UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI

CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU

BACHARELADO EM BIOQUÍMICA

Disciplina: Biotecnologia Vegetal

Docente: Marlucia Souza Padua Vilela

Relatório de aulas práticas: Avaliação de germinação de Leucena leucocephala.

Allan Kardec Moreira de Aguiar

Bruna Pereira Ramos
Eduardo Thomaz
Pâmela Salviano Coelho
Weslyn Nana Ama Asare

Divinópolis-MG
Junho, 2023
 1. RESUMO

A Leucena leucocephala (Lam), conhecida como "Leucena", é uma espécie de

crescimento rápido utilizada na recuperação de áreas degradadas, forragem, produção de
madeira e melhoramento do solo. Suas propriedades medicinais, associadas a compostos
como galactomananas e polissacarídeos sulfatados, também são exploradas na medicina
tradicional. A Leucena é adaptável a ambientes extremos e é propícia ao cultivo in vitro. Este
estudo teve como objetivo observar a germinação in vitro de sementes de Leucena
leucocephala (Lam) em meio de cultura WPM com diferentes concentrações de sacarose. Os
resultados apreciados que concentrações de 45 g/L de sacarose favoreceram a germinação,
resultaram em maior quantidade de sementes germinadas em comparação com 60 g/L. O
tratamento com 45 g/L de sacarose resultou em plantas com tamanho variado, maior número
de folíolos e comprimento de raiz maior. Contaminações por microrganismos foram
observadas, mas não afetaram significativamente o desenvolvimento das plantas. A presença
adequada de fonte de carboidratos, como a sacarose, foi considerada fundamental para a
germinação e crescimento das plantas in vitro. É importante ressaltar que este estudo teve um
período de avaliação curto, e estudos futuros podem complementar os resultados obtidos. A
Leucena leucocephala é uma espécie diversificada com aplicações em diversos setores, desde
a agricultura até a medicina tradicional. No cultivo in vitro, a concentração adequada de
sacarose influenciou a germinação e o desenvolvimento das plantas. As contaminações por
microrganismos não afetaram significativamente o crescimento. A fonte de carboidratos é
essencial para o sucesso do cultivo in vitro. Estudos futuros podem expandir esses resultados.

2. INTRODUÇÃO

A Leucena leucocephala (Lam) conhecida popularmente como “Leucena” possui

crescimento rápido, além de estar entre as espécies que possuem uma ótima fixação de
nitrogênio com características promissoras para recobrir uma área degradada (FRANCO e
FARIA, 1997; RESENDE e KONDO, 2001).
Natural da América Central e amplamente distribuída, a Leucena tem sido cultivada,
também, por causa de sua versatilidade funcional. Segundo a Embrapa (1983), na agricultura,
esta espécie é fortemente utilizada para forragem, produção de madeira, carvão vegetal e
melhoramento do solo, assim como na medicina tradicional, onde é utilizada para tratamento
facultativo em síndromes metabólicas como Diabetes, para doenças estomacais e como
anticoagulante (CHOWTIVANNAKUL et al., 2016; OLIVA et al., 2000). Segundo Almeida
et al. (2006), suas atividades medicinais estão associadas à presença de galactomananas,
polissacarídeos sulfatados e compostos de natureza fenólica.
Fatores como plasticidade e tolerância a ambientes extremos, tornam L. leucocephala
propícia para o cultivo in vitro (FONSECA; JACOBI, 2011). Segundo a União Internacional
para a Conservação da Natureza (2013), L. leucocephala é considerada uma espécie invasora
e se propaga por sementes, que apresentam dormência tegumentar (RIBEIRO et al. 2019). O
crescimento inicial é lento, mas, uma vez adaptado ao ambiente, brota e cresce vigorosamente
( VEIGA; SIMÃO NETO, 1992).
Segundo relatos da Embrapa (1983), a planta apresenta um sistema radicular
profundo, com poucas raízes laterais, que ocorrem em pequeno número, próximas à
superfície do solo e que portam nódulos fixadores de nitrogênio com 2,5 a 15 mm de
diâmetro e com formato frequentemente multilobado. Ela é resistente a solos secos e de baixa
fertilidade, além de se regenerar rapidamente após corte ou queima (MELO-SILVA et al.
2014).
Para cada fase do desenvolvimento vegetal in vitro, as formulações e dosagens de
nutrientes do meio de cultivo variam conforme a necessidade da espécie. O meio nutritivo
WPM (Woody Plant Medium) (LLOYD e MCCOWN, 1981), apresenta 25% das
concentrações dos íons nitrato e amônia do meio MS, além de mais potássio e um alto nível
de íons sulfato, sendo amplamente utilizado para a micropropagação de espécies lenhosas
(PASQUAL, 2001).
3. OBJETIVO

Este estudo teve como objetivo, observar e avaliar a germinação in vitro de sementes
de Leucena leucocephala (Lam) em meio WPM, acrescido de diferentes concentrações de
sacarose.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

Os discentes foram divididos em 4 grupos formados por 5 alunos para cada grupo. As
aulas práticas de Biotecnologia Vegetal ocorreram no Laboratório de Biotecnologia de
Microrganismos, sala 207 do Bloco E, do Campus Centro-Oeste Dona Lindu (CCO), da
Universidade Federal de São João del-Rei (UFSJ). Sementes de Leucaena leucocephala
(FABACEAE), coletadas em julho de 2016, foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de
Farmacobotânica e Plantas Medicinais (LAFAB) da UFSJ. As soluções estoque utilizadas
para a preparação dos meios nutritivos foram preparadas conforme protocolo do Laboratório
de Cultura de Tecidos de Plantas, do Departamento de Biologia da Universidade Federal de
Lavras (UFLA). Para a solidificação do meio, utilizou-se agar agar em pó bacteriológico puro
da marca Vetec e como fonte de carbono Sacarose P.A. da marca Neon.
 4.1 Preparo do meio de cultura
Para a realização do teste de germinação foram preparados 150 mL de meio de
cultura, a partir das soluções estoque previamente preparadas (Figura 1). Na Tabela 1, é
apresentado o volume utilizado de cada solução. Nesta etapa, adicionou-se água para ajuste
volume aproximado de 75 mL.

Tabela 1: Volume utilizado de cada solução para o preparo do meio.

Solução Volume (mL)

A 6,00

B 6,00

C 6,00

D 1,50

E 1,50

F 1,50

G 1,50

H 7,50

I 3,50

Para avaliar a necessidade de sacarose da Leucena, cada grupo utilizou uma

concentração diferente de sacarose no meio de cultura. As concentrações dos grupos 1, 2, 3 e
4 foram 0,0 g/L, 30,0 g/L, 45 g/L e 60 g/L, respectivamente. Abaixo está o cálculo da massa
de sacarose empregada pelo grupo 2:
30 g−1000 mL
x−150 mL
x=4 , 5 g
O pH do meio de cultura foi corrigido para 5,7 com o gotejamento de KCl e
incorporou-se 1,05 g de ágar, para então completar o volume final de 150 mL com água.
 Figura 1: Composição das soluções estoques para o preparo do meio de cultura. (Fonte: acervo pessoal)

O grupo 2 preparou 4 frascos de cultura com 15 mL do meio de cultura e 6 frascos

com 13 mL do meio. Essa diferença no volume de meio de cultura se deve a uma perda de
material que o grupo teve em um frasco quebrado. Os tubos foram, então, tampados e
identificados com a numeração do grupo e a concentração de sacarose, para poder ser
autoclavado a 120 ºC por 20 minutos e armazenados a 4 ºC até o dia da inoculação.

4.2 Inoculação das sementes

Decorridos 7 dias do preparo do meio de cultivo, foi realizada a inoculação das
sementes. Selecionou-se cerca de 30 sementes (Figura 2) para o teste de germinação. As
sementes foram transferidas para um béquer e higienizadas com álcool 70%, durante 30
segundos. Em seguida, as sementes foram desinfetadas com hipoclorito de sódio 1,5% por 20
minutos sob agitação manual constante com auxílio de uma pinça. Em seguida, procedeu-se a
uma tríplice lavagem em água destilada autoclavada por, aproximadamente, 5 minutos. Após
a retirada da água, foi feita a escarificação mecânica das sementes por meio de uma incisão
feita por bisturi na parte oposta ao embrião (Figura 3), com o objetivo de despertar a latência
das sementes. As sementes, então, foram inoculadas em frascos com meio de cultivo, de
modo que elas se encontrassem fixas no meio, porém sem estarem mergulhadas no ágar.
Após a inoculação, os frascos foram armazenados em estufa a 25 ºC.
Figura 2: Sementes selecionadas para o teste de germinação. (Fonte: acervo pessoal)

Figura 3: Escarificação da semente. (Fonte: acervo pessoal).

 Acompanhou-se o desenvolvimento das plantas durante 3 semanas, sendo feita uma
avaliação a cada 7 dias. Na primeira semana avaliou-se o estado de oxidação do meio,
presença de contaminações e estado germinativo. Na segunda semana, avaliou-se também a
presença de parte aérea e na terceira semana os parâmetros de avaliação foram: estado de
oxidação do meio, presença de contaminações, comprimento da plântula, número de folíolos
e comprimento da raiz principal. Cada grupo observou o desenvolvimento de todas as
plantas, não só aquelas inoculadas pelo grupo.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na semana 1 houveram poucas alterações nos experimentos. Observou-se que todas

as sementes que se desenvolveram já germinaram na primeira semana, principalmente nas
concentrações de 45 e 60 g/L de sacarose. Foi observado que os ensaios em que não
germinaram, também apresentaram maior grau de oxidação, já na primeira semana, na
concentração 0 g/L de sacarose, quase todos os tubos estavam oxidados. Possivelmente está
oxidação em maior âmbito neste experimento veio da ausência de concentração de sacarose
uma vez que a oxidação vem do lançamento de fenóis no meio onde promovem a oxidação e
inibem o crescimento celular da cultura in vitro. O cultivo in vitro é estressante para a planta,
sob estresse, ela começa a se proteger produzindo compostos fenólicos que são antioxidante
mas para produzir compostos fenólicos, ela precisa de carbono que neste estudo foi a
sacarose, no entanto ele também precisa crescer e para crescer ela também precisa de
esqueletos de carbono advindos de carboidratos. O metabolismo primário que consiste no
crescimento e desenvolvimento é a prioridade dela, diante disso produzir compostos do
metabolismo secundário por ser moléculas menores é mais fácil. Submetidas ao ambiente
estressante in-vitro , a planta investe mais no metabolismo secundário produzindo compostos
fenólicos para sobreviver que não consegue crescer.
A contaminação por microrganismos é considerada uma das mais importantes razões
pela baixa produtividade em cultura de tecidos de plantas (OYEBANJI et al., 2009),
considerando que estes agentes competem de forma ativa por água e nutrientes disponíveis no
meio de cultura, causando déficits como aumento da mortalidade e variação na taxa de
crescimento das culturas, aparecimento de tecidos necrosados, e redução na proliferação de
brotações e raízes (PEREIRA et al., 2003). Ocorreram poucas contaminações e estas não
afetaram o desenvolvimento da plântula, onde em literatura pôde-se encontrar que em até
10% não ocorre interferência.
 Na semana 2, pode-se observar, em alguns tratamentos, a parte aérea em diferentes
estágios de desenvolvimento. As maiores concentrações continuaram com o maiores índices
de crescimento, embora a concentração de 45g/L apresentasse resultados mais promissores
que na concentração de 60g/L. Neste estágio do experimento, pode-se observar que
contaminações não afetaram o desenvolvimento das plantas, pois houveram frascos que,
mesmo com contaminação, as sementes germinaram sem atraso no crescimento, comparado a
outros frascos que se desenvolveram sem contaminação. Nos ensaios de 45 g/L foram
observados 7 frascos com parte aérea desenvolvida, sendo 4 com crescimento avançado,
enquanto a concentração de 60 g/L apresentou 5 frascos com parte aérea, com apenas 2 em
desenvolvimento mais avançado. A semente germinada na concentração de 0 g/L não se
desenvolveu mais e adotou-se a germinação como 0, o mesmo foi observado foi na
concentração de 30 g/L. Os dados completos referentes às avaliações das semanas 1 e 1 estão
descritos na Tabela 2.

Tabela 2: Avaliação de diferentes parâmetros na semana 1 e na semana 2.

SEMANA 1

Fatores 00g/L de Sacarose 30g/L de Sacarose 45g/L de Sacarose 60g/L de Sacarose

Oxidação 5 muito oxidadas 1 muito oxidada 5 1 muito oxidada e 1 muito oxidada e

e 3 pouco pouco oxidadas 2 pouco oxidadas 2 pouco oxidadas
oxidadas.

Contaminação 1 0 1 2

Germinação 1 0 6 4

SEMANA 2

Fatores 00g/L de Sacarose 30g de Sacarose 45g de Sacarose 60g de Sacarose

Oxidação 6 muito oxidadas 4 pouco oxidadas 3 muito oxidadas 2 muito oxidadas

e 4 pouco e 1 muita oxidada e 1 pouco oxidada
oxidadas

Contaminação 1 02 2

Germinação 0 01 0

Parte aérea 0 07 5

Na 3º semana coletou-se dados quantitativos, como altura da plântula, comprimento

da raiz e número de folíolos, por isso os frascos foram avaliados individualmente (tabela 3).
Não estão listados as avaliações dos ensaios de 0 e 30g/L de sacarose por que não houve
diferenças significativas entre as semanas 2 e 3 nestes experimentos, foi notado apenas um
aumento na oxidação do meio de cultivo, não houve nenhuma germinação portanto não há
dados referentes ao crescimento.

Tabela 3: Avaliação de diversos parâmetros na terceira semana nos ensaios de 45g/L e 60g/L

45 g/L de Sacarose

Amostra Oxidação Contaminação Altura da Comprimento N° de folíolos

planta (cm) da raiz (cm)

1 não não 9,5 13 14

2 não não 8,5 12 12

3 não não 7,5 6 12

4 não não 9 13 14

5 não não 13 16 12

6 não não 6,5 5 14

7 não sim 14 6 14

8 sim não 1 0 0

9 sim sim 0 0 0

10 sim não 0 0 0

60 g/L de Sacarose

Amostra Oxidação Contaminação Altura da Comprimento N° de folíolos

planta da raiz

1 não não 11 8 14

2 não não 11 8 4

3 não não 11 9 3

4 não não 7 9 14

5 sim sim 0 0 0

6 sim sim 0 0 0
 7 pouco não 0 0 0

8 não não 0 0 0

9 não não 0 0 0

10 não não 0 0 0

6. Conclusão
Estratégias simples, rápidas, eficazes e de baixo custo para a superação da dormência
tegumentar de sementes são o ponto de partida para o estabelecimento da germinação in vitro
bem sucedida. Os dados obtidos neste estudo, também, revelam que doses apropriadas da
fonte de carbono (sacarose) utilizada, são imprescindíveis para o correto crescimento e
desenvolvimento in vitro das plântulas de Leucaena leucocephala.
Com base nos dados apresentados, a concentração de 45 g/L de sacarose favorece a
germinação das sementes de Leucena leucocephala, resultando em uma maior quantidade de
sementes germinadas em comparação com a concentração de 60 g/L. Além disso, as
sementes cultivadas no tratamento com 45 g/L de sacarose também apresentaram variações
de tamanho das plantas, maior número de folíolos e um comprimento de raiz maior em
relação ao tratamento com 60g/L.
Os resultados também revelaram que os tratamentos com baixa concentração de
sacarose, ou mesmo sem sacarose, não resultaram em germinação das sementes, indicando
que uma fonte de carboidratos para a germinação é fundamental.
Portanto, ao realizar o cultivo de sementes de Leucena leucocephala em meio de
cultivo, é essencial garantir a presença adequada de uma fonte de carboidratos, como a
sacarose, para promover uma melhor germinação e crescimento dos órgãos e tecidos vegetais
das plantas.

Por fim, temos que levar em consideração que as plantas foram avaliadas em um
período de tempo curto, e talvez seja necessário realizar estudos futuros, que possam
complementar os resultados desse estudo.

7. Referência Bibliográfica

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6. Anexos.
1 Semana
Grupo 1
Grupo 2

Grupo 3
Grupo 4
2 Semana
3 Semana