Princípios e Aplicações da Técnica de PCR

Prof. Dr. Renah Boanerges de

Queiroz Pimentel
 PCR
Reação em Cadeia da
Polimerase
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION

A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Amplificação in vitro de sequências
ESPECÍFICAS de DNA
 ESTRUTURA E
REPLICAÇÃO DO DNA
Estrutura dos ácidos nucleicos
DNA – Ácido DesoxirriboNucleico
RNA – Ácido RiboNucleico
Estrutura dos ácidos nucleicos
Desnaturação e Renaturação do DNA

FORTE FRACA
ligações pontes de H
fosfodiéster (entre as
(mesma fita) fitas)
Estrutura dos ácidos nucleicos
Desnaturação e Renaturação do DNA

5’ 3’

3’ 5’
Estrutura dos ácidos nucleicos
Desnaturação e Renaturação do DNA
5’ 3’

3’ 5’
Estrutura dos ácidos nucleicos
Desnaturação e Renaturação do DNA

5’ 3’

3’ 5’
Replicação do DNA
A replicação do DNA ocorre de forma semiconservativa
Replicação do DNA
Polimerização unidirecional: sentido 5’ € 3’
 PCR
Fundamentos da Técnica
Fundamentos da PCR
Estrutura dos ácidos nucleicos
Replicação do DNA
Conceito da técnica de PCR
Fundamentos da técnica de PCR
Aplicações da PCR
Como visualizar e interpretar os resultados
Quais as variações da técnica de PCR
Como preparar reações de PCR
PCR na prática!
Fundamentos da PCR
A Reação em Cadeia da Polimerase

Polimerização in vitro do DNA

- Apenas moléculas de DNA (RNA e proteínas)
- Enzima DNA polimerase
- Amplificação de sequências específicas

Reação em “Cadeia”: reação cíclica

- Produtos de um ciclo são substrato para o ciclo
seguinte
Fundamentos da PCR

PCR
Reação enzimática baseada na
Replicação
Fundamentos da PCR

TEMPERATURA
Fundamentos da PCR
Os iniciadores de PCR
A Enzima DNA polimerase não se liga em fita
simples Iniciadores ou oligonucleotídeos
(=PRIMERS)
Utilização de pares de inciadores (um complementar para cada
fita) Iniciador Senso (Forward): se liga na fita 3’-5’

Iniciador Antissenso (Reverse): se liga na fita 5’-3’

Fundamentos da PCR
2 5°C

95°C

60°C

72°C
Fundamentos da PCR

Reação Cíclica

Desnaturação

Várias vezes...
Extensão
Hibridização
Fundamentos da
PCR
Fundamentos da PCR

…até bilhões de
cópias!
Fundamentos da PCR

Visualização dos produtos em géis (eletroforese)

A cada ciclo, o número de cópias aumenta

10 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

Número de ciclos
Fundamentos da PCR
Componentes de uma reação de PCR:

Amostra de DNA
dNTPs (dATP, dTTP, dCTP,
dGTP)
Iniciadores (S e AS)
Enzima DNA
Polimerase Tampão da
enzima

Mg2+ (MgCl2 ou MgSO4)

Fundamentos da PCR

Mg2+

TAMPÃO
Fundamentos da PCR
As principais etapas:

Desnaturação Hibridização Extensão

(90-96°C) (45-60°C) (68-
72°C)
DNA
Polimerase
(termoestável)
Fundamentos da PCR

Enzima DNApolimerase

95°C 60°C 72°C

Fundamentos da
PCR
Fundamentos da PCR

Thermus aquaticus (1976)

+ Pares de iniciadores
(Yellowstone National Park)

(Taq DNA polymerase)

Fundamentos da PCR

1983 – Automação da técnica de PCR

1989 – Patente (Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation)

1993 – Prêmio Nobel de Química

Kary Banks Mullis

 PCR
Amplificação da sequência
alvo
Fases da PCR: princípio básico
Reação enzimática: DNA polimerase.
Temperatura + pH
Temperaturas diferentes: enzima e
substrato/produto
Produto da reação: Gel (agarose; poliacrilamida).

Reagentes Termociclador Gel

Fases da PCR: ciclos

T °C

95

72
60

Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo n

Tem po
Fases da PCR: ciclos
Termocicladores
Fases da PCR: amplificação da sequência
alvo

http://www.youtube.com/watch?v=ZmqqRPISg0g
Fases da PCR: amplificação da sequência
alvo
Fases da PCR: amplificação da sequência
alvo

Rate of PCR2n
1.8E+09

1.6E+09

1.4E+09

1.2E+09
DNA copy number

1.0E+09

8.0E+08

6.0E+08

4.0E+08
1 2 4 8
2.0E+08

0.0E+00
15 20
0 5 10
PCR cycle
25 30 35
Número de moléculas de DNA
Fases da PCR: amplificação da sequência
alvo
109
108
107
Platô
Cópias

106
105
104 Cópias do DNA: 1.073.741.824
Cópias do alvo: 1.073.741.764
103
102
10

1 3 5 10 15 20 25 30
Ciclos
Fases da PCR: amplificação da sequência
alvo
Platô
Linear Sem amplificação
Baixa eficiência

Log [DNA]

Exponencial
Alta eficiência

N° de Ciclos
Fases da PCR: amplificação da sequência alvo

Platô Detecção e m gel

Sem amplificação
• Perda da atividade da enzima;

• Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de

DNA;
• Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si,
em detrimento do pareamento com os iniciadores;

• Gasto dos reagentes, especialmente dos inciadores e dos

dNTPs;

• Acúmulo de pirofosfato (resultante das ligações fosfodiéster);

• Competição com outros produtos que vinham sendo

amplificados;

• INIBIÇÃO PELOS PRODUTOS.

 PCR
Aplicações da técnica
Aplicações da técnica de PCR

Identificação de
espécies
Iniciadores para cada espécie
Amplificação de genes
específicos (Ausência nas
outras espécies)

Diagnóstico molecular
Iniciadores específicos
Presença/ausência do gene
(positivo ou negativo para o
teste)
Aplicações da técnica de PCR

Medicina forense
Identificação humana
Marcadores humanos
específicos (necessidade de
controles)

Teste de paternidade
Identificação humana
Marcadores humanos
específicos (teste em todos os
envolvidos)
Aplicações da técnica de PCR
As diferentes aplicações da técnica de PCR:
Amplificação de fragmentos específicos de
DNA; Clonagem;
Medicina forense;
Diagnóstico molecular;
Detecção de mutações;
Identificação de espécies;
Análises de expressão
gênica; Filogenia
molecular...
 PCR
Variações da técnica
Variações da Técnica de PCR
• Touchdown PCR e Hot start DNA pol
• RAPD, AFLP e RFLP
• Nested PCR
• Multiplex PCR e Rep-PCR
• SSCP
• PCR assimétrica e LATE-PCR
• PCR inversa
• QC-PCR
• Long PCR e PCR in situ (PRINS)
• RACE
• PCR digital
• Transcrição Reversa seguida de PCR (RT-PCR)
• PCR quantitativa e m tempo real (qPCR)
Variações da PCR: RT-PCR

Transcrição Reversa

mRNA

cDNA
Variações da PCR: RT-PCR
Permite a análise de transcritos (mRNA)
Análises fenotípicas de expressão gênica
Variações da PCR: RT-PCR
Padronização; Baixa
sensibilidade; Baixa
resolução;
Pobre discriminação entre os produtos amplificados;
Técnica qualitativa (pouco quantitativa);

Não automatizado.
1 2 3 4
500
400
305, 315 ou 325 pb ?
300
50, 55 ou 70 ng ? 200
100
Variações da PCR: qPCR

PCR quantitativa em tempo real (qPCR)

Método baseado na PCR convencional (presença de
fluoróforos) Monitoramento contínuo de um sinal fluorescente
ao logo dos ciclos Permite análise de dados durante todo o
processo (Real-Time).

Conversão do sinal fluorescente em valor numérico para cada

amostra.

Desn atur ação Hibridização Extensão

Variações da PCR:
qPCR
Variações da PCR: qPCR

Aumento da quantidade de um produto de

amplificação

Aumento da
fluorescência
Variações da PCR: qPCR

Ciclos
MIQE
Guidelines