DESENVOLVIMENTO DE UM MEIO SELETIVO PARA Pseudomonas

syringae PV. lachrymans1

ANDREA BITENCOURT MOURA2 e REGINALDO DA SILVA ROMEIRO

Revista Brasileira de Sementes, vol. 15, no 2, p. 209-214, 1993

RESUMO - Sete isolados foram obtidos de lesões típicas de mancha angular

em folhas de pepino e abóbora coletadas em diferentes locais do município de
Igarapé, MG, tendo sua identidade confirmada por meio de testes de
patogenicidade e provas bioquímicas. Antibiogramas indicaram insensibilidade
de todos aos antibióticos bacitracina e lincomicina até 1024µg/ml, a sulfato
depolimixina B até 256µg/ml e aos compostos antifúngicos cicloheximida,
captan, rosa bengala e nistalina até 1024µg/ml. O meio seletivo foi preparado
pela adição desses compostos ao meio 523 de Kado & Heskett (1970), sendo
bacitracina, captan, lincomicina e sulfato de polimixina B a 200µg/ml e
ciclohexemida, nistatina e rosa bengala a 300g/ml. O crescimento de fungos e
bactérias em cultura pura foi totalmente inibido por este meio seletivo mas não
o dos isolados de Pseudomonas syringae pv. lachryrnans. O meio foi também
supressivo para a microflora presente em suspensão de solo ou naturalmente
associada a sementes de pepino. O índice de repressão calculado do meio
para Pseudornonas syringae pv. lachryrnans foi menor que 2%.
Conseqüentemente, o meio seletivo desenvolvido e testado pode ser utilizado
para detecção e quantificação do patógeno em substratos como solo, extratos
de sementes, etc.

Termos para indexação: Pseudomonas lachrymans, meio de cultura

DEVELOPMENT OF A SELETIVE MEDIUM FOR Pseudomonas syringae

PV. lachrymans

ABSTRACT - Seven isolates were obtained from typical lesions of angular spot
in cucumber and squash leaves obtained from different platations located in the
parish of Igarapé, MG. Isolates identify was confirmed through pathogenicity
and biochemical tests. Antibiograms indicated insensibility of all isolates to the
antibiotics bactitracin and lincomcin up to 1024µg/ml, to polymyxin B up to
256µg/ml and to antifungal cornpounds cycloheximide, captan, rose bengal and
nistatin up to 1024g/ml. The selective mediurn was thought out by adding the
afore mentioned antimicrobial substances to medium 523 of Kado & Heskett
(1970) as follows: bacitracin, captan, lincomycin, polymyxin B (200µg/ml) and
cycloheximide, nistatin and rose bengal (300µg/ml). The selective medium
totally suppressed the growth of several fungi and bacteria in pure cultures but
not the growth of P. syringae pv. lachrymans isolates. Moreover, it completely

1
Aceito para publicação em 30.08.93
2
Respectivamente, docente e professor do Programa de Pos-Graduação em Fitopatologia.
Universidade Federal de Viçosa. Centro de Ciências Agrárias. Departamento de
Fitotopatologia. 36.570 - Viçosa, MG, Brasil
inhibited growth of microrganisms present in a soil suspension or naturally
associated to cucumber seeds. The repression index figured out for the
selective medium was smaller than 2%. Consequently, the selective medium
here developed can be used for detection and quantification of P. syringae pv.
lachrymans in substrates like soil, seed extracts and so on.

Index terms: Pseudomas lachrymans, medium

INTRODUÇÃO

Uma possibilidade, atualmente aceita, é o uso de meios seletivos ou semi-

seletivos (Schaad & White, 1974: Randhawa & Schaad. 1983: Saetller et al.,
1989; Klement et al., 1990), para detecção e quantificação de patógenos
bacterianos em sementes.
Técnicas de detecção e quantificação de fitobactérias em sementes pelo
uso de meios seletivos ou semi-seletivos possuem as vantagens de serem de
rápida execução e obtenção de resultados e poderem ser adotadas como
técnicas de rotina (Ciaflin et al., 1987; Roth, 1989: Saetller et al., 1989), porém,
é dificii de se desenvolver um meio que restrinja o crescimento de todos os
contaminantes da microflora existente nas sementes, tecidos vegetais, solo ou
água (Claflin et al., 1987) sem apresentar ele graus variáveis de repressividade
para o patógeno com o qual se trabalha.
Seletividade usualmente é conseguida pelo uso de fontes de carbono
específicas, de antibiótieos ou de outros compostos inibidores que favoreçam o
crescimento do patógeno em meio de cultura (Fahy & Persiey, 1983; Klement
et al., 1990). Um bom meio seletivo deve, prefereneiaimente, utilizar
ingredientes facilmente encontráveis, ser de fácil preparo, baixo custo e
passível de armazenamento por longos períodos (Claflin et aI., 1987).
Meios seletivos têm sido desenvolvidos e utilizados em outros países em
testes de rotina: MXP para a detecção de Xanthomonas campestris pv.
phaseoli em sementes de feijão (Claflin et aI., 1987), XTS para Xanthomonas
campestris pv. translucens em sementes de trigo (Schaad & Forster, 1989),
SCM para Clavibacter michiganense subsp. michiganense em sementes de
tomate (Fatmi & Schaad, 1989) e MD5 para Xanthomonas campestris pv.
carotae em sementes de cenoura (Kuan, 1989), por exemplo.
Com o propósito de se idealizar um meio seletivo para P. syringae pv.
Lachrymans, estudou-se a sensibilidade de uma população de 7 isolados de P.
syringae pv. lachrymans a diversos compostos antibacterianos e antifúngicos
por meio de bioensaios de difusão em ágar. A seguir, selecionaram-se aquelas
substâncias antibacterianas e antifúngicas às quais os sete isolados eram
absolutamente insensíveis. Essas substâncias foram adicionadas a um meio
básico, preparando-se assim o meio seletivo. Supressividade e repressividade
do meio seletivo foram avaliadas, de modo a verificar sua efetividade para
detecção de P. syringae pv. lachrymans em sementes de pepino.

MATERIAL E MÉTODOS

Origem, cultivo e manutenção dos isolados

 Os isolados foram provenientes de folhas de abóbora e de pepino
coletadas em locais distintos do município de Igarapé, MG. Esses foram
cultivados em meio King B (King et aI., 1954) e mantidos sob óleo mineral ou
em água, por repicagens semestrais.

Meio básico e modificações pretendidas

O meio básico foi o 523 de Kado & Heskett (1970). Pretendeu-se

adicionar ao meio antibióticos e compostos antifúngicos aos quais a fitobactéria
em estudo fosse insensível (Sands & Rovira, 1970; Simon et aI., 1973; Fahy &
Persley, 1983; Soares et aI., 1990). Para tanto, estudou-se a sensibilidade do
patógeno em questão a estes compostos, por meio de antibiogramas
qualitativos e quantitativos (Baker, 1970; Bailey & Scott, 1974; Lacaz, 1975).

Isolados e substâncias antimicrobianas em teste

Os isolados foram obtidos conforme técnica padrão (Romeiro, 1976). A

partir de folhas de abóbora e pepino com sintomas típicos de mancha angular.
Os isolados foram previamente testados quanto à pureza (Ackerman-Brown,
1978), patogenicidade (Romeiro, 1991; Romeiro, 1991) e identidade pelo uso
dos testes Lopat (Lelliott & Stead, 1987; Fahy & Persley, 1983). As substâncias
antimicrobianas utilizadas nesta fase estão listadas na Tabela 1 e foram
empregadas sob forma de discos de papel contendo quantidades conhecidas
de cada uma delas. Os discos foram adquiridos sob forma de "kits" (Interlab
Distribuidora de Produtos Científicos, S.A. São Paulo, Brasil).

Antibiogramas qualitativos

Em placas de petri de 160mm de diâmetro, estéreis, foram vertidos 20ml

de ágar-água 2%, de modo a formar uma camada básica. Sobre esta camada
adicionaram-se 10ml de meio básico semi-sólido (a 0,8% de ágar) fundente e
resfriado a ±48oC aos quais isolados foram incorporados a 100µl de suspensão
de crescimento bacteriano cultivado em meio básico líquido com 24 horas de
idade, seguida de homogeneização, tendo-se o cuidado de não permitir a
formação de bolhas. Após a solidificação, foram depositados 9 discos de
antibióticos distintos por placa, uniformemente distanciados. As culturas em
placas foram incubadas a 28oC durante 24 horas e, posteriormente, verificou-
se a formação ou não de halos de inibição. Em caso positivo, registrou-se o
diâmetro, em milímetros, dos halos supramencionados.

Antibiogramas quantitativos

O processo iniciou-se da mesma forma que para antibiogramas

qualitativos. Após a solidificação da sobrecamada, foram perfurados 6 orifícios
(4mm de diâmetro) por placa, com auxílio de um furador de rolhas estéril. Aos
orifícios foram adicionados 10µl de soluções de antibióticos e antifúngicos que
se mostraram inefetivos, pelos antibiogramas qualitativos, contra os isolados
em estudo, a saber: bacitracina, captan, cicloheximida, lincomicina, polimixina
B, nistatina e rosa bengala. Todos os compostos foram utilizados nas
concentrações de 1.024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1 e 0µg/ml. As
culturas em placas foram incubadas a 28oC durante 24 horas. Após este
período, observou-se a ocorrência ou não de halo de inibição e, em caso
positivo, seu diâmetro em milímetros foi registrado.
Constituição do meio seletivo idealizado

O meio básico foi o 523 de Kado & Heskett (1970). Acrescentou-se a este
meio 200µg/ml de bacitracina, captan, lincomicina e sulfato de polimixina B e
300µg/ml de cicloheximida, nistatina e rosa bengala.

Testes de supressividade do meio idealizado contra bactérias e fungos

em culturas puras

Em placas contendo o meio seletivo foram semeadas, por meio de estrias,

4 culturas puras por placa, de forma que cada estria ocupasse o centro de um
quadrante e, invariavelmente, 1 quadrante fosse ocupado por P. syringae pv.
lachrymans (controle). Foram utilizados os fungos: Trichoderma hamatum,
Trichoderma harzianum, Trichotecium roseum, Aspergillus niger, Penicillium
digitatum, Gliocladium roseum e as bactérias: Pseudomonas avenae,
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Erwinia carotovora, Xanthomonas
campestris pv. manihotis e dois isolados de Agrobacterium tumefaciens. Como
testemunha, foi usado o meio básico. As culturas em placas foram incubadas a
28oC/72 horas, quando se verificou o crescimento ou não das culturas.

Testes de supressividade do meio seletivo idealizado contra flora

bacteriana de uma suspensão de solo

A suspensão foi preparada pela adição de 10,0g de solo a 90ml de água,

mistura esta submetida à agitação branca por 30 minutos (Tuite, 1969; Dhingra
& Sinclair, 1985) e posterior centrifugação a 3.000rpm por 15 minutos, numa
centrífuga clínica, descartando-se o precipitado. Com o sobrenadante, foi
preparada uma série de diluições de 5-1 a 5-10, utilizando-se como diluente
solução salina estéril (NaCI a 0,85%). Outra série de diluições semelhante à
anterior foi preparada, porém acrescentou-se à diluição inicial 1ml de
suspensão de P. syringae pv. lachrymans, em salina (NaCI a 0,85%), cuja
concentração foi ajustada ao espectrofotômetro para OD540 = 0,10. Semearam-
se 100µI das diluições obtidas em meio seletivo e em meio básico. As culturas
em placas foram incubadas a 28oC e, após 72 horas, verificou-se a ocorrência
ou não de crescimento. Propositadamente, todos esses procedimentos foram
realizados sem qualquer tipo de assepsia.

Testes de supressividade do meio seletivo idealizado contra a flora

bacteriana associada a sementes de pepino

Utilizando-se as mãos, e sem qualquer tipo de assepsia ou desinfecção

superficial das sementes, foram distribuídas 200 sementes de pepino, 50 por
placa, uniformemente espaçadas em placas com o meio seletivo. Para a
testemunha, procedeu-se da mesma forma, distribuindo-se, porém, em meio
básico. As culturas em placas foram incubadas a 28oC durante 24 horas, após
as quais, verificou-se o crescimento ou não de colônias de bactérias, leveduras
ou fungos.

Determinação do índice de repressividade

Para verificar a possibilidade de ocorrência de repressividade ao

patógeno ativo, determinou-se o número de unidades formadoras de colônias
(CFU) no meio básico e no meio seletivo. Para tanto, obteve-se suspensão de
P. syringae pv. lachrymans em salina (NaCl a 0,85%) cuja concentração foi
ajustada em espectrofotômetro para OD540 = 0,10. Esta suspensão foi
homogeneizada em agitador de tubos, para dissolver eventuais aglomerados
existentes na suspensão. Transferiu-se imediatamente 1ml da suspensão para
um tubo contendo 4ml da mesma salina utilizada anteriormente. O processo foi
repetido até a obtenção de diluição 5-10. Semearam-se 100µl de cada
suspensão em ambos meios, em quatro repetições, cada placa constituindo
uma repetição. As placas foram incubadas a 20oC/24 horas e, após, procedeu-
se à contagem do número de colônias. O índice de repressão (IR) foi
determinado para uma dada diluição, dividindo-se o número de CFU surgidas
no meio básico pelo número de CFU surgidas no meio seletivo.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O espectro de sensibilidade dos isolados às substâncias antimicrobianas

testadas seguiu um padrão homogêneo no sentido em que prevaleceu a
tendência de quando uma substância antimicrobiana era efetiva contra um
dado isolamento ela também o era contra todos os outros. Somente no caso de
alguns antibióticos esse padrão não prevaleceu (Tabela 1). Variações na
sensibilidade a diferentes tipos de antibióticos dentro de uma mesma espécie é
prevista e conhecida (Baker, 1970; Lacaz, 1975).

Existem tabelas onde classificam-se os isolados bacterianos como

resistentes, intermediários e sensíveis, de acordo com o antibiótico e com o
diâmetro do halo de inibição (Bauer et aI., 1966). Porém, a maioria dos autores
considera sensíveis todos os isolados que formarem qualquer tipo de halo de
inibição (Baker, 1970; Bailey & Scott, 1974; Lacaz, 1975). Neste trabalho foram
considerados sensíveis os isolados para os quais houve formação de halo de
inibição, independente da magnitude de seu diâmetro.
Compostos para os quais isolados de P. syringae pv. lachrymans
mostraram-se resistentes foram selecionados, a saber: bacitracina, captan,
cicloheximida, lincomicina e polimixina B. Para este, foram conduzidos
antibiogramas quantitativos, de modo a se ter noção mais precisa da
sensibilidade em termos quantitativos e os resultados indicaram que no caso
de bacitracina, captan, ciclohexamida, lincomicina, nistatina e rosa bengala,
todos isolados mostraram-se insensíveis até a concentração de 1.024µg/ml, e,
para polimixina B, a maioria dos isolados foi resistente até 256µ/ml.
O meio seletivo foi testado quanto sua efetividade em inibir crescimento
de outros microrganismos que não o de P. syringae pv. lachrymans. Nos testes
de repressividade do meio utilizando-se culturas puras, observou-se cresci-
mento de todas as espécies em questão no meio básico e ausência total de
crescimento em meio seletivo, a exceção de P. syringae pv. lachrymans.
O meio seletivo foi capaz de inibir crescimento de bactérias, fungos e
leveduras testados em culturas puras, em suspensão de solo e sementes
(Tabela 2). Esta seletividade foi alcançada por meio do uso de antibióticos
bacteriostáticos e bactericidas que atuam nos grupos de bactérias Gram
positivas e Gram negativas, de agentes fungistáticos e fungicidas de amplo
espectro de ação, inclusive em leveduras (Jawetz, 1956; Baker, 1970; Lacaz,
1975; Zambolim & Chaves, 1989).

O índice de repressão (IR) foi calculado com as médias da diluição 5-7

(Tabela 3) e foi de 2,16%. Os resultados das contagens de unidade formadoras
de colônias encontram-se na Tabela 4. Verifica-se que houve um baixo índice
de repressão, principalmente quando se compara o valor encontrado com
índices de meios desenvolvidos para outras bactérias como é o caso daquele
desenvolvido para Pseudomonas marginalis que foi de 90% (Soares et aI.,
1990).
 Meios seletivos costumam ser repressivos, mesmo para o organismo para
o qual ele foi desenvolvido (Fahy & Persley, 1983; Klement et aI., 1990). O
desenvolvimento de um meio seletivo de baixa repressividade apresenta
grandes vantagens, principalmente quando a população a ser recuperada ou
quantificada é pequena.
A alta seletividade alcançada permite manipulação do meio sem que
condições de assepsia sejam necessárias. Este aspecto é muito interessante
no que diz respeito a seu emprego em técnicas rotineiras como detecção e
quantificação da bactéria em solo ou sementes. A alta seletividade minimiza
problemas com contaminações, eliminando problema de contaminações por
outros organismos da flora do solo ou daquela associada às sementes, bem
como os problemas advindos do fato dos saprófitas crescerem mais rápido e
inibirem o crescimento da bactéria patogênica desejada, que geralmente
apresenta crescimento mais lento.

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