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FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
FORTALEZA
2016
ALYNE MARA RODIGUES DE CARVALHO
FORTALEZA
2016
ALYNE MARA RODRIGUES DE CARVALHO
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________
Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará
___________________________________________
Profa. Dra. Aline de Albuquerque Oliveira
Faculdade Metropolitana de Fortaleza
__________________________________________
Prof. Dra. Teresa Maria de Jesus Ponte Carvalho
Universidade Federal do Ceará
__________________________________________
Prof. Dra. Patrícia Freire de Vasconcelos
Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira
__________________________________________
Prof. Dr. Francisco Fleury Uchoa Santos Júnior
Centro Universitário Estácio do Ceará
AGRADECIMENTOS
Do fruto não maduro da espécie Aniba riparia (Nees) Mez, encontramos algumas alcamidas,
uma em especial, a Riparina II (RipII) possui um interessante potencial terapêutico. Estudos
anteriores mostraram que a mesma apresentou efeitos ansiolíticos e antidepressivo além de um
efeito antiinflamatório. Este trabalho foi desenvolvido após aprovação pela CEUA/UFC (nº
41/15). O objetivo do estudo foi avaliar o papel da RipII no processo de nocicepção, os possíveis
canais e mediadores envolvidos e os possíveis mecanismos farmacológicos envolvidos. Foram
utilizados camundongos Swiss machos e inicialmente foi realizado o teste de toxicidade
segundo a OECD 425, o teste de toxicidade oral por 28 dias e a modelagem molecular para os
os receptores TRPV1, TRPA1 e bradicinina. Os modelos experimentais de nocicepção
realizados foram: contorções induzidas pelo ácido acético, hipernocicepção mecânica induzida
por agentes algésicos (carragenina, PGE2 e epinefrina), teste de nocicepção induzida pela
injeção intraplantar de capsaicina, cinamaldeído, mentol, bradicinina, PMA e 8-Br-AMPc, além
de investigar o envolvimento dos canais de potássio e alguns sistemas de neurotransmissores.
A RipII (25 e 50 mg/kg, v.o.) foi capaz de reduzir de forma significativa a nocicepção induzida
por ácido acético e a hipernocicepção induzida por carragenina, PGE2 e epinefrina. No teste das
contorções abdominais induzidas por ácido acético foi realizada curva de tempo com a dose de
50mg/kg e observou-se que os efeitos da RipII-50mg/kg apareceram após 30 minutos e persistiu
por 240 minutos. Na investigação do mecanismo antinociceptivo, a RipII mostrou efeito
relacionado com os canais K+ATP, TRPV1, TRPM8, ASIC, receptores de bradicinina, PKA e
PKC. Para estudar as possíveis vias de neurotransmissão foi realizado o modelo de contorções
induzidas por ácido acético e os animais foram pré-tratados diferentes substâncias. O efeito
antinociceptivo da RipII (50 mg/kg, v.o.) foi revertido quando os animais foram pré tratados
com naloxona, glibenclamida e ioimbina, enquanto os animais não apresentaram qualquer
alteração comportamental, quando pré-tratadas com NAN-190, ritanserina, ondansetrona,
atropina e/ou haloperidol. Estes dados demonstram que RipII produz um importante efeito
antinociceptivo através de mecanismos moleculares dos canais K+ATP, TRPV1, TRPA1,
TRPM8, ASIC, PKC, PKA, receptores de bradicinina, receptores α2-adrenérgico e receptores
opioides.
The unripe fruit of the species of Aniba riparia (Nees) Mez, found some alkamides, one in
particular, Riparin II (RipII) has an interesting therapeutic potential. Previous studies showed
that it had anxiolytic and antidepressant effects as well as an antiinflammatory effect. This study
was conducted after approval by the CEUA/UFC (n° 41/15). The aim of the study was to
evaluate the role of RipII in nociception process, possible channels and mediators involved and
the possible pharmacological mechanisms involved. They used male Swiss mice and was
initially performed the toxicity test according to OECD 425, the oral toxicity test for 28 days
and the molecular modeling of the TRPV1, TRPA1 and bradikynin receptors. The models of
nociception were performed: writhes induced by acetic acid, hyperalgesia mechanical induced
nociceptive agents (carrageenan, PGE2 and epinephrine), nociception test induced by
intraplantar injection of capsaicin, cinnamaldehyde, menthol, bradykinin, PMA and 8-Br-
cAMP, and investigate the role of potassium channels and some neurotransmitter systems. The
RipII (25 and 50 mg/kg, p.o.) was able to significantly reduce nociception induced by acetic
acid and hyperalgesia induced by carrageenan, PGE2 and epinephrine. In the test of writhing
induced by acetic acid was carried out time curve at a dose of 50 mg/kg and we observed that
the effects of RipII-50mg/kg appeared within 30 minutes and persisted for 240 minutes. In the
investigation of the analgesic mechanism, RipII showed effect related to the K+ ATP channels,
TRPV1, TRPM8, ASIC, bradykinin receptors, PKA and PKC. To study possible
neurotransmission pathways was performed writhing model of acetic acid-induced and the
animals were pretreated different substances. The analgesic effect of RipII (50 mg/kg, p.o.) was
reversed when the animals were pretreated with naloxone, glibenclamide and yohimbine, while
the animals showed no behavioral change when pretreated with NAN-190, ritanserin,
ondansetron, atropine and/or haloperidol. These data demonstrate that RipII produces a
significant antinociceptive effect via molecular mechanisms of K+ ATP channels, TRPV1,
TRPA1, TRPM8, ASIC, PKC, PKA, bradykinin receptors, α2 adrenergic receptors and opioid
receptors.
1 Média do ganho de peso dos animais no teste de toxicidade oral por 28 dias....... 51
2 Efeito da administração de RipII na nocicepção induzida por ácido acético em
camundongos......................................................................................................... 61
3 Efeito da RipII no teste da hipernocicepção inflamatória induzida por
carragenina............................................................................................................. 63
4 Análise histológica das patas de camundongos...................................................... 64
5 Níveis de MDA e Nitrito nas patas de camundongos inflamadas por
carragenina............................................................................................................. 66
6 Efeito da RipII no teste da hipernocicepção inflamatória induzida por
PGE2...................................................................................................................... 67
7 Efeito da RipII no teste da hipernocicepção inflamatória induzida por
Epinefrina............................................................................................................... 68
8 Papel dos receptores de potencial transiente do tipo V1 (TRPV1) no efeito
antinociceptivo da RipII......................................................................................... 69
9 Papel dos receptores de potencial transiente do tipo A1 (TRPA1) no efeito
antinociceptivo da RipII......................................................................................... 70
10 Papel dos receptores de potencial transiente do tipo M8 (TRPM8) no efeito
antinociceptivo da RipII......................................................................................... 72
11 Papel dos canais iônicos sensíveis ao ácido (ASIC) no efeito antinociceptivo da
RipII....................................................................................................................... 74
12 Envolvimento da RipII no comportamento nociceptivo causado pela injeção
intraplantar de bradicinina...................................................................................... 76
13 Efeito da RipII na nocicepção induzida pela injeção intraplantar de PMA........... 77
14 Efeito da RipII na nocicepção induzida pela injeção intraplantar de 8-Br-
AMPc..................................................................................................................... 78
15 Influência do pré-tratamento com glibenclamida (2 mg/kg) sobre o efeito
antinociceptivo da RipII......................................................................................... 79
16 Influência do pré-tratamento com naloxona (1 mg/kg) sobre o efeito
antinociceptivo da RipII......................................................................................... 80
17 Influência do pré-tratamento com ioimbina sobre o efeito antinociceptivo da
RipII...................................................................................................................... 81
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
µg Micrograma
5-HT 5-hidroxitriptamina (serotonina)
AMPc Adenosina 3´5´monofosfato cíclica
ANOVA Análise de variância
ATP Adenosina trifosfato
ASICs Canais iônicos sensíveis ao ácido
ASIC 1 Canais iônicos sensíveis ao ácido tipo 1
ASIC 4 Canais iônicos sensíveis ao ácido tipo 4
BK Bradicinina
Cg Carragenina
CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
COX Ciclooxigenase
DZP Diazepam
E.P.M. Erro Padrão da Média
GDNF Células gliais derivadas de fator neurotrófico
HE Hematoxilina Eosina
Il Interleucina
i.p. Intraperitonial
NGF Fator de crescimento neural
NK1 Neuroquinina 1
NMDA N-metil D-Aspartato
NMR Núcleo magno da rafe
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
P Nível de significância
P2X3 Receptor purinérgico 3
PAG Substância cinzenta periaquedutal
pCPA p-clorofenilalanina
PGs Prostaglandinas
PGE2 Prostaglandina tipo E2
PGF2 Prostaglandina tipo F2
PKA Proteína quinase A
PKC Proteína quinase C
RPM Rotações por minuto
s.c. Subcutâneo
SP Substância P
SMT Trato espinomesencefálico
SNC Sistema nervoso central
SRT Trato espinoreticular
STT Trato espinotalâmico
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TRKA Receptor de Tirosina Quinase tipo A
TRPA Receptor de Potencial Transitório do tipo Anquirina
TRPA 1 Receptor de Potencial Transitório do tipo Anquirina 1
TRPC Receptor de Potencial Transitório do tipo Canônico
TRPM Receptor de Potencial Transitório do tipo Melastatina
TRPM 8 Receptor de Potencial Transitório do tipo Melastatina 8
TRPV Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide
TRPV 1 Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide 1
TRPV 2 Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide 2
TRPV 3 Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide 3
TRPV 4 Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide 4
VLF Funículo ventrolateral
v.o. Via oral
VR1 Receptor do tipo vanilóide 1
Vs. Versus
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 15
1.1 Nocicepção e Dor 15
1.1.1 Transdução 17
1.1.2 Transmissão 22
1.1.3 Modulação da dor 28
1.2 Plantas Medicinais 31
1.2.1 Família Lauraceae e a espécie Aniba riparia 32
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA 36
3 OBJETIVO 37
3.1 Geral 37
3.2 Específicos 37
4 MATERIAIS E MÉTODOS 38
4.1 Material Botânico 38
4.2 Drogas e substâncias utilizadas 38
4.3 Animais 39
4.4 Princípios éticos 39
4.5 Estimativa da DL50 da Riparina II através da OECD 425 (Acute Oral 40
Toxicity-Up-And-Down)
4.6 Avaliação da toxicidade oral de doses repetidas por 28 dias 40
4.6.1 Procedimentos analíticos 41
4.6.1.1 Análise dos parâmetros hematológicos 41
4.6.1.2 Análise dos parâmetros bioquímicos 41
4.7 Modelagem Molecular 41
4.8 Avaliação da Atividade antinociceptiva 42
4.8.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético 42
4.8.2 Hipernocicepção inflamatória induzida por carragenina 43
4.8.2.1 Análise da lesão causada pela carragenina 43
4.8.3 Hipernocicepção inflamatória induzida por PGE2 43
4.8.4 Hipernocicepção inflamatória induzida por Epinefrina 44
4.9 Avaliação do mecanismo antinociceptivo da RipII 44
4.9.1 Participação dos receptores potêncial transiente (TRP) 44
4.9.1.1 TRPV1 44
4.9.1.2 TRPA1 44
4.9.1.3 TRPM8 45
4.9.2 Participação dos canais iônicos sensíveis ao ácido (ASICs) 45
4.9.3 Participação dos receptores de bradicinina 45
4.9.4 Participação da Proteína Quinase C (PKC) 46
4.9.5 Participação da Proteína Quinase A (PKA) 46
4.9.6 Participação dos Canais de potássio dependentes de ATP 46
4.9.7 Participação do Sistema Opióide 46
4.9.8 Participação do sistema α2-adrenérgico 47
4.9.9 Participação de receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5- 47
HT3)
4.9.10 Participação do sistema colinérgico 47
4.9.11 Participação do sistema dopaminérgico 47
4.10 Análise estatística 48
5 RESULTADOS 49
5.1 Ensaios de Toxicidade 51
5.1.1 Estimativa da DL50 da RipII através da OECD 425 (Acute Oral Toxicity- 51
Up-And-Down)
5.2 Toxicidade oral da Riparina II no protocolo de doses repetidas por 28 51
dias
5.2.1 Sobrevivência, massa corpórea e observações comportamentais. 51
5.2.2 Análise dos parâmetros hematológicos 52
5.2.3 Análise dos parâmetros bioquímicos 53
5.2.4 Análise macro e microscópica dos órgãos 54
5.3 Modelagem Molecular 55
5.3.1 TRPV1 55
5.3.2 TRPA1 56
5.3.3 Bradicinina 57
5.4 Avaliação da Atividade Antinociceptiva 61
5.4.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético 61
5.4.2 Hipernocicepção inflamatória induzida por carragenina 63
5.4.2.1 Análise da lesão causada pela carragenina 64
5.4.3 Hipernocicepção inflamatória induzida por PGE2 67
5.4.4 Hipernocicepção inflamatória induzida por Epinefrina 68
5.5 Avaliação do mecanismo antinociceptivo da RipII 69
5.5.1 Participação dos receptores TRP 69
5.5.1.1 TRPV1 69
5.5.1.2 TRPA1 70
5.5.1.3 TRPM8 72
5.5.2 Participação dos canais iônicos sensíveis ao ácido (ASICs) 74
5.5.3 Participação dos receptores de Bradicinina 76
5.5.4 Participação da Proteína Quinase C (PKC) 77
5.5.5 Participação da Proteína Quinase A (PKA) 78
5.5.6 Participação dos Canais de potássio dependentes de ATP 79
5.5.7 Participação do Sistema Opióide 80
5.5.8 Participação do Sistema α2 adrenérgico 81
1 INTRODUÇÃO
Desde os tempos mais remotos, conforme sugerem alguns registros gráficos da pré-
história e de documentos escritos, o homem sempre procurou esclarecer as razões que
justificassem a ocorrência de dor e os procedimentos destinados ao seu controle. A dor desde
os primórdios da humanidade está ligada ao homem e continua sendo uma grande preocupação
para a sociedade (SBED, 2016).
Atualmente, os dados adquiridos no último censo demográfico realizado pelo
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) em 2010, foram observadas mudanças
na estrutura etária brasileira (11,3 % da população brasileira acima de 60 anos), que está
diretamente relacionada à transição epidemiológica, pois à medida que a população envelhece,
maior é a prevalência de problemas crônicos de saúde (IBGE, 2010). Dentre as principais
consequências que essa mudança traz para a sociedade, a dor é uma das mais significativas,
sendo em muitos casos a dor crônica como principal queixa do indivíduo, interferindo
consideravelmente na qualidade de vida dos idosos (SBED, 2015).
A incidência da dor crônica no mundo oscila entre 7% a 40% na população. No
Brasil, estudos mostram altas taxas de prevalência, cerca de 41,4 até 61,4% na população
(KRELING; CRUZ; PIMENTA, 2006; SÁ et al., 2009), sendo que cerca de 50% a 60% dos
pacientes ficam parcial ou totalmente incapacitados, de maneira transitória ou permanente,
comprometendo de modo significativo a qualidade de vida, com impactos sociais e econômicos
negativos. Consequentemente, muitos dias de trabalho podem ser perdidos por indivíduos
portadores de quadro álgico (BLYTH, 2008).
A Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) em uma reunião que
ocorreu em Kyoto no ano de 2007 definiu a dor como “uma experiência sensorial e emocional
desagradável, associada a uma lesão tecidual, real ou potencial, ou descrita em termos de tal
lesão”. No entanto, em 2011 a IASP alterou este conceito, que passou a ser “uma experiência
sensorial e emocional desagradável associada a uma lesão tissular, potencial ou real, ou mesmo
a nenhuma lesão, embora, ainda assim, descrita com termos sugestivos de que o dano tecidual
tivesse de fato ocorrido” (IASP, 2010).
A dor é sempre subjetiva onde cada indivíduo aprende a aplicação da palavra
através de experiências relacionadas com lesões no início da vida. Porém, a percepção corporal
16
da dor é denominada nocicepção, termo fisiológico usado para descrever o processo neural de
codificação e processamento de estímulos nocivos (LOESER; TREEDE, 2008).
O termo nocicepção, na comunidade científica, foi introduzido em 1906 para
diferenciar a percepção de estímulos nocivos da sensação da dor propriamente dita, é um
processo puramente fisiológico. Desta forma, a nocicepção consiste na recepção e
decodificação do estímulo nocivo por estruturas altamente especializadas do sistema nervoso
– os nociceptores. Tais nociceptores consistem em terminações nervosas livres associadas a
fibras aferentes primárias com características distintas (por exemplo, limiares de ativação e
sensibilidade) em relação a outras estruturas nervosas sensoriais (ALMEIDA;
ROIZENBLATT; TUFIK, 2004; LOESER; TREEDE, 2008).
A dor fisiológica é aquela que induz respostas protetoras, como o reflexo de
retirada (ou reação de fuga), com intuito de interromper a exposição ao estímulo nocivo. Este
sinal é típico da dor aguda produzida por estímulos intensos na superfície da pele. (FANTONI;
MASTROCINQUE, 2002; HELLEBRAKERS, 2002).
A dor também pode ser avaliada em animais, através da observação
comportamental de movimentos estereotipados clássicos da espécie que são evidenciados após
a estimulação nociceptiva. Assim sendo, modelos animais de dor são, de fato, modelos de
nocicepção uma vez que a discriminação do componente emocional da dor é limitada. A
importância desses estudos experimentais em animais encontra-se no fato de que eles têm
contribuído de forma significativa para o entendimento dos múltiplos mecanismos envolvidos
na transmissão e processamento da informação nociceptiva. (TJOLSEN; HOLE, 1997;
MERCADANTE, 1999).
O conhecimento sobre os mecanismos nociceptivos atingiu avanços significativos,
porém contrasta diretamente com a ausência de avanços nas estratégias terapêuticas. Sabemos
que os fármacos utilizados hoje para o controle da dor são os mesmos há décadas, basicamente
opióides e anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), que, embora eficazes em grande parte
das condições dolorosas, apresentam efeitos adversos que tornam o tratamento clínico limitado
(NEGUS et al., 2006; WOODCOCK et al., 2007). O aparecimento da tolerância analgésica e
a possibilidade de desenvolvimento de dependência química são alguns dos efeitos adversos
apresentados pelos analgésicos opióides. Entre os AINEs, o problema mais frequente está
relacionado às complicações gastrintestinais (HENRY et al., 1996; COLLETT, 1998;
WHITTLE, 2003).
A dor tem diversas classificações, que vai depender do enfoque para análise. Em
relação ao tempo de permanência, podemos classificá-la como: aguda (resposta normal
17
causada por dano tecidual, com ativação de receptores, de modo que a dor pode ser revertida
antes mesmo da total restauração fisiológica do local afetado), e crônica (a lesão ou a patologia
que a gera e supera a capacidade do organismo em restaurar o tecido afetado) (LOESER;
MELZACK, 1999). Quanto à localização, pode ser classificada em: visceral (quando os
estímulos dolorosos são provenientes dos orgãos internos), ou somática (onde o estímulo que
gera a sensação dolorosa é oriundo da periferia do organismo, podendo ser superficial cutânea
ou profunda) (RAJA et al., 1999).
A dor ainda pode ser classificada quanto a sua fisiopatologia, em nociceptiva,
neuropática e psicogênica. A nociceptiva ocorre se os mecanismos de sustentação da dor
envolvem lesão tecidual e pode envolver tanto estruturas viscerais como somáticas. Já a dor
neuropática é proveniente do processamento somatosensorial anormal a nível central ou
periférico. E por fim, a dor psicogênica ocorre quando existe uma dor persistente sem evidência
de má desordem que poderia causa-la. (BEERS, 2003).
A dor pode ser gerada pelo excesso de estímulos nociceptivos, pela diminuição do
limiar de disparo sensitivo ou pela hipoatividade do sistema supressor. Nas condições normais,
a divisão aferente do sistema nervoso periférico (SNP) capta estímulo sensorial e transmite
para o Sistema Nervoso Central (SNC), onde é decodificada e interpretada. Mecanismos
modulatórios sensibilizam ou suprimem a nocicepção em todas as etapas em que ela é
processada. (MILLAN, 1999; STANFIELD, 2013).
Existem três mecanismos interligados que explicam a ocorrência da sensação de
dor. O primeiro deles é a transdução, que consiste na ativação dos nociceptores por ocorrência
de um estímulo nocivo (podendo ser mecânico, térmico ou qúimico), gerando um potencial de
ação. A transmissão, efetuada pelo conjunto de vias que conduzem o impulso nervoso gerado
pelo nociceptor, leva a informação dolorosa para o SNC. Por fim, a modulação pode ativar vias
responsáveis pela supressão da dor gerada pelos próprios nociceptores e suas vias
(MESSLINGER, 1997; PORTO, 2004; TRANQUILLI, 2004).
1.1.1 Transdução
temperatura da pele; e nociceptores para detectar estímulos lesivos a tecidos (MUIR III, 2001)
(Tabela 1).
que participam da nocicepção inflamatória bem como algumas características que devem ser
ressaltadas sobre os mesmos estão relacionados na figura 2.
1.1.2 Transmissão
Essa informação se propaga pelos neurônios de segunda ordem, que podem ser
classificados em: neurônio nociceptivo específico (NS), que se encontra em elevada proporção
na lâmina I e responde apenas a impulsos provenientes de estimulação nociva somática e
visceral de alta intensidade - fibras Aδ e C; e/ou de neurônio de ampla faixa dinâmica (WDR),
que são encontrados principalmente na lâmina V. Eles se projetam no tronco encefálico e em
certas regiões do tálamo, podendo efetuar sinapses com os aferentes primários
mecanorreceptivos de baixo limiar (fibras do tipo Aβ, relacionadas com o tato) (MILLAN,
2002).
As informações sobre o dano tecidual são conduzidas por vias ascendentes ântero-
laterais de transmissão e que tem origem nos axônios dos neurônios de segunda ordem das
lâminas I e V principalmente, e ascendem pelo funículo ântero-lateral para estruturas supra-
espinhais. Este complexo sistema de vias diretas e indiretas conduz a transmissão das
informações nociceptivas para neurônios que se projetam através de várias vias ascendentes,
como: (LAMONT; TRANQUILLI; GRIMM, 2000; DREWES, 2006; KLAUMANN et al.,
2008).
- Via da coluna dorsal e do leminisco medial: transmite ao tálamo informações
provenientes de mecanorreceptores e proprioceptores. Nessa via, os neurônios de primeira
26
As plantas medicinais constituem uma fonte renovável de onde podem ser obtidos
novos e eficazes medicamentos. A indicação de plantas medicinais aumenta a opção
terapêutica, ofertando medicamentos equivalentes, e talvez com indicações terapêuticas
complementares as medicações existentes sem substituir os medicamentos já comercializados
e registrados (SIMÕES et al, 1999; MAIOLI-AZEVEDO; FONSECA-KRUEL, 2007). As duas
principais vias de identificação de produtos naturais são (i) o conhecimento das práticas
tradicionais (ou etnofarmacologia), e (ii) a triagem aleatória de plantas, sendo a primeira mais
32
USO ESPÉCIES
Persea americana Mill., P. gratissima L., Laurus nobilis L.,
Culinária Cinnamomum zeylanicum Breyne e C. cassia (Nees) Nees & Ebert ex
Blume.
Cinnamomum camphora (L.) Presl., Lindera benzoin (L.) Blume,
Indústria Licaria guianensis Aubl., A. parviflora, A. rosaeodora Ducke, A.
Química canellita (H.B.K) Mez, Sassafras albidum Nutt., Ocotea pretiosa
(Nees) Benthan & Hooke e O. costulata Mez.
Das espécies que possuem efeito medicinal, uma que se destaca são as do gênero
Aniba, onde diversos efeitos farmacológicos têm sido encontrados na literatura, como: efeito
antiespasmódico da A. canelila (MAIA et al., 2003), efeitos cardiovasculates do óleo essencial
da A. canelilla (LAHLOU et al., 2005), atividade larvicida da A. duckei (SOUZA et al., 2007),
antifúngica e sedativa da A. roseodora (ALMEIDA et al., 2009; SIMIC et al., 2004).
A espécie Aniba riparia (Ness) Mez (que possui como sinônimo Aydendron
riparium Nees) é popularmente conhecida como louro e possui distribuição em diversos países
como Brasil (Região Amazônica), Colômbia, Peru, Equador, Bolívia e Venezuela. Seus frutos
contêm diversos constituintes químicos, como por exemplo, flavonóides, neolignanas,
stirilpironas e alcamidas (BARBOSA-FILHO et al., 1987). Esta última classe de substância tem
sido fonte de interesse de pesquisadores na busca de novas fontes vegetais com princípios
farmacologicamente ativos (CASTELO-BRANCO, 2000) (Figura 9).
34
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
Não há estudos epidemiológicos que englobem todas as regiões do país sobre a dor.
Em geral, a média da população brasileira que se queixa ou sofre de dor, é de cerca de 30%
(SBED, 2015). O tratamento convencional para o controle da dor apresenta baixa eficácia e
muitos efeitos colaterais, o que acaba afetando negativamente a qualidade de vida dos pacientes,
resultando na interrupção do tratamento (ATTAL et al., 2010).
Dessa forma, novas substâncias que possam agir em novos alvos moleculares
relacionados ao processo nociceptivo, como a transdução, é extremamente importante para a
descoberta de tratamentos eficazes para os pacientes com dor.
Em estudos prévios realizados por nosso grupo de pesquisa, a atividade
antinociceptiva e anti-inflamatória das riparinas I, II e III foi testada. A Riparina I demonstrou
esta atividade em modelos químicos e térmicos de nocicepção em camundongos, sendo
sugeridos mecanismos de ação periféricos e centrais do composto (ARAÚJO et al., 2009). A
Riparina II apresentou uma atividade anti-inflamatória em modelos químicos da inflamação
aguda (CARVALHO et al., 2013). Já a Riparina III apresentou uma atividade antinociceptiva
periférica, interagindo com os receptores TRP e os sistemas serotonérgico, opióide e colinérgico
(VASCONCELOS, 2015).
Considerando os estudos anteriores do nosso grupo, aliado a uma semelhança
estrutural entre as riparinas, decidiuse no presente trabalho investigar os efeitos antinociceptivo
da riparina II dando enfoque aos mecanismos envolvidos nesse potencial efeito.
37
3 OBJETIVO
3.1 Geral
3.2 Específicos
4 MATERIAIS E MÉTODOS
A planta Aniba riparia (Nees) Mez foi identificada pelo botânico Klaus Kubitzki
da Universidade de Hamburgo/Alemanha. O fruto verde de Aniba riparia (material botânico)
foi coletado na região de Humaitá, estado do Amazonas, Brasil (BARBOSA FILHO et al.,
1987). O material foi cedido ao Prof. Dr. José Maria Barbosa-Filho do grupo de pesquisa do
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba, e a extração e
isolamento foram feitos pelo Prof. Dr. Stanley Juan Chávez Gutierrez da Universidade Federal
do Piauí, conforme descrito abaixo.
A riparina II foi isolada da Aniba riparia, purificada por cromatografia em camada
delgada preparativa a sua estrutura foi confirmada por RMN e a pureza foi determinada por
cromatografia em camada delgada analítica e cromatografia liquida de alta eficiência,
determinado um grau de pureza de 99%.
4.3 Animais
4.5 Estimativa da DL50 da Riparina II através da OECD 425 (Acute Oral Toxicity-Up-
And-Down)
A dose via oral inicial de RipII foi de 175 mg/Kg e a progressão ou regressão das
doses se dava de acordo com a sobrevivência ou não do animal, respeitando um intervalo de 48
horas entre as administrações de acordo com as recomendações da OECD 425 (OECD, 2001).
O peso do animal foi medido antes, no 7º e no 14º dia da administração. Cada animal
era observado por 14 dias quanto ao possível aparecimento de sinais de toxicidade (mudanças
na pele, pelo, olhos, mucosas e respiração, tremores, convulsão, salivação, diarreia, letargia e
coma) e sacrificados por deslocamento cervical após esse período. Órgãos como coração, rins,
cérebro, fígado e estômago foram retirados através de técnicas cirúrgicas adequadas para
análise macroscópica.
sapiens) respectivamente, porém ambos escolhidos por fatores de similaridade com a espécie
Mus Musculus, empregando o servidor Run Blast.
O receptor de bradicinina pertencente à espécie Mus Musculus não possuía estrutura
cristalografada no banco de dados, então foi necessário realizar a criação do mesmo através de
homologia. Para isso, foi utilizado o molde da proteína PDB (ID: 4YAY- Receptor de
Angiotensina), e a modelagem espacial foi realizada empregando o software Robetta Server,
que é utilizado como um método de previsão da estrutura tridimensional da proteína e
proporciona uma orientação automatizada, além de fornecer dados para uma previsão da função
da proteína.
Em seguida, a estrutura foi otimizada com auxílio do software WinCoot versão
0.8.1 e, validada pelo servidor online do MolProbity usando o gráfico de Ramachandran e o
ProSA.
A análise da interação molecular (Docking Molecular) ocorreu através da utilização
da estrutura da RipII com os receptores, com auxílio do software Autodock Tool. A técnica
permite obter diferentes conformações espaciais do ligante, possibilitando identificar qual
dentre estas é a mais provável na interação ligante alvo.
Grupos de 8 animais foram tratados com veículo (3% Tween 80 em água destilada),
RipII (3,125; 6,25; 12,5; 25, 50, 100 ou 200 mg/kg) ou Indometacina (5 mg/kg- usada como
droga de referência). Após 60 minutos do tratamento, os animais receberam uma injeção
intraperitonial (i.p.) de ácido acético 0,6% e foram colocados individualmente em funis de
vidro. Após 10 minutos da administração do ácido acético, o número de contorções abdominais
foi registrado durante 20 minutos. Uma contorção consiste na contração da musculatura
abdominal, juntamente com a extensão das patas traseiras. (KOSTER et al., 1959).
Em outra série de experimentos, foi avaliado a duração do efeito antinociceptivo da
RipII. Os animais receberam RipII-50 mg/kg (v.o.) e após 30, 60, 120, 240 e 360 minutos após
a administração, receberam ácido acético e o número de contorções foi avaliado conforme
descrito anteriormente.
43
A curva dose x resposta também foi realizada e a DE50 da RipII foi estimada com
os dados acima.
animais foram submetidos ao filamento de von Frey embaixo da superfície plantar da pata
direita traseira em escala crescente de estímulo de força até um valor máximo de 50g (de modo
a evitar lesão na pata). Os resultados foram calculados pela diferença dos valores das leituras
nos tempos (30, 60 e 180 minutos) pela leitura do tempo zero (antes da aplicação da PGE2)
(CUNHA et al., 1992).
4.9.1.1 TRPV1
4.9.1.2 TRPA1
Os animais foram tratados com veículo (3% Tween 80 em água destilada), RipII
(25 e 50 mg/kg; v.o.) ou cânfora (7,6 mg/kg, s.c- antagonista TRPA1). Após 30 (s.c) ou 60
minutos (v.o.), os animais receberam uma injeção intraplantar de 20 µl da solução de
cinamaldeído (10 nmol/pata) na pata posterior direita. O tempo em que o animal permaneceu
45
4.9.1.3 TRPM8
Os animais foram tratados com RipII (25 e 50 mg/kg, v.o.) ou veículo (3% de
Tween 80 em água destilada; v.o.). Após 60 min, os animais receberam por via intraplantar 20
μl de solução de salina ácida (ácido acético 2%, pH 1,98 – ativador de ASIC e receptor TRPV1)
na pata posterior direita. Para descartar o efeito sobre o TRPV1, um grupo foi pré-tratado com
capsazepina (5 mg/kg; i.p.) antes de receber a salina ácida. O tempo que o animal permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada foi registrado durante um período de 20 min.
(BAUTISTA et al., 2006). Em outro experimento, a RipII (25 e 50µg/pata, i.pl.) foi
coadministrada com salina ácida (ácido acético 2%, pH 1,98) na pata direita traseira e a resposta
determinada como descrita anteriormente.
Os animais foram tratados por via oral com RipII na dose de 50 mg/kg (v.o.) ou
veículo (3% de Tween 80 em água destilada). Após 60 min, os animais receberam por via
intraplantar 20 μl de PMA (500 pmol/pata- ativador de PKC). O tempo que o animal
permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada, considerado como resposta nociceptiva,
foi mensurado no período de 15-45 minutos (FERREIRA et al., 2005).
Camundongos foram pré-tratados com ioimbina (2,5 mg/kg; i.p.) ou veículo (3%
de Tween 80 em água destilada), depois de 15 minutos os animais receberem RipII-50 mg/kg
ou clonidina (0,15 mg/kg, i.p.). Após 30 minutos do último tratamento (RipII, ioimbina ou
clonidina), os animais foram submetidos ao teste das contorções abdominais induzidas por
ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2010).
A análise estatística dos dados foi realizada pelo programa Graph Pad Prism 5.0
(USA). Para os testes com mais de três grupos foi feita a análise estatística empregando o teste
de análise de variância (ANOVA). Para verificar se houve diferença significativa entre os
grupos, foi realizado o teste de comparações múltiplas de Student-Newman-Keuls ou
Bonferroni. Para a análise dos testes com apenas dois grupos, foi utilizado o teste não
paramétrico de Mann-Whitney (t-test). Foi realizada a regressão não-linear para a determinação
da DE50 na curva dose x resposta. Os resultados foram expressos como média ± E.P.M
(variáveis com distribuição normal) ou mediana com máximo e mínimo, sendo as diferenças
consideradas estatisticamente significativas a partir de p<0,05.
49
5 RESULTADOS
5.1.1 Estimativa da DL50 da RipII através da OECD 425 (Acute Oral Toxicity-Up-And-Down)
O primeiro camundongo recebeu a dose inicial de RipII 175 mg/Kg por via oral e
após tal administração, foram realizadas observações no comportamento do animal por 48 horas
a procura de algum sinal tóxico. Após esse período foi administrada a próxima dose de 550
mg/Kg ao segundo animal. Semelhante ao animal anterior, o segundo não apresentou sinais de
toxicidade e sobreviveu após as 48 horas. Então, o terceiro animal recebeu a dose de 2000
mg/Kg. Durante a primeira meia hora após a administração da RipII, o animal apresentou
piloereção e letargia que desapareceu e o mesmo permaneceu sem sinais de toxicidade até o
final do experimento.
Seguindo a OECD 425, administrou-se a dose de 2000 mg/kg ao quarto animal que
também apresentou letargia na primeira meia hora após o tratamento. Após esse intervalo, o
animal retornou ao estado normal e sobreviveu. Em seguida, a dose de 2000 mg/Kg foi
administrada ao quinto animal e encerrou-se o ensaio de toxicidade oral aguda, já que três
animais consecutivos receberam a mesma dose (2000 mg/kg) e permaneceram vivos, como
demonstrado na tabela 5.
Observamos também que os animais tiveram uma evolução normal de peso ao
longo dos 14 dias de observação (ganho em média de 4,8 kg), não ocorrendo redução de massa
corpórea nos animais tratados com a RipII. Esse é um dado relevante pois a perda de peso é um
forte indicativo de toxicidade.
50
Mortalidade - - - - -
Nos cinco camundongos foram administrados RipII nas doses de 175 mg/Kg, 550 mg/Kg, 2000 mg/Kg, 2000
mg/kg e 2000 mg/Kg de acordo com a OECD 425. As observações foram 30 minutos, 1 hora e 4 horas após a
administração. SST: sem sinais de toxicidade.
Gráfico 1. Média do ganho de peso dos animais no teste de toxicidade oral por 28 dias
40 Controle Riparina II
Peso dos animais (g)
35
30
25
20
0 1 2 3 4
Semanas
Animais tratados com veículo (controle) e RipII-500 mg/Kg durante 28 dias. Os resultados dos grupos
experimentais (n=10) foram expressos como média.
52
GRUPOS EXPERIMENTAIS
PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS
Controle Riparina II
Média ± E.P.M Média ± E.P.M
Hemácias (106/µL) 8,627±0,1202 8,718±0,1091
VCM: volume corpuscular médio; HCM: hemoglobina corpuscular média; CHCM: concentração de hemoglobina
corpuscular média. Os resultados dos grupos experimentais (n=10) foram expressos como média ± erro padrão da
média (EPM) (t-test com Mann-Whitney post test).
53
Tabela 7. Níveis plasmáticos de uréia, creatinina, AST e ALT dos camundongos após o
tratamento diário consecutivo por 28 dias com Riparina II ou veículo (Controle).
GRUPOS EXPERIMENTAIS
PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
Controle Riparina II
Os resultados dos grupos experimentais (n=10) foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM) (t-
test com Mann-Whitney post test).
54
Legenda: A: Cérebro (esquerda-controle; direita: RipII); B: Rim (esquerda-controle; direita: RipII); C: Fígado
(esquerda-controle; direita: RipII); D: Coração (esquerda-controle; direita: RipII)
55
5.3.1 TRPV1
5.3.2 TRPA1
5.3.3 Bradicinina
O eixo Psi e Phi variam de -180 a +180, onde as regiões das áreas demarcadas do gráfico são consideradas regiões
permitidas. A1 e A2: antes do refinamento. B1 e B2: após o refinamento. Legenda: Área branca: regiões não
favoráveis/permitidas; Região azul escuro: regiões adicionalmente permitidas; Região azul clara: regiões
favoráveis/permitidas
Outro modelo para validar a estrutura foi realizado utilizando o programa ProSA,
que analisa a qualidade global e local do modelo, tendo como referência outras estruturas de
proteínas do mesmo tamanho já depositadas no PDB (regiões azuis do gráfico), pela avaliação
das coordenadas e das energias em função das distâncias entre os resíduos.
A figura indica um gráfico de energia que mostra a qualidade global do modelo em
função da posição do aminoácido na sequência proteica, no qual obteve o resultado de -4,81.
Em geral, valores positivos correspondem a regiões do modelo que estão erradas ou com
59
problemas. A avaliação mostra que a maioria dos resíduos está na região negativa, indicando
qualidade local satisfatória (Figura 13).
Legenda: Região azul (clara e eescura) indicam outros modelos de proteínas do mesmo tamanho que já foram
depositadas no PDB. Receptor de bradicinina (ponto preto)
A
50
Número de contorções (n)
40
*
30
20
*
10
0
Veículo 3,125 6,25 12,5 25 50 100 200 INDO
B
70
50
DE50=24,72 mg/kg
40 (16,12 - 37,91)
30
20
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
log[Dose]
C
60
Número de contorções (n)
50
Linha Controle
40
30 *
*
*
20
*
10
0 30 60 120 240 360 480
Tempo (min)
O gráfico A mostra o efeito antinociceptivo da RipII em diversas doses (3,125-200 mg/kg). Indometacina (INDO-
5 mg/kg; v.o.) foi utilizada como droga de referência. O gráfico B mostra uma curva Log [dose] x resposta da
RipII. O gráfico C mostra o tempo de ação antinociceptiva da RipII-50 mg/kg (v.o). Os valores representam a
média ± E.P.M. com máximo e mínimo do número de contorções. *p<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-
Newman-Keuls ou Bonferroni, post hoc). Regressão não-linear foi utilizada para estimar a DE50 com intervalo de
confiança de 95%.
63
6
Intensidade da hipernocicepção
5
( limiar de retirada, g)
4
Veículo
3
2
25
1
0 *
* * Indo
*
-1 * * * 50
-2
*
30 60 180
Tempo (min)
RipII 25 e 50 mg/kg, veículo e indometacina (Indo) foram administrados antes da carragenina a 0,1%. Cada ponto
representa a média ± EPM do limiar de retirada da pata (em gramas) da estimulação tátil da pata direita traseira.
*p<0,05 vs Veículo (Two way ANOVA Bonferroni post hoc).
64
3
*
Escores
0
Sadio Veículo RipII-25 RipII-50 Indometacina
B
2.5
2.0
*
Escores
1.5
1.0
0.5
0.0
Sadio Veículo RipII-25 RipII-50 Indometacina
Animais foram tratados com RipII (25 e 50 mg/kg), veículo, salina (sadio) e indometacina (5 mg/kg). A: Infiltrado;
B: Edema. *p<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
65
*
*
*
*
*
*
Indometacina Indometacina
(x20) (x40)
Animais foram tratados com RipII (25 e 50 mg/kg), veículo, salina (sadio) e indometacina (5mg/kg).
*: infiltrado; seta: edema
66
O pré-tratamento com RipII (25 ou 50 mg/kg; v.o.) foi capaz de reduzir de forma
significativa os níveis de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico [Veículo: 19,52 ± 3,049;
RipII-25: 8,000 ± 1,204; RipII-50: 7,820 ± 0,5739], bem como os níveis de nitrito [Veículo:
539,7 ± 75,76; RipII-25: 291,6 ± 49,46; RipII-50: 283,7 ± 50,24].
Nenhuma alteração foi observada no grupo não tratado com carragenina, apenas
salina [TBARS: 8,000 ± 1,528; Nitrito: 125,5 ± 27,75]. (Gráfico 5)
25
nmols de MDA/ g tecido
20
15
*
10 *
0
Sadio Veículo RipII-25 RipII-50 Indometacina
800
600
nM Nitrito/g tecido
*
400
200 *
0
Sadio Veículo RipII-25 RipII-50 Indometacina
Animais foram tratados com RipII (25 e 50 mg/kg), veículo, salina (sadio) e indometacina (5 mg/kg). A:
Determinação de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico; B: Determinação do conteúdo de nitrito *p<0,05 vs
Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
67
8
Intensidade da hipernocicepção
7 Veículo
6
( limiar de retirada, g)
5 25
4
3
2 50
1
0
-1
-2
-3
-4 *
-5
-6
-7 *
30 60 180
Tempo (min)
RipII 25 e 50 mg/kg (v.o.) e veículo foram administrados antes da PGE2 (3nmol/pata). Cada ponto representa a
média ± EPM do limiar de retirada da pata (em gramas) da estimulação tátil da pata direita traseira. *p<0,05 vs
Veículo (Two way ANOVA Bonferroni post hoc).
68
8
Intensidade da hipernocicepção
7 Veículo
6
( limiar de retirada, g)
5 25
4
3
2 50
1
0 *
-1 *
-2
-3 *
-4
-5
-6
-7
30 60 120 240
Tempo (min)
RipII 25 e 50 mg/kg e veículo foram administrados antes da epinefrina (100 ng/pata). Cada ponto representa a
média ± EPM do limiar de retirada da pata (em gramas) da estimulação tátil da pata direita traseira. *p<0,05 vs
Veículo (Two way ANOVA Bonferroni post hoc).
69
5.5.1.1 TRPV1
40
Tempo de Lambedura (s)
30
*
20
10
0
Veículo 25 50
RipII (g/kg; i.pl.)
RipII (25 e 50 µg/kg, i.pl.) foi coadministrada com capsaicina (2,2 µg/pata). Os valores representam a média ±
E.P.M. do tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo; ap<0,05 vs RipII-50 (ANOVA e Student-Newman-Keuls,
post hoc).
70
5.5.1.2 TRPA1
50
Tempo de Lambedura (s)
40
30
20
*
10
0
Veículo 25 50 Cânfora
RipII (mg/kg; v.o.)
Cinamaldeído 10 nmol/pata
71
B
80
*
40
20
0
Veículo 25 50
RipII (g/pata; i.pl.)
Cinamaldeído 10 nmol/pata
A: Os animais foram tratados com veículo, RipII (25 e 50 mg/kg, v.o.) e cânfora (7,6 mg/kg, s.c). B: RipII (25 e
50 µg/kg, i.pl.) foi coadministrada com cinamaldeído (10nmol/pata). Os valores representam a média ± E.P.M. do
tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
72
5.5.1.3 TRPM8
Gráfico 10. Papel dos receptores de potencial transiente do tipo M8 (TRPM8) no efeito
antinociceptivo da RipII.
A
50
Tempo de Lambedura (s)
40
30
20 *
10
0
Veículo 25 50
RipII (mg/kg; v.o.)
40
20
10
0
Veículo 25 50
RipII (g/kg; i.pl.)
A: Os animais foram tratados com veículo e RipII (25 e 50 mg/kg, v.o.). B: RipII (25 e 50 µg/kg, i.pl.) foi
coadministrada com a mentol (1,2 µmol/pata). Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura.
*
p<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
74
Gráfico 11. Papel dos canais iônicos sensíveis ao ácido (ASIC) no efeito antinociceptivo da
RipII.
150
Tempo de Lambedura (s)
100
50 a
0
Veículo RipII-25 RipII-50 CZP CZP+RipII-50
B
200
100 *
50
0
Veículo 25 50
RipII (g/kg; i.pl.)
A: Os animais foram tratados com veículo, RipII (25 e 50 mg/kg, v.o.), capsazepina (CZP- 5mg/kg; i.p.) e
CZP+RipII-50. B: RipII (25 e 50 µg/kg, i.pl.) foi coadministrada com a salina ácida. Os valores representam a
média ± E.P.M. do tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo; ap<0,05 vs RipII-50 (ANOVA e Student-Newman-
Keuls, post hoc).
76
O grupo tratado com RipII (50 mg/kg; v.o.) foi capaz de reduzir de forma
significativa a resposta nociceptiva induzida pela injeção intraplantar de bradicinina (20,67 ±
1,783), comparada com o veículo (50,20 ± 8,639). (Gráfico 12)
80
Tempo de Lambedura (s)
60
40
*
20
0
Veículo RipII-50
Bradicinina 10g/pata
Os animais foram tratados com veículo e RipII-50 mg/kg (v.o.). Os valores representam a média ± E.P.M. do
tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo (t-test; Mann-Whitney).
77
Gráfico 13. Efeito da RipII na nocicepção induzida pela injeção intraplantar de PMA.
200
Tempo de Lambedura (s)
150
100 *
50
0
Veículo RipII-50
PMA 500 pmol/pata
Os animais foram tratados com veículo e RipII 50 mg/kg (v.o.) 60 minutos antes da administração de PMA na pata
direita traseira. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo (t-test; Mann
Whitney).
78
Gráfico 14. Efeito da RipII na nocicepção induzida pela injeção intraplantar de 8-Br-
AMPc.
25
Tempo de Lambedura (s)
20
15
*
10
0
Veículo RipII-50
8-Br-cAMP 500 nmol/pata
Os animais foram tratados com veículo e RipII 50 mg/kg (v.o.) 60 minutos antes da administração de 8-Br-AMPc.
Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. *p<0,05 vs Veículo (T-test; Mann Whitney).
79
40
Número de contorções (n)
30 a
b
20
*
10 *
0
Veículo Glib RipII-50 Glib+RipII-50 Diaz Glib+Diaz
Grupos receberam veículo, RipII (50 mg/kg; v.o.), glibeclamida (Glib- 2 mg/kg; i.p.), Glib+RipII, Diazóxido
(Diaz- 3 mg/kg; i.p.) 3 Glib+Diaz. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. *p<0,05 vs
Veículo; ap<0,05 vs RipII-50; bp<0,05 vs Diaz (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
80
40
Número de contorções (n)
30 a
20
*
10
*
0
Veículo Nal RipII-50 Nal+RipII Morf
Grupos receberam veículo, RipII (50 mg/kg; v.o.), naloxona (Nal- 1mg/kg; i.p.), Nal+RipII, morfina (5 mg/kg;
i.p.). Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. *p<0,05 vs Veículo e ap<0,05 vs RipII-
50 (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
81
50
Número de contorções (n)
40
30
a
20
b
10 *
*
0
lo b. 0 50 n. n.
cu im I-5 III
- lo lo
e í Io i pI ip
C +C
V R
+R b.
b. im
m Io
I oi
Grupos receberam veículo, RipII (50 mg/kg; v.o.), ioimbina (Ioimb.-2,5 mg/kg; i.p.), Ioimb.+RipII, clonidina
(Clon.-0,15 mg/kg; i.p.). Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. *p<0,05 vs Veículo;
a
p<0,05 vs RipII-50; bp<0,05 vs Clon. (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
82
O número de contorções foi contado durante 20 min após a administração de ácido acético. NAN (NAN-190), RIT
(Ritanserina), OND (ondansetrona). *p<0,001 vs veículo; ns não houve significância em relação ao veículo.
ANOVA e Student-Newman-Keuls, post ho.
83
6 DISCUSSÃO
A busca por novos agentes tem levado a descoberta de muitas drogas clinicamente
úteis no tratamento de diversas patologias e nesse contexto, extratos vegetais de plantas
possuem uma grande diversidade de moléculas que podem atuar sinergicamente em múltiplos
alvos, e podem ser uma alternativa mais econômica (PATWARDHAN; VAIDYA, 2010;
MAROON et al., 2010).
Na grande maioria das vezes, o processo para a obtenção de compostos isolados de
espécies vegetais é trabalhoso com um baixo rendimento ao final do processo extrativo. Isso
leva a um desinteresse das indústrias no que se refere a exploração dessas substâncias,
dificultando ainda mais a descoberta de novos medicamentos a partir de espécies vegetais.
Então, atualmente se está investindo na síntese dessas substâncias de maneira planejada, pois
se mantém a atividade biológica sem a demora e os custos na obtenção do produto natural
(COSTA, 2009).
Os estudos mostram que mesmo as substâncias provenientes de plantas não são
desprovidas de toxicidade ou efeitos adversos, o que mostra a importância de se conhecer bem
as condições do seu uso seguro. Realizar uma avaliação de segurança torna-se importante, pois,
se pode caracterizar os efeitos tóxicos considerando o órgão alvo, tempo de exposição,
reversibilidade dos efeitos e tempo em que os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem. É
um parâmetro necessário para qualquer estudo in vivo e in vitro (FDA, 2002).
Os estudos de toxicidade são utilizados para classificar as substâncias quanto a sua
capacidade de causar agravos ao organismo vivo. Existem dois ensaios que são mais utilizados,
pois diferenciam-se de acordo com a manifestação dos efeitos em relação ao tempo de
exposição, que são os testes agudos e crônicos. Tais estudos são obtidos por meio da realização
de testes, que envolvem a aplicação de protocolos pré-estabelecidos, principalmente por órgãos
regulatórios conhecidos mundialmente, como a Organização para Cooperação Econômica e
Desenvolvimento (Organization for Economic Cooperation and Development – OECD).
(SPINDLER; SJOBERG; KNUDSEN, 2000; MONTEIRO, 2010). Os protocolos preconizados
pela OECD são de grande aceitação pela comunidade científica na avaliação da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substância.
O guia da OECD 425 (Método Up-and-Down) é um teste de toxicidade aguda que
apresenta boa reprodutibilidade, utiliza poucos animais e também reduz o sofrimento dos
mesmos. Consiste em uma administração sequenciada em animais individuais, onde a dose de
para cada animal é ajustada dependendo do resultado do animal anterior. Esse método objetiva
84
estimar a dose letal 50 (DL 50%- corresponde à dose que mata 50% dos animais) e permite
classificar a substância de acordo com sistemas internacionalmente aceitos (Globally
Harmonised System-GHS) (OECD, 2001).
De acordo com os resultados obtidos no presente estudo, nenhum animal morreu
após o tratamento com doses crescentes de RipII até 2000 mg/kg. Pode-se inferir, portanto, que
a sua DL50 é superior a 2000 mg/kg (na faixa de 2000-5000 mg/kg), o que a enquadra na
categoria 5 (substâncias com baixa toxicidade) de acordo com o sistema de Classificação
Globalmente Harmonizado (GSH).
Dando sequência a avaliação da toxicidade da RipII, foi realizado o tratamento oral
de doses repetidas durante 28 dias (toxicidade subcrônica). Nesse teste, os efeitos tóxicos são
avaliados através da análise do peso corporal, exames bioquímicos, exames hematológicos e
análise macro e microscópica dos principais órgãos. Esse ensaio fornece resultados acerca da
exposição contínua de um composto, bem como os níveis de exposição com segurança.
No presente estudo, a administração por 28 dias de RipII 500mg/kg apresentou um
padrão semelhante ao controle quanto a ingestão de água e comida, bem como no ganho de
peso. Tal parâmetro é utilizado para indicar o aparecimento dos efeitos tóxicos de uma
substância no animal (PITA, 2011). Sinais de toxicidade, como alterações na pele, olhos,
mucosas, diarreia, letargia e aumento na salivação também não foram observados nos animais
tratados.
A toxicidade de uma substância pode comprometer alguns órgãos, e dentre eles, o
fígado e os rins são os mais susceptíveis. Por isso, torna-se importante a análise de parâmetros
que avaliem as funções hepáticas e renais (MOTTA, 2003).
As substâncias quando aplicadas por via oral, são absorvidas no trato
gastrointestinal e em seguida transportadas para o fígado para então serem distribuídas pela
corrente sanguínea. Então, a avaliação de parâmetros de função hepática torna-se essencial para
a análise toxicológica (BRUNTON et al., 2012).
coração e pâncreas) (MABEKU et al., 2007). Ambas aparecem elevadas mediante um dano
irreversível a membrana celular com o consequente extravasamento das enzimas. (HENRY,
2008).
No presente estudo, não foi observado alteração dessas duas enzimas nos grupos
tratados com RipII por 28 dias, bem como não houve alteração macro ou microscópica no
fígado dos animais, sugerindo uma ausência de toxicidade nesse órgão.
Os rins possuem como uma de suas funções a excreção de metabólitos, sendo
também necessário à sua análise em protocolos de toxicidade. Ureia e creatinina são parâmetros
úteis na avaliação da função renal (LI et al., 2011).
A creatinina é um composto nitrogenado formado pela hidrólise não enzimática da
creatina liberada durante a defosforilação da creatina fosfato. Uma vez gerada, ela entra na
circulação por difusão e é filtrada pelos rins, sendo excretada somente pela urina. Então, a
creatinina indica o ritmo da filtração glomerular onde níveis elevados indicam uma deficiência
na funcionalidade renal (HEYMSFIELD et al., 2005).
Já a ureia consiste no maior produto final do catabolismo de aminoácidos e
proteínas e é gerada no fígado pelo ciclo da ureia, onde é distribuída e excretada pelos rins. O
seu aumento pode ser devido a uma elevação do metabolismo dos aminoácidos e incremento
da reabsorção tubular, sendo um índice preditivo da insuficiência renal sintomática e de
desordens hepáticas (OSTERMANN et al., 2012).
No estudo, não foi observado alteração nos níveis de ureia e creatinina nos grupos
tratados com RipII por 28 dias, bem como não houve alteração macro ou microscópica nos rins
dos animais, indicativo de ausência de toxicidade renal.
reduzir a nocicepção causada pelo glutamato, o que nos leva a sugerir que ela seja uma molécula
capaz de atuar em diferentes sítios com uma forte interação entre o sistema glutamatérgico e os
TRP´s.
Além dos TRP, outros canais que participam da transdução do sinal nociceptivo são
os canais iônicos sensíveis ao ácido (ASICs). Pertencem a superfamília de canais de Na+
epiteliais degenerina e são ativados por prótons extracelulares e modulado por diversos cátions
e proteínas quinases (PKC e PKA), tendo sua expressão aumentada mediante alguns
mediadores inflamatórios (bradicinina, serotonina e IL-1) (MAMET et al., 2002). Existem 7
subtipos de ASICs, sendo que o subtipo 3 é expresso nos neurônios sensoriais e o mais sensível
para detectar as alterações de pH (SMITH et al., 2007). Estudos mostram que esses canais
possuem a capacidade de detectar variações de pH na faixa fisiológica e patofisiológica e estão,
portanto, envolvidos no processo de dor inflamatória crônica e reações isquêmicas (WANG et
al., 2006; DUBÉ; ELAGOZ; MANGAT, 2009).
O presente estudo mostrou que a RipII foi capaz de reduzir a nocicepção causada
pela salina ácida, já que foi realizado o bloqueio dos receptores TRPV1 (que também podem
ser ativados por prótons) pela capsazepina. Pode-se sugerir então que a RipII possa agir através
de algum efeito de neutralização dos prótons extracelulares.
A bradicinina (BK), considerada essencial para o processo inicial da dor, bem como
para a produção de hiperalgesia, atua através da estimulação dos receptores de bradicinina B1
e B2 (ambos acoplados a proteína G). O receptor B2 é constitutivo em todo o sistema nervoso
e responsável pela fase inicial da dor inflamatória, enquanto a expressão de B1 é induzida em
resposta a alguns estímulos nocivos e relacionada com processos patológicos persistentes
(RAHID et al., 2004; SANTOS et al., 1997a). Os efeitos da BK são provenientes da ativação
da fosfolipase C e/ou fosfolipase A2, com a consequente liberação de Ca2+ e PKC para fosforilar
receptores de membranas e canais iônicos (CALIXTO et al., 2001).
A ativação do receptor B2 provoca hiperalgesia térmica e que camundongos
nocaute para TRPV1 apresentam pouca sensibilidade térmica no local da inflamação tecidual,
sugerindo que a ativação de B2 ativa uma isoforma específica da PKC (PKCε), que fosforila o
TRPV1 facilita a sua abertura (WANG et al., 2008).
Na periferia, a BK exerce ações pró inflamatórias, como a liberação de
prostaglandinas, citocinas, óxido nítrico, histamina, radicais livres, estimulam e sensibilizam os
neurônios sensoriais e é capaz de induzir dor pela estimulação direta e sensibilização de
nociceptores (DRAY; PERKINS, 1997; RANG, URBAN, 1995; SHUGRUE et al., 2003). O
SNC também apresenta todos os componentes das cininas em regiões como córtex, tronco
93
receptor TRPV1, fazendo com que ele se abra promovendo assim, o influxo de cátions em
temperaturas mais baixas que o normal, sensibilizando o receptor (MILLER et al., 1997;
WANG et al., 2001; VELAZQUEZ et al., 2007).
Os presentes achados mostram que a administração intraplantar de miristato acetato
de forbol (PMA) causou nocicepção em animais por ligar-se a PKC e estimular a atividade
catalítica da quinase e que a RipII foi capaz de reduzir tal parâmetro, sugerindo a participação
da PKC no seu mecanismo antinociceptivo o qual pode ser através da inibição da translocação
do citosol para a membrana ou pela sensibilização dos receptores TRPV1.
A PKA altera as atividades de proteínas alvo, fosforilando grupos específicos de
serina e treonina e pode ser ativada por concentrações de AMPc e óxido nítrico
(MOHAPATRA; NAU, 2003; MALMBERG et al., 1997). É capaz de fosforilar o canal de
sódio Nav1.8, resultando em diminuição do seu limiar de ativação e aumento da corrente; os
receptores AMPA de glutamato através da ativação dos receptores para o CGRP e o receptor
TRPV 1que leva a uma potencialização da sua resposta por redução da dessensibilização
(PREMKUMAR et al., 2005; KAUER; GIBSON, 2009). A ativação de PKA também está
diretamente relacionada com a hiperalgesia inflamatória induzida por PGE2 e BK (ENGAND
et al., 1996; FERREIRA et al., 2005).
Os resultados deste trabalho mostraram que a aplicação de 8-Br-AMPc (ativador
de PKA) causou uma intensa nocicepção e que a RipII foi capaz de reduzir esse parâmetro,
indicando o envolvimento da PKC no seu efeito antinociceptivo.
Em resposta aos estímulos nociceptivos, nosso corpo possui mecanismos de
controle que modulam o estímulo doloroso, permitindo que tais estímulos sejam seletivamente
inibidos alterando assim, a transmissão para os centros superiores (YOSHIMURA, FURUE,
2006; MILLAN, 1999). Os principais neurotransmissores inibitórios no corno dorsal da medula
são os peptídeos opioides, a norepinefrina e a serotonina, que parecem inibir a excitação dos
neurônios de segunda ordem frente a um estínulo nocivo (MILLAN, 2002).
Visando ampliar o conhecimento do mecanismo antinociceptivo da RipII, foi
analisado o seu efeito frente a pontos chave da via inibitória da dor como os canais de potássio,
sistema opioide e α2 adrenérgico.
Os canais de potássio são de extrema importância no controle da excitabilidade
neuronal. Eles controlam o potencial de repouso das células neuronais e também a recuperação
da voltagem após um potencial de ação. A ativação desses canais causa um aumento do efluxo
de potássio, o que leva a uma hiperpolarização e redução da geração do potencial de ação,
reduzindo assim as respostas neuronais o que resulta em uma antinocicepção (SACHS et al.,
95
2002; VERRI et al., 2006). Ações pós-sinápticas dos receptores α2-adrenérgicos, μ e δ opióides
são mediados primariamente pela abertura dos canais de potássio (GALEOTTI et al., 1999;
RODRIGUES, DUARTE, 2000; GOLAN et al., 2014).
Os reaultados deste trabalho mostraram que o pré tratamento dos animais com a
glibenclamida (um bloqueador de K+ATP) foi capaz de reverter parcialmente o efeito
antinociceptivo da RipII, sugerindo o possível envolvimento desses canais no mecanismo
antinociceptivo da RipII.
Os opioides inibem a transmissão sináptica e são liberados em vários locais do SNC
em resposta ao estímulo nocivo. Produzem analgesia através de sua ação no cérebro, no tronco
encefálico, na medula espinhal e nas terminações periféricas dos neurônios aferentes primários
(BAILEY et al., 2004). Os receptores opioides são divididos em 3 subtipos (µ, δ e κ) e
pertencem a família dos receptores acoplados a proteína G. Os efeitos da sua sinalização
consiste na redução da condução pré-sináptica do cálcio, inibindo a liberação de
neurotransmissores como o glutamato e aumento da condutância pós-sináptica de potássio
reduzindo a geração de um potencial de ação (KING et al., 1999; GOLAN et al., 2014). Assim,
o efeito final é inibitório a nível celular.
Nesta pesquisa, tanto a morfina quanto a RipII apresentaram um efeito
antinociceptivo no modelo de contorções induzidas por ácido acético. Entretanto, o pré-
tratamento com a naloxona (antagonista opioide), conseguiu reverter de forma significativa o
efeito antinociceptivo promovido pela RipII e pela morfina, sugerindo a relação do efeito
antinociceptivo da substância com o sistema opioide.
A literatura mostra que a ativação dos receptores α2 adrenérgicos exerce um poder
antinociceptivo associado a inibição descendente. As principais fontes de projeções
noradrenérgicas diretas para a medula espinhal são os núcleos A5, A6 e A7, e são nessas regiões
onde podem ocorrer as respostas pré e pós-sinápticas. A literatura mostra que a clonidina
(agonista seletivo do reeptor α2) é capaz de causar antinocicepção que é revertida por
antagonistas seletivos dos mesmos receptores. As ativações de tais receptores produzem não
somente um efeito antinociceptivo, como também um efeito sinérgico com agonistas dos
receptores µ. Os opioides espinhais inibem a liberação das vesículas sinápticas dos aferentes
primários e hiperpolarizam os neurônios pós-sinápticos. (FIELDS; BASBAUM;
HEINRICHER, 2005; PERTOVAARA, 2006).
O presente trabalho demonstrou que a ioimbina reverteu significativamente o efeito
antinociceptivo da RipII e a clonidina causou significativa redução da nocicepção no modelo
estudado e tal efeito bloqueado pela ioimbina (antagonista α2). Podemos então sugerir o
96
envolvimento de pelo menos em parte dos receptores adrenérgicos. Tal resultado corrobora
também com os resultados anteriores da hipernocicepção mecânica.
O efeito antinociceptivo da RipII foi investigado em animais tratados com
antagonistas dos receptores 5-HT1 (NAN-190), 5HT-2A/C (ritanserina) e 5-HT3 (ondansetrona)
para a verificação da participação do sistema serotonérgico. Visto que estudos mostram que a
inibição descendente da nocicepção é mediada por neurônios serotonérgicos que se projetam
no tronco espinhal e liberam serotonina na medula (RAHMAN et al., 2009). Os resultados
mostraram que não há a participação do sistema serotonérgico na atividade analgésica da RipII.
Outra parte do presente estudo foi avaliar o possível envolvimento de outras vias
de neurotransmissão que podem modular o processo nociceptivo no mecanismo antinociceptivo
da RipII, como as vias colinérgica e dopaminérgica.
Sabe-se que o sistema colinérgico modula parcialmente a analgesia mediada pelos
sistemas adrenérgico e serotonérgico (JONES et al., 2007). Já em relação ao sistema
dopaminérgico, os receptores D2, D3 e D4 ativam os canais de potássio, conferindo
características analgésicas (MANSIKKA et al., 2005). No entanto, esses sistemas parecem não
estar envolvidos na ação antinociceptiva da RipII, visto que o pré-tratamento com atropina e
haloperidol não foram capazes de reverter o efeito antinociceptivo da substância.
97
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A RipII mostrou ser relativamente segura, pois não apresentou efeitos nocivos nos testes
de toxicidade aguda e crônica.
O tratamento oral com RipII foi capaz de causar uma antinocicepção no modelo de
contorções induzida por ácido acético.
Seu efeito parece não estar relacionado com o sistema serotonérgico, colinérgico e
dopaminérgico.
98
8 CONCLUSÃO
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