UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

FACULDADE DE FARMÁCIA

ERON LINCOLN ALVES PEREIRA

Nanopartículas híbridas lipídico-poliméricas contendo

coenzima-Q10 para potencial atividade anticâncer

NATAL
2022
 Eron Lincoln Alves Pereira

Nanopartículas híbridas lipídico-poliméricas contendo Coenzima-

Q10 para potencial atividade anticâncer

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso

de Graduação em Farmácia da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do
título de Bacharel em Farmácia.

Orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antonio da Silva Júnior

Coorientadora: Msc. Thayse Silva Medeiros

Natal - RN
2022
Nanopartículas híbridas lipídico-poliméricas contendo Coenzima-Q10 para
potencial atividade anticâncer

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

ao Curso de Graduação em Farmácia da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como requisito para obtenção do título de
Bacharel em Farmácia.

Orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antonio da Silva

Júnior
Coorientadora: Msc. Thayse Silva Medeiros

_________________________________________________________
Presidente: Prof. Dr. Arnóbio Antonio da Silva Júnior – Orientador, UFRN

_________________________________________________________
Membro: Profa. Dra. Alianda Maira Cornélio da Silva - UFRN

_________________________________________________________
Membro: Msc. Mariana Farias Alves da Silva - UFRN

Natal - RN, 27 de janeiro de 2022

 AGRADECIMENTOS

A Deus pela sua infinita bondade.

A meus pais, Bernadete e Francivan, por todo amor, esforço e dedicação para me
manter estudando em Natal.
À minha irmã, Denise, pelo apoio.
À minha noiva, Letícia, por todo o amor, carinho, incentivo e por sempre acreditar em
mim, não deixando desanimar.
À minha sogra, Dilma (in memoriam), meus cunhados Kaio, Kalebe e Kennedy, pelo
acolhimento e pelas risadas.
A meu amigo Eduardo, com quem dividi morada durante toda a graduação.
A todos os amigos que a graduação me proporcionou.
Ao meu grande amigo Weslley, com quem compartilho o mesmo caminho há 19
anos.
Ao professor Arnóbio, pela oportunidade e por todo o aprendizado que foi
proporcionado com os Journals.
A todos da família TECBIOFAR, em especial Mari e Dani e mais em especial ainda,
Thayse, que foram meus alicerces durante a iniciação científica, sem vocês eu não
teria conseguido.
À minha família e a todos que
acreditam em mim.
 RESUMO

O câncer é uma doença de alta incidência e prevalência em todo o planeta e seu

tratamento é bastante problemático pelo alto grau de toxicidade dos fármacos
utilizados, dificuldade no direcionamento e limitações relacionadas a mecanismos
evasivos dos tumores. A Coenzima Q-10 é uma molécula antioxidante endógena,
altamente lipofílica e amplamente estudada para diversas aplicações, entre elas, seu
potencial efeito anticâncer. A nanotecnologia é empregada como artifício para
minimizar esses problemas e poder promover um tratamento mais seguro, eficaz e
humanizado aos pacientes. Dentro da nanotecnologia, as nanopartículas híbridas
lipídico-poliméricas são sistemas novos, que unem a versatilidade dos polímeros com
a biocompatibilidade dos lipídios, produzindo sistemas que trazem o melhor dos dois
estruturantes. Foi objetivado obter e caracterizar NPH de PLGA e colesterol
carregadas com a CoQ10. Neste trabalho foi feita a incorporação de Coenzima Q-10
em nanopartículas híbridas lipídico-poliméricas de colesterol/PLGA, estabilizadas com
Span 80® e Tween 80®, pelo método de nanoprecipitação. A caracterização dessas
nanopartículas foi feita quanto ao diâmetro, índice de polidispersão (IP), potencial zeta
(PZ) e pH, e os mesmos parâmetros foram utilizados para mensurar a estabilidade do
sistema por até 45 dias. A eficiência de encapsulação da Coenzima Q-10 foi
mensurada por método indireto, por filtros VIVASPIN® com cut-off de 10 KDa, e foi
realizado teste de hemólise para avaliar compatibilidade do sistema com os eritrócitos.
Foram obtidas nanopartículas com tamanho entre 100-200 nm, com baixo IP (em torno
de 0,1), o PZ evidenciou que as nanopartículas produzidas são aniônicas com carga
superficial em torno de 18 mV, com eficiência de encapsulação superior a 90% e foi
observado elevado grau de hemólise como resultado preliminar. Os sistemas foram
obtidos e caracterizados com sucesso, permitindo o avanço no estudo, buscando
melhorias e novos testes.

Palavras-chave: Câncer, Nanopartículas híbridas, Coenzima Q-10.

 ABSTRACT

Cancer is a disease of high incidence and prevalence all over the planet and its
treatment is quite problematic due to the high toxicity degree of the drugs used,
difficulty in targeting and limitations related to evasive mechanisms of tumors.
Coenzyme Q-10 is an endogenous antioxidant molecule, highly lipophilic and widely
studied for several applications, including its potential anticancer effect.
Nanotechnology is used as a device to minimize these problems and be able to
promote safer, more effective and humanized treatment for patients. Within
nanotechnology, hybrid lipid-polymeric nanoparticles are new systems that combine
the versatility of polymers with the biocompatibility of lipids, producing systems that
bring out the best of both structuring agents. It was aimed to obtain and characterize
NPH of PLGA and cholesterol loaded with CoQ10. In this work, was caried out the
incorporation of Coenzyme Q-10 into lipid-polymeric cholesterol/PLGA hybrid
nanoparticles, stabilized with Span 80® and Tween 80®, by the nanoprecipitation
method. The characterization of these nanoparticles was evaluated in terms of
diameter, polydispersity index (PdI) zeta potential (PZ) and pH, and the same
parameters were used to measure the system stability during 45 days. The of
Coenzyme Q-10 encapsulation efficiency was measured by an indirect method, by
VIVASPIN® filters with 10 KDa cut-off, and a hemolysis test was performed to assess
the system's compatibility with erythrocytes. Nanoparticles were obtained with a size
between 100-200 nm, with low PdI (around 0.1), the PZ showed that the nanoparticles
produced are anionic with a surface charge around 18 mV, with encapsulation
efficiency above 90% and a high degree of hemolysis was observed as a preliminary
result. The systems were successfully obtained and characterized, allowing progress
in the study, seeking improvements and new tests.

Keywords: Cancer, Hybrid Nanoparticles, Coenzyme Q-10.

 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura química da CoQ10……………………………………………..........15

Figura 2: Estrutura química do PLGA………………………………..…………………..17
Figura 3: Estrutura química do colesterol……………………………………………..…18
Figura 4: Sistemas de NPH carregados com CoQ10 ………………………………..…25
Figura 5: Eficiência de incorporação de CoQ10……………………………………...…27
Figura 6: Gráfico de estabilidade NPH_Branca………………………………………....28
Figura 7: Gráfico de estabilidade PH 2,5%.................................................................29
Figura 8: Gráfico de estabilidade NPH 5%.................................................................29
Figura 9: Gráfico de estabilidade NPH 10%...............................................................30
Figura 10: Gráfico do ensaio hemolítico………………………………………………....31
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Quantidades de cada componente das formulações de NPH…………….21

Tabela 2: Massa de todos os componentes na formulação final……………………..21
Tabela 3: Caracterização das NPH………………………………………………………26
Tabela 4: Eficiência de incorporação da CoQ10 nas NPH……………………………27
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

EPR Enhanced Permeability and Retention

(Permeabilidade e Retenção Aumentadas)
CoQ10 Coenzima Q-10
CTE Cadeia Transportadora de Elétrons
BSA Albumina Sérica Bovina
FA Fase Aquosa
FO Fase Orgânica
IARC International Agency for Research on Cancer
(Agência Internacional para Pesquisa em Câncer)
MMP-2 Metaloproteinase de Matriz tipo 2
NPH_Branca Nanopartícula Híbrida sem Coenzima Q-10
NPH_2,5% Nanopartícula Híbrida com 2,5% de Coenzima Q-10
NPH_5% Nanopartícula Híbrida com 5% de Coenzima Q-10
NPH_10% Nanopartícula Híbrida com 10% de Coenzima Q-10
 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 11
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 13
2.1 Câncer 13
2.2 Coenzima Q-10 14
2.3 Nanopartículas híbridas lipídico-poliméricas (NPH) 16
2.4 Nanoprecipitação 18
3 OBJETIVOS 19
3.1 Objetivo geral 19
3.2 Objetivos específicos 19
4 MATERIAIS E MÉTODOS 20
4.1 Materiais 20
4.2 Métodos 20
4.2.1 Obtenção das nanopartículas 20
4.2.2 Eficiência de incorporação (EI) 21
𝐸𝐼% = 𝐶𝑜𝑄10 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝐶𝑜𝑄10 𝑑𝑒𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎 𝑛𝑜 𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜𝐶𝑜𝑄10 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑥100 22
4.2.3 Diâmetro das partículas e Índice de polidispersão (IP) 22
4.2.4 Potencial Zeta (PZ) 22
4.2.5 Potencial hidrogeniônico (pH) 23
4.2.6 Estudo de estabilidade físico-química 23
4.2.7 Atividade Hemolítica 23
4.2.8 Análise Estatística 24
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 25
5.1 Obtenção e caracterização das NPH 25
5.2 Eficiência de Incorporação (EI) 26
5.3 Estabilidade físico-química 28
5.4 Atividade hemolítica 30
6 CONCLUSÕES 32
7 REFERÊNCIAS 33
 11

1 INTRODUÇÃO

O câncer é o nome dado a mais de 100 tipos distintos de doenças (INCA 2020)
que se caracteriza pelo crescimento desordenado de células mediado por mutações
genéticas específicas. Tais mutações podem ser associadas a fatores intrínsecos ao
indivíduo, como a predisposição genética, fatores ambientais e maus hábitos de vida
(HAUSMAN, 2019; BASHYAM et al., 2019). É uma doença que possui altas taxas de
incidência, prevalência e mortalidade, e que demanda muitos recursos para
tratamento e prevenção (World Health Organization, 2021).
Atualmente, o tratamento anticâncer se baseia em cirurgia, imunoterapia,
radioterapia, quimioterapia e terapia hormonal (VASSAN, et al. 2019). A quimioterapia
anticâncer tem sido muito estudada, no que se refere a redução dos inconvenientes
decorrentes do tratamento. Tais efeitos acontecem pela falta de seletividade dos
agentes quimioterápicos, que acabam por afetar também, células saudáveis. Outro
fator que influencia diretamente a toxicidade dos tratamentos é o não direcionamento
para o tecido tumoral, permitindo que o fármaco se distribua para todos os tecidos e
possa se ligar livremente às células normais (WICKI, 2015). Nesse cenário se faz
necessária a busca por moléculas alternativas e sistemas de liberação que promovam
drug targeting eficaz.
Muitas moléculas, oriundas de diversas fontes são estudadas como adjuvantes
no tratamento do câncer, como por exemplo o fitol (KIM, et al. 2015), que tem origem
vegetal e a Coenzima Q-10 (CoQ10) que é uma molécula endógena estruturalmente
similar à vitamina K, com alto poder antioxidante. A CoQ10 vem sendo estudada pelo
seu potencial no tratamento de várias doenças, incluindo o câncer. Estudos apontam
que baixos níveis de coenzima Q-10 são correlacionados com piores prognósticos em
pacientes com câncer, e que a suplementação desse micronutriente tem efeito
benéfico na cardiotoxicidade em pacientes tratados com antraciclinas, além de ação
anticâncer por mediar aumento da atividade do sistema imune e atividade antioxidante
(GARRIDO-MARAVER, 2014). Porém essa promissora molécula possui
desvantagens quanto a sua absorção oral e direcionamento para sítios alvos
(BAGHAVAN e CHOPRA, 2006), e a nanotecnologia é uma alternativa promissora
para contornar tais desvantagens.
As nanopartículas podem modificar a absorção de moléculas por via oral, além
de possibilitar p direcionamento passivo para o tecido tumoral, pois apresentam
 12

tamanho na escala nanométrica e conseguem passar pelas fenestrações dos

capilares tumorais, assim como aumentar a concentração do fármaco dentro da célula
tumoral, por meio do efeito de permeação e retenção aumentadas (EPR) (DANHIER,
2016). Além disso, nanopartículas promovem uma liberação modificada, o que permite
atingir o sucesso terapêutico com uma dosagem menor de fármaco, algo que contribui
ainda mais para a diminuição da toxicidade do tratamento (SINGH, et al. 2017).
Dentro na nanotecnologia, o uso de nanopartículas híbridas (NPH) tem sido
apontado como promissor para o tratamento de câncer. Essa classe de
nanocarreadores é caracterizada por uma matriz composta por duas classes
diferentes de estruturantes, a fim de conferir ao sistema benefícios de ambos, e neste
caso, o tipo de NPH utilizado foi a lipídico-polimérica, que pertence à terceira geração
de nanopartículas e combina um lipídio e um polímero para compor sua estrutura
(MUKHERJEE, et al 2019).
 13

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 Câncer

O câncer assola a população mundial, e possui números alarmantes. De

acordo com a International Agency for Research on Cancer (IARC), em 2020, houve
incidência de 19,3 milhões de casos de câncer ao redor do mundo, com uma
mortalidade de 9,9 milhões de pessoas, sendo o sexo masculino mais suscetível a
essa doença. Segundo a IARC, projeta-se um crescimento linear, tanto na incidência
quanto na mortalidade, culminando em 30,3 milhões de novos casos e 16,3 milhões
de mortes em 2040. Os tipos de cânceres mais relevantes no cenário mundial são
mama, pulmão, colorretal, próstata e estômago, cada um apresentando incidência
superior a um milhão de casos em 2020. O câncer colorretal é tido como um marcador
socioeconômico, já que é observado que em países emergentes, à medida que o IDH
aumenta, aumentam também os casos desse tipo de câncer (BRAY, et al. 2014).
Neoplasias ocorrem quando o DNA de uma célula sofre uma mutação, e a partir
dessa mutação, entra em um estado de divisão desenfreada, tornando-se irresponsiva
a sinais moleculares de parada. Essas mutações podem ocorrer principalmente em
quatro tipos de genes, proto-oncogenes, genes supressores tumorais, genes
relacionados a apoptose e genes de reparo de DNA e acontecem tanto por
predisposição genética, quanto por influência do ambiente e estilo de vida do
indivíduo. Alguns fatores de risco não relacionados à predisposição genética são
tabagismo, alcoolismo, exposição à radiação ou outras substâncias cancerígenas
(BASHYAM, et al. 2019). Quando essas mutações ocorrem, a célula se divide
indefinidamente e a massa tumoral pode tomar três destinos diferentes. Quando ficam
limitadas a um único local, sem infiltração nos tecidos adjacentes o tumor é chamado
de benigno, quando ocorre infiltração e invasão de tecidos, o tumor é classificado
como maligno, e se houver disseminação via sangue ou sistema linfático, são
originadas as metástases, ou tumores secundários (HEIKEN, 2007).
Para que ocorra metástase, as células tumorais precisam vencer os tecidos em
que estão localizadas para chegarem às vias circulatórias e assim poderem atingir
outros sítios. O principal mecanismo utilizado é por meio das metaloproteinases de
matriz, principalmente a do tipo 2 (MMP-2), que são enzimas proteolíticas zinco-
dependentes, que têm como função degradar a matriz extracelular abrindo caminho
 14

para a infiltração de células malignizadas, facilitando sua disseminação (GOBIN, et al.

2019; WANG, et al. 2014). Além disso são marcadores de crescimento, metástase e
angiogênese em tumores sólidos (TAFAZOLI, 2017).
Células tumorais apresentam características únicas, conferidas a elas pelos
genes mutados, tais como sinalização autócrina de crescimento, evasão a
mecanismos de supressão, imortalidade replicativa, indução de angiogênese e
resistência à apoptose (HAUSMAN, 2019). Além disso, a célula tumoral apresenta
uma alta taxa de glicólise, o que faz com que o pH do microambiente tumoral caia,
devido à alta produção de subprodutos ácidos (COLEY, 2011). Todas essas
características fazem com que o tratamento anticâncer seja mais desafiador, e
reforçam a necessidade de alternativas terapêuticas mais eficientes.
Atualmente, os fármacos mais utilizados na quimioterapia são pertencentes às
classes das antraciclinas, dos taxanos, dos derivados da cisplatina, dos alcalóides da
vinca, das epipodofilotoxinas, das antraquinonas e dos inibidores tirosina quinase
(HOUSMAN, et al 2014).. Esses fármacos enfrentam fortes mecanismos de evasão
por parte dos tumores, além de não apresentarem seletividade para célula tumoral, o
que acaba por causar um alto grau de toxicidade e imunogenicidade em outros tecidos
(AL-MAHAYRI, PATRINOS e ALI, 2020). Um exemplo é a Doxorrubicina (da classe
das antraciclinas) que tem seu uso correlacionado a episódios de cardiotoxicidade.
Dito isso, se reforça a necessidade da busca por tratamentos com fármacos
mais seguros, que possam diminuir a ocorrência de metástases e por alternativas que
diminuam efeitos adversos dos tratamentos disponíveis.

2.2 Coenzima Q-10

A CoQ10 (Figura 1) é uma molécula endógena, encontrada em todas as células

do corpo humano, que desempenha importante papel na via de biossíntese de energia
na mitocôndria, atuando na cadeia transportadora de elétrons (CTE), durante a
respiração celular aeróbica (CRANE, 2001). É um micronutriente estruturalmente
semelhante à vitamina K, e a longa cadeia carbônica que possui várias insaturações,
confere uma grande atividade antioxidante à molécula, além de torná-la altamente
lipofílica, o que acaba por dificultar sua absorção oral, um fator limitante para seu uso.
 15

Figura 1: Estrutura química da CoQ10

Autoria própria

Estudos demonstram o efeito benéfico da CoQ10 no tratamento do câncer, e

atribuem esse efeito a um aumento da atividade do sistema imunológico e à atividade
antioxidante. A atividade anticâncer da CoQ10 se baseia no efeito antioxidante sobre
o peróxido de hidrogênio, que tem papel fundamental na ativação da MMP-2
(TAFAZOLI, 2017; ALIMOHAMMADI, et al. 2021; BAHAR, et al. 2010).
Foi relatado também que a CoQ10 está associada à diminuição de níveis
séricos das citocinas IL-6 e TNF, assim como a inibição de ativação dos fatores de
transcrição NFkB (fator nuclear kappa B) e AP-1(proteína ativadora-1) que
desempenham funções carcinogênicas (MANTLE, et al. 2021). Um derivado da
CoQ10, o 4-Acetilantroquinonol, foi capaz de aumentar a atividade de células
dendríticas em cultura de células tronco de câncer hepático, pois aumentou a
expressão de MHC de classe I e II na superfície celular, assim como da molécula co-
estimulatória CD80, aumentando a atividade do sistema imunológico sobre o tumor
(LI e CHIANG, 2019).
Além disso, o uso de CoQ-10 é associado à cardioproteção em pacientes
tratados com antraciclinas, como a doxorrubicina, pois o mecanismo de toxicidade
deste fármaco é a formação irreversível de um complexo com a cardiolipina
(fosfolipídio aniônico) na membrana da mitocôndria e culmina na formação de radicais
superóxidos, afetando negativamente a cadeia transportadora de elétrons (SONGBO,
2019; QUAGLIARELLO, et al. 2020). Sendo assim, a CoQ10 age tanto na CTE, quanto
impedindo os danos dos radicais formados, pela sua ação antioxidante.
Por ser uma molécula endógena, a CoQ10 é um fármaco seguro, com estudos
apontando toxicidade apenas para dosagens superiores a 1200 mg/dia. Os efeitos
adversos descritos na literatura são leves e incluem efeitos gastrointestinais,
irritabilidade, e aumentos dos níveis séricos de enzimas hepáticas, porém sem
 16

ocorrência de hepatotoxicidade (ARENAS-JAL, et al 2020). A maior desvantagem

dessa molécula é sua baixa biodisponibilidade oral (MANTLE e DYBRING, 2020), uma
limitação que a nanotecnologia potencialmente pode resolver (CHATURVEDI, et al.,
2019; ALAVI, et al. 2019)).

2.3 Nanopartículas híbridas lipídico-poliméricas (NPH)

As NPH são sistemas de tamanho nanométrico, sólidos à temperatura corporal,

em que é empregada a coexistência de um polímero e um lipídio na matriz estabilizada
por tensoativos. Tal coexistência confere a esse tipo de sistema grande versatilidade,
pois permite a produção de nanopartículas que combina características de sistemas
poliméricos e sistemas lipídicos, além da possibilidade de produção de sistemas
anfifílicos, podendo promover a encapsulação de fármacos tanto hidrofílicos quanto
lipofílicos. Esses sistemas permitem muitas combinações de lipídio e polímero, além
de permitirem a utilização de métodos de fácil obtenção (WU, 2016).
Os componentes lipídicos e poliméricos podem ser arranjados de cinco
diferentes maneiras na produção de NPH, polímero e lipídio uniformemente
distribuídos, formando uma matriz monolítica, um núcleo polimérico envolto por uma
camada lipídica, formando uma NPH do tipo núcleo-casca (que se assemelha
estruturalmente a um lipossoma, com a distinção do núcleo sólido), um centro oco,
envolto por uma camada lipídica concêntrica, que é envolta por uma camada
polimérica, que por sua vez é envolto por outra camada lipídica, nanopartículas
poliméricas de tamanho menor que 100 nm camufladas por membrana celular e
lipossomas com polímeros ancorados em sua superfície (MANDAL, et al. 2013; BOSE,
et al. 2016). Exemplos de polímeros amplamente utilizados e descritos na literatura
são a policaprolactona, o poli ácido lático co-glicólico (PLGA), e o dextrano, e como
lipídios, ácidos graxos, esteróides, lecitina, fosfolipídeos zwitteriônicos, catiônicos,
aniônicos e neutros (HADINOTO, et al. 2013)
O PLGA (Figura 2) é um co-polímero alifático, que tem seus monômeros
compostos por moléculas de ácido lático e glicólico intercaladas. O ácido lático possui
um carbono-α quiral e no PLGA as conformações D e L estão em proporções iguais e
o radical metila confere à molécula alta lipofilia, fazendo com que esse polímero seja
solúvel em solventes orgânicos como acetona, THF e DCM. É degradável quando
exposto à umidade, pois sofre hidrólise das ligações éster. É altamente biocompatível
 17

e biodegradável, além de possuir uma farmacocinética de perfil não linear e dose-

dependente (MAKADIA, et al. 2011). Esse co-polímero está amplamente descrito e
utilizado na literatura na área da nanotecnologia, e aprovado tanto pela Food and
Drug Administration (FDA) quanto pela European Medicines Agency (EMA).

Figura 2: Estrutura química do PLGA

Autoria própria

O colesterol (Figura 3) é um esteroide endógeno, que compõe a membrana

celular conferindo fluidez e permeabilidade, o que significa que é um composto
biocompatível (MEYER e SMIT, 2009). Por ser um lipídio, possui alta afinidade por
solventes orgânicos e baixa solubilidade em água. É sólido à temperatura corporal e
é bastante utilizado na produção de NPH lipídico-poliméricas, de nanopartículas
lipídicas sólidas e de lipossomas. Foi demonstrado que o colesterol conseguiu
aumentar a captação de sistemas carreadores híbridos in vitro e aumentar a
estabilidade da formulação a longo prazo (HU, et al., 2015).

Figura 3: Estrutura do colesterol

Autoria própria
 18

Existem diversas técnicas para obtenção de NPH, tanto de alta quanto de baixa
energia, tais como emulsificação-difusão, dupla emulsificação, emulsificação-
coacervação, revestimento de polímero, camada por camada, salting out e
nanoprecipitação (MORA-HUERTAS, et al. 2009). Entre essas se destaca a técnica
de nanoprecipitação.

2.4 Nanoprecipitação

Esse método também é conhecido por deslocamento de solvente ou deposição

interfacial. Baseia-se no deslocamento de um solvente orgânico através de uma fase
não solvente, onde os componentes da fase orgânica se depositam na interface e se
solidificam, passando por um processo de auto-montagem em que os estruturantes
formam a matriz e são estabilizados em colóides por surfactantes (FESSI, et al. 1989).
Esse método é bastante utilizado por não empregar o uso de alta energia, por ser de
fácil execução, oferecer a possibilidade de encapsulação de fármacos hidrofílicos e
lipofílicos e entregar uma boa reprodutibilidade, além de estar amplamente descrito
na literatura com alto índice de sucesso na obtenção desses sistemas
(BARRICHELLO, et al. 1999; MARTINEZ-RIVAS, et al. 2017).
 19

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Desenvolver e caracterizar um sistema de nanopartículas híbridas lipídico-

poliméricas de PLGA e Colesterol contendo Coenzima Q-10 para potencial atividade
anticâncer.

3.2 Objetivos específicos

● Obter NPH de PLGA/Colesterol a partir da metodologia de nanoprecipitação;

● Monitorar as nanopartículas obtidas através de análises de:
- Diâmetro e índice de polidispersão pelo espalhamento dinâmico de luz
(Dynamic Light Scattering);
- Potencial Zeta por mobilidade eletroforética;
- Potencial hidrogeniônico;
- Eficiência de incorporação;
- Estudo de estabilidade físico-química.
● Avaliar compatibilidade com eritrócitos por teste de hemólise.
 20

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais

O poli ácido lático co-glicólico (PLGA) (viscosidade inerente 0.63 dL g-1 a 30°
C) foi fornecido pela Birmingham Polymers Inc. (Pelham, AL, EUA); O Colesterol,
Polissorbato 80(Tween 80®), Monooleato de sorbitano (Span 80®) foram fornecidas
pela Sigma-Aldrich Brasil Ltda (Saint Louis, MO, EUA); A CoQ10 foi adquirida pela
Xangai Biolang Biotecnologia Co., Ltd. (Hubei, China). O solvente orgânico acetona
(ACE) Qhemis (São Paulo, BRA); A água purificada (>0,1 μS) foi preparada a partir
do equipamento de purificação de osmose reversa modelo OS50 LX (Gehaka, SP,
Brasil).

4.2 Métodos

4.2.1 Obtenção das nanopartículas

Para este trabalho, o polímero utilizado foi o poli ácido láctico-co-ácido glicólico
(PLGA) e como componente lipídico, o colesterol. Como tensoativos, foram utilizados
o monooleato de sorbitano (Span 80®), um tensoativo não iônico que possui equilíbrio
hidrófilo-lipófilo (EHL) 4,3, e o Polissorbato (Tween 80®), outro tensoativo não iônico,
mas que possui EHL 15. Para a obtenção do sistema foi empregada a técnica de
nanoprecipitação com evaporação de solvente.
As nanopartículas foram obtidas pelo método de nanoprecipitação (n=3)
(FESSI et. al., 1989). A fase orgânica (FO) foi preparada em acetona e composta por
PLGA, Colesterol, Span 80® e, nos sistemas carregados, Coenzima Q10 em quatro
drug loadings. A fase aquosa foi composta de água purificada e Tween 80®. Todas
as quantidades estão dispostas na tabela 1. A FO foi filtrada em membrana de nylon
com poro de 0,22 µm e a FA foi filtrada em membrana de acetato de celulose com
poro 0,45 µm, a fim de garantir a qualidade das soluções, e em seguida a FO foi
injetada em um fluxo de 2 mL/minuto na FA sob agitação magnética de 720 rpm a
25ºC. Logo após o solvente foi evaporado em overnight, sob agitação magnética de
720 rpm a 25ºC. As amostras foram hermeticamente fechadas e armazenadas em
geladeira a 5ºC.
 21

A quantidade de CoQ10 nas formulações, foram calculadas com base na

massa de matriz empregada (PLGA + colesterol). As massas finais de cada
componente estão dispostas na Tabela 2.

Tabela 1: Quantidades de cada componente das formulações de NPH

Formulação PLGA (%) Colesterol Span 80® Coenzima Tween

(%) (%) Q10 (%) 80® (%)

NPH_Branca 0,25 0,25 0,3 0 0,1

NPH_2,5% 0,25 0,25 0,3 2,5 0,1

NPH_5% 0,25 0,25 0,3 5 0,1

NPH_10% 0,25 0,25 0,3 10 0,1

Tabela 2: Massa de todos os componentes na formulação final

Concentração nas fases Massa na formulação

Componente
(%) final (mg)

PLGA 0,25 15

Colesterol 0,25 15

Span 80® 0,3 18

Tween 80® 0,1 14

Coenzima Q10 2,5 / 5 / 10 0,75 / 1,5 / 3

4.2.2 Eficiência de incorporação (EI)

Para mensurar quanto da CoQ10 foi incorporada às NPH, os sistemas foram

centrifugados em filtros VIVASPIN® de (membrana filtrante com cut-off de 10KDa) a
4500 rpm, a 4ºC, durante 60 minutos e o filtrado foi analisado em espectrofotômetro
com comprimento de onda λ= 275 nm. Os dados foram analisados com auxílio de uma
curva padrão apropriada (R²=0,9996), e as análises foram realizadas em triplicata,
sendo os resultados expressos em média ± desvio padrão. A eficiência de
incorporação foi calculada de acordo com a equação 1 abaixo:
 22

Equação 1: Porcentagem de CoQ10 encapsulada nas NPH

𝑪𝒐𝑸𝟏𝟎 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 − 𝑪𝒐𝑸𝟏𝟎 𝒅𝒆𝒕𝒆𝒓𝒎𝒊𝒏𝒂𝒅𝒂 𝒏𝒐 𝒇𝒊𝒍𝒕𝒓𝒂𝒅𝒐

𝑬𝑰% = 𝒙𝟏𝟎𝟎
𝑪𝒐𝑸𝟏𝟎 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍

4.2.3 Diâmetro das partículas e Índice de polidispersão (IP)

Para leituras deste tópico e do seguinte, foi utilizado o analisador Zetasizer

(Nano ZS Zetasizer, Malvern Instruments Corp., UK) do Laboratório de Sistemas
Dispersos - LaSiD, do Departamento de Farmácia UFRN e os dados obtidos foram
analisados com o software Zeta Plus® Particle Sizing versão 8.01. Para mensurar
diâmetro e IP, a técnica utilizada é a de espalhamento dinâmico de luz, utilizando um
comprimento de onda de 659 nm e 173º como ângulo de detecção
(BHATTACHARJEE, 2016). As amostras foram diluídas em uma proporção de 1:10
para evitar agregação. As análises foram realizadas em triplicata, a 25ºC e os
resultados foram expressos com média ± desvio padrão.

4.2.4 Potencial Zeta (PZ)

O PZ traz informações sobre a carga de superfície da partícula e foi

determinado por perfil de mobilidade eletroforética com aplicação de uma força de
campo de 5,9 V cm-1 de acordo com a equação de Helmholtz-Smoluchowski
(Equação 2) (BHATTACHARJEE, 2016). Não houve diluição da amostra a fim de
evitar interferência da água na leitura, as análises foram realizadas em triplicata, a
25ºC e os resultados foram expressos com média ± desvio padrão.

Equação 2: Equação de Helmholtz-Smoluchowski

Onde Vosm representa a velocidade linear máxima das nanopartículas na

suspensão, ε a constante dielétrica do meio, ε0 a permissividade do vácuo, ζ o
potencial zeta, η a viscosidade da solução e E o campo elétrico aplicado (TAVARES,
1996).
 23

4.2.5 Potencial hidrogeniônico (pH)

A medida foi realizada com pHmetro Gehaka PG 2000 do Laboratório de

Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica - Tecbiofar, do departamento de Farmácia
da UFRN. Não houve diluição da amostra a fim de evitar interferência da água na
leitura, as análises foram realizadas em triplicata, a 25ºC e os resultados foram
expressos com média ± desvio padrão.

4.2.6 Estudo de estabilidade físico-química

As NPH foram colocadas em frascos hermeticamente fechados e armazenadas

em refrigeração a 5ºC e foram analisadas em intervalos de 24 horas, 7, 15, 30 e 45
dias, quanto ao diâmetro médio, IP, PZ e pH. As análises foram realizadas de acordo
com os itens anteriores.

4.2.7 Atividade Hemolítica

A Hemólise é caracterizada pela lise da hemácia mediante interação com

fatores que promovam ruptura da membrana celular, como agentes químicos,
osmóticos ou mecânicos, o que promove a liberação da hemoglobina do meio intra
para o meio extracelular.
O ensaio de atividade hemolítica foi utilizado para mensurar o grau de
toxicidade da formulação em ambiente simulado do sangue. A toxicidade das
nanopartículas frente aos eritrócitos foi avaliada por ensaio de atividade hemolítica
seguindo os métodos descritos por Menezes e colaboradores (MENEZES, et al. 2014)
modificado.
A suspensão de eritrócitos foi lavada três vezes com solução tampão fosfato
(PBS) (pH 7,4) e centrifugada a 2000 rpm por 10 minutos. Os eritrócitos foram
incubados a 37ºC por 60 minutos com solução de Coenzima Q-10 (500 µg/mL),
NPH_BRANCA e NPH_10% (seis pontos de diluição) e posteriormente centrifugada a
2000 rpm por 10 minutos, e a hemoglobina no sobrenadante foi quantificada em leitor
de microplacas (Epoch-Biotek, Winooski, VT), utilizando comprimento de onda λ= 540
nm. Para controle positivo (100% de hemólise) foi utilizada água purificada e para
controle negativo (0% de hemólise) foi utilizado PBS (pH 7,4).
 24

4.2.8 Análise Estatística

Os resultados dos experimentos foram apresentados como média mais desvio

padrão. Foi realizada a análise de variância (ANOVA) de uma entrada, seguido pelo
teste de Tukey ou Dunnett usando o software GraphPad Prism® versão 9.0.0
(Califórnia, EUA), quando aplicável. Os resultados foram considerados
estatisticamente significantes para o valor de p < 0,05.
 25

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Obtenção e caracterização das NPH

Após o período de 24 horas de evaporação foram feitas as leituras dos

parâmetros de caracterização das NPH. Os sistemas obtidos estão apresentados na
Figura 4, foi possível perceber uma mudança na tonalidade do sistema à medida que
o drug loading aumenta, isso ocorre devido à cor amarelada da CoQ10.

Figura 4: Sistemas de NPH carregados com CoQ10

Os resultados da leitura de 24 horas após obtenção estão dispostos na tabela

3. Foram obtidas nanopartículas com tamanho inferior a 180 nm, e foi observado um
aumento estatisticamente significativo (p<0,05) no diâmetro das nanopartículas
quando houve incorporação de fármaco (esse comportamento não se mostrou dose-
dependente), passando de 146,1 nm da NPH_Branca para 171,3 nm da NPH_10%,
sem perturbação no IP, o que indica que provavelmente ocorreu a internalização da
CoQ10 na matriz (LIU, et al. 2020).
O PZ das nanopartículas brancas foi de -14,8 mV, e houve aumento no módulo
desse valor nas nanopartículas carregadas, onde a NPH_5% apresentou um valor de
-19,1 mV, o que caracteriza nanopartículas aniônicas, e esse aumento na carga de
superfície pode ter ocorrido pela influência das carbonilas presentes na molécula da
CoQ10, pois em estudo de Kim e colaboradores (2012) com partículas de CoQ10 em
suspensão, foi verificado um PZ negativo, que variava de -33,9 - 51,1 mV. Não houve
variação significativa de pH nas NPH.
 26

Tabela 3: Caracterização inicial das NPH

Diâmetro (nm) IP ± DP PZ (mV) ± DP pH ± DP

± DP

NPH_Branca 146,1 ± 8,075 0,119 ± 0,011 -14,8 ± 0,696 3,95 ± 0,010

NPH_2,5% 164,4 ± 4,384 0,103 ± 0,016 -18,0 ± 0,644 3,98 ± 0,038

NPH_5% 158,8 ± 4,507 0,098 ± 0,016 -19,1 ± 0,548 3,93 ± 0,020

NPH_10% 171,3 ± 6,606 0,087 ± 0,009 -18,2 ± 0,844 3,93 ± 0,020

O tamanho <200 nm que foi obtido, é ideal para sistemas que têm como alvo o
câncer, pois nanopartículas nessa faixa de diâmetro podem ter direcionamento
passivo pelas fenestrações capilares para a massa tumoral em tumores sólidos, e
assim aumentar a concentração de fármaco no sítio alvo, através do efeito EPR
(FANG, et al. 2011; SHI, et al. 2020)
O IP reduzido (<0,2) indica alto grau de uniformidade na distribuição de
tamanho das partículas, e atesta o sucesso da formação das NPH pelo método
empregado (FANG, et al. 2010).

5.2 Eficiência de Incorporação (EI)

É de grande importância que a maior quantidade possível de CoQ10 seja

incorporada à nanopartícula, a fim de obter uma boa formulação, com o mínimo de
perdas no processo. Foram mensuradas as eficiências de incorporação de CoQ10 sob
três concentrações diferentes, 2,5%, 5% e 10% (p/p) em relação à massa da matriz
estrutural. Os resultados expressos na Figura 5 mostram uma relação de
proporcionalidade nas variáveis de EI e concentração de CoQ10, sendo que quanto
maior a concentração, maior a eficiência. Em todas as formulações, a EI foi superior
 27

a 90%, sendo assim o aumento do diâmetro das NPH corrobora os dados de eficiência
de incorporação (Figura 5 e Tabela 4).

Figura 5: Eficiência de incorporação de CoQ10

Tabela 4: Eficiência de incorporação da CoQ10 nas NPH

Formulação EI (%)± DP

NPH_Branca -

NPH_2,5% 91,74 ± 3,88

NPH_5% 96,78 ± 0,39

NPH_10% 98,12 ± 0,45

Provavelmente, a CoQ10 está interagindo com a matriz PLGA e colesterol por

meio de interações lipofílicas, onde esses componentes estão unidos pelo Span 80®
e o sistema está estabilizado em suspensão aquosa pelo Tween 80®. A não alteração
do pH era esperada, pois na molécula da coenzima não há presença de grupamentos
que pudessem alterar tal parâmetro.
Ankola e colaboradores em 2007, produziram nanopartículas de PLGA
contendo CoQ10 e conseguiram incorporar até 83,1%, o que sugere que a adição do
colesterol ajudou a aumentar a interação do sistema com o fármaco, aumentando a
sua incorporação.
 28

5.3 Estabilidade físico-química

Os resultados da estabilidade do sistema nos intervalos de tempo de 24 horas,

7, 15, 30 e 45 dias estão dispostos na Figura 6, 7, 8 e 9, correspondendo a
NPH_Branca, NPH_2,5%, NPH_5% e NPH_10%, respectivamente. Os valores
obtidos nas leituras atestam que não houveram fenômenos de incompatibilidade e/ou
instabilidade entre os componentes, como agregação das partículas (PHYS, et al.
2017).

Figura 6: Gráfico de estabilidade NPH_Branca

Figura 7: gráfico de estabilidade NPH_2,5%

 29

Figura 8: Gráfico de estabilidade NPH_5%

Figura 9: Gráfico de estabilidade NPH_10%

 30

O PZ é um parâmetro determinante para a estabilidade, pois cargas de

superfícies com módulos entre 30 e 50 mV têm força de repulsão suficiente para evitar
a agregação das partículas em nanosistemas sem tensoativo. Já com a presença de
um estabilizante, sistemas com módulo de PZ em torno de 20 mV já se mostram
estáveis, isso pelo efeito de impedimento estérico dos surfactantes (MITRI, et al.,
2011).
Pelas características físico-químicas dos componentes da formulação, um alto
drug loading poderia afetar negativamente a formação e a estabilidade do sistema,
pois, se carregado com altas quantidades de CoQ10 o sistema poderia tornar-se muito
lipofílico, e os tensoativos poderiam ser insuficientes para estabilizá-lo em meio
aquoso (ZOU, et al. 2013). No entanto, para carregamentos de até 10% o sistema
surfactante apresentou êxito na estabilização.

5.4 Atividade hemolítica

Os valores de hemólise da solução de CoQ10 (500 µg/mL), NPH_Branca e

NPH_10% estão dispostos na Figura 4. Os resultados mostram um elevado grau de
hemólise (>30%) tanto na solução de fármaco livre quanto nas NPH para as duas
primeiras diluições, sem grandes distinções entre NPH_Branca e NPH_10%.
 31

Figura 10: Atividade hemolítica dos sistemas contendo CoQ10

O alto índice hemólise da solução de CoQ10 provavelmente ocorreu devido ao

sistema solvente utilizado, de metanol com etanol como co-solvente, que foi
empregado pela baixa solubilidade da CoQ10 em água. Já o fenômeno observado nas
NPH, provavelmente ocorreu pela interação com os tensoativos, pela solubilização da
bicamada fosfolipídica (MANAARGADOO-CATIN, et al. 2016). Um fator que influencia
diretamente nesse teste é a osmolaridade, já que um sistema hiposmótico promove
maior lise das hemácias (GOODHEAD, et al. 2017)
Muitas alternativas podem ser avaliadas para redução do potencial hemolítico
das formulações, como a adição de agentes funcionalizantes à superfície das
partículas. Cavalcante em 2020, reduziu a hemólise do sistema com a funcionalização
com Albumina Sérica Bovina, que recobriu o Tween 80® que estava estabilizando a
superfície da NPH e impediu a interação com a membrana dos eritrócitos.
 32

6 CONCLUSÕES

O sistema foi desenvolvido com sucesso. A técnica de nanoprecipitação se

mostrou eficaz na produção das nanopartículas híbridas PLGA/colesterol com
tamanho em escala nanométrica (<200 nm), com baixa polidispersão, e com carga de
superfície negativa. Foi possível incorporar grande quantidade de CoQ10 nas NPH
(91,74% - 98,12%). Porém, como resultado preliminar, o sistema se mostrou
hemolítico nas primeiras diluições do teste. De acordo com os resultados
apresentados, é possível continuar a pesquisa com o sistema com CoQ10 incorporada
a fim de melhorar as deficiências do sistema e verificar atividade anticâncer.
 33

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