Polymerase chain reaction and realtime PCR for diagnosing of Leishmania infantum chagasi in dogs

Reao em Cadeia da Polimerase e PCR em tempo real para diagnstico de Leishmania infantum chagasi em ces
Rafael Antonio do Nascimento Ramos1*; Carlos Alberto do Nascimento Ramos2; Mrcia Mariza Gomes Jusi3; Flbio Ribeiro de Arajo2; Rosangela Zacarias Machado3; Maria Aparecida da Glria Faustino1; Leucio Cmara Alves1
1

Laboratrio de Doenas Parasitrias dos Animais Domsticos, Departamento de

Medicina Veterinria, Universidade Federal Rural de Pernambuco UFRPE, Recife, PE, Brasil
2

Laboratrio de Imunologia, rea de Sanidade Animal, Embrapa Gado de Corte, Campo Laboratrio de Imunoparasitologia, Departamento de Patologia Veterinria,

Grande, MS, Brasil

3

Universidade Estadual Paulista UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil Received April 26, 2011Accepted November 25, 2011

Abstract
The importance of dogs as a reservoir for Leishmania infantum chagasi in urban environments has stimulated numerous studies assessing diagnostic techniques. When performed properly, such procedures are an important step in preventing leishmaniasis in humans. Molecular methods have become prominent for this purpose. The aim of the present study was to determine the performance of the polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR (qPCR) for diagnosing of canine visceral leishmaniasis (CVL) using different biological samples. For this, 35 dogs from an area endemic for CVL were used. Bone marrow aspirate and lymph node and spleen fragments from these dogs were used for the molecular diagnosis. In the present study, qPCR was able to detect a greater number of positive animals than seen with PCR. Among the different biological samples used, there was no significant difference in L. infantum chagasi DNA detection between PCR and qPCR. However, considering that lymph nodes are easy to acquire, these can be considered to be the best samples for making molecular diagnoses of L. infantum chagasi infection. Keywords: Leishmaniasis, diagnosis, molecular, L. infantum chagasi.

Resumo

A importncia do co como reservatrio de L. infantum chagasi no meio urbano tem estimulado a realizao de inmeros trabalhos de avaliao de tcnicas de diagnstico, uma vez que este procedimento, quando realizado corretamente, torna-se um importante passo na preveno da doena em humanos. Dentre os mtodos de diagnstico, as tcnicas moleculares tm adquirido destaque. Objetivou-se neste trabalho verificar o desempenho da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) e da PCR em tempo real (qPCR) para diagnstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) utilizando diferentes amostras biolgicas. Para tanto foram utilizados 35 ces provenientes de uma rea endmica para LVC, onde foram utilizados para o diagnstico molecular, aspirado de medula ssea, fragmentos de linfonodo e bao. Neste estudo a qPCR foi capaz de detectar um maior nmero de animais positivos quando comparada com a PCR. J entre as diferentes amostras biolgicas utilizadas no foi observada diferena significativa na deteco de DNA de L. infantum chagasi por meio da PCR e qPCR. Mesmo assim, considerando a facilidade de obteno, o linfonodo pode ser considerada como a melhor amostra para diagnstico molecular da infeco por L. infantum chagasi. Palavras-chave: Leishmaniose, diagnstico, molecular, L. infantum chagasi.
*Corresponding author: Rafael Antonio do Nascimento RamosLaboratrio de Doenas Parasitrias dos Animais Domsticos, Programa de Ps-Graduao em Biocincia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco UFRPE, Av. Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmos, CEP 52171-900, Recife, PE, Brasil

Introduo Diagnosticar corretamente para leishmaniose visceral canina (LVC) em ces um desafio na prtica veterinria de rotina. Dependendo do estgio da doena e das condies imunolgicas, os animais podem ser assintomticos (TASCA et al., 2009), o que torna o diagnstico mais difcil. Tcnicas parasitolgicas so usados para o diagnstico desta doena (Barrouin-MELO et al., 2006), mas estes mtodos tm algumas limitaes, tais como, um baixo grau de sensibilidade (Piarroux et al., 1994). Em algumas partes do Brasil, onde a LVC endmica, o diagnstico da doena feito por meio de testes sorolgicos, como o teste de imunofluorescncia indireta (RIFI) eo ensaio imunoenzimtico (ELISA). No entanto, resultados falso-negativos de ces assintomticos e reaes cruzadas com outros organismos podem ocorrer. A cultura de clulas de Leishmania e xenodiagnstico, tambm so utilizados. No entanto, estas tcnicas so demoradas, baixa sensibilidade, e este ltimo pouco utilizada

em

diagnstico

de

rotina

(Piarroux

et

al.,

1994).

Assim, as tcnicas alternativas so necessrias para o diagnstico em ces naturalmente infectados por Leishmania infantum chagasi. Uma srie de estudos tm proposto que a reaco em cadeia da polimerase (PCR) pode ser utilizada para diagnosticar a doena de (HU et al, 2000;. LEONTIDES et al, 2002,.. OSHAGHI et al, 2009). PCR em tempo real (qPCR), tambm uma ferramenta til para o diagnstico molecular CVL e faz com que seja possvel determinar a carga de parasita em diferentes tecidos (Francino et al, 2006;. ROLO et al, 2004;. VITALE et al, 2004.; WORTMANN et al., 2004). Alta sensibilidade e especificidade para a deteco de protozorios fizeram ferramentas moleculares importante para diagnosticar corretamente LVC. Alm disso, estes so mtodos rpidos, prticos, que podem ser usados com diferentes amostras biolgicas (Ikonomopoulos et al., 2003). O objetivo do estudo foi determinar a realizao de ensaios de PCR e qPCR para fazer diagnsticos moleculares de L. infantum chagasi utilizando diferentes Materiais 1. Animais Um total de 35 ces naturalmente infectados por L. infantum chagasi foram usados. Os animais foram obtidos a partir do Centro de Controle de Doenas Zoonotic a cidade de Petrolina (Brasil). A infeco foi confirmada por meio do teste de anticorpo fluorescente indirecto (IFAT 40). De acordo com seus sinais clnicos de leishmaniose, os ces foram divididos em trs grupos: polissintomtica, ou seja, mais de trs sinais clnicos; oligossintomticos, 02:59 sinais clnicos, e assintomticos, quando eles no estavam apresentando nenhum sinal clnico. Os ces foram anestesiados com tiopental sdico (25 mg / kg) e sacrificados por meio de uma injeco intravenosa de cloreto de potssio de 19,1%, no Centro 2. Amostras biolgicas Inicialmente, bipsia de medula ssea foi realizada, diretamente do manbrio do esterno. Depois que os ces j tinha sido derrotada, linfonodo e fragmentos 3. do bao foram coletados. de Controlo de Doenas Zoonotic da cidade de Petrolina. amostras e biolgicas. Mtodos

Diagnstico 3,1 Extraco de

molecular ADN

O ADN genmico a partir de sangue e de medula ssea foi extrada atravs do sangue QIAamp DNA Mini-kit (Qiagen), enquanto que o ADN genmico a partir de ndulos linfticos e do bao foi extrado utilizando o QIAamp DNA Mini-kit 3,2 Reaco em cadeia da polimerase (PCR) As reaces foram realizadas num volume final de 25 ul, contendo 2,5 mL de tampo de PCR: 20 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada desoxinuclesido-trifosfato, 1,5 U de ADN-polimerase Taq (Invitrogen), 10 pmol de cada iniciador e 100 g de DNA genmico. O perfil de amplificao consistiu de um ciclo de desnaturao a 94 C durante 5 minutos, hibridao a 65 C durante 1 minuto e extenso a 72 C durante 1 minuto, seguido por 29 ciclos de desnaturao a 94 C durante 1 minuto, hibridao a 65 C durante 1 minuto e extenso a 72 C durante 1 minuto, com uma extenso final a 72 C durante 5 minutos. Os iniciadores utilizados (MC1 e MC2) foram descritos por Cortes et al. (2004): MC1: (5 '- GTT TGG AGC AGC TCT TGG TG - 3') e MC2: (5 '- CCA CAC TTT TTC CGA TTT TG - 3'). Usando estes iniciadores, a amplificao de um fragmento de 447 pares de bases foi activado. Os produtos de amplificao foram visualizados sob luz ultravioleta aps electroforese em gel de agarose (2%) corado com brometo de etdio. 3,3 PCR minicrculo 3'), e a foi sonda em realizada TaqMan-MGB utilizando (FAMtempo os iniciadores real Leish-1 PCR em tempo real para a deteco e quantificao de DNA do cinetoplasto (5'AACTTTTCTGGTCCTCCGGGTAG-3 ') e Leish-2 (5'-ACCCCCAGTTTCCCGCC5'-AAAAATGGGTGCAGAAAT-3'-nofluorescente quencher-MGB), como descrito por Francino et al. (2006). A mistura da reaco (12,5 uL) continha 6,25 mL de Taqman Universal PCR Mix Master, cada iniciador numa concentrao de 900 nM, a sonda a uma concentrao de 200 nM e 50 g de DNA template. A corrida consistiu de um arranque a quente a 95 C durante 3 minutos e 42 ciclos de desnaturao (95 C durante 10 segundos) e extenso do (Qiagen), seguindo as instrues do fabricante.

recozimento (60 C durante 30 segundos). Todos os ensaios foram realizados em triplicado, com um controle negativo (DNA de um co de uma rea no endmica) 194 4. A anlise estatstica As diferenas entre as freqncias de resultados positivos foram avaliados atravs do teste exato de Fisher eo teste do qui-quadrado, com um nvel de significncia Resultados 1. A Dos 35 ces estudados, avaliao 14,28% (5/35) foram classificados clnica como de 5%. Ramos, e um R.A.N. et controle ai. positivo Rev. Bras. em cada srie. Parasitol. Veterinrio.

assintomticos, 68,87% (24/35), oligossintomticos e 17,14% (6/35) como polissintomtica para leishmaniose visceral canina. Os sinais clnicos mais comuns 2. PCR e qPCR A partir dos testes de PCR, DNA de L. infantum chagasi foi detectada em 40% (14/35) dos animais. Nestes animais, 42,85% (6/14) foram positivos em apenas uma amostra biolgica e de 57,15% (8/14) foram positivas em trs amostras analisadas. Electroforese em gel de agarose revelou a amplificao de um fragmento de 447 bp de L. infantum chagasi em reaces positivas. Por outro lado, nenhuma amplificao foi observada em controlos negativos. A partir dos testes de qPCR, DNA de L. infantum chagasi foi observada em 100% dos animais. Nesses animais, de 2,85% (1/35) foram positivos em apenas uma amostra, 2,85% (1/35) foram positivos em duas amostras e 94,30% (33/35) foram positivas em trs amostras analisadas. Nenhuma amplificao Tabela biolgicas Discusso Os sinais clnicos nos animais encontrados no presente estudo foram de acordo com cada grupo clnico (P> foi observada em controlos negativos. 1. 0,05). Os resultados da PCR e qPCR de cada amostra biolgica so descritas na No foram observadas diferenas significativas entre as diferentes amostras foram: dermatopatia perda de peso, e onicogrifose.

compatveis com os achados descritos em casos de LVC, e os mais freqentes a dermatopatia, caquexia e onicogrifose. Embora as amostras utilizadas foram de ces sacrificados, estas amostras podem tambm ser obtidos a partir de animais vivos, especialmente em amostras de medula ssea e de fragmentos de linfonodos. Uma das desvantagens em relao ao uso dos fragmentos de bao neste tipo de diagnstico refere-se a recolha do material, por causa da possibilidade de hemorragia (Leveille et al., 1993). No entanto, este risco consideravelmente reduzido com o auxlio de ultra-som abdominal (Watson et al., 2011). A sensibilidade da anlise de PCR pode variar amplamente, dependendo do tempo de infeco. A sensibilidade considerada nula infeco imediatamente a seguir e pode atingir valores de 78 a 88%, 135 dias aps a infeco (QUINNEL et al., 2009). Alm disso, a carga de parasita tambm afecta a sensibilidade desta tcnica, a qual, apesar de ser capaz de detectar pequenas quantidades de ADN, tem as suas limitaes. Em relao s diferentes amostras biolgicas analisadas utilizando PCR, fragmentos de linfonodos provou ser a melhor opo para a deteco de DNA a partir do protozorio, e estas amostras de animais positivos detectados em todos os trs grupos clnicos (A, O, P). De acordo com Ikonomopoulus et al. (2003), os ndulos linfticos considerada como o rgo preferido para fazer diagnsticos moleculares de L. infantum chagasi usando PCR. Em contraste, usando a medula ssea e bao de fragmentos, os animais positivos foram apenas detectados nos Grupos S e P. Esta diferena nos resultados podem estar relacionados com a distribuio heterognea dos parasitas, em cada tecido, bem como para a carga parasitria e resposta imune local (MAIA et al., 2009). Devido s limitaes da PCR, qPCR provou cada vez mais teis para a deteco e quantificao de protozorios, incluindo L. infantum chagasi (ROLO et al., 2004). No presente estudo, qPCR foi capaz de detectar a presena de L. infantum chagasi ADN em todos os animais estudados. A partir da anlise das amostras diferentes, os valores de positividade elevadas foram encontradas em diferentes grupos clnicos, com frequncias relativas que variam 83,3-100%. As amostras a partir do bao e dos gnglios linfticos alcanado positividade de 95,8% no Grupo O e 100% nos grupos A e P. Considerando a facilidade de aquisio, os ndulos linfticos, mais uma vez provou ser o rgo mais vivel para a deteco de ADN de L. infantum

chagasi

em

ces.

Diagnstico molecular utilizando qPCR mostrou fivel na deteco de L. infantum chagasi DNA, independentemente do estado clnico do animal. Este achado difere do que foi alcanado com os mtodos sorolgicos e parasitolgicos, para que os valores de positividade so maiores em animais sintomticos (QUARESMA et al., 2009). Diagnosticar animais assintomticos de considervel importncia, uma vez que tais animais constituem um reservatrio de L. infantum chagasi (DANTAS-TORRES, 2006). Um grande nmero de estudos relataram que qPCR tem uma maior sensibilidade do que o PCR (Francino et al., 2006). No entanto, este no sempre o caso, uma vez que a variao depende dos iniciadores utilizados e do tipo de DNA a ser amplificada (BASTIEN et al., 2008). A sensibilidade obtida no presente estudo, pode estar relacionado com o DNA alvo amplificado, uma vez que a deteco de DNA do cinetoplasto normalmente mais sensvel, devido ao grande nmero de cpias por Tabela 1. PCR e qPCR resultados de diferentes amostras biolgicas provenientes de animais nos diferentes grupos clnicos:

v. 21, n. 3, julho-definido. 2012 PCR e qPCR no diagnstico de Leishmania infantum como chagasi DNA 195 ribossomal. parasita (Lachaud et al., 2002), em comparao com as sequncias alvo, tais Estudos sobre os mtodos de diagnstico para a CVL so necessrias a fim de determinar a melhor forma de identificar esta infeco em ces, tanto nas reas endmicas e no endmicas. Controlador CVL particularmente relacionado com o uso de mtodos de diagnstico que fornecem resultados fiveis, de modo que os animais positivos pode ser removido, desse modo contribuindo para a propagao no da doena. Os resultados do presente estudo demonstram a importncia de qPCR para diagnosticar CVL: este teste foi capaz de detectar os animais positivos, independentemente do estado clnico. Concluses No presente estudo, qPCR era melhor ferramenta de diagnstico de PCR para

a deteco de L. infantum chagasi. Entre as amostras biolgicas analisadas, linfonodos provaram ser os meios mais adequados para a deteco de L. infantum chagasi DNA por PCR e qPCR, uma vez que foi capaz de detectar animais positivos independentemente do seu estado clnico. A facilidade de se obter amostras de ndulos linfticos demonstra ainda mais a maior viabilidade deste material biolgico sobre fragmentos de bao para o diagnstico Referncias Barrouin-Melo SM, Larangeira DF, De Andrade Filho FA, J Trigo, Julio FS, Franke CR, et al. Pode aspiraes bao ser usado com segurana para o diagnstico parasitolgico de leishmaniose visceral canina? Um estudo em animais assintomticos e polissintomtica. J Vet 2006; 171 (2): 331-339. PMID: 16490717. http://dx.doi.org/10.1016/j.tvjl.2004.11.010 Bastien P, Procop GW, Reischl U. Quantitative PCR em tempo real no mais sensvel do que o "convencional" de PCR. J Clin Microbiol 2008, 46 (6): 18971900. PMID: 18400914 PMCid: 2446855. http://dx.doi.org/10.1128/JCM.0225807 Cortes S, Rolo N, Ramada J, L. Campino PCR como uma ferramenta rpida e sensvel para o diagnstico da leishmaniose humana e canina utilizando Leishmania donovani Trans sl-se R Soc os iniciadores Med especficos 2004; (03) Leishmania infantum 98 de parasitas 12-17. 00002-6 (Kinetoplastida: cinetoplastidas. Trop Hyg (1): de rotina L. infantum chagasi.

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