Técnicas realizadas nas aulas práticas de Imunologia

Monitora: Rafaela Alves Freitas

Med 81
1- Imunodifusão radial
Na imunodifusão radial, será utilizado um gel de agarose, onde será
aplicado o soro do paciente (onde estão os Anticorpos). Na lâmina onde será
realizada a imunodifusão, encontram-se alguns “poços” circulares, onde
será colocado o antígeno. Dessa forma, ocorrerá a difusão, com a reação
antígeno-anticorpo, a qual será notada por meio da formação de anéis de
precipitação ao redor dos poços. À medida que a quantidade de antígeno
aumenta, a reação com o anticorpo também aumenta, até atingir um
máximo. Há uma relação entre o quadrado do diâmetro do halo e a
concentração do antígeno.

2- Citometria de Fluxo
A citometria de fluxo será realizada colocando-se as células a serem
analisadas em um equipamento denominado citômetro de fluxo, o qual
alinhará as células de forma que possam passar enfileiradas pelo sistema e
serem analisadas. Para ser feita a análise, o aparelho utiliza um sistema
óptico, no qual se incide feixes de laser sobre as células, as quais serão
analisadas tendo como base a forma como a luz foi desviada. A luz desviada
pela célula será captada por detectores: o FSC é relacionado ao volume
celular e o SSC analisa a complexidade da célula (se ela tem grânulos, tipo
dos grânulos, forma do núcleo, etc). Cada célula que passa através do feixe
de laser, dispersa a luz de uma forma, tornando possível fazer esta análise.
A aplicação desta técnica é feita na imunologia para a distinção de tipos
celulares em uma amostra (por exemplo, separar neutrófilos, macrófagos e
linfócitos em uma determinada amostra), pode ser usada na hematologia e
oncologia para a detecção de células cancerosas, etc.
3- Imuno-histoquímica
Como o próprio nome já diz, a imuno-histoquímica é a técnica utilizada
para detectar algum antígeno de interesse em um tecido, utilizando-se de
um anticorpo marcado, geralmente com uma enzima.
Para a execução da técnica, utiliza-se um anticorpo primário não marcado,
o qual reagirá com o antígeno de interesse do tecido. Em seguida, utiliza-se
um secundo anticorpo marcado, que se ligará ao primeiro anticorpo,
amplificando o sinal.
Por fim, adiciona-se o substrato da enzima, para que a reação possa ocorrer
e observarmos o resultado.
4- Aglutinação Direta
No teste de aglutinação direta, o antígeno faz parte naturalmente da
célula, e haverá aglutinação dessas células promovida por anticorpos
contra esses antígenos. Como exemplo de aglutinação indireta, temos a
hemaglutinação, usada para a identificação de antígenos eritrocitários
na tipagem sanguínea utilizando anticorpos específicos.
Os testes para detectar anticorpos específicos são realizados empregando-se
diluições em série do anticorpo, frente a uma quantidade constante de
antígeno. Após um período de incubação, a aglutinação se completa e o
resultado é geralmente expresso como a máxima diluição em que ocorre a
aglutinação.

5- Aglutinação Indireta

A aglutinação indireta, ou aglutinação passiva é uma técnica em que será

utilizada uma partícula, onde serão adsorvidos antígenos de interesse, por
exemplo, pode se utilizar partículas de poliestireno (poderia ser látex ou mesmo
a própria hemácia) sensibilizadas com estreptolisina O, então, ao se colocar o
soro de um paciente que possui anticorpos anti-estreptolisina O, esses
anticorpos se ligarão à essas partículas e causarão a aglutinação das partículas
de poliestireno.
 Então, qual a diferença para a aglutinação direta? Na aglutinação direta, o
antígeno é a própria hemácia! Quando o anticorpo se liga, ele aglutina as
próprias hemácias. Já na indireta, o anticorpo se liga em antígenos que estão na
superfície de determinadas partículas (que inclusive, podem ser hemácias).

6. Imunofluorescência Indireta (RIFI)

Na imunofluorescência indireta, lâminas de vidro são sensibilizadas com o

antígeno de interesse; em seguida, o soro do paciente é colocado em contato com a
lâmina e se houver anticorpos contra este antígeno, os mesmos irão se ligar a ele na
lâmina. Após o primeiro anticorpo, será adicionado um segundo anticorpo
marcado com um fluorocromo (fluoresceína ou rodamina), e este anticorpo irá se
ligar ao anticorpo do paciente.
A fluoresceína produz uma marcação visível no microscópio de fluorescência, e
quanto mais houver anticorpos no soro do paciente, mais forte a marcação será.
A aplicação do RIFI é na detecção de auto-anticorpos e na detecção de anticorpos
anti-nucleares presentes no lúpus eritematoso sistêmico.
7. ELISA

ELISA é a sigla para Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, em português, Ensaio
de Imunoabsorção Enzimática. O teste de ELISA possui várias formas de ser
realizado, como o ELISA indireto ou o ELISA sanduíche.
Deve-se ter em mente que o teste de ELISA é utilizado para detectar a presença de
anticorpos no soro do paciente, contra determinado antígeno, por meio da
marcação de uma enzima que fará a catálise de determinada substância, fazendo
com que o meio mude de cor (como na imunohistoquímica!).
Este é o teste de primeira linha para o diagnóstico do HIV e de outras doenças,
sejam elas auto-imunes, alergias, etc.

7.1. Elisa Indireto

Primeiramente prepara-se uma placa de ELISA, sensibilizando-a com o antígeno
de interesse, em seguida adiciona-se o soro do paciente, fazendo com que os
anticorpos contra este antígeno de interesse se liguem a ele na placa. Porém, para
que possamos fazer a leitura do ELISA, é necessário que seja adicionado mais um
anticorpo, o qual estará marcado com uma enzima (Peroxidase), denominado
anticorpo conjugado.
Quando se adiciona o substrato da enzima (no caso da Peroxidase, o substrato é o
H2O2), ocorre a reação e pode-se observar uma mudança de cor.
7.2 ELISA Sanduíche
Na técnica do ELISA sanduíche, haverá a formação de um “sanduíche” com dois
anticorpos e o antígeno entre eles ao final do ensaio.
Primeiramente, será adicionado um anticorpo denominado anticorpo de captura, o
qual será fixado no fundo do poço da placa. Logo após, adiciona-se o antígeno de
interesse, por exemplo, podemos supor que queremos pesquisar a presença de
TNA-alfa em uma amostra sanguínea de um paciente, ou que queremos pesquisar
a presença de determinado antígeno na urina de alguém. Sendo assim, ao
adicionar-se o antígeno, ele se ligará aos anticorpos no fundo do poço, entretanto,
ainda não podemos enxergá-lo, visto que ainda não está marcado.
Sendo assim, será adicionado mais um anticorpo, dessa vez marcado com a
enzima, para que possamos enxergar o resultado do teste, uma vez que ele estará
marcado com a enzima e adicionaremos seu substrato para que ocorra a reação.
OBS: A forma de realização do ELISA pode variar de um kit para outro, então
podem ter pequenas mudanças, por exemplo, pode-se jogar o 2º anticorpo sem a
marcação e depois jogar um 3º anticorpo marcado... Mas a essência do teste não
muda.

 O ELISA é um teste que nos permite inferir pela intensidade da cor da

reação, a quantidade de antígeno presente.
8.Prick Test

O Prick Test é um teste para avaliação da Hipersensibilidade Imediata (Mediada

por IgE) a determinados antígenos, tais como fungos, pelo de cachorro, pelo de
gato, ácaros, etc.

O teste é realizado no antebraço, onde é pingada uma gota de controle negativo

(onde não se desenvolverá reação), uma gota de controle positivo (histamina) e
uma gota de cada antígeno. Aguarda-se 15 minutos para a leitura do diâmetro da
elevação da pápula.

O surgimento da pápula representa uma reação em que há presença do anticorpo

IgE específico contra o alérgeno testado. Consideram-se positivos resultados cujo
diâmetro da pápula é maior ou igual a três milímetros em relação ao controle
negativo. A histamina sempre formará uma pápula maior ou igual a três
milímetros. O significado do teste positivo relaciona-se a uma sensibilização e não
necessariamente à alergia. Para comprovar a alergia deve haver uma correlação
clínica.

 Vale lembrar que da primeira vez em que a pessoa é exposta ao alérgeno,

não terá reação de hipersensibilidade, pois é necessário ter a produção de
IgE primeiro, para que ela possa se ligar nos mastócitos e desencadear a
liberação de histamina.