Preparo de Materiais em microbiologia,Meios

de cultura usados no laboratrio, tcnicas de

semeadura e Coloraes

Prof (a) Dr Luciana Debortoli de Carvalho

Preparo de materiais
 Meios de Cultura
O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura
utilizados fornece as primeiras informaes para a sua identificao.
importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura
e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material
Agar sangue (AS) meio rico e no seletivo, diferencial para a hemlise,
nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, alm de
fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espcies de
hemfilos e outros fastidiosos
 Meios de Cultura

gar Thayer Martin Modificado (TMM) meio seletivo pela adio de

colistina, vancomicina e nistatina. Inibe crescimento de enterobactrias,
Gram positivos, fungos e algumas espcies de Neisserias saprfitas.
Enriquecido com a adio de complementos para a recuperao de N.
meningitidis e N. gonorrhoeae.
 Meios de Cultura
Agar chocolate (AC) meio rico e no seletivo, permite o crescimento da
grande maioria das bactrias aerbias e facultativas. Quando incubado em
CO2 d suporte tambm ao crescimento dos microaerfilos. Pode-se
observar halos esverdeados com colnias alfa- hemolticas. base do
meio, adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura
alta, o que faz com que as hemcias lisem, liberando hemina e hematina,
compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos
exigentes.
 Meios de Cultura

GAR CLED CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT: usado para isolamento e

quantificao de microrganismos presentes em amostras urina. A deficincia de
eletrlitos inibe o vu de cepas de Proteus.

Empregado para isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram

negativos e leveduras.

INTERPRETAO

Cor original do meio: azul claro.

Colnias lactose positiva: cor amarela.

Colnias lactose negativa: cor azul.

 Meios de Cultura
Agar MacConkey (MC) meio seletivo para Gram negativo e diferencial
para a utilizao de lactose. O cristal violeta inibe o crescimento de
microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e
estafilococos.
Lactose positiva colorao avermelhada

Lactose negativa colorao inalterada

Como exceo, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e

Bacillus
 Meios de Cultura

gar Salmonela-Shigella (SS) meio seletivo para Salmonela e Shigella e

diferencial para a utilizao de lactose (colorao rsea) e produo de
H2S (colorao negra); possue componentes (sais de bile, verde brilhante
e citrato de sdio) que inibem microrganismos Gram positivos.
 Meio de Rugai

Este meio utilizado para identificao presuntiva das

principais espcies de Enterobactrias. Sua finalidade
principal a triagem bioqumica de colnias isoladas nos
meios seletivos para bacilos gram-negativos oxidase-
negativa. Em um nico tubo a leitura possvel verificar 9
reaes: motilidade da bactria indicado pela turvao da
lisina na base, lisina descarboxilase, fermentao da glicose
em profundidade e da sacarose na superfcie do meio,
produo de gs sulfdrico (H2S), gs em glicose, utilizao
do aminocido L-triptofano (desaminao), hidrlise da
uria e no tampo do tubo, um desenvolvimento de
colorao avermelhada que indica a formao de indol.
 Meio IAL
(Pessoa e Silva)

Identificao presuntiva
 LWENSTEIN JENSEN

A base do meio constituda por ovos integrais, o que permite amplo

crescimento das micobactrias e o crescimento satisfatrio para o teste
de niacina (que positivo para Mycobacterium tuberculosis).

INTERPRETAO

Cor original do meio: verde claro

Positivo: Crescimento de colnias amarelas

Negativo: ausncia de crescimento.

 TCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE
MICRORGANISMOS
Isolamento de um microrganismo: O isolamento consiste na obteno de uma cultura pura
(colnias isoladas de um nico microrganismo, separando-o de outros que se encontram no
mesmo material).

Finalidades do isolamento: Identificao de um microrganismo. A simples observao de

caracteres morfolgicos no suficiente para a identificao e classificao dos
microrganismos. Para isto, lanamos mo da anlise de uma srie de caractersticas destes,
como: caractersticas bioqumicas, sorolgicas, de patogenicidade, etc. O estudo destas
caractersticas est na dependncia do microrganismo que se pretende identificar.

Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um

material contaminado qualquer.

Repique: Consiste na transferncia de um microrganismo de um meio de cultura para outro.

 TCNICAS DE SEMEADURA

Mtodos de Isolamento e Identificao

A identificao da maioria dos microrganismos depende de uma completa

descrio de suas caractersticas morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas e
antignicas. Desde que, na maioria dos casos, o organismo a ser isolado
faz parte de uma populao mista, indispensvel o seu isolamento, no
sentido de obteno de cultura pura.
 Mtodos de Inoculao
1. Semeadura em Meio Slidos

1.1. Semeadura em Tubos de Ensaio (em

meios inclinados) Esgotamento de ala

1.1.1. Tcnica utilizada para obteno de

crescimento bacteriano e/ou para a
observao de propriedades bioqumicas da
bactria. A semeadura , geralmente, feita da
base do meio para a extremidade do mesmo
(pode tambm ser chamada de estriamento).

Figura 1: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela tcnica do esgotamento

(Ex. meio de cultura: TSI)
 Mtodos de Inoculao

1.1.2. A semeadura tambm pode ser

realizada da base para a extremidade do
+ -
meio, de forma uniforme. Esta tcnica
realizada para que haja crescimento
bacteriano, bem como poderemos utiliz-la
para observar funes metablicas de
algumas bactrias.

Figura 2: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela tcnica

supracitada (Ex. meio de cultura: Citrato de Simmons)
 Mtodos de Inoculao
1.1.3. Em Picada: Esta tcnica de semeadura utilizada para que se
possa observar funes metablicas de alguns microrganismos
(bactrias) que so submetidas a anlise microbiolgica.

Figura 3: Figura ilustrativa de dois meios de cultura semeados com a tcnica em picada. No
tubo esquerda, observamos o momento da picada que realizada com o auxlio de uma
agulha de semeadura e direita observamos a picada propriamente dita (Ex. meio de
cultura: SIM).
 Mtodos de Inoculao
1.2. Semeadura em Placas de Petri (em superfcie): O material a ser
semeado dever conter poucos microrganismos porque o inculo para o
isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colnia formada na superfcie
de um meio slido originada de um ou alguns microrganismos. Quanto
maior o nmero, menor possibilidade de isolamento e maior
probabilidade de crescimento confluente. Quando o inculo for obtido a
partir de meio slido (inculo pesado), este poder ser diludo em salina
estril ou ser utilizada a tcnica de esgotamento adequada.
 Mtodos de Inoculao

1.2.1. Estrias Mltiplas para Isolamento: Consiste em

espalhar o material com o auxlio de uma ala
bacteriolgica, fazendo estrias sucessivas at o
esgotamento do material, de modo a obter-se um
perfeito isolamento das bactrias existentes na
amostra. Quando o material muito denso, a ala
dever ser flambada.

Figura 4: Figura ilustrativa de como se deve proceder para realizar a tcnica de estrias mltiplas,
onde a ala dever ser deslizada sobre a regio onde h um inculo bacteriano e logo depois
deve ser passada na superfcie da placa para semeadura com movimentos em ZIG-ZAG,
visando o isolamento bacteriano.
 Mtodos de Inoculao

1.2.2. Alternativamente, para se obter um tapete uniforme de crescimento microbiano, ou

colnias isoladas (aps diluio) utiliza-se o mtodo de espalhamento em placa. Consiste em
espalhar o material (suspenso bacteriana na maioria das vezes) com o auxlio de um swab (para
obteno de tapete uniforme) ou ala de Drigalski (para obteno de colnias isoladas aps diluio),
fazendo a semeadura por toda a superfcie da placa de Petri a ser utilizada nesta tcnica. Deve-se ter
o cuidado para que toda a superfcie da placa seja semeada, evitando regies sem semeadura.
Recomenda-se que faa o procedimento de semeadura com o swab em trs direes distintas, com a
ala em toda a superfcie rodando a placa.

Ala de drigalski
Tcnica para semeadura em superfcie (meios slidos):

O inculo obtido a partir de uma cultura em caldo ou de uma diluio da cultura em meio
slido feito da seguinte maneira:

Retiramos o inculo do tubo com a ala j flambada e fria.

Abrimos a placa, de modo que a tampa forme um chapu com a placa .

Colocamos o inculo junto a parte superior da placa, espalhando-o a seguir atravs de

estriamento (que poder ser contnuo ou descontnuo). O estriamento poder se feito de
maneiras variadas, tomando-se sempre o cuidado de nunca passar a ala duas vezes no mesmo
local. O estriamento permite o esgotamento dos microrganismos que se encontram na ala.
Quando passamos a mesma 2 vezes no mesmo local, promovemos o recarregamento do local,
deixando ali mais bactrias, o que dificultar o seu perfeito isolamento. Durante o estriamento,
aps termos semeado metade da placa, deveremos cessar o mesmo. A seguir flambamos a
ala, esperamos esfriar e continuamos o estriamento novamente, carregando a ala na ltima
estria que realizamos. Depois de terminado o estriamento, fechar a placa e identificar, levando-
a a seguir para incubao na estufa, com a tampa voltada para baixo.

Flambar a ala utilizada, esperar esfriar e guardar no suporte apropriado.

 Tcnica para semeadura em meios lquidos:

Segurar a ala com a mo direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar

esfriar (a ala flambada na posio vertical e dever ficar atrs da chama para proteo do

operador).

Retirar a rolha de algodo do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado

(que dever estar na mo esquerda) utilizando-se o dedo mnimo da mo direita. A ROLHA

DEVER PERMANECER SENDO SEGURA COM O DEDO MNIMO, AT O FINAL DA OPERAO.

Flambar a boca do tubo, e retirar o inculo com a ala fria.

Flambar novamente a boca do tubo e fechar.

Pegar o tubo onde se ir realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar.

Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar.

Esterilizar a ala, identificar o tubo semeado e levar para incubao em estufa.

 Tcnica para semeadura em meios semi-slidos

Retirar o microrganismo do meio slido ou lquido com o auxlio de uma

ala em agulha j flambada e fria.

Abrir o tubo que contm o meio semi-slido e semear o microrganismo

atravs de picada at mais ou menos 1/3 ou do tubo.

Fechar o tubo, identificar e levar para incubao.

Flambar a agulha, deixar esfriar e colocar no suporte adequado.

 Colorao de GRAM

Passar a lamina c/
esfregao por 3x
Ala sob a chama.

Fixao do
esfregao pelo
calor

Bactrias isolada Esfregao

Tcnica de GRAM

1. Cobrir lamina com cristal violeta e deixar por 1 min.

2. Escorrer excesso do corante e lavar.

3.Cobrir lamina com Lugol e deixar por 1 min. Proceder a colorao
de GRAM
4. Escorrer excesso do corante e lavar.

5.Cobrir lamina com Eter-acetona e deixar por 30s.

6. Escorrer excesso do corante e lavar.

7.Cobrir lamina com Fucsina e deixar por 30s.

Fucsina
8 . Escorrer excesso do corante, lavar e deixar secar.
 Colorao de Ziehl-Neelsen
Passar a lamina c/
esfregao por 3x
Colnias de
sob a chama.
Micobactrias Usar capela de fluxo
laminar.

Fixao do
esfregao pelo
Esfregao calor
Meio de cultura
para
Micobactrias a) Cobrir os esfregao com fucsina de Ziehl. Aquecer at a emisso de
vapores (No deixar o corante secar). Esperar 5 minutos;
b) Lavar com gua corrente;
Resultado c) Descorar com lcool (97%), cido clordrico (1%);
d) Lavar em gua corrente; Proceder a colorao
e) Corar com azul de metileno por 1 minuto; de Ziehl-Neelsen

f) Lavar e secar;
g) Observar ao microscpio as lminas coradas;
h) Como se apresentam os BAAR.