Formaldeído e a Xilol nos Laboratórios de

Anatomia Patológica e Patologia Forense:

Toxicidade da Exposição Profissional a

Utilização de Reagentes Alternativos

João Manuel Vale

MEDICINA LEGAL
MESTRADO

M 2019

João Manuel Vale - Toxicidade da Exposição Profissional a Formaldeído e a Xilol nos Laboratórios de Anatomia M.ICBAS 2019
Patológica e Patologia Forense: Utilização de Reagentes Alternativos
Toxicidade da Exposição Profissional a Formaldeído e a Xilol nos Laboratórios de
Anatomia Patológica e Patologia Forense: Utilização de Reagentes Alternativos
João Manuel Vale
Instituto Ciências Biomédicas Abel Salazar
João Manuel Baptista do Vale

Toxicidade da Exposição Profissional a Formaldeído e a Xilol nos

Laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia Forense:
Utilização de Reagentes Alternativos

Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre em

Medicina Legal submetida ao Instituto de Ciências
Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto.

Orientador – Prof. Doutora Maria José Pinto da Costa.

Categoria – Professora Associada Convidada.

Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas de Abel

Salazar da Universidade do Porto; Instituto Nacional de
Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P.

Co-orientador – Prof. Doutora Catarina Eloy.

Categoria – Diretora Técnica do Serviço de Anatomia

Patológica do Instituto de Patologia e Imunologia
Molecular da Universidade do Porto (Ipatimup
Diagnósticos).

Afiliação – Instituto de Patologia e Imunologia Molecular

da Universidade do Porto (Ipatimup Diagnósticos).
ii
AGRADECIMENTOS

Quero agradecer à Prof. Doutora Maria José Pinto da Costa por todo o apoio dado
na execução desta dissertação e por todos os conhecimentos adquiridos ao longo destes
anos. Sem dúvida é a minha maior referência na área das Ciências Forenses.

À Prof. Doutora Catarina Eloy por ser um exemplo profissional a seguir, por todos
os conhecimentos transmitidos na área profissional e pessoal, pelo apoio na execução
deste trabalho e por me ter dado energia para concluí-lo.

Aos meus colegas e amigos de trabalho, por toda a paciência e incentivo diário
para comigo. Aos meus familiares e amigos, por tudo. Não preciso de referir nomes,
todos eles sabem quem são.

Muito obrigado!

iii
Conteúdo sem conflitos de interesse a declarar.

iv
RESUMO

Nos laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia Forense utilizam-se diversos

reagentes, como o formaldeído e o xilol, que são uma fonte de risco químico ocupacional.
A toxicidade do formaldeído exprime-se de diversas formas, como irritações, alterações
neurológicas, tumores nasais e leucemias. A exposição ao xilol pode resultar em irritação
do nariz e garganta, problemas pulmonares, efeitos cardiovasculares e depressão do
sistema nervoso central. Desta forma, é importante substituir estes reagentes por outros
menos nocivos e com características técnicas equiparadas. Assim, este trabalho de
revisão bibliográfica teve como principal objetivo a demostração de reagentes substitutos
do formaldeído e xilol e expor as propriedades físico-químicas, vantagens e
desvantagens destes reagentes alternativos e se há potencialidades da sua aplicação
prática. O FineFIX®, o RCL2® e o Glioxal são exemplos de reagentes substitutos do
formaldeído, que apresentam bons resultados na preservação da morfologia tecidular e
na integridade molecular dos tecidos. O isopropanol, MileGREEN®, Ottix Plus® e SBO®
são exemplos de reagentes substitutos do xilol, com bons resultados na desparafinação e
na diafanização. Todos os substitutos do formaldeído revistos apresentam bons
resultados, sendo que não se consegue eleger um fixador alternativo com total
convicção, comparativamente ao formaldeído. O Ottix Plus® pode ser substituto integral
do xilol, uma vez que pode ser usado em todas as etapas na rotina laboratorial.
Independentemente do reagente substituído, é necessário que seja sempre executado a
validação e viabilidade da aplicação dos substitutos, realizando-se testes experimentais
para avaliar a potencial implementação na rotina laboratorial.

Palavras-chave: Anatomia Patológica, Formaldeído, Xilol, Risco Químico, Reagentes

Alternativos

v
 TRACT

vi
ABSTRACT

Pathological Anatomy and Forensic Pathology laboratories use various reagents, such as
formaldehyde and xylene, which are a source of occupational chemical risk.
Formaldehyde toxicity is expressed in various ways, such as irritation, neurological
changes, nasal tumors and leukemias. Exposure to xylene may result in nose and throat
irritation, lung problems, cardiovascular effects and central nervous system depression. It
is therefore important to replace these reagents with less harmful ones with similar
technical characteristics. Thus, this review work aimed at demonstrating formaldehyde
and xylene substitute reagents and exposing the physicochemical properties, advantages
and disadvantages of these alternative reagents and whether there is potential for their
practical application. FineFIX®, RCL2® and Glyoxal are examples of formaldehyde
substitute reagents that have good results in preserving tissue morphology and tissue
molecular integrity. Isopropanol, MileGREEN®, Ottix Plus® and SBO® are examples of
xylene substitute reagents with good deparaffinization and diaphanization results. All
reviewed formaldehyde substitutes have good results, and it is not possible to choose an
alternative fixator with full conviction compared to formaldehyde. Ottix Plus® can be an
integral substitute for xylene as it can be used at all stages in the laboratory routine.
Regardless of the reagent replaced, the validation and feasibility of substitute application
must always be performed and experimental tests performed to assess potential
implementation in the laboratory routine.

Keywords: pathological anatomy, formaldehyde, xylene, chemical hazard, alternative

reagents

vii
viii
ÍNDICE

1 – INTRODUÇÃO 2

1.1 – Poluição ambiental e qualidade do ar exterior 2

1.2 – Qualidade do ar interior 3

1.3 – Orgânica dos Laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia Forense 6

1.3.1 – Autópsia 8

1.3.2 – Fixação de tecidos biológicos 8

1.3.3 – Macroscopia 9

1.3.4 – Processamento de tecidos 11

1.3.5 – Inclusão e corte histológico 12

1.3.6 – Coloração por Hematoxilina-Eosina 12

1.3.7 – Citopatologia 13

1.3.8 – Técnicas complementares de diagnóstico em Anatomia Patológica 15

1.4 – Gestão do risco químico em Anatomia Patológica 16

1.5 – Toxicidade do formaldeído 20

1.6 – Toxicidade do xilol 26

2 – JUSTIFICAÇÃO DO TEMA E OBJETIVOS 29

3 – SUBSTITUTOS DO FORMALDEÍDO 31

3.1 – FineFIX® 31

3.2 – RCL2® 32

3.3 – Glioxal 33

4 – SUBSTITUTOS DO XILOL 35

4.1 – Isopropanol 36

4.2 – MileGREEN® 37

4.3 – Ottix Plus® 37

4.4 – SBO® 38

5 – DISCUSSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS 39

6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 42

ix
ÍNDICE DE FÍGURAS

Figura 1 – Esquema geral organizacional de um Laboratório de Anatomia Patológica 7

e sua relação com as diferentes valências.

Figura 2 – Retalho de pele com lesão irregular de cor acastanhada. 10

Figura 3 – Colheita de fragmentos referentes à amostra histológica representada na 10

Figura 2.

Figura 4 – Exemplo de um protocolo da coloração de Hematoxilina e Eosina, 14

demonstrando os reagentes químicos necessários para a sua execução.

Figura 5 – Fórmula molecular do formaldeído: estrutura plana (à esquerda) e 20

estrutura espacial/ tridimensional (à direita).

Figura 6 – Metabolismo do formaldeído. 23

Figura 7 – Fórmula molecular dos isómeros do xileno: Orto-xileno, Para-xileno e 26

Meta-xileno, respetivamente.

x
ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 – Características físico-químicas do formaldeído. 21

Tabela 2 – Características físico-químicas do xilol. 27

Tabela 3 – Sintomatologia dos diversos sistemas do organismo associada 28

relacionada com a dose e o tempo de exposição ao xileno

Tabela 4 – Aplicações práticas do formaldeído e do xilol nas diferentes valências da 30

Anatomia Patológica.

Figura 5 – Fórmula molecular do formaldeído: estrutura plana (à esquerda) e 20

estrutura espacial/ tridimensional (à direita).

Figura 6 – Metabolismo do formaldeído. 23

Figura 7 – Fórmula molecular dos isómeros do xileno: Orto-xileno, Para-xileno e 26

Meta-xileno, respetivamente.

xi
Conteúdo sem conflitos de interesse a declarar.

INTRODUÇÃO
1 – INTRODUÇÃO

1.1 – Poluição ambiental e qualidade do ar exterior

No início do século XX, o ar necessário para a respiração de todos os seres vivos

do planeta ainda não era considerado um problema porque acreditava-se que este
estaria constantemente a ser renovado (1).

Novas fontes de poluição, como a queima de combustíveis fósseis pelos motores

na expensão industrial, levaram à contaminação exacerbada do ar (2). A poluição
atmosférica foi, e é, uma consequência provocada principalmente por atividade antrópica
e que, em concentrações elevadas, reduz consideravelmente a qualidade do ar ambiental
levando à incidência de problemas de saúde em todos os seres vivos (3). Quando
subsistem no ambiente uma ou mais substâncias químicas que, a determinadas
concentrações, são capazes de provocar malefícios em seres humanos, animais, flora ou
mesmo materiais, o ar é considerado poluído (2-4).

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), na população mundial, 90%

das pessoas respiram ar poluído e contaminado. De acordo com o relatório da OMS,
anualmente morrem sete milhões de pessoas por etiologia diretamente relacionada com
a poluição e os níveis de contaminação permanecem gravemente elevados em várias
regiões mundiais. Em causa está a poluição com partículas microscópicas que penetram
no sistema respiratório e cardiovascular, conduzindo a patologias potencialmente letais,
como derrames cerebrais, ataques cardíacos, obstruções pulmonares e infeções
respiratórias (5).

Estudos e ações relacionas com a poluição atmosférica indicam que a qualidade

do ar influencia seriamente a qualidade de vida humana (2,3). Consequentemente,
pesquisas relacionadas com a qualidade do ar ambiental provocaram desenvolvimentos
científicos sobre a qualidade do ar interior, devido à similaridade das consequências entre
as duas áreas (3,4,6). Questões relacionadas com a qualidade do ar interior de divisões
fechadas tem adquirido crescente expressão nas áreas científica, técnica e legal devido à
frequência de determinadas patologias correlacionadas diretamente com a exposição de
determinados agentes patogénicos e químicos (6).

2
1.2 – Qualidade do ar interior

Há algumas décadas, o único requisito solicitado na construção de um edifício

dizia respeito às condições adequadas para que os utilizadores realizassem as suas
atividades, independentemente dos seus fins. No decorrer dos anos e com a evolução do
conhecimento sobre qualidade do ar interior e exterior ao edifício, novas exigências foram
progressivamente adicionadas às condições básicas de construção, como a segurança
estrutural e impermeabilidade e/ou estanqueidade a chuvas. O conforto, seja
higrotérmico, visual, olfativo ou auditivo, por sua vez foi sendo privilegiado (7).

Novos produtos foram engendrados e novas técnicas construtivas foram

materializadas contribuindo para locais adaptados para diversas atividades com menor
gasto monetário possível (7,8). A evolução dos edifícios determinou novos estímulos,
nomeadamente na vertente económica e energética, mais evidente após a crise do
petróleo nos anos setenta (8). Com a subida do preço dos combustíveis, desencadeou
um corrente mundial de preservação energética, resultando, consequentemente, em
edifícios com poucas aberturas para ventilação (7-10).

Para além dos edifícios se tornarem cada vez mais fechados, o grau de
automatização também aumentou. A sua dependência de controlos computadorizados
(sistemas forçados de ventilação, sistemas de ar condicionado, entre outros) foi
crescendo (9). Diminuições nos gastos energéticos foram possíveis pela implementação
de computadores para controlar a variação das quantidades de ar introduzidas no
edifício, baseadas somente em requisitos de carga térmica nos espaços ocupados. O
único critério usado, no que diz respeito ao ar interior, foi a temperatura e a humidade.
Paralelamente, outros parâmetros envolvendo a qualidade do ar interior foram ignorados
(8-10).

Se, por um lado, houve um cuidado acrescido com a economia energética, por
outro, a qualidade do ar interior foi deixada para segundo plano. Avanços nos sistemas
automatizados provocaram uma redução drástica nas perdas de energia nos últimos
trinta anos e as taxas de infiltração de ar decresceram (9). Como resultado deste
acontecimento, as concentrações médias dos diversos poluentes no ar interno
aumentaram consideravelmente (7).

O número de registos sobre os efeitos prejudiciais da exposição a uma

inadequada qualidade do ar interior no conforto e saúde do ser humano tem vindo a
aumentar, motivo pela qual o estudo do ambiente interior tem vindo a merecer crescente
interesse (10).

3
 Segundo alguns autores, a incidência de poluentes no ar em ambientes fechados
é frequentemente superior à do exterior (11-13).

A qualidade do ar interior é influenciada pelos seguintes fatores: o ar exterior; os

materiais de construção e revestimento; e os sistemas de climatização, comummente
denominados por ar condicionado (11). Considera-se os materiais como difusores de
substâncias poluentes do ar interior, assumindo-se uma importância crescente com
consequência de duas tendências gerais na prática de construção, especificamente a
aplicação de novos materiais e produtos de construção sintéticos, à base de derivados do
petróleo (12). Os sistemas de climatização, aplicados maioritariamente como conforto
ambiental, são produtores de poluição, em maior percentagem de natureza biológica,
pela incorreta ou inexistente limpeza e/ou troca dos filtros e devido às condições
climatéricas diversificadas (11,13).

As estratégias para a melhoria da qualidade do ar interior focam-se no controlo na

fonte (correspondendo à aplicação do princípio da prevenção) e à ventilação (que
minimiza a concentração dos poluentes no ar) (13). Os requisitos adequados para os
níveis de ventilação fundamentam-se na análise de risco para a saúde (como as
infeções, o cancro e as doenças crónicas) e na avaliação sensorial (sintomatologia como
a fadiga e irritação das mucosas) (13,14). Devido aos efeitos referidos é possível
padronizar valores de ventilação mínima. No entanto, como a ventilação exige um
consumo elevado de energia esta tenderá a ser uma solução de último recurso,
priorizando, por sua vez, a aplicação de matérias na construção e revestimento com
baixo nível de emissão de poluentes (14).

Diversos estudos demonstram uma ligação direta entre determinadas

concentrações de poluentes com problemas de saúde como alergias, asma, bronquite,
pneumonia, cancro pulmonar, entre outras (15). A prevalência destas patologias
aumentou nas décadas recentes, sendo que a ocorrência de doenças alérgicas e
asmáticas duplicou em países desenvolvidos (12,16). Estas patologias abrangem uma
das nove maiores problemáticas atuais para a saúde pública, envolvendo imensos custos
médicos e terapêuticos (16). Acredita-se que a deterioração da qualidade do ar interior é
a principal etiologia para o incremento destas doenças (17).

Paralelamente aos problemas de saúde relacionados a uma deficiente qualidade

do ar interior, existem fatores, como o absenteísmo e baixa de produtividade laboral, que
não são facilmente identificados e que podem estar relacionados com a deterioração do
ar interior (18). As patologias provocadas por um ambiente interior poluído estão entre os
principais motivos de ausência do período laboral, nos Estados Unidos e na Europa.
Estudos comprovam que uma melhoria da qualidade do ar interior tem um efeito

4
significativamente positivo na produtividade (16,18).

Os sintomas e doenças relacionados com edifícios que apresentam um ar

deficitário podem ser classificados em “Síndrome do Edifício Doente” (SED) e “Doenças
Relacionadas com Edifícios” (DRE). O SED define-se como uma situação na qual os
ocupantes apresentam sintomatologia aguda sem uma etiologia percetível e sem a
hipótese de corroboração de uma causa, sendo, por isso, desconhecida (19,20). O
conceito SED é também utilizado para relatar ocorrências em que uma anómala
percentagem dos ocupantes (pelo menos 20%) exibe sintomas agudos e desconforto,
que aparentemente estão relacionados com o tempo passado no interior do edifício. As
causas dos relatos dos ocupantes são multifatoriais (11,19). A sintomatologia mais
frequente do SED passa por irritação e obstrução nasal, desidratação e irritação dérmica,
irritação e secura na mucosa oral e olhos, cefaleias, letargia e fadiga generalizada que
provoca falta de concentração (20-22). O SED envolve interação multifatorial de natureza
física, química, biológica e psicológica. A etiologia foca-se maioritariamente na anómala
conceção estrutural do edifício; ventilação desajustada; fraca filtração do ar; escassa
manutenção e limpeza das instalações; contaminação das condutas dos sistemas de
aquecimento, ventilação e ar condicionado (AVAC); e detritos produzidos pelo
metabolismo humano. A presença de odores, quer causem ou não sintomas, também se
relaciona a uma má qualidade do ar. Estudos indicam que taxas de ventilação mais
elevadas estão relacionadas a um decréscimo da prevalência dos sintomas do SED
(13,21-23). Geralmente os sintomas associados ao SED desaparecem quando os
ocupantes permanecem afastados de um ambiente inadequado, no entanto existem
casos onde a sintomatologia só é ultrapassada após tratamento médico (22,23). As DRE
associam-se a determinadas doenças que estão diretamente relacionados a eventuais
contaminantes (conhecidos) do ar dentro de um edifício. Nesta situação, ocorre a
persistência dos sintomas após a saída do espaço envolvido e os afetados podem
mesmo necessitar de um intervalo de tempo mais alongado de recuperação. As doenças
desta índole incluem infeções, reações alérgicas e reações imunológicas (24,25).

Como verificado, a estrutura dos edifícios pode ser uma fonte de contaminação
com extrema relevância no que toca à qualidade do ar e à saúde dos ocupantes. Esta
situação torna-se ainda mais problemática quando, em contexto ocupacional, se
manipulam reagentes químicos, biológicos e radioativos.

5
1.3 – Orgânica dos Laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia Forense

A Anatomia Patológica é uma especialidade médica responsável pela análise

morfológica e molecular de órgãos, tecidos e células, cujo principal objetivo é determinar
ou contribuir decisivamente para o diagnóstico macro e microscópico de patologias, com
implicações na terapêutica e prognóstico, bem como na sua prevenção e deteção
precoce. Esta área médica pode subdividir-se em cinco grandes valências
(detalhadamente verificadas na Figura 1): a histopatologia (biópsias e peças cirúrgicas); a
citopatologia (esfoliativa e aspirativa); os exames per-operatórios (exames
extemporâneos); técnicas complementares de diagnóstico; e a autópsia (26,27).
A base metodológica da Anatomia Patológica foca-se na observação macro e
microscópica, podendo auxiliar-se na realização de técnicas complementares para uma
interpretação diagnóstica mais precisa e detalhada (26). As técnicas complementares de
diagnóstico incluem a imunohistoquímica, a histoquímica, a hibridização in situ, a captura
híbrida, a biologia molecular, entre outras. Estas técnicas possibilitam identificar
especificamente agentes patogénicos de origem biológica, química ou física; caracterizar
a patogénese de lesões; identificar alvos terapêuticos e fatores preditivos à resposta
terapêutica; deteção de mutações genómicas somáticas e germinativas; e alterações
microscópicas que caracterizam os mecanismos de morte de um determinado indivíduo
(26-28).

Os laboratórios de Anatomia Patológica e de Patologia Forense são organizados

por uma panóplia de profissionais com funções específicas e fundamentais, como
médicos patologistas, técnicos de Anatomia Patológica, administrativos e auxiliares de
saúde (26,27). O médico patologista tem um papel fulcral na Anatomia Patológica,
principalmente no diagnóstico microscópico. O técnico de Anatomia Patológica contribuí
na execução de todas as técnicas necessárias ao diagnóstico anatomopatológico,
estando submetido a um ambiente com elevado risco biológico, químico e ergonómico
(30).

6
7
Figura 1 – Esquema geral organizacional de um Laboratório de Anatomia Patológica e sua relação com as diferentes valências.
1.3.1 – Autópsia

As autópsias anátomo-clínicas facultam informações relevantes para validação de

condutas clínico-terapêuticas nos hospitais, contribuindo para a recolha de dados
epidemiológicos relativos à mortalidade no país e no mundo (27). Possibilitam, ainda, a
educação médica e técnica, continuando a ser uma forma de investigação de novas
patologias, da ação de patogénicos e dos efeitos de determinados agentes terapêuticos.
Em suma, as autópsias anátomo-clínicas são realizadas sempre em contexto clínico
(27,30).
Paralelamente, a autópsia médico-legal integra-se numa especialidade médica
distinta, a medicina legal, que, por sua vez, é uma das imensas valências que incorporam
as Ciências Forenses (27,31). Desta forma, a autópsia médico-legal trata-se de um tipo
de perícia, sendo um meio de prova processual (penal ou de jurisdição laboral). No
momento da autópsia médico-legal propriamente dita (executadas por médicos legistas,
técnicos de Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica e auxiliares de Tanatologia),
são colhidos tecidos e/ou órgãos de interesse para serem processados e analisados no
laboratório de Anatomia Patológica, comummente denominado por laboratório de
Patologia Forense. Neste contexto, todo o procedimento técnico da amostragem é
comum em ambos os tipos de autópsia, tendo apenas a análise microscópica (relatório
final) objetivos distintos (31).

Na colheita de fragmentos e/ou órgãos para a análise histológica é fundamental a

preservação dos mesmos, por outras palavras, uma adequada fixação. Desta forma,
garante-se a integridade celular desde a colheita até ao diagnóstico microscópico.

1.3.2 – Fixação de tecidos biológicos

A fixação tem como objetivo a preservação das células e tecidos o mais próximo
possível do seu estado in vivo, evitando a degradação dos componentes tecidulares,
incluindo proteínas, péptidos, ácido ribonucleico mensageiro (mRNA), ácido
desoxirribonucleico (DNA) e lípidos (32). Este processo impede também a destruição de
estruturas macromoleculares, como membranas citoplasmáticas, retículo endoplasmático
liso, retículo endoplasmático rugoso, membranas nucleares, lisossomas e mitocôndrias
(32,33).

A fixação apropriada dos tecidos para análise histológica é extremamente

importante. Quando ocorre algum problema com este processo o diagnóstico

8
anatomopatológico tornar-se-á ineficaz e praticamente inútil. Por isso, é fundamental a
fixação de todos os produtos histológicos, independentemente da sua proveniência
(autópsia ou pequena e grande cirurgia) (33).

O estudo da função e estrutura dos tecidos biológicos levou ao desenvolvimento

de inúmeros tipos de fixadores ao longo dos anos. Os mecanismos e princípios pelos
quais os fixadores atuam para endurecer e preservar os tecidos biológicos e prevenir a
perda molecular são imensamente diversificados. Estes processos incluem a adição
covalente de grupos reativos e de ligações cruzadas, desidratação, efeito de ácidos,
formação de sais e reações exotérmicas. Os fixadores compostos podem funcionar com
a combinação destas reações físico-químicas (34).

Apesar de cada fixador ter vantagens, todos eles apresentam imensas

desvantagens, como a perda molecular; aumento ou retração tecidular; variações na
qualidade das técnicas de histoquímica e imunohistoquímica; e ineficácia na preservação
de estruturas e componentes celulares para a realização de exames bioquímicos e
técnicas de biologia molecular (34,35).

O formaldeído a 10% tamponado é o fixador mais utilizado nos laboratórios de

Anatomia Patológica e Patologia Forense (34-36). A fixação com este reagente é um
processo químico demorado e que ocorre através da sua reação com os grupos reativos
das proteínas que leva à formação de pontes metilénicas entre as moléculas do tecido. A
rede proteica formada evita a difusão das moléculas, tornando-as insolúveis (34,35). Este
fixador evita o crescimento de microrganismos; permite a preservação morfológica ideal
dos tecidos; mantém a estabilidade dos tecidos durante décadas; evita a retração
excessiva dos tecidos; endurece ligeiramente os tecidos de forma a melhorar o corte
histológico; é compatível com a maioria das técnicas histoquímicas e imunohistoquímica;
e é relativamente barato e fácil de preparar e manusear (34-36).

Um dos maiores problemas da fixação com formaldeído é a perda do

imunoreconhecimento de antigénios tecidulares após a etapa de processamento de
tecidos, nomeadamente com a embebição dos fragmentos biológicos com parafina
(37,38). No entanto, com a descoberta da recuperação antigénica (através de calor, por
exemplo) antes da aplicação de técnicas imunohistoquímicas foi possível reverter esta
problemática (37-39).

1.3.3 – Macroscopia

A macroscopia (também denominada registo macroscópico) compreende a

9
descrição e identificação de tecidos ou órgãos removidos cirurgicamente ou provenientes
de autópsias, associando as suas características macroscópicas a determinadas
patologias. Os fragmentos histológicos representativos resultantes deste procedimento
são fundamentais para estabelecer um diagnóstico (clínico ou mecanismo de causa de
morte) e podem determinar o prognóstico e decisões terapêuticas (40).

A macroscopia é a primeira etapa do exame anatomopatológico. Nesta fase as

amostras histológicas são rececionadas já fixadas em formaldeído de forma a manter a
integridade tecidular e viabilizar o exame (36). O volume de fixador ideal é 10 a 15 vezes
superior ao volume da amostra, de forma a não saturar o reagente e a garantir uma
fixação eficaz. Em produtos biológicos com maiores dimensões pode haver necessidade
de acondicioná-los, isto é, realizar uma pré-disseção de forma a facilitar e permitir uma
correta penetração do fixador nos tecidos (36,40).

Esta valência é da responsabilidade médica, no entanto, na última década, os

técnicos de Anatomia Patológica desenvolveram conhecimentos nesta área e tornaram-
se autónomos na execução deste procedimento (41).

Devido à diversa complexidade dos produtos histológicos que podem ser

registados, os médicos patologistas e técnicos de Anatomia Patológica ficam expostos
(direta ou indiretamente) ao fixador durante praticamente todo o seu horário laboral.

Após a descrição macroscópica sucedida da colheita de fragmentos

representativos, cada um deles é colocado em cassetes histológicas devidamente
identificadas, como exemplificado nas Figuras 2 e 3, e, posteriormente, essas cassetes
seguem uma nova etapa – o processamento de tecidos.

Figura 2 – Retalho de pele com lesão irregular Figura 3 – Colheita de fragmentos referentes à
de cor acastanhada. amostra histológica representada na Figura 2.
(Imagem obtida em: Bancroft JD, Suvarna SK, Layton C. Bancroft's (Imagem obtida em: Bancroft JD, Suvarna SK, Layton C. Bancroft's
Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. Churchill Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. Churchill
Livingstone, Elsevier: 2013. p.98) Livingstone, Elsevier: 2013. p.98)

10
1.3.4 – Processamento de tecidos

Após a colheita de fragmentos na macroscopia, estes devem ser processados de

forma a impregnar no tecido um meio firme o suficiente para permitir cortes com
espessura apropriada para observação microscópica (42). O processamento de tecidos,
convencionalmente, tem como etapas a fixação, a desidratação, a diafanização e a
impregnação. Este processo é realizado de forma automatizada num aparelho
denominado processador de tecidos (42-44).

A fixação com formaldeído no processamento histológico é uma etapa facultativa

mas quase sempre utilizada, garantindo a fixação adequada dos fragmentos biológicos.
Também permite que este procedimento técnico seja programado para um intervalo de
tempo de interesse, fazendo com que os fragmentos fiquem submetidos em agente
fixador até ao início do processamento (44).

A desidratação é alcançada através de passagens sucessivas em etanóis de

concentrações sucessivamente crescentes, permitindo a remoção do fixador e de água
dos tecidos (45). A água está presente nos tecidos sob a forma livre e sob a forma ligada.
Na forma ligada é constituinte integrante das moléculas celulares e não deve ser extraída
durante a desidratação, uma vez que a sua remoção origina uma retração excessiva,
dificulta a microtomia e provoca padrões anómalos morfológicos e de afinidade de
colorações. Por sua vez, uma desidratação incompleta impedirá a penetração do agente
diafanizador nos tecidos, o que consequentemente impedirá a uma adequada
impregnação (44,45).

A diafanização é a fase onde ocorre a substituição do agente desidratante dos

tecidos por um reagente miscível com esta solução e com o meio de impregnação. Um
diafanizador ideal deve ser solúvel na solução desidratante, para possibilitar a sua
completa remoção dos tecidos, e com o reagente utilizado na impregnação de forma a
permitir a sua total penetração nos tecidos (45-47). Em contrapartida, um bom
diafanizador deve dissolver lípidos que, caso contrário, impediria a penetração do agente
de impregnação. O diafanizador mais comummente utilizado no processamento
histológico é o xilol. Este reagente é um excelente solvente de lípidos, no entanto, é
insolúvel em água levando a uma desidratação excessiva os tecidos porque é capaz de
remover a água ligada (45-48).

A impregnação consiste na exoneração do diafanizador dos tecidos para posterior

impregnação com o meio de inclusão. O meio de impregnação mais usado é a parafina,
que permite a obtenção de cortes histológicos de qualidade. Os tecidos que não
impregnam suficientemente não ficam bem processados, ficando com uma consistência

11
amolecida. Por outro lado, os fragmentos submetidos demasiado tempo em banhos de
parafina apresentam uma redução significativa do tamanho e quebradiços, dificultando a
fase de inclusão e corte (45,46,48).

1.3.5 – Inclusão e corte histológico

Uma vez terminado o processamento histológico, as cassetes contendo os

fragmentos histológicos são removidas do processador e colocadas num aparelho de
inclusão (44). Durante a inclusão, os fragmentos de cada cassete são introduzidos,
devidamente orientados num molde metálico com parafina líquida (devido ao seu
aquecimento a mais de 55ºC). O fundo do molde é arrefecido na placa fria do
equipamento, onde se exerce pressão sobre os fragmentos para assegurar que estes
ficam completamente representados no mesmo plano de corte. Posteriormente, as
cassetes são colocadas sobre os respetivos moldes e este é deixado a arrefecer numa
placa fria, formando-se, desta forma, um bloco de parafina (44,49).

O corte histológico é conseguido através da utilização de um micrótomo que

permite o corte a fina espessura do tecido incluído no bloco de parafina para
posteriormente ser aderido a uma lâminas de vidro e, despois de corado, é visualizado ao
microscópio ótico. Inicialmente, é efetuado o desbaste dos blocos a uma espessura entre
5 a 30 micrómetros, com o objetivo de remover a parafina que se encontra sobre o tecido
de forma a expor por completo a superfície do fragmento. De seguida, com o bloco
gelado, é efetuado o corte histológico a 3 ou 4 micrómetros, com o auxílio de um banho
com água fria e um banho com água quente para facilitar a extensão e recolha em lâmina
de vidro. Por fim, as lâminas contendo os cortes histológicos são colocadas em suportes
apropriados para se proceder à coloração (44,49).

1.3.6 – Coloração por Hematoxilina-Eosina

A coloração de rotina nos laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia

Forense é a coloração de Hematoxilina-Eosina (49-51). Esta coloração consiste na
aplicação de dois corantes, a hematoxilina e a eosina, e outros reagentes químicos em
cortes histológicos e tem como objetivo evidenciar as estruturas celulares dos tecidos,
demonstrando as diferentes características nucleares, citoplasmáticas e extracelulares
(50,51).

12
 A hematoxilina é um corante básico catiónico, derivado da hemateína (45,52,53).
Este reagente não possui por si só propriedades corantes até a hemateína ser oxidada e
combinada com um mordente (45). A hematoxilina cora a cromatina e outros
componentes celulares ácidos, como os ribossomas e o retículo endoplasmático rugoso.
Tecidos bem processados e corados demonstram núcleos vesiculares, exibem uma
membrana nuclear corada de azul e cromatina bem definida. Um bom detalhe
intranuclear possibilita observar e avaliar padrões característicos e variados de
condensação da cromatina o que permite caracterizar o tipo celular e eventual
associação a um tipo de patologia (45,52,53).

Em contrapartida, a eosina é um corante ácido aniónico, corando a maioria dos

organelos celulares, citoplasma e componentes da matriz extracelular. Amostras bem
processadas e coradas apresentam uma coloração com várias tonalidades que
demonstra três padrões de rosa entre eritrócitos, colagénio e músculo liso (52,53). Para
além da utilização dos corantes referidos anteriormente na técnica de coloração de
Hematoxilina-Eosina, é necessário utilizar uma série de reagentes químicos para que se
obtenha uma lâmina com um corte histológico corado com qualidade (Figura 4). No final
da coloração, o corte histológico corado é protegido com um meio de montagem sintético
seguido de uma lamela, não só para permitir a sua visualização ao microscópio mas
também para preservar a coloração do tecido (54,55).

1.3.7 – Citopatologia

A citopatologia é a valência da Anatomia Patológica que se foca na análise de

células recolhidas de um determinado tecido ou órgão do organismo. Uma citologia
permite avaliar a morfologia celular, o seu crescimento e a sua função através das
alterações celulares induzidas por processos patológicos, desde inflamação até
neoplasias. É também utilizada como forma de rastreio, como a citologia cérvico-vaginal
(56).

Independentemente da forma de acondicionamento de uma citologia, todas as

amostras passam por um procedimento técnico até chegar à lâmina corada para
diagnóstico anatomopatológico. Existem algumas colorações aplicadas em citopatologia,
consoante a natureza e acondicionamento da amostra, no entanto, na fase final da
coloração, as lâminas são sempre submetidas a xilol para posterior montagem com meio
sintético e lamela (57-58).

Diversas vezes a amostra citológica é envolvida em gel sintético para passar a ser

13
Figura 4 – Exemplo de um protocolo da coloração de
Hematoxilina e Eosina, demonstrando os reagentes
químicos necessários para a sua execução.
14
tratada como um exame histológico – técnica denominada por citobloco – passando por
todo o procedimento técnico histológico, a partir do processamento histológico (59).

1.3.8 – Técnicas complementares de diagnóstico em Anatomia Patológica

A histoquímica é uma técnica complementar de diagnóstico que tem como

objetivo evidenciar e identificar determinadas estruturas e/ou constituintes tecidulares,
certos microrganismos (como fungos e bactérias) e pigmentos, com a finalidade de
distingui-los através da utilização de diversos reagentes químicos que reagem com
determinados elementos, provocando produtos corados. Existe uma panóplia de
colorações histoquímicas aplicadas com diversos objetivos, auxiliando o diagnóstico
anatomopatológico. Com a necessidade de utilização de inúmeros químicos, a
histoquímica é uma fonte de risco químico (60,61).

A imunohistoquímica é uma técnica que utiliza anticorpos específicos de forma a

detetarem antigénios de interesse em tecidos ou células, fundamentadas na interação
que ocorre entre os antigénios e anticorpos (60-62). Desta forma, os anticorpos
reconhecem o antigénio específico e liga-se a este possibilitando, através de sistemas de
deteção, a formação de um precipitado colorido e insolúvel no local do complexo de
ligação antigénio-anticorpo, proporcionando a sua visualização microscópica no tecido ou
células na região onde a marcação foi sucedida (60,61). Esta técnica tem as suas
principais aplicações no estudo de doenças infeciosas, degenerativas e neoplásicas. No
caso das neoplasias, a imunohistoquímica tem um papel preponderante não só quanto ao
seu diagnóstico para diferenciação entre maligno e benigno, caraterização da
histogénese e patogénese, e caraterização da origem de metástases, mas também
auxilia no prognóstico e indicação terapêutica. Tal como a histoquímica, esta valência
uma fonte de risco químico (61,62).

15
1.4 – Gestão do risco químico em Anatomia Patológica

A gestão de riscos é uma vertente central e essencial de todo o trabalho dos

laboratórios de Anatomia Patológica e de Patologia Forense (63).

Existem normas de certificação e acreditação europeias e diretivas nacionais que

garantem a segurança dos trabalhadores, pacientes e público em geral. Ao nível
ocupacional evita lesões, doenças e fatalidades relacionadas com o trabalho, emitindo e
aplicando padrões de segurança e saúde (61,63).

Os trabalhadores têm o direito em trabalhar em ambientes onde os riscos para a

saúde e segurança são adequadamente controlados (ou seja, minimizados). Segundo as
leis de segurança na saúde, a principal responsabilidade é das entidades empregadoras,
com as expectativas de que os funcionários garantam a sua própria segurança, a dos
seus colegas e pacientes, aderindo às políticas e procedimentos adequados e definidos
(63)(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h),(i).

___________________________________________________

(a) Lei n.º 102/2009, de 10 de setembro, que regulamenta o regime jurídico da promoção da segurança e saúde no trabalho, nos termos do
artigo 284.º do Código do Trabalho, aprovado pela Lei n.º 7/2009, de 12 de fevereiro (alterado pela Lei n.º 42/2012, de 28 de agosto).

(b) Decreto-Lei n.º 88/2015, de 28 de maio, que altera o Decreto-Lei n.º 141/95, de 14 de junho, que estabelece as prescrições mínimas para
a sinalização de segurança e de saúde no trabalho, alterado pela Lei n.º 113/99, de 3 de agosto; a Lei n.º 102/2009, de 10 de setembro, que
aprova o regime jurídico da promoção da segurança e saúde no trabalho, alterada pelas Leis n.os 42/2012, de 28 de agosto, e 3/2014, de 28
de janeiro; o Decreto -Lei n.º 24/2012, de 6 de fevereiro, que consolida as prescrições mínimas em matéria de proteção dos trabalhadores
contra os riscos para a segurança e a saúde devido à exposição a agentes químicos no trabalho e transpõe a Diretiva n.º 2009/161/UE, da
Comissão, de 17 de dezembro de 2009; e o Decreto-Lei n.º 301/2000, de 18 de novembro, que regula a proteção dos trabalhadores contra os
riscos ligados à exposição a agentes cancerígenos ou mutagénicos durante o trabalho.

(c) Decreto-Lei n.º 106/2017, de 29 de agosto, regula a recolha, publicação e divulgação da informação estatística oficial sobre acidentes de
trabalho.

(d) Lei n.º 113/99, de 3 de agosto, que desenvolve e concretiza o regime geral das contraordenações laborais, através da tipificação e
classificação das contraordenações correspondentes à violação da legislação específica de segurança, higiene e saúde no trabalho em
certos sectores de atividades ou a determinados riscos profissionais.

(e) Decreto-Lei n.º 24/2012, de 6 de fevereiro, que consolida as prescrições mínimas em matéria de proteção dos trabalhadores contra os
riscos para a segurança e a saúde devido à exposição a agentes químicos no trabalho e transpõe a Diretiva 2009/161/UE, da Comissão, de
17 de dezembro de 2009.

(f) Decreto-Lei n.º 41/2018, de 11 de junho, que procede à segunda alteração ao Decreto -Lei n.º 24/2012, de 6 de fevereiro, alterado pelo
Decreto -Lei n.º 88/2015, de 28 de maio, transpondo a Diretiva (UE) 2017/164 da Comissão, de 31 de janeiro de 2017, que estabelece uma
quarta lista de valores -limite de exposição profissional indicativos nos termos da Diretiva 98/24/CE do Conselho, e que altera as Diretivas
91/322/CEE, 2000/39/CE e 2009/161/CE.

(g) Decreto-Lei n.º 301/2000, de 18 de novembro, regula a proteção dos trabalhadores contra os riscos ligados à exposição a agentes
cancerígenos ou mutagénicos durante o trabalho.

(h) Decreto-Lei n.º 84/97, de 16 de abril, que transpõe para a ordem jurídica interna as Diretivas do Conselho 90/679/CEE, de 26 de
novembro, e 93/88/CEE, de 12 de Outubro, e a Diretiva 95/30/CE, da Comissão, de 30 de junho, relativas à proteção da segurança e saúde
dos trabalhadores contra os riscos resultantes da exposição a agentes biológicos durante o trabalho.

(i) Decreto-Lei n.º 141/95, de 14 de junho, que estabelece as prescrições mínimas para a sinalização de segurança e de saúde no trabalho.

16
 Para cumprir a legislação e manter as normas e acreditações, um laboratório deve
apresentar uma política eficaz de gestão de riscos. De forma a minimizar ou extinguir a
ocorrência de acidentes deve-se identificar todos os riscos existentes; avaliar a
probabilidade e gravidade desses riscos; eliminar os riscos elimináveis; e reduzir o efeito
dos riscos que não podem ser eliminados (64).

Um laboratório de Anatomia Patológica, tal como qualquer entidade empregadora,

deve ter um responsável pela gestão de riscos e pela saúde e segurança dos
trabalhadores (61-65). Para funcionar de maneira eficaz e segura, todos os
procedimentos e atividades de um laboratório devem ser submetidos à análise da gestão
de risco. Os riscos nos laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia Forense são
similares a nível mundial, embora com uma variação devido às particularidades
institucionais (61,65). Não é possível evitar ou eliminar todos os riscos. É importante
identificar e perceber os riscos envolvidos nas práticas de trabalho do laboratório (61,63-
65). O responsável pela gestão de riscos e pela saúde e segurança dos trabalhadores
preocupa-se com todos os riscos associados ao laboratório e a outras organizações
relacionas com este, como os transportadores das amostras e produtos químicos,
alertando a presença de riscos que devem ser adequadamente controlados dentro ou
fora do laboratório ou da instituição em que se inserem (hospital ou centro de
investigação, por exemplo) (61). A equipa de gestão de riscos e pela saúde e segurança
dos trabalhadores tem de garantir a disponibilidade de recursos adequados para a
prestação de serviços com segurança para os funcionários e pacientes. Níveis de
pessoal e respetivas competências profissionais, tempo de resposta e qualidade dos
resultados, gestão orçamental, consumíveis, equipamentos e manutenções são outras
áreas de atuação e preocupação (61,63-65). Apesar de existirem profissionais
responsáveis pela gestão do risco, as restantes equipas devem estar conscientes que o
mau funcionamento nas suas áreas de atividade e podem contribuir para um aumento
significativo dos riscos para o próprio e para os restantes membros. Devem, por isso,
trabalhar conforme as regras de segurança estabelecidas pelo laboratório (63,64). É
relevante referir que, independentemente dos riscos que sejam identificados, as medidas
de gestão do risco implementadas devem ser auditadas regularmente para avaliar se
estão a ser cumpridas e se são apropriadas e eficazes (63). Os riscos em cada setor do
laboratório são melhor identificados pelo responsável da área e pelos restantes membros
dessa equipa, garantindo uma maior abrangência de diferentes problemáticas. Durante
esse processo de identificação, é útil subdividir os riscos em diferentes categorias (como
físicos, químico e biológicos) (61,63-64). A análise e avaliação de potenciais riscos são
uma parte essencial do processo e são utilizadas para identificar a probabilidade e a

17
gravidade dos mesmos. Ao classificar os riscos quanto à sua probabilidade e gravidade,
é possível usar uma matriz como uma ferramenta que valoriza riscos específicos. Os
incidentes e acidentes, por menos relevantes que possam parecer, devem ser registados
para que essas informações sejam trabalhadas e aplicadas melhorias (63).

Como referido anteriormente, as amostras que são rececionadas nos laboratórios

de Anatomia Patológica e Patologia Forense são sujeitas a várias etapas. Em todos estes
procedimentos, excetuando o corte histológico, os técnicos de Anatomia Patológica,
Citológica e Tanatológica manuseiam substâncias químicas como formaldeído, álcoois,
xilol, parafina, corantes e reagentes ácidos e bases (61). Há cada vez mais uma
preocupação acrescida com a exposição a reagentes químicos nocivos para a saúde e
há a necessidade de encontrar uma ferramenta credível e de fácil utilização, que
possibilite a identificação de possíveis falhas ou deficiências na manipulação dos
mesmos (61,64). Para além de haver manipulação de material biológico perigoso, a
avaliação do risco químico permite também a sensibilização de todos os trabalhadores
para esta problemática e contribui para a execução de práticas ocupacionais mais
seguras (61). O risco para a segurança e saúde dos profissionais consequente da
presença no local de trabalho de reagentes químicos perigosos deve ser eliminado ou
reduzido mediante a conceção e organização de metodologias de trabalho; a utilização
de equipamentos de proteção individual para trabalhar com agentes químicos; o uso de
procedimentos de manutenção que garantam a saúde e a segurança dos profissionais; a
diminuição do número de trabalhadores submetidos à exposição a determinado agente
químico; a redução da duração e grau de exposição; a tomada de medidas de higiene
adequadas; a diminuição da quantidade de agentes químicos armazenados necessária à
execução das tarefas laboratoriais; a aplicação de processos de trabalho apropriados,
nomeadamente, disposições que assegurem a segurança no momento da manipulação,
armazenagem e transporte dos agentes químicos perigosos e dos resíduos que os
incluam; a substituição dos agentes químicos mais perigosos e mais manipulados por
outros menos nocivos e igualmente eficazes; e, não menos importante e como
mencionado inicialmente, as condições estruturais dos edifícios (incluindo sistemas de
climatização) devem ser as ideias (61,63-65).

As medidas adotadas nos laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia

Forense estão também correlacionadas com procedimentos de proteção coletiva, como a
existência de dispositivos de ventilação adequados (locais e gerais), concretamente
hottes com filtração específica e condutas especializadas, com plano de manutenção
assegurado e a presença de chuveiro e lava-olhos de emergência (61). A volatilização de
alguns agentes químicos perigosos levaram a medidas de extração mais eficazes e em

18
maior ampliação. Como exemplo, para diminuir a exposição ao formaldeído na receção
das amostras, adaptou-se, em alguns laboratórios, o local de receção e registo
informático das mesmas com um sistema de exaustão (acoplada a utilização de
máscaras individuais próprias) (61-64). O mesmo acontece com o transporte das
cassetes com os fragmentos recolhidos após a macroscopia para o processador de
tecidos que é feito em caixa fechada e, no local do equipamento, adaptou-se um sistema
de exaustão idêntico à da receção (64).

19
1.5 – Toxicidade do formaldeído

O formaldeído está categorizado entre os 25 reagentes químicos mais produzidos

mundialmente devendo-se fundamentalmente à sua alta reatividade, ausência de cor, à
pureza da configuração comercial e, ainda, ao seu reduzido custo (65,66). A sua
aplicação ocorre em áreas distintas de atividade, nomeadamente na produção de
produtos fertilizantes, papel, madeira e resinas, açúcares e cosméticos, na agricultura
como conservante, nas indústrias da borracha e do calçado, na preservação da madeira,
na produção de filmes fotográficos e na fixação de tecidos em laboratórios de saúde
humana e animal e museus anatómicos (65).

O formaldeído tem a forma molecular CH2O, sendo um dos aldeídos mais simples
(Figura 5), encontrando-se em condições ambientais normais no estado gasoso (65,66).
É solúvel em água, acromático e exibe um odor picante e bastante singular sendo, no
estado gasoso, inflamável e explosivo. A sua grande reatividade advém da presença de
uma ligação dupla polarizada entre o átomo de carbono e o átomo de oxigénio, enquanto
a alta pressão de vapor explica a sua elevada volatilidade (Tabela 1) (66).

Figura 5 – Fórmula molecular do

formaldeído: estrutura plana (à esquerda)
e estrutura espacial/ tridimensional (à
direita).

Em contacto com o ar e à temperatura ambiente polimeriza rapidamente dando

origem a paraformaldeído. O formaldeído (e paraformaldeído) reage violentamente com
oxidantes (peróxidos, por exemplo) e com redutores, podendo produzir reações
exotérmicas e originar gases inflamáveis (66,67).

Com a incidência de radiação solar, o formaldeído reage rapidamente com outras

substâncias presentes na atmosfera envolvente, levando a que o tempo necessário a que
se reduza a metade da quantidade a uma determinada concentração seja curto. Durante

20
o dia, o tempo de semi-vida do formaldeído é sensivelmente de 50 minutos, diminuindo
para 35 minutos na presença de dióxido de azoto no ar (66).

Tabela 1 – Características físico-químicas do formaldeído.

Fórmula molecular CH2O
Designação IUPAC Metanal
Peso molecular 30,03 g/mol
Ponto de fusão -92,0ºC
Ponto de ebulição -19ºC
Temperatura de auto ignição 424ºC
Pressão de vapor 516 kPa
Solubilidade Água, acetona e outros solventes

O formaldeído presente no ar ambiental pode ter origem em acontecimentos

naturais ou em atividades antropogénicas, dividindo com o acetaldeído a primeira posição
do aldeído mais abundante na atmosfera terrestre (69). Pode surgir no ambiente através
de reações fotoquímicas, mas também devido às emissões gasosas dos veículos
motorizados ou de outras fontes de combustão de origem humana. A fonte originária de
formaldeído atmosférico incide na reação de radicais hidroxilo com gás metano (68,69).

A produção de formaldeído data do ano de 1889, com fins de comercialização,

através da oxidação catalítica do metano. O fabrico e o uso deste químico tem vindo a
aumentar significativamente em todo o mundo, com especial destaque na Europa (70,71).

O formaldeído pode ser comercializado no estado sólido (paraformaldeído) e

como trioxano ((CH2O)3) (65,72). Também é habitualmente usado e conservado em
solução aquosa com concentração entre 30% a 50%, a qual geralmente contém, como
agente estabilizador, o metanol, com uma concentração que pode ultrapassar os 15%.
Pode apresentar múltiplas denominações, dependendo do âmbito de atividade onde é
empregado, nomeadamente formol, aldeído fórmico, formalina, óxido de metileno, entre
outras (65,71,72).

Nos laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia Forense utiliza-se

formaldeído em solução aquosa, denominado comummente por formol (72). Trata-se de
um reagente comercial de formaldeído a 37% que, posteriormente, é submetido a uma
diluição a 10% (podendo já ser comercializado nesta diluição). Este químico é utilizado
como fixador de material biológico, com a finalidade de o manter preservado. A fixação

21
com este reagente é um processo químico demorado e que ocorre através da sua reação
com os grupos reativos das proteínas que leva à formação de pontes metilénicas entre as
moléculas do tecido (73). A rede proteica formada evita a difusão de moléculas, tornando-
as insolúveis. É um fixador economicamente acessível e bastante eficaz sendo há muitos
anos o eleito para aplicação na rotina em Anatomia Patológica. Apresenta propriedades
desinfetantes e não provoca o endurecimento excessivo dos tecidos, tornando-o um
excelente meio para preservar e armazenar tecidos e órgãos humanos e animais (72,73).

Os níveis de concentração de formaldeído em ambientes interiores são

fortemente influenciadas pelas características estruturais dos edifícios (ventilação,
revestimento e acabamentos), as condições climatéricas (altas temperaturas e humidade
provocam a emissão de vapores de formaldeído) e o ar exterior (se o ambiente exterior
possuir o químico a sua deslocação para o ar interior poderá ser executado através de
janelas ou sistemas de ventilação (74-76).

Em Portugal não existem dados estruturados e publicados alusivos à exposição a

formaldeído nas diferentes áreas ocupacionais, nomeadamente o número total de
trabalhadores expostos e os níveis de exposição (77).

O formaldeído está naturalmente no organismo em reduzidíssimas concentrações,

podendo na circulação sanguínea dos mamíferos – Homem, ratos e macacos – rondar
valores aproximados de 0,1 mM. Parte deste químico resulta na exposição do organismo
a fontes externas. Paralelamente, o formaldeído intrínseco ao organismo deriva de
diversos metabolismos, como os da serina, metionina, glicina, sarcosina, colina,
homoserina e da desmetilação de compostos N-metil, S-metil e O-metil. Alguns fármacos
anti-tumorais podem levar à produção endógena de formaldeído, contribuindo para a
demetilação do citocromo P450 e, também, a desaminação da epinefrina leva à formação
deste químico (78,79).

Através do meio ambiental, o formaldeído introduz-se no organismo

maioritariamente pela via respiratória, devido à sua elevada volatilidade (71). A
penetração por via dérmica é normalmente reduzida, enquanto a via oral representa uma
situação pontual e rara (71,80). Devido à sua alta solubilidade na água, o formaldeído
que penetra por inalação ou ingestão é rapidamente absorvido nos sistemas respiratório
e gastrointestinal e altamente metabolizado em formato na própria região de absorção,
que, posteriormente, parte é removido através da circulação sanguínea, finalizando-se na
urina (Figura 6) (80). A absorção por via dérmica, por sua vez, é frequentemente fraca,
conduzindo maioritariamente ao risco de dermatites de contacto (71,80). O formaldeído
absorvido, por sua vez, reage instantaneamente com aminas primárias e secundárias,
hidroxilos, tióis e amidas para formar derivados de metilol. Pode ligar-se reversivelmente

22
à cisteína para formar tiazolidina-4-carboxilato e ligar-se também à ureia para originar
adutos hidroximetil. Pode ainda reagir com macromoléculas como o DNA, RNA e
complexos proteicos para formar adutos reversíveis ou irreversíveis. Há uma panóplia de
enzimas envolvidas no processo de oxidação do formaldeído, designadamente a
desidrogenase do formaldeído (ADH3), o aldeído desidrogenase, a S-formilglutationa
hidrolase, a glioxalase e a catalase (65,71,78)

Figura 6 – Metabolismo do formaldeído (adaptação: Teng S, Beard K, Pourahmad J,

Moridani M, Easson E, Poon R, O'Brien PJ. The formaldehyde metabolic detoxification
enzyme systems and molecular cytotoxic mechanism in isolated rat hepatocytes.
Chemico-Biological Interactions. 2001;130:285-96).

O mecanismo pelo qual o formaldeído origina os seus efeitos toxicológicos ainda

não está totalmente esclarecido. Sabe-se que a toxicidade ocorre quando os níveis
intracelulares saturam a atividade da ADH3. Desta forma, os mecanismos de
autoproteção ficam comprometidos, conduzindo à presença de moléculas não
metabolizadas livres (71).

23
 A toxicidade do formaldeído exprime-se de diversas formas, desde simples
irritações das mucosas, como epífora e prurido, até danos graves, como alterações
neurológicas irreversíveis e tumores nasais, levando à incapacidade ou à morte do
indivíduo exposto (81,82). Na generalidade, os efeitos agudos principais provocados pela
exposição ao formaldeído são da origem das suas características irritantes. A expressão
da toxicidade depende da dose (concentração e tempo de exposição) e das regiões
anatómicas onde ocorre a absorção (77,78,83). A sintomatologia mais facilmente
detetável provocada pela exposição a formaldeído é a ação irritante, temporária e
reversível sobre as mucosas oculares e do trato respiratório superior (nasofaringe e
orofaringe), para exposições frequentes e superiores a 1ppm. Doses mais elevadas são
citotóxicas conduzindo à degenerescência e necrose das mucosas e epitélios. A
perceção olfativa varia de pessoa para pessoa, mas a sua deteção ronda em média entre
os 0,1 e os 0,3ppm no ar envolvente (69,71-73,80).

Ao nível dermatológico, o contacto direto com soluções aquosas com

concentrações entre 5 e 25% pode provocar irritações, levando a sintomas como prurido,
sensação de dormência e rubor, podendo ter propriedades corrosivas a partir de
concentrações superiores a 25%. Exposições prolongadas com o formaldeído podem
causar dermatites por contacto (69,71-73).

Os efeitos da exposição crónica a formaldeído sobre o sistema respiratório pode

conduzir a alterações degenerativas, inflamatórias e hiperplásicas na mucosa nasal.
Alterações do lavado nasal com irritação do epitélio são verificadas na exposição de
formaldeído no ar na ordem dos 0,4ppm com uma duração de 4 horas. Em
concentrações superiores a 50ppm pode provocar lesões críticas no trato respiratório (71-
73,84).

O formaldeído é potencialmente teratogénico (85). Há relação entre a associação

entre a exposição profissional a formaldeído e o sucesso da gravidez, das taxas de
aborto espontâneo e de partos prematuros (85,86).

Por sua vez, o formaldeído é um agente mutagénico e clastogénico (87-100).

Quando absorvido, o formaldeído sofre reações químicas com compostos orgânicos
(nucleótidos, proteínas e aminoácidos) por adição e condensação, formando adutos e
ligações DNA-proteína. Estudo em indivíduos exposto em contexto ocupacional a
formaldeído demostram ligações DNA-proteína, troca de cromatídeos irmãos, aberrações
cromossómicas e incremento de micronúcleos (87-99). Os efeitos genotóxicos em
humanos tem sido comprovada pela observação do aumento da frequência de
micronúcleos nas mucosas oral e nasal de indivíduos expostos. Em estudos laboratoriais
da exposição ao formaldeído, em animais, observou-se mecanismos patológicos nos

24
tecidos, como hiperplasia, metaplasia e displasia, na cavidade nasal a concentrações a
partir de 2ppm. Concentrações de formaldeído superiores a 15ppm, o índice de
proliferação celular aumentou 8 a 13 vezes em ratos, em 18 horas, após um período
único de inalação de 6 horas. Depois de uma exposição de curta duração, durante 5 dias
sucessivos, a uma concentração superior, o índice aumentou entre 13 e 23 vezes (78,87-
100). Para além das suas propriedades mutagénicas, em 2006 o formaldeído foi
categorizado como carcinogénico, com base em diversos estudos em profissionais
ligados ao uso desta substância química que apresentavam tumores nasofaríngeos
(101,102). Os mecanismos de carcinogenicidade ainda não estão bem elucidados, no
entanto a proliferação celular associada à utilização do formaldeído torna um fator
importante no desenvolvimento neoplásico (101-105). Alguns estudos mencionam ainda
outras neoplasias com possível relação com a exposição a formaldeído, nomeadamente
cancro biliar, cancro do canal hepático, cancro linfático e hematopoiético. Foram também
descritos alguns registos pontuais de leucemia, cancro do pâncreas e do cólon, mieloma
múltiplo, linfoma de Hodgkin e melanoma do globo ocular (105-108).

Existem cada vez mais provas científicas sobre as consequências na saúde dos
trabalhadores que manipulam formaldeído, facto que tem levado a uma revisão dos
valores limite recomendados da sua exposição (100-108). Em 2017 a American
Conference of Governmental Industrial Hygienists (ACGIH) atualizou os valores,
registando um valor limite de 0,1ppm para exposições de 8 horas diárias e 0,3ppm para
exposições de curta duração (15 minutos, no máximo) (73).

25
1.6 – Toxicidade do xilol

O xileno é um dos 30 principais produtos químicos produzidos no mundo, em

termos de volume. É amplamente utilizado como solvente nas indústrias da borracha,
calçado, reprográfica e couro, sendo também utilizado como diluente para tintas, agentes
de limpeza e vernizes (109).
Nos laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia Forense o xileno é usado
como um agente diafanizador no processamento de tecidos e nas colorações e como
agente desparafinador. O xileno, para garantir qualidade técnica, é uma combinação dos
três isômeros (Orto, Para e Meta), dando-se a essa mistura a denominação de xilol
(Figura 7) (110).

Figura 7 – Fórmula molecular dos isómeros do xileno:

Orto-xileno, Para-xileno e Meta-xileno, respetivamente.

O xilol é um líquido incolor, insolúvel em água e miscível em etanol, éter e outros

solventes orgânicos, de odor característico, nocivo e inflamável (Tabela 2). A sua solução
comercial resulta da mistura dos três isómeros de xileno, etilbenzeno e outros
hidrocarbonetos aromáticos, em diferentes proporções (Orto-xileno: 23%; Meta-xileno:
46%; Para-xileno: 21%; etilbenzeno: 0,9%; e outros hidrocarbonetos aromáticos: 9%)
(64).

Estudos demonstraram que o xileno é altamente absorvido pela via respiratória,

oral e, em menor percentagem, pela via cutânea (111,112). Uma vez absorvido, o xileno
entra em circulação sanguínea e é distribuído por todo o organismo (111). A
biotransformação do xileno, independentemente do isómero e da via de administração,
prossegue através da oxidação de um grupo metil de cadeia lateral por oxidases de
função mista no fígado para formar ácidos metilbenzóicos que se conjugam com a glicina

26
para produzir ácido metil-hipúrico, que é excretado na urina. Grande parte do xileno que
entra no organismo é exteriorizado após 18 horas da exposição. Após exposição
prolongada, especialmente em ambientes ocupacionais, há forte probabilidade de
acumulação do xilol principalmente no tecido adiposo e muscular (111,112).

Tabela 2 – Características físico-químicas do xilol.

Fórmula molecular C8H10
Designação IUPAC Dimetilbenzeno
Peso molecular 106,16 g/mol
Ponto de fusão -25 °C, -48 °C e 13 °C (orto, meta e para, respetivamente)
Ponto de ebulição 144 °C, 139 °C e 138 °C (orto, meta e para, respetivamente)
Temperatura de auto ignição 465,9 °C
Pressão de vapor 1,33 kPa
Solubilidade Hidrocarbonetos aromáticos, etanol e parafina
.

A exposição inalatória aguda ao xilol a 200ppm entre 3 a 5 minutos resulta em

irritação do nariz e da garganta. Regiões focais de hemorragia intra-alveolar e edema
pulmonar com congestão pulmonar grave foram observadas na exposição aguda de
100ppm (114,115). Em técnicos de Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica foi
relatado diminuição da função pulmonar e dispneia, devido à exposição crónica ao xilol.
Efeitos cardiovasculares como rubor, palpitações e dores no peito também foram
observados (113-115). A exposição crónica ao xilol também provoca sintomas
gastrointestinais, como desconforto gástrico, náuseas e emese. Outra sintomatologia, na
vertente neurológica, como cefaleias, ansiedade, tonturas, incapacidade de concentração
e esquecimento é verificada com exposição prolongada a este reagente químico.
Também foram observados abortos espontâneos em técnicas de Anatomia Patológica,
Citológica e Tanatológica expostas a formaldeído e xilol, mas não foi detetada relação
direta com o hidrocarboneto aromático (113-117).

Os efeitos do xileno na saúde dependem da via de exposição e da concentração

no meio envolvente, como verificado na Tabela 3.

27
Tabela 3 – Sintomatologia dos diversos sistemas do organismo associada relacionada com a dose e
o tempo de exposição ao xileno. (Adaptação: Rajan ST, Malathi N. Health Hazards of Xylene: A
Literature Review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 2014;8(2):271-4).

Sistema Tipo de xileno Dose (ppm) Tempo de exposição Sintomatologia

Irritação no nariz e
Xilol 200 3-5 minutos
garganta.
Morte, congestão
Exposição aguda pulmonar grave com
Xilol 10000
(autópsia) hemorragia intra-alveolar
focal, edema pulmonar
Respiratório Não Exposição ocupacional Respiração difícil, função
Xilol
especificado crónica pulmonar comprometida
1 a 7,5 horas por dia, Irritação no nariz e
Para-xileno 100
durante 5 dias garganta.
Irritação no nariz e
Xilol 14 7 anos
garganta.
Não Náuseas, vómitos,
Xilol Não especificado
especificado desconforto gástrico
Gastrointestinal
Não
Xilol 2 semanas Vómitos, anorexia
especificado
Circulatório Xilol 14 7 anos Sem efeitos visíveis
Diminuição da força de
Muscular Xilol 14 7 anos pressão e força muscular
nas extremidades
Nenhuma alteração nos
Hepático Xilol 14 7 anos valores bioquímicos
séricos
Aumento da ureia no
sangue, diminuição da
depuração urinária de
creatinina endógena,
Renal Xilol 10000 Exposição aguda aumento da β-
glucuronidase, aumento
da albumina, excreção
de glóbulos vermelhos e
leucócitos
Meta-xileno 690 15 minutos Tonturas
Memória perturbada,
Não
Xilol Não especificado humor e equilíbrio a
especificado
afetar o sono, cefaleias
Neurológico
Ansiedade,
esquecimento,
Xilol 14 7 anos
incapacidade de
concentração, tonturas
Eritema cutâneo,
Não
Meta-xileno Não especificado vasodilatação, pele seca,
especificado
Tegumentar descamação da pele
Não
Não especificado Não especificado Urticária
especificado
Xilol 200 3 a 5 minutos Irritação ocular
1 a 7,5 horas por dia,
Ocular Para-xileno 100
durante 5 dias
Irritação ocular
Xilol 14 7 anos Irritação ocular

OBJETIVOS
28
2 – JUSTIFICAÇÃO DO TEMA E OBJETIVOS

A preocupação com a segurança e saúde de todos os trabalhadores dos

laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia Forense está cada vez mais presente na
consciência geral. São diversos os riscos existentes nestes locais e estão relacionados
ao manuseamento de equipamentos, reagentes químicos e material biológico.

A segurança nos laboratórios é essencial para garantir um trabalho com qualidade

e asseverar a saúde dos trabalhadores, uma vez que a falta de conhecimento e erros
realizados nesta vertente pode não só colocar em perigo o próprio mas também terceiros.

Desta forma, torna-se imperativo a prevenção e minimização dos riscos referidos,

adotando uma cultura de segurança que necessariamente abrange o conhecimento dos
riscos expostos. Para tal, é fundamental a preparação antecipada e cuidada de todas as
atividades laboratoriais que devem envolver a compreensão dos riscos e segurança
associados à manipulação dos reagentes, dos produtos intermédios e finais, assim como
dos equipamentos.

O formaldeído e o xilol são os dois reagentes químicos mais utilizados na rotina

laboratorial e, como já referido, acarretam uma panóplia de riscos para a saúde dos
profissionais de laboratório, principalmente para os técnicos de Anatomia Patológica,
Citológica e Tanatológica. A substituição de reagentes químicos por outros alternativos é
cada vez mais debatido e estudado com o intuito de aumentar a segurança dos técnicos,
garantindo a qualidade das técnicas executadas e não comprometendo o diagnóstico
anatomopatológico. É importante reter que o formaldeído e o xilol têm diversas
aplicações na prática laboratorial, com objetivos distintos (verificado na Tabela 4), o que
pode tornar as suas substituições uma atividade complexa.

Desta forma, este trabalho de revisão bibliográfica teve como principal objetivo a
demostração de reagentes substitutos do formaldeído e xilol com potencial utilização nos
laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia Forense. Pretendeu-se, como objetivos
específicos, expor as propriedades físico-químicas, vantagens e desvantagens destes
reagentes alternativos e se há potencialidades da sua aplicação prática.

29
Tabela 4 – Aplicações práticas do formaldeído e do xilol nas diferentes valências da Anatomia
Patológica.

Reagente Área laboratorial Aplicação

Fixação de tecidos e órgãos

Fixação no processamento
Histopatologia histológico

Agente redutor em técnicas

histoquímicas (Reticulina,
por exemplo)
Formaldeído
Citopatologia Fixador celular

Biologia Molecular (relação
indireta)
Preservação, através da
fixação prévia dos tecidos
biológicos, do DNA, RNA e
outras estruturas celulares
importantes para
diagnóstico molecular

Agente diafanizador no
processamento de tecidos

Agente desparafinador de
cortes histológicos para
colorações (Hematoxilina-
Histopatologia Eosina e histoquímica)

Xilol Agente diafanizador em

colorações (Hematoxilina-
Eosina e histoquímica)

Agente de limpeza de
equipamentos

Agente diafanizador em
Citopatologia
colorações

30
3 – SUBSTITUTOS DO FORMALDEÍDO

Um fixador ideal deve ser não-tóxico e permitir a análise microscópica da

morfologia tecidular e celular detalhada, colorações histoquímicas e técnicas de
imunohistoquímica de alta qualidade e boa preservação do DNA e RNA, a um custo
acessível. O fixador universal não existe, apesar de muitos considerarem o formaldeído
como tal, tornando-se fundamental avaliar as vantagens e desvantagens de novos
reagentes (118).

Na Anatomia Patológica, o formaldeído (formol a 10% neutro tamponado) é o

fixador “ideal” há décadas. É barato, permite o arquivo a longo prazo de material
biológico, preserva eficazmente as características morfológicas tecidulares e celulares,
permite a aplicação técnicas como histoquímica e imunohistoquímica (118,119).

No entanto, o formaldeído foi classificado como cancerígeno para seres humanos

e, portanto, representa um risco para qualquer pessoa que manipule o reagente. Além do
mais, suas características químicas nos tecidos pode mascarar determinados antigénios
e ácidos nucleicos, que pode prejudicar a análise por imunohistoquímica e eficiência da
extração de DNA e RNA de qualidade (118-122).

A substituição é uma medida preventiva que consiste em eliminar um determinado

risco, agindo na origem, usando um agente químico alternativo ou usando outro
procedimento. Na maioria dos casos, implica o aparecimento de um novo risco,
necessariamente de menor magnitude, que deve ser avaliado e controlado
adequadamente. Existem diversos fixadores alternativos ao formaldeído, como o
glutaraldeído, a acetona, o ácido pícrico e a acroleína, no entanto a sua toxicidade e a
suas propriedades fixadoras não compensam a sua utilização regular (118,119,121).

3.1 – FineFIX®

O FineFIX® é um concentrado patenteado (Milestone, Itália) sem formaldeído e à

base de água. Quando diluída com etanol, a sua fórmula de aditivos de baixa toxicidade
supera os inconvenientes comumente associados ao uso de etanol puro ou fixadores à
base de etanol (por exemplo, retração significativa de tecido, vacuolização e núcleos
picnóticos). O FineFIX® também fornece preservação ideal de antigénios tecidulares,
morfologia nuclear e citoplasmática e lise reduzida de eritrócitos com preservação das
membranas citoplasmáticas. Os riscos para a saúde dos utilizadores baseiam-se
principalmente pela presença de etanol que, comparativamente com o formaldeído, são
muito menores (123,124).

31
 O FineFIX®, contrariamente ao formaldeído, atua precipitando e reduzindo a
solubilidade das moléculas proteicas dos tecidos e, frequentemente, interrompe as
interações hidrofóbicas que normalmente resultam na estrutura terciária das proteínas.
(125).

Diversos estudos foram realizados com a comparação entre o FineFIX® e o

formaldeído.

Um estudo de dois anos realizado na Universidade médica de Kaunas concluiu

que a utilização de FineFIX® contribuiu positivamente na preservação de cadáveres para
ensino e principalmente numa grande diversidade de órgãos e tecidos. O FineFIX® fixou
os órgãos tornando-os com a consistência de disseção ideal, com uma cor muito
aproximada à de origem e com uma libertação de odores quase nula, após lavagem em
água corrente, devido à composição do reagente à base de etanol (126).

Num outro estudo realizado por Zenini, et al. verificou-se que a utilização deste
reagente químico provoca um endurecimento dos fragmentos biológicos após o
processamento histológico dificultando, consequentemente, as etapas de inclusão em
parafina e o corte histológico. A base em etanol do FineFIX® contribui para um índice de
rigidez tecidular maior, sendo necessário ocorrer modificações no processamento de
tecidos uma vez que este procedimento compreende uma etapa de desidratação,
igualmente à base em etanol, levando a uma maior rigidez do que o habitual (127).

Relativamente à morfologia tecidular e celular, vários estudos realizados

demonstraram que detalhes nucleares e citoplasmáticos foram equiparados aos tecidos
fixados em formaldeído. As características tintoriais da coloração de hematoxilina-eosina
e técnicas de histoquímica obtiveram bons resultados assim como os resultados em
imunohistoquímica. No entanto, na imunohistoquímica ocorreram diferenças significativas
pela aplicação do mesmo protocolo da técnica em tecidos fixados com diferentes
reagentes uma vez que os antigénios são mascarados molecularmente de forma distinta.
Torna-se necessário, desta forma, existir otimizações dos protocolos utilizados para os
diferentes soros imunológicos (128-131).

A nível molecular, o FineFIX® revelou-se estatisticamente superior ao formaldeído

na preservação do DNA, RNA e outras proteínas (128-131)

3.2 – RCL2®

O RCL2® é um fixador comercial (ALPHELYS, França) à base de etanol e ácido

acético que é descrito por diversos autores como um meio de preservação

32
histomorfológico e permite a integridade dos ácidos nucleicos (132).

Os componentes do RCL2®, cuja constituição é protegida por patente, são

demonstrados sem riscos para a saúde humana e o meio ambiente há anos, em
conformidade com as regulamentações europeias ou americanas, e são até autorizados
para alimentos humanos. Trata-se, portanto, de um fixador sem nenhum risco de ser
classificado como perigoso.

A atuação nos tecidos e os resultados morfológicos e moleculares da fixação pela

utilização do RCL2® em tecidos histológicos revelam resultados muito similares ao
FineFIX®, visto se tratarem de fixadores alcoólicos (128,130-133).

Um estudo comparativo que utilizou o RCL2® e o FineFIX® revelou a perda de

grânulos eosinofílicos e granulócitos comparativamente com tecidos fixados com
formaldeído, causados provavelmente pela atuação do etanol e ácido acético. Foi
também observado que tecidos fixados com RCL2® mostraram menor retração do que os
fragmentos fixados com FineFIX® devido possivelmente à presença de ácido acético do
fixador referido primeiramente. Também foi relatado que o descolamento da membrana
basal e do epitélio é mais acentuado no material fixado em FineFIX® (118).

3.3 – Glioxal

O glioxal é um pequeno aldeído que apresenta baixa toxicidade. O glioxal é

usado, em baixas concentrações, em estudos de glicação e metabolismo e já foi descrito
como um potencial fixador em 1963 por Sabatini, et al. (135-136).

Segundo um complexo e recente estudo sobre a potencialidade de fixação e

preservação celular do glioxal concluiu ser mais eficiente do que o formaldeído, em
diversos laboratórios de variados países. Da amostragem analisada a esmagadora
maioria demonstrou um detalhe morfológico e características tintoriais melhores quando
utilizaram glioxal. Relativamente à preservação proteica dos diferentes organelos
celulares o glioxal obteve os melhores resultados, com exceção na da mitocôndria. A
imunomarcação de diversos complexos antigénicos foi superior na fixação com glioxal. A
utilização deste fixador revelou marcações mais intensas e brilhantes, devido ao facto do
formaldeído apenas fixar 60% das proteínas e, por consequente, ter uma fração
significativa de proteínas móveis, podendo alterar a sua distribuição ou ate serem
perdidas. Este estudo concluiu que o glioxal penetra mais rapidamente nos tecidos,
levando a uma fixação mais rápida e eficaz e, desta forma, contribui para melhores
resultados de imunohistoquímica e biologia molecular uma vez que retém as proteínas

33
nas regiões celulares originais (137).

DO XILOL
34
4 – SUBSTITUTOS DO XILOL

O xilol é dos reagentes químicos com uma diversidade de aplicabilidades na

rotina dos laboratórios de Anatomia Patológica e Patologia Forense (138). No
processamento de tecidos atua como agente diafanizador, sendo uma substância
química miscível com o meio desidratante (etanol) e com o meio de impregnação
(parafina) (139). Um bom diafanizador deve ser solúvel na solução desidratante, para
permitir a sua completa remoção dos tecidos, e com o reagente utilizado na impregnação
de forma a permitir a sua total impregnação nos tecidos. Por outro lado, um bom agente
diafanizador deve dissolver lípidos que impedem a penetração do agente de impregnação
(45,139).

Sendo o xilol miscível com parafina, este também é utilizado como agente
desparafinador em cortes histológicos parafinados para se proceder a diversas
colorações (138). No final das colorações é necessário diafanizar os cortes para, após a
desidratação dos cortes histológicos com etanol, ocorrer a substituição do meio
desidratante e permitir a montagem com lamela através da miscibilidade do xilol e o meio
de montagem. Desta forma, torna-se difícil encontrar um substituto com estas
características e com reduzidas propriedades toxicológicas (140).

A procura de protocolos de processamento e coloração alternativos que utilizam

reagentes menos nocivos para a saúde e para o ambiente assim como o
desenvolvimento de protocolos para um processamento mais célere dos tecidos é uma
realidade cada vez mais presente nos laboratórios de Anatomia Patológica (140,141).
Apesar destes protocolos contribuírem largamente para a melhoria da qualidade do ar
interior bem como para um diagnóstico mais célere, é necessário avaliar a qualidade do
processamento e da coloração assim como as vantagens e desvantagens da sua
implementação (141). O facto de o processamento de tecidos convencional ser um
processo demorado e o aumento da consciencialização sobre os riscos para a saúde
associados à exposição aos seus reagentes, levaram à formulação de protocolos de
processamento alternativos (46). Foram desenvolvidos diversos processadores de
tecidos com protocolos alternativos utilizando reagentes menos nocivos para a saúde dos
utilizadores (142). Estes processadores possuem um sistema completamente fechado,
impedem a difusão de vapores para o exterior, permitem a utilização de um volume
menor de reagente e mantém os reagentes em circulação na câmara, o que melhora
consideravelmente a qualidade do processamento e diminui a sua duração (143). Por
outro lado, estes modelos possibilitam, em qualquer etapa, a aplicação de calor (micro-
ondas e/ou resistência, por exemplo), pressão, vácuo e agitação (144). Possuem ainda

35
sistemas de alerta automáticos para a troca de reagentes fornecendo mecanismos de
troca que reduzem ainda mais a exposição aos agentes químicos (142-145).

4.1 – Isopropanol

O isopropanol, também denominado por álcool isopropílico ou propan-2-ol, é uma

substância química incolor, altamente inflamável e de forte odor (idêntico ao do álcool
misturado com acetona) (146). É representado pela fórmula química C3H8O, sendo um
exemplo mais simples de um álcool secundário. É um químico levemente tóxico se
ingerido ou absorvido pela pele e mucosas, podendo causar lesões na córnea. Os seus
vapores têm efeito anestésico podendo, desta forma, causar tonturas (147,148).

A utilização de isopropanol no processamento de tecidos está maioritariamente

associado à utilização de equipamentos com tecnologia de vácuo e micro-ondas (48). O
isopropanol possui baixa acidez, é miscível com água, álcoois e outros solventes
orgânicos e é menos tóxico que o xilol (148). Desta forma, o isopropanol finaliza a
desidratação iniciada pelo etanol absoluto e, com recurso a alta pressão, provida por um
sistema de vácuo, e elevadas temperaturas, provenientes de resistência e micro-ondas, é
evaporado dos tecidos para permitir a sua impregnação pela parafina (148,149). Este
reagente químico não é habitualmente usado devido à sua baixa difusão nos tecidos, no
entanto, esta problemática é ultrapassada pela utilização de micro-ondas (150). O uso de
micro-ondas gera calor rapidamente, excitando as moléculas dos fluídos polares que
colidem com as moléculas adjacentes resultando em transferência da energia rotacional
e criando fricção que leva à produção de calor dentro do próprio material biológico
irradiado (147-151). Nos tecidos biológicos, o isopropanol combinado com micro-ondas
não provoca tanto endurecimento e retração dos tecidos como o xilol (152,153). No
entanto, as alterações morfológicas tecidulares e celulares estão mais relacionadas com
a aplicação de energia micro-ondas. A utilização de micro-ondas durante o
processamento histológico tem várias vantagens, nomeadamente a utilização de um
volume menor de reagentes e a diminuição substancial do tempo de processamento
(150,154,155). Vários estudos reportaram resultados similares ou superiores em técnicas
histoquímicas, de imunohistoquímica e na preservação do DNA, RNA e outras estruturas
importantes para a análise por biologia molecular, em tecidos processados com recurso a
micro-ondas e substituição do xilol por isopropanol, comparativamente ao processamento
convencional (154,156,157). No entanto, há estudos que indicam que a aceleração das
taxas de difusão em consequência do aumento brusco da temperatura provocado pelas
micro-ondas e de processos reativos pode levar à formação de artefactos morfológicos

36
como perda de afinidade por alguns corantes ou perda de imunoreatividade por diversos
soros imunológicos (158-160). O aquecimento de reagentes utilizados na fixação e
processamento de tecidos, como o isopropanol, pode levar à perda de componentes
voláteis e à alteração, precipitação e decomposição de reagentes termoinstáveis. A perda
de componentes voláteis deve-se à evaporação ou ebulição destes reagentes
(154,155,158-160).

4.2 – MileGREEN®

O MileGREEN® é um solvente comercial (Milestone, Itália) constituído por

isoparafinas que substitui o xilol no processamento histológico e em processos de
limpeza de material parafinado, devido à sua solubilidade com a parafina. Trata-se de um
reagente quase inodoro e com baixa toxicidade para o utilizador. Quando aquecido esta
solução é altamente eficaz na dissolução dos lípidos tecidulares, mantendo a estrutura
das células adiposas e, também, a morfologia nuclear e citoplasmática. Devido à sua
solubilidade com parafina, o MileGREEN® pode ser utilizado com agente desparafinador
na coloração de Hematoxilina-Eosina e em técnicas histoquímicas (161). Apesar de ainda
não existirem estudos que provem a eficácia e viabilidade deste reagente, já existem
instituições de referência que o usam e descrevem bons resultados.

4.3 – Ottix Plus®

O Ottix Plus® é um reagente patenteado (Diapath, Itália) sendo um substituto não

tóxico do xilol. É um reagente composto por uma mistura de álcoois e solventes não
aromáticos e indicado para protocolos de processamento e coloração de tecidos, sendo
compatível com todos os tipos de meios de montagem, exceto aqueles à base de
limoneno. Devido à composição de hidrocarbonetos lineares alifáticos faz com que seja
um bom substituto do xilol na rotina da Anatomia Patológica (162).

Várias investigações realizadas em diversas áreas científicas utilizaram o Ottix

Plus® no processamento de tecidos e na coloração de cortes histológicos, obtendo
excelentes resultados nos seus estudos, verificanso-se, desta forma, a aplicabilidade
deste reagente na rotina laboratorial, mais concretamente na histopatologia, na
imunohistoquímica, na histoquímica e na biologia molecular (163-167).

37
4.4 – SBO®

O SBO® (Kunming, China) é um substituto não tóxico do xilol originado através de

uma mistura, por hidrogenação, de 86% de óleo branco mineral nº2 e 14% de N-heptano
(139). Trata-se de uma substância incolor, sem cheiro e praticamente não volátil.
Comparativamente com o xilol, o SBO® possui um ponto de inflamação, ponto de
ebulição e ponto de ignição muito mais altos, fazendo com que reduza bastante a
exposição química e aumente a segurança e a confiabilidade ao ser utilizado. Ao mesmo
tempo, mantém as características de solubilidade em etanol e parafina (139,168,169).

Um estudo comparativo entre a aplicabilidade nos laboratórios de Anatomia

Patológica do SBO® e do xilol revelou uma boa manutenção da morfologia e estrutura
celulares e coloração do núcleo e do citoplasma adequadas, em ambos os reagentes. A
utilização do SBO® em todo o circuito laboratorial demonstrou resultados equiparados ou
melhores em técnicas de histoquímica e de imunohistoquímica. Além do mais, o SBO®
mostrou-se eficaz no processamento de tecidos ricos em tecido adiposo e componentes
vasculares devido principalmente pela utilização de óleo branco mineral nº2 (139).

FINAIS
38
5 – DISCUSSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS

As atividades realizadas nos laboratórios de Anatomia Patológica são

indispensáveis para o correto diagnóstico, prognóstico e indicação terapêutica de
diversas patologias, através da análise microscópica de células e tecidos (64).
Paralelamente, nos laboratórios de Patologia Forense o diagnóstico é similar mas com
fins médico-legais, principalmente no auxílio em autópsias (170). Assim, como em
qualquer atividade laboratorial, os trabalhadores destes laboratórios são diariamente
expostos aos riscos inerentes ao seu processo ocupacional, podendo ser biológicos,
químicos, físicos e ergonómicos (171).

Para o correto funcionamento de todas técnicas necessárias para a contribuição

de um bom diagnóstico anatomopatológico é necessária a utilização de uma diversidade
de reagentes químicos que podem colocar em risco a saúde dos utilizadores,
principalmente os técnicos de Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica (64). É
importante frisar que a utilização de equipamentos de proteção individual (como batas,
luvas, manguitos, máscara e óculos de proteção) e equipamentos de proteção coletiva
(como a hotte) são essenciais para reduzir a exposição à maioria dos reagentes químicos
presentes no ambiente laboratorial. Desta forma, é necessário que se tomem ações de
sensibilização interna para a utilização adequada e eficaz destes mecanismos de
proteção individual e coletiva que, usados da forma correta, contribui para um decréscimo
significativo dos riscos químicos (172). Mesmo com a utilização de equipamentos de
proteção não é garantida a total segurança dos trabalhadores. As condições da
infraestrutura do espaço ocupacional, como a ventilação e os materiais de construção,
contribuem para um ambiente envolvente adequado.

Sendo o formaldeído e o xilol os reagentes tóxicos mais utilizados nos laboratórios

de Anatomia Patológica e Patologia Forense torna-se quase imperativo recorrer-se a
alternativas mais seguras para os utilizadores e mais sustentáveis para o ambiente.

A maior limitação deste estudo de revisão bibliográfica foi a identificação de

reagentes químicos que substituam o formaldeído e o xilol, assim como a ecassez de
estudos que corroborem as respetivas substituições.

No entanto, como verificado, existem algumas opções, maioritariamente

comercias, para a substituição do formaldeído nos laboratórios de Anatomia Patológica e
Patologia Forense. Todos os substitutos do formaldeído revistos apresentam bons
resultados, sendo que não se consegue eleger um fixador alternativo com total
convicção, comparativamente ao formaldeído (123-128,131). No entanto, a substituição
do formaldeído por outro reagente alternativo torna-se um procedimento extremamente

39
complexo. A fixação é um processo pré-analítico, sendo efetuada antes de qualquer
produto histológico ser entregue num serviço de Anatomia Patológica. Os departamentos
clínicos são os responsáveis primordiais pelo acondicionamento do material histológico
que recolhem nos pacientes, colocando os produtos biológicos em fixador. A
implementação de um novo fixador tornar-se-á numa difícil organização logística que
poderá levar a um grande intervalo de tempo de adaptação, sendo crucial a
sensibilização clínica para proteção das próprias equipas e dos próprios doentes. Muitos
profissionais fora dos laboratórios não têm conhecimento da toxicidade do formaldeído e
se não forem devidamente alertados podem desvalorizar a importância da substituição
deste fixador. A implementação de um substituto torna-se mais facilitada quando são os
laboratórios de Anatomia Patológica a fornecer o fixador às entidades clínicas. Quando
são os hospitais e as clínicas a adquirirem o agente fixador torna-se ainda mais difícil
esta implementação devido aos custos da compra de reagentes alternativos. O
formaldeído é um químico relativamente barato comparativamente aos potenciais
substitutos (118,119). Por sua vez, a utilização de reagentes alternativos de fixação nos
laboratórios de Patologia Forense deverá ser menos complexa porque o circuito de
movimentação do material histológico é restrito aos Institutos de Medicina Legal e
Ciências Forense e Gabinetes Médico-Legais, podendo ser a sua implementação mais
facilitada. Relativamente à utilização do formaldeído na rotina dos laboratórios de
Anatomia Patológica e Patologia Forense, não existem estudos que provem que a
aplicação de um fixador alternativo no processamento de tecidos em amostras
previamente fixadas em formaldeído tenha bons resultados e sem interferências nas
técnicas subsequentes. Da mesma forma, não há qualquer prova científica da aplicação
de substitutos do formaldeído que possam ter resultados satisfatórios em técnicas
histoquímicas, como a reticulina, que utilizam esta substância química como agente
redutor.

O xilol, contrariamente ao formaldeído, é um reagente aplicado no processo

analítico, ou seja, está limitado aos procedimentos laboratoriais. De todos os reagentes
analisados, o isopropanol apresenta bons resultados na utilização no processamento de
tecidos, como substituto do xilol. No entanto, a utilização deste reagente só é possível
conjugando com um aparelho com tecnologia micro-ondas o que pode dificultar a sua
implementação. O Ottix Plus® revelou, neste estudo de revisão, ser o reagente com
maior versatilidade, sendo eficaz na aplicação no processamento de tecidos, como
agente desparafinador e agente diafanizador nas colorações tecidulares, sendo
compatível com a esmagadora maioria dos meios de montagem. Devido à sua
versatilidade, identifica-se como um potencial substituto do xilol.

40
 Independentemente do reagente substituído, é necessário que seja sempre
executada a validação e viabilidade da aplicação dos substitutos nos laboratórios de
Anatomia Patológica e Patologia Forense, isto é, realizar testes experimentais para
avaliar a potencial implementação na rotina laboratorial. A realidade da orgânica de cada
laboratório é diferente de serviço para serviço e a subjetividade da avaliação
anatomopatológica do suporte bibliográfico encontrado pode ser uma limitação neste tipo
de investigações.

Para finalizar, a precariedade da legislação, regulamentos e normas portuguesas

levam a que este tipo de temáticas abordadas sejam cada vez mais importantes.
Segundo a Direção Geral da Saúde todas as patologias contraídas pelo trabalhador na
sequência da exposição a um ou mais fatores de risco presentes em contexto
ocupacional, nas condições e/ou nas técnicas usadas durante o trabalho denomina-se
por “doença profissional”. O Decreto-Regulamentar n.º 76/2007, de 17 de julho, publica a
“Lista das Doenças Profissionais” que inclui cinco capítulos, nomeadamente doenças
provocadas por agentes químicos; doenças do aparelho respiratório; doenças cutâneas e
outras; doenças provocadas por agentes físicos; e doenças infeciosas e parasitárias
(173). Segundo a lista, a exposição a formaldeído surge apenas no capítulo das “doenças
cutâneas e outras” associada apenas a sintomatologia como ulcerações cutâneas,
dermite de contacto alérgica, dermite de contacto irritativa ou traumática, urticária, rinite e
asma brônquica. Como verificado neste estudo de revisão bibliográfica, a sintomatologia
pelo formaldeído em contexto profissional é mais grave do que aquela que é exposta
nesta listagem. Em contrapartida, o xilol surge, acertadamente, no capítulo de doenças
provocadas por agentes químicos (174). Por vezes a desvalorização por parte de
entidades de referência, como a Direção Geral da Saúde, de determinadas fontes de
risco ocupacional leva a que haja uma despreocupação pelo trabalhador na sua
segurança e na dos outros. A incongruência das informações cedidas publicamente com
os resultados de diversas investigações leva a que haja dificuldades na atribuição de
incapacidades resultantes na atividade ocupacional da população, seguindo, por
exemplo, a Tabela Nacional de Incapacidades (175). Para contornar todas estas
problemáticas, é imperativo a mudança de hábitos ocupacionais tentando reduzir-se ao
máximo todos os riscos possíveis.

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