Técnicas utilizadas em BCM

análise genética vs análise proteica

- proteica: eletroforese em gel, western-blotting, imunoensaios, MALDI-TOF,
espectrometria de massa
- genética: hibridação in situ, PCR, sequenciação de DNA

microscopia
- microscopia ótica: utiliza luz visível para observar células e grandes organelos
 oculares – apenas ampliação
 objetivas – ampliação e definição
 microscopia de campo claro: configuração básica do microscópio
ótico, é uma técnica em que há pouco contraste
- microscopia de fluorescência: usa fluocromos ou proteínas fluorescentes para
visualizar proteínas componentes celulares específicos
 fluorescência: capacidade de uma substância emitir luz quando
exposta a radiações do tipo ultravioleta, raios catódicos ou raios X
 radiações absorvidas: invisíveis ao olho humano, transformam-se em
luz visível, ou seja, com um comprimento de onda superior ao da
radiação incidente
 energia absorvida por um átomo: eletrão excitado
 quando o eletrão regressa ao seu estado fundamental, emite um fotão
 fluoróforo = fluorocromo (marcador/fluorescência extrínseca) –
componente de uma molécula que faz com que esta seja fluorescente,
absorverá energia de um comprimento de onda específico e
posteriormente emitirá noutro comprimento de onda superior (com
menor energia), a quantidade de energia emitida e o seu comprimento
de onda dependem tanto do próprio fluoróforo como do ambiente
químico em que está
 GFP (green fluorescente protein) – pode ser fundida com qualquer
proteína de interesse usando métodos convencionais de DNA
recombinante, introduzindo o gene que vai expressar a GFP, as células
emitem fluorescência verde quando irradiadas corretamente, esta
técnica permite a localização subcelular de uma determinada proteína
- microscopia confocal: fornece imagens de alta resolução ao eliminar a luz desfocada
 técnica avançada de imagem usada para obter imagens de alta
resolução e em 3 dimensões de amostras biológicas, a principal
vantagem é a capacidade de produzir imagens mais nítidas ao eliminar
a luz fora de foco o que permite a visualização detalhada de estruturas
celulares em diferentes planos
 utiliza um laser como fonte de iluminação
- microscopia eletrónica: utiliza um feixe de eletrões em vez de luz, oferece
visualizações detalhadas da ultraestrutura celular com resolução muito alta
 SEM – 0,4 nm
 TEM – 0,05 nm
 a imagem é projetada sobre uma tela fosforescente de sulfureto de
zinco, nos pontos onde embate um eletrão são emitidos fotões podendo
a imagem ser vista indiretamente, através da “descodificação”
realizada pela matéria fosforescente do ecrã
  preparação:
1. fixação – agentes físicos ou químicos
2. inclusão – resinas do tipo epóxi (Araldite, Epon)
3. ultramicrotomial/corte – espessura  0,1m ( 100nm)
4. desidratação – com uma mistura de resina de inclusão
5. coloração/contraste – deposição de elementos de elevado
nºatómico (chumbo, urânio, tungsténio) – dispersantes de
eletrões
6. observação
 informação topográfica – eletrões secundários (10nm de profundidade)
 informação do contraste atómico (composição) – eletrões
retrodifundidos (1-2m profundidade)
 informação elemental (quantitativa e qualitativa) – raios X (2-5m
profundidade)

Imunocitoquímica
- utilizada para visualizar e localizar proteínas ou outros antígenos dentro de
células individuais
- utiliza anticorpos específicos que se ligam às moléculas alvo
- técnica amplamente usada em bcm para estudar a distribuição e expressão de
proteínas específicas em células
- fixação – células são fixadas numa lâmina para preservar a sua morfologia e as
estruturas internas
- permeabilização – para permitir a entrada dos anticorpos nas células, a
membrana celular é permeabilizada com detergentes
- incubação com anticorpo primário – um anticorpo primário, específico para o
antígeno ou proteína de interesse, é aplicado sobre as células, este anticorpo irá ligar-se
especificamente à proteína alvo
- incubação com anticorpo secundário – após o anticorpo primário se ligar à
proteína alvo, é aplicado um anticorpo secundário que reconhece o anticorpo primário, o
anticorpo secundário é geralmente conjugado com uma molécula sinalizadora
(fluoróforo, enzima – reações de coloração visíveis)
- deteção
 fluorescência – anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo, as
células podem ser visualizadas ao microscópio de fluorescência
 colorimétrica – anticorpos secundários ligado a uma enzima (peroxidase),
a reação entre a enzima e um substrato forma um precipitado colorido, que
pode ser visualizado ao microscópio ótico

principais tipos de instrumentos de fluorescência

- citómetros de fluxo – medem a fluorescência de partículas em suspensão numa
amostra em fluxo permitindo a identificação e quantificação de subpopulações
- microscópios de fluorescência – detetam a fluorescência de objetos
microscópicos (menos de 1mm diâmetro) em função das coordenadas espaciais a 2 ou 3
dimensões
- espectrofluorímetros e leitores de microplacas – medem a fluorescência total
média da amostra
- fluorescence scanners – detetam a fluorescência de objetos macroscópicos (géis
de eletroforese) em função das coordenadas espaciais a 2 dimensões
componentes de instrumentos de fluorescência
- fonte de luz de excitação
- filtros para isolar os fotões de emissão dos fotões de excitação
- detetor que regista os fotões de emissão
- quase todos requerem a presença de um fluoróforo na amostra
- produzem diferentes artefactos e requerem diferentes características dos fluoróforos

citometria de fluxo
- técnica laboratorial utilizada para contar, classificar e caracterizar células ou
partículas em suspensão, com base nas suas propriedades físicas e bioquímicas
- eficaz para a análise de populações celulares complexas de forma rápida e precisa
- amostra contendo células ou partículas é suspensa num líquido e passda através
de um sistema que permite a análise individual de cada célula à medida que passa por um
feixe de luz
- tamanho – com base na dispersão de luz frontal (FSC – forward scatter)
- granulosidade interna/complexidade – com base na dispersão de luz lateral
(SSC – side scatter)
- expressão de marcadores de superfície/intracelulares – detetada através da
fluorescência de anticorpos conjugados a fluorocromos

eletroforese de proteínas
- técnica utilizada para separar proteínas com base no seu peso molecular
- desnaturação de proteínas – as proteínas são tratadas como SDS (dodecil
sulfato de sódio), um detergente que rompe as interações não covalentes das proteínas,
fazendo com que se desenrolem e adquiram uma forma linear, também se liga
uniformemente às proteínas, conferindo-lhes uma carga negativa proporcional ao seu
comprimento, a carga original da proteína é mascarada e todas as proteínas migrarão de
acordo com o seu tamanho
- DTT/-mercaptoetanol – reagentes adicionados para quebrar pontes de
dissulfeto nas proteínas, assegurando que as suas subunidades de proteínas multiméricas
sejam separadas
- gel de poliacrilamida – atua como matriz porosa, quando uma corrente elétrica
é aplicada, as proteínas carregadas negativamente devido ao SDS, migram em direção ao
elétrodo positivo (ânodo), a densidade do gel pode ser ajustada para criar poros maiores
ou menores, permitindo a separação eficiente de proteínas com diferentes pesos
moleculares
- separação por peso molecular – as proteínas menores migram mais
rapidamente através dos poros do gel, enquanto as proteínas maiores encontram mais
resistência e, portanto, movem-se mais lentamente, esta separação é quase
exclusivamente baseada no tamanho das proteínas, já que o SDS uniformiza a carga
- coloração do gel – após a eletroforese, o gel é corado com um corante que se
liga às proteínas, tornando-as visíveis, as proteínas aparecem como bandas distintas e a
posição das bandas no gel indica o tamanho das proteínas em relação a um padrão de peso
molecular conhecido

Western-Blotting
- princípio – deteção da expressão proteica, método semiquantitativo
Imunoensaios
- reação antigénio-anticorpo – radioimunoensaio (RIA), imunocromatografia,
imunoaglutinação, imunofluorescência, imunoenzimático (ELISA)
- reação enzimática
- quantificação por espectrofotometria – direto (deteção antigénio), indireto
(deteção anticorpo)
- testes serológicos para a COVID-19

Sistemas de identificação microbiana por Maldi-TOF

- é usado para sequenciar proteínas, mapear biomoléculas em tecidos, identificar
microrganismos e analisar vários milhares de ensaios bioquímicos num dia
- princípio – identificação de uma molécula e determinação da sua estrutura
química por meio de análises de massa e carga de iões, determinar a composição
elementar de uma amostra, identificação do género e espécie de um microrganismo em
apenas alguns minutos

análise de genes
hibridação in situ
- técnica de biologia molecular usada para detetar e localizar sequências
específicas de DNA ou RNA diretamente em células, tecidos ou cromossomas, mantendo
a sua arquitetura intacta
- amplamente utilizada para estudar a expressão génica, distribuição de genes e
arranjos cromossómicos em contextos celulares e tecidulares
- fluorescente (FISH – fluorescence in situ hybridization) – utiliza sondas
marcadas com fluorocromos, quando essas sondas hibridam com o DNA ou RNA alvo,
podem ser visualizadas diretamente usando um microscópio de fluorescência
- cromogénica (CISH – chromogenic in situ hybridization) – utiliza sondas
ligadas a enzimas que geram um produto colorido após uma reação enzimática, a
vantagem é que os resultados podem ser visualizados num microscópio ótico
convencional
- com RNA (RNA-ISH) – é usada para detetar RNA mensageiro ou outras
moléculas de RNA em células e tecidos, permite visualizar a expressão espacial e
temporal de genes específicos em diferentes estágios de desenvolvimento ou condições
patológicas
PCR (polymerase chain reaction)
- princípio – amplificar uma sequência de ácidos nucleicos
- aplicação – pesquisa de DNA, RNA viral ou RNAr a partir
de produtos biológicos

RT-PCR (reverse transcription PCR)

- baseada na técnica de PCR
- análise de expressão de genes pela quantificação de RNAm
- transcriptase reversa converte o RNAm em cDNA

PCR quantitativo (qPCR)

Sequenciação de DNA
- determinação da sequência nucleotídica de um fragmento de DNA
- sequenciação completa de genomas
- determinação de mutações genéticas
- descrita pela 1ºvez em 1977 por Sanger et al.
- reação de sequenciação:
 reação de PCR com apenas um primer
 incorporação de didesoxinucleótidos na cadeia em crescimento termina o
passo e extensão