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ficante da molécula de DNA, responsável

MEDICINA NO SÉCULO XXI pela síntese de uma única proteína, dando


origem ao postulado “um gene, uma
MONOGRAFIA - I enzima”. Dessa forma, os genes passaram
Genética Molecular - Conceitos Gerais a ser considerados unidades invioláveis
Iuri D. Louro, MD. PhD. & Sandra Galeotti, MS de processamento de informação genética
– exceto pelos casos de mutações oca-
Introdução sionais. Acreditava-se também haver uma
quase completa incompatibilidade entre
O rápido acúmulo de novos os genomas de diferentes espécies.
conhecimentos no campo da Genética e a
crescente ênfase nos aspectos moleculares No entanto, o crescente número de
envolvidos na etiologia e etologia de descobertas da Biologia Molecular,
diversas doenças, assim como no desen- apoiada por novas técnicas e novos
volvimento de novas abordagens terapêu- recursos tecnológicos, gradualmente
ticas e diagnósticas, exige que o médico e desafiou esse modelo, através de novas
o estudante de Medicina atualizem-se evidências que não se enquadravam no
rapidamente, para acompanhar os desen- postulado vigente: o genoma parecia cada
volvimentos da Medicina do século XXI. vez menos estável e menos inviolável. A
Contribuir para que isso aconteça, é nosso descoberta dos transposons, que promo-
objetivo. Independente da especialidade vem a recombinação gênica, por Barbara
de atuação ou interesse do leitor, certos McClintock, representou um dos princi-
conhecimentos e conceitos são indis- pais desafios à idéia de gene estável. Em
pensáveis à compreensão da medicina 1988, Elizabeth Blackburn e Carol
contemporânea. Esta primeira monografia Greider descobriram a enzima telomerase,
abordará, portanto, os conceitos gerais da ao mesmo tempo em que outros pesqui-
Genética Molecular, com o objetivo de sadores constataram a impossibilidade de
facilitar a leitura das monografias que se se estabelecer limites definidos para os
seguem. sítios onde um gene termina, devido às
bordas sobrepostas de muitos genes
A genética mendeliana ocupou-se (sliding edges), aumentando o desafio à
do estudo de características herdadas e do validade do postulado genético clássico.
comportamento de transmissão das mes-
mas, determinando os conceitos de traços Os íntrons, segmentos aparen-
dominantes e recessivos. Mas somente no temente não codificantes do DNA, que se
início do século XX a Genética Mende- acreditava não possuírem nenhuma fun-
liana foi redescoberta, estabelecendo-se ção fisiológica importante, em contra-
assim a idéia de genes como unidades de posição aos éxons (segmentos codifi-
herança. A seguir, os vários anos de cantes), também desafiaram o modelo
pesquisa da molécula de DNA realizados vigente, revelando-se como agentes
por Rosalind E. Franklin, no King’s controladores do splicing de éxons no
College, possibilitou a Watson e Crick, pré-RNA mensageiro e, possivelmente,
auxiliados por Jerry Donahue, o servindo como sítio de amortização
desenvolvimento do esboço estrutural, em mutacional. Curiosamente e à excessão
1953, de duplo filamento da molécula de da regra, um sítio de transcrição ativa,
DNA, dispostos em forma helicoidal ou identificado no homem e no camun-
dupla hélice. A partir de então, o gene dongo como U22, revelou-se como um
passou a ser visto como um sítio codi- gene pelo avesso, pois demonstra
inatividade traducional de seus éxons no pela redundância funcional de diversas
RNA maduro, enquanto seus íntrons enzimas. Em outras palavras, além de
traduzem o transcrito snoRNA, cons- uma certa proteína estar envolvida em
tituinte do RNA de nucléolos. No caso diversas funções diferentes (pleiotro-
do U22, portanto, os éxons são inativos e pismo), um grande número de proteínas
os íntrons proces-sados durante o splicing pode também executar uma mesma
são codificantes ativos função (redundância).

O postulado “um gene, uma Descobertas recentes modificaram


enzima”, acabou por perder sentido, também a visão que tínhamos das proteí-
frente à descoberta do processo de nas, através da constatação da habilidade
splicing ou arranjo alternativo, que de certas proteínas não enzimáticas em
permite a síntese de mais de uma versão reconhecer sítios específicos no DNA
protéica (isoformas de uma mesma e/ou em outras proteínas. A identificação
proteína), com funções às vezes com- da estrutura modular das proteínas, com
plementares e às vezes antagônicas às cada módulo constituindo um domínio
demais isoformas. A grande variância na diferente e com funções específicas,
expressão e intensidade fenotípica da facilitou a compreensão da função dos
doença em diferentes portadores de uma receptores transmembrana, bem como de
mesma síndrome monogênica, indica o proteínas citoplasmáticas estratégica-
provável papel da interação gene - meio mente localizadas em regiões específicas
ambiente, assim como a participação de do citosol. O citoplasma celular, uma vez
outros genes ou de diferenças poli- já considerado um “saco amorfo de
mórficas. enzimas”, revelou-se ao final do século
XX um microambiente altamente estru-
Estes poucos exemplos podem dar turado de organelas e vias de sinalização,
uma idéia das diferenças marcantes entre conduzindo sinais que viajam em direção
a visão da Genética Mendeliana Clássica ao núcleo, através da mediação de
e da Genética Molecular. O gene mole- diversas proteínas amplificadoras de
cular é melhor descrito como um sítio ou sinal.
locus transcricional ativo - que atua por
meio da transcrição de produtos sob a Uma vez pincelado esse pano-
forma de RNA que podem ser traduzidos rama, vamos passar a uma revisão dos
em proteínas ou não. Assim como o conceitos hoje conhecidos através da
conceito da Física Clássica de tempo e Genética e Biologia Moleculares, sob o
espaço foi mudado pela introdução da enfoque de suas implicações para o
inseparabilidade do continuum tempo- clínico na Medicina do Século XXI.
espacial da Teoria da Relatividade e pelas
descobertas da Física Quântica, a noção Genes - Transcrição e Tradução de
de estrutura e função, uma vez vistas na Produtos Gênicos
Biologia como entidades separadas,
tornaram-se praticamente sinônimos na A unidade básica da molécula de
visão da Biologia Molecular, podendo ser DNA são os nucleotídeos, constituídos
expressas como uma unidade estrutura- por uma base nitrogenada, um açúcar
função. A noção de que cada proteína ou (ose) e um grupo fosfato. As bases
enzima possuía uma função específica nitrogenadas incluem duas purinas –
única, foi também transformada pela guanina e adenina (G e A) – e duas
descoberta de um amplo pleiotropismo e pirimidinas – timina e citosina (T e C) -
que formam pares complementares A-T e às quais a enzima polimerase se liga para
C-G. Na molécula de RNA, a base timina iniciar a transcrição gênica.
é substituída por outra base nitrogenada, a
uracila (U). Os dois filamentos da Quando a expressão de um gene é
molécula de DNA são pareados de forma ativada, seus éxons são transcritos para
complementar através de pares de núcleo- um molde (template) de pré-RNA e este
tídeos formados entre os dois filamentos e processo - conhecido como splicing (do
ligados por pontes de hidrogênio. Duas Inglês, to splice = unir pontas soltas) - é
pontes de hidrogênio ligam os pares responsável pela eliminação dos íntrons.
adenina-timina (A-T) e três pontes de No RNAm (RNA mensageiro) ocorre a
hidrogênio ligam os pares citosina- substituição das timinas por uracilas
guanina (C-G). (Figura 1). Este processo acontece no
núcleo celular, sendo a seguir o RNAm
Os sítios ou loci codificantes da transportado para o citoplasma, onde os
molécula de DNA constituem os genes, ribossomas processam a tradução do
que são formados por pares de bases (pb) produto gênico em uma proteína. Cada
ou seqüências nucleotídicas, em quanti- códon é traduzido como um aminoácido
dades que variam de algumas centenas a específico que fará parte da cadeia poli-
milhares de bases (Kb). As regiões peptídica que está sendo polimerizada.
codificantes de um gene são transcritas Muitas proteínas passam por um proces-
para o RNA mensageiro. Elas são samento pós-tradução, com o acréscimo
formadas por seqüências de três pares de de outros grupos à molécula, assim como
base chamadas códons, e constituem os cortes na sequência de aminoácidos, de
éxons; enquanto as regiões que são forma a promover sua conformação final
excisadas durante a transcrição são e funcional. Em muitos casos, a forma
chamadas íntrons. Os íntrons ainda são final da proteína apresenta propriedades
uma grande incógnita, podendo, em físicoquímicas bem diferentes do produto
alguns casos, possuir funções reguladoras inicialmente traduzido. A transcrição
da transcrição ou, como no já citado gene gênica é realizada no sentido 5’ ! 3’ de
pelo avesso U22, serem eles próprios as cada filamento de DNA, os quais estão
seqüências codificantes. Por outro lado, pareados de forma antiparalela; i.e., um
segmentos do DNA que funcionam como filamento 5’ ! 3’ está pareado a um
íntrons em um determinado gene podem filamento 3’ ! 5’.
agir como éxons em outros genes adja- Figura 1. Transcrição – Acontece dentro do
centes durante o splicing. Alguns autores núcleo celular
consideram a possibilidade dos íntrons DNA ➜ 5’… AGG TCC TAG TAA ...3’
(sentido da transcrição)
serem sítios de amortização mutacional, "
protegendo assim os genes da maioria das Pré-RNA ➜ 3’… TCC AGG ATC ATT …5’
alterações genéticas. A identificação de (transcrito de éxons na cadeia molde)
"
um gene é tarefa difícil e atualmente feita RNAm ➜ 5’… AGG UCC UAG UAA …3’
por algorítimos de computadores. É (seqüência de códons prontos para tradução)
necessária a localização de elementos
característicos como um promotor, um As isoformas das proteínas são
códon iniciador presente no quadro de geralmente resultantes do splicing alter-
leitura, com um códon de término, assim nativo que ocorre durante a transcrição,
como sítios doadores e aceptores de mas também podem ser fruto de modifi-
splice. Promotores são regiões do DNA cações pós-tradução. No splicing alterna-
tivo, um evento até hoje observado
apenas em células eucariótas, uma para o seqüenciamento do genoma
sequência diferente de códons é formada humano, levou à diversos desafios e a um
no RNAm, determinando a tradução de aumento exponencial de novos termos
uma cadeia polipeptídica alternativa. técnicos, hoje utilizados nos textos cientí-
ficos de Biologia e Medicina. É nosso
A tradução de proteínas é rea- objetivo esclarecer o conceito subjacente
lizada no citoplasma pelos ribossomas, a esses novos termos, para facilitar a
que são pequenas organelas concentradas leitura da literatura atual e a compreenção
no retículo endoplasmático rugoso - ou de conferências e seminários. A análise
sob forma de polissomas no citoplasma de elementos promotores de transcrição é
das células eucariótas. Ribossomas são um recurso utilizado na identificação de
compostos por 2 subunidades de RNA novos genes, em associação com a
ribossômico (RNAr), uma pequena e a detecção da presença de códons de ini-
outra grande (em humanos, 18S e 28S, ciação e de terminação in frame, assim
respectivamente) e várias proteínas espe- como os sítios doadores e aceptores de
cíficas a cada subunidade ribossômico. O splicing. As seqüências potencialmente
RNA mensageiro é processado através de codificadoras encontradas em tal região
um fenda entre as duas subunidades de são denominadas ORFs (Open Reading
RNAr, enquanto o RNA transportador Frames ou quadros de leitura abertos).
(RNAt) atua como adaptador, posi-
cionando os aminoácidos em alinhamento Por meio da reação de trans-
com seus códons correspondentes no criptase reversa e PCR (Polymerization
RNAm. O RNAt associa-se ao RNAm Chain-Reaction), foi possível criar uma
formando um anticódon complementar, biblioteca de genes compostos apenas por
que promove a correta ligação seqüencial éxons, denominados DNAc. O DNAc é o
dos aminoácidos, segundo a ordem DNA obtido a partir de RNAm, após a
estabelecida no RNAm. Tal correspon- conversão pela transcriptase reversa. Tal
dência entre códons e anticódons é deno- biblioteca permite o estudo da expressão
minada colinearidade. O processo de gênica, auxilia na identificação de novos
tradução é iniciado por um códon genes e serve como base de dados para o
iniciador (AUG) e finalizado por um dos estudo comparativo da função de novos
três códons de terminação (UAG, UAA, genes identificados.
UGA). Além dos códons de iniciação e
terminação da tradução, o RNAm apre- Através da clonagem e sequen-
senta uma sequência líder que antecede o ciamento das bibliotecas de DNAc é
códon de iniciação e uma sequência final possivel identificar a sequência de partes
(trailer sequence) após o códon de de genes expressos por um grupo celular,
terminação. Uma vez terminada a tradu- mesmo que muitos dos genes sejam ainda
ção do polipeptídeo, a proteína é dês- desconhecidos. Esta idéia inspirou um
ligada do complexo ribossoma/RNAm e projeto do governo americano que gerou
passa a ser processada através de diversos um banco de dados de ESTs (Expressed
processos bioquímicos para assumir sua Sequence Tags ou rótulos de seqüências
conformação funcional. expressas). Existem ESTs derivadas de
populações de células específicas – tais
Estados Gênicos, Genes e Pseudogenes como um determinado tecido, órgão,
estágio de desenvolvimento embrionário,
O esforço internacional do tumores e de linhagens celulares. Os
Consórcio Projeto Genoma Humano, resultados atuais da análise seqüencial do
genoma dividiram os genes em cinco um domínio funcional de uma
categorias: proteína conhecida e que determina
uma função específica, tal como
Categoria 1: Genes já identificados domínios de imunoglobulinas, SH2,
anteriormente e divulgados através da tirosina, zinc fingers (i.e., proteínas
literatura ou de bancos de dados públicos. com dedos de zinco), etc.

• Subcategoria 1.1: Genes comple- • Subcategoria 3.2: Genes com amino-


tamente identificados, com função ácidos semelhantes a domínios de
definida (i.e., fator de crescimento, uma proteína conhecida, porém com a
fator transcricional, GAPDH, cinase, função de tais domínios ainda desco-
citocinas, etc.). nhecida.

• Subcategoria 1.2: Genes com identi- Categoria 4: Novos genes definidos


ficação completa em um DNAc, apenas através de técnicas preditivas de
porém com função desconhecida. bioinformática, denominados genes su-
postos ou preditos, sem nenhuma
Categoria 2: Novos genes apresentando semelhança com proteínas ou motivos
semelhanças ao DNAc de qualquer protéicos conhecidos.
organismo.
• Subcategoria 4.1: Genes putativos
• Subcategoria 2.1: Genes similares ou constituídos por dois ou mais éxons
apresentando homologia a um outro já localizados dentro de uma região com
caracterizado de qualquer outro orga- menos do que 20.000 bases (< 20 Kb)
nismo, com uma identidade na que demonstram similaridade com
seqüência de aminoácidos entre 25 e éxons de ESTs. Esta subcategoria
100%. Esta subcategoria define novos possui maior potencial codificante do
membros de famílias de genes huma- que as categorias seguintes.
nos, bem como ortólogos ou homo-
logos humanos de genes da levedura • Subcategoria 4.2: Genes supostos que
Caernorhabditis elegans, camun- mostram grande semelhança a ESTs
dongo, Droso-phila melanogaster e mas não são preditos pelos programas
de outros organismos. de predição de éxons.

• Subcategoria 2.2: Genes apresen- • Subcategoria 4.3: Genes supostos


tando semelhanças com uma ORF preditos através de padrões con-
hipoteticamente predita em uma sistentes de éxons sem nenhuma
seqüência genômica de um outro semelhança a ESTs.
organismo, mas que ainda aguarda
validação experimental. Categoria 5: Pseudogenes - Seqüências
que perderam sua capacidade trans-
Categoria 3: Esta categoria reúne os cricional ou apresentam níveis insigni-
genes com similaridades com a seqüência ficantes de transcrição, por razões como:
de aminoácidos confinada a uma região a), ausência de íntrons b), presença de
de uma proteína conhecida. códons de terminaçào no interior da ORF;
e c), inserções ou deleções de seqüências
• Subcategoria 3.1: Genes com uma que interrompem a ORF.
seqüência de aminoácidos similar a
Características Gerais do DNA de coli, o DNA humano contém apenas 10
Mamíferos vezes mais genes do que o DNA desta
bactéria. Isto provavelmente se explica
Ao contrário do que se pensava, o pelo fato de grande parte da molécula
sequenciamento de todo o genoma humana não conter genes, mas sim
mostrou que os genes não se encontram seqüências repetidas e segmentos não
aleatoreamente distribuídos pelo geno- codificantes, como supra mencionado,
ma, mas parecem estar agrupados em além daquelas que constituem os telo-
determinados locais. Estes grupos meros, nas extremidades de cada
encontram-se separados por longos cromossoma. Os telômeros conferem
trechos de DNA sem conteúdo gênico. estabilidade ao cromossoma e protegem o
Ainda mais claro está o agrupamento de material genético contra eventuais fusões
alguns aglomerados de genes perten- cromossômicas aberrantes durante a
centes à mesma família, como por replicação do DNA.
exemplo, os genes da família HOX. Os
genes podem ter um número variado de Muitas das seqüências repetidas
cópias, desde uma única cópia por encontradas no DNA humano são
genoma haplóide a milhares de cópias, repetições simples, do tipo ACACACAC
dependendo do gene. Por exemplo, genes ou CGCGCGCG e supõe-se que sejam
codificando RNAr apresentam entre 150 e formadas por erros durante a replicação
200 cópias, enquanto os genes codifi- do DNA. Elas podem ser encontradas nos
cantes de histonas possuem até 1.000 centrômeros e telômeros ou espalhadas
cópias. No entanto, a maioria dos genes pelo genoma. Com excessão dos telo-
humanos apresenta apenas uma única meros, cujas seqüências curtas, repetidas
cópia em cada alelo. até 10.000 vezes, estabilizam a molécula
de DNA e preservam a integridade de
Várias seqüências altamente genes funcionais, as demais repetições
repetidas estão presentes no DNA de não possuem função conhecida, embora
mamíferos, tais como SINES (Short repetições longas possam ativar ou
Interspersed Sequences), LINES (Long desativar genes e causar doenças, como a
Interspersed Sequences), elementos ALU LTR denominada L1, envolvida na
(um tipo de SINES), LTR (Long inativação de genes em vários tumores.
Terminal Repeats). De fato, essas
seqüências repetidas ocupam aproxi- Repetições moderadas,
madamente 50% do DNA humano e, geralmente constituídas por fragmentos
quando somadas às seqüências não codi- de DNA viral e não mais codificantes,
ficantes, constituem cerca de 98% da representam cerca de 45% do DNA
molécula. Em outras palavras, apenas 2% humano. Seqüências Retrovirais
do DNA humano codifica produtos Endógenas (SRE ou ERVs –
funcionais. Os resultados das pesquisas Endogenous Retroviral Sequences) que
do Projeto Genoma Humano, publicadas codificam uma enzima transcriptase
em fevereiro de 2001, revelam que as reversa funcional também são
estimativas anteriores sobre o número de encontradas com freqüência. Esta enzima
genes em humanos foi superestimada converte RNA em DNA, permitindo
(70.000 a 100.000 genes). A estimativa assim a integração de se-qüências
atual oscila entre 35.000 e 55.000 genes. retrovirais ao genoma humano. Como
Embora nosso DNA seja 1.000 exemplo, podemos citar os retransposons,
vezes maior do que o DNA da bactéria E. ERVs, LTRs, e LINES. Alguns
transposons parecem ser herança de diferentes executarem a mesma função. A
infecções bacterianas, promovendo a redundância funcional não deve ser
acumulação gradual desses elementos no confundida com a homologia gênica.
DNA, ao longo da evolução dos mamí- Genes homólogos são aqueles que
feros, devido a múltiplos episódios infec- possuem, em diferentes espécies, grande
ciosos. similaridade entre si, na sequência de
seus nucleotídeos. Por exemplo, os genes
Os elementos ALU são SINES Homeobox, que controlam a embriogê-
com um comprimento aproximado de 300 nese e são uma seqüência evolucio-
pb e são denominadas ALU por possuí- nariamente conservada em vários mamí-
rem sítios para a enzima de restrição ALU feros, inclusive no homem.
em ambas as extremidades. As enzimas
de restrição são endonucleases que reco- Alguns genes são responsáveis por
nhecem seqüências palindrômicas (i.e., funções essenciais à manutenção de quase
recorrentes) curtas de nucleotídeos e todos os tipos celulares, sendo, portanto,
cortam a fita de DNA geralmente dentro denominados genes zeladores (house-
deste palíndromo. Uma região palindrô- keeping genes), como por exemplo a
mica caracteriza-se por uma cadeia actina gama, o citocromo p450, as
polinucleotídica onde uma seqüência de ATPases, a glutationa-S-transferase e a
bases é seguida por uma série de bases N-acetil-transferase.
que permite o pareamento complementar
das duas fitas, quando a nova molécula de Outra classe de genes, essencial à
DNA é novamente enrolada. As LTRs preservação da integridade do genoma,
constituem seqüências repetidas em codifica produtos envolvidos na detecção
tandem (i.e., enfileiradas, uma atrás da de alterações no DNA, constituindo o
outra) nas extremidades do genoma dos sistema intra-celular de reparo a danos
retrovírus e seqüências similares, encon- ao DNA. O DNA está sujeito a danos
tradas no genoma humano – provavel- tanto de natureza exógena (mutágenos
mente resultantes da integração de químicos ambientais, radiação UVA e
seqüências virais. UVB, infecções, inflamações crônicas,
etc.), quanto endógena (metabólitos
Classificação Funcional de Genes genotóxicos resultantes da ação natural
do metabolismo enzimático, deficiências
Uma outra classificação de genes nutricionais, radicais livres etc).
refere-se às funções por eles desempe-
nhadas. No entanto, diversos genes Os genes de receptores de
apresentam diferentes graus de pleio- membrana codificam dois tipos de
tropia e/ou de redundância funcional. A receptores: os receptores catalíticos e os
pleiotropia diz respeito à observação de não-catalíticos. A maioria dos receptores
mais de um efeito causado por um dado de membrana não é catalítica, mediando o
produto gênico. Tal efeito pleiotrópico sinal químico regulador da atividade de
pode variar em diferentes circunstâncias várias proteínas em uma seqüência de
do microambiente celular ou pode se eventos que termina por produzir um
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expressar como efeitos diferentes em sinal intracelular como o Ca ou o AMP
diferentes tecidos, indicando, assim, a cíclico. Os receptores catalíticos são
especificidade tecidual de cada efeito. A glicoproteínas transmembranas que pos-
redundância funcional define a capaci- suem uma estrutura protéica modular
dade de produtos derivados de genes complexa, com uma “cauda” que penetra
no citosol. Na superfície, possuem um Os genes que codificam fatores
sítio de ligação específico para um transcricionais têm como produto
determinado ligante extracelular, tal proteínas necessárias para a iniciação da
como um fator de crescimento ou um transcrição, que não sejam da família das
hormônio. Na porção imersa no citosol, enzimas polimerase. Os fatores de trans-
apresentam um domínio contendo enzi- crição atuam de diversas formas durante a
ma, além de outros domínios de ligação iniciação da transcrição, podendo intera-
proteína–proteína, que podem servir para gir com a RNA polimerase ou com o
amplificar o sinal. Uma vez que o ligante complexo iniciador inteiro, ou ainda, com
ocupe o receptor, pode ocorrer a outras moléculas ativadoras ou com o
dimerização de dois receptores catalí- próprio DNA. Fatores transcricionais são
ticos, ativando o domínio enzimático e classificados de acordo com sua atividade
apresentando sua enzima a outras proteí- em três grupos: 1, Fatores Gerais de
nas alvo, presentes no citosol. A ativação Transcrição, 2, Ativadores de Transcrição
do receptor desencadeia, portanto, uma e 3, Co-ativadores.
série de respostas intracelulares que são Os Genes Repressores de
mediadas por proteínas não catalíticas, Expressão Gênica são codificadores de
cujo objetivo é a transdução do sinal uma classe especial de fatores de não-
para o núcleo celular; i.e., um sítio transcrição. Em vez de estimularem a
específico do DNA a ser ativado. Em transcrição, atuam negativamente, ini-
outras palavras, a cascata de sinais bindo-a. Alguns fatores de transcrição
desencadeada por um receptor ativado podem fazer as duas coisas - estimular ou
visa ou a ativação de um gene (ou de um inibir - dependendo das circunstâncias ou
aglomerado de genes da mesma família) da presença de outras determinantes pre-
no DNA nuclear ou, ainda, a indução do sentes no microambiente celular.
processo de replicação do DNA –
dependendo do tipo de receptor ativado. Por fim, fatores de transcrição
alterados por mutações podem perder a
Figura 3. Ação de proteínas modulares de capacidade estimulatória, ligando-se ao
ligação p-p em receptores catalíticos ativados DNA com eficiência, mas sem executar
sua função indutora de transcrição.
Freqüentemente nestes casos, uma cópia
alterada de um fator de transcrição é
capaz de inibir a função da cópia intacta,
por competir pelo mesmo sítio de ligação.

Os Genes de Fatores de
Crescimento codificam polipeptídeos que
promovem o crescimento celular através
da interação com receptores celulares
específicos e são geralmente produzidos
por genes ativamente expressos em outras
células ou órgãos, sendo por isso
denominados ligantes extra-celulares.
Por exemplo, os hormônios hipofisários,
tal como o hormônio tireotrófico - que
ocupa receptores catalíticos em células da
tireóide, estimulando a proliferação proliferação celular, com o conse-
celular - e o hormônio de crescimento, qüente crescimento descontrolado de
responsável pelo crescimento ósseo e pela células em um dado tecido ou órgão,
síntese protéica em diversos tecidos, o que resultará em displasias e/ou
durante a infância e puberdade – além de tumores malignos.
atuar na reparação de tecidos, durante
toda a vida do organismo. b. Oncogenes: Genes cujos produtos
Outros exemplos de fatores de respondem aos estímulos enviados
crescimento são: Fator de Crescimento por receptores ativados por hormônios
Epidérmico (Epidermal Growth Factor - ou por fatores de crescimento -
EGF), Fator de Crescimento de Fibro- promovendo o crescimento e a
blasto (Fibroblast Growth Factor - FGF), progressão do ciclo celular em direção
Fator de Crescimento Derivado de à mitose. São também considerados
Plaquetas (Plaquette-Derived Growth oncogenes aqueles cujos produtos
Factor - PDGF), Fator de Crescimento possuem a função de amplificar e
Semelhante à Insulina (Insulin-like sustentar o estímulo pró-mitótico,
Growth Factor - IGF). necessário para que uma das fases do
ciclo celular se complete.
Os assim chamados genes estruturais
codificam a estrutura primária de proteí- Inicialmente, os oncogenes eram
nas de membrana, enzimas, actina do considerados formas mutadas de proto-
citoesquelesto, colágeno, elastina e outros oncogenes, mas são atualmente reco-
produtos necessários à morfologia nhecidos como qualquer gene – mutado
estrutural/funcional de células, tecidos e ou não, super expresso ou não – capaz de
órgãos. induzir a formação de tumores, alterar os
padrões de expressão gênica ou inibir
Os Genes de Controle do Ciclo outros genes de regulação da proliferação.
Celular são de duas diferentes classes e Essas alterações podem incluir as
estão envolvidos diretamente no processo seguintes mudanças nos padrões de
de proliferação celular: expressão gênica: 1, aumento anormal
dos níveis de seus produtos na célula; 2,
a. Genes Supressores de Tumor: atuam a expressão do oncogene em tecidos nos
no controle da divisão celular, quais não deveria ser expresso; 3,
prevenindo a proliferação celular aumento do número de cópias do
excessiva, evitando assim a formação oncogene (amplificação gênica); 4,
de displasias e tumores. A perda de mutações estruturais no próprio
função desses genes ou a inibição de oncogene, causando ganho de função.
seus produtos por onco-proteínas
mutadas leva à desregulação da
como é o caso do gene gap Krupple e do
Qualquer gene que venha a causar gene fushi tarazu (ftz).
morte, quando a perda de heterozigose
ocorre é denominado gene letal. São Os genes associados com a regulação
também chamados genes letais zigóticos do ciclo circadiano e outros ciclos bio-
e podem estar expressos de forma lógicos em muitos organismos são
homozigótica mesmo no décimo ciclo denominados genes relógio (Clock
celular da formação do blastoderma, Genes). A identificação de um gene
relógio é feita através do estudo de
células em culturas e de embriões que ativados pela mesma seqüência regula-
perderam os ritmos circadianos normais. dora. Genes mestres são também
A inserção de um gene no DNA dessas denominados genes selecionadores, pois
linhagens ou embriões que restaure o “escolhem” entre duas vias embrio-
ciclo normal, identifica-o como um gene gênicas de desenvolvimento, através da
relógio repressão e ativação seletiva de grupos de
genes.
Os genes associados a Sexo (Sex- Exemplos de genes controlados
linked Genes) são genes localizados nos pelos genes mestres são os genes HOX,
cro-mossomas sexuais, X ou Y, com uma primeiramente estudados na Drosophila
função específica na regulação de outros melanogaster sob o nome de genes
genes desses cromossomas, tal como o Homeóticos Seletores. Estes genes são
gene SRY, encontrado no cromossoma responsáveis pela morfologia de mem-
Y. O produto de SRY é um fator bros, órgãos, tecidos e pela diferenciação
transcricional de ligação ao DNA com célular. Genes HOX são encontrados em
função crucial no desenvolvimento dos todas as espécies animais e guardam uma
testículos e na determinação do gênero alta homologia, ao longo da cadeia
masculino. Mutação neste gene dá evolutiva. Esta homologia é caracterizada
origem a fêmeas XY, com disgênese por uma seqüência de nucleotídeos
gonádica. altamente conservada em todas as
espécies (peixes, lesmas, Drosophila
melanogaster e mamíferos) conhecida
Elementos Reguladores da Expressão como homeobox. Genes HOX ocorrem
Gênica em aglomerados nos diversos segmentos
do embrião e, quando ativados, guiam o
Relembrando, expressão gênica desenvolvimento morfogenético de um
significa a produção de RNA pelo gene determinado membro ou órgão. São
correspondente. O sítio no DNA ao qual a também indispensáveis durante a Reno-
enzima RNA-polimerase irá ligar-se para vação celular e na manutenção da
dar início à transcrição de um deter- diferenciação das células em cada tecido
minado produto gênico é denominado ao longo da vida do animal, assegurando
seqüência promotora ou promotor. Tal a correta diferenciação funcional e
região promotora é geralmente de difícil maturação de células recém replicadas, de
caracterização, podendo estar localizada acordo com a fisiologia específica do
próxima ou distante do gene em questão, tecido que constituem.
na maioria das vezes a montante do início
da sequência gênica (upstream). Os produtos de certos genes
modificam a função de outros genes,
Durante a embriogênese, genes sendo conhecidos como genes modifica-
denominados genes mestres (master dores (modifier genes), os quais parecem
genes) controlam a expressão ordenada de ser responsáveis pela variância feno-
aglo-merados inteiros de genes e/ou típica de certas doenças monogênicas,
grupos de genes, que atuam em cascata tais como a hemofilia, cardiomiopatias,
em uma determinada via de desen- fibrose cística e displasias. Tal variância
volvimento. Geralmente, um grupo de fenotípica não deve ser confundida com a
genes contíguos ou pertencentes à mesma penetrância de doenças hereditárias.
família, que se encontram organizados em Enquanto a variância fenotípica descreve
uma única unidade transcricional, são níveis de gravidade da doença, a pene-
trância define o percentual de indivíduos ao operador, impedindo a transcrição de
portadores de uma mutação que manifes- genes estruturais.
tam a doença. Quando a repressão enzimática
ocorre, o óperon inativa o gene estrutural;
Outro elemento regulador da porém, a introdução de uma substância
expressão gênica são os genes amplifi- indutora, como a lactose, que no caso da
cadores (enhancers). Os amplificadores E. coli, é o substrato alvo do produto dos
encon-tram-se em uma posição-cis três genes estruturais (enzimas), o locus
(mesmo cromossoma) do gene que do operador (ou óperon) é ativado,
amplificam e aumentam os níveis de produzindo um RNAm policistrônico,
transcrição basal. Ainda mais diver- que leva à síntese das três enzimas
sificados que os promotores, os genes necessárias à metabolização da lactose.
amplificadores podem estar localizados Quando os níveis de lactose baixam, a
praticamente em qualquer local do expressão do operador é novamente
cromossoma: - acima, abaixo, próximo ou supressa. Na E. coli, este conjunto
distante do gene alvo. Quando um gene operador foi denominado LAC-Operon.
recebe influência de outro gene localizado O RNAm policistrônico é um RNAm
em outro cromossoma, diz-se que tal bastante comum em procariotos,
elemento de influência encontra-se em contendo informações para a tradução de
posição-trans. mais de uma proteína, originadas de
transcritos de diferentes genes funcionais
Figura 4. Elementos àcima ou a montante (i.e., genes funcionais = cístrons).
(upstream) e abaixo (downstream) de um dado
gene.
Embora o modelo óperon tenha sido
desenvolvido com base no estudo de
Elemento àcima ⇒ Gene ⇐ Elemento abaixo
5’..!!!……"""""""""…888..3’
procariotos, a idéia geral foi incorporada
Sentido da Transcrição: 5’⇒ 3’ ao processo de diferenciação celular de
células eucariótas, no qual a repressão
seletiva de alguns genes e a indução
O óperon é um grupo de genes que forma
alternada da expressão de outros genes
um conjunto regulador da expressão de
leva ao desenvolvimento embrionário
genes estruturais, que foi primeiramente ordenado.
estudado por Jacob e Monod na bactéria
Escherichia coli. Eles demonstraram que
Famílias de Genes
a produção de lactato ocorre apenas na
presença das enzimas beta-galactose,
Famílias gênicas são formadas
lacpermease e transacetilase - o que é
por genes que exibem seqüências
uma exemplo de indução enzimática –
nucleotídicas semelhantes. Tais genes
pois a oferta de lactose induz a expressão
podem derivar de um gene ancestral
dos genes codificadores dessas três
comum e ter adquirido suas
enzimas. O modelo óperon Jacob-Monod
características atuais por meio dos
é composto por um gene regulador, uma
processos de divergência e recombinação
região promotora e uma região operadora,
gênicas.
além de pelo menos um gene estrutural
codificador da estrutura primária de uma
As principais causas de diver-
enzima. O modelo sugere a presença de
um gene regulador sintetizando um pro- gência gênica são as mutações espon-
duto com atividade repressora que se liga tâneas, que levam à variabilidade genética
entre as espécies e em diferentes
populações de uma mesma espécie. A Outra família de genes
divergência gênica pode também resultar importantes no controle do ciclo celular
da migração dessas mutações em uma são os Genes de Reparo do DNA que
população, por meio do fluxo genético ou codificam enzimas que atuam em várias
da transdução de material gênico viral ou fases do ciclo celular (G1, S e G2),
bacteriano no DNA de seus hospedeiros. interrompendo a transcrição da nova fita
quando encontram adutos químicos, erros
A recombinação gênica pode ser de pareamento de bases, etc, retirando-os
homologa ou não-homóloga (i.e., da fita e substituindo-os por seqüências
heteróloga), promovendo a migração de corretas.
genes nos organismos eucariotos. A
recombinação gênica ocorre nas primeiras Durante a intérfase (fases G0, G1,
horas da embriogênese entre os alelos S, G2) as células que não se encontram
maternos e paternos herdados pelo em processo proliferativo, permanecem
embrião. em G0 (por ex., a maioria dos neurônios),
enquanto as que devem se dividir passam
Exemplos de famílias gênicas são pelas fases G1, S e G2, entrando a seguir
as histonas, genes HOX, Citocromo P450, em mitose. Os tecidos de renovação
oncogene ras, receptores de proteínas G, rápida permanecem menos tempo em G1
receptores de Fatores de Crescimento, do que os de renovação lenta, ao passo
entre outros. que as fases S e G2 parecem ter durações
semelhantes, independente da velocidade
Em 1999 foi descoberta uma nova proliferativa tecidual.
família de genes, primeiramente identi-
ficada em camundongos e posteriormente No final da fase G1, o ciclo é
em nematódios, plantas, mofo e peixe interrompido para verificação e reparo de
zebra, o que indica uma alta conservação possíveis erros de transcrição ou na
evolucionária. Em camundongos, esta presença de adutos químicos em bases
família de genes denominada MORC, nucleotídicas, o que é conhecido como
regula a produção e maturação de ponto de restrição (R). Uma vez
espermatozóides. O papel desempenhado realizados os reparos necessários, o ciclo
pelos genes MORC em outras espécies prossegue para a fase S, iniciando a
ainda não está esclarecido. síntese do DNA. No caso de danos
irreparáveis, a via que induz a apoptose
Genes Envolvidos no Controle do Ciclo ou morte celular programada é ativada,
Celular evitando a formação de clones mutados
nas gerações seguintes de células. Ao
Os dois principais grupos de final de cada fase, os produtos gênicos
genes envolvidos no controle do ciclo que a regularam são degradados ou
celular são aqueles que estimulam e os inativados, de forma que, uma vez feita a
que inibem o ciclo celular: - os oncogenes transição para a fase seguinte, torna-se
e os genes supressores de tumor, anterior- impossível regredir à fase anterior. Uma
mente descritos. Estas duas classes de vez ultrapassado o ponto de restrição, o
genes controlam redes de sinalização ciclo celular progredirá pelas fases S e G2
intracelulares e modulam a expressão de em direção à mitose.
outros genes durante a progressão do
ciclo celular. No final da fase G2 o ciclo será
novamente pausado para nova verifi-
cação das recém sintetizadas seqüências mente isto é possibilitado pela expressão
que constituirão as novas fitas de DNA, de uma enzima específica, não expressa
realização de reparos e nova tomada de em mamíferos, ligada a um promotor
decisão (mitose ou apoptose?), através da ativo nas células tumorais, desta forma
regulação de expressão do gene p21. A convertendo dentro da célula tumoral um
enzima topoisomerase III confere as substrato inofensivo em um molécula
seqüências de nucleotídeos recém sinte- tóxica para a célula. A transfecção de
tizadas, elimina as incorretamente células tumorais com o gene tirosina-
transcritas e permite reparos no ponto de cinase do vírus Herpes Simplex (HSVtk)
verificação do final da G2, antes que os torna-as sensíveis à droga antiviral,
diversos segmentos sintetizados sejam ganciclovir. A expressão do gene HSVtk
ligados entre si pela enzima DNA-ligase, na célula tumoral induz a fosforilação do
para formar a nova fita de DNA. ganciclovir em monofosfato que, seguida
pela fosforilação mediada por cinases
Uma vez duplicado o DNA, com celulares a trifosfato, leva à inibição da
cada fita recém sintetizada e pareada a DNA polimerase em células tumorais em
uma das duas fitas de DNA parental proliferação, induzindo a apoptose. Um
complementar (replicação semi-conser- efeito residual potente persiste, induzindo
vadora), o ciclo progride para mitose, também as células adjacentes à apoptose.
dando origem aos núcleos das duas Testes realizados em tumores ovarianos
células-filhas idênticas, que serão for- irradiados, demonstraram que o efeito
madas através da citocinese (divisão do residual é eficaz. Células expressando
citoplasma). HSVtk foram injetadas na cavidade
peritoneal das pacientes, as quais
Genes Experimentais receberam a seguir ganciclovir. Através
Na busca de soluções terapêuticas do efeito residual, as células que sobrevi-
ou de novas estratégias de identificação veram à radiação gama foram induzidas à
de genes, vários genes e cromossomas apoptose. Em camundongos murinos
modificados foram desenvolvidos, como transgênicos com tumores cerebrais, o
ilustram os exemplos a seguir. efeito residual induziu a apoptose de 30 a
60% das células tumorais e o efeito
Gene Reporter: Genes utilizados em residual levou à remissão completa em
laboratório para avaliar a expressão de 80% dos animais testados.
outros. São geralmente utilizados de uma
maneira artificial. Por exemplo, ao se YAC (Yeast Artificial Chromosome): Um
clonar o promotor do gene X justaposto dos organismos utilizados como modelo
ao gene da beta-galactosidase, pode-se para o estudo do ciclo celular são os
avaliar a ativação do gene X, sob fungos utilizados em fermentos, tal como
diferentes condições - ou até mesmo o Saccharomyces, pertencente à classe
durante o desenvolvimento embrionário - dos Hemascomycetes. YAC é um
através da presença de cor azul nas cromossoma artificial de levedura, que
células, gerada pelo “gene reporter” beta- permite a clonagem de fragmentos de
galactosidase. DNA humano nele inseridos de até um
milhão de pb (pares de base). Este
Gene Suicida: Uma estratégia tera- cromossoma auto replicante inclui três
pêutica que visa tornar o tumor mais seqüências de DNA e dois sítios de
vulnerável à quimioterapia, ou a uma reconhecimento para enzimas de res-
outra droga, como o ganciclovir. Geral- trição que permitem a replicação e
transmissão do genoma às células filhas. enzimas de restrição EcoRI e BamHI,
Essas três seqüências e os sítios de recebendo telômeros em cada
restrição são descritos abaixo: extremidade, for-mando assim um
cromossoma linear. O fragmento de
• Telômeros – localizados em cada DNA humano é então recombinado com
extremidade do cromossoma, prote- este cromossoma linear nos sítios de
gendo o DNA contra a degradação EcoRI, sendo ambos covalentemente
por nucleases; unidos pela enzima DNA ligase. Desta
• Centrômero – o local de ligação do forma, um vetor YAC é produzido e pode
fuso mitótico que segrega cada cópia ser utilizado para infectar células de
de cromossoma para um polo celular levedura em cultura, produzindo um
oposto; número ilimitado de cópias.
• Seqüências promotoras na origem de
cada forquilha de replicação, que Mutações Gênicas, Mutações Cromos-
promovem a replicação de seqüências sômicas e Impressão Epigenética
específicas de DNA
• Sítio de reconhecimento para duas As mutações gênicas e as recombinações
enzimas de restrição: EcoRI e BamHI. são as principais fontes de variabilidade
genética, proporcionando a diversidade de
Marcadores selecionáveis são também características individuais em cada
inseridos, o que permite que as células espécie, bem como a multiplicidade de
que incorporaram o vetor contendo o espécies, ao longo da evolução biológica.
fragmento de DNA humano sejam
facilmente isoladas das demais células da A diversidade genética permite a
cultura. evolução da espécie, visto que indiví-
duos que herdaram diferentes variações
A clonagem de DNA humano em YAC gênicas respondem diferentemente às
tornou possível a análise de longas mudanças ambientais, tais como mudan-
seqüências, tais como as encontradas em ças climáticas, poluição, aumento de
genes humanos. A clonagem de material radiação UV, etc. Tais diferenças de
genético de mamíferos pode ser também resposta às pressões ambientais favore-
feita através da inserção dessas seqüên- cerão a adaptabilidade e sobrevivência de
cias em plasmídeos bacterianos. Porém, o certos grupos de indivíduos daquela
plasmídeo não comporta mais do que mesma espécie em detrimento de outros,
10.000 pb, tornando evidente a vantagem aumentando, porém, a chance de sobre-
do YAC. vivência da espécie em si. Este é o
conceito moderno de seleção natural.
A clonagem de DNA humano em YAC
tem início com a digestão parcial do Mutações podem ocorrer em dois
DNA pela enzima de restrição EcoRI, diferentes níveis: cromossomas ou genes.
obtendo-se assim fragmentos muito As mutações cromossômicas são carac-
grandes. Por sua vez, um plasmídeo terizadas por alterações suficientemente
bacteriano circular é modificado, grandes para serem detectadas pelas
recebendo centrômero e elementos técnicas de citogenética clássica
promotores de replicação, de forma a (cariotipagem), incluindo cópias extras ou
permitir a replicação do material a ser faltantes de um cromossoma; deleção de
clonado pelas células de levedura. A fragmentos grandes; translocações;
seguir, o plasmídeo é digerido pelas duplicações e inversões. Quando um
cromossoma perde seu centrômero, não (Loss Of Imprinting - LOI), podem
pode ser copiado para as células-filhas, ambas causar doença, dependendo do
causando a perda de todos os alelos tecido e das circuntâncias. Um número
localizados naquele cromossoma. A crescente de doenças, até hoje atribuído a
presença de uma terceira cópia de um mutações hereditárias, tem recentemente
cromosoma constitui uma trissomia, revelado evidências que apontam para a
como no caso da síndrome de Down desregulação de processos de impressão
(trissomia do cromossoma 21). epigenética. Exemplos são as síndromes
de Prader-Willi (PWS), síndrome de
As mutações gênicas são peque- Angelman (AS), síndrome de Beckwith-
nas e passam despercebidas durante a Wiedemann, Tumor de Wilms, mola
cariotipagem, consistindo de adições, hidatiforme, teratoma ovariano completo,
perdas ou substituições de nucleotídeos. hepatoblastoma e rabdo-miossarcoma.
Mutações em células germinativas (game-
tas) são transmitidas aos descendentes, Mutações gênicas autossômicas
enquanto as que ocorrem em células dominantes são as que apresentam um
somáticas podem causar doença ou morte fenótipo patológico dominante a nível
apenas no próprio indivíduo que as celular, sendo a causa de diversas doenças
adquiriu. Portanto, as mutações podem monogênicas. Um caso intrigante é o
ser herdadas ou adquiridas (esporádicas). câncer hereditário, onde a mutação
autossômica é na maioria das vezes
Além disso, durante a fertilização recessiva a nível celular, mas o fenótipo é
ou a embriogênese, mutações de novo herdado de maneira dominante. A
podem ocorrer, principalmente durante a mutação de um dos alelos parentais é
recombinação gênica, as quais, embora herdada em todas as células do indivíduo,
presentes ao nascimento, não são mas somente as que sofrem alteração do
encontradas nos genomas materno e segundo alelo desencadearão o processo
paterno. de tumorigênese. Contudo, devido ao
fator temporal e ao grande número de
A metilação de histonas é um células com uma alteração de base, o
dos processos de controle da expressão fenótipo "câncer" é herdado de maneira
gênica, denominados controles epige- dominante, visto que estes indivíduos
néticos, possuindo um papel crucial no desenvolvem tumores com freqüência,
desenvolvimento ordenado do embrião. geralmente múltiplos e em idade precoce.
Ela é também essencial na diferenciação
celular, mantendo silenciados os genes Em tumores malignos e benignos
que não devem ser expressos em um são comuns os rearranjos cromossô-
determinado tecido. Outro controle micos, tais como a translocação, recom-
epigenético é a acetilação de histonas, binações promovidas por transposons,
que induz a expressão de genes da região inversões e deleções, que podem alterar a
acetilada. taxa de expressão de um gene ou
inibir/abolir a função de sua proteína.
O silenciamento de um gene por
metilação ou por desacetilação é Tipos de Mutações Gênicas
denominado impressão epigenética
(imprinting). Portanto, a impressão epi- Single Nucleotide Polymorphisms -
genética anormal de um gene ou a perda (SNPs): mutações de ponto, que ocorrem
de uma impressão epigenética normal em um único nucleotídeo, através da
substituição de uma base. Polimorfismos ACg CTT ACC GTT AGC C (mutação)
em genes envolvidos no biometabolismo UAG
celular são responsáveis pelas variações
individuais na taxa metabólica de res- Este tipo de mutação pode causar uma
posta a medicamentos e pelos diferentes das seguintes alterações: perda de função,
graus de susceptibilidade a poluentes e truncagem de leitura, perda de códon de
efeitos adversos a medicamentos. SNPs terminação com possível fusão de duas
podem ocorrer das seguintes formas: proteínas, efeito polar (no caso de grandes
• Transição: uma purina (A ou G) inserções).
substitui outra purina; ou uma piri-
midina (C ou T) substitui outra Mutação por Deleção: uma parte do
pirimidina; DNA é perdida, causando também
• Transversão: uma purina substitui mudança no quadro de leitura, com as
uma pirimidina ou vice-versa; mesmas conseqüências da inserção.
Assim, a mutação de ponto pode produ- Geralmente, as mutações de ponto e as
zir os seguintes resultados: inserções podem ser revertidas; as
deleções, porém, não são reversíveis.
a) redundância de bases (AA ou GG;
CC ou TT), que leva a uma mutação Inserção ou Deleção de 3 Nucleotídeos
silenciosa de mesmo sentido (ou mais): não modifica o quadro de
(samesense); leitura, embora a perda de função do
b) bases diferentes produzindo a subs- produto traduzido seja comum.
tituição do códon de um aminoácido
por outro, produzem uma mutação Grandes inserções ou deleções
missense ou de sentido errôneo. Se o podem ocorrer e geralmente resultam em
novo aminoácido possui proprie- mutações sem sentido, até que um códon
dades semelhantes ao original (wild de terminação seja encontrado nas adja-
type), a mutação pode ser neutra; cências do locus. Grandes inserções
caso contrário, pode originar uma podem também resultar no efeito polar,
proteína mutante e modificar o onde um gene mutado passa a afetar
fenótipo; outros genes abaixo e costuma ocorrer
c) a mutação de ponto pode originar um com genes operons.
códon de terminação da tradução no
meio do quadro de leitura, causando Supressão Intragênica: Ocorre quando
uma mutação sem sentido, com a uma segunda mutação mascara a presença
da primeira, sendo, portanto, uma
tradução protéica terminando preco-
cemente e dando assim origem a um mutação compensadora, que preserva
produto truncado. desta forma a função da proteína.

Supressão Intergênica: é observada


Mutação por Inserção: adiciona nucleo-
quando duas proteínas devem interagir e a
tídeos durante a replicação do DNA, o
mutação em uma delas impede a
que resulta em uma mutação frameshift
interação. A mutação supressora, pode
ou mudança na matriz ou quadro de
então ocorrer no gene codificador da
leitura. Por exemplo,
outra proteína, restabelecendo a intera-
tividade dos dois produtos. Pode também
Wild type ou seqüência original:
ocorrer entre duas vias biometabólicas
AGC TTA CCG TTA GCC #
interdependentes. Neste segundo caso,
dois eventos distintos podem ocorrer: 1), recorrentes podem também induzir
a mutação da segunda via metabólica mutação genética, levando a perdas
pode permitir que a primeira via mutada funcionais ou ao câncer.
passe a ser ignorada; ou 2), a mutação
pode ocorrer em uma via metabólica DNA Mitocondrial e Herança Materna
alternativa, aumentando a função perdida Extra-Nuclear
na outra, de forma compensatória. Se por
outro lado o locus afetado pela primeira Os mitocôndrias possuem DNA circular,
mutação deu origem a um novo códon de com comprimento de 16 Kb no ser
terminação, o RNA transportador (RNAt) humano, contendo cerca de 20 genes
responsável pelo reconhecimento de expressos e o restante da molécula
códons durante a tradução, pode sofrer constituída por seqüências repetidas. Os
uma mutação supressora, que lhe permita primeiros estudos que demonstraram que
não reconhecer o códon de terminação o DNA mitocondriano (DNAmt) é her-
(originado pela primeira mutação) como dado da fêmea, foram realizados em
um UAG, permitindo que a tradução plantas, com o DNA de cloroplastos (no
continue. Por exemplo, o RNAt mutado caso dos cloroplastos, nem sempre isso é
pode interpretar o códon mutado UAG verdade). Em mamíferos, os camun-
como sendo o códon AAG da lisina dongos Mus domesticus e Mus spretus
originalmente presente, adicionando este serviram de modelo animal para os
aminoácido. estudos que demonstraram que o DNAmt
é herdado exclusivamente da mãe.
Além das mutações espontâneas Estudos posteriores demonstraram que o
endó-genas, supra descritas, o genoma mesmo acontece em outras espécies,
está também sujeito à ação de mutágenos inclusive a humana. Este padrão de
ambientais, cujos metabólitos se inserem herança genética é denominado herança
no DNA sob a forma de adutos químicos, materna. O DNAmt contém RNAr,
causando mutações exógenas i.e., RNAt, genes estruturais e subunidades
induzidas por agentes xenobióticos. A enzimáticas.
radiação por raios X, por exemplo, causa
quebras cromossômicas que levam a Os processos bioquímicos
deleções, enquanto a radiação UV induz a realizados por mitocôndrias durante a
dimerização de pirimidinas. Quando não produção de energia, (cadeia respiratória
corrigidas, essas alterações levam à mitocon-driana) têm lugar em cinco
transformação celular e ao câncer. Alguns complexos protéicos: I, II, III, IV e V.
mutágenos químicos modificam as Dos 80 genes necessários para a síntese
ligações entre as bases, causando ligações das proteínas componentes desses
cruzadas entre elas, enquanto outros complexos, alguns se encontram no
inserem nucleotídeos de pares adjacentes próprio DNAmt, enquanto os demais
que resultam em mudanças do quadro de estão localizados no DNA nuclear. Os
leitura. genes do DNAmt sofrem uma taxa de
mutação 5 a 10 vezes superior a dos
A inserção de genoma viral e genes do DNA nuclear, o que produz
bacteriano, durante infecções é também distúrbios no metabolismo celular e está
um outro fator indutor de mutações, como também associado ao processo de
as induzidas pelos vírus da hepatite e pela envelhecimento. Algumas mutações em
bactéria gástrica Helicobacter pilori. genes do DNAmt (herdadas da mãe)
Processos inflamatórios crônicos ou resultam em deficiências congênitas nos
complexos da cadeia respiratória ou no representará um risco para o restante da
sistema enzimático de detoxicação e progênie. Outra característica da mutação
eliminação de metabólitos tóxicos herdada, é que ela não se encontra
produzidos ao longo da cadeia necessariamente presente em todas as
respiratória. Em quaisquer dos casos, o células e tecidos do organismo, de forma
resultado será a manifestação de fenótipos que apenas os tecidos portadores de
patológicos de diferentes graus de mitocôndrias mutados apresentarão dis-
gravidade, dependendo do tipo de funções. O número de cópias mutadas do
mutação e da extensão de suas gene em questão, em relação ao número
implicações. São exemplos de patologias de cópias normais presentes nos mito-
causadas por mutações no DNA de côndrias é também um fator decisivo para
mitocôndrias o sub-desenvolvimento a manifestação ou não do fenótipo
acompanhado de anorexia crônica durante patológico.
a infância, que resulta em baixa estatura,
desordens neurocognitivas, deterioração
neurológica progressiva. Esta condição
poderá resultar em demência, convulsões
e ataques de origem neurológica,
dificuldades de deglutição, desordens Técnicas Utilizadas em Genética
visuais, surdez, desordens mielotróficas, Molecular
cardiomiopatias e arritmias, além de
desordens renais. A seção de metodologia dos
trabalhos científicos atualmente publi-
Todo o DNA de mitocôndrias cados sobre Genética Molecular men-
deriva do óvulo materno e o ciona diversas técnicas, pressupondo que
espermatozóide não contribui nesse o leitor esteja familiarizado com elas, ao
processo. No caso de presença de menos conceitualmente. Portanto, descrê-
mutações no DNAmt, as mesmas estarão vemos a seguir, essas técnicas para
presentes na maioria dos óvulos, mas não atualização e a título de uma pronta
em todos – devido à natureza aleatória de referência.
distribuição dos mitocôndrias - o que
implica um alto risco de mais de um filho PCR: Polymerase Chain Reaction, ou
com distúrbios derivados de tais Reação em Cadeia da Polimerase é uma
mutações. Além disso, cada mitocôndria técnica de Biologia Molecular (1985),
presente no óvulo contém várias cópias através da qual é possível a amplificação
de cada gene mitocondriano e se uma do número de cópias de uma seqüência
mutação estivesse presente em todas as específica de DNA de maneira expo-
cópias de um determinado gene, o nencial. Esta técnica requer a existência
embrião provavelmente não sobreviveria de uma sequência molde (template) que
aos primeiros estágios da embriogênese. será amplificada através da hibridização
Portanto, um indivíduo portador de com sondas complementares (primers) a
mutações mitocondrianas possui cópias pequenos trechos de ambas as extre-
normais e cópias mutadas do mesmo midades da sequência molde. A reação
gene. requer a variação contínua de tempe-
Mutações de novo (que não ratura, permitindo a hibridização entre
estavam presentes originalmente no fragmentos, a extenção por polime-
óvulo) podem também ocorrer no rização de nucleotídeos e em seguida a
momento da fertilização, o que não desnaturação das seqüências recém-
sintetizadas, para que um novo ciclo que a reação ocorre. Tal efeito é pos-
possa ser iniciado. Visto que a des- sibilitado atráves da adição de sondas
naturação requer temperaturas próximas a (probes) contendo moléculas fluores-
100oC, foi necessário isolar polimerases centes que são ativadas somente ao serem
de organismos termoresistentes, de modo degradadas pela polimerase. Assim, pode-
a possibilitar a reação enzimática em se detectar e quantificar a intensidade da
cadeia, sem destruir a atividade enzi- amplificação como sendo diretamente
mática da polimerase. proporcional à luz gerada.
Através da técnica de PCR, é
possível se utilizar um pequeno número LCR: Ligase Chain Reaction ou Reação
de moléculas de DNA e amplificá-las até em Cadeia da Ligase consiste na
se obter o número desejado de moléculas. amplificação de um fragmento de DNA
Este procedimento é de grande valia na pela ligação em cadeia de duas sondas
clonagem de genes, análise de expressão complementares. As sondas são plane-
e identificação de indivíduos (paternidade jadas de modo a se hibridizarem ao DNA-
e medicina forense). molde e serem ligadas pela enzima ligase.
A amplificação ocorre após múltiplas
rtPCR: Semelhante ao PCR, porém etapas de desnaturação e ligação.
inclui uma etapa anterior na qual o RNA
é convertido em cDNA pela enzima Southern Blot: Técnica de hibridização
transcriptase reversa. O cDNA resultante de DNA-alvo com DNA-sonda. O DNA-
pode então ser amplificado por PCR. alvo, geralmente fragmentado, é sepa-
Esta técnica permite a análise de ex- rado por eletroforese em gel de agarose e
pressão de genes em células ou tecidos transferido para uma membrana de nylon
específicos. ou nitrocelulose. O DNA-sonda é
marcado com radioatividade ou métodos
PCR Semi-quantitativo: Variação do não radioativos e hibridizado ao DNA
PCR no qual os ciclos são otimizados no imobilizado na membrana. O sinal
sentido da amplificação ser o mais quanti- positivo é indicativo da presença no
tativa possível. Uma maneira de obter DNA-alvo de seqüências semelhantes ou
este efeito é contaminar a reação de idênticas às do DNA-sonda. Condições
amplificação com outra seqüência conhe- de lavagem podem aumentar ou diminuir
cida - e geralmente presente em todas as o limite da hibridização, permitindo, por
amostras – tal como genes zeladores (i.e. exemplo, apenas a hibridização de
housekeeping genes). Ao se atingir o seqüências idênticas.
máximo possível de amplificação da
sequência contaminante, a reação pára de Dot Blot: Semelhante ao método anterior,
progredir de maneira exponencial, impe- porém o DNA-alvo não é separado por
dindo assim que, ao longo dos ciclos, as eletroforese, mas sim "blotted" ou
seqüências em menor número sejam borrado em regiões específicas da
amplificadas, produzindo um sinal tão membrana. A vantagem é a rapidez e a
intenso como o gerado pelas seqüências desvantagem é a falta de separação por
em maior número. tamanho de fragmentos, o que im-
possibilita saber ao certo se a positividade
Real Time PCR (TaqMan): Variação da é devido à presença exata do gene
técnica de PCR, inventada pela compa- interrogado ou de genes semelhantes e/ou
nhia Perkin Elmer, que permite a com trechos com um grau de homologia
visualização da amplificação à medida em
suficiente para permitir a hibridização ern Blots e, mais recentemente, os
com a sonda. modernos Biochips de DNA.

Northern Blot: Mesma filosofia do cDNA library: Biblioteca gênica gerada


Southern Blot, porém o material alvo é pela clonagem de toda uma população de
RNA, em vez de DNA. Essa técnica, cDNAs em um vetor de escolha. Tal
assim como o rt-PCR, permite a análise biblioteca representa o pool ou banco de
de expressão de determinados genes em genes expressos naquele grupo celular,
células ou tecidos específicos. visto que foi gerada através da conversão
das moléculas de RNA em DNA.
Western Blot: Também semelhante aos
anteriores, contudo o alvo - que é sepa- Genomic library: Biblioteca gênica
rado por tamanho e imobilizado em gerada pela clonagem de fragmentos de
membrana - é constituído de proteínas e a DNA em um vetor de escolha. Tal
sonda é substituída por anticorpos mono biblioteca representa todos os genes
ou policlonais, que investigam epítopos presentes em um indivíduo - inde-
específicos da proteína de interesse. A pendente do tecido utilizado.
detecção do sinal é geralmente por
quimio-luminescência. Identificação Genética (DNA finger-
printing): Utilização da composição
ISH ou Hibridização In Situ (In Situ genética de um indivíduo para permitir
Hybridization): Permite investigar a sua identificação. Atualmente são
expressão de seqüências de RNA em utilizados preferencialmente os Short
lâminas de tecido. Técnica elegante, onde Tandem Repeats (STR), que após am-
se pode determinar com precisão a plificação por PCR são separados de
localização do RNA expresso, por exem- acordo com o tamanho, gerando um
plo no tumor ou tecido conjuntivo padrão altamente polimórfico que,
peritumoral. A hibridização é feita com combinado, produz uma identificação
sondas RNA antisenso e o sinal detec- genética de alta resolução.
tado por radioatividade ou imuno-
coloração. Fluorescence activated cell sorting
(FACS) ou Citometria de Fluxo (Flow
Imunohistoquímica: Semelhante ao Cytometry): Separação celular com base
anterior, porém o material investigado na em moléculas expressas na superfície
lâmina é proteína e não RNA - e a sonda destas células. Anticorpos marcados
é substituída por anticorpos mono ou específicos reconhecem as moléculas
policlonais. A detecção do sinal é por marcadoras de superfície, gerando cores
imunocoloração. diferentes de acordo com o anticorpo
utilizado. De acordo com a cor de cada
Imunocitoquímica: Variação da técnica célula - ou combinação de cores, a
anterior, na qual o tecido em lâmina é máquina promove a separação celular
substituído por células em suspensão. para compartimentos diferentes. Este
método é também muito útil na iden-
Expression Analysis: É o uso de qualquer tificação e classificação de tumores, de
técnica que permita a análise de acordo com os marcadores tumorais
expressão gênica em tecidos ou células expressos.
diferentes, por exemplo, rtPCR, North-
DNA Chip: Chips de sílica contendo mutações) e estuda-se o efeito fenotípico
milhares de seqüências curtas de DNA, de forma controlada.
ou seqüências inteiras de cDNA.
Utilizados preferencialmente para se SNP ou Single Nucleotide Poly-
analisar simultaneamente a expressão de morphisms: A mais sutil variação
milhares de genes em um determinado genética entre indivíduos, consistindo na
tecido ou grupo de células. Pode-se, por variação que ocorre em um único
exemplo, analisar as diferenças de nucleotídeo, como acima exposto.
expressão gênica entre tecido tumoral e Estima-se que existam variações nucleo-
tecido normal e, ao mesmo tempo, obter- tídicas deste tipo a cada 1.000 ou 1.300
se um mapa dos níveis de expressão de nucleotídeos. Considera-se na atualidade
milhares de genes. que o grupo total de SNPs de um
indivíduo é o fator determinante para
Transgenic Mouse: Camundongos todas as predisposições genéticas deste
transgênicos contendo um gene exógeno, indivíduo. Espera-se que futuramente,
por exemplo, humano. Esta técnica com a possibilidade da análise simultâ-
requer a microinjeção do gene em células nea de todos os SNPs, possa-se deter-
cultivadas in vitro, que depois são minar estatísticamente a predisposição
introduzidas no útero da fêmea grávida. individual a múltiplas doenças e, desta
Estas células transgênicas se misturam forma, tomar medidas preventivas muito
com as células normais e geram um precocemente.
animal quimérico, contendo células
normais e transgênicas. Através de Bibliografia Consultada e Recomendada:
1) Peter Beurton, Raphael Falk, Hans-Jørg Rheinberger
cruzamentos sucessivos, é possível obter
(eds.) The Concept of the Gene in Development and
um animal completamente transgênico. Evolution. Cambridge Studies in Philosophy and
Biology. Cambridge Univer-sity Press, 2000.
Knockout Mouse: Consiste na eliminação 2) Alberts, B., Bray, D., Lewis J., Raff, M., Roberts, K.,
a
Watson, J. Molecular Biology of the Cell, 3 ed.
de um gene específico no camundongo, Garland Publishing, Inc., 1994.
para estudo das alterações durante a 3) Kornberg, R.D. Eukaryote transcriptional control.
embriogênese ou na vida adulta do Trends in Cell Biology, Trends in Biochemistry,
Science and Trends in Genetics (joint issue); 1999:24,
camundongo. Por exemplo, abolindo-se a M46-8.
função de um gene supressor tumoral, 4) Yaspo, M-L., Reinhardt, R., Lenbrach, H. et. cols.
pode-se observar o aparecimento precoce The DNA sequence of human chromosome 21. Nature;
18 May 2000; 311-319.
de tumores. A ruptura é feita in vitro,
através da recombinação homóloga em
células embrionárias que são poste-
riormente selecionadas e implantadas na
fêmea grávida. O mesmo processo de
cruzamento de quimeras é necessário para
se obter um camundongo completamente
knockout.

Knockin Mouse: Variação da técnica


anterior, na qual o gene, ao invés de
eliminado, é substituído por outro. Por
exemplo, substitui-se a versão normal de
um gene pela versão alterada (com