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Jornal de pesquisa apícola

ISSN: (Imprimir) (Online) Página inicial da revista:https://www.tandfonline.com/loi/tjar20

Pesquisa longitudinal revela efeitos retardados da baixa

expressão genética na saúde das colônias de abelhas sem ferrão

Lílian César, Anelise Martins Correa Lopes, Jefferson Nunes Radaeski, Soraia
Girardi Bauermann, Enéas Ricardo Konzen, Jean-François Pombert, Aroni
Sattler, Betina Blochtein, Airton Torres Carvalho e Karen Luisa Haag

Para citar este artigo:Lílian César, Anelise Martins Correa Lopes, Jefferson Nunes Radaeski, Soraia Girardi
Bauermann, Enéas Ricardo Konzen, Jean-François Pombert, Aroni Sattler, Betina Blochtein, Airton Torres
Carvalho & Karen Luisa Haag (2022) Levantamento longitudinal revela efeitos retardados da baixa expressão
gênica sobre a saúde das colônias de abelhas sem ferrão, Journal of Apicultural Research, 61:5, 654-663, DOI:
10.1080/00218839.2021.1962123

Para vincular a este artigo:https://doi.org/10.1080/00218839.2021.1962123

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JORNAL DE PESQUISA APÍCOLA 2022,
VOL. 61, NÃO. 5, 654–663
https://doi.org/10.1080/00218839.2021.1962123

ARTIGO DE PESQUISA ORIGINAL

Pesquisa longitudinal revela efeitos retardados da baixa expressão genética na saúde das
colônias de abelhas sem ferrão

EU-euLião Césara, Anelise Martins Correa Lopesb, Jefferson Nunes Radaeskic, Soraia Girardi Bauermannc,
En-eas Ricardo Konzend, Jean-François Pomberte, Aroni Sattlerf, Betina Blochteing, Airton Torres Carvalhoh
e Karen Luisa Haaga,b
aPrograma de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio
Grande do Sul, Brasil;bDepartamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande, Porto Alegre, Rio
Grande do Sul, Brasil;cLaboratório de Palinologia, Universidade Luterana do Brasil, Canoas, Rio Grande do Sul, Brasil;dCentro de
Estudos Costeiros Limnológico e Marinhos, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Imb-e, Rio Grande do Sul, Brasil;
eDepartamento de Biologia, Instituto de Tecnologia de Illinois, Chicago, Illinois, EUA;fLaboratório de Apicultura, Faculdade de Agronomia,

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil;gEscola de Ciências da Saúde e da Vida, Pontifíciaeucia
Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil;hUnidade Acadêmica de Serra Talhada, Universidade
Federal Rural de Pernambuco, Serra Talhada, Pernambuco, Brasil

ABSTRATO HISTORIA DO ARTIGO

As populações de abelhas estão diminuindo globalmente devido a diferentes estressores ambientais, como Recebido em 18 de janeiro de 2021

patógenos, desnutrição e agroquímicos. O Brasil é o lar de centenas de espécies de abelhas sem ferrão, Aceito em 7 de junho de 2021

algumas delas hoje consideradas ameaçadas de extinção, embora muito pouco se saiba sobre o impacto
PALAVRAS-CHAVE
das doenças nas abelhas nativas. No Sul do Brasil a abelha sem ferrão ameaçada de extinçãoMelipona
Saúde das abelhas; colapso da
quadrifasciataé afetada por uma síndrome anual que causa morte súbita de operárias, levando
colônia; efeitos subletais; dinâmica de
eventualmente ao colapso das colônias. Embora novos vírus tenham sido encontrados em forrageadoras de colônias; abelha sem ferrão;
colónias doentes, nenhum foi consistentemente implicado no surto. Aqui conduzimos uma pesquisa Melipona quadrifasciata
longitudinal integrativa sobreM. quadrifasciatacolônias gerenciadas, medindo características individuais e
em nível de colônia, para identificar as causas por trás da síndrome. Descobrimos que genes-chave
relacionados à metabolização xenobiótica, nutrição e respostas imunológicas são regulados negativamente
em forrageadoras de colônias que adoeceram dois meses depois. O período que antecedeu o surto também
foi marcado por pronunciada perda de peso das forrageiras, bem como por mudanças comportamentais.
Nossas descobertas revelam que a síndrome pode resultar da falha das abelhas sem ferrão em responder a
estressores subletais e à interrupção da dinâmica da colônia. Estes resultados apoiam a proposição de que a
mortalidade mundial das abelhas é influenciada por uma combinação de diversos factores subletais, e
aumentam a consciência dos efeitos a longo prazo da erosão da diversidade genética em espécies de
abelhas sem ferrão, o que pode aumentar a sua vulnerabilidade aos factores de stress ambientais.

Introdução abelhas eussociais, onde a aptidão da colônia é alcançada pela

cooperação, fatores subletais caracteristicamente comprometem
A diminuição mundial das populações de abelhas
a capacidade das fêmeas não reprodutivas de realizar suas
observada na última década é motivo de grande
tarefas regulares (Berenbaum & Liao, 2019). Por exemplo,
preocupação. Algumas perdas de colônias são explicadas
abelhas operárias criadas em colônias sob estresse de pólen
pela presença de patógenos e outros agentes infecciosos
apresentam desenvolvimento pré-imaginal normal, mas como
(Evans & Schwarz,2011; Schwarz et al.,2015), mas sabe-se
que vários estressores adicionais que interagem, como adultos são menos propensos a dançar e a informar com

perda de habitat, desnutrição, agroquímicos e práticas de precisão a localização dos alimentos (Scofield & Mattila,2015). A

manejo de colônias, reduzem a aptidão das populações exposição das larvas a doses subletais de pesticidas induz

de abelhas (Goulson et al.,2015). Estudos teóricos múltiplas alterações na expressão genética, levando a alterações

indicam que embora estresses multifatoriais possam no desenvolvimento e no comportamento dos adultos que

causar falência de colônias, é muito provavelmente
resultado de um nível crítico de estresse proveniente do
acúmulo de fatores subletais (Bryden et al.,2013).
Uma das propriedades intrínsecas dos fatores subletais é
o seu efeito retardado na aptidão do organismo. Em
enfraquecem as colônias de abelhas (Berenbaum & Liao,2019;
Wu e outros,2017). Além do mais
interagindo uns com os outros, estressores ambientais
são modulados por fatores endógenos que estão, em última
análise, ligados à origem genética da abelha (Poquet et al.,
2016). Algumas práticas de manejo de abelhas,

CONTATOKaren Luisa Haag karen.haag@ufrgs.br

Dados suplementares para este artigo estão disponíveis online emhttps://doi.org/10.1080/00218839.2021.1962123
- Associação Internacional de Pesquisa de Abelhas 2021

incluindo a translocação de colónias, pode levar à
homogeneização genética, à perda de diversidade genética e
à quebra das adaptações locais, impactando finalmente a
sua capacidade de resposta a factores de stress (Espregueira
Themudo et al.,2020; Jaff-e et al.,2016).
A abelha sem ferrãoMelipona quadrifasciataé uma das
espécies mais extensivamente manejadas e objeto de
intenso comércio no Sul do Brasil, onde seus ninhos
praticamente desapareceram da natureza (Fundação
Zoobotânica, 2014). Nesta região, a prática de divisão de
colônias é realizada há décadas e tornou-se mais comum
com a intensificação do comércio (Jaff-e et al.,2015), que
agora está ameaçada por uma síndrome que ocorre
anualmente no final do verão, muitas vezes levando ao
colapso das colônias (Caesar et al., 2019; D-euaz et al.,2017).
O primeiro relato dessa síndrome foi feito por um apicultor
em 2014, que a descreveu como um fenômeno regular que
€ge,
observa há vários comunicação
anos (Valmir Zu pessoal). Durante o
surto, algumas abelhas operárias de colônias afetadas
apresentam sintomas neurológicos, como tremores e paralisia,
que sugerem envenenamento ou infecções virais. Apesar de
terem sido encontrados novos vírus associados a abelhas
sintomáticas, como os dicistrovírus, que causam sintomas
semelhantes emA. mellifera (Genersch & Aubert,2010), nenhum
vírus (Caesar et al.,2019), e nenhum outro patógeno (D-euaz et
al.,2017) foi encontrado consistentemente associado a abelhas
de colônias doentes.
Aqui relatamos um estudo integrativo e longitudinal
concebido para descobrir as causas subjacentes à
síndrome anual deM. quadrifasciata.Além das análises
transcriptômicas exploratórias, foi realizada uma
pesquisa temporal em três pares de colônias mãe-filha
mantidas em duas localidades separadas, a fim de avaliar
a contribuição de fatores genéticos e ambientais para a
manifestação da síndrome, medindo-se indivíduos e
colônias. características de nível.
Materiais e métodos
Procurando genes diferencialmente expressos
durante a síndrome
TrêsM. quadrifasciatacolônias foram selecionadas para análises
transcriptômicas exploratórias para identificar genes
diferencialmente expressos durante o surto da síndrome. Duas
colônias foram amostradas durante o surto em meliponários de
Bom Príncipe.eupio (BP; 29-31014h3000S/51-17029h0000W) e
Estância Velha (EV; 29-38'50,316''S/ 51-10'23,592''W). Ambas as
colônias estavam manifestando os sinais da síndrome, como
mortalidade de abelhas adultas, ou abelhas apresentando
tremores e paralisia. Uma terceira colônia, que não apresentava
tais sinais, foi amostrada em BP. Três abelhas de cada colônia
(rotuladas como D1, D2 e H, respectivamente) foram coletadas e
armazenadas a -80-C até extração de RNA para sequenciamento
do transcriptoma. RNA total de abelhas individuais foi extraído
com TRIzolMTReagente (Thermo Fisher Scientific, EUA), seguindo
as recomendações do fabricante.
REVISTA DE PESQUISA APÍCOLA 655
O rendimento de RNA foi avaliado com fluorômetro Qubit
(Invitrogen, EUA) e a integridade foi verificada em gel de agarose
a 1%. Para sequenciamento, alíquotas de 2eug RNA tratado com
TURBO DNase (Thermo Fisher Scientific, EUA) de três forrageiras
foram reunidos com as respectivas amostras de colônias. As
transcrições foram purificadas por seleção de cauda poliA,
seguida de construção de biblioteca usando TruSeq Stranded
mRNA Library Prep Kit (Illumina, EUA). Sequenciamento de
extremidade única (comprimento de leitura¼150nt) foi realizado
em um instrumento Illumina NextSeq, produzindo cerca de 100
milhões de leituras por amostra.
O Trimmomatic v.0.36 foi executado com parâmetros
padrão para remover leituras de baixa qualidade (Bolger et
al.,2014). Expressão genetica (GE)foi estimado com o
profundidadecomando do Samtools v.1.3.1 (Li et al.,2009)
mapeando as leituras cortadas emM. quadrifasciatagenoma
(GenBank: GCA_001276565.1) com GSNAP v. 04/07/2018 (Wu
et al.,2016) e recuperando o número de leituras por gene.
Para normalizar a expressão genética (NGE)entre os três
transcriptomas foi utilizada a seguinte fórmula:NGE¼ (
100.000.000/número de leituras mapeadas) GE. Em seguida,
a semelhança na expressão genética (SGE)entre
transcriptomas foi estimado com scripts Perl personalizados
comparandoNGEde amostras saudáveis e doentes com a
seguinte fórmula:SGE¼ (HºD)/(2 máximo),
ondeHé oNGEdo transcriptoma obtido da colônia
saudável,Dé oNGEdo transcriptoma obtido de uma
colônia doente, emáx.é o maior NGEvalor entreHeD
sendo comparado. O resultado varia entre 0,5 e 1, e os
genes foram considerados como expressos
diferencialmente (DEGs) quandoSGE foi igual ou
inferior a 0,7. Genes hipotéticos entre DEGs foram
anotados novamente com BLASTp contra onº banco
de dados (valor e de corte 1e-5) (Altschul et al.,1990).
Para encontrar funções super-representadas em DEGs,
uma análise de enriquecimento funcional foi realizada
usando a versão online do g:Profiler com parâmetros padrão
(limiar g:SCS de 0,05) e anotação de ontologia genética
(termos GO) como fonte de dados (Raudvere et al .,2019).
Redes de similaridade de termos GO foram realizadas com
REVIGO, aplicando o limite de similaridade médio (0,7)
(Supek et al.,2011). As redes interativas resultantes foram
usadas como entrada no Cytoscape v. 3.2.8 (Shannon et al.,
2003) para edição posterior. DEGs com papéis conhecidos
para a saúde das abelhas foram selecionados para
quantificação relativa com RT-qPCR (veja seus supostos
papéis biológicos emTabela S1). As anotações de proteínas
de DEGs selecionados foram cruzadas com a versão online
do eggNOG-mapper v2 (Huerta-Cepas et al.,2017), análise
BLASTp contra
A. melíferaproteínas (táxido¼7460) e contra o completonº
banco de dados do NCBI (valor e de corte 1e-5) (Altschul et
al.,1990). As proteínas também foram comparadas com o
Banco de Dados de Domínios Conservados (CDD) usando a
ferramenta Batch CD-Search (valor e de corte 1e-3) (Lu et al.,
2020).
656 L. CÉSAR ET AL.
Monitoramento de colônias de abelhas antes, durante e
depois do surto
A fim de monitorar as alterações de várias características
biológicas importantes, foram feitas observações emM.
quadrifasciata colônias sob condições semi-controladas
durante seis meses em duas localidades, ou seja, Bom
Príncipe (BP; 29-31014h3000S/51-17029h0000W) e Porto Alegre
(PA; 30-2'4,7292''S/51-13'3,5724''W). O meliponário da BP está
localizado dentro de uma pequena propriedade agrícola
onde são utilizados regularmente agrotóxicos. As colônias de
AP foram mantidas nas proximidades de uma floresta
secundária localizada dentro do Campus Universitário. Para
controlar os fatores genéticos que contribuem para a
síndrome, três colônias de BP (denominadas BP1, BP2 e BP3)
foram divididas em fevereiro de 2018, resultando em três
pares de colônias mãe-filha (MD). Colônias filhas
(denominadas PA1, PA2 e PA3) foram translocadas para PA
após seis meses, quando amadureceram. Todas as seis
colônias foram monitoradas mensalmente de dezembro de
2018 (verão) a maio de 2019 (outono). Cada colônia foi
equipada com um datalogger (ONSET, Brasil) para registrar a
temperatura e umidade dentro da colmeia. Os registros
foram feitos diariamente a cada seis horas durante o
experimento, e as análises a jusante foram realizadas com a
menor temperatura diária (t) e a maior umidade (h). Além
disso, uma variável chamada delta (D¼valor máximo-valor
mínimo) foi calculado para avaliar a quantidade de variação
diária na temperatura da colônia (t) e umidade (h).
Recursos polínicos utilizados pelas abelhas sem ferrão
Alíquotas de pólen armazenadas pelas abelhas operárias
foram coletadas mensalmente com pinça e armazenadas no
laboratório às 4 horas.-C. Quando nenhum pólen
armazenado foi encontrado em nossas colmeias
experimentais, ou o armazenamento era inacessível para
amostragem, o pólen foi amostrado de colônias não
experimentais localizadas nas proximidades. O pólen foi
processado quimicamente por acetólise (Erdtman, 1952).
Foram montadas quatro lâminas para cada amostra com
gelatina de glicerina (Salgado-Labouriau,2007) e cerca de 500
grãos de pólen foram identificados em nível de família,
gênero ou espécie usando material de referência da
biblioteca polínica do Laboratório de Palinologia da
Universidade Luterana do Sul do Brasil (Ulbra), Herbário ICN
da Universidade Federal do Rio Grande do Sul ( UFRGS), base
de dados da Rede de Catálogos Polínicos (RCPol;
www.rcpol.org.br) e descrições de pólen de plantas do Sul do
Brasil (Bauermann et al.,2013; Evaldt et al.,2009; Liskoski e
outros,2018; Radaeski et al.,2014).
Peso das abelhas e quantificação relativa da
expressão gênica
Com aspirador entomológico foram coletadas mensalmente
cinco forrageadoras de cada um dos seis experimentos.
colônias, no período de dezembro de 2018 a abril de 2019. Elas
foram pesadas em balança digital de precisão e transferidas
individualmente para frascos contendo 200euL de RNAlater
(Thermo Fisher Scientific, EUA), seguido de armazenamento a -80
-C para extração de RNA e análise de expressão gênica por RT-
qPCR. O RNA total foi extraído de todo o corpo e quantificado
conforme explicado anteriormente. Uma alíquota de 1eug RNA
de cada forrageira foi usado como entrada para a primeira fita
de cDNA
síntese com o Alta capacidade Reverter
Kit de transcrição (Thermo Fisher Scientific, EUA).
Três DEGs foram selecionados para monitorar
padrões de expressão de abelhas forrageiras durante a
pesquisa, nomeadamente supostos padrões
mitocondriaiscitocromo P450 (CYP450; WN51_04136),
fenoloxidase (PO;WN51_02761) e apolipoforina (ApoLp;
WN51_14077). Primer3 de Geneious R11 (Kearse et al.,
2012) foi usado para projetar primers com base em cada
respectiva sequência genética (Tabela S2). Actina (agir)e
proteína ribossômica 40S S5 (rpm5)foram usados como
referências para normalização da expressão gênica (Brito
et al.,2015; Evans e outros,2006). StepOnePlusMTO
sistema de PCR em tempo real (Applied Biosystems) foi
utilizado para os ensaios de RT-qPCR. As amplificações
foram realizadas em 25euL soluções de reação contendo
12,5euL cDNA (diluído a 1:30), 0,2 X SYBRMTColoração em
gel de ácido nucléico Green I (Thermo Fisher Scientific,
EUA), 0,25 U de Platinum Taq DNA polimerase
(Invitrogen, EUA), tampão PCR 1 X (Tris-HCl 200 mM, pH
8,4, KCl 500 mM), 3 mM MgCl2, 0,1 mM de cada dNTP, 0,2
euM de cada primer específico.
A eficiência de amplificação do primer foi calculada com
qBASEºsoftware (Hellemans et al.,2007) a partir da inclinação
de uma diluição em série 1:10 de cinco pontos de amostras
de cDNA do calibrador (Tabela S2). A configuração
experimental do qPCR envolveu o método de maximização
da amostra (Hellemans et al.,2007), com três réplicas técnicas
para cada amostra, e amostras de calibradores entre ensaios
foram consideradas nos cálculos dos efeitos de variação
entre ensaios. O qBASEºpipeline foi usado para quantificação
de modelo (Hellemans et al.,2007), calculando primeiro as
médias e os desvios padrão dos valores do ciclo de
quantificação (Cq) das réplicas técnicas e relativizando os
valores de Cq com base na eficiência de amplificação
específica do gene. Em seguida, os fatores de normalização
específicos da amostra foram calculados tomando a média
geométrica das quantidades relativas dos dois genes de
referência (agirerps5).Os valores normalizados de Cq foram
finalmente reescalonados em relação à amostra com a
menor quantidade relativa (Hellemans et al.,2007), expressos
na forma de quantidades relativas normalizadas calibradas
(CNRQ) e utilizados para análises estatísticas. Informações
detalhadas sobre nossos ensaios RT-qPCR são fornecidas
comoDados suplementares (Tabela S2).
 REVISTA DE PESQUISA APÍCOLA 657

Figura 1.Padrões de expressão gênica de abelhas operárias a partir de análises de transcriptoma e RT-qPCR. (a)Melipona quadrifasciataabelha
operária (Fototeca Cristiano Menezes,http://www.splink.org.br/search?lang=en&collectioncode=FCM). (b) Diagrama de Venn mostrando genes
diferencialmente expressos (DEGs) regulados para cima ou para baixo em forrageadoras de colônias doentes (D1 ou D2). (c) Visão geral funcional
dos DEGs com base na anotação da ontologia genética (P<1), com o asterisco indicando termos GO enriquecidos nos DEGs (P<0,05). As barras
são classificadas de acordo com processos biológicos (BP), função molecular (MF) e componente celular (CC). (d) Gráfico de barras comparando a
expressão relativa (CNRQ) deCYP450, POeApoLpem forrageadoras de colônias que permaneceram saudáveis (H), com aquelas que
apresentaram sinais de doença (D) durante o período do surto. As barras indicam o erro padrão; letras maiúsculas indicam diferenças
significativas entre meses, e letras minúsculas indicam diferenças significativas entre colônias saudáveis e não saudáveis dentro de meses, de
acordo com o teste de Tukey (P<0,05).

análise estatística o peso da forragem foi avaliado por ANOVA unidirecional

usando “mês” como fator. O teste de Kruskal-Wallis foi
Todas as análises foram realizadas no R versão 3.6.3 (R Core
utilizado para avaliar as diferenças mensais das variações
Team,2019). Os dados foram testados quanto ao seu ajuste à
diárias na temperatura e umidade das colônias (Dt eDh).
normalidade e homogeneidade de variância usando os
Para testar se as colónias não saudáveis eram, em média,
testes de Shapiro e Bartlett (P<0,05), respectivamente.
mais frias e/ou mais húmidas, as temperaturas mais baixas e
Quando aplicável, embalar MASS (Venables & Ripley,2002) foi
as humidades mais altas diárias de Março foram analisadas
utilizado para transformação Box-Cox de dados não normais
pelo teste de Mann-Whitney. O pacote Laércio (Silva,
e não homogêneos. Diferenças temporais em
658 L. CÉSAR ET AL.

Figura 2.Mudanças nas características do nível da colônia ao longo do levantamento longitudinal. (a) Boxplot mostrando a variação mensal do
peso médio da forrageira. (b) Barplot mostrando a variação mensal do pólen armazenado. (c) Gráfico de linha da temperatura mínima diária e
umidade máxima dentro da colônia em março, medida por um registrador de dados. O estado de saúde da colónia durante o período do surto
(mostrado por uma linha horizontal acima do eixo X) é rotulado por cores diferentes (verde¼saudável; roxo¼doente). (d) Gráfico de barras da
diferença diária média dentro da colônia no máximovs.temperatura mínima (Dt) e umidade (Dh). As barras verticais indicam o erro padrão; letras
minúsculas representam diferenças significativas de acordo com (A) teste de Tukey ou (D) teste de Nemenyi (P<0,05).

2015) foi utilizado para comparações de médias com o teste características foram calculadas com o pacote Hmisc (Harrell
de Tukey e PMCMRplus (Pohlert,2020) para o teste de et al.,2020).
Nemenyi. Diferenças de CNRQ forrageadora paraCYP450, PO
e ApoLpforam avaliados por ANOVA unidirecional usando
“mês” e “colônia” como fatores separadamente. Levando em Resultados

consideração que a síndrome ocorre em março e que as

colônias foram monitoradas de janeiro a abril, uma ANOVA
bidirecional usando “colônia”, “colônias MD”, “estado de
saúde” ou “intensidade” combinada com “mês” como fatores
também foi realizado, permitindo-nos identificar efeitos de
expressão gênica em períodos específicos durante o curso
de nossa pesquisa. Coeficientes de correlação de Pearson
entre todos
Genes expressos diferencialmente
durante o surto
O sequenciamento do transcriptoma das forrageadoras D1, D2 e
H produziu 99.766.936, 102.034.731 e 135.982.124 leituras de
extremidade única com corte de alta qualidade, respectivamente.
De todas as leituras, 87–99% mapearam em relação aoM.
quadrifasciatagenoma. Um total de 558 DEGs foram

Figura 3.Matriz de correlação de Pearson de todas as características quantificadas nos níveis de colônia e indivíduo. (a) Correlações positivas e negativas
significativas são exibidas em círculos azuis e vermelhos, respectivamente (P<0,05). A intensidade da cor é proporcional aos coeficientes de correlação (r). (b)
Matriz comPvalores para os coeficientes de correlação (valores significativos em negrito), histogramas com estimativa de densidade de kernel e gráficos de
dispersão com linha ajustada para cada correlação.
encontrado comparando abelhas de colônias saudáveis
e ambas doentes, com 493 reguladas negativamente em
forrageadoras de colônias doentes (Figura 1B;Tabela S3).
Os componentes da membrana (GO:0016020 e
GO:0016020) são significativamente enriquecidos em
DEGs (Figura 1C;Figura S1;Tabela S4), dos quais a grande
maioria é regulada negativamente, representando
grandes déficits nas abelhas afetadas pela síndrome.
Alguns termos GO, embora não enriquecidos, são
relativamente mais frequentes e altamente conectados a
outros, como o processo biológico “modificação de
RNA” (GO:0009451; Figura S2) e a função molecular
“Atividade transferase, transferindo grupos
glicosil” (GO:0016757; Figura S3).
Até onde sabemos, a maioria dos genes altamente expressos
diferencialmente nunca foram diretamente implicados na saúde
das abelhas. Portanto três DEGs homólogos a genes com papel
conhecido para a saúde das abelhas e comumente encontrados
diferencialmente expressos em abelhas não saudáveis de
outras espécies foram escolhidos para quantificar variações
temporais na expressão gênica em forrageadoras sob condições
semi-controladas usando RT-qPCR ou sejaCYP450, POeApoLp (
Tabela S1).CYP450eApoLpsão ambos regulados negativamente
em nossos transcriptomas de colônias doentes, mas
curiosamentePOmostraram padrões inconsistentes de expressão
diferencial em D1 e D2 em relação a H.
Resultados da pesquisa
Entre as seis colônias monitoradas mensalmente em
nosso estudo, quatro manifestaram sinais da síndrome
em março de 2019. As colônias BP2 e BP3 manifestaram
os sinais mais fortes da doença, com alta mortalidade de
operárias, e algumas abelhas apresentando tremores ou
REVISTA DE PESQUISA APÍCOLA 659
paralisia. Suas respectivas colônias filhas PA2 e PA3
apresentaram sinais menos intensos e foram caracterizadas
como levemente doentes. Descartamos a possibilidade
que as abelhas morreram devido a doses letais de agroquímicos,
desde resíduo análises conduzido por NSF
Laboratórios Internacionais (Porto Alegre, Brasil) não
detectaram esses compostos em três grupos de 20
abelhas de colônias insalubres. A lista dos 197 compostos
testados e seus respectivos limites de detecção estão
disponíveis emTabela S5. O par de colônias MD BP1 e PA1
não manifestou alterações de saúde.
Variação temporal na expressão gênica
Houve uma variação temporal significativa na
transcrição deCYP450 (P¼0,009), com picos em março
em ambas as forrageadoras de colônias saudáveis e
doentes, e em janeiro apenas nas saudáveis (Figura
1D). Variações mensais emCYP450, POeApoLp a
expressão gênica mostrou interações semelhantes
com o estado de saúde da colônia (P¼0,0103, 0,0152 e
<0,0005, respectivamente), e forrageadoras de
colônias que permaneceram saudáveis durante o
período do surto mostraram a maior expressão
desses três genes em janeiro (Figura 1D).
Mudanças na nutrição das abelhas operárias e no microclima
das colônias
Encontramos uma redução acentuada no peso da
forrageira de janeiro a março (P<0,0005;Figura 2A), com o
menor peso médio alcançado durante o surto da
síndrome (março). De janeiro a fevereiro observamos
uma mudança brusca no pólen armazenado pelas
abelhas operárias, ou seja, na sua composição
660 L. CÉSAR ET AL.
mudou de Myrtaceae (comoEucaliptosp.) a Fabaceae
(principalmenteMimosa bimucronata;Figura 2B). A
redução do peso das abelhas foi acompanhada pela
redução da temperatura interna das colônias (R¼0,63,
P¼0,0088) e aumento da umidade (R¼ -0,58, P¼
0,0179;Figura 3). Este padrão foi mais pronunciado
nas colónias que adoeceram durante o surto, ou seja,
colónias MD 2 (BP2 e PA2; P<0,0005). Além disso, a
temperatura foi mais baixa (P<0,0005) e a umidade foi
mais alta (P<0,0005) dentro de colônias doentes
quando os sintomas da síndrome foram observados
pela primeira vez em março (Figura 2C). As maiores
diferenças na temperatura e umidade diárias dentro
das colônias ocorreram de dezembro a março (P<
0,0005;Figura 2D).
Discussão
Nosso estudo revelou que fatores genéticos e
ambientais podem influenciar a taxa anualM.
quadrifasciatasíndrome. Colônias mãe-filha,
exibindo uma relação genética média de 0,375 (Oliveira et al.,
2015), apresentaram estado de saúde semelhante durante o
surto, apesar de terem sido mantidos em localidades diferentes.
Suspeitamos que a prática rotineira de divisão de colônias,
associada à concomitante perda de ninhos silvestres, possa ter
reduzido a diversidade genética deM. quadrifasciatapopulações,
consistente com estudos anteriores em colônias manejadas
desta espécie no sul do Brasil (Koser et al., 2014). A diversidade
genética reduzida pode ter afectado a sua capacidade de
responder adequadamente às tensões ambientais sob a forma
de factores subletais, tais como agroquímicos, agentes
patogénicos e recursos alimentares limitados, predispondo-os a
doenças. Descobrimos que os sintomas das abelhas operárias
eram mais fortes em duas colônias afetadas localizadas próximas
a um ambiente agrícola. Assim, duas linhas de evidência
permitem-nos sugerir alguns dos mecanismos que podem estar
envolvidos numa maior susceptibilidade à síndrome e,
eventualmente, na falência das colónias, possivelmente através
do comprometimento das respostas das forrageadoras aos
factores de stress interactivos.
Primeiramente, nossas análises transcriptômicas exploratórias
mostraram que os componentes da membrana celular,
representando a camada que se comunica diretamente com o meio
ambiente, são enriquecidos com DEGs que são regulados
negativamente em forrageadoras de colônias afetadas por doenças.
Além disso, a análise de enriquecimento também indicou uma ligeira
representação excessiva dos processos metabólicos lipídicos e das
funções moleculares da oxidoredutase, que anteriormente
demonstraram responder a pesticidas em abelhas melíferas (Wu et
al.,2017). Em segundo lugar, as forrageadoras das nossas colónias
pesquisadas afectadas pela síndrome em Março expressaram
significativamente menos CYP450, ApoLp e POem janeiro. As abelhas
dependem do CYP450 para a desintoxicação xenobiótica, que
determina sua sensibilidade aos agroquímicos (Manjon et
al.,2018). ApoLp é responsável pelo transporte lipídico,
estando principalmente envolvido na imunidade inata
(Kim & Jin,2015). PO é uma enzima responsável por ativar
a melanogênese, importante mecanismo de defesa dos
insetos, e considerada um indicador de estado de saúde
fortemente influenciado pela dieta (Gonz-alez-Santoyo &
Co. - rdoba-Aguilar,2012). Assim,
não é surpreendente que os padrões de expressão
destes três genes (especialmenteApoLpePO)são tão
notavelmente semelhantes em nossa pesquisa,
sugerindo o envolvimento combinado de três processos
fisiológicos noM. quadrifasciatasíndrome, ou seja,
desintoxicação xenobiótica, imunidade e nutrição.
Embora não tenhamos conseguido detectar resíduos de
agroquímicos nas abelhas afetadas pela síndrome, não
podemos descartar a contaminação por doses subletais
meses antes do surto, como em janeiro. Sabe-se que os
agroquímicos reduzem os níveis de ApoLp nas abelhas
(Nicodemo et al.,2018) e aumentar a sua procura por
alimentos (Balieira et al.,2018). O estresse polínico, por sua
vez, também pode contribuir para o comprometimento do
desenvolvimento e do comportamento (Scofield & Mattila,
2015). Além disso, Janeiro é caracterizado por uma elevada
densidade de polinizadores em geral, incluindoA. melífera,
criando oportunidades para entrar em contato com uma
maior diversidade de patógenos.Melipona spp. o
desenvolvimento leva cerca de 40 dias do ovo ao adulto
(Alves et al.,2009), por issoM. quadrifasciataas forrageiras
amostradas durante o surto em março eram imaturas em
janeiro. Assim, encontramos uma pronunciada perda de
peso das forrageadoras ocorrendo entre janeiro e março,
bem como uma mudança no pólen armazenado pelas
abelhas operárias de Myrtaceae para principalmente Mimosa
bimucronataentre janeiro e fevereiro. Tal mudança pode
resultar da oportunidade de forragearMimosa,que começa a
florescer em fevereiro, mas também da exclusão
competitiva, já queM. quadrifasciataaparentemente compete
comA. melíferapara flores de Myrtaceae (Wilms & Wiechers,
1997).
Curiosamente, dois meses depoisM. quadrifasciata
armazenamento iniciadoMimosa,notou-se uma recuperação
gradual do peso da forrageira. A recuperação das colônias
após o período do surto também é sugerida por um melhor
desempenho das abelhas operárias no controle do
microambiente de seus ninhos, conforme observado pelas
reduzidas diferenças na umidade e temperatura diária das
colônias em abril e maio. A termorregulação do ninho e do
corpo é controlada pelas abelhas operárias através de
comportamentos especializados (Engels et al.,1995; Jones e
Oldroyd, 2006) e parecem ser importantes na criação de um
microambiente para o estabelecimento de simbiontes
(Hammer et al.,2020). Algumas bactérias intestinais parecem
ter um melhor desempenho em temperaturas mais altas e
contribuem para reduzir infecções por patógenos (Palmer-
Young et al.,2019). O efeito da alteração

a termorregulação na manutenção de uma microbiota
intestinal saudável ainda é pouco compreendida nas abelhas
e deve ser investigada também no contexto desta síndrome
das abelhas.
Infelizmente, não se pode descartar que as diferenças na
expressão gênica das abelhas forrageiras observadas em
nosso estudo sejam devidas a diferenças de idade. Sabe-se
que o polietismo etário é uma característica lábil, uma vez
que a diferenciação das forrageadoras das enfermeiras pode
ser acelerada se a colónia enfraquecer (Huang & Robinson,
1999). A realização de estudos invasivos com abelhas sem
ferrão não é simples. Suas colônias são muito menores que
as abelhas melíferas, 300 operárias (Dos-Santos et al., 2014),
e possuem uma estrutura de colmeia diferente, o que leva a
uma série de desafios significativos para a condução de
experimentos evitando os efeitos colaterais da manipulação
excessiva. Por exemplo, coletar 50 forrageadoras de umM.
quadrifasciatacolônia representa a perda de 1/6 de sua
população e interfere significativamente na aptidão da
colônia. Além disso, para aceder às reservas alimentares é
por vezes necessário desorganizar a construção da colmeia,
removendo o invólucro do ninho ou mesmo os favos de cria.
Apesar desses desafios, nossas descobertas orientarão
investigações futuras, talvez em configurações
experimentais mais controladas e com um número maior de
colônias, fornecendo candidatos a preditores de saúde das
abelhas e estressores envolvidos noM. quadrifasciata
síndrome da colônia.
Embora quatro das seis colônias pesquisadas em nosso
estudo manifestassem algum grau dos sintomas da síndrome,
nenhuma delas entrou em colapso durante o período do surto.
Pensamos que os colapsos anuais relatados paraM.
quadrifasciatacolônias no Sul do Brasil poderiam resultar de uma
dependência positiva da densidade influenciada pela
combinação de diversos fatores subletais (Bryden et al.,2013;
Khoury et al.,2011). Por dependência positiva da densidade
queremos dizer que colónias maiores têm menos probabilidade
de sofrer mortes causadas por factores de stress ambiental. Na
verdade, as colónias PA, que foram apenas ligeiramente
afectadas pela síndrome, também tinham rainhas mais jovens
que normalmente produzem mais ovos, resultando numa
população maior. A complexidade das causas por trás do colapso
das colónias de abelhas em todo o mundo exige esforços para
sustentar os serviços de polinização. Com base em nossas
descobertas, sugerimos que práticas como limitar o uso de
agroquímicos nas proximidades de colônias manejadas e
fornecer recursos poliflorais naturais abundantes por meio da
conservação de florestas nativas poderiam ajudar a prevenir o
crescimento anualM. quadrifasciatasíndrome. Além disso,
recomendamos que os apicultores registrem a mortalidade
anual durante o surto da síndrome e selecionem os estoques que
melhor respondem à síndrome, ou seja, colônias com menos ou
nenhuma morte por forrageiras. As recomendações acima são
úteis para o manejo das abelhas em geral e baseiam-se na
premissa de que a saúde dos polinizadores
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não pode ser sustentada com uma visão determinista
estreita.
Agradecimentos
Agradecemos ao apicultor Evald Gossler por disponibilizar seu
meliponário para a pesquisa e por colaborar durante toda a
pesquisa. Agradecemos ao apicultor Gilson Maas por fornecer
amostras de abelhas para nosso estudo e a Charles Fernando
dos Santos por enriquecer as discussões científicas sobre o
comportamento das abelhas sem ferrão. Também estamos
gratos a dois revisores anônimos por suas valiosas sugestões.
Declaração de divulgação
Nenhum potencial conflito de interesses foi relatado
pelos autores.
Financiamento
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo – Pesquisa
do Estado do Rio Grande do Sul; e Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científicoeufico e tecnologia
- gico (FAPERGS/CNPq 12/
2014—PRONEX, protocolo nº 19694.341.13831.26012015, CNPq/
MCTIC/IBAMA/Associação ABELHA nº 400597/2018-7, e CNPq PQ
nº 302121/2017-0). A LC foi apoiada pela Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de N-euNível Superior (CAPES;
Código Financeiro 001).
Aprovação de ética
De acordo com a legislação brasileira, as amostras foram
coletadas com autorização ICMBIO MMA 66382-2 e acesso ao
patrimônio genético pelo registro SisGen A1B8F1F.
ORCIDA
Airton Torres Carvalho http://orcid.org/0000-0003-
3395-4444
Karen Luisa Haag http://orcid.org/0000-0003-1162-0152
Acessibilidade de dados
Os conjuntos de dados de sequenciamento estão disponíveis no NCBI
Sequence Read Archive (BioSamples: SAMN15728692, SAMN15728693
e SAMN15728694). Os dados e o código para todas as análises estão
disponíveis no GitHub (https://github.com/liliancaesar/
Publication_scripts/tree/main/2020_Longitudinal_survey).
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