avels (Euphorbia tirucalli), por meio do teste para deteco de clones de tumor (warts) em Drosophila melanogaster
Evaluation of the anticarcinogenic effect of the latex of avels (Euphorbia tirucalli), through the test for detection of tumor clones (warts) in Drosophila melanogaster
Elcio Moreira Alves Graduando em Medicina pelo Centro Universitrio de Patos de Minas. e-mail: jrelcio@hotmail.com
Jlio Csar Nepomuceno Professor Associado do Instituto de Gentica e Bioqumica da Universidade Federal de Uberlndia. Professor Titular do Centro Universitrio de Patos de Minas. e-mails: nepomuceno@ufu.br; jcnepomuceno@unipam.edu.br
Resumo: O avels (Euphorbia tirucalli) uma planta de origem africana amplamente utilizada na medicina popular no tratamento de cnceres, lceras, inflamaes e verrugas. considera- da uma planta txica, pois seu ltex corrosivo em contato com a pele e a mucosa. Nesta pes- quisa, foi utilizado o teste para deteco de clones de tumor epitelial em Drosophila melano- gaster, com o propsito de conhecer o potencial anticarcinognico do avels. Para tanto, lar- vas wts+/+mwh, foram pr-tratadas com o quimioterpico mitomicina C (0,1mM), conhecida- mente indutor de tumor e, posteriormente, com extrato aquoso do avels (0,33; 0,5 e 1L/mL). O avels no induziu aumento nas frequncias de tumores. Porm, na associao com a mitomicina C foram verificadas redues, estatisticamente significativas, nos tumores induzidos por este quimioterpico. O extrato aquoso de avels mostrou indicaes de dose resposta na associao com a mitomicina C. Portanto, nas condies experimentais propostas neste estudo, o ltex do avels foi capaz de reduzir tumor. Palavras-chave: Euphorbia tirucalli. Avels. Warts.
Abstract: The avels (Euphorbia tirucalli) is a plant of African origin widely used in popular medicine in the treatment of cancers, ulcers, inflammations and warts. It is considered a toxic plant, because its latex is corrosive in contact with the skin and mucosa. In this research, we used the test for detection of epithelial tumor clones in Drosophila melanogaster, with the objective of knowing the anti-carcinogenic potential of the avels. This way, wts+/+mwh larvae were pre-treated with the chemotherapy drug mitomycin C (0,1mM), known as a tumor inductor, and afterwards with the aqueous extract of avels (0,33; 0,5 e 1L/mL). The avels did not induce increase in the tumor frequency. However, in the association with mitomycin C, we verified statistically significant reductions in the tumor induced by this chem- otherapy drug. The aqueous extract of avels showed indications of answer dose in associa- Perquirere, 9(2):125-140, dez. 2012 Centro Universitrio de Patos de Minas 2012 126
tion with mitomycin C. Therefore, in the experimental conditions proposed by this study, the latex of avels was able to reduce tumor. Keywords: Euphorbia tirucalli; avels; warts.
1. Introduo
A utilizao de plantas como medicamentos , provavelmente, to antiga quan- to o prprio homem. As plantas, muitas vezes consideradas seres espirituais por suas propriedades teraputicas ou txicas, adquiriram extrema importncia na medicina popular (MARTINS et al., 1995). Embora a medicina moderna seja bastante desenvolvi- da, a Organizao Mundial de Sade (2002) divulgou que 80% da populao dos pases em desenvolvimento utilizam prticas tradicionais para os cuidados bsicos com a sa- de, sendo que 85% destes o fazem por meio de plantas medicinais. O Brasil detm de 15 a 20% da biodiversidade mundial. As plantas componen- tes dessa biodiversidade so a base para a fabricao de fitoterpicos e de outros medi- camentos. Com isso, o Brasil tem a oportunidade de desenvolvimento prprio e sobe- rano na rea da sade e do uso de medicamentos naturais, que zele pela sustentabili- dade dos componentes da biodiversidade (BRASIL, 2006). O avels uma planta de origem africana levada a diversos pases tropicais, dentre eles o Brasil, no qual se aclimatou melhor na regio Nordeste. O arbusto quase sem folhas mede cerca de 7 a 8 metros de altura e conhecido pelo perigo que oferece, j que produz um suco leitoso (ltex) acre e custico (CRUZ, 1979). Por isso, utilizado nesta regio principalmente como cerca viva para afastar homens e animais (RIZZINI; MORS, 1995). Extratos da espcie Euphorbia tirucali (avels) so usados corriqueira e indiscri- minadamente como automedicao complementar ao tratamento do cncer e de outras doenas como AIDS, asma, artrite reumatoide e sfilis. Por isso, importante destacar o risco toxicolgico dessa planta medicinal, muito debatido pelo meio cientfico (VARRIC- CHIO et al., 2008b). As clulas, por meio de sinais bioqumicos, se desenvolvem, crescem, diferenci- am e morrem. As neoplasias so um conjunto de clulas que no respondem a estes sinais e se proliferam inapropriadamente. A incidncia dessas alteraes est aumen- tando devido, principalmente, ao envelhecimento da populao (JORDE et al., 2004). O Instituto Nacional de Cncer (2011) estimava que em 2012 surgissem aproximadamente 518.510 novos casos dessa doena no pas, incluindo cncer de pele no melanoma. O amplo emprego popular do avels a fim de regredir tumores estimulou Var- ricchio et al. (2000), Granja (2003), Avelar (2010), Rezende et al. (2004) e Khaleghian et al. (2010) a pesquisarem a espcie. Eles observaram indcios de que a ingesto da soluo do ltex promove diminuio na concentrao de clulas tumorais, porm os estudos no foram conclusivos. Avelar (2010) afirma que o avels estimula a produo de cito- cinas que excitam o sistema imune a combater tumores. Entretanto, ela salienta que so necessrias investigaes in vivo, utilizando modelos de desenvolvimento tumoral, associados ao tratamento com a planta. Rezende et al. (2004) encontraram potencial de antimutagenicidade na soluo ELCIO MOREIRA ALVES & JLIO CSAR NEPOMUCENO
127
contendo ltex dessa Euforbicea; no entanto, afirmam que os resultados encontrados por eles abrem caminho para o desenvolvimento de novas pesquisas que elucidaro os efeitos da espcie. Granja (2003) encontrou conflitos na literatura: alguns trabalhos apontam para um efeito pr-carcinognico, enquanto outros, para o antitumoral. Ali- ando isso ao uso popular da espcie, consideraram fundamentais novos trabalhos que explorem essas propriedades. Ainda no h estudos cientficos que comprovem a atividade anticancergena do avels, pelo contrrio existem alguns que revelam que o seu ltex pode reduzir a imunidade celular, acarretando em um efeito pr-cancergeno (IMAI et al., 1994 apud CAVALINI et al.,2005). A presente pesquisa objetivou avaliar a frequncia de clones de tumor observa- dos em Drosophila melanogaster, heterozigota para o gene supressor de tumor wts, pr- tratada com Mitomicina C e posteriormente com extrato aquoso do avels.
2. Referencial terico
2.1. Avels (Euphorbia tirucalli)
A espcie Euphorbia tirucalli (Figura 1), popularmente conhecida como avels, apresenta ampla distribuio, fcil propagao, pode ser obtida durante todo o ano, e o processo para extrair sua substncia ativa simples (JURBERG; CABRAL NETO; SCHALL, 1985). Esta ampla distribuio geogrfica deve-se sua grande capacidade de acli- matao. Considerado tambm txico, porm, extratos de seu ltex em gua ou extra- to total de seu caule demonstram atividade biolgica mista e instiga estudos sobre as suas propriedades toxicolgicas e biolgicas. importante salientar que diversas es- pcies da famlia Euphorbiaceae so conhecidas e utilizadas como avels no Brasil, sem o serem, no entanto (VARRICCHIO et al., 2008b).
Figura 1. Avels (Euphorbia tirucalli) AVALIAO DO EFEITO ANTICARCINOGNICO DO LTEX DO AVELS
128
Existem relatos de que esta espcie apresenta propriedades curativas para al- gumas doenas (MWINE; DAMME; JUMBA, 2010), como carcinomas e epiteliomas benig- nos; e de que tem propriedades contra picada de escorpio e de cobras, sendo ainda purgativa. Alm disso, pode-se usar o ltex externamente contra verrugas, como rube- faciente e antirreumtico (MARTINS et al., 1995). A E. tirucalli tambm tem atividade moluscicida (AFONSO NETO; BESSA; SOARES, 2010; JURBERG; CABRAL NETO; SCHALL, 1985; TIWARI; SINGH; SINGH, 2003) e antimicrobiana (NETZEL; ARAJO, 2009). Observamos ain- da atividade larvicida em Aedes aegypti (VARRICCHIO et al., 2008b) em Escherichia coli (GONALVES; ARAJO, 2009) e em Anopheles funestus e A. gambae (MWINE; DAMME; JUMBA, 2010). Existem tambm alguns estudos que relatam a capacidade da espcie de produ- zir combustvel, j que esta possui genes que participam na biossntese de triterpenoi- des e esteris (KAJIKAWA et al., 2004). A anlise do tecido vegetal da planta demonstra que ela rica em clcio (244,85 g/kg), potssio (13,74 g/kg) e magnsio (4,34 g/kg), apresenta tambm altas concentraes de nitrognio (9,17 g/kg), fsforo (1,05 g/kg), mangans (102,67 mg/kg), boro (20,28 mg/kg), ferro (62,73 mg/kg), zinco (20,30 mg/kg) e cobre (9,78 mg/kg) (NETZEL; ARAJO, 2009). O Sistema Nacional de Informaes Txico Farmacolgicas adverte que o con- tato da seiva leitosa com a pele e mucosa causa leses. Alm disso, pode ocorrer ede- ma de lbios, boca e lngua, dor em queimao e coceira. O contato com os olhos pro- voca irritao, lacrimejamento, edema das plpebras e dificuldade de viso; a inges- to pode causar nuseas, vmitos e diarreia (BRASIL, 2009).
2.2. Cncer
O cncer caracterizado como uma das principais causas de morte nos pases desenvolvidos, sendo que um tero da populao ser vitima dessa doena durante a vida (RANG et al., 2007). Branco (2005) ressalta que os tumores malignos no so impor- tantes apenas pela sua frequncia e gravidade, mas pela evoluo dessa frequncia que tem aumentado a nvel mundial. O cncer definido como um conjunto de doenas que possuem a caracterstica em comum de crescimento incontrolado, que desencadeia na formao de uma massa de clulas denominada neoplasia ou tumor. Vrios eventos so necessrios para as clulas escaparem das restries que evitam a proliferao descontrolada. Sinais que induzem a proliferao devem ser produzidos e as clulas devem tornar-se resistentes aos sinais que inibem o crescimento. Com isso, as clulas seriam levadas morte celu- lar programada (apoptose), porm elas desenvolvem alguma forma de invalidar esse processo. A crescente massa de clulas necessita de nutrio, com isso ocorre a angio- gnese, na qual as clulas vizinhas se diferenciam em novos vasos sanguneos. Os si- nais inibitrios adicionais devem ser superados para que o tumor seja maligno, haven- do invaso de tecidos prximos e posterior alastramento da neoplasia (metstase) para os locais mais distantes do corpo. A capacidade de invadir e formar metstase distin- gue as neoplasias benignas das malignas (JORDE et al., 2004). As alteraes genticas costumam afetar os genes responsveis pelo incio do ciclo celular e pela apoptose das clulas. Os proto-oncogenes normalmente regulam a ELCIO MOREIRA ALVES & JLIO CSAR NEPOMUCENO
129
multiplicao celular. Entretanto, vrios eventos podem transformar o proto-oncogene em um oncogene, este por sua vez promove a multiplicao celular descontrolada, que acarreta o crescimento excessivo de um grupo de clulas, denominado tumor, e a dis- perso de clulas tumorais pelo corpo, metstase. Existem tambm os genes supresso- res tumorais que codificam reguladores negativos do ciclo celular e positivos de apop- tose. Os alelos mutantes iro inativar as protenas que eles codificam, assim, o ciclo celular no ser inibido (GRIFFITHS et al., 2002). Como j mencionado, as clulas possuem um mecanismo de reparo do DNA, por isso no desenvolvemos cncer rapidamente. Diante disso, a existncia de clulas alteradas significa que estas escaparam dos mecanismos homeostticos intracelulares, que as levariam apoptose. Se estes mecanismos no forem capazes de reparar o DNA ou de encaminhar a clula apoptose, ela resistir e se fixar na populao. medida que estas clulas se duplicam, as mutaes se acumulam, acarretando a manifestao do tumor (BELTRO-BRAGA; TEIXEIRA; CHAMMAS, 2006). Embora o cncer parea ser intrinsecamente gentico, Jorde et al. (2004) afirmam que os fatores ambientais podem alterar a frequncia das mutaes. Inmeras substn- cias com propriedades carcinognicas j foram identificadas, como o cigarro que causa cncer de pulmo e outros tipos de tumor. Portanto, o meio ambiente torna os genes de predisposio menos penetrantes, ou seja, o risco de cncer uma composio dos fa- tores genticos e ambientais. Os frmacos antineoplsicos so utilizados para tratar mais de 100 diferentes ti- pos de neoplasias, objetivando a destruio das clulas malignas. Outros frmacos complementares fortalecem o sistema imune do indivduo; assim, as clulas tumorais que no forem destrudas pelas drogas antineoplsicas sero erradicadas. A maioria dos agentes antitumorais mais eficiente para destruir as clulas que esto com o ciclo celular ativo do que aquelas que esto em repouso na fase G0. Porm, estas drogas no so especficas, ento o processo de diviso das clulas normais, como as dos folculos capilares, medula ssea e epitlio intestinal, interrompido. Essas clulas de diviso rpida so muito sensveis a essas drogas, resultando nos principais efeitos adversos da quimioterapia (LARNER; GROSH, 2006).
2.3. Mitomicina C
A mitomicina C (MMC) um antibitico isolado de Streptomyces caespitosus. Ela apresenta na sua estrutura um grupo azauridina e outro quinona, bem como um anel mitosano. Esta droga tem atividade clnica restringida e foi substituda por frmacos menos txicos e mais efetivos em cnceres. Porm, continua apresentando relevncia farmacolgica (CHABNER, 2006). A MMC empregada, principalmente, no tratamento do cncer de clulas esca- mosas do nus, na quimioterapia de associao em casos de carcinoma de clulas es- camosas do colo uterino e adenocarcinomas do estmago, pncreas e pulmo, e espe- cialmente utilizada no tratamento intravesical do cncer de bexiga superficial (CHU; SARTORELLI, 2005). Observa-se que esta droga pode se ligar de modo covalente ao DNA e apresentar ligao cruzada. Acredita-se que ela inibe a sntese do material gentico por meio de AVALIAO DO EFEITO ANTICARCINOGNICO DO LTEX DO AVELS
130
sua capacidade de alquil-lo e produzir ligao cruzada entre os filamentos duplos. Existem evidncias sobre a necessidade de reduo enzimtica por uma redutase de- pendente de nicotinamida-adenina dinucleotdio fosfato reduzido (NADPH) para ativar o frmaco (SIKIC, 2005). No interior das clulas a droga convertida em forma que atua como agente al- quilante, matando clulas nas fases G1-M. Os principais alvos da toxicidade da mitomi- cina so a medula ssea e o trato gastrointestinal. sempre infundida por via endove- nosa em dose nica ou em cinco doses administrando-se uma por dia (TRIPATHI, 2006). Sampaio Filho et al. (2006) advertem que ao administrar mitomicina deve-se evi- tar exposio solar. A associao desta com alcaloides da vinca pode acarretar bronco- espasmos intensos, e o O2 em cirurgia pode precipitar angstia respiratria. Chu e Sar- torelli (2005) ressaltam a possibilidade de ocorrncia de nusea, em toxicidade aguda, e tardiamente, trombocitopenia, anemia, leucopenia, mucosite. Relatam ainda outros efeitos txicos comuns, como a ocorrncia de sndrome hemoltico-urmica, manifesta- da como anemia hemoltica microangioptica, trombocitopenia e insuficincia renal, bem como alguns casos de pneumonite intersticial. Assim como todas as drogas antineoplsicas, a intoxicao por este frmaco produz principalmente transtornos digestivos e hematolgicos. Como efeitos digesti- vos, pode-se observar estomatite, vmitos e diarreia. As manifestaes hematolgicas incluem a leucopenia, trombocitopenia e anemia. A apario destes sintomas deve acarretar a suspeno imediata da administrao da droga. A transfuso sangunea constitui a medida mais importante para os efeitos hemticos. Para prevenir, indicada a realizao de exames hematolgicos semanalmente (LITTER, 1975). A droga em ques- to teratognica, carcinognica e pode formar vesculas locais (SIKIC, 2005). Em Drosophila melanogaster a mitomicina C utilizada como controle positivo, induzindo significativamente a formao de tumores epiteliais (COSTA; OLIVEIRA; NE- POMUCENO, 2011).
2.4. Teste para deteco de tumor epitelial em Drosophila melanogaster
A espcie Drosophila melanogaster (Figura 2), conhecida como mosca da fruta, utilizada em pesquisas genticas desde 1909, depois das bactrias e fungos. Atual- mente seu uso recorrente em estudos porque fcil mant-la em laboratrio, ela tem um ciclo de vida relativamente curto, cerca de 10 dias a 25 C, e grande prognie. Na forma adulta, possui cerca de 2 mm de comprimento, trs pares de pernas e apenas um par de asas, porque o segundo par foi modificado e est dentro de pequenos apndices chamados halteres, que ajudam na aerodinmica para o voo (SNUSTAD; SIMMONS, 2006).
ELCIO MOREIRA ALVES & JLIO CSAR NEPOMUCENO
131
Figura 2. Casal de Drosophila melanogaster: o macho (esquerda) menor e possui pente sexual e a fmea (direita) maior e no apresenta pente sexual
A conservao evolutiva de genes supressores tumorais entre Drosophila e mamferos tem levado a estudos na induo e no desenvolvimento de tumores nessas moscas. Diversos proto-oncogenes e supressores tumorais de mamferos se apresen- tam tambm nesta espcie (EEKEN et al., 2002). Nishiyama et al., (1999) descreveram homologias entre o gene supressor de tumor warts (wts) em Drosophila com o LATS1 em humanos. Quando deficiente, este gene mostrou desenvolvimento de sarcomas em tecidos moles e tumores ovarianos. Em homozigoze, o marcador wts uma mutao recessiva letal nos zigotos. Por apresentar esta capacidade letal, mantido na linhagem estoque com a presena de um balanceador cromossmico ( TM3 ). O cruzamento entre linhagens wts/TM3 e multiple wing hairs (mwh/mwh) resulta em larvas heterozigotas (wts/+) ( SIDOROV et al., 2001). A perda da heterozigoze nas clulas do disco imaginal ocasiona a formao de clones homozigotos (que vivel em conjuntos de clulas isoladas) na larva, que se manifestam como tumores na mosca adulta ( SIDOROV et al., 2001). O gene warts (wts) foi identificado por Nishiyama et al. (1999) com base na sua habilidade de agir como um supressor de tumor em Drosophila. A deleo desse gene acarreta a formao de clones de clulas que literalmente geram "verrugas" nas pernas e no corpo. Assim, o gene warts considerado importante no controle da morfognese e proliferao celular. Eeken et al. (2002) ressaltam ainda que a inativao de ambos os alelos wts, em todas as clulas da Drosophila, resultam em letalidade embrionria. Mas a mutao e recombinao mittica, nos indivdius heterozigotos, podem levar a clones mutantes que induzem a formao dos tumores.
3. Metodologia
3.1. Obteno do ltex do avels
O avels foi obtido em um jardim privado da cidade de Patos de Minas-MG. O Dr. Evandro Binotto Fagan, professor titular das disciplinas Morfologia e Sistemtica Vegetal, do Centro Universitrio de Patos de Minas (UNIPAM) e coordenador do Ncleo de Pesquisa em Fisiologia Vegetal, Agroclimatologia, Modelagem na Agricultura e Irrigao (FAMI), realizou a identificao taxonmica da espcie, classificando-a como AVALIAO DO EFEITO ANTICARCINOGNICO DO LTEX DO AVELS
132
Euphorbia tirucalli. Uma amostra dessa planta foi catalogada no Herbrio do curso de Cincias Biolgicas desta instituio, sob o protocolo 00000010 supervisionado pelo mesmo professor. As larvas de Drosophila melanogaster foram tratadas com solues de diferentes concentraes do ltex, preparadas no momento anterior. Este trabalho pri- mou por utilizar a posologia folclrica, tambm respeitada por Oliveira e Nepomuceno (2004), de 2 gotas em 200 mL de gua, ou seja, 0,5 microlitros do ltex diludos em 1 mL de gua destilada estril. A ttulo de comparao, assim como neste trabalho, foram utilizadas tambm as solues de 0,33 e 1,0 microlitros de ltex diludos na mesma quantidade de solvente.
3.2. Agente qumico
Como agente indutor de tumor utilizou-se a Mitomicina C (CAS 50-07-7), fabri- cado por Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd., Shizuoka, Japo e embalado por Bristol-Myers Squibb S.r.l., Sermoneta, Latina, Itlia. Importado por Bristol-Myers Squibb Farmacu- tica S.A. Rua Carlos Gomes, 924 Santo Amaro, So Paulo. Cada frasco contm 5 mg de p liofilizado para soluo injetvel. Tem peso molecular 334,327 e frmula molecu- lar C15H18N4O5 (Figura 3).
Figura 3. Frmula estrutural da Mitomicina C
3.3. Teste para deteco de tumores epiteliais em D. melanogaster
Para a realizao do teste foram utilizadas duas linhagens mutantes de Droso- phila melanogaster, wts e mwh, portadoras dos marcadores genticos warts (wts, 3-100) e multiple wing hairs (mwh, 3-03), respectivamente. A linhagem wts foi gentilmente cedida pelo Bloomington Drosophila Stock Center, da Universidade de Indiana, USA, com o nmero de registro: Bloomington/7052. Mantiveram-se os estoques em frascos de de litro contendo o meio de cultura da Drosophila melanogaster com 820 mL de gua; 25g de fermento (Saccharomyces cerevi- siae); 11g de agar, 156g de banana e 1g de nipagin. A temperatura foi mantida em 25 C e umidade a 60%.
3.3.1. Cruzamento
Para obteno de larvas heterozigotas wts +/+ mwh realizou-se o cruzamento en- ELCIO MOREIRA ALVES & JLIO CSAR NEPOMUCENO
133
tre fmeas virgens wts/TM3, Sb 1 e machos mwh/mwh. Desse cruzamento, todas as larvas foram tratadas com os agentes qumicos testados. No entanto, foram analisadas somen- te as moscas adultas que no apresentavam o balanceador cromossmico (TM3, Sb 1 ), ou seja, aqueles que apresentavam, fenotipicamente, pelo longo.
3.4. Procedimento experimental
Aps o cruzamento, as moscas foram transferidas para recipientes contendo 1,5 g de meio de pur de batatas (meio alternativo para Drosophila) e 5 mL de extrato aquo- so de avels nas diferentes concentraes: 0,33 l/mL, 0,5 l/mL e 1,0 l/mL. Para o controle positivo utilizou-se a Mitomicina C, e para o controle negativo, gua destilada estril. Para avaliar se a planta em questo induz a formao de tumores, as moscas foram expostas ao ltex dessa substncia. O frmaco foi combinado ao Avels nas dife- rentes concentraes para avaliar se a soluo reduziu a quantidade de tumores indu- zidos.
3.5. Anlise das moscas
Aps sofrerem metamorfose, os organismos-testes adultos foram transferidos para outros recipientes contendo etanol 70% e, posteriormente, foram analisados os machos e as fmeas que apresentavam fentipos pelo longo. Para a anlise das moscas foram utilizadas lupas estereoscpicas e pinas entomolgicas. A tabulao foi feita em um laudo, que separava quantitativamente a incidncia de tumores nas regies do olho, cabea, asa, corpo, perna, halteres e o total por mosca, em cada concentrao.
3.6. Anlise estatstica
As diferenas estatsticas entre a frequncia de tumor das concentraes testa- das e dos controles foram calculadas usando o teste U, no paramtrico, de Mann- Whitney.
4. Resultados e discusso
Os resultados encontrados demonstram a ao anticarcinognica do ltex do avels nas concentraes 0,33L/mL; 0,5L/mL; 1L/mL. Os testes para carcinogenici- dade da espcie no foram estatisticamente significativos em nenhuma dose. Podemos observar a frequncia de clones de tumor por segmento da Drosophila melanogaster, ob- tida neste trabalho, na Tabela 1. Para o controle negativo utilizou-se gua osmose reversa, observando-se a fre- quncia de 0,30 tumores por mosca. Esta discreta induo de tumores ocorre devido predisposio gentica do organismo teste. J o controle positivo, 0,1 mM de Mitomici- na C, induziu uma frequncia de 1,94 tumores por mosca. Isso demonstra que a linha- gem responde induo tumoral. A quimioterapia antineoplsica pretende alterar o DNA da clula tumoral a fim de conter seu crescimento. No entanto, como a substncia age sistemicamente, as clu- AVALIAO DO EFEITO ANTICARCINOGNICO DO LTEX DO AVELS
134
las saudveis tambm podem sofrer tais alteraes, ocorrendo efeito pr-tumoral. As- sim, torna-se relevante a avaliao dos efeitos cancergenos da espcie. As larvas que no foram submetidas ao pr-tratamento com MMC, mas somente expostas soluo do ltex do avels, nas concentraes de 0,33L/mL; 0,5L/mL; 1L/mL, apresentaram uma frequncia de 0,2; 0,24 e 0,14 tumores por mosca, respecti- vamente. Este resultado demonstra que o avels, quando comparado ao controle nega- tivo, no induziu uma quantidade de tumores, estatisticamente significativa, para ser considerado carcinognico; portanto, a utilizao do mesmo no agravaria o quadro de pacientes oncolgicos quanto concentrao de clulas tumorais. Oliveira e Nepomuceno (2004) encontraram resultados semelhantes, j que nas doses testadas por eles, idnticas s deste trabalho, no houve efeito genotxico. Ao testar o avels fitoterpico nas clulas procariticas, Lima et al. (2009) concluram que ele no capaz de induzir agravos nas mesmas. Assim, como os mecanismos de reparo do DNA dos eucariontes so mais sensveis e especficos, provvel o avels no dani- fique o DNA de pacientes que recebem o composto. J o tratamento com a associao da MMC (pr-tratamento) com o avels resul- tou em frequncias distintas. No primeiro caso observou-se a frequncia de 0,66 tumo- res por mosca, no segundo 0,61, e no terceiro 0,55. Podemos observar que estes trs valores so significativamente menores, em comparao com o controle positivo. Dian- te disso, evidencia-se que o extrato aquoso do ltex de avels capaz de reduzir tumo- res.
Tabela 1. Frequncia de clones de tumor observados em Drosophila melanogaster, heterozigota para o gene supressor de tumor wts, pr-tratada com Mitomicina C (6 horas) e posteriormente tratada com extrato aquoso do Avels.
ELCIO MOREIRA ALVES & JLIO CSAR NEPOMUCENO
135
Outros estudiosos encontraram resultados similares e elaboraram hipteses ba- seadas em seus resultados para explic-los. Avelar (2010) relatou em seus trabalhos um aumento, estatisticamente significativo, no percentual de neutrfilos e linfcitos positi- vos para as citocinas do tipo1, ao serem estimulados por ltex bruto do avels, mos- trando-se relevante a estimulao imunolgica da espcie contra as clulas neoplsicas. O ltex da espcie estudada rico em diterpenoides:, steres diterpnicos de forbol, ingenanos, tiglianos, dafnanos e dafnanos aromticos (VARRICCHIO et al., 2008a). Ao entrar no citoplasma das clulas, o ingenano interage com protenas citoplasmti- cas. Neurnios expostos a esta substncia iniciam um processo que pode levar morte celular, ou seja, o ingenano, constituinte do avels, induz a apoptose. No entanto, o efeito txico do ingenano ainda no foi completamente elucidado (KHALEGHIAN et al., 2010). Os steres de ingenol se ligam tubulina, desestabilizando-a atravs de uma mudana conformacional por meio de alteraes na posio do triptofano no sentido da guanosina-5-difosfato (GTP). A tubulina uma protena com variadas funes como transduo de sinais e, principalmente, sintetizao dos microtbulos, que do suporte ao citoesqueleto (KHALEGHIAN et al., 2010). As concluses de Khaleghian et al. (2010) auxiliam na compreenso dos efeitos anticarcinognicos do avels, j que as clulas que sofrem a ao do ingenano apresen- tam uma desestabilizao da tubulina que acarretar em alteraes dos microtbulos. Estas alteraes impedem a diviso do centrmero e separao das cromtides irms, realizada pelo mesmo no ciclo celular. A ausncia destas etapas ir parar o ciclo celular na fase G, induzindo a formao de uma clula com microncleo, que possui menor tempo hbil, ou ser direcionada apoptose. Assim, em casos de cncer, a polimeriza- o da tubulina e a estabilidade de microtbulos inibem o crescimento celular. As Euphorbiaceae so capazes de aumentar a expresso dos receptores Fc para gama-globulina, que agem diretamente sobre a atividade funcional dos macrfagos. Esses receptores para a poro Fc situados em neutrfilos, macrfagos e outros fagci- tos mononucleares, facilitam o reconhecimento do antgeno, potencializando a eficin- cia da fagocitose (GRANJA, 2003). Ao estimular linfcitos com o ltex dessa Euphorbiaceae, in vitro, Avelar (2010) evidenciou um aumento estatisticamente significativo no percentual de linfcitos T e T CD4 positivos para as citocinas do tipo 1, TNF- e IFN-. So estas citocinas as respon- sveis por ativar o sistema imune para respostas imunoprotetoras diante de processos tumorais. Os neutrfilos e linfcitos T CD8 exibiram um perfil misto de produo de citocinas do tipo 1 e 2. Observamos, assim, uma resposta imunolgica predominante- mente do tipo 1 e uma provvel ativao de mecanismos moduladores, mediados por linfcitos T CD8 e neutrfilos. Avelar (2010) ressalta ainda que a resposta antitumoral dependente do acio- namento da resposta imune celular. Diante disso, possvel que a sntese de IFN- em linfcitos T helper, induzida pelo ltex de E. tirucalli, possa favorecer a apresentao de antgenos, contribuindo para a eliminao de clulas tumorais, por intermdio da ao antgeno especfica de linfcitos T CD8. Estes linfcitos aumentam a produo de cito- cinas do tipo I, que favorece as funes secretoras, principalmente citotoxicidade. Alm disso, libera protenas, tais como perforina, granzimas e granulisina que induzem apo- AVALIAO DO EFEITO ANTICARCINOGNICO DO LTEX DO AVELS
136
ptose de clulas alvo. Existem ainda algumas evidncias da participao de princpios ativos encontrados em Euphorbia, sobre diversos processos biolgicos mediados por TNF-. importante salientar que o TNF- tambm pode ser efetor na apoptose de clulas tumorais, atravs da unio aos receptores que apresentam domnios de morte que sinalizaram os eventos apoptticos. Outro constituinte da E. tirucalli o ster de forbol que ativa a protena quinase C, as possveis vias para a produo de citocinas pr-inflamatrias que envolveriam os fatores de transcrio NF-kB, Elk e a juno de Jun e Fos, conhecido como AP1. A res- posta imune um grande aliado na imunoterapia de tumores, uma vez que tais citoci- nas so importantes mediadores dos processos oncolgicos (AVELAR, 2010). necessrio salientar ainda que a frequncia de tumores diminuiu discretamen- te com o aumento da dose utilizada, indicando a possibilidade da eficcia do tratamen- to ser dose dependente. Granja (2003) concluiu que a Euphorbia tirucalli confere uma proteo dose-dependente contra a mielossupresso desencadeada pelo desenvolvi- mento tumoral. Gonalves e Arajo (2009) observaram que medida que a concentra- o do ltex da planta aumenta, a Escherichia coli se torna mais perceptvel. No entanto, como o ltex dessa planta pode ser txico, a concentrao a ser utilizada deve ser con- trolada.
5. Concluso
O amplo emprego do avels na medicina popular foi justificado, j que, neste trabalho, ele diminuiu a concentrao de clulas tumorais na Drosophila melanogaster. Em busca de explicaes para tal resultado, encontramos na literatura associaes entre algumas substncias presentes nesta Euphorbiaceae, principalmente ingenano e steres de forbol, e reaes bioqumicas que aumentam a imunidade celular e favorecem a apoptose. Evidenciou-se ainda que os resultados so dose-dependentes. No entanto, necessrio precauo ao administrar este composto, j que apresenta alta toxicidade e ainda no existem estudos cientficos que comprovem a posologia segura para a me- lhoria dos efeitos. O potencial carcinognico da E. tirucalli no foi comprovado nas doses testadas. Assim, a utilizao desta no comprometeria o quadro de pacientes oncolgicos. Este estudo abre caminhos para demais pesquisas que envolvam a planta em questo, j que por meio deles poderemos comprovar quais compostos so realmente capazes de produzir tais efeitos. Por esse meio, poderemos promover a sade e a qualidade de vida dos pacientes oncolgicos, alm de melhorias no prognstico.
Referncias
AFONSO NETO, I. S.; BESSA, E. A.; SOARES, G. L. G. Avaliao da atividade moluscicida do ltex de trs espcies de Euphorbia (Euphorbiaceae) sobre Leptinaria unilamellata DOrbigny, 1835 (Gastropoda Subulinidae). Revista Brasileira de Plantas Medicinais. Botucatu, v. 12, n. 1, p. 90-95, 2010. Disponvel em: ELCIO MOREIRA ALVES & JLIO CSAR NEPOMUCENO
AVELAR, Bethnia Alves de. Deteco in vitro de citocinas intracitoplasmticas (interferon gama, fator de necrose tumoral, interleucina 4 e interleucina 10) em leuccitos humanos trata- dos com extrato bruto diludo de Euphorbia tirucalli. 2010. 79f. Dissertao (Mestrado em Cincias Fisiolgicas) Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucur, Diamantina, 2010.
BELTRO-BRAGA, P. C. B.; TEIXEIRA, V. R.; CHAMMAS, R. Aspectos moleculares da transfor- mao celular: conceitos e implicaes, in: WAITZBERG, Dan Linetzky. Dieta, nutrio e cncer. So Paulo: Atheneu, 2006, cap. 6, p. 79-87.
BRANCO, Isaura Maria Bata Henriques Peixoto. Preveno do cncer e educao em sade: opinies e perspectivas de enfermagem. Texto Contexto Enfermagem. Florianpo- lis, v. 14, n. 2, p. 246-249, abr./jun. 2005. Disponvel em: <http://www.scielo.br/pdf/tce/v14n2/a12v14n2.pdf>. Acesso em: 9 jan. 2011
BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Cincia, Tecnologia e Insumos Estratgicos. Departamento de Assistncia Farmacutica. Poltica nacional de plantas medicinais e fitote- rpicos. Braslia, 2006.
______. Ministrio da Sade. Sistema Nacional de Informaes Toxico Farmacolgicas. Plantas txicas do Brasil. Braslia, set. 2009. Disponvel em: <http://www.fiocruz.br/sinitox/avelos.htm>. Acesso em: 20 jan. 2011.
CAVALINI, Marcelle et al. Servio de informaes sobre plantas medicinais e medica- mentos fitoterpicos. Extensio. Florianpolis, v. 2, n. 2, p. 1-11, maio 2005. Disponvel em: <http://www.periodicos.ufsc.br/index.php/extensio/article/view/5131/4525>. Aces- so em: 20 jan. 2011.
CHABNER, B. A. et al. Agentes antineoplsicos, in: GOODMAN, L. S.; GILMAN, A. As bases farmacolgicas da teraputica. 11 ed. Rio de Janeiro: McGraw-Hill, 2006, cap. 51, p. 1185- 1264.
CHU, E.; SARTORELLI, A. C. Quimioterapia do cncer, in: KATZUNG, B. G. Farmacologia bsica e clnica. 9 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005, cap. 55, p. 751-777.
COSTA, W. F.; OLIVEIRA, A. B.; NEPOMUCENO, J. C. Lapachol as na epithelial tumor inhibitor agente in Drosophila melanogaster heterozygote for tumor supressor gene wts. Genetics and Molecular Research, n. 10, p. 3236-3245, 2011.
CRUZ, G. L. Dicionrio das plantas teis do Brasil. Rio de Janeiro: Civilizao Brasileira, 1979.
EEKEN, J. C. J. et al. Induction of epithelial tumors in Drosophila melanogaster hete- rozygous for the tumor supressor gene wts. Environmental and Molecular Muta- genesis. [S.l.], n. 40, p. 277-282, 2002. AVALIAO DO EFEITO ANTICARCINOGNICO DO LTEX DO AVELS
138
GONALVES, Diogo Moreira; ARAJO, Jos Hilton Bernardino de. Aplicao do ltex bruto de Euphorbia tirucalli L. no combate ao microrganismo Escherichia coli. XIV SICITE. [S.l.], v. 2, 2009. Disponvel em: http://216.59.16.221/hvip/nacamura.com.br/sicite/sicite2009/artigos_sicite2009/108.pdf. Acesso em: 20 jan. 2011.
GRANJA, Silvia. Efeitos do extrato liofilizado da Euphorbia tirucalli sobre a resposta hemato- poitica em camundongos portadores de tumor asctico de Ehrlich. 2003. 77 f. Dissertao (Mestrado em Farmacologia) Faculdade de Cincias Mdicas, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2003.
GRIFFITHS, A. J. F. et al. Introduo gentica. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.
Instituto Nacional de Cncer. Estimativa 2012: incidncia de cncer no Brasil. Rio de Janeiro: 2011. Disponvel em: <http://www.inca.gov.br/estimativa/2012/index.asp?ID=2>. Acesso em: 29 fev. 2012.
JORDE, L. B. et al. Gentica do cncer, in: Gentica mdica. 3 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2004. cap. 11, p. 261-284.
JURBERG, Pedro; CABRAL NETO, Janurio Bispo; SCHALL, Virgnia T. Molluscicide acti- vity of the Avels plant (Euphorbia tirucalli, L.) on Biomphalaria glabrata, the mollusc vector of schistosomiasis, Mem. Inst. Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, v. 80, n. 4, p. 423-427, out./dez. 1985.
KAJIKAWA, Masataka et al. Expressed sequence tags from callus of Euphorbia tirucalli: a resource for genes involved in triterpenoid and sterol biosynthesis. Plant Biotechnology. [S.l.], v. 21, n. 5, p. 349-353, 2004. Disponvel em: <http://www.wdc- jp.biz/pdf_store/jspcmb/pdf/pb21_5/21_349.pdf>. Acesso em: 7 jan. 2011
KHALEGHIAN, Ali et al. Effect of inganen anticancer properties on microtobule organiza- tion. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences. Karachi, v. 23, n. 3, p. 273-278, jul. 2010. Disponvel em: <http://www.pjps.pk/CD-PJPS-23-3-10/Paper-7.pdf>. Acesso em: 7 jan. 2011.
LARNER, J. M.; GROSH, W. W. Mecanismo de ao de drogas antineoplsicas, in: MINNE- MAN, K. P. et al. Brody: farmacologia humana. 4 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2006. cap. 42, p. 491-508.
LIMA L. G. S. et al. Avaliao do potencial genotxico e mutagnico de solues diludas e dinamizadas de Euphorbia tirucalli Lineu (Aveloz). Brazilian Homeopathic Journal. [S.l.], v. 11, n. 1, p. 1-2, 2009.
LITTER, Manuel. Quimioterapia del cncer, in: Farmacologa. 5 ed. Buenos Aires: El ELCIO MOREIRA ALVES & JLIO CSAR NEPOMUCENO
MWINE, Julius; DAMME, Patrick Van; JUMBA, Francis. Evaluation of larvicidal properties of the latex of Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) against larvae of Anopheles mosqui- toes. Journal of Medicinal Plants Research. [S.l.], v. 4, n. 19, p. 1954-1959, out. 2010.
NISHIYAMA, Yasuyuki. A human homolog of Drosophila warts suppressor, h-warts, localized to mitotic apparatus and specifically phosphorylated during mitosis. FEBS Letters. Heidelberg, n.459, p.159-165, 1999.
NETZEL, Guilherme Torrecilia; ARAJO, Jos Hilton Bernardino de. Estudo da atividade antimicrobiana in vitro do ltex de Euphorbia tirucalli L. SICITE, XIV. [S.l.], v. 2, 2009. Disponvel em: <http://216.59.16.221/hvip/nacamura.com.br/sicite/sicite2009/artigos_sicite2009/126.pdf >. Acesso em: 20 jan. 2011
OLIVEIRA, ngela Pfeifer de; NEPOMUCENO, Jlio Csar. Avaliao dos efeitos genotxi- cos e antigenotxicos do Avels (Euphorbia tirucalli) em Drosophila melanogaster. Biosci. J. Uberlndia, v. 20, n. 2, p. 179-186, maio/ago. 2004.
ORGANIZAO MUNDIAL DE SADE. Traditional medicine strategy 20022005. Geneva, 2002. Disponvel em: < http://www.scitech-iran.com/whotradmedstrategy.pdf>. Acesso em: 10 jan. 2011.
RANG, H. P. et al. Quimioterapia do cncer, in: Farmacologia. 6 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2007, cap. 51, p. 718-736.
REZENDE, Judy Ruiz et al. Efeito antimutagnico do ltex de Euphorbia tirucalli no siste- ma metionina em Aspergillus nidulans. Acta Scientiarum. Biological Sciences. Maring, v. 26, n.4, p. 481-484, 2004. Disponvel em: <http://periodicos.uem.br/ojs/index.php/ActaSciBiolSci/article/viewFile/1531/958>. Acesso em: 7 jan. 2011.
RIZZINI, C. T.; MORS, W. B. Plantas txicas, in: Botnica econmica brasileira. 2 ed. Rio de Janeiro: mbito cultural, 1995, cap. 9, p. 107-124.
SAMPAIO FILHO, C. et al. Agentes antineoplsicos, in: SILVA, Penildon. Farmacologia. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006, cap. 107, p. 1055 -1070.
SIDOROV, R. A. et al. Induction of tumor clones in D. Melanogaster wts/+ hete- rozygotes with chemical carcinogens. Mutation Research. [S.l.], n. 498, p. 181- 191, 2001.
SIKIC, B. I. Frmacos antineoplsicos, in: CRAIG, C. R.; STITZEL, R. E. Farmacologia moderna AVALIAO DO EFEITO ANTICARCINOGNICO DO LTEX DO AVELS
140
com aplicaes clnicas. 6 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005, cap. 56, p. 601-618.
SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Cellular reproduction and model genetic organisms, in: Principles of genetics. 4. ed. [S.l.]: Wiley, 2006. cap. 2, p. 17-41.
TIWARI, Sudhanshu; SINGH, Pratibha; SINGH, Ajay. Toxicity of Euphorbia tirucalli plant against freshwater target and non-target organisms. Pakistan Journal of Biological Scien- ces. [S.l.], v. 6, n. 16, p. 1423-1429, 2003.
TRIPATHI, K. D. Agentes antineoplsicos, in: Farmacologia Mdica. 5 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006, cap. 60, p. 675-686.
VARRICCHIO, M. C. B. N. et al. Emprego do Avels (Euphorbia tirucalli) dinamizado no tra- tamento do cncer. Revista Homeopatia Brasileira. Rio de Janeiro, v. 6, n. 1, p. 64-67, 2000. Disponvel em: <http://www.ihb.org.br/ojs/index.php/artigos/article/viewFile/144/87>. Acesso em: 7 jan. 2011.
______. Euphorbia tirucalli: anlise qualitativa do desenvolvimento vegetal durante o cultivo in vitro. Revista de Biologia e Farmcia. [S.l.], v. 3, n. 1, p. 53-65, 2008a. Disponvel em: <http://eduep.uepb.edu.br/biofar/n2v1/EUPHORBIA_TIRUCALLI.pdf>. Acesso em: 23 jan. 2012.
______. O uso de Euphorbia tirucalli (Aveloz) em medicina tradicional e as evidncias cientficas. Revista de Biologia e Farmcia. [S.l.], v. 3, n. 1, p. 84-92, 2008b. Disponvel em: <http://eduep.uepb.edu.br/biofar/n2v1/O_USO_DE_EUPHORBIA_TIRUCALLI.pdf>. Acesso em: 7 jan. 2011.
Estudo "in vitro" do extrato bruto da Hyptis suaveolens (L.) Poit. e Hyptis mutabilis (Rich.) Brig. como possível inibidora do crescimento de leveduras do gênero cândida
Avaliação dos Descritores Morfoagronômico e Morfoanatomia da Lâmina Foliar de Pilocarpus: Microphyllus Stapf ex Wardleworth – Rutaceae, Ananas Comosus Var. Erectifolius (L. B. Smith) Coppens & F. Leal – Bromeliacea e Psychotria Ipecacuanha (Brot.) Stokes
Biomarcadores de resistência a verminose em ovinos: caracterização dos possíveis biomarcadores em ovinos resistentes à verminose e microrganismos entéricos associados