Subprojeto 3.

3 Anexo 45

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CRIAO IN VITRO DE RAINHAS DE ABELHAS SEM FERRO: UMA FERRAMENTA PARA A PRODUO RACIONAL DE COLNIAS
Cristiano Menezes1, Vera Lucia Imperatriz Fonseca2 1 Departamento de Biologia, FFCLRP/USP, Ribeiro Preto, SP 2 Departamento de Ecologia, Instituto de Biocincias USP, So Paulo, SP

Introduo
A criao racional das abelhas sem ferro, conhecida como meliponicultura, avanou bastante nos ltimos anos. Embora seja uma atividade tambm indicada para preservao e uso dos recursos naturais, o foco dos criadores no Brasil ainda a produo de mel, um produto altamente valorizado devido a suas peculiaridades. Porm, novas demandas tm surgido e aumentado a procura por colnias consideravelmente, levando alguns criadores a se dedicarem tambm multiplicao e venda de colnias (Nogueira-Neto, 1997; Cortopassi-Laurino et al., 2006). O foco do presente trabalho foi a criao de rainhas in vitro e o aperfeioamento dessa tcnica, que tem sido muito importante para o entendimento dos sistemas de determinao de castas das abelhas sem ferro nas ltimas dcadas. Por causa dos avanos da meliponicultura, se tornar uma tcnica importante, no s do ponto de vista cientfico, mas tambm prtico, permitindo obter grandes quantidade de rainhas e conseqentemente aumentar o nmero de colnias produzidas. Tambm foi estudada a viabilidade das rainhas produzidas in vitro e de um novo processo de multiplicao de colnias, por meio da formao de mini-colnias. O foco foi a identificao dos principais problemas ao longo desse processo e, tambm, a viabilidade de se formar colnias a partir de mini-colnias.

Material e Mtodos
Local de estudo e detalhes da populao estudada O estudo foi realizado no Laboratrio de Abelhas da Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras de Ribeiro Preto da Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto-SP. Foram utilizadas colnias Scaptotrigona aff. depilis, identificadas pelo Prof. Joo M. F. de Camargo. Elas foram mantidas em suportes individuais em um meliponrio com cerca de 50 colnias da mesma espcie.

Criao de rainhas in vitro

Foi utilizada a tcnica descrita por Camargo (1972) com algumas modificaes, conforme descrito abaixo. Ao invs de serem usados alvolos de cera, foram utilizados orifcios em placas de acrlico, tambm usadas em testes imunolgicos (ELISA). Cada placa continha 96 orifcios com 7mm de dimetro e 10 mm de profundidade, dimenses semelhantes s clulas reais naturais da espcie estudada.
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O alimento larval utilizado foi retirado de clulas de cria recm construdas. Posteriormente, ele foi homogeneizado e distribudo nos alvolos artificiais com uma pipeta automtica.
As larvas utilizadas nos experimentos foram provenientes de favos de cria contendo clulas de operrias e machos. Em cada placa de criao in vitro foram utilizadas larvas provenientes de trs colnias. As clulas de cria foram desoperculadas e, com o auxlio de um alfinete entomolgico dobrado na ponta em ngulo reto, uma larva recm eclodida (0-1 dia) foi colocada sobre o alimento de cada alvolo.

Controle de umidade relativa na criao in vitro

As larvas foram criadas em diferentes condies de umidade relativa ao longo do seu desenvolvimento para verificar qual seria a mais adequada. Para controlar a umidade relativa (UR) foram utilizadas solues saturadas de NaCl para manter 75%UR e de KCl para 85%UR, alm de gua destilada para 100%UR (Winston e Bates, 1960). As placas de acrlico foram mantidas sem tampa, mas dentro de placas de Petri (150x30mm) com a soluo salina ou aquosa.

Quantidade ideal de alimento larval para produo de rainhas

Foram produzidas rainhas com trs volumes diferentes de alimento larval, com 120 l (n=42 rainhas), 130 l (n=152 rainhas) e 150l (n=90 rainhas). A distncia intertegular das rainhas foi medida, conforme descrito anteriormente, e comparadas com rainhas naturais (n=126). Todas receberam o mesmo tratamento de umidade relativa (100% UR nos primeiros trs dias; 85% UR nos prximos cinco dias de larva; e 75% UR no restante do desenvolvimento).

Formao de mini-colnias com rainhas in vitro

As mini-colnias foram formadas em colmias de observao (17 x 17x 6cm, medidas internas) confeccionadas com madeira e cobertas por folha de acetato transparente. A partir de cinco colnias fortes, foram formadas 50 mini-colnias, de modo que cada colnia gerou 10 mini-colnias. Cada uma recebeu cerca de 150 operrias jovens, um favo com cerca de 350 pupas, um pouco de invlucro, um pote de plen de S. aff. depilis e um pote com mel de Apis mellifera. Cada mini-colnia recebeu, tambm, trs rainhas virgens produzidas in vitro com 3-5 dias de idade, que foram colocadas dentro de um pote de cera perfurado, permitindo que as operrias o abrissem aps certo tempo. Cada rainha foi marcada com tinta atxica no trax, para facilitar sua identificao, antes de ser introduzida na mini-colnia. As mini-colnias foram colocadas em prateleiras, distantes umas das outras por cerca de 30 cm, mas com entradas dispostas em orientaes diferentes. Foram alimentadas quinzenalmente com um pote de plen de S. aff. depilis e um pote preenchido com mel de Apis mellifera. Foram vistoriadas semanalmente para verificar se a rainha havia iniciado postura ou no. Quando havia postura, sua mini-colnia recebeu mais um favo com cerca de 250 operrias.

Resultados
O controle da umidade mostrou-se essencial para obter sucesso nas criaes in vitro. A umidade
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extrema (100% UR) causou acmulo de gua dentro do alvolo e conseqente afogamento das larvas com seis dias de vida. No entanto, o ressecamento do alimento tambm foi um problema grave nos tratamentos que mantiveram umidade relativa igual ou menor que 85% nos primeiros dias da larva. Os outros tratamentos, em que a umidade foi mantida alta nos primeiros dias e diminuda durante o restante do desenvolvimento tiveram maior sucesso (entre 75% e 97,9%). Os experimentos sobre a quantidade ideal de alimento larval para produo de rainhas mostraram que o tamanho dos indivduos produzidos influenciado pela quantidade de alimento ingerido durante a fase larval (ANOVA, F =171,5; R2 = 0,56; p < 0.0001). Porm, no houve diferena significativa entre as rainhas in vitro obtidas com 150l e as rainhas naturais (Tukey, p>0,05). Os demais grupos foram diferentes entre si (Tukey, p<0,05). Das 50 mini-colnias formadas, 13 delas tiveram uma rainha in vitro fecundada com sucesso e iniciaram oviposio. As treze mini-colnias que obtiveram sucesso foram consideradas estveis e independentes em torno de seis meses aps sua formao. As demais perderam suas rainhas, provavelmente durante o vo nupcial. Aps trs meses, suas operrias e estruturas foram doadas para as outras colnias que tinham rainhas fecundadas.

Discusso
A reduo de umidade ao longo do desenvolvimento das larvas foi utilizada pela primeira vez por Camargo (1972), sendo adotada por outros autores (Campos & Costa, 1989; Maciel-Silva & Kerr, 1991; Hartfelder & Engels, 1992; Campos & Coelho, 1993; Bezerra, 1995). O presente relato evidencia que se esse controle for realizado de forma adequada as taxas de sobrevivncia podem ser bastante altas (97,9%). O experimento sobre a quantidade ideal para se produzir rainhas in vitro, mostrou que as larvas alimentadas com o volume mdio encontrado nas clulas reais (130l, Menezes, in prep.) foram bem menores que as naturais, enquanto as que ingeriram 150l atingiram o mesmo tamanho que as naturais. Hartfelder e Engels (1992) relatam dificuldade de produzir rainhas in vitro de tamanho prximo ao tamanho de rainhas criadas em clulas reais, o que pode estar relacionada a dois fatores. Primeiro, porque na maioria dos testes realizados foi observado que as larvas sempre deixam um pouco de alimento no fundo da clula, provavelmente por causa do ressecamento do alimento e dificuldades de simular o microambiente das clulas de cria naturais. Segundo, porque geralmente usa-se a quantidade mdia de alimento larval encontrada nas clulas reais, freqentemente medida por meio de capilares ou pipetas, porm sem levar em considerao que uma parte do alimento fica aderido s paredes das clulas amostradas. Portanto, aconselhvel que seja utilizado cerca de 10 a 20% a mais do que a mdia encontrada de alimento larval nas clulas de rainhas. A utilizao da tcnica de criao de rainhas in vitro esbarrava em um obstculo crucial, a incerteza sobre a capacidade dessas rainhas de formar colnias. Camargo (1972) foi a primeira a mostrar que rainhas produzidas in vitro so capazes de formar colnias. A autora realizou um experimento com Scaptotrigona postica de forma semelhante ao presente trabalho, utilizando cinco rainhas. Duas foram mortas pelas operrias, duas voaram e no voltaram e uma conseguiu retornar sua colnia e iniciar postura. Alm desse trabalho, recentemente Prato (2007) conseguiu formar uma colnia de Tetragonisca angustula com rainha produzida in vitro e Baptistella (2009) tambm formou seis colnias de Frieseomelitta varia com rainhas in vitro. O presente estudo mostrou, com um nmero razovel de observaes (13 de S. aff. depilis), que as rainhas produzidas in vitro esto aptas a formar colnias e realizar oviposio normalmente. Esses dados representam um avano muito importante para futuras pesquisas que dependem de grande nmero de rainhas em curtos perodos de tempos.
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O novo mtodo de multiplicao possui um potencial significativo em relao aos mtodos tradicionais, pois cinco colnias de S. aff. depilis produziram 13 colnias-filha, em perodo relativamente curto, seis meses, utilizando uma pequena quantidade de materiais da colnia me. Utilizando mtodos tradicionais, cada colnia-me usada no experimento poderia formar no mximo duas colnias filhas no mesmo perodo (Nogueira-Neto,1997; Kerr et al., 1996; Heard e Dollin, 2000; QuezadaEun et al., 2001; Cortopassi-Laurino et al., 2006; Klumpp, 2007). Portanto, as cinco colnias mes gerariam 10 filhas com os mtodos tradicionais. Esse nmero inferior ao nmero de colnias obtidas com o novo mtodo (13 colnias-filha), o que j representa um ganho de 25% de produtividade.

Referncias
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