Esclerosteose 1

Isabella Oliveira de Rezende

1. Características Clínicas e Padrão de Herança

A esclerose-1 é uma doença rara, autossômica recessiva, caracterizada por supercrescimento
esquelético progressivo. Essa displasia óssea esclerosante grave é um distúrbio de
hiperatividade dos osteoblastos. Pacientes com esclerosteose-1, na maioria dos casos,
apresentam estatura alta, sindactilia, mandíbula com uma aparência anormalmente quadrada,
displasia das unhas, alteração nos ossos temporais e paralisia facial. Já em alguns casos,
pacientes podem apresentar atrofia do nervo óptico, estesia facial, exoftalmia, anosmia e
estrabismo convergente.

2. Base Molecular

2.1. Gene: O gene SOST está localizado no cromossomo 17, de coordenada 43.753.738
até a coordenada 43.758.791. Portanto, é formado por 180.817 pares de bases. Esse
gene possui 2 éxons e 1 inton.

2.2. mRNA: O gene SOST apresenta 1 variante de splicing. Essa variante de splicing
escolhida para o desenvolvimento desse trabalho é um RNAm maduro formado por
2.296 nucleotídeos.

2.3. Proteína: A proteína codificada possui o tamanho de 213 aminoácidos e o peso

molecular de 24.030Da. A sua estrutura tridimensional está representada na imagem
abaixo:

Características estruturais e interações da esclerostina A estrutura de um

domínio de hélice beta em complexo com o peptídeo S

2.4. Papel bioquímico e fisiológico da proteína: A esclerostina é uma

glicoproteína que atua inibindo a sinalização Wnt e a formação óssea,
regulando negativamente o crescimento ósseo. Ela se liga à heparina e seu
processo biológico é a Via de sinalização Wnt.

3. Variabilidade Genética
 O gene SOST é descrito no The Human Gene Mutation Database (HGMD) com 15
variações de acesso público, nas quais 8 ocasionam a esclerosteose-1. Desse total disponível
gratuitamente, 8 variações são substituições (com sentido/sem sentido), 2 são deleções, 2 são
inserções, 2 são variações que influenciam o splicing e 1 é variação que compromete regiões
regulatórias.

4. Fisiopatologia Molecular
Variações no DNA comprometem a tradução da proteína, o que gera alterações ou perda de
sua função. Dessa forma, uma variação no gene SOST prejudica a função da proteína
esclerostina. Como essa proteína inibe a a sinalização Wnt e a formação óssea, a perda de
suas funções favorece essa sinalização e causa crescimento ósseo progressivo, caracterizando
a esclerosteose-1. Essa doença é uma displasia óssea esclerosante que provoca hiperostose
generalizada e esclerose levando a um crânio acentuadamente espessado, com mandíbula,
costelas, clavículas e todos os ossos longos também sendo afetados.

5. Diagnóstico Molecular
5.1. Heredograma

5.2. Obtenção de DNA de membros da família

Para a obtenção de DNA de membros da família do item 5.1, foi coletado amostras
de 10mL de sangue coagulado de 3 indivíduos da família (III-1; III-2 e IV-1). A partir
desse material foi extraído DNA utilizando o Método de extração por EZ-DNA.
Esse método consiste em extrair DNA, usando o kit de extração EZ-DNA, após as
amostras de sangue coaguladas serem congeladas. Para romper membranas celulares
foi utilizado o reagente Isotiocianato de Guanidina que é um detergente. Foi
transferido 500µL de amostra tratada para microtubos de 1,5mL, contendo 1,0mL de
solução de RBCL (red blood cell lysis), homogeneizados em Vortex por 20 minutos,
centrifugadas por 3 minutos a 6.280xg e foi desprezado o sobrenadante. Isso foi
 repetido até que fosse obtido um pellet mais limpo possível. Após, foi adicionado às
amostras 1,0mL de solução de RBC (red blood cell), com homogeneização em
Vortex por 20 minutos e centrifugação por 3 minutos a 6.280xg e o sobrenadante
novamente foi descartado e foram adicionados 300µL de solução de EZ-DNA. As
amostras permaneceram 7 dias em banho-maria a 56ºC para dissolver ao máximo o
pellet. O DNA foi precipitado com 700µL de álcool absoluto gelado e os microtubos
centrifugados por 1 minuto a 7.700xg. O sobrenadante foi desprezado e 500µL de
etanol 95v/v foram adicionados às amostras. Novamente, os microtubos foram
centrifugados por 1 minuto a 7.700xg, os quais, após o descarte do sobrenadante,
foram mantidos abertos overnight (15-18h) para a secagem do álcool. Ao final, o
DNA foi hidratado com 50µL de água ultrapura e mantido a -20ºC até o momento do
uso.

5.3. Desenho de iniciadores para PCR

Abaixo está a sequência de DNA flanqueando a variação causal rs387906320
(NC_000017.11:g.43758672G>A; ENSP00000301691.1:p.Gln24Ter)
CACCACCCCAGCGTCCTCCCTGCCCTGGGCTCTCACCAGCGTCTGTTGCCTCATGCCTCT
GCACCTGAATTTGAAGGCTGCACCAGCGAGCCATTCTTCCCCCACCTCCAGGCAAGACTG
TTCCTCGACCAGTGCTGGCAGAGGCCAGCAATCTTCACTGGGTCTACCCCAGTCTTCCAA
GCCTCCCAAAGAGAAGTTTCTAAAACCTCCCCAGGATCTTTTACTAAGAATTCTCTCCTC
CACCCCATACCTTTGGTCTCAAAGGGGTGGTGGGGAGGCCGCCCTCCGTTCTCCGCCCGG
TTCATGGTCTTGTTGTTCTCCAGCTCCGGTGGAGGCTCGGGGTACTCTCCGAGCTCGGGG
ATGATTTCCGTGGCATCATTCTTGAACGCCTGCCACCCCT[R]GCCCTCCACTACACGGAAG
GCTGTGTGTACCAGCAGGCAGACGAGACACAGGGCCAGTGGGAGCTGCATGGTACCAGCC
AGAGGAGGGCACGCCACCTTCCAGTAGCACAGGCTCTGGTCTCCAGCCGAGACACGGTCG
CCTTTTTAAAGCCCCTCTCTGCTTCATGCCAGCCAATGAGGACAGGCTGGGGCAGGGCTG
GTCCCATGTTTCCCTCAGCCCCGGAGGGAGGGAAAGGGGTGTGCTCAGAGCAAACCCTCC
CCAAAGACTTCTCCTCTAGCTCAGCAAACTTCCAAATTGCTGCTGGCACTCCCAGGTGAC
CCAGAGAGAGGGGGCGTGTGAGGCAAGGCCCAAGCCTGCTCTCCGGCACCTCCCACGTGC
TGGCGGCTGTGGTTTTCAGAT

Abaixo o par de iniciadores desenhado utilizando o Primer 3

1 CACCACCCCA GCGTCCTCCC TGCCCTGGGC TCTCACCAGC GTCTGTTGCC

51 TCATGCCTCT GCACCTGAAT TTGAAGGCTG CACCAGCGAG CCATTCTTCC

101 CCCACCTCCA GGCAAGACTG TTCCTCGACC AGTGCTGGCA GAGGCCAGCA

151 ATCTTCACTG GGTCTACCCC AGTCTTCCAA GCCTCCCAAA GAGAAGTTTC

201 TAAAACCTCC CCAGGATCTT TTACTAAGAA TTCTCTCCTC CACCCCATAC

251 CTTTGGTCTC AAAGGGGTGG TGGGGAGGCC GCCCTCCGTT CTCCGCCCGG

301 TTCATGGTCT TGTTGTTCTC CAGCTCCGGT GGAGGCTCGG GGTACTCTCC

351 GAGCTCGGGG ATGATTTCCG TGGCATCATT CTTGAACGCC TGCCACCCCT

401 RGCCCTCCAC TACACGGAAG GCTGTGTGTA CCAGCAGGCA GACGAGACAC

451 AGGGCCAGTG GGAGCTGCAT GGTACCAGCC AGAGGAGGGC ACGCCACCTT

501 CCAGTAGCAC AGGCTCTGGT CTCCAGCCGA GACACGGTCG CCTTTTTAAA

551 GCCCCTCTCT GCTTCATGCC AGCCAATGAG GACAGGCTGG GGCAGGGCTG

601 GTCCCATGTT TCCCTCAGCC CCGGAGGGAG GGAAAGGGGT GTGCTCAGAG

651 CAAACCCTCC CCAAAGACTT CTCCTCTAGC TCAGCAAACT TCCAAATTGC

701 TGCTGGCACT CCCAGGTGAC CCAGAGAGAG GGGGCGTGTG AGGCAAGGCC

751 CAAGCCTGCT CTCCGGCACC TCCCACGTGC TGGCGGCTGT GGTTTTCAGA

801 T

Iniciador F - GATTTCCGTGGCATCATTCT
Iniciador R - TGAAGCAGAGAGGGGCTTTA
Tamanho do fragmento amplificado: 204 pb

5.4. Amplificação pela PCR

Para amplificar o DNA das amostras do pai, mãe e probando foi preparado um mix
da reação da cadeia de polimerase. Para o preparo desse mix da reação dessas 3
amostras foi realizado cálculos para descobrir o volume que deveria ser utilizado
levando em consideração 5 amostras: uma para o DNA da mãe, uma para o DNA do
pai, uma para o DNA do probando, uma para o branco(controle negativo) e uma para
o excesso, para compensar a perda de líquido da pipeta. Por exemplo: para calcular o
volume do tampão em μl, no mix, foi considerado que ele é 10x na [ ] estoque e sua
[ ] final é 1x, já que foi realizado a reação em 12.5 μl, e foram utilizados 5 tubos, seu
volume no tampão foi de 6.25 μl. O preparo do mix foi de acordo com a tabela
abaixo:

A temperatura de melting do meu primer é 60ºC, com isso, a temperatura de

anelamento é 55ºC. Assim esse é meu programa de amplificação:

-Programa de amplificação
Desnaturação 94ºC por 5 min

1- Desnaturação no ciclo: 94ºC por 1 min

2- Anelamento 55ºC por 1 min
3- Extensão 72ºC por 1 min

repete 30x 1-3

Extensão final 72ºC por 10 min

Armazenamento 4ºC infinito

5.5. Eletroforese em Gel de Agarose

Protocolo para Eletroforese de DNA em gel de Agarose

1. O gel de agarose foi feito previamente adicionando-se 0,5 g de agarose em 50

mL de tampão TAE 1x, fundindo-se o gel em microondas, adicionando-se 10
g/ml de brometo de etídio e despejando-o na cuba apropriada para solidificação.
2. Após solidificação, transferir o gel com o suporte para a cuba de eletroforese.
Adicionar quantidade suficiente do tampão de corrida TAE para cobrir o gel a
uma altura de aproximadamente 1 mm.
3. Conectar os eletrodos à fonte, certificando se as canaletas do gel estão próximas
do catodo (eletrodo preto).
4. Preparar as amostras de DNA misturando-as ao tampão de aplicação da amostra
segundo esquema abaixo(*). Para facilitar a aplicação, o óleo do PCR foi retirado
e o tampão adicionado.
5. Utilizando uma micropipeta aplicar lentamente 10 µl das misturas das amostras
nas canaletas do gel. Anotar no espaço abaixo a sequência das amostras aplicadas
no gel.
6. Aplicar uma voltagem de 100V, prosseguindo a corrida até que os corante azul
de bromofenol (e xileno cianol qdo houver) tenham migrado uma distância
apropriada no gel.
7. Desligar a corrente elétrica e remover os cabos dos eletrodos.
8. Examinar o gel por luz ultravioleta, pois o Etídio intercalado em DNA fluoresce
no vermelho enquanto que o não intercalado no amarelo claro – assim, o DNA
aparece alaranjado. Documentar o gel. Qdo foto é realizada, usa-se um filtro que
não permite que a UV seja transmitida, mas somente a luz alaranjada.
OBS: Radiação ultravioleta é danosa, particularmente para os olhos. Use óculos,
máscaras de proteção ou barreiras adequados.
Solução TAE 1x: Tris base 40 mM pH 7,2, ácido acético 20 mM, 1 mM EDTA
Tampão da amostra 6 x: TAE 6x, azul de bromofenol 0,25% (xileno cianol 0,25%),
Ficol 400 15%
Padrão de tamanho molecular 1 Kb ladder ou lambda Hind III em tampão de amostra
- 10 l

As quantidades de amostras a serem analisadas são:

 - reação de PCR: 10 l + 2 l de tampão de amostra 6x
- reação de digestão: 20 l + 4 l de tampão de amostra 6x
Analisar também controles negativos de digestão (sem enzimas) e PCR (sem DNA).

5.6. Sequenciamento pelo método de SANGER

Protocolo de reação de Sequenciamento

As amostras a serem sequenciadas no 3500 deverão ser preparadas em placas, caso já

não estejam desde a PCR ou purificação.

Perfil no seqüenciador (duração aproximada: 3h)

96ºC - 1 min
96ºC - 15s
50ºC - 15s
} 35X
60ºC - 4min
8ºC - ∞
As amostras devem ser precipitadas em seguida. Não armazenar por mais de um dia e
não deixar overnight no termociclador. Caso a placa seja guardada antes da
precipitação, envolvê-la em papel alumínio.

Fragmento amplificado no pai homozigoto A/A

...TGCCACCCCTAGCCCTCCACT...
Fragmentos amplificados na mãe heterozigoto G/A
...TGCCACCCCTGGCCCTCCACT…

Fragmento amplificado no filho/probando homozigoto A/A

...TGCCACCCCTAGCCCTCCACT…