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ndice Folha de Rosto....................................................................................................................i Ficha Catalogrfica............................................................................................................ii Banca Examinadora..........................................................................................................iii ndice................................................................................................................................iv Agradecimentos...............................................................................................................vi Dedicatria......................................................................................................................vii Lista de Abreviaturas.....................................................................................................viii Resumo............................................................................................................................ix Abstract............................................................................................................................xi 1-Introduo...................................................................................................................

01 1.1 O Parasito..................................................................................................... 01 1.2 A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA)..........................................02 1.3 A Patologia da LTA..................................................................................... 04 1.4 Controle, Diagnstico, e Tratamento da LTA............................................. 05 1.5 A Resposta Imune do Hospedeiro................................................................ 07 1.6 Os Macrfagos.............................................................................................. 09 1.7 Os Efeitos da Hipxia na Resposta Imune................................................... 10 2- Objetivos.................................................................................................................... 14 3- Materiais e Mtodos................................................................................................... 15 3.1 Animais..........................................................................................................16 3.2 Meio de cultura..............................................................................................16 3.3 Obteno e Manuteno do Parasito.............................................................16 3.4 Condies de Microambiente Hipxico........................................................17 3.5 Obteno e Cultivo de Macrfagos Primrios Humanos a Partir de Moncitos de Sangue Perifrico...........................................................................................17

ndice Folha de Rosto....................................................................................................................i

Ficha Catalogrfica............................................................................................................ii Banca Examinadora...........................................................................................................iii ndice.................................................................................................................................iv Agradecimentos.................................................................................................................vi Dedicatria........................................................................................................................vii Lista de Abreviaturas.......................................................................................................viii Resumo...............................................................................................................................ix Abstract..............................................................................................................................xi 1-Introduo......................................................................................................................01 1.1 O Parasito....................................................................................................... 01 1.2 A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA).............................................02 1.3 A Patologia da LTA........................................................................................ 04 1.4 Controle, Diagnstico, e Tratamento da LTA............................................... 05 1.5 A Resposta Imune do Hospedeiro.................................................................. 07 1.6 Os Macrfagos................................................................................................ 09 1.7 Os Efeitos da Hipxia na Resposta Imune..................................................... 10 2- Objetivos...................................................................................................................... 14 3- Materiais e Mtodos..................................................................................................... 15 3.1 Animais............................................................................................................16 3.2 Meio de cultura................................................................................................16 3.3 Obteno e Manuteno do Parasito...............................................................16 3.4 Condies de Microambiente Hipxico..........................................................17 3.5 Obteno e Cultivo de Macrfagos Primrios Humanos a Partir de Moncitos de Sangue Perifrico..............................................................................................17 3.5.1 Procedimento de Coleta de Sangue Perifrico.............................................17 3.5.2 Separao dos moncitos de Sangue Perifrico com Histopaque................18 3.5.3 Cultivo de Macrfagos Humanos Primrios................................................18 3.6 Testes de Infeco e Fagocitose de Macrfagos Primrios Humanos com L. amazonensis..........................................................................................................19 3.6.1 Infeco com L. amazonensis......................................................................19 3.6.2 Cultivo de Macrfagos Primrios Humanos com Beads.........................19 3.6.3 Infeco de Macrfagos em Ambiente Hipxico........................................20 iv

3.6.4 Avaliao do Meio..................................................................................................23 3.7 Teste de Viabilidade Celular..........................................................................23 3.8 Determinao da Produo do TNF-...........................................................24 3.8.1 Obteno de Sobrenadantes de Culturas de Macrfagos............................24 3.8.2 Teste de Deteco de TNF- .......................................................................25

3.9 Anlise Estatstica .........................................................................................26 4- Resultados................................................................................................................... 27 4.1 Obteno de Macrfagos Humanos................................................................27 4.2 Infeco de Macrfagos Humanos com L. amazonensis................................29 4.3 Infeco de Macrfagos Humanos em Hipxia.............................................33 4.4. Avaliao da Viabilidade do Meio de cultura Aps Hipxia........................43 4.5. Viabilidade de Macrfagos em Hipxia........................................................45 4.6-Produo de TNF- por Macrfagos em Hipxia..........................................46

5- Discusso..................................................................................................................... 48

6- Concluses.................................................................................................................. 57

7- Referncias Bibliogrficas.......................................................................................... 58

Agradecimentos

Professora Selma Giorgio pela orientao, pelo profissionalismo, dedicao, pacincia e, principalmente, pela confiana em mim depositada. Aos professores do Departamento de Parasitologia pelos valiosos ensinamentos e pela ajuda nos momentos em que precisei. Aos funcionrios do Departamento de Parasitologia pelo auxlio e pela dedicao durante a realizao deste trabalho. professora Urara Kawazoe pelas sugestes oferecidas e pelo apoio dado durante todos os momentos do meu trabalho. professoras Ana Maria A. Guaraldo, Silmara Marques Allegretti, e aos professores Fbio T. M. Costa, Marcelo Brocchi e Odair Benedito Ribeiro pelas importantes sugestes dadas a este trabalho. Aos amigos do laboratrio, Adriana, Diana, Letcia, Maira, Wagner, pela pacincia e pelo apoio. Aos amigos Alessandro, Brenno, Daniel e Rafael que literalmente deram o sangue para realizao deste projeto.

vi

Dedico este trabalho ao meu pai Walter, a minha esposa Sandra e ao meu filho Diogo por acreditarem em mim e pelo apoio fundamental pra a realizao deste projeto.

vii

Lista de Abreviaturas

CFU CSF CFU-GM GM-CSF HIF-1

Fator de formao de colnia Fator de estimulao de colnia Unidade de formao de colnia de granulcitos/macrfagos Fator de estimulao de colnia da granulcitos/macrfagos Fator induzido por hipxia um-alfa Protena de choque trmico de 70 kilodaltons Interferon gama Interleucina Lipopolissacardeo de origem bacteriana Macrfagos humanos primrios xido ntrico sintase induzida xido ntrico Salina em tampo fosfato Presso parcial de oxignio Soro fetal bovino Linfcito tipo helper 1 Linfcito tipo helper 2 Fator de necrose tumoral alfa

HSP-70 INF

IL LPS MHP iNOS NO PBS pO2 SFB Th1 Th2 TNF

viii

Resumo A leishmaniose tegumentar uma parasitose causada por protozorios do gnero Leishmania que acomete preferencialmente a pele e/ou as mucosas e caracteriza-se pelo aparecimento de leses ulcerosas. Histologicamente, esta leso caracteriza-se pela desintegrao da epiderme e da membrana basal, com grande incidncia de histicitos, linfcitos, granulomas e proliferao de parasitos. Como conseqncia, a regio lesada apresenta redistribuio de vasos sanguneos, e dificuldades na difuso de oxignio, resultando em microambiente hipxico. Macrfagos se adaptam a hipxia, alterando seu metabolismo, produo de linfocinas e atividade fagoctica. No presente trabalho

comparamos os efeitos da hipxia (6% O2) e da normxia (21% O2) na infeco in vitro de macrfagos humanos obtidos de moncitos de sangue perifrico com o parasito Leishmania amazonensis. Culturas de macrfagos humanos expostos a hipxia antes da infeco com L. amazonensis mostraram reduo na porcentagem de clulas infectadas quando comparadas com culturas de macrfagos humanos que permaneceram em normxia. Ns tambm investigamos se a hipxia estaria inviabilizando a sobrevivncia dos macrfagos (teste do MTT) e induzindo a produo da linfocina TNF- (boiensaio

com clulas L929). Macrfagos humanos submetidos hipxia no mostraram diferenas significativas em relao viabilidade quando comparados aos macrfagos que permaneceram em ambiente normxico. Culturas de macrfagos humanos estimulados com LPS e submetidos a perodos de hipxia produziram mais TNF

do que culturas de

macrfagos estimulados com LPS que permaneceram em normxia. Porm quando infectados com L. amazonensis, macrfagos estimulados com LPS em hipxia mostraram produo significativamente menor de TNF

quando comparados a macrfagos no

infectados e estimulados por LPS, em ambiente hipxico. Verificamos tambm que a ix

produo de TNF

nas culturas de macrfagos infectados com L. amazonensis,

estimuladas com LPS, em hipxia foi similar a produo de TNF-

dos macrfagos

infectados com L. amazonensis, estimulados com LPS, mas que permaneceram em normxia. Nossos resultados indicam que hipxia altera a susceptibilidade de macrfagos humanos obtidos de moncitos de sangue perifrico para a infeco com L. amazonensis, e que a produo de TNF

no est envolvida no mecanismo pelo qual estas clulas

controlam a carga parasitria.

Abstract The tegumentary leishmaniasis is a parasitic disease caused by protozoa Leishmania which attacks skin and/or mucosal tissues. The lesions are histologically characterized by degeneration of epidermal and the basal membranes with infiltration of histiocytes, lymphocytes, granuloma and parasite proliferation. Cutaneous lesions are

associated with rearrangement of the blood vessels and decreased oxygen diffusion, resulting in a hypoxic microenvironment. Macrophages adapt to hypoxia altering their metabolism, lymphocytes production and phagocytosis activity. In the present study we have compared the effect of hypoxia (6% O2) with normoxia (21% O2) in human macrophages, derived from peripheral blood monocytes, infected with Leishmania amazonensis. Human macrophages exposed to hypoxia before infection with L. amazonensis showed a reduction of the percentage of infected cells. Cell viability was tested by MTT and TNF- production was detected by bioassay using cell line L929.

Human macrophages exposed to hypoxia showed similar viability when compared with human macrophages in normoxia. Human macrophages stimulated with LPS and exposed to hypoxia increased TNF- production when compared with macrophage stimulated by

LPS cultured in normoxia. However, macrophage, infected with L. amazonensis stimulated with LPS and exposed to hypoxia showed a reduction in TNF

production when

compared with non infected macrophage, stimulated with LPS and exposed to hypoxia. We also observed that TNF- production in L. amazonensis infected macrophages stimulated

with LPS and exposed to hypoxia was similar to TNF

production of infected

macrophages stimulated with LPS, in normoxia.

xi

Our data indicated that hypoxia cam alter human macrophages susceptibility to L. amazonensis infection and no correlation between TNF

production and control of

parasite infection in this cells under hypoxia conditions.

xii

1-Introduo 1.1 O Parasito O gnero Leishmania foi criado por Ross em 1903 a partir das observaes do parasito feitas por Cunnigham (1885), Leishman (1900) e Donavan (1903) (GONTIJO & CARVALHO, 2003). No ciclo de vida do parasito existem duas formas morfolgicas: os promastigotas e os amastigotas. Os promastigotas so formas alongadas com flagelo na regio anterior, medem 16,0 a 40,0 m de comprimento e 1,5 a 3,0 m de largura, incluindo o flagelo, que geralmente maior do que o corpo. Reproduzem-se por diviso binria no hospedeiro invertebrado, produzindo formas infectantes denominadas promastigotas metacclicos. Estes parasitas migram para a probcide do inseto e no momento do repasto sanguneo so inoculados no tecido celular subcutneo do hospedeiro vertebrado. No vertebrado so fagocitados por macrfagos presentes nos tecidos (histicitos) e transformam-se na forma amastigota. Os amastigotas so esfricos com um flagelo interno rudimentar (pequena invaginao na superfcie do parasito). Estes medem de 3,0 a 6,5 m, e reproduzem-se por diviso binria dentro dos macrfagos, causam lise celular, e infectam outros macrfagos. No repasto sangneo do inseto vetor em um vertebrado infectado ocorre a ingesto das formas amastigotas, que se transformaro em promastigotas em seu intestino, fechando o ciclo evolutivo do parasito (HEPBURN 2000; HANDMAN, 2001). So conhecidas aproximadamente 21 espcies do protozorio, que podem se hospedar em cerca de 30 espcies de vetores (CUNINGAM, 2002). O vetor da doena um dptero da famlia Psychodidae, subfamlia Phlebotominae pertencente aos gneros: Phlebotomus, prevalente na frica, Europa e sia e Lutzomyia, prevalente nas Amricas. As fmeas so hematfagas e se contaminam ao ingerir 1

macrfagos do hospedeiro infectado com formas amastigotas do parasito. No Brasil, espcies do gnero Lutzomyia esto presentes em todas as regies do pas, onde recebem nomes populares, tais como, cangalha, mosquito-palha, birigui e tatura. Estes insetos so morfologicamente menores que os mosquitos comuns, apresentam-se muito pilosos e tem colorao clara. As fmeas necessitam de sangue para completarem o ciclo reprodutivo e costumam exercer a hematofagia no perodo noturno (CUNINGAM, 2002; GONTIJO & CARVALHO, 2003). Alguns mamferos prximos ao homem, que fazem parte do ciclo de vida do parasito, so reconhecidos como reservatrios de Leishmania, tais como, ces, roedores, cavalos, gambs, macacos e tamandus (HEPBURN, 2000; GONTIJO & CARVALHO, 2003). Neste trabalho, utilizamos formas promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonensis. Esta espcie de Leishmania, provoca a forma tegumentar ou cutnea da infeco. 1.2 A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) A leishmaniose tegumentar americana (LTA) uma parasitose de ciclo heteroxnico que acomete preferencialmente a pele e/ou as mucosas e caracteriza-se pelo aparecimento de leses ulcerosas. A LTA endmica e com incidncia alta em regies tropicais da frica, Amricas, ndia, Mediterrneo e Sudeste Asitico, totalizando 1,5 milhes de pessoas infectadas. Paises como Ir, Arbia Saudita, Sria, Afeganisto, Brasil e Peru apresentam 90% dos casos relatados da doena (HEPBURN, 2000; GONTIJO & CARVALHO, 2003). No Brasil, estima-se o aparecimento de aproximadamente 35.000 novos casos clnicos por ano em todas as regies do pas (HEPBURN, 2000; GONTIJO & CARVALHO, 2003). 2

A LTA caracteriza-se pelo aparecimento de leso cutnea de aspecto ppulovesiculoso que eventualmente pode disseminar-se para outras reas do corpo. No caso de disseminao cutnea, denomina-se a doena de LCD (Leishmaniose Cutnea Difusa) e no caso de invaso de mucosa nasofarngea, Leishmaniose Cutneo-Mucosa (LCM). Uma outra caracterstica importante da LTA a sua reativao em pacientes imunossuprimidos devido infeco pelo Vrus da Imunodeficincia Humana (HIV). A gravidade e a incidncia de LTA levaram a Organizao Mundial de Sade a incluir esta doena entre as seis mais importantes endemias causadas por parasitos (www. who. int/ health topics/leishmaniasis). No Brasil, casos clnicos de LTA eram conhecidos por Cerqueira desde 1885 e sua forma epidmica foi relatada em 1907 entre os trabalhadores da construo da Estrada de Ferro Noroeste do Brasil (HEPBURN, 2000; GONTIJO & CARVALHO, 2003; HERWALDT, 1999). Devido grande diversidade de gneros do protozorio, foi proposta uma classificao por Laison & Shaw (1987) que divide os subgneros em grandes complexos, dos quais destacamos os seguintes, de interesse parasitolgico no Brasil por causarem LTA, os complexos, mexicana (subgnero Leishmania) e braziliensis (subgnero Viannia). Dentro destes complexos tambm foi proposta a classificao das espcies, s quais destacamos, devido patogenia em humanos: Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) guyanensis e Leishmania (Viannia) brasiliensis (LAISON & SHAW, 1992). Ainda podemos citar duas espcies de Leishmania pertencentes ao complexo donovani, as Leishmania (Leishmania) donovani e Leishmania (Leishmania) chagasi, que, embora no provoquem a LTA, so responsveis pela forma visceral e geralmente fatal da 3

leishmaniose tambm conhecida como calazar (HERWALDT, 1999; GONTIJO & CARVALHO, 2003). 1.3 A Patologia da LTA A leso cutnea aguda causada por Leishmania se inicia aps a inoculao dos parasitos, que so fagocitados por macrfagos e se tornam hospedeiros das formas amastigotas. As leses podem ser ppulas, ndulos ou placas que formam crostas ou lceras. Aps um perodo de incubao que varia entre 1 e 12 semanas observa-se no local da picada a primeira manifestao clnica que uma pequena ppula indolor que pode permanecer estacionria ou evolui para um ndulo drmico, conhecido como histioma, que se caracteriza por apresentar uma massa drmica contendo um infiltrado de macrfagos e linfcitos. Histologicamente, esta leso se caracteriza por hipertrofia do estrato crneo, com acmulo de histcitos onde os parasitos se multiplicam. Este ndulo desenvolve necrose central que resulta na desintegrao da epiderme e da membrana basal, formando uma leso ulcerosa circular e crostosa (MEHREGAN et al., 1999 e GHERSETICH et al., 1999). O infiltrado drmico nesse estgio se estende visivelmente e a rea de necrose aumenta desenvolvendo leses caractersticas de L. amazonensis, L. brasiliensis e L. guyanensis. Aps a perda da crosta superior, observa-se uma elevao das bordas cujo fundo granuloso, repleto de exudado purulento, com grande incidncia de histicitos, linfcitos, e granulomas. Nas bordas da leso grande o nmero de formas amastigotas (MEHREGAN et al.,1999; GHERSETICH et al, 1999; HANDMAN, 2001). A leso causada por L. amazonensis cura-se espontaneamente e susceptvel ao tratamento. Entretanto, alguns pacientes desenvolvem a forma difusa da doena (Leishmaniose Cutnea Difusa, LCD), na qual o parasito migra por vasos linfticos, provocando o aparecimento de leses por toda a pele e formando metstases (HANDMAN, 4

2001; GONTIJO & CARVALHO 2003).

Na LCD no h resposta aos tratamentos

conhecidos e est associada deficincia da resposta imune celular do paciente frente aos antgenos do parasito. Na LCD comum tambm o aparecimento de leses no-ulcerosas com focos necrticos e granulomas, principalmente no rosto e membros (MEHREGAN et al., 1999; HANDMAN, 2001; GONTIJO & CARVALHO, 2003). Todas as leses, cutneas, mucosas e cutneas difusas apresentam redistribuio focal de vasos sanguneos, causando dificuldades na difuso de oxignio no local (isquemia) e resultando em um ambiente de pouco aporte de oxignio ou hipxico. A hipxia tecidual deve prejudicar o efeito das drogas e alterar a cicatrizao destas leses (MEHREGAN et al.,1999; LAHAT, et al., 2003 e COLHONE et al., 2004). 1.4. Controle, Diagnstico e Tratamento da LTA Por ser uma zoonose primitiva de florestas, a LTA resiste a qualquer medida preventiva aplicvel s doenas transmitidas por vetores devido impossibilidade atuao na fonte da infeco silvestre. Os resultados, ainda preliminares, com imunoterapia e imunoprofilaxia representam possibilidades profilticas promissoras. (HANDMAN, 2001; GONTIJO & CARVALHO, 2003). O diagnstico parasitolgico pode ser feito diretamente com a demonstrao das formas amastigotas obtidas da leso por escarnificao, aspirao ou bipsia da borda, corado por Giemsa ou Leishman (MEHREGAN et al., 1999; HANDMAN, 2001). O diagnstico imunolgico pode ser feito pelo Intradermorreao de Montenegro, que consiste de injeo intradrmica de soluo de antgeno padronizado no antebrao. considerado positivo o paciente que aps 48 ou 72 horas apresenta endurao maior ou igual a 5 mm na regio aplicada. O teste detecta hipersensibilidade tardia e normalmente negativo nas formas cutneas difusas (LCD) ou em pacientes imunodeprimidos, porm, 5

de grande valor presuntivo no diagnstico de LTA e nos inquritos epidemiolgicos de reas endmicas (MEHREGAN et al., 1999; GHERETICH et al., 1999; HANDMAN, 2001). Outros mtodos utilizados para a deteco de LTA so as reaes de ELISA, o diagnstico histolgico e a reao em cadeia de polimerase (PCR) que permite detectar quantidades muito pequenas do DNA do parasito (MEHREGAN et al., 1999; GHERETICH et al., 1999; HANDMAN, 2001). O tratamento da doena em humanos feito administrando-se antimoniais pentavalentes como o antimoniato de meglumine (Glucantime) ou o stibogluconato de sdio (Pentostam). Seus efeitos colaterais mais freqentes so artralgia, mialgia, inapetncia, cefalia, febre, vmitos, tontura e inchao na regio de aplicao. Cardio, hepato e nefrotoxicidade tambm so observadas, limitando o uso dessas drogas, especialmente em pacientes idosos e, por ser abortiva, a droga vetada em gestantes. O antibitico, anfotericina B, de reconhecida ao leishmanicida, normalmente a opo quando o antimonial se torna proibitivo ou inoperante. Apesar de eficaz para leses cutneas, a anfotericina B apresenta srios efeitos colaterais como nuseas, vmitos, insuficincia renal, anemia e alteraes cardacas. O uso endovenoso e os quadros de cardio e nefrotoxicidade impedem o seu uso fora de ambiente hospitalar.

(www.who.int/tdr/ ; HERWALD, 1999; HEPBRUN, 2001).

1.5 A Resposta Imune do Hospedeiro Aps a infeco, os parasitos necessitam se reproduzir rapidamente, e de preferncia, em macrfagos quiescentes ou em moncitos recm chegados ao tecido infectado. Para isso, usam mecanismos de evaso ou escape que, por exemplo, inibam o burst respiratrio dos macrfagos. O parasita tambm induz alteraes na resposta imune do hospedeiro, como modificaes na produo de citocinas, inibio da apresentao de antgenos e estimulao de linfcitos do tipo T (CD4+) helper Th2 (MAUEL, 1996; BOGDAN & ROLLINGHOFF, 1998; GHERSETICH et al., 1999). H, pelo menos, duas respostas imunes celulares envolvidas no

controle/susceptibilidade infeco com Leishmania, muito estudadas nos modelos murinos da leishmaniose cutnea. No processo de imunidade celular protetora, o linfcito T do tipo Th1 produz e libera IL-2 e IFN- , citocinas que recrutam clulas (neutrfilos e

moncitos) para local de infeco e que tambm ativam macrfagos e clulas NK (Natural Killer). Os macrfagos por sua vez liberam citocinas como o TNF- e IL-1 que aumentam

a atividade microbicida dos prprios macrfagos, ou IL-12 que estimula linfcitos Th1 a produzirem novas citocinas (HERWALD, 1999 e HEPBRUN, 2000). As citocinas TNF

e IL-1, alm de estimularem ao microbicida dos macrfagos, recrutam mais linfcitos para a regio de inflamao. Esta inflamao passa a apresentar caractersticas de Hipersensibilidade do tipo Tardia, em que ocorre persistncia dos agentes infecciosos no interior dos macrfagos, formao de granulomas, destruio tissular, redistribuio de vasos sanguneos por estmulo dos prprios macrfagos e formao de ambiente com pouca oxigenao. Vrios estudos sugerem que o TNF- um dos principais fatores de

estmulo para que macrfagos eliminem parasitos intracelulares como Leishmania (MAUEL, 1996). 7

Estudos de Liew et al. (1990), demonstraram que camundongos CBA/T6T6 infectados com L. amazonensis e tratados com anticorpo anti-TNF

tm leses mais

graves que aquelas de animais no tratados com o mesmo anticorpo. Experimentos realizados com culturas de clulas tambm indicam um papel importante do TNF- na

reduo da infeco. Macrfagos peritoniais murinos tratados com TNF

e LPS e

infectados com L. major foram capazes de destruir os parasitos intracelulares. Entretanto, a presena de LPS foi fundamental para a ativao dos mecanismos leishmanicidas (LIEW et al., 1990). Uma interao sinrgica de TNF- com INF- reduzindo a carga parasitria de

macrfagos infectados com L. major foi demonstrada por Bogdan et al. (1990). A associao de INF- com IL-4 no mostrou efeitos nas mesmas clulas infectadas com o

parasito (BOGDAN et al., 1990). A produo de TNF- durante o processo de controle da

infeco pode estar associada ao ambiente hipxico presente nas leses (LEEPERWOODFORD et al., 1999; LAHAT et al., 2003 e COLHONE et al., 2004). No processo de imunidade celular relacionado susceptibilidade na infeco com Leishmania, esto envolvidos os linfcitos T do tipo Th2. Apesar do padro de produo das citocinas ainda no ser completamente entendido, sabe-se que, dependendo do estmulo antignico, linfcitos Th podem se diferenciar em linfcitos Th2 que produzem IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 e provocam um efeito supressor da capacidade de defesa contra o parasito. (MEHREGAN, 1999; HANDMAN, 2002; GHERSETICH, 1999; HERVALDT, 1999). Este efeito est ligado ao da IL-4 que inibe a ativao dos macrfagos por INF

, provocando uma diminuio na produo de TNF- e IL-1. Os linfcitos Th2 produzem

IL-10 que est associada inibio de protenas coestimulatrias da membrana de macrfagos e de clulas dendrticas. (HO et al., 1992). Apesar de bastante estudadas em

modelos murinos e culturas de clulas murinas, as respostas imunes e a dicotomia Th1/Th2 so menos avaliadas em pacientes e em clulas de origem humana. 1.6. Os Macrfagos Macrfagos so clulas do sistema fagocitrio mononuclear, originadas de clulas tronco hematocitopoticas presentes na medula ssea que se diferenciam em clulas formadoras de colnia CFU (colony-forming unit). Estas clulas do origem a quatro linhagens bsicas do sangue: eritride, megacarioctica, linfide e mielide. As CFU, sob a influncia de citocinas produzidas por clulas maduras na medula ssea, como por exemplo, CSF (clolony stimulatory factor), GM-CSF (granulocyte-macrophage

stimulatory factor) e das interleucinas IL 1, IL3, IL4, IL5 e IL6, do origem s clulas precursoras mielides, CFU-GM (colony-forming unit granulocyte-macrophage) e posteriormente a CFU-M (colony-forming unit macrophage), que originam as clulas precursoras dos macrfagos presentes na corrente sangunea, os moncitos

(KLEINERMAN, et al., 1988; SCHONLAU et al, 2003). Os moncitos correspondem a 1-6% das clulas brancas do sangue, onde so as maiores clulas brancas presentes, com dimetro variando entre 12 e 15 m e apresentando um grande ncleo riniforme, bilobado e central. Estas clulas tm a capacidade de migrarem dos vasos sanguneos e se instalarem nos tecidos. A mudana de ambiente provoca um estmulo que resulta em diferenciao celular, gerando clulas fagocticas chamadas macrfagos (KELLEY et al., 1988; LEWIS et al, 1999). Estruturalmente, os macrfagos apresentam uma cromatina frouxa, com grnulos dispersos no ncleo e maior quantidade de citoplasma se comparado aos moncitos. No citoplasma, o complexo de Golgi muito desenvolvido devido grande produo de fagolisossomos. O citoplasma ondulado, com presena de muitas fibras proticas do citoesqueleto responsveis pela 9

formao de pesudpodes que participam das funes fagocticas dos macrfagos (LEWIS et al, 1999; COX et al., 1999). Em mamferos, cada tecido apresenta caractersticas microambientais prprias. Por exemplo, enquanto o peritnio altamente anaerbico, os alvolos pulmonares so muito oxigenados e assim aerbicos. Em cada tipo de microambiente tissular, o processo de diferenciao do macrfago (adaptao) pode gerar mudanas fenotpicas que diferenciam um macrfago de outro, embora sua funo fagoctica permanea a mesma (LEEPER-WOODFORD et al., 1999). Os macrfagos quando ativados, principalmente por lipopolissacardeos de Escherichia coli (LPS) ou TNF- , apresentam no interior de seus fagolisossomos

secundrios, alm de enzimas hidrolticas, uma srie de metablitos oxigenados como, perxido de hidrognio (H2O2), nion superxido (O2-), oxignio singlet (1/2 O2), radical hidroxila (OH-), xido ntrico (NO) e o peroxinitrito (ONOO-). (HO et al., 1992; WEINBERg et al., 1995; GIORGIO et al., 1996; GANTT et al., 2001). Para a produo destes metablitos txicos, durante o processo de fagocitose, ocorre um grande aumento no consumo de oxignio pelos macrfagos, conhecido como burst respiratrio ou exploso respiratria. Estes fagcitos tambm sintetizam xido ntrico a partir de L-arginina pela enzima NO-sintetase induzida (iNOS), um importante radical livre microbicida que reage com o superxido gerando peroxinitrito, outro agente citotxico (WEINBERG et al., 1995). Protozorios como Leishmania possuem mecanismos de evaso destes metablitos, tal como, a capacidade de inibir da expresso da produo de iNOS (LINARES, et al., 2000; SACKS, & SHER, 2002 e MATEO et al., 2003). 1.7 Os Efeitos da Hipxia na Resposta Imune Em condies normais, a presso parcial de oxignio (pO2) no tecido cutneo de 50-60 mmHg. Durante infeces h mudanas na presso parcial de oxignio 10

tornando o micro ambiente tecidual hipxico (oxigenao diminuda). O fluxo sangneo alterado, a isquemia e a proliferao de clulas e organismos infectantes so alguns dos fatores responsveis pela hipxia associada s infeces. Em tecido drmico lesado, as medidas de pO2 mostram gradientes hipxicos de 5-28 mmHg. (HARRON et al., 2000). Na rea central da leso, onde se encontram grandes quantidades de fibrina, plasma e abundante populao de leuccitos mediadores de inflamao, normal encontrar os nveis mais baixos de pO2. (LEWIS et al., 1999). A situao de hipxia em leses granulomatosas mediadas por macrfagos tem sido relacionada induo de citocinas angiognicas e sntese de matriz extracelular por fibroblastos (HARRON et al., 2000). Embora se saiba que ambientes com baixa pO2 provocam apoptose em macrfagos (SHIMIZU, et al., 1996), estas clulas podem se adaptar gerando mudanas fenotpicas para garantir sua sobrevivncia e funcionamento. Fato que, macrfagos se acumulam no centro e nas adjacncias de reas hipxicas e pouco vascularizadas dos tecidos lesados e so capazes de secretar substncias nestas condies (LEWIS et al., 1999). Em caso de falta de oxignio, os macrfagos fazem gliclise anaerbica da hexose monofosfato, liberando cido pirvico, que na ausncia do oxignio rapidamente se converte em cido ltico, deixando o ambiente nos vacolos ainda mais cido. Esta via metablica anaerbica permite que fagcitos possam eliminar microrganismos mesmo em condies de anaerobiose, como em granulomas. Nos locais de inflamao, normalmente, ocorrem processos isqumicos devido s leses teciduais que ocorrem nos vasos sanguneos e, nestes ambientes, os macrfagos liberam citocinas, como o FGF (fator de crescimento de fibroblastos) e o VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) que participam do processo de reconstruo vascular da regio lesada (LEEPER-WOODFORD et al., 1999; LEWIS et al., 1999 ). 11

Macrfagos submetidos hipxia sintetizam maiores quantidade de citocinas, como as IL-1, IL-6 e TNF

(SCANELL et al., 1993), e tambm da enzima iNOS

(ALBINA et al., 1995), responsvel pela sntese de NO, em associao aos ativadores como o INF- e o TNF- , na presena de LPS (STUEHR, 1997). A produo de protenas

de choque trmico como a HSP-70 (70-Kd Heat Shock Protein) sofrem reduo em perodos de hipxia, e se as clulas foram reoxigenadas, a produo da HSP-70 retorna aos nveis pr-hipxicos (DEGROSSOLI, et al., 2004). Em relao aos processos de fagocitose, estes tambm ficaram alterados em ambientes hipxicos. Por exemplo, clulas de Kupffer submetidas hipxia in vitro e in situ mostraram diminuio da capacidade fagoctica para partculas de carbono em comparao com clulas de Kupffer que foram oxigenadas (LE KOPPELE et al., 1991). Resumidamente, apesar de clulas como os moncitos e os macrfagos poderem sofrer apoptose em condies de hipxia, elas tambm se adaptam a estes ambientes, alterando o seu metabolismo, produzindo linfocinas pr-inflamatrias como o TNF- e a

IL-1, e alterando as atividades exo-endofagocticas. Vrios mecanismos celulares de resposta hipxia tm sido propostos nos ltimos anos como participantes do processo, mas no foram baseados em modelos experimentais de infeces (ALBINA et al., 1995; LEWIS et al., 1999; YUN et al., 1997). Nosso laboratrio tem explorado o papel da hipxia durante a infeco com L. amazonensis. A leso causada pelo parasito L. amazonensis tem caractersticas que levam hipxia tecidual, tais como, a presena de um grande nmero de amastigotas em diviso, a migrao de clulas inflamatrias, as infeces secundrias com bactrias aerbicas e anaerbicas e a expresso de uma protena presente em ambiente hipxico, o fator de transcrio Hypoxia Inducible Fator (HIF1- ), (AUGUSTO et al., 1996; ALEXANDER et

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al., 1999; SOLBACH et al., 2000; HANDMAN, 2000 e MATEO et al., 2003 e ARRAISSILVA et al., 2005), que justificam os estudos. De fato, resultados recentes do nosso grupo de pesquisa obtidos, tanto com culturas primrias de macrfagos de camundongos como com linhagens tumorais, demonstraram que um ambiente de baixa tenso de oxignio (5% O2, 5% CO2, balanceado com N2) tem efeito negativo no ndice de infeco (COLHONE et al., 2004). Macrfagos submetidos hipxia fagocitam normalmente os parasitas, mas aps a infeco apresentam-se ativados e controlam a proliferao de amastigotas. Os efeitos da hipxia na infeco de macrfagos originados de moncitos de sangue humano com L. amazonensis ainda no tinham sido avaliados e so de extrema importncia para a ampliao dos resultados e das concluses obtidas com clulas de camundongos. Nosso modelo in vitro mais prximo da situao da infeco que ocorre em seres humanos.

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2-Objetivos Os objetivos deste projeto inserem-se na principal linha de pesquisa do nosso laboratrio de Leishmaniose e relacionam-se compreenso do papel deletrio e/ou teraputico da hipxia em infeces intracelulares como a leishmaniose. Especificamente, pretendemos:

1) Purificar moncitos humanos de sangue perifrico de indivduos adultos saudveis para obteno de culturas de macrfagos humanos;

2) Padronizar o mtodo de infeco de macrfagos humanos com L. amazonensis;

3) Avaliar o efeito da hipxia na viabilidade de macrfagos humanos e no ndice de infeco dessas clulas com L. amazonensis;

4) Avaliar a produo de TNF

nas culturas de macrfagos humanos submetidos

hipxia.

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3- Materiais e Mtodos

Lista de Compostos e Equipamentos Usados e Procedncias

Meio RPMI

Sigma Aldrich Co (USA)

Soro Fetal Bovino Inativado

Sigma Aldrich Co (USA)

Lipopolissacardeos de E. coli (LPS)

Sigma Aldrich Co (USA)

Gentamicina/penicilina

Sigma Aldrich Co (USA)

TNF- recombinante

Amersham Life science (USA)

Cell Growth Determination Kit, MTT Based

Sigma Aldrich Co. (USA)

Bicarbonato de Sdio

Sigma Aldrich Co (USA)

HEPES

Sigma Aldrich Co (USA)

Histopaque 1.077

Sigma Aldrich Co (USA)

Placa de Cultura de 24/96 Poos

Corning TRP Co. (USA)

Tubos Cnico p/ Centrfuga 15/50 ml

Corning TRP Co. (USA)

Centrfuga Eppendorf 5810

Eppendorf (USA)

Estufa de CO2 Shelab TC 2323

Shellab (USA)

Fluxo Laminar Veco Clean plus 09

Veco (Brasil) 15

3.1 Animais Camundongos isognicos fmeas da linhagem BALB/c, livres de patgenos especficos, com idade entre 6 e 12 semanas, foram fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigao Biolgica CEMIB/UNICAMP e foram mantidos no Biotrio do Departamento de Parasitologia do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas. 3.2 Meio de Cultura O meio de cultura utilizado no cultivo de parasitos e de moncitos/macrfagos humanos foi o RPMI 1640 suplementado com 10% de SFB (inativado a 56oC durante 1 hora) para os parasitos e 20% de SFB para os macrfagos humanos, 20 Mm de bicarbonato de sdio, 10mM de tampo HEPES e 25g/ml de gentamicina ou

penicilina/estreptomicina. 3.3 Obteno e Manuteno do Parasito O parasito utilizado foi a L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269). As formas amastigotas foram mantidas em camundongos BALB/c atravs da inoculao subcutnea de 2X106 parasitos no coxim plantar de uma das patas traseiras. Os amastigotas foram retirados de leses desenvolvidas nas patas desses animais por meio de raspagens com bisturi em salina estril suplementada com gentamicina (2g/ml). A suspenso obtida foi filtrada em gaze estril para retirada de resduos (protocolo adaptado de Cantos et al., 1993). O nmero de amastigotas foi contado em cmara de Neubauer. Para diferenciao em promastigotas, frascos de cultura com amastigotas em meio RPMI 1640 foram mantidos em estufa seca, com temperatura de 26 a 28oC. Aps 2 a 3 dias, ocorria a diferenciao. As formas promastigotas foram mantidas em frascos plsticos

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de cultura, com meio RPMI 1640 suplementado com 10% de SFB estril em estufa seca a temperatura de 26 a 28oC. 3.4 Condies de Microambiente Hipxico O ambiente hipxico foi estabelecido com a lavagem de uma cmara incubadora (Billups Rothenberg, modelo MIC 101) com a mistura gasosa padro primrio (White Martins) a 2 % de oxignio, 5 % de CO2 e balanceada com nitrognio, pelo perodo de 15 minutos. Em seguida, as mangueiras de entrada e sada de gs foram fechadas e a cmara mantida em estufa a 37oC. Para aferir o grau de hipxia dentro da cmara foi utilizado um analisador de gs (testoryt/confort), com uma soluo absorvente do oxignio (Oxsorbent-EUA). Aps a lavagem da cmara, a entrada de gs foi fechada e a sada acoplada a extremidade do analisador. Por meio de compresso de uma pra acionada por 18 vezes consecutivas, o ar de dentro da cmara entrou em contato com a soluo absorvente dentro do analisador e depois de homogeneizada a soluo, mediu-se a concentrao de oxignio que, em nossos experimentos foi de 6%. A tenso de oxignio no meio foi de 37 mmHg sob condies hipxicas e de 150 mmHg sob condies normxicas (estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC). 3.5 Obteno e Cultivo de Macrfagos Primrios Humanos a partir de Moncitos de Sangue Perifrico: 3.5.1 Procedimentos de Coleta de Sangue Perifrico: A coleta de sangue foi feita em doadores adultos e saudveis doadores de sangue, com agulha estril em tubo estril de vcuo (volume de 9ml), revestidos internamente com heparina ou EDTA (Vacoutainer, Brasil).

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3.5.2 Separao dos Moncitos de Sangue Perifrico com Histopaque 1.077: Imediatamente aps a coleta de sangue, em fluxo laminar procedeu-se o seguinte protocolo: em tubo cnico foi colocado mistura 3:5 de sangue/PBS (salina em tampo fosfato 0,01M, pH 7,4) isento de clcio e magnsio. Cuidadosamente, em tubo cnico p/ centrfuga, colocamos a mistura sangue/PBS sobre Histopaque 1.077 (Sigma), na proporo de 8:3 (sangue/Histopaque). O material foi centrifugado a 400G (1.500 RPM) durante 30 minutos em temperatura ambiente. Aps a centrifugao, a camada intermediria opaca, continha clulas mononucleares. As clulas foram lavadas a 250G (1250 RPM) por 10 minutos, temperatura ambiente, duas vezes (protocolo adaptado de Product information Sigma - Histopaque 1.077; FELDMAN et al., 1987; KELLEY et al., 1988; KALMAR et al., 1988). As clulas foram ressuspensas em meio RPMI 1640 suplementado com 20% de SFB, e o total de clulas viveis contadas em cmara de Neubauer, utilizando-se soluo de Tripan Blue diluda 10:1 em meio de cultura. Foi realizada contagem diferencial para avaliar a morfologia das clulas e para estabelecer o nmero aproximado de moncitos na amostra, corando-se com cristal violeta 1mg/ml em cido actico 10% (200 moncitos + 50 l do corante).

l dos

O clculo do nmero de moncitos feito usando-se a seguinte frmula e considerando-se 20% das clulas como moncitos: No. de moncitos/ml = no. de clulas totais X 104 por ml X 20%. 3.5.3 Cultivo de Macrfagos Primrios Humanos: Cerca de 0,5x106 clulas foram cultivadas em lamnula de vidro de 13 mm de dimetro inseridas em placa de cultura de 24 poos com 1ml de meio RPMI 1640 durante 7 dias 37oC, sob 21% de O2, 5% de tenso de CO2 (adaptado de BERMAN et al., 1979). A 18

cada dois dias era realizada a aspirao do meio de cultura e a colocao de meio fresco (adaptado de DORTA, 1997). 3.6 Testes de Infeco e Fagocitose de Macrfagos Primrios Humanos com L. amazonensis 3.6.1 Infeco com L. amazonensis As clulas, obtidas aps 7 dias de cultura, foram incubadas durante 24 horas com amastigotas ou promastigotas de L. amazonensis em estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC. (BERMAN et al., 1979). Aps 24 horas, as lamnulas de vidro contendo macrfagos foram retiradas da estufa e das placas de cultura. As lamnulas foram lavadas em soluo salina, secas, e fixadas em metanol durante 15 minutos, transferidas para soluo de Giemsa durante 10 minutos e lavadas em gua destilada. Aps a secagem, foram montadas com resina em lminas de vidro. A avaliao das porcentagens de macrfagos humanos infectados e as propores de parasito/macrfago contando-se de 200 clulas por lamnula, foi realizada em microscopia tica com aumento de 1000 vezes. As fotos foram obtidas em cmara digital de captura de imagens, Lool.SMA Procolor, programa Image Pr-plus (Media Cybernetcs, USA) conectada a um microscpio Nikon Elipse E-800 (Japo). 3.6.2 Cultivo de Macrfagos Primrios Humanos com Beads Macrfagos humanos, obtidos aps 7 dias de cultura, foram incubadas durante 24 horas em estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC, com microesferas de poliestireno de 6 micrmetros, beads (Poly Science, USA). A colorao das lamnulas, a avaliao das porcentagens de macrfagos que fagocitaram beads, e as propores de beads por clula foram realizadas conforme descrito no item 3.6.1.

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3.6.3 Infeco de Macrfagos em Ambiente Hipxico Protocolo 1: Clulas incubadas em hipxia com amastigotas de L. amazonensis por 24 horas no 7. dia de cultura. Aps 7 dias de cultura em estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC, macrfagos humanos foram infectados com amastigotas de L. amazonensis na proporo de 2:1 (parasito:clula) e imediatamente colocados em cmara incubadora com 5% O2 , 5% CO2, balanceado com N2, a 37oC durante 24 horas (vide esquema 1). Protocolo 2: Clulas incubadas em hipxia por 24 horas no 6. dia de cultura seguido de incubao com amastigotas de L. amazonensis por 24 horas no 7. dia de cultura. Aps 6 dias de cultura em estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC, macrfagos humanos foram colocados em cmara incubadora com 5% O2 , 5% CO2, balanceado com N2, a 37oC durante 24 horas. Aps este perodo (7. dia de cultura) foram retirados e infectados com amastigotas de L. amazonensis na proporo de 2:1 (parasito:clula) e incubados em ambiente normxico (estufa de 5% CO2 37oC e 21% de O2) por mais 24 horas. Este protocolo tambm foi feito, usando-se microesferas de poliestireno de 6 micrmetros, (beads), no lugar dos parasitos (vide esquema 2). Protocolo 3: Clulas incubadas em hipxia por 24 horas no 7. dia de cultura seguido de incubao com amastigotas de L. amazonensis por 24 horas no 8. dia de cultura. Aps 7 dias de cultura em estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC, macrfagos humanos foram colocados em cmara incubadora com 5% O2 , 5% CO2, balanceado com N2, a 37oC durante 24 horas. Aps este perodo (8. dia de cultura) foram retirados da hipxia e infectados com amastigotas de L. amazonensis na proporo de 2:1 (parasito:clula) e incubados em ambiente normxico (estufa de 5% CO2 37oC e 21% de O2) por mais 24 horas (vide esquema 3). 20

Protocolo 4: Clulas incubadas em hipxia por 24 horas no 8. dia de cultura seguido de incubao com amastigotas de L. amazonensis por 24 horas no 9. dia de cultura. Aps 8 dias de cultura em estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC, macrfagos humanos foram colocados em cmara incubadora com 5% O2, 5% CO2, balanceado com N2, a 37oC durante 24 horas. Aps este perodo (9. dia de cultura) foram retirados e infectados com amastigotas de L. amazonensis na proporo de 2:1 (parasito:clula) e incubados em ambiente normxico (estufa de 5% CO2 37oC e 21% de O2) por mais 24 horas (vide esquema 4). Em todos os protocolos a colorao das lamnulas, a avaliao das porcentagens de fagocitose dos macrfagos e as propores de beads por clula foram realizadas conforme descrito no item 3.6.1.

ESQUEMA 1 7. Dia: Incubao em hipxia e infeco por 24 horas

1. Dia: Coleta e incio da cultura

Incubao em, estufa umidificada 21% de O2, 5% de CO2, 37oC.

21% de O2

6% de O2

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ESQUEMA 2

1. Dia: Coleta e incio da cultura

Incubao em, estufa umidificada 21% de O2, 5% de CO2, 37oC.

6. Dia: Incubao em hipxia por 24 horas

7. Dia: infeco por 24 horas em normxia

21% de O2

6% de O2

21% de O2

ESQUEMA 3 8. Dia: infeco por 24 horas em normxia

1. Dia: Coleta e incio da cultura

Incubao em, estufa umidificada 21% de O2, 5% de CO2, 37oC.

7. Dia: Incubao em hipxia por 24 horas

21% de O2

6% de O2

21% de O2

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ESQUEMA 4

1. Dia: Coleta e incio da cultura

Incubao em, estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC.

8. Dia: Incubao em hipxia por 24 horas

9. Dia: infeco por 24 horas em normxia

21% de O2

6% de O2

21% de O2

3.6.4 Avaliao do Efeito do Meio de Cultura Aps 6 dias de cultura em estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC, macrfagos humanos foram colocados em cmara incubadora com 5% O2 , 5% CO2, balanceado com N2, a 37oC durante 24 horas. Aps este perodo (7. dia de cultura), as culturas tiveram o seu meio trocado por meio novo e infectados com amastigotas de L. amazonensis na proporo de 2:1 (parasito:clula), e incubados em ambiente normxico (estufa de 5% CO2 37oC e 21% de O2) por mais 24 horas. 3.7 Teste de Viabilidade Celular A viabilidade dos macrfagos foi determinada atravs do teste do MTT [3-(4,5dimethylthyazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (MOSMANN, 1983), conforme o seguinte protocolo: 200 l de meio RPMI com 20 % de SFB contendo 3x104 moncitos coletados do sangue perifrico (item 3.5.1 e 3.5.2) foram inseridos em poos de placas de cultura de 96 poos e cultivados durante 6 dias em estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC. Aps 6 dias de cultura, as clulas foram colocadas em cmara incubadora com 5% O2, 5% CO2, balanceado com N2, a 37oC, durante 24 horas. 23

Aps 7 dias de cultura, o sobrenadante foi retirado e adicionou-se 100l de meio novo + 10 l de MTT. As clulas foram, ento, incubadas durante 4 horas em estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC. O controle negativo (clulas mortas) foi obtido adicionando 52 mM de perxido de hidrognio s culturas e o controle positivo foi obtido de clulas cultivadas 7 dias em ambiente normxico (estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC). Aps este perodo, o meio + MTT foi retirado e acrescentado 100 l de soluo de MTT mantendo a placa de cultura durante uma hora sob agitao constante (Maxi Rocker, Lab-Line). As placas foram retiradas e foi feita a leitura em 590 e 650 nm, usando meio de cultura puro como parmetro para o branco. Os resultados foram obtidos usando-se a frmula: Mdia da da absorbncia de (590nm 650nm) 3.8 Determinao da Produo do TNF- 3.8.1 Obteno de Sobrenadantes de Culturas de Macrfagos Moncitos coletados do sangue perifrico (item 3.5.1 e 3.5.2) foram cultivados em poos de placas de cultura durante 6 dias em estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC. Aps este perodo, adicionou-se LPS (1g/ml) ou amastigotas de L. amazonensis na proporo de 2:1 (parasito:clula). As clulas foram incubadas em ambiente hipxico (cmara incubadora com 5% O2, 5% CO2, balanceado com N2, a 37oC) ou normxico (estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC). Aps 24 horas, os sobrenadandes das culturas foram aspirados, centrifugados 1.500 RPM por 10 minutos e congelado a 70oC para posterior dosagem e deteco de TNF- .

24

3.8.2 Teste de Deteco de TNF

Clulas de fibroblastos tumorais murinos L929 sensveis a TNF- (LEEPER &

WOODFORD, 1999) foram usadas nos testes de deteco de TNF- dos sobrenadantes

obtidos de macrfagos humanos. Cerca de 3x104 clulas tratadas com actinomicina D, 2g/ml, foram transferidas para placa de 96 poos e incubadas em estufa umidificada a 21% de O2, 5 % de CO2, 37oC, durante 18 horas (MOLL et al., 2000). As placas de cultura de L929 tiveram o meio de cultura substitudo por sobrenadantes a serem testados. O controle negativo para citotoxicidade foi obtido incubando clulas L929 em normxia apenas com meio RPMI 1640, com actinomicina D. O controle positivo para citotoxicidade foi obtido incubando as clulas L929 com meio RPMI 1640 e TNF- recombinante em uma concentrao letal (0,9 ng/ml).

As clulas foram coradas com soluo de cristal violeta, 0,5% em metanol 20% por 10 minutos, lavadas com gua destilada. A determinao da quantidade de clulas L929 sensveis ao TNF- foi feita em leitor de ELISA, 540nm (FLICK & GIFFORD, 1984 e

MEAGER, et al., 1989). A porcentagem de toxicidade foi calculada usando o seguinte clculo (FLICK & GIFFORD, 1984): % citotoxicidade = Mdia da Absorbncia controle negativo Absorbncia da amostra _______________________________________________________ Mdia Absorbncia controle negativo

A porcentagem mdia da citotoxicidade de cada amostra foi obtida pela mdia simples de seis testes para cada amostra.

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Os resultados so comparados com uma curva-padro de citotoxicidade obtida utilizando quantidades conhecidas de TNF- recombinante recentemente feita em nosso

laboratrio. 3.9 Anlise Estatstica O teste estatstico utilizado foi o Teste-T independente, do software BioEstat 3.0 (2003).

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4-Resultados 4.1 Obteno de Macrfagos Humanos: Com o objetivo de comprovar a eficincia dos nossos protocolos de purificao de moncitos de sangue perifrico e de cultivo de macrfagos, primeiramente analisamos a morfologia dos moncitos. As anlises morfolgicas iniciais feitas aps a extrao do sangue confirmaram a presena de moncitos, clulas comparativamente menores que os macrfagos, com pouco citoplasma e ncleo reniforme bastante caracterstico (fig.1A). Aps 4 dias de cultivo em meio RPMI 1640, observamos a mudana morfolgica das clulas, que passaram a apresentar caractersticas mais comuns aos macrfagos, isto , aumento do citoplasma e ncleo arredondado (fig.1B). Estas clulas, aps 7 e 8 dias de cultura, apresentavam-se morfologicamente como macrfagos, isto , com um grande ncleo arredondado, quantidade abundante de citoplasma e prolongamentos da membrana plasmtica (figs. 1C e 1D, respectivamente). A viabilidade analisada por Tripan Blue foi de aproximadamente 95,5%. A confirmao de que estas clulas eram macrfagos veio tambm da anlise funcional, isto , comprovamos sua capacidade fagoctica. Utilizando formas amastigotas de L. amazonensis e beads de poliestireno (figs.1E e 1F), observamos os parasitos e os beads dentro de vacolos fagocitrios. Anlises por

citometria de fluxo de clulas obtidas e cultivadas utilizando o nosso protocolo e realizados por Bosetto & Giorgio confirmaram o fentipo caracterstico de macrfagos (CD14+, HLA-DR+, CD4-, e CD3-, BOSETTO & GIORGIO, dados no publicados).

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Figura 1A: Lmina de esfregao de sangue humano contendo moncito recm extrado, corada com Giemsa. Notar o grande ncleo riniforme caracterstico (aumento de 1000 X).

Figura 1B: Moncitos humanos aps 4 dias de cultura, corados com Giemsa. Notar o aumento da quantidade de citoplasma e o ncleo arredondado (aumento de 1000 X).

Figura 1C Macrfagos humanos aps 7 dias de cultura, corados com Giemsa. Notar os prolongamentos aumento do volume citoplasmtico (aumento 1000 X).

Figura 1D: Macrfagos humanos aps 7 dias de cultura, corados com Giemsa. Notar os prolongamentos bastante pronunciados (aumento de 1000 X).

Figura 1E: Macrfagos humanos aps 7 dias de cultura, corados com Giemsa e infectados L. amazonensis. Notar o vacolo parasitfago repleto de amastigotas (aumento de 1000 X).

Figura 1F: Macrfagos humanos aps 7 dias de cultura, corados com Giemsa e incubados com beads plsticos. Notar os beads envolvidos pela membrana plasmtica (aumento de 1000 X).

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4.2 Infeco de Macrfagos Humanos com L. amazonensis Comprovada a viabilidade e a funcionalidade das culturas de macrfagos humanos, nosso prximo passo foi avaliar qual das formas infectantes de L. amazonensis (promastigotas ou amastigotas) apresentaria ndices mais satisfatrios de infeco. Foram realizados experimentos comparando-se a porcentagem de infeco de macrfagos cultivados com as formas amastigotas e promastigotas. Conforme demonstrado na figura 2, observamos que os amastigotas, em propores de, 1 ou 2 parasitos por macrfago, infectavam mais de 50% das clulas aps 24 horas de cultura. Os promastigotas, mesmo quando introduzidos em grandes quantidades nas culturas de macrfagos (10 promastigotas por macrfago), infectaram menos de 20% das clulas. Como este ndice foi inferior inclusive ao observado nos experimentos com beads (cerca de 35 % das clulas fagocitaram os beads), optamos por trabalhar com as formas amastigotas.

% de macrfagos c/ beads ou infectados

70 60 50 40 30 20 10 0 be a ds:c e l.( 1 :1 ) p r o :c e l ( 1 0 :1 ) am a :c e l 2 :1

Figura 2: Capacidade fagoctica de macrfagos humanos. Macrfagos humanos aps 7 dias de cultura infectados durante um perodo de 24 horas com promastigotas de L. amazonensis na proporo 10:1 (promastigotas : macrfago), amastigotas de L. amazonensis na proporo de 2:1(amastigotas : macrfago) e incubados com beads na proporo 1:1 (bead : macrfago).

29

A figura 3 mostra resultados de um experimento representativo realizado para avaliar o nvel de infeco de macrfagos humanos incubados com diferentes propores de amastigotas de L. amazonensis por macrfagos. Observamos que incubaes nas razes de 50 ou 20 amastigotas por clula resultaram em infeces de macrfagos com excesso de amastigotas e parasitos aderidos s clulas, no sendo possvel uma visualizao precisa dos parasitos. As propores de 10 e 4 amastigotas por macrfago resultaram em excesso de formas amastigotas dentro de macrfagos, e em lise celular acentuada (proporo de 10 amastigotas por macrfago, fig. 3A). As razes de 2, 1, 0,5 ou 0,25 amastigotas por macrfago resultaram em boa visualizao dos parasitos intracelulares e facilidade na contagem de clulas e parasitas. No havendo diferena significativa entre as razes de 1 e 2 ama/macrfago, optamos por utilizar a proporo de 2 amastigotas por macrfago, pois, nesta proporo encontramos as culturas mais homogneas em relao infeco (Fig. 3A). A quantidade de amastigotas fagocitados nesta proporo tambm facilitou a contagem de amastigotas intracelulares (Fig. 3B).

30

Propor o de ama stigota s por ma crfa go usa do na infe co

70
% de macrfagos infectados

60 50 40 30 20 10 0
01 mac/ 0,25 ama
7 6 amastigotas p/ clula 5 4 3 2 1 0

01 mac/ 0,5 ama

01 mac/ 01 ama

01 mac/ 02 ama

01 mac/ 04 ama

01 mac/ 10 ama

01 mac/ 20 ama

01 mac/ 50 ama

Figura 3: Infeco de macrfagos humanos com amastigotas de L. amazonensis. MHP aps 7 dias de cultura foram incubados por um perodo de 24 horas com amastigotas de L. amazonensis em vrias propores de parasitas por clulas. As lamnulas foram coradas com Giemsa e a porcentagem de macrfagos infectados (A) e o nmero de amastigotas fagocitados pelos macrfagos (B) avaliados em microscpio ptico (mac = macrfago e ama = amastigota). No houve diferena significativa entre as propores de 1/1 e 2/1e 4/1 ama/clula.

01 mac/0,25 ama

01 mac/ 0,5 ama

Prop oro de amastigotas p or macrfago usada na infeco

01 mac/ 01 ama

01 mac/ 02 ama

01 macr/ 04 ama

01 mac/ 10 ama

01 mac/ 20 ama

01 mac/ 50 ama

31

Na figura 4 observamos os ndices de infeco de culturas de macrfagos humanos incubados com amastigotas durante vrios perodos de tempo. Observamos que no perodo de 24 horas de incubao a porcentagem de infeco cerca de 25% e 35% maior do que nos perodos de 48 e 72 horas, respectivamente. No perodo de 96 horas de incubao observou-se grande quantidade de lise celular. Optamos por trabalhar com o perodo de 24 horas.

% de macrfagos infectados

60 50 40 30 20 10 0 24 h

48 h

72 h

96 h

t e m p o d e in c u b a o c o m a m a st ig o t a s

B
2.5
amastigotas p/ clula

2 1.5 1 0.5 0 24 h 48 h 72 h 96 h
t em p o de in cubao c o m am ast igo t a s

Figura 4: Infeco de macrfagos humanos com amastigotas de L. amazonensis durante vrios perodos de tempo em normxia: MHP aps 7 dias de cultura foram infectados por perodos de 24, 48, 72 e 96 horas (2 amastigotas de L. amazonensis por clula). As lamnulas foram coradas com Giemsa e a porcentagem de macrfagos infectados (A) e o nmero de amastigotas dentro de macrfagos (B) foram avaliados por microscopia tica.

32

4.3 Infeco de Macrfagos Humanos em Hipxia Nosso prximo passo foi avaliar o efeito de diferentes protocolos de hipxia na infeco de L. amazonensis em macrfagos humanos. Foram iniciados os testes submetendo-se as culturas de macrfagos humanos microambiente com 6% de oxignio, 5% de CO2, balanceados com nitrognio, (hipxia) ou com 21% de oxignio, 5% de CO2, balanceados com nitrognio (normxia). No primeiro protocolo, em que os resultados esto mostrados na figura 5, as clulas foram cultivadas durante 7 dias em normxia e levadas para cmara hipxica no 7. dia, quando foram infectadas com L. amazonensis e mantidas neste ambiente por 24, 48, 72 e 96 horas. Na figura 5 observa-se que no houve diferenas significativas nas porcentagens de infeco entre as culturas de macrfagos humanos submetidas ambiente hipxico e normxico. Aps 24, 48 ou 72 horas de incubao as culturas tinham 46,5%, 35%, 30% e 3% de macrfagos infectados, respectivamente, em normxia e 42%, 34,5%, 35% e 9% de infeco respectivamente em hipxia. O nmero de amastigotas por clula no variou em culturas mantidas em normxia e hipxia. Aps 96 horas de incubao com os parasitos, os macrfagos apresentaram grande ndice de lise celular tanto em hipxia quanto em normxia.

33

Comparao da infe co e m hipxia e normxia durante dife re nte s pe rodos de te mpo (protocolo 1)

A
60 % demacrfagos infectados 50 40 30 20 10 0 24 h

normxia:

hipxia

48 h

72 h

96 h

tempo de incubao com amastigotas

B
3 2,5 amastigotas p/ clula 2 1,5 1 0,5 0 24h 48h 72h 96h tempo de incubao com amastigotas normoxia hipxia

Figura 5: Infeco de macrfagos humanos por amastigotas de L. amazonensis por vrios perodos de tempo em condies de hipxia e normxia Macrfagos humanos aps 7 dias de cultura em normxia foram infectados com amastigotas de L. amazonensis (2 amastigotas para 1 macrfago), e mantidos em ambientes normxico ou hipxico durante 24, 48, 72 e 96 horas. As lamnulas foram coradas e a porcentagem de macrfagos infectados (A) e o nmero de amastigotas dentro de macrfagos (B) foi avaliado por microscopia ptica.

34

No tendo obtido resultados diferentes em ambientes hipxico e normxico com o protocolo anterior (fig. 5), nosso objetivo, a seguir, foi verificar se macrfagos humanos podiam apresentar comportamentos diferentes em relao infeco se fosse modificado o protocolo de hipxia. No segundo protocolo testado, macrfagos com 6 dias de cultura foram incubados por 24 horas em microambiente hipxico. Aps este perodo de hipxia (24 horas no 7 dia de cultura), as clulas foram retiradas da cmara hipxica, infectadas em ambiente normxico com formas amastigotas de L. amazonensis e incubadas por mais 24 horas em ambiente normxico (8 dia de cultura). A porcentagem de macrfagos infectados aps este perodo em hipxia foi comparada com a porcentagem de macrfagos que permaneceram em normxia durante 7 dias consecutivos e infectados com amastigotas de L. amazonensis. Os resultados mostraram que em culturas submetidas hipxia antes da infeco com L. amazonensis havia 72 % menos macrfagos infectados do que em culturas mantidas em normxia (cerca de 47% de clulas infectadas quando ficaram em nomxia e 14% de clulas infectadas quando passaram por hipxia, fig. 6). O nmero de amastigotas intracelulares tanto em hipxia quanto em normxia foram estatisticamente semelhantes. A diminuio do nvel de fagocitose e de infeco em macrfagos humanos expostos hipxia um dado semelhante aos obtidos em nosso laboratrio com macrfagos peritoniais murinos e tambm em estudos anteriores (LE KOPPELE, et al., 1999 e COLHONE, et al., 2004). Nosso prximo passo (protocolo 3) foi avaliar se macrfagos humanos submetidos pr-exposio hipxia aps 7 dias de incubao tambm teriam comportamento diferente daquele de clulas infectadas em normxia. No terceiro protocolo, macrfagos humanos com 7 dias de cultura, foram incubados por 24 horas em hipxia, retirados e infectados em ambiente normxico com formas amastigotas de L. amazonensis e cultivados por mais 24 35

horas em normxia. A porcentagem de macrfagos infectados destas culturas foi comparada com a porcentagem de macrfagos de culturas que permaneceram em normxia durante 8 dias consecutivos e infectados com amastigotas de L. amazonensis. Os resultados mostraram que estas culturas tambm apresentaram menores porcentagens de macrfagos infectados do que as culturas que ficaram em normxia (cerca de 67% de clulas infectadas quando ficaram em nomxia e 26% de clulas infectadas quando passaram por hipxia, fig. 7). As quantidades de amastigotas intracelulares em hipxia e normxia foram diferentes estatsticamente. A seguir, os macrfagos foram cultivados durante 8 dias de cultura em nomxia (protocolo 4) e foram retirados deste ambiente, incubados por 24 horas em hipxia, infectadas com L. amazonensis no 9o. dia de cultura e comparadas a macrfagos que foram incubados 8 dias em normxia e infectados com L. amazonensis em normxia no 9. dia de cultura. Observamos resultados semelhantes aos protocolos anteriores (protocolos 2 e 3), isto , reduo da infeco (61% de clulas infectadas quando ficaram em normxia e 34% de clulas infectadas quando passaram por hipxia, fig.8). As quantidades de amastigotas intracelulares foram estatisticamente semelhantes tanto em hipxia quanto em normxia.

36

Pr-exposio a hipxia no 6o. dia de cultura (protocolo 2)

A
60
% de macrfagos infectados

50 40 30 20 10 0 normxia
tipo de ambiente

hipxia

5 amastigotas p/ clula 4 3 2 1 0

normxia tipo de ambiente

hipxia

Figura 6: Infeco de macrfagos humanos com amastigotas de L. amazonensis em condies de prexposio hipxia e em normxia. : Macrfagos Humanos aps passarem por perodo de 24 horas de hipxia no 6. dia de cultura foram infectados com amastigotas de L. amazonensis no 7o. dia de cultura, na proporo de 2 amastigotas para 1 macrfago. A porcentagem de macrfagos infectados (A) e o nmero de amastigotas dentro de macrfagos (B) foram avaliados por microscopia tica. Diferenas significativas entre condies normxicas e hipxicas (*P<0,05). No houve diferenas significativas entre o nmero de amastigotas dentro de macrfagos.

37

Pr -e xposio hipxia no 7o. dia de cultura (protocolo 3) 80 % de macrfagos infectados 70 60 50 40 30 20 10 0 normxia tipo de ambiente hipxia

B
3 amastigotas p/ clula 2.5 2 1.5 1 0.5 0 normxia tipo de ambiente hipxia

Figura 7: Infeco de macrfagos humanos por amastigotas de L. amazonensis em condies de hipxia e normxia. : Macrfagos humanos aps passarem por perodo de 24 horas de hipxia no 7. dia de cultura foram infectados com amastigotas de L. amazonensis no 7o. dia de cultura. (2 amastigotas p/macrfago). A porcentagem de macrfagos infectados (A) e o nmero de amastigotas dentro de macrfagos (B) foram avaliados por microscopia tica. Diferenas significativas entre condies normxicas e hipxicas e entre o nmero de amastigotas intracelulares (*P<0,05).

38

Pre -exposio a hipxia no 8o. dia de cultura (protocolo 4) % de macrfagos infectados

A
80 60 40 20 0 normxia tipo de ambiente hipxia

B
3 ,5 3 2 ,5 2 1 ,5 1 0 ,5 0 n o rm x ia t ip o de am bien t e h ip x ia amastigotas p/ clula

Figura 8: Infeco de macrfagos humanos por amastigotas de L. amazonensis em condies de hipxia e normxia. : MHP aps passarem por perodo de 24 horas de hipxia no 8. dia de cultura foram infectados com amastigotas de L. amazonensis no 7o. dia de cultura. (2 amastigotas p/macrfago). A porcentagem de macrfagos infectados (A) e o nmero de amastigotas dentro de macrfagos (B) foram avaliados por microscopia tica. Diferenas significativas entre condies normxicas e hipxicas (*P<0,05). No h diferenas significativas entre o nmero de amastigotas dentro de macrfagos.

39

O conjunto destes dados e a comparao dos resultados demonstram que nos experimentos nos quais os macrfagos foram infectados aps um perodo de hipxia (protocolos 2, 3 e 4), a reduo da porcentagem de clulas infectadas foi significativa, o que no ocorreu nos macrfagos que foram infectados ao mesmo tempo em que eram expostos hipxia (fig. 9).

Quadro comparativo da porcentagem de infeco em culturas de macrfagos humanos s ubmetidos a diferentes protocolos
80 % de reduo da infeco 70 60 50 40 30 20 10 0 p rotocolo 1 p rotocolo 2 p rotocolo 3 p rotocolo 4

Figura 9 Porcentagem de infeco em culturas de macrfagos submetidos a pr-exposio hipxia comparada a porcentagem de infeco em culturas de macrfagos infectados durante a exposio hipxia: As porcentagens de macrfagos humanos infectados com L. amazonensis aps passarem por perodo de 24 horas de hipxia no 6., 7. e 8. dias de cultura e posteriormente infectados em normxia (respectivamente protocolos 2, 3 e 4) foram comparadas com as porcentagens de macrfagos humanos infectados em ambiente hipxico com L. amazonensis no 7o.

40

Para avaliar se macrfagos humanos tambm modificavam o seu comportamento em relao a outros estmulos quando em hipxia, tambm avaliamos a fagocitose de beads neste ambiente. Macrfagos humanos pr-expostos hipxia no 6. dia de cultura por 24 horas, retirados, e incubados em normxia com beads, estruturas inorgnicas, fagocitaram cerca de 40% menos beads do que macrfagos que permaneceram em normxia (49,5% das clulas fagocitaram beads em mdia em normxia e 31% das clulas fagocitaram beads em mdia, em hipxia, fig. 10). As quantidades de beads intracelulares por macrfagos foram semelhantes em normxia e hipxia (1,5 beads em normxia e 1,3 beads em hipxia, fig. 10).

41

% de macrfagos com beads

A
60 50 40 30 20 10 0 n o r m o x ia t ip o de a m bie n t e h ip o x ia

B
2 beads p/ clula

B
1

0 norm oxia t ipo de am bient e hipoxia

Figura 10 Porcentagem de beads fagocitados por macrfagos humanos aps pr-exposio hipxia e em normxia. : Macrfagos Humanos aps passarem por perodo de 24 horas de hipxia no 6. dia de cultura foram infectados com beads de poliestireno no 7o. dia de cultura, na proporo de 1 bead para 1 macrfago. A porcentagem de macrfagos infectados (A) e o nmero de amastigotas dentro de macrfagos (B) foram avaliados por microscopia tica. Diferenas significativas entre condies normxicas e hipxicas (*P<0,05). No h diferenas significativas entre o nmero de beads dentro de macrfagos.

42

4.4 Avaliao de Alteraes no Meio de Cultura Aps a Hipxia Os experimentos descritos a seguir tiveram objetivo de avaliar se a hipxia causou alguma alterao no meio de cultura que provocaria a reduo da fagocitose observada em macrfagos submetidos hipxia (fig. 6, 7, 8 e 10.) Para avaliarmos o efeito da hipxia no meio de cultura, culturas de macrfagos humanos aps 6 dias de cultura foram incubadas em hipxia por 24 horas. Ao serem retiradas da cmara hipxica e antes de serem infectadas com amastigotas de L. amazonensis, culturas de macrfagos humanos tiveram o meio RPMI trocado por outro meio fresco, isto , que no foi incubado em hipxia. Estas culturas foram comparadas com culturas de macrfagos humanos em meio RPMI que passaram por perodo de incubao de 24 horas em ambiente hipxico no 6. dia de cultura e no tiveram o meio trocado. As duas culturas formam infectadas por 24 horas. Observamos que os macrfagos submetidos hipxia que tiveram o meio renovado tiveram uma porcentagem de infeco (20,%), praticamente igual porcentagem de infeco observada nas culturas de macrfagos que no tiveram o meio renovado, (19,%). Ambas (com troca e sem troca de meio) apresentaram diferenas significativas em relao ao controle normxico (fig. 11A). No houve diferenas significaivas entre as quantidades de amastigotas fagocitados por clula em ambas as situaes (fig. 11B).

43

Avaliao do efe ito da hipxia sobre o me io de cultura % demacrfagos infectados

A
50 40 30 20 10 0 normoxia hipoxia (meio no trocado) tipo de ambiemte hipoxia (meio trocado)

B
amastigotas p/ clula 3 2 ,5 2 1 ,5 1 0 ,5 0 n o r m o x ia h ip o x ia ( m e io n o t r o c a do ) t ip o de a m bie n t e h ip o x ia ( m e io t r o c a do )

Figura 11: Infeco de macrfagos humanos por amastigotas de L. amazonensis em condies de hipxia e normxia com troca de meio aps a hipxia : Culturas de macrfagos que ficaram em hipxia, no 6o. dia de incubao, tiveram o meio trocado por meio fresco, enquanto outro grupo permaneceu com o meio que ficou em hipxia. No houve diferena significativa entre as duas culturas, somente entre estas e o controle (*p<0,05). A porcentagem de macrfagos infectados (A) e o nmero de amastigotas dentro de macrfagos (B) foram avaliados por microscopia tica .

44

4.5 Viabilidade de macrfagos em hipxia: Uma possvel explicao para a reduo da porcentagem de infeco em macrfagos humanos submetidos hipxia seria que a diminuio da tenso de O2 por 24 horas afetaria a viabilidade dos macrfagos. Para determinarmos se a hipxia influencia a viabilidade dos macrfagos foi realizado o teste de MTT (fig. 12). Os dados mostram que a maioria dos macrfagos permaneceu vivel aps perodos de 24 horas em ambiente hipxico, quando comparados com macrfagos que permaneceram em normxia. Quanto menor o ndice de absorbncia, maior a mortalidade das clulas e o controle negativo foi obtido testando as clulas com H2O2 (fig. 12).

Avaliao da viabilidade dos Macrfagos p/ MTT

0,07 0,06 0,05


absorbncia

* *

0,04 0,03 0,02 0,01 0

controle negativo

normxia

hipxia

Figura 12: Teste de viabilidade dos macrfagos humanos. Macrfagos humanos aps 7 dias de cultura foram submetidos a 24 horas de hipxia ou 24 horas de normxia e ento submetidos ao teste de viabilidade do MTT. O controle negativo (mortalidade das clulas) foi obtido incubando os macrfagos humanos com 52 mM de H2O2 . (* P< 0,05).

45

4.6 Produo de TNF- por macrfagos em hipxia:

Eliminados os fatores meio de cultura e viabilidade celular, uma provvel explicao para a diminuio da porcentagem de infeco de macrfagos humanos submetidos hipxia seria o aumento da produo de TNF- (SCANNELL, et al., 1993 e

LEEPER-WOODFORD et. al., 1999), citocina que estimula macrfagos a eliminarem amastigotas de Leishmania (BOGDAN, et al., 1990). Para verificarmos se nossas culturas submetidas hipxia tiveram um aumento significativo na produo de TNF- , em

comparao com as culturas normxicas, seus sobrenadantes foram testados em culturas de fibroblastos murinos de linhagem tumoral L929, sensveis ao TNF- .

Como observado na fig. 13, os sobrenadantes obtidos de macrfagos que permaneceram em ambiente normxico e estimulados por LPS (1g/ml) produziram um aumento significativo da citotoxicidade em relao aos sobrenadantes de macrfagos que no foram estimulados com LPS. Os sobrenadandes obtidos de culturas normxicas infectadas com L. amazonensis produziram ndices de citotoxicidade em clulas L929 semelhantes aos sobrenadantes das culturas no infectadas e no estimuladas com LPS. As culturas infectadas e estimuladas com LPS no apresentaram diferenas significativas de citotoxicidade em comparao com os sobrenadantes obtidos de culturas infectadas e no estimuladas com LPS (ambas em normxia, fig. 13). Por outro lado, sobrenadandes obtidos de macrfagos que permaneceram em ambiente hipxico e foram estimulados por LPS produziram citotoxicidade cerca de 50% maior do que os sobrenadandes de macrfagos no estimulados por LPS sob hipxia. Os sobrenadandes obtidos de culturas hipxicas infectadas com L. amazonensis no estimuladas com LPS produziram ndices de citotoxicidade em clulas L929 semelhante aos ndices de citotoxicidade provocados por 46

sobrenadandes obtidos de culturas hipxicas infectadas e estimuladas com LPS (fig. 13). Porm, sobrenadantes destas culturas hipxicas infectadas, estimuladas ou no com LPS, provocaram um ndice de citotoxicidade significativamente menor do que o ndice de citotoxicidade causado pelo sobrenadante de culturas hipxicas estimuladas por LPS e no infectadas com L. amazonensis (fig. 13). Os dados indicam que LPS foi um estmulo para produo de TNF- em hipxia, e que a infeco por L. amazonensis parece ter inibido o

efeito do LPS em macrfagos.

ndice de citotoxicidade por TNF

120

100

80 % de citotoxicidade

60

40

* *

20

Nor.

Nor.c/ LPS

Nor.-Infec.

Nor.-infc. c/LPS

Hip.

Hip.c/ LPS

Hip.-Infc.

Hip.-infc. c/LPS

Figura 13: Produo de TNF- por macrfagos humanos. Clulas de linhagem tumoral L929 sensveis ao TNF- foram incubadas durante 24 horas com sobrenadandes de meio de cultura provenientes de culturas de macrfagos primrios humanos submetidos a ambientes hipxico e normxico estimuladas ou no com LPS (1g/ml) e infectadas com amastigotas de L. amazonensis. A presena de TNF- foi como descrito em Materiais e Mtodos (* P< 0,05).

47

5- Discusso Nas leishmanioses ocorre inflamao ativa com migrao de leuccitos mononucleares, destruio tecidual mediada por clulas inflamatrias e infeces secundrias causadas por bactrias aerbicas e anaerbicas provocando o aparecimento de reas de baixa tenso de oxignio (hipxia), (WEINGLE & SARAIVA, 1996; GIORGIO et al., 1998; ARRAIS-SILVA et al., 2005). Recentemente nosso grupo de pesquisa demonstrou que leses cutneas induzidas por L. amazonensis expressam marcador de hipxia HIF-1 (ARRAIS-SILVA et al., 2005).

Vrios estudos tm mostrado que a permanncia de clulas como macrfagos em ambientes com diferentes tenses de oxignio provoca alteraes na capacidade fagoctica, na atividade metablica, nos marcadores de superfcie e na produo de linfocinas (SCANNELL, et al., 1993; ALBINA, 1995; Stuehr, 1997; LEWIS, et al., 1999; LEEPER WOODFORD, 1999 e MATEO, 2003). Recentemente Colhone et al. (2004), avaliaram o efeito da hipxia (in vitro) em macrfagos murinos infectados com L. amazonensis, demonstrando uma reduo dos nveis de infeco. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar o efeito da hipxia em culturas de macrfagos primrios humanos infectados com L. amazonensis. O nosso primeiro passo foi a obteno de culturas de macrfagos humanos primrios. Os protocolos foram desenvolvidos pela primeira vez no laboratrio durante o nosso trabalho. A obteno de moncitos humanos de sangue perifrico e sua diferenciao in vitro para macrfagos seguiram os protocolos de Feldman et al. (1987); Kelley et al. (1988); Kalmar et al. (1988), nos quais foram obtidos culturas com 95% de clulas mononucleares. 48

Pesquisadores, como Ho et al. (1992) e Dorta (1997), cultivaram moncitos humanos primrios com GM-CSF para otimizar a diferenciao e a estimulao dos moncitos. Em nosso trabalho utilizamos os protocolos de Berman et al. (1979) nos quais a transferncia dos moncitos para lamnulas de vidro em placas de cultura por 6 a 7 dias de incubao gera o estmulo necessrio para a diferenciao dos moncitos humanos de sangue perifrico em macrfagos. Nossos resultados demonstram que aps 7 dias de cultura obtivemos uma populao de macrfagos (Figs 1 e 2). De fato, a morfologia tpica de macrfagos (fig. 1D) e a capacidade fagoctica de beads de ltex so semelhantes a de macrfagos obtidos por Berman et al. (1979). Nosso prximo passo foi avaliar a capacidade infectiva de macrfagos humanos. Durante o processo de padronizao dos experimentos avaliamos a diferena entre as porcentagens de macrfagos infectados com formas amastigotas e promastigotas de L. amazonensis, as porcentagem de macrfagos infectados com vrias propores de parasito por clula, as diferenas nas porcentagems de macrfagos infectados durante diferentes perodos de tempo (cintica), e a proporo de formas amastigotas intracelulares em macrfagos (carga parasitria). Em nossos experimentos, a porcentagem de macrfagos infectados por formas amastigotas de L. amazonensis foi cerca de 30% superior porcentagem de macrfagos infectados por formas promastigotas (fig. 2). Assim, estabelecemos como padro para todos os experimentos posteriores, a utilizao das formas amastigotas de L. amazonensis (fig. 2). Em experimentos utilizando propores de amastigotas por macrfago acima de 2 ama/clula (fig. 3) verificamos que macrfagos eram altamente infectados (mais que 6 ama/clula). A contagem dos amastigotas ficou prejudicada quando utilizamos mais que 4 ama/clula, o que poderia causar erros nas contagens. Outro problema gerado pelo excesso de amastigotas por clula foi o fato de que 49

a presena de muitos parasitos dentro dos macrfagos resultavam em lise destas clulas (20 ou 50 ama/clula). Em relao aos perodos aos quais os macrfagos permaneceram incubados com as formas amastigotas de L. amazonensis (entre 24 e 96 horas, fig. 4), as clulas incubadas por 24 horas com os parasitos mostraram altas porcentagems de clulas infectadas e quantidade de amastigotas intracelulares (fig.4). De fato, culturas de macrfagos humanos infectados com amastigotas de L. amazonensis por 24 horas tiveram em mdia 50% de macrfagos infectados e carga parasitria intracelular de 3 amastigotas por macrfago quando a infeco foi feita na proporo de 2 ama/macrfago. Bermam et al. (1979) utilizando amastigotas de L. donovani e de L. tropica com protocolos de incubao e de infeco semelhantes aos nossos observaram mdia de 40% de macrfagos infectados, e cerca de 3 amastigotas por macrfagos. Bosque et al. (1998), observaram porcentagens de infeco em torno de 60% ao realizar incubao com promastigotas de L. panamensis em macrfagos humanos primrios. Apesar de observarmos que o nmero de macrfagos infectados diminuiu ao longo do experimento (fig. 4), o nmero de amastigotas presentes dentro dos macrfagos permanece constante ao longo das primeiras 72 horas de cultura (fig. 4). Sugerimos que macrfagos muito infectados lisam com o tempo de cultura de 96 horas, o que explicaria a diminuio na porcentagem de clulas infectadas. O protocolo mais eficiente para obteno e manuteno de culturas de macrfagos humanos desenvolvido durante este trabalho foi o seguinte: culturas de macrfagos obtidos de moncitos humanos de sangue perifrico aps 7 dias de incubao em meio RPMI, incubadas por 24 horas com formas amastigotas na proporo de 2 ama/clula.

50

Estabelecido este protocolo, nosso prximo passo foi avaliar o comportamento de macrfagos humanos submetidos hipxia (6% de O2, 5% de CO2, balanceado com N). A princpio, infectamos os macrfagos humanos no 7. dia de cultura em normxia e imediatamente introduzimos as culturas em ambiente hipxico por 24 horas. Nossos dados no indicaram redues significantes na porcentagem de macrfagos infectados quando comparada a culturas mormxicas (fig. 5). Culturas de macrfagos humanos obtidas e infectadas da mesma maneira, porm incubados por mais tempo em hipxia (48, 72 e 96 horas) tambm no indicaram redues significantes na porcentagem de macrfagos infectados quando comparadas a culturas normxicas (fig. 5). No entanto, em um segundo protocolo, no qual as clulas passaram por um perodo de 24 horas em hipxia, foram retiradas deste ambiente e infectadas em ambiente normxico, e ali permanecendo por 24 horas, verificamos reduo cerca de 70% na porcentagem de macrfagos infectados (figs.6 e 9). Observamos reduo de macrfagos infectados em protocolos similares, nos quais os perodos de hipxia foram administrados em diferentes dias de cultura. Por exemplo, hipxia aplicada no 7. dia de cultura e infeco no 8. dia em normxia, por 24 horas resultou em cerca de 60% menos macrfagos infectados quando comparados as culturas normxicas (figs. 7 e 9). Hipxia aplicada no 8. dia de cultura e a infeco durante 24 horas no 9. dia em normxia, tambm resultou em 45% menos macrfagos infectados quando comparadas as culturas normxicas (figs. 8 e 9). Utilizando outro protocolo similar, aplicando hipxia no 6. dia de cultura e incubando os macrfagos humanos com beads de poliestireno no 7. dia em normxia, durante 24 horas, observamos reduo de 40% na porcentagem de macrfagos que fagocitaram beads (fig. 10).

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Poucos so os trabalhos que relacionam diretamente a hipxia com a reduo da infeco em macrfagos. Peyssomaux et al. (2005) demonstraram que macrfagos estimulados pela hipxia reduziram a infeco pela bactria Staphylococcus aureus e Colhone et al. (2004) verificaram que em macrfagos murinos peritoniais e linhagens tumorais humana (U937) e murina (J774) infectados com L. amazonensis ocorria reduo de cerca de 45% da porcentagem de clulas infectadas em culturas expostas a hipxia. Degrossoli et al. (2004) tambm verificaram que culturas de macrfagos murinos peritoniais e de linhagem tumoral J774 infectados com L. amazonensis quando submetidos hipxia apresentavam reduo na porcentagem de clulas infectadas. Nossos resultados so semelhantes, pois tambm indicam uma reduo significativa de infeco em macrfagos humanos em hipxia. Os mecanismos envolvidos na reduo da infeco em hipxia no foram analisados por estes autores. Nosso prximo passo foi avaliar se a reduo das porcentagens de infeco no estaria relacionada diminuio da viabilidade dos macrfagos devido hipxia. Para este fim realizamos testes de viabilidade celular. O teste de viabilidade celular MTT [3-(4,5 dimethilthiazol-2-yl)- 2,5 diphenyl tetrazolium bromide) avalia a capacidade funcional da mitocndrias intracelulares atravs da anlise da produo de formazan. Segundo Mosmann (1983), atravs do teste do MTT possvel diferenciar clulas vivas de clulas mortas sendo de ampla aplicabilidade para medidas de sobrevivncia e proliferao de vrias clulas. Aplicamos este mtodo para avaliar se os macrfagos humanos submetidos a hipxia permaneciam viveis, e os resultados so compatveis com aqueles obtidos por Degrossoli et al. (2004) e Colhone et al. (2004) e com os dados mostrando que macrfagos se adaptam a ambientes hipxicos alterando a sua via metablica para via glicoltica anaerobia (Lewis, et al., 1999). No encontramos diferenas significativas entre as 52

culturas de macrfagos humanos cultivadas em hipxia e em normxia (fig. 12), sugerindo que mesmo aps perodos de 24 horas em hipxia as clulas estavam viveis. Vale a pena salientar que a morfologia de macrfagos em hipxia semelhante a de macrfagos em normxia. Uma hiptese aventada para explicar a reduo da infeco em macrfagos cultivados em hipxia seria a de que a baixa tenso de O2 causaria alteraes no meio de cultura. Para testarmos esta hiptese, culturas de macrfagos aps 6 dias de cultura foram incubadas 24 horas em hipxia. Estas foram lavadas, o meio de cultura retirado, os poos repostos com meio fresco (que no passou por hipxia) e infectadas com amastigotas de L. amazonensis. A porcentagem de macrfagos infectados nestas culturas foi comparada com a porcentagem de macrfagos infectados em culturas de 6 dias, incubadas por 24 horas em hipxia e infectadas com amastigotas de L. amazonensis que permaneceram com o mesmo meio de cultura, ou seja, que ficou em ambiente hipxico. No encontramos diferenas significativas entre as porcentagens de macrfagos infectados nestas culturas. (fig.11). Observamos que em ambas as culturas ocorreu reduo significativa da infeco quando comparadas as culturas que no passaram por hipxia (fig. 11). Estes resultados sugerem que o meio de cultura no foi alterado pela baixa tenso de oxignio, e assim, no foi um fator envolvido na diminuio da infeco por L. amazonensis de macrfagos submetidos a ambiente hipxico. Conforme j assinalado, os mecanismos responsveis pela reduo da infeco com L. amazonensis em hipxia no foram avaliados anteriormente (DEGROSSOLI et al., 2004; COLHONE et al., 2004). Entre as alternativas para explicar a reduo na porcentagem de infeco, sugerimos que macrfagos cultivados em hipxia esto ativados para produzirem substncias leishmanicidas. Uma possibilidade que estas 53

clulas produzam TNF- . Scannell et al. (1993) utilizando macrfagos humanos de

linhagem tumoral THP-1 verificaram aumento da produo de TNF

em ambiente

hipxico. Leeper-Woodford et al. (1999) demonstraram que em macrfagos isolados de pulmo de ratos h aumento da secreo TNF- e IL-1 em hipxia e Lahat et al. (2003)

observaram aumento da produo de TNF

em macrfagos humanos obtidos de

moncitos estimulados com LPS e ativados em hipxia. Pensamos na possibilidade de que a produo de TNF- por macrfagos humanos em hipxia infectados com L. amazonensis

pudesse estar envolvida na reduo da infeco. De fato, as propriedades leishmanicidas do TNF- so relatadas nos trabalhos de

Liew et al. (1990) e Bogdan et al. (1998). Os autores mostraram que a presena do TNF

est relacionada com a diminuio de leses leishmaniticas em patas de camundongos susceptveis BALB/c e com diminuio na carga parasitria de macrfagos murinos peritoniais in vitro. Em nossos experimentos utilizamos clulas fibroblsticas de linhagem tumoral L929 sensvel presena de TNF- . Este bioensaio determina a presena de TNF- atravs

da citotoxicidade das L929 e foi utilizado por Leeper-Woodford, et al. (1992) para avaliar a produo de TNF- em macrfagos alveolares em hipxia. Nossos resultados mostram

que sobrenadantes de culturas de macrfagos humanos estimulados com LPS em normxia apresentam aumento significativo de citotoxicidade para a L929 quando comparados aos sobrenadantes de culturas de macrfagos no estimulados com LPS em normxia (fig. 13), Em sobrenadantes de culturas de macrfagos estimulados com LPS em hipxia tambm houve aumento significativo de citotoxicidade em L929 (cerca de 50% maior do que a de sobrenadantes de clulas que no receberam LPS, fig 13). Estes dados so semelhantes aos de Lahat et al. (2003) onde foi verificado aumento da produo de TNF- em macrfagos

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humanos primrios estimulados com LPS em hipxia. Os dados indicam que a hipxia age sinergicamente com o LPS e produz mais TNF

do que macrfagos em normxia

estimulados com LPS (fig. 13). Nossos resultados tambm so semelhantes aos de LeeperWoodford et al. (1999) que observou aumento cerca de 35% na produo de TNF- em

macrfagos alveolares de ratos estimulados por LPS em hipxia. Avaliamos tambm a produo de TNF

em sobrenadantes de culturas de macrfagos sob normxia e

infectadas com L. amazonensis, na presena ou no de LPS. Nesse caso, as clulas infectadas no apresentaram nveis diferentes de TNF

em relao s clulas no

infectadas (fig. 13). No entanto, sobrenadantes de culturas de macrfagos em hipxia e infectados com L. amazonensis na presena ou no de LPS apresentaram produo reduzida de TNF- quando comparados aos sobrenadantes de culturas no infectadas em

hipxia. Esses dados sugerem que o TNF- no est atuando como fator leishmanicida e

que sua produo est inibida com a infeco em hipxia. Assim, a infeco por L. amazonensis parece induzir uma diminuio da produo de TNF- , e no caso do ambiente

hipxico, onde observamos incremento da produo desta linfocina, a reduo do TNF

foi mais evidente. Estes resultados so compatveis com dados da literatura, pois a ao evasiva de Leishmania nos macrfagos j foi relatada. Por exemplo, Passwel et al. (1994), demonstraram a ao inibitria de Leishmania no burst respiratrio, isto , em diminuio progressiva de mecanismos oxidativos dos macrfagos. Ghalib et al. (1995) e Sartori et a. (1997) relataram que as infeces por L. donovani e L. brasiliensis no induziram a produo de IL-12 e de TNF- em macrfagos. De Almeida et al. (2003)

relataram efeitos inibitrios causados por L. donovani em moncitos humanos de sangue perifrico, tais como a inibio da expresso da protena de superfcie CD11b (receptora de LPS e promotora da transcrio do fator transcripsional NF-kB). Segundo Leeper55

Woodford et al, 1999 macrfagos alveolares sob hipxia apresentam aumento na produo de NF-kB, o que influenciaria na produo de TNF- .

Podemos sugerir que a hipxia um poderoso estmulo quando associado ao LPS para a produo de TNF- , porm o parasito intracelular L. amazonensis atuou como um

inibidor da expresso de TNF- .

Outros mecanismos leishmanicidas devem atuar em macrfagos cultivados em hipxia. A produo de intermedirios reativos de nitrognio, espcies descritas como leishmanicida em macrfagos murinos (WILHELM et al., 2005; AWASTHI, et al., 2004;), assim como a produo de intermedirios reativos de oxignio (MURATA, et al., 2002; GREGORY et al., 2005) poderiam estar envolvidos no fenmeno observado neste trabalho. Foi possvel, com os experimentos realizados neste trabalho, demonstrar que macrfagos humanos originados de moncitos perifricos quando cultivados em microambiente hipxico tm reduzida a sua carga parasitria e que este fenmeno no est relacionado com a mortalidade das culturas de macrfagos. Ns tambm sugerimos que a produo de TNF- no estar envolvida nos mecanismos leishmanicidas observados nestes

macrfagos. Este trabalho abre perspectivas para se estudar mais detalhadamente o comportamento dos macrfagos humanos frente infeco com um parasito intracelular em microambiente de cultura similar ao microambiente encontrado em leses leishmaniticas e em reaes inflamatrias.

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6-Concluses

Podemos concluir que:

1- A hipxia altera a susceptibilidade de macrfagos humanos ao parasito L. amazonensis. Culturas de macrfagos submetidos a perodos de hipxia (protocolos 2, 3 e 4 do

Materiais e Mtodos) quando comparadas a culturas de macrfagos que permaneceram em normxia tem uma porcentagem significativamente menor de clulas infectadas.

2- A hipxia no altera a viabilidade dos macrfagos humanos. Macrfagos submetidos a perodos de hipxia quando comparados pelo mtodo do MTT, a macrfagos que permaneceram em ambientes normxicos apresentaram ndices de viabilidade

estatisticamente semelhantes.

3- Macrfagos humanos estimulados com LPS submetidos a perodos de hipxia produzem TNF- , mas a infeco pelo parasito L. amazonensis um fator de inibio da produo

desta linfocina. Culturas de macrfagos estimulados com LPS, submetidos hipxia e infectados com amastigotas de

L.

amazonensis

mostraram

uma

produo

significativamente menor de TNF-

quando comparadas s culturas de macrfagos

estimulados por LPS, em ambiente hipxico que no foram infectadas. A produo de TNF

parece no estar envolvida na reduo do ndice de infeco de macrfagos

humanos por L. amazonensis.

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7-Referncias Bibliogrficas

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