Diversidade e Ecologia Microbiana

Welington Luiz de Araújo

wlaraujo@usp.br
Engenharia Ambiental - 2018
 Diversidade microbiana
Diversidade Biológica

Conhecer, preservar e fazer uso sustentável

 Diversidade microbiana
A busca pelo conhecimento da diversidade biológica

Qual a Diversidade biológica em outros planetas?

E a do passado?
 Diversidade microbiana

• Diversidade ≠ riqueza de espécies

• Riqueza de espécies: o número de espécies em uma área
• Diversidade: a variedade e a abundância relativa de espécies
• Existem três tipos de diversidade: alfa (α), beta (β) e gama (γ).
• Diversidade α ou local é a diversidade dentro de um habitat ou comunidade
(é restrito)
• Diversidade γ, ou regional, é a diversidade de uma grande área, bioma,
continente, ilha, etc.
• Diversidade β é a diversidade entre habitats ou outra variação ambiental
qualquer, medindo o quanto a composição de espécies varia de um lugar
para outro.

• Diversidade: necessário identificar e conhecer os grupos biológicos e o

ambiente
Quem são os micro-organismos?
O conhecimento sobre a diversidade microbiana aumenta

• Novos filos
• Novas vias metabólicas
• Novos mecanismos de interação
 Isolamento de Micro-organismos
O isolamento de micro-organismos permite quantificar e identificar
membros de uma comunidade microbiana

O tipo de ambiente a ser avaliado interfere na estratégia para obter a

suspensão de células
❖ O solo deve ser agitada em solução tampão
❖ Para remoção da comunidade microbiana de superfícies, as
amostras devem ser agitadas em solução contendo bolinhas de
vidro.
❖ Compostos surfactantes (p.e. Tween 80) podem ser utilizados para
facilitar a dispersão

Diluições ou concentração de amostras podem ser necessárias.

❖ Para amostras de solo, diluições apropriadas são necessáias.
❖ Para amostras de água e ar, podem ser utilizados filtros para
concentrar as células das amostras
 Isolamento de Micro-organismos

Seletividade dos meios de cultivo permite avaliar grupos

microbianos específicos

O número de colônias deve estar entre 30 e 300 UFC.g de

amostra-1. ou permitir a observação de colônias isoladas
 Isolamento de Micro-organismos
Método de semeadura em Placa de Petri

Método da Método de espalhamento

Sobrecamada sobre o meio de cultura
Meio de cultura
sobre as células
 Isolamento de Micro-organismos
Método de semeadura em Placa de Petri

Método de espalhamento - sobre o meio de cultura

Método da Sobrecamada - Células no Meio de cultura

Isolamento de Micro-organismos
Método de enriquecimento

Estratégias de enriquecimento:
• Fontes de carbono
• Temperatura
• Resistência a fatores físico-químicos e etc
 Detecção de Micro-organismos
Método de coloração por DAPI ou Acridina Laranja (AO)
Estratégias:
• DAPI (diamidino-2-phenylindole) cora as células de azul fluorescente
• AO cora de laranja ou laranja esverdeado
• Fluorescência é observada sobre Luz U.V.
• Permitem a quantificação de micro-organismos ao microscópio de
fluorescência.
• São inespecíficos pois coram os ácidos nucleicos
• Não permite diferenciar células vivas de células mortas
DAPI Acridina Laranja
 Diversidade microbiana cultivável
a 66
b 100% 99% 97% 95%
66
a b c d 61
56
61
56
51 51
46

número de filotipos
46

número de filotipos
41 41
36 36
31 31
26 26
21 21
16 16
11 11
e f g h 6 6
1 1
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71

c 66
número de sequências
d 66
número de sequências

61 61
56 56
51 51

número de filotipos
46

número de filotipos
46
41 41
36 36
i j k l 31
26
31
26
21 21
16 16
11 11
6 6
1 1
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76
e 66
número de sequências
f número de sequências
66
61 61
m n o p 56 56
51 51

número de filotipos
46

número de filotipos
46
41 41
36 36
31 31
26 26
21 21
16 16
11 11
6 6
1 1
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66
número de sequências número de sequências

Riqueza de espécies é alta, mas o que observamos está

abaixo da realidade
 Culturabilidade

Meio de cultivo 1 Meio de cultivo 2

Amostra ambiental
 Culturabilidade

Inconsistência entre a Diversidade observada e a

isolada

Baixa culturabilidade microbiana

Seletividade dos meios de cultivo

Seletividade das condições de cultivo: CO2, O2, temperatura,

fonte de C, N, fatores de crescimento e etc.

Pequena representatividade da comunidade in vivo (coleções

de culturas) - identificação
Microbiologia do solo
 Métodos de avaliação da Diversidade

Comunidade Bacteriana de Soja

Espécies observadas por isolamento Espécies observadas por DGGE
Pseudomonas spp. Pseudomonas spp.
Erwinia sp. Erwinia sp.
Pantoea sp. Pantoea sp.
Enterobacter sp. Enterobacter sp.
Acinetobacter sp. Acinetobacter sp.
Agrobacterium sp. Agrobacterium sp.
Caulobacter/Asticcacaulis
Ralstonia picketti
Burkholderia sp.
Klebsiella spp.
Bradyrhizobium spp.
Herbaspirillum sp.
Xanthomonas sp.
Stenotrophomonas malthophilia

Kuklinsky-Sobral et al., 2004

Microbioma Humano
Métodos Independentes de Cultivo
Diversidade
Diversidade Microbiana – Correlação com fatores ambientais
 Diversidade Microbiana – Correlação com fatores ambientais
13TIRG02900
Rio Tietê
1.0

13BQGU03850
Total phosphorus B.O.D. 5,20
Total O.Carbon Amoniacal N
Conductivity 13TATU04850
13TAMT04900
Índice de Qulaidade
Sodium
de água:
Potassium Péssimo
14JUNA04900
13PINH04500 13TIPI04900
14TIPI04900 14TIRG02900
14TIET02450 Dissolved Fe
Ruim
14CPIV02700
14TIET02400 Turbidity Total Fe
Temperature Regular
14RGRA02990 13TIET04200
14BQGU03850 Total Al
14TIET02700 14SORO02100 14TAMT04900
14TIPR02990 14PARN02100
14TIET04200
Bom
14TIET02500 14TITR02100
14TIET02600
14ISOL02995 14PINH04500
14TITR02800
13TIET02400 Ótimo
14JCGU03900 13TIET02600 13CMDC02900
pH.
14PATO02900
14JPEP03600 14CMDC02900
13PARN02100
14LENS03950 Nitrate 14TATU04850 13TIBB02900
13Headwater 14SOURCE 13TIET02450
13JCGU03900 13PCAB02195 13JUNA04900
13TITR02100
14ESGT02050 13ISOL02995
13BATA2800 13CPIV02700
13TIET02700
13ESGT02050 13PATO02900
13RGRA02990
➢ A comunidade bacteriana responde à
13TIPR02990 13TITR02800 13TIET02500
13LENS03950
13JPEP03600 distribuição de nutrients, metais e
13SOIT02850
13SORO02100
oxigênio dissolvido
➢ Existe sobreposição de pontos,
D.Oxygen
sugerindo que ocorre uma transição
da diversidade microbiana entre
pontos.
-1.0

-1.0 1.0
Diversidade de bactérias associadas à planta de arroz

Edwards et al. (2015) PNAS. 112(8): E911–E92

Status no ambiente
 Tipos de interação micro-organismos no solo

Simbiose parasítica:
O microrganismo em determinada fase do seu ciclo de vida
parasita o hospedeiro, retirando nutrientes sem benefícios mútuos.

Simbiose mutualística:
O microrganismo em determinada fase do seu ciclo de vida
interage com o hospedeiro, obtendo nutrientes e melhorando o
desempenho do parceiro em determinadas condições.
 Importância dos micro-organismos no solo

• Os micro-organismos do solo afetam a estrutura (agregação) e

fertilidade do solo
• Contribui para a disponibilidade de nutrientes (degradação da
matéria orgânica, formação do húmus, fixação de N e germinação
de sementes
• Degrada pesticidas e produtos químicos do solo
• Contribui para o crescimento e produtividade das plantas
• Contribui com a estabilidade do solo por meio de diferentes
processos bioquímicos
• Reduz a incidência de patógenos no solo (solos supressivos).
Interações Microbianas
Interações microbianas
 Interação entre Rhyzopus microporus e uma Endobactéria

(A) Hypha showing bacteria migrating to the tip (scale bar represents 25 mm). (B) A single vegetative spore containing a rod-shaped
GFP-labeled endobacterium (scale bar represents 2 mm). (C and D) Sporangiophores, sporangia, and spores formed after restitution of
the symbiosis (white light and fluorescence mode, scale bar represents 30 mm).
Current Biology 17, 773–777, May 1, 2007 ª2007 Elsevier Ltd All rights reserved DOI 10.1016/j.cub.2007.03.039
 Interação entre Rhyzopus microporus e uma Endobactéria

Monitoring Microinjection of GFP-Labeled Endosymbionts into the Fungus and Migration within the Hyphae
Micrographs (A)–(E) are screen captures taken at 0.5 min intervals. Scale bar represents 10 mm. Red arrow indicates site of laser
injection; white arrows highlight GFP-labeled bacteria and direction of their migration.

Current Biology 17, 773–777, May 1, 2007 ª2007 Elsevier Ltd All rights reserved DOI 10.1016/j.cub.2007.03.039
 Interação entre Rhyzopus microporus e uma Endobactéria

Aparência típica da linhagem selvagem, contendo a A linhagem curada não forma esporângio.
endobactéria. A barra de escala representa 30 mm.

Current Biology 17, 773–777, May 1, 2007 ª2007 Elsevier Ltd All rights reserved DOI 10.1016/j.cub.2007.03.039
 Interação entre Aspergillus nidulans e Streptomyces hygroscopicus

(B) Scanning electron micrograph

of A. nidulans coincubated with S.
(A) Scanning electron
hygroscopicus. (Scale bar: 200
micrograph of A. nidulans.
μm.)
(C) Magnification of A.
(D) Magnification of B. (Scale bar:
nidulans (Scale bar: 20 μm.)
20 μm.)
(E) Further magnification of
(F) Further magnification of D
A. nidulans
showing the close contact
between the filamentous bacteria
and fungal mycelia.

Schroeckh V et al. PNAS 2009;106:14558-14563

Quantidade relative de mRNA do gene orsA (AN7909) da policetídeo e análise de HPLC do sobenadante
da cultura.

PKS orsA (AN7909) gene expression and HPLC profiles of supernatants. I: Control, A. nidulans. II: Cocultivation of A. nidulans and S. hygroscopicus
(1/20). III: A. nidulans culture, inoculation with filtered S. hygroscopicus culture supernatant. IV: Cocultivation of A. nidulans and S. hygroscopicus,
inoculation with 1/100 volume of S. hygroscopicus culture. V: Cocultivation of A. nidulans and S. hygroscopicus (1/100) separated by a dialysis
bag. VI: Cultivation of A. nidulans, inoculation with 1/20 volume culture supernatant of a coculture of A. nidulans WT and S. hygroscopicus. VII:
Cultivation of A. nidulans with 1/20 volume culture supernatant of a coculture of A. nidulans ΔorsA (ΔAN7909) strain and S. hygroscopicus.

Schroeckh V et al. PNAS 2009;106:14558-14563

Predação de bactéria por bactéria
Bdellovibrio bacteriovorus
 Predação de eucarioto por fungos

Principalmente pelo fungo Paecilomyces spp.

Alga sendo Formação de anel de constrição
predada por fungo
Fungo e insetos - controle biológico
Bacillus thuringiensis – controle de insetos
 Interação plantas micro-organismos

Hardoim et al., 2008

Durante esta interação, diferentes moléculas são produzidas

 Methylobacterium na planta hospedeira

- Utiliza metanol como fonte de

carbono e energia
- Capacidade de utilizar metanol
aumenta habilidade competitiva na
planta.
 Methylobacterium na planta hospedeira

Ação da enzima Pectin-methylesterase libera metanol durante a

degradação da pectina.
Metanol pode ser liberado pelas folhas via estômatos
Pectin-methylesterase também pode regular os níveis de etanol.
 Interação micro-organismos – plantas
Reconhecimento do hospedeiro

➢ Genótipo da planta e do
micro-organismo;
➢ Condições abióticas;
➢ Condições bióticas

Germinação

Estimulação Rizotropismo Colonização

Exsudados das raízes
estimulam o micro-
organismo

Presença do micro-
organismo no solo raiz haustório
Interação com organismos hospedeiros - plantas

Crescimento vegetativo

Adesão ao Germinação
hospedeiro
Formação de
apressório

conidiação

Penetração(h
austório)

Resposta de
Crescimento hipersensibilidade
invasivo
Interação com organismos hospedeiros - plantas

a b c

d e
Interação com organismos hospedeiros - plantas
 Interação com organismos hospedeiros - plantas

A B

C D

Andreote et al., (2006) Can. J. Microbiol. 52: 419-426.

Interação com organismos hospedeiros - plantas
 Papel dos micro-organismos nas plantas

Micro-organismos causadores de doenças em plantas

 Promoção de crescimento vegetal

+ - - +
 Resistência Sistêmica

Resistência de plantas à patógenos e insetos

 Resistência sistêmica

Resistência sistêmica induzida (ISR)

Resistência sistêmica adquirida (SAR)

 Resistência Sistêmica Adquirida - SAR
 desencadeada no hospedeiro por um organismo
patogênico
 planta produz e acumula ácido salicílico
 expressão de proteínas de resistência (PRs)
 ativação de morte celular e reação de
hipersensibilidade.

reação de
hipersensibilidade
necrose
 Resistência Sistêmica Induzida - ISR
 Induzida por organismo não patogênico -
Rizobactérias
 Independe do acúmulo de ácido salicílico.
 Desencadeada por alteração nos níveis de
etileno e ácido jasmônico.
Hora de descansar e… aula prática