Controle da expresso gnica

Prof. Dr. Jos Luis da C. Silva

Controle da Expresso gnica Procariotos

Princpios da regulao gnica Organismos procariontes e eucariontes so sensveis pequenas variaes do meio ambiente, tais como a disponibilidade de nutrientes, sinais hormonais, etc. Assim a regulao da expresso dos seus genes s necessidades celulares objetiva uma melhor adaptao s variaes do meio.

Princpios da regulao gnica Genes para os produtos que so requeridos durante todo o tempo so expressos em nveis constantes. So os chamados genes da economia domstica (housekeeping). A expresso invarivel destes genes denominada de expresso gnica constitutiva. Ex. Enzimas do Ciclo de Krebs Genes que so expressos em resposta a sinais moleculares enquadram-se na expresso gnica regulada. Estes genes podem ser induzidos ou reprimidos de acordo com as necessidades celulares

Alvos da regulao gnica

Os principais alvos da regulao esto no nvel de transcrio e traduo da informao do mRNA.

O problema bsico que a clula enfrenta possuir mecanismos para reprimir ou desligar a transcrio de todos os genes codificantes de enzimas que no so necessrias e ativar a transcrio destes genes quando as enzimas so necessrias

Protenas reguladoras da transcrio (ativadores, repressores)

Protenas reguladoras geralmente ligam-se a sequncias especficas do DNA. A afinidade para essas sequncias alvo de 104 a 106 vezes maior do que para outras regies do DNA.

Essas protenas possuem domnios (regies pequenas e delimitadas) de ligao ao DNA que interagem com as sequncias alvo.

A maioria dos contatos que permitem especificidade incluem grupos qumicos das bases do DNA expostos no sulco principal do DNA.

Interaes entre protenas-DNA

Hlice-volta-hlice
Este motivo de ligao ao DNA crucial para a interao de muitas protenas reguladoras procariticas. Este motivo engloba cerca de 20 aa em dois segmentos -helicoidais separados por uma volta do tipo .

Este o domnio do repressor do Operon da Lactose, denominado de repressor Lac

Zper de Leucina
Este motivo uma -hlice anfiptica com aa hidrofbicos em um dos lados do motivo. Neste motivo, a cada 7 resduos de aa h um Leucina (Leu) formando uma linha reta ao longo da superfcie hidrofbica. O domnio de ligao rico em resduos bsicos (Lys ou Arg) que interagem com cargas negativas dos fosfatos do DNA. So encontrados em muitas protenas reguladoras de eucariotos.

GCN4 de levedura

Regulao Transcricional

Sistemas operons da E. coli: Operon lac (controlador da sntese das enzimas do metabolismo de lactose), Operon trp (controle da sntese das enzimas

sintetizadores de triptofano)

Muitos genes esto em complexos chamados OPERONS, e nestes que, complexos atuando normalmente "parceria", existe uma protena certas repressora e uma ativadora da transcrio de vrios genes em determinam caractersticas.

Modelo de operon procaritico

OPERON LAC

No metabolismo da lactose por E. coli so necessrias duas enzimas que fazem parte de um operon chamado lac. A primeira enzima capaz de clivar a lactose em glicose e galactose que assim serviro como fonte de carbono para a clula.

A -galactosidase dita uma enzima indutvel, ou seja, sua expresso varia com as necessidades celulares.

Caso a bactria esteja crescendo em meio rico em lactose, sua expresso ser alta; Caso a fonte de carbono seja outro carboidrato, sua expresso ser reduzida.

O Operon Lac est sujeito a regulao negativa

O gene I codifica o repressor Lac que uma molcula com dois stios de reconhecimento, um que pode reconhecer a sequncia operadora especfica para o operon Lac e outro que pode reconhecer a lactose e alguns anlogos da lactose. Na ausncia da Lactose, os genes do operon Lac esto reprimidos pela ligao do repressor Lac.

Represso do Operon Lac

Operador principal

promotor do repressor Lac Pseudo-operadores

A ligao dor repressor reduz a transcrio por um fator de 100x, mas no absoluta
Repressor ligado aos operadores

O alvio da represso chamado de induo. Os derivados de lactose que inativam o repressor e levam a expresso dos genes lac so chamados de indutores.

Os indutores de lac so efetores alostricos e quando se ligam ao stio alostrico, causam uma alterao conformacional na protena reguladora, alterando a estrutura do domnio de ligao ao DNA

Regulao positiva do Operon Lac

A alta concentrao do cAMP necessria para a ativao do operon lac.

Os mutantes que no podem converter ATP em cAMP no podem ser induzidos a produzir -galactosidase, pois a concentrao de cAMP no grande o suficiente para ativar o operon lac.

Em bactrias, o AMPc liga-se ao CAP ou CRP (catabolite gene activator protein protena ativadora de genes por catablitos; codificada pelo gene crp), uma protena dimrica com 2 subunidades idnticas de 22Kd. Cada subunidade possui um domnio de ligao ao DNA e ao AMPc. Somente o complexo CAP-AMPc capaz de estimular a transcrio e se ligar a determinados promotores. No operon lac, CAP se liga prximo a regio que se liga a RNA polimerase e interage com a RNA polimerase.

Mas como se d essa modulao da transcrio via cAMP?

A ativao da transcrio exige duas condies

Com alta [glicose] no h formao do complexo CRP-AMPc

A Lactose no suficiente para induzir a ativao do operon Lac

Mas como se d essa modulao da transcrio via cAMP?

Na ausncia de lactose para servir de indutor, o repressor lac capaz de se ligar ao operador; independente dos nveis de cAMP e da presena de CAP, a produo de mRNA reprimida.

Com lactose presente para se ligar ao repressor, este incapaz de se ligar ao operador. Entretanto, apenas pequenas quantidades de mRNA so produzidos, pois a presena de glucose mantm os nveis de cAMP baixos e, portanto, no se forma o complexo cAMP-CAP e no h ligao ao promotor.

Com o repressor inativado pela lactose e com altos nveis de cAMP presentes (devido a ausncia de glucose), cAMP liga-se CAP. O complexo cAMP-CAP ento capaz de se ligar ao promotor e aumentar a trancrio em 50x. O operon lac ento ativado e so produzidos grandes quantidades de mRNA.

Resposta estringente na sntese de rRNA

Em procariotos a sntese dos rRNA a partir dos 7 operons, responde taxa do crescimento celular e s alteraes na disponibilidade dos nutrientes cruciais, particularmente os aminocidos.

Essa regulao coordenada chamada de resposta estringente. Quando as concentraes dos aa so baixas, a sntese do rRNA interrompida.

A carncia dos aa leva ligao dos tRNAs no carregados no stio A dos ribossomos e isso desencadeia a ligao de uma enzima chamada de fator de estringncia (protena RelA) ao ribossomo.

Mecanismo da resposta estringente

A protena RelA catalisa a formao do nucleotdeo no usual Guanosina Tetrafosfato (ppGpp), adicionando pirofosfato posio 3 do GTP:

GTP + ATP

ppGpp + AMP

A elevao abrupta do ppGpp, em resposta carncia dos aa, leva a uma grande reduo na sntese do rRNA, medido em parte pela ligao do ppGpp RNA polimerase e inibio. ppGpp e cAMP so nucleotdeos modificados que atuam como 2 mensageiros intracelulares.

Resposta SOS requer a destruio de protenas repressoras

A leso abrangente do DNA no cromossomo bacteriano desencadeia a induo de muitos genes envolvidos na resposta SOS de reparo do DNA. Os elementos chave so a protena RecA e o repressor LexA. O repressor LexA inibe a trancrio de todos os genes SOS e a induo requer a remoo do LexA. O mecanismo a autoclivagem do LexA com o auxlio da RecA produz 2 fragmentos peptdicos inativos. RecA no uma protease, mas sua interao com LexA facilita a reao de auto-clivagem, sendo chamada de atividade coprotease. A RecA fornece a ligao entre o sinal biolgico (leso no DNA) e a induo dos genes SOS.

Mecanismo da resposta SOS

Leses extensas no DNA levam a ligao da protena RecA ao DNA fita simples, quando RecA estiver ligada facilitar a auto-clivagem de LexA.

CONTROLE DA EXPRESSO GNICA EM EUCARIOTO

Estrutura da Cromatina e regulao da expresso

Os cromossomos eucariticos so maiores e tm um grau mais complexo de organizao estrutural do que os procariticos. Os genomas de levedura, mosca das frutas e humanos contm cerca de 4, 40 e 1000 vezes mais DNA, respectivamente que o genoma de Escherichia coli. Esta abundncia dota os eucariontes de potencialidades que esto ausentes nos procariontes e adiciona desafios replicao e expresso.

Estado basal transcricional restritivo em eucariotos

Diferentemente de procariotos, os promotores fortes de eucariotos so geralmente inativos in vivo na ausncia de sequncias regulatrias, ou seja, o estado transcricional restritivo. Os genes eucariticos requerem ativao para serem transcritos, o que no ocorre em procariotos. Em procariotos, no havendo repressores ligados os genes so transcritos (no-restritivo)

Quatro caractersticas importantes que distinguem a regulao da expresso em eucariotos do procaritico: 1: o acesso aos promotores eucariticos restrito pela estrutura da cromatina, e a ativao da transcrio associada com alteraes mltiplas na estrutura da cromatina na regio transcrita. 2: embora os elementos regulatrios positivos e negativos sejam encontrados nas clulas eucariticas, os mecanismos positivos predominam em todos os sistemas caracterizados at agora estudados.

3: As clulas eucariticas possuem protenas reguladoras multimricas maiores e mais complexas do que as bactrias.

4: A transcrio no ncleo eucaritico est separada tanto no espao quanto no tempo da traduo no citoplasma.

Estrutura do gene eucaritico

CROMATINA
Como as histonas se combinam com o DNA para formar a fibra de CROMATINA? Em 1974, Roger Kornberg props que a cromatina feita de unidades repetidas, cada uma consistindo de 200pb de DNA e duas de cada H2A, H2B, H3 e H4. Essas unidades repetidas so hoje conhecidas como nucleossomos. A maior parte do DNA envolve externamente um cerne de histonas. O restante do DNA, chamado DNA ligante, une nucleossomos adjacentes e contribui para a flexibilidade da fibra de cromatina. Portanto, uma fibra de cromatina uma cadeia flexvel de nucleossomos.

Estrutura da cromatina

Cromatina ativa e inativa

A transcrio de um gene eucaritico fortemente reprimida quando o DNA est condensado na forma de cromatina. Nucleases, como a DNase I clivam o DNA em fragmentos com mltiplos de 200 pb, refletindo a estrutura regular dos nucleossomos. Nas regies transcricionalmente ativas, os fragmentos produzidos pela DNase I so menores e mais heterogneos em tamanho. So regies chamadas de stios de hipersensibilidade a DNase I, consistindo em cerca de 100 a 200 pb dentro de 1000 pb que flanqueiam as extremidades 5 dos genes transcritos. Em alguns genes so encontradas na regio 3 e dentro do gene.

Remodelagem da cromatina
As histonas possuem dois domnios estruturais distintos. Um deles envolvido na interao histona-histona e um segundo domnio aminoterminal rico em Lisina na superfcie exterior da partcula do nucleossomo montada. Esses resduos de Lisina so acetilados por histona acetiltransferases (HATs). As HATs tipo B acetilam as histonas para montagem do nucleossomo, a montagem das histonas tambm facilitada por protenas adicionais: CAF1 e NAP. As HATs tipo A auxiliam na acetilao no evento da transcrio. As histonas deacetilases atuam no silenciamento da transcrio gnica.

A cromatina remodelada pela acetilao e por deslocamentos nucleossomais

A cromatina transcricionalmente ativa tende a ser deficiente em Histona H1 e as outras histonas so modificadas por acetilao ou ubiquitinao. Em genes ribossomais geralmente no so associadas as histonas.

Estrutura do DNA e atividade gnica

Quatro nveis nos quais a expresso gnica pode ser controlada:

1. Transcrio 2. Processamento 3. Estabilidade do mRNA 4. Traduo O nvel mais importante da regulao o incio de transcrio. A partir de determinados sinais, sequncias regulatrias so reconhecidas, possibilitando a ativao de um gene ou grupo de genes, havendo a transcrio, e posterior traduo do mRNA.

Nvel transcricional da regulao

A iniciao da transcrio dependente de fatores ativadores (protenas), transativadores. A estruturao da cromatina a provvel razo para a necessidade de regulao positiva, de forma que os genes esto inativos na ausncia de regulao. Na regulao positiva, a maioria dos genes est normalmente inativa (ou seja, a RNA pol no se liga aos promotores) e a clula sintetiza apenas as protenas ativadoras necessrias para a transcrio de um conjunto de genes.

Enhancers e UASs
A maioria das RNA pol II de eucariotos requerem alm das sequncias TATA e Inr (Iniciadora), outras sequncias adicionais requeridas para a regulao da transcrio. Enhancers so sequncias intesificadoras nos eucariotos superiores e UASs (sequncias ativadoras a montante) em Leveduras. A localizao do enhancer pode ser montante, jusante ou mesmo dentro do gene. Quando protenas reguladoras esto ligadas nestas sequncias adicionais, aumentam a transcrio dos promotores prximos, independentemente da sua orientao no DNA.

Os

silenciadores

so

seqncias

de

ao

cis

que

so

ligadas

repressores, inibindo assim os ativadores e reduzindo a transcrio.

Alguns genes apresentam o enhancers (reforador ou acentuador), localizados a uma distancia maior do stio de transcrio, tanto upstream como downstream (a jusante), e que so capazes de estimular o nvel de transcrio. Tanto os promotores como os enhancers podem apresentar elementos que respondam a estmulos, como choque de calor (heat shock), hormnios ou metais.

Classes de protenas ativadoras da Transcrio

Fatores basais de transcrio: requeridos pela RNA pol II

Transativadores:Ligam-se facilitando a transcrio.

aos

Enhancers

UASs

Co-ativadores: No agem diretamente no DNA, mas atuam em interaes protenas-protena. Protenas repressoras podem impedir estas interaes.

Protena de ligao TATA (TBP)

Esta a primeira protena a se ligar no complexo de pr-iniciao na sequncia TATA de um promotor tpico da RNA pol II. Nesse complexo, esto vrios fatores de transcrio gerais, que pode no se formar na ausncia de transativadores e co-ativadores.

Formadoras de alas

O modelo para ao a distncia inclui algum tipo de dobra do DNA. Neste modelo, uma ala de DNA coloca protenas ativadoras ligadas a elementos acentuadores distantes em proximidade a complexos proticos associados a seqncias de ao cis proximais a promotores.

Animao

Muitos promotores eucariticos so regulados positivamente

RNA polimerases eucariticas possuem pouca ou nenhuma afinidade intrnseca para os seus promotores: a iniciao da transcrio , quase sempre, dependente de mltiplas protenas ativadoras (regulao positiva). O armazenamento do DNA, dentro da cromatina, efetivamente torna a maioria dos promotores inacessveis. De forma que os genes esto normalmente silenciosos na ausncia de outra regulao.

Regulao do metabolismo da Galactose em Leveduras Os genes das enzimas do metabolismo da galactose em leveduras esto dispersos em vrios cromossomos e no esto organizados em um operon como em bactrias. Entretanto, todos os genes GAL possuem promotores semelhantes e so regulados coordenadamente por um conjunto de protenas comuns.

Represso Gal4p + Gal80p

Sinalizao Galactose + Gal3p

Genes do metabolismo da Galactose em Leveduras

A regulao pode ocorrer por meio da fosforilao de fatores de transcrio nuclear em mamferos