UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE

SIMONE GOMES PONTES

PRODUÇÃO DE DIHIDROXIACETONA POR CÉLULAS DE Gluconobacter

oxydans A PARTIR DE GLICEROL

NITERÓI
2012
 SIMONE GOMES PONTES

PRODUÇÃO DE DIHIDROXIACETONA POR CÉLULAS DE Gluconobacter

oxydans A PARTIR DO GLICEROL

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a

Produtos para Saúde da Faculdade
de Farmácia da Universidade
Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do
Grau de Mestre. Concentração:
Pesquisa e Desenvolvimento de
Produtos para a Saúde.

Orientadora: Profa.Dra. ESTELA MARIS FREITAS MURI

Co-orientadora: Prof ª. Dr ª. SORELE BATISTA FIAUX

Niterói

2012

SIMONE GOMES PONTES

 PRODUÇÃO DE DIHIDROXIACETONA POR CÉLULAS DE Gluconobacter
oxydans A PARTIR DE GLICEROL

Dissertação apresentada ao Curso

de Pós-graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde da
Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial para
obtenção do Grau de Mestre em
Pesquisa e Desenvolvimento de
Produtos para a Saúde.

Aprovada em_______ de ______________ de 2012

Prof ª. Dra. ESTELA MARIS FREITAS MURI- Orientadora

Universidade Federal Fluminense – UFF

Prof ª. Dra. SORELE BATISTA FIAUX - Co-orientadora

Universidade Federal Fluminense - UFF

Prof ª. Dra. ELIANA FLÁVIA CAMPORESE SERVULO

Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ

Prof ª. Dr ª.MARCIA MONTEIRO MACHADO GONÇALVES

Universidade do Estado do Rio de Janeiro - UERJ

Niterói

2012
Aos meus pais, Abelolides e Espedito

À minha irmã, Cristiane

e ao Lucas.
 AGRADECIMENTOS

A Deus, arquiteto de todas as minhas conquistas,por sua infinita bondade.

Às minhas orientadoras, Profa. Dra. Estela Maris Freitas Muri e Profa. Drª. Sorele
Batista Fiaux, pela paciência, atenção constante, pelo exemplo de amor à docência e
apoio para a realização deste trabalho.

Aos meus pais e minha irmã, por terem sido meus primeiros mestres, base de todos os
meus valores. Agradeço pela compreensão da minha ausência em muitos momentos,
pelo apoio e amor inquestionáveis.

À Profa. Dra. Kátia Gomes de Lima Araújo por gentilmente aceitar o convite para ser
revisora deste trabalho.

Às Profas. Drª.Eliana Flávia Camporese Servulo e Drª. Márcia Monteiro Machado

Gonçalves por gentilmente aceitar o convite para participar da etapa final deste trabalho.

À amiga Simone Oliveira, pela amizade, apoio emocional, pelos tantos cafés ao longo
desses dois anos.

Às amigas, Bruna Rachel Peçanha e Thaís Gonçalves, companheiras de curso, pelo

apoio.

Aos alunos do Laboratório de Tecnologia Microbiana da Faculdade de Farmácia da

UFF, especialmente à Emanuelle e Natalia, pela participação neste projeto.

À técnica do laboratório Sandra Bitencourt, pela simpatia constante, sempredisposta a

ajudar.

Aos meus amigos, Bruno, Desí, Ellen, Fefa, Gisele, Gláu, Jajá, Michela, Michele,
Suellen e Wellington, entre tantos outros, por compartilharem a dádiva da amizade
comigo. “A amizade... nem mesmo a força do tempo irá destruir. Somos verdade!”. Às
minhas amigas de república, minha segunda família há sete anos, Kallyne e Carina.

À Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense e à própria UFF.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, pela ajuda

financeira.
“Todas as vitórias ocultam uma abdicação.”

Simone de Beauvoir
 SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS x
LISTA DE TABELAS xii
LISTA DE ABREVIATURAS xiii
RESUMO xiv
ABSTRACT xv
1. INTRODUÇÃO 1
2. OBJETIVOS 3
2.1 Objetivo geral 3
2.2 Objetivos específicos 3
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 4
3.1 Dihidroxiacetona 4
3.2 Gluconobacteroxydans 7
3.3 Glicerol desidrogenase 11
3.4 Produção de DHA por Gluconobacteroxydans a partir de glicerol 13
3.5 Biotransformação 17
3.6 Glicerol 20
4. METODOLOGIA 16
4.1 Microrganismos 18
4.2 Produção de dihidroxiacetona (DHA) por células em crescimento
(fermentação) 23
4.2.1 Preparo do inóculo 23
4.2.2 Condições de cultivo 24
4.3 Produção de DHA por biotransformação utilizando células secas de
Gluconobacteroxydans
24
4.3.1 Obtenção de biomassa 24
4.3.2 Determinação das melhores condições de secagem 24
4.3.3 Secagem das células na presença de íons cálcio e magnésio 25
4.3.4 Acompanhamento da viabilidade celular através de plaqueamento 26
4.4 Produção de DHA por biotransformação utilizando células crescidas de
Gluconobacteroxydans 26
4.4.1 Obtenção de biomassa 26
4.4.2 Determinação das melhores condições de pH e temperatura 26
4.4.3 Produção de DHA por células crescidas 27
4.4 Influência do tempo de estocagem na atividade celular 27
4.5 Métodos Analíticos 28
4.5.1 Determinação da concentração celular 28
4.5.1 Concentração de dihidroxiacetona (DHA) 28
4.5.2 Atividade enzimática celular 28
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 29
5.1 Construção das curvas-padrão 29
5.2 Produção de DHA por células em crescimento (fermentação) 30
5.2.1 Cinética do crescimento microbiano 30
5.2.2 Cinética da produção de DHA 32
5.2.3 Medida do pH 33
5.2.4 Análise da atividade enzimática 35
5.3 Secagem das células em acetona 38
5.4 Produção de DHA com células crescidas 43
6 CONCLUSÕES 56
7 PERPECTIVAS 59
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Bioconversão do glicerol em dihidroxiacetona por Gluconobacter

oxydans. 7
Figura 2 - Assimilação de glicerol por diferentes vias em uma célula de G.
oxydans (adaptado de Ohrem e col, 1996). 12
Figura 3 – Curva de calibração para dosagem da DHA. 29

Figura 4 - Curva de calibração para linhagem G. oxydans 0174 30

Figura 5 - Cinética do crescimento microbiano. Linha inteira: G. oxydans CCT

31
0552. Linha tracejada: G. oxydans CCT 0174.
Figura 6 - Cinética da produção de DHA. Linha inteira: linhagem G. oxydans CCT 32
0552. Linha tracejada: linhagem G. oxydans CCT 0174.
Figura 7 - Cinética da variação do pH durante o crescimento celular. Linhagem G.
34
oxydans CCT 0552 (a); Linhagem G. oxydans CCT 0174 (a).
Figura 8 - Atividade celular relativa à enzima glicerol desidrogenase, apresentada
em termos de concentração da dihidroxiacetona formada na análise versus idade
das células e peso seco de células versus tempo de cultivo. 36
Figura 9 - Atividade celular relativa à enzima glicerol desidrogenase, apresentada
em termos de quantidade de DHA (g) formada por grama de célula versus a idade
das células. 38
Figura 10 - Diagrama de Pareto para a variável resposta (g DHA / g células secas).
45
Figura 11 - Modelo obtido para a variável resposta em função da temperatura e do
pH. Linhagem G. oxydans CCT 0552. (a) Superfície de resposta; (b) Curvas de
47
contorno.
Figura 12 - Diagrama de Pareto para a variável resposta (g DHA / g células Secas). 48
Linhagem: G. oxydans CCT 0174
Figura 13 - Modelo obtido para a variável resposta em função da temperatura e do
pH Linhagem G. oxydans CCT 0174. (a) Superfície de resposta; (b) Curvas de
contorno. 50
Figura 14 - Oxidação do glicerol à DHA por células previamente crescidas. 51
Figura 15 - Produtividade obtida na oxidação de glicerol a DHA por células
previamente crescidas 52
Figura 16 - Oxidação de glicerol 25g/L à DHA por células previamente crescidas 53
da linhagem G. oxydans CCT 0552
Figura 17 - Produtividade obtida na oxidação de glicerol 25g/L a DHA por células
53
previamente crescidas da linhagem G. oxydans CCT 0552.
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Domínio utilizado no DCCR para secagem de células 25

Tabela 2 - Domínio utilizado no plano fatorial fracionado para a secagem de 26

células
Tabela 3 - Valores utilizados no DCCR para biotransformação por células 27
crescidas
Tabela 4 - Valores utilizados no DCCR para secagem de células de G. oxydans 40
CCT 0174.
Tabela 5 - Matriz do plano fatorial fracionado para a secagem de células da 42
linhagem G. oxydans CCT 0174
Tabela 6 - Matriz do delineamento 44

Tabela 7 - Análise de variância (ANOVA) para a resposta produção de DHA para

a linhagem CCT 0552. 46
Tabela 8 - Análise de variância (ANOVA) para a resposta produção de DHA para
a linhagem CCT 0174. 49
Tabela 9 - Atividade celular em relação à glicerol desidrogenase da linhagem G.
oxydans CCT 0552 em 1 hora de reação, utilizando células de 24 horas de idade, 54
estocadas em congelador a -5º C por diferentes tempos.

Tabela 10 - Atividade celular em relação à glicerol desidrogenase da linhagem G.

oxydans CCT 0174 em 1 hora de reação, utilizando células de 24 horas de idade. 55
 LISTA DE ABREVIATURAS

AGPI Ácidos graxos poliinsaturados

ATCC American Type Culture Collection
CCT Coleção de culturas tropical
Cyt. c Citocromo do tipo C
Cyt. o Citocromo do tipo O
DHA Dihidroxiacetona
DSMZ Deustche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid
EMP Embden-Meyerhof-Parnas pathway
FAD Flavin adenine dinucleotide
FDA Food and Drug Administration
FPS Fator de proteção solar
HPLC High-performance liquid chromatography
Km Constante de Michaelis-Menten
NAD Nicotinamide adenine dinucleotide
NADH Nicotinamida adenina dinucleótido
NAD-P Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
PABA p-Aminobenzoic acid
PDE Entner-Doudoroff pathway
pH Potencial hidrogeniônico
PPP Pentose phosphate patway
PQQ Pirrolquinolina quinona
PUVA Psoraleno em associação a radiação UVA
Q10 Ubiquinona-10
TCA Tricarboxylic acid cycle
UVA Ultravioleta do tipo A
 RESUMO

PONTES, Simone Gomes. Produção de dihidroxiacetona por células de

Gluconobacter oxydans a partir de glicerol. Orientadora Estela Maris Freitas Muri e
co-orientadora Sorele Batista Fiaux. Niterói, 2012. Dissertação (Mestrado em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde) - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal
Fluminense.

A dihidroxiacetona (DHA) é uma molécula constituída por três carbonos e não

tóxica, utilizada como insumo para as indústrias de cosméticos, fármacos e química
fina. É produzida industrialmente por fermentação, utilizando a bactéria Gluconobacter
oxydans. Esse processo tem como principal limitação a inibição do crescimento tanto
pelo substrato – glicerol – quanto pelo produto – DHA e, por tal, estudos recentes
descrevem propostas para melhoria do processo. Sendo a conversão de glicerol a DHA
realizada por uma única enzima em uma etapa, o presente trabalho considera que tal
processo se enquadra nas definições de uma biotransformação, ou seja, a utilização de
um catalisador biológico com o propósito de converter um substrato a um produto
estruturalmente similar, através de modificações específicas e utilizando um número
limitado de etapas enzimáticas. Dessa forma, neste estudo foram avaliados
comparativamente a secagem de células em acetona e, em um segundo momento, a
utilização de células de Gluconobacter oxydans previamente crescidas, para a produção
de DHA a partir de glicerol. Objetivando contornar o principal problema do processo,
que é a inibição do crescimento microbiano pelo substrato e pelo produto, foram
testadas duas linhagens. A utilização de células secas em acetona se mostrou possível,
porém os resultados não foram reprodutíveis e células previamente crescidas por 24
horas passaram a ser usadas nos experimentos de biotransformação. O pH e a
temperatura de reação foram selecionados a partir de um planejamento delineamento
composto central rotacional como sendo de 34ºC e pH de 4,5, para G. oxydans CCT
0552 e de 26ºC e pH de 4,5 para G. oxydans CCT 0174. A linhagem G. oxydans CCT
0552 se mostrou mais adequada à oxidação de glicerol à DHA, com aumento do
acúmulo de DHA no meio reacional com o tempo (2,1 g/g biomassa) e com a
produtividade constante (0,45 g/g biomassa). Foi constatada perda de atividade nas
células estocadas por congelamento, o que leva à necessidade de selecionar um melhor
método de conservação das células para a utilização na produção.

Palavras-chave: Gluconobacter oxydans. Dihidroxiacetona. Glicerol. Biotransformação

 ABSTRACT

PONTES, Simone Gomes. Production of dihydroxyacetone by Gluconobacter

oxydans cells using glycerol. Orientadora Estela Maris Freitas Muri e co-orientadora
Sorele Batista Fiaux. Niterói, 2012. Dissertação (Mestrado em Ciências Aplicadas a
Produtos para Saúde) - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense.

The dihydroxyacetone (DHA) is a non-toxic molecule consisting of three

carbons, used in the cosmetics, pharmaceuticals and fine chemicals industry. The DHA
is industrially produced by fermentation, using the bacteria Gluconobacter oxydans.
The main bottleneck of this process is the growth inhibition by the substrate – glycerol –
and the product – DHA. This problem leads recent studies to describe proposals for
improving the process. As the conversion of glycerol to DHA is performed by a single
enzyme in one step, this study considers that this process fits in the definitions of
biotransformation, in other words, the use of a biological catalyst in order to convert a
substrate for a structurally similar products, by speficic modifications, and using a
limited number of enzymatic steps. Thus, this study were assessed by comparison with
drying of cells in acetone and in second stage, the use of previously grown cells of
Gluconobacter oxydans for the production of DHA from glycerol. The use of dried cells
proved to be possible, but the results were not reproducible and the biotransformation
experiments were done with previously grown cells of 24 hours age.

. The best pH and temperature for the reaction were selected from a central
composite design as being 34o C and pH 4.5 for G. oxydans CCT 0552 and 26o C and
pH 4.5 for G. oxydans CCT 0174. The strain G. oxydans CCT 0552 was more suitable
for the oxidation of glycerol to DHA, with increased accumulation of DHA in the
reaction media (2,1 g/g biomass) and constant productivity (0,45 g/g biomass). Loss of
activity was observed in cells stored by freezing, which leads to the need to select a best
method of preserving cells for the production.

KEYWORDS: Gluconobacter oxydans. Dihydroxyacetone. Glycerol.

Biotransformation
 1- INTRODUÇÃO

A dihidroxiacetona (DHA) é uma molécula simples, de três carbonos, com

conhecido potencial para intermediário na síntese de diferentes compostos químicos de
grande interesse para as indústrias farmacêutica e de química fina (Zelikin e col., 2006,
Feng e col., 2012). É comumente utilizada como agente bronzeador em produtos para
bronzeamento artificial, sem necessidade de exposição ao sol (Wittgenstein e Berry,
1960; Wei e col., 2007a, Ma e col., 2010) e, portanto, sem o risco de desenvolvimento
de câncer de pele. Sob uma outra perspectiva, ela também representa um insumo de alto
interesse para a saúde pública, já que confere certo grau de proteção solar (Levy, 2001),
e pode também ser utilizada em medicamentos de uso tópico para tratamento de
psoríase (Mishra e col., 2008) e vitiligo (Fesq e col., 2001) dentre outros.

A DHA pode ser sintetizada quimicamente a partir de formaldeído ou glicerol,

cataliticamente e eletrocataliticamente, empregando catalisadores metálicos como a
platina, ou por via microbiana, a partir do glicerol. No entanto, apesar da via química
ser possível, os problemas de baixo rendimento, superoxidação do produto, toxidez dos
catalisadores químicos e dificuldade de separação dos subprodutos (Ciriminna e col.,
2006; Mota, 2009) tornam a via microbiana a mais viável e, portanto, empregada
industrialmente.

Embora diversos microrganismos demonstrem capacidade de oxidação de

glicerol em DHA, tradicionalmente este processo ocorre via fermentação por células da
bactéria Gluconobacter oxydans, que graças as suas peculiaridades metabólicas
mostram-se mais adequadas e eficientes ao processo de oxidação incompleta do glicerol
à DHA (Hekmat e col., 2003; Hu e col., 2010; Mishra e col., 2008). Porém, apesar de
ser industrial, esse processo tem como principal limitação a inibição de sua produção
tanto pelo substrato – glicerol – quanto pelo produto – DHA (da Silva e col., 2009;
Gätgens e col., 2007; Bauer e col., 2005; Hekmat e col., 2003).

Ainda que considerando tal síntese como um processo que se enquadra

perfeitamente nas definições de uma biotransformação, ou seja, a utilização de um
catalisador biológico com o propósito de converter um substrato em um produto
estruturalmente similar, utilizando um número limitado de etapas enzimáticas, quer
sejam catalisadas por enzimas isoladas ou por células íntegras (Dalla-Vecchia e col.,
2004, Medeiros, 2002), vislumbrou-se a otimização do processo, através da utilização
de células secas em acetona e, em um segundo momento, através de células crescidas.
Tais processos contornariam o principal problema, que é a inibição do crescimento
celular ocasionado tanto pelo substrato como pelo produto. Adicionalmente, estando a
enzima responsável por essa oxidação ligada à membrana microbiana, ou seja, externa à
célula, sua ação sobre o substrato seria facilitada, conferindo uma imobilização natural.
2- OBJETIVOS

2.1- OBJETIVO GERAL

● Avaliar o uso de células de Gluconobacter oxydans na bioconversão e

biotransformação de glicerol em dihidroxiacetona usando diferentes linhagens e
condições.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Verificar a produção de DHA a partir de glicerol por duas linhagens de

Gluconobacter oxydans durante o crescimento, usando o processo tradicional
(fermentação).

 Crescer células em condições apropriadas, visando obtenção de biomassa para o

processo de biotransformação.

 Definir estratégias para o uso de células secas com acetona e avaliar sua atividade na
biotrasnformação de oxidação de glicerol a DHA;

 Verificar a atividade de células crescidas para a oxidação de glicerol a DHA;

 Definir, através de planejamento fatorial, as condições de pH e temperatura para

a produção de DHA utilizando células crescidas.
  Verificar o efeito da armazenagem das células a -20º C na a produção de DHA.

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 DIHIDROXIACETONA

1,3-Dihidroxipropan-2-ona, ou dihidroxiacetona (DHA - 1) é uma molécula

simples de três carbonos, fisiologicamente formada no ciclo de Krebs (Wulf e col,
2004), aquiral e não tóxica. Atualmente é muito utilizada na indústria de cosméticos
como princípio ativo dos bronzeadores artificiais (Wei e col, 2007 b; Mishra e col.,
2008; Bauer e col., 2005, Hu e col., 2011), como intermediário em sínteses quimicas
(Zelikin e col., 2006; Feng e col., 2012) e em produtos farmacêuticos, principalmente
para o tratamento de doenças de pele (Fesq e col., 2001; Asawanonda e col., 1999).
 Embora desde a década de 20 a DHA tenha sido observada como agente de
coloração da pele, somente na década de 50 estudos possibilitaram reproduzir
consistentemente este efeito (Mishra e col., 2008). Nessa época, Eva Wittgenstein
(Wittgenstein, 1960; Mishra e col, 2008) estudava o uso de DHA como droga oral no
tratamento de crianças com deficiência no armazenamento de glicogênio. Foi observado
que essa substância conferia uma coloração acastanhadada à pele, quando em contato
com a mesma. Continuando a estudar esse efeito, Eva Wittgenstein verificou que este
atingia apenas a camada superficial da pele. Tais pesquisas abriram caminho para os
bronzeadores artificiais e em 1960 a DHA foi aprovada pelo órgão americano Food and
Drug Administration (FDA) para uso em produtos cosméticos, como bronzeadores
artificiais, na proporção de 5-15% (p/p) (Dain, 2012). Dados de 2007 já mostravam uma
demanda de aproximadamente 1.800 toneladas ao ano (Kenar, 2007).

A principal vantagem do uso da DHA nestes produtos é obter um bronzeado sem

a necessidade de exposição ao sol, ou seja, protegido dos efeitos malignos das radiações
solares e sem o risco do desenvolvimento de câncer. O câncer de pele é o mais
frequente no Brasil, com alto índice de metástase, correspondendo a 25% dos casos de
tumores registrados. A estimativa é que em 2012 ocorram 6.230 novos casos (INCA,
2011). No bronzeamento artificial, a DHA reage com os aminoácidos presentes na
camada superior da pele, o estrato córneo, para produzir um efeito de escurecimento,
devido ao pigmento melanoidina que se assemelha a melanina. O mecanismo de ação é
baseado na reação de Maillard, onde os carboidratos reagem com aminoácidos para
produzir a pigmentação marrom (Ciriminna e col., 2006). A intensidade da cor
desenvolvida é diretamente proporcional à concentração de dihidroxiacetona usada.
Devido à penetração apenas até ao estrato córneo, não causa quaisquer efeitos nocivos
sobre a pele (Fusaro e col, 2005). A cor marrom obtida na pele não absorve na
extremidade inferior do espectro visível, conferindo proteção contra radiação
ultravioleta do tipo A (UVA) e assim um efeito modesto sobre o fator de proteção solar
(FPS), fornecendo proteção FPS 3 ou 4 (Levy, 2001).

A DHA tem sido estudada como alternativa no tratamento do vitiligo, doença de

despigmentação da pele com uma prevalência mundial de 0,5-4%, afetando
principalmente os jovens (Fesq e col., 2001). Na maioria dos casos, as mãos, os pés e o
rosto são afetados, acarretando modificações estéticas com impacto psicológico
importante sobre o indivíduo. A maioria dos protocolos de tratamento do vitiligo,
infelizmente, são morosos e geralmente não resultam em repigmentação completa.
Atualmente, os tratamentos mais comuns são esteróides tópicos e fotoquimioterapia,
como psoraleno em associação a radiação UVA (PUVA) (Leeuw e col., 2010). No
entanto, as partes do corpo, como as extremidades distais, frequentemente permanecem
resistentes à terapia utilizada.

Já foram relatadas outras aplicações da DHA na área da saúde. Há descrições do

uso tópico da DHA para proteção da pele de pessoas com doenças que não permitem
exposição ao sol ou com manchas e como auxiliar no tratamento fotoquimioterápico de
psoríase (Mishra e col., 2008). Foi descrito seu uso no tratamento da porfiria variegata,
um subgrupo hepático de porfiria, sendo essa uma deficiência enzimática na formação
do grupo heme, acarretando no acúmulo de metabólitos intermediários deste
(Asawanonda e col., 1999). Estudos in vivo relataram sua ação na redução do ganho de
peso, quando utilizada na suplementação alimentar de ratos (Emery e col, 2005).
Dihidroxiacetona também foi estudada quanto ao seu potencial de estimular a secreção
de insulina, em células pancreáticas do tipo beta (Tsuura e col., 1994; Berggren e col.,
2003). Também há potencial aplicação em drogas antimaláricas e anti tripanossômicas,
visto alguns estudos que demonstraram que aquaporinas presentes em Trypanosoma
brucei são permeáveis a DHA, no entanto, tal protozoário parece não possuir enzimas
responsáveis pela metabolização da mesma, o que a tornaria tóxica para essas células
(Uzcátegui e col., 2007). Ainda há relatos do seu uso como antídoto contra
envenenamento por cianeto, como antioxidante e como agente na melhoria da
resistência aeróbica (Nguyen e Nevoigt, 2009).

A DHA também encontra aplicação como intermediário na síntese de fármacos e

outros produtos de química fina (Mishra e col., 2008; Wei e col., 2007b; Bauer e col.,
2005; Hekmat e col., 2003). Os dois grupos funcionais hidroxila presentes em sua
estrutura a tornam um interessante intermediário sintético para uma gama de compostos
químicos. Pode ser citada a síntese do metotrexato, usado no tratamento quimioterápico
do cancro (Gatgens e col., 2007), dos biomaterias poliméricos, tais como
policarbonatos, poliésteres ou poliuretanos. Muitos desses polímeros são
biocompatíveis, biodegradáveis e não-tóxicos, podendo ser usados em sistemas de
liberação controlada de fármacos (“drug delivery”) (Zelikin e col., 2006).
 É possível sintetizar a DHA por via química ou eletrocatalítica, mas a via
microbiana é a mais viável por apresentar baixo custo, condições brandas de realização
do processo, processo ambientalmente limpo e a facilidade de purificação do produto
(Nguyen e Nevoigt, 2009).

3.2 GLUCONOBACTER OXYDANS

Pesquisas sobre a produção de DHA a partir de glicerol (figura 1) por via

microbiana têm sido relatadas nos últimos anos (Hekmat e col. 2003, 2007; Hu e col,
2010a; Mishra e col, 2008). Diversos microrganismos têm sido estudados nesta
conversão, tais como Gluconobacter oxydans (antes Acetobacter suboxydans),
Acetobacter xylinum e Gluconobacter melanogenus. No entanto, G. oxydans se destaca
como o mais extensivamente utilizado. Nessa bactéria a conversão se passa pela
oxidação incompleta de glicerol em DHA através da ação da enzima glicerol
desidrogenase (Figura 1) (Mishra e col, 2008). A conversão não é de 100%, como
acontece em outras oxidações incompletas, como por exemplo a oxidação de sorbitol a
sorbose e a oxidação de glicose em ácido glucônico (Bremus, 2006, apud Gatgens e col,
2007), enquanto que a conversão do glicerol em DHA foi de apenas 70%, sendo os
30% restantes incorporados ou convertidos em outros produtos, não detectados pelo
método de HPLC utilizado (Gatgens e col, 2007).
 Figura 1 - Bioconversão do glicerol em dihidroxiacetona por Gluconobacter
oxydans.

Gluconobacter oxydans é uma bactéria Gram-negativa, aeróbia, pertencente à

família das bactérias ácido-acéticas (Acetobacteriaceae) (Bauer e col, 2005; Wei e col,
2007). Anteriormente conhecido como Acetobacter suboxydans, foi caracterizada como
tendo a capacidade pronunciada de oxidar glicose para gluconato e pouca capacidade
para oxidar etanol para acetato (Gupta e col, 2001).

Apresentam-se em forma de bastonetes, elipse, aos pares e raramente em cadeias.

Já foi relatada sua ocorrência em frutos, tais como maçãs e peras, estando associada em
alguns estudos à deterioração dos mesmos, ainda que, para o ser humano este não
apresente patogenicidade (Gupta e col, 2001; Mishra e col, 2008). A temperatura ótima
para crescimento é de 25-30°C, não suportando temperaturas acima de 37°C (Mishra e
col, 2008). Devido às altas taxas de oxidação de substratos, exige alta demanda de
oxigênio (Hanke e col., 2012).

Graças a uma variedade de desidrogenases integrais de membrana, é conhecido

por sua capacidade de oxidação incompleta de vários carboidratos e alcoóis o que o
torna apropriado para a síntese de vários produtos (Parmentier e col., 2005; Gatgens e
col., 2007; Muynck e col., 2007; Wei e col., 2007b; Mishra e col., 2008, Hanke e col.,
2012). Os centros catalíticos destas desidrogenases estão localizados no periplasma,
promovendo a transferência de elétrons e/ou prótons para a cadeia respiratória (Bott e
col, 2012). Os produtos reduzidos acumulam-se no meio de cultura, promovendo
acidificação do mesmo, condição sob a qual a célula não sofre alterações na sua taxa de
crescimento. Entretanto, há evidências indiretas de que o citocromo c, componente em
abundância na cadeia respiratória de G. oxydans, seja dependente de regulação pelo pH,
aumentando em quantidade a medida que o pH se torna ácido (Matsushita e col, 2002;
Bott e col, 2012).

G. oxydans tem sido usado com êxito na produção industrial de produtos

alimentícios, medicamentos e cosméticos, por exemplo, ácido 2-ceto-l-gulônico,
precursor da vitamina C (Herrmann e col, 2005) e 6-amino-L-sorbose, precursor do
miglitol (Schedel e col, 2000).
 Outra aplicação biotecnológica provém de estudos recentes, os quais analisaram a
produção de uma nova dextrana solúvel, a partir de maltodextrina por extrato celular de
G. oxydans DSM 2003. A dextrana produzida por G. oxydans é obtida pela ação da
enzima dextrana dextrinase sobre a maltodextrina e tem potencial para, assim como
outras dextranas, ser utilizada em fármacos, como expansor do volume plasmático
sanguíneo e, também, como adjuvante e espessante na indústria alimentícia, entre outros
(Wang e col., 2011).

G. oxydans vem sendo amplamente estudado para a construção de biosensores

(Švitel e col, 2006). A utilização de células íntegras confere maior estabilidade aos
biocatalisadores, e proporciona as coenzimas e ativadores necessários à reação
(Šefčovičová e col, 2011).

Uma das configurações possíveis para um biosensor amperométrico consiste em

um eletrodo de trabalho coberto com um biocatalisador. O analito é, então, oxidado no
eletrodo de trabalho e os elétrons resultantes da oxidação transferidos para o outro
eletrodo. Em alguns casos, o processo é feito na presença de um mediador como
metassulfato de fenazina, ferricianeto, ferroceno e seus derivados, para auxiliar na
transferência de elétrons. Esta configuração permite uma variedade de materias para
compor a superfície do eletrodo, como por exemplo a platina, carbono vítreo, grafite
entre outros, além de permitir a utilização de diversos métodos de imobilização de
células, como o aprisionamento e a adsorção (Švitel e col, 2006).

Recentemente, um sistema combinado das bactérias G. oxydans e Ralstonia

eutropha foi avaliado quanto à redução assimétrica de cetonas. As oxirredutases de G.
oxydans utilizadas nesse processo eram dependentes de NAD(P)H, de forma que um
sistema capaz de regenerar eficientemente este cofator foi requerido. A utilização de
hidrogenases, como as presentes em R. eutropha, fornece um sistema de regeneração
sem produtos secundários e utilizando H2 como agente redutor. O sistema composto
por esses dois microrganismos foi comparado com outro, que consistia apenas de
células de G. oxydans, e foi possível notar que o sistema combinado mostrou melhor
rendimento (75% vs 48%), melhor pureza enantiomérica (98% vs 93%) do produto (S)-
2-octanol e o dobro da velocidade de reação (Adlercreutz e col, 2012).
 Como aeróbio obrigatório, G. oxydans pode obter energia por oxidação de
açúcares, alcóois alifáticos e cíclicos, de esteróides para seus respectivos produtos de
oxidação e, como uma pequena fração dos açúcares e alcóois é transportado para o
citoplasma, também através da via Entner-Doudoroff (PDE) e da via da pentose fosfato
(PPP – pentose phosphate patway), onde ocorre inicialmente uma fosforilação seguida
de oxidação (Mishra e col, 2008). Para as espécies de Gluconobacter a via da pentose
fosfato constitui a rota catabólica mais importante para a quebra de açúcares e polióis
em dióxido de carbono, já que a glicólise (via Embden-Meyerhof-Parnas - EMP), é
inexistente, devido à ausência de um gene que codifica a enzima 6-fosfofrutoquinase
(Mishra e col, 2008; Hanke e col, 2012). Nesse caso, os substratos são inicialmente
fosforilados por quinases específicas e degradados por suas respectivas isomerases e
desidrogenases. Além disso, o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) é incompleto, devido
à ausência dos genes que codificam para a succinato desidrogenase e também, para a
succinil-CoA sintetase, sendo, portanto, incapazes de oxidar o ácido acético a CO2 e
H2O (De Muynck e col, 2007, Gatgens e col, 2007; Mishra e col, 2008; Hanke e col,
2012).

As desidrogenases presentes em G. oxydans são divididas em dois grupos, sendo

um deles constituído por enzimas presentes na membrana celular e vinculadas ao
sistema de citocromos, enquanto o outro grupo consiste em enzimas localizadas no
citoplasma, dependentes de NAD(P), responsáveis pelo catabolismo intracelular de
carboidratos (Gupta e col, 2001; Parmentier e col, 2005). As desidrogenases ligadas à
membrana podem ser quinoproteínas, quando associadas a coenzima quinona do tipo
pirroloquinolina quinona (PQQ) ou flavoproteínas, quando covalentemente ligadas a
flavina-adenina dinucleotídeo (FAD) (Parmentier e col, 2005).

Em G. oxydans a enzima responsável pela oxidação do glicerol a DHA é uma

quinoproteina ligada à membrana, a glicerol desidrogenase, caracterizada em 1985
(Ameyama e col, 1985). A produção de DHA é realizada pela célula íntegra do
microrganismo, através da catálise regiosseletiva dessa enzima em uma única etapa,
oxidando, assim o glicerol a DHA, empregando o oxigênio como aceptor final dos
equivalentes reduzidos, sem o envolvimento de coenzimas NAD ou FAD (Hauge e col,
1954; Bauer e col., 2005; Mishra e col., 2008; da Silva e col., 2009). Como a enzima é
ligada à membrana, DHA é liberada e acumulada diretamente no meio (De Muynck e
col., 2007; Mishra e col., 2008; Hanke e col., 2012 ). Os meios de crescimento
frequentemente utilizados para produção de dihidroxiacetona a partir de glicerol contém
sais minerais e alguns aminoácidos. Estudos demonstraram que meios com adição de
CaCl2, bem como de ácido pantoténico e ácido p-aminobenzóico promoveram maior
crescimento de G. oxydans (Bauer e col., 2005; Mishra e col., 2008).

3.3 GLICEROL DESIDROGENASE

G. oxydans é equipado com numerosas desidrogenases e oxi-redutases, sendo a

maioria das reações oxidativas realizada por desidrogenases presentes na membrana,
cujos centros reativos são orientados para o espaço periplasmático, de forma que há
acúmulo de produtos no meio (Parmentier e col, 2005; Gätgens e col., 2007).

Foram caracterizados dois tipos de glicerol desidrogenases responsáveis pela

oxidação microbiana de glicerol a DHA (Figura 2). Uma delas é vinculada à membrana
e a maior produção de DHA ocorre em pH ácido (Ameyama e col, 1985). Esta utiliza O2
como aceptor final de elétrons e equivalentes reduzidos, por meio de ubiquinona e
citocromo-O, sem envolvimento de NADH (da Silva e col., 2009). Esta enzima contém
a pirroloquinolina quinona (PQQ) como grupo prostético (Parmentier e col, 2005; Bauer
e col, 2005), como ocorre em outras desidrogenases das bactérias da família
Acetobacteriaceae. Tal desidrogenase teve sua atividade como quinoproteína
confirmada pelo isolamento do grupo prostético PQQ, utilizando metanol (Ameyama e
col, 1985; Adachi e col, 2008). A PQQ possui estrutura de ortoquinona, sendo
responsável por sua atividade de oxiredução, função característica destas quinoproteínas
ou seja, uma oxidação primária e não fosforilada do substrato (Matsushita e col, 2002;
Matsushita e col, 2003; Holscher e col, 2007; Adachi e col, 2008; Yang e col, 2010).
Estudos envolvendo a linhagem selvagem de Gluconobacter suboxydans IFO 3255
mostraram que a quinoproteína glicerol desidrogenase converte quantitativamente o
glicerol em DHA no início da fase exponencial e a DHA acumulada no meio é
incorporada às células no início da fase estacionária. A outra desidrogenase é
citoplasmática, possui pH ótimo por volta de 8,5 e foi parcialmente purificada a partir
de vários microrganismos, como por exemplo, a partir da fração solúvel de E. coli
(Asnis e Brodie, 1953). A DHA é formada e utilizada intracelularmente.
Industrialmente, a enzima glicerol desidrogenase ligada à membrana é a responsável
pela oxidação do glicerol a DHA (Gatgens, 2007). Neste caso, a reação se passa do lado
de fora da célula e a DHA é acumulada no meio de cultivo (Bott e col., 2012).

DHA O2
MEIO H2O
Glicerol

Quinona

Glicerol
3-fosfato
desidrogenase
Glicerol DHA-
3-fosfato fosfato
Glicerol
CITOPLASMA

MEMBRANA CITOPLASMÁTICA

Figura 2 – Ação das glicerol desidrogenases da membrana e citoplasmática em uma

célula de G. oxydans (adaptado de Ohrem e Voβ, 1996).
 O isolamento, purificação e propriedades da glicerol desidrogenase ligada à
membrana foram descritos para a linhagem IFO 3260 de Gluconobacter industrius. A
enzima apresentou uma ampla especificidade de substrato e oxidou rapidamente o
glicerol na presença de 2,6-diclorofenol indofenol e metossulfato de fenazina, como
aceptor de elétrons. No entanto, o mesmo não foi observado na presença de NAD e
NADP. O mesmo estudo demonstrou que a atividade desta enzima foi completamente
bloqueada quando tratada com 2 mM de EDTA (pH 7,5), sendo posteriormente
restaurada para o nível original quando o cofator (grupo prostético) da enzima glicerol
desidrogenase, ou seja, a pirroloquinolina quinona (PQQ) foi adicionada em presença de
íons magnésio (Ameyama e col, 1985), que, assim como outros cátions divalentes, são
importantes para a configuração de quinoproteínas, mantendo-as ligadas à respectiva
apoenzima (Adachi e col, 2003).

A glicerol desidrogenase purificada mostrou uma atividade ótima em pH 7,0-7,5 e

foi mais estável em pH 8,5-9,5; a taxa de oxidação do glicerol foi máxima em 33-37°C.
Os valores das constantes de Michaelis-Menten (Km) para diferentes substratos, ou seja,
glicerol, D-sorbitol e D-manitol foram de 0,83, 1,0 e 2,4 mM, respectivamente
(Lapenaite et al., 2005).

3.4. PRODUÇÃO DE DHA POR GLUCONOBACTER OXYDANS A PARTIR

DE GLICEROL

É possível sintetizar a DHA quimicamente a partir de glicerol ou formaldeído.

Apesar de apresentar rendimentos próximos a 82%, este método possui como
desvantagem a dificuldade de purificação e consequentemente alto custo (Mishra e col,
2008). A DHA também pode ser sintetizada tanto cataliticamente como
eletrocataliticamente (Ciriminna e col., 2006). Catalisadores metálicos, como a platina,
podem promover a oxidação do glicerol a alcóois primários ou secundários, que são
direcionados à obtenção de dihidroxiacetona (Kwon e col., 2012, Hu e col., 2009), com
rendimentos entre 50 e 70%. No entanto, a platina pode promover intoxicação, além de
conferir uma oxidação mais seletiva da hidroxila primária (Mota, 2009; Rodrigues,
2008), sendo essas algumas das desvantagem do processo. Já a via eletroquímica, por
possuir um tempo de reação elevado, tem como desvantagens a possibilidade da
formação de ácido pirúvico e baixo rendimento (25%) (Ciriminna e col., 2006; Mishra e
col, 2008). Apesar da via química ser possível, os problemas de baixo rendimento,
superoxidação do produto, toxidez dos catalisadores químicos e dificuldade de
separação dos subprodutos fazem com que a via microbiana seja a mais viável. As
vantagens da via microbiana são o menor custo, a realização do processo em condições
brandas e ambientalmente limpo e a facilidade de purificação do produto (Nguyen e
Nevoigt, 2009).

Industrialmente, a DHA é produzida por fermentação em tanques agitados e

aerados utilizando Gluconobacter oxydans (Bauer e col., 2005; Hekmat e col., 2003).
Sua produção ainda é baixa e o custo é alto, o que impede o mercado para esse
composto de se desenvolver em sua plenitude (Brandner e col., 2009). Um dos
principais problemas dessa síntese é a inibição do crescimento celular pelo substrato –
glicerol e pelo produto – DHA (da Silva e col., 2009; Gätgens e col., 2007; Bauer e col.,
2005; Hekmat e col., 2003). A inibição causada pelo glicerol e pela DHA possuem
mecanismos distintos. O efeito causado pelo excesso de glicerol está relacionado ao
transporte celular. Já a inibição causada pelo excesso de DHA está relacionada às
enzimas envolvidas no crescimento celular (Mishra e col, 2008) e é oriunda de uma
lesão irreversível das células de G. oxydans, além de afetar a glicerol desidrogenase,
enzimas da via da pentose fosfato e, também, uma proteína relacionada à difusão do
glicerol pela célula (Gatgens, 2007).

Inicialmente, altas concentrações de DHA (acima de 85g/L) inibiram o

crescimento celular e, num segundo momento, afetaram a oxidação do glicerol (Mishra
e col, 2008). Estudos demonstraram que em concentrações acima de 108g/L a produção
foi inibida, por lesão irreversível das células (Hu e col, 2010). Outros estudos
demonstraram que em concentrações elevadas de DHA, a atividade respiratória das
células diminuiu, enquanto que a fase lag aumentou. Em concentrações de DHA
superiores a 80 g/L nenhuma atividade respiratória foi observada (Bauer e col, 2005).
Gätgens e col (2007) citam também a inibição, pelo produto, da enzima responsável
pela síntese.
 Para tentar minimizar a inibição, a produção industrial é realizada por batelada
alimentada, com adição controlada do substrato e com limite de concentração de DHA
produzida (Hekmat e col., 2003, Bauer e col, 2005). Ainda assim, a produção de DHA a
partir de glicerol continua sendo estudada para obtenção de melhor crescimento e
produtividade.

Gätgens e col. (2007) propuseram a modificação genética de G. oxydans para

aumento de produção. Foi observado que a linhagem selvagem de G. oxydans, DSM
2343, foi incapaz de oxidar o glicerol quando concentrações superiores a 18 g/L de
DHA foram atingidas. Em contraste, maiores quantidades de DHA foram toleradas (~
30 g/L) em linhagens com superexpressão de genes que codificam a glicerol
desidrogenase.

Em 2003, Hekmat estudou a operação em batelada alimentada repetida para

operação quase contínua em um estágio (Hekmat e col., 2003). Glicerol foi utilizado
como substrato e o processo foi realizado a 30° C e pH 4,5. O sistema consistia de um
bioreator com agitação, associado a uma coluna de percolação, com recheio, onde as
células ficavam retidas por imobilização in situ. A inibição irreversível das células foi
evitada através da manutenção das concentrações do produto – DHA - abaixo de um
nível crítico, sendo este aproximadamente 60 g/L de DHA. Dentro de 17 dias, foi
verificado um aumento na produtividade do processo em cerca de 75%.

Também foi proposta a batelada alimentada repetida para operação quase

contínua em dois estágios (Bauer e col, 2005), na qual o primeiro estágio foi usado para
providenciar uma cultura viável e que não sofresse inibição pelo produto e o segundo
foi utilizado a fim de alcançar altas concentrações finais de DHA, levando em
consideração que G. oxydans possui pronunciado crescimento independente da
formação de produto. Foi usada a adição controlada de glicerol nos dois estágios, sendo
a temperatura de 30° C. Neste estudo, a capacidade de regeneração celular foi perdida
em concentrações de DHA acima de 160 g/L. No entanto, a formação de produto foi
observada até uma concentração máxima de 220 g/L de DHA, porque a glicerol
desidrogenase ligada a membrana manteve-se ativa, mesmo com a inibição do
crescimento celular (Bauer e col, 2005).
 Ainda tentando otimizar o processo de produção industrial de DHA, em 2007
Wei e colaboradores propuseram a imobilização de células de G. oxydans. Neste estudo,
as células foram imobilizadas pelo método de aprisionamento, utilizando o álcool
polivinílico (PVA) como matriz polimérica. Os resultados demonstraram como
melhores condições a temperatura 30° C e o pH 6,0, com 86% de conversão e
manutenção da atividade celular, mesmo após um período de 14 dias de armazenagem
(Wei e col., 2007a).

A modificação do meio de cultivo foi proposta pelo mesmo grupo citado

anteriormente (Wei e col., 2007b), a fim de minimizar o custo de produção, através da
utilização de subprodutos agrícolas, como o hidrolisado de farinha de milho. Quando
este foi comparado com o meio contendo extrato de levedura e sorbitol, verificou-se que
o desempenho da produção foi similar, sendo a atividade da glicerol desidrogenase
igual a 5,23 U/mL para o meio contendo o hidrolisado de milho e 5,35 U/mL para o
meio contendo extrato de levedura e sorbitol, no entanto a redução no custo da produção
foi alcançada, que passou a ser de apenas 15% do custo usual.

Estudos com G. oxydans ATCC 621 realizados por Deckwer e col. (1999)
avaliaram a influência de vitaminas e aminoácidos na composição do meio de conversão
de glicerol em dihidroxiacetona. Foi verificado que, meios contendo as vitaminas B5
(ácido pantotênico), ácido para-amino benzoico (PABA, vitamina do complexo B) e
vitamina B3 (ácido nicotínico), bem como os aminoácidos serina e glutamina
permitiram uma diminuição de aproximadamente 5-10% das concentrações de extrato
de levedura antes utilizadas. Quando comparadas com os meios complexos
normalmente utilizados nesse tipo de bioconversão, o rendimento foi mais baixo (0,02g
de biomassa por g de glicerol), a taxa específica de crescimento permaneceu a mesma
(0,24 a 0,38h-1), porém conferiu alta produtividade (10,3g de DHA/g.h). Nesse mesmo
estudo, verificou-se que a adição de CaCl2 contribuiu positivamente para o crescimento
celular, uma vez que o cálcio está presente na configuração ativa da enzima, a
holoenzima.

Hu e col. (2010) propuseram a produção de DHA, por células de G. oxydans

ZJB09113, focando na melhora da atividade da glicerol desidrogenase, baseada na
otimização do meio reacional, através de planejamento experimental, e num biorreator
com sistema de aeração -“airlift”- que promove a movimentação do meio, permitindo
transferência de massa e de calor. A concentração máxima média de DHA foi 156,3g/L,
com conversão de glicerol em DHA próxima a 90%, durante 72h de reação.

Além dos problemas da inibição pelo substrato e pelo produto, a complexidade

do meio utilizado para a obtenção da DHA por fermentação traz dificuldade de
purificação e cristalização da mesma, o que aumenta os custos de produção (Zhong e
col., 2011).

3.5 BIOTRANSFORMAÇÃO

Os termos biotransformação e biocatálise são frequentemente cambiáveis na

literatura, embora a biocatálise seja considerada um termo mais amplo, definindo
processos intermediados, por exemplo, por enzimas isoladas, células íntegras ou extrato
celular. O termo biotransformação, por sua vez, define a reação química onde um
composto orgânico é alvo de interconversões na estrutura química ou modificações
específicas na mesma, através de reações realizadas por biocatalisadores (Dalla-Vecchia
e col, 2004). A biotransformação abrange processos em que um catalisador biológico
converte um substrato através de um pequeno número de etapas enzimáticas, o que
difere da fermentação, na qual o substrato é um nutriente que será utilizado e convertido
em um produto ou mais produtos, através de um caminho metabólico bastante complexo
na célula, em reações consecutivas e numerosas (Medeiros, 2002).

A biotransformação apresenta características vantajosas sobre a síntese química,

como alta especificidade, elevado poder catalítico, atividade ótima em condições suaves
de temperatura e pH e ambientalmente limpas, além de formação de poucos ou nenhum
sub-produto. Também deseja-se que o biocatalisador do processo tenha potencial para
atividade em solventes orgânicos (Chatterjee e col, 2000).

Os biocatalisadores utilizados geralmente são células inteiras, enzimas presentes

no microrganismo, quer seja em crescimento, em repouso ou até mesmo
“permeabilizadas”. Tanto as células íntegras quanto as enzimas podem ser utilizadas em
sua forma livre ou imobilizada. A imobilização consiste na fixação do biocatalisador em
uma matriz sólida ou no aprisionamento entre membranas semi-permeáveis. A
imobilização tem como objetivos a recuperação e reutilização de produtos, promover
estabilidade do substrato e de enzimas, aumentar a produtividade, diminuição de custos,
entre outros (Carballeira e col, 2009).

De um modo geral, bioconversões químicas catalisadas enzimaticamente são

bem aceitas pelas indústrias química e farmacêutica. Os primeiros processos industriais
que se enquadram na definição de biotransformação são a oxidação de álcool a ácido
acético por Bacterium xylinum e Acetobacter aceti, a oxidação de glicose a ácido
glucônico por Acetobacter aceti e a oxidação de sorbitol a sorbose por Acetobacter sp.
(Rodrigues e Moran, 2001). A atual preocupação com o meio ambiente e a busca por
fontes renováveis culminaram em algumas restrições ambientais, sobretudo a
compostos orgânicos emergentes, o que trouxe a via microbiana como forte competidor
ao cenário da síntese química. (Mishra e col, 2008).

Devido à eficiência em condições reacionais suaves e a alta atividade catalítica

em comparação aos catalisadores convencionais, a utilização de biocatalisadores na
indústria é objeto de muitas pesquisas (Dalla-Vecchia e col, 2004). Este processo pode
ser otimizado através de diferentes estratégias, abordando a operação envolvida, o tipo
de reator, fatores físicos e químicos que interfiram na atividade da enzima, como pH,
osmolaridade, temperatura, proporção entre catalisador e substrato, presença de
inibidores ou ativadores, a linhagem utilizada, o tipo de enzima (se constitutiva ou
induzida), entre outros fatores (Bernal e col, 2007).

Dentre os diversos métodos que podem ser empregados em biotransformação,

destacam-se como os mais frequentes a adição do substrato, quer seja durante o
crescimento microbiano ou em células previamente crescidas, e o isolamento de
enzimas.

Quando a biotransformação ocorre com células em crescimento, a adição do

substrato pode ocorrer no momento da inoculação ou através de adições em intervalos
regulares. No primeiro caso, há que se considerar uma possível inibição do crescimento
do microrganismo em determinadas concentrações do substrato, já que a
biotransformação e o crescimento celular ocorrem concomitantemente. Essa inibição
pode ser contornada controlando-se a adição do substrato, em pequenas quantidades e
em diferentes intervalos, ou seja, em batelada alimentada (Bauer e col, 2005).

Outro método alternativo para inibição acarretada pelo substrato é a

biotransformação utilizando células previamente crescidas. Este método é dividido em
duas etapas, sendo a primeira responsável pela obtenção de biomassa e a segunda a sua
utilização em um meio diferente do primeiro, adequado à biotransformação. Desta
forma, utilizar a célula para a biotransformação após separá-la do meio de crescimento
permite a otimização de cada etapa do processo, através da utilização de diferentes e
mais adequadas condições ambientais (Medeiros, 2002). O meio de biotransformação
nesse método é bem simples, composto apenas de água ou tampão. Em alguns casos, no
entanto, é necessário adicionar a esse segundo meio um nutriente ou substância, a fim
de manter a viabilidade celular e auxiliar na regeneração de um cofator, quando este for
exigido pela enzima responsável pelo processo (Muniruzzaman e col., 1995). A
quantidade reduzida de nutrientes torna o meio de biotransformação pouco propício à
contaminação, além de facilitar a recuperação do produto (Chatterjee e col., 2000). A
realização da biotransformação em separado do crescimento em alguns casos também
permite a utilização das células em meios orgânicos.

Em algumas situações, a permeabilidade do substrato ou do produto é

dificultada pela própria membrana celular. Nestes casos, considera-se a utilização de
enzimas isoladas. Esse tipo de biotransformação também mostra-se vantajosa quando
existem reações laterais indesejáveis, quando há degradação do produto e,
principalmente, quando a enzima já é comercializada ou quando esta pode ser
facilmente isolada e purificada, tendo como princípio de que este é um processo de alto
custo. Entretanto, quando a enzima desejada é intracelular ou dependente de um cofator,
é preferível utilizar as células intactas, já que estas possuem a capacidade de regenerar
por si só o cofator (Fauconnier e col., 1999).

Embora tradicionalmente o processo de produção de DHA seja considerado uma

fermentação, sendo uma oxidação direta catalisada por uma única enzima e em uma
única etapa, sem passar pelo complexo metabolismo microbiano, se encaixa
perfeitamente na definição de biotransformação ou biocatálise, qual seja, “modificação
de um composto orgânico em outro estruturalmente similar, através de um pequeno
número de reações específicas, simples e quimicamente definidas, catalisadas por
enzimas isoladas ou em células íntegras” (Medeiros, 2002). Alguns autores já fazem
esta consideração para o processo de fermentação acética (Kieslich, 1984), que é
também uma oxidação realizada por microrganismos da mesma gênero de
Gluconobacter. Em última instância, esse processo pode ser considerado uma síntese
orgânica, biocatalisada.

Considerando o processo como biotransformação ou biocatálise, o fato de a

enzima não ser dependente de coenzima abre precedente para que o processo possa ser
facilmente realizado pela enzima isolada ao invés da célula íntegra (Medeiros, 2002).
No entanto, a purificação de enzimas é trabalhosa e tem custo elevado, o que poderia
inviabilizar o processo. Portanto, a utilização de células íntegras aparece como melhor
alternativa.

Considerando, ainda, que Gluconobacter oxydans sofre inibição do crescimento

pelo substrato e pelo produto no processo de formação de DHA, a utilização de células
já crescidas seria uma solução para contornar esse problema. Assim, a biomassa seria
utilizada em condições ótimas de produção, sem a necessidade de manter condições
para o crescimento. Outra proposta seria o uso de células secas em acetona, chamado
por alguns autores de “acetone powder”. Esse preparado é feito desidratando as células
em acetona (Korn e col, 1956; Nakamura e col, 2003, Matsumura e col, 1997; Hamada
e col, 2001, Cavalcanti e col, 2007). Entre as vantagens desse método cita-se alta
especificidade de substrato, relação favorável entre o biocatalisador e o substrato,
facilidade de preparação, reprodutibilidade e possibilidade de armazenamento das
células por longo período de tempo (Nakamura e col, 1996, Nakamura e col, 2003).
Preparados de células secas foram utilizados com grande exito em reduções assimétricas
por Geotrichum candidum (Nakamura e col, 1996; Nakamura e col, 1998; Nakamura e
col, 2000; Hamada e col, 2001) e na preparação de derivados de xilana por
Aureobasidium pullulans (Matsumura e col, 1997; Nakamura e col, 2000).

3.6 GLICEROL
 O glicerol é tradicionalmente produzido por processos fermentativos ou a partir de
derivados do petróleo por via química e mais recentemente, também passou a ser obtido
como subproduto da produção de biodiesel (da Silva e col., 2009). O termo glicerol
aplica-se somente ao componente químico puro 1,2,3-propanotriol, já o termo glicerina
aplica-se normalmente a produtos contendo pelo menos 95% de glicerol.

No processo de produção do biodiesel, em torno de 10% (w/w) de glicerol é

formado (Gupta e col., 2009; da Silva e col., 2009). Este subproduto, após tratado com
ácido, geralmente, clorídrico ou fosfórico, passa a ser denominado glicerina loira, com
cerca de 80% de glicerol. Considerando a demanda por biocombustíveis em todo o
mundo, tem-se que o biodiesel é uma das alternativas mais promissoras e tende a ter o
seu consumo aumentado (Gonzalez e col, 2008; da Silva e col., 2009, Hu e col, 2010,
Turon e col, 2012). Em 2010, o consumo nacional de biodiesel alcançou 2,5 bilhões de
litros e a expectativa é que o país torne-se independente dentro dos próximos cinco
anos. Também há previsão de aumento da concentração do biodiesel no combustível,
podendo alcançar cerca de 20% da composição do combustível em 2020
(http://www.biodieselbr.com/noticias/em-foco/consumo-biodiesel-cresce-pais-
270111.htm , acessado em 25/03/12). Com a crescente demanda mundial por biodiesel,
num futuro próximo, o glicerol pode estar em excesso no mundo, representando sérios
problemas econômicos e ambientais. Alguns impactos já podem ser verificados, como a
grande queda no preço do glicerol, o fechamento de empresas produtoras desse
composto por síntese química e o custo para dispor o excesso de glicerol pelos
produtores de biodiesel (da Silva e col., 2009; Saxena e col., 2009; Gonzalez e col.,
2008).

O manejo desse glicerol para sua utilização como fonte de carbono em processos
fermentativos ou como substrato em processos de biocatálise para obtenção de
compostos e moléculas com elevado interesse econômico é uma das aplicações mais
estudadas. Por ser uma molécula altamente funcionalizada, o glicerol torna-se
extremamente versátil em condições catalíticas adequadas podendo originar diversos
produtos (Mishra e col, 2008). Além de ser uma matéria-prima abundante e de baixo
custo, o glicerol é mais facilmente convertido a alguns produtos do que os açúcares,
como por exemplo na produção de succinato, etanol, xilitol, hidrogênio, propionato
entre outros (da Silva e col., 2009).

O glicerol obtido como subproduto da produção de biodiesel apresenta elevado

teor de impurezas como água, catalisador alcalino, ácidos graxos, entre outros. Sendo o
processo de purificação de alto custo, procura-se utilizar o glicerol em processos que
não dependam de alto grau de pureza, como a hidrogenólise, para obtenção de
propilenoglicol, a eterificação, esterificação, desidratação, oxidação para obtenção de
DHA, entre outros (Mota e Pestana, 2011, Turon e col, 2012).

Considerando a importância do custo financeiro na viabilidade industrial de um

bioprocesso, tem-se que substituir uma fonte de carbono tradicional, como a glicose,
pelo glicerol, torna o processo menos oneroso (da Silva et al., 2009; Turon e col, 2012).
O glicerol pode ser utilizado como fonte de carbono por um número elevado de
microrganismos (Da Silva e col, 2009). No entanto, como o glicerol bruto, obtido como
subproduto da indústria do biodiesel, é impuro, essas impurezas podem causar
problemas para o microrganismo produtor, conforme tem sido relatado por alguns
pesquisadores (Saxena e col., 2009). É importante encontrar soluções para minimizar a
ação dessas impurezas sobre o microrganismo.

Nos últimos anos, a utilização de glicerol em processos microbianos tem sido

muito estudada, destacando a síntese de 1,3-propanodiol por Clostridium
acetobutylicum e Clostridium sp. Ácido cítrico, ácidos graxos poliinsaturados (AGPI),
carotenóides, ácido succínico estão entre os principais produtos de alto valor baseados
em fermentações que utilizam o glicerol como substrato (Turon e col, 2012). Outros
compostos químicos de relevância comercial podem ser produzidos por
microorganismos como Propionibacterium, Anaerobiospirillum, espécies de
Escherichia, Citrobacter entre outros, crescidos em glicerol bruto, oriundo da produção
do biodiesel (Yazdani e Gonzáles, 2007).

Estudos recentes mostraram a capacidade de microrganismos, tais como

Klebsiella, Clostridium e Enterobacter, crescerem anaeobicamente em meios contendo
glicerol como única fonte de carbono, que pode ser metabolizado tanto pela via
oxidativa como pela via redutiva. Na via oxidativa, a conversão de glicerol em
dihidroxiacetona é catalisada pela enzima glicerol desidrogenase NAD + dependente,
sendo posteriormente fosforilado pela enzima da via glicolítica dihidroxiacetona
quinase e, então, canalizado para a glicólise. A via de redução é catalisada pela
coenzima glicerol desidratase B12-dependente e por diol-desidratases, que convertem o
glicerol em 3-hidroxipropionaldeído, que através da 1,3-propanodiol desidrogenase
NADH+H+(1,3-propanodiol-oxidoredutase) é reduzido, regenerando o NAD+ e
obtendo-se o 1,3-propanodiol, sendo este um produto altamente específico da
fermentação do glicerol, não sendo obtido por outro processo anaeróbico (da Silva e col,
2009).

Ainda, em diversas leveduras, como Saccharomyces cerevisiae, o glicerol é

degradado através de sua conversão em dihidroxiacetona ou via glicerol quinase,
obtendo-se glicerol-3-fosfato, que pode ser utilizado quer como um precursor para
biossíntese de lípidios ou na conversão em dihidroxiacetona fosfato, podendo ser
transformada em gliceraldeído-3-fosfato pela isomerase triose fosfato na glicólise ou
servindo como substrato para o síntese de outros metabolitos. Vias parecidas para
oxidação do glicerol estão presentes em Klebsiella pneumoniae, Gluconobacter oxydans
e C. acetobutylicum (da Silva e col, 2009).
4 METODOLOGIA

4.1 MICRORGANISMOS

Foram utilizadas as linhagens Gluconobacter oxydans subsp. suboxydans CCT

0174 e Gluconobacter oxydans subsp. suboxydans CCT 0552 (IFO 3172, ATCC 23774
e ATCC 621), adquiridas da Coleção de Culturas Tropical (CCT - Fundação André
Tosello).

As linhagens foram conservadas congeladas a - 5°C, em presença de glicerol

50%. Para obtenção do cultivo de trabalho, as células congeladas foram transferidas
para meio de cultivo líquido contendo (g/L): (NH4)2SO4, 2,0; K2HPO4, 0,1; KH2PO4,
0,9; MgSO4.7 H2O, 1,0; extrato de lêvedo, 2,5; glicerol, 25 e após o seu crescimento a
30º C por 24 h e sob agitação, foram repicadas para meio solidificado contendo a
mesma composição do meio anterior, substituindo o glicerol por sorbitol 50 g/L, com a
adição de agar-agar 20 g/L e incubadas por 5 dias.

4.2 PRODUÇÃO DE DIHIDROXIACETONA (DHA) POR CÉLULAS EM

CRESCIMENTO (FERMENTAÇÃO)

Os experimentos foram realizados para o levantamento da cinética de produção

de DHA, do crescimento celular, do pH e da atividade enzimática das duas linhagens.

4.2.1 Preparo do inóculo

 O inóculo foi preparado a partir do cultivo de trabalho crescendo as células em
frascos Erlenmeyers de 250 mL com 100 mL de meio líquido contendo (NH4)2SO4, 2.0;
K2HPO4, 0.1; KH2PO4, 0.9; MgSO4.7 H2O, 1.0; extrato de lêvedo, 2.5; glicerol, 25; em
pH 5,5, por 24 h, 30º C e sob agitação de 180 rpm (agitador incubador Superohm G-25).

4.2.2 Condições de cultivo

Os experimentos foram realizados em duplicata em frascos erlenmeyers de 250

mL, contendo 100 mL do mesmo meio de cultivo do inóculo, sendo a concentração de
glicerol de 50g/L e o pH de 5.5. As amostras foram constituídas de todo o conteúdo do
frasco e retiradas em intervalos regulares. As células foram separadas por centrifugação
a 3500 rpm por 10 minutos (Sigma 2K15 – Labozentrifugen) e o pH foi medido
(Corning pHmeter 320), sendo as células posteriormente utilizadas para a determinação
da concentração celular e da atividade enzimática. A DHA foi analisada no
sobrenadante.

4.3 PRODUÇÃO DE DHA POR BIOTRANSFORMAÇÃO UTILIZANDO

CÉLULAS SECAS DE Gluconobacter oxydans:

4.3.1 Obtenção da biomassa

O cultivo foi realizado em frascos erlenmeyers de 250 mL, contendo 100 mL do

mesmo meio de cultivo usado no item 4.2.1, sendo a concentração de glicerol de 50 g/L
e o pH 5,5. Cada frasco recebeu 5 mL da suspensão de células do inoculo, crescido
como em 4.2.1. A incubação foi realizada por 24 horas, sob agitação de 180 rpm e
temperatura de 30º C. Após o crescimento, as células foram separada por centrifugação
a 3500 rpm por 10 minutos e lavada com água estéril, utilizando tubos do tipo Falcon
estéreis. A biomassa foi armazenada congelada a -5º C até o momento do uso.

4.3.2 Determinação das melhores condições de secagem

Para a seleção das melhores condições de secagem das células empregou-se um

planejamento experimental delineamento composto central rotacional (DCCR), 22
acrescido de 3 repetições no ponto central. As duas variáveis escolhidas para o estudo
foram a concentração de acetona e o tempo de exposição. O domínio estudado está
apresentado na Tabela 1. A biomassa obtida anteriormente foi ressuspensa em 30 mL de
acetona gelada na concentração experimental indicada, sendo mantida sob agitação de
180 rpm, pelo tempo estipulado para cada ensaio.

Após secas, as células (todo o conteúdo da secagem) foram centrifugadas

(Eppendorf Centrifuge 5403) sob condições estéreis e separadas da acetona, lavadas
com água estéril e direcionadas para a medida de atividade enzimática.

Tabela 1 - Domínio utilizado no DCCR para secagem de células

Variável Código -1,414 -1 0 +1 +1,414

Concentração de acetona (%) X1 18 30 59 88 100

Tempo de exposição (h) X2 0,36 2 6 10 11,36

4.3.3 Secagem das células na presença de íons cálcio e magnésio

Um planejamento fatorial fracionado foi utilizado para verificar a influência da

concentração de acetona, tempo de exposição à acetona e concentração dos íons cálcio e
magnésio, na forma de cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, respectivamente. O
domínio utilizado está apresentado na Tabela 2. A biomassa obtida anteriormente foi
resuspensa em 30 mL de acetona gelada nas condições indicadas no experimento, sendo
mantidas sob agitação de 180 rpm, pelo tempo estipulado para cada ensaio.

Após secas, as células (todo o conteúdo da secagem) foram centrifugadas

(Eppendorf Centrifuge 5403) sob condições estéreis e separadas da acetona, lavadas
com água estéril e direcionadas para a medida de atividade enzimática.
Tabela 2 - Domínio utilizado no plano fatorial fracionado para a secagem de células.

Variável Código -1 0 +1

Conc. Ca+2 (g/L) X1 0 2 4

Conc. Mg+2 (g/L) X2 0 13 16

Conc. Acetona(%) X3 0 40 80

Tempo de exposição (h) X4 1 4 7

4.3.4 Acompanhamento da viabilidade celular através de plaqueamento

A eficiência da secagem para a eliminação da viabilidade celular foi

acompanhada através do plaqueamento (25µL da massa de células após secagem mais
100 µL de água estéril, espalhando com alça de Drigalski) em meio solidificado,
contendo (g/L) (NH4)2SO4, 2.0; K2HPO4, 0.1; KH2PO4, 0.9; MgSO4.7 H2O, 1.0; extrato
de lêvedo, 2.5; sorbitol 50; ágar, 20. As placas foram acompanhadas durante uma
semana, a fim de verificar possível crescimento.

4.4 PRODUÇÃO DE DHA POR BIOTRANSFORMAÇÃO UTILIZANDO

CÉLULAS CRESCIDAS DE Gluconobacter oxydans

4.4.1 Obtenção de biomassa

Para obtenção da biomassa, o crescimento do microrganismo foi realizado

conforme o item 4.3.1.

4.4.2 Determinação das melhores condições de pH e temperatura

 Foi realizado um planejamento experimental Delineamento Composto Central
Rotacional (DCCR), 2 ² para duas variáveis, pH e temperatura, acrescido de 3 repetições
no ponto central. O domínio utilizado no planejamento está apresentado na Tabela 3. A
biomassa anteriormente obtida foi adicionada à 30 mL de meio reacional, composto por
tampão McIlvaine contendo 50 g/L de glicerol, sendo mantida sob agitação de 180 rpm,
por temperatura e pH estipulados para cada experimento. Em seguida, foi separada por
centrifugação em tubos tipo Falcon, procedendo-se as análises para quantificar a
dihidroxiacetona produzida. Para a análise estatística dos dados foi utilizado o programa
software Statistica 5.5 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA)

Tabela 3 - Valores utilizados no DCCR para biotransformação por células crescidas

Variável Código -1,414 -1 0 +1 +1,414

Temperatura (°C) X1 20,36 26 30 34 39,64

pH X2 4,09 4,5 5,5 6,5 6,91

4.4.3 Produção de DHA por células crescidas

A biomassa foi obtida como descrito anteriormente. Para o experimento foram

utilizadas duas concentrações de glicerol: 50 g/L e 25 g/L. As células foram suspensas
em 30 mL de meio reacional, composto por tampão McIlvaine contendo glicerol. A
reação foi mantida em agitação de 180 rpm, nas melhores condições previstas pelo
planejamento experimental anterior, ou seja, 4,5 de pH e 34°C, para G. oxydans CCT
0552 e 4,5 de pH e 26°C para G. oxydans CCT 0174. O experimento foi acompanhado
por 5 horas, sendo retiradas amostras em 1, 3 e 5 horas. O experimento foi realizado em
duplicata.

4.4.4. Influência do tempo de estocagem na atividade celular

As células, após estocagem a -5º C por diferentes períodos de tempo, foram

utilizadas na determinação da atividade da enzima glicerol desidrogenase. As células
foram suspensas em 30 mL de meio reacional, composto por tampão McIlvaine
contendo 50g/L de glicerol. A reação foi mantida em agitação de 180 rpm, nas melhores
condições previstas pelo planejamento experimental anterior, ou seja, 4,5 de pH e 34°C,
para G. oxydans CCT 0552 e 4,5 de pH e 26°C para G. oxydans CCT 0174. O tempo de
reação foi de uma hora. O experimento foi realizado em duplicata.

4.5 MÉTODOS ANALÍTICOS:

4.5.1 Determinação da concentração celular

A concentração celular foi determinada pelo método da densidade ótica

associada ao peso seco, por leitura de absorbância em espectrofotômetro a 540 nm.

4.5.2 Concentração de DHA

A DHA foi medida pelo método da difenilamina (Tkác e col, 2001). O reagente
difenilamina foi preparado com 0,6 g de difenilamina (LCG Biotecnologia), 6 mL de
ácido sulfúrico 98% (Vetec) e 54 mL de ácido acético 99% (Vetec). Para a análise,
foram adicionados 4,5 mL do reagente de difenilamina e 0,5 mL da amostra. Tubos
fechados contendo reagente e amostra foram incubados em água em ebulição por 20
minutos. Após arrefecimento, a absorbância da solução foi lida em 615 nm. A curva
padrão obtida foi linear entre 0,06 e 0,3 g/L de DHA.

4.5.3 Atividade da enzima glicerol desidrogenase nas células

A atividade da enzima glicerol desidrogenase das células foi medida colocando-

se as células em contato com uma solução de glicerol e determinando-se a concentração
de DHA formada. A reação foi realizada em frascos erlenmeyers de 250 mL, contendo
50 mL de glicerol 50 g/L em tampão MacIlvaine agitados a 180 rpm à 30° C por 1
hora. Após a separação das células por centrifugação, o sobrenadante foi utilizado para
análise de DHA. A atividade foi expressa pela quantidade de DHA formada por unidade
de massa celular. O experimento foi realizado em duplicata.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 CONSTRUÇÃO DAS CURVAS-PADRÃO

Na primeira etapa do trabalho foi realizada a implantação dos métodos de

análise para a dosagem do produto – dihidroxiacetona – e da concentração celular
(método da densidade ótica associada ao peso seco de células). Os dois métodos
utilizados foram espectrofotométricos. As curvas de calibração exigidas para proceder
com as metodologias de análise foram construídas periodicamente, a fim de garantir a
validade das mesmas. Para os dois casos, as curvas obtidas apresentaram boa
linearidade e coeficiente de determinação (R2) próximo a 1. Nas Figuras 3 e 4 está
apresentada uma das curvas obtidas para cada método.

0,7
Densidade Òtica (Absorvância)

0,6

0,5
y = 1,9476x + 0,0402
0,4
R² = 0,9942
0,3

0,2

0,1

0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
Concentração (g/L)

Figura 3 – Curva calibração concentração DHA x absorvância.

 0,7

Densidade Ótica (Absorvância) 0,6

y = 3,1767x - 0,0067
0,5 R² = 0,9861

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 0,05 0,1 0,15 0,2
Peso Seco (g/L)

Figura 4 – Curva de calibração concentração x absorvância para linhagem G.

oxydans 0174

5.2 PRODUÇÃO DE DHA POR CÉLULAS EM CRESCIMENTO

(FERMENTAÇÃO)

A cinética foi acompanhada num processo com células em crescimento, isto é, o

processo tradicionalmente usado para a produção de DHA. O conhecimento da cinética
permitiu obter informações sobre a relação entre o crescimento microbiano e a formação
de DHA. Além disso, a atividade das células em relação à enzima glicerol
desidrogenase foi medida, de forma a determinar a idade celular que apresentava maior
atividade para uso nos ensaios de biotransformação. O crescimento microbiano e a
produção de DHA foram acompanhados durante 72 horas. Também foi verificada a
variação do pH do meio.

5.2.1 Cinética do crescimento microbiano

O perfil do crescimento microbiano (Figura 5) mostra que a taxa de crescimento

nas primeiras 24 horas foi maior, atingindo 0,5 e 0,4 g/L de massa celular seca, para as
linhagens G.oxydans CCT 0552 e G. oxydans CCT 0174, respectivamente. Em seguida
foi observado um platô entre 24 e 32 horas, para a linhagem G. oxydans CCT 0552, e
entre 24 e 49 horas para a linhagem G. oxydans CCT 0174. Após os respectivos
intervalos, foi observado, novamente, aumento no crescimento em função do tempo
atingindo 0,9 g/L e 0,6 g/L de massa celular seca, respectivamente para as linhagens G.
oxydans CCT 0552 e G. oxydans CCT 0174.

1,2

0,8
Peso Seco (g/L)

0,6

0,4

0,2

0
-20 0 20 40 60 80
-0,2
Tempo (h)

Figura 5 - Cinética do crescimento microbiano. Linha inteira: G. oxydans CCT

0552. Linha tracejada: G. oxydans CCT 0174.

Embora a concentração máxima obtida tenha sido diferente em cada uma das
linhagens, o perfil de ambas foi concordante. Wethmar e Deckwer (1999) utilizando G.
oxydans CCT 0552 obtiveram concentração celular de 0,8 g/L em 24 horas de cultivo,
compatível com a observada no presente trabalho. Em comparação, Wei e col (2007)
utilizando outra linhagem, G. oxydans DSM 2003, obtiveram 4 g/L de células ao final
das mesmas 24 horas de cultivo.

Os estudos de Wethmar e Deckwer (1999) e Wei e col (2007) foram conduzidos

por aproximadamente 30 horas. Gatgens e colaboradores (2007) acompanharam o
crescimento de G. oxydans DSM 2343 durante 48 horas. Nesses estudos, o tempo de
acompanhamento da cinetica provavelmente não foi suficiente para observar a retomada
do crescimento microbiano, como verificado no experimento relatado na Figura 5.
5.2.2 Cinética da produção de DHA

A produção de DHA (Figura 6) mostrou-se máxima em 49 horas, com

aproximadamente 24g/L de DHA para a linhagem G. oxydans CCT 0552 e em 56 horas,
com cerca de 22 g/L de DHA para a linhagem G. oxydans CCT 0174. Após isso, foi
observada queda na concentração do produto.

30

25

20
DHA (g/L)

15

10

0
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)

Figura 6 - Cinética da produção de DHA. Linha inteira: linhagem G. oxydans CCT

0552. Linha tracejada: linhagem G. oxydans CCT 0174.

Wei e colaboradores (2007) observaram em seus trabalhos que as maiores taxas

de oxidação de substratos correlacionam-se com uma baixa produção de biomassa.
Segundo esse autor, isso se deve as peculiaridades do metabolismo de G.oxydans, onde
as vias Embden-Meyerhof-Parnas e do citrato são incompletas, o que culmina em baixa
eficiência da oxidação fosforilativa e, consequentemente, utilização inadequada dos
substratos.

Hu e colaboradores (2010) estudaram os efeitos da manutenção da concentração

de oxigênio dissolvido na produção de DHA por G. oxydans ZJB09112, em
fermentação por batelada alimentada e verificaram que a estabilidade da biomassa é um
fator crucial nesse processo. O autor considerou esse bioprocesso como sendo dividido
em dois estágios: um de crescimento celular e outro de produção de DHA. Durante as
primeiras 24h, verificou-se uma proporcionalidade entre o crescimento celular e a
produção de DHA. Segundo o autor, nessa fase, o glicerol foi utilizado não somente
como fonte de carbono para o crescimento celular, mas também como substrato para
produção de DHA. Após 24h, no entanto, Hu verificou quase que exclusivamente a
produção de DHA, sendo sua maior parte biossintetizada nesse estágio, enquanto que a
biomassa manteve-se constante.

As observações de Wei e colaboradores (2007) e Hu e colaboradores (2010)

corroboram com o observado no presente trabalho. Para ambas as linhagens, a
concentração de DHA aumentou com o aumento da concentração celular nas primeiras
horas. A partir de 24 horas de cultivo, quando o crescimento ficou constante, houve
maior produção de DHA, provavelmente pelo fato de que uma pequena parcela do
glicerol foi destinada a manutenção das condições fisiológicas das células enquanto a
maior parte foi utilizada como substrato para bioconversão em DHA. Aparentemente,o
observado não corresponde a uma diauxia, pois não houve quedana concentração de
DHA, ao contrário a produção aumentou.

5.2.3 Medida do pH

Para ambas as linhagens em estudo foi verificado que o pH decresceu até

aproximadamente 24 horas (Figura 7a e b) de cultivo, estabilizando a partir desse tempo
em um pH próximo a 3.
 6

pH 4

0
0 20 40 60 80
Tempo (h)

(a)

4
pH

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)

(b)

Figura 7 - Cinética da variação do pH durante o crescimento celular. Linhagem

G. oxydans CCT 0552 (a); Linhagem G. oxydans CCT 0174 (a).
 Essa observação corrobora com o observado por outros autores, segundo os
quais, a acidificação seria oriunda dos produtos reduzidos que se acumulam no meio de
cultura (Matsushita e col, 1989). Sob essas condições, a concentração celular foi
constante. Este fato também é coerente com o perfil de crescimento observado para
ambas as linhagens a partir de 24 horas, quando ambas demonstraram um platô (Figura
5).

Há evidências indiretas de que o citocromo C, componente em abundância na

cadeia respiratória de G. oxydans, seja dependente de regulação pelo pH, aumentando
em quantidade a medida que o pH se torna ácido até um certo valor (Matsushita e col,
1989; Hanke e col, 2012). Logo, o transporte de elétrons na cadeia respiratória seria
prejudicado. Pela Figura 6 é possível notar um aumento da formação de DHA a partir
das 24 h. Pelos dados, assim que o pH mais favorável à cadeia respiratória foi atingido,
houve aumento da produção de DHA.

5.2.4 Análise da atividade enzimática

Para a análise da atividade enzimática, a biomassa gerada em cada amostra foi

utilizada. Para a linhagem G. oxydans CCT 0552, a concentração de DHA obtida na
medida de atividade foi maior (0,48 g/L) com células com 24 horas de idade (Figura
8a). A atividade vista em relação à quantidade de DHA produzida mostrou-se
proporcional ao crescimento microbiano até 24 horas, após isso nota-se uma queda
nessa atividade, que coincide com o momento em que o crescimento celular entrou em
fase estacionária (Figura 8a e b). Em aproximadamente 50 horas, no entanto, a produção
apresentou um pequeno aumento, voltando a decrescer em seguida.
 0,7 1,2

0,6 1

0,5
0,8

Biomassa (g/L)
0,4
DHA (g/L)

0,6
0,3
0,4
0,2
0,2
0,1

0 0
0 20 40 60 80
-0,1 -0,2
Idade das Células/tempo (h)

(a)

0,80 0,8000

0,70 0,7000

0,60 0,6000

0,50 0,5000
DHA (g/L)

Biomassa
(g/L)

0,40 0,4000

0,30 0,3000

0,20 0,2000

0,10 0,1000

0,00 0,0000
0 20 40 60 80
Idade das Células/tempo (h)

(b)

Figura 8 - Atividade celular relativa à enzima glicerol desidrogenase, apresentada em

termos de concentração da dihidroxiacetona formada na análise versus idade das
linhagens de G. oxydans e peso seco de células versus tempo de cultivo. Linha: peso
seco de células; : DHA. (a) CCT 0552; (b) CCT 0174.
 Para linhagem G. oxydans CCT 0174 a concentração de DHA obtida na medida
de atividade, assim como a linhagem anteriormente citada, foi maior em células com 24
horas de idade celular, com aproximadamente 0,57g/L de DHA (Figura 8b). Após esse
tempo, a atividade decresceu, demonstrando que a mesma é inversamente proporcional
a idade celular. Assim como na linhagem G. oxydans CCT 0552, a queda na atividade
em termos de concentração de DHA formada, coincide com o momento em que o
crescimento celular entrou em fase estacionária.

Sob outra perspectiva, a análise da atividade da glicerol desidrogenase por

grama de biomassa (g DHA/g célula), mostrou que as células mais ativas foram as com
idade celular de 8 horas, com aproximadamente 3,3g DHA/g biomassa para a linhagem
G. oxydans CCT 0552 e 2,7 g DHA/g biomassa para a linhagem G. oxydans CCT 0174
(Figura 9a e b). A atividade decai até zero em 72 horas para ambas as linhagens. Isso
corrobora com a Figura 8 e com a diminuição da concentração de DHA no final do
crescimento, observada na cinética de produção (Figura 6). A baixa atividade celular e o
contínuo aproveitamento da DHA para manter as células podem ter levado a diminuição
observada na concentração.
 3,5

2,5
g DHA/ g Célula

1,5

0,5

0
0 8 24 32 49 56 72
Idade das células (h)

(a)

3,0000

2,5000

2,0000
g DHA/ g Célula

1,5000

1,0000

0,5000

0,0000
0 8 24 32 49 56 72
Idade das células (h)

(b)

Figura 9 – Atividade celular relativa à enzima glicerol desidrogenase, apresentada em

termos de quantidade de DHA (g) formada por grama de célula versus a idade das
células. (a) G. oxydans CCT 0552; (b) G. oxydans CCT 0174.

As células mais ativas foram as de 8 horas de idade para ambas as linhagens. No

entanto, apesar de as células estarem mais ativas em 8 horas de cultivo, a massa total
obtida foi muito baixa (0,05 g/L para G. oxydans CCT 0552 e 0,14g/L para G. oxydans
CCT 0174). Considerando também os dados apresentados na Figura 9, escolheu-se
como idade celular adequada à obtenção das células mais ativas, o tempo de 24 horas,
que forneceu 0,5 g/L de células com atividade de 0,97 g DHA/ g biomassa, para G.
oxydans CCT 0552 e 0,4 g/L de células com atividade de 0,67 g DHA/ g biomassa, para
G. oxydans CCT 0174. Mediante o observado, os experimentos com células secas foram
realizados com células de 24 horas de idade.

5.3 PRODUÇÃO DE DHA POR CÉLULAS SECAS EM ACETONA

A conversão de glicerol em DHA é realizada em uma etapa por uma única

enzima e, por isso, esse processo pode ser considerado como uma biotransformação ou
biocatálise. A utilização de células secas permitiria o uso da enzima, como uma
imobilização natural, sem a necessidade de isolá-la e sem interferência do metabolismo
celular.

Essa estratégia foi testada utilizando as células de 24 horas de idade, conforme

dados de atividade obtidos no ensaio de cinética.

Para a seleção das melhores condições de secagem das células empregou-se um

planejamento experimental delineamento composto central rotacional (DCCR), 22
acrescido de 3 repetições no ponto central. As duas variáveis escolhidas para o estudo
foram a concentração de acetona e o tempo de exposição.

A linhagem G. oxydans CCT 0552 após secagem não apresentou atividade em

nenhum dos ensaios. A linhagem G. oxydans CCT 0174 apresentou baixa atividade. Os
resultados dos ensaios experimentais para essa linhagem estão apresentados na Tabela
4.
Tabela 4 – Matriz do DCCR para secagem de células de G. oxydans CCT 0174 e
resultados obtidos.

Ensaios Concentração Tempo de Produção de Observação do

de acetona exposição à DHA crescimento em
acetona (horas) placa
(gDHA/gcél)

1 30 2 0,024 sem crescimento

2 88 2 0,031 sem crescimento

3 30 10 0,021 sem crescimento

4 88 10 0,033 sem crescimento

5 18 6 0,037 pouco crescimento

6 100 6 0,012 sem crescimento

7 59 0,36 0,023 sem crescimento

8 59 11,36 0,022 sem crescimento

9 59 6 0,035 sem crescimento

10 59 6 0,026 sem crescimento

11 59 6 0,020 sem crescimento

A secagem se mostrou eficiente para eliminar a viabilidade celular, fato

observado através da inexistência de crescimento microbiano após exposição à acetona.
Ou seja, a formação de DHA verificada foi gerada pela presença da enzima no
preparado seco e não pela metabolização do glicerol pelo microrganismo. Conclui-se
que a formação da DHA nesse caso pode ser considerada biotransformação, Como a
secagem foi eficiente e a linhagem G. oxydans CCT 0174 apresentou atividade, essa foi
a selecionada para os próximos experimentos.

A produção de DHA pelas células secas de G. oxydans CCT 0174 foi baixa se
comparada à obtida na fermentação (Tabela 4 e Figura 6). Na tentativa de melhorar os
resultados, nova consulta à literatura foi realizada. Foi verificado que a coenzima
pirroloquinolinaquinona (PQQ), grupo prostético da glicerol desidrogenase, pode ser
desligada da enzima por lavagem com metanol a 90% (Ameyama e col, 1985). Sendo a
acetona um solvente como o metanol a baixa atividade do preparado poderia estar
ligada à remoção do grupo prostético, durante a lavagem das células com acetona.
Ainda na pesquisa bibliográfica, foi verificado que o grupo prostético volta a se ligar à
enzima em presença de íons cálcio e magnésio (Adachi e col, 2003). O cálcio é
necessário para a ligação do grupo prostético com a enzima. Aparentemente o magnésio
auxilia nessa ligação, além de estabilizar a enzima. Esses íons divalentes tem a
capacidade de manter a enzima em sua configuração ativa, ou seja, uma holoenzima
(Adachi e col., 2003).

A adição de íons cálcio e magnésio foi avaliada em um ensaio preliminar se

mostrando válida, e um novo planejamento experimental foi elaborado. Para esse
planejamento as variáveis anteriores, concentração de acetona e tempo de exposição,
foram mantidas , sendo acrescidas a concentração de íons cálcio e concentração de íons
magnésio. O domínio para essas últimas variáveis foi escolhido com base no trabalho de
Lapenaite e col. (2005). Como o número de variáveis foi maior, optou-se por realizar
primeiramente um planejamento fatorial fracionado seguido de um DCCR. Nesse
planejamento o menor nível da variável concentração de acetona foi zero, visando
avaliar a atividade das células sem secagem. A Tabela 5 mostra os resultados obtidos no
planejamento fatorial fracionado.
Tabela 5 - Matriz do plano fatorial fracionado e resultados obtidos para a secagem de
células da linhagem G. oxydans CCT 0174

Ensaios Concentração Concentração Tempo Concentração gDHA/ Observação do

de Ca+2 de Mg+2 gcél crescimento em
(g/L) de de Acetona placa
(g/L) exposição (%)

à acetona
(horas)

1 0 0 1 0 0,253 Com cresc

2 4 0 1 80 0,014 Sem cresc

3 0 16 1 80 0,000 Sem cresc

4 4 16 1 0 0,460 Com cresc

5 0 0 7 80 0,000 Sem cresc

6 4 0 7 0 0,232 Com cresc

7 0 16 7 0 0,058 Com cresc

8 4 16 7 80 0,000 Sem cresc

9 2 13 4 40 0,129 Sem cresc

10 2 13 4 40 0,059 Sem cresc

11 2 13 4 40 0,021 Sem cresc

Os ensaios não demonstraram boa reprodutibilidade, o pode ser constatado pelos

resultados do ponto central. O ensaio no ponto central foi repetido para averiguar a
reprodutibilidade do experimento, mas, mesmo assim, os resultados foram discrepantes.
Provavelmente, existe a influência de alguma variável não considerada no
planejamento. Sendo assim, os resultados não puderam ser tratados estatisticamente.

Apesar de não haver reprodutibilidade, alguns resultados obtidos foram

interessantes. Nos ensaios sem acetona (concentração no nível mais baixo – 0%) as
células mantiveram sua viabilidade, vista pela obtenção de crescimento em placa. Nos
ensaios onde as células foram secas, independente da concentração de acetona, essas
perderam sua viabilidade, verificada pela ausência de crescimento em placa. Nos
ensaios com a concentração mais alta de acetona verificou-se também perda da
atividade enzimática, possivelmente por desnaturação da proteína ou desativação da
enzima por remoção do grupo prostético (PQQ). Nos ensaios com 40% de acetona foi
verificada atividade enzimática maior do que a obtida para a concentração de 30% no
planejamento anterior, mostrando que a presença de cálcio e magnésio favoreceram a
manutenção da atividade enzimática mesmo no processo de secagem. Nos ensaios onde
células estavam suspensas em solução aquosa de cálcio e magnésio isenta de acetona,
pelo mesmo tempo utilizado na secagem das células, foram observados os mais altos
valores de atividade celular. A presença de cálcio e magnésio melhorou ainda mais
esses valores.

Hu e colaboradores (2010) utilizando a linhagem G. oxydans ZJB09112

verificaram que a maior parte da DHA foi sintetizada na fase estacionária. Segundo o
autor, a maior parte do glicerol foi destinada a produção de DHA e pequena parte foi
direcionada para manutenção das condições fisiológicas da célula. Mediante os
resultados do planejamento e das considerações de Hu e colaboradores, vislumbrou-se a
possibilidade da utilização de células já crescidas para a produção de DHA a partir de
glicerol. Sendo assim, os experimentos passaram a ser feitos com as células sem a
secagem com acetona.

5.4 PRODUÇÃO DE DHA COM CÉLULAS CRESCIDAS

O processo industrial de obtenção de DHA utiliza as células em crescimento

para a produção, num processo considerado fermentação; já a utilização de células
crescidas ou seja, em estágio de não proliferação, para a oxidação de glicerol à DHA,
assim como no processo usando células secas, pode ser considerado biotransformação,
uma vez que utiliza as células somente como catalisadores, sem crescimento celular e
em meio simples, constituído apenas de tampão e glicerol. O meio simples também
favorece a etapa de separação e purificação do produto (Nguyen e Nevoigt, 2009).

Visando buscar as condições mais adequadas para a oxidação do glicerol e para

a manutenção da atividade pelas células já crescidas, um novo planejamento fatorial foi
proposto. As variáveis pH e temperatura foram, então, selecionadas com base no
conhecimento de que essas influenciam diretamente na atividade de enzimas. Os valores
comumente relatados na literatura (Bauer e col, 2005; Gatgens e col, 2007) como os
melhores foram utilizados no ponto central e, a partir destes, foram definidos os demais
níveis do domínio. Como o número de variáveis foi pequeno, optou-se por realizar
diretamente um DCCR acrescido de 3 pontos centrais, para avaliar a reprodutibilidade e
permitir a análise de variância.

A tabela 6 mostra os resultados obtidos. A linhagem G. oxydans CCT 0552

voltou a ser considerada nessa nova abordagem.

Tabela 6 - Matriz do delineamento e resultados obtidos para as células crescidas das

linhagens G. oxydans CCT 0552 e G. oxydans CCT 0174.

Ensaios pH Temp g DHA/g cél G DHA/g cél

(linhagem G. oxydans (linhagem G. oxydans

CCT 0552) CCT 0174)

1 4,4 26 1,6539 3,7867

2 6,5 26 1,5014 0,6710

3 4,5 34 1,8047 3,4654

4 6,5 34 1,8114 2,6983

5 4,0 30 2,1638 2,8378

6 6,9 30 0,9628 2,0084

7 5,5 20,36 1,5658 1,7419

8 5,5 39,64 2,0130 2,3073

9 5,5 30 1,1136 1,7917

10 5,5 30 1,1339 1,6572

11 5,5 30 1,2338 1,7867

Como pode ser visto na tabela 6, para ambas as linhagens os melhores resultados
foram obtidos onde o pH foi mínimo. É nítido o efeito negativo do aumento pH sobre a
produção de DHA, quando se compara os ensaios realizados na mesma temperatura (1 e
2, 3 e 4, 5 e 6).

Para a análise estatística dos dados foi utilizado o programa Statistica 5.5
(Statsoft Inc, Tulsa, OK, USA) considerando a produção de DHA por grama célula
como resposta das variáveis em estudo. Foram considerados significativos os
parâmetros com p-valores menores que 5% (p < 0,05).

Para a linhagem G. oxydans CCT 0552, a significância estatística de cada efeito

pode ser vista no diagrama de Pareto (Figura 10). De acordo com o diagrama, apenas os
efeitos à direita da linha que corresponde a um valor de p igual a 0,05, ou seja, as
variáveis pH linear e temperatura quadrática, foram significativos.

Figura 10 - Diagrama de Pareto para a variável resposta (g DHA / g células secas).

Linhagem: G. oxydans CCT 0552. Legenda: Temp: temperatura; L: linear; Q:
quadrática.

A fim de simplificar o modelo, a interação entre pH e temperatura foi excluída

por ter pouca influência sobre a resposta (p = 0,76). Entretanto, apesar de não
significativas, as variáveis pH quadrático e temperatura linear foram mantidas no
modelo, uma vez que sua remoção acarretou uma diminuição grande no coeficiente de
determinação (R2).
 A Tabela 7 mostra a análise de variância. Como F calculado para a regressão
(Fcalc=6,48) foi maior que o tabelado (F tab = 4,53) podemos concluir que o modelo se
ajusta bem aos dados experimentais. O coeficiente de determinação R² =79,63% foi
considerado razoável, considerando a grande variabilidade inerente aos bioprocessos.

Tabela 7 - Análise de variância (ANOVA) para a resposta produção de DHA para a

linhagem CCT 0552.

Soma dos Graus de Quadrado F calc

Quadrados liberdade médio

Regressão 1,384 4 0,346 6,48

Resíduo 0,321 6 0,0535

Total 1,545 10

F tab (4; 6; 0,05) = 4,53

R² = 79,63%

A equação gerada pelo modelo (variáveis normalizadas), que descreve a

influência das variáveis sobre a resposta foi:

DHA (g/g célula) = 1,160 – 0,230*pH + 0,206*pH² + 0,137*T + 0,320*T²

onde T é a temperatura.

Através da equação, da superfície de resposta (Figura 11a) e da curva de

contorno (Figura 11b) geradas pelo modelo, é possível verificar que quanto menor o pH
maior a produção de DHA e que valores muito altos ou muito baixos de temperatura
levam aos melhores resultados. Considerando o domínio em estudo, a temperatura de
34ºC e o pH de 4,5 foram os melhores para a resposta.
 (a)

(b)

Figura 11 – Modelo obtido para a variável resposta em função da temperatura e do pH

Linhagem G. oxydans CCT 0552. (a) Superfície de resposta; (b) Curvas de contorno.

A análise estatística dos dados gerados para a linhagem G. oxydans CCT 0174
está retratada na Figura 12, que mostra a significância estatística de cada efeito no
diagrama de Pareto. De acordo com o diagrama, apenas o efeito à direita da linha que
corresponde a um valor de p igual a 0,05, ou seja, a variável pH linear, foi significativo
Figura 12 - Diagrama de Pareto para a variável resposta (g DHA / g células secas).
Linhagem: G. oxydans CCT 0174. Legenda: Temp: temperatura; L: linear; Q:
quadrática.

A fim de simplificar o modelo, a temperatura quadrática foi excluída por ter

pouca influência sobre a resposta (p = 0,31). Entretanto, apesar de não significativas, as
variáveis pH quadrático, interação entre pH e temperatura e a temperatura linear foram
mantidas no modelo, uma vez que sua remoção acarretou uma diminuição grande no
coeficiente de determinação (R2).

A Tabela 8 mostra a análise de variância. Como F calculado para a regressão

(Fcalc=5,38) foi maior que o tabelado (F tab = 4,53) podemos concluir que o modelo se
ajusta bem aos dados experimentais. O coeficiente de determinação R² =78,18% foi
considerado razoável, considerando, mais uma vez, a grande variabilidade de processos
biotecnológicos.
Tabela 8 - Análise de variância (ANOVA) para a resposta produção de DHA para a
linhagem CCT 0174.

Soma dos Graus de Quadrado F calc

Quadrados liberdade médio

Regressão 2,884 4 0,721 5,38

Resíduo 0,805 6 0,134

Total 3,689 10

F tab (4; 6; 0,05) = 4,53

R² = 78,18%

A equação gerada pelo modelo (variáveis normalizadas), que descreve a

influência das variáveis sobre a resposta foi:

DHA (g/g célula) = 1,344 – 0,431*pH + 0,256*pH² + 0,213*T + 0,399*pH*T

T é a temperatura.

Através da equação, da superfície de resposta (Figura 13a) e da curva de

contorno (Figuras 13b) geradas pelo modelo, é possível verificar que quanto menor o
pH maior a produção de DHA e que valores mais baixos de temperatura levam aos
melhores resultados. Considerando o domínio em estudo, a temperatura de 26ºC e o pH
de 4,5 foram os melhores para a resposta.
 (a)

(b)

Figura 13 – Modelo obtido para a variável resposta em função da temperatura e do pH

Linhagem G. oxydans CCT 0174. (a) Superfície de resposta; (b) Curvas de contorno.

Após a determinação das melhores condições de pH e temperatura, as células

microbianas foram utilizadas para outro experimento, avaliando a oxidação do glicerol
em função do tempo, cuja variação foi de 1 a 5 horas para ambas as linhagens. A Figura
14 mostra a produção de DHA para ambas as linhagens, utilizando uma concentração
inicial de 50 g/L de glicerol. Observa-se que a DHA vai se acumulando no meio de
cultivo com o passar do tempo e que, nitidamente, para a linhagem G. oxydans CCT
0552 a produção de DHA é bem superior à linhagem G. oxydans CCT 0174, sendo ao
final de 5 horas, respectivamente 2,1 e 0,9 g/g biomassa.

2,500

2,000
DHA (g/g biomassa)

1,500

1,000

0,500

0,000
0 1 2 3 4 5 6
Tempo de reação (h)

Figura 14 - Oxidação do glicerol à DHA por células previamente crescidas. Linha

inteira: G. oxydans CCT 0552; Linha tracejada: G. oxydans CCT 0174.

Pela Figura 15 observa-se que a produtividade da linhagem G. oxydans CCT

0552 é constante com o tempo (0,45 g/g biomassa/h), mostrando que as células mantêm
o seu poder catalítico com o decorrer das horas no intervalo estudado. Já a linhagem G.
oxydans CCT 0174 apresentou queda acentuada em sua atividade, reduzindo quase à
metade após 5 horas de reação.
 0,600

0,500
DHA (g/g biomassa/h)

0,400

0,300

0,200

0,100

0,000
0 1 2 3 4 5 6
Tempo de reação (h)

Figura 15 - Produtividade obtida na oxidação de glicerol à DHA por células

previamente crescidas. Linha inteira: linhagem G. oxydans CCT 0552; Linha tracejada:
linhagem G. oxydans CCT 0174.

Tendo em vista os melhores resultados observados para a linhagem G. oxydans

CCT 0552, essa foi escolhida para avaliar a produção e produtividade oxidando glicerol
a uma concentração inicial mais baixa (25 g/L).

Observando as figuras 16 e 17 é possível notar a produtividade foi próxima para

ambas concentrações de glicerol (0,4 g DHA/ g biomassa/ h) e que, como observado
anteriormente (figura 15), essa é constante com o tempo, mostrando que as células
mantém seu poder catalítico. A produtividade foi mantida mesmo quando a
concentração inicial de glicerol foi 50 g/L, mostrando que mesmo a uma concentração
duas vezes maior de glicerol as células continuam funcionando satisfatoriamente, sem
aparente inibição.
 2,500

DHA (g/ g biomassa)

2,000

1,500

1,000

0,500

0,000
0 1 2 3 4 5 6
Tempo de reação (h)

Figura 16 - Oxidação de glicerol 25g/L à DHA por células previamente

crescidas da linhagem G. oxydans CCT 0552.

0,600
DHA (g/ g biomassa/h)

0,500

0,400

0,300

0,200

0,100

0,000
0 1 2 3 4 5 6
Tempo de reação (h)

Figura 17 - Produtividade obtida na oxidação de glicerol 25g/L à DHA por

células previamente crescidas da linhagem G. oxydans CCT 0552.
 Foi observado que a concentração de DHA por grama de biomassa foi menor
neste último experimento em comparação com as células usadas no DCCR. Essa
observação levou ao pensamento de que o tempo de estocagem das células poderia estar
influenciando na atividade. Dessa forma, foi proposto estudar a atividade em relação ao
tempo de estocagem. As células foram guardadas em congelador a -5º C até o momento
do uso. As Tabela 9 e 10 mostram os resultados deste experimento.

Tabela 9 - Atividade celular em relação à glicerol desidrogenase da linhagem G.

oxydans CCT 0552 em 1 hora de reação, utilizando células de 24 horas de idade,
estocadas em congelador a -5º C por diferentes tempos.

TEMPO DE ATIVIDADE PERDA DA

ESTOCAGEM ATIVIDADE (%)
(g DHA/ g Biomassa)

Recém preparadas 0,96 -

7 dias 0,65 32

60 dias 0,32 67

Tabela 10 - Atividade celular em relação à glicerol desidrogenase da linhagem G.

oxydans CCT 0174 em 1 hora de reação, utilizando células de 24 horas de idade,
estocadas em congelador a -5º C por diferentes tempos.
 TEMPO DE ATIVIDADE PERDA DE ATIVIDADE

ESTOCAGEM (%)
(G DHA/ G BIOMASSA)

Recém preparadas 1,33 -

7 dias 0,64 52

60 dias 0,44 70

Comparando-se os valores obtidos, observa-se que as células crescidas mantêm

sua atividade por pelo menos 60 dias, no entanto há uma perda nessa atividade. Isso
explica porque o resultado em uma mesma condição variou de experimento para
experimento. Embora a linhagem G. oxydans CCT 0174 tenha demonstrado uma
atividade maior que a linhagem G. oxydans CCT 0552 em células recém crescidas, a
perda da atividade enzimática para a primeira foi maior. Logo nos primeiros sete dias, a
linhagem G. oxydans CCT 0174 perdeu 52 % de sua atividade, bem maior que a perda
de 32 % observada para a outra linhagem. Ao final dos 60 dias do experimento, a perda
total foi de 70%, um pouco maior que para a linhagem G. oxydans CCT 0552, que foi
de 67 %. Para que as células possam ser utilizadas como catalisador para a oxidação de
glicerol a DHA é necessário escolher um melhor método de conservação das células até
o momento do uso ou otimizar o já utilizado. Esse dado também aponta para a
vantagem potencial do uso de células secas, que, segundo vários autores (Nakamura e
col, 1996, Matsumura e col, 1997; Hamada e col, 2001; Nakamura e col, 2003;) podem
ser estocadas sem perder a atividade.
6- CONCLUSÕES

A cinética do crescimento microbiano mostrou que a taxa de crescimento foi

maior nas primeiras 24 horas para ambas as linhagens estudadas e o máximo de massa
celular seca foi 0,9 g/L e 0,6 g/L, respectivamente para as linhagens G. oxydans CCT
0552 e G. oxydans CCT 0174. Embora a concentração máxima obtida tenha sido
diferente em cada uma das linhagens, o perfil de ambas foi coerente.

A produção de DHA mostrou-se máxima em 49 horas, com aproximadamente

24g/L de DHA para a linhagem G. oxydans CCT 0552 e em 56 horas, com cerca de 22
g/L de DHA para a linhagem G. oxydans CCT 0174. A partir de 24 horas de cultivo,
quando o crescimento celular foi constante, houve maior produção de DHA.

O acúmulo de DHA no meio promoveu a acidificação deste. Para ambas as

linhagens foi verificado que o pH decresceu até aproximadamente 24 horas de cultivo,
estabilizando a partir desse tempo em um pH próximo a 3. A partir desse ponto, a
produção de DHA aumentou, mostrando que o pH baixo pode estar relacionado à
formação do produto.

A análise da atividade enzimática da glicerol desidrogenase mostrou que, para

ambas as linhagens, a produção foi maior em células com 24 horas de idade celular,
com 0,48g/L de DHA para a linhagem G. oxydans CCT 0552 e 0,57g/L de DHA para a
linhagem G. oxydans CCT 0552, nas mesmas condições de ensaio. Após esse tempo, a
produção decresceu, demonstrando que a mesma é inversamente proporcional a idade
celular. Para as duas linhagens, a maior concentração de DHA formada coincide com o
momento em que o crescimento celular estacionou.

As células mais ativas foram as de 8 horas de idade para ambas as linhagens

(3,3g DHA/g biomassa para a linhagem G. oxydans CCT 0552 e 2,7 g DHA/g biomassa
para a linhagem G. oxydans CCT 0174). No entanto, apesar de as células estarem mais
ativas em 8 horas de cultivo, a massa total obtida foi muito baixa (0,05 g/L para G.
oxydans CCT 0552 e 0,14 g/L para G. oxydans CCT 0174).
 Células de 24 horas de idade foram as escolhidas para os experimentos com
células secas e com células previamente crescidas, já que apresentaram boa atividade e
quantidade de massa interessante, ou seja, 0,5 g/L de células com atividade de 0,97 g
DHA/ g biomassa, para G. oxydans CCT 0552 e 0,4 g/L de células com atividade de 1,3
g DHA/ g biomassa, para G. oxydans CCT 0174.

A linhagem G. oxydans CCT 0552 após secagem em acetona não apresentou

atividade em nenhum dos ensaios. A linhagem G. Oxydans CCT 0174 apresentou
atividade discreta. A secagem se mostrou eficiente para eliminar a viabilidade celular.

Embora os ensaios de secagem não tenham apresentado reprodutibilidade

suficiente para serem tratados estatisticamente, algumas observações interessantes
puderam ser feitas. A presença de íons cálcio e magnésio na solução de secagem das
células melhorou a atividade do preparado seco. O pré tratamento das células
previamente crescidas com os mesmos íons aumentou a atividade das células.

O aumento do pH do meio reacional exerce efeito negativo sobre a produção de

DHA por células previamente crescidas. As melhores condições de produção de DHA
pelas células previamente crescidas foram temperatura de 34ºC e o pH de 4,5 para a
linhagem G. oxydans CCT 0552 e temperatura de 26ºC e o pH de 4,5, para a linhagem
G. oxydans CCT 0174, no domínio estudado.

A linhagem G. oxydans CCT 0552 foi capaz de oxidar glicerol em diferentes

concentrações de glicerol e manteve sua produtividade constante no intervalo de tempo
estudado. As células mantiveram seu poder catalítico, mesmo em concentração de
glicerol de 50 g/L. Esse comportamento não foi observado para a linhagem G. oxydans
CCT 0174, que apresentou queda acentuada em sua atividade, reduzindo quase à metade
após 5 horas de reação.

Células de 24 horas de idade armazenadas congeladas mantêm sua atividade por

pelo menos 60 dias, no entanto há uma perda nessa atividade. Para que as células
possam ser utilizadas como catalisador para a oxidação de glicerol a DHA é necessário
escolher um melhor método de conservação das células até o momento do uso.

As análises da cinética de crescimento microbiano, de produção de DHA e de

atividade da glicerol desidrogenase associadas ao planejamento estatístico
possibilitaram selecionar as células previamente crescidas como uma alternativa, através
da biotransformação, para a produção de DHA.
7- PERSPECTIVAS

 Otimizar o processo de secagem das células em acetona para uso na produção de

DHA a partir de glicerol.

 Avaliar o desempenho de outras linhagens para a biotransformação de glicerol

em DHA.

 Verificar a produção de DHA na presença de íons cálcio e magnésio, por células

previamente crescidas.

 Realizar novos estudos cinéticos com células previamente crescidas, para

verificar a produção máxima e o tempo para essa obtenção, utilizando essas
células.
8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ADACHI, O.; ANO, Y.; SHINAGAWA, E.; MATSUSHITA, K.; Purification and
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