1.

Introdução

A espécie Lippia sidoides é um vegetal arbustivo, conhecida popularmente como

alecrim-pimenta, suas folhas são grosso-serreadas com dimensões variáveis
(aproximadamente até 8 cm), revestidas por pelos em ambas as faces; suas flores são de
cor branco-amareladas pequenas, e encontram-se em inflorescências subglobosas e
subpiramidais (CRAVEIRO et al., 1981). Encontrada em abundância no sertão
nordestino, sendo mais comum nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte.
A L. sidoides é bastante utilizada na medicina popular, principalmente como
antisséptico (LACOSTE et al., 1996; LEMOS et al., 1990). Suas folhas são geralmente
utilizadas de forma tópica, como remédios caseiros no tratamento de acne, ferimentos,
infecções da pele e do couro cabeludo. Sua infusão tem sido usada na medicina popular
como aromoterápico para rinite alérgica e no tratamento das infecções vaginais, boca e
garganta (MATOS; OLIVEIRA, 1998).
Podemos encontrar na literatura, algumas ações biológicas da espécie L.
sidoides que já foram comprovadas cientificamente, como: atividade antimicrobiana
contra Staphylococcus aureus (SILVA et al., 2010), antifúngica em Curvularia luneta
(DE SOUZA FERREIRA et al., 2018), inseticida em Rhodnius prolixus (vetor da
doença de Chagas) (FIGUEIREDO et al., 2017), inibidor da excitabilidade nervosa em
nervo ciático de ratos (BARBOSA et al., 2017), efeito antiespasmódico em traqueia de
ratos (TEÓFILO, 2012).
Mediante o efeito miorrelaxante em musculatura de vias aéreas de roedores,
procuramos evidenciar se a espécie L. sidoides apresenta esse mesmo efeito em vias
aéreas de porco, uma vez que há uma semelhança da fisiologia do suíno com a dos seres
humanos. Além disso, visando substituir o uso de animais laboratoriais, obedecendo
assim a regra dos 3 Rs (reduce, refine, replace). O qual foi iniciado pela federação das
Universidades para o Bem-estar Animal (The Universities Federation for Animal
Welfare – UFAW’s), que significa reduzir o número de animais utilizados na pesquisa,
refinar a metodologia de forma a diminuir a dor e desconforto sofrido pelos mesmos, e
buscar métodos alternativos que, por fim, substituam seu uso, sendo esta a meta máxima
a ser alcançada (RUSSEL; BURCH, 1992).
Neste trabalho optou-se por utilizar como modelo altenativo, o tecido brônquico
de porcos da espécie Sus scrofa domesticus (Large Whit), o tecido provenientes de
suínos se caracteriza como um método alternativo, uma vez que, os animais utilizados
para extração dos bronquíolos são abatidos para comercialização de sua carne. Esse
trabalho objetivou demonstrar o efeito miorrelaxante do óleo essencial de Lippia
sidoides sobre o musculo liso de bronquíolos de suínos, contribuindo com o avanço nas
pesquisas com fármacos broncodilatadores oriundos de produtos naturais, bem como
com a adoção de métodos alternativos ao uso de animais de laboratório. Esse estudo
contribui para o avanço cientifico na pesquisa com produtos naturais.

2. Material e método

2.1 Material vegetal e extração de óleo essencial

O material botânico de Lippia sidoides CHAM. foi coletado no Horto de Plantas

Medicinais, do Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais - LPPN da Universidade
Regional do Cariri - URCA. O período de coleta foi escolhido de acordo com a época
que produz um maior rendimento de óleo essencial sendo feita em junho de 2013. Após
a identificação das espécies, uma amostra foi depositada no Herbário Dárdano de
Andrade Lima, Universidade Regional Cariri-URCA e identificada sob número de
registro #6480.

2.2 Óleo essencial de L. sidoides

O óleo essencial de L. sidoides (OELs.) foi obtido por hidrodestilação em

aparelho tipo Clevenger. As folhas foram cortadas em fragmentos de aproximadamente
1cm2 e posteriormente, imersas em água destilada e submetidos à extração por
aproximadamente 2 horas. Em seguida o óleo essencial foi tratado com sulfato de sódio
anidro, filtrado em algodão e transportado por pipeta de Pasteur para vidro âmbar e
armazenado a -20 oC.

2.3 Análise química

2.3.1 Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa (GC-MS).

A análise em GC-MS foi realizada em um XL GC-MS que opera no modo EI aos

70 eV, equipado com um injetor split/splitless (220 °C). O gás Hélio será usado como
transportador (1,0 mL min-1) e as colunas capilares utilizadas foram uma HP 5MS (30 m
× 0,35 mm, espessura do filme 0,50 mm) e uma HP Innowax (30 m × 0,32 mm i.d.,
espessura do filme 0,50 mm). O programador de temperatura foi o mesmo que usado
para analisar o GC. O volume injetado será de 1 μL do óleo essencial diluído em
clorofórmio (1: 10).

2.3.2 Cromatografia em fase gasosa com detector por ionização de chama

(GC-FID).

A cromatografia gasosa (GC) foi realizada com equipamento Agilent

Technologies Sistema GCFID 6890N equipado com um capilar DB-5 coluna (30 m ×
0,32 mm; 0,50 mm) e conectada a um detector FID. O programador térmico foi de 60
°C (1 min) a 180 °C a 3 °C min-1; temperatura do injetor de 220 °C; taxa de divisão
1:10. O gás transportador foi o Hélio. O quociente de vazão: 1,0 mL min-1. O volume a
ser injetado foi de 1 μL, diluído em clorofórmio (1:10). Duas réplicas de amostras foram
processadas da mesma forma. As concentrações relativas dos componentes foram
calculadas com base nas áreas de pico do GC sem usar fatores de correção.

2.3.3 Identificação dos componentes

A identificação dos constituintes foi realizada com base no índice de retenção

(RI), determinado com referência da série homóloga de n-alcanos, C7-C30, em
condições experimentais idênticas, e a comparação foi feita com a pesquisa da
biblioteca de espectros de massa (NIST e Wiley), e com a literatura de espectros de
massa. As quantidades relativas de componentes individuais foram calculadas com base
na área do pico CG (resposta FID).

2.4 Para a verificação das alterações eletrofisiológicas

Segundo a resolução Normativa Concea n° 30, de 02 de fevereiro de

2016 cadáveres ou parte deles oriundos das atividades de matadouros, frigoríficos,
abatedouros ou produtores rurais para consumo, fica isento de passar pela a Comissão
de uso e Experimentação Animal (CEUA) para que seja avaliado seus aspectos éticos.
 Um total de 24 fragmentos de pulmões de porcos Sus scrofa domesticus, adultos,
distribuídos em protocolos de 3 animais, que foram obtidos do abatedouro Frigorífico
Industrial do Cariri, localizado em Juazeiro do Norte, Ceará, Brasil. O órgão foi provido
de animais que foram abatidos para consumo de carne. Todos os animais assim como
sua carne e vísceras foram inspecionados por médicos veterinários antes e depois do
abate, constatando a sanidade do animal.

Durante o transporte para o laboratório, os pulmões foram colocados em solução

gelada de Tyrode modificado (TM) com seguinte composição em mM: NaCl, 136; KCl,
5.0; MgCl2, 0.98; NaH2PO4, 0.36; NaHCO3, 11.9; CaCl2, 2.0 e Glicose, 5.5. A solução
nutritiva foi mantida constantemente aerada por borbulhamento de ar, à temperatura de
37° C e o pH ajustado para 7,4 através de HCl 1M e/ou NaOH 1M. O brônquio do
tronco de um lobo inferior do pulmão foi dissecado e os ramos laterais foram retirados e
colocados em TM.

Posteriormente foi feita a limpeza dos segmentos brônquicos e logo após

cortados em anéis (3 a 5 mm de comprimento e 3 a 5 mm de diâmetro). Estes anéis
foram horizontalmente suspenso entre dois ganchos de aço inoxidável em forma de L e
montados em banho para órgão isolado com capacidade para 10 mL de TM com
contínua aeração, regulação da temperatura em 37° C e pH 7,4. A preparação foi uma
extremidade conectada a um transdutor de força através de uma haste móvel, e a outra
extremidade a uma base fixa do equipamento. As respostas musculares mecânicas
(geração de força ou relaxamento) foram transformadas pelo transdutor em sinal
elétrico. O transdutor foi conectado a um amplificador diferencial (DATAQ, modelo
PM-1000, USA), e este à entrada de uma placa conversora analógica digital (DATAQ
DI-200) instalada num computador, cujos dados coletados foram convertidos em
traçados e armazenados em arquivos através do software WINDAQ (DATAQ
Instrumentos, Inc. USA), para análise posterior. Após a preparação, os segmentos
isolados de bronquíolos foram submetidos a uma tensão de 1 gf e estabilização mantida
por um período de 1 hora com renovação do TM a cada 15 minutos, tempo necessário
para a adaptação da preparação às novas condições.

Para avaliação do efeito do óleo essencial de Lippia sidoides, (OELs) e seu

componente, foi obtido duas curvas concentração-resposta do agente contraturante KCl
à 60 mM (K60), provando a viabilidade do tecido, para dar continuidade, uma terceira
contração foi evocada com o agente contraturante a depender da via a ser analisada: via
do potássio KCl (60 mM) ou via colinérgica (ACh 10 μL). Em seguida sobre essa
terceira contração foi acrescentada doses subsequentes e cumulativas do OELs, nas
concentrações de: 1, 3, 10, 30, 100, 300, 600, 1000 e 3000 µg/mL, em experimentos
distintos, logo após foram realizadas lavagens sucessivas com TM afim de
desimpregnar os agentes em estudo do tecido brônquico para posterior indução de
contração com K60 a fim de observar a recuperação do tecido.

2.5 Análise estatística

Os resultados dos dados obtidos nos testes foram apresentados como média ±
E.P.M. (n), onde não representou o número de experimentos e E.P.M. é o erro padrão da
média. Os gráficos foram produzidos através do software Sigma Plot 11.0 para análise
estatística. Para comparação de dois grupos, será realizado o teste t pareado ou não
pareado; para mais de dois grupos experimentais, ANOVA seguido de técnica de
contraste (testes paramétricos ou não paramétricos), conforme apropriado. Foram
considerados estatisticamente significantes os resultados que apresentarem
probabilidade de ocorrência da hipótese de nulidade menor que 5% (p < 0,05). As IC 50
foram calculadas por interpolação semilogarítmica e ajuste sigmoide através do
software Sigma Plot 11.0, sendo consideradas neste trabalho como a concentração da
substância que é capaz de produzir 50% do efeito inibitório máximo.

3. Resultados e discussão

3.1 Caracterização química do OELs

Com a análise química do óleo essencial de L. sidoides por CG-MS permitiu
identificar 30 compostos, representando 97.74 % do óleo essencial; seus índices de
retenção e composição percentual são apresentados na Tabela 1. O timol apresentou-se
como constituinte majoritário (74.88 %), seguido por outros constituintes secundários
como (E)-cariofileno (5.41 %), ρ-cimene (5.21 %), eucaliptol (2.39 %) e γ-terpinene
(1.51 %). Os demais constituintes apresentaram teor menor que 1% da constituição do
óleo.

Grande parte dos trabalhos sobre análise da composição química do óleo

essencial L. sidoides, espécie nativa da região Nordeste do Brasil tem demonstrado a
presença do monoterpeno timol como composto majoritário, assim como observado no
presente trabalho, resultado este semelhante ao obtido por Brito et al. (2015), no qual
também se verificou o timol como constituinte majoritário.
Destaca-se que o timol 5-metil-2-(1-metiletil)-fenol é um monoterpeno
encontrado em inúmeras plantas aromáticas sendo biossintetizados a partir do γ-
terpineno e do ρ-cimeno, assim como seu isômero carvacrol, 2-metil-5-(1-metiletil)-
fenol, constituintes estruturalmente semelhantes diferindo apenas na posição do grupo
hidroxila ligado ao anel aromático. (NOSTRO; PAPALIA, 2012).
Os resultados verificados para a análise químíca do OELs neste estudo, também
foram similares ao descritos por Oliveira et al. (2018) (68.45%) , Costa e Carvalho et
al. (2013) (42.33%), Veras et al., (2012) (84.9%) que identificaram o timol como
constituinte majoritário do OELs nos seus respectivos trabalhos. Entretanto os
resultados apresentados diferem do descrito por Guimarães et al. (2014) no qual foram
identificados o carvacrol (26,44%) e o 1,8-cineol (22,63%) como os constituintes mais
abundantes do OELs. Segundo Santos et al. (2015) alguns fatores como idade da planta,
disponibilidade nutricional, fatores genéticos e fatores climáticos, são significativos e
influenciam na composição química e no conteúdo de óleos essenciais de plantas
aromáticas.

O gênero Lippia possui espécies conhecidas por serem em sua grande maioria
produtoras de óleos essenciais e por sua diversidade de compostos químicos como
timol, carvacrol, geranial, linalol, ρ-cymene, carvona, neral, limoneno, β-caricofeno,
óxido de cariofileno, mirceno e γ -terpineno, que conferem amplas propriedades
medicinais a estas espécies (SANTOS et al., 2015).
Neste aspecto o óleo essencial de L. sidoides tem sido alvo de inúmeras
investigações, especialmente por suas potenciais atividades biológicas atribuídas a
presença de princípios ativos. A literatura reporta diversas propriedades biológicas do
óleo essencial e seus constituintes como timol e carvacrol tais como: larvicida (URANO
CARVALHO et al., 2003), fungicida (COSTA e CARVALHO et al., 2013)
leshimanicida (FARIAS-JUNIOR et al., 2012) antibacteriana (LOBO et al., 2014) e
acaricida (OLIVEIRA et al., 2018), miorrelaxante em traqueia de ratos (TEÓFILOO,
2012).

Devido tais características o efeito miorrelaxante é bastante estudado para vários

constituintes presentes no OELs â exemplo temos: efeito vasorrelaxante do timol e
carvacrol em aorta isolada de rato (PEIXOTO-NEVES et al., 2010), efeito relaxante do
carvacrol em traqueia de cobaia (BOSKABADY; JANDAGHI, 2003), efeito
vasorrelaxante do 1,8-cineol em aorta de rato (PINTO et al., 2009) e efeito
miorrelaxante do trans-cariofileno em traqueia de rato (PINHO-DA-SILVA et al., 2012).
Além disso, sabe-se que estudos comprovam a baixa toxicicidade do OELs
(FONTENELLE et al., 2007), e ainda que este espécime foi incluído na lista de plantas
selecionadas pelo Governo do estado do Ceará, como fitoterápico e é cultivado em
hortos de plantas medicinais, reforçando a Política Nacional de Práticas Integrativas e
Complementares (PNPIC) no âmbito do SUS (COSTA et al., 2002). Todos esses dados
contribuem para a avaliação do efeito do OELs nos protocolos apresentados a seguir.

3.2 Efeito boncodilatador de L. sidoides

Para avaliar a influência do OELs, sobre contrações induzidas por K + e ACh

foi administrada concentrações crescentes e cumulativas de OELs 1-3000 µg/mL, nas
preparações de musculo brônquico suíno previamente contraídos por KCl (60 mM) ou
ACh (10 μM).
Inicialmente, ao avaliar as contrações da musculatura lisa brônquica induzida
por KCl, verificou-se que OELs, foi capaz de relaxar 100% a contração promovida por
K60 de forma concentração dependente quando comparado com o controle (Fig. 1A).
Observou-se que, esse efeito ocorreu de forma estatisticamente significante a partir da
concentração de 100 μg/mL (p < 0,001, ANOVA, método Holm-Sidak). Os valores de
IC50 obtidos nesta via foi de: 450,49 ± 5,73 μg/mL. Sabe-se que a presença do K + no
meio extracelular desencadeia uma alteração do potencial transmembrana por via
eletromecânica, que promove uma despolarização na membrana e abre canais para Ca 2+
operados por voltagem (CCOV), ocorrendo o influxo de Ca 2+ promovendo assim a
contração (BOLTON et al., 1999).
Ao avaliar o OELs sobre as contrações promovidas pela acetilcolina 10 μM,
verificou-se que o OELs, não inibiu 100% a contração mesmo triplicando a
concentração máxima do protocolo anterior (Fig. 1B). O relaxamento promovido pelo
OELs nesta via foi estatisticamente significante apenas para as concentrações de 600,
1000 e 3000 μg/mL, sendo: 15.14 ± 8.23, 20.15 ± 9.88, 30.39 ± 10.51 %, o relaxamento
obtido, respectivamente (p < 0,001, ANOVA, método Holm-Sidak). (Fig. 1B).
Esses dados nos permite sugerir que o OELs também possui atividade, mesmo
que reduzida, nos receptores muscarínicos e como efeito secundário promovendo pouco
ou nenhum influxo de Ca2+ pelos canais de cálcio ligante-dependentes, uma vez que,
esses receptores necessitam de segundos mensageiros trifosfato inorgânico (IP3),
diacilglicerol (DAG), que são ativados pela ACh (DEVI et al., 2011).
Os resultados sugerem que o OELs apresenta efeito miorrelaxante em tecido
brônquico suíno. Tal efeito possivelmente tem participação direta dos CCOV, pois a
broncodilatação não foi observada com igual potência para o efeito do OELs em
contrações evocadas por ACh. Pode-se afirmar que do ponto de vista farmacodinâmico
o OELs apresenta efeito miorrelaxante, o qual se mostra reversível mediante a
realização de lavagens com a solução nutridora, mostrando que o tecido permaneceu
viável durante todo o experimento.
O possível envolvimento dos CCOV deve ser ressaltado uma vez que, esses
canais são os principais canais ativados mediante a mudança transitória de potencial
transmembrana causado pela alteração da concentração de íons tais como o K+ no meio
externo (SOMLYO AND SOMLYO, 1994).
Neste aspecto estudos anteriores relataram atividade miorrelaxante da espécie
Lippia alba em aorta, útero e porções intestinais de ratos (SILVA et al., 2018;
PEREIRA-DE-MORAIS et al., 2019; BLANCO et al., 2013), tais resultados destacam o
efeito miorrelaxante em presença de contrações evocadas por K+ e ACh.
Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com os dados encontrados por
Carvalho et al. (2018) nos quais demonstram que o óleo essencial de Lippia alba e seus
constituintes isolados, promovem relaxamento das contrações provocadas pela via
eletromecânica (K+) em contraste com o baixa eficácia no relaxamento das contrações
provocadas pela via farmacológica (ACh). Com isso, sugere-se que a atividade
observada está relacionada ao bloqueio dos canais iônicos dependentes de voltagem.
Os trabalhos citados para efeito miorrelaxante de produto natural são em sua
maioria em tecido muscular de roedores, o método utilizado propõe um modelo
farmacológico alternativo para estudo de substâncias naturais com potencial
farmacológico em doenças respiratórias (DANTAS et al., 2019).
Neste aspecto propõe que esse estudo evidenciou atividade relaxante do OELs
no tecido respiratório de S. scrofa domesticus. Dada a semelhança fisiológica do trato
respiratório suínos com o dos seres humanos, fica demonstrado que o OELs tem grande
potencial farmacológico para tratar doenças do trato respiratório. No entanto, se fazem
necessários outros estudos para compreender melhor os mecanismos envolvidos, bem
como avaliar outras possíveis vias farmacológicas e/ou eletromecânica. É necessário
também estudos mais aprofundados na área da fisiologia respiratória para evidenciar se
os estudos com tecidos de suínos são mais promissores do que estudos com tecidos de
ratos, para portanto validarmos o estado da arte.

4. Conclusão

Os resultados mostram que o OELs, possui efeito miorrelaxante em tecido

brônquico de suíno, este efeito pode ser mediado por canais iônicos presentes na
membrana, pois reverte as contrações induzidas pelo potássio. Com isso evidenciou-se
potencial para ser futuro agente terapêuticos na prevenção contra doenças que afetam o
sistema respiratório as quais envolvem brococonstricção, como no caso da asma e
bronquites. Podemos observar também a eficácia do método escolhido para o
desenvolvimento da pesquisa. Estudos posteriores serão necessários para atestar o
mecanismo de ação do OELs e para demostrar se o método de bronquíolo de porco é
melhor do que o método já bem disseminado com traqueia e brônquio de ratos.