Interference of hepatitis C virus

RNA replication by short

interfering RNAs
Sharookh B. Kapadia, Amy Brideau-Andersen, and Francis V. Chisari
Department of Molecular and Experimental Medicine, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA 92037

PNAS, 100 (4), 2014-2018, February 18, 2003

Introduo

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- HCV

- Fgado
- Aproximadamente 170 milhes de pessoas em fase crnica

- 3% da populao mundial
- Doena crnica
- Cirrose e Cncer
- Transfuso de sangue e drogas injetveis
- Transmisso parental
- INF e Ribavirin

O HCV

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Flaviviridae (Febre Amarela)

- Esfrico (envelope e capsdeo)

- sfRNA+ (mRNA)
- 9.6 Kb

- 1 poliprotena
- 3 protenas estruturais e 7 no estruturais
- No mantido em cultura

Estrutura
do genoma do HCV
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Protenas no estruturais
Protenas estruturais
3 UTR

5 UTR

IRES internal ribosome entry site

Poly (U/UC)

Replicao do HCV

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Biochemical Society Transactions (2002) Volume 30, part 2

Estrutura
da poliprotena do HCV
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ORF

5 UTR

E1

E2

p7

NS2

NS3

NS4a NS4b

3 UTR

NS5a

NS5b

C Capsideo
Arch Virol (2003) 148: 12471267
E1 e E2 Glicoprotenas do envelope
P7 - ?
NS2 Metaloprotease Zinco dependente (NS2/NS3)
NS3 Serina protease e RNA helicase
NS4a Cofator para NS3
NS4b - ?
NS5a Replicase ?
NS5b RNA polimerase dependente de RNA (GDD)

Estrutura do Replicon

______________________________________________________

5 UTR

3 UTR

JOURNAL OF VIROLOGY, Feb. 2003, p. 20292037

Objetivo
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Verificar se utilizando RNAi

possvel inibir a replicao do HCV

Material e mtodos

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- Clulas de hepatoma humano Huh-7

- S1179I HCV subgenomic replicon

- siRNA foram determinados utilizando o Ambion web-based
criteria e gerados utilizando Silencer siRNA construction Kit
(Ambion)
- Testados 7 siRNA
- Foram usados 2: NS3-1948 e NS5B-6133
- Foram transfectados utilizando Oligofectamine
- Scrambled siRNA (scr)
- GAPDH siRNA

S1179I
HCV
Subgenomic
Replicon
______________________________________________________

Efeitos dos vrios siRNAs nos

nveis
de
transcrio
HCV
e
GADPH
______________________________________________________

GAPDH cDNA copies (log)

HCV cDNA copies (log)

Analise por Real Time RT-PCR dos

nveis
de RNA de HCV e GAPDH
______________________________________________________

Efeito do RNAi na expresso das

protenas
de HCV nas clulas S1179I
______________________________________________________

2 dias

4 dias

6 dias

Localizao e expresso de NS5B e

siRNA em clulas S1179I
______________________________________________________

Dia 2

Dia 4

Tratamento
com
IFN
______________________________________________________
-

Induz a expresso de vrios genes

- PKR: protena Kinase ativada por dsRNA

clula
IFN

Fosforilao eIF2 alpha, parando a traduo na

Induz a fosforilao de IKappa, produzindo

- MxA: Myxovirus resistance 1 (GTPase)

- OAS: 2,5-oligoadenylate synthetase 1
Protena Kinase dependente de ds-RNA

Efeitos do RNAi sobre os gene

induzidos por IFN
______________________________________________________

PKR

MxA

6.4

367

NS3-1948

< 2.7

< 2.7

NS5B-6133

< 2.7

< 2.7

IFN

Determinao da expresso de
mRNA de OAS e GAPDH por RT-PCR
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Efeitos do tratamento com IFN e

RNAi sobre a replicao do HCV
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INIBIO
- 12,5 x com IFN

- 32 x com NS3-1948
- 36 x com NS5B-6133

Dia 2

Concluses

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- RNAi pode inibir a replicao de HCV em culturas de clulas Huh7

- A diminuio nos nveis de cDNA de HCV seqncia especfica

- RNAi comea ter efeito 2 dias aps a transfeco
- RNAi tem efeito at 6 dias aps a transfeco
- Pode ser usado na terapeutica
- Pode haver bloqueio no RNAi como ocorre em FHV