Universidade Federal de Viosa Centro de Cincias Biolgicas e da Sade Departamento de Microbiologia

QUORUM SENSING EM BACTRIAS PSICROTRFICAS PROTEOLTICAS ISOLADAS DE LEITE

Uelinton Manoel Pinto Maria Cristina D. Vanetti Hilrio Cuqueto Mantovani Elza Fernandes Arajo Virgnia M. C. Alves

Regulao em procariotos
Fatores ambientais:
Fonte de carbono, nitrognio, osmolaridade, temperatura, pH aceptor final de eltrons Sistemas de dois componentes Fatores sigma Sinais diversos como cAMP, oxignio, substncias atrativas ou repelentes, etc.

Regulao baseada no nmero de clulas

Um novo tipo de regulao Existe uma comunicao entre as clulas Populaes bacterianas como organismos multicelulares

Regulao da expresso gnica em funo da densidade populacional - Quorum sensing (Fuqua et al., 1994).

Gram-negativos

Gram-positivos

Bioluminescncia, produo de antibiticos, enzimas extracelulares e diversos outros fatores de virulncia

Competncia e esporulao em B. subtilis, produo de fatores de virulncia em S. aureus

Fonte: Bassler (2002)

O paradigma do sistema
Simbiose entre Vibrio fisheri e a lula Eupryma scolopes

Ladzdunski et al. (2004)

Ruby (1996)

Componentes do sistema Quorum Sensing

Vibrio fisheri Molcula sinal (Acil-homoserina lactona - AHL) Sintase de AHL - LuxI Protena sensora de AHL - LuxR box lux Genes alvos - luxICDABEG e luxR

Clula

Quorum Sensing
Vibrio fisheri

luxR
LuxR

box Lux

luxI C D A B E G
OHHL LuxI

Quorum Sensing em outras bactrias Gram-negativas

AHLs de cadeias carbnicas laterais diferentes; Protena sensora homloga LuxR; Sintase homloga LuxI; Genes alvos diversos; Outros sistemas diferenciados.

Quorum sensing
Deteco da Produo de AHL Bioluminescncia - Escherichia coli pSB403 Pigmentao (Violacena) - Chromobacterium violaceum CV026 Atividade de -Galactosidase - Agrobacterium tumefaciens
A136

Valores mdios da populao de P. fluorescens e os valores mdios da concentrao de tirosina por 5 ml de LDR 12% durante a estocagem a 2C ( ), 4C ( ), 7C ( ), 10C ( ). A- P. fluorescens 07A, B- P. fluorescens 041.

A
6

Tirosina(mg/5ml)

Tirosina(mg/5ml)

0 0 2 4 6 8 10

0 0 2 4 6 8 10

Log UFC/ ml

Log UFC/ ml

Pinto et al. (2004)

Problemas tecnolgicos em produtos lcteos relacionados ao crescimento de bactrias psicrotrficas em leite cru refrigerado
Produto Leite UHT Psicrotrficos em leite cru (Log UFC/mL) 6,9 - 7,2 Problema Gelificao entre 2-10 semanas; Perda de frescor; Sabor amargo. Reduo da vida til; Diminuio da estabilidade trmica. Reduo do rendimento; Defeitos de flavor; Rancidez. Rpido desenvolvimento de rancidez.

Leite pasteurizado Queijo

7,0 - 8,0

7,5 - 8,3

Manteiga

ND

Srhaug & Stepaniak (1997)

 Deteriorao de leite e produtos lcteos: Acmulo e atividade de enzimas proteolticas e lipolticas de bactrias psicrotrficas;

Principais bactrias relacionadas: Achromobacter, Aeromonas, Serratia, Chromobacterium, Flavobacterium e Pseudomonas

Frank (1997)

Caractersticas das Proteases

Termoestabilidade (Law, 1979; Cousin, 1982) Extracelulares (Liao & McCallus, 1998) Metaloproteases/Endopeptidases (Srhaug & Stepaniak,1997;
Liao & McCallus,1998)

Produo e atividade a baixa temperatura

Stepaniak,1997)

(Srhaug &

Caractersticas das Proteases

A aerao otimiza a sua produo; Acares fermentescveis reprimem a produo; ons clcio e zinco estabilizam a enzima (Malik et al., 1985) Fases de produo
(Malik et al., 1985; Srhaug & Stepaniak, 1997; Rajmohan et al., 2002; Pinto et al., 2004)

O quorum sensing pode estar relacionado regulao da atividade hidroltica em Pseudomonas deterioradoras de leite.
Whan et al. (2000)

 Deteco de altas concentraes de AHL em bactrias deterioradoras e em alimentos (Ravn et al., 2001; Gram et al., 2002;
Flodgaard et al., 2003)

Regulao de enzimas hidrolticas em Serratia proteamaculans por quorum sensing (Christensen et al., 2003) A adio de duas AHLs ao meio reduziu a fase lag e a taxa de crescimento exponencial em P. fluorescens (Whan et al.,
2000)

Presena de bactrias produtoras de AHL e potencial funo do quorum sensing na deteriorao de carne (Bruhn et
al., 2004)

Percentual de Bactrias Psicrotrficas Proteolticas Isoladas do Leite Cru

20,7 22,67 4,58 3,92 4,62 34,28

79,3 Gram-negativos Gram-positivos

9,23 Aeromonas Klebsiella Outros

PINTO, 2004

Pseudomonas Serratia Moraxella

Objetivo Geral

Avaliar a produo de AHL por isolados bacterianos

psicrotrficos proteolticos e verificar se a produo de proteases termorresistentes por P. fluorescens est relacionada com o sistema quorum sensing.

Objetivos Especficos
Detectar a produo de molculas indutoras (Acil Homoserina Lactona - AHL) em bactrias psicrotrficas proteolticas isoladas de leite; Determinar o crescimento, atividade proteoltica e a produo de AHL pelo isolado de P. fluorescens 07A em diferentes meios de cultivo e durante o crescimento celular; Verificar o efeito da adio molculas indutoras ou do

extrato de AHL obtido da cultura sobre o crescimento e atividade proteoltica da estirpe P. fluorescens 07A.

Estratgia Experimental
Estirpes Testes Cinqenta e trs isolados psicrotrficos proteolticos (Pinto, 2004) Estirpes de Referncia Aeromonas hydrophila ATCC 7966 Chromobacterium violaceum ATCC 6357 Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 Pseudomonas fluorescens ATCC 13525 Serratia liquefaciens ATCC 27592 Bactrias Indicadoras Agrobacterium tumefaciens A136 (Fuqua e Winans, 1996) A. tumefaciens KYC55 (Zhu et al., 2003) A. tumefaciens WCF47 (Zhu et al., 1998) Chromobacterium violaceum CV026 (McClean et al.,1997) Escherichia coli pSB403 (Winson et

al., 1998)

Estratgia Experimental
Produo de AHL - Pigmentao

Estirpe teste

AHL de cadeia curta (4-8 C) AHL de cadeia comprida (10-14 C)

C. violaceum CV026

gar LB suplementado ou no com N-hexanoil-L-homoserina lactona

Estratgia Experimental
Produo de AHL - Bioluminescncia

Estirpe teste

E. coli pSB403

gar LB

Estratgia Experimental
Produo de AHL - Beta-Galactosidase

Estirpe teste

A. tumefaciens A136

gar LB + X-Gal

Extrao de AHL para estirpes 07A e 016

Acetato de etila Acetato de etila 3x 30 s

Evaporao

Estocagem a - 20C

3x

Ressuspenso em 0,5 a 1,0 mL de gua

Shaw et al. (1997) ou Ravn et al. (2001)

Estratgia Experimental
Determinao de AHL em extrato obtido de S. liquefaciens 016 e P. fluorescens 07A

Extrato 50 l

C. violaceum CV026 ou A. tumefaciens A136 inoculados em gar LB

Estratgia Experimental
Determinao de AHL em sobrenadante ou extrato da estirpe 07A
Sobrenadante 12 ml gar AT concentrado 5 ml Extrato - 0,1 ml

Meio AT - 15 m

Estirpe monitora

Estirpe monitora

Antibiticos

X-gal - 40 g/ml

Antibiticos

X-gal - 40 g/ml

Estratgia Experimental
Dinmica da produo de AHL

Extrao de AHL ao longo de crescimento P. fluorescens 07A (22C/150 rpm) Ensaio de -Gal Miller (1972)

Ressuspeno em 0,5 ml de gua esterilizada 0,1 ml

A. tumefaciens
KYC55

Meio AT

25C/150 rpm por 12 h Zhu et al. (2003)

Estratgia Experimental
Avaliao do crescimento e produo de proteases

Leite Desnatado Reconstitudo 12% (LDR);

Meio Mnimo Sal (K2HPO4 0,7%; KH2PO4 0,2%; MgSO4.7H2O
0,02%; (NH4)2SO4 0,1%; glicerol 0,4% e CaCl2 1 mmol l-1 );

Caldo TYEP (triptona 1%; extrato de levedura 0,25%; KH2PO4 0,1%; K2HPO4 0,1%); Caldo TYEP + Lactose 0,5%; Caldo TYEP + Glicose 0,5%; Caldo TYEP + CaCl 0,25%.

Estratgia Experimental
Crescimento (Tcnica de Microgotas) Atividade proteoltica (Rajmohan et al., 2002)

Diluies seriadas Salina 0,85%

P. fluorescens (22C/150 rpm)

gar PCA

Estratgia Experimental
Induo da atividade proteoltica pelo sobrenadante da cultura

Crescimento at final da fase log de crescimento a 25C/150 rpm em 5000 g 100 ml LB

Esterilizao

Extrao de AHL em acetato de etila

Avaliao da produo de proteases e protena microbiana por diferentes densidades populacionais de P. fluorescens em MMS

Tabela 1: Determinao de bactrias produtoras de AHL

Espcies avaliadas N de estirpes positivas 1 1 2 1 2 1 1 1 1 E. cloacae E. gergoviae E. sakasaki Hafnia alvei K. oxytoca K. ozanae M. catharralis 1 1 2 3 2 2 1 1 1 1 1 2 3 2 2 1 1 1 1 1 1 3 1 1

ResultadosN de respostas em cada sistema N de estirpes

negativas em todos sistemas monitor

A. lwoffi A. hydrophila

B. pseudomallei Cedecea lapagei Chryseobacterium miningosepticum C. luteola

CV 026 Induzido Inibido pSB403 A136 1 1 1 1 1 2 1 1 2

Resultados
Espcies avaliadas N de estirpes positivas 2 N de estirpes N de respostas em cada sistema negativas monitor em todos sistemas CV 026 Induzido Inibido pSB403 A136 2 2 1 1 7 7 2 2 1 1 1 S. liquefaciens 4 1 1 1 1 S. odorifera Total 1 1 47 1 6 10 1 36 1 15 9 4 1 1 1 IC 1 1 1

P. agllomerans Pantoea spp P. stuartii Pseudomonas fluorescens P. putida P. stutzeri R. aquatilis

7 2 2 1 1

Resultados
Tabela 2: Porcentagem de isolados positivos para produo de AHL em cada sistema monitor

CV 026 pSB403 A136 Total geral Induzido Inibido Isolados psicrotrficos 18,9 67,9 28,3 17,0 88,7 proteolticos Estirpes de referncia 14,3 85,7 28,6 42,8 100 Total avaliado 18,3 70,0 28,3 20,0 90,0

Bioensaio de induo da produo de violacena pela estirpe CV 026 em gar LB 1,2%

C. violaceum CV026

C. violaceum CV026

P. fluorescens 07A

S. liquefaciens 016

Resultado negativo

Resultado positivo

Bioensaio de inibio da produo de violacena pela estirpe CV 026 em gar LB 1,2% suplementado com HHL

S. liquefaciens 039

P. aeruginosa ATCC 15442

C. violaceum CV026

C. violaceum CV026

Resultado negativo

Resultado positivo

Bioensaio de induo da produo de bioluminescncia pela estirpe E. coli pSB403 em gar LB 1,2%

E. coli pSB403

E. coli pSB403

P. fluorescens 07A

S. liquefaciens 016

Resultado negativo

Resultado positivo

Bioensaio de induo da produo de -Galactosidase pela estirpe A. tumefaciens A136 em gar LB 1,2% suplementado com 50 g/ml de X-Gal

A. tumefaciens A136

A. tumefaciens A136

S. liquefaciens 016

P. fluorescens 07A

Resultado negativo

Resultado positivo

Resultados
Verificao da presena de AHL em extratos obtidos da cultura S. liquefaciens 016 e P. fluorescens 07A em bioensaio com a cultura C. violaceum CV026

016

07A

016

07A

Resultados
Verificao da presena de AHL em extrato ou sobrenadante obtido da cultura P. fluorescens 07A em bioensaio com as estirpes monitoras A. tumefaciens A136 (1), WCF47(2) e KYC55(3)

C1 2 3

C+

1 2 3

Resultados
Dinmica da produo de AHL por P. fluorescens 07A em MMS e TYEP +CaCl2
1600 Atividade de Betagalactosidase 1200 800 400 0 0 20 40 60 80 Tempo (h)

1600 Atividade de BetaGalactosidase 1200 800 400 0 0 20 40 60 80 Tempo (h)

Resultados
Crescimento de P. fluorescens 07A
10,0

Populao Log(UFC/mL)

9,0

8,0
TYEP

7,0

TYEP + Lactose 0,5% TYEP + Glicose 0,5%

6,0

TYEP + CaCl2 0,25% MMS

5,0

LDR 12%

4,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 Tempo (h)

Resultados
Atividade proteoltica de P. fluorescens 07A
70 60 50 40 30 20 10 0 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 Tempo (h)
TYEP TYEP + Lactose 0,5% TYEP + Glicose 0,5% TYEP + CaCl2 0,25% MMS LDR 12%

Unidades de Enzimas proteolticas

Resultados
Atividade proteoltica e densidade populacional TYEP
Unidades de Enzimas Proteolticas Unidades de Enzimas Proteolticas 60 45 30 15 0 6 7 8 9 10 Populao (UFC/mL)

TYEP + Lac
45 30 15 0 6 7 8 9 10 Populao (UFC/mL)

TYEP + Glic
Unidades de Enzimas Proteolticas 60 45 30 15 0 6 7 8 9 10 Pop ulao (UFC/mL)

60

TYEP + CaCl2
Unidades de Enzimas Proteolticas 60 45 30 15 0 6 7 8 9 10 Populao (UFC/mL)

LDR 12%
Unidades de Enzimas Proteolticas 45 30 15 0 6 7 8 9 10 Pop ulao (UFC/mL)
Unidades de Enzimas Proteolticas

MMS
60 45 30 15 0 6 7 8 9 10 Populao (UFC/mL)

60

Resultados
Efeito do crescimento de P. fluorescens 07A sobre o pH

Meios pH i pH f

TYEP

TYEP + Lactose 7,00 8,76 0,15

TYEP + Glicose 7,00 8,4 0,14

TYEP + CaCl2

MMS

LDR

7,00 8,72 0,15

7,00

7,00

6,80

8,48 0,19 6,74 0,04 7,31 0,37

Resultados
Efeito do crescimento de P. fluorescens 07A sobre a produo de pigmentos fluorescentes em diferentes meios de cultivo aps 80 h de incubao a 22C/150 rpm

TYEP

TYEP + Lactose

TYEP + TYEP + Glicose CaCl2

LDR 12%

MMS

Resultados
Efeito da adio de -amino butirolactona (ABL) e N-hexanoil homoserina lactona (HHL) sobre o crescimento e atividade proteoltica de P. fluorescens 07A

10,0 8,0

60

Log (UFC/mL)

Controle ABL HHL

Unidades de enzimas proteolticas

50 40 30 Controle 20 10 0 ABL HHL

6,0 4,0 2,0 0,0 0 10 20 30

40

Tempo (h)

50

15

20

25

30

35

40

45

50

Tempo (h)

Resultados
Efeito da adio do extrato de P. fluorescens 07A sobre a atividade proteoltica especfica (Unidades de enzimas/protena microbiana)
90,0 80,0 70,0 Atividade Proteoltica Especfica 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 C1 E1 C2 E2 C3 E3 C4 E4 T2 T5 T10 T24

(C1 e E1 correspondem ao Tratamento Controle e Extrato na populao de 5 x 109 UFC/ml, C2 e E2 a 2 x 109 UFC/ml, C3 e E3 2 x 108 UFC/ml e C4 e E4 2 x 107 UFC/ml)

Agradecimentos

EcoR1

PluxI

OriV

lux R

EcoR1 luxC luxD

pSB403
(unio de luxRI::luxCDABE no esqueleto do plasmdeo pRK415).

luxA

pSB403 17.3 kbp

luxB

luxE

OriT Tcr

Pst1
Winson et al. (1998)

Quorum sensing
Diferenas nas cadeias de AHL

Gram et al. (2002)

Quorum sensing
Estrutura cristalina de TraR complexada com o autoindutor e DNA

Zhang et al. (2002)