NewsLab - edio 77 - 2006 94

Introduo Introduo
A
c r i pt oc oc os e uma
doena causada por
Cryptococcus neoformans, uma
levedura capsulada, encontrada
no meio ambiente em detritos
de origem vegetal e animal,
como excretas de pombos e
outras aves. Os propgulos do
microrganismo dispersos no ar
so inalados, alcanam os pul-
mes, e a levedura apresenta
tendncia em invadir o sistema
nervoso central (1). Atinge o
Diagnstico Laboratorial da Criptococose
Reginaldo dos Santos Pedroso
1
, Regina Celia Candido
2
1 Farmacutico-Bioqumico, Mestre em Cincias Farmacuticas, rea Anlises Clnicas, FCFRP/USP
2 Professora Associada do Departamento de Anlises Clnicas, Toxicolgicas e Bromatolgicas da Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto,
Universidade de So Paulo
Artigo
A criptococose micose oportunista causada por
Cryptococcus neoformans, levedura capsulada, que aco-
mete principalmente indivduos imunocomprometidos.
O diagnstico feito atravs do exame direto, cultura,
sorologia, histopatologia e, atualmente, so descritas
tcnicas moleculares. O exame direto com tinta da Chi-
na demonstra leveduras capsuladas, arredondadas ou
ovais, com tamanho e espessura de cpsula variveis.
As amostras biolgicas so diversas, como lquor, urina,
lavado broncoalveolar, raspados de leses cutneas
e fragmentos de tecidos. O isolamento da levedura
em cultura feito em meios isentos de ciclo-heximida,
incubados a 30-32C. A identicao denitiva feita
mediante provas morfolgicas, produo de urease e
fenol-oxidase em meios diferenciais (L-dopa, sementes
de girassol ou alpiste), assimilao de fontes de carbono
e de nitrognio. O diagnstico sorolgico se baseia
na deteco de antgeno polissacardico no soro ou
lquor, mediante tcnica de aglutinao com partculas
de ltex. A demonstrao de C. neoformans em tecido
facilitada pela colorao de mucicarmim ou alcian
blue. O diagnstico atravs de tcnicas moleculares
tem apresentado resultados satisfatrios.
Palavras-chave: Cryptococcus neoformans, criptoco-
cose, diagnstico laboratorial.
Resumo Summary
Lab diagnosis of Cryptococcosis
Cryptococcosis is a fungal disease caused by the encapsu-
lated yeast Cryptococcus neoformans, that is responsible
for life-treatening infections, particularly in immunocompro-
mised patients. The diagnosis of cryptococcosis is made
by direct examination of pathologic specimens, culturing
clinical samples, serological and molecular techniques.
By using India Ink for the direct microscopic examination
of clinical samples, it is possible to detect spherical and
ovoid encapsulated yeasts in CSF, urine, bronchoalveolar
washes, scrapings of cutaneous lesions and even sections
of infected tissues. The primary isolation of C. neoformans
must be done with mycological media that do not contain
cyclo-heximide and which must be incubated at 30-32C.
A denite identication is determined by morphology,
urease and phenol-oxidase production, and the sugar and
nitrogen assimilation prole. The serologycal diagnosis
is based on detection of the polysaccharidic antigen in
serum or CSF by the agglutination of antibody-coated latex
particles. The identication of C. neoformans in tissues is
easier when it is possible to stain for the presence of the
capsule with mucicarmine or alcyan blue. Diagnosis by
molecular techniques has presented good results.
Keywords: Cryptococcus neoformans, cryptococcosis,
laboratory diagnosis.
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homem e ani mai s, i ncl usi ve
domsticos, como ces e gatos
(2). A i nci dnci a da doena
aumentou a partir da dcada
de 1980, com a expanso da
AIDS e a maior sobrevivncia
de pacientes no estado imuno-
comprometido (3).
Morfologicamente, Cryptococ-
cus neoformans uma levedura
arredondada, ovalada ou elip-
side, geralmente envolta por
cpsula de mucopolissacardeo.
So conhecidas duas variedades
da espcie, C. neoformans var.
neoformans, que compreende
os soroti pos A, D e AD, C.
neoformans var. gattii, com os
sorotipos B e C. A fase sexuada
do fungo o coloca entre os basid-
iomicetos, gnero Filobasidiella,
com a espcie F. neoformans
e as variedades neoformans e
bacillispora, respectivamente
correspondendo aos sorotipos
A , D e AD, B e C (1).
Ecologia e epidemiologia
O principal reservatrio de
C. neoformans var. neoformans
so excretas de aves, principal-
mente pombos (Columba livia).
A var. gattii teve seu primeiro
reservatrio descrito em 1991,
relacionado a Eucaliptus camal-
dulensis, na Austrlia, mas j
foi descrito em outras espcies
de vegetais em vrias partes
do mundo, como oiti, cssia,
fcus, amendoeiras, inclusive
no Brasil (4, 5, 6).
Em pacientes com AIDS, a
criptococose muitas vezes a
primeira indicao da doena.
Quase todos os casos de crip-
tococose nestes pacientes so
devido a C. neoformans var.
neoformans, sorotipo A, mesmo
em reas onde a variedade gattii
endmica (3). Aproximada-
mente 5-6% dos indivduos com
AIDS desenvolvem infeces por
C. neoformans (7).
Em pacientes imunocompe-
tentes, a variedade gattii pre-
domina em regies tropicais,
inclusive no Brasil. Nas regies
subtropicais, sul do Brasil, Ar-
gentina e sul da Austrlia, a
variedade neoformans parece
ser prevalente (8). No Brasil
predomina a variedade neofor-
mans sorotipo A, seguido pela
variedade gattii, sorotipo B, em
menor freqncia (9).
Manifestaes clnicas
As mani festaes cl ni cas
geralmente so relacionadas ao
sistema nervoso central, com
quadro de meningoencefalite
subaguda ou crnica. Os sinto-
mas so febre e cefalia e mais
raramente alterao do nvel de
conscincia (3).
A infeco pulmonar pode
passar despercebida, ou apre-
sentar manifestaes discretas
compatveis com quadro gripal.
Em imunocomprometidos pode
ocorrer disseminao sistmica.
O acometimento geniturinrio,
envolvendo pielonefrite raro,
sendo que a cultura de urina
especfica pode ser importante
nesse caso, inclusive em casos
de criptococcemia. A prstata
tambm pode ser ati ngi da,
sendo uma possvel fonte de
recidivas em pacientes imuno-
comprometidos (10, 11).
Outras manifestaes relata-
das na literatura so hepatite,
sinusite, leses em diversos
rgos e tecidos, como pele,
olhos, esfago, boca, estmago,
intestino, trato genital feminino
e ossos (1).
Diagnstico de laboratrio
O diagnstico laboratorial da
criptococose pode ser feito a
partir de uma grande variedade
de materiais clnicos: lquor,
urina, fragmentos de tecido,
aspirados de leses cutneas,
escarro e demais amostras do
trato respiratrio, entre outras.
So realizados exame direto,
cultura, histolgicos e sorologia.
Tcnicas moleculares tambm
podem ser utilizadas, porm
ainda apresentam aplicao res-
trita no diagnstico clnico (3).
Exame direto
O exame direto revela leve-
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duras arredondadas ou ovais,
geralmente apresentando bro-
tamento ni co, envol tas por
cpsula polissacardica, que
evidente quando analisadas em
preparaes com tinta da China
ou nigrosina (12).
As amostras de escarro e
outras purulentas podem ser
tratadas com KOH a 10% a fim
de eliminar a maioria das clulas
do hospedeiro e outros artefatos
que poderiam ser confundidos
com C. neoformans. O lquor e
a urina devem ser centrifuga-
dos e o sedimento examinado
com tinta da China. Amostras
recentes so preferidas, pois
a presena de polimorfonucle-
ares em amostras estocadas
por 24 horas em refrigeradores
pode mimetizar a presena de
cpsula, confundindo o analista
menos experiente.
Cultura
As amostras cl ni cas so
semeadas em gar Sabouraud
e em outro meio diferencial que
pode ser gar semente de Niger
(alpiste), semente de girassol,
gar dopamina, gar L-dopa
ou gar batata cenoura (13).
Nestes meios, a enzima fenol-
oxidase produzida pelo micror-
ganismo age sobre os substratos
cido cafico ou compostos di
ou pol i fenl i cos, produzi ndo
melanina, atravs de uma rea-
o de oxi dao, resul tando
numa colorao amarronzada
ou preta das colnias (1). Estes
meios no devem conter mais
que 0,1% de glicose em suas
composies, pois altas concen-
traes de glicose inibem ou difi-
cultam a formao de pigmentos
marrons (13). As amostras de
escarro, pus, urina e raspados
de pele devem ser inoculadas
em meios contendo antimicro-
bianos, mas sem ciclo-heximida,
pois a maioria dos isolados de
C. neoformans sensvel a este
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antifngico (1, 12).
As col ni as de l eveduras
produtoras de melanina, urease
positivas e capsuladas levam
suspeita de C. neoformans,
sendo que a identificao de-
finitiva feita a partir do perfil
fisiolgico do fungo: assimila
inositol, no assimila lactose e
cresce a 37C. Alguns isolados
que produzem cpsula e no
produzem fenol-oxidase devem
ser identificados atravs de seus
perfis fisiolgicos para confir-
mao (3).
Isolados da variedade neo-
formans crescem bem a 37C,
e as colnias tornam-se visveis
em dois a trs dias. Na varie-
dade gattii muitos isolados tm
dificuldade em crescer a 37C,
e levam de quatro a cinco dias
para formar colnias visveis.
Por outro lado, a 30C, os isola-
dos da variedade gattii formam
colnias em dois dias (13).
O aspecto macroscpico das
colnias, em gar Sabouraud,
incubado a 25 ou 30C, em dois
a quatro dias, so brilhantes,
ti pi camente brancas a cas-
tanhas, podendo ser amarelas,
rosa-cl aro ou marrom-cl aro.
Se o organismo for capsula-
do, as colnias apresentam-se
mucides e brilhantes, tomando
o aspecto de leite condensado.
No entanto, podem tornar-se
secas e opacas com tempo. A
morfologia microscpica revela
l eveduras arredondadas ou
ovais, isoladas ou aos pares,
de paredes finas e de tamanhos
variados, no ocorrendo pseu-
do-hifas e hifas verdadeiras. O
brotamento pode ser simples ou
duplo, com pontos de ligao
estreitos entre as clulas-me
e filha. As clulas so, usual-
mente, envoltas por cpsulas,
que variam em espessura, es-
pecialmente em preparaes
feitas diretamente a partir de
amostras clnicas (12).
Teste sorolgico
O teste sorol gi co para o
diagnstico da criptococose
sensvel, especfico, e permite
um diagnstico rpido e seguro.
Durante a i nfeco, ant ge-
nos capsulares polissacardicos
solveis so encontrados em
fluidos corporais, e podem ser
detectados e quantificados com
anti-soro especfico. O mtodo
mais comum empregado para
triagem ou titulao do soro a
aglutinao de ltex. As partcu-
las de ltex, recobertas com
imunoglobulinas hiperimunes
especficas de coelho, so mistu-
radas com diluies da amostra
do paciente, que pode ser lquor,
soro ou urina. Aglutinao posi-
tiva em uma diluio de 1:4
altamente sugestiva de infeco
criptoccica. Ttulos maiores ou
iguais a 8 geralmente indicam
doena ativa. A maioria dos
pacientes com AIDS tem altos
ttulos do antgeno (3).
Aglutinaes no especficas
podem ocorrer em soros posi-
tivos para fator reumatide.
Raramente resultados falsos-
positivos ocorrem quando um
outro antgeno est presente,
apresentando reao cruzada,
por exempl o, com o pol i s-
sacar deo de Tri chosporon
beigelii ou de outro microrgan-
ismo. Testes falsos-positivos
tambm podem ser causados
pela contaminao da amostra
clnica com diminutas quanti-
dades de gar ou agarose, fato
que ocorre se a mesma pipeta
que foi usada para inocular o
meio de cultura for reintro-
duzida no frasco contendo a
amostra clnica (3, 14).
Alguns testes de Elisa foram
desenvolvidos para detectar
antgeno ou anticorpo contra
C. neoformans. Em comparao
com o teste de ltex, a leitura
de ELISA menos subjetiva e
no sofre efeito prozona e ainda
pode detectar o antgeno quan-
do est em pequena quantidade
na amostra. No sofre interfer-
ncia do fator reumatide. Uma
desvantagem estaria no tempo
de liberao do resultado, que
na aglutinao do ltex mais
rpida (3).
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Concluso
Histopatologia
A histopatologia da criptoco-
cose pode apresentar-se com
doi s padres, gel ati noso ou
granulomatoso. O padro gela-
tinoso caracteriza-se por pouco
ou nenhuma reao inflamatria
e grande quantidade de fungos
com cpsula volumosa. O pa-
dro granulomatoso caracteriza-
se pela presena de granulomas
epiteliides, clulas gigantes,
linfcitos e proliferao linfob-
lstica. O infiltrado inflamatrio
fundamentalmente constitudo
por macrfagos. A quantidade
de parasitas sensivelmente
menor que nas gelatinosas. As
coloraes teis para a visual-
izao do fungo so H.E. (hema-
toxilina e eosina), mucicarmim,
PAS (periodic acid-Schiff), alcian
blue (15). Mucicarmim cora as
clulas de vermelho e Fontana-
Masson cora a melanina fngica
de marrom avermelhado, e so
mais especficas para C. neofor-
mans (16).
Tcnicas moleculares
Os mtodos de identificao
moleculares so mais recentes
e so teis em estudos epide-
miolgicos, para a identificao
da variedade, do sorotipo, e
variaes individuais de cepas
(3, 17).
Paschoal et al. (18) otim-
izaram a tcnica de PCR (reao
em cadeia da polimerase), com
o objetivo de aplicao no diag-
nstico em laboratrio clnico,
sendo que a tcnica demon-
strou nveis de sensibilidade
e especificidade superiores
cultura e ao exame direto pela
tinta da China. Estes autores
concluram que o mtodo de
PCR, sendo sensvel, especfico,
e reprodutvel, representa uma
ferramenta promi ssora para
anlise de amostras de lquor em
pacientes com suspeita clnica
de neurocriptococose. Os resul-
tados da pesquisa de DNA em l-
quor de paciente com meningite
criptoccica tm correlacionado
com a melhora clnica durante o
tratamento (19).
O uso dessas tcnicas para
a identificao de C. neofor-
mans tambm um avano
importante, pois permite um
resultado mais preciso e mais
rpido que o usual. Leal et al.
(20) padronizou um mtodo de
PCR multiplex que permite a
diferenciao entre C. neofor-
mans var. neoformans e var.
gatti, facilitando sobremaneira
o diagnstico e tornando-o mais
seguro e gil.
Concluso
O di agnsti co l aboratori al
da criptococose pode ser feito
com segurana quando tcni-
cas e mtodos laboratoriais so
utilizados adequadamente. As
caractersticas micromorfolgi-
cas do organismo, no espcime
clnico ou na cultura, quando
observadas atentamente, po-
dem direcionar a cultura e a
identificao do microrganismo.
A suspeita clnica e os dados
clnicos do paciente permitem
tambm agilizar os procedimen-
tos laboratoriais, permitindo a
utilizao de meios de cultura
seletivos e/ou diferenciais, in-
cubao em temperatura ade-
quada e realizao de provas
de identificao direcionadas.
O conhecimento dos materiais
clnicos onde C. neoformans
pode ser isolado importante
para a triagem inicial, que vai
da realizao do exame direto
escolha dos meios de cultura.
Considerando a maior sobrevida
de indivduos em condio de
imunocomprometimento, diver-
sas espcies de microrganismos
esto emergindo como agentes
de infeco. Um conhecimen-
to mais profundo e atualizado
sobre esses microrganismos e
suas principais caractersticas
diferenciais importante para
um diagnstico mais rpido e
mais seguro.
Correspondncia para:
Reginaldo dos Santos Pedroso
rpedroso@fcfrp.usp.br
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