XI SIMPEP Bauru, SP, Brasil, 08 a 10 de novembro de 2004.

Avaliao das alteraes fsico-qumicas em iogurte adicionado de culturas probiticas

Islaine Maria Faria Biscaia (CEFET-PR)islainebiscaia@hotmail.com Dr. Carlos Csar Stadler (CEFET-PR)cstadler@pg.cefetpr.com.br Dr. Luiz Alberto Pilatti (CEFET-PR)lapilatti@pg.cefetpr.com.br

Resumo A procura por alimentos cada vez mais saudveis fez com que fosse estudada a incorporao de bactrias chamadas probiticas, por recompor a microbiota intestinal, em um alimento saudvel como o iogurte. As bactrias probiticas so benficas sade, e por isso que atualmente o uso delas vm se tornando cada vez maior e constante. Esses alimentos incorporados com bactrias probiticas so includos no grupo dos alimentos funcionais. No presente trabalho, houve o desenvolvimento de um iogurte tradicional e nele foi adicionado bactrias probiticas prprias e previamente estudadas, bem como a anlise deste iogurte para verificao de sua viabilidade. Palavras-chave: Probitico, Bactrias Probiticas, Iogurte 1. Introduo O iogurte desenvolvido considerado um alimento probitico, que so produtos que carreiam de forma vivel, bactrias da flora intestinal humana, quando estes forem destinados ao consumo humano (MITSUOKA, 1984). Bactrias probiticas so aquelas responsveis por recompor a microbiota intestinal, sendo agentes benficos sade e podem ser usadas isoladas ou combinadas com outras bactrias lcticas, interagindo de diversas formas para o seu desenvolvimento e funcionabilidade. O uso de bactrias probiticas em produtos lcteos, na atualidade, comum devido aos efeitos benficos proporcionados como: reduo dos efeitos da intolerncia a lactose, possvel diminuio do colesterol srico, atividade anticarcinognica e, mais recentemente, pesquisadores tm proposto sua utilizao no tratamento auxiliar da Sndrome da Imunodeficincia Adquirida (AIDS) pela inativao do vrus HIV (KIM, 1998; O'SULLIVAN et al, 1992). As bactrias lcticas e as bactrias bfidas so as principais bactrias saprfitas comprometidas pelo uso de antibiticos. Quando, por algum modo, a microbiota intestinal foi desbalanceada por tratamentos com antibiticos, quimioterapia, radioterapia ou por situaes de stress, os tratamentos usados para esses casos, podem causar reaes diversas. Uma delas pode ser a diarria, que elimina os microrganismos benficos, importantes para o equilbrio da flora intestinal. Por isso, as bactrias lcticas em conjunto com as bactrias bfidas agem no organismo de maneira benfica e completa (MITSUOKA, 1984). As bactrias bfidas so bacilos Gram positivos, anaerbios, sensveis ao oxignio. Algumas destas bactrias so tolerantes ao ar, enquanto outros so extremamente sensveis (MITSUOKA, 1984).

As bactrias mais comumente utilizadas para a suplementao do iogurte so Lactobacillus acidophillus e Bifidobacterium bifidum, que podem ser isoladas do prprio trato intestinal do homem e dos animais. Essas bactrias foram incorporadas ao iogurte, juntamente com as bactrias do processamento normal do iogurte que so Streptococcus thermophillus e Lactobacillus bulgaricus. Os alimentos probiticos esto includos no grupo dos alimentos funcionais que recebem denominao internacional de Foods for Specified Health Use (FOSHU). Desta maneira, sua suplementao torna-se interessante como fator de proteo da flora intestinal e suas funes. As culturas probiticas utilizadas no iogurte desenvolvido neste trabalho foram: Lactobacillus acidophillus denominada de La-5, obtida atravs de doao da empresa Chr Hansen e Bifidobacterium bifidum denominada de Bb-12, obtido por doao pela empresa Chr Hansen, alm das bactrias prprias da elaborao do iogurte (Streptococcus thermophillus e Lactobacillus bulgaricus) denominadas de YC-X11 da empresa Chr Hansen. Foi desenvolvido um iogurte tradicional adicionado de cepas de bactrias probiticas em dois blocos (duplicata); escolhidas as bactrias probiticas de maneira eficaz para sua viabilidade e sobrevivncia. O iogurte ficou armazenado sob refrigerao durante o perodo de trinta dias, tempo em que foram realizadas as anlises fsico-qumicas em intervalos especificados, com base na preconizao da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), no que diz respeito aos padres de qualidade e identidade de iogurtes. Avaliao das alteraes fsico-qumicas em um iogurte adicionado de culturas probiticas. O iogurte desenvolvido, adicionado de bactrias probiticas, um produto alimentcio com propriedade funcionais no que diz respeito recomposio da microflora intestinal e melhorias no sistema imunolgico (KIM, 1998; O'SULLIVAN et al, 1992). 2. Fermentao lctica A fermentao lctica constitui uma das formas mais antigas de conservao de produtos oriundos da agricultura ou da indstria agroalimentar. Esse tipo de fermentao est relacionada em primeiro lugar com os produtos lcteos (iogurte, queijos, manteiga e creme), mas tambm com carnes, frios, pes, cerveja, vinho entre outros. A fermentao lctica feita por diversas bactrias chamadas lcticas (BL) que convertem os acares do meio em cido lctico (PIARD, LOIR, POQUET et al, 2001). A fermentao o processo metablico em que os carboidratos e compostos afins so oxidados com liberao de energia em ausncia de qualquer influncia externa. As bactrias cido lcticas, como microrganismos fermentadores, precisam de sistemas funcionais de transporte de eltrons ao grupo hemo ou a citocromos, e obtm sua energia por fosforilao oxidativa a nvel de substrato (JAY, 1994). 3. Processamento do iogurte O iogurte o leite fermentado ou coalhada medicinal. preparado por quase todos os povos da Europa oriental (Turquia, Bulgria, Srvia, Grcia, Romnia) e Arbia, onde constitui um alimento corrente e popular desde pocas remotas, como leite de grande digestibilidade. O paladar timo e tem um aroma peculiar e agradvel.

O iogurte uma associao de microrganismos, que vivem em simbiose, formada pelo Streptococcus thermophillus e Lactobacillus bulgaricus. Sendo o iogurte um produto biolgico e de grande valor diettico, o emprego de conservantes ou inibidores (qumicos) de fermentao deve ser excludo na sua manipulao, pois os inibidores vm eliminar totalmente o seu valor teraputico e torn-lo um produto de difcil digesto. Como a cultura do iogurte uma associao simbitica, o pH e a temperatura tima para o desenvolvimento do Streptococcus thermophillus esto ao redor de 6,8 e 38C, enquanto que o Lactobacillus bulgaricus esto compreendidos em 6,0 e 43C. As culturas de Streptococcus thermophillus alcanam 90 Dornic de acidez, enquanto que as culturas de Lactobacillus bulgaricus, chegam at 140 Dornic. Entretanto, a cultura do iogurte deve conter uma porcentagem igual dos dois microrganismos, do contrrio no se obter a consistncia e a caracterstica desejvel. Na fermentao do iogurte, Streptococcus thermophillus se desenvolve inicialmente com grande intensidade gerando um ambiente favorvel para o microorganismo Lactobacillus bulgaricus, que por conseqncia tero seu desenvolvimento intensificado. Assim, as duas culturas se completam em um desenvolvimento simbitico, porm devem sempre estar em igualdade de porcentagem. Para isso, deve-se sempre controlar as a equivalncia das culturas certificando-se do equilbrio entre as mesmas (BEHMER, 1999). 4. Bactrias utilizadas no desenvolvimento do iogurte 4.1. Bactrias lcticas 4.1.1. Gnero Lactobacillus Outro gnero que integra o mundo dos agentes probiticos o Lactobacillus, isolado pela primeira vez por MORO em 1900, a partir das fezes de lactentes amamentados ao peito materno. Este investigador atribuiu-lhes o nome de Bacillus acidophilus, designao genrica dos lactobacilos intestinais. Estes microrganismos so geralmente caracterizados como Gram positivos, incapazes de formar esporos, desprovidos de flagelos, possuindo forma bacilar ou cocobacilar, e aerotolerantes ou anaerbios. O gnero compreende, neste momento, 56 espcies oficialmente reconhecidas; as mais utilizadas para fins de aditivo diettico so L. acidophilus, L. rhamnosus e L. casei. ou L. acidophilus. Pertencente ao gnero Lactobacillus, famlia Lactobacillaceae, estes microrganismos so bacilos geralmente largos e finos, que formam cadeias na maioria de suas espcies. So microaerfilos, catalase positivo, Gram negativos, e fermentam os acares produzindo cido lctico com principal produto. Se so homofermentativos, fermentam o acar formando principalmente, cido lctico e insignificantes quantidades de cido actico, dixido de carbono e outros produtos; se so heterofermentativos, produzem cido lctico, e uma importante quantidade de compostos volteis, entre eles se encontram o lcool (JAY, 1994). O Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophillus, esto entre os lactobacilos homofermentativos. O Streptococcus thermophillus, pertencente ao gnero Streptococcus, famlia Lactobacillaceae, so cocos que formam cadeias curtas ou largas, e so homofermentativos (FRAZIER e WESTHOFF, 1993). 4.2. Bactrias bfidas

4.2.1. Gnero Bifidobacterium As bifidobactrias foram isoladas pela primeira vez no final do sculo XIX por TISSIER, sendo, em geral, caracterizadas por serem microrganismos Gram-positivos, no formadores de esporos, desprovidos de flagelos, catalase negativos e anaerbios (SGORBATI et al., 1995). No que diz respeito sua morfologia, podem ter vrias formas que incluem bacilos curtos e curvados, bacilos com a forma de cacete e bacilos bifurcados. Atualmente, o gnero Bifidobacterium inclui 30 espcies, 10 das quais so de origem humana (cries dentrias, fezes e vagina), 17 de origem animal, 2 de guas residuais e 1 de leite fermentado; esta ltima tem a particularidade de apresentar uma boa tolerncia ao oxignio, ao contrrio da maior parte das outras do mesmo gnero. As bifidobactrias esto inseridas na ordem das actinomicetas, dentro do grupo das bactrias Gram positivas (SGORBATI et al., 1995), e so caracterizadas por um contedo elevado de guanina e citosina que varia, em termos molares, de 54 a 67%; possuem tambm algumas diferenas notveis ao nvel das propriedades fisiolgicas e bioqumicas, incluindo os constituintes da parede celular. So organismos heterofermentativos, que produzem cidos actico e lctico na proporo molar de 3: 2 a partir de 2 moles de hexose, sem produo de CO2, exceto durante a degradao do gluconato. Alm da glicose, todas as bifidobactrias de origem humana so capazes de utilizar a galactose, a lactose e a frutose como fontes de carbono. Um estudo recente, que avaliou 290 estirpes de 29 espcies de bifidobactrias de origem animal ou humana (CROCIANI et al., 1994), apontou a possibilidade de algumas espcies serem capazes de fermentar hidratos de carbono complexos. Segundo KIM (1988), bactrias lcticas e bifidobactrias so considerados microrganismos que trazem benefcio a organismos humanos e animais. Assim, o desenvolvimento de pesquisas com relao a tais bactrias apresenta grande interesse em diferentes setores da cadeia alimentar. Vrios produtos comerciais contendo bactrias lcticas e/ou bifidobactrias esto disponveis e sua funcionalidade e viabilidade comercial so amplamente discutidos no que diz respeito aos benefcios que trazem: constipao, diarria e outras desordens intestinais podem ser satisfatoriamente tratadas pela L.acidophillus; outra propriedade da L. acidophillus o efeito antagnico que apresenta com relao a microrganismos enteropatognicos como Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus e Clostridium perfringens; benefcios em pacientes com intolerncia lactose parece funo da L. acidophillus; possveis efeitos na reduo srica de colesterol e degradao de nitrosaminas.

A atividade redutora dos nveis sricos de colesterol pelas bactrias lcticas tambm relatada por GOPAL e colaboradores (1996). Desde 1941, quando METCHNIKOFF lanou as primeiras idias de que o consumo regular de produtos lcteos fermentados poderiam oferecer certos benefcios salutares para seu consumidor, efeitos profilticos e teraputicos de iogurte e produtos correlatos tm sido objeto de muitas pesquisas (TAMIME et al, 1995). A influncia das culturas lcteas nas caractersticas fsico-qumicas e organolpticas de iogurte foi estudada por meio da inoculao do leite com diferentes combinaes dessas culturas durante um perodo de armazenamento de trinta dias (NEIROTTI e OLIVEIRA, 1988).

5. Valores nutritivo e teraputico dos alimentos probiticos A constatao de efeitos probiticos de aditivos bacterianos viveis data de h muitos anos e tem variado, ao longo do tempo, em funo do conhecimento em diferentes momentos. No princpio do sculo XX, TISSIER defendia que as bifidobactrias eram importantes para a sade e nutrio das crianas, incluindo os recm-nascidos afetados por diarrias; tal efeito era atribudo capacidade das bifidobactrias removerem as bactrias putrefativas responsveis pelas desordens gstricas, e de se restabelecerem ecologicamente como microrganismos intestinais dominantes. Pouco depois, METCHINIKOFF atribua propriedades mgicas ao iogurte, capaz de desencadear uma longevidade duradoura, alegando que o consumo regular de grandes quantidades de iogurte contendo espcies de L. acidophilus resultava numa capacidade alargada de controle de infeces por agentes patognicos entricos, associados ao controlo da toxemia crnica natural, a qual tem um papel fundamental no envelhecimento e, conseqentemente, na mortalidade. 6. Efeito benfico: possveis mecanismos Os efeitos salutares das bactrias lticas esto possivelmente ligados a efeitos como: melhor digestibilidade, aumento do valor nutritivo, nveis elevados das vitaminas do complexo B e de alguns aminocidos, melhor utilizao da lactose, nveis reduzidos de lactose no produto e maior disponibilidade de lactase. A ao antagnica contra agentes patognicos entricos, distrbios tais como diarria, colite mucosa, colite ulcerosa, diverticulite e colite antibitica, deve-se possivelmente a ao controlada pela acidez, a inibio da adeso de outros microrganismos, e inibio da ativao de microrganismos patognicos. Colonizao intestinal, sobrevivncia no suco gstrico, resistncia a lisozima e tenso superficial baixa do intestino, adeso ao epitlio intestinal, multiplicao no trato gastrointestinal, modulao imunitria, ao anticarcinognica, converso de potenciais pr-carcinognicos em compostos menos perniciosos, ao inibitria perante alguns tipos de cancro, ao hipocolesterolmica, produo de inibidores da sntese de colesterol, utilizao do colesterol por assimilao e precipitao com sais biliares desconjugados, modulao imunitria, melhor produo de macrfagos, tambm so mecanismos efetivos para obteno dos efeitos benficos por meio da ingesto de bactrias lcticas. A eficaz dos agentes probiticos nestas situaes justificado, no s no tratamento, mas tambm na preveno de tais alteraes. So vrios os trabalhos de reviso (MARTEAU e RAMBAUD, 1993; SALMINEN et al., 1996) que documentam o uso destes agentes para o tratamento de desordens intestinais. 7. Desenvolvimento A composio do leite para posterior processamento do iogurte determinada para o estabelecimento de suas qualidades fsico-qumicas e nutricionais, bem como para a aptido do produto para o consumo humano. As bactrias probiticas adicionadas ao iogurte possuem propriedades teraputicas e tambm aquelas vinculadas qualidade fsico-qumica e sensorial do produto, porm, pouco se

conhece sobre os aspectos tecnolgicos da incorporao destes microrganismos em produtos lcteos (DINAKAR; MISTRY, 1994; MALCATA et al, 1995). Mesmo assim, comprovada a ao de atividades enzimticas responsveis pelos fenmenos de fermentao, protelise e liplise, bem como da produo de compostos aromticos (DELLAGIO et al, 1992). Na fermentao do iogurte, os microrganismos thermophillus se desenvolvem inicialmente com grande intensidade para gerar ambiente favorvel para os microrganismos bulgaricus, os quais intensificam seu desenvolvimento gradativamente. Assim, as duas culturas so simbiticas (BEHMER, 1999). A cultura "starter" do iogurte, pertencentes ao grupo conhecido genericamente como bactrias cido lcticas, pois iro iniciar o processo de coalho do leite para posterior iogurte, deve conter uma porcentagem igual das duas bactrias e tambm das bactrias probiticas usadas: Lactobacillus acidophillus e Bifidobacterium bifidum. 8. Material Vidrarias necessrias para a realizao das anlises fsico-qumicas; Reagentes analticos puros de boa procedncia, necessrios s anlises; Leite integral obtido da ordenha da fazenda escola da Universidade Estadual de Ponta Grossa; Culturas "starter": Staphilococcus thermophillus e Lactobacillus bulgaricus, na mesma porcentagem, nomeadas de YC-X11 (Chr Hansen); Culturas probiticas selecionadas: Lactobacillus acidophillus e Bifidobacterium bifidum, nomeadas de La-5 e Bb-12 (Chr Hansen), respectivamente. As porcentagens das culturas "starter" e as bactrias probiticas utilizadas para suplemento no iogurte foram utilizadas conforme seleo avaliada por QUEIROGA (2001).

9. Mtodos Foram elaborados dois iogurtes, com os microrganismos comuns: Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus segundo BEHMER (1995). Logo aps a adio das bactrias lcticas comuns, era adicionada a bactria probitica em cada iogurte: Lactobacillus acidophillus em iogurte comum e Bifidobacterium bifidum em iogurte comum anteriormente elaborado. O iogurte probitico lquido era envasado em tubos de ensaio estreis, colocados em estufa (43 C), durante 5 horas aproximadamente. Em seguida, o iogurte probitico pronto, j com sua viscosidade normal, era armazenado sob refrigerao. O iogurte era analisado fsicoquimicamente durante um perodo de 30 (trinta) dias, sendo que as anlises avaliadas foram executadas posteriormente no dcimo dia, vigsimo dia, vigsimo quinto dia e trigsimo dia. A elaborao deste produto foi realizada em dois blocos, por meio de procedimentos idnticos, tanto para o processamento, quanto para as anlises realizadas no mesmo. As anlises fsico-qumicas realizadas no iogurte adicionado de bactrias probiticas, em cada um dos intervalos pr-determinados foram: Extrato seco total, pelo mtodo Gravimtrico; Extrato seco desengordurado, por reduo de extrato seco total e lipdios; Protenas, pelo mtodo de Kjeldahl;

Acidez, pelo mtodo Titulomtrico (Dornic); pH, pelo mtodo Eletroanaltico; Componentes lipdicos e lipossolveis, pelo mtodo do Butirmetro de Gerber; Resduo mineral fixo, pelo mtodo da incinerao Dupla em Manta a 5500C (PEREIRA et al, 2001).

As anlises fsico-qumicas relevantes no estabelecimento da qualidade do iogurte so aquelas relacionadas concentrao de componentes (protenas, lipdios, extrato seco), bem como quelas relacionadas s caractersticas sanitrias (acidez, pH). Os intervalos para a avaliao fsico-qumica do iogurte probitico foram realizadas no 1 dia de armazenamento, 10 dia, 20 dia, 25 dia e 30 dia de armazenamento do iogurte. Esses intervalos foram escolhidos para se observar s mudanas que poderiam ocorrer no iogurte durante seu armazenamento e saber como se comportam as mudanas, analisando o iogurte em intervalos de tempo menores. As bactrias probiticas conseguiram sobreviver durante 30 dias de armazenamento; pois um iogurte natural tm uma "shelf-life" (vida-de-prateleira) de aproximadamente 30 dias, quando a acidez est em grau elevado, porm com caractersticas sensoriais e sanitrias aceitveis. 10. Concluso Quando se trata do desenvolvimento de um produto alimentcio necessrio um rgido controle de qualidade. Neste trabalho foram realizadas as anlises fsico-qumicas referentes a um novo produto: um iogurte adicionado de bactrias probiticas. Desta maneira, ocorreram: diminuio nas concentraes de extrato seco total, extrato seco desengordurado, minerais, protenas, gordura (devido utilizao destes componentes como nutrientes e fontes de carbono e nitrognio), reduo de pH e elevao da acidez (devido converso de lactose em cido ltico) do iogurte probitico. Foram detectados tambm resultados discrepantes, como a concentrao de protenas que iniciou com uma concentrao "X", ocorrendo uma pequena diminuio e posterior aumento gradativo e depois um decrscimo (nos dois tipos de iogurtes: Bb-12 e La-5). Isso tambm ocorreu com a concentrao de minerais. Com as concentraes de extrato seco total e desengordurado ocorreu tambm este tipo de comportamento, entretanto sua concentrao iniciou alta, diminuindo e posteriormente aumentando levemente, e seguido de nova diminuio (ocorreu com o iogurte tipo La-5). (Isso pode ter acontecido durante a manipulao do iogurte para a coleta, na realizao das anlises ou por erro dos equipamentos que foram utilizados para tais anlises). Com relao acidificao do produto, os resultados apresentados so satisfatrios no que diz respeito ao controle sanitrio e caractersticas sensoriais. A acidificao se tornou estvel a partir do 25 dia das anlises realizadas, ocorrendo simultaneamente nos dois tipos de culturas probiticas adicionadas no iogurte. 11. Referncias BADRAN, I. I; REICHART, O. Studies on the growth and acid production of pure and mixed cultures of Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophillus and Lactobacillus bulgaricus. Acta Alimentaria. Vol.24(3), pp227-287, 1995.

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