UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DANIELA PALA

EFEITO DO AÇAÍ (Euterpe oleracea Mart.,) SOBRE

O ESTADO OXIDATIVO E A INFLUÊNCIA NAS
TRANSFERÊNCIAS DE LÍPIDES PARA HDL EM
MULHERES.

OURO PRETO
MINAS GERAIS-BRASIL
2016

I
 DANIELA PALA

EFEITO DO AÇAÍ (Euterpe oleracea Mart.,) SOBRE O

ESTADO OXIDATIVO E A INFLUÊNCIA NAS
TRANSFERÊNCIAS DE LÍPIDES PARA HDL EM
MULHERES.

Tese de Doutorado apresentada à Universidade Federal

de Ouro Preto, como parte das exigências do Programa
de Pós graduação em Ciências Biológicas, área de
concentração: Bioquímica Metabólica e Fisiológica para
obtenção do título de Doctor Scientiae.

OURO PRETO

MINAS GERAIS-BRASIL

2016

II
III
IV
Dedico este trabalho aos meus pais que me
deram asas para voar e raízes para voltar

V
 APOIO FINANCEIRO

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Epidemiologia Molecular da Escola de

Nutrição e do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas-NUPEB da Universidade

Federal de Ouro Preto com o auxílio financeiro da FAPEMIG, CAPES, CNPq e UFOP.

VI
 AGRADECIMENTOS

 Agradeço em especial, a professora Renata Nascimento de Freitas pelo carinho,

dedicação, aprendizado e ensinamentos. Minha eterna gratidão pela orientação e
confiança em mim depositada, você é um exemplo de profissional que levarei
pelo resto da vida.
 A professora Ana Carolina Pinheiro Volp obrigada pela ajuda, suporte e
orientação ao longo desse trabalho, pelas fundamentais questões ao longo do
estudo e por todo auxilio acadêmico.
 Ao professor Raul Cavalcante Maranhão, diretor do Laboratório de Metabolismo
de Lípides do InCor, pela colaboração na realização de parte dos experimentos
deste trabalho no seu laboratório, pelo essencial aprendizado desta complexa
área que é o metabolismo de lípides. A todos os colegas do Laboratório de
Lípides pelo auxilio e por me receberem tão bem, Fátima, Débora, Andréia,
Alessandra, Ana, Camila, Wilson, Dalila, Cintia, Elaine, Jô, Vanderley e toda a
equipe.
 Aos colaboradores do Laboratório de Bioquímica Metabólica (LBM),
professoras Maria Lucia Pedrosa e Daniela Caldeira Costa e a Joamyr Rossini
Junior, Carolina Morais de Araújo e Glaucy Rodrigues de Araújo, pela
disponibilidade e por serem tão acessíveis quando precisei, o suporte de vocês
foi fundamental na realização deste trabalho
 Ao Laboratório de Epidemiologia das Doenças Parasitárias, Laboratório de
Fisiopatologia Molecular e ao Laboratório Piloto de Análises Clínicas todos da
UFOP, pelo suporte necessário a realização deste trabalho.
 Ao Laboratório de Epidemiologia Molecular pelos conhecimentos
compartilhados e por serem tão queridas. Em especial a Melina, Carla, Priscila e
Raiana que tanto me ajudaram e pela convivência tão agradável.

VII
 AGRADECIMENTOS PESSOAIS

 Agradeço aos meus pais, Ana e Marcos pelo amor e carinho e por
compartilharem todos os meus sonhos e anseios, obrigada mais uma vez.

 Aos meus irmãos Gabriela e Danilo pelos ensinamentos e cumplicidade, mesmo

longe sempre estão por perto.

 Ao meu amor João Antônio pelo apoio, paciência e incentivo constante, você (e
seus cafés fortes) foram de extrema importância nessa etapa.

 Agradeço a todos que contribuíram para a realização desse rico trabalho

VIII
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2

2.1 Doenças cardiovasculares 2

2.2 Lipoproteinas 3

2.3 Metabolismo de lípídes e transporte reverso de colesterol 4

2.4 Estado oxidativo e aterosclerose 7

2.5 Sistema de defesa antioxidante 10

2.5.1 Sistema enzimático 10

2.5.2 Sistema não enzimático 11

2.6 Marcadores do estado oxidativo 12

2.6.1 Classificação dos biomarcadores sanguíneos 12

2.7 Alimentos funcionais 14

2.8 O açaí e seu potencial efeito como alimento funcional 15

2.9 Efeitos funcionais dos componentes do açaí 17

2.9.1 Flavonóides 17

2.9.2 Ácidos graxos insaturados 18

2.9.3 Fibras alimentares 19

2.10 Estudos realizados com açaí 19

3. OBJETIVOS 21

3.1 Objetivo Geral 21

3.2 Objetivos específicos 21

IX
4. MATERIAIS E MÉTODOS 23

4.1 Desenho do estudo 23

4.2 Recrutamento das voluntárias 24

4.3 Critérios para seleção das voluntárias 24

4.4 Questões éticas 26

4.5 Coleta de dados 26

4.5.1 Dados antropométricos e de composição corporal 26

4.5.2 Pressão Arterial 26

4.5.3 Dados bioquímicos 26

4.5.4 Estilo de vida 27

4.6 Obtenção das células mononucleares e polimorfonucleares 27

4.6.1 Teste de viabilidade celular 28

4.6.2 Teste de Citometria de fluxo 28

4.7 Marcadores do estado oxidativo 29

4.7.1 Séricos 29

4.7.2 Celulares 31

4.8 Polpa de açaí 34

4.9 Análise centesimal da polpa de açaí 35

4.10 Determinação da atividade antioxidante da polpa de açaí 35

4.11 Transferência de lípides 38

4.11.1 Preparo da emulsão lipídica artificial (LDE) 38

4.11.2 Transferência de colesterol livre (CL), éster de colesterol (EC), 38

triglicérides (TG) e fosfolípides (FL) de uma emulsão lipídica artificial (LDE)

X
para HDL

4.12 Análise estatística 39

5. RESULTADOS 40

5. 1 Análise das variáveis antropométricas, clínicas e bioquímicas 41

5.2 Efeito do consumo da polpa de açaí no estado oxidativo sérico. 42

5.3Análise do perfil oxidativo em células mononucleares, antes e após a 47

intervenção nutricional com a polpa de açaí.

5.4 Análise do perfil oxidativo em células polimorfonucleares, antes e após a 48

intervenção nutricional com a polpa de açaí.

5.5 Taxa de transferência de colesterol livre, éster de colesterol, triglicérides e 51

fosfolípides da emulsão lipídica artificial (LDE) para a HDL das voluntárias
antes e após a intervenção nutricional com a polpa de açaí.

6. DISCUSSÃO 52

7. CONCLUSÕES 59

8. PERSPECTIVAS 60

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 61

10. ANEXOS 80

Anexo 1. QUESTIONÁRIOS 80

Anexo 2. ESCLARECIMENTO SOBRE A PESQUISA DADOS DE 84

IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA

Anexo 3 -TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 86

Anexo 4 - APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA 88

Anexo 5- QUESTIONÁRIO MET’s 89

Anexo 6-HISTOPAQUE 90

XI
Anexo 7 -CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL 91

Anexo 8- LDL OXIDADA 92

Anexo 9 - SUPERÓXIDO DISMUTASE 95

Anexo 10 -CATALASE 96

Anexo 11- GLUTATIONA PEROXIDASE 97

Anexo 12 - ÓXIDO NÍTRICO SINTASE 98

Anexo 13 - ÓXIDO NITRICO 99

Anexo 14 - ARTIGOS PUBLICADOS 100

XII
 

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Efeito do consumo de açaí sobre a Capacidade Antioxidante Total no soro de

mulheres saudáveis. .............................................................................................................................. 45

Gráfico 2 Efeito do consumo de polpa de açaí sobre a atividade da enzima

Paraoxonaseno soro de mulheres saudáveis .......................................................................... ...............46

Gráfico 3 Efeito do consumo de polpa de açaí sobre a concentração de LDL oxidada

nosoro de mulheres saudáveis. ....................................................................................................... ......47

Gráfico 4 Efeito do consumo de açaí sobre a concentração sérica de Dialdeído Malônico

(µM) no soro de mulheres saudáveis .................................................................................................... 48

Gráfico 5 Efeito do consumo de açaí sobre a produção de espécies reativas de oxigênio

por células polimorfonucleares de mulheres saudáveis. ....................................................................... 50

Gráfico 6 Efeito do consumo de açaí sobre a Capacidade Antioxidante Total em células

polimorfonucleares de mulheres saudáveis. ......................................................................................... 51

Gráfico 7 Efeito do consumo de açaí sobre as enzimas (A) SOD, (B) CAT, (C) GPx e
(D) iNOs em células polimorfonucleares de mulheres saudáveis ........................................................ 52

Gráfico 8 Taxa de transferência (%) do éster de colesterol (EC), colesterol livre (CL),
fosfolípides (FL) e triglicérides (TG) da emulsão rica em colesterol LDE para HDL,
antes e após o consumo de açaí. ........................................................................................................... 53

XIII
 LISTA DE QUADRO E TABELAS

Quadro1. Classes de biomarcadores em sangue e suas principais

substancias.......................................................................................................................35

Tabela 1 Composição química centesimal da polpa de açaí utilizado no trabalho .............................. 37

Tabela 2 Variáveis antropométricas, clínicas e bioquímicas das voluntárias estudadas,

ao início e ao final do período de intervenção. ..................................................................................... 43

Tabela 3. Inçngestão alimentar habitual estimada por meio de questionário de frequencia alimentar
e atividade fisica, ao inicio e ao final do periodo de intervenção....................................................44

Tabela 4 Efeito do consumo da polpa de açaí sobre as atividades das enzimas SOD,CATe GPX
em células monocleares de mulheres saudáveis...............................................................................49

XIV
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Formação da placa de aterosclerose. ...................................................................................... 4

Figura 2. Estrutura das lipoproteínas ...................................................................................................... 5

Figura 3 Metabolismo da HDL-c. ........................................................................................................ 08

Figura 4 Os estágios de desenvolvimento da palca aterosclerótica ...................................................... 11

Figura 5 Produção de espécies reativas e ação das defesas antioxidantes enzimáticas.

Adaptado. Halliwel & Gutteridge, 2001. .............................................................................................. 13

Figura 6 Fotos do açaizeiro, de seu fruto, o açaí do processamento .................................................... 11

Figura 7 Estrutura química de cinco flavonóides encontrados no açaí ............................................... 20

Figura 8 Diagrama do desenho de estudo prospectivo de intervenção nutricional .............................. 25

Figura 9 Diagrama de recrutamento e seleção das voluntarias que participaram do

presente estudo ..................................................................................................................................... 27

Figura 10 Esquema da obtenção de células mononucleares e polimorfonucleares para os

ensaios do estado oxidativo............................................................................................30

Figura 11 Avaliação da produção de ERO ........................................................................................... 35

Figura 12 Esquema da reação para detecção do óxido nítrico ............................................................. 36

Figura 13 Gráfico da porcentagem de redução do DPPH................................................... 39

XV
 LISTA DE ABREVIATURAS

AG Ácidos graxos
APO Apolipoproteína
CAT Catalase
CETP Proteína de transferência de éster de colesterol
CL Colesterol livre
EC Ester de colesterol
ERO Espécies reativas de oxigênio
FL Fosfolípides
GSH Glutationa reduzida
GSSH Glutationa oxidada
GPx Glutationa Peroxidase
H2O2 Peróxido de hidrogênio
HDL-c Lipoproteína de alta densidade
INOs Óxido nítrico sintase
LCAT Lecitina colesterol acil transferase
LDL-c Lipoproteína de baixa densidade
LDL-ox Lipoproteína de baixa densidade oxidada
MN Células mononucleares
NO Oxido nítrico
O2•- Superóxido
OH• Radical hidroxil
ONOO Peroxinitrito
PON Enzima paraoxonase- atividade paraoxonase
PMN Células Polimorfonucleares
QM Quilomícrons
RLU Unidade relativa de luz
SOD Superóxido dismutase
TAC Capacidade antioxidante Total
TG Triglicérides

XVI
 RESUMO
A espécie vegetal Euterpe oleracea Mart.,é uma palmeira nativa da região Amazônica.
Alguns estudos têm mostrado que seu fruto, o açaí, possui alto potencial para ser
reconhecido como "alimento funcional", devido às elevadas concentrações de
polifenóis, especialmente as antocianinas que conferem alta capacidade antioxidante
total (TAC), propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. No entanto, poucos
estudos têm investigado o efeito do consumo de açaí sobre marcadores do estado
oxidativo e no metabolismo de lipídes em humanos. Dessa forma, nosso estudo teve
como objetivo avaliar o efeito do consumo de polpa de açaí sobre parâmetros
antropométricos, clínicos, bioquímicso e de estilo de vida e sobre biomarcadores do
metabolismo redox no soro e em células mononucleares e polimorfonucleares e a
influência nas transferências de lípides para HDL em mulheres saudáveis Foi realizado
um estudo prospectivo de intervenção nutricional, no qual 42 mulheres consumiram
200g de polpa de açaí/dia durante quatro semanas. Antes e após o período de
intervenção foram avaliados parâmetros antropométricos, clínicos (pressão arterial) e
bioquímicos (glicemia, insulina, colesterol, HDL-c, LDL-c, trialcilgliceróis) além de
biomarcadores do estado redox no soro (capacidade antioxidante total, LDL oxidada,
enzima paraoxonase-atividade paraoxonase e dialdeido malônico,MDA), em células
mononucleares (MN) (atividade das enzimas CAT, SOD e GPx) e em células
polimorfonucleares (PMN) (atividade das enzimas CAT, SOD e GPx, a produção de
espécies reativas de oxigênio, ERO, de óxido nítrico e capacidade antioxidante total
(TAC). Também avaliamos após o consumo do açaí o perfil de apolipoproteinas e a
transferência de lípides da nanoemulsão de LDE para a HDL. Nossos resultados
mostraram, após o consumo da polpa de açaí, uma ligeira diminuição da circunferência
abdominal (84,9±9,9cm vs 83,9 ±9,6cm, p=0,04) e de apolipoproteina A-1 (200 ± 37,9
mg/dL vs 240,5 ± 47,9 mg/dL) e no soro , aumento da TAC (443,6±144,7µM vs 509,1
±121,7µM, p=0,031), aumento na atividade da enzima PON (120,3U/mL [76,5-
184,5U/mL] vs 146,2,5U/mL [79,3,-225,5U/mL]; p=0,0006), diminuição de 42% nas
concentrações de LDL oxidada (226,0±85,5µg/mL vs 131,1± 79,6µg/mL; p=0,0005) e
ainda diminuição nas concentrações de MDA (6,8±1,9µM vs 4,7±1,3µM;
p=0,00000009) sugerindo que o açaí pode estar envolvido na remoção de ERO,
diminuindo a oxidação de proteínas e lipídios e oferecendo ação antioxidante,

XVII
principalmente em relação ao processo aterosclerótico. Nas células PMN também
encontramos aumento da TAC (228,5 ±169,3µM vs 453,7±251,1µM; p=0,001) e da
atividade da CAT (0,2 ±0,1U/L vs 8,1 ±3,2U/L; p=1,07 x 10-14) reforçando o efeito
antioxidante proporcionado pela adição do açaí na dieta das voluntárias. Nenhuma
alteração foi observada na atividade das enzimas em células MN (CAT, SOD e GPx).
Em relação a taxa de transferência de colesterol livre, éster de colesterol, triglicérides e
fosfolípides da emulsão lipídica artificial (LDE) para a HDL, encontramos aumento nas
taxas de transferência do éster de colesterol (p=0,0043) e de fosfolípides (p=0,0338).
Dessa forma, nossos resultados demonstram que a adição da polpa de açaí na dieta
habitual pode estar envolvida na proteção contra o estado oxidativo e também ter um
efeito benéfico no metabolismo de lípides e assim que o açaí pode apresentar efeito
atero protetor em mulheres saudáveis.

Palavras chave: Euterpe oleracea Mart.; açaí; metabolismo oxidativo; antioxidantes;

lipídes;

XVIII
 ABSTRACT
The plant specie Euterpe oleracea Mart., is a palmeira popularly known as açaí and is
native to the Amazon region. Some studies in vitro and animal studies reported that its
fruit, acai, has high potential to be recognized as "functional food" due to high
concentrations of polyphenols, especially anthocyanins that give high total antioxidant
capacity (TAC), properties antioxidants and anti-inflammatory. However, few studies
have investigated the effect of consuming acai on oxidative status markers and lipid
metabolism in humans. Thus, our study was to evaluate the effect of açaí on
anthropometric, clinical, biochemists and lifestyle and on the redox metabolism
biomarkers in serum and mononuclear cells and polymorphonuclear and influence on
lipid transfer for HDL in healthy women. Study of nutritional intervention with 42
women who consumed 200g of açaí pulp per day for four weeks. Before and after the
experimental period were mensured anthropometric parameters (weight, height, waist
circumference, abdominal and hip and percentage of body fat), clinical (blood pressure)
and biochemical (blood glucose, insulin, cholesterol, HDL-C, LDL -c, triacylglycerides)
in addition sérum oxidative status markers were determined (TAC, oxidized LDL,
paraoxonase enzyme, and malondialdehyde MDA) in mononuclear cells (MN) (CAT
activity of enzymes, SOD and GPx) and cells polymorphonuclear (PMN) (activity of
enzymes CAT, SOD and GPx, the production of reactive oxygen species, ROS, nitric
oxide and TAC). We also evaluated after consumption of acai the apolipoprotein profile
and lipid transfer of nanoemulsion LDE to HDL. These results indicate, after
consumption of açaí, a slight decrease in waist circumference (84.9 ± 9.9 cm vs 83.9 ±
9.6 cm, p = 0.04) and apolipoprotein A-1 (200 ± 37.9 mg / dL vs 240.5 ± 47.9 mg / dL)
and serum, increasing the TAC (± 443.6 vs. 509.1 ± 144,7μM 121,7μM, p = 0.031)
increase in activity the PON enzyme (120,3U / ml [76,5-184,5U / ml] vs 146,2,5U / ml
[79.3, -225,5U / ml], p = 0.0006), decrease 42% in oxidized LDL concentration (226.0
± 85,5μg / mL vs 131.1 ± 79,6μg / ml; p = 0.0005) and also decreased the MDA
concentration (± 6.8 vs 1,9μM 4.7 ± 1,3μM; p = 0.00000009) suggesting that acai may
be involved in the removal of ROS, decreasing the oxidation of proteins and lipids and
providing antioxidant activity, especially regarding the atherosclerotic process. The
PMN cells also found increased TAC (228.5 ± 169,3μM vs 453.7 ± 251,1μM; p =
0.001) and the CAT activity (0.2 ± 0.1U / L vs 8.1 ± 3 , 2U / L; p = 1.07 x 10-14)

XIX
enhancing the antioxidant effect provided by the addition of acai in the diet of
volunteers. No change was observed in the activity of enzymes in MN cells (CAT, SOD
and GPx). In relation to free cholesterol transfer rate, cholesterol ester, triglycerides and
phospholipids of artificial lipid emulsion (LDE) to HDL, found no difference in transfer
rates of cholesterol ester (p = 0.0043) and phospholipid (p = 0.0338). Thus, our results
demonstrate that the addition of açaí in the usual diet may be involved in protection
against oxidative state and also have a beneficial effect on lipid metabolism and so that
acai may have athero protective effect in healthy women.

Keys words: Euterpe oleracea Mart.; açaí; oxidative metabolism; antioxidants; lipids;

XX
1. INTRODUÇÃO
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) as doenças cardiovasculares (DCVs) são
distúrbios do coração e dos vasos sanguíneos e incluem doença cardíaca coronária, doença
cerebrovascular, doença cardíaca reumática e outras condições. A OMS estima que 17,5 milhões de
pessoas morrem a cada ano de DCVs, o que equivale a aproximadamente 31% de todas as mortes no
mundo.
O Brasil possui significativa riqueza de espécies nativas com potencial alimentício, tanto
hortaliças, como frutas, porém ambos ainda pouco explorados. Um dos frutos que vem se destacando
nesse cenário, tanto no exterior como em nosso país, é o açaí. Alguns estudos mostraram benefícios
do seu consumo para a saúde, principalmente devido a alta concentração de fitoquimicos (Del Pozo-
Insfran, Brenes e Talcott, 2004; Schauss et al., 2006).
O consumo de açaí aumentou desde 2009, quando a fruta foi reconhecida por propriedades
associadas a beleza como por exemplo na prevenção de envelhecimento, em um programa de TV
muito popular nos Estados Unidos ("The Oprah Winfrey Show"). Logo depois, Marcason publicou
um artigo intitulado "O que é o açaí e quais são os benefícios para a saúde?", no qual o autor destaca
o fato de que o açaí tem sido associado a uma infinidade de benefícios para a saúde, mas sem
evidência científica para essas conclusões (Marcason, 2009). Desde então, as propriedades benéficas
do açaí têm sido demonstradas tanto in vitro quanto em modelos animais (De Souza et al., 2010;
Guerra et al., 2011; Bonomo et al., 2014)
Porém, embora a capacidade antioxidante do açaí tenha sido descrita em vários estudos, ainda são
limitados em humanos (MertensTalcott et al., 2008; Udani et al., 2011; Gale, Kaur e Baker, 2014),
principalmente associando o efeito do açaí sobre o metabolismo oxidativo e lipídico a médio/longo
prazo com uma amostra significativa. Em vista da alta prevalência de DCVs, como a aterosclerose,
os estudos para elucidar os mecanismos pelos quais os alimentos e seus compostos bioativos podem
prevenir e controlar essas doenças, são de extrema importância para a comprovação cientifica de seu
efeito funcional e para que as recomendações especificas sejam preconizadas de maneira segura.
Dessa forma, o presente estudo, se propos investigar o efeito do consumo diário de açaí
disponível comercialmente por 30 dias sobre o metabolismo redox e sobre o metabolismo de lípides
em mulheres saudáveis.

1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Doenças cardiovasculares

Dados da OMS estimam que quatro em cada cinco mortes são devidas a ataques cardíacos e
acidente vascular cerebral (AVC) sendo que mais de 75% das mortes decorrentes de DCV ocorrem
em países de baixa e de média renda (Organização Mundial de Saúde, 2016). No Brasil as DCV são
responsáveis por cerca de 29,4% de todas as mortes. A alta freqüência dessa doença coloca o Brasil
entre os dez países com maior índice de mortes por DCV (Ministério da Saúde, 2011).
Uma das principais características das doenças cardiovasculares é a presença da aterosclerose,
que é uma doença na qual uma placa constituída de gordura, colesterol, cálcio e outras substâncias se
acumulam dentro da artéria (Figura 1). Com o passar do tempo essa placa enrijece e estreita as
artérias, limitando a circulação sanguínea para outros órgãos importantes do corpo. A aterosclerose
pode levar a sérios problemas, incluindo infarto, derrame e até mesmo a morte (NHLBI, 2015).
As causas da aterosclerose podem ser de origem genética, mas as principais causas são fatores
modificáveis, condições conhecidas como fatores de risco, como: obesidade, sedentarismo,
tabagismo, hipertensão, colesterol alto, consumo excessivo de álcool e dieta pouco saudável
(Avezum et al.,2005; NHLBI, 2015).
Estudos vem mostrando que fatores dietéticos são importantes na patogênese da DCV (De
Backer, et al 2003; Hu et al., 2002; Eman et al., 2012) e um aumento do consumo de frutas e vegetais
está associado com uma diminuição na incidência DCV como o acidente vascular cerebral (Menotti
et al., 1999; Sasazuki, 2001; Bazzano et al., 2002).

2
Figura 1. Formação da placa de aterosclerose. A) Mostra uma artéria normal com o fluxo normal de sangue e
B) mostra uma artéria com o acúmulo de placa. A imagem a direita ampliada mostra uma secção transversal
de uma artéria normal e com o acúmulo de placas. Adaptado: American Heart Society.

2.2 Lipoproteínas
As lipoproteínas são uma família de partículas cuja função é transportar lípides, principalmente
triglicérides e colesterol, entre órgãos e tecidos. Elas se diferem quanto à composição (diferenças
quantitativas e qualitativas dos lipídios e apolipoproteínas), tamanho e mobilidade eletroforética
(Alaupovic & Lee, 1970; Chapman et al.,1981). Localizados e ancoradas na monocamada lipídica
estão as apolipoproteínas (apo) que possuem ações sobre o metabolismo das lipoproteínas (Figura
2).

Figura 2 .Estrutura das lipoproteínas que são agregados moleculares hidrossolúveis no meio aquoso para o
transporte efetivo de lípides. No interior da molecula encontramos triglicerídeos e éster de colesterol e em sua
superficie fosfolípides e colesterol livre.

3
 A densidade de LDL corresponde a 1,019-1,063 g/ml e a sua proteína estrutural é a apo B-100.
Sob condições normais, a LDL carrega aproximadamente 2/3 do colesterol presente no plasma
(Brown et al., 1981). O principal órgão com ação na remoção da LDL do plasma é o fígado, via
receptores de LRP. Intracelularmente ocorre a hidrólise do éster de colesterol pela lipase ácida o que
libera colesterol livre (Goldstein et al.,1979). É a quantidade de colesterol dentro da célula que
controla a afinidade de LRP, em altas concentrações ocorre a redução na atividade da enzima que
catalisa a biossíntese do colesterol, 3-hidroxi-3-metilglutaril Co A redutase (HMG CoA redutase), há
menor expressão de LRP e ativação de outra enzima que armazena o colesterol, a colesterol
aciltransferase no fígado (ACAT) (Grundy & Bilheimer, 1984; Brown & Goldstein, 1990).
A HDL é uma lipoproteína plasmática menor e mais densa, 1,063 a 1,25g/ml. Sua estrutura é
formada por um núcleo lipídico hidrofóbico que contém, em sua maioria, éster de colesterol, e em
menor quantidade TG e colesterol não esterificado (livre) (Kontush & Chapman, 2006). Ao redor do
núcleo encontramos uma camada monofásica de fosfolípides, colesterol livre e apolipoproteinas,
principalmente A-1 (Lima & Couto, 2006). A HDL transporta enzimas envolvidas no metabolismo
lipídico, tais como a lecitina-colesterol aciltransferase (LCAT) que participa do transporte reverso do
colesterol e moléculas envolvidas com atividade antioxidante, como o fator de ativação de plaquetas
acetil hidrolase (PAF-AH) e a enzima paraoxonase (PON1), entre outras.
Várias funções são atribuídas a HDL, entre elas promover o efluxo do colesterol nas células,
funções de caráter anti-inflamatório e antitrombótico, tipicamente observado como a inibição da
oxidação de LDL (Bowry et al., 1992; Ansell et al.,2005; Maranhão, et al 2014). HDL também
possui propriedades antioxidantes relacionadas com a presença de apo A-I e apo E e também é capaz
de inibir a geração de espécies reativas de oxigênio tanto in vitro como in vivo (Lee et al., 2005;
Nicholls et al., 2005).

2.3 Metabolismo de lípides e transporte reverso de colesterol

O conceito de transporte de lípides é diferenciado entre a via de transporte exógeno de lípides
provenientes da alimentação e a via do transporte endógeno de lípides sintetizados no fígado (Brown
et al., 1981). No transporte exógeno os ácidos graxos (AG) da dieta, estão, em sua grande maioria,
sob a forma de éster de colesterol, fosfolípides e TG. Os AG de cadeia curta e média, no processo de
digestão gástrica, passam para a veia porta utilizando a albumina como transportadora. Já os outros
lípides precisam se unir a sais biliares formando micelas biliares mistas que facilitam a ação da lipase
pancreática e a difusão junto à borda em escova dos enterócitos (Hoffmann & Borgstrom, 1964;
Wilson et al., 1971; Ramirez et al., 2001).

4
 Esses lípides são reesterificados em TG, éster de colesterol e fosfolípides nos enterócitos, que
serão compartimentalizados em lipoproteína QM para serem transportados através do sistema
linfático e atingir o sistema sanguíneo (Ramirez et al., 2001; Devlin, 2002). Na circulação, passam
por um processo dinâmico de troca de moléculas de superfície com outras lipoproteínas plasmáticas,
principalmente com as HDL, dessa forma os QM adquirem apo C-II, apo C-III e apo E. A apo C-II
ativa a enzima lipase lipoprotéica (LLP), que hidrolisa os TG dos QM e libera AG livres que serão
armazenados no tecido adiposo ou utilizados como fonte energética pelo tecido muscular (Hussain,
2000). Esta transferência de lípides é parte de um mecanismo complexo denominado transporte
reverso de colesterol.
Após a hidrólise, as partículas apresentam-se em menor tamanho, com quantidade relativamente
maiores de éster de colesterol e enriquecidas de apo E, são chamadas de QM remanescente (Goldman
& Braunwald, 2000), as quais são removidas da circulação pela interação entre a apo E e o receptor
LRP localizado principalmente nas células hepáticas (Goldman & Braunwald, 2000; Hussain et al.,
2000). Após a captação hepática, o QM remanescente é degradado a AG, glicerol, aminoácidos e
colesterol. Este colesterol originado da degradação do QM pode ser excretado na bile na forma de
ácidos biliares, utilizado na síntese de membranas ou pode integrar as lipoproteínas produzidas e ser
secretado pelos hepatócitos (Havel & Hamilton, 1988; Havel & Hamilton, 2004).
O transporte reverso do colesterol consiste na via pela qual o excesso de colesterol nos tecidos
extra-hepáticos é transferido para o fígado, sendo excretado pela bile ou incorporado a VLDL,
evitando assim seu acúmulo (Ansell et al.,2005) (Figura 3). Através da proteína de transferência de
colesterol esterificado (CETP) há a transferência da maior porção deste colesterol esterificado para
QM, VLDL e LDL em troca de TG, caracterizando a via indireta do transporte reverso do colesterol.
A via direta ocorre com a ação da lipase lipoproteína hepática sobre TG e fosfolípides e da interação
com os receptores scavenger SR-B1 (Tulenko & Sumner, 2002).

5
Figura 3 Metabolismo da HDL. Sintetizada no fígado e no intestino a apo A-I adquire fosfolípidos (PL) e
compartimentaliza dentro da particula (1). Ocorre o efluxo do colesterol livre (CL) e PL a partir das células
periféricas, através de transportadores de cassete de ligação de ATP (ABCA-1), e são captados pela
apolipoproteina pobre em A-I para formar novas partículas (2). A ação progressiva de lecitina colesterol acil
transferase (LCAT) na HDL nascente gera uma partícula de HDL esférica madura (3). Estas partículas de
HDL têm um núcleo de lípido de éster de colesterol (EC) e de triglicéridios (TG) e pode adquirir lípidos
adicionais, através de efluxo mediado por ABCA- 1 (4). A proteína de transferência de fosfolipides (PLTP)
promove o efluxo de PL para HDL a partir de células periféricas e de TG, durante a degradação dos
quilomícrons e VLDL pela lipase lipoproteína (5). O teor de colesterol esterificado na HDL é transportado
para o fígado por um processo de absorção que envolve os receptores SR-BI (6). A proteína de transferência
de éster de colesterol (CETP) facilita a troca de TG nas lipoproteínas contendo apo-B (VLDL, IDL e LDL)
para éster de colesterol na HDL (7). CETP também é responsável para a transferência EC entre subclasses de
HDL, HDL3 e HDL2 (8). Tanto o teor de colesterol livre e esterificado de lipoproteínas contendo apo-B são
absorvidos pelo fígado, predominantemente através do receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDL-R)
(9). Em seguida, o teor de colesterol é excretado na bile (10). Adaptado: Maranhão & Freitas, HDL
Metabolism and Atheroprotection: Predictive Value of Lipid Transfers. In Gregory S. Makowski, editor:
Advances in Clinical Chemistry, Vol. 65, Burlington: Academic Press, 2014, pp. 1-41

A HDL tem papel fundamental no transporte reverso do colesterol pois participa da esterificação
do colesterol livre e em excesso armazena na HDL para ser levada ao fígado (Tall et al., 1984;
Maranhão & Freitas 2014). Ésteres de colesterol são mais hidrofóbicos do que colesterol livre, de

6
modo que após esterificação, o colesterol é deslocado da superfície da monocamada da lipoproteína
para o núcleo da HDL é assim é impedido de voltar a superfície o que promove a remoção celular do
colesterol (Rousset et al.,2009). Isto ocorre porque a HDL oferece condições ótimas para a ação da
enzima LCAT, devido sua afinidade por ela e pelo alto teor de apo A-I, cofactor da enzima (Rousset
et al.,2009). A remodelação da HDL também é promovida pela proteína de transferência de
fosfolipides (PLTP) que favorece o efluxo de fosfolipídios para HDL a partir de células periféricas e
das lipoproteínas ricas em TG durante a hidrolise de quilomicrons e VLDL (Rao et al., 1997).
Na etapa final do processo reverso do colesterol, éster de colesterol de HDL são diretamente
transportados para o fígado, onde o receptor scavenger classe B tipo I (SR-BI) capta o conteúdo das
lipoproteínas e o colesterol e elimina esses elementos através da bile. Ao mesmo tempo, éster de
colesterol na HDL são transferidos para as lipoproteínas contendo apo B, pela ação de da enzima
CETP, assim sendo também excretada na bile (Chapman et at., 2010). De acordo com Maranhão &
Freitas (2009) essas mudanças lipídicas são bidirecionais, mas o resultado é o esgotamento de éster
de colesterol no HDL e enriquecimento de HDL com TG.

2.4 Estado oxidativo e aterosclerose

O estado oxidativo tem sido associado com várias condições fisiopatológicas e com o
processo de envelhecimento (Halliwel, 1987; Forsberg et al., 2001), é decorrente do desequilíbrio
entre o sistema de defesa antioxidante e os pro-oxidantes, ou seja, entre a produção e remoção dos
radicais livres (Rock et al, 1996; Sies, 1997).
O radical livre é qualquer espécie química que contêm um ou mais elétrons desemparelhados.
Muitos radicais livres são instáveis e altamente reativos e para alcançar a estabilidade, tende a se ligar
a outro elétron (Cheeseman & Slater, 1993, Souza & Ferreira, 2007). Os radicais livres derivados de
oxigênio representam as mais importantes espécies reativas geradas em sistemas vivos (Liochev &
Fridovich, 1994). A designação “espécies reativas de oxigênio” (ERO) é uma classe formada não
apenas por radicais de oxigênio, como por exemplo, o radical hidroxil (OH•) e o peroxinitrito
(ONOO•), mas também pelo peróxido de hidrogênio (H2O2) e pelo óxido nítrico (NO) (Lobo et al,
2010).
ERO são formadas em nosso organismo em condições fisiológicas e tem as quantidades
controladas pelas defesas antioxidantes, entretanto, em situações patológicas ocorre um desequilíbrio
entre esses sistemas com preponderância dos compostos oxidantes (Halliwell & Whiteman 2004). As
ERO são capazes de atacar alvos moleculares, como o núcleo e as membranas celulares, e a
superprodução dessas espécies pode causar dano oxidativo a biomoléculas, como lipídios, proteínas e
ácidos nucléicos. Dessa forma, está envolvida no surgimento e evolução de várias doenças crônicas

7
não transmissíveis, tais como aterosclerose, câncer, diabetes, artrite reumatóide, infarto do miocárdio,
doenças cardiovasculares, inflamação crônica, acidente vascular cerebral, choque séptico e outras
doenças degenerativas em humanos (Yong & Woodside, 2001; Fang et al., 2002).
A molécula de LDL apresenta ácidos graxos poli-insaturados dos fosfolípides, tais como o
linoleico e araquidônico na superfície de sua membrana, esses lipídios são facilmente oxidáveis,
dando origem a grandes quantidades de dienos conjugados e dialdeído malônico (MDA) (Batlouni et
al.,1996; Moura et al., 2010). Sabe-se que oxidação da LDL ocorre em pequena proporção na
circulação devido a presença de antioxidantes no plasma. Acredita-se que na íntima das artérias é
onde realmente desenvolve a modificação oxidativa da LDL (Batlouni et al., 1996). Segundo
Steinberg & Witztum (1990) a LDL em seu estado nativo não apresenta propriedades aterogênicas,
sendo necessária a modificação oxidativa dessa lipoproteína para que ela se torne altamente lesiva ao
endotélio vascular.
Níveis elevados de colesterol induzem um aumento na síntese de prostangladinas pela via das
cicloxigenases, tendo como produto final a produção do ânion superóxido. Concomitantemente a este
processo, a via das cicloxigenases incorporam oxigênio molecular aos ácidos graxos poli-insaturados
presentes na LDL, gerando grandes quantidades de hidroperóxidos lipídicos, desencadeando o
processo de peroxidação lipídica (Steinbrecher et al., 1990).
A partir desse processo, ocorre a formação da LDL minimamente oxidada (LDL-mmox),
caracterizada pela oxidação de compostos lipídicos da LDL com poucas alterações na fração proteica
(Berliner et al.,1995). A LDL é a principal lipoproteína de transporte de colesterol e é conhecida
como “mau” colesterol, porém quando oxidada transforma-se em uma forma mais reativa e assim
mais danosa. A LDL-ox pode ser recrutada para a parte intima da artéria e, juntamente com
macrófagos e outros lipídios, acumular-se nesse local e participar da formação da placa de
aterosclerose (Hessler et al.,1979; Murugesan et al.,1993).
A oxidação da apoB-100 provoca uma alteração nos receptores normais da LDL que passam a
ser reconhecidas por receptores específicos nos macrófagos, denominados receptores scavenger
(Sparrow et al., 2001). Os receptores scavenger não apresentam nenhum tipo de regulação, o que
permite o acúmulo da LDL-ox no interior da célula, dando origem as células espumosas. As células
espumosas junto com as células T dão início a primeira atapa da placa aterosclerótica, à medida que
ela vai crescendo uma série de reações vão acontecendo devido ao processo inflamatório que se
instala; ocorre a formação de placas de coágulos na superfície dessas placas ateroscleróticas, que vão
aumentando com o passar do tempo quando células de colágeno se deslocam para essa região,
formando uma matriz dura e fibrosa ligando-se desta forma as células, podendo gerar uma obstrução
na luz do lúmen. Essa obstrução pode levar a isquemias, dando origem a infartos e derrames (Lopes

8
et al., 2010; Carvalho et al., 2010). Além da estenose que pode ocorre devido à obstrução do fluxo
sanguíneo, essas placas podem virar coágulos ou trombos, devido à secreção de substâncias
inflamatórias pelas células espumosas, que enfraquecem as placas, levando ao processo de
coagulação (Figura 4).

Figura 4 Os estágios de desenvolvimento da placa aterosclerótica (1) A LDL é transportada para o endotélio;
(2) Ocorre a oxidação da LDL pelos macrófagos; (3) Fatores de crescimento e citocinas são atraídos para o
local; (4) Atração de monócitos adicionais; (5) Acumulação de células espumosas; (6,7,8) Proliferação de
células musculares que resulta na formação de placa, o que pode causar apoptose celular. Adaptado: Faxon
D.P, Fuster V, Libby P. Conferência da doença aterosclerótica vascular. Circulation. 2004; 109 (21): pp- 2617-
25.

Porém não é apenas a LDL que pode sofrer oxidação, outros lipídios como aqueles que
compõem a lipoproteina de alta densidade (HDL) também podem ser modificados e causar prejuízo
no transporte reverso do colesterol. A PON possui capacidade de prevenir tanto a oxidação de LDL
quanto de HDL, além de hidrolisar fosfolipídeos e hidroperóxidos já oxidados na LDL-ox. O
aumento na atividade da PON está inversamente relacionado com o processo aterogênico. Além
disso, a PON exerce papel anti-inflamatório, reduzindo a adesão de monócitos nas células endoteliais
e o recrutamento e aderência celular na íntima da artéria (Kim et al, 1998; Ahmed et al., 2003).
Cada vez há maior evidência científica de que o estado oxidativo está associado a
complicações metabólicas e os mecanismos envolvidos implicam no desenvolvimento de doença
como a aterosclerose. Em relação aos fatores modulatórios do estado redox estão componentes
alimentares que fazem parte de nossa dieta.

9
2.5 Sistema de defesa antioxidante
Sob condições basais, a produção das ERO é balanceada pelos sistemas de defesa
antioxidante que envolve mecanismos enzimáticos e não enzimáticos (Sies, 1993).

2.6.1 Sistema enzimático

As defesas antioxidantes enzimáticas incluem a enzima superóxido dismutase (SOD), a
catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx), as quais constituem a primeira linha de defesa
endógena de neutralização das ERO. Enquanto as defesas não enzimáticas abrangem especialmente
os antioxidantes de origem dietética como: ácido ascórbico (vitamina C), α tocoferol (vitamina E),
tióis, bilirrubina, carotenóides e flavonóides (Maritim et al., 2003; Yeh et al., 2009; Barbosa et al.,
2010).
A enzima SOD, presente na maioria dos organismos eucarióticos, é fundamental na defesa
contra as ERO, pois catalisa a dismutação do radical O2•- em H2O2 (Mcord & Fridovich, 1969).

O2•-+ O2•-+ 2H+ H2O2+O2

O H2O2 por sua vez é degradado pela ação das enzimas CAT e GPx, resultando em O 2 e água
(Farber, 1990)

2 H2O2 H2O +O2

Existem diferentes isoformas de enzima SOD, dependendo do metal que atua como co-fator
em seu sitio catalítico e de sua localização celular, mas todas elas agem, geralmente, de acordo com a
reação acima. Dois exemplos, são as SOD que contém cobre e zinco (Cu/ZnSOD), presente
principalmente no citoplasma, estáveis e presentes em quase todas as células eucarióticas (Haliiwel &
Gutteridge, 1985). Já a SOD dependente de manganês (MnSOD) esta localizada na mitocôndria,
diferente da Cu/ZnSOD, dessa forma o estudo dessa enzima depende do tecido e da espécie do
organismo a ser estudado (Halliwell & Gutteridge, 1989).
A enzima CAT é uma hemeproteina citoplasmática, encontrada no sangue, medula óssea, rim
e fígado, que catalisa a redução do H2O2 em O2 e água, como citado anteriormente (Mayes et al.,
1990; Ferreira & Matsubara, 1997). A enzima CAT das células eucarióticas é formada por quatro
subunidades, onde cada uma possui um grupo heme, contendo ferro em seu sítio ativo, e em cada
dessas subunidades também esta acoplada uma molécula NADH (Scott et al., 1991; Jourd´Heul,
1998). A diminuição da atividade dessa enzima pode estar associada a doenças crônicas como

10
diabetes, asma, artrite reumatoide e doença de Alzheimer (Mohammedi et al., 2013; Al-Shobaili et
al.,2013; Taniguchi, 2014).
A enzima GPx também catalisa a redução de H2O2 e peróxidos orgânicos para seus
correspondentes álcoois através da oxidação da glutationa reduzida (GSH) a glutationa oxidada
(GSSH) (Shan et al., 1990). A família GPx possui quatro isoformas e integra o grupo de
selenoproteinas, pois contem selênio em seu sitio ativo (Vasconcelos, 2007). Alguns trabalhos têm
mostrado o efeito positivo de compostos fenólicos sobre a atividade dessa enzima em tecidos como
fígado, coração e rins (Chenni et al.,2007)
As enzimas CAT e GPx agem no mesmo substrato, H2O2, dessa maneira, ambas impedem seu
acúmulo. Essa função enzimática é muito importante, pois essa espécie reativa, H2O2, é formada
através das reações de Fenton e Haber-Weiss e resulta na produção do radical •OH, contra o qual não
há sistema enzimático de defesa (Schneider & Oliveira, 2004; Barbosa et al., 2010), Figura 5.

Figura 5 Produção de espécies reativas e ação das defesas antioxidantes enzimáticas. Adaptado. Halliwel &
Gutteridge, 2001.

2.6.2 Sistema não enzimático

Fazem parte do sistema de defesa não-enzimático, os compostos antioxidantes de origem
dietética: vitaminas, minerais e compostos fenólicos, especialmente os flavonoides. Entre as

11
vitaminas se destacam, o ácido ascórbico (vitamina C), o α-tocoferol e β-caroteno, precursores das
vitaminas E e A. Entre os minerais destacam-se o zinco, cobre, selênio e manganês (Bianchi et al.,
1999; Barbosa et al., 2010). Antioxidantes alimentares podem neutralizar radicais livres e inibir a
cadeia de iniciação ou interromper a cadeia de propagação das reações oxidativas promovidas pelos
radicais livres (Podsedek, 2007).
Estudos epidemiológicos mostram haver uma estreita correlação entre o consumo de frutas e
uma redução no risco de doenças crônicas não transmissíveis. Acredita-se que uma alimentação rica
em vitaminas, minerais, compostos fenólicos antioxidantes e fibras seja a responsável por esse efeito.
Paralelemente a isso vem crescendo o reconhecimento e o interesse pelo consumo de frutas tropicais,
consideradas exóticas em todo o mundo (Vasco et al., 2008).

2.6 Marcadores do estado oxidativo

2.6.1 Classificação dos biomarcadores sanguíneos

De acordo com de Zwart e colaboradores (1999) os biomarcadores têm características passíveis
de avaliação e mensuração, como indicadoras de processos biológicos normais, processos
patogênicos ou de resposta a uma intervenção terapêutica (fármacos e alimentos, por exemplo).
Dessa forma, sua mensuração refletiria mudanças em sistemas biológicos relacionadas à exposição
ou aos efeitos de outros fatores.
O biomarcador ideal deve reunir as seguintes características: mostrar alta especificidade para o
efeito de interesse; refletir o efeito desde o início; ser passível de determinação e análise fáceis e de
baixo custo; ser analisado por técnica não invasiva, de alta sensibilidade no fluido biológico
escolhido. Dessa maneira, deve já existir uma relação bem estabelecida entre a concentração do
biomarcador e a exposição ao agente, ao dano induzido e à susceptibilidade pesquisada.
Quando a produção de ERO aumenta e outras espécies reativas supera a capacidade de ação dos
antioxidantes, ocorre a oxidação de biomoléculas, gerando metabólitos específicos, marcadores do
metabolismo oxidativo, que podem ser identificados e quantificados. Tais marcadores são derivados,
sobretudo, da oxidação de lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos sendo os produtos de lipídios os
primeiros utilizados e de maior expressão (Halliwell & Whiteman, 2004; Vincent et al., 2007). No
Quadro 1, estão apresentadas as classes dos principais biomarcadores do metabolismo oxidativo
presentes no sangue.

12
Quadro 1 Classes de biomarcadores em sangue e suas principais substâncias

CLASSES SUB-CLASSES PRINCIPAIS SUBSTÂNCIAS

Antioxidantes Capacidade Antioxidante Total TAC, ABTS, FRAP, ORAC
Enzimas antioxidantes SOD, CAT e GPx
Antioxidantes não enzimáticos Vitamina E, C, βcaroteno e compostos
fenólicos
Marcadores de dano Proteinas oxidadas Detecção de grupos carbonila
oxidativo Lipidios oxidados Detecção de dialdeído malônico
Oxidação das bases de DNA Detecção de 8-OHdG em linfócitos
Quebra de DNA Ensaio cometa em leucócitos

Adaptado de:Vasconcelos et al., 2007

8-OHdG 8-hidroxi-guanina, ABTS 2,20-azino-bis (ácido 3-ethylbenzthiazoline- 6-sulfônico), CAT catalase,

DNA acido desoxirribonucleico, FRAP ferric reducing antioxidante power , GPx glutationa peroxidase, SOD
superóxido dismutase, TAC capacidade antioxidante total e ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity

O sistema imunológico é vulnerável a danos oxidativos porque algumas células desse sistema,
tais como neutrófilos e monócitos ativados, produzem ERO e outras espécies reativas, como parte
dos mecanismos de defesa do organismo para destruir os patógenos invasores. Quando os neutrófilos
produzem ERO em grandes quantidades, podem danificar componentes celulares essenciais e dessa
forma causar algumas complicações metabólicas, da mesma forma quando há presença de
antioxidantes a produção de ERO por neutrófilos diminui e não há ativação de monócitos. Esse
processo de produção de ERO se dá através do sistema fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e
adenina oxidase (NADPH oxidase), localizado na membrana plasmática da célula, sendo este
processo conhecido como ''explosão respiratória” (Pyne et al., 1996; Yamada et al., 2000; Marin et
al., 2010).
Outra forma de abordar a avaliação do estado oxidativo é a que emprega métodos indiretos,
baseados na capacidade antioxidante. Em relação a capacidade antioxidante total (TAC), alguns
autores defendem seu uso pois sua metodologia considera a ação de todos os antioxidantes presentes
in vivo (Prior & Cao, 1999; Ghiselli et al., 2000; Huang et al., 2005).

13
 2.6.2 Outras determinações associadas ao estado oxidativo
No presente estudo, escolhemos mensurar, em associação com outros biomarcadores, a
concentração de oxido nítrico (NO) e a concentração da enzima óxido nítrico sintase induzível
(iNOs) em células polimorfonucleares. O NO é um radical simples e abundante envolvido em uma
variedade de processos biológicos, incluindo o relaxamento muscular, a vasodilatação, a regulação da
pressão arterial, além de modificar a adesividade leucocitária e a diapedese dos neutrófilos. A enzima
capaz de sintetizar o NO é a oxido nítrico sintase (NOS) que converte o aminoácido L-arginina a
NO• e L-citrulina. A NOS possui três isoformas, sendo duas constitutivas em determinadas células e
uma induzível (Stuehr et al., 1991; Wang & Mardsen, 1995; Filho & Zilberstein, 2000).

2.7 Alimentos funcionais

A Nutrição é uma das ciências mais antigas que objetiva estudar as interrelações entre
alimento, nutrientes e saúde humana; tal fato pode ser comprovado a partir de citações de
consideráveis autores da antiguidade, como Hipócrates, considerado o pai da medicina moderna, que
há 2500 anos advertiu sobre a importância da relação da nutrição e doença, “faça do alimento seu
medicamento” (Hasler, 2000; Tirapegui, 2002).
Nas últimas décadas várias pesquisas têm demonstrado a associação entre dieta e etiologia de
várias doenças, entre elas a obesidade, diabetes tipo 2, doenças cardiovasculares, câncer e doenças
neurodegenerativas (Riboli & Norat, 2003; Kerley-Hamilton et al., 2012). Nas últimas décadas,
alguns estudos, além de mostrar essa associação, atribuem aos alimentos a capacidade de prover
benefícios, além daqueles conferidos pelos nutrientes presentes no alimento, considerando tais
alimentos como funcionais por serem capazes de reduzirem o risco de algumas doenças
(Trichopoulou et al., 2003; Knoops et al., 2004; Karlsen et al.,2007; Krikorian et al.,2010).O
conceito de alimento funcional surgiu na década de 1980, no Japão, quando pesquisadores se
reuniram em um programa de governo com objetivo de desenvolver alimentos saudáveis para uma
população que envelhecia e apresentava uma grande expectativa de vida (Colli, 1998). A baixa
incidência de doenças em alguns povos chamou a atenção para algumas dietas típicas. Os esquimós,
com sua alimentação baseada em peixes e produtos do mar ricos em ômega 3 e 6, têm baixo índice de
problemas cardíacos, assim como os franceses que apresentam alto consumo de vinho tinto. Os
orientais, devido ao consumo de soja, apresentam baixo índice de câncer de mama e redução do risco
de doenças coronarianas (Anjos, 2004).
Estudos epidemiológicos foram realizados e, aliados à indústria alimentícia e ao
desenvolvimento de novos produtos, esses alimentos ficaram recentemente em evidência, pois
começaram a atrair a atenção de consumidores que decidiram por hábitos de vida saudáveis e pela

14
comunidade científica afim de pesquisar os potenciais efeitos desses alimentos e componentes
alimentares (Moraes & Colla, 2006; Stringheta et al, 2007; Grisotti, 2008).
Não existe um consenso a respeito da definição de alimento funcional, embora algumas
organizações competentes tenham tentado definir essa classe de alimento. De acordo com Borges
(2001) os alimentos funcionais devem exercer um efeito metabólico ou fisiológico que contribua para
a saúde física e para a redução do risco de desenvolvimento de doenças crônicas. Dessa forma, esses
alimentos devem fazer parte da alimentação usual e proporcionar efeitos positivos, obtidos com
quantidades não tóxicas e que exerçam esses efeitos mesmo após a suspensão de sua ingestão e que
não estejam associados com tratamento e cura de doenças, e sim à redução do risco de adquirir
doenças.
Já na definição de Anjos (2004) esse conceito se modifica, “alimentos funcionais são
definidos como qualquer substância ou componente de um alimento que proporciona benefícios para
a saúde, inclusive a prevenção e o tratamento de doenças”. Porém a Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA), na Resolução nº 18 de 30 de abril de 1999, não define “alimento funcional” e
sim classifica o alimento, tido como produto final, com “alegação de propriedade funcional: que é
aquela relativa ao papel metabólico ou fisiológico que o nutriente ou não nutriente tem no
crescimento, desenvolvimento, manutenção e outras funções normais do organismo humano”
(ANVISA, 1999). Dessa forma trata-se de alimento, na forma como é consumido habitualmente,
excluindo capsulas, pós e similares, e assim não há aprovação de alegações para ingredientes ou
componentes alimentares, e também não considera a associação do consumo desses alimentos com o
tratamento e/ou a cura de doença.

2.8 O açaí e seu potencial efeito como alimento funcional

A espécie vegetal Euterpe oleracea Mart., é uma palmeira popularmente conhecida como
açaizeiro e é nativa da região Amazônica. Seu fruto, o açaí, é pequeno, arredondado e de coloração
roxo-escuro em função da presença de pigmentos naturais (Tateno, 2001; Almeida, 2004) (Figura 6).
Alguns estudos têm mostrado que o açaí possui alto potencial para ser reconhecido como "alimento
funcional", devido às suas elevadas concentrações de polifenóis, especialmente as antocianinas
(Lichtenthaler et al, 2005; Hassimotto et al., 2005, Schauss et al., 2006a).
O consumo de açaí no Brasil já era notável, porém ganhou notoriedade mundial a partir de
2009, quando Nicholas Perricone, MD, apresentou o açaí como um "Superfood for Age-Defying
Beauty" em um programa de televisão norte americano. Hoje o Brasil se posiciona como o maior
produtor, consumidor e exportador desse produto (Menezes, 2005). Mais recentemente, o açaí tem

15
recebido maior atenção, devido aos benefícios relacionados à saúde e a sua composição fitoquímica
associada a alta capacidade antioxidante do fruto (Pacheco, 2007; Carvalho-Silva et al., 2014).
De acordo com o estudo de Schauss e colaboradores (2006), o açaí é composto por 52,2% de
carboidratos (destes 44,2% são fibras), 32,5 % lipídios e 8,1% de proteínas. Os lipídios são
compostos por ácidos graxos poli-insaturados, saturados e monossaturados na proporção de 13,3%,
26,1% e 60,7%, respectivamente, dessa forma podemos observar que os lipídios encontrados no açaí
são predominantemente, 73,9%, insaturados. O estudo também mostrou que o açaí em sua forma
liofilizada contém vitamina A, C, cálcio e ferro (Schauss et al, 2006b).
A análise fotoquímica mostrou que o açaí contém em sua composição, alguns fitoesterois,
destacando-se o β-sitosterol, campesterol e estigmasterol. Os autores também mostraram que o açaí é
um fruto rico em compostos fenólicos, destacando se os flavonoides predominantemente da subclasse
das antocianinas.

Figura 6 Da esquerda para a direita, fotos do açaizeiro, de seu fruto, o açaí do processamento e da polpa
pronta para o consumo.

Estudo recente em adipócitos murinos observou, que o açaí foi capaz de reduzir o acúmulo de
lipídios intracelulares em adipócitos diferenciados de uma forma dependente da dose utilizada (2.5, 5
e 10 µg de quivalente de acido gálico) e regulou negativamente a expressão de genes como o fator de
transcrição C/ebpα, C/ebpβ, Klf5 e Srebp1c. Também acompanhou a diminuição da expressão de
genes como aP2, LPL, FATP1 e FAS, leptin e PAI e aumento da expressão do gene da adiponectina.
O mesmo estudo observou que o açaii protege as células da produção de ROS, evidenciando que os

16
polifenóis encontrados no açaí são uteis na prevenção de adipogênese, estresse oxidativo e
inflamação (Martino et al.,2016)

2.9 Efeitos funcionais dos componentes do açaí

2.9.1 Flavonóides
Os compostos fenólicos ou polifenóis são encontrados em frutas, legumes, cereais e bebidas
derivadas de plantas, como sucos de frutas, café, chá e vinho tinto. Os polifenóis são potentes
antioxidantes e estão amplamente presentes na dieta (Scalbert et al., 2000; Arts et al., 2005). Estudos
epidemiológicos associaram o consumo dietético de polifenóis com o risco reduzido para doenças,
como o câncer, diabetes e doenças cardiovasculares (Vita, 2005; Kuriyama et al., 2006). As
principais classes de polifenóis incluem os flavonóides, ácidos fenólicos, estilbenos e lignanas (Arts
& Hollman 2005). Estudos experimentais indicam que os efeitos anti-obesogênicos de dietas ricas em
polifenóis pode ser atribuído à capacidade de polifenóis de interagir, direta ou indiretamente, com o
tecido adiposo (pré-adipócitos, células do estroma do tecido adiposo e células imunes) (Esfahani et
al., 2011; Kalupahana et al., 2012).
Os flavonóides, são a maior classe dos polifenóis e também a mais estudada, possuindo mais
de 5.000 compostos já identificados (Ross & Kasum 2002). Os flavonóides apresentam atividade
antioxidante através de efeitos diretos e indiretos. Eles são capazes de neutralizar as ERO de maneira
direta, através da transferência de átomos de hidrogênio que neutralizam essas espécies reativas. Ao
mesmo tempo que, indiretamente, participam da ativação de sistemas de defesa antioxidante e/ou na
inibição de enzimas oxidativas que geram ERO (Rice-Evans et al.,1996; Terao, 2009). Esses
compostos fenólicos podem quelar metais de ferro e cobre, evitando assim a reação de Fenton, na
qual é formada o radical hidroxil e também teem ação antioxidante através da modulação de algumas
proteínas, além de promoverem alterações na expressão gênica (Agarwal 2000; Kim et al. 2003;
Amakura et al, 2003).
No entanto, alguns compostos específicos estão em maiores concentrações em determinados
alimentos, como a quercetina na cebola, miricetina no brócolis, as antocianinas em frutas de
coloração vermelha-arroxeada, tais como cereja, morango e uvas, e as flavanonas em frutas cítricas,
como laranja e tangerina. Estudos utilizando modelos experimentais têm demonstrado que
flavonóides de diversas fontes exercem significantes efeitos benéficos à saúde, como efeitos
hipolipidêmico, antiaterosclerótico, anti-inflamatório imunomodulatório (Raederstorff et al., 2003;
Calpe-Berdiel et al., 2005; Fito et al., 2008;).

17
 As antocianinas são pigmentos naturais, pertencentes à família dos flavonóides, sendo estes
responsáveis pela cor do açaí. Cinco tipos diferentes de antocianinas foram identificados no açaí,
sendo a cianidina 3-glicosideo e cianidina 3-rutinosideo as mais predominantes (Figura 7). Além das
antocianinas, doze outros flavonóides foram identificados, entre eles epicatequina, catequina,
homoorientina e orientina (Schauss et al, 2006b; Kang et al. ,2011).

Figura 7 Estrutura química de cinco flavonoides encontrados no açaí (1) (2S,3S)-dihyrokaempferol 3-O-b-D-
glucoside , (2) (2R,3R)-dihydrokaempferol 3-O-b-D-glucoside, (3) isovitexina, (4) velutina e (5) 5,40-
dihydroxy-7,30,50-trimethoxyflavone. Adaptado: Flavonoids from acai (Euterpe oleracea Mart.) pulp and their
antioxidante and anti-inflammatory activities, 2011. Food Chem. 2011 1;128(1):152-7.

2.9.2 Ácidos graxos insaturados

O açaí apresenta alto conteúdo de ácidos graxos insaturados em sua polpa destacando a
presença dos ácidos oleico e linoleico. Em 100g de peso seco de açaí, 32,5g são gorduras (saturadas e
insaturadas). Dessas gorduras totais, 8,5g estão representadas por ácidos graxos saturados,
destacando-se a presença do ácido palmítico e 24g (74%) estão representadas por ácidos graxos
insaturados (Schauss et al., 2006a).
A importância do consumo de ácidos graxos insaturados tem aumentado significativamente a
partir dos anos 60, decorrente do número de publicações que mostram uma relação positiva entre o
consumo destas gorduras e a saúde (Matthan et al., 2009; Pagkalos et al., 2009). Os estudos com
grandes populações, têm revelado associação negativa entre a ingestão de ácidos graxos
monoinsaturados (MUFA) e ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) e a incidência de DCV bem
como uma associação com efeitos benéficos nas concentrações de LDL e HDL (Mensink & Katan,

18
1989; Jonnalagadda et al., 1996). Sugere-se que esses ácidos graxos insaturados promovam a redução
dos níveis de colesterol total e da LDL na circulação, por aumentar a expressão ou a atividade de
receptores de LDL no fígado (Hu et al., 1997; Fernandez & West, 2005).
Ensaios clínicos randomizados têm demonstrado que a adoção de dieta pobre em gorduras
saturadas reduz os níveis séricos de colesterol e também reduz a incidência de eventos
cardiovasculares. No estudo EPIC, que mostrou os benefícios da dieta tipo Mediterrânea, observou-se
que o baixo consumo de carne é o segundo item mais importante, e a relação de ácido graxo
monoinsaturado/saturado alta, é o quinto para a proteção cardiovascular (Trichopoulou et al., 2009).

2.9.3 Fibras alimentares

Em 100g de peso seco de açaí encontram-se 12,5g de fibra alimentar. Esse composto dietético
está entre as opções alimentares disponíveis para ajudar na regulação dos níveis plasmáticos do
colesterol e, consequentemente, reduzir o risco de desenvolvimento de DCV (Trowell 1972; Wolk et
al., 1999; Kromhout et al., 1984).
Dados experimentais tanto em animais como em humanos sugerem uma associação entre o
aumento da ingestão de fibra alimentar e melhora do perfil de lípides plasmáticos, como diminuição
das concentrações de LDL. Estas observações indicaram uma via de regulação entre a fibra, lipides e
aterosclerose (Anderson 1995; Fernandez 2001). As frutas, legumes e cereais integrais são as
principais fontes de fibras. As fibras alimentares podem ser divididas em 2 grupos: as solúveis
(pectina, gomas e mucilagem) e as insolúveis (celulose, hemicelulose, lignana).
Várias propriedades das fibras são descritas como, aumento da viscosidade das fezes
facilitando o trato intestinal, capacidade de ligação de ácido biliar, fermentação no cólon, possível
modulação da síntese de colesterol e maior captação do colesterol da circulação (Glore et al., 1994;
Tillotson et al., 1997; Brown et al., 1999).

2.10 Estudos realizados com açai

Matheus e colaboradores (2006) avaliaram os efeitos das flores, frutos e espigas da palmeira
Euterpe oleracea Mart., em relação a produção de NO e a atividade e a expressão da enzima iNOs
em culturas de células RAW 264.7 de macrófagos de camundongos. Os resultados obtidos mostraram
que o fruto do açaí, foi mais eficiente em inibir a produção de NO e diminuir a atividade, e a
expressão da enzima iNOS em relação as outras partes analisadas. Esse efeito foi justificado pela
presença dos polifenóis encontrados em diferentes concentrações dependendo da parte da planta.
Souza e colaboradores (2010) estudaram dois grupos de ratos, controle e
hipercolesterolêmico, com suplementação de açaí e observaram diminuição na concentração de

19
proteína carbonilada, aumento na concentração de grupos sulfridrilas que é tido como um radical
protetor de lesão oxidativa, além da diminuição da atividade de SOD e aumento na atividade da PON
no grupo de animais hipercolesterolêmicos que consumiram açaí. Esses resultados mostraram um
efeito do açaí sobre o estado oxidativo e sobre o perfil lipídico, pois foi também observado um efeito
hipolipidêmico do açaí nesses animais.
Outro estudo utilizando como modelo C. elegans encontrou que a suplementação com extrato
aquoso de açaí melhorou o estado oxidativo e a resistência a ele e esteve correlacionado com a
redução na produção de ROS, a prevenção de sulfidrila (SH) e redução da gcs-1 sob condições de
estresse, através da via de resposta ao estresse osmótico OSR-1 / UNC-43 / SEK-1. Dessa forma
sugerindo que os compostos naturais encontrados no açaí podem melhorar a capacidade antioxidante
do organismo por mecanismos diretos e indiretos (Bonomo et al. ,2014)
Apesar dos efeitos nutracêuticos notáveis do açaí, ainda são limitados os estudos realizados
com humanos, principalmente associando o efeito do açaí sobre o metabolismo oxidativo. Udani e
colaboradores (2010) em seu estudo piloto com 10 individuos com excesso de peso, avaliaram
parâmetros bioquímicos, Proteina C reativa e NO, após o consumo de 200g de polpa de açaí por dia
por um período de 30 dias. Os autores observaram diminuição da glicemia e nas concentrações de,
insulina e colesterol, mostrando assim um efeito do açaí sobre fatores de riscos clássicos envolvidos
em doenças crônicas.
Recentemente Gale et al (2014) avaliaram 20 indivíduos (13 mulheres e 7 homens), saudáveis
em relação a parâmetros hemodinâmicos e eletrocardiográficos, após o consumo de uma dose única
de cápsulas de açaí (2 capsulas de 500mg cada) e analisaram as variáveis no início (baseline) e após
2 e 6 horas e compararam com um grupo placebo. Em relação ao eletrocardiograma não foram
encontradas diferenças entre o grupo placebo e o grupo que consumiu o açaí, porém a pressão arterial
sistólica encontrada foi menor, após 6 horas, no grupo que consumiu cápsulas de açaí, em relação ao
grupo placebo.
Dessa maneira, considerando o açaí como um alimento altamente antioxidante, envolvido
com mecanismos do estado redox e assim, possivelmente, associado com a fisiopatologia de várias
doenças e a falta de estudos em humanos que avaliem um painel completo de marcadores do estado
oxidativo, é que nos propusemos a realizar o presente estudo. Neste trabalho avaliamos, em um grupo
de mulheres, o efeito do consumo da polpa de açaí sobre marcadores do metabolismo oxidativo e
outros parâmetros metabólicos.

20
3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar o efeito do consumo de polpa de açaí sobre as variaveis antropométricos, clínicos,
bioquímicos e sobre biomarcadores do estado oxidativo no soro e em células mononucleares e
polimorfonucleares e o perfil de lipoproteinas em mulheres aparentemente saudáveis.

3.2 Objetivos específicos

1. Avaliar variáveis antropométricas, clínicas e bioquímicas das voluntárias ao início e ao final do
período experimental;

2. Avaliar a ingestão alimentar habitual e estilo de vida, através da atividade física, das voluntárias
ao início e ao final do período experimental;

3. Analisar no soro das voluntárias, ao início e ao final do período experimental;

-Capacidade antioxidante total (TAC);
-Concentração de LDL-ox;
-Atividade da enzima PON;
-Concentração de Dialdeído Malônico (MDA);

4. Determinar em células mononucleares das voluntárias analisadas, ao início e ao final do período

experimental;
-Atividade das enzimas SOD, CAT e GPx.

5. Em células polimorfonucleares das voluntárias analisadas, ao início e ao final do período

experimental, determinar:
-Produção de ERO;
-TAC;
-Produção de NO;
-Atividade de SOD, CAT, GPx e oxido nítrico sintase (iNOs).

6. No soro das voluntárias analisadas, ao início e ao final do período experimental, avaliar a

concentração da apolipoproteina A e da apolipoproteina B.

21
7. No soro das voluntárias analisadas, ao início e ao final do período experimental, avaliar o efeito da
polpa de açaí na transferência de lípides da nanoemulsão de LDE para a HDL.

22
4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Desenho do estudo

Foi realizado um estudo prospectivo de intervenção nutricional no município de Ouro Preto,
MG, para avaliar o efeito do consumo de polpa de açaí sobre parâmetros metabólicos e do estado
oxidativo em mulheres aparentemente saudáveis. O protocolo experimental foi desenvolvido de abril
a dezembro de 2013.
O estudo foi realizado em três etapas: recrutamento e preparo das voluntárias para a
participação no estudo (Etapa I), etapa da intervenção nutricional (Etapa II) e final da intervenção
nutricional (Etapa III) O estudo foi elaborado para que a voluntária colaborasse durante quatro
semanas, com quatro encontros nas três etapas, com um plano cronológico esquematizado na Figura
8. As voluntárias foram orientadas a manterem seus hábitos de vida e ingerir 200g de polpa de açaí
por dia, durante as quatro semanas, sem alterar a dieta habitual e o nível de atividade física durante
toda a intervenção.

Figura 8 Diagrama do desenho de estudo prospectivo de intervenção nutricional

23
4.2 Recrutamento das voluntárias
O recrutamento ocorreu através de anúncios em rádio, TV e folhetos divulgados junto a
profissionais de saúde para toda a comunidade de Ouro Preto. A divulgação e difusão também foram
feitas por meio da webpage da Universidade Federal de Ouro Preto com endereço de e-mail e
telefones de contato disponíveis para as mulheres que tivessem interesse pelo estudo.
A seleção das voluntárias foi realizada por profissionais treinados (graduandos e pós-
graduandos da Universidade Federal de Ouro Preto), por meio dos dados obtidos com questionário
estruturado (Anexo 1).
No recrutamento, as voluntárias foram informadas oralmente e em seguida receberam por
escrito, uma descrição do estudo e de todos os procedimentos a que seriam submetidas, bem como
informadas dos riscos e benefícios de sua participação (Anexo 2). Todas as voluntárias deram seu
consentimento por escrito.
As voluntárias selecionadas foram orientaas que poderiam abandonar o estudo em qualquer
momento se não desejassem continuar ou se o pesquisador encontrasse alguma condição médica que
não fosse aconselhável a continuidade de sua participação.

4.3 Critérios para seleção das voluntárias

Após o recrutamento, foram selecionadas as voluntárias que se não enquadravam em qualquer
um dos seguintes critérios de exclusão:
- Não saber ler e escrever ou apresentar dificuldades cognitivas que dificultem o
preenchimento dos questionários.
- Mudanças de peso de mais de 10% do peso corporal nos dois meses anteriores ao
estudo.
- Pressão arterial ≥ 140 mmHg e,ou diastólica ≥ 90mmHg.
- Glicemia de jejum de ≥126 mg/dL ou pós prandial de ≥ 200 mg/dL aferido na triagem, utilizando
sangue capilar.
- História de dislipidemia ou colesterol total ≥ 240 mg/dL aferido na triagem ou triacilgliceróis ≥
200mg/dL aferido na triagem, utilizando sangue capilar.
- Doenças tireoidianas tratadas com fármacos (hipotireoidismo tratado e bem controlada
Foi permitido).
- Alergias alimentares, desordens alimentares, ou intolerância ao açaí.
- Dietas especiais (dieta vegetariana, dieta Atkins, etc) aos dois meses antes do estudo.
- Uso de suplementos nutricionais (complexo vitamínicos, minerais), etc seis meses
antes do estudo.

24
- Intercorrência clínica que impeça a conclusão do estudo.
- Atletas de elite.
- Pessoas que sofreram intervenção cirúrgica para tratamento da obesidade.
- Portadoras de doenças crônicas (cardiovascular, renal, hepática, intestinal).
- Portadoras de doenças infecciosas ou inflamatórias.
- Doença aguda que tenha requerido tratamento nos últimos 2 meses.
- Relato de diagnóstico de câncer nos dez anos anteriores.
- Uso crônico de medicação, exceto contraceptivos, esteróides inalados ou sprays
nasais.
- Gestação e amamentação.
- Portadoras de necessidades especiais.

Tais informações foram relatadas pelas voluntárias em entrevista durante a seleção por
profissionais treinados. Na Figura 9, está apresentado o diagrama de recrutamento e seleção das
voluntárias que foram incluídas no estudo.

Figura 9 Diagrama de recrutamento e seleção das voluntarias que participaram do presente estudo

25
4.4 Questões éticas
As voluntárias selecionadas para participarem do estudo assinaram, em duplicata, o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 3). O protocolo para este estudo foi submetido e
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Ouro Preto (CAAE:
0062.0.238.000-10, Anexo 4).

4.5 Coleta de dados

4.5.1 Dados antropométricos e de composição corporal

O peso corporal foi aferido em balança digital Welmy® (modelo W200-A). A estatura foi
mensurada com estadiômetro vertical acoplado a balança (Lohman et al., 1988). Em seguida, o IMC
foi calculado de acordo com a Organização Mundial de Saúde (WHO, 2000). As circunferências da
cintura (CC) e do quadril (CQ) foram medidos utilizando fita flexível e inelástica. O percentual de
gordura corporal (%CG) foi determinado através de bioimpedância elétrica tetrapolar horizontal
(Biodynamics, modelo 310e) (Lukaski et al, 1995).

4.5.2 Pressão Arterial

Pressão arterial sistólica e diastólica foram medidas por esfigmomanômetro digital Omron
(modelo HEM-705CP) de acordo com as orientações da Associação Americana do coração
(American Heart Association, 2005).

4.5.3 Dados bioquímicos

Amostras de sangue foram coletadas por punção venosa na região antecubital das voluntárias
com 12 horas de jejum, no inicio e ao final de quatro semanas. Foram coletados em tubo contendo
heparina para os ensaios com células, com EDTA para realização do hemograma e em tubo sem
anticoagulante para obtenção de soro para as dosagens bioquímicas e de estado oxidativo. Foram
dosados glicose, colesterol total, HDL-c e triacilgliceróis por método enzimático colorimétrico. As
concentrações de LDLc foram calculadas de acordo com a equação de Friedewald (Friedewald et al.,
1972). A dosagem de insulina de jejum no soro foi determinada por imuno ensaio
quimioluminescente utilizando o kit Access Ultrasensitive Insulin (AcessImmunoassay System), com
sensibilidade de 0,3 μIU/mL. A resistência a insulina foi estimada pelo índice de homeostase da
resistência à insulina (HOMA -IR) a partir da equação proposta por Matthews et al. (1985). As
apolipoproteinas A-1 e B foram determinadas por imunoturbidimetria, utilizando o reagente
precipitante constituído de cloreto de magnésio e acido fosfotungstico.

26
 4.5.4 Estilo de vida

Ingestão dietética
O conteúdo calórico expresso em calorias, assim como carboidrato, proteína, lipídios totais,
ácidos graxos saturados, monoinsaturados, poli-insaturados e fibras (dados não mostrados) foram
quantificados pelo questionário de frequência alimentar previamente validado (Sichieri e Everhart,
1998).

Atividade física
A escala de atividade física (Anexo 5) utilizada no presente estudoé uma adaptação da escala
desenvolvida por Aadahl e Jorgensen (2003) que mede a atividade física total no período de 24 horas
de um dia útil incluindo atividades de trabalho, lazer e esporte. As atividades físicas estão agrupadas
em nove níveis de intensidade que variam entre o sono (nível A) e atividades de alta intensidade,
como correr e corrida de bicicleta (nível I). (Santos e Simões, 2009)
O MET equivale à energia suficiente para um indivíduo se manter em repouso, representado pelo
consumo de oxigênio de aproximadamente 3,5 ml/kg/min, sendo este múltiplo da taxa metabólica
basal. Quando se exprime o gasto de energia em METs, representa-se o número de vezes pelo qual o
metabolismo de repouso foi multiplicado durante uma atividade. Logo, se o indivíduo realiza
atividade leve de 4 METs, isso implica em gasto calórico quatro vezes maior que o que vigora em
repouso. Portanto, o MET é a determinação, de forma acurada, da intensidade da atividade física
(Porto; Junqueira, 2008).

4.6 Obtenção das células mononucleares e polimorfonucleares

As células mononucleares (MN) e as polimorfonucleares (PMN) foram isoladas do sangue
periférico das voluntarias, após jejum de 12 horas. Adquirimos da Sigma-Aldric (St. Louis, MO,
USA) os gradientes Histopaque 1119 (densidade =1,119 g/mL) para isolamento das células PMN e o
Histopaque 1077 (densidade 1,077g/mL) para isolamento das células mononucleares (MN). O
protocolo utilizado foi adaptado da orientação do fabricante (Anexo 6). Em resumo, 5mL de sangue
periférico heparinizado foram adicionados em dois tubos Falcon, que continham 3 ml do Histopaque
1077 sob 3 ml de Histopaque 1099.
Após centrifugação a 700g por 10 minutos foram obtidos dois anéis distintos, sendo a porção
superior formado por células MN e o inferior por PMN (Figura 10). Inicialmente o anel superior foi
transferido cuidadosamente para outro tubo; em seguida, realizou-se o mesmo procedimento para o
anel inferior, formado em sua maioria por neutrófilos. Em seguida, ambos os tubos foram lavados

27
duas vezes com Hank´s pH 7,4. Após as duas lavagens as células foram ressuspensas em 1,0 mL de
Hank´s pH 7,4. As células MN foram usadas para os ensaios de atividade enzimática de SOD, CAT e
GPx, enquanto que as células PMN foram usadas para o ensaio de quimioluminescência, dosagem de
óxido nítrico, atividade de CAT, SOD, GPx e óxido nítrico sintase. Em seguida foi realizada
contagem de células MN e PMN no microscópio (Bioval®) com câmara de Neubauer espelhada
(NewOptics) e realizada o teste de viabilidade celular.

Figura 10 Esquema da obtenção de células mononucleares e polimorfonucleares para os ensaios do

estado oxidativo.

4.6.1 Teste de viabilidade celular

A viabilidade das células PMN utilizadas nos ensaios do estado oxidativo, foi avaliada pelo
teste de exclusão com azul de tripan (Oliveira-Lima & Dias da Silva, 1970). Após o isolamento das
células PMN, 1 x 106 células foram adicionadas 30 µL de azul de tripan (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA) e diluídas em Hank´s. Em todos os ensaios monitorados a viabilidade celular nunca se
mostrou inferior a 95%.

4.6.2 Teste de Citometria de fluxo

A técnica da citometria de fluxo permite que seja realizada uma avaliação simultânea de
múltiplas propriedades de uma célula suspensa em meio líquido. Dessa forma, a caracterização inclui
a análise básica de três parâmetros celulares, sendo estes: tamanho, granulosidade e intensidade
relativa de fluorescência. Para detecção destes parâmetros descritos, um sistema óptico-eletrônico
emite sinais que podem ser medidos e armazenados para análise em softwares específicos (Cram,

28
2002). Nesse contexto, garantimos que a fração celular obtida era realmente de células PMN para
podermos prosseguir com os ensaios específicos.

4.7 Marcadores do estado oxidativo

4.7.1 Séricos

Capacidade Antioxidante Total

A capacidade antioxidante total (TAC) foi determinada usando o kit colorimétrico Quanti
Chrom TM Antioxidant Assay Kit (DTAC-100) fornecido pela BioAssay System (BioAssay System,
CA, USA) (Anexo 7). O Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico), o análogo
hidrossolúvel da vitamina E, é usado para comparar o poder antioxidante de vários compostos, dessa
forma, esse ensaio foi medido em equivalentes de Trolox e esse reagente também foi usado para a
realização da curva padrão. Este ensaio mediu a capacidade antioxidante total em que uma solução de
cobre II (Cu2 +) foi reduzida por antioxidantes para formar cobre I (Cu +). O resultante Cu+,
especificamente, forma um complexo colorido com o reagente corante (batocuproina) que pode ser
detectado por absorbância no comprimento de onda específico. Resumidamente, as células PMN
foram homogeneizadas com Hank´s pH 7,4, e centrifugados a 14000 rpm, por 10 minutos à
temperatura ambiente. Foi utilizado 20 μL do sobrenadante que foram retirados e transferidos para
placa de 96 poços, onde foram adicionados a cada poço 100μL do reagente de trabalho fornecido
pelo fabricante. A placa foi incubada por 10 minutos a temperatura ambiente. A intensidade da cor é
proporcional à TAC da amostra. A absorbância foi medida em 570 nm usando espectofotometro de
microplaca Epoch (Biotek)

Enzima Paraoxonase-atividade paraoxonase

A atividade da paraoxonase (PON) foi determinada utilizando o paraoxon como substrato,
considerando como base a velocidade de hidrólise deste, com a liberação do paranitrofenol por
minuto, conforme descrito por Beltowski et al. (2002). Primeiramente preparou-se em tubo falcon
uma solução com 9 mL de tampão glicina/OH 50mM, pH 10,5, contendo CaCl 2 0,9mM e 2 µL de
paraoxon. Em uma microplaca foram adicionados 780 µL dessa solução com 20 µL de cada amostra
de soro. A solução foi homogeneizada e lida a cada 1 minuto por três minutos, a 412nm. De acordo
com Beltowki et al (2002) 1U da atividade PON é equivalente a hidrólise de 1 mmol de paraoxon por

29
minuto. A absorbância utilizada é o delta obtido das três absorbâncias lidas (absorbância final-
absorbância inicial/2).

LDL oxidada
A LDL oxidada foi determinada através do kit de imunoensaio enzimático OxiSelect™
HumanOxidized LDL ELISA Kit (MDA-LDL Quantitation) comercializado pela CellBiolabs, INC.
Inicialmente as amostras de soro foram preparadas com 200 µL de solução de precipitação de LDL e
incubadas à temperatura ambiente durante 5 minutos, até a precipitação ocorrer, conforme
orientação do fabricante (Anexo 8). Em seguida as amostras foram centrifugadas durante 20 minutos
a 2000g. Foram adicionados 100µL de LDL-ox padrão e a mesma quantidade de amostra na
microplaca já sensibilizada. Incubou-se a microplaca a temperatura ambiente durante 2 horas num
agitador. Em seguida os poços foram lavados 3 vezes com tampão de lavagem. Foram adicionados
100 uL de reagente de bloqueio já diluído em cada poço da microplaca e em seguida incubou se por
mais 1 hora. Novamente a os poços foram lavados e adicionados 100 uL de anticorpo biotinilado
anti-humano ApoB-100 em cada pocinho, incubou se à temperatura ambiente durante 1 hora num
agitador. Os pocinhos foram lavados e adicionou-se o conjugado de estreptavidina em cada poço.
Novamente houve incubação de 1 hora. Por último, os poços foram novamente lavados e foram
adicionados 100 µL de solução de substrato em cada pocinho, incluindo o branco. Incubamos a
microplaca à temperatura ambiente e esperamos alterar a cor, na sequencia foi adicionado a solução
de parada em todos os poços e a microplaca foi lida no espectrofotómetro a 450 nm.

Dialdeído Malônico (MDA)

A concentração sérica dos níveis de peroxidação lipídica foi realizada conforme procedimento
descrito previamente (Esterbauer e Cheeseman, 1990). Em resumo, foram adicionados em um falcon
50 mL de hidroxitolueno butilado (BHT 10 mM), 500 µL de ácido tricloroacético (TCA 20%), 500
µL de ácido tiobarbitúrico (TBA 1%), 250 mL de soro (ou água para o branco ou série de padrões). A
mistura foi homogeneizada e incubada a 100ºC durante 60 minutos Após esse tempo, a mistura foi
resfriada em água com gelo e adicionou-se 1,5 mL de butanol. A mistura foi novamente
homogeneizada centrifugada a 1000g durante 5 mim. O sobrenadante foi transferido para uma cubeta
de quartzo e a leitura foi realizada em espectrofotômetro (Epoch, Biotek®) a 532 nm, acertando o
zero com o branco da reação. Os resultados foram expressos em [µM de MDA].

30
 4.7.2 Celulares

Células Mononucleares

Atividade da enzima superóxido dismutase

A atividade da superóxido dismutase total foi determinada utilizando o kit colorimétrico
EnzyChromTMSuperoxide Dismutase Assay Kit (ESOD-100) fornecido pela BioAssay System
(BioAssay System, CA, USA). Em resumo, 1×10 6 de células foram homogeneizadas em 1 mL de
Hank´s pH 7,4 e centrifugadas a 14000 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente. O
sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido com 500µL de tampão de lise gelado. As
amostras foram deixadas no gelo por 10 minutos. Em seguida, foram centrifugadas de acordo com
orientação do fabricante (Anexo 9).
Para a realização dessa dosagem foi utilizado 20 μL de sobrenadante. Esse ensaio determina
quantitativamente a atividade da enzima SOD, através do superóxido (O 2-), fornecido pela reação
catalizada pela xantina oxidase (XO). O O2- reage com um sal tetrazólio (WST-1, (2 (4-iodofenil) -3
(4-nitrofenil) -5 (2,4 -disulfo-fenil) 2H-tetrazólio), o qual produz um corante solúvel (WST-1
formazan) que é utilizado para a quantificação calorimetrica. A enzima SOD inibe a reação e assim
há menos O2- disponível para a reação cromogênica. A intensidade da cor gerada foi usada para
determinar a atividade da SOD na amostra.
A reação iniciou-se pela adição do reagente de trabalho que continha xantina e o WST-1, em
seguida, foi adicionada os poços com as amotras a enzima XO e feita a leitura no espectofotometro
de microplaca Epoch (Biotek). Logo em seguida a placa foi incubada no escuro por 60 minutos. Após
esse intervalo foi novamente feita a leitura a 450 nm utilizando o mesmo equipamento Epoch.

Atividade da enzima catalase

A catalase é uma enzima antioxidante que catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio
(H2O2) em água e oxigênio. A atividade da catalase foi determinada usando o kit fluorimétrico
EnzyChromTMCatalase Assay Kit (ECAT-100) fornecido pela BioAssay System (BioAssay System,
CA, USA). Resumidamente, 1×106 células foram homogeneizadas em 200 μL de Hank´s pH 7,4 e
centrifugadas a 14000 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente, para sedimentar os detritos.
Seguindo as orientações do fabricante (Anexo 10) colocou-se 10μL da amostra em placas de 96
poços e adicionados 1μL do mix 1 (H2O2 a 4,8 mM ) e 90 μL do mix 2. As amostras foram incubadas
por 30 minutos a temperatura ambiente. Em seguida foi preparado o reagente de detecção que

31
continha a enzima HRP (Horseradishperoxidase) e o fluorogênico Dye (quinoneiminedye). As
amostras foram incubadas por 10 minutos em temperatura ambiente e a absorbância foi medida em
570 nm usando espectofotômetro de microplaca Epoch (Biotek). A unidade de leitura para realização
dos cálculos foi definida como: uma unidade é a quantidade de catalase que decompõe um μmol de
H2O2 por min em pH 7,0 em temperatura ambiente.

Atividade da enzima glutation peroxidase

A atividade da glutationa peroxidase foi determinada usando o kit EnzyChromTMGlutathione
Peroxidase Assay Kit (EGPX-100) fornecido pela BioAssay System (BioAssay System, CA, USA).
A enzima GPx converte a glutationa reduzida (GSH), a glutationa oxidada (GSSG), reduzindo os
hidroperóxidos de lípidos aos seus álcoois correspondentes ou reduzindo peróxido de hidrogênio
livre em água. Esse ensaio é baseado na atividade da enzima GPx em reduzir o hidroperóxido de
cumeno (disponível no kit comercial), enquanto oxida a GSH para a GSSG (Anexo 11). A GSSG
gerada é reduzida para GSH com o consumo de NADPH (também disponível no kit) pela enzima
glutationaredutase (GR). A diminuição do NADPH é proporcional à atividade da enzima GPx. Em
resumo, foi adicionado 10μl de cada amostra na placa de 96 poços e em seguida, adicionado o
reagente de trabalho, composto pelo tampão fosfato, glutationa, NADPH e pela enzima GR. Em
seguida foi adicionado o hidroperoxido de cumeno e feito a leitura no espectrofotômetro Epoch
(Biotek) em 340 nm imediatamente e após 4 minutos.

Células Polimorfonucleares

Produção de Espécies Reativas de Oxigênio

A produção de ERO foi avaliada através de um ensaio de quimioluminescência amplificado
por luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4phthalozinedione), como descrito por Chaves et al. (2000). O
ensaio de quimioluminescência permite avaliar, a atividade da NADPH oxidase, a enzima
responsável pela geração de espécies reativas de oxigênio, durante o processo de fagocitose celular
(Babior, 1994). Esta metodologia se baseia na reação entre o luminol e as espécies reativas
produzidas. A luminosidade pode ser captada usando-se reagentes químicos que, ao reagirem com
ERO, passam a emitir fótons e assim uma luminescência maior (Figura 11).
Para a realização do ensaio, 1 x 106 células em solução Hank´s pH 7,4, foram incubadas com
500 µL de luminol em tubos de siliconizados específicos. Os fótons emitidos foram registrados
durante 30 minutos, em intervalos de 1 em 1 min e registrados pelo computador adaptado do
luminômetro Berthold Sirius (Sirius Berthold, Germany) durante esse período. Neste estudo excluiu-

32
se os 10 minutos iniciais e os 10 minutos finais, considerando a excitação inicial das células PMN e a
diminuição progressiva da produção de ROS, ao longo de 20 minutos. Os valores foram expressos
em unidade relativa de luz por minuto (RLU/min).

Figura 11 Avaliação da produção de ERO através do ensaio de quimioluminescência amplificado por luminol.
Ocorre uma reação entre o luminol e as espécies reativas produzidas e a luminosidade pode ser captada na
presença de α-aminoftalato.

Atividade da enzima oxido nítrico sintase

A atividade da enzima óxido nítrico sintase (iNOS) foi determinada usando o kit colorimétrico
EnzyChromTMNitric Oxide Synthase Assay Kit (ENOS-100) fornecido pela BioAssay System
(BioAssay System, CA, USA) (Anexo 12). Esse ensaio envolve duas etapas, a primeira na qual o
óxido nítrico (NO) é produzido pela enzima iNOS e a segunda etapa, que se baseia na detecção do
NO na amostra. Uma vez que o NO produzido é rapidamente oxidado em nitrito e nitrato, a produção
de NO é medida após a redução do nitrato a nitrito usando um método de Griess adaptado (descrito
no próximo item). Em resumo, em 25 μL de amostra foi adicionado o reagente de trabalho para iNOs
e incubamos a 37 ° C durante 20 minutos. Após esse intervalo, realizamos a desproteinação dessas
amostras com 7μL ZnSO4 e de NaOH, conforme orientação do fabricante. Adicionamos, em seguida,
o reagente de detecção de iNOs e incubamos por mais 5 minutos a 60 ° C. As amostras foram
centrifugadas, por 5 minutos e transferidas para a placa de 96 poços. Em seguida, foi realizar a leitura
a 570nm noespectofotometro de microplaca Epoch (Biotek).

Dosagem de óxido nítrico

A concentração de NO foi determinada através do kit colorimétrico QuantiChromTMNitric
Oxide Assay Kit (D2NO – 100) da BioAssay System (BioAssay System, CA, USA). O kit mensura o
NO pela redução de nitrato a nitrito utilizando o método de Griess adaptado (Figura 12). Nesse
ensaio o nitrito reage com a sulfanilamina (disponível no kit comercial) em meio ácido, formando um
composto diazo. Esse composto, por sua vez, reage com o cloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina
gerando um composto de coloração rósea que pode ser quantificado através de espectofotometria.
Resumidamente, as células PMN foram homogeneizadas com Hank´s pH 7,4, e centrifugados
por 10 minutos. O sobrenadante foi retirado e usado na dosagem. Para a reação de desproteinação,
33
150 μL da amostra foi adicionada a 8μL de sulfato de zinco (ZnSO4, 75 mM) e levada ao vortex, em
seguida foram adicionados 8μL de hidróxido de sódio (NaOH, 55 mM) e a amostra foi levada para
centrifugação a 14000 rpm por 10 minutos. Em seguida, 100μL do sobrenadante de cada amostra foi
transferida para outro tubo do tipo eppendorf e adicionou se o reagente de trabalho, conforme
orientações do fabricante (Anexo 13). As amostras foram incubadas por 10 minutos a 60 ºC,
transferidas para placas de 96 poços e realizada a leitura no espectrofotômetro (Biotek) a 570nm.

Figura 12 Esquema da reação para detecção do óxido nítrico baseado no método de Griess adaptado.

A TAC e a atividade das enzimas SOD, CAT e GPx também foram dosadas em células PMN
seguindo a metodologia descrita anteriormente.

4.8 Polpa de açaí

A quantidade de polpa de açaí necessária para o desenvolvimento do estudo foi adquirida em
comércio local um único lote do mesmo fornecedor de maneira a garantir a homogeneidade da polpa
durante todo o experimento (IceFruit® Lote 04/13). Porções de 100g de polpa de açaí foram dadas as
voluntarias do estudo. As voluntarias foram orientadas a consumir duas porções por dia, ou seja, 200
g/dia. Porções suficientes para oito dias foram fornecidas a cada voluntária semanalmente. Nos dias
1, 8, 15 e 22 do estudo foram entregues as polpas de açaí para o seguimento da semana. Esses
encontros para fornecer a polpa de açaí, serviam também para acompanhar a rotina que elas estavam
seguindo ao consumir a polpa, a aceitação com as preparações, adesão ao estudo dentre outras
informações.

34
4.9 Análise Bromatológicas da polpa de açaí
As análises da composição bromatológicas foram realizadas no Laboratório de Bromatologia da
Escola de Nutrição, da UFOP. Foram determinados os valores de umidade, cinzas, lipídios totais,
proteínas, carboidratos e fibras. Todas as análises foram realizadas segundo o Método Físico-
químico para Análise de Alimentos – IV, do Instituo Instituto Adolf Lutz (2005). A umidade foi
determinada utilizando o método baseado na perda de massa por secagem em estufa a 105°C. O teor
de proteína foi quantificado de acordo com o método de Kjeldahl clássico. Para análise do teor de
cinzas o método por incineração em mufla, foi realizado. Os lipídios totais foram determinados pelo
método de extração Soxhle. Para quantificação das fibras alimentares foi utilizado o método
enzimático gravimétrico. O teor de carboidratos foi calculado pela diferença percentual da soma dos
teores de proteínas, lipídios totais, umidade, cinzas e fibras (Cacchi, 2003) . Para cada voluntária foi
fornecido 200 g de polpa de açaí/dia que contém cerca de 20 g de fruta seca, o que corresponde a 103
kcal.

Tabela 1. Composição química centesimal da polpa de açaí utilizado no trabalho

100g de peso seco de polpa de açaí

Lipídeos (g) 47,0

Proteína (g) 11,0
Carboidrato (g) 11,6
Fibra (g) 27,2
Cinzas (g) 3,2
Valor energético total (kcal)¹ 513,4

Fatores de conversão: carboidrato 4 kcal/g. proteína 4 kcal/g e lipídeo 9 kcal/g.

4.10 Determinação da atividade antioxidante da polpa de açaí

Várias metodologias foram utilizadas para quantificar a atividade antioxidante da polpa de açai
que oferecíamos as voluntárias, no inicio e ao final da intervenção, entre eles a determinação de
polifenóis totais e métodos colorimétricos que relacionam a capacidade dos antioxidantes em
neutralizar radicais como DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazila) ou ABTS [sal de amônio do ácido
2,2’-azinobis(3-etilbenzenotiazolina-6-sulfônico)] e em reduzir o metal, como o método FRAP (ferric
reducing antioxidante power) .

35
 4.10.1 Polifenóis totais pelo Método Folin Ciocalteau
Para determinação de polifenóis totais no extrato bruto da amostra de polpa de açaí utilizamos a
metodologia descrita por Shahidi e Nackz (1995). Uma alíquota de 100µL do extrato da polpa foi
diluído em 1mL do reagente de Folin-Ciocalteu (0,25N). Após 2 minutos de repouso na ausência de
luz, foram adicionados 1mL de solução de carbonato de sódio. A mistura foi novamente colocada em
repouso no escuro, durante 2 horas. Após esse tempo, a leitura foi realizada utilizando
espectrofotômetro a 760nm. A curva padrão para quantificação dos polifenóis totais no extrato bruto
foi determinada utilizando solução de ácido gálico nas seguintes concentrações: 5, 10, 15, 20, 25, 30
e 35 mg/L. O teor de polifenóis totais no extrato bruto encontrado foi 131 mg EAG/100g ao inicio do
estudo e de 155 mgEAG/100g ao final , expresso em mg equivalente de ácido gálico (EAG) em 100g
de amostra.

Atividade antioxidante da polpa de açai pelo Método DPPH

A capacidade antioxidante foi avaliada utilizando o método do seqüestro de radicais livres do
DPPH como descrito por Brand-Williams et al (1995) e adaptado por Sanchez-Moreno et al (1998)
que se baseia em um ensaio fotométrico onde o radical livre DPPH, que apresenta coloração roxa
intensa em solução alcoólica, se reduz em presença de moléculas antioxidantes, formando o 2,2
difenil-1-picrilhidrazil, que é incolor.
Para o ensaio de atividade antioxidante com o radical DPPH, 100µL de diferentes concentrações
do extrato 160, 239, 320, 400 e 552 (g/L) foram adicionados em tubos de ensaio com 3,9 mL de
solução de DPPH diluído em metanol (100mM). A mistura foi homogeneizada e mantida no escuro
em temperatura ambiente por 30 minutos. Após esse tempo as absorbâncias foram lidas em
espectrofotômetro a 517 nm. Utilizou-se metanol como branco para calibrar o aparelho. A
concentração de DPPH foi calculada com base na curva de calibração de DPPH e expressa em %
inibição e IC50 (mg AGE/L extrato), o que corresponde a concentração necessário de extrato para
oxidar 50% do radical DPPH.
O ensaio de DPPH apresentou em EC50 de 512mg/ml no inicio da intervenção e ao final
EC50: 869mg/mL (Figura 13).

36
Figura 13. Gráfico da porcentagem de redução do DPPH em relação as concentrações de 160, 239, 320, 400 e
552 g/L de extrato da polpa de açaí.

Atividade antioxidante da polpa de açai pelo Método FRAP.

Outra metodologia empregada para determinação da atividade antioxidante foi a quantificação
da redução de ions ferro como descrito por Pulido et al (2000). A metodologia consiste na capacidade
dos polifenóis em reduzir o Fe3+ em Fe2+. Quando isto ocorre, na presença de 2,4,6-tripiridils-
triazina (TPTZ), a redução é acompanhada pela formação de um complexo corado com o Fe 2+.
Para o preparo do reagente FRAP foram adicionados 25 mL de tampão acetato (0,3M), 2,5
mL de uma solução de TPTZ (2,4,6-Tris(2-piridil)-s-triazina) (10 mM) e 2,5 mL de uma solução
aquosa de cloreto férrico (20 mM).
Uma alíquota de 90 μL de cada concentração de extrato foi misturada em tubos de ensaio com
270μL de água destilada e 2,7 mL do reagente FRAP. Após homogeneização, os tubos foram
colocados em banho-maria a 37°C durante 30 minutos. Após esse tempo, foi realizado leitura em
espectrofotômetro a 595 nm. A curva-padrão foi obtida utilizando solução padrão de sulfato ferroso
em diferentes concentrações: 500, 1000, 1500 e 2000 μM .
O método do FRAP com a polpa de açai resultou em 12,0µM de sulfato ferroso/g ao inicio da
intervenção e ao final.
Dessa forma, verificamos que as condições de armazenamento sob refrigeração a -70 C da
polpa durante o ensaio não interferiram de maneira importante no conteúdo de polifenóis e na
capacidade antioxidante da polpa de açai que sofreram pequena variação , dessa forma manteve a

37
estabilidade mesmo sob congelamento até o final do presente estudo de acordo com as metodologias
citadas acima.

4.11 Transferência de lípides

4.11.1 Preparo da emulsão lipidica artificial LDEA

LDE foi preparada de acordo com a metodologia de Ginsburg (1982) e modificada por
Maranhão e col. (1993). Em resumo, foram pipetados 40 µL fosfatidilcolina, 20mg de ester de
colesterol, 1mg de trioleína e 0,5 mg ed colesterol, diluídos em clorofórmio/metanol. Em seguida, foi
adicionado 3H-éster de colesterol (3H-EC) e 14
C-fosfatidilcolina (14C-FL) ou 3
H-triglicerides (3H-
14
TG) e C-colesterol livre (14C-CL). Sob o fluxo de nitrogênio, a mistura foi secada e mantida no
dessecador a vácuo por 16 horas, a 4C para remoção dos solventes. A mistura de lipides foi
emulsificada por irradiação ultra-sonica de 125watt de potencia durante 3 horas, sob atmosfera de 51
a 55°C. Por ultimo, a nanoemulsao foi purificada 2 vezes por ultracentrifugação e esterilizada através
da passagem em filtro (Millipore®). Todo o procedimento de preparo da nanoemulsão foi feito em
capela de fluxo laminar.

4.11.2 Transferência de colesterol livre (CL), éster de colesterol (EC), triglicérides (TG) e
fosfolípides (FL) de uma emulsão lipídica artificial (LDE) para HDL
Foi utilizado para o ensaio 1 ml de plasma das voluntarias. As amostras foram incubadas com
50µL da LDE marcada radioativamente com 3H-CE e 14
C-FL ou 3H- 3H-TG e 14
C-CL por 60
minutos, em agitdor orbital Gyromax 706R, sob agitação a 40 rpm.
Após incubação foram adicionados 250 µL de reagente de precipitação de lipoproteínas
contendo apo B (sulfato de dextran 0,2%MgCl2 3M, v/v). A mistura foi agitada em vortex e
posteriormente centrifugada por 10minutos a 3.000rpm. A fração HDL foi obtida após precipitação
da nanoemulsão. Aliquotas de 250µL de sobrenadante, contendo HDL, foram pipetadas em frascos
apropriados para cintilaçõ. Foi acrescentado 5 mL de solução cintiladora Ultima Gold (perkinElmer,
Boston, USA) e, finalmente, a radioatividade presente nas amostras foi quantificda em contador Beta
(liquid Scintillation anlyzer, Packard 1600 TR, Palo Alto, CA) com a utilização do software Plus
14
Vers 5.01 da Diamond Computers, para determinação das contagens de C e 3H das amostas. A
quantificaão dos lípides transferidos de LDE para HDL plasmática foi expressa em porcentagem (%)
em relação a radioatividade total.

38
4.12 Análise estatística
Inicialmente foi realizado o teste de Shapiro-Wilk a 5% de significância para verificar a
normalidade da distribuição de todos os dados (antes e após a intervenção) que estão apresentados
como a média ± DP ou em mediana e intervalo interquartil, de acordo com a distribuição. O teste t
pareado ou Wilcoxon U-Mann-Whitney foram utilizados, de acordo com a distribuição das variáveis,
para comparar variáveis antropométricas, clínicas, bioquímicas e moleculares antes e após a
intervenção com a polpa de açaí. Os valores discrepantes (outliers) foram excluídos para a
formulação dos gráficos. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa STATA
9.0. Foi considerado o nível de significância estatística de 5% de probabilidade.

39
5. RESULTADOS

5. 1 Análise das variáveis antropométricas, clínicas e bioquímicas

O presente estudo avaliou 42 voluntarias, com idade entre 18 e 32 anos (24; ± 3 anos) em
relação a variáveis antropométricas, clínicas, bioquímicas e marcadores do estado oxidativo antes e
após o consumo de polpa de açaí por quatro semanas. As variáveis altura, circunferência da cintura
(CC), circunferência abdominal (CA), porcentagem de gordura corporal (%GC), albumina,
triacilgliceróis, HDL-c, pressão arterial sistólica (PAS) e pressão arterial diastólica (PAD) seguiram
distribuição simétrica enquanto as outras variáveis não apresentaram distribuição paramétrica. Na
Tabela 2 está apresentada a análise comparativa das variáveis antropométricas, clínicas e
bioquímicas, antes e após o consumo do açaí. Verificamos que a media de CA após o consumo do
açaí diminuiu (84,88± 9,87cm vs 83,93±9,56cm) de maneira significativa (p=0,039).
As voluntárias, após o consumo do açaí apresentaram aumento na concentração da
apolipoproteina A-1 (200 ±37,9 mg/dL) vs (240,5 ±47,9 mg/dL; p< 0,019) enquanto a concentração
de apoliproteina B não apresentou diminuição em sua concentração após o consumo de açaí pelas
voluntárias. Não encontramos alterações significativas após a intervenção com o açaí em relação as
outras variáveis analisadas.
Na Tabela 3 podemos observar os dados de ingestão alimentar habitual e estilo de vida
coletados no inicio do estudo e ao final da intervenção. Baseado nessa avaliação o consumo de
carboidrato, proteínas, colesterol e ácidos graxos saturados assim como a ingestão calórica total e a
atividade física das voluntarias, não foram significativamente alterados ao final da intervenção.
Porém a quantidade de lipídes totais, incluindo ácidos graxos monoinsaturados (p=0,010), poli-
insaturados (p=0,021) e fibra álimentar (p=0,015) ingerida após o período de intervenção, estiveram
aumentados após o consumo de açaí.

40
 Tabela 2. Variáveis antropométricas, clínicas e bioquímicas das voluntárias estudadas, ao
início e ao final do período de intervenção.

INICIO FINAL
Média ou DP Média ou DP
VARIÁVEIS n Mediana ou Mediana ou P
IC IC
Antropométricas
Altura (m) 42 1,7 0,06 1,7 0,06 0,36
Peso (kg) 42 61,6 55,2-76,3 61,5 56,0 -76,5 0,07
CC (cm) 42 75,7 9,0 72,4 8,9 0,19
CA (cm) 42 84,9 9,9 83,9 9,6 0,04
CQ (cm) 42 98,3 93,8-108,9 100,0 96,2-109,1 0,65
GC (%) 42 31,7 5,2 32,1 5,0 0,05
Bioquímicas
Glicose (mg/dL) 42 78,5 75,0-84,3 78,5 75,0-84,3 0,98
Insulina (µIU/mL) 37 5,8 4,4-7,5 6,2 4,1-8,6 0,83
HOMA_IR 37 1,2 0,9-1,5 1,2 0,8-1,7 0,90
TG (mg/dL) 42 81,8 35,9 83,7 37,3 0,67
Colesterol
CT (mg/dL) 42 184,0 163,5-204,8 186,0 168,3-214,0 0,77
LDL-c (mg/dL) 42 102, 2 79,6-123,4 104,1 84,3-129,8 1,00
HDL-c (mg/dL) 42 65,2 13,5 66,2 14,2 0,40
Não HDL-c 42 124,0 33,0 125 39,0 0,79
Apolipoproteinas
A-1 (mg/dL) 16 200 37,9 240,5 47,9 0,019
B (mg/dL) 16 58,5 9,8 54,5 11,9 0,12
Clínicas
PAS (mmHg) 36 104,3 10,5 103,1 10,9 0,41
PAD (mmHg) 36 71,3 7,6 71,1 7,6 0,86
CA, circunferência abdominal; CC, circunferência da cintura; CQ, circunferência do quadril; CT, colesterol total; GC%,
porcentagem de gordura corporal por bioimpedanciatetrapolar; HDL-c, lipoproteína de alta densidade; HOMA-IR, índice
de homeostase de resistência a insulina; LDL-c, lipoproteína de baixa densidade; PAS, pressão arterial sistólica; PAD,
pressão arterialdiastólica; TG, triacilgliceróis.

41
Tabela 3. Ingestão alimentar habitual estimada por meio de questionário de freqüência alimentar e
atividade física, ao início e ao final do período de intervenção.

Nutrientes Antes Depois % Variação p

Lipídes totais (g) 67±23 82±39 +22.0±0,11 0.031

SFA 24±8 23±8 -3.7±0.27 0.86

MUFA 18±5 22±8 +21.3±2.44 0.010

PUFA 15±8 17±9 +15.2±1.27 0.021

Colesterol (mg) 271±109 250±91 -7.8±0.69 0.10

Proteina (g) 86 ±27 87 ± 29 +1.2±0.93 0.86

Carboidratos (mg) 457±302 478±301 +4.7±15.37 0.70

Fibra alimentar (g) 22±8 27±14 +23.1±3.03 0.015

Energia total (kcal) 2087±638 2225±956 +6.6±27.50 0.08

Atividade física (hs) 41±9 39±8 -1.2±0,98 0,47

MUFA, ácidos graxos monosaturados; PUFA, ácidos graxos poliinsaturados; SFA, ácidos graxos
saturados.

5.2 Efeito do consumo da polpa de açaí no estado oxidativo sérico.

Em relação aos marcadores do estado oxidativo, observamos que houve aumento na
capacidade antioxidante total (TAC) no soro das voluntárias após o consumo de açaí (443,6±
144,7µM vs 509,1± 121,7µM; p=0,031) (Gráfico 1). Os dados referentes ao perfil oxidativo dessas
voluntárias foram e publicados no periódico Nutrition (Anexo 14).

42
Gráfico 1 Efeito do consumo de açaí sobre a Capacidade Antioxidante Total no soro de mulheres saudáveis.
* Valor de p= 0,031, para teste t pareado na comparação dos valores no início e ao final do período de
intervenção.

43
 As voluntárias, após o consumo do açaí apresentaram aumento na atividade da enzima
Paraoxonase-atividade paraoxonase (PON), (120,3 [76,5-184,5 U/mL] vs (146,2 [79,3-225,5 U/mL];
p=0,0006) (Gráfico 2).

Gráfico 2 Efeito do consumo de polpa de açaí sobre a atividade da enzima Paraoxonase-Atividade

Paraoxonase no soro de mulheres saudáveis
* Valor de p=0,0006, para teste t pareado na comparação dos valores no início e ao final do período de
intervenção.

44
Encontramos também uma diminuição considerável (42%) nas concentrações séricas de LDLox (p
=0,0005) no soro das voluntárias após o consumo da polpa de açaí (Gráfico 3). A média das
concentrações de LDLox das voluntárias no inicio da intervenção foi de 226,0±85,5ng/mL e ao final
do estudo diminuiu para 131,1±79,6ng/mL.

Gráfico 3 Efeito do consumo de polpa de açaí sobre a concentração de LDL oxidada no soro de mulheres
saudáveis.
* Valor de p =0,0005, na comparação dos valores no início e ao final do período de intervenção.

45
Também foi observada diminuição nas concentrações séricas de Dialdeído Malônico
(p=0,00000009) no soro das voluntárias após o consumo da polpa de açaí (Gráfico 4). A média das
concentrações de MDA das voluntárias no inicio da intervenção foi de 6,8±1,9µM e ao final
diminuiu para 4,7±1,3µM, após o consumo da polpa de açaí.

Gráfico 4 Efeito do consumo de açaí sobre a concentração sérica de Dialdeído Malônico (µM) no soro de
mulheres saudáveis
* Valor de p= 0,00000009 (9,0 x 10-8), para teste t pareado na comparação dos valores no início e ao final do
período de intervenção.

46
5.4 Análise do perfil oxidativo em células mononucleares, antes e após a intervenção nutricional
com a polpa de açaí.
Como as enzimas SOD, CAT e GPx são enzimas envolvidas no sistema de defesa
antioxidante elas foram determinadas em células mononucleares, no início e ao final da intervenção
com o açai. Na tabela 4 podemos observar esses resultados. Não encontramos alterações
significativas na atividade destas enzimas nestas células após o consumo de açai.

Tabela 4 Efeito do consumo da polpa de açai sobre as atividades das enzimas SOD, CAT e GPX em
células monocleares de mulheres saudáveis.

INICIO FINAL

Variáveis n Média ou DP ou IC Média ou DP ou IC

Mediana Mediana P

SOD (U/mL) 30 0,029 0,029-0,030 0,029 0,028-0,030 0,59

CAT (U/L) 30 8,32 3,62 9,38 2,29 0,09
GPx (U/L) 20 59,60 40,70-87,88 47,00 34,40-53,14 0,09

CAT, catalase, GPx, glutationa peroxidase e SOD, superóxido dismutase.

47
5.5 Análise do perfil oxidativo em células polimorfonucleares, antes e após a intervenção
nutricional com a polpa de açaí.
A adição da polpa de açaí na dieta habitual das voluntárias não alterou a produção de ERO de
maneira significativa (Gráficos 5), porém aumentou em 199% a capacidade antioxidante total em
células polimorfonucleares (228,5±169,3 vs 453,7±251,1; p=0,00007) (Gráfico 6).
Em relação as enzimas SOD, CAT, GPX e óxido nítrico sintase (iNOs), observamos (Gráfico
7) aumento considerável na atividade da enzima catalase em células PMN (0,2±0,1U/L vs 8,1±2,2
U/L; p<0,001), porém não observamos alteração na atividade das outras enzimas envolvidas no status
antioxidante. A concentração de NO também não apresentou alteração após a intervenção

Gráfico 5 Efeito do consumo de açaí sobre a produção de espécies reativas de oxigênio por células
polimorfonucleares de mulheres saudáveis.

48
Gráfico 6 Efeito do consumo de açaí sobre a Capacidade Antioxidante Total em células polimorfonucleares
de mulheres saudáveis.
* Valor de p= 0,00007 (7,7x10-5), para teste t pareado na comparação dos valores no início e ao final
do período de intervenção.

49
Gráfico 7 Efeito do consumo de açaí sobre as enzimas (A) SOD, (B) CAT, (C) GPx e (D) iNOs em células
polimorfonucleares de mulheres saudáveis
* Valor de p=1,07 x 10-14, para teste t pareado na comparação dos valores no início e ao final do período de
intervenção.

50
5.6 Taxa de transferencia de colesterol livre, éster de colesterol, triglicérides e fosfolípides da
emulsão lipídica artificial (LDE) para a HDL das voluntárias antes e após a intervenção
nutricional com a polpa de açaí.
O consumo de açai modificou a abilidade da molécula de HDL em receber lipides de algumas
nanoemulsões após a intervenção nutricional. No Gráfico 8 observa-se os valores das taxas de
transferência de ester de colesterol, colesterol livre, triglicérides e fosfolipideos de LDE para HDL.
Encontramos diferença nas taxas de transferência do éster de colesterol (p=0,0043) e de
fosfolípides (p=0,0338). Não houve diferença nas taxas de transferência do colesterol livre (p=0,171)
e triglicérides (p=0,617). Os dados referentes ao perfil oxidativo dessas voluntárias foram submetidos
no periódico Clinical Nutrition (Anexo 15).

Gráfico 8 Taxa de transferência (%) do ester de colesterol (EC), colesterol livre (CL), fosfolipideos (FL) e
triglicérides (TG) da emulsão rica em colesterol LDE para HDL, antes e após o consumo de açaí.

51
6. DISCUSSÃO

Para esclarecer os possíveis efeitos dos alimentos na saúde, estudos de intervenção são
necessários, porém ainda são raros e escassos aqueles realizados em humanos. Algumas propriedades
de alegação funcional dos alimentos, incluindo os nativamente brasileiros, são divulgados
diariamente, porém para grande parte das alegações não há comprovação científica de sua segurança
e eficácia. No presente estudo propusemos-nos avaliar o efeito do consumo de 200g de polpa de açaí
por 4 semanas, sem alterar os hábitos de vida das voluntárias, e avaliar o estado oxidativo, o perfil
lipídico e o comportamento de lípides da HDL, após o período de intervenção nutricional.
Embora não tenham sido orientadas a forma de consumo do açaí (preparo, horário de consumo,
adição ou substituição de refeições), não houve diferença do peso corporal, ingestão alimentar total e
atividade fisica após as 4 semanas. Foi observado apenas uma ligeira diminuição na circunferência
abdominal, porém sem relevância clínica (0,3cm).
A composição química e fitoquímica do açai sugere um importante papel como alimento
funcional tanto pela prevenção de doença cardiovascular, quanto pela presença de polifenóis e
apresença de ácidos graxos insaturados, fitoesteróis e fibras alimentares (Schauss et al, 2006;.
Sanabria e Sangronis, 2007), pois esses compostos participam da modulação do colesterol através de
diversos mecanismos. O açaí é rico em flavonóides, composto presente em frutas, legumes, chá e no
vinho tinto. Evidências epidemiológicas têm mostrado que os flavonóides de diferentes fontes
exercem efeitos benéficos à saúde, tais como eefito hipolipidico, anti-aterosclerótico e
antiinflamatório (Dreosti, 2000; Rosso et al, 2008;. Pacheco-Palencia & Talcott, 2010). Os açai
possui vários componentes polifenólicos com propriedades antioxidantes, entre eles cianidina 3-O-
glicosídeo, a cianidina 3-O-rutinoside, homoorientin, orientin e isovitexina (Gallori, Bilia, Bergonzi,
Barbosa, & Vincieri, 2004). A presença destas substâncias está associada a propriedades
antioxidante, anti-inflamatória, anti-proliferativo e cardioprotetores. Uma revisão em 2011 mostrou
20 compostos químicos bioativos e várias atividades farmacológicas da espécie (Heinrich, et al.,
2011).
O açaí também é rico em fibras, 68,5% de suas fibras é do tipo insolúvel (Rufino et al., 2011). É
amplamente aceito que as fibras agem diretamente no lúmen intestinal, promovendo respostas
secundárias no fígado e na circulação periférica (Fernandez et al, 1997;.. Galisteo et al, 2008;. Roy et
al, 2012). No entanto, os mecanismos exatos para a redução dos níveis séricos e de colesterol pelas
fibras não são bem compreendidos. As fibras agem indiretamente na transcrição de genes envolvidos
no metabolismo do colesterol hepático através de sinais secundários gerados por metabólitos
produzidos no instestino durante a fermentação para produzir ácidos graxos de cadeia curta. (Young

52
et al, 2005;.. Rideout et al, 2008). As fibras causam uma redução da absorção intestinal do colesterol
vindo da dieta e a consequentemente aumenta a liberação do esterol através dos quilomícrons
(Adlercreutz, et al 1987; Fernandez, 2001). Além disso, as fibras têm sido mostradas como agentes
responsáveis pelo aumento da taxa de excreção biliar reduzindo, assim o colesterol total no soro e
bloqueando parcialmente a circulação entero-hepática e prevenção de reutilização de ácidos biliares
pelo fígado (Van Bennekum et al., 2005 Schatzkin et al., 2008). A produção de ácidos graxos de
cadeia curta, especificamente o propionato, inibe a síntese de colesterol (Amaral, et al., 1992)
Os fitoesteróis são esteróis de plantas que ocorrem de maneira natural e são estruturalmente
semelhantes ao colesterol. Dessa forma reduza absorção intestinal de colesterol, tal como compete
para a absorção intestinal e diminue a solubilidade do colesterol em micelas mistas e aumenta a
excreção fecal de ácidos biliares (Normen et al., 2000; Ostlund Jr., 2004;. Rozner et al, 2009).
O mecanismo proposto para explicar o efeito hipocolesterolémico de ácidos graxos insaturados
refere-se à capacidade destas lipídes em proporcionar um aumento na expressão e na atividade do
receptor LDL-R no fígado (Fernandez & West, 2005). Além disso, os ácidos graxos poli-insaturados
podem atuar como ativadores potentes da família do receptor nuclear, o receptores ativados por
proliferadores de peroxissomos (PPARs) (Kliewer et al., 1997).
De acordo com o estudo de Souza e colaboradores 2012 realizado em modelo animal, o grupo de
ratos que receberam dieta hipercolesterolêmica suplementados com polpa de açaí a 2% apresentaram
uma redução significativa no colesterol total sérico, diminuição de LDL e do índice aterogênico,
também foi observado aumento tanto da HDL como da excreção de fecal de colesterol em
comparação com o grupo hipercolesterolemico. Estes resultados sugerem que a polpa de açaí possui
um efeito hipocolesterolêmico que pode ser justificado pela presença de fibras e de outros compostos,
dessa forma foi sugerido como um possível mecanismo que a expressão aumentada de portadores
ABCG5 e ABCG8 que proporcionaria um efluxo de colesterol livre do fígado para a bílis. Por
conseguinte, com uma concentração de colesterol hepático menor aumentaria a expressão dos
receptores LDL-R e assim aumentaria a absorção hepática de LDL-colesterol.
A adição do açaí por quatro semanas aumentou a capacidade antioxidante total tanto no soro
(p=0,031) como em células polimorfonucleares (p<0,001) das voluntárias analisadas. Estudos in vitro
e in vivo já mostraram essa ação antioxidante do açaí (Del Pozo-Insfran et al., 2004; Schauss et al.,
2006). Mertens-Talcott et al. (2008) analisaram doze individuos e avaliaram a capacidade
antioxidante no plasma, a concentração sérica de antocianinas e ácido úrico e a geração de espécies
reativas por células mononucleares após o consumo da polpa de açaí, suco de açaí, suco de maçã e
uma bebida não antioxidante. Cada indivíduo consumiu 7 ml de açaí por kilo de peso e tiveram
amostras de sangue colhidas, após jejum e em intervalos de 30 minutos, 1, 2, 4, 6 e 12 horas após o

53
consumo. Os resultados mostraram que a concentração de antocianinas no soro dos indivíduos que
consumiram a polpa e o suco de açaí foram significativamente elevadas e observaram um aumento na
capacidade antioxidante total plasmática em três vezes, nos individuos que consumiram a polpa de
açaí. Porém até o presente momento nenhum outro estudo avaliou o efeito do açaí no estado
oxidativo a longo prazo.
Não foi observado alteração, após o consumo de açaí nas atividades das enzimas SOD, CAT e
GPx em células mononucleares, provavelmente devido as dosagens terem sido incapazes de serem
realizadas em células ativadas (macrófagos), enquanto em células polimorfonucleares foi observado
aumento apenas na concentração da enzima CAT (p<0,001). Esses resultados, referentes ao painel de
biomarcadores e outros parâmetros do estado oxidante, não pode ser facilmente comparado com
outros estudos realizados pois, esta é a primeira vez que tais parâmetros são investigados em
humanos após a ingestão da polpa de açaí. Guerra e colaboradores (2011) estudaram, em modelo
animal, dois grupos de ratos (controle e diabéticos) que receberam dieta suplementada com açaí e
observaram diminuição da produção de ERO por neutrófilos em ambos os grupos. Também
observaram aumento da glutationa hepática em ambos os grupos. Porém não foi observada alteração
na atividade de CAT. As concentrações de ácido tiobarbitúrico (TBARs), marcador para peroxidação
lipídica, e de proteína carbonilada, marcador de modificação proteica, foram diminuídas no grupo
diabético que recebeu suplementação com açaí. Esses resultados sugerem um efeito modulatório do
açaí na produção de ERO por neutrófilos e um efeito benéfico no sistema de defesa antioxidante no
modelo animal.
Em outros países, o açaí é reconhecido como uma berry (açaí berry) mas, corretamente, não
pertence a essa família botânica. Porém, vale a pena ressaltar as semelhanças entre composição de
polifenóis nesses frutos, o que nos permite comparar nossos resultados aos outros estudos realizados
em humanos com algumas berrys.
Duthie et al (2006) avaliaram 20 mulheres, entre 18 e 40 anos, 11voluntárias consumiram 750
ml de suco de cranberry por dia e 9 voluntárias consumiram o produto placebo, por apenas duas
semanas. Ao final da intervenção, observaram semelhança entre a capacidade antioxidante do
plasma, peroxidação lipídica e atividade das enzimas CAT, SOD e GPx em ambos os grupos.
Também não observaram diferenças no dano oxidativo no DNA. Esses resultados podem demonstrar
que a curto prazo a suplementação com uma bebida rica em polifenóis pode ser ineficaz para proteger
contra o estado redox de maneira efetiva.
No nosso estudo, após o consumo de açaí foi observado aumento nas concentrações de
apoliproteinas A-1 (p=0,019), principal proteína da fração HDL, da enzima PON (p<0,001) ao
mesmo tempo que houve uma diminuição na concentração da LDL-ox (p=0,001) e de MDA (p=9,0 x

54
10-8) o que sugere um efeito protetor para eventos ateroscleróticos. Outro estudo, de Xie e
colaboradores (2011), avaliou o efeito atero-protetor do açaí em ratos deficientes no gene da
apolipoproteina E, proteína envolvida na redistribuição do colesterol, encontraram aumento dos
níveis de HDL-c, menor área de lesão aórtica (58%), diminuição nas concentrações de marcadores de
peroxidação lipídica e aumento na atividade da enzima PON, resultado compatível com nosso estudo,
e também encontrou aumento, além da atividade, da expressão de enzimas antioxidantes, GPx e
glutationa redutase, evidenciando assim um efeito anti aterogênico do suco de açaí nesse modelo.

Estudo recente, estudou dois grupos de ratos com doença da doença hepática gordurosa não
alcoólica (DHGNA). E encontraram que a polpa de açaí impediu a oxidação de LDL e aumentou a
expressão de PON1 e ApoA-I no fígado e a atividade da no soro. Em ratos que receberam a polpa de
açaí por 6 semanas,o aumento da atividade de PON1 foi correlacionada com a redução da esteatose
hepática e danos no hepaticos. Dessa forma, os resultados sugeriram que o açaí ppode ser utilizado
para controlar danos hepáticos em animais (Pereira et al., 2016).
Nossos resultados sugerem um efeito modulatório do açaí sobre a oxidação de LDL com
possível efeito atero protetor em humanos saudáveis. A PON está associada a HDL-c e ela é a enzima
responsável por conferir seu papel antioxidante ao reduzir a acumulação de produtos de peroxidação
lipídica, por exemplo o MDA que também esteve diminuído após o consumo do açaí, e assim evitar a
oxidação de LDL e diminuir o processo aterogênico (Mackness et al., 1991; Aviran et al 1998;
Calabresi et al., 2004). Vários fatores afetam a função da HDL no transporte reverso do colesterol,
por exemplo o conteúdo de colesterol e fosfolípides, a atividade da enzima LCAT, a atividade das
proteínas de transferência de lípides entre outras. A habilidade de receber lípides é uma propriedade
fundamental da HDL. O colesterol existe no organismo em duas formas, a forma livre e a forma
esterificada. A forma livre do colesterol, localizada na superficie da partícula da lipoproteína, é mais
instável do que sua forma esterificada e pode dissociar-se das lipoproteínas e imergir no meio aquoso
plasmático. A forma éster do colesterol, situado no centro da lipoproteína, é mais estável e depende
da enzima CETP para deslocar-se de uma lipoproteína para outra (Garret e Grisham, 1995). As
moléculas de colesterol passam da superfície para o centro das partículas de lipoproteinas e a HDL
transforma-se em uma forma química mais apolar. Esse processo é catalisado pela enzima LCAT que
utiliza como co-fator a apo A-I. Desta maneira, o colesterol é seqüestrado para o “pool mais estável”,
evitando sua difusão para o meio plasmático de onde pode, facilmente, precipitar-se na parede
arterial e se acumular. A HDL tem um papel crucial no transporte reverso do colesterol, pois recebe
colesterol das células e de outras lipoproteínas, esterificando-o e transferindo-o para outras classes de
lipoproteínas (Sviridov; Nestel, 2002, De Grooth et al., 2004, Lewis; Rader, 2005).

55
 Não verificamos alterações no perfil lipídico clássico, como níveis séricos de colesterol,
triglicerídeos, LDL e HDL, porém podemos obsevar que ocorreu uma modificação a nível molecular
de parâmetros associados ao metabolismo de lípides, evidenciado inicialmente pelo aumento a apo
A-1, assim como aumento da concentração da enzima PON, diminuição da LDL-ox e por último pelo
aumento na transferência de éster de colesterol na fração HDL.
No presente estudo observamos um aumento significativo na transferência de éster de
colesterol (p=0,0043) após o consumo de açaí, o que pode ser considerado um efeito benéfico, uma
vez que o aumento do influxo do colesterol facilitaria a eliminação do colesterol pela bile, reduzindo
o acúmulo de colesterol nas artérias e assim prevenindo a evolução da doença cardiovascular.
Estudo prévio realizado por Strunz e colaboradores (2008) em humanos que ingeriram
castanha do Pará (em média 11 unidades) por 15 dias, foi observado aumento da taxa de transferência
do éster de colesterol ao final do estudo, dado semelhante ao nosso estudo, porém foi observada
alteração na concentração de apoliproteinas e na atividade da enzima PON. A castanha, assim como o
açaí é um alimento rico em ácidos graxos mono e poli-insaturados, porém, enquanto apresenta por
volta de 30% de MUFA e 21% de PUFA, o açaí possui 60 % de MUFA e menor quantidade de
PUFA, por volta de 13%. O mecanismo proposto para explicar o efeito hipocolesterolêmico de
ácidos graxos insaturados refere-se à capacidade destas gorduras em proporcionar um aumento na
expressão e na atividade de LDL-R no figado (Fernandez, 2005). Além disso, PUFA encontrados em
maior quantidade no açaí do que na castanha, podem atuar como ativadores potentes da família dos
receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (PPARs) que regulam genes envolvidos com
o metabolismo lipídico (Braissant, 1996; Kliewer et al., 1997).
O açaí também é rico em fibras e 68,5% é fibra alimentar insolúvel (Rufino et al., 2011). As
fibras alimentares são referidas como tendo efeitos benéficos hipocolesterolêmicos e na prevenção de
doenças cardiovasculares (História et al 1997;. Fernandez, 2001). Os mecanismos exatos para a
redução dos níveis séricos e de colesterol hepático por fibras que ocorrem naturalmente não são bem
compreendidos. Um estudo demonstrou, em modelos animais, que a inclusão das fibras na dieta
reduziu a ingestão de alimento em cerca de 15- 20% em relação ao grupo de controle, ao mesmo
tempo que o colesterol absorvido nos grupos de fibras também diminuiu em 15-20% em relação ao
valor do grupo de controle, para além de aumentar o de ácido biliar fecal e a excreção de colesterol
(Bennekum et al., 2005).
O fígado tem papel fundamental na homeostase do colesterol porque controla as vias de
biossíntese e remoção. As concentrações plasmáticas e intracelulares de colesterol são parcialmente
reguladas ao nivel da transcrição pela proteína de ligação ao elemento regulador de esterol 2
(SREBP-2) (Brown e Goldstein, 1997). De acordo com o estudo de Souza et al, 2012, com ratos, os

56
animais do grupo com dieta hipercolesterolêmica suplementado com polpa de açaí a 2%
apresentaram uma redução significativa nos níveis de colesterol total do soro, LDL, índice
aterogênico e também aumento de HDL e da excreção de colesterol pelas fezes em comparação com
o grupo hipercolesterolêmico. Além disso, a expressão do LDL-R, ABCG5, e os genes ABCG8, que
têm papel direto na excreção de colesterol através da bile, foi significativamente aumentado pela
presença de polpa de açaí. Estes resultados sugerem que a polpa de açaí promove um efeito
hipocolesterolêmico que pode ser justificado pela presença de fibras e outros compostos presentes na
de polpa de açaí como os ácidos graxos insaturados.
Ao nosso conhecimento, o estado oxidativo e parâmetros do perfil lipídico associado a
ingestão do açaí ainda foi pouco explorado, principalmente em humanos. Os estudos disponíveis na
literatura não foram realizados para avaliar tal efeito funcional da polpa de açaí. A este respeito,
Udani e colaboradores em 2011 realizaram um estudo piloto com dez indivíduos de ambos os sexos,
com sobrepeso e que consumiram, semelhante ao nosso protocolo, 200g de açaí por dia. Após um
mês de intervenção observaram diminuição nas concentrações de glicose, insulina e colesterol
séricos, porém os níveis de Proteina C Reativa e de óxido nítrico (NO) não mostraram alteração ao
final da intervenção. Dessa forma, nossos resultados divergem dos encontrados no estudo de Udani,
um dos poucos estudos que foram realizados com o açaí que avaliou o estado oxidativo em humanos,
pois não encontramos alteração no perfil lipídico e glicêmico. É importante notar que a amostra do
presente estudo é consideravelmente maior quando comparado com os outros estudos realizados e ao
selecionarmos apenas voluntárias do sexo feminino, possivelmente foi reduzida diferenças
bioquímicas e fisiologicas entre os sexos, explicando os diferentes resultados entre os estudos. Além
disso, as voluntárias foram orientadas em nosso estudo a não alterar qualquer hábito de vida
diferentemente do estudo supra citado que ofereceu uma lista de alimentos contendo nitratos que os
indivíduos participantes do estudo deveriam evitar, entre eles bacon e cachorro quente, fato esse que
poderia resultar numa diminuição da ingestão calórica total especialmente de gorduras e assim
diminuir as concentrações de colesterol e outras variáveis envolvidas no perfil glicêmico. No nosso
estudo não foi observada, ao final da intervenção, diferença significativa na ingestão dietética das
voluntárias, assim como não foi alterado o nível de atividade física delas. Dessa forma acreditamos
que o efeito encontrado nos perfis bioquímicos, do metabolismo redoxe na transferência de lípides
seja devido a adição da polpa de açaí na rotina diária alimentar das voluntarias participantes.
Uma das limitações em nosso estudo é em seu desenho que mesmo sendo do tipo de
intervenção não possui um grupo controle e tal fato limita nossa capacidade ocasional de inferência.
A ausência de um placebo também é um fator limitante no presente estudo. Além disso, não
controlamos o horário de ingestão e a forma de preparo das refeições com a polpa de açaí. As

57
voluntárias em nosso estudo, consumiram a polpa de açaí em sua rotina alimentar diária sem
qualquer outra alteração em seu dia a dia. Porém, nós não pode excluir completamente o viés
metodológico que pode ter ocorrido nos resultados encontrados, mesmo com entrevistadores
treinados e bem orientados. Queríamos que o estudo tivesse um impacto mínimo na vida das
mulheres por isso também oferecemos o açai como normalmente é consumido, e não na forma de
comprimidos ou suplementos.
Porém vale ressaltar , que o tamanho de nossa amostra é grande em relação aos outros estudos
em humanos, o período de intervenção de com o açai também foi superior e totalizou vários dados
em um único estudo e isso são pontos importantes do presente trabalho.
Dessa forma, o consumo observamos em nosso estudo que 200g de polpa de açaí, consumida
diarimanente, por mulheres saudáveis causou melhora significativa em parâmetros oxidativos e
também esteve associados com a prevenção, desenvolvimento e agravo de eventos cardiovasculares.

58
7. CONCLUSÕES

Nossos resultados demonstram que a adição da polpa de açaí na dieta pode estar envolvida na
proteção contra o estado oxidativo e também ter um efeito benéfico no metabolismo de lípides, uma
vez que foi observado aumento nas concentrações de Apo- A1, PON ao mesmo tempo diminuição de
LDLox e MDA. Podemos sugerir que o açaí tem efeito direto na remoção de espécies reativas,
através do aumento da capacidade antioxidante total, e indiretamente aumentando a atividade das
enzimas antioxidantes melhorando o perfil oxidativo. Em conjunto, estes resultados nos permitem
sugerir que o açaí pode apresentar efeito atero protetor em mulheres saudáveis.

59
8. PERSPECTIVAS

Futuros estudos são necessários para elucidar os mecanismos diretos e indiretos pelos quais o
açaí atua no metabolismo redox em humanos. Seria interessante para auxiliar nessa área, repetir o
estudo com outras populações, com uma amostra maior e com voluntários que apresentem alguma
alteração metabólica como pacientes hipercolesterolêmicos ou diabéticos para avaliar o efeito do açaí
nessas doenças.
Outro perpectivas seria realizar outro estudo similar com um grupo placebo para melhor
entendimento e eficácia do consumo da polpa de açaí sobre os resultados encontrados. Também é
necessário determinar a quantidade recomendada da ingestão saudável desse potente alimento. Em
conclusão, os nossos resultados mostram um efeito antioxidante de açaí na dieta de mulheres
saudáveis. Nossos resultados abrem um vasto caminho para uma melhor compreensão e uma
aplicação dietético mais adequado deste importante fruto brasileiro.

60
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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79
10. ANEXOS

Anexo 1
QUESTIONARIO

80
81
82
83
 Anexo 2
ESCLARECIMENTO SOBRE A PESQUISA DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO
SUJEITO DA PESQUISA
NOME: ____________________________________________ Nº: ______________
IDENTIDADE N°: _____________ÓRGÃO EXPEDIDOR:______ IDADE:_______
ENDEREÇO: ___________________________________________________________
BAIRRO: _______________ CIDADE: _____________TELEFONE: (__) __________
- DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA
Título do Estudo: Efeito do consumo da polpa de açaí sobre parâmetros metabólicos,
inflamatórios, estado oxidativo e composição corporal em mulheres jovens eutróficas e
com
excesso de peso
Local de Execução: Departamento de Nutrição Clínica e Social (DENCS) – Escola de
Nutrição
- Universidade Federal de Ouro Preto - UFOP.
Pesquisadores responsáveis:
Profª Ana Carolina Pinheiro Volp - DENCS - UFOP (Coordenadora)
Profª Renata Nascimento de Freitas DENCS – UFOP
Contatos:
Telefones de contato: (31) 8693 4551 (24 horas) / (31) 3559 1838 (horário comercial /
email: projetoacaiufop@yahoo.com.br
Comitê de Ética em Pesquisa da UFOP: (31) 3559 1368 / email: cep@propp.ufop.br
Duração do Estudo: 2 anos
Avaliação do Risco: Risco Mínimo

ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS

DO SUJEITO DA
PESQUISA:
1. Benefícios: Você poderá conhecer e receber orientações quanto ao estado nutricional,
antropometria e composição corporal, adequação do consumo alimentar e condições
gerais desaúde: pressão arterial, níveis de colesterol e glicemia. Poderá também, se
assim desejar,

84
receber aconselhamento/orientações nutricionais por graduando da Escola de Nutrição
sob orientação de nutricionistas. Quando for observada qualquer alteração clínica e, ou
bioquímica, serão encaminhados para avaliação médica a ser agendada no Centro de
Saúde da UFOP.
2. Riscos: O estudo não oferece riscos. Os equipamentos e materiais usados em todos os
procedimentos serão estéreis e,ou descartáveis. Você não será submetida a nenhum tipo
de
intervenção que possa causar danos à saúde, visto que todos os procedimentos adotados
são
inócuos e têm respaldado na literatura científica. Durante a coleta de sangue pode
ocorrer
pequeno desconforto ou pequeno hematoma que deve ser tratado com banho de gelo.
3. Privacidade e anonimato: Em nenhum momento desse estudo, as pessoas que
estarão
trabalhando com este material saberão que é seu, garantindo o sigilo de seus dados.
Nenhuma
outra pessoa ou instituição, que não aquelas envolvidas no presente projeto, terá acesso
aos
questionários ou dados individuais gerados por esta pesquisa. Os resultados deste
trabalho serão
publicados apenas em veículos de divulgação científica (revistas especializadas e
congressos)
garantindo-se o anonimato dos participantes. Sua participação ou não neste estudo não
influenciará de nenhuma forma no tipo e na qualidade do atendimento médico que você
está
recebendo ou poderá receber no futuro. Você poderá solicitar aos pesquisadores, a
qualquer
momento, o seu desligamento do estudo e a retirada dos seus dados.
4. Liberdade de não participar ou de retirar seu consentimento a qualquer momento
e de
deixar de participar do estudo, sem que isto traga qualquer prejuízo.

85
 Anexo 3
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu entendo que minha participação é voluntária e posso recusar-me a participar ou
posso
interromper minha participação em qualquer hora, sem penalização.
Minha participação neste estudo não implica em contrato de trabalho.
Fui comunicada da inocuidade de todos os procedimentos realizados neste estudo,
assim,
qualquer enfermidade que surja durante o estudo, deverá ser tratada por conta própria,
ou seja, o
estudo que participo não assume nenhum compromisso no tratamento da mesma. Nestes
casos,
deverei comunicar à equipe do projeto todas as informações referentes à enfermidade e
o seu
tratamento e não poderei mais participar do estudo
Eu não receberei qualquer compensação financeira para participar do estudo. Quando
for
observada qualquer alteração clínica e, ou bioquímica, serei encaminhado para
avaliação médica
a ser agendada no Centro de Saúde da UFOP
Se existir alguma intercorrência decorrente da pesquisa, poderei me comunicar com
os
pesquisadores por meio do telefone: (31) 8693 4551, em qualquer horário do dia ou da
noite.
Fui esclarecido em relação a todos os procedimentos que serão realizados neste
estudo. Minhas
dúvidas foram respondidas. Eu entendo que perguntas adicionais relacionadas ao estudo
devem
ser dirigidas aos investigadores listados acima. Eu entendo que, se tenho dúvidas sobre
direitos
dos voluntários, posso contatar o Comitê de Ética da UFOP. Eu concordo com os
termos acima
e acuso o recebimento de uma cópia deste consentimento.
Declaro que, após convenientemente esclarecida pelo pesquisador e ter entendido o que

86
me foi explicado, consinto em participar do protocolo da pesquisa acima especificado.
Ouro Preto, ______ de ________________ de 20____.
Voluntário – Nome completo: _______________________________________
Voluntário – Assinatura:____________________________________________
Testemunha – Nome completo: ______________________________________
Testemunha – Assinatura:___________________________________________
Testemunha – CPF/RG:____________________________________________
Pesquisador – Nome completo: ______________________________________
Pesquisador – Assinatura: __________________________________________

87
 Anexo 4
APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA

88
Anexo 5

89
 ANEXO 6
BULA HISTOPAQUE

90
 Anexo 7
CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL

91
 Anexo 8
BULA KIT LDL OXIDADA

92
93
94
 Anexo 9
SUPEROXIDO DISMUTASE

95
 Anexo 10
CATALASE

96
 Anexo 11
GLUTATIONA PEROXIDASE

97
 Anexo 12
ÓXIDO NÍTRICO SINTASE

98
 Anexo 13
ÓXIDO NITRICO

99
Anexo 14

100
Anexo 15

101