Quim. Nova, Vol. 31, No.

2, 413-416, 2008

Geisiane Maria Cavalcante Alves, Larissa Arajo Rolim, Pedro Jos Rolim Neto*, Ana Cristina Lima Leite e Dalci Jos Brondani Departamento de Cincias Farmacuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Rua Prof. Arthur de S, s/n, Cidade Universitria, 50740-52 Recife - PE, Brasil Flvia Patrcia Morais de Medeiros Laboratrio Farmacutico do Estado de Pernambuco, Largo de Dois Irmos, 1117, 52171-010 Recife - PE, Brasil Lothar W. Bieber Departamento de Qumica Fundamental, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof. Luiz Freire, s/n, Cidade Universitria, 50740-540 Recife - PE, Brasil Francisco Jaime Bezerra Mendona Junior Departamento de Antibiticos, Universidade Federal de Pernambuco, Rua Prof. Arthur de S, s/n, Cidade Universitria, 50740-52 Recife - PE, Brasil Recebido em 3/1/07; aceito em 21/6/07; publicado na web em 19/12/07

PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF -LAPACHONE AND STABILITY STUDY OF THE CRYSTALS UNDER DIFFERENT STORING CONDITIONS. The -lapachone is a product obtained from the Ip Roxo tree [Tabebuia avellandae], which has proved its excellent antineoplasic potential acting through a particular mechanism of apoptosis against various cancer types. This study aims at determining the identity card of -lapachone by means of physico-chemical and pharmaco-technical characterization. A purifying process has been performed, as well as the isolation of a contaminant, its isomer -lapachone. A stability study was also performed, determining the ideal storing conditions for -lapachone, essential for the ongoing pre-formulation studies for obtaining the different classic pharmaceutical forms and modified release systems. Keywords: -lapachone; characterization and stability study.

INTRODUO A -lapachona (C15H14O3, MM 242,3), conhecida quimicamente por 3,4-diidro-2,2-dimetil-2H-naftol[1,2-b]pirano-5,6-diona, uma ortonaftoquinona de ocorrncia natural isolada do ip-roxo, ou paudarco roxo (Tabebuia avellandae Lor), da famlia Bignoneaceae, que cresce principalmente no Brasil1-4. um produto vegetal simples que tem demonstrado excelente potencial antineoplsico, agindo por um mecanismo particular de apoptose contra diversos tipos de cncer, em especial algumas linhagens de prstata refratrias aos tratamentos convencionais5-8. Est sendo desenvolvido pelo Laboratrio Farmacutico do Estado de Pernambuco LAFEPE, como parte integrante de seu elenco oncolgico, um medicamento base de -lapachona na forma farmacutica cpsula gelatinosa mole. Para isso, de suma importncia a caracterizao fsico-qumica do princpio ativo pois, dessa forma, se estabelece a carta de identidade do produto, possibilitando sua padronizao e avaliao de sua pureza, tornando-o adequado para a realizao de estudos de pr-formulao. Este trabalho relata mtodos especficos para a determinao de pureza da -lapachona e sua caracterizao fsico-qumica e farmacotcnica, por diversas metodologias. MTODOS EXPERIMENTAIS Equipamentos Na purificao dos lotes 402 e 702 de -lapachona foram utili*e-mail: pedro.rolim@pq.cnpq.br

zados uma estufa de secagem Fanem modelo 315/3 e luz ultravioleta Spectroline modelo ENF-240C para revelao das placas cromatogrficas de camada delgada. Para os testes analticos realizados na caracterizao da lapachona lote 103, utilizou-se os seguintes equipamentos: anlises microscpicas microscpio ptico Zeizz Axiolab com cmara acoplada MC 80; ponto de fuso fusimetro Polax WRS1; umidade por perda por incinerao balana Metter Toledo HB43 Hologen Moisture Analyzer, e por Karl Fischer Mettler DL-18; anlise granulomtrica microscpio ptico Lieka Leitz Bimed com objetiva de 40x. O sistema cromatogrfico utilizado para o doseamento consistiu num cromatgrafo lquido de alta eficincia HP (HewlettPackard) Srie 1100 equipado com sistema de bombas quaternrio, degaseificador por ultra-som, detector UV-VIS e injetor automtico, acoplado a um integrador de dados HP 3395 (Hewlett-Packard). A coluna utilizada foi uma Shim-pack 100 CLC(M) ODS (C18) de fase reversa, com 46 mm x 25 cm e partculas esfricas de 5 m de dimetro (Shimadzu). As curvas de calorimetria exploratria diferencial (DSC convencional) foram obtidas num calormetro Shimadzu modelo DSC50 interligado aos softwares Shimadzu TA-60WS/TA-50WS. O sistema de DSC-fotovisual foi constitudo pelo mesmo equipamento utilizado no DSC convencional acoplado a um microscpio Olympus conectado a uma cmara fotogrfica Sanyo de alta resoluo modelo VCC-D520, com imagem interligada ao software Intel Smart Vdeo Record II. As curvas de termogravimetria (TG) foram obtidas numa termobalana Shimadzu modelo TGA-50H. Os espectros de infravermelho (IVTF) foram realizados em

Nota Tcnica

PURIFICAO E CARACTERIZAO DA -LAPACHONA E ESTUDO DE ESTABILIDADE DOS CRISTAIS EM DIFERENTES CONDIES DE ARMAZENAMENTO

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Espectrofotmetro de IVTF Bruker modelo IFS66 (Fourier TranformFT) utilizando pastilhas de KBr. O espectro de varredura no ultravioleta foi obtido em espectrofotmetro Shimadzu UV-VIS 2401 PC. As ressonncias magnticas nucleares protnicas (RMN1H) e de carbono 13 (RMN13C) foram realizadas em espectrmetro Varian, modelo Unity plus-300 MHz, utilizando clorofrmio deuterado (Tedia) como solvente. Para a espectrometria de massa (EM) foi utilizado um espectrmetro Finnigan GCQ Mat tipo quadrupolo on-trap, acoplado a um cromatgrafo a gs HP 5890 Series II. Para o estudo de estabilidade dos cristais foi utilizada uma cmara climtica Fanem modelo 345, dessecador Satelit HS 320 e refrigerador Electrolux modelo R130. Materiais Foram utilizados dois lotes de -lapachona matria-prima, produzidos pelo Departamento de Antibiticos da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), L. 402 e L. 702, e um lote obtido atravs da purificao dos dois lotes anteriores, L. 103. Foi utilizado tambm um padro secundrio de -lapachona produzido pela UFPE, padronizado a partir do padro primrio Sigma Lote 31K1558. Na etapa de purificao foram utilizados etanol P.A., acetato de etila e tolueno (Merck) e placas cromatogrficas pr-fabricadas com camada adsorvente de dixido de silcio poroso sinttico e slica gel 60 F254, depositada em uma lmina de alumnio (Merck). Acetonitrila, grau HPLC (Tedia), gua ultrapurificada pelo sistema Milli-Q Plus (Millipore) e cido actico glacial (Merck) foram utilizados para preparao da fase mvel, amostras e curva controle na realizao dos doseamentos. Membranas tipo HV com 47 mm de dimetro e 0,45 m de dimetro do poro (Supelco) e unidades filtrantes MillexTM tipo HV com 13 mm de dimetro e 0,45 m de dimetro do poro (Millipore), foram utilizadas para filtrao da fase mvel e das amostras, respectivamente. Papel de filtro quantitativo com 125,0 1,0 mm tambm foi utilizado no preparo das amostras (Framex). Processo de purificao Os dois lotes de -lapachona contaminados, L. 402 e L. 702, foram utilizados para obteno de um terceiro lote puro, L. 103. Os lotes contaminados foram solubilizados a quente no solvente utilizado no processo de semi-sntese da -lapachona, etanol PA. Aps recristalizao, os cristais formados foram filtrados a vcuo e colocados em estufa at completa secagem a 80 C. A pureza foi verificada atravs da anlise de cromatografia em camada delgada (CCD). A fase mvel utilizada foi composta de tolueno:acetato de etila (9:1). A revelao das placas foi realizada atravs de luz ultravioleta a 254 nm. O contaminante foi isolado por cromatografia em coluna de slica gel, 70-230 mesh, 60 (Aldrich Chemical) utilizando o mesmo sistema eluente da CCD e foi identificado por espectroscopia de ressonncia magntica nuclear protnica (RMN 1H) e de infravermelho (IVTF). Caracterizao Toda a caracterizao foi realizada com o lote 103 purificado, seguindo as especificaes para cada mtodo. Condies cromatogrficas utilizadas para o doseamento O doseamento foi realizado por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). A fase mvel foi obtida realizando uma mistu-

ra de acetonitrila:cido actico 0,25% (50:50, v/v). A razo do fluxo da fase mvel foi de 2 mL/min, o volume de injeo foi de 20 L utilizando um comprimento de onda fixado em 254 nm. A coluna deve ser mantida a uma temperatura de 25 C. As amostras de -lapachona foram preparadas em acetonitrila com posterior diluio em fase mvel obtendo uma concentrao final de 5 g/mL. Para cada corrida cromatogrfica realizada, foi feita uma curva de calibrao, para obteno das concentraes das amostras do dia. Inicialmente foi preparada uma soluo me de -lapachona padro secundrio em acetonitrila obtendo-se uma concentrao de 10 g/mL. Posteriores diluies em fase mvel foram feitas para obteno das seguintes concentraes: 0,125; 1 e 8 g/mL. Estudo calorimtrico Antes de iniciar as anlises de DSC e DSC-fotovisual o equipamento foi calibrado, em relao temperatura, com os padres ndio (156,6 C 0,2) e zinco (419,5 C 0,3) atravs de seus pontos de fuso. Os fluxos de calor e entalpia foram calibrados com o calor de fuso do ndio (28,58 J/g 0,30) usando as mesmas condies das amostras. O fator de correo foi calculado de acordo com os procedimentos e especificaes da Shimadzu. A curva de DSC convencional foi obtida com uma atmosfera de nitrognio de 50 mL min-1 e razo de aquecimento de 10 C min-1, numa faixa de temperatura de 25 400 C. As amostras foram colocadas em uma clula de alumnio fechada com massa de 2 mg 0,03. As fotos do DSC-fotovisual foram obtidas com razo de aquecimento de 10 C min-1, em uma faixa de temperatura variando entre 25 240 C, com clula de alumnio aberta. A curva TG foi obtida em atmosfera de ar sinttico com fluxo de 20 mL min-1, na razo de aquecimento de 10 C min-1, numa faixa de temperatura de 25 900 C, utilizando os softwares Shimadzu TA-60WS/TA-50WS. A amostra foi empacotada em uma clula de alumnio com massa de 5,12 mg. Caracterizao farmacotcnica As propriedades de compactao da -lapachona foram obtidas atravs da determinao da capacidade de compactao, densidade aparente (dAP) e densidade de compactao (dCP). Este ensaio foi realizado com 100 g de -lapachona em um compactador automtico (desenvolvimento local) provido de uma proveta normatizada. O equipamento promove uma compactao do p atravs de movimentos verticais repetidos na proveta. O volume inicial (V0) ocupado pelo produto foi medido, com posterior medio aps 10 compactaes, necessrias para acomodao do p (V 10), 500 compactaes (V500) e 1250 compactaes (V1250). Ao final das compactaes foi possvel a determinao da capacidade de compactao pela subtrao de V10 - V1250, onde valores acima de 20 mL so considerados inadequados para manipulao de formas slidas, pois dificultariam o enchimento de cmaras ou de cpsulas. A relao entre a massa de -lapachona e o volume ocupado pelo p antes e aps a compactao determinou as densidades aparente e de compactao, respectivamente9. O ndice de Carr exprime em forma percentual a capacidade de compactabilidade e compressibilidade de um p ou granulado. dado pela Equao 1, onde valores entre 5 e 15% so considerados com excelente fluxo10: ICARR (%) = (dCPdAP)*100/dCP (1)

Um ndice similar, de interpretao mais simples, foi proposto por Hausner (1967) (Equao 2), onde valores menores que 1,25

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Purificao e caracterizao da -lapachona e estudo de estabilidade dos cristais

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indicam bom fluxo; valores maiores que 1,5 indicam fluxo ruim; valores entre 1,25 e 1,5 exigem a adio de lubrificantes para melhorar o escoamento10 IHAUSNER = dCP / dAP (2)

Estes ndices so determinaes pontuais, exprimindo apenas o potencial de compactao/compresso, e no a facilidade ou velocidade com que estas ocorrem. Para este tipo de avaliao temos o ngulo de repouso e o tempo de escoamento10. O ngulo de repouso um parmetro que tem como finalidade avaliar a dificuldade que um p tem para fluir livremente atravs de um orifcio para uma superfcie livre. Deixando um p fluir livremente atravs de um orifcio sobre uma superfcie plana ser formado um cone, onde o ngulo da base desse cone chamado de ngulo de repouso, ou seja, a relao entre a altura (h) e o raio (r) do cone formado. Considera-se que um p tem boas propriedades de escoamento quando possui ngulo de repouso igual ou inferior a 30. ngulos superiores a 40 sugerem difcil fluxo9. Esse ngulo foi determinado pelo cone resultante do escoamento de 100 g de p em um funil normatizado, cuja abertura de sada encontrava-se a 20 cm de altura, sobre uma folha de papel milimetrado. Foi calculado o valor mdio de trs determinaes. Paralelamente ao ngulo de repouso, foi determinado o tempo de escoamento, onde resultados acima de 10 s so considerados com tempo de escoamento infinito. Estudo de estabilidade dos cristais Os cristais de -lapachona foram colocados em 5 condies de armazenamento diferentes, com o propsito de monitorar as instabilidades ocorridas em cada condio: temperatura ambiente protegido da luz, temperatura ambiente exposto luz fluorescente, dessecador, refrigerador com temperatura de 2 2 C e cmara climtica com temperatura de 40 2 C e umidade relativa de 75 5%, com o objetivo de aumentar a velocidade de degradao qumica e modificaes fsicas. Os tempos de anlises do estudo foram de 0, 30, 60, 90 e 180 dias e foram realizadas avaliaes macroscpicas, microscpicas, por CCD e por CLAE, com os mesmos parmetros utilizados anteriormente11. RESULTADOS E DISCUSSO Processo de purificao Na anlise de CCD da -lapachona, Rf 0,25, foi possvel verificar a diferena de pureza entre as amostras antes e aps o processo de purificao, atravs da observao da presena de contaminao pelo ismero -lapachona, com Rf de 0,50, originado no processo de semi-sntese no padronizado da droga, que foi identificado por espectroscopia de RMN 1H e de IVTF, estando de acordo com a literatura12,13. Foram necessrios trs ciclos de recristalizao para obteno de uma matria-prima livre de -lapachona, quando analisada por CCD. Caracterizao A -lapachona possui uma forma bem definida de cristais aciculares, laranja-avermelhado, visveis a olho nu (Figura 1). Os cristais observados no microscpio ptico para anlise granulomtrica tinham um tamanho praticamente uniforme, originando um tamanho mdio de 233,1 m como observado na Figura 2.

Figura 1. Microscopia ptica dos cristais de -lapachona na objetiva 4x

Figura 2. Grfico da anlise granulomtrica

A umidade residual encontrada no Karl Fischer foi de 0,4247%, enquanto que a encontrada pela perda por dessecao foi de 0,36%. Esses resultados indicam que a -lapachona possui uma boa proteo contra alteraes que possam ser provenientes de uma higroscopicidade elevada, como o caso de hidrlises. O teste de metais pesados foi realizado seguindo os mtodos gerais da Farmacopia Brasileira IV, estando de acordo com a especificao colorimtrica14. O doseamento por CLAE comprovou mais uma vez a pureza da substncia, obtendo-se um cromatograma com apenas o pico caracterstico da -lapachona, com um teor de 100,77% e tempo de reteno de 6,9 min. A curva de DSC mostrou um pico endotrmico caracterstico de fuso em 155,46 C, com um calor de fuso de 91,01 J/g e pureza de 99,67%, evidenciando uma boa qualidade do processo de purificao da droga. Houve duas etapas de perda de massa detectadas pela curva da TG, a primeira com perda percentual de 70,6% e a segunda com 26,8%. Em seguida, ocorreu um processo de decomposio iniciado a 191 C e finalizado em 250 C, confirmado pelo DSC-fotovisual. A faixa de fuso da droga tambm foi confirmada pelo DSC-fotovisual nas temperaturas de 154,0 a 156,0 C, estando de acordo com a literatura e com a anlise realizada em fusimetro que apresentou valores de 154,5 a 155,4 C 13. As anlises da -lapachona por espectroscopia de infravermelho (IVTF), de ressonncia magntica nuclear protnica (RMN 1H) e de carbono 13 (RMN 13H) e espectrometria de massa (EM) e ultravioleta confirmaram a pureza e estrutura do composto atravs de seus picos, absores e fragmentaes caractersticas12,13. O espectro de IVTF da amostra de -lapachona apresentou banda de absoro caracterstica de deformao axial de C-H aromtico e aliftico na regio de 2977 e 2909 cm-1, respectivamente. Verificou-se a presena de harmnicas de combinao entre 2000 e 1800 cm-1 e de banda em 1591 referente deformao axial C=C do anel. Podem ainda ser destacadas duas bandas na regio de 1313,7 e 1117,0 cm-1 correspondentes s respectivas deformaes axial assimtrica e simtrica de C-O-C. Foi observado tambm o sinal na regio de 1694 cm-1 atribudo banda de deformao axial de

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C=O; esta banda de absoro situada numa freqncia menor pode ser explicada pela forte influncia do ngulo de ligao do anel que contm a carbonila. No caso da -lapachona o ngulo menor que 120 graus12,13. A partir da anlise de RMN 1H da amostra foi observado um singleto em 1,448 ppm corresponde aos dois grupos metilnicos. Os prtons dos dois grupos metilnicos do ster cclico so encontrados na forma de tripleto em 1,84 e 2,554 ppm, respectivamente. Os prtons referentes ao anel aromtico so encontrados como duplo dupleto em 8,034 ppm (mais desblindado pela proximidade com a carbonila), 7,988; 7,63 e 7,488 ppm. O espectro de massa da amostra de -lapachona analisado revela o pico do on molecular (M++1) em m/z 242g/mol, com 14% de abundncia relativa. O pico de base em m/z 159 refere-se a fragmento inico proveniente da abertura e rearranjo do ciclo com perda da parte aliftica e de C=O. A varredura espectrofotomtrica por absoro ultravioleta mostrou um espectro idntico ao obtido na literatura, com pico de absoro mxima em 256,00 nm15. A -lapachona demonstrou uma capacidade de compactao de 6 mL, com densidade aparente e de compactao de 0,54 e 0,57 g/mL, respectivamente. Em relao determinao do ndice de Carr e do ndice de Hausner os valores obtidos foram ICARR = 5,26% e IHAUSNER = 1,06. O resultado encontrado para a tangente entre altura e raio formado pelo escoamento do p formou um ngulo de 28,73 com um tempo de escoamento de 7,66 s. Estes valores indicam que apesar da forma cristalina, a -lapachona apresenta propriedades de fluxo e compactao adequadas para desenvolvimento farmacotcnico. Estudo de estabilidade dos cristais Foi verificada uma instabilidade dos cristais expostos luz fluorescente com mudana da cor de laranja para vinho logo com 30 dias de estudo. Essa colorao se intensificou com o passar do tempo. Ao atingir 180 dias de estudo foram realizadas anlises de RMN 1H, RMN 13C e IVTF, onde ficou comprovado que havia ocorrido apenas uma alterao fsica de cor, sem alteraes qumicas detectveis pelos mtodos utilizados. Os cristais submetidos s outras condies de armazenamento no sofreram alteraes visveis. Microscopicamente no houve diferena entre a morfologia dos cristais nas condies de armazenamento do estudo realizado nos tempos avaliados. Atravs da anlise de CCD foi possvel perceber que em todas as condies estudadas no houve degradao das amostras em qualquer outra substncia capaz de ser identificada atravs do sistema utilizado, apresentando somente uma mancha com fluorescncia laranja caracterstica da -lapachona, com Rf de 0,25. As anlises realizadas por CLAE demonstraram que no houve diferenas significativas entre as condies de armazenamento e os tempos avaliados, quando tratadas estatisticamente por anlise de varincia two-way, pois o F calculado foi menor que o F crtico com um intervalo de confiana de 95% (Tabelas 1 e 2). No houve diferena entre os cromatogramas das anlises por CLAE, apresentando apenas o pico caracterstico da -lapachona como demonstrado no doseamento. CONCLUSO Os resultados obtidos mostram que o mtodo de purificao utilizado satisfatrio para a obteno de uma matria-prima com

Tabela 1. Resultados do estudo de estabilidade dos cristais de lapachona em diferentes condies de armazenamento Tempo/ Temp. Dessecador Refrigerador Cmara Exposto Condies Ambiente Climtica Luz (g/mL) (g/mL) (g/mL) (g/mL) (g/mL) T0 T30 T60 T90 T180 5,003 5,045 5,026 5,070 5,022 5,091 5,056 5,046 5,065 5,060 5,039 5,046 5,088 5,045 4,988 5,086 5,060 5,075 5,021 4,988 5,031 5,042 5,074 5,049 5,034

Tabela 2. Tratamento estatstico por anlise de varincia two-way do estudo de estabilidade dos cristais de -lapachona Fonte de Variao Tempo Condies Residual MQ 0,001327 0,002496 0,000705 F calculado 1,18837 0,8857 F crtico 3,007 3,007

alta qualidade de pureza, comprovada atravs da CCD, que possibilita a separao do ismero -lapachona, um contaminante para a amostra em estudo. Dependendo da concentrao de contaminao torna-se necessria a repetio do processo para a obteno de uma matria-prima pura. O sistema eluente utilizado possibilitou a separao das duas substncias, sendo possvel a identificao da -lapachona como contaminante. A matria-prima purificada apresentou-se com padres de qualidade para ser utilizada no processo de obteno de uma forma farmacutica. O estudo de estabilidade dos cristais de -lapachona mostrou que no houve diferena entre as condies avaliadas, com exceo da amostra submetida exposio luz, que causou uma instabilidade fsica de colorao, devendo-se assim recomendar manter o produto sempre armazenado em frasco mbar para evitar este desvio de qualidade. REFERNCIAS
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