TCNICAS BSICAS DA

MICROBIOLOGIA

DUAS OPERAES BSICAS EM MICROBIOLOGIA

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
Separao de estirpes microbianas especficas a partir de populaes mistas
(ex. amostras ambientais, amostras clnicas)
CULTURA DE MICRORGANISMOS
Crescimento de populaes de microrganismos em meios de cultura laboratoriais
(usualmente, em cultura pura)

Tcnicas bsicas da Microbiologia

Preparao de meios de cultura
Tcnicas de asspsia e de esterilizao
Isolamento de culturas puras
Manuteno de clulas viveis no laboratrio
Microscopia

Preparao de meios de cultura

A composio de um dado meio de cultura est
dependente da espcie que se pretende cultivar.
O conhecimento do habitat natural de um dado microrganismo
muitas vezes til na seleco do meio de cultura adequado, j
que as suas necessidades nutricionais reflectem esse mesmo
habitat.

ELEMENTOS ESSENCIAIS
Carbono (C)

Protenas, cidos nucleicos, polissacridos, lipidos

(Elemento comum a todos os

constituintes celulares
~ 50% do peso seco da clula)

Oxignio (O)
(~ 20% do peso seco da clula)

Azoto (N)
(~ 14% do peso seco da clula)

Hidrognio (H)
(~ 8% do peso seco da clula)

Fsforo (P)
(~ 3% do peso seco da clula)

Enxofre (S)
(~ 1% do peso seco da clula)

Protenas, cidos nucleicos, polissacridos, lipidos

Protenas, cidos nucleicos, coenzimas

Protenas, cidos nucleicos, polissacridos, lipidos

Fosfolpidos, cidos nucleicos, ATP
Protenas, coenzimas

CATEGORIAS
NUTRICIONAIS
DOS
MICRORGANISMOS

Fontes de Carbono
- CO2
- Compostos orgnicos

Fontes de energia
Maior parte dos microrganismos
usam um de trs tipos de
fontes de energia

Chlorophyll or
bacteriochlorophyll

Macronutrientes (
)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Fig. 9.1

Macronutrientes Fontes de elementos principais

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

(g/l)

(mg/l)

Micronutrientes ou elementos trao (g/l)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Vitaminas factores de crescimento essenciais.

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

 Meios de cultura sintticos ou definidos meios

de cultura cuja composio qumica perfeitamente conhecida.
Meios de cultura complexos - meios de cultura cuja
composio exacta desconhecida. Podem ter como componentes
diversos ingredientes, tais como Peptonas, Extracto de Levedura,
Extracto de Carne, etc.

PEPTONAS
Hidrolizados de
protenas preparados
por digesto
proteolitica parcial
de fontes proteicas
(p.ex. extracto de
carne, casena, soja,
gelatina, etc.). Os
aminocidos e
pequenos pptidos
resultantes servem
como fonte de
carbono (C), de
energia e de azoto
(N), para os
microrganismos.

EXTRACTO DE
LEVEDURA
(Yeast extract)
Obtido a partir da lise
de clulas de levedura
da cerveja e hidrlise
dos seusconstituintes.
Fonte de vitaminas,
compostos de
Carbono (C), de azoto
(N) e sais minerais.

Meios de cultura liquidos e slidos

Agar
agente solidificante
(polissacrido de alga marinha vermelha)

Meios selectivos e meios diferenciais

Os meios de cultura podem ser usados na seleco e crescimento de um
determinado microrganismo ou na identificao de uma espcie em particular.

Meios selectivos
suprimem o crescimento de
determinados
microrganismos em
benefcio de outros.
(ver aula sobre cultura de
enriquecimento)

Meios diferenciais
permitem a distino entre diferentes
grupos de microrganismos com base na
capacidade de metabolizar componentes
especficos presentes no meio de cultura
e/ou
na morfologia (aparncia) das colnias.
Permitem, por vezes, a identificao de
microrganismos com base nas suas
caractersticas fisiolgicas.

Microrganismos so ubquos
(gua, ar, solo, corpo, etc.)
Solo

ar

lngua

(In J. Black, Microbiology, principles and exploration, 6th ed, J Wiley & Sons)

Figura mostra colnias de microrganismos (na superfcie de meio slido)

Pasteur Sec. XIX

. Refutao final da teoria da gerao expontnea

. Desenvolvimento de tcnicas de esterilizao
eficientes
(pasteurizao)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Crescimento microbiano em meio lquido turbidez

Esterilizao no Laboratrio
ESTERILIZAO Morte ou remoo de todos os organismos vivos, estruturas
biolgicas e virus de um material, meio de cultura, etc. (in Brock Biology of Microorganisms)

CALOR

CALOR SECO - em estufa (160C/2horas; 180C/1 hora)

- pouco eficiente
- em desuso; s aplicvel a material de vidro
ou outro resistente a temperaturas altas
CALOR HMIDO na AUTOCLAVE

RADIAO Ultra- Violeta (

= 260 nm)
Limitada a superficies (p.ex. salas, pequenos compartimentos, superficie de utenslios
(No penetra vidro, filmes sujos, gua, etc.)

FILTRAO

Esterilizao

na AUTOCLAVE
por aco do calor hmido*

* Vapor de gua saturado,

sob presso (1 bar)
CONDIES DE
ESTERILIZAO
NA AUTOCLAVE
121C (presso: 1 bar)
Durao depende de:
Volume de material
dentro da autoclave;
Grau de contaminao do
material a esterilizar
(usual 15 min)

APLICADA A:
- Meios de cultura sem
componentes termolbeis
(p.ex. muitos aucares, aminocidos,
vitaminas, no so estveis a 121C)
- Materiais de plstico ou vidro
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

- Descontaminao de materiais
contaminados com clulas viveis

Esterilizao na autoclave

Porqu 121C,
durante pelo menos 15 minutos?

Esporos bacterianos (endsporos) so as estruturas biolgicas

mais resistentes ao calor
( a sua extrema resistncia que determina quais as condies de
funcionamento da autoclave que asseguram uma esterilizao eficiente dos materiais)

Condies que causam a MORTE CELULAR:

Levedura
Bolor
Bactria

Clulas vegetativas
5 min a 50-60C
30 min a 62C
10 min a 60-70C

Esporos
5 min a 70-80C
30 min a 80C
2-800 min a 100C
ou 0,5-12 min a

Vrus

30 min a 60C

121C

Bacillus sp.

Clula
vegetativa

Endsporo

ENDSPOROS:
- Presentes na gua, solo, etc
- Podem permanecer viveis durante muito tempo
(dcadas; milhares/milhes(?) de anos encontrados em locais arqueolgicos, no intestino de
abelha extinta preservada em ambar)
- Algumas bactrias que os produzem so agentes de doenas graves (ex. Ttano, Botulismo)

TESTE QUE PODE SER USADO

PARA VERIFICAR O FUNCIONAMENTO EFICIENTE DA AUTOCLAVE

(1)
(2)

(Perry, Staley, Lorry, Microbial Life, Sinauer ed.)

Spore strip = Tira de papel esterilizada contendo sobre a superfcie endsporos de uma
bactria (p.ex. do gnero Bacillus)

Esterilizao
por filtrao

(In J. Black, Microbiology Fundamentals and Applications,

J. Wiley and sons)

APLICADA A:

Lquidos
- Solues de compostos sensveis a temperaturas altas
(p.ex. antibiticos, vitaminas, aminocidos, aucares
podem sofrer alteraes, incluindo degradao, a 121C)
- Meios de cultura liquidos com componentes termossensveis

Gases

Esterilizao do AR por filtrao

Mscaras cirurgicas

Rolhas de algodo nos frascos

onde so cultivados
microrganismos

Sistemas usados para filtrar ar

que entra em bioreactor

Filtros HEPA
(high-efficiency particulate air
filters)
(eficcia de reteno de 99,99% para
particulas de 0,3 g)

usados em:
- cmaras de fluxo laminar
de segurana biolgica
- salas limpas

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Cmaras de Fluxo Laminar de Segurana Biolgica

(vrios graus de conteno biolgica)

Segurana Biolgica
(nvel de conteno 4)

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

( In Microbiology today, vol 33, pag 18)

Transferncia de culturas de microrganismos - Tcnicas de asspsia

Chama do bico de Bunsen
(Vizinhana da chama do bico de Bunsen oferece condies asspticas)

Ansa de repicagem
(filamento metlico)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Isolamento de colnias em meio slido

A imobilizao das clulas num meio slido torna possvel a visualizao do
crescimento em massas celulares homogneas e isoladas denominadas colnias.
Isolamento de
colnias pela tcnica
de RISCADO EM
MEIO SLIDO

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Colnia cultura pura de um microrganismo

A cultura pura de um dado microrganismo uma cultura de clulas gentica e
morfologicamente idnticas.

CRESCIMENTO MICROBIANO exponencial

...

(Inculo inicial
num ponto da superfcie
de meio de cultura slido)

1 gerao

2 gerao

3 gerao

...

Isolamento de colnias de microrganismos

Tcnica de ESPALHAMENTO em meio slido

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Exemplo:
Suspenso de solo em gua
(Populao mista de microrganismos)
Aps incubao T ambiente durante 24 h

COLNIAS COM MORFOLOGIAS DIFERENTES

MICRORGANISMOS DIVERSOS
(Noo de estirpe)

Morfologia de colnias

forma e tamanho dependem do microrganismo

mas, tambm podem depender das condies ambientais,
tais como, quantidade de oxignio e
nutrientes disponveis no meio de cultura, pH,etc..

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Robert KOCH (1876) primeiro cientista a definir CULTURA PURA e

a isolar COLNIAS de bactrias em meios de cultura slidos.
R. Koch
Microfotografia de bactrias
provenientes de uma colnia
isolada (confirmao de ser
um nico tipo morfolgico)

Bacillus anthracis
(desenhos de R. Koch, sec XIX)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Isolamento de colnias e
enumerao de Unidades Formadoras de Colnias (UFC) clulas viveis
(p.ex. numa amostra de solo)

Passo 1.

Solo populao mista

- vrios trilies de clulas
de microrganismos
diversos
Suspenso de solo em gua
(10g / 100 ml)

Passo1. Diluies sucessivas da

suspenso de solo
(10-1 ou 1: 10;
10-2 ou 1: 100;
10-3 ou 1: 1000;
10-4 ou 1: 10000;
...)

0,1 ml
Passo 2.

Passo 3a

Passo 3b

Passo 4.
(In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)

Diluio

10-2

10-3

10-4

(In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)

50 colnias (diluio 10-3)

N de colnias em cada placa de Petri est
relacionado com o tamanho da POPULAO
CULTIVVEL presente na amostra original de solo

50 x 10 x 103 UFC / ml suspenso de solo (A)

50 x 106 UFC / 100 ml de suspenso de solo
/10 g de solo

Tipos morfolgicos diferentes das colnias

em cada placa relacionado com a diversidade
de microrganismos cultivveis presentes
no solo.

Bactrias

Fungos miceliais (bolores)

CULTURA DE
ENRIQUECIMENTO
Isolamento de
microrganismos
pouco abundantes e
com requerimentos
nutricionais especficos,
a partir de populaes
mistas
(p.ex. bactrias que so capazes
de degradar benzoato, i.e.
usam benzoato
como fonte de C e
energia).

(adaptado de Perry, Staley, Lory,

Microbial Life, Sinauer ed.)

PRESSO SELECTIVA
presena de fonte de C e energia
nica (neste caso, benzoato)

Crescimento em
meios de cultura selectivos
1) enriquecimento em meio liquido
(nas bactrias em causa)
2) isolamento de colnias
em meio slido

Outros exemplos:
- Isolamento de bactrias que
degradam um certo
pesticida ou
hidrocarbonetos do
petrleo ou
outros poluentes orgnicos
do Ambiente.

LIMITAO DAS TCNICAS DE ISOLAMENTO DE COLNIAS

Clulas viveis, mas no cultivveis

Estima-se que que somente 1-10% dos microrganismos funcionais presentes nos ambientes naturais
(p.ex solo, gua, amostras clnicas) so cultivveis em meios de cultura laboratoriais conhecidos

versus

vs
6

4.2 x 10

UFC de bactrias / g solo

UFC=CFU
Unidades Formadoras de Colnias
(Colony Forming Units)

Bactrias observveis numa amostra de solo

(observao directa atravs de microscpio
de fluorescncia)
10

4.2 x 10

Clulas totais / g solo

Diversidade microbiana no solo uma fonte

importante para explorao biotecnolgica de
NOVOS microrganismos, produtos e processos

(Prescott, Harley e Klein, Microbiology, 5th edition)

Explorao das potencialidades dos microrganismos no-cultivveis

nos meios de cultura laboratoriais conhecidos
- Desenvolvimento de mtodos moleculares (no dependentes do cultivo)
para pesquisa e identificao ( ex. Anlise de DNA, RNA, protenas)
-Procura de novas frmulas para cultivo de microrganismos


Procura de microrganismos adequados para um processo industrial:

- a partir da Natureza / Ambiente (solo, gua, etc.)

- so frequentemente sujeitos a processos de melhoramento

(Engenharia Gentica; mutao)

Maximizar o rendimento do processo

Novos produtos

Estirpes adequadas (estirpes selvagens, mutantes ou geneticamente
manipuladas) so conservadas em colecces de culturas nacionais
e internacionais
(por ex. Micoteca da Universidade do Minho, American Type Culture Collection ATCC,
National Collection of Industrial Cultures - UK)

Manuteno de microrganismos viveis no Laboratrio e em Coleces de Culturas

Vrias metodologias permitem a manuteno de culturas viveis, no contaminadas e
inalteradas nas suas propriedades durante perodos de tempo mais ou menos longos,
nomeadamente:
. Em rampas ou placas de Petri contendo meio slido
(viabilidade das clulas: dias ou semanas)

. Congelao
(clulas suspensas em meio de cultura + glicerol (anti-criognico)
(viabilidade das clulas: anos)

- em Azoto lquido (-196C)

- em Arcas congeladoras (-70C)

. Liofilizao
(liofilizao - desidratao das cluas por
sublimao de gua congelada, sob vcuo)
(viabilidade das clulas: anos; dcadas)