TÉCNICAS BÁSICAS DA

MICROBIOLOGIA
 DUAS OPERAÇÕES BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

Separação de estirpes microbianas específicas a partir de populações mistas

(ex. amostras ambientais, amostras clínicas)

CULTURA DE MICRORGANISMOS

Crescimento de populações de microrganismos em meios de cultura laboratoriais

(usualmente, em cultura pura)

Técnicas básicas da Microbiologia

Preparação de meios de cultura

Técnicas de assépsia e de esterilização

Isolamento de culturas puras

Manutenção de células viáveis no laboratório

Microscopia
Preparação de meios de cultura
A composição de um dado meio de cultura está
dependente da espécie que se pretende cultivar.

O conhecimento do habitat natural de um dado microrganismo é

muitas vezes útil na selecção do meio de cultura adequado, já
que as suas necessidades nutricionais reflectem esse mesmo
habitat.

ELEMENTOS ESSENCIAIS

Carbono (C) Proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos, lipidos

(Elemento comum a todos os
constituintes celulares
~ 50% do peso seco da célula)

Oxigénio (O) Proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos, lipidos

(~ 20% do peso seco da célula)

Azoto (N) Proteínas, ácidos nucleicos, coenzimas

(~ 14% do peso seco da célula)

Hidrogénio (H) Proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos, lipidos

(~ 8% do peso seco da célula)

Fósforo (P) Fosfolípidos, ácidos nucleicos, ATP

(~ 3% do peso seco da célula)

Enxofre (S) Proteínas, coenzimas

(~ 1% do peso seco da célula)
CATEGORIAS Fontes de Carbono
NUTRICIONAIS - CO2
DOS
- Compostos orgânicos
MICRORGANISMOS

Fontes de energia

Maior parte dos microrganismos

usam um de três tipos de
fontes de energia

Chlorophyll or
bacteriochlorophyll

Macronutrientes (
)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) Fig. 9.1
 Macronutrientes – Fontes de elementos principais

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

(g/l)

(mg/l)
Micronutrientes ou elementos traço (µg/l)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Vitaminas – factores de crescimento essenciais.

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
• Meios de cultura sintéticos ou definidos – meios
de cultura cuja composição química é perfeitamente conhecida.

• Meios de cultura complexos - meios de cultura cuja

composição exacta é desconhecida. Podem ter como componentes
diversos ingredientes, tais como Peptonas, Extracto de Levedura,
Extracto de Carne, etc.

PEPTONAS
EXTRACTO DE
Hidrolizados de LEVEDURA
proteínas preparados (“Yeast extract”)
por digestão
proteolitica parcial Obtido a partir da lise
de fontes proteicas de células de levedura
(p.ex. extracto de da cerveja e hidrólise
carne, caseína, soja, dos seusconstituintes.
gelatina, etc.). Os Fonte de vitaminas,
aminoácidos e compostos de
pequenos péptidos Carbono (C), de azoto
resultantes servem (N) e sais minerais.
como fonte de
carbono (C), de
energia e de azoto
(N), para os
microrganismos.
Meios de cultura liquidos e sólidos

Agar
agente solidificante
(polissacárido de alga marinha vermelha)

Meios selectivos e meios diferenciais

Os meios de cultura podem ser usados na selecção e crescimento de um

determinado microrganismo ou na identificação de uma espécie em particular.

Meios selectivos Meios diferenciais

suprimem o crescimento de permitem a distinção entre diferentes

determinados grupos de microrganismos com base na
microrganismos em capacidade de metabolizar componentes
benefício de outros. específicos presentes no meio de cultura
e/ou
(ver aula sobre “cultura de na morfologia (aparência) das colónias.
enriquecimento”)
Permitem, por vezes, a identificação de
microrganismos com base nas suas
características fisiológicas.
 Microrganismos são ubíquos
(água, ar, solo, corpo, etc.)

Solo

ar

língua

(In J. Black, Microbiology, principles and exploration, 6th ed, J Wiley & Sons)

Figura mostra colónias de microrganismos (na superfície de meio sólido)

 Pasteur – Sec. XIX

. Refutação final da teoria da geração expontânea

. Desenvolvimento de técnicas de esterilização

eficientes
(pasteurização)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Crescimento microbiano em meio líquido ⇒ turbidez

 Esterilização no Laboratório
ESTERILIZAÇÃO – Morte ou remoção de todos os organismos vivos, estruturas
biológicas e virus de um material, meio de cultura, etc. (in Brock Biology of Microorganisms)

CALOR SECO - em estufa (160ºC/2horas; 180ºC/1 hora)

- pouco eficiente
CALOR - em desuso; só aplicável a material de vidro
ou outro resistente a temperaturas altas

CALOR HÚMIDO – na AUTOCLAVE

λ = 260 nm)
RADIAÇÃO Ultra- Violeta (λ
Limitada a superficies (p.ex. salas, pequenos compartimentos, superficie de utensílios
(Não penetra vidro, filmes sujos, água, etc.)

FILTRAÇÃO
 * Vapor de água saturado,
Esterilização na AUTOCLAVE sob pressão (1 bar)
por acção do calor húmido*
CONDIÇÕES DE
ESTERILIZAÇÃO
NA AUTOCLAVE

121ºC (pressão: 1 bar)

Duração depende de:

Volume de material
dentro da autoclave;
Grau de contaminação do
material a esterilizar
(usual – 15 min)

APLICADA A:

- Meios de cultura sem

componentes termolábeis
(p.ex. muitos açucares, aminoácidos,
vitaminas, não são estáveis a 121ºC)

- Materiais de plástico ou vidro

- Descontaminação de materiais
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
contaminados com células viáveis
 Porquê 121ºC,
Esterilização na autoclave durante pelo menos 15 minutos?

Esporos bacterianos (endósporos) são as estruturas biológicas

mais resistentes ao calor
(é a sua extrema resistência que determina quais as condições de
funcionamento da autoclave que asseguram uma esterilização eficiente dos materiais)
Célula
Bacillus sp. vegetativa
Condições que causam a MORTE CELULAR:

Células vegetativas Esporos

Levedura 5 min a 50-60ºC 5 min a 70-80ºC Endósporo
Bolor 30 min a 62ºC 30 min a 80ºC
Bactéria 10 min a 60-70ºC 2-800 min a 100ºC
ou 0,5-12 min a
Vírus 30 min a 60ºC 121ºC
-

ENDÓSPOROS:
- Presentes na água, solo, etc
- Podem permanecer viáveis durante muito tempo
(décadas; milhares/milhões(?) de anos – encontrados em locais arqueológicos, no intestino de
abelha extinta preservada em ambar)
- Algumas bactérias que os produzem são agentes de doenças graves (ex. Tétano, Botulismo)
 TESTE QUE PODE SER USADO
PARA VERIFICAR O FUNCIONAMENTO EFICIENTE DA AUTOCLAVE

(1)

(2)

(Perry, Staley, Lorry, Microbial Life, Sinauer ed.)

“Spore strip” = Tira de papel esterilizada contendo sobre a superfície endósporos de uma
bactéria (p.ex. do género Bacillus)
Esterilização
por filtração

(In J. Black, Microbiology – Fundamentals and Applications,

J. Wiley and sons)

APLICADA A:

Líquidos
- Soluções de compostos sensíveis a temperaturas altas
(p.ex. antibióticos, vitaminas, aminoácidos, açucares
podem sofrer alterações, incluindo degradação, a 121ºC)

- Meios de cultura liquidos com componentes termossensíveis

Gases
Esterilização do AR por filtração
• Máscaras cirurgicas

• Rolhas de algodão nos frascos

onde são cultivados
microrganismos

. Sistemas usados para filtrar ar

que entra em bioreactor

• Filtros HEPA
(“high-efficiency particulate air
filters”)
(eficácia de retenção de 99,99% para
particulas de 0,3 µg)
usados em:
- câmaras de fluxo laminar
de segurança biológica

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

- salas limpas
 Câmaras de Fluxo Laminar de Segurança Biológica
(vários graus de contenção biológica)

Segurança Biológica
(nível de contenção 4)

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

( In Microbiology today, vol 33, pag 18)

Transferência de culturas de microrganismos - Técnicas de assépsia

Chama do bico de Bunsen

(Vizinhança da chama do bico de Bunsen oferece condições assépticas)

Ansa de repicagem
(filamento metálico)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

 Isolamento de colónias em meio sólido
A imobilização das células num meio sólido torna possível a visualização do
crescimento em massas celulares homogéneas e isoladas denominadas colónias.
Isolamento de
colónias pela técnica
de RISCADO EM
MEIO SÓLIDO

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Colónia – cultura pura de um microrganismo

A cultura pura de um dado microrganismo é uma cultura de células genética e
morfologicamente idênticas.
CRESCIMENTO MICROBIANO é exponencial

(Inóculo inicial
...
num ponto da superfície
de meio de cultura sólido)

1ª geração 2ª geração 3ª geração ...

 Isolamento de colónias de microrganismos

Técnica de ESPALHAMENTO em meio sólido

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Exemplo:
Suspensão de solo em água
(População mista de microrganismos)

Após incubação à T ambiente durante 24 h

COLÓNIAS COM MORFOLOGIAS DIFERENTES

→ MICRORGANISMOS DIVERSOS

(Noção de estirpe)
 Morfologia de colónias

forma e tamanho dependem do microrganismo

mas, também podem depender das condições ambientais,
tais como, quantidade de oxigénio e
nutrientes disponíveis no meio de cultura, pH,etc..

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Robert KOCH (1876) – primeiro cientista a definir CULTURA PURA e
a isolar COLÓNIAS de bactérias em meios de cultura sólidos.
R. Koch
Microfotografia de bactérias
provenientes de uma colónia
isolada (confirmação de ser
um único tipo morfológico)

Bacillus anthracis
(desenhos de R. Koch, sec XIX)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

 Isolamento de colónias e
enumeração de Unidades Formadoras de Colónias (UFC) – células viáveis
Passo 1. (p.ex. numa amostra de solo)

Solo – população mista

- vários triliões de células
de microrganismos
diversos

Suspensão de solo em água

(10g / 100 ml) Passo1. Diluições sucessivas da
0,1 ml suspensão de solo
Passo 2. (10-1 ou 1: 10;
10-2 ou 1: 100;
10-3 ou 1: 1000;
10-4 ou 1: 10000;
...)
Passo 3a

Passo 3b

Passo 4.
(In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)
 Diluição 10-2 10-3 10-4

(In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)

50 colónias (diluição 10-3)

Nº de colónias em cada placa de Petri está 50 x 10 x 103 UFC / ml suspensão de solo (A)
relacionado com o tamanho da POPULAÇÃO
CULTIVÁVEL presente na amostra original de solo
50 x 106 UFC / 100 ml de suspensão de solo
/10 g de solo

Tipos morfológicos diferentes das colónias

em cada placa relacionado com a diversidade
de microrganismos cultiváveis presentes
no solo.

Bactérias Fungos miceliais (bolores)

 CULTURA DE
ENRIQUECIMENTO

Isolamento de
microrganismos
pouco abundantes e
com requerimentos
nutricionais específicos,
a partir de populações
mistas
(p.ex. bactérias que são capazes
de degradar benzoato, i.e.
usam benzoato
como fonte de C e
energia).

Outros exemplos:
- Isolamento de bactérias que
degradam um certo
pesticida ou
hidrocarbonetos do
(adaptado de Perry, Staley, Lory,
Crescimento em petróleo ou
Microbial Life, Sinauer ed.) meios de cultura selectivos outros poluentes orgânicos
do Ambiente.
1º) enriquecimento em meio liquido
PRESSÃO SELECTIVA (nas bactérias em causa)
presença de fonte de C e energia
única (neste caso, benzoato) 2º) isolamento de colónias
em meio sólido
LIMITAÇÃO DAS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO DE COLÓNIAS

Células viáveis, mas não cultiváveis

Estima-se que que somente 1-10% dos microrganismos funcionais presentes nos ambientes naturais
(p.ex solo, água, amostras clínicas) são cultiváveis em meios de cultura laboratoriais conhecidos

versus

Bactérias observáveis numa amostra de solo

vs (observação directa através de microscópio
6 de fluorescência)
4.2 x 10 UFC de bactérias / g solo
10
UFC=CFU 4.2 x 10 Células totais / g solo
Unidades Formadoras de Colónias
(Colony Forming Units)

Diversidade microbiana no solo é uma fonte

importante para exploração biotecnológica de
NOVOS microrganismos, produtos e processos
 (Prescott, Harley e Klein, “Microbiology”, 5th edition)

Exploração das potencialidades dos microrganismos “não-cultiváveis”

nos meios de cultura laboratoriais conhecidos

- Desenvolvimento de métodos moleculares (não dependentes do cultivo)

para pesquisa e identificação ( ex. Análise de DNA, RNA, proteínas)

-Procura de “novas fórmulas” para cultivo de microrganismos


Procura de microrganismos adequados para um processo industrial:

- a partir da Natureza / Ambiente (solo, água, etc.)

- são frequentemente sujeitos a processos de melhoramento

(Engenharia Genética; mutação)

Maximizar o rendimento do processo

Novos produtos

Estirpes adequadas (estirpes selvagens, mutantes ou geneticamente

manipuladas) são conservadas em coleccções de culturas nacionais
e internacionais
(por ex. Micoteca da Universidade do Minho, American Type Culture Collection – ATCC,
National Collection of Industrial Cultures - UK)
Manutenção de microrganismos viáveis no Laboratório e em Colecções de Culturas

Várias metodologias permitem a manutenção de culturas viáveis, não contaminadas e

inalteradas nas suas propriedades durante períodos de tempo mais ou menos longos,
nomeadamente:

. Em rampas ou placas de Petri contendo meio sólido

(viabilidade das células: dias ou semanas)

. Congelação
(células suspensas em meio de cultura + glicerol (anti-criogénico)
(viabilidade das células: anos)

- em Azoto líquido (-196ºC)

- em Arcas congeladoras (-70ºC)

. Liofilização
(liofilização - desidratação das céluas por
sublimação de água congelada, sob vácuo)

(viabilidade das células: anos; décadas)