COLÉGIO ESTADUAL PROFESSOR ELYSIO VIANNA

CURSO TÉCNICO EM QUÍMICA INDUSTRIAL

AULA PRÁTICA DE MICROBIOLOGIA – COLORAÇÃO DE GRAM
INTRODUÇÃO:
As bactérias podem ser observadas de duas maneiras: com e sem coloração.
1- Sem coloração: os microrganismos são observados vivos, podendo ser evidenciada a motilidade.
2- Com coloração: os microrganismos são corados após serem mortos.
Apesar de quimicamente distintas do meio que as rodeiam, as bactérias são quase incolores não apresentando
contraste suficiente com o meio em que se encontram, o que dificulta sua visualização. A diferença química entre as
bactérias e o meio é que nos permite distingui-las por meio de coloração, pois o corante não reage com o meio externo,
tornando-as quando coradas, mais visíveis ao microscópio. Desta maneira poderemos observar suas formas
fundamentais, dimensões e arranjos.
As bactérias coram-se com os derivados de anilina (azul de metileno, fucsina,cristal, violeta, etc..) que são corantes
básicos ( íon colorido = cátion ) e que possuem afinidade pelo citoplasma destas células. Esta afinidade se deve ao fato
do citoplasma bacteriano apresentar carga elétrica negativa, derivada, principalmente, dos radicais fosfatos dos ácidos
nucléicos que aí se encontram.
São dois os processos que nos permitem corar as bactérias:
COLORAÇÃO SIMPLES: Nesta coloração utilizamos apenas um corante e ela baseia-se na diferença química existente
entre as bactérias e o meio. Uma vez coradas, apresentam contraste, podendo ser melhor visualizadas.
COLORAÇÃO DIFERENCIAL: Nesta coloração utilizamos geralmente 2 corantes, além do mordente e do diferenciador.
Baseia-se na diferença química existente entre as bactérias e consequentemente na reação diferente que as bactérias
podem apresentar frente a um determinado corante. É utilizada para distinguir diferentes tipos de bactérias. Os métodos
de Gram (1884) e de Ziehl-Neelsen (1882) são exemplos de coloração diferencial.

SOLUÇÕES EMPREGADAS:
1- CRISTAL VIOLETA - função: corante principal ( cora igualmente todas as bactérias )
2- LUGOL ( solução de iodo-iodeto de potássio) - função: mordente. O mordente tem a finalidade de aumentar a afinidade
do corante pela célula, permitindo que ela se core mais intensamente.
3- ÁLCOOL ETÍLICO - função: agente descorante e diferenciador. Sua utilização permite que algumas células se descorem
mais facilmente que outras. Este comportamento distinto de descoloração é que diferencia as bactérias.
4-- FUCSINA DILUÍDA - função: corante de contraste, corante secundário ou contracorante. É o corante que dá às células
descoradas uma cor diferente daquelas que mantêm a cor do corante principal. Os microrganismos que não se descoram
facilmente retêm a cor do corante principal ( cristal violeta ) enquanto que aqueles que se descoram facilmente poderão
ser visualizados, pois corar-se-ão com o corante de contraste ( fucsina. ).

PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO E FIXAÇÃO DA AMOSTRA PARA COLORAÇÃO:

O Material a ser utilizado poderão ser provenientes de: água, solo, alimentos, medicamentos, lesão, sangue, urina,
líquor, fezes, escarro, secreção uretral, etc. Realizar o esfregaço do material na lâmina.
Fixar o material com ajuda do calor. A fixação evita que as células dos microrganismos sejam lavadas e perdidas
durante o processo de coloração. Além disto, a fixação permite a aderência das células à lâmina, matando os
microrganismos através da coagulação seus protoplasmas, preservando suas estruturas na forma e posição originais. O
calor é o método de fixação frequentemente utilizado. Para fixarmos, passamos a lâmina com o esfregaço voltado para
cima, por três vezes através da chama. Evitar o super aquecimento testando a cada passada a temperatura da lâmina no
dorso da mão. Após a fixação, proceder com a coloração.

PROCEDIMENTO TÉCNICO:
1º-Fazer o esfregaço do material
2º-Passar o material ao fogo ( 3x sobre a chama)
3º- Cobrir o esfregaço já fixado com solução de Cristal Violeta (violeta de genciana) por um (1) minuto.
4º- Escorrer o cristal violeta, lavar em fio d’água ( com o pisseti)
5º - Cobrir o esfregaço com Lugol por um (1) minuto.
6º-Escorrer o lugol, lavar em fio d’água , usando o pisseti
7º- Descorar rapidamente com Álcool Etílico ( +/- 20 segundos)
8º-Interromper o processo de descoramento lavando o esfregaço com fio d’ água.
9º-Cobrir o esfregaço com Fucsina diluída por 30 segundos.
10º-Lavar e secar com papel, pressionando o esfregaço cuidadosamente.

RESULTADO:
Bactérias coradas em roxo ( cor do cristal violeta ) - GRAM POSITIVAS
Bactérias coradas em vermelho ( cor da fucsina ) - GRAM NEGATIVAS

FUNDAMENTO DA TÉCNICA DE GRAM:

Muitas explicações já foram sugeridas na tentativa de elucidar o mecanismo da reação de Gram. As mais plausíveis
dizem respeito à diferença na estrutura química da parede celular. Num primeiro momento, todas as bactérias ( G+ e G-
) absorvem igualmente o cristal violeta ( corante básico que possui afinidade pelos seus citoplasmas, devido a carga
elétrica negativa). A seguir, o lugol reage com o cristal violeta formando o complexo iodo-pararosanilina, que se fixa e
cora a célula mais intensamente. Posteriormente, quando tratamos o esfregaço com álcool, as bactérias se comportam
de maneira diferente:
-1) as Gram-positivas não se descoram facilmente pelo tratamento com o álcool. Isto se explica pelo fato de comporem
sua parede celular uma espessa camada de peptideoglicano, além de outros possíveis componentes, como: ác. teicoicos,
proteínas. polissacarideos e etc., substâncias estas, não solúveis em álcool. O álcool atua desidratando as várias camadas
desta parede, o que traz como consequência uma diminuição na sua porosidade e esta diminuição reduziria a
permeabilidade da parede, dificultando a extração (saída) do complexo CV-I ( que se encontra no citoplasma ) de dentro
da célula. Além disto, parece haver uma retenção do CV-I na parede após a ação do álcool, o que também contribuiria
para a diminuição de sua porosidade. A bactéria Gram-positiva permanece então com a mesma coloração até o final.
-2) as bactérias Gram-negativas são descoradas pelo tratamento com o álcool. Tal fato se explica por comporem a
parede destas bactérias: delgada camada de peptideoglicano (menor entrecruzamento, o que não é suficiente para
impedir a passagem do solvente ) além de substâncias ricas em lipídios (lipoproteina de apoio, fosfolípides da membrana
externa e lipídio “A” que participa do LPS). O álcool solubiliza (dissolve) estes lipídeos (muitas vezes extraindo a camada
da membrana externa), aumentando a porosidade da parede, o que contribuiria para um aumento da permeabilidade.
Assim sendo, o álcool penetra dentro da célula (atravessando a membrana citoplasmática), removendo o complexo CV-I,
descorando a célula. Finalmente as bactérias descoradas pelo álcool, por não apresentarem contraste que permita sua
visualização, seriam coradas pelo corante secundário que é a fucsina. As células que não foram descoradas pelo álcool (e
tiveram sua permeabilidade diminuída) permaneceriam coradas com a cor do corante principal até o final da coloração,
pois não absorveriam a fucsina.

QUESTIONÁRIO A SER ENTREGUE RESPONDIDO JUNTO COM O RELATÓRIO

1) Em que consiste a coloração simples?
2) Em que consiste a coloração diferencial?
3) Por que passar a lâmina sobre a chama antes da coloração?
4) Qual a importância da coloração de gram?
5) Por que as bactérias gram positivas não se descoram com o álcool?
6) Por que as bactérias gram negativas se descoram com o álcool?
7) O que são bactérias gram negativas? Por que receberam este nome?
8) O que são bactérias gram positivas? Por que receberam este nome?