Tese - Investigação Dos Mecanismo de Ação Da Melanina Associada Ou Não A Quercetina.

1
3 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

4 DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA E FISIOLOGIA ANIMAL
5 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIA ANIMAL
6
7
8
10 ÉRIQUE RICARDO ALVES
11
12
13
14
15 INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE AÇÃO DA MELATONINA

16 ASSOCIADA OU NÃO COM A QUERCETINA SOBRE O FÍGADO E RINS DE
17 RATOS DIABÉTICOS A NÍVEL CELULAR, BIOQUÍMICO E
18 IMUNOHISTOQUÍMICO.
19
20
21
22
23
24
25
26
27 RECIFE
28 2023
1
29
30
31 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

32 PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
33 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIA ANIMAL
34

36
37
38 INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE AÇÃO DA MELATONINA

41 IMUNOHISTOQUÍMICO.
42
43 Tese apresentada ao Programa de Pós-

44 graduação em Biociência Animal da
45 Universidade Federal Rural de Pernambuco,
46 como pré-requisito para a obtenção do grau
47 de Doutor em Biociência Animal. Área de
48 Morfofisiologia.
49
50 Orientadora:
51 Profa. Dra. Valéria Wanderley Teixeira
52 Coorientadores:
53 Profa. Dra . Tatiana Souza Porto
54 Prof° Dr°. Álvaro Aguiar Coelho Teixeira
55 RECIFE
56 2023
2
57
59
60 “INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE AÇÃO DA MELATONINA

63 IMUNOHISTOQUÍMICO.”
64
65 ________________________________________________________
66 Profª Drª Valéria Wanderley Teixeira – UFRPE
67 Orientadora
68 ________________________________________________________
69 Prof. Dr. Álvaro Aguiar Coelho Teixeira – UFRPE
70 Titular
71 ________________________________________________________
72 – UFPE
73 Titular
74 ________________________________________________________
75 – UFRPE
76 Titular
77 ________________________________________________________
78 – UFRPE
79 Titular
80 RECIFE
81 2023
3
82 AGRADECIMENTOS
83
84 Antigamente me perguntava como Deus pode agir e interferir de forma

85 tão material e pessoal nas nossas vidas. Hoje sei a resposta: na maioria das
86 vezes ele utiliza pessoas como instrumento de Sua vontade e como
87 providência para cumprir seus planos. Todas as pessoas que irei citar nestes
88 agradecimentos foram e são de certa forma instrumento divino, para que hoje
89 pudesse terminar esse trabalho.
90 Primeiramente quero agradecer a Deus pela sua misericórdia e

91 providência. Por me dar paz e coragem para prosseguir em toda essa
92 empreitada. Pelo seu amor e graça, pois sem Deus e sem sua permissão nada
93 seria feito. Obrigado Senhor por cuidar de mim em cada situação.
94 Agradecer também minha mãe Maria, pelo apoio de todas as formas e

95 pelo amor incondicional, que me serviram como esteio. Prestando também
96 meus agradecimentos as minhas irmãs Jane e Andreia pelo apoio e incentivo.
97 Quero agradecer também as minhas melhores amigas Milani e Joásia pelo
98 apoio incondicional e pela cumplicidade, paciência e ajuda. Agradeço o apoio e
99 por sempre se colocarem um lugar de disponibilidade de meus amigos Daniel
100 Peixoto e Diogo de Moraes.
101 Quero dar gratidão a todos os familiares e amigos que acreditaram e me

102 ajudam de forma direta e indireta. Agradecendo a todos sem exceção, do
103 laboratório de histologia pela ajuda, paciência e compreensão, pois agiram
104 sempre com muita gentileza e bondade comigo. Nesse ínterim quero agradecer
105 em especial a Yasmim, Vanessa, Bruno, Anthony, Ana Cláudia, Marina, Jaiurte
106 pelos momentos de alegria, ajuda e cumplicidade. Agradeço também Cíntia,
107 Carol, Aline, Clóvis, Rebecca e Glaucilane.
108 Quero também agradecer ao professor Valdemiro Amaro da Silva Junior

109 e o professor Francisco de Assis Leite Souza pelo tempo desprendido, pela
110 compreensão, confiança e por sempre se mostrar solicito a me ajudar em todos
111 os momentos que precisei. Quero agradecer também a minha coorientadora e
112 sempre coordenadora Tatiana Porto pela sua paciência e ajuda durante toda
4
113 minha vida pós-acadêmica. Agradeço também nesse momento ao Professor

114 Leucio Duarte Vieira Filho da UFRPE pela ajuda e confiança de ceder seu
115 laboratório e tempo para finalizar esse trabalho.
116 Quero dedicar esse parágrafo a duas pessoas de extrema importância

117 nesse meu trajeto no doutorado. A primeira é Laís, ela foi de extrema
118 importância para conclusão desse trabalho. Lembro que fomos os primeiros
119 corajosos a voltar para o laboratório ainda nas incertezas da pandemia, mas
120 quando já estava começando a diminuir os casos. Estávamos super receosos e
121 mesmo assim, juntos fomos fazer o experimento. Aí a parceria e amizade só
122 cresceram. Obrigado Laís sua doida, pela alegria, diversão, ajuda, boas ideias.
123 A outra pessoa é Ismaela. O que falar desse ser de luz?! Só agradecer Isma
124 sem você esse trabalho não teria chegado até aqui, você é a pessoa mais
125 bondosa e compreensiva que conheci até hoje, você merece conquistar o
126 mundo!
127 Quero mostrar minha gratidão também à professora Valéria Wanderley

128 Teixeira pelo tempo desprendido na realização deste trabalho e por sempre
129 agir comigo com uma profícua honestidade e afabilidade, e às vezes até me
130 tratando como um filho, sempre me estimulando! Quero também agradecer ao
131 professor Álvaro Aguiar Coelho Teixeira por sua paciência e ajuda. Quero
132 agradecer também a FACEPE e Universidade Federal Rural de Pernambuco
133 pelo apoio, como também ao Programa de Pós-Graduação em Biociência
134 Animal e seu coordenador Pabyton Cadena pelo empenho e dedicação para
135 nossa formação, como pesquisadores e docentes. Ademais agradeço ajuda a
136 Renato, André bem como também ao coordenador do Biotério. E agradeço
137 também a Edna Maria Edna Gomes de Barros técnica do DMFA pela ajuda e
138 paciência.
139
140
141
142
143
144
145 RESUMO
146 O diabetes mellitus é uma doença crônica de caráter hiperglicemiante, suas
147 complicações atingem todos os órgãos do corpo, inclusive o fígado e rins, e já
148 é notório que o estresse oxidativo e a inflamação fazem parte de sua
149 fisiopatologia. Nesse sentido se destaca dois antioxidantes: a quercetina
150 (flavonoide) e a melatonina (hormônio pineal), os dois também com potencial
151 anti-inflamatório. Nesse sentido o presente trabalho objetivou analisar o efeito
152 do tratamento com quercetina associado ou não com a melatonina nos rins e
153 fígado de ratos diabéticos. Foram usados 90 ratos machos divididos nos
154 seguintes grupos: Grupo I (Controle): ratos sem indução ao diabetes; Grupo II:
155 ratos diabéticos (GD); Grupo III: ratos diabéticos tratados com insulina (GDI);
156 Grupo IV: ratos diabéticos tratados com melatonina (GDM); Grupo V: ratos
157 diabéticos tratados com quercetina (GDQ); Grupo VI: ratos diabéticos tratados
158 com melatonina e quercetina (GDMQ). O diabetes foi induzido através da
159 estreptozotocina (60 mg/kg). A melatonina foi administrada (10 mg/kg) por 30
160 dias após a indução do diabetes. A quercetina foi administrada (40 mg/kg)
161 também por 30 dias após a indução do diabetes. A glicose foi medida através
162 de tiras e glicosimetro comercial. Ao final do experimento os animais foram
163 anestesiados e eutanasiados, os órgãos foram coletados e o sangue foi
164 centrifugado e o soro foi guardado para análise. Os órgãos seguiram para o
165 processamento histológico de rotina (lâminas em H.E para histopatologia e
166 morfometria) e o soro seguiu para análise bioquímica para creatinina, ureia,
167 TGO e TGP. Também foi analisado estresse oxidativo tecidual para avaliar
168 peroxidação lipídica e glutationa reduzida. Ademais foi feito imunohistoquímica
169 para IL-6, TNF-α e Teste de Tunel (apoptose) nos rins e IL-6, TNF-α e IL-10
170 para o fígado. Os resultados demonstraram que os tratamentos só com
171 melatonina e melatonina + quercetina foram mais efetivos em diminuir os níveis
172 glicêmicos, proteger os animais contra a perda de peso corporal e renal, além
173 de diminuir o estresse oxidativo e evitar alterações patológicas severas nos
174 rins, bem como proteger o tecido renal e estabilizar níveis de creatinina e ureia,
175 ademais protegeram contra o aumento da apoptose e de interleucinas
176 inflamatórias. O tratamento só com quercetina demonstrou uma leve ou
177 moderada efetividade nos agravos renais dessa doença. No fígado os grupos
178 tratados com melatonina e quercetina, tanto juntos quanto separados
179 conseguiram proteger os animais contra a perda de peso hepática, além de
180 diminuir o estresse oxidativo e evitar alterações patológicas severas no fígado.
181 Ademais estabilizou os níveis séricos de TGO e TGP, e evitaram o aumento de
182 interleucinas inflamatórias (IL-6 e TNF-α) e redução da IL-10 (interleucina anti-
183 inflamatória). Conclui-se que para o tecido renal os tratamentos só com
184 melatonina e melatonina associada com quercetina foram os mais eficazes
185 contra as complicações renais no diabetes. No entanto para o fígado, todos os
186 mesmos tratamentos associados ou não, foram benéficos na proteção contra
187 os danos ocasionados pelo diabetes.
5
188 Palavras-Chave: hiperglicemia, melatonina, flavonoide, estresse oxidativo,

189 inflamação, ratos.
190
191 ABSTRACT
192 Diabetes mellitus is a chronic hyperglycemic disease, its complications affect all
193 organs of the body, including the liver and kidneys, and it is already known that
194 oxidative stress and inflammation are part of its pathophysiology. In this sense,
195 two antioxidants stand out: quercetin and melatonin, both also with anti-
196 inflammatory potential. In this sense, the present work aimed to analyze the
197 effect of treatment with quercetin associated or not with melatonin in the
198 kidneys and liver of diabetic rats. Ninety male rats divided into the following
199 groups were used: Group I (Control): rats without induced diabetes; Group II:
200 diabetic rats (GD); Group III: diabetic rats treated with insulin (GDI); Group IV:
201 diabetic rats treated with melatonin (GDM); Group V: diabetic rats treated with
202 quercetin (GDQ); Group VI: diabetic rats treated with melatonin and quercetin
203 (GDMQ). Diabetes was induced by streptozotocin (60 mg/kg). Melatonin was
204 administered (10 mg/kg) for 30 days after diabetes induction. Quercetin was
205 administered (40 mg/kg) also for 30 days after diabetes induction. Glucose was
206 measured using strips and a commercial glucometer. At the end of the
207 experiment, the animals were anesthetized and euthanized, the organs were
208 collected and the blood was centrifuged and the serum was saved for analysis.
209 The organs were sent for routine histological processing (H.E slides for
210 histopathology and morphometry) and the serum was sent for biochemical
211 analysis for creatinine, urea, TGO and TGP. Tissue oxidative stress was also
212 performed to assess lipid peroxidation and reduced glutathione. In addition,
213 immunohistochemistry was performed for IL-6, TNF-α and Tunnel Test
214 (apoptosis) in the kidneys and IL-6, TNF-α and IL-10 for the liver. The results
215 showed that treatments with melatonin alone and melatonin + quercetin were
216 more effective in lowering glycemic levels, protecting animals against body and
217 kidney weight loss, in addition to reducing oxidative stress and avoiding severe
218 pathological changes in the kidneys, as well as protecting the renal tissue and
219 stabilize levels of creatinine and urea, in addition they protected against the
220 increase of apoptosis and inflammatory interleukins. Treatment with quercetin
221 alone showed mild or moderate effectiveness in the aggravations of this
222 disease. In the liver, the groups treated with melatonin and quercetin, both
223 together and separately, managed to protect the animals against hepatic weight
224 loss, in addition to reducing oxidative stress and avoiding severe pathological
225 changes in the liver. Furthermore, it stabilized the serum levels of TGO and
226 TGP, and prevented the increase of inflammatory interleukins (IL-6 and TNF-α)
227 and reduction of IL-10 (anti-inflammatory interleukin). It is concluded that for the
228 renal tissue, treatments with melatonin alone and melatonin associated with
229 quercetin were the most effective against renal complications in diabetes.
6
230 However, for the liver, the same treatments associated or not, were beneficial in
231 protecting against the damage caused by diabetes.
232
233 Keywords: hyperglycemia, melatonin, flavonoid, oxidative stress, inflammation,
234 rats.
235
236 SUMÁRIO
237
RESUMO........................................................................................................VI
ABSTRACT...................................................................................................VII
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................X
LISTA DE TABELAS....................................................................................XIII
INTRODUÇÃO................................................................................................14
OBJETIVOS GERAIS......................................................................................16
OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................17
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................17
238
Capítulos
I DECLARAÇÃO DE PUBLICAÇÃO.......................................................20
ANTIOXIDANTES COMO PERSPECTIVA DE TRATAMENTO PARA

O DIABETES MELLITUS.......................................................................21
RESUMO..................................................................................................22
ABSTRACT..............................................................................................22
1. MATERIA E MÉTODOS.....................................................................23
2. INTRODUÇÃO.....................................................................................23
3. DIABETES MELLITUS.......................................................................24
4. ANTIOXIDANTES COMO PERSPECTIVA DE

TRATAMENTO.......................................................................................27
5. MELATONINA E DIABETES............................................................28
6. QUERCETINA E DIABETES.............................................................30
7. CONCLUSÃO......................................................................................31
8. REFERÊNCIAS....................................................................................31
7 9
8
II MELATONINA E QUERCETINA: UMA PERSPECTIVA PARA O

CONTROLE DAS ALTERAÇÕES RENAIS EM RATOS
DIABÉTICOS............................................................................................36
RESUMO ..................................................................................................37
ABSTRACT .............................................................................................38
INTRODUÇÃO........................................................................................39
MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................41
RESULTADOS........................................................................................47
DISCUSSÃO............................................................................................63
CONCLUSÃO.........................................................................................65
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................66
III ASSOCIAÇÃO DE ANTIOXIDANTES PREVINE O FÍGADO

CONTRA AGRAVOS OCASIONADOS PELO DIABÉTES MELLITUS
EM
RATOS....................................................................................................72
RESUMO ................................................................................................73
ABSTRACT ............................................................................................74
INTRODUÇÃO .......................................................................................75
MATERIAL E MÉTODOS .....................................................................77
RESULTADOS ........................................................................................82
DISCUSSÃO ............................................................................................96
CONCLUSÃO..........................................................................................98
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................99
239
240
9 10
10
241
242 LISTA DE FIGURAS

243
244
245 Capítulo II
246
247 Figura 1. Níveis glicêmicos (mg/dL). GC-grupo controle; GD- grupo diabético;
248 GDI- grupo diabético tratado com insulina; GDM- grupo diabético tratado com
249 melatonina; GDQ- grupo diabético tratado com quercetina; GDQM- grupo
250 diabético tratado com quercetina e melatonina. *Médias seguidas pela mesma
251 letra não diferem significativamente entre si pelo teste de comparações
252 múltiplas de Tukey e Kramer
253 (p>0.05)..............................................................................................................48
254
255 Figura 2. Gráfico dos valores dos pesos corporais dos grupos experimentais
256 (g) do dia antes do início do tratamento (A) e do último dia de tratamento – 30
257 dias (B). GC-grupo controle; GD- grupo diabético; GDI- grupo diabético tratado
258 com insulina; GDM- grupo diabético tratado com melatonina; GDQ- grupo
259 diabético tratado com quercetina; GDQM- grupo diabético tratado com
260 quercetina e melatonina. *Médias seguidas pela mesma letra não diferem
261 significativamente entre si pelo teste de múltiplas de Tukey e Kramer
262 (p>0.05)..............................................................................................................49
263
264 Figura 3. Gráfico dos valores dos pesos dos rins dos animais dos grupos
265 experimentais (g). GC-grupo controle; GD- grupo diabético; GDI- grupo
266 diabético tratado com insulina; GDM- grupo diabético tratado com melatonina;
267 GDQ- grupo diabético tratado com quercetina; GDQM- grupo diabético tratado
268 com quercetina e melatonina. *Médias seguidas pela mesma letra não diferem
269 significativamente entre si pelo teste de comparações múltiplas de Tukey e
270 Kramer (p>0.05).................................................................................................50
271
272 Figura 4. Gráfico dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
273 (TBARS) renal (nm/mg). GC-grupo controle; GD- grupo diabético; GDI- grupo
278 Kramer (p>0.05).................................................................................................51
279
280 Figura 5. Gráfico dos níveis de glutationa reduzida (GSH) renal (nm/mg). GC-
281 grupo controle; GD- grupo diabético; GDI- grupo diabético tratado com insulina;
282 GDM- grupo diabético tratado com melatonina; GDQ- grupo diabético tratado
283 com quercetina; GDQM- grupo diabético tratado com quercetina e melatonina.
284 *Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo
11 11
12
285 teste de comparações múltiplas de Tukey e Kramer

286 (p>0.05).............................................................................................................52
287
288 Figura 6. Histopalogia renal. Notar em A e B grupo controle, camada cortical
289 (c), medular (m) e um glomérulo renal (ponta de seta azul). C, D, E e F – grupo
290 GD. Legenda das alterações: degeneração vacuolar (estrela), atrofia
291 glomerular (asterisco), congestão vascular (seta fina) e descamação apical
292 (ponta de seta preta)
293 ...........................................................................................................................54
294
295 Figura 7. Histopalogia renal. Notar em A– grupo GDI; B- grupo GDM; C- grupo
296 GDQ; D- grupo GDQM. Legenda das alterações: degeneração vacuolar
297 (estrela), atrofia glomerular (asterisco), congestão vascular (seta fina) e
298 descamação apical (ponta de seta preta) e congestão glomerular (seta
299 vermelha)...........................................................................................................55
300
301 Figura 8. Fotomicrografias da imunohistoquímica para IL-6 nos rins dos
302 animais dos grupos experimentais. A – (GC), B (GD), C – (GDI), D (GDM), E –
303 (GDQ) e F – (GDQM), G – gráfico da quantificação em pixels da marcação
304 positiva em marrom da IL-6. Médias seguidas pela mesma letra não diferem
305 significativamente entre si teste de Comparações Múltiplas de Tukey e Kramer
306 (P>0,05).............................................................................................................58
307
308 Figura 9. Fotomicrografias da imunohistoquímica para TNF-α nos rins dos
311 positiva em marrom da TNF-α. Médias seguidas pela mesma letra não diferem
313 (P>0,05).............................................................................................................60
314
315 Figura 10. Fotomicrografias da imunohistoquímica para apoptose nos rins dos
316 animais dos grupos experimentais. A-B: GC; C-D: GD e E-F: GDI. Notar forte
317 marcação no grupo GD. Teste de TUNEL.........................................................61
318
319 Figura 11. Fotomicrografias para apoptose (teste de TUNEL) nos rins dos
320 animais dos grupos experimentais. A-B: GDM; C-D: GDQ e E-F: GDQM. Notar
321 fraca e uniforme marcação. G – Gráfico do percentual de células TUNEL
322 positivas em marrom. Médias seguidas pela mesma letra não diferem
324 (P>0,05).............................................................................................................62
325
326
13 12
14
327 Capítulo III
328 Figura 1. Níveis glicêmicos (mg/dL). GC-grupo controle; GD- grupo diabético;
329 GDI- grupo diabético tratado com insulina; GDM- grupo diabético tratado com
330 melatonina; GDQ- grupo diabético tratado com quercetina; GDQM- grupo
331 diabético tratado com quercetina e melatonina. *Médias seguidas pela mesma
332 letra não diferem significativamente entre si pelo teste de comparações
333 múltiplas de Tukey e Kramer
334 (P>0,05)..............................................................................83
335
336 Figura 2. Gráfico dos valores dos pesos dos fígados dos animais dos grupos
337 experimentais (g). GC-grupo controle; GD- grupo diabético; GDI- grupo
342 Kramer (p>0.05).................................................................................................84
343
344
345 Figura 3. Gráfico dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
346 (TBARS) e glutationa reduzida (GSH) hepáticas (nmol/mg). GC-grupo controle;
347 GD- grupo diabético; GDI- grupo diabético tratado com insulina; GDM- grupo
348 diabético tratado com melatonina; GDQ- grupo diabético tratado com
349 quercetina; GDQM- grupo diabético tratado com quercetina e melatonina.
350 *Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo
351 teste de comparações múltiplas de Tukey e Kramer
352 (p>0.05)..............................................................................................................85
353
354 Figura 4. Fotomicrografias da histopatologia hepática. Notar em A–B grupo
355 GC; C-D grupo GD; E-F grupo GDI. Legenda das alterações: congestão
356 vascular (ponta de seta vermelha), necrose (seta preta), degeneração hidrópica
357 (seta vermelha), hipertrofia de hepatócitos (asterisco), mitose (seta azul) e
358 anisocariose (moldura
359 quadrada).......................................................................87
360
361 Figura 5. Fotomicrografias da histopatologia hepática. Notar em A–B grupo
362 GDM; C-D grupo GDQ; E-F grupo GDQM. Legenda das alterações:
363 degeneração vacuolar (seta espessa), necrose (seta preta), proliferação de
364 ductos biliares (ponta de seta preta), hipertrofia de hepatócitos (asterisco) e
365 anisocariose (moldura
366 quadrada)............................................................................................88
367
368 Figura 6. Fotomicrografias da imunohistoquímica para o IL-6 no fígado dos
15 13
16

373 (P>0,05).............................................................................................................92
374 Figura 7. Fotomicrografias da imunohistoquímica para TNF-α no fígado dos
377 positiva em marrom do TNF-α. Médias seguidas pela mesma letra não diferem
379 (P>0,05).............................................................................................................93
380
381 Figura 8. Fotomicrografias da imunohistoquímica para IL-10 no fígado dos
385 significativamente entre si teste de Comparações Múltiplas de Tukey e
386 Kramer
387 (P>0,05)...........................................................................................................95
388
389 LISTA DE TABELAS

390 Capítulo II
391 Tabela 1. Média ± desvio padrão do diâmetro do glomerular (DG), volume do
392 glomérulo (VG) e diâmetro (DCB) e volume (VCB) da cápsula de Bowman dos
393 rins dos animais dos grupos experimentais.....................................................56
394
395
396 Tabela 2. Média ± desvio padrão do perfil bioquímico renal dos animais dos
397 grupos experimentais aos 10 e 30 dias, após indução do diabetes e respectivos
398 tratamentos........................................................................................................57
399
400 Capítulo III

401 Tabela 1. Média ± desvio padrão da porcentagem de parênquima lobular e não
402 lobular no fígado dos animais dos grupos experimentais..................................89
403
404 Tabela 2. Média ± desvio padrão dos níveis séricos de TGO e TGP nos
405 animais dos grupos experimentais, aos 10 dias de
406 tratamento.....................................90
407
408
409 Tabela 3. Média ± desvio padrão dos níveis séricos de TGO e TGP nos
410 animais dos grupos experimentais, aos 30 dias de
411 tratamento.....................................91
412
17 14
18
413
19 15
20
414 INTRODUÇÃO
415 O diabetes mellitus é uma doença de caráter crônico e de natureza
416 metabólica e sistêmica. Nesse distúrbio há uma desregulação dos níveis
417 glicêmicos, se estabelecendo assim uma hiperglicemia constante
418 (PETERSMANN et al., 2019). Isso pode ser ocasionado quando o pâncreas
419 não produz insulina de forma suficiente ou quando há uma produção ineficaz
420 desse hormônio, ou ainda pode haver uma resistência à insulina (EGAN;
421 DINNEEN, 2019).
422 Diversos estudos atuais estimam que haja mais de 537 milhões de
423 pessoas sejam portadoras do diabetes no mundo. No Brasil é estimado cerca
424 de 15,7 milhões de diabéticos, nesse ínterim o Brasil ocupa a 6º posição no
425 ranking mundial. Destaca-se também que os gastos públicos com esse mal são
426 exorbitantes, só no território brasileiro foram gatos US$ 42,9 bilhões em saúde,
427 com essa doença (INTERNATIONAL DIABETES FEDERETION, 2021).
428 Existem vários tipos de diabetes, porém os mais comuns são o diabetes
429 tipo I e tipo II. O do tipo I (DMI) se caracteriza como uma síndrome autoimune,
430 que ocorre quando o organismo começa a combater as suas próprias células
431 betas, prejudicando assim a produção de insulina e o diabetes tipo II (DMII) que
432 é o diabetes mais comum, tem como causa principal a resistência à insulina ou
433 ocorre uma produção inadequada da mesma (AMERICAN DIABETES
434 ASSOCIATION, 2020).
435 O diabetes gera um grande impacto na sociedade, pois é uma doença
436 altamente incapacitante, e isso é devido as suas inúmeras complicações. As
437 mais frequentes são os distúrbios cardiovasculares, moléstias renais
438 (principalmente que afetam os glomérulos) que podem levar a nefropatia

21 16
22
439 diabética (POURGHASEM; SHAFI; BABAZADEH, 2015); retinopatia e
440 neuropatia, e, além disso, a diabetes leva ao agravamento da arteriosclerose,
441 aumentando assim os riscos envolvidos no surgimento do infarto do miocárdio,
442 infarto cerebral e doença arterial oclusiva das extremidades inferiores
443 (PETERSMANN et al., 2019). Essas complicações são as primeiras causas de
444 morbidade e mortalidade em pacientes diabéticos (INGELFINGER; JARCHO,
445 2017).
446 O tecido hepático é um dos órgãos mais afetados por essa desordem
447 hiperglicemiante, os males mais comuns são diminuição do parênquima
448 hepático, degeneração dos hepatócitos e infiltrado gorduroso que pode levar há
449 uma disfunção generalizada desse tecido (FERREIRA et al., 2011; SILVA et al.,
450 2011).
451 A doença renal diabética é a principal causa de insuficiência renal no
452 mundo. Algumas alterações causadas pelo diabetes que levam a essa
453 insuficiência são esclerose glomerular, declínio da taxa de filtração, hipóxia
454 renal, hipertensão, lesão podocitária, autofagia desregulada e inflamação
455 (DEFRONZO; REEVES; AWAD, 2021).
456 Atualmente já se sabe da relação entre o estresse oxidativo e o diabetes,
457 e que existe uma relação direta e determinante no estabelecimento das
458 complicações diabéticas (ZHANG et al., 2020), com esse aumento e
459 desregulação dos níveis espécies reativas de oxigênio (ROS) que caracteriza o
460 estresse oxidativo, bem como com uma defesa antioxidante prejudicada
461 (ALKADI, 2020; SIES, 2020).
462 Tratamentos antioxidantes são uma nova perspectiva de tratamento para
463 o diabetes, visto que essa doença tem um componente fisiopatológico bem
23 17
24
464 estabelecido no estresse oxidativo (GULCIN, 2020; NEHA et al., 2019). Nesse
465 ínterim um grupo de moléculas antioxidantes tem ganhado bastante
466 notoriedade, os flavonoides, e mais especificamente a quercetina, um agente
467 antioxidante que tem demonstrado uma capacidade de reverter e proteger
468 contra diversas doenças (KAŞIKCI; BAĞDATLIOĞLU, 2016; YI et al., 2021).
469 Outra molécula que já tem grande notoriedade como um potente agente
470 antioxidante é a melatonina (REITER et al., 2016). Um hormônio produzido
471 pela glândula pinel que tem demonstrado ser um promissor agente terapêutico
472 para diversas doenças de cunho oxidativo, tanto diminuindo alterações como
473 as prevenindo (PATEL et al., 2022).
474 Além disso, já é notório que a inflamação e estresse oxidativo participam
475 da patogênese dessa doença (REIS et al., 2012). Levando-se em consideração
476 que atualmente se tem buscado alternativas naturais de tratamento (SILVA,
477 2012), e que tratamentos associativos de moléculas antioxidantes naturais têm
478 demonstrado efeitos promissores em diversas doenças (YANG; KANG, 2018;
479 ZANONI et al., 2015), torna-se pertinente investiga a ação da melatonina
480 associada ou não a quercetina sobre os rins e fígado de ratos diabéticos, como
481 um possível tratamento alternativo para esse mal que atinge boa parte da
482 população mundial.
483
484 Objetivo Geral
485 Realizar uma revisão de literatura acerca de como os antioxidantes estão
486 sendo usados como perspectiva de tratamento para o diabetes mellitus, além
487 de analisar a influência do tratamento com melatonina associada ou não a

25 18
26
488 quercetina sobre os rins e fígado de ratos diabéticos a nível celular, bioquímico
489 e imunohistoquímico.
490
491 Objetivos Específicos
492  Publicação de revisão de literatura em capítulo de livro: Antioxidantes
493 como perspectiva de tratamento para o diabetes mellitus;
494  Avaliar histologicamente os rins e fígado de ratos diabéticos co-tratados ou
495 não com melatonina (MEL) e quercetina (QCT);
496  Avaliar o peso dos animais, rins e fígado de ratos diabéticos e co-tratados
497 ou não com MEL e QCT;
498  Analisar imunohistoquimicamente os rins e fígado de ratos diabéticos e co-
499 tratados ou não com MEL e QCT quanto à expressão de IL-6, TNF-α e IL-10
500 (essa última citocina avaliada só no fígado);
501  Avaliar apoptose (TUNEL) nos rins de ratos diabéticos e co-tratados ou não
502 com MEL e QCT;
503  Avaliar perfil glicêmico e bioquímico hepático e renal de ratos diabéticos e
504 co-tratados ou não com MEL e QCT;
505  Avaliar o estresse oxidativo tecidual em relação aos níveis de substâncias
506 reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e Glutationa Reduzida (GSH).
507
508 REFERÊNCIAS
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577
578
579
580
31 21
32
581
582 APÍTULO I
583
584
33 22
34
585 ANTIOXIDANTES COMO PERSPECTIVA DE TRATAMENTO PARA O

586 DIABETES MELLITUS.
587
588 ANTIOXIDANTS AS A TREATMENT PERSPECTIVE FOR DIABETES
589 MELLITUS.
590
591 Primeiro Autor, Érique Ricardo Alves
592 Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Morfologia e
593 Fisiologia Animal
594 Recife-PE
595 Orcid: 0000-0002-7925-9212
596 Segundo Autor, Laís Caroline da Silva Santos
599 Recife-PE
600 Orcid: 0000-0003-3123-4224
601 Terceiro Autor, Maria Vanessa da Silva
604 Recife-PE
605 Orcid: 0000-0002-4733-461X
606 Quarto Autor, Yasmim Barbosa dos Santos
609 Recife-PE
610 Orcid: 0000-0002-6228-6951
611 Quinto Autor, Alef de Moura Pereira
614 Recife-PE
615 Orcid: 0000-0003-3659-3947
616 Sexto Autor, Bruno José do Nascimento
619 Recife-PE
35 23
36
620 Orcid: 0000-0001-9404-7501

621 Sétimo Autor, Ana Cláudia Carvalho de Araújo
624 Recife-PE
625 Orcid: https://orcid.org/0000-0001-6169-2782
626 Oitavo Autor, Álvaro Aguiar Coelho Teixeira
629 Recife-PE
630 Orcid: 0000-0001-5940-9220
631 Nono Autor, Valéria Wanderley Teixeira
634 Recife-PE
635 Orcid: 0000-0001-9533-5476
636 Data de submissão: 08/04/2021
637
638 RESUMO: O diabetes mellitus é um distúrbio caracterizado pela hiperglicemia
639 constante e traz diversas complicações em diversos órgãos, o que pode
640 incapacitar o indivíduo e trazer inúmeros impactos socioeconômicos. Um dos
641 fatores fisiopatológicos mais envolvidos nessa doença é o estresse oxidativo
642 com o aumento dos radicais livres. Atualmente existe um esforço na busca de
643 novas perspectivas de tratamento com moléculas naturais antioxidante tendo
644 menos efeitos colaterais e baixo custo para o tratamento de diversas doenças
645 inclusive do diabetes. Duas moléculas se destacam nesse cenário: a
646 quercetina, um flavonoide encontrado em legumes e vegetais e a melatonina
647 hormônio produzido pela glândula pineal, ambas com propriedades
648 antiapoptóticas e antioxidantes. Assim, este trabalho objetivou fazer uma
649 revisão de literatura sobre as perspectivas terapêuticas com esses
650 antioxidantes para o tratamento da diabetes. Para isso, foi feito uma revisão de
651 literatura realizada entre os meses de janeiro e março de 2022, onde foram
652 coletados dados a partir de estudos acadêmicos já existentes como artigos,
653 federações internacionais e agências públicas selecionados em plataformas de
654 busca (Scielo, Google acadêmico, Science direct e Pubmed). A partir disso
655 conclui-se que a melatonina e quercetina possuem potencial para tratar a
656 diabetes, porém são necessários mais estudos que confirmem a segurança, de
657 melhores dosagens e se as ambas juntas podem ser utilizadas como
658 tratamento contra essa enfermidade.
659 PALAVRAS-CHAVE: Antioxidativo; Hiperglicemia; Flavonoides; Indolamina.
660
37 24
38
661 ABSTRACT: Diabetes mellitus is a disorder characterized by constant

662 hyperglycemia and brings several complications in various organs, which can
663 incapacitate the individual and bring numerous socioeconomic impacts. One of
664 the pathophysiological factors most involved in this disease is oxidative stress
665 with an increase in free radicals. Currently, there is an effort in the search for
666 new perspectives of treatment with natural antioxidant molecules with fewer
667 side effects and low cost for the treatment of several diseases, including
668 diabetes. Two molecules stand out in this scenario: quercetin, a flavonoid found
669 in legumes and vegetables, and the hormone melatonin produced by the pineal
670 gland, both with anti-apoptotic and antioxidant properties. Thus, this study
671 aimed to review the literature on the therapeutic perspectives with these
672 antioxidants for the treatment of diabetes. For this, a literature review was
673 carried out between January and March 2022, where data were collected from
674 existing academic studies such as articles, international federations and public
675 agencies selected in search platforms (Scielo, Google academic, Science direct
676 and Pubmed). From this, it is concluded that melatonin and quercetin have the
677 potential to treat diabetes, but more studies are needed to confirm the safety,
678 better dosages and whether both together can be used as a treatment against
679 this disease.
680
681 KEYWORDS: Antioxidative; Hyperglycemia; Flavonoids; Indolamine.
682
683 1. MATERIAL E MÉTODOS
684 Como esta pesquisa se trata de uma revisão de literatura que foi
685 realizada entre os meses de janeiro e março de 2022, os dados foram reunidos
686 entre estudos acadêmicos já existentes, bem como em agências públicas,
687 federações internacionais e artigos científicos. Estes por sua vez foram
688 selecionados através do banco de dados do Scielo, Google acadêmico,
689 Science Direct e Pubmed. A busca nos bancos de dados foi alcançada
690 empregando o uso de terminologias utilizadas pelos descritores em ciências da
691 saúde em português e inglês como: “melatonina”, “quercetina”, “antioxidantes”,
692 “diabetes mellitus”, “estresse oxidativo e diabetes”, “melatonina como
693 antioxidante”, “quercetina como antioxidante”, “tratamento antioxidante para o
694 diabetes” e “terapia antioxidante”.
695
696 2. INTRODUÇÃO
697 A diabetes mellitus é definida como uma doença de ordem metabólica, onde
698 o estado hiperglicemiante é constante (RODEN, 2016). Nessa desordem pode
699 haver uma interrupção/diminuição drástica da secreção de insulina provocado
700 pela destruição das células beta pancreática (EGAN; DINNEEN, 2019) ou há
701 uma produção ineficiente desse hormônio com uma incapacidade do corpo de
39 25
40
702 responder a mesma (GOYAL; JIALAL, 2022). Suas complicações são a

703 principal causa dos impactos na saúde pública e na sociedade. E o estresse
704 oxidativo participa tanto do seu estabelecimento quanto do seu
705 recrudescimento (YARIBEYGI et al., 2020a).
706 O estresse oxidativo ocorre quando há um desbalanceamento nos níveis de
707 moléculas oxidantes e antioxidantes, com o aumento do primeiro ou com a
708 diminuição do segundo (SIES, 2020). Nesse sentido há uma busca por novos
709 tratamentos com moléculas antioxidantes naturais, para trata doenças que
710 tenham o estresse oxidativo como participante da sua fisiopatologia (GULCIN,
711 2020).
712 Nesse âmbito a melatonina, que é um potente agente antioxidante tem
713 ganhado destaque como possibilidade de tratamento para diversas doenças.
714 Essa molécula é produzida principalmente pela pineal, mas outros órgãos
715 também podem sintetizá-la (REITER et al., 2016a; TAN et al., 2015). Na
716 diabetes, age diminuindo as moléculas pro-oxidantes, aumentando níveis de
717 enzimas antioxidantes (ALVES et al., 2020), reduz a hiperlipidemia e
718 hiperglicemia, além de diminuir níveis de moléculas inflamatórias (TNF-α, IL-6 e
719 IL-1) (NISHIDA, 2005).
720 Outra substância com alta capacidade contra os danos oxidativos, é a
721 quercetina. Uma molécula da família dos flavonoides (PANCHE; DIWAN;
722 CHANDRA, 2016), naturalmente encontrados em frutas e legumes (ex.: cebola,
723 couve, maçã) (PANCHE; DIWAN; CHANDRA, 2016). Suas ações no diabetes
724 estão associadas as suas qualificações como anti-inflamatório e antioxidante,
725 levando a uma elevação dos níveis e na sensibilidade da insulina, estimula a
726 proliferação das células beta pancreáticas e ainda previne a apoptose de
727 células.
728 O levantamento de conhecimentos sobre moléculas antioxidantes torna-se
729 de extrema importância tanto para o mundo acadêmico quanto científico, então
730 torna-se essencial uma busca bibliográfica revisional sobre a quercetina e
731 melatonina como agentes terapêuticos antioxidantes para a diabetes, com o
732 intuito de trazer luz sobre as novas perspectivas e direcionamentos para um
733 tratamento natural para essa doença que atinge milhões de pessoas e traz
734 tantos impactos para a sociedade.
735
41 26
42
736 3. DIABETES MELLITUS

737 A diabetes mellitus é caracterizada como uma desordem crônica
738 metabólica, ocasionada por um desbalanceamento nos níveis glicêmicos do
739 organismo (DAVID et al., 2015), bem como também representa um grupo de
740 doenças autoimunes e genéticas que compartilham um aspecto geral – a
741 hiperglicemia (EGAN; DINNEEN, 2019). Nessa doença o pâncreas pode não
742 produzir insulina ou a insulina é sintetizada de forma ineficaz (DAVID et al.,
743 2015), ou ainda pode haver resistência à insulina (KUZUYA et al., 2002). Essa
744 enfermidade em conjunto com suas complicações são notavelmente as
745 principais causas de morte na maior parte dos países (INTERNATIONAL
746 DIABETES FEDERETION, 2021).
747 Segundo um atual e extenso levantamento de dados feito pela
748 INTERNATIONAL DIABETES FEDERETION (2021), tornou-se notório que em
749 2021 havia 537 milhões de pessoas (com idade entre 20-79 anos) com
750 diabetes em todo o globo. Demonstrando desta forma que de cada 10 pessoas
751 adultas, 1 vive com essa doença. O que implica em um gasto exorbitante,
752 principalmente com suas complicações, chegando a US$ 966 milhões das
753 despesas em saúde mundialmente, isso corresponde a um aumento de 316 %
754 nos últimos 15 anos. Ainda nesse relatório, um número assustador foi exposto
755 que a cada 5 segundos uma pessoa morre por essa enfermidade no mundo.
756 Tudo isso levou a um total de 6,7 milhões de mortes em 2021.
757 Esse mesmo levantamento mostrou que 541 milhões de pessoas têm
758 intolerância a glicose e estão enquadradas em um alto risco de
759 desenvolvimento do diabetes, o que também alimenta a projeção para o ano de
760 2045, que estará na ordem dos 783 milhões.
761 Segundo a fonte supracitada é notória a posição do Brasil em vários
762 parâmetros do estudo. Ocupando no ranking mundial dos países com maiores
763 índices de adultos diabéticos o 6° lugar, com cerca 15,7 milhões de casos. E
764 tendo uma projeção de 23,2 milhões de casos para o ano de 2045. Isso levou o
765 Brasil a desembolsar até o referido ano, US$ 42,9 bilhões com gastos em
766 saúde, ficando no 3º lugar no ranking mundial de países com maiores gastos,
767 perdendo apenas para o Estado Unidos (1º lugar) e China (2º lugar).
768 Existem diferentes tipos de diabetes, mas os dois principais e mais comuns
769 subtipos são: o diabetes tipo I (DMI) que é caracterizada como uma reação
43 27
44
770 autoimune inflamatória onde o sistema imunológico ataca as células beta

771 produtoras de insulina nas ilhotas pancreáticas. Como resultado, o corpo
772 produz nenhuma ou pouca insulina gerando assim um quadro irreversível de
773 deficiência absoluta de insulina (EGAN; DINNEEN, 2019). As causas deste
774 processo destrutivo não são totalmente entendidas, mas uma combinação de
775 suscetibilidade genética e gatilhos ambientais, tais como infecção viral, toxinas
776 e alguns fatores dietéticos influem nessa patogênese (AMERICAN DIABETES
777 ASSOCIATION, 2014). A doença pode se desenvolver em qualquer idade, mas
778 o tipo I ocorre com mais frequência em crianças e adolescentes. Pessoas com
779 este tipo de diabetes precisam de injeções diárias de insulina, monitoramento
780 regular e manutenção de uma dieta saudável, a fim de manter um nível de
781 glicose no intervalo adequado, porém sem insulina não seriam capazes de
782 sobreviver. (INTERNATIONAL DIABETES FEDERETION, 2021) .
783 Já o tipo II (DMII) é o mais comum dos diabetes mellitus, correspondendo
784 em torno de 90% de todos os pacientes portadores e sua incidência está
785 aumentando em quase todos os países (DE GREGORIO et al., 2018). Neste, a
786 hiperglicemia é uma consequência de uma produção inadequada de insulina e
787 incapacidade do corpo para responder plenamente a esta, isso pode ser
788 definido como resistência à insulina. O DMII é mais comumente visto em
789 adultos mais velhos, mas é cada vez mais visto em crianças, adolescentes e
790 adultos mais jovens devido ao aumento dos níveis de obesidade, sedentarismo
791 e má alimentação. Alguns fatores de risco relativos importantes incluem:
792 obesidade, má alimentação e nutrição, inatividade, pré-diabetes ou tolerância
793 prejudicada pela glicemia, tabagismo e história pregressa de diabetes com
794 exposição do feto ao diabetes gestacional (MALIK et al., 2010; IMAMURA et
795 al., 2015).
796 Os sintomas do DMII podem ser idênticos às do tipo I, incluindo em
797 particular, aumento da sede, micção frequente, cansaço, feridas de cicatrização
798 lenta, recorrentes infecções e formigamento ou dormência nas mãos e pés.
799 Como resultado, muitas vezes há um longo período para a detecção inicial e
800 isso faz com que boa parte dos casos não sejam diagnosticados porque podem
801 permanecer sem sintomas por muitos anos. E quando descoberto já se está
802 em um quadro avançado de suas complicações (GOYAL; JIALAL, 2022).
45 28
46
803 A fisiopatologia do diabetes seja do tipo I ou II envolve uma participação

804 de múltiplas vias com participação de diversos tecidos (SCHWARTZ et al.,
805 2016). Porém um fator preponderante tanto no estabelecimento quanto no
806 agravamento desse mal é o estresse oxidativo e a inflamação (YARIBEYGI et
807 al., 2020b). E esses fatores somados são os que levam à maioria das
808 complicações do diabetes. As mais frequentes são os distúrbios
809 cardiovasculares, como cardiopatia isquêmica, doença vascular periférica
810 (SCHEFFEL et al., 2004); moléstias renais (principalmente as que afetam os
811 glomérulos) podem levar a nefropatia diabética (SUN et al., 2013); retinopatia e
812 neuropatia (KUZUYA et al., 2002).
813
814 4. ANTIOXIDANTES COMO PERSPECTIVA DE TRATAMENTO
815 Na atualidade existe um crescente interesse na busca por substâncias com
816 propriedades antioxidantes que possam ser fornecidas tanto pela alimentação
817 quanto como produtos farmacêuticos e que possam ser incorporadas como
818 uma parte terapêutica de complemento à saúde humana em diversas doenças
819 (GULCIN, 2020). Nesse panorama, existe também um esforço na exploração
820 de novas estratégias terapêuticas, onde os compostos naturais antioxidativos
821 com menos efeitos colaterais e baixo custo se destacam, para o uso em
822 diversas doenças, inclusive no diabetes mellitus. Visto que essa doença é um
823 problema de saúde pública e muito dos medicamentos atualmente usados têm
824 diversos efeitos colaterais e não conseguem proteger o indivíduo de todas as
825 suas complicações (UNUOFIN; LEBELO, 2020).
826 O estresse oxidativo pode ser definido como um estado de desequilíbrio
827 entre agentes oxidantes (principalmente espécies reativas de oxigênio: ROS) e
828 antioxidantes, ou seja, quando há um excesso de moléculas oxidantes em
829 detrimento de uma defesa antioxidante diminuída ou insuficiente (SIES;
830 BERNDT; JONES, 2017; SIES, 2020).
831 Os antioxidantes são moléculas ou substâncias que atuam retardando,
832 bloqueando ou removendo danos oxidativos, ou seja, essas moléculas agem
833 eliminando de forma direta espécies reativas de oxigênio (ROS) ou regulando
834 indiretamente as vias de defesa antioxidante, inibindo assim a produção de
835 dessas espécies reativas que acontece de forma exagerada, evitando que
836 causem danos a outras moléculas, células ou tecidos (GULCIN, 2020). Existe
47 29
48
837 uma grande diversidade de antioxidantes, tanto naturais (ácido úrico, ácido
838 lipóico, glutationa, melatonina, carotenoides, flavonoide, vitamina C e E entre
839 outros) quanto sintéticos (propil galato, octil galato, hidroxitolueno butilato entre
840 outros) (NEHA et al., 2019). Estudos já demonstraram que essas moléculas
841 têm alto potencial anticâncer (resveratrol e curcumina), anticatarata (β-
842 caratone, luteína, zeaxantina, quercetina), antidiabético (acridina, fenantrolina e
843 alguns polifenóis), anti-inflamatório (derivados do pyrazol, cumarina, ácido
844 lipóico, chalconas), defesa contra distúrbios cardiovasculares (α-tocoferol,
845 ácido ascórbico, β-caroteno), hepatoprotetor (vitamina E, resveratrol, anastatina
846 B), nefroprotetor (propil galato, curcumina, vitamina C), neuroprotetor (fisteína -
847 a, resveratrol) (NEHA et al., 2019).
848 O tratamento antioxidante mesmo sendo bem visto e aprovado por diversos
849 estudos, para outros tantos trabalhos ainda é motivo de controvérsia. Essa
850 ideia é sustentada pela premissa que o estresse oxidativo pode ser participante
851 ativo em diversas doenças, mas a extensão de sua participação é muito
852 variável. Então o aumento indiscriminado da defesa antioxidante pode não ser
853 a resposta terapêutica para algumas dessas. Outras limitações para o avanço
854 dessa terapia é a dificuldade de atingir concentrações significativamente
855 eficientes in vivo e entender que moléculas oxidantes (como moléculas reativas
856 ao oxigênio) são de grande importância para diversas vias de sinalização
857 celular e a sua diminuição pode acarretar no interrompimento de vias
858 importantes para o pleno funcionamento de células e tecidos (FORMAN;
859 ZHANG, 2021).
860 5. MELATONINA E DIABETES

861 A N-acetil-5-metoxitriptamina ou mais comumente conhecida como
862 melatonina é uma indolamina (por ter em sua constituição química um grupo
863 indol). É o principal hormônio sintetizado pela glândula pineal nos vertebrados
864 (AXELROD, 1974; COMMENTZ; HELMKE, 1995). Mas pode também ser
865 produzida por outras estruturas (fontes secundárias de produção) como retina,
866 intestino, pele, plaquetas, medula óssea e provavelmente em outros locais,
867 cuja contribuição sistêmica é mínima (ACUÑA-CASTROVIEJO et al., 2014).
868 Os seus principais efeitos fisiológicos estão relacionados com a duração
869 da escuridão. Nesse contexto sua função é mediar os sinais do ciclo
49 30
50
870 claro/escuro, com possíveis interferências no controle da ritmicidade e

871 sazonalidade circadiana. Porém essa função principal, que é gerada à noite, é
872 interpretada de maneiras diferente em animais noturnos e humanos (POZA et
873 al., 2018).
874 Atualmente está indolamina tem ganhado destaque através da sua
875 capacidade antioxidante protetora para diversas doenças onde o estresse
876 oxidativo é participante patogênico ativo, como no diabetes (RADOGNA;
877 DIEDERICH; GHIBELLI, 2010; REITER et al., 2016b; SHARMA et al., 2015).
878 Segundo Reiter et al. (2003), a ação antioxidante da melatonina parece agir
879 por diferentes vias: 1. Como neutralizador direto de Radicais Livres; 2. Como
880 antioxidante indireto via estimulação de enzimas antioxidantes; 3. Aumentando
881 a eficiência da fosforilação oxidativa mitocondrial e reduzindo o vazamento de
882 elétrons (diminuindo, com isso, a geração de radicais livres); 4. Aumentando a
883 eficiência de outros antioxidantes. Diferentemente de outros antioxidantes
884 bastante lipofílicos, como é o caso da vitamina E, que é inicialmente presa na
885 membrana plasmática, a melatonina passa pelas membranas celulares,
886 alcançando facilmente compartimentos intracelulares, particularmente, a
887 mitocôndria (MARTÍN-HIDALGO et al., 2011). Porém, quando a melatonina
888 passa pelas membranas celulares, ela se localiza, principalmente, em posição
889 superficial nas bicamadas lipídicas, próxima à cabeça polar dos fosfolípideos
890 da membrana. Nessa posição, ela é capaz de funcionar como um “removedor”
891 (scavenger) de radicais livres e também promover meios indiretos pelos quais
892 as membranas podem resistir ao dano oxidativo, estabilizando a fluidez da
893 membrana e preservando sua eficiência (REITER, 2000).
894 Muitos estudos atualmente indicam a suplementação com a melatonina

895 como uma importante alternativa terapêutica para o diabetes, tanto na
896 prevenção de suas complicações quanto na sua patogênese, indicando assim
897 a importância de novos estudos que tragam novas evidências, inclusive sobre
898 seus efeitos protetores na suplementação com esse hormônio no início do
899 diabetes (DIEDERICH; GHIBELLI, 2010; CARPENTIERI et al., 2012;
900 RADOGNA; RICARDO et al., 2013; SHE; LAUDON; YIN, 2014).
901 O tratamento com a mesma mostrou ainda, a capacidade de diminuir os

902 níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS: um indicador
51 31
52
903 dos níveis de moléculas oxidantes) e aumentar os níveis de glutationa reduzida

904 (um antioxidante) no testículo de ratos diabéticos induzidos por
905 estreptozotocina (ALVES et al., 2020). Ademais, esse hormônio mostrou
906 eficiência na redução da hiperglicemia, hiperlipidemia e na redução dos níveis
907 de TNF-α, IL-6 e IL-1 (moléculas pró-inflamatórias) suprimindo assim parte da
908 inflamação tanto em modelos diabéticos humanos (NISHIDA, 2005) quanto em
909 animais (DE MELO et al., 2020).
910 6. QUERCETINA E DIABETES

911 Um dos bem mais descritos antioxidantes dos grupos dos flavonoides, a
912 quercetina, é um flavonol (subclassificação dentro do grupo dos flavonoides,
913 outros participantes desse grupo são rutina e kaempferol) (PANCHE; DIWAN;
914 CHANDRA, 2016). Seu nome tem origem da palavra quercetum, que significa
915 floresta de cavalos, e seu nome tem sido usado desde de 1857 (LI et al., 2016).
916 Pode ser encontrada naturalmente em cebola, couve, maça, aspargos, alface,
917 tomate e entre outras frutas e legumes (PANCHE; DIWAN; CHANDRA, 2016).
918 As investigações acerca de sua natureza química demonstram que essa
919 molécula apresenta quatro grupos hidroxila no anel benzo-dihidropirano, e isso
920 lhe confere uma forte capacidade antioxidante de eliminador de radicais livres,
921 o que pode favorecer com que esse equilíbrio de moléculas oxidantes e
922 antioxidantes seja estabelecido (YANG et al., 2020)
923 A atenção da ciência na modernidade está voltada para moléculas bioativas
924 naturais e muitas delas tem ganhado destaque com suas utilidades
925 terapêuticas singulares, e essa qualidade se aplica bem a quercetina, tendo
926 suas múltiplas qualidades clínicas e eficácia, aprovadas e demonstradas por
927 diversos estudos (SALEHI et al., 2020).
928 Essa molécula tem ganhado notoriedade quanto a sua capacidade para
929 tratar diversas doenças. HE et al. (2017) demonstraram que a quercetina
930 possui uma capacidade de regular a atividade autofágica de células, isso
931 aponta que essa molécula pode ser um ótimo candidato para tratamentos de
932 doenças onde a autofagia é um agente preponderante para sua ocorrência e
933 desenvolvimento. Esse flavonol, segundo (SALEHI et al., 2020), age por
934 diversos mecanismos para tratar o diabetes, muitos mediados pelo seu alto
935 potencial antioxidativo e anti-inflamatório, entre eles estão elevação da insulina,
53 32
54
936 ativação da síntese de glicogênio, e melhora da sensibilidade à insulina. Além

937 disso, possui efeito estimulador da proliferação de células beta pancreática, o
938 que desencadeia o aumento da secreção da insulina. O mesmo autor
939 supracitado apontou que esse flavonoide atuou mitigando processos de
940 disfunção em órgãos reprodutivos no diabetes (disfunção sexual, testicular e
941 infertilidade), mostrou que possui atividade protetora contra os distúrbios
942 neurodegenerativos, aumentando os índices de fatores neurotróficos e
943 dificultando a apoptose dos neurônios, causadas por essa enfermidade. Ainda
944 possui propriedades contra danos cardiovasculares diabetogênicos, diminuindo
945 pressão arterial (SÁNCHEZ et al., 2006), modulando as vias de ativação de
946 enzimas como angiotensina e bradicinina (HÄCKL et al., 2002), diminui a
947 disfunção endotelial (GANZ; VITA, 2003) e detém a habilidade de
948 vasodilatação (SURI et al., 2010
949
950 7. CONCLUSÃO
951 Mediante aos fatos supramencionados é importante entender que as
952 moléculas antioxidantes estão ganhando notoriedade como perspectiva
953 terapêutica para diversas doenças, e que a melatonina e a quercetina que são
954 duas moléculas com propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias têm
955 ganhado destaque nesse cenário, inclusive como agentes antidiabéticos.
956 Nesse sentido é interessante a produção de mais pesquisas que atestem a
957 seguridade, melhor dosagem e os efeitos, inclusive sinérgicos, dessas duas
958 moléculas associadas como tratamento para o diabetes mellitus, na tentativa
959 de amenizar suas complicações e consequentemente seus impactos na
960 sociedade.
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1110 Synthesis and Metabolism. Molecules, [s. l.], v. 20, n. 10, p. 18886–18906,
1111 2015.
1112 UNUOFIN, J. O.; LEBELO, S. L. Antioxidant Effects and Mechanisms of

1113 Medicinal Plants and Their Bioactive Compounds for the Prevention and
1114 Treatment of Type 2 Diabetes: An Updated Review. Oxidative Medicine and
1115 Cellular Longevity, [s. l.], v. 2020, p. e1356893, 2020.
1116 YANG, D.; WANG, T.; LONG, M.; LI, P. Quercetin: Its Main Pharmacological
1117 Activity and Potential Application in Clinical Medicine. Oxidative Medicine and
1118 Cellular Longevity, [s. l.], v. 2020, p. e8825387, 2020.
1119 YARIBEYGI, H.; SATHYAPALAN, T.; ATKIN, S. L.; SAHEBKAR, A. Molecular

1120 Mechanisms Linking Oxidative Stress and Diabetes Mellitus. Oxidative
1121 Medicine and Cellular Longevity, [s. l.], v. 2020, p. e8609213, 2020. a.

1123 Mechanisms Linking Oxidative Stress and Diabetes Mellitus. Oxidative
1124 Medicine and Cellular Longevity, [s. l.], v. 2020, p. e8609213, 2020. b.
1125
1126
1127
1128
63 37
64
1129
1130
1131 CAPÍTULO II
1132
1133 Melatonina e quercetina: uma perspectiva para o controle das alterações renais em
1134 ratos diabéticos
1135
1
1136 Érique Ricardo Alves; 1Laís Caroline da Silva Santos; 1Ismaela Maria Ferreira de
1137 Melo; 2Leucio Duarte Vieira Filho, 3Valdemiro Amaro da Silva Junior, 1Álvaro Aguiar
1138 Coelho Teixeira; 1*Valéria Wanderley Teixeira
1139
1
1140 Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Morfologia e Fisiologia
1141 Animal, Recife, Brasil
1142 2
Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
1143 Centro de Ciências Biológicas, Recife, Brasil
1144 3
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Medicina Veterinária,
1145 Recife, Brasil
1146
1147 *Autor para correspondência: UFRPE-DMFA. Av. Dom Manoel de Medeiros s/n Dois
1148 Irmãos-Recife-PE-Brazil. CEP 52171-900. Tel. +55 81 33206389
1149 E-mail: valeria.wanderley@ufrpe.br (WANDERLEY-TEIXEIRA V.)
1150
1151 RECIFE
1152 2023
65 38
66
1153 RESUMO
1154 O diabetes mellitus é uma doença crônica ocasionada e caracterizada pela hiperglicemia
1155 e leva a diversas complicações teciduais e sistêmicas. Sabe-se ainda que o estresse
1156 oxidativo está associado com suas complicações. Nesse sentido o presente trabalho
1157 objetivou analisar o efeito do tratamento com quercetina associado ou não com a
1158 melatonina, dois antioxidantes, sobre os rins de ratos diabéticos. Para isso foram usados
1159 90 ratos machos divididos nos seguintes grupos: Grupo I (Controle): ratos sem indução
1160 ao diabetes; Grupo II: ratos diabéticos (GD); Grupo III: ratos diabéticos tratados com
1161 insulina (GDI); Grupo IV: ratos diabéticos tratados com melatonina (GDM); Grupo V:
1162 ratos diabéticos tratados com quercetina (GDQ); Grupo VI: ratos diabéticos tratados
1163 com melatonina e quercetina (GDMQ). O diabetes foi induzido através da
1164 estreptozotocina (60 mg/kg). A melatonina foi administrada por 30 dias após a indução
1165 do diabetes (10 mg/kg). A quercetina foi administrada também por 30 dias após a
1166 indução do diabetes (40 mg/kg). Os animais ao final do experimento foram anestesiados
1167 e eutanasiados, os órgãos foram coletados e o sangue foi centrifugado e o soro guardado
1168 para análise (medição da creatinina e ureia). Também foi analisado o estresse oxidativo
1169 tecidual para avaliar peroxidação lipídica (TBRAS) e glutationa reduzida (GSH). Além
1170 de fazer analises imunohistoquímicas (IL-6, TNF-α e apoptose). Os resultados
1171 demonstraram que os tratamentos só com melatonina e melatonina + quercetina foram
1172 os mais efetivos em diminuir os níveis glicêmicos, proteger os animais contra a perda de
1173 peso corporal e renal, além de diminuir o estresse oxidativo e evitar alterações
1174 patológicas severas nos rins, bem como proteger o tecido renal. Ademais estabilizou os
1175 níveis séricos de creatinina e ureia, alterados pelo diabetes e protegeram contra o
1176 aumento da apoptose e de interleucinas inflamatórias. O tratamento só com quercetina
1177 demonstrou uma leve ou moderada efetividade nos parâmetros supramencionados.
1178 Nesse sentido conclui-se que os tratamentos mais promissores na proteção contra
1179 complicações renais diabéticas, foram os tratamentos só com melatonina ou sua
1180 associação com quercetina.
1181
1182 PALAVRAS-CHAVE: hiperglicemia, pineal, flavonoides, inflamação, estresse
1183 oxidativo, ratos.
1184
1185
1186
1187
1188
1189
1190
1191
67 39
68
1192 ABSTRACT
1193 Diabetes mellitus is a chronic disease caused and characterized by hyperglycemia and
1194 leads to several tissue and systemic complications. It is also known that oxidative stress
1195 is associated with its complications. In this sense, the present work aimed to analyze the
1196 effect of treatment with quercetin associated or not with melatonin, two antioxidants, on
1197 the kidneys of diabetic rats. For this, 90 male rats divided into the following groups
1198 were used: Group I (Control): rats without diabetes induction; Group II: diabetic rats
1199 (GD); Group III: diabetic rats treated with insulin (GDI); Group IV: diabetic rats treated
1200 with melatonin (GDM); Group V: diabetic rats treated with quercetin (GDQ); Group
1201 VI: diabetic rats treated with melatonin and quercetin (GDMQ). Diabetes was induced
1202 by streptozotocin (60 mg/kg). Melatonin was administered for 30 days after diabetes
1203 induction (10 mg/kg). Quercetin was also administered for 30 days after diabetes
1204 induction (40 mg/kg). At the end of the experiment, the animals were anesthetized and
1205 euthanized, the organs were collected and the blood was centrifuged and the serum
1206 saved for analysis (measurement of creatinine and urea). Tissue oxidative stress was
1207 also analyzed to assess lipid peroxidation (TBRAS) and reduced glutathione (GSH). In
1208 addition to performing immunohistochemical analyzes (IL-6, TNF-α and apoptosis).
1209 The results showed that treatments with melatonin alone and melatonin + quercetin
1210 were the most effective in reducing glycemic levels, protecting animals against body
1211 and kidney weight loss, in addition to reducing oxidative stress and avoiding severe
1212 pathological changes in the kidneys, as well as how to protect kidney tissue. In addition,
1213 it stabilized the serum levels of creatinine and urea, altered by diabetes and protected
1214 against the increase of apoptosis and inflammatory interleukins. Treatment with
1215 quercetin alone showed mild or moderate effectiveness in the aforementioned
1216 parameters. In this sense, it is concluded that the most promising treatments in terms of
1217 protection against diabetic renal complications were treatments with melatonin alone or
1218 its association with quercetin.
1219
1220 KEYWORDS: hyperglycemia, pineal, flavonoids, inflammation, oxidative stress, rats.
1221
1222
1223
1224
1225
1226
1227
1228
1229
1230
1231
69 40
70
1232 Introdução
1233 Diabetes Mellitus (DM) é um grupo de distúrbios metabólicos de natureza
1234 crônica, ocasionado pelo estabelecimento de um estado hiperglicêmico no organismo,
1235 afetando assim todos os sistemas (HARREITER; RODEN, 2019b). Nessa desordem, o
1236 pâncreas não produz insulina ou a produzida é ineficaz ou não é reconhecida pelo
1237 organismo (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2020; OGURTSOVA et al.,
1238 2022). Estima-se que haja mais de 537 milhões de pessoas com diabetes no mundo,
1239 destes 15,7 milhões estão no Brasil, nesse ínterim o Brasil ocupa a 6º posição no rank
1240 mundial de países com mais pessoas diabéticas. Torna-se notório também que os gastos
1241 públicos com esse mal são exorbitantes, só no território brasileiro foram gatos US$ 42,9
1242 bilhões em saúde, com essa doença (INTERNATIONAL DIABETES FEDERETION,
1243 2021).
1244 Essa doença causa diversas complicações como retinopatia, neuropatia,
1245 distúrbios cardiovasculares e hepáticos, poliúria, polidipsia, fadiga, perda de peso
1246 inexplicável, suscetibilidade a infecções, cetoacidose, síndrome hiperosmolar com risco
1247 de coma (HARREITER; RODEN, 2019b).
1248 A diabetes afeta também diretamente os rins, sabe-se que pessoas diabéticas têm
1249 uma maior propensão em desenvolver complicações renais, inclusive com evolução
1250 para a doença renal terminal, o que também pode acarretar em maior risco de morbidade
1251 cardiovascular e mortalidade por todas as outras causas (SHEN et al., 2017). Nessa
1252 doença existem lesões histopatológicas bem evidenciadas como espessamento da
1253 membrana, expansão das células mesangiais, gloméruloesclerose, hipertrofia e
1254 proliferação celular, todos esses achados como indicação de lesão renal
1255 (POURGHASEM; SHAFI; BABAZADEH, 2015). Citocinas pró-inflamatórias como

71 41
72
1256 IL-1, IL-6, IL18 e TNF-α, também estão envolvidas como marcadores de inflamação
1257 (AMORIM et al., 2019). Inclusive o diagnóstico de lesão renal pode ser confirmado
1258 através dos níveis de albumina e creatinina séricos (HAHR; MOLITCH, 2015).
1259 Atualmente acredita-se que o estresse oxidativo tenha papel determinante na
1260 patogênese das complicações diabéticas (YARIBEYGI et al., 2020). Esse processo se
1261 caracteriza por um estado de desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de
1262 oxigênio (ROS) e a capacidade antioxidante endógena (SIES, 2020).
1263 A melatonina é uma indolamina produzida pela glândula pineal (COMMENTZ;
1264 HELMKE, 1995). Mas pode também ser produzida por outros órgãos (ACUÑA-
1265 CASTROVIEJO et al., 2014). Possui diversas funções entre as quais estão:
1266 determinante do ciclo sono-vigília, da atividade reprodutora e metabólica de diversas
1267 espécies (POZA et al., 2018). E já é notório que essa indolamina possui atividade
1268 antioxidante (REITER et al., 2016b).
1269 A quercetina é uma biomolécula da classe dos flavonoides (moléculas de origem
1270 natural, mais encontrada em plantas e não é sintetizada pelos humanos) (PANCHE;
1271 DIWAN; CHANDRA, 2016) que já possui comprovadamente alta capacidade
1272 antioxidante (ELBE et al., 2015) e hiperglicemiante, anti-inflamatória, antiapoptótica,
1273 anticancerígena (NEHA et al., 2019). E já está sendo utilizada para amenizar algumas
1274 complicações diabéticas (SALEHI et al., 2020).
1275 Além disso, já é notório que a inflamação e estresse oxidativo participam da
1276 patogênese dessa doença (REIS et al., 2012). Levando-se em consideração que
1277 atualmente se tem buscado alternativas naturais de tratamento (SILVA, 2012), e que
1278 tratamentos associativos de moléculas antioxidantes naturais têm demonstrado efeitos
1279 promissores em diversas doenças (YANG; KANG, 2018; ZANONI et al., 2015), torna-
73 42
74
1280 se pertinente investiga a ação da melatonina associada ou não a quercetina sobre os rins,
1281 de ratos diabéticos, como um possível tratamento alternativo para esse mal que atinge
1282 boa parte da população mundial.
1283 Materiais e Método
1284 Animais
1285 Foram utilizados 60 ratos albinos da linhagem wistar, com 70 dias de idade e peso
1286 aproximadamente de 250 ± 30g, provenientes do Biotério do Departamento de
1287 Morfologia e Fisiologia Animal (DMFA) da Universidade Federal Rural de
1288 Pernambuco (UFRPE), mantidos em ambiente com temperatura (22 ± 1ºC) e
1289 fotoperíodo (12 h claro e 12 h escuro) controlados e em regime de alimentação e
1290 ingestão de água ad libitum. O protocolo experimental foi submetido e aprovado pelo
1291 Comitê de Ética nº: 130/2019.
1292 Grupos Experimentais
1293 Os animais foram divididos de forma aleatória nos seguintes grupos: Grupo I
1294 (Controle): ratos sem indução ao diabetes; Grupo II: ratos induzidos ao diabetes (GD);
1295 Grupo III: ratos induzidos ao diabetes e tratados com insulina (GDI); Grupo IV: ratos
1296 induzidos ao diabetes e tratado com melatonina (GDM); Grupo V: ratos induzidos ao
1297 diabetes e tratados com quercetina (GDQ); Grupo VI: ratos induzidos ao diabetes e
1298 tratados com melatonina e quercetina (GDQM).
1299 Indução do diabetes
1300 O diabetes foi induzido pela administração intraperitoneal de solução de
1301 estreptozotocina (Sigma Chemical Co., USA) após jejum alimentar de 14 horas e
1302 confirmado no quinto dia após a aplicação. A estreptozotocina foi diluída em tampão
1303 citrato de sódio a 10 mM e pH 4,5, na dosagem única de 60 mg/kg de peso do animal.

75 43
76
1304 Os animais não diabéticos (grupo controle) receberam da mesma forma, doses
1305 equivalentes de solução salina e decorridos 30 minutos da administração da
1306 estreptozotocina todos os animais foram alimentados normalmente (DALL’AGO et al.,
1307 2002). Foram incluídos no estudo apenas animais que apresentaram glicose sanguínea
1308 acima de 200 mg/dL (confirmados através do Glicosímetro Kit Accu-Chek Activ),
1309 exceto o grupo controle. Todos os tratamentos começaram no dia que os animais foram
1310 confirmados com diabetes.
1311 Tratamento com melatonina
1312 A melatonina, N-acetil-5-metoxitriptamina (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)
1313 foi administrada em injeções diárias, por 30 dias, via intraperitoneal e sempre no
1314 período das 18:00 às 19:00h, de 10 mg/Kg, esta foi dissolvida em 0,2 mL de etanol e
1315 diluída em 0,9 mL NaCl a 0,9%.
1316 Tratamento com quercetina
1317 O flavonoide quercetina (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) foi dissolvido
1318 em uma solução de água destilada em concentração de 2% de dimetilsulfóxido (DMSO)
1319 (AN et al., 2010), posteriormente essa solução foi homogeneizada no vórtex e em
1320 seguida foi administrada por via intragástrica por 30 dias. Os animais do grupo controle
1321 receberam só a solução com DMSO. A dosagem de 40 mg/kg foi escolhida por que
1322 simula a ingestão diária humana deste flavonoide (SU et al., 2002, 2003; SU; GUO;
1323 WEI, 2002).
1324 Administração da Insulina
1325 A insulina foi administrada por via subcutânea durante 30 dias, na dose de 5
1326 U/dia, sendo duas unidades de insulina às 10 h e três unidades restantes às 19 h
1327 (PINHEIRO; DE MELO; ANDREAZZI, 2011).
1328 Níveis Glicêmicos

77 44
78
1329 A glicemia dos animais foi monitorada durante o período experimental, sendo
1330 medida com o auxílio de um Glicosímetro Kit Accu-Chek Activ, nos momentos antes
1331 da indução, confirmação do diabetes (cinco dias após a indução), 10, 20 e 30 dias dos
1332 tratamentos com insulina, melatonina e quercetina.
1333 Análise da peroxidação lipídica (TBARS) e glutationa reduzida (GSH)
1334 O estresse oxidativo foi estimado pela avaliação da peroxidação lipídica (TBARS)
1335 e níveis de glutationa reduzida (GSH) nos rins dos animais. O tecido renal foi macerado
1336 em solução de KCl 150 mM e 3 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (1g de
1337 tecido: 5mL). A peroxidação lipídica foi avaliada pelo método de (OHKAWA;
1338 OHISHI; YAGI, 1979), para medição de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico no
1339 homogenato, tendo a curva padrão desenhada utilizando 1,1,3,3-tetraetoxi-propano
1340 (TEP) e a absorbância da fase orgânica mensurada a 535 nm (BUEGE; AUST, 1978). Já
1341 os níveis de GSH foram avaliados através da quantificação de grupos sulfidrilas não-
1342 proteicos (SEDLAK; LINDSAY, 1968) no sobrenadante das amostras, que foram
1343 submetidas à precipitação de proteínas pela adição de ácido tricloroacético. A L-cisteína
1344 foi utilizada para construir a curva padrão do GSH e absorbância foi mensurada a 412
1345 nm. Os níveis de TBARS e GSH foram corrigidos para o teor de proteína, medido pelo
1346 método de Folin-fenol (LOWRY et al., 1951b; VIEIRA et al., 2018; VIEIRA-FILHO et
1347 al., 2009).
1348 Coleta dos órgãos (rins)
1349 Para coleta dos rins os ratos foram anestesiados com hidrocloridrato de cetamina
1350 (80 mg/kg) e xilazina (6,0 mg/kg) por via intramuscular. Após a abertura da cavidade e
1351 a coleta do órgão os animais foram eutanasiados utilizando-se hidrocloridrato de
1352 cetamina (80 mg/kg) e xilazina (6,0 mg/kg) por via intramuscular, associado ao
1353 tiopental (100 mg/kg), via intraperitoneal.

79 45
80
1354 Fragmentos dos rins foram fixados em formol tamponado, permanecendo no
1355 mesmo por 48h. Em seguida foram desidratados em álcool etílico em concentrações
1356 crescentes, diafanizados pelo xilol, impregnados e incluídos em parafina. Os blocos de
1357 parafina foram cortados em micrótomo do tipo Minot (Leica RM 2035) ajustado para
1358 5m. Os cortes assim obtidos foram colocados em lâminas previamente untadas com
1359 albumina de Mayer e mantidos em estufa regulada à temperatura de 37C, durante 24h,
1360 para secagem e colagem. Em sequência, os cortes foram submetidos à técnica de
1361 coloração pela hematoxilina e eosina (H.E.) e analisados e fotografados em microscópio
1362 de luz, da marca OLYMPUS BX-49 e OLYMPUS BX-50 respectivamente.
1363 Análise Morfométrica dos Rins.
1364 Para a análise morfométrica dos rins, foram utilizadas três lâminas de cada grupo
1365 e analisados dez glomérulos em cada lâmina. As medidas foram restritas aos glomérulos
1366 que demonstraram, num único corte, os pólos vascular e urinário. Essa disposição
1367 indica a secção coincidente com a região equatorial do glomérulo. Para as mensurações
1368 foram utilizados os glomérulos selecionados ao acaso. A captura da imagem foi
1369 efetuada através de câmera de Vídeo Sony®, acoplada ao microscópio Olympus® Bx50.
1370 A morfometria foi realizada através de aplicativo Morfometria de Linhas, calibrado em
1371 micrômetros, associado ao programa Optimas® 6.2 para Windows. Para a obtenção da
1372 área glomerular o cursor foi posicionado na área central do glomérulo, estabelecendo-
1373 se, a partir daí, uma linha circular externa, coincidente com os limites do tufo
1374 glomerular. Para mensuração da cápsula de Bowman foi adotado a mesma metodologia
1375 (AKAOKA; WHITE; RAAFAT, 1994). O volume glomerular e da cápsula de Bowman,
1376 foi calculado de acordo com os critérios preconizados por Pagtalunan, Drachman e
1377 Meyer (2000). Para essa estimativa, utilizou-se a equação 4/3πr3, destinada ao cálculo
1378 do volume da esfera, na qual “r” representa o raio.

81 46
82
1379
1380
1381 Análise Bioquímica
1382 As amostras foram coletadas nos períodos de 10 e 30 dias após os tratamentos.
1383 Para isso, os ratos foram imobilizados em contensor mecânico e o sangue coletado por
1384 punção da veia caudal lateral com uso de cateter (24G) (PEREIRA, 2001). Após
1385 centrifugação refrigerada, o plasma foi acondicionado em microtubo eppendorf, em
1386 duplicata, e congelado a -20°C até o momento das dosagens (COELHO TEIXEIRA et
1387 al., 2004). Para a creatinina o protocolo seguiu duas etapas: a primeira consiste na
1388 desproteinização, onde ocorre a agitação e centrifugação, durante 5 minutos. A segunda
1389 etapa é a colorimetria ocorrendo à homogeneização das amostras e deixando em
1390 repouso em temperatura ambiente durante 7 minutos. A leitura das absorbâncias foi
1391 feita em 520 nm. Os cálculos seguiram o protocolo do fabricante. Já para a ureia foi
1392 feita uma mistura por agitação e incubação das amostras por 5 minutos no banho maria
1393 a 37ºC. A leitura das absorbâncias em espectrofotômetro ajustado para 600 nm. Para o
1394 cálculo dos resultados, utiliza-se curva de calibração que acompanha o kit.
1395 Analise Imunihistoquímica ( IL-6 e TNF-α) e Teste de Tunel (Apoptose)
1396 Para análise imunohistoquímica, as lâminas silanizadas foram desparafinizadas e
1397 reidratadas em xilol e álcool respectivamente. A recuperação antigênica foi realizada
1398 através de uma solução de tampão citrato (pH 6.0) em alta temperatura no micro-ondas
1399 por 5 minutos. A peroxidase endógena foi inibida através de uma solução de peróxido
1400 de hidrogênio (3%) em metanol. A reação antígeno-anticorpo inespecífica foi bloqueada
1401 através da incubação das lâminas em PBS e albumina sérica bovina (BSA) 5% durante
1402 uma hora. Todos os anticorpos (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EUA)
1403 foram diluídos em PBS/BSA 1% por uma hora. Subsequentemente, as lâminas foram
83 47
84
1404 tratadas com o anticorpo secundário, o histofine, por trinta minutos. A reação antígeno-
1405 anticorpo foi observada através de um precipitado marrom após aplicação de 3,3
1406 diaminobenzidina por quatro minutos e contra corados com hematoxilina. As imagens
1407 foram capturadas por meio de câmera de Vídeo Sony ®, acoplada ao microscópio
1408 Olympus® Bx50, as quais foram submetidas ao aplicativo Gimp 2.0 para a quantificação
1409 por meio de Histograma RGB (Red-Green-Blue) (OBERHOLZER et al., 1996; LEE et
1410 al., 2001).
1411 Foi utilizado o método de TUNEL como indicador de apoptose. Os cortes foram
1412 inicialmente desparafinizados e hidratados e, logo em seguida incubados em PBS por 5
1413 minutos em temperatura ambiente. Após, a proteinase K foi aplicada sobre as lâminas
1414 por 15 minutos. As lâminas foram lavadas em água destilada e incubadas em peróxido
1415 de hidrogênio por 5 minutos. Os cortes foram lavados em PBS e incubados em tampão
1416 equilíbrio por 60 minutos a 4°C, depois os cortes seguiram para incubação com TdT a
1417 37°C por uma hora em câmara úmida. Foi aplicada a solução stop por 10 minutos,
1418 depois foram lavadas em PBS e incubadas em anti-digoxigenina. Em seguida foram
1419 enxaguadas em no tampão, e os cortes foram revelados com substrato cromogênico
1420 diaminobenzidina por 20 minutos, posteriormente foram contracorados com
1421 hematoxilina. Após isso, foram desidratados e colocados em xilol e foram montados. O
1422 índice apoptótico foi determinado pela contagem do percentual de células positivas a
1423 partir de pelo menos 500 núcleos subdividido em 10 campos escolhidos de forma
1424 aleatória utilizando-se a objetiva de 40X (Wu et al., 2013)
1425
1426 Análise Estatística
1427 Os dados dos pesos dos animais, índice glicêmico, peso dos rins, níveis de
1428 TBARS e GSH, bioquímica, citocinas inflamatórias e morfometria foram submetidos

85 48
86
1429 a análise de variância, quando significante foi complementada pelo teste de
1430 comparações múltiplas de múltiplas de Tukey e Kramer (P<0,05).
1431
1432 Resultados
1433 Níveis glicêmicos
1434 Os níveis glicêmicos no dia antes da indução do diabetes se apresentaram
1435 semelhantes, portanto, os grupos não diferiram, e todos estavam dentro de uma
1436 normoglicemia. No tempo após a indução somente o grupo controle estava com índices
1437 normoglicêmicos, diferindo de todos os outros grupos, que demonstraram glicemia
1438 acima dos 200 mg/dl, o que confirma o diabetes nesses grupos experimentais. E no
1439 último dia de tratamento o grupo diabético continuou com o maior nível glicêmico, o
1440 grupo GDQ apresentou um índice glicêmico menor e diferiu de todos os outros, já o
1441 grupo GDMQ apresentou uma queda desses níveis ficando um pouco abaixo do grupo
1442 anterior e também diferindo estatisticamente de todos os outros grupos. Porém os
1443 grupos que apresentaram os menores índices glicêmicos e semelhantes entre si foram os
1444 grupos GC, GDI e GDM (figura 1).

87 49
88
1445
1446 Figura 1. Níveis glicêmicos (mg/dL). GC-grupo controle; GD- grupo diabético; GDI-
1447 grupo diabético tratado com insulina; GDM- grupo diabético tratado com melatonina;
1448 GDQ- grupo diabético tratado com quercetina; GDQM- grupo diabético tratado com
1450 significativamente entre si pelo teste de comparações múltiplas de Tukey e Kramer
1451 (p>0.05).
1452
1453 Pesos corporais e peso dos rins
1454 Nos pesos corporais se demonstrou no dia antes do tratamento que todos os
1455 grupos apresentaram valores semelhantes, portanto não houve diferença estatística entre
1456 nenhum dos grupos (Figura 2A). Já no último dia de tratamento (figura 2B) o grupo GD
1457 e GDQ não diferiram entre si, no entanto diferiram de todos os outros grupos,
1458 apresentando menores pesos. E os restantes dos grupos experimentais se assemelharam
1459 ao grupo controle.

89 50
90
1460
1461
1462 Figura 2. Gráfico dos valores dos pesos corporais dos grupos experimentais (g) do dia
1463 antes do início do tratamento (A) e do último dia de tratamento – 30 dias (B). GC-grupo
1464 controle; GD- grupo diabético; GDI- grupo diabético tratado com insulina; GDM- grupo
1465 diabético tratado com melatonina; GDQ- grupo diabético tratado com quercetina;
1466 GDQM- grupo diabético tratado com quercetina e melatonina. *Médias seguidas pela
1467 mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de múltiplas de Tukey e
1468 Kramer (p>0.05).
1469
1470 A análise do peso renal demonstrou que o grupo diabético (GD) apresentou as
1471 maiores médias de pesos e diferiu de todos os outros grupos. Já os grupos restantes (GC,
1472 GDI, GDM, GDQ, GDQM) se assemelharam estatisticamente entre si (figura 3)
1473
1474
1475
1476
1477
1478
1479
1480
91 51
92
1481
1482 Figura 3. Gráfico dos valores dos pesos dos rins dos animais dos grupos experimentais
1483 (g). GC-grupo controle; GD- grupo diabético; GDI- grupo diabético tratado com
1484 insulina; GDM- grupo diabético tratado com melatonina; GDQ- grupo diabético tratado
1485 com quercetina; GDQM- grupo diabético tratado com quercetina e melatonina. *Médias
1486 seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de
1487 comparações múltiplas de Tukey e Kramer (p>0.05).
1488
1490 Na análise dos níveis de TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico)
1491 um indicador da peroxidação lipídica, o grupo controle (GC) não diferiu
1492 estatisticamente de nenhum outro grupo, exceto do diabético, que apresentou os maiores
1493 níveis dessa substância e diferiu de todos os outros grupos (figura 4).
93 52
94
1494
1495 Figura 4. Gráfico dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
1496 renal (nm/mg). GC-grupo controle; GD- grupo diabético; GDI- grupo diabético tratado
1497 com insulina; GDM- grupo diabético tratado com melatonina; GDQ- grupo diabético
1498 tratado com quercetina; GDQM- grupo diabético tratado com quercetina e melatonina.
1499 *Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de
1500 comparações múltiplas de Tukey e Kramer (p>0.05).
1501
1502 Nos níveis de GSH (glutationa reduzida) tornou-se evidente que o grupo que
1503 possui o maior nível dessa substância é o GDM, que diferiu estatisticamente de todos os
1504 outros. Os grupos GC, GDI e GDMQ, se assemelharam estatisticamente entre si, com
1505 níveis moderados dessa substância, no entanto o grupo GDQ teve valores menores de
1506 GSH em ralação ao grupo anterior e diferiu de todos os grupos. Já o grupo diabético
1507 (GD) teve as menores taxas dessa molécula (figura 5).

95 53
96
1508
1509 Figura 5. Gráfico dos níveis de glutationa reduzida (GSH) renal (nm/mg). GC-grupo
1510 controle; GD- grupo diabético; GDI- grupo diabético tratado com insulina; GDM- grupo
1511 diabético tratado com melatonina; GDQ- grupo diabético tratado com quercetina;
1512 GDQM- grupo diabético tratado com quercetina e melatonina. *Médias seguidas pela
1513 mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de comparações múltiplas
1514 de Tukey e Kramer (p>0.05).
1515
1516
1517 Histopatologia Renal
1518 Os resultados da averiguação histopatológica demonstram os seguintes achados:
1519 Congestão vascular (seta fina – figura 6D), congestão glomerular (ponta de seta
1520 vermelha – figura 7A), atrofia glomerular (asterisco – figura 6D), degeneração vacuolar
1521 tubular (estrela – figura 6C), descamação apical celular (ponta de seta preta – figura 6F).
1522 Os achados foram os mesmos em quase todos os grupos, o que diferenciou foi à
1523 frequência e extensão da lesão, que define o grau de severidade. O grupo controle (GC)
1524 demonstrou todos os componentes estruturais como corpúsculo renal e túbulos renais na
1525 cortical (figura 6A) e medular (figura 6B) e seus túbulos tudo dentro da normalidade. O
1526 grupo diabético (GD) apresentou todas as lesões supracitadas de forma severa e
97 54
98
1527 extensiva. O grupo GDI apresentou atrofia glomerular (leve) e congestão glomerular,
1528 congestão vascular, degeneração vacuolar de forma moderada (figura 7A). O grupo
1529 GDM apresentou uma moderada descamação apical (figura 7B), além de atrofia
1530 glomerular, e degeneração vacuolar leve. Já o grupo GDQ demonstrou uma
1531 degeneração vacuolar de severa/moderada (figura 7C). Ademais houve a presença de
1532 descamação apical leve e pontual. O grupo GDMQ apresentou apenas uma atrofia
1533 glomerular leve (figura 7D).
1534
1535
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1538
99 55
100
1539
1540 Figura 6. Histopalogia renal. Notar em A e B grupo controle, camada cortical (c),
1541 medular (m) e um glomérulo renal (ponta de seta azul). C, D, E e F – grupo GD.
1542 Legenda das alterações: degeneração vacuolar (estrela), atrofia glomerular (asterisco),
1543 congestão vascular (seta fina) e descamação apical (ponta de seta preta)
1544
101 56
102
1545
1546 Figura 7. Histopalogia renal. Notar em A– grupo GDI; B- grupo GDM; C- grupo GDQ;
1547 D- grupo GDQM. Legenda das alterações: degeneração vacuolar (estrela), atrofia
1548 glomerular (asterisco), congestão vascular (seta fina) e descamação apical (ponta de seta
1549 preta) e congestão glomerular (seta vermelha).
1550
1551 Morfometria Renal
1552 Para a morfometria renal o grupo diabético (GD) foi o único a diferir de forma
1553 significativa do restante dos grupos experimentais, apresentando assim as maiores
1554 médias para diâmetro glomerular, volume glomerular, diâmetro da cápsula de Bowman
1555 e volume da cápsula de Bowman. Portanto os grupos com os tratamentos experimentais
1556 (GDI, GDM, GDQ, GDMQ) se assemelharam estatisticamente com o grupo controle
1557 (tabela 1).
1558
103 57
104
1559Tabela 1. Média ± desvio padrão do diâmetro do glomerular (DG), volume do glomérulo

1560(VG) e diâmetro (DCB) e volume (VCB) da cápsula de Bowman dos rins dos animais dos
1561grupos experimentais.
1562
Grupos DG (µm) VG (µm3) DCB (µm) VCB (µm3)
GC 86,90 ± 3,41b 277,70 ± 15,02b 113,57 ± 4,11b 281,68 ± 10,55b
374,45 ± 7,52a
GD 101,40 ± 3,04a 356,90 ± 14,63a 170,11 ± 10,30a
304,70 ± 17,55b
GDI 91,60 ± 3,49b 284,31 ± 14,48b 120,68 ± 9,55b
305,41 ± 13,59b
GDM 96,14 ± 3,22b 290,34 ± 6,96b 114,94 ± 3,03b
278,51 ± 12,52b 115,27 ± 2,38b 295,55 ± 12,21b

GDQ 92,51 ±3,48b
288,39 ± 14,11b 113,72 ± 3,64b 293,10 ± 10,27b

GDQM 96,17 ± 4,96b
P 0,0431 0,0011 0,0068 0,0402

1563 Médias seguidas pelas mesmas letras nas colunas não diferem significativamente entre
1564 si pelo teste de comparações múltiplas de Tukey e Kramer (P0,05).
1565
1566 Análises bioquímicas
1567 Os resultados da análise da bioquímica renal demonstraram que o grupo
1568 diabético foi o único que diferiu estatisticamente de todos os outros grupos,
1569 apresentando as maiores médias tanto para os níveis sanguíneos de ureia quanto para os
1570 níveis sanguíneos de creatinina. Assim sendo, os outros grupos experimentais (GDI,
1571 GDM, GDQ, GDMQ) apresentaram valores significativamente semelhantes ao controle,
1572 fazendo com que nenhum deles diferisse do mesmo (tabela 2).
1573
1574
1575
1576
1577
105 58
106
1578Tabela 2. Média ± desvio padrão do perfil bioquímico renal dos animais dos grupos
1579experimentais aos 10 e 30 dias, após indução do diabetes e respectivos tratamentos
1580
Uréia Creatinina
Grupos\Dias 10 30 10 30
GC 64,90 ± 1,77b 62,35 ± 1,43b 0,53 ± 0,09c 0,53 ± 0,08c
GD 143,23 ± 18,94a 148,90 ± 16,07a 3,54 ± 0,63a 5,18 ± 0,66a
GDI 79,70 ± 13,28b 75,97 ± 10,15b 2,03 ± 0,16b 2,54 ± 0,48b
GDM 68,93 ± 7,95b 65,86± 3,20b 0,63 ± 0,08c 0,78 ± 0,50c
GDQ 61,03 ± 8,63b 63,73 ± 5,16b 1,80 ± 0,7b 3,34 ± 0,49b
GDQM 88,28 ± 12,69b 66,85 ± 7,56b 0,56 ± 0,10c 1,22 ± 0,32c
P 0,0114 0,0278 0,0201 0,0012

Médias seguidas pelas mesmas letras nas colunas não diferem significativamente entre si
1581
pelo teste de múltiplas de Tukey e Kramer (P0,05).
1582
1583
1584 Analise Imunohistoquímica (IL-6, TNF-α e apoptose)
1585 Na quantificação da interleucina IL-6 foi observado que o grupo que apresentou
1586 os maiores níveis de expressão dessa molécula e diferiu de todos os outros grupos foi o
1587 grupo diabético (GD). Já os grupos GC e GDQ apresentaram-se semelhantes entre si
1588 com índices de expressão dessa interleucina menores que o grupo anterior. No entanto
1589 os grupos GDI, GDM e GDMQ, demonstraram as menores expressões dessa proteína,
1590 não havendo diferença estatística entre esses grupos (figura 8).
1591
1592
1593
1594
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107 59
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1619
G
1620
1621 Figura 8. Fotomicrografias da imunohistoquímica para IL-6 nos rins dos animais dos
1622 grupos experimentais. A – (GC), B (GD), C – (GDI), D (GDM), E – (GDQ) e F –
1623 (GDQM), G – gráfico da quantificação em pixels da marcação positiva em marrom da
1624 IL-6. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si teste de
1625 Comparações Múltiplas de Tukey e Kramer (P>0,05).
1626
109 60
110
1627 A análise imunohistoquímica do TNF-α revelou forte marcação nos rins dos
1628 animais do grupo GD, em relação aos demais, o que foi confirmado pela quantificação
1629 em pixels dessa citocina (figuras 9). Esse mesmo comportamento foi verificado nesse
1630 grupo para a apoptose com aumento expressivo de células TUNEL positivas (figuras 10
1631 e 11).
1632
111 61
112
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1666
1667
1668
1669
1670 G
1671 Figura 9. Fotomicrografias da imunohistoquímica para TNF-α no fígado dos animais
1672 dos grupos experimentais. A – (GC), B (GD), C – (GDI), D (GDM), E – (GDQ) e F –
1673 (GDQM), G – gráfico da quantificação em pixels da marcação positiva em marrom da
1674 TNF-α. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si teste
1675 de Comparações Múltiplas de Tukey e Kramer (P>0,05).
1676
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114
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1707 Figura 10. Fotomicrografias da imunohistoquímica para apoptose nos rins dos animais
1708 dos grupos experimentais. A-B: GC; C-D: GD e E-F: GDI. Notar forte marcação no
1709 grupo GD. Teste de TUNEL.
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G
1738
1739 Figura 11. Fotomicrografias para apoptose (teste de TUNEL) nos rins dos animais dos
1740 grupos experimentais. A-B: GDM; C-D: GDQ e E-F: GDQM. Notar fraca e uniforme
1741 marcação. G – Gráfico do percentual de células TUNEL positivas em marrom. Médias
1742 seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si teste de Comparações
1743 Múltiplas de Tukey e Kramer (P>0,05).
1744
1745
117 64
118
1746 Discussão
1747 Segundo Wan et al. (2013), Eid; Haddad (2017) e Torres-Villarreal et al. (2017)
1748 tanto a melatonina quanto a quercetina podem melhorar à sensibilidade a insulina e o
1749 metabolismo da glicose. Entretanto, em nosso estudo a melatonina isolada
1750 semelhantemente a insulina, reduziu significativamente os níveis glicêmicos. Já a
1751 quercetina isolada ou associada à melatonina apresentou uma leve melhora na
1752 hiperglicemia apenas em relação aos animais diabéticos. Outro ponto a ser destacado é
1753 em relação ao peso corporal, onde o tratamento com a quercetina isolada apresentou
1754 valores similares ao grupo diabético, sem, no entanto, afetar o peso renal. O tratamento
1755 com melatonina isolada ou associada à quercetina mostrou valores similares aos
1756 observados no grupo controle, sugerindo uma ação exclusiva da melatonina tanto na
1757 glicemia como no peso corporal, sem efeitos sinérgicos expressivos, o que talvez esteja
1758 relacionado com o tempo de administração ou dosagem da quercetina. De fato,
1759 pesquisas demonstraram efeitos na redução da glicemia e do peso corporal quando a
1760 quercetina foi aplicada em dosagens variando de 40 e 300 mg/Kg por um período de 45
1761 e 60 dias, respectivamente (BHUTADA et al., 2010; MAHESH et al., 2004).
1762 Vários estudos relataram que a hiperglicemia contribui para o aumento de pró-
1763 oxidantes e deficiência de antioxidantes em animais diabéticos (WEST 2000;
1764 MURAOKA et al., 2002; DIAS et al., 2005; PIWKOWSKA et al., 2011). Consistente
1765 com esses relatos, nossos dados mostraram que o TBARS e GSH foram aumentados e
1766 suprimidos, respectivamente, no grupo diabético, enquanto os tratamentos com
1767 quercetina e melatonina, isoladas ou não, preveniram esses efeitos, com destaque para a
1768 melatonina isolada que mostrou ser mais efetiva no aumento do GSH. Estes
1769 antioxidantes tem ação através da interação direta com radicais de oxigênio e
1770 nitrogênio, neutralizando-os, quanto através na regulação das vias que geram esses
119 65
120
1771 radicais, além de aumentar antioxidantes endógenos (KORKMAZ et al., 2009; REITER
1772 et al., 2003, 2016a; XU et al., 2019). Dessa forma, mesmo a qercetina isolada não
1773 promovendo elevação expressiva do GSH, foi capaz de reduzir o TBARS. Além disso,
1774 sua associação com a melatonina indica ser promissora, pois reduziu o TBARS e
1775 aumentou o GSH a níveis similares aos observados nos tratamentos controle e com
1776 insulina.
1777 O estresse oxidativo é notadamente uns dos principais fatores para o
1778 desencadeamento e agravamento das complicações diabéticas teciduais renais
1779 (DEHDASHTIAN et al., 2018). Nos nossos achados histopatológicos e morfometricos,
1780 houve um aumento no peso dos rins, do diâmetro glomerular, volume glomerular,
1781 diâmetro da cápsula de Bowman e volume da cápsula de Bowman nos animais do grupo
1782 diabético. Os tratamentos com quercetina e melatonina, associadas ou não, promoveram
1783 redução desses danos. Sabe-se que a administração isolada de quercetina e melatonina
1784 tem efeito protetor sobre a histoarquitetura renal em condições diabéticas em estudos in
1785 vitro e in vivo, por reduzir o estresse oxidativo (BABUJANARTHANAM et al., 2011;
1786 ARYA et al., 2014; BASHIR et al., 2014; LIU et al., 2019; AFSAR et al., 2020;
1787 PROMSAN; LUNGKAPHIN 2020; IZAK-SHIRIAN et al., 2022; WANG et al., 2022).
1788 Em nosso estudo foi demonstrado um efeito sinérgico eficaz dessas substancias sobre a
1789 histopatologia renal.
1790 A creatinina e ureia sérica são bons marcadores da função renal, ou seja, quando
1791 existem determinados níveis de lesões renais, há alterações nas concentrações dessas
1792 moléculas (ISLES; PATERSON 1996; CHUTANI; PANDE 2017). Isso se mostrou
1793 evidente onde o grupo diabético foi o único apresentar as maiores taxas dessas
1794 moléculas, o que coaduna com resultados histopatológicos. Os níveis de creatinina e
1795 ureia nos tratamentos quercetina e/ou melatonina apresentaram-se similares aos
121 66
122
1796 observados no controle e no tratamento com insulina. Isto pode está relacionado à
1797 melhora na histopatologia renal promovida por esses tratamentos (HOU et al., 2014;
1798 YANG et al., 2018; YILMAZ et al., 2022), principalmente, quando associados.
1799 A análise imunohistoquímica revelou que os tratamentos com a quercetina,
1800 melatonina associadas ou não reduziram os níveis de IL-6 e TNF-α e o índice
1801 apoptótico. Esses achados podem ser esclarecidos pelo fato da melatonina e quercetina
1802 apresentarem capacidade de inibir a ativação de fatores responsáveis pela gênese da
1803 inflamação NF-κB, COX-2 e p38 MAPK, que estimulam a expressão de citocinas
1804 inflamatórias e desencadeiam a apoptose (DEHDASHTIAN et al., 2018). Nesse ínterim,
1805 a quercetina também já possui na literatura dados que demonstram seu efeito inibidor do
1806 NF-κB (GARDI et al., 2015), o que também explica no nosso estudo as diminuições nos
1807 níveis das citocinas inflamatórias e da apoptose no tratamento com quercetina isolada, o
1808 que fortalece mais uma vez a capacidade de sinergia dessas duas moléculas.
1809
1810 Conclusão
1811 Assim, concluímos que ao analisar os resultados da presente pesquisa fica
1812 evidente que embora a melatonina e quercetina isoladamente auxiliem nas respostas ao
1813 animal diabético. A associação mostrou resultados promissores. Embora a melatonina
1814 isoladamente mostrou-se tão efetiva quanto a sua associação, o mesmo resultado não foi
1815 evidenciado para quercetina que se mostrou melhor quando associada.
1816
1817 Agradecimentos
1818 Agradecemos o apoio do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, e do
1819 Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal da Universidade Federal Rural de
1820 Pernambuco (UFRPE), Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de

123 67
124
1821 Pernambuco (FACEPE) pela concessão da bolsa e por todos o incentivo e
1822 fortalecimento dos cursos de pós-graduações do Estado de Pernambuco, agradeço
1823 também todo apoio do Laboratório de Fisiologia e Farmacologia Renal da Universidade
1824 Federal de Pernambuco (UFPE).
1825
1826 Referências Bibliográficas
1827 ACUÑA-CASTROVIEJO, D.; ESCAMES, G.; VENEGAS, C.; DÍAZ-CASADO, M.

1828 E.; LIMA-CABELLO, E.; LÓPEZ, L. C.; ROSALES-CORRAL, S.; TAN, D.-X.;
1829 REITER, R. J. Extrapineal melatonin: sources, regulation, and potential functions.
1830 Cellular and Molecular Life Sciences, v. 71, n. 16, p. 2997–3025, 2014.
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2057
2058 CAPÍTULO III
2059
2060 Associação de Antioxidantes previne o fígado contra agravos pelo diabetes mellitus
2061 em ratos.
2062
2063
1
2064 Érique Ricardo Alves, 1Ismaela Maria Ferreira de Melo, 1Laís Caroline da Silva Santos,
2065 1
Franscisco de Assis Leite Souza, 2Leucio Duarte Vieira Filho, 1Álvaro Aguiar Coelho
2066 Teixeira; 1*Valéria Wanderley Teixeira
2067
2068 1
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Morfologia e Fisiologia
2069 Animal, Recife, Brasil
2070 2
Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
2071 Centro de Ciências Biológicas, Recife, Brasil
2072
2073 *Autor para correspondência: UFRPE-DMFA. Av. Dom Manoel de Medeiros s/n Dois
2074 Irmãos-Recife-PE-Brazil. CEP 52171-900. Tel. +55 81 33206389
2075 E-mail: valeria.wanderley@ufrpe.br (WANDERLEY-TEIXEIRA V.)
2076
2077
2078
2079
2080 RECIFE
137 74
138
2081 2023
2082 RESUMO
2083 Estima-se que haja mais de 537 milhões de pessoas com diabetes (doença crônica
2084 hiperglicemiante) no mundo, destes 15,7 milhões estão no Brasil. Torna-se notório que
2085 os gastos públicos no território brasileiro foram de US$ 42,9 bilhões com essa doença.
2086 Assim, estratégias para minimizar seus danos são necessários. Nesse sentido o presente
2087 trabalho analisou o efeito do tratamento com quercetina associado ou não com a
2088 melatonina, dois antioxidantes, no tecido hepático de ratos diabéticos. Para isso forma
2089 usados 90 ratos machos divididos nos seguintes grupos: Grupo I (Controle): ratos sem
2090 indução ao diabetes; Grupo II: ratos diabéticos (GD); Grupo III: ratos diabéticos
2091 tratados com insulina (GDI); Grupo IV: ratos diabéticos tratados com melatonina
2092 (GDM); Grupo V: ratos diabéticos tratados com quercetina (GDQ); Grupo VI: ratos
2093 diabéticos tratados com melatonina e quercetina (GDMQ). O diabetes foi induzido
2094 através da estreptozotocina (60 mg/kg). A melatonina foi administrada por 30 dias após
2095 a indução do diabetes (10 mg/kg). A quercetina foi administrada também por 30 dias
2096 após a indução do diabetes (40 mg/kg). Os animais ao final do experimento foram
2097 anestesiados e eutanasiados, o fígado foi coletado e o sangue foi centrifugado e o soro
2098 guardado para analise bioquímica (TGO e TGP). Também foi analisado estresse
2099 oxidativo tecidual para avaliar peroxidação lipídica (TBRAS) e glutationa reduzida
2100 (GSH). Além de serem feitas imunohistoquímicas (IL-6, TNF-α e IL-10). Os resultados
2101 demonstraram que os animais tratados com melatonina e quercetina, tanto juntos quanto
2102 separados diminuíram a hiperglicemia, além de proteger os animais contra a perda de
2103 peso hepática, diminuir o estresse oxidativo e evitar alterações patológicas severas no
2104 fígado. Ademais estabilizou os níveis séricos de TGO e TGP, alterados pelo diabetes e
2105 evitaram o aumento de interleucinas inflamatórias (IL-6 e TNF-α) e redução da IL-10
2106 (interleucina anti-inflamatória). Nesse sentido conclui-se que os tratamentos tanto com
2107 melatonina ou quercetina isolados, quanto os dois em associação, levaram a boas
2108 garantias de proteção contra complicações hepáticas diabéticas.
2109 PALAVRAS-CHAVE: hiperglicemia, flavonoides, indolamina, inflamação, estresse
2110 oxidativo, ratos.
2111
2112
2113
2114
2115
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2118
139 75
140
2119 ABSTRACT
2120 It is estimated that there are more than 537 million people with diabetes (chronic
2121 hyperglycemic disease) in the world, of which 15.7 million are in Brazil. It is clear that
2122 public spending in the Brazilian territory was US$ 42.9 billion with this disease. Thus,
2123 strategies to minimize their damage are needed. In this sense, the present work analyzed
2124 the effect of treatment with quercetin associated or not with melatonin, two
2125 antioxidants, in the hepatic tissue of diabetic rats. For this, 90 male rats were divided
2126 into the following groups: Group I (Control): rats without diabetes induction; Group II:
2127 diabetic rats (GD); Group III: diabetic rats treated with insulin (GDI); Group IV:
2128 diabetic rats treated with melatonin (GDM); Group V: diabetic rats treated with
2129 quercetin (GDQ); Group VI: diabetic rats treated with melatonin and quercetin
2130 (GDMQ). Diabetes was induced by streptozotocin (60 mg/kg). Melatonin was
2131 administered for 30 days after diabetes induction (10 mg/kg). Quercetin was also
2132 administered for 30 days after diabetes induction (40 mg/kg). The animals at the end of
2133 the experiment were anesthetized and euthanized, the liver was collected and the blood
2134 was centrifuged and the serum saved for biochemical analysis. Tissue oxidative stress
2135 was also analyzed to assess lipid peroxidation (TBRAS) and reduced glutathione
2136 (GSH). In addition to immunohistochemistry (IL-6, TNF-α and IL-10). The results
2137 demonstrated that the groups treated with melatonin and quercetin, both together and
2138 separately, decreased hyperglycemia, in addition to protecting the animals against
2139 hepatic weight loss, decreasing oxidative stress and avoiding severe pathological
2140 changes in the liver. Furthermore, it stabilized the serum levels of TGO and TGP,
2141 altered by diabetes and prevented the increase of inflammatory interleukins (IL-6 and
2142 TNF-α) and reduction of IL-10 (anti-inflammatory interleukin). In this sense, it is
2143 concluded that treatments with either melatonin or quercetin alone, or both in
2144 combination, led to good guarantees of protection against diabetic liver complications.
2145
2146 KEYWORDS: hyperglycemia, flavonoids, indolamine, inflammation, oxidative stress,
2147 rats.
2148
2149
2150
2151
2152
2153
2154
2155
2156
141 76
142
2157 Introdução
2158 Caracterizado como um agravo metabólico e de cunho crônico, o diabetes
2159 Mellitus (DM) é um grupo de doenças, onde há o estabelecimento da hiperglicemia, que
2160 afeta todos os sistemas do corpo (EGAN; DINNEEN, 2019; HARREITER; RODEN,
2161 2019a). O pâncreas nessa doença, pode não produzir insulina, ou a insulina sintetizada é
2162 ineficaz ou não é reconhecida pelo próprio organismo (AMERICAN DIABETES
2163 ASSOCIATION, 2020; OGURTSOVA et al., 2022).
2164 Existem estimativas que demonstram que há mais de 537 milhões de pessoas
2165 vivendo com o diabetes no mundo, e que destes 15,7 milhões estejam no Brasil, que
2166 ocupa atualmente o 6º lugar no rank dos países com mais pessoas diabéticas no mundo.
2167 É notório também que os gastos públicos com essa desordem metabólica são
2168 excessivos, chegando a US$ 42,9 de gastos com saúde só no Brasil (ASCHNER et al.,
2169 2021).
2170 Diversas complicações são relatadas advindas dessa doença como retinopatia,
2171 neuropatia, distúrbios cardiovasculares e hepáticos, poliúria, polidipsia, fadiga, perda de
2172 peso inexplicável, suscetibilidade a infecções, cetoacidose, síndrome hiperosmolar com
2173 risco de coma (HARDING et al., 2019).
2174 O fígado é um órgão bastante afetado pelo diabetes, podendo haver diversas
2175 alterações em parâmetros bioquímicos como enzimas hepáticas e colesteróis, além de
2176 diversas modificações estruturais como infiltrado inflamatório, hipertrofia celular,
2177 células de Kupffer ativadas, displasia das vias biliares (SHARMA et al., 2019). Além
2178 dessas, outras alterações são relatadas como consequências do diabetes: degeneração
2179 gordurosa, hepatite, fibrose hepática que levam a morte celular através principalmente
143 77
144
2180 da necrose e aumento da apoptose (BEDI et al., 2019). O caráter inflamatório dos
2181 distúrbios diabéticos causados no fígado também é bem conhecido, acredita-se que a
2182 inflamação está por trás da maioria dos mecanismos das lesões hepáticas no diabetes.
2183 Nesse ínterim, interleucinas inflamatórias, como IL-6, IL-1, TNF-α entre outras, tem
2184 demonstrado papel decisivo na patogênese dessas complicações (WANG; YANG;
2185 LIAO, 2020). Outra citocina, no caso anti-inflamatória, que também tem sido
2186 demonstrada como uma ótima marcadora de progressão e regressão de lesões
2187 inflamatórias, dependendo de sua taxa de expressão no tecido, é a interleucina 10 (IL-
2188 10) (WANG; YANG; LIAO, 2020; WANG et al., 2022).
2189 Existem evidências científicas suficientes demonstrando que o estresse oxidativo
2190 tenha papel determinante na patogênese das complicações diabéticas (YARIBEYGI et
2191 al., 2020). Esse processo se caracteriza por um estado de desequilíbrio entre a produção
2192 de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a capacidade antioxidante endógena (SIES,
2193 2020).
2194 A melatonina é um hormônio sintetizado pela pineal (COMMENTZ; HELMKE,
2195 1995). Mas também pode haver outros tecidos que a produzam em menor escala
2196 (AMARAL; CIPOLLA-NETO, 2018). Possui uma vasta lista de funções naturais como:
2197 determinante do ciclo sono-vigília, da atividade reprodutora e metabólica de diversas
2198 espécies (BHATTACHARYA et al., 2019; REITER et al., 2016a). E possui notoriedade
2199 como uma molécula com alta atividade antioxidante (ZHAO et al., 2019).
2200 A quercetina é uma molécula originariamente natural da classe dos flavonoides
2201 (mais encontrada em plantas e não é sintetizada pelos humanos) (PANCHE; DIWAN;
2202 CHANDRA, 2016) que possui comprovadamente uma boa capacidade antioxidante
145 78
146
2203 (ELBE et al., 2015) e hiperglicemiante, anti-inflamatória e antiapoptótica (NEHA et al.,
2204 2019).
2205 Ademais, já é conhecida a natureza inflamatória, além de que o estresse
2206 oxidativo esteja envolvidos da patogênese dessa doença (WANG et al., 2019). Levando-
2207 se em consideração que exista uma busca por alternativas de tratamentos naturais
2208 (SILVA, 2012), e que tratamentos associativos de moléculas antioxidantes naturais têm
2209 demonstrado efeitos promissores em diversas doenças (YANG; KANG, 2018; ZANONI
2210 et al., 2015), torna-se pertinente investiga a ação da melatonina associada ou não a
2211 quercetina sobre o tecido hepático, de ratos diabéticos, como um possível tratamento
2212 alternativo para esse mal.
2213 Materiais e Método
2214 Animais
2215 Foram utilizados 90 ratos albinos da linhagem wistar, com 70 dias de idade e peso
2216 aproximadamente de 250 ± 30g, provenientes do Biotério do Departamento de
2217 Morfologia e Fisiologia Animal (DMFA) da Universidade Federal Rural de
2218 Pernambuco (UFRPE), mantidos em ambiente com temperatura (22 ± 1ºC) e
2219 fotoperíodo (12 h claro e 12 h escuro) controlados e em regime de alimentação e
2220 ingestão de água ad libitum. O protocolo experimental foi submetido e aprovado pelo
2221 Comitê de Ética nº: 130/2019.
2222 Grupos Experimentais
2223 Os animais foram divididos de forma aleatória nos seguintes grupos: Grupo I
2224 (Controle): ratos sem indução ao diabetes; Grupo II: ratos induzidos ao diabetes (GD);
2225 Grupo III: ratos induzidos ao diabetes e tratados com insulina (GDI); Grupo IV: ratos
2226 induzidos ao diabetes e tratado com melatonina (GDM); Grupo V: ratos induzidos ao
147 79
148
2227 diabetes e tratados com quercetina (GDQ); Grupo VI: ratos induzidos ao diabetes e
2228 tratados com melatonina e quercetina (GDMQ); Grupo VII: ratos induzidos ao diabetes
2229 e tratados com insulina e melatonina (GDMI) ; Grupo VIII: ratos diabéticos e tratados
2230 com insulina e quercetina (GDIQ); Grupo IX: ratos diabéticos e tratados com insulina,
2231 melatonina e quercetina (GDIMQ).
2232 Indução do diabetes
2233 O diabetes foi induzido pela administração intraperitoneal de solução de
2234 estreptozotocina (Sigma Chemical Co., USA) após jejum alimentar de 14 horas e
2235 confirmado no quinto dia após a aplicação. A estreptozotocina foi diluída em tampão
2236 citrato de sódio a 10 mM e pH 4,5, na dosagem única de 60 mg/kg de peso do animal.
2237 Os animais não diabéticos (grupo controle) receberam da mesma forma, doses
2238 equivalentes de solução salina e decorridos 30 minutos da administração da
2239 estreptozotocina todos os animais foram alimentados normalmente (DALL’AGO et al.,
2240 2002). Foram incluídos no estudo apenas animais que apresentaram glicose sanguínea
2241 acima de 200 mg/dL (confirmados através do Glicosímetro Kit Accu-Chek Activ),
2242 exceto o grupo controle. Todos os tratamentos começaram no dia que os animais foram
2243 confirmados com diabetes.
2244 Tratamento com melatonina
2245 A melatonina, N-acetil-5-metoxitriptamina (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)
2246 foi administrada em injeções diárias, por 30 dias, via intraperitoneal e sempre no
2247 período das 18:00 às 19:00h, de 10 mg/Kg, esta foi dissolvida em 0,2 mL de etanol e
2248 diluída em 0,9 mL NaCl a 0,9%.
2249 Tratamento com quercetina
2250 O flavonoide quercetina (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) foi dissolvido
2251 em uma solução de água destilada em concentração de 2% de dimetilsulfóxido (DMSO)

149 80
150
2252 (AN et al., 2010), posteriormente essa solução foi homogeneizada no vórtex e em
2253 seguida foi administrada por via intragástrica por 30 dias. Os animais do grupo controle
2254 receberam só a solução com DMSO. A dosagem de 40 mg/kg foi escolhida por que
2255 simula a ingestão diária humana deste flavonoide (SU et al., 2002, 2003; SU; GUO;
2256 WEI, 2002).
2257
2258 Administração da Insulina
2259 A insulina foi administrada por via subcutânea durante 30 dias, na dose de 5
2260 U/dia, sendo duas unidades de insulina às 10 h e três unidades restantes às 19 h
2261 (PINHEIRO; DE MELO; ANDREAZZI, 2011).
2262 Níveis Glicêmicos
2263 A glicemia dos animais foi monitorada durante o período experimental, sendo
2264 medida com o auxílio de um Glicosímetro Kit Accu-Chek Activ, nos momentos antes
2265 da indução, confirmação do diabetes (cinco dias após a indução), 10, 20 e 30 dias dos
2266 tratamentos com insulina, melatonina e quercetina.
2268 O estresse oxidativo foi estimado pela avaliação da peroxidação lipídica (TBARS)
2269 e níveis de glutationa reduzida (GSH) nos fígados dos animais. O tecido hepático foi
2270 macerado em solução de KCl 150 mM e 3 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)
2271 (1g de tecido: 5mL). A peroxidação lipídica foi avaliada pelo método de Ohkawa;
2272 Ohishi; Yagi (1979) para medição de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico no
2273 homogenato, tendo a curva padrão desenhada utilizando 1,1,3,3-tetraetoxi-propano
2274 (TEP) e a absorbância da fase orgânica mensurada a 535 nm (BUEGE; AUST, 1978). Já
2275 os níveis de GSH foram avaliados através da quantificação de grupos sulfidrilas não-
2276 proteicos (SEDLAK; LINDSAY, 1968), no sobrenadante das amostras, que foram
151 81
152
2277 submetidas à precipitação de proteínas pela adição de ácido tricloroacético. A L-cisteína
2278 foi utilizada para construir a curva padrão do GSH e absorbância foi mensurada a 412
2279 nm. Os níveis de TBARS e GSH foram corrigidos para o teor de proteína, medido pelo
2280 método de Folin-fenol (LOWRY et al., 1951a; VIEIRA et al., 2018; VIEIRA-FILHO et
2281 al., 2009).
2282
2283 Coleta do figado
2284 Para coleta dos fígados os ratos foram anestesiados com hidrocloridrato de
2285 cetamina (80 mg/kg) e xilazina (6,0 mg/kg) por via intramuscular. Após a abertura da
2286 cavidade e a coleta do órgão os animais foram eutanasiados utilizando-se
2287 hidrocloridrato de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (6,0 mg/kg) por via intramuscular,
2288 associado ao tiopental (100 mg/kg), via intraperitoneal.
2289 Fragmentos dos fígados foram fixados em formol tamponado, permanecendo no
2290 mesmo por 48h. Em seguida foram desidratados em álcool etílico em concentrações
2291 crescentes, diafanizados pelo xilol, impregnados e incluídos em parafina. Os blocos de
2292 parafina foram cortados em micrótomo do tipo Minot (Leica RM 2035) ajustado para
2293 5m. Os cortes assim obtidos foram colocados em lâminas previamente untadas com
2294 albumina de Mayer e mantidos em estufa regulada à temperatura de 37C, durante 24h,
2295 para secagem e colagem. Em sequência, os cortes foram submetidos à técnica de
2296 coloração pela hematoxilina e eosina (H.E.) e analisados e fotografados em microscópio
2297 de luz, da marca OLYMPUS BX-49 e OLYMPUS BX-50 respectivamente.
2298 Análise Morfométrica Hepática.
2299 O estudo morfométrico foi realizado segundo a metodologia descrita por
2300 Engelman et al. (2001). Foi determinada por métodos estereológicos, a proporção entre
2301 o parênquima não lobular e lobular do fígado das ratas dos grupos experimentais,
153 82
154
2302 utilizando uma quadrícula com 100 pontos-teste. A contagem foi feita em três lâminas,
2303 de maneira que, foram contados 10 campos utilizando-se a objetiva de 40x, perfazendo
2304 um total de 3.000 pontos por grupo. De maneira semelhante, foram quantificadas as
2305 células de Kupffer em preparações pela hematoxilina-eosina, nas quais se pode
2306 evidenciar o núcleo alongado e característico das células em relação aos núcleos
2307 volumosos e arredondados dos hepatócitos.
2308 Análise Bioquímica
2309 As amostras foram coletadas nos períodos de 10 e 30 dias após os tratamentos.
2310 Para isso, os ratos foram imobilizados em contensor mecânico e o sangue coletado por
2311 punção da veia caudal lateral com uso de cateter (24G) (PEREIRA, 2001). Após
2312 centrifugação refrigerada, o plasma foi acondicionado em microtubo eppendorf, em
2313 duplicata, e congelado a -20°C até o momento das dosagens (COELHO TEIXEIRA et
2314 al., 2004). A função hepática foi determinada pela atividade das transaminases, alanina
2315 aminotransferase (ALT ou TGP), aspartato aminotransferase (AST ou TGO). Para isso
2316 foi adicionado em tubo de vidro o reagente 1 e posteriormente esse tubo foi colocado
2317 em banho maria por 3 minutos em 37 °C, em seguida foi adicionado a amostra e
2318 homogeneizado e seguiu mais vez para o banho maria em 37 °C por 30 minutos. Depois
2319 adicionou-se o reagente 2 e mais uma vez foi homogeneizado e ficou em temperatura
2320 ambiente por 20 minutos, a etapa final consistiu em adicionar o reagente de trabalho e
2321 agitar no vórtex e seguiu para a leitura da absorbância no espectrofotômetro em 505 nm.
2322 Para o cálculo dos resultados, utiliza-se curva de calibração que acompanha o kit. Os
2323 procedimentos foram iguais para a leitura tanto do TGO quanto do TGP, porém com
2324 kits diferentes.
2325 Analise Imunohistoquímica (IL-6, IL-10 e TNF-α)

155 83
156
2326 Para análise imunohistoquímica, as lâminas silanizadas foram desparafinizadas e
2327 reidratadas em xilol e álcool respectivamente. A recuperação antigênica foi realizada
2328 através de uma solução de tampão citrato (pH 6.0) em alta temperatura no micro-ondas
2329 por 5 minutos. A peroxidase endógena foi inibida através de uma solução de peróxido
2330 de hidrogênio (3%) em metanol. A reação antígeno-anticorpo inespecífica foi bloqueada
2331 através da incubação das lâminas em PBS e albumina sérica bovina (BSA) 5% durante
2332 uma hora. Todos os anticorpos (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EUA)
2333 foram diluídos em PBS/BSA 1% por uma hora. Subsequentemente, as lâminas foram
2334 tratadas com o anticorpo secundário, o histofine, por trinta minutos. A reação antígeno-
2335 anticorpo foi observada através de um precipitado marrom após aplicação de 3,3
2336 diaminobenzidina por quatro minutos e contra corados com hematoxilina. As imagens
2337 foram capturadas por meio de câmera de Vídeo Sony ®, acoplada ao microscópio
2338 Olympus® Bx50, as quais foram submetidas ao aplicativo Gimp 2.0 para a quantificação
2339 por meio de Histograma RGB (Red-Green-Blue) (LEE et al., 2001; OBERHOLZER et
2340 al., 1996).
2341 Análise Estatística
2342 Os dados do índice glicêmico, peso dos órgãos, os níveis de TBARS e GSH
2343 (estresse oxidativo), análise bioquímica e morfométrica, bem como a análise
2344 imunohistoquímica foram submetidos análise de variância, quando significante foi
2345 complementada pelo teste de comparações múltiplas de múltiplas de Tukey e Kramer
2346 (P<0,05).
2347 Resultados
2348 Níveis glicêmicos
2349 Os níveis glicêmicos no dia antes da indução do diabetes se apresentaram
2350 semelhantes, portanto, os grupos não diferiram, e todos estavam dentro de uma
157 84
158
2351 normoglicemia. No tempo após a indução somente o grupo controle estava com índices
2352 normoglicêmicos, diferindo de todos os outros grupos, que demonstraram glicemia
2353 acima dos 200 mg/dl, o que confirma o diabetes nesses grupos experimentais. E no
2354 último dia de tratamento o grupo diabético continuou com o maior nível glicêmico, o
2355 grupo GDQ apresentou um índice glicêmico menor e diferiu de todos os outros, já o
2356 grupo GDMQ apresentou uma queda desses níveis ficando um pouco abaixo do grupo
2357 anterior e também diferindo estatisticamente de todos os outros grupos. Porém os
2358 grupos que apresentaram os menores índices glicêmicos e semelhantes entre si foram os
2359 grupos GC, GDI e GDM (figura 1).
2360
2361
159 85
160
2362 Figura 1. Níveis glicêmicos (mg/dL). GC-grupo controle; GD- grupo diabético; GDI-
2363 grupo diabético tratado com insulina; GDM- grupo diabético tratado com melatonina;
2364 GDQ- grupo diabético tratado com quercetina; GDQM- grupo diabético tratado com
2366 significativamente entre si pelo teste de comparações múltiplas de Tukey e Kramer
2367 (p>0.05).
2368
2369 Pesos dos fígados
2370
2371 A análise do peso hepático mostrou que o grupo diabético (GD) apresentou as
2372 maiores médias de pesos e diferiu de todos os outros grupos. Já os grupos (GC, GDI,
2373 GDM, GDQ, GDQM) se assemelharam estatisticamente entre si (figura 2).
2374
2375
2376 Figura 2. Gráfico dos valores dos pesos dos fígados dos animais dos grupos
2377 experimentais (g). GC-grupo controle; GD- grupo diabético; GDI- grupo diabético
2378 tratado com insulina; GDM- grupo diabético tratado com melatonina; GDQ- grupo
2379 diabético tratado com quercetina; GDQM- grupo diabético tratado com quercetina e
2380 melatonina. *Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si
2381 pelo teste de comparações múltiplas de Tukey e Kramer (p>0.05).
2382
2384
2385 A análise do estresse oxidativo demonstrou no índice da substância reativa ao ácido
2386 tiobarbitúrico (TBARS) que o grupo GD apresentou os maiores níveis dessa substância e
161 86
162
2387 diferiu de todos os outros grupos. Já o restante dos grupos apresentou níveis menores e não
2388 divergiram entre si. Para os níveis de glutationa reduzida (GSH) se evidenciou que os
2389 menores índices foram encontrados no grupo GD, que divergiu estatisticamente de todos os
2390 grupos restantes. Os grupos GC, GDI, GDM, GDQ e GDQM demonstraram níveis mais altos
2391 desse antioxidante, e se assemelharam estatisticamente entre si (figura 3).
2392 Figur
2393 a 3. Gráfico dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) glutationa
2394 reduzida (GSH) renais (nmol/mg). GC-grupo controle; GD- grupo diabético; GDI- grupo
2395 diabético tratado com insulina; GDM- grupo diabético tratado com melatonina; GDQ- grupo
2396 diabético tratado com quercetina; GDQM- grupo diabético tratado com quercetina e
2397 melatonina. *Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo
2398 teste de comparações múltiplas de Tukey e Kramer (p>0.05).
2399
2400
2401
2402
2403
2404
163 87
164
2405 Histopatologia hepática

2406
2407 O grupo controle (GC) demonstrou todos os componentes hepáticos estruturais
2408 celulares e teciduais preservados. A única alteração visível foi congestão pontual e
2409 discreta de algumas veias centrolobulares. No grupo GD (figura 4: C-D) observou-se na
2410 maioria dos animais uma hipertrofia difusa e acentuada de hepatócitos, bem como uma
2411 anisocariose moderada. Além disso, havia necrose individual e aleatória de hepatócitos.
2412 Outros achados não tão frequentes foi uma massiva degeneração hidrópica, de
2413 moderada a severa, além de mitoses frequentes. O grupo GDI (figura 4: E-F), no
2414 entanto, foi observada degeneração hidrópica de hepatócitos, massiva e acentuada, além
2415 de áreas multifocais de necrose de coagulação acentuada. Achados menos frequentes
2416 foram hipertrofia difusa e acentuada em hepatócitos, bem como uma discreta
2417 degeneração microvacuolar e áreas multifocais de necrose de coagulação discreta desses
2418 hepatócitos. No grupo GDM (figura 5: A-B) os achados mais frequentes foram
2419 hipertrofia de hepatócitos, áreas de necrose de coagulação multifocal todos de caráter
2420 discreto. Um achado não tão frequente nesse grupo foi à proliferação de ductos biliares,
2421 mas também discreta. Os achados histopatológicos mais frequentes no grupo GDQ
2422 (figura 5: C-D) foram hipertrofia de hepatócitos, bem como áreas de necrose coagulação
2423 multifocal e moderada. Ademais outras alterações com menor frequência foram discreta
2424 degeneração vacuolar de hepatócitos, proliferação de ductos biliares discreta, bem como
2425 moderada anisocariose. Já o grupo GDQM (figura 5: E-F) apresentaram discreta
2426 hipertrofia de hepatócitos, além de degeneração microvacuolar focal e discreta e, áreas
2427 de necrose de coagulação multifocal e moderada.
2428
2429
2430
2431
2432
2433
2434
2435
2436
2437
2438
165 88
166
2439
2440 Figura 4. Fotomicrografias da histopatologia hepática. Notar em A–B grupo GC; C-D
2441 grupo GD; E-F grupo GDI. Legenda das alterações: congestão vascular (ponta de seta
2442 vermelha), necrose (seta preta), degeneração hidrópica (seta vermelha), hipertrofia de
2443 hepatócitos (asterisco), mitose (seta azul) e anisocariose (moldura quadrada).
2444
2445
167 89
168
2446
2447 Figura 5. Fotomicrografias da histopatologia hepática. Notar em A–B grupo GDM; C-
2448 D grupo GDQ; E-F grupo GDQM. Legenda das alterações: degeneração vacuolar (seta
2449 espessa), necrose (seta preta), proliferação de ductos biliares (ponta de seta preta),
2450 hipertrofia de hepatócitos (asterisco) e anisocariose (moldura quadrada).
2451
2452
169 90
170
2453 Morfometria Hepática

2454
2455 A morfometria hepática revelou para o parênquima lobular que o grupo GD
2456 apresentou um aumento nesse parâmetro e diferiu de todos os outros grupos, que
2457 tiveram esse parênquima menor, e se assemelharam entre si. Já para o parênquima não
2458 lobular os grupos GD e GDM apresentaram-se semelhantes estatisticamente com
2459 valores menores, e os restantes dos grupos não diferiram do grupo controle (GC) com
2460 valores maiores desse parênquima (tabela 1).
2461
2462 Tabela 1. Média ± desvio padrão da porcentagem de parênquima lobular e não lobular
2463 no fígado dos animais dos grupos experimentais.
Grupos Parênquima lobular Parênquima não lobular
GC 88,08 ± 1,11b 11,92 ± 1,11a
GD 95,00 ± 0,90a 5,00 ± 0,45b
87,67 ± 2,32b 12,33 ± 2,32a

GDI
87,83 ± 2,33b 12,17 ± 2,31b

GDM
90,42 ± 2,30b 9,58 ± 2,04a

GDQ
85,75 ± 2,14b 14,25 ± 3,14a

GDQM
P 0,0101 0,0103
2464 Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem significativamente entre si
2465 pelo teste de Tukey e Kramer (p<0,05).
2466
2467 Análises Bioquímicas
2468
2469 No resultado das análises bioquímicas das enzimas hepáticas com 10 dias de
2470tratamento tronou-se evidente que para o TGO os grupos que apresentaram os maiores
2471índices foram o GD e GDI que se assemelharam entre si, porém diferiram de todos os
2472outros. Os grupos GC, GDM e GDQM tiveram as menores taxas dessa enzima, se
171 91
172
2473igualando estatisticamente entre si, porém diferindo do restante dos grupos. Já o grupo
2474GDQ se isolou estatisticamente apresentando níveis moderados dessa enzima. Para a
2475TGP o grupo que se apresentou com os maiores níveis foi o grupo GD, que difere de
2476todos os outros grupos. O menor índice foi encontrado no grupo GDQ. O grupo GDI se
2477isola estatisticamente com valores um pouco abaixo do grupo GD, porém maiores que o
2478restante dos grupos. No entanto os grupos GC, GDM e GDQM demonstraram valores
2479mais próximos do grupo GDQ, ou seja, valores mais baixos dessa enzima, não diferindo
2480entre si, mas diferindo do restante (tabela 2).
2481 Já para essa mesma análise com 30 dias de tratamento o que se observa é que
2482para o TGO o grupo que apresentou os maiores níveis foi o GD, que diferiu de todos os
2483outros grupos. Já o restante dos grupos (GC, GDI, GDM, GDQ e GDQM) apresentaram
2484baixos índices dessa enzima e não diferiram entre si. O mesmo comportamento entre os
2485grupos ocorreu para o TGP (tabela 3).
2486Tabela 2. Média ± desvio padrão dos níveis séricos de TGO e TGP nos animais dos
2487grupos experimentais, aos 10 dias de tratamento.
Grupos (n=4) TGO TGP
GC 61,83 ± 2,85c 13,06 ± 5,39d
GD 143,90 ± 32,22a 91,60 ± 4,74a
GDI 129,81 ± 27,19a 54,25 ± 12,47b
GDM 69,62 ± 6,55c 16,30 ± 4,50d
GDQ 85,46 ± 3,70b 39,72 ± 3,35c
GDQM 64,57 ± 2,67c 25,63 ± 7,15d
P 0,0050 < 0,0001
2488
2489
2490
173 92
174
2491Tabela 3. Média ± desvio padrão dos níveis séricos de TGO e TGP nos animais dos
2492grupos experimentais, aos 30 dias de tratamento.
Grupos (n=4) TGO TGP
GC 51,43 ± 8,28b 19,70 ± 6,37b
GD 88,95 ± 11,45a 68,38 ± 1,79a
GDI 48,22 ± 18,43b 18,41 ± 3,52b
GDM 54,35 ± 7,60b 19,36 ± 3,82b
GDQ 57,68 ± 7,68b 21,37 ± 5,15b
GDQM 61,56 ± 5,19b 22,22 ± 4,46b
P 0,0075 < 0,0001
2493
2494
2495
2496 Análise imunohistoquímica (IL-6, IL-10 e TNF-α)
2497
2498 Na imunohistoquímica para IL-6 observou-se que o grupo que apresentou o maior nível
de expressão para essa interleucina foi o grupo GD, que diferiu de todos os outros grupos. Já
2499
os grupos GC, GDI, GDM, GDQ e GDQM apresentaram taxas de expressão menores dessa
2500
proteína, e se assemelharam estatisticamente entre si (figura 6).
2501
2502 Os resultados da expressão do TNF-α através da técnica de imunohistoquímica

demonstraram que no grupo GD teve a maior taxa de expressão desta interleucina, que
2503
diferiu do restante dos grupos. No entanto, todos os outros grupos (GC, GDI, GDM, GDQ e
2504
GDQM) apresentaram taxas menores e não diferiram estatisticamente entre si (figura 7).
2505
2506
175 93
176
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2527
2528
2529
2530
2531
2532 G
2533 Figura 6. Fotomicrografias da imunohistoquímica para o IL-6 no fígado dos animais dos
2534 grupos experimentais. A – (GC), B (GD), C – (GDI), D (GDM), E – (GDQ) e F – (GDQM),
2535 G – gráfico da quantificação em pixels da marcação positiva em marrom da IL-6. Médias
2538
2539
177 94
178
2540
2541
2542
2543
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2548
2549
2550
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2552
2553
2554
2555
2556
2557
2558
a
2559 a
2560
2561
2562
2563
2564 G
2565 Figura 7. Fotomicrografias da imunohistoquímica para TNF-α no fígado dos animais dos
2567 G – gráfico da quantificação em pixels da marcação positiva em marrom do TNF-α. Médias
2570
179 95
180
2571 Para a imunohistoquímica da IL-10 tornou-se evidente que os grupos com os maiores
2572 percentuais de expressão foram os grupos GDI, GDM, GDQ e GDQM, e não diferiram entre
2573 sim. O grupo GD expressou a menor quantidade da interleucina, e se isolou estatisticamente
2574 do restante dos grupos. O grupo GC apresentou taxa intermediária dessa proteína (maior que o
2575 GD e menor que os outros) e diferiu estatisticamente do restante dos grupos experimentais
2576 (figura 8).
2577
2578
2579
2580
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2611
G
2612 Figura 8. Fotomicrografias da imunohistoquímica para IL-10 no fígado dos animais dos
2614 G – gráfico da quantificação em pixels da marcação positiva em marrom da IL-10. Médias
2617
2618
183 97
184
2619 Discussão
2620 Já são identificadas na literatura, que a causa primaria dos danos hepáticos nos
2621 diabéticos é a hiperglicemia. Nesse contexto, o fígado é um dos órgãos mais
2622 susceptíveis aos efeitos do estresse oxidativo e do aumento da inflamação,
2623 principalmente induzido por essas altas taxas dos níveis glicêmicos (MOHAMED et al.,
2624 2016).
2625 No presente estudo os resultados demonstraram que os grupos tratados com
2626 melatonina (sozinha ou acompanhada) tiveram uma diminuição dos níveis glicêmicos.
2627 Isso pode ser explicado segundo Pirozzi, Bonini-Domingos & Ruiz (2016) pois a
2628 melatonina é uma molécula que atua no gasto energético e no metabolismo da glicose e
2629 lipídeos, além de ter capacidade de melhora da tolerância a glicose. Os animais tratados
2630 com quercetina (tanto administrado junto ou separado da melatonina) também
2631 apresentaram uma moderada diminuição da glicemia, isso por que esse flavonoide tem a
2632 capacidade, comprovada na literatura, de melhora da intolerância a glicose, além de
2633 atuar no metabolismo da glicose (TORRES-VILLARREAL et al., 2017).
2634 Ainda no presente estudo os tratamentos tanto com melatonina e quercetina
2635 juntos tanto quanto os tratamentos separados demonstraram uma capacidade de diminuir
2636 a expressão de citocinas inflamatórias (IL-6 e TNF-α), isso é imprescindível para a
2637 eficácia do tratamento, visto que o aumento dessas citocinas são uns dos fatores que
2638 levam ao desencadeio dos agravos no diabetes (BEDI et al., 2019).
2639 Uma explicação para a melatonina diminuir citocinas inflamatórias é sua
2640 competência em inibir a cascata NF-κB e com isso diminuir a expressão de citocinas
2641 inflamatórias (JIANG et al., 2012). Já a quercetina possui uma ação anti-inflamatória
2642 devido a sua aptidão em regular negativamente alguns fatores da cascata inflamatória,
185 98
186
2643 além de diminuir a secreção de interleucinas como IL-6, TNF-α e IL-1β em alguns tipos
2644 celulares (macrófagos e fibroblastos) (CHEN et al., 2016).
2645 Segundo Chen et al. (2016) a quercetina possui habilidades de aumentar
2646 citocinas anti-inflamatórias, isso corrobora com nossos estudos que demonstraram que o
2647 grupo tratado com quercetina apresentou altos níveis de IL-10, esses níveis aumentados
2648 dessa citocina também são bons marcadores de melhora no quadro de inflamação.
2649 A quercetina por ser um antioxidante natural possui capacidade de diminuir o
2650 estresse oxidativo seja ativando vias de eliminação de radicais livres quanto ativando
2651 outras enzimas antioxidantes (JAISHREE; NARSIMHA, 2020; KALENDER et al.,
2652 2012). Isso também coaduna com nossos achados e explica o porquê da diminuição do
2653 TBARS e aumento do GSH nos grupos tratados com quercetina. Já a melatonina tem
2654 uma potente ação antioxidante que é baseada na sua própria capacidade de eliminação
2655 direta de radicais livres (tanto derivados do oxigênio quanto do nitrogênio), atua
2656 interferindo em cascatas bioquímicas associadas ao balanço do estresse oxidativo, além
2657 disso, atua ativando e estimulando a síntese de enzimas antioxidantes
2658 (MORVARIDZADEH et al., 2020). Isso corrobora com nossos resultados, que
2659 demonstraram que os animais diabéticos tratados com melatonina apresentaram
2660 diminuição do TBARS e aumento dos níveis de glutationa reduzida, um antioxidante.
2661 As complicações e os impactos negativos do diabetes nos órgãos são ativados e
2662 sustentados principalmente pela cascata inflamatória e pelo aumento do estresse
2663 oxidativo (BEDI et al., 2019; IGHODARO, 2018). Isso responde em partes o porquê
2664 dos grupos tratados com melatonina e quercetina terem uma melhora significativa tanto
2665 de marcadores de leões hepáticas como o TGO e TGP (que demonstraram que nos
2666 últimos dias de tratamentos as taxas se igualaram ao grupo controle) como na análise
2667 histopatológica que evidenciou que os animais tratados com os antioxidantes tiveram
187 99
188
2668 alterações, mas bem menos severas do que os animais do grupo só diabéticos. Ainda se
2669 tornou notório que o tratamento de animais diabéticos com insulina causa diversas
2670 alterações histopatológicas com agravos significativos no tecido hepático.
2671 E ainda na análise morfométrica ficou evidente que o grupo com maior nível de
2672 parênquima lobular foi o grupo GD, isso, pois na análise histopatológica o fígado dos
2673 animais diabéticos estava com hipertrofia de hepatócitos massiva, então os hepatócitos
2674 ocupavam mais espaço no fígado. E nos outros grupos as porcentagens dos parênquimas
2675 se estabilizaram, pois a hipertrofia e outras alterações dos parênquimas não foram tão
2676 acentuadas quando do grupo diabético.
2677
2678 Conclusão
2679 O tratamento antioxidante com melatonina e quercetina demonstraram boa
2680 efetividade na proteção contra agravos hepáticos, aumentando citocina anti-
2681 inflamatória, diminuindo citocinas inflamatórias, estresse oxidativo e evitando
2682 severidade em lesões histopatológicas e seus marcadores séricos, além de diminuir os
2683 altos níveis de glicemia. Demonstrando assim novas perspectivas para tratamentos do
2684 diabetes mellitus. Ademais se faz necessário salientar a importância de pesquisas e
2685 análises mais profundas para atestar realmente se esses tratamentos sejam, como um
2686 tratamento coadjuvante dos tratamentos convencionais ou como futuros agentes
2687 terapêuticos para esse distúrbio, que atinge uma grande parcela da população mundial.
2688
2689 Agradecimentos
2690 Agradecemos o apoio do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, e do
2691 Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal da Universidade Federal Rural de
2692 Pernambuco (UFRPE), Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de

189 100
190
2693 Pernambuco (FACEPE) pela concessão da bolsa e por todos o incentivo e
2694 fortalecimento dos cursos de pós-graduações do Estado de Pernambuco, agradeço
2695 também todo apoio do Laboratório de Fisiologia e Farmacologia Renal da Universidade
2696 Federal de Pernambuco (UFPE).
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2877
2878
2879
2880
2881

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1

3 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

10 ÉRIQUE RICARDO ALVES

15 INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE AÇÃO DA MELATONINA

31 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

35 ÉRIQUE RICARDO ALVES

38 INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE AÇÃO DA MELATONINA

43 Tese apresentada ao Programa de Pós-

51 Profa. Dra. Valéria Wanderley Teixeira

53 Profa. Dra . Tatiana Souza Porto

54 Prof° Dr°. Álvaro Aguiar Coelho Teixeira

58 ÉRIQUE RICARDO ALVES

60 “INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE AÇÃO DA MELATONINA

66 Profª Drª Valéria Wanderley Teixeira – UFRPE

69 Prof. Dr. Álvaro Aguiar Coelho Teixeira – UFRPE

84 Antigamente me perguntava como Deus pode agir e interferir de forma

90 Primeiramente quero agradecer a Deus pela sua misericórdia e

94 Agradecer também minha mãe Maria, pelo apoio de todas as formas e

101 Quero dar gratidão a todos os familiares e amigos que acreditaram e me

108 Quero também agradecer ao professor Valdemiro Amaro da Silva Junior

113 minha vida pós-acadêmica. Agradeço também nesse momento ao Professor

116 Quero dedicar esse parágrafo a duas pessoas de extrema importância

127 Quero mostrar minha gratidão também à professora Valéria Wanderley

188 Palavras-Chave: hiperglicemia, melatonina, flavonoide, estresse oxidativo,

ANTIOXIDANTES COMO PERSPECTIVA DE TRATAMENTO PARA

4. ANTIOXIDANTES COMO PERSPECTIVA DE

II MELATONINA E QUERCETINA: UMA PERSPECTIVA PARA O

III ASSOCIAÇÃO DE ANTIOXIDANTES PREVINE O FÍGADO

242 LISTA DE FIGURAS

285 teste de comparações múltiplas de Tukey e Kramer

327 Capítulo III

372 significativamente entre si teste de Comparações Múltiplas de Tukey e Kramer

389 LISTA DE TABELAS

400 Capítulo III

416 metabólica e sistêmica. Nesse distúrbio há uma desregulação dos níveis

417 glicêmicos, se estabelecendo assim uma hiperglicemia constante

421 DINNEEN, 2019).

423 pessoas sejam portadoras do diabetes no mundo. No Brasil é estimado cerca

424 de 15,7 milhões de diabéticos, nesse ínterim o Brasil ocupa a 6º posição no

427 com essa doença (INTERNATIONAL DIABETES FEDERETION, 2021).

433 ocorre uma produção inadequada da mesma (AMERICAN DIABETES

434 ASSOCIATION, 2020).

435 O diabetes gera um grande impacto na sociedade, pois é uma doença

436 altamente incapacitante, e isso é devido as suas inúmeras complicações. As

437 mais frequentes são os distúrbios cardiovasculares, moléstias renais

438 (principalmente que afetam os glomérulos) que podem levar a nefropatia

439 diabética (POURGHASEM; SHAFI; BABAZADEH, 2015); retinopatia e

440 neuropatia, e, além disso, a diabetes leva ao agravamento da arteriosclerose,

441 aumentando assim os riscos envolvidos no surgimento do infarto do miocárdio,

442 infarto cerebral e doença arterial oclusiva das extremidades inferiores

443 (PETERSMANN et al., 2019). Essas complicações são as primeiras causas de

444 morbidade e mortalidade em pacientes diabéticos (INGELFINGER; JARCHO,

447 hiperglicemiante, os males mais comuns são diminuição do parênquima

451 A doença renal diabética é a principal causa de insuficiência renal no

453 insuficiência são esclerose glomerular, declínio da taxa de filtração, hipóxia

454 renal, hipertensão, lesão podocitária, autofagia desregulada e inflamação

455 (DEFRONZO; REEVES; AWAD, 2021).

456 Atualmente já se sabe da relação entre o estresse oxidativo e o diabetes,

457 e que existe uma relação direta e determinante no estabelecimento das

458 complicações diabéticas (ZHANG et al., 2020), com esse aumento e

461 (ALKADI, 2020; SIES, 2020).

462 Tratamentos antioxidantes são uma nova perspectiva de tratamento para

465 ínterim um grupo de moléculas antioxidantes tem ganhado bastante