Doenças Micóticas PDF

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Captulo 4
Micologia
Aurea Maria Lage de Moraes
Rodrigo de Almeida Paes
Vernica Leite de Holanda
1. Introduo micologia
Os fungos so organismos que convivem conosco todos os dias. Estes
organismos so encontrados praticamente em qualquer local do ambiente que
nos cerca, inclusive no ar, onde estruturas reprodutivas, na forma de esporos
ou condios, esto prontas para, ao cair em um substrato adequado, desenvol-
ver novas estruturas vegetativas e reprodutivas.
Estes organismos, muitas vezes, nos so teis, decompondo resdu-
os orgnicos, causando a decomposio ou a degradao de alimentos, ou
mesmo atacando seres vivos, parasitando-os e, eventualmente, causando a
sua morte.
Os fungos so importantes, tanto do ponto de vista ecolgico quanto
econmico. Ecologicamente, so considerados os lixeiros do mundo, pois
degradam todo tipo de restos orgnicos, independente da origem, transfor-
mando-os em elementos assimilveis pelas plantas. J, economicamente, tm
implicaes em vrias reas: Medicina humana e veterinria, Farmcia, Nutri-
o, Fitopatologia, Agricultura, Biotecnologia, entre outras.
400 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade
Os fungos tiveram seu grupo reconhecido como um reino a partir da

descrio de cinco reinos por Whittaker em 1969. Esses organismos foram
alocados em reinos com base na morfologia e no modo de nutrio dos seres
vivos, sendo criado, ento, o reino Fungi. Em 1990, Carl Woese props o
agrupamento dos cinco reinos estabelecidos por Whittaker em trs domnios:
Archaea, Eubacteria e Eukaria, onde o reino Fungi faz parte do domnio
Eukaria, que rene todos os eucariontes.
A Micologia , portanto, a rea da Biologia destinada ao estudo
dos fungos.
1.1. Elementos fundamentais dos fungos e Citologia

Os fungos so organismos eucariontes, unicelulares (leveduriformes) ou
multicelulares (filamentosos), haploides (homo ou heterocariticos), com pa-
rede celular contendo quitina e a-glucano. No apresentam plastos ou pig-
mentos fotossintticos.
Todos os fungos conhecidos, com poucas excees, tm origem nos
esporos (reproduo sexuada) ou condios (reproduo assexuada), corps-
culos que podem ser comparados s sementes das plantas superiores, embora
no sejam morfologicamente semelhantes a estas.
Os esporos ou condios, para germinarem, necessitam de calor e
umidade e o resultado desta germinao a formao de um ou mais filamentos
finos, conhecidos como tubos germinativos. Estes tubos se ramificam em
todos os sentidos formando uma massa filamentosa, chamada miclio, que
constitui o sistema vegetativo, responsvel pelo desenvolvimento fngico e
pela absoro dos alimentos. Os filamentos simples ou ramificados que
formam o miclio so denominados hifas. Na maioria dos casos, o sistema
vegetativo encontra-se no interior dos tecidos parasitados, no solo ou na
matria orgnica em decomposio.
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Com a formao dos esporos ou condios necessrio que estes

tenham acesso livre ao ar, para assegurar sua disseminao. Realiza-se, ento,
uma diferenciao das hifas vegetativas, geralmente levantadas verticalmente
sobre o plano do miclio, conhecido como esporforo ou conidiforo, e
sobre estes se originam os esporos ou condios. As hifas, por sua vez,
podem ser apocticas (com septo) ou cenocticas (sem septo).
O ciclo de vida dos fungos compreende duas fases. Uma somtica,
caracterizada por atividades alimentares, e outra reprodutiva, onde os fun-
gos podem realizar reproduo sexuada ou assexuada. Em ambos os casos,
um grande nmero de estruturas formado, dependendo da espcie. As
estruturas assexuadas, como tambm as sexuadas, podem ser formadas
isoladamente ou em grupos, neste caso, formando corpos de frutificao.
Assim, condios podem ser formados em conidiforos isolados ou agrupa-
dos, constituindo ento os conidiomas. Os esporos podem ser formados
em ascomas (onde so formados os ascos) ou basidiomas (onde so for-
mados os basdios).
De acordo com tipo de reproduo realizada, os fungos podem ser
divididos em trs grupos:
Holomorfo: aquele que no ciclo de vida realiza ambas as reprodu-
es, sexuada e assexuada.
Anamorfo: aquele que no ciclo de vida realiza apenas a reprodu-
o assexuada.
Teleomorfo: aquele que no ciclo de vida realiza apenas a reprodu-
o sexuada.
Esquema do ciclo de vida geral do fungo.
1.2. Nutrio, metabolismo e habitat

Os fungos so considerados seres heterotrficos, necessitando de materiais
orgnicos j formados, que servem como fonte de energia e como constituintes
celulares. Por causa da rigidez da parede celular, sua nutrio por absoro de
nutrientes solveis simples. Realizam respirao celular ou fermentao para obten-
o de energia, e sua reserva energtica sob a forma de glicognio.
Devido ausncia de clorofila nos fungos, torna-se necessrio que o
substrato fornea as substncias j elaboradas indispensveis alimentao,
obrigando os fungos a viverem em estado de saprofitismo, parasitismo, simbiose
(liquens, por exemplo) ou mutualismo. Eles podem ser subdivididos em:
Saprfitas obrigatrios Fungos que vivem exclusivamente em matria
orgnica morta, no podendo parasitar organismos vivos.
Parasitas facultativos ou saprfitas facultativos Fungos capazes de
causar doenas ou de viver em restos orgnicos, de acordo com as
circunstncias.
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Parasitas obrigatrios Fungos que vivem exclusivamente atacando

organismos vivos.
Os fungos so considerados seres cosmopolitas, pois esto presentes
em qualquer parte do planeta. Sendo amplamente distribudos pela natureza,
so encontrados na gua, no ar atmosfrico, no solo, sobre os animais e
vegetais vivos, na matria orgnica em decomposio, nos produtos alimentci-
os e industriais.
A maioria dos fungos tm como necessidades nutricionais, os elemen-
tos C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Mo, Fe e Zn. Muitas espcies
no necessitam de luz para seu desenvolvimento, j outras necessitam para
formar suas estruturas de reproduo, podendo ser consideradas fototrficas
(que buscam a luz). A temperatura ideal para o crescimento dos fungos fica
entre 0 a 350C, mas o timo para a maioria fica entre 20 a 300C e a
umidade ideal fica em torno da saturao.
1.3. Posio sistemtica dos fungos

O reino Fungi dividido em sete filos, (Chytridiomycota,
Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Microspordia, Glomeromycota,
Ascomycota e Basidiomycota), e um grupo, os fungos anamrficos. Este
grupo no possui valor taxonmico, sendo seus membros relacionados aos filos
Ascomycota e Basidiomycota.
A taxonomia dos fungos tradicionalmente baseada em caracteres
citolgicos e morfolgicos. Mas, atualmente, com o desenvolvimento de tc-
nicas bioqumicas e moleculares, novos caracteres foram adicionados como
auxlio na identificao das espcies fngicas. Tais como as tcnicas baseadas
em PCR (RAPD, RFLP, AFLP), sequenciamento de DNA, isoenzimas e
cromatografia (TLC, HPLC, CG, espectometria de massa).
1.3.1. Filo Chytridiomycota
Os representantes do filo Chytridiomycota so considerados cosmo-

politas e saprfitos aquticos. A maioria de gua doce poucos so
marinhos. A principal caracterstica do grupo a formao de zosporo
flagelado, estruturas de propagao no ambiente aqutico, onde o flagelo
ajuda na sua movimentao.
Ex: Chytriomyces sp.
1.3.2. Filo Neocallimastigomycota
So encontrados no sistema digestivo dos grandes mamferos herbvoros

e possivelmente em outros ambientes anaerbios terrestres e aquticos. Tratam-
se de zosporos no flagelados.
Ex: Neocallimastix sp.
1.3.3. Filo Blastocladiomycota

Seus representantes apresentam reproduo assexuada com zosporo
de um nico flagelo, e reproduo sexuada atravs da fuso de planogametas.
So habitantes restritos de gua e solo e parasitos de insetos.
Ex: Allomyces sp. e Coelomomyces sp.
1.3.4. Filo Microspordia
Organismos eucariontes sem mitocndria e flagelo desconhecido. So

parasitas obrigatrios de animais, e comumente atacam peixes e insetos. Estes
organismos foram includos no reino Fungi aps estudos filogenticos.
1.3.5. Filo Glomeromycota
O filo Glomeromycota representado por fungos de micorrizas

arbusculares (FMA). Participam de uma associao mutualstica com as razes
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de algumas plantas, na qual a planta, atravs da fotossntese, fornece energia e

carbono para a sobrevivncia e multiplicao do fungo, enquanto este absorve
nutrientes, minerais e gua do solo transferindo-os para as razes da planta.
Tambm so considerados cosmopolitas. Foi includo neste grupo os represen-
tantes do antigo filo Zygomycota, que tem como principais caractersticas, hifas
cenocticas e a formao de zigospornangio, por reproduo sexuada; e
esporngio, por reproduo assexuada. Os esporngios so estruturas forma-
doras de propgulos para disperso.
Ex: Mucor sp. e Glomus sp.
1.3.6. Filo Ascomycota
O filo Ascomycota compreende o maior grupo do reino Fungi, consti-

tudo de aproximadamente 75% de todos os fungos descritos. Seus represen-
tantes so considerados cosmopolitas e so encontrados na natureza como
saprfitos, parasitas (especialmente de plantas), ou em associao mutualstica
(com algas unicelulares) formando os liquens.
A principal caracterstica do grupo a presena de asco contendo
ascosporos, geralmente oito, que representam a estrutura de propagao do
grupo. So produzidos por reproduo sexuada.
A reproduo assexuada tambm pode ser encontrada. O asco for-
mado em uma estrutura denominada ascocarpo (corpo de frutificao), que
pode ser encontrado nas seguintes formas: apotcio (ascocarpo em forma de
taa), cleistotcio (ascocarpo totalmente fechado, que se rompe com a matu-
ridade), e peritcio (ascocarpo em forma de balo, com um poro na sua
ponta). A ausncia da formao de ascocarpo tambm observada, sendo
este considerado como ascos nus.
Ex: Eurotium sp. e Emericella sp.
1.3.7. Filo Basidiomycota
Os representantes do filo Basidiomycota so considerados cosmopolitas

e saprfitos. So comumente denominados cogumelos. Tm como principal
caracterstica a presena de basdio contendo basidiosporos, geralmente qua-
tro, produzidos por reproduo sexuada.
A reproduo assexuada tambm pode ser encontrada. O basdio
formado a partir de um basidiocarpo, sendo este constitudo, basicamente, por
pleo (o chapu do cogumelo), lamela (estrutura pregueada abaixo do pleo,
onde se encontram os basidios) e estirpe (estrutura que sustenta o pleo).
Ex: Agaricus sp. e Rhodotorula sp.
1.3.8. Fungos Anamrficos
Os Fungos Anamrficos formam um grupo de fungos onde a reprodu-

o assexuada predominante, com a formao de condios como estrutura de
propagao.
A reproduo sexuada ausente, desconhecida ou teve a capacidade
perdida. Esse grupo est relacionado a gneros do filo Ascomycota e
Basidiomycota por comparao de sequncias gnicas. So considerados como
cosmopolitas, saprfitos, e parasitas de animais e plantas.
Os condios so formados por clulas conidiognicas, presentes nos
conidiforos, que so prolongamentos de hifas modificadas, com funo
reprodutiva. Os condios podem ter diferentes formas, tamanhos e cores,
podem possuir ou no a superfcie texturizada, ornamento ou septo.
Ex: Aspergillus sp e Penicillium sp.
2. Por que estudamos os fungos

Por
Os fungos so conhecidos da humanidade h vrios sculos, tanto por
seus benefcios quanto pelos problemas que causam. Muitas doenas huma-
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nas, de animais e plantas (micoses) so causadas por fungos. Em humanos e

animais os fungos podem causar alergias respiratrias e cutneas leves ou inten-
sas, dependendo da suscetibilidade e pr-disposio do indivduo. Podem
causar infeces em mucosas e outros tecidos subcutneos, assim como infec-
es crnicas e letais envolvendo rgos inteiros. Cada tecido ou rgo do
corpo humano pode ser afetado, com exceo dos dentes.
Ns dependemos da agricultura para nos fornecer alimentos, principal-
mente os gros de cereais (milho, trigo, aveia, amendoim, etc.) que alimentam
tanto os humanos quanto os animais. Doenas fngicas em cereais causam
perdas significantes na agricultura, tanto para o consumo interno quanto para a
exportao de gros atividade to importante em nossa economia. Alm
disso, o ataque dos fungos no se restringe ao campo de produo, eles
atacam tambm os gros estocados causando sua destruio ou produzindo
toxinas carcinognicas potentes (micotoxinas) dentro destes gros.
Os fungos tm sido utilizados para os mais diferentes propsitos, desde
a antiguidade. O uso mais antigo deles tem sido como alimento, propriamente
dito, tendo sido utilizado mais tarde tambm na indstria alimentcia para a
produo de pes, queijos, cervejas e vinhos. O sabor e a textura de muitos
alimentos, como os queijos e o molho de soja, so dados pelos fungos usados
em sua fabricao. Posteriormente, foi descoberto o poder dos fungos na
produo de metablitos que poderiam ser teis, como a Penicilina.
Estudos em Biotecnologia e Engenharia gentica propiciaram a pro-
duo destes metablitos em larga escala. Hoje produtos fngicos usados
comercialmente incluem cidos orgnicos, etanol, alguns antibiticos (alm
da Penicilina), pigmentos, vitaminas, enzimas e pesticidas biolgicos. Alm
de se tornarem valiosos objetos de pesquisa, em particular, como modelos
eucariontes, uma vez que so facilmente manipulados em laboratrio, for-
necendo informaes importantes sobre a bioqumica, a gentica e a biolo-
gia molecular dos eucariontes.
3. Micologia Mdica
A Micologia mdica tem como principal objetivo estabelecer o diag-
nstico micolgico das infeces por fungos, que por sua vez se baseia em
correta coleta e processamento de espcimes clnicos. A observao das nor-
mas de preservao, e transporte adequados dos materiais clnicos at os locais
de processamento, como laboratrio de Microbiologia/Micologia tambm tem
enorme importncia para a obteno de resultados acurados.
3.1. Classificao das micoses

Didaticamente, podemos dividir as micoses em grupos, como demons-
trado a seguir:
3.1.1. Micoses superficiais e cutneas
As MICOSES SUPERFICIAIS so infeces causadas por

fungos que invadem as camadas mais superficiais da capa
crnea da pele ou a haste livre dos pelos. As leses se
manifestam como mancha pigmentar na pele, ndulo ou
pelos. A forma invasiva do fungo uma hifa, caracterstica
de cada micose.
A piedra negra uma micose causada pela Piedraia hortae. Esta micose
consiste em ndulos duros, de cor escura, localizados na haste dos pelos e
bastante aderentes a eles. Em parasitismo, o fungo se apresenta como um
emaranhado de hifas intimamente unidas. Essas hifas so de cor castanha e tm
parede e septos espessos. Os ndulos constituem, na verdade, um ascostroma,
pois em meio ao enovelado de hifas formam-se lculos ovalados contendo
oito ascsporos. J a piedra branca causada por leveduras do gnero
Trichosporon. Nesta infeco o fungo cresce sobre a haste dos pelos, forman-
do ndulos de hifas hialinas septadas e ramificadas, facilmente destacveis dos
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pelos, que podem se desarticular, resultando em artrocondios retangulares que

se tornam esferides ou polidricos.
Leveduras do gnero Malassezia so os agentes da pitirase versicolor.
Esses fungos vivem normalmente sobre a pele do homem, na forma de levedura.
Usualmente podem filamentar e invadir as clulas queratinizadas das camadas
superficiais da pele, determinando a micose. A doena se manifesta como
manchas descamativas distribudas pelo trax, abdome e membros superiores.
Ao contrrio do que muitos pensam, a micose no adquirida na praia; o que
ocorre que quando o doente se bronzeia, os locais da pele onde o fungo
est em parasitismo no se queimam, permitindo que as leses possam ser
visualizadas com maior facilidade. O diagnstico definitivo se d somente pelo
exame direto atravs da observao de hifas curtas e curvas e elementos redon-
dos. A Malassezia no cresce nos meios de cultura habituais usados na rotina
porque necessita de suplemento lipdico para seu crescimento.
As MICOSES CUTNEAS se caracterizam por serem

causadas por fungos que invadem toda a espessura da
capa crnea da pele ou a parte queratinizada intrafolicular
dos pelos ou a lmina ungueal. Na pele, as leses se
manifestam como mancha inflamatria, nos pelos como
leso de tonsura e na unha por destruio da lmina
ungueal. O contgio feito atravs de animais, homens
ou de solo infectado.
As dermatofitoses constituem manifestaes clnicas muito variadas cau-

sadas por um grupo de fungos, denominados dermatfitos, que produzem
leses na pele, pelos ou unhas. Os fungos dermatfitos degradam queratina e
pertencem aos gneros Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton. H
reconhecidamente 27 espcies patognicas para o homem, dentre as quais 15
ocorrem no Brasil. Destas, as principais so: Trichophyton rubrum,
Epidermophyton floccosum, T. mentagrophytes, Microsporum canis, M.

gypseum e T. tonsurans.
As dermatofitoses podem ser classificadas nas seguintes modalidades
clnicas: dermatofitose ou tinha do couro cabeludo, da pele glabra, da
barba e da face, dos ps, das unhas e inguinal, dependendo da localizao
da leso no paciente. J nos cabelos, pela relao com os fungos, podem
ser diferenciados dois tipos de parasitismo: endotrix, onde os artrocondios
se localizam somente no interior do pelo, esse causado, por exemplo, por
T. tonsurans; e ectotrix, onde os artrocondios se dispem no interior e ao
redor do fio de cabelo. Podemos citar M. canis e T. mentagrophytes
como agentes deste tipo de parasitismo pilar.
Em cultivo, os dermatfitos, em sua maioria, produzem dois tipos de
condios: macrocondios e microcondios que, juntamente com a caracters-
tica macroscpica da colnia, vo permitir a identificao das diferentes
espcies dos dermatfitos. Os macrocondios so caractersticos dos se-
guintes gneros:
Microsporum So fusiformes, grandes, multisseptados de pare-
des rugosas.
Epidermophyton So clavados, robustos bi ou trisseptados com
paredes lisas e espessas.
Trichophyton Quando existentes so delicados, clavados,
multisseptados de paredes finas e lisas.
O quadro a seguir mostra as caractersticas macro e micromorfolgicas
que so observadas nas colnias dos principais fungos responsveis por
dermatofitoses.
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Fungo dermatfito Macromorfologia Micromorfologia

Trichophyton rubrum Colnia branca, granular ou Microcondios em gota de
cotonosa, com pigmento lgrima dispostos ao longo
vermelho no verso da hifa e macrocondios,
que quando existem, so
comuns do gnero
T. mentagrophytes Colnia branca, granular ou Macrocondios do gnero,

cotonosa, com pigmento microcondios redondos
que vai do amarelo ao numerosos
marron no verso
T. tonsurans Colnia acastanhada com Microcondios numerosos e
pigmento vermelho- polimrficos, usualmente
ferruginoso no verso clavados ou alongados
Microsporum canis Colnia branca, penugenta Macrocondios fusiformes,

com pigmento amarelo multisseptados de paredes
alaranjado no verso rugosas e mais espessas que
a dos septos, poucos
microcondios
M. gypseum Colnia pulverulenta de cor Numerosos macrocondios
camura, com pigmento fusiformes, multissepados,
pardo no verso de paredes rugosas e finais
poucos microcondios
Epidermophyton flocosum Colnia membranosa de Macrocondios em grupos

cor verde-limo de trs ou mais na extremi-
dade de conidiforos,
microcondios inexistentes
A candidase micose causada por leveduras do gnero Candida, em

especial pela espcie C. albicans. Elas so hspedes normais do trato
gastrintestinal do homem e fazem parte da microbiota de determinadas regies
do tegumento cutneo. Porm a Candida pode invadir a camada crnea da
pele ou a lmina ungueal de hospedeiros normais. As leses tm localizao
peculiar: nas unhas das mos e nas reas intertriginosas da pele (regio inguinal,
espaos interdigitais das mos, regio submamria e axilar). Tambm possvel
ocorrerem leses nas unhas dos ps.
H ainda outras micoses de pele e de unha que no so causadas nem
por fungos dermatfitos nem por fungos do gnero Candida. Dentre esses
fungos destacam-se: Fusarium sp., Scytalidium dimidiatum, e S. hyalinum
que podem causar leses principalmente em unhas e em espaos interdigitais
dos ps. Em cultivo, S. dimidiatum se apresenta como colnia cotonosa,
branca no incio tornando-se cinza a negra em dez dias. Microscopicamente,
se compe de hifas demceas e hialinas, com artrocondios septados e no
septados. S. hyalinum considerado um mutante de S. dimidiatum incapaz
de sintetizar melanina e, com isso, as hifas e os condios so sempre hialinos.
As culturas de Fusarium sp. podem ser as mais variadas possveis, quanto
macroscopia. Esta depender da espcie que causa a leso. Porm, micros-
copicamente, o que caracteriza Fusarium sp. a presena de macrocondios
em forma de lua, bi ou trisseptados.
3.1.2 . Micoses subcutneas
As MICOSES SUBCUTNEAS se caracterizam por

resultar da inoculao de um fungo patognico por oca-
sio de um traumatismo, manifestando-se como tumefao
ou leso supurada da pele ou do tecido subcutneo,
produto da disseminao do fungo por contiguidade ou
por via linftica, porm limitada ao territrio aqum do
linfonodo regional.
A esporotricose tem como agente Sporothrix schenckii. Esse um

fungo dimrfico, logo, muda entre as formas miceliana e leveduriforme, de
acordo com a temperatura e as condies do ambiente onde se encontra.
Assim sendo, S. schenckii, em parasitismo nos tecidos apresenta-se como
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elementos leveduriformes bem pequenos, com brotamento geralmente em

forma de charuto. Na natureza, em associao a vegetais e madeira, vive na
forma filamentosa. A transmisso clssica da esporotricose se d por traumatismo
causado por vegetais onde o fungo se encontra ou pela forma zooflica, ou
seja, atravs de leses provocadas por animais infectados por S. schenckii,
em especial gatos, como vm ocorrendo no estado do Rio de Janeiro, que
uma rea endmica de esporotricose. A leso inicial da esporotricose
uma ppula ou ndulo que surge no ponto da inoculao, usualmente loca-
lizado nos membros. Desse local o fungo pode propagar-se por contiguidade,
determinando uma leso circunscrita ou por via linftica, ocasionando o apa-
recimento de ndulos em nmero varivel sobre o trajeto de um linftico
superficial. O diagnstico definitivo se d com o isolamento em cultivo do
fungo em amostras de pus ou bipsia das leses. Testes de deteco de IgG
e IgM em amostras de soro podem auxiliar no diagnstico e no acompanha-
mento teraputico desta infeco.
A cromoblastomicose uma infeco que se caracteriza pelo aspecto
parasitrio de seus agentes: o corpo muriforme. Esses so elementos globosos,
com parede acastanhada espessa e septados em planos distintos. Podem ser
visualizados tambm elementos no septados e outros com apenas um septo,
porm o que caracteriza o corpo muriforme a presena de septos em planos
diferentes. As principais espcies que podem causar cromoblastomicose no ser
humano so Fonsecaea pedrosoi, F. compacta, Cladophialophora carrionii,
Phialophora verrucosa, e Rhinocladiella aquaspersa. No Brasil, normalmente,
os casos dessa micose so causados por F. pedrosoi, aps traumatismo com
matria orgnica vegetal.
Micetoma o nome coletivo de micoses produzidas por algumas esp-
cies de fungos ou de actinomicetos aerbios, os quais, nos tecidos, se organi-
zam em um agregado de hifas ou filamentos bacterianos, denominados gros.
Os agentes de micetoma possuem habitat na natureza associado a vegetais,
nutrindo-se de outros vegetais em decomposio ou como fitopatgenos.

O micetoma eumictico se distingue do actinomictico por ser: causado por
um fungo, enquanto o actinomictico causado por bactrias filamentosas.
Os gros, de tamanho e forma variados, podem ter colorao branco-amare-
lado, vermelha ou negra. O que caracteriza a cor de um gro somente o
fungo ou actinomiceto agente da doena. Por isso, a cor do gro obtido das
leses do paciente j fornece um indicativo de qual seja o agente do micetoma.
O quadro a seguir o relata alguns desses agentes, com o respectivo tipo e
colorao dos gros:
Fungos causadores de micetoma

Gro eumictico negro Gro eumictico branco
Madurella mycetomatis Acremonium sp.
M. grisea Pseudallescheria boydii (Scedosporium apiospermum)
Pyrenochaeta romeroi Neotestudina rosatii
Exophiala jeanselmei Aspergillus nidulans (Emerciella nidulans)
Actinomicetos causadores de micetoma
Gro actinomictico vermelho Gro actinomictico branco
Actinomadura pelletieri Actinomadura madurae
Nocardia brasiliensis
N. asteroides, N. caviae
Streptomyces somaliensis
H outras micoses subcutneas de interesse, como a lobomicose e a

entomoftoramicose. No entanto, a esporotricose, cromoblastomicose e
micetomas so as mais comuns no Brasil.
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3.1.3. Micoses sistmicas e oportunsticas
As MICOSES SISTMICAS se caracterizam por serem

adquiridas por inalao de propgulos fngicos, sendo,
consequentemente a leso primria pulmonar, com ten-
dncia regresso espontnea. O fungo pode se disse-
minar pelo corpo atravs do sangue, originando leses
extrapulmonares nos indivduos. Os agentes de micoses
sistmicas raramente so implantados traumaticamente; quan-
do isso ocorre, determinam uma leso granulomatosa cir-
cunscrita, com ou sem linfangite regional, que regride
espontaneamente.
Ao invadir os tecidos, os fungos desencadeiam resposta imunolgica no

hospedeiro, que pode ser evidenciada por reao intradrmica, na qual se
verifica a resposta celular dada pelo hospedeiro, por reaes de
hipersensibilidade tardia e por provas de deteco de anticorpos em amostras
de soro (imunodifuso dupla e fixao do complemento), onde avaliada a
resposta humoral. Uma reao intradrmica positiva evidencia que o indivduo
j foi previamente sensibilizado pelo fungo e as provas sorolgicas indicam que
h anticorpos contra o fungo. Porm, as provas sorolgicas podem fornecer
resultados falso-positivo e falso-negativo, visto que podem ocorrer reaes
cruzadas com outros anticorpos na prova aplicada. As provas sorolgicas auxi-
liam no diagnstico de micoses sistmicas, mas o que realmente diagnostica a
doena o isolamento do fungo em cultivo ou sua observao no exame
micolgico direto dos materiais adequados para o exame, tendo as provas
imunolgicas valor diagnstico presuntivo. As provas imunolgicas so teis
para avaliaes epidemiolgicas, para avaliao prognstica e para a triagem de
pacientes. As reaes intradrmicas apresentam valor diagnstico baixo, uma
vez que no discriminam entre infeces passadas ou recentes. Porm so de
grande valor nos estudos epidemiolgicos.
As micoses sistmicas so a coccidioidomicose, a blastomicose, a

histoplasmose, e a paracoccidioidomicose. As duas primeiras no so co-
muns no Brasil, embora sejam relatados casos de coccidioidomicose no semi-
rido do Nordeste, em especial no Piau em caadores de tatus, que revolve-
ram o solo para desentocar a caa. H tambm a esporotricose sistmica,
que resultado da inalao de condios de S. schenckii os quais vo causar
infeco pulmonar que pode sistematizar-se. Este tipo de apresentao clni-
ca da esporotricose bastante raro. O aspecto macro e micromorfolgico
do fungo o mesmo do agente da esporotricose subcutnea.
A histoplasmose uma infeco sistmica, causada por Histoplasma
capsulatum var. capsulatum ou H. capsulatum var. duboisii. Enquanto o primei-
ro agente tem distribuio cosmopolita, o outro tem sua distribuio geogrfica
restrita ao continente africano. O cultivo de H. capsulatum temperatura
ambiente constitudo de colnia branca que, quando muito velha, assume
colorao camura. O crescimento do fungo bem lento. Microscopicamente
se observam hifas finas e delicadas e condios de dois tipos. Os macrocondios
esfricos e tuberculados so estruturas marcantes para a identificao do fungo.
Porm, a presena de microcondios esfricos necessria para a correta iden-
tificao do agente, pois h alguns fungos saprfitas, pertencentes ao gnero
Chrysosporium, que tambm produzem estruturas de propagao semelhan-
tes. Deve-se, para a correta identificao do agente da histoplasmose, realizar
a converso desse fungo para a fase leveduriforme em meios enriquecidos com
incubao a 37C. Todavia, a converso de H. capsulatum no facilmente
obtida e depende tambm das caractersticas fisiolgicas de cada isolado.
Quando convertidos fase leveduriforme observam-se colnias glabras, lisas,
branco-amarelada, e na microscopia notam-se leveduras ovais e unibrotantes.
A paracoccidioidomicose uma micose sistmica causada por
Paracoccidioides brasiliensis, caracterizada pela forma parasitria do seu agente:
clula leveduriforme mutibrotante com parede celular birrefringente. a micose
Micologia | 417
sistmica mais frequente na Amrica Latina. Afeta usualmente agricultores, que

mantm contato direto com a natureza, em principal com o solo. A micose
endmica no Brasil. As manifestaes clnicas da paracoccidioidomicose resul-
tam da inalao de elementos infectantes do fungo ou de uma reativao de
leso primria quiescente, ou seja, de uma leso adquirida h algum tempo,
muitas vezes mais de trinta anos, e que no tinha ainda se desenvolvido. O
fungo, alm de acometer o pulmo, dissemina-se para outras partes do corpo,
atingindo principalmente as mucosas do indivduo, sua pele e linfonodos. O
aspecto macroscpico da cultura de leveduras desse fungo tem colorao
creme-clara, consistncia cremosa e conseguido em meios especiais, como o
meio de Fava-Neto, com incubao a 37C. O cultivo a 25C d origem a
colnias de crescimento muito lento, filamentosas, algodoadas ou aveludadas,
compostos de uma trama de hifas sem condios.
As MICOSES OPORTUNSTICAS so causadas por

fungos termotolerantes (que crescem a uma temperatura de
37C), de baixa virulncia e que determinam doenas em
hospedeiros com graves deficincias do sistema
imunodefensivo. Esses fungos tm porta de entrada vari-
vel, usualmente provocam reao supurativa necrtica. Po-
dem acometer os mais variados rgos, produzindo qua-
dros polimrficos que se apresentam como manifestao
cutnea, subcutnea ou sistmica. Os fungos invadem os
tecidos como uma hifa.
A criptococose causada por leveduras do gnero Cryptococcus, das

quais destacam-se duas espcies: C. neoformans, que acomete principalmen-
te indivduos imunodeprimidos e C. gattii, que pode acometer indivduos
imunocompetentes. A micose de frequncia elevada nas grandes cidades,
onde so diagnosticadas suas formas clnicas mais graves. As formas subclnicas
ou as que se manifestam como infeco respiratria inespecfica devem ser
bastante frequentes. A doena endmica no Norte e no Nordeste do pas,

acometendo crianas, jovens e adultos, de ambos os sexos e todas as faixas
etrias, com ou sem depresso do sistema imunolgico. O fungo apresenta
tropismo pelo sistema nervoso central e o lquor do paciente pode simular
meningite viral, bacteriana e tambm tuberculose. As leveduras do gnero
Cryptococcus possuem uma caracterstica especial, que a presena de uma
cpsula polissacardica que envolve todo o fungo. Essa cpsula pode ser evi-
denciada em exames laboratoriais por contraste com tinta nanquim ou com a
colorao pelo Mucicarmin de Mayer. C. neoformans e C. gattii so capazes
de produzir a enzima extracelelular fenol oxidase, que extremamente til para
a identificao do agente da criptococose, pois esta enzima faz com que a
levedura se torne melanizada quando colocada em cultivo com compostos
fenlicos. Esta enzima e a cpsula polissacardica esto relacionadas com a
virulncia desse fungo ao organismo.
A aspergilose causada por membros do gnero Aspergillus que se
apresentam nos tecidos como hifas hialinas septadas e ramificadas
dicotomicamente, ou seja, num ngulo de 45. A micose se manifesta em
trs formas clnicas: a alrgica, de colonizao e a forma invasiva. Poucos
grupos de Aspergillus causam infeco no homem. Espcies de Aspergillus
dos grupos fumigatus, niger e flavus so os patgenos mais comuns, porm
tambm podem causar infeco fungos dos grupos nidulans, terreus, ustus e
restrictus. O aspecto microscpico do conidiforo permite a distino entre
as diferentes espcies.
A candidase oportunista tem incidncia mundial e resulta da invaso
por espcies de Candida dos tecidos de hospedeiros com endocrinopatias,
nos que recebem teraputicas imunodepressivas, nutrio parenteral e adminis-
trao prolongada de antibiticos ou esteroides, e ainda em pacientes com
complicaes aps grandes cirurgias. Nos tecidos, as espcies de Candida se
apresentam como hifas de aspecto peculiar, com exceo de C. glabrata (nun-
Micologia | 419
ca filamenta, sempre se apresenta na forma de levedura). O agente mais

comum C. albicans, espcie que faz parte da microbiota do tubo digestivo
do homem. Vive tambm em menor nmero na rvore brnquica e na cavidade
vaginal. Os microrganismos responsveis pela candidase so classificados em
sua forma anamrfica, usando provas fisiolgicas de assimilao e fermentao
de acares. medida que vm sendo descobertas as formas teleomrficas
das espcies de Candida, as caractersticas dos esporos demonstram que elas
pertencem a vrios gneros distintos.
3.2. Agentes antifngicos

O nmero de frmacos disponveis para o tratamento de infeces fngicas
sistmicas limitado. Nos ltimos anos, a anfotericina B e os azis principal-
mente cetoconazol, fluconazol e itraconazol tm sido os frmacos de primeira
escolha na terapia. Estas duas classes de medicamentos tm como alvo a membra-
na celular dos fungos. Os polienos ligam-se a uma poro esterol, basicamente
ergosterol, presente na membrana de fungos sensveis, formando poros ou ca-
nais. O resultado um aumento na permeabilidade da membrana que permite o
extravasamento de diversas molculas pequenas, levando morte celular. A
anfotericina B um antibitico fungicida de largo espectro e potente, mas seu
uso associado a efeitos adversos significantes, como nefrotoxicidade e febre
com calafrios, como reao aguda infuso intravenosa, j que a farmacocintica
deste frmaco no permite a administrao oral.
Os azis so compostos totalmente sintticos. O mecanismo de ao
destes frmacos baseia-se na inibio da esterol-14-a-desmetilase, um sistema
enzimtico microssomal dependente do citocromo P450, que prejudica a
sntese do ergosterol na membrana citoplasmtica e leva ao acmulo de 14- a-
metilesteris. Esses metil-esteris no possuem a mesma forma e propriedades
fsicas que o ergosterol e levam formao da membrana com propriedades
alteradas, que no desempenha as funes bsicas necessrias ao desenvolvi-
mento do fungo. Os azis causam menos reaes adversas que a

anfotericina B, mas so menos potentes que ela. Podem ter ao fungisttica
ou fungicida. O uso excessivo dos azis levou ao aparecimento de
resistncia em espcies suscetveis.
Um outro agente antifngico sistmico utilizado o pr-frmaco flucitosina.
Todos os fungos sensveis so capazes de desaminar a flucitosina em 5-
fluorouracila, um potente antimetablito; como resultado final, a sntese de
cido desoxirribonucleico dos fungos fica prejudicada. Embora as clulas dos
mamferos no convertam a flucitosina em fluorouracila, o que crucial para
ao seletiva do composto, alguns microrganismos da flora intestinal o fazem,
causando certa toxicidade aos humanos.
A atividade antimicrobiana de um composto pode ser quantificada
com base na determinao da concentrao mnima capaz de inibir o cresci-
mento de um dado microrganismo, um valor chamado CIM (Concentrao
Inibitria Mnima), ou MIC (Minimum Inhibitory Concentration) em
ingls. Este valor pode ser determinado atravs do mtodo das diluies
sucessivas ou do mtodo da difuso em gar, ou ainda atravs do uso de
tiras contendo um gradiente de concentrao de antibitico, conhecido
como E-teste.
Do ponto de vista microbiolgico e clnico, o conceito de sensibilidade
e resistncia aplicado para classificar o isolado como sensivel ou resistente.
No aspecto microbiolgico, uma cepa considerada resistente a um antifngico
quando a concentrao inibitria mnima mais elevada que a habitual do
antifngico frente a essa espcie.
Podemos observar trs diferentes tipos de resistncia aos agentes
antifngicos:
Intrnseca: dita quando nenhum membro de uma espcie sensvel
ao antifngico, ou seja, todos so insensveis.
Micologia | 421
Primria: ocorre quando dentro de uma espcie, normalmente sensvel

a determinado antifngico, encontra-se uma cepa com resistncia natural
a ele, sem necessidade de contato prvio com a droga.
Secundria: ocorre quando uma cepa, previamente sensvel, desen-
volve resistncia droga aps ter sido exposta a ela.
3.3. Diagnstico imunolgico das micoses pulmonares

As provas imunolgicas prestam valiosos auxlios no diagnstico de uma
infeco fngica. Os dados obtidos atravs de tais provas, devem ser
criteriosamente interpretados e correlacionados com os achados micolgicos,
evidncias clnicas e circunstncias epidemiolgicas.
Para segurana e facilidade na interpretao dos resultados, soros con-
troles positivos devem ser includos nas provas sorolgicas para deteco de
anticorpos em soro. Essas provas devem ser realizadas com uma bateria de
antgenos. No caso especfico das micoses pulmonares, essa bateria deve
incluir, no mnimo, antgenos de Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma
capsulatum, Aspergillus fumigatus e Coccidioides immitis.
Para melhor avaliao prognstica, as provas devem ser executadas com
amostras seriadas do soro colhido em diferentes perodos, possibilitando assim
a elaborao da curva sorolgica.
importante salientar que as provas imunolgicas tm

valor presuntivo no diagnstico das infeces fngicas,
sendo o exame de cultivo o padro-ouro para diagns-
tico definitivo das micoses.
3.4. Interpretao das provas imunolgicas
3.4.1. Paracoccidioidomicose
Pacientes portadores de paracoccidioidomicose ativa sem tratamento

apresentam positividade nas provas sorolgicas acima de 90%. Os ttulos da
reao de fixao de complemento so mais elevados nas formas graves e
agudas da doena, sofrendo quedas medida que ocorre melhora clnica. A
reao no tem muito valor diagnstico quando tomada como dado isolado.
A correlao com os dados clnicos, epidemiolgicos e resultados fornecidos
por outras tcnicas faz com que a importncia diagnstica aumente.
Na imunodifuso dupla de Ouchterlony pode ocorrer a formao de
vrias bandas de precipitao, sendo mais frequente a demonstrao de apenas
uma delas. A reao dotada de alta especificidade. Reaes cruzadas so
mnimas e podem ocorrer principalmente com soros de pacientes portadores
de histoplasmose.
A contraimunoeletroforese mais sensvel que a imunodifuso dupla e
permite que os resultados sejam conhecidos em tempo reduzido. Ao lado do
alto valor diagnstico, a reao permite tambm acompanhar a evoluo sorolgica
do paciente, atravs da titulao seriada de amostras do soro. O sorodiagnstico
especfico da paracoccidioidomicose pode ser obtido por intermdio da
imunoeletroforese, atravs da demonstrao do arco de precipitao corres-
pondente ao antgeno E2 ou gp43. O arco de precipitao correspondente
forma-se na regio catdica da lmina.
3.4.2. Histoplasmose
Anticorpos fixadores do complemento podem ser demonstrados na

maioria dos pacientes, j a partir da quarta semana aps a infeco. Preconiza-
se a utilizao dos antgenos obtidos da fase leveduriforme do Histoplasma
Micologia | 423
capsulatum bem como do antgeno obtido da sua fase filamentosa para aplica-
o no teste, uma vez que o antgeno leveduriforme apresenta uma maior
especificidade e o antgeno filamentoso maior sensibilidade. Os resultados
inespecficos esto geralmente relacionados aos ttulos de 1:8 e 1:32.
Consequentemente ttulos inferiores a 1:8 so considerados normais, e
entre 1:8 e 1:32 so considerados de valor presuntivo. Ttulos de 1:32
ou mais elevados so altamente sugestivos de histoplasmose em atividade.
Aps a cura clnica, os ttulos caem rapidamente e normalmente desapare-
cem aps nove meses. Reaes cruzadas podem ocorrer com soros de
portadores de paracoccidioidomicose.
Na imunodifuso dupla podem ser verificadas duas faixas de precipi-
tao de importncia diagnstica, denominadas bandas H e M. A faixa M
forma-se prxima do orifcio que recebe o antgeno e pode ser demonstra-
da com soros de pacientes com formas agudas ou crnicas de histoplasmose,
ou em indivduos sensveis a histoplasmina e que se submeteram a recente
teste intradrmico com o antgeno. A precipitina H demonstrada no soro
de pacientes com a doena ativa ou at dois anos aps recuperao clnica,
raramente ocorre na ausncia de M.
A contraimunoeletroforese tem praticamente o mesmo valor da
imunodifuso dupla, permitindo ainda a titulao dos anticorpos anti- H.
capsulatum.
A deteco de antgeno de H. capsulatum em espcimes de urina,
sangue e fluido crebroespinhal oferece um mtodo rpido para o diag-
nstico, para o monitoramento de terapia, assim como para a identificao
de recadas na histoplasmose disseminada. Resultados falso-positivos tm
sido observados somente em pacientes com blastomicose,
paracoccidioidomicose e infeco por Penicillium marneffei, e menos fre-
quentemente em pacientes com coccidioidomicose.
3.4.3. Aspergilose
Nos aspergilomas, os ttulos de anticorpos especficos demonstrados

pela reao de fixao de complemento esto geralmente elevados. As bandas
de precipitao reveladas pela imunodifuso dupla e contraimunoeletroforese
so geralmente mltiplas, podendo ser acima de dez. Aps a remoo cirrgi-
ca do aspergiloma ou tratamento adequado, estes anticorpos deixam de ser
detectados em pouco tempo.
Na aspergilose brnquica alrgica os ttulos de anticorpos especficos
so baixos, e na asma aspergilar raramente so demonstrados. Atravs de
provas cutneas com aspergilina, pode-se demonstrar reaes de
hipersensibilidade do tipo I e III na aspergilose brnquica alrgica, e do tipo I
na asma aspergilar.
Nas formas invasivas da doena raramente se demonstram anticorpos
atravs das provas usuais, necessitando-se o emprego de provas mais sensveis
tais como radioimunoensaios e imunoenzimticas.
Na imunodifuso dupla e contraimunoeletroforese, podem ocorrer rea-
es inespecficas devido protena C-reativa do soro do paciente. A elimina-
o de tal reao inespecfica se faz atravs da lavagem da lmina, em soluo
de citrato de sdio a 5% durante trinta minutos.
3.4.4. Criptococose
O imunodiagnstico da criptococose se baseia principalmente na de-

monstrao de antgeno solvel de C. neoformans ,
(GLUCORONOXILOMANANA) atravs da reao de soro ou lquor
com partculas de ltex sensibilizadas com gamaglobulina de coelho anti-
polissacride capsular. Interferncias, tais como fator reumatoide e efeito prozona
podem ser encontradas neste teste, e so facilmente eliminadas com tratamento
das amostras com pronase.
Micologia | 425
Os reagentes para demonstrao de antgeno solvel so encontrados

no comrcio, de procedncia norte-americana, na forma de KIT.
Anticorpos podem ser demonstrados na fase inicial e final da criptococose.
As provas mais utilizadas para tal propsito, so as reaes de imunofluorescncia
indireta e aglutinao de suspenso de clulas de C. neoformans, porm
apresentam baixo rendimento.
4. Meios de cultura e corantes
4.1. Meios de cultura

Os meios de cultura so preparaes que contm as fontes nutricionais
necessrias para o crescimento e multiplicao dos organismos.
O cultivo de microrganismos pode ter diferentes propsitos, mas em
todos eles o meio de cultura deve suprir as necessidades mnimas para que in
vitro se consiga um ambiente semelhante ao que se encontrava o organismo
na natureza.
Levando em considerao que os nutrientes so unidades estruturais e
fontes de energia para a construo e manuteno da estrutura e organizao
dos microrganismos, o meio de cultura deve cont-los para que viabilize o seu
crescimento.
So esses os principais constituintes do meio de cultura:
gua: sempre deve ser usada gua destilada para o preparo de meios
de cultura. A gua da torneira de constituio desconhecida, variando
especialmente em ons e em pH.
Fonte de carbono: necessria para a sntese de numerosos compos-
tos orgnicos que fazem parte do protoplasma. A glicose a principal
fonte de carbono utilizada pelos microrganismos.
Fonte de nitrognio: muitos componentes da clula, principalmente as

protenas, contm nitrognio.
Minerais: enxofre e fsforo.
Elementos de trao: so os minerais que so exigidos em quantidades
mnimas. Exemplos: potssio, magnsio, etc.
Fatores de crescimento: um fator de crescimento um componente
orgnico que a clula deve conter para crescer, mas incapaz de sinte-
tizar. Exemplos: aminocidos, purinas, etc.
Observao: Para o preparo do meio de cultura, as drogas usadas devem ser

de maior pureza. O pH, a temperatura e a aerao devem ser cuidadosamente
controlados. Sempre se deve observar o prazo de validade do produto.
Os meios de cultura podem ser classificados da seguinte forma:

Quanto ao estado fsico
Slido: contm gar (agente solidificante) na concentrao de 1,5g
a 3,0g por litro.
Semisslido: 0,1g a 1,1g de gar.
Lquidos (caldos): ausncia de gar.
Agentes solidificantes:
Gelatina: pode ser hidrolizada. mais utilizada hoje em provas
bioqumicas.
gar: uma substncia hidrocarbonada extrada de vrias espcies
de algas vermelhas, e imune ao desdobramento pela maioria dos
microrganismos.
Slica gel: usada quando se deseja cultivar microrganismos autotrficos.
Micologia | 427
Quanto composio qumica
Naturais ou Complexos: formados por substncias de composio

qumica no definida.
Sintticos: quando a composio qumica conhecida e seus com-

ponentes servem para suprir as fontes necessrias de carbono, nitro-
gnio, vitaminas, etc.
Quanto ao emprego
Meios de enriquecimento: so meios enriquecidos com determina-
dos nutrientes que favorecero o desenvolvimento de determinado
microrganismo, entre vrios outros.
Meio de manuteno: garante a viabilidade do microrganismo, por
longos perodos, de modo a torn-los disponveis em qualquer ex-
perimentao.
Meio diferencial: permite ao microrganismo produzir estruturas ou
reaes que podem ser usadas na sua diferenciao entre gneros ou
espcies.
Meio seletivo: permite o crescimento de um determinado grupo
ou gnero de microrganismo, em detrimento de outros.
Os meios de cultura devem ser preparados e esterilizados cuidadosa-

mente, de acordo com o protocolo a seguir:
a) Pesagem dos ingredientes
Se o meio preparado a partir de seus ingredientes bsicos,

suas massas corretas para o volume desejado devem ser pesadas
isoladamente.
Para meios desidratados, pesar a massa correspondente ao volume

desejado.
b) Dissoluo dos ingredientes

Nunca usar recipientes de cobre ou zinco para dissoluo dos
ingredientes do meio de cultura, usar preferencialmente o balo de
vidro, quimicamente limpo.
Adicionar ao recipiente contendo os ingredientes uma quantidade
de gua destilada, aproximadamente a metade do volume desejado,
agitando constantemente com basto de vidro, e evitando a forma-
o de bolhas; aquecer brandamente.
Usar gua destilada temperatura ambiente, no preparo de meios
lquidos.
Completar o volume do meio com a gua aps a formao de
suspenso homognea. Isso essencial, principalmente em meios
contendo agentes solidificantes.
O aquecimento para uma efetiva dissoluo dos ingredientes e
esterilizao do meio deve ser feito no menor tempo possvel. Os
meios que contm gar devem ser aquecidos at o seu ponto de
ebulio para uma completa dissoluo.
Resfriar os meios contendo gar temperatura aproximada de
50 C, reajustar o volume de gua destilada aquecida de 45 a
50 C, se houver perda significativa de gua durante o aquecimento.
c) Determinao e ajuste de pH
Determinar o pH de meios formulados antes de adicionar o gar.
Quando se tratar de meios formulados, se deve aferir 0,2 unida-

des de pH acima do desejado, haja visto que o pH abaixa aproxima-
Micologia | 429
damente este valor aps a autoclavao. Nos meios desidratados,

no necessrio o ajuste do pH, pois os meios j vm tamponados.
Determinar o pH atravs de um potencimetro ou por papel indi-

cador de pH.
Ajustar o pH com soluo de cido clordrico (HCl) 0,1N ou

soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 0,1N.
d) Distribuio dos meios

Distribuir os meios em recipientes, quimicamente limpos e no caso de
meios que no suportem nova autoclavao, usar recipientes estreis.
Ao distribuir em frascos de Erlenmeyers ou bales de fundo chato,
evitar ultrapassar 50% do volume total do frasco.
A distribuio em placas deve ser de aproximadamente 15mL; 6ml
em tubos para meio inclinado, 5ml para camada alta e 6ml para
caldos em geral.
A distribuio nos tubos deve ser feita com pipetas;
Codificar os meios conforme padro ou conveno do laboratrio;
e) Esterilizao dos meios
Com algumas excees, esterilizar os meios em autoclave a 121 C

durante 15 minutos.
f) Preparo de gar inclinado em tubos
Ao retirar os tubos contendo meio slido da autoclave, inclin-los

apoiando-os num suporte de madeira, permanecendo os mesmos
com aproximadamente 1cm de meio na base. Deixar solidificar
temperatura ambiente.
g) Plaqueamento de meio de cultivo

Fundir o meio slido em banho-maria, resfri-lo em banho dgua,
de modo a evitar ou diminuir a umidade que se condensa na tampa
da placa de Petri, quando o gar se solidifica.
Flambar a boca do recipiente que contm o meio, antes de
distribu-lo na placa.
Prximo chama do bico de Bunsen, verter o meio, levantando
parte da tampa da placa de Petri estril, o suficiente para permitir a
introduo da boca do tubo ou outro recipiente que contm o
meio, sem tocar as bordas da placa. Pode-se usar uma pipeta para
a distribuio.
Fechar a placa, moviment-la levemente sobre a bancada para
permitir uma distribuio uniforme, e deixar solidificar temperatu-
ra ambiente.
h) Armazenamento e conservao dos meios de cultura:

Para perodos de tempo prolongados, recomenda-se guardar os
tubos e frascos de Erlenmeyers contendo meio em temperatura de
12 a 15 C. Os meios contendo gar no devem ser guardados
abaixo de 0 C para no alterar seu gel.
Geralmente possvel sua conservao durante um ou dois meses
temperatura ambiente em locais secos, limpos e abrigados da luz;
Identificar todos os tubos, placas ou frascos que contenham meios
de cultura.
Para que no haja perda de gua do meio para o ambiente, os
recipientes devem ser bem vedados. No caso de placas de Petri,
seus bordos podero ser lacrados com parafilme.
Micologia | 431
Lista de meios de cultura mais utilizados em laboratrio de Micologia
gar extrato de arroz (Rice extract agar)

Meio desidratado 15g
gar 30g
gua destilada 1000mL
Suspender o p na gua e deixar embeber o gar durante trinta

minutos, fundir, distribuir e esterilizar em autoclave por quinze
minutos a 121 C.
gar Sabouraud glicosado (Sabouraud glycose agar)

Dextrose 30g
Peptona 10g
gar 30g
Misturar todos os elementos em balo, deixar embeber o gar

por trinta minutos, levar autoclave e aquecer lentamente 120
C. Agitar e ajustar o pH para 6,5. Esterilizar por quinze minu-
tos a 121 C.
Batata dextrose gar (Potato dextrose agar BDA)

Meio desidratado 39g
gar 5g
Suspender em gua e deixar embeber o gar por quinze minutos.

Aquecer at a dissoluo completa. Esterilizar em autoclave por
quinze minutos a 121 C.
Mycosel (Mycobiotic) agar

Farinha de soja digerida 10 g
Dextrose 10 g
Cicloheximida 0,4 g
Cloranfenicol 0,05 g
Agar 15 g
gua destilada 1000 mL
Misturar os reagentes. Esquentar agitando frequentemente at

dissolver todos os ingredientes. Autoclavar a 118C por quinze
minutos. No aquecer de forma excessiva. Para o meio desidrata-
do seguir o mesmo procedimento sem adio do gar.
Czapeck dox gar (CZ)

Sacarose 30 g
Nitrato de sdio 3g
Fosfato di-potssico 1g
Sulfato de magnsio 0,5 g
Cloreto de potssio 0,5 g
Sulfato ferroso 0,01g
gar 30 g
Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o gar e deixar embe-

ber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,3 antes de
esterilizar. Fundir o gar e esterilizar em autoclave por quinze
minutos a 121 C. Para o meio desidratado, seguir o mesmo
procedimento sem adio do gar.
gar infuso de crebro e corao (Brain Heart Infusion agar BHI)

Infuso de 200g de crebro de bezerro 7,7 g
Infuso de 250g de corao de vaca 9,8 g
Proteose Peptona 10 g
Micologia | 433
Dextrose 2g
Cloreto de sdio 5g
Fosfato dissdico 2,5 g
gar 20 g
Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o gar e deixar embe-

ber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,4 antes de
esterilizar. Fundir o gar e esterilizar em autoclave por quinze
minutos a 121 C. Para o meio desidratado seguir o mesmo
procedimento sem adio do gar.
gar dextrose farinha de milho (Corn meal agar CMA)

Farinha de milho 40 g
Dextrose 20 g
gar 20 g
Colocar a farinha em Becker com gua e aquecer em banho-maria

a 60 C por uma hora. Em seguida, filtrar em gaze dobrada duas
vezes. Restabelecer o volume inicial com gua destilada. Transferir
para balo que j contenha o gar e a dextrose pesados. Esterili-
zar em autoclave a 121 C por vinte minutos. Para o meio
desidratado usar o mesmo procedimento usado no BDA, porm
esterilizar a 121 C por vinte minutos.
OBS: Quando este meio utilizado para Mucoracea, trocar a
dextrose por glicose.
Extrato de malte gar (Malt extract agar MEA)

Extrato de malte 30 g
gar 30 g
Usar o mesmo procedimento do meio BDA, e ajustar o pH para
7,0.
Sabouraud
Glicose 30 g
Peptona 10 g
gar 20 g
Usar o mesmo procedimento do meio Sabouraud glicosado.
Meio seletivo para fungos entomopatognicos

Farinha de aveia 10 g
gar 10 g
Sulfato de estreptomicina 0,50 g
Dodine 0,45 g
Penicilina G 0,20 g
Cristal violeta 2,5 mg
* Soluo estoque de cristal violeta: 0,1g de cristal violeta em

200 ml de gua destilada.
*Soluo estoque de antibiticos: 4g de penicilina G e 10 g de
sulfato de estreptomicina em 40 mL de gua destilada.
Mistura-se aveia e gar em 490 mL de gua destilada; agita-

se vigorosamente aquecendo at a fervura, adiciona-se Dodine
e 5 mL da soluo estoque de cristal violeta enquanto estiver
quente, e autoclava-se por vinte minutos. Quando estiver na
temperatura de 50 a 55 C, adicionam-se 2 mL de soluo
estoque de antibiticos; agita-se bem e distribui-se imediata-
mente o meio em placas de Petri.
Micologia | 435
Farinha de aveia gar (Oatmeal gar OM)

Farinha de aveia 60 g
gar 12,5 g
Bater a farinha no liquidificador com um pouco da gua por um

minuto. Depois adicionar o gar e a gua e homogeneizar. Esteri-
lizar em autoclave a 121C por vinte minutos.
OBS: No utilizar o frasco de Erlenmeyer na medida exata do
meio, pois durante a autoclavao, o meio ferve e pode molhar a
rolha ou transbordar.
Extrato de levedura-peptona-glicose-gar (Yeast extract-peptone-

glucose-agar PYGA)
Peptona 5g
Extrato de levedura 5g
Glicose 20 g
gar 13 g
Seguir os mesmos procedimentos usados para Sabouraud glicosado.
MP-5 (meio seletivo para fungos aquticos)

Peptona 1g
Maltose 4g
gar 20 g
Seguir os mesmos procedimentos usados para o Sabouraud

glicosado
Observao:Todos os meios utilizados no laboratrio de Micologia podem
ser acrescidos com antibiticos (cloranfenicol, estreptomicina, etc.) para evitar
o crescimento de outros microrganismos.
Meio de cultura Fava Netto (para antgeno de P. brasiliensis)

Proteose peptona n0 3 (Difco) 3g
Peptona 10 g
Extrato de carne 5g
Cloreto de sdio 5g
Extrato de levedura 5g
Dextrose 40 g
gar 18 g
gua destilada qsp 1000 mL
Fundir o meio em banho maria fervente. Ajustar o pH entre 7,2

e 7,4. Autoclavar a 1200C durante vinte minutos.
Meio de cultura - Smith-Asparagina ( para histoplasmina)

L-Asparagina 7g
Cloreto de amnio 7g
Fosfato monocido de potssio 1,31 g
Citrato de sdio 0,9 g
Sulfato de magnsio heptahidratado 1,5 g
Citrato frrico 0,3 g
Glicose 10 g
Glicerina 25 g
gua destilada qsp 1000 mL
Dissolver a asparagina em cerca de 300 mL de gua destilada

aquecida a 500C. Dissolver os sais separadamente em 25 mL de
gua destilada, sendo que o citrato frrico dever ser dissolvido
em gua quente. Misturar as solues dos sais com a soluo de
asparagina. Homogeneizar. Acrescentar a glicose e a glicerina.
Completar o volume com gua destilada. Homogeneizar. Distri-
buir o meio, pores de 200 mL, em bales de 500 mL.
Autoclavar a 1200C durante vinte minutos
Micologia | 437
Meio de Cultura Negroni (Filtrado de cultura de P. brasiliensis)

Dissolver 60 g de neopeptona em 120 mL de gua destilada
aquecida a 45C.
Colocar a soluo de neopeptona em tubos para dilise (mem-
branas de celofane) e dialisar contra gua destilada (cerca de 2
litros) durante cinco horas a 70C, e por uma noite em geladeira
a 4C.
Retirar o contedo do tubo de dilise e completar o volume
com gua destilada para 1.800 mL. Adicionar 36g de glicose,
0,18 g de tiamina e 0,36 g de asparagina.
Homogeneizar e acertar o pH, que deve ser entre 6.8 e 7.0;
Distribuir o meio, pores de 150 mL em frascos Erlenmeyer
ou bales de 300 mL de capacidade.
Autoclavar a 120C durante 15 minutos.
Observao: Todos os meios utilizados no laboratrio de Micologia podem

ser acrescidos com antibiticos (cloranfenicol, estreptomicina, etc), para evitar
o crescimento de outros microrganismos.
4.2. Corantes
A colorao um meio utilizado em laboratrios de Micologia com o
objetivo de visualizar estruturas vegetativas e reprodutivas dos fungos, as for-
mas de leveduras, e realizar testes de viabilidade. As solues utilizadas so:
a) Soluo de hidrxido de potssio KOH (soluo clarificante)

Concentraes:
40% - unhas (fneros).
30% - pelos e pele.
10% - pele tenra de criana.
6% - para exame de escarro.
5% - para estudo de Basiodiomycotina e outros fungos.
Frmula (para soluo 30%):

KOH em lentilhas 30 g
gua destilada 70 mL
Preparo:
Dissolver os dois ingredientes em movimentos giratrios, at a total
dissoluo dos componentes.
A soluo deve ficar transparente.
Armazenar em vidro escuro.
b) Lactofenol de Amann com azul de algodo

Usado para tornar mais distintas as estruturas hialinas dos fungos (corante
citoplasmtico)
Frmula:
cido fnico 20 g
cido ltico 20 g
Glicerina 40 g
gua destilada 20 mL
Azul de Poirrierblau 0,05 g
Preparo:
Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor.
Depois adicionar 0,05g de azul de Poirrierblau.
Esperar 24 horas e filtrar.
Observao: Para estudar as estruturas de fungos demceos (negros) pode-se

utilizar Lactofenol de Amann sem adio de azul de algodo.
Micologia | 439
c) Acridine Orange
Corante vital usado para teste de viabilidade que distingue clulas vivas
e mortas, onde as clulas vivas adquirem colorao laranja, e as clulas
mortas, colorao verde.
Frmula:
Acridine orange 0,02 g
PBS pH 7,7 100 mL
Preparo:
Dissolver os dois ingredientes e agitar.
d) Verde janus B
Usado na diferenciao de clulas vivas e mortas. As clulas vivas per-
manecem incolor, enquanto as clulas mortas adquirem colorao azul.
Frmula:
Verde-janus B 0,05 g
Preparo:
Dissolver os dois ingredientes e agitar.
e) Reagente de Melzer
Usado para deteco de reao amiloide ou dextrinoide de esporos,
ascas e tecidos himeniais de Ascomycotina e Basidiomycotina, na qual
uma colorao azulada determina uma reao amiloide e uma marrom
determina uma reao dextrinoide.
Frmula:
Iodo 0,5 g
Potssio iodado 1,5 g
Hidrato de cloro 20 g
gua destilada 20 mL
Preparo:
Dissolver os ingredientes e agitar.
f) Floxina B
Usada para o estudo do citoplasma de Basiodiomycotina.
Frmula:
Floxina B 10 g
Glicerina 75 mL
Preparo:
Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor.
g) Glicerina 10%
Preserva a colorao original do fungo estudado.
Frmula:
Glicerina 10 mL
gua 90 mL
Preparo:
Misturar os ingredientes com leve agitao.
Micologia | 441
5. Tcnicas micolgicas
5.1. Diluio seriada

A diluio seriada uma tcnica simples que pode ser usada para vrios
propsitos, como: separao de duas cepas fngicas que estejam misturadas
em um tubo ou placa (contaminao no tubo ou na placa), contagem de
colnias em amostras, isolamento de fungos de substratos lquidos (anlise de
gua, leite, etc) e de solo, alm da determinao da quantidade e qualidade
de um inculo para processos fermentativos ou inculos lquidos.
a) Preparo da amostra
Separao de duas cepas de fungos
Fazer uma raspagem com a ala em L na placa ou no tubo onde se
encontram as duas cepas a serem separadas no caso de separao de
duas cepas de fungos.
Este raspado deve ser colocado em um tubo com 10mL de soluo
salina a 0,85% e homogeneizar.
Isolamento de fungos de substratos lquidos

Colocar 2 mL da amostra lquida (gua, leite, etc) em um tubo com
10 mL de soluo salina a 0,85% e homogeneizar.
Isolamento de fungos de solo

Colocar 1g do solo a ser analisado em um tubo com 10 mL de
soluo salina a 0,85% e homogeneizar.
b) Diluio da amostra
Utilizando uma srie de dez tubos com 9 mL de salina, colocar no
primeiro tubo 1ml da suspenso homogeinizada do primeiro tubo (deve-
se usar uma pipeta para cada transferncia); homogeneizar e transferir
1mL para o segundo tubo; homogeneizar novamente e transferir 1mL

para o terceiro tubo. Repetir este procedimento at o ltimo tubo
c) Semeadura nos meios de cultura

Preparar uma placa de Petri com o meio de cultura escolhido para
cada tubo de diluio.
Todas as placas devem ser marcadas com as respectivas diluies.
Retirar 0,1mL ou 1mL ( escolha) de cada uma das diluies e
transferir para a placa de Petri com a pipeta (deve-se usar uma pipeta
para cada diluio) e espalhar na placa com o auxilio da ala de
Drigalski.
Incubar as placas por, no mnimo, sete dias na estufa a 250C.
Aps o perodo de incubao, observar as placas e fazer a contagem
das colnias ou no caso de separao das cepas fngicas, observar as
placas e retirar a colnia desejada com a ala em L.
d) Observao dos resultados Contagem

A contagem de colnias feita a partir da observao das placas e
contagem manual das colnias crescidas e quantificao da diluio origi-
nal, ou seja, quantos condios ou esporos haviam na sua suspenso
original. O nmero de condios presentes na suspenso original ser
igual ao nmero de colnias multiplicado pelo fator de diluio.
Ex: Se na diluio 10-4 obtivemos cinquenta colnias com inculo de
1mL, a concentrao original ser de 50 x 104 = 5 x 105 condios/mL.
Se na diluio 10-6 obtivermos 135 colnias com um inculo de 0,1ml,
a concentrao original ser de 135 x 106 x 10 = 135 x 107 =
1,35 x 109 condios/mL.
Observao: Para a contagem de condios ou esporos em uma soluo tambm

podemos usar a Cmara de Neubauer
Micologia | 443
5.2. Tcnicas de semeadura e microscopia
5.2.1.Semeadura de fungos
Inoculao em placas
As tcnicas usadas para inocular fungos em placas so fundamental-
mente efetuadas para obter culturas axnicas (culturas puras) e so bem desen-
volvidas, j que a identificao de fungos filamentosos baseia-se principalmente
nas caractersticas morfolgicas.
Procedimento:
Flambar a ala ao rubro e esfriar.
No caso de a amostra estar em tubo:
remover a tampa de rosca ou tampo de algodo do tubo

que contm a cepa, com o dedo mnimo da mo direita,
segurando o tubo com a mo esquerda;
flambar a boca do tubo, imediatamente antes e depois da

inoculao;
No caso de a amostra tambm estar em placa:
tomar a placa com a mo esquerda, de modo que a base da

placa fique segura e a tampa possa ser manipulada num movi-
mento de abrir e fechar, com os dedos polegar e indicador;
proceder a uma rpida flambagem na placa toda vez que esta

tenha que ser aberta;
manipular a placa na altura da chama do bico de Bunsen;

introduzir a ala ou agulha no tubo ou placa de Petri com amostra,

e retirar uma quantidade suficiente do inculo;
tomar uma placa, abrir conforme exposto anteriormente e inocular

no centro da placa ou conforme especificaes em trs pontos
eqidistantes.
Incubao das placas:
incubar as placas, invertidas em estufa ou temperatura

ambiente, para evitar que, durante a incubao, a gua de
condensao da superfcie do gar, provoque crescimento
confluente do organismo, impedindo a formao de colnias
isoladas.
obedecer aos requisitos fisiolgicos de crescimento do mi-

crorganismo, tais como temperatura ideal de incubao, ilumi-
nao, tempo de incubao, etc.
Inoculao em tubos ou frascos de Erlenmeyers
A inoculao em tubos ou frascos de Erlenmeyers pode ser feita em

meios slidos e lquidos. Apresentam inmeras finalidades de uso. Em todos
os casos, tomam-se medidas asspticas durante a inoculao.
a) Meio lquido para meio lquido
Quando a cultura estiver em meio lquido e se pretende repic-la para

um tubo contendo meio lquido, deve-se usar uma ala de platina ou
nquel-cromo em forma de gota, observando-se as condies de assepsia.
Micologia | 445
b) Meio lquido para meio slido
Tomar com uma ala em forma de gota um inculo da amostra em

meio lquido.
Introduzir a ala sobre a superfcie do gar inclinado, at a base do

mesmo.
Fazer estrias ou um esfregao em direo boca do tubo, sobre a

superfcie inclinada at da sua extenso. A superfcie inclinada do
gar deve ficar voltada para cima, com a mo do operador por baixo do
tubo, de modo que a superfcie inclinada possa ser vista sem obstculo.
c) Meio slido para meio lquido
Introduzir a agulha ou ala em forma de L estril no tubo que contm

a cultura em gar inclinado e tomar uma pequena quantidade do inculo.
Evite carrear pedaos ou fragmentos do meio com o inculo.
Imergir o inculo no meio lquido, agitar a agulha suavemente contra a

parede do tubo para ressuspender o inculo.
Homogeneizar o meio sob leve agitao.
d) Meio slido para meio slido
Tomar com uma agulha ou ala em forma de L o inculo no meio

slido.
Introduzir a agulha sobre a superfcie do gar inclinado, at a sua base.
Fazer estrias ou um esfregao em direo boca do tubo, sobre a

superfcie inclinada, at aproximadamente da sua extenso. O proce-
dimento o mesmo da inoculao de meio lquido para o meio slido.
Incubao dos tubos:
preferencialmente todos os tubos com meio slido

devem ficar em posio vertical em estantes ou outros
tipos de suporte.
6.2.2. Microscopia
Exame direto de um pedao da colnia
Com a ala de platina em forma de L ou agulha esterilizada, cortar um

pedao da colnia e coloc-lo sobre uma lmina. No se deve raspar a
superfcie da colnia, porque apenas os condios sero retirados. Desta forma,
em muitos casos possvel identificar o fungo.
Colocar uma gota do corante lactofenol de Amann com azul de
algodo ou outro corante desejado sobre o pedao da colnia. Se o fungo
for muito escuro, substituir o corante por uma soluo clarificante ou uma
gota de gua.
Cobrir a preparao com uma lamnula, comprimindo-a com o cabo
do bisturi ou do estilete. Examinar ao microscpio, com objetivas de 10X,
40X e 100X.
Tcnica de cultivo em lmina
Na maioria das vezes, necessrio obter preparaes onde as estruturas

do fungo so observadas por inteiro. Isto porque h muitos gneros cujos
esporos ou condios por si s no so caractersticos. Neste caso, as estruturas
responsveis pela formao e sustentao dos condios ou esporos necessitam
ser observadas por completo. Isto nem sempre possvel com a tcnica de
exame direto, havendo necessidade de se fazer o cultivo na prpria lmina.
Com isto, obtm-se os fungos com suas estruturas intactas.
Micologia | 447
Procedimento:
Vazar em placa de Petri uma camada fina do meio de cultura adequado

para cada gnero ou espcie de fungos a ser examinado.
Aps a solidificao do meio, com o auxlio de um bisturi, cortar
fragmentos de 0,5 cm2.
Montar uma placa de 15 cm de dimetro e cobrir o fundo com papel
de filtro e colocar sobre este um basto em forma de U, duas lminas
e duas lamnulas.
Aps a esterilizao, colocar o quadrado de meio sobre cada lmina;
Inocular nos quatro lados do quadrado do meio de cultura, fragmentos
miceliais e/ou esporos.
Colocar sobre o meio de cultura a lamnula.
Molhar o papel de filtro com gua destilada estril formando uma
cmara mida.
Deixar em temperatura ambiente, por aproximadamente uma semana
ou mais dependendo do fungo estudado.
Observar crescimento e esporulao.
Fixar pelo formol por 24 horas.
Montar lminas e lamnulas com corante e observar em microscpio
tico com objetivas de 10x, 40x e 100x.
Tcnica da fita adesiva
Esta tcnica d excelentes resultados quando o fungo est sendo cultiva-

do em placa de Petri. Na maioria das vezes, suas estruturas aparecero inteiras,
como no cultivo em lmina.
Procedimento:
Cortar um pedao de fita adesiva um pouco menor do que a lmina e

coloc-lo sobre a colnia, com a cola para baixo.
Comprimir com a ala de platina em forma de L para que o fungo cole

na fita.
Colar a fita sobre o corante na lmina.
Observar ao microscpio tico com objetivas de 10X, 40X e 100X.
Cultivo sob lamnula
O objetivo desta tcnica a observao das microestruturas vegetativas

e reprodutivas do fungo mais intactas.
Procedimento:
Inocular em uma placa de Petri, contendo 20 mL de meio de cultura

especfico para o gnero a ser identificado, fragmentos do fungo em trs
pontos equidistantes entre si, e sobre cada um destes colocar uma
lamnula de 24x32mm, previamente flambadas em bico de Bunsen.
Aps sete dias de crescimento, as lamnulas sobre os pontos de

inculo devem ser retiradas do interior da placa, com auxlio de uma
pina, previamente flambada. As lamnulas devem ser colocadas inverti-
das sobre lminas contendo uma gota de Lactofenol de Amann com
azul de algodo.
Observar ao microscpio ptico com objetivas de 10X, 40X e 100X.

Micologia | 449
Tcnicas para estudo de Ascomycotina
Procedimento:
O uso de um microscpio estereoscpico (lupa) indispensvel para

o exame do material.
Seces verticais no corpo frutfero do fungo estudado podero ser

feitas com auxlio de uma gilete ou bisturi.
A maioria das lminas para posterior observao ao microscpio ptico

montada normalmente em gua para medio dos ascosporos e obser-
vao de sua colorao, o reagente de Melzer s tambm devendo ser
usado para o estudo dos anis apicais das ascas.
O estudo destes fungos em meio de cultura tambm deve ser feito

para que se conhea o seu anamorfo. Isto poder ser feito atravs da
tcnica de isolamento de ascoporos (single ascospore isolation).
Tcnica para estudo de Basidiomycotina
O material montado em KOH a 5%.

O reagente de Melzers tambm usado para os esporos de fungos
Agaricceos.
Impresso de esporos:
Uma das mais importantes caractersticas que permite o agrupamento dos

gneros em sees a colorao dos basidisporos em massa, ou seja, a
impresso de esporos.
Procedimento:
Selecionar um corpo frutfero fresco e maduro e cortar sua haste junto

ao pleo.
Colocar o pleo sobre uma folha de papel de duas cores (preta e

branca) com as lminas ou poros para baixo.
Cobrir o pleo e o papel com papel encerado, cristalizador ou com

uma campnula. Se o corpo frutfero do fungo estiver em boas condi-
es, a impresso de seus esporos poder ser obtida em uma hora.
5.3. Coleta e isolamento de fungos ambientais

Observaes quanto ao complexo fungo-substrato so de grande valia
por ocasio de qualquer coleta. Deve-se notar que as estruturas mais visveis de
um fungo no representam, necessariamente, o seu todo. Alm disso, grande
parte de seus ciclos ou remanescentes estruturais podero estar perdidos no
interior do substrato. Desta forma, conclui-se que a amostra que se coleta de
um fungo, na verdade no passa de um momento do seu ciclo biolgico.
As partes mais evidentes, nos fungos, representam em geral, aquelas
que mais resistem ao manuseio e ao tratamento para secagem. As condies
ideais para o estudo dos fungos residem no isolamento dos organismos a partir
de diferentes substratos, e nos diversos ambientes em que os fungos ocorrem:
solo, ar, gua ou mesmo na vegetao.
Independente do espcime a ser coletado, alguns materiais gerais de-
vem ser providenciados para as coletas:
* altmetro * fsforo ou isqueiro
* jornal * caderneta de campo
* lupa de mo * lpis
* mochila ou cesta * mquina fotogrfica
* canivete ou esptula * papel indicador de pH
* faca afiada * saco plstico
* fita crepe * saco de papel
* fita mtrica ou trena
Micologia | 451
A. Solo
Considera-se o solo um mosaico de micro-habitats devido a sua grande
complexidade, longe de ser um simples amontoado de matria inorgnica sem
vida. Ao contrrio, o solo costuma ser rico em microbiota e mesofauna, o que
fora o pesquisador a usar tcnica ou substncias especiais quando pretende
isolar um grupo definido.
O mtodo de diluio o mais usado para se estudar a incidncia de
fungos em solos. O material, ao ser coletado, deve ser colocado em latas
esterilizadas ou em sacos plsticos. As amostras destinadas anlise devem ser
manipuladas com o auxlio de uma esptula ou colher, parcialmente esterilizadas
com algodo embebidos em lcool ou com auxlio de uma lamparina. De
preferncia, o perodo entre a coleta de material e as diluies, no deve
ultrapassar quatro horas.
Procedimento:
Tomam-se 10g de cada amostra de solo e coloca-se em frascos de

Erlenmeyer contendo 90 mL de soluo salina esterilizada. Agitar
vigorosamente (soluo 1:10 - mesmo princpio da diluio seriada
porm em maiores propores).
Desta suspenso, pipeta-se 1mL e adiciona-se a tubo contendo 9 mL
de soluo salina esterilizada, aps agitao (soluo 1:100).
Retira-se ento outro 1mL desta ltima soluo e coloca-se em um

novo tubo contendo tambm 9 mL de soluo salina esterilizada, sem-
pre aps agitao (soluo 1:1000).
Por fim, se necessrio, a mesma operao anterior pode ser repetida, e

uma alquota de 1 ou 0,1mL plaqueada em um meio de cultura apropriado.
Em geral, usa-se gar Sabouraud acrescido de antibitico (cloranfenicol,
estreptomicina ou penicilina).
Aps sete dias, faz-se o isolamento dos fungos, repicando-se as

colnias para tubos de ensaio contendo meio slido.
Aps o desenvolvimento das colnias, procede-se identificao

genrica-especfica dos fungos.
A coleta de substratos orgnicos, como folhas, frutos, razes e troncos

em diferentes estdios de decomposio tambm interessante. Estercos de
herbvoros devem ser coletados frescos, com uma esptula grande e acondici-
onados em sacos plsticos.
Importante lembrar que as regras de assepsia parcial e etiquetagem (local
de coleta, data, condies ambientais e substrato) so idnticas para qualquer
coleta, e devem receber ateno especial.
O mtodo da placa de solo consiste em se colocar, com uma esptula,
quantidades pequenas de solo em uma placa esterilizada, evitando os tor-
res de terra. Verter ento o meio de cultura com antibitico (sugere-se a
utilizao do meio de MARTIN, com rosa-bengala e sulfato de
streptomicina) e deixar solidificar.
Para o isolamento de fungos de substratos orgnicos pode-se utilizar o
mtodo de presso de folhas. Este consiste em se pressionar com uma pina
uma folha sobre a superfcie do meio de cultura com antibitico, retirando-a
em seguida. A placa, ento, deixada temperatura ambiente, observando-se
diariamente o crescimento das colnias.
Outra opo seria plaquear amostras de substratos (folhas, galhos, inse-
tos, etc), cortadas com bisturi em pequenos pedaos. Deposita-se de uma a
trs amostras equidistantes sobre o gar, umedecendo-as levemente com gua
esterilizada. Se a amostra for de insetos muito pequenos, coloc-los intactos.
Micologia | 453
B. Fungos macroscpicos
Existe uma variao muito grande de fungos macroscpicos, de con-

sistncia diferente. Alguns se decompem logo aps serem coletados,
outros so mais resistentes. De qualquer modo, cuidado e bomsenso tor-
nam-se necessrios para o sucesso de uma coleta. Os materiais comumente
usados so:
Cristalizador.
Folha de papel dupla face (branca/preta), para coleta de esporos.
Frascos de vidro escuros com fixador lcool a 5%.
Papel de filtro ou algodo.
No caso de o substrato ser esterco de herbvoros, preparar um cristalizador
contendo papel de filtro embebido em gua e glicerina (para no ressecar
rapidamente), antes de introduzi-lo no recipiente. Tampar, ento, deixando o
conjunto temperatura ambiente e ao abrigo do sol, porm com iluminao.
Impedir o ataque de inseto ou outros artrpodes e observar o crescimento
macroscpico dos fungos.
Nas coletas, deve-se retirar o material por inteiro com o auxlio de uma
faca ou esptula, cuidadosamente, para evitar quebra ou esfarelamento. Se
possvel, trazer parte do substrato junto. Aconselha-se no misturar materiais
diferentes em um mesmo saco a fim de evitar a mistura de esporos. Ao
transport-los para outro lugar, acomod-los na mochila ou cesta, protegendo-
as com folhas de jornal. Amostras delicadas podem ser coladas no fundo de
uma caixa de fsforos. Durante as coletas, anotaes sobre cor, textura e
tamanho do material coletado devem ser feitas, pois na maioria dos casos os
fungos tm suas caractersticas alteradas depois de secos.
C. Ar atmosfrico
O ar representa um repositrio natural, sob a forma de esporos, dos

mais diversos tipos e grupos de fungos. O isolamento depende do local, do
tempo de exposio e do substrato empregado. A coleta de ar pode ser
realizada de duas formas:
1. Com um amostrador de ar por impactao - Nestes amostradores

h um compartimento onde colocada uma placa de Petri com o
meio de cultura escolhido e quando o amostrador ligado, a placa
recebe todo o ar puxado em um volume determinado por dez minu-
tos. Ao trmino, essas placas so incubadas a 250C por sete dias.
As colnias so contadas e repicadas para tubo de ensaio e deve-se
ento proceder identificao dos fungos isolados.
2. Expondo as placas de Petri com meio de cultura escolhido, por

cinco, dez ou quinze minutos ao ar atmosfrico no ambiente selecio-
nado, incubando em seguida a 250C por sete dias. Repicar as
colnias para tubo de ensaio e proceder identificao dos fungos
isolados.
D. gua
Fungos aquticos
Em ambientes aquticos, encontramos tanto fungos zoospricos como
tetraradiados (no zoospricos). Os primeiros so realmente adaptados ao
ambiente aqutico, pois possuem esporos flagelados mveis. O segundo
grupo, sem flagelos, apresenta esporos de forma radiada, com trs ou qua-
tro braos partindo de um mesmo ponto, ou ainda sigmides ou ovalados.
Esta morfologia concede maior facilidade de flutuao, disperso e aderncia
ao substrato.
Micologia | 455
Os fungos aquticos podem tambm ser encontrados no solo, graas

formao de estruturas de resistncia que lhe permitem sobreviver at que
condies de umidade favorveis se estabeleam. Para observao destes fun-
gos, torna-se necessria a coleta de amostras de gua e solo, s quais adicio-
nam-se iscas especiais. Assim, o material para a iscagem :
cido clordrico a 1%.
Frasco de 100ml, de boca larga e tampa.
Hidrxido de potssio a 2%.
Hipoclorito de sdio a 10%.
Iscas como: asa de insetos, celofane, ecdise de cobra, exoesqueleto
de camaro, folha de gramnea descorada ou fervida, frutos (ma,
jabuticaba, etc), gro de plen do Pinus, gravetos e sementes (cnha-
mo, Crotalaria sp.).
Papel alumnio.
Papel encerado.
Saco de tela de nilon ou lata.
A iscagem pode ser realizada no campo ou no laboratrio. importante
salientar que a transparncia do material ir determinar sua eficincia como isca.
De preferncia, os frascos devem ser esterilizados. Para fins taxionmicos, este
requisito passa a ser obrigatrio.
No momento da coleta da gua, juntar ao pote gravetos ou folhas que
estiverem nas proximidades. Uma vez no laboratrio, transferir uma parte do
coletado para placas de Petri esterilizadas, adicionar as iscas e deixar tempe-
ratura ambiente. Com o desenvolvimento das colnias, entre 48 e 72 horas,
procede-se ao isolamento da cultura pura, utilizando o meio MP-5.
Aps o crescimento em meio slido, retirar um pequeno quadrado de
1x1cm da parte mais perifrica da colnia, colocando-o em uma placa esterili-
zada com gua destilada estril e duas a trs metades de sementes de cnha-
mo. Decorridas 48 horas, o material deve estar pronto para ser observado
diretamente ou montado em lmina.
Todos os substratos que portarem crescimento micelial devem ser sepa-
rados, lavados em gua destilada e recolocados em placas contendo novas
amostras do mesmo substrato com gua destilada esterilizada renovada. Em
lmina, pode-se observar os flagelos colocando-se uma a duas gotas de Karo
na montagem, a fim de diminuir a mobilidade dos zosporos.
Para as espcies que dificilmente ocorrem neste tipo de iscagem, reco-
menda-se a submerso de frutos, gravetos ou folhas dentro de latas perfuradas
ou bolsas de nilon. Estas devem ser amarradas com fio plstico e, de prefe-
rncia, protegidas da observao pblica. Aps duas ou trs semanas, este
material deve ser retirado e lavado em gua corrente por cerca de trinta minu-
tos, para a remoo de detritos, bactrias, protozorios e pequenos
invertebrados. Se os fungos estiverem presentes, pstulas esbranquiadas apa-
recero na epiderme do fruto, as quais devero ser observadas.
5.4. Preservao de fungos

Culturas microbianas so extremamente vulnerveis e podem se contami-
nar, mutar ou morrer. Muitas vezes, culturas so insubstituveis, e sua perda
pode ser muito grave. Outras vezes ela pode ser reisolada ou adquirida de
uma coleo de culturas. Em qualquer um dos casos, tempo, informao e
dinheiro so desperdiados, mas isto pode ser evitado ou minimizado com um
sistema eficiente de preservao de linhagens. Esta uma das funes mais
importantes de uma coleo de culturas. A preocupao central a preserva-
o de linhagens com suas caractersticas originais durante um longo perodo de
tempo. Novas espcies, mutantes, organismos portadores de plasmdeos e
linhagens produzidas por engenharia gentica devem ser preservadas, de forma
Micologia | 457
a manter as suas propriedades. Assim, essencial que colees de culturas

executem pesquisas no intuito de definir tcnicas de preservao apropriadas.
importante frisar que no existe nenhum mtodo universal para uma preserva-
o adequada a todos os microrganismos. Grupos taxonmicos de microrga-
nismos, e at linhagens dentro da mesma espcie, variam quanto a sua resposta
aos diferentes mtodos de preservao.
Mtodos de preservao
Estes mtodos tm como objetivo manter as culturas num estado vivel

sem mudana morfolgica, fisiolgica ou gentica. Para se obter um bom
resultado na aplicao de um mtodo de preservao, a cultura deve estar em
timas condies, deve-se respeitar as condies timas de crescimento, tem-
peratura, umidade, aerao, iluminao e meio de cultivo.
A. Repique
gar
O mtodo mais tradicional de preservao de culturas atravs da
transferncia peridica da cultura (repique) para um novo meio de cultivo
slido ou lquido. O intervalo entre cada transferncia varia com o microrganis-
mo, o meio de cultivo empregado e as condies ambientais.
A maioria dos fungos pode crescer em BDA ou EM, contudo, alguns
tm requerimentos especiais de crescimento. O perodo de tempo entre as
transferncias varia de fungo para fungo. Para alguns, a cada duas ou quatro
semanas, a maioria a cada dois a quatro meses, enquanto outros podem
sobreviver 12 meses sem transferncia. Trs condies devem ser determinadas
quando se usa este mtodo para preservao de microrganismos:
Meio adequado para manter as culturas.
Temperatura ideal de estocagem.
Frequncia entre as transferncias.
Preservao sob leo mineral

Muitas espcies de fungos podem ser preservadas por meses ou anos
atravs de um mtodo relativamente fcil e simples, que o de imerso em
leo mineral. O leo deve ser esterilizado por aquecimento em um forno
Pasteur a 170C por uma ou duas horas ou autoclavagem dupla por quinze
minutos a 121C.
Deixar crescer a cultura em meio apropriado. O repique pode ser feito
em gar inclinado ou no.
Aps um crescimento adequado, colocar assepticamente o leo mineral
estril sobre a superfcie da cultura a uma altura aproximada de 1 a 2cm
(quando a cultura estiver em gar inclinado, cobre-se completamente a super-
fcie). Isto impede a desidratao e reduz a atividade metablica, assim como a
velocidade de crescimento do microrganismo, devido reduo da tenso do
oxignio.
Guardar as culturas com leo mineral na posio vertical. Fazer testes de
viabilidade periodicamente para determinar se a cultura est deteriorando.
Blocos de gar em gua

O mtodo consiste em cultivar o microrganismo em uma placa de Petri
contendo um meio de gar apropriado. Aps o crescimento vigoroso o gar
cortado com uma lmina estril em blocos de aproximadamente 4 a 6 mm. No
caso de fungos, a partir do final do crescimento das colnias, um nmero
apropriado de cubos transferido assepticamente para tubos ou frascos con-
Micologia | 459
tendo 10 a 15 mL de gua destilada estril. Para reativao, basta retirar

assepticamente um dos cubos e deposit-los sobre um meio adequado, a sua
aplicao fica restrita a microrganismos que tenham grande aderncia ao gar,
como no caso de fungos filamentosos e algumas leveduras.
B. Secagem
Secagem em areia, solo e slica-gel

Tambm considerada como um bom mtodo de conservao de
microrganismos. Pode ser uma simples secagem de esporos ou secagem
sob vrias condies, como, por exemplo, em secador com ou sem vcuo.
Para tanto, emprega-se a seguinte linha de trabalho: Preparar o tubo
para estocagem (pode ser de tampa rosquivel ou frascos de penicilina),
enchendo-o at com gel (slica-gel purificada, sem indicador, 6-22
mesh), depois esterilizar no mnimo durante trs horas a 180C (calor
seco), e colocar em atmosfera seca para seguir em banho de gelo overnight.
Fazer uma suspenso de esporos em leite frio desnatado (5%). Derramar a
suspenso fria sobre a slica gelada e depois levar para um banho de gelo,
pelo menos durante quinze minutos.
Deixar os gis temperatura ambiente (25 a 30C) dentro de
dessecadores at que, com a agitao, os cristais sejam separados (cerca
de uma a duas semanas ou dois a trs dias para fungos de crescimento
rpido). Armazenar os tubos em dissecadores em sala fria ou recipientes
com slica em geladeira (4C), embora bons resultados possam ser obtidos
Armazenamento em solo estril

A preservao de fungos em solo estril, pode ser feita de duas maneiras:
pela inoculao de uma suspenso de esporos;
pela inoculao de esporos secos em solo seco ou em substrato

similar, com subseqente estocagem do material seco.
O mtodo de estocagem em solo empregado consiste em inocular 5g
de solo (20% de umidade e esterilizado pelo menos duas vezes a 121C
por quinze minutos) com 1mL de suspenso de esporos em gua, com
subsequente crescimento durante cerca de dez dias temperatura ambiente. O
armazenamento dever ser feito de preferncia em refrigerador a 5C.
C. Liofilizao (freeze-drying)
A liofilizao, ou freeze-drying um dos mtodos mais econmicos e
eficientes de preservao a longo prazo. O mtodo permite a produo de
grande nmero de liofilizado porque o uso de ampolas pequenas facilitam a
estocagem. Enquanto o procedimento da liofilizao relativamente simples, o
aspecto terico bastante complexo, pois a liofilizao envolve a remoo de
gua de uma suspenso de microrganismos congelados por sublimao sob
presso reduzida, isto , a gua evaporada sem passar pela fase lquida
(passagem do estado slido para o estado gasoso).
As clulas secas podem ser estocadas por longo perodo, se mantidas
longe de oxignio, umidade e luz. Elas podem a qualquer hora ser facilmente
re-hidratadas e ativadas.
A liofilizao pode ser realizada de vrias maneiras, pois vrios tipos de
aparelhos foram desenvolvidos para este fim.
No caso dos fungos, importante lembrar que o sucesso da liofilizao
varia entre linhagens de mesma espcie; em geral, aqueles que crescem e
Micologia | 461
esporulam bem em cultura sobrevivem ao processo, enquanto que isolados em

estado deteriorado ou debilitado no resistem liofilizao.
Requisitos bsicos para liofilizao

Meio de suspenso externo para congelamento (lcool metlico ou
etlico + gelo seco).
Gerador e mantenedor de vcuo (bomba).
Absorvente do vapor de gua (dissecante - condensador - lquido
refrigerante).
Parmetros de liofilizao
Tipo de clula; crescimento e idade da cultura; concentrao celular; meio de
suspenso (crioprotetores); velocidade de resfriamento; mtodo de seca-
gem; condio de estocagem; mtodo de constituio e mtodos de anlise
(medidas de viabilidade, injria, morte e outros parmetros).
Crioprotetores
Materiais proteicos, carboidratos; aminocidos; leite desnatado e
outros.
Meios de suspenso:
Leite desnatado 10%; leite desnatado 10% + inositol 5%.
Sacarose 7% + peptona 7%; inositol 5% em soro de sangue de
cavalo e outros.
Mtodo de liofilizao:
Pr-congelamento + vcuo (umidade residual 1% a 2%);
Centrifugao + vcuo
Secagem primria: umidade residual 5% a 10%.
Secagem secundria: umidade residual 1% a 2%.
Congelamento:
A preservao das caractersticas de microrganismos armazenados em um
freezer com faixa de temperatura de 0 a -20C produz resultados
diversos, sendo que seu sucesso depende da espcie de fungo.
Parmetro de congelamento:
Escolha do tipo de refrigerador, escolha de ampolas e frascos, agentes
crioprotetores, culturas e preparao de suspenso, velocidade de
resfriamento, estocagem e velocidade de descongelamento.
Pr-resfriamento para congelamento:

Freezer (velocidade de resfriamento, vr = 1C/min.).
Gelo seco (vr = 7C/min).
Fase vapor de nitrognio (vr = 18oC/min).
Congelamento direto:
Fase lquida de nitrognio (vr = 200 C).
D. Armazenamento em nitrognio lquido

Utiliza-se o nitrognio lquido para se conseguir temperaturas ultrabaixas.
Isso tem sido satisfatrio para grande nmero de clulas vivas.
O mtodo apresenta certas desvantagens: a aparelhagem requerida
mais cara que a usada para secagem ou congelamento; h necessidade de
condies bem controladas de congelamento e degelo, e ainda h o risco de
exploso de ampolas. Tambm um mtodo menos interessante que a seca-
gem, quando se usa o armazenamento para distribuio de culturas.
A estocagem a temperaturas ultrabaixas reduz as trocas fsicas e
qumicas e um bom mtodo para ser usado quando as culturas so de
difcil liofilizao.
Micologia | 463
Nos fungos, faz-se uma suspenso de esporos em glicerol 10% e

alquotas de 0,5mL so distribudas em ampolas de vidro-borosilicato ou
criotubos de 1mLe marcadas com o nmero da cultura usando tinta perma-
nente. As ampolas so seladas com maarico (quando criotubos, as tampas
so bem fechadas) e colocadas num banho com corante em refrigerador de 4
a 8C por trinta minutos para pr-resfriamento. Este procedimento permite
que o glicerol penetre e envolva o organismo. O corante indica qualquer falha
no selamento das ampolas ou criotubos, caso o contedo fique colorido.
Tal procedimento seguido pelo congelamento das ampolas a -35C
por quarenta a sessenta minutos, e as ampolas so ento colocadas no nitrog-
nio lquido e congeladas rapidamente a -196C. A reativao feita colocan-
do-se as ampolas rapidamente em banho de gua a 37C at os cristais de
gelo derreterem. As ampolas ento so abertas e o contedo dispensado em
meio de cultura adequado ao crescimento.
Para se fazer o controle da viabilidade e pureza das culturas congeladas,
a reativao deve ser feita aps trs a quatro dias de estocagem no nitrognio
lquido.
E. Mtodo do papel de filtro (preservao de fungos

entomopatognicos)
Procedimento:
Tiras de papel de filtro previamente esterilizadas (estufa 105C por
24h), so distribudas sobre o meio BDA (batata dextrose gar), em
placas de Petri, pouco antes de endurecer.
Culturas fngicas so transferidas para estas placas e incubadas por
oito dias (dependendo do isolado) a 28C.
As tiras de papel apresentando estruturas fngicas so retiradas das
placas e transferidas para placas de Petri, para ento serem mantidas em
dessecador contendo slica gel, onde devero permanecer por 48 horas
Aps este perodo de incubao, as tiras so acondicionadas em

saquinhos de papel-manteiga, previamente esterilizados, e armazenadas
em dessecador temperatura ambiente.
F. Mtodo da slica gel

Procedimento:
Preparar recipientes (vidrinhos com tampa ou tubos Eppendorfs)
parcialmente cheios com slica gel (6 a 22 meshs) sem indicador, seca e
esterilizada com calor seco (180C/90 min).
Cultivar os isolados em meio de cultura at a fase de esporulao.
Preparar suspenso de esporos em leite em p desnatado (10%),
esterilizado e esfriado a 4C.
Adicionar a suspenso de esporos slica, resfriada a 4C, sendo
0,5 mL da suspenso para 4 g de slica.
Incubar a 4C por trinta minutos.
Armazenar temperatura ambiente por duas semanas e depois vedar
as tampas.
Transferir para geladeira (4 C) para longo perodo de armazenamento.
6. Tcnicas utilizadas em Micologia mdica
O diagnstico laboratorial das infeces fngicas requer a coleta

de amostras apropriadas e procedimentos laboratoriais adequa-
dos, segundo indicao clnica do paciente. A qualidade da
amostra disponvel para anlise laboratorial de fundamental
importncia. Coleta, estocagem e processamento de espcimes
inadequados podem levar a um diagnstico errneo.
Dependendo da micose do paciente, uma srie de materiais podem ser

enviados ao laboratrio para exame, como relacionado no quadro a seguir.
Micologia | 465
Tipos de micose Tipos de material usualmente enviado

ao laboratrio para exame
Superficiais e cutneas Pele, pelos, unhas, exsudatos

Subcutneas Pus, tecidos (bipisas), exsudatos
Sistmicas e oportunistas Escarro, pus, tecidos (bipsias), exsudatos
lquor,materiais brnquicos, medula ssea,
sangue, urina
6.1. Coleta e processamento de espcimes clnicos
6.1.1. Pele
A. Coleta
Limpar com lcool etlico ou ter (Em alguns casos nenhuma antissepsia
pode ser feita). Se a leso for mida, limpar com gua destilada ou
soluo salina estril. Lmpada de Wood pode ser usada para orientar a
coleta e o diagnstico.
Raspar com lmina de bistur estril ou cureta dermatolgica a borda
das leses, evitar colher o material do centro da leso.
Colocar o material em placa de Petri entre duas lminas ou em
envelope (estreis).
B. Processamento
Exame microscpico direto - KOH 10% ou NaOH 4%.
Cultivo.
Meios Sabouraud-gar com cloranfenicol

Mycosel gar (contm cicloheximida e cloranfenicol)*
Semeadura Semear trs a cinco escamas de pele em cada tubo
Incubao Incubar temperatura ambiente
Observao Observar o crescimento de fungos por at trs semanas
Identificao Identificar os fungos isolados em geral pela morfologia
6.1.2. Pelos
A. Coleta
Com pina estril coletar o mximo de pelos afetados. A lmpada de
Wood pode ajudar na seleo.
Colocar em placa de Petri, entre duas lminas ou em envelope
(estreis).
Procurar sempre colher, por raspagem, amostra de pele onde se
implantam os pelos afetados, mesmo se tiverem aparncia sadia.
B. Processamento
realizado da mesma maneira que para amostras de pele.
6.1.3. Unhas
A. Coleta
Limpar com lcool etlico ou ter.
Raspar com lmina de bisturi estril ou com tesoura cirrgica de ponta
reta grande quantidade da parte lesada da unha. Desprezar as primeiras
raspagens. Excelente para exame e cultivo a parte da unha aparente-
mente so na borda da leso ungueal.
Raspar o material sob a unha, em caso de leso na parte proximal e
periungueal.
Micologia | 467
Colocar o material em placa de Petri, entre duas lminas ou envelope

(estreis).
B. Processamento
realizado da mesma maneira que para amostras de pele.
6.1.4. Escarro
A. Coleta
Quantidade: 5 a 10 mL so suficientes.
Coletar, de preferncia em jejum, o primeiro da manh, aps escovar
os dentes e bochechar com soluo antissptica.
Colher em recipiente estril.
Processar at duas horas aps a coleta.
B. Processamento
Fluidificao e concentrao de escarro:
Adicionar ao escarro 10 mL de soluo de citrato de sdio
0,10 mol/L e 0,10g de N-acetil L-cistena.
Agitar bastante, centrifugar e desprezar o sobrenadante.
Exame microscpico direto: KOH 10% ou NaOH 4%.
Cultivo:
Meios Sabouraud-gar com cloranfenicol e Mycosel gar
Semeadura Espalhar o material em pelo menos dois tubos de cada meio
Incubao Incubar temperatura ambiente e a 37C
Observao Observar o crescimento de fungos at quatro a seis semanas
Identificao Identificar os fungos isolados*
* Em geral realizada atravs de observao ao microscpio das colnias isoladas, em preparaes com
lactofenol-azul de algodo, cultivo em lminas, demonstrao de termotolerncia e demonstrao do
dimorfismo entre outras tcnicas.
7.1.5. Pus
A. Coleta
Colher assepticamente, de preferncia atravs de puno (nesse caso
o procedimento realizado por um mdico).
Colocar em recipiente estril ou processar imediatamente.
Processar o mais rpido possvel, caso o processamento no tenha
sido realizado no momento da coleta.
B. Processamento
Cultivo:
Semeadura Pelo menos dois tubos de cada, se houver material suficiente.
Caso contrrio, semear em quantos tubos forem possveis
Observao Observar o crescimento de fungos at quatro semanas
Identificao Identificar os fungos isolados
Observao: Caso se observe gros no pus, deve-se limpar a leso com salina
estril, cobri-la com gaze estril e, comprimir a regio ao redor da leso, a fim
de que os gros fiquem retidos na gaze. Se houver dificuldade de se obter
material, deixar a gaze sobre a leso do paciente at o dia seguinte. Obser-
vamos este material ao microscpio estereoscpico pescando os gros, com
auxilio de uma agulha ala de platina e, colocando-os em uma placa com
salina estril para lav-los.
Aps a lavagem, processar:
1. Exame direto: NaOH 4% ou KOH 10%.
2. Cultivo:
Micologia | 469
Gros actinomicticos Semear em Caldo Tioglicolato e Sabouraud sem

antibitico.
Gros eumicticos Semear em Sabouraud com cloranfenicol, observar de
trs a quatro semanas e identificar os isolados.
6.1.6. Aspirado de medula ssea
A. Coleta
O mdico deve coletar por puno.
Colocar em frasco estril com heparina. Evitar heparina de reuso, pois
esta deve ser rigorosamente estril. Nunca colher em frascos com EDTA,
pois esta substncia se combina com elementos da parede do fungo,
diminuindo a sensibilidade do exame.
Processar at duas horas aps a coleta.
B. Processamento
Exame direto geralmente no realizado. Mas se necessrio, corar
lminas com Giemsa ou Gram.
Cultivo:
Meios Sabouraud-gar com cloranfenicol

Mycosel gar
BHI gar (se possvel com sangue de carneiro 5%)
Observao Observar o crescimento de fungos at seis semanas
6.1.7. Tecidos (bipsia)
A. Coleta
O procedimento de coleta realizado pelo mdico
Colocar, preferencialmente em tubo estril, contendo 2 a 3 mL de
soro fisiolgico tambm estril. Na ausncia de frascos estreis com
salina, colocar entre duas gazes estreis umedecidas com soro fisiolgi-
co, acondicionando em recipiente estril para transporte.
Processar rapidamente, no mximo em duas a quatro horas.
B. Processamento
Pinando firmemente o tecido, cortar pequenos fragmentos e em
seguida macerar (em gral, homogeneizador ou com tesoura cirrgica
estril).
Cultivo:

Observao Observar o crescimento de fungos at quatro semanas
* Para isolar Zigomicetos (Mucor, Rhizopus, Absidia etc) usar o meio:
Po umedecido esterilizado em tubo ou placa. Acrescentar cloranfenicol na
concentrao de 300mg/l no processamento. Fragmento de tecido deve ser
cortado com bisturi em pequenos pedaos com cuidado, evitando a macerao.
6.1.8. Lquor
A. Coleta (sempre realizada por um mdico).
Quantidade ideal: 1,0 mL em tubo estril (s vezes vm menos
material).
Micologia | 471
Processar rapidamente;
Se for preciso conservar: guardar sob refrigerao (4C).
Observao: Cryptococcus tolera bem a refrigerao.
B. Processamento
Centrifugar o lquor;
Exame microscpio direto do sedimento com tinta nanquim
(OBRIGATRIO) e esfregaos corados com Gram e Giemsa
(caso necessrio).
Cultivo:
Meios Sabouraud-gar com cloranfenicol e BHI - NUNCA Mycosel

Semeadura Semear o sedimento em pelo menos dois tubos de cada meio
Observao Observar o crescimento de fungos at quatro a seis semanas
Identificao Identificar todos os fungos isolados
6.1.9. Exsudatos (Pleura, pericrdio, peritnio, articulaes, etc)
A. Coleta
Colher em tubo estril com heparina estril. O ideal j ter heparina
na seringa.
Processar rapidamente.
B. Processamento
Centrifugar e desprezar o sobrenadante.
Exame microscpico direto do sedimento com KOH 10% ou NaOH
4% e tinta nanquim.
Cultivo: realizado da mesma forma que escarro (item 6.1.4 deste
captulo)
6.1.10. Material brnquico (aspirado, escovado, lavado e outros)
A Colheita (sempre realizada pelo mdico do paciente)

Colher em frasco estril.
B. Processamento
Centrifugar e desprezar o sobrenadante. Realizar exame microscpico
do sedimento com KOH 10% e tinta nanquim. Cultivo do sedimento
damesma forma que para amostra de escarro.
6.1.11. Urina
A. Coleta
Quantidade 25 a 50 mL em frasco estril;
Recomendar:
Primeira urina da manh.
Cuidados de higiene local.
Desprezar o primeiro jato.
Processar no mximo em duas a quatro horas.
Conservar sob refrigerao (4C), excepcionalmente.
B. Processamento
Exame microscpico direto do sedimento com KOH 10% ou NaOH
4% e tinta nanquim.
Cultivo:

Semeadura Semear o sedimento em pelo menos dois tubos de cada meio
de cultura
Observao Observar o crescimento de fungos at seis semanas
Identificao Identificar os fungos isolados*
Micologia | 473
Nota: Para investigao da etiologia fngica, recomenda-se coleta de uma

amostra matinal diria, por trs dias consecutivos. * A ANVISA tambm
recomenda que seja realizada cultura quantitativa da urina para contagem de
unidades formadoras de colnia, atravs da semeadura da urina no centrifugada
em uma placa de Sabouraud gar com ala calibrada.
6.1.12 Sangue (para hemocultura)

A. Coleta
Fazer assepsia local com lcool iodado.
Quantidade: 4 a 5 mL de sangue (utilizando escalpe e seringa
descartvel).
Colocar diretamente em frasco de hemocultura contendo meio de
BHI lquido ou liquoid.
Manter o frasco (j inoculado) em temperatura ambiente, invertido
em estantes apropriadas.
Processar em 48 horas aps a colheita; dez dias aps a primeira
semeadura e dez dias aps a segunda semeadura.
Se forem utilizados frascos de sistemas automatizados, seguir instru-
es do fabricante.
B. Processamento
Exame direto em geral no realizado, se necessrio, corar lminas
pelo Gram ou Giemsa.
Cultivo:
Meios BHI gar com cloranfenicol
Semeadura Retirar o hemocultivo (com seringa descartvel) e inocular cerca
de 1 mL em cada tubo de cultura, espalhando o sangue por
toda superfcie do meio
Observao Observar as subculturas (tubos) por at seis semanas
Incubao Incubar temperatura ambiente e observar de quatro
a seis semanas
Identificao Identificar todos os fungos isolados
6.2. Coleta de sangue: separao, conservao e

estocagem do soro
Cerca de 10 mL de sangue devero ser colhidos atravs de puno
venosa, em tubo de ensaio estril sem adio de anticoagulantes. O soro
separado aps retrao do cogulo, segundo os preceitos tcnicos, a fim de
evitar hemlise. Adicionar ao soro, mertiolato na concentrao final de
1:10.000, a partir de soluo estoque 1:100.
Distribuir em alquotas de 1 mL em pequenos tubos e ensaio ou frascos,
identific-los corretamente e armazenar em congelador at o momento do uso
ou envio ao laboratrio de referncia.
6.3. Preparo e padronizao dos antgenos utilizados nas

provas sorolgicas e reaes intradrmicas
6.3.1. Polissacride de Paracoccidioides brasiliensis
O antgeno obtido a partir de clulas de Paracoccidioides

brasiliensis em sua fase leveduriforme, segundo tcnica de
FAVA NETTO, de natureza qumica quase que exclusi-
vamente polissacardica. O antgeno utilizado nas reaes
de fixao de complemento, precipitao em meio lquido
e nas provas intradrmicas de leitura tardia.
a) Preparar o meio de cultura - Fava Netto;
b) No preparo do antgeno, utilizar no mnimo trs amostras diferentes de

P. brasiliensis, que so mantidas em sua forma leveduriforme em estufa a
35C , no meio acima descrito e, com repiques a cada vinte dias.
c) Preparar suspenso em soluo fisiolgica estril das clulas

leveduriformes do fungo.
Micologia | 475
d) Com auxlio de pipeta estril, espalhar a suspenso sobre a superfcie

do meio de cultura contido em garrafas de Roux.
e) Incubar a 35C durante vinte dias.
f) Decorrido o prazo estipulado, colher as clulas do fungo, com auxlio

de esptula e fazer suspenso em soluo tampo Veronal, contida em
frascos apropriados para centrifugao.
g) Homogeneizar a suspenso com auxlio de basto de vidro e centrifugar

a 2.000 rpm durante dez minutos.
h) Desprezar o sobrenadante ( conveniente, antes, autoclavar o

sobrenadante, pois ele pode conter clulas viveis, ou adicionar formalina).
i) Fazer suspenso do sedimento em aproximadamente cinco volumes de

acetona. Homogeneizar a suspenso com auxlio de basto de vidro
(estril).
j) Centrifugar a 2.000 rpm durante dez minutos. Desprezar o

sobrenadante.
k) Repetir as operaes i e j por mais duas vezes.
l) Repetir as operaes i, j e k, com ter sulfrico.
m) Anotar o volume do sedimento e deix-lo em frasco aberto em

geladeira at o dia seguinte, quando as clulas estaro secas.
n) Fazer suspenso a 15% em soluo tampo veronal, levando em

considerao o volume das clulas anotado no item m.
o) Autoclavar a suspenso a 115C durante quinze minutos.

p) Centrifugar a 2.000 rpm, durante trinta minutos, tendo o cuidado

em manter condies de esterilidade.
q) Deixar o frasco em geladeira at o dia seguinte.
r) Repetir a operao p.
s) Separar cuidadosamente o sobrenadante e adicionar mertiolato na

concentrao final de 1:10.000.
t) Distribuir o antgeno em alquotas de 1 a 5ml, em frascos ou tubos

estreis. Identificar e datar.
u) Realizar controle de esterilidade.
v) A estabilidade do antgeno superior a dois anos, quando esto-

cado a 4C.
A padronizao do antgeno polissacardico para emprego na reao de

fixao de complemento se faz atravs da titulao desse antgeno ante o soro
de paciente portador de paracoccidioidomicose e, que reconhecidamente seja
positivo em tal reao diante do antgeno padro.
Nas reaes intradrmicas, o antgeno deve ser padronizado em pacien-
tes portadores de paracoccidioidomicose, ou em animais experimentalmente
infectados. Atravs da utilizao de antgeno padro, chega-se diluio tima
que dever ser utilizada para o novo antgeno. Fava Netto, atravs de sua
experincia pessoal, verificou que a diluio do antgeno a ser utilizado nas
provas intradrmicas corresponde a 1/10 daquela que representa a dose tima
de antgeno para fixar unidades de complemento 50% de hemlise, na prova
de fixao de complemento. Geralmente a diluio tima do antgeno para
utilizao nas reaes intradrmicas est em torno de 1:10.
Micologia | 477
6.3.2. Filtrado de cultura de Paracoccidioides brasiliensis
O antgeno obtido por essa tcnica, constitui-se em excelente reagente

para ser utilizado nas reaes de fixao do complemento e precipitao em
gel. Sua natureza qumica glicoproteica.
Preparar o meio de cultura - Negroni (item 4.1 deste captulo)

Inocular os frascos com pelo menos trs amostras diferentes de P.
brasiliensis, a partir de cultivos mantidos a 35C.
Incubar a 35C durante quatro semanas sob agitao constante.
Observao: Se no houver disponibilidade de manter os cultivos sob agita-
o constante, os mesmos podero ser mantidos estticos a 35C durante
12 semanas.
Decorrido o tempo de cultivo, adicionar mertiolato na concentrao
final de 1:10.000, agitar e incubar a 35C durante uma semana.
Realizar controle de esterilidade.
Filtrar as culturas em papel de filtro.
Colocar o filtrado em placas de Petri limpas e deixar em estufa a
37C, at que o volume seja reduzido a 1/20 do volume original, ou
utilizar polietilenoglicol (concentrando vinte vezes).
Centrifugar a 2.500 rpm por trinta minutos.
Distribuir o filtrado, que constitui o antgeno em alquotas de 1 a 5 mL
em frascos tipo penicilina, identificar, datar e estocar a 4C.
6.3.3. Filtrado de cultura de Histoplasma capsulatum

(HISTOPLASMINA)
Preparar o meio de cultura - Smith-Asparagina (item 4.1 deste captulo).

Semear de trs a cinco amostras diferentes de Histoplasma capsulatum
nos bales contendo o meio de cultura.
Deixar as culturas temperatura ambiente e no escuro, durante quatro

a seis semanas, sob agitao.
Decorrido o prazo estabelecido, adicionar mertiolato na concentrao
final de 1:10.000. Agitar para submergir os filamentos e deixar
temperatura ambiente durante uma semana.
Filtrar em papel de filtro.
Dependendo do emprego da histoplasmina, temos dois caminhos a
seguir:
Utilizao em reaes sorolgicas (Reaes de fixao de com-

plemento e precipitao em gel de gar)
Colocar o antgeno em placas de Petri limpas, deixar a 37C

at que o volume seja reduzido para 1/20 do volume original.
Centrifugar a 2.500 rpm durante trinta minutos.
Distribuir o antgeno em frascos tipo penicilina.
Identificar, datar e conservar a 4C.
Para padronizao nas provas sorolgicas, consultar o item

6.5 deste captulo.
Utilizao em provas intradrmicas
Aps filtrar em papel de filtro a histoplasmina filtrada em

membrana esterilizante (poro de 0,22 mm).
Distribuir em frascos tipo penicilina e estocar a 4C.

Micologia | 479
A histoplasmina a ser utilizada nas reaes intradrmicas

geralmente diluda a 1:1000, em soluo fisiolgica estril.
Devero ser realizadas provas em indivduos sensveis ao
antgeno, ou animais previamente sensibilizados, diante de
H. capsulatum, utilizando-se histoplasmina padro para fins
de comparao.
6.3.4. Filtrado de cultura de Aspergillus fumigatus
Cultivar A. fumigatus (mnimo de trs amostras diferentes) em

caldo Sabouraud por quatro semanas temperatura ambiente.
Decorrido o prazo estipulado, adicionar mertiolato na concentrao
final de 1:5.000. Agitar para submergir os filamentos.
Deixar as culturas temperatura ambiente durante uma semana.
Filtrar em papel de filtro.
Colocar o filtrado em placas de Petri limpas e deixar em estufa a

37C, at que o volume seja reduzido para 1/20 do volume origi-
nal, ou utilizar polietilenoglicol para concentrar.
Centrifugar a 2.500 rpm durante trinta minutos.
Distribuir o antgeno em alquotas de 1-5 mL, em frascos tipo

penicilina., Identificar, datar e conservar a 4C.
O filtrado de cultura de A. fumigatus utilizado nas reaes

de fixao de complemento e precipitao em gel de gar.
conveniente preparar pela mesma tcnica, filtrados de cultu-
ras de A. flavus, A. terreus e A. niger. Para a padronizao
do antgeno, consultar o item 6.5 deste captulo.
6.5. Tcnicas de padronizao dos antgenos utilizados nas

provas sorolgicas
a) Reao de fixao de complemento
Os antgenos utilizados nas reaes de fixao de complemento so

padronizados atravs da titulao cruzada perante soro positivo para o antgeno
em estudo. Utiliza-se, para tal propsito, antgeno padronizado com finalida-
des de controle da reao. A diluio tima do antgeno no dever demons-
trar atividade anticomplementar.
b) Imunodifuso dupla de Ouchterlony
So feitas diluies do antgeno (1:2, 1:4, 1:8 etc), as quais so

colocadas para difundir no gel, contra soro reconhecidamente positivo para o
antgeno em questo.
Decorrido o tempo necessrio para formao dos precipitados, proce-
de-se leitura da reao.
O ttulo do antgeno ser aquele correspondente sua mais alta diluio
que se d positividade ntida com o soro e o mesmo nmero de bandas de
precipitao, quando comparado ao antgeno padro.
6.6. Tcnica de imunodifuso radial dupla em gel de gar

(Ouchterlony)
REAGENTES
Reagente 1
gar noble ...............0,5 g
gua destilada..........100 mL (Estocar em erlermayer a 4 C)

Micologia | 481
Reagente 2
gar noble ...............1,0 g
Azida sdica .............0,1 g
PBS 7.2 ................100 mL
*Aquecer em banho-maria at o gar dissolver
* Colocar 3,5 mL em tubo de ensaio e estocar a 4 C
Reagente 3
PBS (Tampo fosfato 0,01 mol/L , NaCl 0,15 mol/L) pH 7.2-7.4
Soluo A: NaH2PO4 0,2 M (Fosfato de sdio monobsico)
Soluo B: Na2HPO4 0,2 M (Fosfato de sdio dibsico)
*Tampo fosfato 0,01mol/L
Adicionar 280 mL da soluo A a 720 mL da soluo B
PBS: 50 mL do tampo fosfato + 50 mL de NaCl 3 mol/L.

Completar para 1000 mL com gua destilada.
Reagente 4
Citrato de sdio 5 g ................100 mL de gua destilada

Reagente 5
SOLUO CORANTE
Coomassie brilliant blue ..............0,5 g
cido actico .........................10 mL
Etanol ...................................45 mL
gua destilada ........................45 mL
Reagente 6
SOLUO DESCORANTE
Metanol ...............................400 mL
cido actico .........................100 mL
gua destilada ........................500 mL
1 Etapa (filmagem das lminas):
Mergulhar as lminas de microscia, devidamente limpas, no reagente

1; com auxlio de uma pina, retir-las em seguida, deixando o
tempo suficiente para umedec-las.
Sec-las em estufa de aproximadamente 60C.
Aps a secagem, estoc-las em caixas para posterior utilizao.
2 Etapa:
Utilizando uma mesa nivelada, colocar a lmina previamente filma-

da com o reagente 1.
Micologia | 483
Colocar em banho-maria os tubos com 3,5 mL de gar (reagente

2) estocados, esperar liquifazer.
Verter sobre a lmina o reagente 2 liquefeito, deixando solidificar

por cinco minutos.
Coloc-las em cmara mida na geladeira.

Observao: Pode permanecer em geladeira na cmara mida at sete dias
(margem de segurana).
Aps dez minutos em geladeira, a lmina j pode ser perfurada

segundo esquema a seguir.
3 Etapa
Colocar o soro - 10 mL em cada orifcio - respeitando o esquema

acima. Nas extremidades superiores e inferiores adicionar soro pa-
dro. Nos poos 1, 2, 3 e 4, adicionar os soros a serem testados.
Aps a colocao dos soros, aguardar uma hora para adicionar os

antgenos nos orifcios centrais.
4 Etapa
Difuso em estufa a 37C ou temperatura ambiente, por 48

horas.
5 Etapa
Iniciar os banhos Colocar as lminas (aps 48 horas) em uma

cuba e verter sobre elas citrato de sdio 5 % (reagente 4) por duas
horas, com objetivo de retirar precipitados inespecficos.
Aps o banho de citrato Adicionar soluo salina 0,9 % por

48 horas, trocando vrias vezes.
6 Etapa
Usando o papel de filtro (umedec-lo previamente em gua desti-

lada), embrulhar as lminas e coloc-las em estufa de secagem a 60
C, at atingir completa secagem.
Mergulhar as lminas em gua destilada, e retirar o papel cuidado-

samente. Lavar em gua corrente para retirar resduos de papel de
filtro e sec-las em estufa.
7 etapa
Corar por dez minutos utilizando o reagente 5.
Colocar em cuba de colorao vrias lminas e verter o corante.

Aps dez minutos, retirar as lminas e estocar novamente o corante (
possvel reaproveit-lo). Periodicamente deve-se filtr-lo novamente.
8 Etapa
Aps o processo de colorao, retirar o excesso de corante com

soluo descorante (reagente 6) at que as linhas de precipitao
fiquem bem ntidas.
Observao: Se descorar muito ou totalmente pode corar novamente.
Micologia | 485
9 Etapa
Leitura: considera-se reao positiva (soro reagente) quando hou-

ver a presena de linhas de precipitao apresentando identidade
total com o soro padro. Exemplo:
6.7. Identificao de leveduras de importncia clnica

As leveduras so um grupo de fungos heterogneos que superficialmen-
te aparentam ser homogneas. A identificao desses fungos baseada nas
caractersticas morfofisiolgicas e bioqumicas. A morfologia primariamente
usada para estabelecer o gnero, entretanto, as provas bioqumicas (Teste de
reduo do nitrato e hidrolise da ureia), e de assimilao e fermentao de
acares so usadas para diferenciar vrias espcies.
6.7.1. Provas morfolgicas
Dentre as provas morfolgicas disponveis para identificar espcies do

gnero Candida temos a tcnica de Dalmau e o tubo germinativo.
A tcnica de Dalmau baseada no fato de que C. albicans, quando
cultivada em meio de cultura pobre em nutrientes, como o gar arroz ou gar
fub, produz uma estrutura de resistncia denominada clamidocondio. Dentre
todas as espcies do gnero Candida, somente C. albicans e C. dubliniensis
so capazes de formar clamidocondios, sendo que esta ltima forma
clamidocondios em cachos, apresentando trs ou mais clamidocondios por
hifa. Alm disso, esta uma espcie rara e altamente relacionada a C. albicans.
O teste do tubo germinativo baseia-se no fato de que C. albicans, quando

incubada a 37C por duas a trs horas, em soro bovino ou de coelho, forma,
a partir de suas leveduras, uma estrutura denominada tubo germinativo que
dar origem s hifas e pseudo-hifas caractersticas desta espcie.
Teste do tubo germinativo
Rotular os tubos testes com o nmero da amostra.
Usando uma pipeta, dispensar 0,5 mL de soro bovino ou de

coelho em cada tubo.
Com uma ala flambada, tocar levemente a colnia de levedura e

coloc-la no soro dentro do tubo.
Agitar para homogeneizar as clulas leveduriformes no soro. Incu-

bar os tubos a 37C por duas a trs horas.
Aps a incubao, colocar uma gota da suspenso numa lmina de

microscopia lisa e cortada e cobrir a preparao com uma lamnula.
Examinar ao microscpio para detectar a presena ou ausncia de

tubo germinativo nas clulas da levedura estudada.
Teste de Dalmau
Usar uma placa de Petri com corn meal gar adicionado de 1%

Tween 80.
Com um bisturi estril, fazer um sulco no meio de cultura, aproxi-

madamente 1 cm esquerda do meio da placa.
Com auxlio de uma ala de platina esterilizada, retirar uma peque-

na quantidade da cultura leveduriforme em estudo e semear no sul-
Micologia | 487
co. Fazer trs furos no meio de cultivo com a mesma ala direita do
sulco, formando um pequeno tringulo.
Colocar uma lamnula (24 mm x 24 mm) estril sobre o meio de

cultura, cobrindo o sulco e sobre os furos.
Incubar a temperatura ambiente por 72 horas.
Observar no microscpio ptico, em objetiva de 10X, a presen-

a ou ausncia de clamidocondios, diariamente at completar cin-
co dias.
6.7.2. Provas de assimilao
Para estudo de assimilao de fontes de carbono por leveduras podem

ser utilizados meios cromognicos, bem como kits comerciais de identificao.
Meio CHROMagar Candida
O meio cromognico CRHOMagar Cndida para diferenciao de

Candida albicans, C. krusei e C. tropicalis e outras espcies permite a identi-
ficao do microrganismo de acordo com a colorao que este apresenta no
meio semeado.
A interpretao dos resultados feita com base na cor e no aspecto
tpico das colnias, conforme apresenta a tabela a seguir:
Cor e aspecto tpico da colnia Microrganismo pr-identificado

Verde Candida albicans
Azul-metlico Candida tropicalis
Rosa, rugosa Candida krusei
Branco violeta Outras espcies
Galeria API 20C Aux
A galeria API 20 C AUX engloba vinte cpulas que contm substratos

desidratados para efetuar 19 testes de assimilao. As cpulas so inoculadas
com um meio mnimo semigelosado e as leveduras crescem apenas se forem
capazes de utilizar o substrato correspondente. A leitura dessas reaes faz-se
por comparao com os controles de crescimento (presena ou ausncia de
turvao) e a identificao possvel consultando o catlogo analtico ou um
sistema de identificao disponvel na internet (Api Web).
Mtodo Vitek YBC (Carto de Bioqumica para levedura)

O carto YBC contm 30 poos. Destes 30, 26 contm caldos
bioqumicos e quatro contm caldos de controle negativo. O carto necessi-
ta de 24 horas, e em alguns casos de 48 horas, de incubao a 30C em
uma estufa e, em seguida, de uma nica leitura depois de decorridas 24
horas, e em alguns casos de uma segunda leitura depois de 48 horas, no
leitor/incubadora VITEK para uma anlise dos dados. O carto baseia-se
nos mtodos bioqumicos estabelecidos de Wickerham e Burton. Estes tes-
tes incluem a assimilao de hidratos de carbono, hidrlise da ureia, resistn-
cia a ciclo-heximida e reduo de nitrato, que foram adaptados para serem
utilizados no sistema VITEK.
6.8. Testes de sensibilidade aos antifngicos

Entre os testes preconizados para detectar resistncia a antifgicos, ape-
nas alguns deles foram at agora suficientemante avaliados em estudos amplos e
bem conduzidos, a fim de comprovar boa reprodutibilidade intra e inter-
laboratorial, alm de correlao com a evoluo clinica dos pacientes. Os mais
conhecidos e difundidos so os do National Commitee for Clinical Laboratory
Standards (NCCLS), denominado, desde 2005, Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI), publicado a partir de 1985, sob a forma de
Micologia | 489
documento. No Brasil, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA)

adquiriu os direitos autorais para a lngua portuguesa dos documentos CLSI/
NCCLSI M27- A3 e M38-A e tornou-os disponveis atravs do site: http:/
www.anvisa.gov.br
M27-A3. Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Cal-

do para a Determinao da Sensibilidade de Leveduras; Terapia
Antifngica Norma Aprovada - Terceira edio do NCCLS:D e s -
creve a metodologia de um teste de sensibilidade aos agentes
antimicrobianos das leveduras que causam infeces fngicas invasivas,
incluindo as espcies de Candida e Cryptococcus neoformans. O
M27-A3 o mtodo mais bem estudado e o documento pertinen-
te contm tcnicas de diluio em meio liquido, macrodiluio em
tubos de ensaios e microdiluio em placas de micro titulao, para
determinar a CIM. As leveduras so testadas ante as drogas
(anfotericina B, 5-fluorocitosina e azlicos, incluindo cetoconazol,
fluconazol, itraconazol, voriconazol, alm de posaconazol e
ravuconazol). O meio usado o RPMI-1640 lquido, inculo inici-
al de 1 a 5 x 106 cel/mL, ajustando em espectrofotmetro a 530
nm, incubao a 35 C. Utilizam-se cepas-controle ATCC em to-
dos os testes realizados.
M38-A. Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo

para Determinao da Sensibilidade Terapia Antifngica de Fungos
Filamentosos; Norma Aprovada do NCCLS.
Descreve um mtodo para testar a sensibilidade dos fungos filamentosos

que causam infeces invasivas, incluindo espcies de Aspergillus,
espcies de Fusarium, Rhizopus arrhizus, Pseudallescheria boydii
(Scedosporium apiospermum) e Sporothrix schenckii, assim como
outros fungos patognicos oportunistas, aos agentes antifngicos. O
meio de cultura recomendado mesmo indicado no documento

M27-A2 e o inculo deve ser ajustado, com auxilio de
espectrofotmetro, para conter 0,4 x 104 a 5 x 104 UFC/mL.
Entretanto, a densidade ptica (DO) a 530 nm, requerida no en-
saio, depende do tamanho do condio ou esporangiosporos do
fungo em estudo. H necessidade de adio de Tween 20, como
agente surfactante, para preparar inculo de Aspergillus spp.
M44-A. esse mtodo descreve uma prova sensvel e prtica,

validada para teste de sensibilidade em Candida spp.; utilizando
discos impregnados com fluconazol ou com voriconazol. Este mto-
do ainda no foi validado para provas com outros gneros de leve-
duras e recentemente foi proposto um novo mtodo para uso com
fungos filamentosos. O documento inclui critrio de interpretao
para os dimetros de halos obtidos com discos de fluconazol e
valores esperados para cepas padro.
EUCAST. ensaio recomendado para avaliao da atividade antifngica

de substncias puras pela tcnica da microdiluio em caldo, pela
organizao europia Antifungal Susceptibility Testing Subcommit-tee
of the European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (AFST-
EUCAST), baseado nos procedimentos da referncia CLSI M27-
A2, mas com algumas modificaes, a fim de se obter maior exatido
na determinao dos valores de CIM. Estudos tm confirmado que a
modificao do documento CLSI M27-A2, com a suplementao do
meio RPMI 1640 e com 2% de glicose no meio de cultura, tornou a
metodologia mais vantajosa. Isso se deu devido a reduo do tempo
de incubao necessrio (24 horas) para se obter um crescimento
suficiente para a determinao dos valores de CIM.
Micologia | 491
Sistemas comerciais: Existem vrios sistemas comerciais para realizar

testes de sensibilidade aos antifgicos, incluindo, entre outros, Asty,
Atb Fungus 3, Candifast, E-Test, Fungitest, Integral Systems Yest,
Mycototal E Sensitrite Yeast One. Apenas o E-Test, o Atb Fungus
3 e o Candifast tm distribuidores no Brasil.
Resumo do captulo
Os fungos so organismos que convivem conosco todos os dias. So
importantes, tanto do ponto de vista ecolgico, quanto econmico. A Micologia
a rea da Biologia destinada ao estudo dos fungos, que teve o seu grupo
reconhecido como um reino a partir da descrio de cinco reinos por Whittaker,
em 1969. Os organismos foram alocados em reinos com base na morfologia e
no modo de nutrio dos seres vivos, sendo criado, ento, o reino Fungi.
Todos os fungos conhecidos, com poucas excees, tm origem dos esporos
(reproduo sexuada) ou condios (reproduo assexuada), corpsculos que
podem ser comparados s sementes das plantas superiores, embora no sejam
morfologicamente semelhantes a estas. Na maioria dos casos, o sistema vegetativo
encontra-se no interior dos tecidos parasitados, no solo ou na matria orgnica
em decomposio. Com a formao dos esporos ou condios, necessrio
que estes tenham acesso livre ao ar, para assegurar sua disseminao. O ciclo
de vida dos fungos compreende duas fases. Uma somtica, caracterizada por
atividades alimentares, e outra reprodutiva, onde os fungos podem realizar
reproduo sexuada ou assexuada. Por causa da rigidez da parede celular, sua
nutrio por absoro de nutrientes solveis simples. Os fungos so consi-
derados seres cosmopolitas, pois esto presentes em qualquer parte do
planeta. A temperatura ideal para o crescimento dos fungos fica entre 0 a
350C, mas o timo para a maioria fica entre 20 a 300C, e a umidade ideal
fica em torno da saturao.
Os fungos so usados como alimento propriamente dito; na indstria
alimentcia, na produo de pes, queijos, cervejas e vinhos; na indstria
farmacutica e biotecnolgica, para a fabricao de antibiticos, cidos, pig-
mentos, enzimas, pesticidas biolgicos, entre outros usos.
Os fungos podem parasitar o homem e outros animais, causando

um grupo de doenas conhecidas como micoses.
Micologia | 493
As micoses podem ser classificadas em cinco grupos, de acordo

com suas manifestaes clnicas.
As micoses superficiais so infeces causadas por fungos que

invadem as camadas mais superficiais da capa crnea da pele ou a
haste livre dos pelos.
As micoses cutneas se caracterizam por serem causadas por fungos

que invadem toda a espessura da capa crnea da pele, a parte
queratinizada intrafolicular dos pelos ou a lmina ungueal.
As micoses subcutneas se caracterizam por resultar da inoculao

de um fungo patognico por ocasio de um traumatismo, em geral
cortes por plantas ou pela manipulao do solo, manifestando-se
como tumefao ou leso supurada da pele ou do tecido subcut-
neo, produto da disseminao do fungo por contiguidade ou por via
linftica.
As micoses sistmicas so caracterizadas por serem adquiridas atra-

vs de inalao de propgulos fngicos, causando, consequentemente
a leso primria pulmonar. Desta forma, o fungo pode se disseminar
pelo corpo atravs da corrente sangunea, originando leses
extrapulmonares nos pacientes.
As micoses oportunsticas so causadas por fungos termotolerantes

de baixa virulncia que determinam doenas em hospedeiros com
graves deficincias do sistema imunolgico.
O diagnstico das micoses realizado atravs da visualizao do

fungo nos espcimes clnicos (exame microscpico direto) e do seu
cultivo em meios adequados. Provas imunolgicas podem auxiliar no
diagnstico, fornecendo resultado presuntivo das infecces.
Questes
1) Cite as tcnicas mais importantes para o isolamento de fungos de solo e de ar.
2) Em que situaes podemos usar a tcnica de diluio seriada?
3) Paciente portador do HIV fazendo uso de corticosteroides e que teve
tuberculose pulmonar h trs anos apresenta imagens radiolgicas de trax
sugestivas de bola fngica. Foi colhida uma amostra de escarro, a qual foi
processada adequadamente. O exame microscpico direto apresentou hifas
septadas e hialinas, ramificadas dicotomicamente. No cultivo, houve cresci-
mento de uma colnia esverdeada, a qual, quando corada pelo lactofenol azul
de algodo, apresentou conidiforo com vescula alongada e filides distribu-
das a partir da metade da vescula, dando origem a longas cadeias de condios
globosos e equinulados. Com base nisso, responda:
a) Explique como deve ser realizado o processamento do espcime

clnico em questo, antes que sejam realizados o exame direto e o
cultivo do material.
b) Qual o agente etiolgico desta micose?
c) Que testes imunolgicos poderiam ser aplicados doena que o

paciente possui?
d) Uma pessoa saudvel, sem uso de medicamentos, poderia adqui-

rir esta infeco? Comente.
Micologia | 495
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| 399

Os fungos tiveram seu grupo reconhecido como um reino a partir da

1.1. Elementos fundamentais dos fungos e Citologia

Com a formao dos esporos ou condios necessrio que estes

Esquema do ciclo de vida geral do fungo.

1.2. Nutrio, metabolismo e habitat

Parasitas obrigatrios Fungos que vivem exclusivamente atacando

1.3. Posio sistemtica dos fungos

1.3.1. Filo Chytridiomycota

Os representantes do filo Chytridiomycota so considerados cosmo-

1.3.2. Filo Neocallimastigomycota

So encontrados no sistema digestivo dos grandes mamferos herbvoros

1.3.3. Filo Blastocladiomycota

1.3.4. Filo Microspordia

Organismos eucariontes sem mitocndria e flagelo desconhecido. So

1.3.5. Filo Glomeromycota

O filo Glomeromycota representado por fungos de micorrizas

de algumas plantas, na qual a planta, atravs da fotossntese, fornece energia e

1.3.6. Filo Ascomycota

O filo Ascomycota compreende o maior grupo do reino Fungi, consti-

1.3.7. Filo Basidiomycota

Os representantes do filo Basidiomycota so considerados cosmopolitas

1.3.8. Fungos Anamrficos

Os Fungos Anamrficos formam um grupo de fungos onde a reprodu-

2. Por que estudamos os fungos

nas, de animais e plantas (micoses) so causadas por fungos. Em humanos e

3.1. Classificao das micoses

3.1.1. Micoses superficiais e cutneas

As MICOSES SUPERFICIAIS so infeces causadas por

pelos, que podem se desarticular, resultando em artrocondios retangulares que

As MICOSES CUTNEAS se caracterizam por serem

As dermatofitoses constituem manifestaes clnicas muito variadas cau-

Epidermophyton floccosum, T. mentagrophytes, Microsporum canis, M.

Fungo dermatfito Macromorfologia Micromorfologia

T. mentagrophytes Colnia branca, granular ou Macrocondios do gnero,

Microsporum canis Colnia branca, penugenta Macrocondios fusiformes,

Epidermophyton flocosum Colnia membranosa de Macrocondios em grupos

A candidase micose causada por leveduras do gnero Candida, em

3.1.2 . Micoses subcutneas

As MICOSES SUBCUTNEAS se caracterizam por

A esporotricose tem como agente Sporothrix schenckii. Esse um

elementos leveduriformes bem pequenos, com brotamento geralmente em

nutrindo-se de outros vegetais em decomposio ou como fitopatgenos.

Fungos causadores de micetoma

H outras micoses subcutneas de interesse, como a lobomicose e a

3.1.3. Micoses sistmicas e oportunsticas

As MICOSES SISTMICAS se caracterizam por serem

Ao invadir os tecidos, os fungos desencadeiam resposta imunolgica no

As micoses sistmicas so a coccidioidomicose, a blastomicose, a

sistmica mais frequente na Amrica Latina. Afeta usualmente agricultores, que

As MICOSES OPORTUNSTICAS so causadas por

A criptococose causada por leveduras do gnero Cryptococcus, das

bastante frequentes. A doena endmica no Norte e no Nordeste do pas,

ca filamenta, sempre se apresenta na forma de levedura). O agente mais

3.2. Agentes antifngicos

mento do fungo. Os azis causam menos reaes adversas que a

Primria: ocorre quando dentro de uma espcie, normalmente sensvel

3.3. Diagnstico imunolgico das micoses pulmonares

importante salientar que as provas imunolgicas tm

3.4. Interpretao das provas imunolgicas

Pacientes portadores de paracoccidioidomicose ativa sem tratamento

Anticorpos fixadores do complemento podem ser demonstrados na

Nos aspergilomas, os ttulos de anticorpos especficos demonstrados