Estudio Fitoquimico y Biologico - 2018

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Estudo fitoquímico e biológico de quatro diferentes

espécies do gênero Waltheria
Taiza Nayara da Silva Caridade

Dissertação de Mestrado
Natal/RN, julho de 2018
TAIZA NAYARA DA SILVA CARIDADE
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE QUATRO DIFERENTES ESPÉCIES

DO GÊNERO Waltheria.
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de

Pós-Graduação em Química - PPGQ, da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN), como requisito parcial para a obtenção do
grau de Mestre em Química.
Área de concentração: Química Orgânica
Orientadora: Profª. Dra. Renata Mendonça Araújo
NATAL/RN
2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Caridade, Taiza Nayara da Silva.

Estudo fitoquímico e biológico de quatro diferentes espécies
do gênero Waltheria / Taiza Nayara da Silva Caridade. - 2018.
106 f.: il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Programa de Pós
Graduação em Química. Natal, RN, 2018.
Orientadora: Profª. Drª. Renata Mendonça Araújo.
1. Waltheria - Dissertação. 2. Malvaceae - Dissertação. 3.

Flavonoides - Dissertação. 4. Auranamida - Dissertação. 5.
Artemia salina - Dissertação. 6. DPPH - Dissertação. I. Araújo,
Renata Mendonça. II. Título.
RN/UF/UFRN CDU 639.63
Elaborado por Ana Cristina Cavalcanti Tinôco - CRB-15/262

AGRADECIMENTOS
A minha família por apoiar minha escolha e ajudar de sua forma. Em especial,
a minha mãe, Doraci, por me incentivar direta e indiretamente a estudar e ser alguém
melhor e ao meu sobrinho Pedro, por ser para mim a personificação do que é o amor
e por me ajudar a ter forças para seguir em frente diariamente.
A todos os professores que passaram pela minha vida acadêmica e que

contribuíram significativamente para o meu crescimento pessoal e profissional.
A Prof. Renata Mendonça pela amizade, risadas, ensinamentos e orientação.
A todos os colegas e professores do LISCO (Laboratório de Isolamento e

Síntese de Compostos Orgânicos) que me ajudaram nessa caminhada, seja pela
presença agradável ou pelo conhecimento compartilhado, em especial a Jany,
Marcela, Gizely e Edson pelos momentos de descontração e amizade.
Ao meu tesouro, Rus, por ser minha muleta emocional e amigo de todas as
horas e momentos, sejam bons ou ruins. Sou muito grata a você por tudo que aprendi
e aprendo contigo diariamente, por me ajudar sempre que precisei e ainda meter a
mão na massa comigo quando eu não sabia fazer, e ainda, me treinar para ser a Celi
(risos).
Minha amiguinha Lilian Kelly pelos dias agradáveis em sua presença, e pelos
abraços fortes (risos), pelos almoços no shopping, as risadas, os doces quase que
diários, que foram extremamente renovadores.
Aos amigos Hanna Stephanny, Maria Clara e Yuri por todos os momentos de
descontração com eles vividos durante esse período, os quais foram essenciais
durante esta caminhada. Muito obrigada pela amizade de vocês!
Ao Instituto de Química/UFRN pela estrutura cedida para o desenvolvimento

da minha pesquisa.
Ao PPGQ/UFRN pelo auxílio financeiro concedido para realização desta

pesquisa.
A técnica do instituto de química/UFRN, Elânia, pela boa vontade e prontidão

em me ajudar, seja em análises ou tratamento de dados.
Ao CENAUREM/UFC pela estrutura fornecida para realização deste trabalho.

Ao Prof. Edilberto Silveira pela maravilhosa receptividade e pelo cappuccino
que fazia todas as tardes no CENAUREM.
Ao técnico do CENAUREM Herbert, pela ajuda no envio dos FID’s sempre com
muita boa vontade e prontidão.
A EMBRAPA por ceder a estrutura e equipamentos para realização deste

trabalho.
Ao Prof. Kirley Marques Canuto e ao Paulo pelo auxílio na realização dos

experimentos de derreplicação.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
A todos, meu muito obrigada!

Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota no mar. Mas o mar seria menor
se lhe faltasse uma gota.
Madre Teresa de Calcutá
RESUMO
O gênero Waltheria pertence à família Malvaceae, que é composta por 243

gêneros e 4225 espécies distribuidas em diferentes regiões do mundo, principalmente
em regiões tropicais da América do Sul, são popularmente utilizadas no tratamento de
úlceras, hemorroidas, asma, diarreia, além de apresentar alta atividade antioxidante,
anticâncer, antiinflamatória e anticonvulsiva. Espécies deste gênero são ricas em
flavonoides, terpenos, alcaloides, ciclopeptídeos, dentre outros metabólitos
secundários. O estudo fitoquímico das partes aéreas e caule de diferentes espécies
de Waltheria conduziu ao isolamento de um triterpeno pentaciclíco do tipo lupano, o
ácido 3-oxolup-20(29)-en-28-óico (ácido betulônico), quatro flavonoides: 5-hidroxi-
3,3’,4’,7-tetrametoxiflavona (retusina), 5-hidroxi-3,7,4’-trimetoxiflavona, canferol-3-O-
β-glicopiranosídeo, glicopiranosídeo e canferol-3-O-β-(6''-cumaroil)-glicopiranosídeo
(tilirosídeo), ambos inéditos para as espécies estudada. Além do dipeptídeo N-benzoil-
L-fenilalaninato de N-benzoil-2- amino-3-fenilpropila conhecido como auranamida,
inédito para o gênero estudado. Ambos obtidos por meio de fracionamentos
cromatográficos, e caracterizados por RMN 1H e 13C. Um ensaio preliminar de
toxidade dos extratos com Artemia salina revelou a baixa toxicidade das espécies
estudadas com DL50 superiores a 1000 ug/mL, além de alta atividade antioxidante
frente ao radical DPPH, com destaque para Waltheria cinerescens, que apresentou
atividade superior as demais espécies estudadas.
Palavras chave: Waltheria. Malvaceae. Flavonoides. Auranamida. Artemia salina.

DPPH.
ABSTRACT
The genus Waltheria belongs to the family Malvaceae, which is composed of
243 genera and 4225 species distributed in different regions of the world, mainly in
tropical regions of South America. Its popular use is vast, and its species are used in
the treatment of ulcers, hemorrhoids, asthma, diarrhea, in addition to presenting high
antioxidant, anticancer, anti-inflammatory and anticonvulsive activity. Species of this
genus are rich in flavonoids, terpenes, alkaloids, cyclopeptides, among other
secondary metabolites. The phytochemical study of the aerial parts and stem of
different Waltheria species led to the isolation of a pentacyclic triterpene of lupan type,
3-oxolup-20 (29) -en-28-oic acid (betulonic acid), four flavonoids: 5- hydroxy-3,3,4,4-
trimethoxyflavone, canferol-3-O-β-glucopyranoside, glycopyranoside and canferol-3-
O-β-hydroxy-3,3 ', 4' (6 '' - cumaroyl) -glycopyranoside (tyloside), both unpublished for
the species studied. In addition to the N-benzoyl-2-amino-3-phenylpropyl N-benzoyl-
L-phenylalaninate dipeptide known as auranamide, unheard of for the genus studied.
Both obtained by chromatographic techniques, and characterized using 1 H and 13 C
NMRA preliminary toxicity test of the extracts with Artemia salina revealed the low
toxicity of the studied species with LD50 higher than 1000 ug / mL, in addition to high
antioxidant activity against the DPPH radical, especially Waltheria cinerescens which
showed superior activity to the other species studied.
Key words: Waltheria. Malvaceae. Flavonoids. Auranamide. Artemia salina. DPPH.

LISTAS DE TABELAS
Tabela 1- Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento do extrato

WCCH ....................................................................................................................... 40
Tabela 2- Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento do extrato WCCH
.................................................................................................................................. 41
Tabela 3- Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento da sub fração

WCTH (14-16) ........................................................................................................... 41
Tabela 4- Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento da sub fração WCTH

(14-16) ....................................................................................................................... 42
Tabela 5- Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento do extrato WDFM

.................................................................................................................................. 43
Tabela 6- Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento do extrato WDFM

.................................................................................................................................. 44
Tabela 7- Frações reunidas e suas respectivas massas no fracionamento de WFFE-

Ac ............................................................................................................................. 45
Tabela 8- Frações e solventes usados no procedimento cromatográfico de WFCH

.................................................................................................................................. 46
Tabela 9- Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento WFCH ................ 46
Tabela 10- Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WFIM-H ....... 48
Tabela 11- Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento de WFIM-H ....... 48
Tabela 12- Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WFIM-H (45-54)

.................................................................................................................................. 48
Tabela 13- Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento da subfração WFIM-

H (45-54) ................................................................................................................... 49
Tabela 14- Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WFIM-H (45-54)

21-39 ......................................................................................................................... 49
Tabela 15- Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento da subfração WFIM-

H (45-54) 21-39 ......................................................................................................... 49
Tabela 16- Preparo de soluções .............................................................................. 52

Tabela 17- Preparação de soluções para teste ....................................................... 54
Tabela 18- Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH 19 comparados com a literatura
.................................................................................................................................. 61
Tabela 19- Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH (14-16) ppt 13 comparados com
a literatura. ................................................................................................................ 66
Tabela 20- Dados de RMN de 1H e 13C para WdFM-Ac ppt 26 comparados com a
literatura .................................................................................................................... 71
Tabela 21- Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH (14-16) ppt 22 comparados com
a literatura ................................................................................................................. 75
Tabela 22- Dados de RMN de 1H e 13C para WfCH ppt 14 comparados com a
literatura ................................................................................................................... 83
Tabela 23- Compostos insaponificáveis identificados via CG/MS ............................ 85
Tabela 24- Compostos saponificáveis identificados via CG/MS .............................. 88

LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Arbusto (A) e partes aéreas (B) de W. cinerescens (A e B), W. ferruginea
(A’ e B’) e W. douradinha (A’’ e B’’) .......................................................................... 24
Figura 2- Flavonoides isolados a partir de diferentes partes de W. indica .............. 26
Figura 3- Alcaloides isolados a partir de diferentes partes de W. indica e W.

douradinha ................................................................................................................ 27
Figura 4- Derivados de triterpenos pentaciclicos isolados a partir da raiz e partes

aéreas de W. indica................................................................................................... 28
Figura 5- Estrutura química de um flavonoide (34) e isoflavonoide (35) ................. 29
Figura 6- Classificação dos flavonoides .................................................................. 30
Figura 7- Formação do ácido chiquímico ................................................................ 31
Figura 8- Formação da fenilalanina .......................................................................... 32
Figura 9- Proposta de mecanismo biossintético para o asperfenamato ................... 33
Figura 10- Redução do radical livre DPPH .............................................................. 34
Figura 11- Esquema de fracionamento para W. cinerescens .................................. 42
Figura 12- Esquema de fracionamento para W. douradinha .................................. 44
Figura 13- Esquema de fracionamento da W. ferrugínea ........................................ 47
Figura 14- Esquema de fracionamento da W. indica. .............................................. 50
Figura 15- Esquema de preparo das amostras a serem analisadas em

espectrofotômetro. .................................................................................................... 53
Figura 16- Estrutura química das substâncias isoladas das espécies de Waltheria .
.................................................................................................................................. 55
Figura 17- Espectro de RMN 1H de WcCH 19 (300MHz; CDCl3) ........................... 57
Figura 18- Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WcCH 19 (300MHz; CDCl3)
.................................................................................................................................. 57
Figura 19- Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WcCH 19 (300MHz; CDCl3)
.................................................................................................................................. 58
Figura 20- Espectro de RMN 13C de WcCH 19 (75MHz; CDCl3) ............................ 58

Figura 21- Expansão [1] do espectro RMN 13C de WcCH 19 (75MHz; CDCl3)....... 59
Figura 22- Espectro de RMN 13C [DEPT 135] de WcCH 19 (75MHz; CDCl3) ........ 59
Figura 23- Espectro de RMN HSQC de WcCH 19 ................................................. 60
Figura 24- Espectro de RMN COSY de WcCH 19.................................................... 60
Figura 25- Espectro de RMN 1H de WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3).......... 63
Figura 26- Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3)
.................................................................................................................................. 63
Figura 27- Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz;
CDCl3) ...................................................................................................................... 64
Figura 28- Espectro de RMN 13C para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3) .... 64
Figura 29- Espectro de RMN HSQC para WcCH (14-16) ppt 13 .............................. 65
Figura 30- Espectro de RMN COSY para WcCH (14-16) ppt 13 .............................. 65
Figura 31- Espectro de RMN 1H para WdFM-Ac ppt 26 (300MHz; DMSO) ............. 68
Figura 32- Expansão [1] do espectro de RMN para WdFM-Ac ppt 26 (300MHz; DMSO)
.................................................................................................................................. 68
Figura 33- Espectro de RMN 13C para WdFM-Ac ppt 26 (75MHz; DMSO) ............. 69
Figura 34- Espectro de RMN DEPT 135 para WdFM-Ac ppt 26 (75MHz; DMSO) ... 69
Figura 35- Espectro de RMN HSQC para WdFM-Ac ppt 26 .................................... 70
Figura 36- Espectro de RMN HMBC para WdFM-Ac ppt 26 ................................... 70
Figura 37- Espectro de RMN 1H para WfFe-Ac (28-31) (MeOD, 500MHz e 125MHz)
.................................................................................................................................. 73
Figura 38- Espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 22 (500MHz/ Acetona-d) 74
Figura 39- Espectro de RMN 13C de WcCH (14-16) ppt 22 (500MHz/ Acetona-d) .. 74
Figura 40- Espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3) ................... 77
Figura 41- Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3)
.................................................................................................................................. 78
Figura 42- Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3)
.................................................................................................................................. 78
Figura 43- Espectro de RMN 13C para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3) ................ 79
Figura 44- Expansão do espectro de RMN 13C para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3)
.................................................................................................................................. 79
Figura 45- Espectro de RMN DEPT 135 para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3) ....... 80
Figura 46- Expansão [1] do espectro de RMN COSY para WfCH ppt 14 ............... 80
Figura 47- Expansão [2] do espectro de RMN COSY para WfCH ppt 14 ................. 81
Figura 48- Espectro de RMN HSQC para WfCH ppt 14 ......................................... 81
Figura 49- Espectro de RMN HMBC para WfCH ppt 14 ........................................... 82
Figura 50-Expansão do espectro de RMN HMBC para WfCH ppt 14 ..................... 82
Figura 51- Estrutura dos compostos insaponificáveis de Waltheria ......................... 87
Figura 52- Estrutura dos compostos saponificáveis de Waltheria ............................ 89
Figura 53- Graficos de concentração vs AA% para as espécies W. cinerescens

(WcCE), W. douradinha (WdFM), W. ferrugínea (WfFE) e W. indica (WiFM) ........... 90
Figura 54- Gráficos de concentração vs % mortalidade para as espécies W.

cinerescens (WcTE), W. ferrugínea (WfFE) e W. indica (WiFM) ............................... 93
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DPPH: 2,2-difenil-picrilhidrazil
CG-MS: Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrômetro de Massas
UPLC-MS QTof: Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho Acoplado a

Espectrômetro de Massa do tipo quadrupolo/tempo de voo
ESI: Ionização por electrospray
NADPH: Fosfato de Dinucleotídeo de Adenina e Nicotinamida
PAL: Fenilalanina Amonia-Liase
LPO: Peroxidação Lipídica
FRAP: Potencial Antioxidante Redutor Férrico
TAS: Teste Preliminar de Toxicidade
CCD: Cromatografia em Camada Delgada
UV-VIS: Ultravioleta visível
RMN 1H: Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN 13C: Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
1D: Unidimensional
2D: Bidimensional
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
COSY: homonuclear Correlation Spectroscopy
HSQC: Heteronuclear Single-Quantum Correlation
HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Coherence
DMSO: Dimetilsufóxido
CD3OD: Metanol deuterado
D2O: Água deuterada
CDCl3: Clorofórmio deuterado

C5D5N: Piridina deuterada
MHz: Mega Hertz
T: tesla
A: ampere
ppm: Partes por Milhão
s: simpleto
d:dupleto
t: tripleto
q: quarteto
dd: duplo dupleto
m: multipleto
δ 1H: Deslocamento químico do hidrogênio em ppm
δ 13C: Deslocamento químico do carbono em ppm
Hex: Hexano
AcOEt: Acetato de etila
CH2Cl2 :Diclorometano
MeOH: Metanol
EtOH: Etanol
CHCl3: Clorofórmio
ppt: Precipitado
CL50: Concentração Letal
DL50: Dose letal
R2: Índice de correlação
RF: Fator de retenção
AA%: Porcentagem de atividade antioxidante
Abs: Absorbância
PROBIT: Estimativas de probabilidades
WcCH: Waltheria cinerescens caule hexano
WcCE: Waltheria cinerescens caule etanol
WdFM: Waltheria douradinha folha metanol
WdFM-H: Waltheria douradinha folha parte hexano
WdFM-C: Waltheria douradinha folha parte clorofórmio
WdFM-Ac: Waltheria douradinha folha parte acetato
WfFH: Waltheria ferruginea folha hexano
WfFE: Waltheria ferruginea folha etanol
WfFE-H: Waltheria ferruginea parte hexano
WfFE-C: Waltheria ferruginea parte clorofórmio
WfFE-Ac: Waltheria ferruginea parte acetato
WfCH: Waltheria ferruginea caule hexano
WfCE: Waltheria ferruginea caule etanol

SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 19
2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 21
2.1 Geral .............................................................................................................. 21
2.2 Específicos ................................................................................................... 21
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................... 22

3.1 Importância das plantas medicinais ........................................................... 22
3.2 Aspectos etnobotânicos e etnofarmacológicos da família malvaceae .... 23
3.3 Considerações sobre o gênero waltheria .................................................. 24
3.4 Metabólitos secundários .............................................................................. 28
3.4.1 Flavonoides e sua estrutura ..................................................................... 29
3.4.1.1 Rota biossintética ............................................................................. 30
3.4.1.1.1 Formação do ácido chiquímico .................................................. 30
3.4.1.1.2 Formação da fenilalanina ......................................................... 31
3.4.1.1.3 Proposta biossintética para o asperfenamato ........................... 32
3.5 Atividades biológicas ................................................................................... 33
3.5.1 Processo oxidativo e atividade antioxidante ............................................ 33
3.5.2 Toxicidade frente ao microcrustacéo Artemia salina ................................ 35
4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 35
4.1 Cromatografia gasosa acoplada à espectrômetria de massas ................ 36
4.2 Cromatografia liquida de ultra eficiência acoplada à espectrômetro de
massas e detector quadrupolo- UPLC-MS QTOF ............................................ 37
4.2.1 Condições do massas de alta resolução - XEVO-QTOF ........................ 37
4.3 Análises espectroscópicas ......................................................................... 37
4.3.1 Ultravioleta visível (UV-Vis) ..................................................................... 37
4.3.2 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e carbono-13

(RMN 13C) ........................................................................................................ 38
4.4 Procedimento experimental ........................................................................ 39
4.4.1 Coleta do material vegetal ...................................................................... 39
4.4.2 Processamento da planta e obtenção dos extratos ................................ 39
4.4.3 Fracionamento cromatográfico ............................................................... 40

4.4.3.1 W. cinerescens ................................................................................ 40
4.4.3.1.1 Fracionamento de WCCH ......................................................... 40
4.4.3.2 W. douradinha ................................................................................. 43
4.4.3.1.1 Fracionamento de WDFM ......................................................... 43
4.4.3.3 W. ferrugínea ..................................................................................... 44
4.4.3.3.1 Fracionamento de WFFE .......................................................... 44
4.4.3.3.1.1 Fracionamento da parte WFFE-Ac ......................................... 45
4.4.3.3.2 Fracionamento de WFCH ......................................................... 45
4.4.3.4 W. indica ...................................................................................... 47
4.4.3.4.1 Fracionamento de WIFM .......................................................... 47
4.4.3.4.2 Fracionamento da subfração WFIM-H ...................................... 47
4.4.3.4.3 Fracionamento da subfração WFIM-H (45-54) ......................... 48
4.4.3.4.4 Fracionamento da subfração WFIM-H(45-54)21-39 ................. 49
4.4.4 Obtenção dos ésteres metílicos .............................................................. 50

4.4.4.1 Reação de saponificação ................................................................. 50
4.4.4.2 Reação de esterificação .................................................................. 51
4.5 Atividades biológicas .................................................................................. 52
4.5.1 Avaliação da atividade antioxidante ........................................................ 52
4.5.2 Avaliação da toxidade frente a Artemia salina ........................................ 53
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 54
5.1. Caracterização estrutural das substâncias isoladas ............................... 54
5.1.1. Elucidação estrutural de WcCH 19 ......................................................... 54
5.1.2 Elucidação estrutural de WcCH (14-16) ppt 13 ........................................ 63
5.1.3 Elucidação estrutural de WdFM-Ac ppt 26 ............................................... 67
5.1.4 Elucidação estrutural de WfFe-Ac (28-31) ............................................... 72
5.1.5 Elucidação estrutural de WcCH (14-16) ppt 22 ........................................ 73
5.1.6 Elucidação estrutural de WfCH ppt 14 ..................................................... 76
5.2 Identificação dos compostos saponificáveis e insaponificáveis das
espécies de Waltheria ....................................................................................... 84
5.2.1 Compostos insaponificáveis..................................................................... 84

5.2.2 Compostos saponificáveis ....................................................................... 84
5.3 Atividades biológicas .................................................................................. 89
5.3.1 Avaliação da atividade antioxidante via DPPH ....................................... 89

5.3.2 Avaliação da toxidade frente ao microcrustáceo Artemia salina ............. 93
6. CONCLUSÕES .................................................................................................... 95
REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 97
19
1. INTRODUÇÃO
As plantas medicinais são consideradas como uma rica fonte de princípios

ativos e podem ser usadas como matérias-primas na extração de ingredientes ativos
utilizados na síntese de diferentes tipos de drogas, em que estes podem estar
diretamente relacionados com atividades biológicas. Estima-se que a maior parte da
população de países em desevnolvimento dependa das práticas tradicionais usando
plantas medicinais para atender suas necessidades primárias de cuidados com a
saúde. Apesar do crescimento da medicina moderna no desenvolvimento de
medicamentos, o uso de fitoterápicos continua crescendo por motivos históricos e
culturais (SAHOO, MANCHIKANT e DEY, 2010; HASSAN, 2012; SINGH, 2015).
A grande área territorial brasileira e sua biodiversidade, estimada em mais de
56.000 espécies, permitindo o desenvolvimento de novas pesquisas utilizando plantas
como alvo de estudos. O norte e nordeste são responsáveis pela maior biodiversidade
existente no país, e permite com facilidade o acesso a inúmeros tipos de plantas e
espécies frutíferas das mais diversas famílias existentes na flora do Brasil, permitindo
seu fácil acesso, facilitando a realização de estudos com as mais diversas classes de
plantas. (MATTIETTO, 2010).
A família Malvaceae é composta por 243 gêneros e 4225 espécies que podem
ser encontradas em diversas regiões do mundo, com predominância nas regiões
tropicais da América do Sul. Sua representação no Brasil conta com 80 gêneros e 400
espécies, dentre as quais é possível destacar os gêneros Ceiba (paineira e sumaúma)
e Theobroma (cacau e cupuaçu) pela ampla comercialização dos seus frutos (COSTA
et al., 2010; EMBRAPA, 2017).
O gênero Waltheria tem um amplo uso na medicina popular, dentre as

atividades descritas na literatura para o gênero destacam-se: anticonvulsiva,
antioxidante, anticâncer, anti-inflamatória, além de ser usada no tratamento de
úlceras, hemorroidas, asma, reumatismo, diarreia, infecção dental, e malária (MUNDO
et al.,2017; VEERAMANI, 2016; MONTEILLIER et al., 2017; ZONGO, 2013;
CRETTON et al., 2014; CRETTON et al., 2015).
Investigações químicas realizadas para o gênero revelam que suas espécies

são ricas em flavonoides, terpenos, alcaloides, ciclopeptídeos, dentre outros
metabólitos secundários, mostrando-se como uma promissora fonte de compostos
20
bioativos. Estudos realizados nos mesmos laboratórios para Waltheria cinerescens e

Waltheria ferruginea apontou flavonoides como sendo a classe de metabólitos
predominantemente encontrada, no entanto, estudos realizados no sul do país para o
mesmo gênero relatam os alcaloides como sendo o principal metabólito isolado
(TSCHESCHE, 1975; HOELZEL, 2005; GRESSLER, 2008). Estudos preliminares
realizados no nosso grupo de pesquisa detectou a presença majoritária de flavonoides
(FERREIRA, 2014).
A divergência encontrada entre os metabólitos isolados e a presença de

compostos com atividade biológica relatadas para espécies do gênero motivou o
estudo químico das espécies W. cinerescens, W. douradinha, W. ferrugínea e W.
indica, visando identificar os metabólitos para cada espécie estudada, bem como seu
potencial biológico.
21
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Estudo da composição química e avaliação da atividade antioxidante e

toxicidade para as espécies Waltheria cinerescens, Waltheria douradinha, Waltheria
ferrugínea e Waltheria indica;
2.2 Específicos
Preparar extratos orgânicos das folhas e caule de W. cinerescens, W.

douradinha, W. ferrugínea e W. indica;
Fracionar os extratos por meio de técnicas cromatográficas;
Isolar e caracterizar os metabólitos secundários majoritários a partir de técnicas

cromatográficas e espectroscópicas;
Submeter os extratos ao teste antioxidante utilizando o radical 2,2-difenil-

picrilhidrazil (DPPH);
Avaliar a toxicidade dos diferentes extratos frente ao microcrustáceo Artemia
salina;
Submeter os extratos à reação de saponificação seguida de metilação para
avaliação de parte de sua composição química usando Cromatografia Gasosa
acoplada Espectrômetro de Massas CG-MS;
Realizar estudo de dereplicação usando UPLC-MS QTof.
22
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Importância das plantas medicinais
O homem pré-histórico fazia uso de plantas medicinais como fonte de cura,

prevenção e tratamentos de diversas doenças, e o mesmo comportamento se
prolonga até os dias atuais. O uso dessas plantas no Brasil tem influência europeia,
devido os primeiros padres a virem pro Brasil, com a finalidade de catequizar os índios
da época, trazerem consigo diversas plantas que foram adaptadas ao clima do país
se reproduzindo e dando origem a variedade de espécies existentes atualmente. Além
da própria influência indígena, pois os índios se baseavam no misticismo e senso
comum para utilização e aperfeiçoamento do uso da fitoterapia. E ainda de origem
africana, devido seu uso em conjunto com o exorcismo para expulsar o espírito mau
que causava doenças (MARTINS et al, 2003).
O documento escrito pelo imperador chinês Shen Nung em 3.000 a.C é o
primeiro registro da fitoterapia. O mesmo catalogou aproximadamente 365 espécies
de origem vegetal, sendo estas plantas e venenos utilizados na época (TOMAZZONI
et al., 2006). Algumas espécies já são conhecidas e catalogadas pela ANVISA devido
sua larga utilização e potencial farmacológico que permeiam desde muito tempo,
como por exemplo, as folhas de Capim santo (Cymbopogon citratus) utilizadas no
combate a cólicas intestinais e uterinas, além de reduzir significamente a ansiedade e
insônia em quadros leves, pois possui efeito calmante.
O Brasil possui a flora mais rica de todo o mundo, correspondendo a 19% da
flora mundial com mais de 56.000 espécies de plantas, o que possibilita o estudo das
mais diversas espécies para comprovação da ação terapêutica e consequentemente
o desenvolvimento de fitoterápicos que auxiliem na prevenção ou cura de doenças,
uma vez que o país é considerado detentor da maior biodiversidade do mundo
(GIULIETTI et al., 2005; KLEIN et al., 2009).
No entanto, há estimativas de que somente 17% das plantas pertencentes a
flora mundial foram exploradas em estudo para aplicação medicinal, e em grande
parte, sem abordar seus aspectos químicos, farmacológicos e toxicológicos. Esses
dados ressaltam o potencial que a natureza tem no auxílio da descoberta de novos
fármacos que possam auxiliar no desenvolvimento de novos fitoterápicos (FOGLIO et
al., 2006).
23
Com isso surge a necessidade de aprofundamento dos conhecimentos acerca

de espécies com potencial para desenvolvimento de um medicamento fitoterápico.
Deste modo, o presente estudo apresenta grande relevância para a comunidade
científica, pois contribui para o conhecimento químico e biológico das espécies do
gênero Waltheria, bem como no desenvolvimento de novos fitoterápicos.
3.2 Aspectos etnobotânicos e etnofarmacológicos da família malvaceae
Espécies da família Malvaceae podem ser encontradas por muitos lugares do

mundo, em destaque encontram-se as regiões tropicais da américa do sul. As
espécies pertencentes a esta família podem ser encontradas na forma de arbusto,
subarbusto, erva e árvore, e sua maior ocorrência é na região amazônica, caatinga,
mata atlântica, e cerrado. No Brasil, especificamente na região nordeste é encontrada
nos estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Maranhão, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio
Grande do Norte e Sergipe, sendo encontrado também em outras regiões do país
(COSTA et al., 2007; SAUNDERS, 1995).
No Brasil, a família é representada por 80 gêneros e 400 espécies, das quais
podemos destacar espécies pertenentes ao gênero Alcea, Hibiscus e Malvaviscus,
pois desempenham alto valor econômico. Além de alguns gêneros largamente
utilizados na gastronomia, com destaque para o gênero Theobroma (cacau e
cupuaçu), Ceiba (paineira e sumaúma) e o gênero Sida, que é um dos maiores da
família em número de espécies, classificadas como daninhas. Além de espécies que
comumente são usadas no ramo textil como o algodão (Gossypium) e juta (Urena). A
família Malvaceae é portanto, uma rica fonte de fibras, bebidas, alimentos,
paisagismo, madeira e fármacos (BRANDAO, FERREIRA e MACEDO, 1984;
EMBRAPA, 2017).
Os usos de espécies dessa família permeiam por vários ramos, tais como
alimentação, têxtil, decoração, além de ser usado no auxílio a cura de doenças.
Estudos realizados com sementes e folhas de Alcea hyrcana Grossh e folhas de Alcea
kurdica Alef revelaram seu alto poder antioxidante e antimicrobiano (ZAKIZADEH,
2011; QADER, 2014).
A espécie Hibiscus cannabinus L. e Hibiscus sabdariffa L., que são
importantes fontes de fibra comercial apresentaram atividade antifúngica e
antioxidante, respectivamente (KOBAISY et al., 2001; ALI et al., 2003). Além disso, a
24
literatura relata que espécies desse gênero apresentam alta atividade anti-
inflamatória, antimicrobiana, antifertilidade, antitumoral, anti-hipertensiva,
hipocolesterolémica e hipoglicemica (VASUDEVA, 2008).
Espécies dessa familia são ricas em flavonoides, alcaloides,
sesquiterpenoides, taninos, saponinas, triterpenos, esteróis, lactonas, ácidos
fenólicos, dentre outros. (HAMED, 2017; SHARMA, 1989; AHMED, 1990)
3.3 Considerações sobre o gênero Waltheria
O gênero Waltheria é composto por 60 espécies amplamente distribuídas em

regiões de clima tropical que se apresentam sob a forma de subarbustos perenes que
vão de 20 a 50 cm de altura. Apresentam raiz bem desenvolvida, rugosa e profunda,
além de folhas simples que exibem nervuras sulcadas na face superior e ramos eretos,
conforme mostra a Figura 1 (SAUNDERS, 2007; CORRÊA, 1931).
Figura 1: Arbusto (A) e flores e folhas (B) de W. cinerescens (A e B), W. ferruginea (A’ e B’) e
W. douradinha (A’’ e B’’)
Fonte: Arquivo pessoal de Renata M. Araújo
Espécies desse genêro são abundantes no Brasil, além de outros países como
México, Estados Unidos, Paraguai, dentre outros. Por crescerem espontaneamente
25
em beiras de estradas, lavouras e terrenos baldios são consideradas “plantas

daninhas” por (CORRÊA, 1931; LORENZI; MATOS, 2002)
A espécie conhecida como douradinha-do-campo (Waltheria douradinha St.

Hilaire), é utilizada na medicina popular como cicatrizante, antissifilítica e no
tratamento de laringites, bronquites e inflamações na bexiga. A mesma também é
utilizada na medicina caseira como estimulante, sudorífica, diurética e emética, além
de ser indicada no tratamento da desenteria, afecções nos pulmões, catarro-brônquico
e cistite. Waltheria americana é comumente usada na medicina tradicional mexicana
para tratar doenças no sistema nervoso. A espécie Waltheria indica encontrada em
regiões tropicais e subtropicais do mundo é usada para tratamento de inflamações e
carcinogênese (SOUZA E LORENZI, 2012; MUNDO, 2017; MONTEILLIER, 2017).
O levantamento bibliográfico realizado para espécies do gênero Waltheria
mostra o isolamento de compostos das classes dos flavonoides e alcaloides em várias
espécies. W. indica apresenta uma vasta quantidade de estudos, e estes permitiram
o isolamento de alguns flavonoides, sendo eles (1-3) isolados de diferentes partes da
planta, onde ambos apresentaram atividade anti-inflamatória, sendo a atividade do
composto 3 superior as demais (RAO ET AL, 2005). Outro estudo permitiu o
isolamento de sete flavonoides, sendo os compostos 2 e 3 relatados anteriormente,
juntamente com os flavonoides 4-8, isolados de diferentes partes, e os mesmos
apresentaram atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Escherichia
coli (MAHESWARA ET AL., 2006). O estudo das partes aéreas permitiu o isolamento
das substâncias 9-13 (PETRUS, 1990), no entanto, nenhuma atividade biológica foi
relatada. (Figura 2)
Os compostos 14-15 isolados de W. indica apresentaram atividade antifúngica,

sendo o primeiro contra Candida albicans com efeito semelhante a 30 mg de
clotrimazol, o segundo apresentou atividade moderada contra Aspergillus niger e T.
mentagrophytes, bem como os compostos 16-20 isolados da mesma espécie
(RAGASA ET AL.,1997; CRETON, 2016) (Figura 2).
26
Figura 2: Flavonoides isolados a partir de diferentes partes de W. indica
Fonte: Autor, 2018
Relatos da literatura também apontam o isolamento de compostos da classe

dos alcaloides, onde os compostos 21-23 e 29-30 foram extraídos a partir de
diferentes partes de W. indica. O composto 30 apresentou alta atividade
27
antitripanossoma frente a T. cruzi (Figura 3) (PAIS, MAINIL, GOUTAREL, 1963; PAIS,

JARREAU, GOUTAREL 1968; CRETTON, 2015).
Já o estudo realizado com W. douradinha permitiu o isolamento de cinco
alcalóides (24-28) a partir do caule da mesma. Além disso, o mesmo estudo permitiu
identificar alta atividade antimicrobiana contra Escherichia coli, Salmonela setubal e
Klebsiella pneumoniae para o alcaloide 25 (Figura 3) (GRESSLER, 2008).
Figura 3: Alcaloides isolados a partir de diferentes partes de W. indica e W. douradinha
Fonte: Autor, 2018

28
Além dos compostos citados, outros três derivados triterpenicos pentaciclicos

foram isolados a partir da raiz e partes aéreas de W. indica (31-33) (Figura 4)
(CRETTON, 2015).
Figura 4: Derivados de triterpenos pentaciclicos isolados a partir da raiz e partes aéreas de

W. indica
Fonte: Autor, 2018
De modo geral, a literatura relata que espécies de Waltheria apresentam

metabólitos de diferentes classes, como flavonoides, alcaloides e triterpenos, além
das diversas atividades acima citadas.
3.4 Metabólitos secundários
São compostos que desempenham um papel importante na adaptação das

plantas ao seu habitat, além de ser uma fonte rica de substâncias farmacologicamente
ativas. Os metabolitos secundários são usualmente classificados de acordo com a sua
29
rota biossintética e divididos em três grupos, sendo eles terpenos, compostos

fenólicos e compostos nitrogenados. (FUMAGALI, 2008; HARBONE, 1999).
3.4.1 Flavonoides e sua estrutura
Os flavonoides são compostos fenólicos, que por vezes, apresentam diversos

efeitos benéficos a saúde e podem ser encontrados em frutas, vegetais e certas
bebidas. Biologicamente, os flavonoides podem ser encontrados em diversas partes
da planta, como, fruto, caule, raiz e flores. (FERREYRA, 2012; PANCHE, 2016).
Sua estrutura básica é formada por quinze átomos de carbonos distribuídos
entre dois anéis aromáticos, sendo o anel A derivado da cadeia policetídica e o anel
B derivado do ácido chiquímico, além de um heterociclo oxigenado (anel C), como
mostra a Figura 5.
Figura 5: Estrutura química de um flavonoide (34) e isoflavonoide (35)
Fonte: Autor, 2018
Os flavonoides estão inseridos na classe de compostos polifenólicos de baixo

peso molecular, e podem ser subdivididos classes como catequinas, flavanonas,
flavonóis, flavonas e antocianinas (Figura 6). Sua classificação depende basicamente
do carbono do anel C em que o anel B está ligado, além do grau de insaturação e
oxidação do anel C. Quando o anel B é diretamente ligado a posição 3 do anel C dá-
se origem as isoflavonas (Figura 5- 35). Caso o anel B esteja ligado na posição 2
(Figura 5-34) resultará em diferentes subgrupos baseado em características
estruturais do anel C. (FERREYRA, 2012; PANCHE, 2016).
30
Figura 6: Classificação dos flavonoides
Fonte: Autor, 2018
3.4.1.1 ROTA BIOSSINTÉTICA
3.4.1.1.1 Formação do ácido chiquímico
O ácido chiquímico éo principal percursor dos compostos fenolicos de micro-

organismos e plantas. É obtido através do acoplamento entre fosfoenolpiruvato e D-
eritose-4-fosfato (derivados da degradação da glicose). Incialmente ocorre a
formação do 7-fosfato-3-desoxi-D-arabino-heptulosonico (38) a partir do ataque inicial
da dupla ligação do D-eritose-4-fosfato (36) a carbonila do fosfoenolpiruvato (37), via
reação aldol. Como o produto gerado contém um grupo abandonador [PO4-], o mesmo
participa de uma β-eliminação, onde o hidrogênio eliminado da origem a dupla ligação,
e esta por ser nucleofílica ataca o carbono carbonílico (39) em uma nova reação aldol
seguida de outra reação aldol intramolecular (40) dando origem ao ácido 3-dehidro-
quínico (41), que é convertido em ácido chiquímico após sofrer desidratação e
redução com NADPH (Figura 7).
31
Figura 7: Formação do ácido chiquímico
Fonte: Autor, 2018
3.4.1.1.2 Formação da fenilalanina
Para formação da fenil-alanina, o ácido chiquímico (41) sofre oxidação por uma
molécula de ATP, gerando o acido 3-fosfo-chiquímico (42), e este por sua vez, reage
com D-eritose-4-fosfato (43) por meio de uma reação aldol formando o ácido 5-
enolpiruvil-3-fosfo-chiquímico (44), que sofre uma eliminação 1,2 com eliminação de
[PO4-], gerando o ácido corísmico (45), que através de um rearrajo sigmatrópico [3,3]
se transforma em ácido prefênico (46), e este após eliminar H2O e CO2 se transforma
em ácido fenil-piruvico (47). Uma transaminação via piridoxal fosfato (PLP) origina L-
fenil-alamina (48) (Figura 8).
32
Figura 8: Formação da fenilalanina
3.4.1.1.3 Proposta biossintética para o asperfenamato
A Fenilalanina (48) reage com o benzoil-CoA (49) por meio de uma reação aldol
com a eliminação do grupo abandonador coenzima SCoA e nova reação aldol para
formação de 52. A redutase e álcool desidrogenase ocorrem para obtenção do aldeído
correspondente (53) e ácido carboxílico (54) e álcool (55). O asperfenamato é formado
a partir de um equivalente de 54 e 55, respectivamente por meio de uma reação aldol
seguida de eliminação de H2O, como ilustrado na Figura 9.
33
Figura 9: Proposta de mecanismo biossintético para o asperfenamato
3.5 ATIVIDADES BIOLÓGICAS
3.5.1 Processo oxidativo e atividade antioxidante
Radicais livres são espécies instáveis, e portanto, altamente reativas. Sua

instabilidade permite a ocorrência de reações de oxirredução, onde o radical livre sofre
oxidação perdendo elétron ou redução, ganhando elétron (Figura 10). Os radicais
livres são os principais responsáveis pelo desencadeamento de doenças, como
diabetes e hipertensão por exemplo (BONOMINI; RODELLA; REZZANI , 2015).
Os agentes antioxidantes são responsáveis pela minimização do processo de
oxidação diminuindo sua velocidade. O corpo humano é capaz de produzir de forma
natural os antioxidantes endógenos, no entanto, a velocidade de oxidação só é
reduzida caso a quantidade de antioxidantes seja suficiente, caso contrário, surge a
34
necessidade do uso de antioxidantes provenientes de fontes externas, pois resultará

em lesões oxidativas (BERGER, 2005; SOUSA et al., 2007).
Dentre os principais compostos naturais com ação antioxidante estão os
compostos fenólicos e polifenólicos, e estes podem ser facilmente encontrados em
espécies vegetais. Relatos da literatura apontam o extrato metanol das folhas de
Waltheria indica como um antioxidante em potencial, e essa atividade pode ser
comprovada através dos métodos DPPH, LPO e FRAP (KRISHNA; SUDARSANAM,
2015).
Segundo BORGUINI (2006), o método 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) é um
recurso fácil e preciso para avaliar atividade antioxidante in vitro em extratos; também
é, amplamente, usado por requerer tempo relativamente curto, em relação a outros
métodos. O efeito dos antioxidantes sobre o sequestro do radical DPPH é atribuído à
habilidade destes compostos de doar hidrogênio.
O ensaio usando o radical livre DPPH, vem sendo comumente utilizado para
determinação do percentual antioxidante. Trata-se de um ensaio in vitro onde a
capacidade antioxidante via atividade sequestradora do radical livre é analisada
utilizando o UV-Vis num comprimento de onda de 517 nm. O DPPH na sua forma
oxidada apresenta a cor purpura, e absorve em comprimento de onda 517 nm, ao
receber um hidrogênio, o radical livre DPPH sofre redução a difenil-picril-hidrazina, e
este possui uma coloração amarelada devido ao decréscimo na absorção citada. A
mudança de coloração pode ser observada alguns minutos após a adição do DPPH
na solução extrativa (TEIXEIRA et al., 2013).
Figura 10: Redução do radical livre DPPH
Fonte: Autor, 2018
Trata-se, portanto, de experimento de fácil realização capaz de comprovar de

forma rápida e segura a capacidade antioxidante de extratos e/ou moléculas isoladas.
35
Seu potencial é medido através da porcentagem oxidante, onde quanto menor for a
concentração de extrato e/ou composto puro e mais elevada for essa capacidade,
maior atividade antioxidante.
3.5.2 Toxicidade frente ao microcrustacéo Artemia salina
A Artemia salina é um microcrustáceo de água salgada que vive sob condições

de alta salinidade e baixa oxigenação da água. É comumente usado como alimento
vivo para peixes, e sua aquisição é de fácil acesso, além de seus cistos
permanecerem viáveis por anos no estado seco. Estes microcrustáceos podem ser
utilizados em testes preliminares de toxicidade (TAS), pois esta espécie geralmente é
utilizada como biomarcadora de toxidade. A simplicidade para realização da TAS
favorece seu uso, pois o mesmo pode ser desenvolvido sem exigir grandes estruturas
e ainda apresentou resultados semelhantes ao teste de viabilidade celular (MTT),
sugerindo que o mesmo se trata de uma alternativa rápida e viável para o ensaio in
vitro (MCLAUGHLIN, 1993; RAJABI, 2015)
Seu uso permitiu estabelecer uma boa correlação da toxicidade, deste modo,
este estudo preliminar se mostrou vantajoso na avaliação da bioatividade dos
produtos naturais, e seu uso é viável como triagem biológica a fim de buscar novas
substâncias bioativas capazes de exercer tal atividade (RAJABI et al., 2015; WANG
et al. 2017)
4. MATERIAIS E MÉTODOS
As colunas cromatográficas foram realizadas com silica em gel (ɸ - µm 400-

200) e (ɸ - µm 63-200), e Sephadex LH-20. O diâmetro e comprimento da coluna
variou de acordo com a quantidade de amostra a ser tratada, bem como a resistência
do material usado, sendo na cromatografia de adsorção (cromatografia flash) um
material resistente a pressão, além do bulbo para armazenamento do solvente neste
procedimento.
Na cromatografia de camada delgada (CCD) foram utilizadas cromatoplacas
de gel de sílica 60 F254 ( m 2-25) sobre alumínio da marca MERCK, e reveladas
36
usando solução de vanilina (C8H8O3 – 3 g dissolvidas em 100 mL de etanol) e ácido

sulfúrico 10% (H2SO4) (Vetec) com proporção de 1:1, seguido de aquecimento para
revelação.
Os solventes hexano, clorofórmio, diclorometano, acetato de etila, etanol,
metanol todos da marca SYNTH e água destilada, além dos solventes deuterados,
clorofórmio, metanol e acetona comercializados pela companhia TEDIA BRAZIL foram
usados como eluentes nos procedimentos cromatográficos e espectroscópicos.
Nas reações de saponificação e esterificação foram utilizados hidróxido de
sódio em micropérolas (NEON), sulfato de sódio anidro (ANDROL) e ácido clorídrico
(SYNTH).
Nos ensaios biológicos de atividade antioxidante e toxidade foram utilizados o
radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) da Sigma Aldrich e cistos de artemia
salina (comercial), respectivamente.
4.1 Cromatografia gasosa acoplada à espectrômetria de massas
Uma massa de 2 mg dos saponificáveis e insaponificavéis foram pesadas e

solubilizadas com diclorometano HPLC, e sua dissolução completa foi possível após
submeter a amostra no ultrassom. Realizado o procedimento a amostra foi filtrada e
injetada no equipamento seguindo a metodologia abaixo.
As análises de CG/EM foram realizadas em cromatografo Thermo Scientific
modelo Focus GC, acoplado a um espectrômetro modelo ISQ, com injetor Split 1:7 e
temperatura de 250 ºC, gás de arraste hélio a fluxo contínuo de 1,5 mL/min e coluna
NST-5MS (30 m x 25 mm x 10 µm) operando em rampa de aquecimento de 80 ºC a
280 °C, sendo 80 – 260 °C (5°C/min); 260 – 280 °C (10 °C/min) por 5 minutos e volume
de injeção 1 uL. O espectrômetro operando na faixa de 35 – 500 amu, e fonte de íons
(70 eV) foi mantida a 240 ºC e a interface a 300 ºC. A identificação dos compostos foi
realizada através da comparação entre os espectros de massas com o banco de
dados do equipamento, utilizando a biblioteca mainlab, como também dados da
literatura.
37
4.2 Cromatografia liquida de ultra eficiência acoplada à espectrômetro de

massas e detector quadrupolo- UPLC-MS QTOF
A análise foi realizada em um sistema Acquity UPLC (Waters), acoplado ao

sistema de Quadrupolo / Tempo de Voo (QtoF, Waters) da Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária - EMBRAPA. A coluna utilizada nas corridas cromatográficas
foi UPLC BEH (150 x 2,1 milímetros, 1,7 um) Waters Acquity, com temperatura fixa de
40 ◦C. As fases móveis utilizada no procedimento foram água com 0,1% de ácido
formico (A) e acetonitrila com 0,1% de ácido formico (B), com gradiente variando de
2% a 95% B (15 min), fluxo de 0,4 mL / min e volume de injeção de 5 µl.
4.2.1 Condições do massas de alta resolução - XEVO-QTOF
O modo ESI- foi adquirido na faixa de 110-1180 Da, temperatura da fonte fixa
a 120 ◦C, temperatura de dessolvatação 350 ◦C, fluxo do gás dessolvatação de 500 L
/ h, cone de extração de 0,5 V, voltagem capilar de 2,6 kV. O modo ESI+ foi adquirido
na faixa de 110-1180 Da, temperatura da fonte fixa de 120 ◦C, temperatura de
dessolvatação 350 ◦C, fluxo do gás dessolvatação de 500 L / h e voltagem do capilar
de 3,2 kV. Leucina encefalina foi utilizada como lock mass. O modo de aquisição foi
MSE. O instrumento foi controlado pelo software Masslynx 4.1 (Waters Corporation).
4. 3 ANÁLISES ESPECTROSCÓPICAS
4.3.1 Ultravioleta visível (UV-Vis)
O espectrofotômetro utilizado nas análises do ultravioleta visível foi Evolution

60S da Thermo Scientific, com cubetas de quartzo com caminho ótico de 1,0 cm, além
do comprimento de onda de 517 nm.
38
4.3.2 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e carbono-13

(RMN 13C)
Os espectros de RMN foram obtidos atráves de espectrômetros Bruker

Avance DPX 300 MHz E DRX 500 MHz pertencente ao Centro Nordestino de
Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal do
Ceará (CENAUREMN- UFC). As amostras foram dissolvidas em 0,6 mL de solvente
deuterado: dimetilsufóxido – DMSO ((CD3)2SO), metanol (CD3OD), água (D2O),
clorofórmio (CDCl3) e piridina (C5D5N) comercializados pela companhia TEDIA
BRAZIL.
No espectrômetro Bruker Avance DRX-300 foi utilizado uma sonda de
detecção inversa de 5 mm e magneto de 7,0 T, operando em frequências de 300,13
MHz para hidrogênio e 75,47 MHz para carbono. Já o equipamento Bruker Avance
DRX-500 operou em frequências de 500,13 MHz e 125,75 MHz, para carbono e
hidrogênio, respectivamente, sob um campo magnético de 11,7 T. O tipo de sonda
varia conforme a técnica utilizada: sonda dual de 5 mm com detecção direta (1D) e
sonda multinuclear de 5 mm com detecção inversa (2D).
Os deslocamentos químicos () foram expressos em partes por milhão (ppm) e
padronizados de acordo com o valor de deslocamento químico tabelado para o
solvente, onde: acetona ( δ 2,05), DMSO ( 2,51), metanol ( 3,31) e clorofórmio (
7,27), para o espectro de 1H, e DMSO ( 39,51), metanol ( 49,15), clorofórmio (
77,23) e acetona ( δ 206,68 e 29,92) nos espectros de 13C.
As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1H foram
indicadas segundo a convenção: s (singleto), d (dupleto), t (tripleto), q (quarteto), dd
(duplo dupleto) e m (multipleto).
A técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), com
ângulos de nutação de 135, úteis na caracterização de carbonos metilênico (CH2) e
carbono metínico (CH) e metílico (CH3) através da subtração do espectro DEPT 135
do espectro BB.
Os experimentos bidimensionais de correlação homonuclear (COSY: homonuclear
Correlation Spectroscopy) e heteronuclear (HSQC: Heteronuclear Single-Quantum
Correlation, HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence e HMBC:
Heteronuclear Multiple Bond Coherence), realizados no aparelho Bruker Avance DRX-
39
300 ou DRX-500, foram efetuados em sonda multinuclear de 5 mm, com detecção

inversa, empregando-se gradiente de campo, posicionado no eixo z e magnitude de
10 A. Os valores de J utilizados para os experimentos pertinentes foram 1JH,C = 145
nJ
H,C = 7, onde n ≥ 2.
4.4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
4.4.1 Coleta do material vegetal
O caule de Waltheria cinerencens foi coletado na Chapada da Ibiapaba (CE) e

sua identificação foi realizada pela Prof. Dra. Maria Lenise Silva Guedes (UFBA) no
herbário Alexandre Leal Costa (ALCB), sob o número de exsicata 47.508. As folhas
da Waltheria douradinha foram coletadas no município de Tibau do Sul (RN) e
depositadas no herbário da UFRN e apresenta o número de registro 24100. As folhas
e caule de Waltheria ferruginea, assim como as folhas de Waltheria indica foram
coletadas no município de Beberibe e Russas, respectivamente, ambas localizadas
no estado do Ceará (CE). As exsicatas foram depositadas no herbário Prisco Bezerra
do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, sob o número de
registro 94575 e 58398, respectivamente. Todas as espécies utilizadas encontram-se
registradas no SisGen no cadastro de número A12E895.
4.4.2 Processamento da planta e obtenção dos extratos
O caule de W. cinerescens (607,5 g) e W. ferruginea (1058,6 g) e folhas de W.

douradinha (71,99 g), W. ferruginea (70,97 g) e W. indica (73,87 g) foram desidratados
e submetidos a secagem em temperatura ambiente por duas semanas e processada
em moinho de facas. Em seguida foram colocadas em contato com hexano de forma
exaustiva (3x 72h), posteriormente o material vegetal foi concentrado dando origem
aos extratos WCCH (3,736 g), WFCH (2,100 g), WDFH (2,104 g), WFFH (9,862 g) e
WIFH (1,301 g). Após extração da fração hexano, o material vegetal foi submetido a
extração com etanol ou metanol por igual período e procedimento, fornecendo os
40
extratos e WCCE (12,28 g), WFCE (21,32 g), WDFM (15,29 g), WFFE (2,733 g) e
WIFM (15,67 g), respectivamente.
4.4.3 Fracionamento cromatográfico
4.4.3.1 Estudo fitoquímico de W. cinerescens
4.4.3.1.1 Fracionamento de WCCH
O extrato WCCH (3,736 g) foi particionado usando uma coluna com sílica em
gel e eluída segundo gradiente com solventes hexano, acetato de etila e metanol,
rendendo 36 frações, como mostra a Tabela 1. Todas as frações foram submetidas a
cromatografia de camada delgada (CCD) com fase móvel clorofórmio e
clorofórmio/metanol (9:1), e reunidas conforme semelhança cromatográfica (Tabela
2).
Tabela 1: Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento do extrato WCCH
FRAÇÕES SOLVENTE
WCCH 1-13 Hex
WCCH 14-22 Hex/AcOEt 10%
WCCH 35 AcOEt
WCCH 36 MeOH
41
Tabela 2: Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento do extrato WCCH
FRAÇÃO MASSA (g) FRAÇÃO MASSA (g)

1-6 0,018 19 0,007
7 0,013 20-23 0,050
8-10 0,020 24-26 0,059
11 0,003 27-29 0,065
12 0,032 30-32 0,130
13 0,001 33 0,075
14-16 1,839 34 0,039
17-18 0,079 35-36 0,136
Rendimento: 68,9 %
A fração 19 (0,007 g) (Hex/AcOEt 10%) nomeada como WcCH 19 se

apresentou como cristais amarelos, onde a mesma era insolúvel em hexano, deste
modo, foi lavada com esse solvente e submetida a análise por RMN 1H e 13C 1D e 2D
para sua elucidação.
A fração 14-16 (1,839 g) obtida nesse procedimento foi submetida a uma coluna
flash usando os solventes hexano, acetato de etila e metanol nas proporções da
Tabela 3, rendendo 26 frações.
Tabela 3: Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento da subfração WCCH

(14-16)
FRAÇÕES SOLVENTE
WCCH (14-16) 1-16 Hex/AcOEt 5 %
WCCH (14-16) 17-23 Hex/AcOEt 10%
WCCH (14-16) 24 Hex/AcOEt 50%
WCCH (14-16) 24-25 AcOEt
WCCH (14-16) 26 MeOH
Todas as frações foram analisadas em CCD e as semelhantes reunidas, como

mostrado na Tabela 4. As frações WCCH (14-16) ppt 13 (0,006 g) (acetato de etila 5
%) e WCCH (14-16) ppt 22 (0,008 g) (Hex/AcOEt 10%) se apesentaram como puras,
com aspecto de cristais amarelos e um sólido amorfo de cor branca, respectivamente.
42
Estes foram lavados com hexano e submetidos a análise de RMN 1H e 13C 1D e 2D

para confirmação da estrutura química. As referidas substâncias foram denominadas
de WcCH (14-16) ppt 13 e WcCH (14-16) ppt 22, respectivamente.
Tabela 4: Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento da subfração WCCH (14-16)

1-4 0,1281 16-18 0,0297
5-8 0,0100 19-21 0,0058
9-10 0,0383 22-23 0,0127
11-13 0,0805 ppt 22 0,0075
ppt 13 0,0060 24-25 0,0173
14-15 0,0981 26 0,0298
Rendimento: 25,2%
A Figura 11 ilustra o esquema de fracionamento dos estratos de Waltheria

cinerescens para obtenção de WcCH 19, WcCH (14-16) ppt 13 e WcCH (14-16) ppt
22, respectivamente.
Figura 11: Esquema de fracionamento da W. cinerescens

43
4.4.3.2 Estudo fitoquímico de W. douradinha
4.4.3.1.1 Fracionamento de WDFM
Uma alíquota de 9,26 g do extrato WDFM foi submetida a partição liquído-liquído

com os solventes hexano, clorofórmio e acetato de etila, e a partir disso, foi possível
obter as frações WDFM-H (0,0069 g), WDFM-C (0,052 g) e WDFM-Ac (0,292 g) e
WDFM-Hidro (7,934 g).
A fração WDFM-Ac (0,2915 g) foi submetida a coluna flash e fase móvel composta
pelos solventes hexano, clorofórmio e metanol, puros ou em proporções, rendendo 36
frações como mostra Tabela 5. Todas as frações foram reunidas de acordo com a
semelhança cromatográfica apresentada em na cromatografia de camada delgada
(Tabela 6), e a fração ppt 26 (0,003 g) (Clo/MeOH 30%) apresentou um aspecto de
substância pura com um sólido de cor amarela. A mesma foi submetida a análise de
RMN 1H e 13C 1D e 2D para sua elucidação estrutural e denominada de WdFM-Ac ppt
26.
Tabela 5: Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento do extrato WDFM
FRAÇÕES SOLVENTES
WDFM 1 Hex/CHCl3 20 %
WDFM 2 Hex/CHCl3 70 %
WDFM 3-7 CHCl3
WDFM 8-10 CHCl3/MeOH 2%
WDFM 32-36 MeOH
44
Tabela 6: Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento do extrato WDFM

1-3 0,012 21-25 0,013
4-10 0,011 ppt 26 0,003
11-16 0,013 26-30 0,106
17-20 0,031 31-36 0,046
Rendimento: 80,6%
A Figura 12 ilustra os extratos trabalhados e substância WdFM-Ac ppt 26

isolada de Waltheria douradinha.
Figura 12: Esquema de fracionamento da W. douradinha
4.4.3.3 Estudo fitoquímico de W. ferrugínea
4.4.3.3.1 Fracionamento de WFFE
O extrato WFFE (9,862 g) foi dissolvido em metanol e submetido a partição

líquido-líquido usando hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol/H2O, rendendo
45
as frações WFFE-H (1,65 g), WFFE-C (0,27 g), WFFE-Ac (1,17 g), WFFE-Hid (6,12
g).
4.4.3.3.1.1 Fracionamento da parte WFFE-Ac
A fração foi tratada através de coluna cromatográfica Sephadex LH-20,

rendendo 60 frações que foram reunidas conforme semelhança de fator de retenção
analisado por CCD (Tabela 7).
Tabela 7: Frações reunidas e suas respectivas massas no fracionamento de WFFE-Ac
Frações Massas (g)

1-6 0,159
7-8 0,046
9-16 0,106
17-21 0,120
22-27 0,141
28-31 0,371
32-37 0,060
38-60 0,122
Rendimento: 96,2%
Após análise cromatográfica, as frações WFFE-Ac (28-31) (0,371 g) e WFFE-

Ac (32–37) (0,060 g) se mostraram quase puras, sendo portanto submetidas ao
processo de purificação utilizando CLAE com eluição no modo reverso e fluxo de 4,7
mL/min, com fase móvel água-acetonitrila (70:30). Realizado o procedimento, foram
obtidas as substâncias WfFE-Ac (28-31) e WfFE-Ac (32–37), respectivamente.
4.4.3.3.2 Fracionamento de WFCH
O extrato WFCH (2,100 g), foi submetido ao procedimento cromatográfico

usando coluna comum com os solventes hexano, clorofórmio, acetato de etila e
46
metanol rendendo 20 frações (Tabela 8), e reunidas conforme Tabela 9. A fração 14

(ppt 14) (0,010 g) (Clo/AcOEt 50%) deste procedimento se mostrou quase pura, sendo
necessária a lavagem com clorofórmio para obtenção de substância pura denominada
de WfCH ppt 14, confirmada através da cromatografia de camada delgada. A fração
foi submetida a análise de RMN de 1H e 13C (1D e 2D) para elucidação de sua
estrutura.
Tabela 8: Frações e solventes usados no procedimento cromatográfico de WFCH
Fração Solvente
1-4 Hex/CHCl3 50%
5-7 CHCl3
8-9 CHCl3/AcOEt 20%
10-14 CHCl3/AcOEt 50%
15-17 AcOEt/MeOH 50%
18-20 MeOH
Tabela 9: Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento WFCH
Fração Massa (g)

1-9 0,793
10-14 0,076
ppt 14 0,010
15-20 0,372
Rendimento: 59,6%
O esquema abaixo (Figura 13) mostra de forma como se deu o isolamento de

WfFE-Ac (28-31), WfFE-Ac (32–37) e WfCH ppt 14 de W. ferrugInea.
47
Figura 13: Esquema de fracionamento da W. ferrugínea
Fonte: Autor, 2018
4.4.3.4 Estudo fitoquímico de W. indica
4.4.3.4.1 Fracionamento de WIFM
O extrato WIFM (2,5 g) foi submetido a partição liquído-liquído com os solventes

hexano, clorofórmio e acetato de etila em diferentes proporções, e a partir disso, foi
possível obter as frações WFIM-H (0,599 g), WFIM-C (0,033 g), WFIM-Ac (0,775 g) e
WFIM-Aq (1,407 g).
4.4.3.4.2 Fracionamento da subfração WiFM-H
WiFM -H (0,599 g) foi submetida a uma coluna flash utilizando os solventes

hexano, clorofórmio e metanol, puros ou em proporções rendendo 54 frações (Tabela
10). Todas foram analisadas em CCD e reunidas conforme Rf’s, como mostra Tabela
11.
48
Tabela 10: Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WiFM-H
FRAÇÃO SOLVENTE FRAÇÃO SOLVENTE

1–6 Hex 23-28 CHCl3
7-12 Hex/CHCl3 5% 29-38 CHCl3/MeOH 5%
13-19 Hex/CHCl3 10% 39-45 CHCl3/MeOH 10%
20 Hex/CHCl3 20% 46-48 CHCl3/MeOH 50%
21 Hex/CHCl3 40% 49-54 MeOH
22 Hex/CHCl3 50%
Tabela 11: Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento de WiFM-H
FRAÇÃO Massa (g) FRAÇÃO Massa (g)

1 – 15 0,024 23-36 0,179
16-18 0,003 37-44 0,046
19-22 0,021 45-54 0,284
Rendimento: 93,2%
4.4.3.4.3 Fracionamento da subfração WiFM -H (45-54)
WiFM H (45-54) (0,284 g) foi submetida ao procedimento cromatográfico usando

coluna comum usando hexano, clorofórmio e metanol puros ou em proporções
rendendo 54 frações (Tabela 12). Estas foram reunidas após análise por CCD, como
mostra Tabela 13.
Tabela 12: Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WiFM-H (45-54)
Fração Solvente
1-6 Hex/CHCl3 30%
7-12 Hex/CHCl3 50%
13-20 CHCl3
21-30 CHCl3/MeOH 5%
31-33 CHCl3/MeOH 10%
46-54 MeOH
49
Tabela 13: Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento da subfração WiFM-H (45-54)
1-3 0,005 21-39 0,116
4-14 0,006 50-54 0,074
15-20 0,012 Rendimento: 75,2%
4.4.3.4.4 Fracionamento da subfração WiFM-H (45-54) 21-39
A subfração WiFM-H (45-54) 21-39 (0,116 g) foi submetida ao procedimento

cromatográfico coluna flash usando os solventes clorofórmio e metanol puro ou em
proporções, rendendo 25 frações (Tabela 14). Todas as frações obtidas neste
procedimento foram submetidas a análise em cromatografia de camada delgada e
reunidas conforme Tabela 15.
Tabela 14: Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WiFM-H (45-54) 21-39
Fração Solvente
1-7 CHCl3
8-13 CHCl3/MeOH 5%
24-25 MeOH
Tabela 15: Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento da subfração WiFM-H (45-54) 21-39

1-5 0,020 15-18 0,007
6-9 0,016 19-25 0,015
10-14 0,021 Rendimento: 67,6%
50
A fração 6-9 (0,016 g) (CHCl3/MeOH 5%) foi submetida a análises de RMN 1H e

13C 1D e 2D para elucidação estrutural, e a mesma foi denominada de WiFM-H(45-
54) 21-39 (2). Tal substância já foi isolada a partir da W. ferruginea e W. douradinha
neste estudo.
A Figura 14 mostra o esquema para obtenção de WiFM-H(45-54) 21-39 (2) a

partir das folhas de W. indica.
Figura 14: Esquema de fracionamento da W. indica
Fonte: Autor, 2018
4.4.4 Obtenção dos ésteres metílicos
4.4.4.1 Reação de saponificação
Os extratos alcóolicos das diferentes espécies (WcCE, WdFM, WfFE e WiFM)

foram submetidas a reação de saponificação. Todos os extratos foram solubilizados
adicionando-se algumas gotas de MeOH em seguida adicionou-se uma solução
alcoólica de NaOH. A solução de NaOH foi preparada através da dissolução do
51
mesmo em uma pequena quantidade de água, e o volume máximo completado com

etanol. A mistura reacional foi transferida para balão de fundo redondo, e mantida sob
agitação e refluxo, com temperatura de 60 ºC, durante o período de duas horas.
Ao final da reação foram adicionados 20 mL de água destilada, e todo volume
transferido para um funil de separação, de modo a realizar uma partição líquido-líquido
e obter os compostos insaponificáveis. Foram utilizados os solventes diclorometano
(CH2Cl2) e acetato de etila (AcOEt) e as partes obtidas foram coletadas em
erlenmeyer. Às partes obtidas foram adicionadas sulfato de sódio anidro para remoção
de resíduo de água, seguido de filtração e então concentrado em evaporador rotativo.
Após secagem, as amostras foram analisadas em cromatográfo gasoso acoplado a
espectrômetro de massas – CG-EM, segundo o procedimento 4.1.
4.4.4.2 Reação de esterificação
A parte aquosa obtida no procedimento 4.4.4.1 foi acidificada com ácido

clorídrico concentrado (HCl) até obter um pH ~ 2 – 3 e submetida a esterificação afim
de obter os compostos saponificáveis. Após acidificação do meio foram adicionados
5mL de MeOH e a reação foi posta sob agitação e refluxo por 1h em temperatura de
60 ºC.
Após finalização do procedimento foram adicionados 10 mL de uma solução
saturada de KCl, e a mistura obtida foi transferida para um funil de separação para
obtenção dos ésteres metílicos. Para o procedimento citado foram utilizados os
solventes CH2Cl2 e AcOEt. Realizada a partição, às partes que continham o material
de interesse foram adicionadas sulfato de sódio anidro, seguido de filtração e
concentração da fase orgânica em evaporador rotativo. Depois de secas, as partes
saponificáveis foram submetidas a análise de CG-MS.
52
4.5.1 Avaliação da atividade antioxidante
O procedimento foi adaptado do trabalho de SOUSA et al. (2007), e realizada

para os extratos hexano e etanol das quatro espécies de Waltheria. A partir do extrato
alcoólico das espécies foi preparada uma solução de concentração de 500 µg/mL. A
partir dessa, foram preparadas diluições conforme Tabela 16.
Tabela 16: Preparo de soluções
Concentração (µg/mL) Solução de estoque (mL) Volume de MeOH (mL)

25 0,1 1,9
50 0,2 1,8
100 0,3 1,7
150 0,4 1,6
200 0,6 1,4
250 1 1
Para cada diluição foram adicionadas a solução de DPPH com concentração

de 40 µg/mL (4 mg de DPPH /100 mL de EtOH), exceto nos brancos, onde é
adicionado apenas a amostra e solvente, neste caso o metanol. Após a adição do
DPPH nas amostras, foi necessário esperar 30 minutos para início do procedimento
de leitura no espectrofotômetro a 517 nm, que é o comprimento de onda de absorção
máxima do DPPH. A Figura 15 ilustra este procedimento.
53
Figura 15: Esquema de preparo das amostras a serem analisadas em espectrofotômetro.
Fonte: Autor, 2018
Após obter os valores de absorbância medidos em triplicata e calcular os

valores médios, os mesmos foram aplicados na equação abaixo para obtenção da
concentração mínima necessária para a redução de 50% dos radicais livres.
AA% = 100 – {[Absamostra - Absbranco) x 100] / Abscontrole}
Onde:
Absamostra = Absorbância do extrato vegetal com o DPPH
Absbranco = Absorbância do extrato solubilizado
Abscontrole = Absorbância do DPPH puro (40 µg/mL)
4.5.2 Avaliação da toxidade frente a Artemia salina
Os extratos hexano e etanol de todas as espécies foram submetidos a

avaliação da toxidade frente ao minicrustáceo Artemia salina. O procedimento seguiu
a metodologia de MCLAUGHLIN et al. (1988) com algumas modificações.
Preparou-se uma solução salina utilizando 35 g de sal marinho sintético e 951

mL de água destilada. Em média 500 mL desta solução foi transferida para um funil
de decantação e os cistos de Artemia foram postos em contato de modo a ocorrer a
sua eclosão. Para isto, foi necessário cobrir o funil com papel alumínio e usar uma
iluminação artificial com temperatura ambiente controlada (±30 °C). Após um período
54
de 24 h os náuplios foram transferidos para uma placa de Petri e ficaram em repouso

por mais 24 h, até atingir o estado de maturação esperado, o metanáuplios.
Foram utilizados 50 mg do extrato bruto e dissolvidos em 25 mL, dos quais 4,2

mL eram de tween 5% e 20,8 mL eram solução salina, obtendo, portanto, uma solução
estoque com concentração de 2 mg/mL, onde a partir da mesma foram preparadas
diluições. A Tabela 17 apresenta os volumes utilizados da solução estoque e
concentração final de cada diluição para um volume final de 5 mL.
Tabela 17: Preparação de soluções para teste
Solução de estoque Concentração

(µL) (µg/mL)
0,13 50
0,25 100
0,63 250
1,25 500
1,88 750
2,5 1000
Após 48 h, 10 espécimes foram postas em um tubo de ensaio contendo a

solução com concentração conhecida citada acima, e mantidos a temperatura
ambiente e luz natural. Após 24 h foi verificado o número de sobreviventes e este
número foi submetido a análise PROBIT para aquisição da concentração letal. O
procedimento foi realizado em triplicata para cada concentração especificada.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização estrutural das substâncias isoladas
O estudo permitiu o isolamento de seis substâncias químicas (Figura 16)

dentre as quais quatro flavonoides, sendo eles 5-hidroxi-3,3’,4’,7-tetrametoxiflavona
(retusina) (WcCH 19), 5-hidroxi-3,7,4’-trimetoxiflavona (WcCH (14-16) ppt 13),
canferol-3-O-β-(6''-cumaroil)-glicopiranosídeo (tilirosídeo) (WdFM-Ac ppt 26, WfFE-Ac
(32–37 e WiFM- H(45-54) 21-39 (2) ) e canferol-3-O-β-glicopiranosídeo (WfFE-Ac (28-
31)), ambos inéditos para a espécie. Além do triterpeno ácido 3-oxolup-20(29)-en-28-
55
óico (ácido betulônico) (WcCH (14-16) ppt 22) e o N-benzoil-L-fenilalaninato de N-

benzoil-2- amino-3-fenilpropila (auranamida) (WfCH ppt 14), inédito para o gênero.
Figura 16: Estrutura química das substâncias isoladas das espécies de Waltheria
5.1.1. Elucidação estrutural de WcCH 19
Os cristais amarelos de WcCH 19 (Hex/AcOEt 10%) foram submetidos a

análise RMN 1H e 13C 1D e 2D para sua elucidação. O espectro de RMN 1H (Figuras
17, 18 e 19) apresentou um total de 9 sinais, sendo cinco na região de aromáticos,
característicos de flavonoides com deslocamentos químicos específicos, além de
permitir a identificação do padrão de oxigenação.
Os sinais em δ 7,76 [dd, 8,6 e 1,8 Hz] (H-6’), 7,70 [d, 1,8 Hz] (H-2’), 7,00 [d, 8,4
Hz] (H-5’), 6,46 [d, 2,1 Hz] (H-8) e 6,37 [d, 2,1 Hz] (H-6) evidenciados na figura 18
são característicos de hidrogênios aromáticos. Onde H-6 e H-8 sofrem o efeito doador
56
de elétrons livres do oxigênio, e portanto, são os mais protegidos. A partir dos

hidrogênios em δ 6,37 e 6,46 com J= 2,1 Hz que aparecem no espectro como dupletos
foi possível identificar o padrão de substituição do anel A, onde existe substituinte em
C-5 e C-7. Além disso, os hidrogênios δ 7,70 [d, 1,8Hz] (H-2’), δ 7,0 [d, 8,4Hz] (H-5’)
e δ 7,75 [dd, 8,6 e 1,8 Hz] (H-6’). O sistema AMX permitiu identificar o padrão de
substituição do flavonoide como sendo tetrasubstituído.
Os hidrogênios da região entre δ 7,76 e 6,37 permitiram identificar o padrão de
substituição do flavonoide, e a partir das constantes de acoplamento as posições dos
substituintes em 3, 7, 3’ e 4’. Além disso, os valores de deslocamento δ 3,98, 3,97,
3,89 e 3,87 permitiram identificar os substituinte como sendo metoxilas, uma vez que
o deslocamento é superior ao esperado.
A análise do RMN 13C (Figuras 20 e 21), mostrou 19 linhas espectrais, das
quais um sinal em δ(C-4) 179,11 que evidencia a presença de uma carbonila de
cetona α,β insaturada, onde é possível evidenciar a presença de uma metoxila
adjacente a mesma, além de quatro sinais que evidenciam a presença dos carbonos
metílicos das metoxilas em δ 60,4, 56,3, 56,2 e 56,0 que correspondem a C-3, C-7, C-
3’ e C-4’, respectivamente. Onde C-3 apresenta um deslocamento superior aos
demais, visto que o mesmo sofre o efeito desprotetor mesomérico retirador da
carbonila, com isso, fica mais desprotegido que os demais. Além de um sinal em δ
162,33 que indica o carbono que contém a hidroxila do núcleo flavonoídico. Os demais
sinais apresentados no espectro se referem as demais carbonos não hidrogenados e
carbonos metínicos, em que os últimos podem ser confirmados através do espectro
13C DEPT 135 (Figura 22), que mostrou a existência dos mesmos e carbonos
metílicos.
As correlações mostradas no espectro HSQC (Figura 23) evidenciam os
acoplamentos (J1) entre o dupleto de dupleto em δ 7.75, os dupletos em δ 7,70, 7,00,
6,46 e 6,37 com seus respetivos carbonos metínicos δ 122,4, 111,6, 111,1, 92,4 e
98,0, respectivamente. A análise do espectro COSY (Figura 24) mostra o
acoplamento vicinal (J3) entre os hidrogênios 5’ e 6’.
57
Figura 17: Espectro de RMN 1H de WcCH 19 (300MHz; CDCl3)
Figura 18: Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WcCH 19 (300MHz; CDCl3)
58
Figura 19: Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WcCH 19 (300MHz; CDCl3)
Figura 20: Espectro de RMN 13C de WcCH 19 (75MHz; CDCl3)

59
Figura 21: Expansão [1] do espectro RMN 13C de WcCH 19 (75MHz; CDCl3)
Figura 22: Espectro de RMN 13C [DEPT 135] de WcCH 19 (75MHz; CDCl3)
60
Figura 23: Espectro de RMN HSQC de WcCH 19
Figura 24: Espectro de RMN COSY de WcCH 19

61
A Tabela 18 apresenta os valores de deslocamento químico e correlações do

espectros de RMN COSY, juntamente com os dados da literatura.
Tabela 18: Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH 19 comparados com a literatura
POSIÇÃO HSQC δ 1H (lit)* δ 13C (lit)*

δ 1H δ 13C
2 - 156,1 - 156,1
3 - 139,3 - 137,0
4 - 178,9 - 175,7
5 - 162,3 - 160,9
6 6,37 (1H, d, J=2,1) 98,3 6,38 (1H, s) 98,1
7 - 165,7 - 163,0
8 6,46 (1H, d, J=2,1) 92,7 6,79 (1H, s) 93,3
9 - 156,9 - 157,2
10 - 106,3 - 104,0
1’ - 123,2 - 121,9
2’ 7,70 (1H, d, J=1,8) 111,6 7,65 (1H, s) 115,1
3’ - 148,9 - 147,7
4’ - 151,8 - 149,6
5’ 7,00, (1H, d, 111,2 7,15 (1H, d, J 115,9
J=8,4) = 8,5)
6’ 7.76, (1H, dd, 122,4 7,72 (1H, dd, J 119,9
J=8,6 e 1,8) = 8,5; 1,9)
OCH3 (3) 3,98 (3H, s) 60,4 3,81 (3H, s) 60,6
OCH3 (7) 3,97 (3H, s) 56,3 3,85 (3H, s) 56,4
OCH3 (3’) 3,89 (3H, s) 56,2 3,85 (3H, s) 56,2
OCH3 (4’) 3,87 (3H, s) 56,0 3,85 (3H, s) 56,5
*Al-Oqail, 2012.[ DMSO, 500MHz e 125MHz]
Fonte: Autor, 2018
A partir das informações obtidas nos espectros de 1H e 13C (1D e 2D), e

comparação com os dados presentes na literatura, é possível concluir que a
substância WcCH 19 trata-se do flavonoide 5-hidroxi-3,3’,4’,7-tetrametoxiflavona
(retusina), já relatada para outras espécies, no entanto, nunca citados na espécie
estudada. Existem relatos na literatura que derivados de retusina aminoalquiladas
apresentaram atividade antiproliferativa contra as células de câncer HeLa, HCC1954
e SK-OV-3 (LI et al., 2017).
62
5.1.2 Elucidação estrutural de WcCH (14-16) ppt 13
O espectro de RMN de 1H (Figuras 25, 26 e 27) mostrou um conjunto de

absorções semelhantes a WcCH 19 (Ver tópico 5.1.1), sugerindo a existência de um
composto flavonoídico mudando apenas o padrão de substituição do anel aromático.
O mesmo apresentou quinze sinais de hidrogênio dos quais quatro sinais pertencem
a hidrogênios δ 8,04, 7,03, 6,46 e 6,36, sugerindo eixos de simetria na molécula. Os
hidrogênios, localizados em campo baixo, são simétricos, sendo o δ (H2’-H6’) 8,04 [d;
8,4Hz] os mais desprotegidos pelo efeito retirador da carbonila do anel C do
flavonoide, enquanto que δ(H3’-H5’) 7,03 [d; 8,4Hz] são favorecidos pelo efeito doador
de elétrons do oxigênio da metoxila em C-4’. A simetria do anel B juntamente com o
acomplamento orto entre esses hidrogênios permitiram identificar o mesmo como
sendo para-substituindo em H-4’.
Além disso, os hidrogênios H-6 e H-8 em δ 6,46 e δ 6,36, respectivamente,
encontram-se em uma região de maior proteção comparada aos demais devido ao
efeito doador do oxigênio que deixa tais posições mais protegidas. Estes sinais
associados ao acoplamento meta desses hidrogênios foram úteis na identificação da
posição do substituinte no anel A, onde este encontra-se em H-7. O espectro COSY
(Figura 30) mostrou uma correlação (Figura 31) característica de hidrogênios vicinais
(3J) entre H-2’/H-6’ e H-3’/H-5’.
O espectro RMN 13C (Figura 28) apresentou 16 linhas espectrais. O sinal em
δ(C-4) 179,02 sugere a presença do carbono carbonílico com deslocamento inferior
ao característico de cetona, pois o mesmo sofre o efeito da conjugação ficando mais
protegido. Além disso, três sinais em δ 60,36, 56,00 e 56,65 característicos de carbono
metoxílicos, onde o sinal em δ 60,36 (C-3) sofre efeito desprotetor da carbonila. Os
demais sinais pertencentes ao espectro correspondem aos demais carbonos do anel
flavonoídico. O espectro de RMN 2D HSQC (Figura 29) permitiu a visualização das
correlações 1J (C-H), utéis na determinação estrutural do composto.
63
Figura 25: Espectro de RMN 1H de WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3)
Figura 26: Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3)
64
Figura 27: Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3)
Figura 28: Espectro de RMN 13C para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3)
65
Figura 29: Espectro de RMN HSQC para WcCH (14-16) ppt 13
Figura 30: Espectro de RMN COSY para WcCH (14-16) ppt 13

66
Na Tabela 19 é apresentado os valores de deslocamentos químicos para

WcCH (14-16) ppt 13 juntamente com os dados da literatura.
Tabela 19: Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH (14-16) ppt 13 comparados com a literatura.
POSIÇÃO δ 1H δ 13C δ 1H(lit)* δ 13C (lit)*

2 - 156,0 - 156,2
3 - 139,1 - 139,1
4 - 179,0 - 179,0
5 - 161,8 - 161,9
6 6,36, (1H, d, 98,0 6,35 (1H, d, 98,1
J=2,1) J= 2.1)
7 - 165,6 165,6
8 6,46, (1H, d, 92,4 6,45 (1H, d, 92,4
J=2,1) J= 2.1)
9 - 157,0 - 157,0
10 - 106,3 - 106,3
1’ - 123,1 - 123,0
2’ e 6’ 8,04, (1H, d, 130,4 8,08 (1H, d, 130,4
J=8,4) J= 9)
3’ e 5’ 7,03, (1H, d, 114,3 7,02 (1H, d, 114,3
J=8,4) J= 9)
4’ - 162,3 - 162,2
OCH3 (3) 3,91 (3H, s) 60,4 3,90 (3H, s) 60,4
OCH3 (7) 3,88 (3H, s) 56,0 3,87 (3H, s) 56,1
OCH3 (4’) 3,87 (3H, s) 55,7 3,85 (3H, s) 55,7
*Paula & Cruz, 2006. [CDCl3, 300MHz e 75MHz]
Fonte: Autor, 2018
A partir da análise espectral juntamente com os dados contidos na literatura foi

possível identificar a substância WcCH (14-16) ppt 13 como sendo 5-hidroxi-3,7,4’-
trimetoxiflavona, que já foi identificada no gênero nas partes áereas de W. indica
(CRETTON, 2016), porém, é inédita para espécie W. cinerescens da qual foi isolada.
Relatos da literatura apontam que a 5-hidroxi-3,7,4’-trimetoxiflavona apresenta
atividade anti-hipertensiva (AHMED, 2005).
67
5.1.3 Elucidação estrutural de WdFM-Ac ppt 26
A substância WdFM-Ac ppt 26, assim como os demais flavonoides isolados das
espécies de Waltheria, apresentou-se na forma de sólido amarelo. O espectro de RMN
de 1H (Figuras 31 e 32) mostrou um simpleto em δ 12,5 característico de hidrogênio
de hidroxila (C-5) em ponte com o oxigênio da carbonila (C-4). A análise permitiu
identificar dois sinais em δ 6,1 e 6,3 que aparecem na forma de simpleto e dupleto,
respectivamente, em que o último exibiu um acoplamento meta (J= 2,0 Hz), os quais
foram atribuidos aos hidrogênios 6 e 8 do anel A. Além de dupletos em δ 8,0 (H2’ e
H6’) e 6.8 (H3’e H5’) ambos acoplando orto (J= 8,7 e 7,9 Hz) entre si, sugerindo a
existência de um sistema do tipo AA’BB’ para o anel B do flavonoide.
Sinais entre δ 4,0 e 5,2 indicam a presença de uma unidade de açúcar. Um
dupleto em δ 5,2 (J= 7,25Hz) é característico de hidrogênio ligado a carbono
anomérico o que sugere que a estrutura apresenta um glicosídeo em sua composição.
Além disso, um novo sistema AA’BB’ foi identificado em δ 7,32 (J= 8,3 Hz) e 6,80 (J=
7,9Hz) que se apresentaram na forma de dupletos e se referem aos hidrogênios H2’’’
e H6’’’, e H3’’’ e H5’’’, respectivamente. Os hidrogênios em δ 7,41 e 6,09 que aparecem
na forma de dupletos no espectro 1H, ambos com acoplamento trans (J= 15,9Hz), são
típicos de hidrogênios olefínicos. Tal proposição aliada aos sinais que se apresentam
como dupletos em δ 7,32 e 6,80 sugerem a existência de uma unidade p-cumaroil
ligada ao oxigênio do carbono metilênico (C-6’’) da glicose, pois há ausência de sinais
na região de δ 3,20 a 3,60 que indicam o grupo CH2OH em posição terminal.
Os espectros de RMN 13C e DEPT 135 para WdFM-Ac ppt 26 (Figuras 33 e

34) permitiram identificar a presença de um grupo carbonílico (C-4), além de carbonos
ligados a átomos de oxigênio em C-3, C-5, C-7, C-4’ e C-4’’’ e sinais com
deslocamentos entre δ 69.9 e 76.1 pertencentes a unidade sacarídica. Além desses
sinais, foi possível confirmar a existência de um carbono metilênico em δ 62,9
referente a C-6’’ da unidade cumaroil.
68
Figura 31: Espectro de RMN 1H para WdFM-Ac ppt 26 (300MHz; DMSO)
Figura 32: Expansão [1] do espectro de RMN para WdFM-Ac ppt 26 (300MHz; DMSO)
69
Figura 33: Espectro de RMN 13C para WdFM-Ac ppt 26 (75MHz; DMSO)
Figura 34: Espectro de RMN DEPT 135 para WdFM-Ac ppt 26 (75MHz; DMSO)
70
Figura 35: Espectro de RMN HSQC para WdFM-Ac ppt 26
Figura 36: Espectro de RMN HMBC para WdFM-Ac ppt 26

71
Na Tabela 20 são expressados os valores de deslocamentos químicos e suas

respectivas correlações em comparação com os dados da literatura.
Tabela 20: Dados de RMN de 1H e 13C para WdFM-Ac ppt 26 comparados com a literatura
HMBC HSQC
POSIÇÃO 3
J δ 1H δ 13C δ 13C (lit)*
1’ H-3’ e 5’ - 121,3 120,7
2’ e 6’ - 8,00, d (8,7) 130,8 130,1
3’ e 5’ - 6,82, d (7,9) 115,4 115,8
4’ H-2’ e 6’ - 161,1 160,0
2 H-2’ e 6’ - 157,9 156,6
3 H-2’ e 6’ - 132,9 132,9
4 - - 177,9 176,7
5 - - 160,8 161,0
6 - 6,09, s 98,9 99,6
7 - - 164,4 164,1
8 - 6,39, d (2,0) 93,6 94,1
9 - - 156,6 155,8
10 - - 103,6 102,5
1’’ - 5,42, d (7,25) 101,0 101,4
2’’ - - 74,2 74,2
3’’ - - 76,1 76,3
4’’ - - 69,9 69,9
5’’ - - 74,1 74,1
6’’ - 4,11, dd (11,5 62,9 62,9
e 6,5) e 4,24,
d (11,8)
1’’’ H-3’’’ e 5’’’ - 125,7 124,7
2’’’ e 6’’’ H-7’’ 7,32, d (8.3) 129,8 130,6
3’’’ e 5’’’ - 6,79, d (7.9) 114,6 115,0
4’’’ H-7’’’ - 159,7 159,9
7’’’ H-2’’’ e 6’’’ 7,39, d (15.9) 144,7 144,6
8’’’ - 6,12, d (15.9) 113,3 113,5
9’’’ H-2’’’ e 6’’’ - 166,4 166,2
*SANTOS JÚNIOR, 2010 [DMSO, 500MHz e 125MHz]
Os espectros de correlação heteronuclear HMBC e HSQC (Figuras 35 e 36)

juntamente com os dados presentes na literatura permitiram a identificação de WdFM-
Ac ppt 26 como sendo canferol-3-O-β-(6''-cumaroil)-glicopiranosídeo (tilirosídeo)
(C30H26O13), substância inédita para as espécies W.ferruginea e W douradinha. O
tilirosideo apresenta atividades diversas como anti-inflamatória, antioxidante, anti
hiperlipidemia, hiperglicêmica, antigiardial e antinociceptiva, dentre outras (SALA et
al. 2003; ZHANG, et al. 2015; BARBOSA, 2007; ORHAN, 2007). O mesmo também
foi isolado em W. ferruginea e W. indica nas frações WfFE-Ac (32-37) e WiFM-H (45-
54) 21-39 (2), respectivamente.
72
5.1.4 Elucidação estrutural de WfFe-Ac (28-31)
O espectro de RMN 1H do composto WfFe-Ac (28-31) (Figura 37) apresentou

um padrão característico de flavonoides. Além disso, o mesmo mostrou similaridade
com WdFM-Ac ppt 26, diferenciando apenas na ausência da unidade do ácido
cumárico. O espectro evidencia a presença de seis hidrogênios de natureza
aromática entre δ 6 e 8,5, sendo dois dupletos em δ 8,0 (H-2’ e H-6’) e 6,9 (H-3’ e H-
5’) ambos acoplando em orto com J= 8,8 Hz, referentes aos hidrogênios do anel B,
além de dois dupletos em δ 6,2 e 6,4 (J= 1,4), que correspondem a H-8 e H-6, em
meta, respectivamente.
Juntamente com os sinais de natureza aromática, o espectro de RMN 1H

apresenta deslocamentos químicos referentes a uma unidade de açúcar, essa região
compreende a área entre δ 3,15 e 5,2, onde o último refere-se ao deslocamento
correspondente ao hidrogênio anomérico. A existência de um hidrogênio anomérico
juntamente com a constante trans-diaxial (J= 9 Hz) e os dados contidos na literatura,
possibilitaram a identificação do açúcar na forma β-D-glicopiranosídica, com isso, foi
possível caracterizar WfFe-Ac (28-31) como sendo canferol-3-O-β-glicopiranosídeo.
O mesmo é inédito para a espécie W. ferruginea, e apresenta atividade
antiproliferativa moderada e atividade antioxidante relatadas na literatura (YILDIZ,
2017; SIANTURI, 2016).
73
Figura 37: Espectro de RMN 1H para WfFe-Ac (28-31) (MeOD, 500MHz e 125MHz)
5.1.5 Elucidação estrutural de WcCH (14-16) ppt 22
O espectro de RMN 1H (Figura 38) apresentou sinais entre δ 0,5 e 2,5 que são
característicos de esteroides e triterpenos. Podemos destacar simpletos pertencentes
a grupos metila em δ 1,69, 1,07, 1,01, 0,99, 0,97 e 0,92. Contudo, o espectro também
mostrou dois simpletos largos na região de hidrogênios olefínicos, em δ 4,75 e 4,62.
Dados do espectro de RMN 13C (Figura 39) revelaram diversas linhas
espectrais. Sinais entre δ 10 e 50, característicos de esteroides e triterpenos. Além de
sinais em campo mais baixo δ 216,28 (C-3) e outro em δ 178,68 (C-28), relativos a
carbonila da cetona e de ácido carboxílico, respectivamente. A quantidade de sinais
no espectro de carbono elimina a possibilidade de ser um esteroide, isto, juntamente
com dois sinais em δ 109,65 (C-29) e δ 19,2 (C-30), que evidenciam a presença de
uma dupla terminal, juntamente com os valores de hidrogênio sugerem a presença de
um triterpeno de esqueleto lupano.
74
Figura 38: Espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 22 (500MHz/ Acetona-d)
Figura 39: Espectro de RMN 13C de WcCH (14-16) ppt 22 (500MHz/ Acetona-d)
75
Os valores de deslocamentos químicos da Tabela 21, referentes ao composto

WcCH (14-16) ppt 22 em comparação com os dados da literatura são expressos
abaixo.
Tabela 21: Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH (14-16) ppt 22 comparados com a literatura
POSIÇÃO δ 1H δ 13C δ 13C (lit)*

1 - 39,5 39,6
2 - 34,1 34,0
3 - 216,3 218,1
4 - 47,5 47,3
5 - 56,4 54,8
6 - 19,6 19,5
7 - 33,8 33,6
8 - 40,7 40,6
9 - 49,9 49,8
10 - 36,8 36,8
11 - 21,4 21,3
12 - 25,8 25,4
13 - 38,4 38.5
14 - 42,6 42,5
15 - 29,7 29,6
16 - 32,6 32,0
17 - 56,4 56.3
18 - 49,4 49,1
19 3,0, td 47,1 46,8
20 - 150,2 150,2
21 - 30,1 30,5
22 - 36,8 36,8
23 1,12, s 26,5 26,6
24 1,06, s 21,0 20,9
25 0,99, s 15,8 15,8
26 1,00, s 15,8 15,9
27 1,04, s 14,6 14,6
28 - 178,7 181,8
29 4,75, s 109,7 109,7
4,62, s
30 1,70, s 19,2 19,3
* CARPENTER et al.,1980 [25MHz, CDCl3]
A análise espectral juntamente com os dados contidos na literatura permitiram

a identificação da substância WcCH (14-16) ppt 22 como sendo ácido 3-oxolup-
20(29)-en-28-óico (ácido betulônico), já identificado em espécie do gênero
(CRETTON, 2015).
76
5.1.6 Elucidação estrutural de WfCH ppt 14
A substância denominada de WfCH ppt 14 se apresentou como um sólido

amarelo, solúvel em clorofórmio. O espectro de 1H (Figuras 40, 41 e 42), evidenciou
sinais entre δ 6,5 e 8,0 pertencentes a hidrogênios aromáticos, como também sinais
entre δ 2,5 e 5,0 pertencentes a hidrogênios alifáticos que sofrem efeito desprotetor
indutivo. Seis dupletos de dupletos δ 2,90 (8,4 Hz/ 8,3 Hz), δ 3,01 (6,5 Hz/6,5 Hz); δ
4,05 (4,3 Hz/ 11, Hz), δ 4,55 (3,35 Hz/ 11,3 Hz), 3,22 (7,1 Hz/ 7,1 Hz) e 3,3 (6,5 Hz/
6,5 Hz) pertencentes aos hidrogênios diasterotópicos H-3, H-1 e H-3’,
respectivamente. Um quarteto em δ 4,93 (6,7 Hz, H-2’) e um multipleto em δ 4,63 (H-
2), correspondente ao hidrogênio adjacente a heteroátomo Além destes sinais citados,
dois dupletos em δ 6,58 (6,4 Hz) e δ 6,67 (8,3 Hz) indicam a presença de um grupo
amida secundário.
O espectro de RMN 13C (Figuras 43, 44 e 45), apresentou 24 linhas espectrais,

das quais cinco são referentes a carbonos alifáticos: 3 de carbonos metilênicos, um
oxigenado em δ 65,66 (C-1) e dois ligados a núcleos aromáticos em δ 37,50 (3) e δ
37,77 (C-3’); dois metínicos ligados a nitrogênio δ 50,51 (C-2) e δ 54,69 (C-2’); sinais
em δ 137,38 (C-4), δ 135,99 (C-4’), δ 134,44 (C-11) e δ 133,56 (C-11’), juntamente
com outros entre δ 127,03 a δ 135,99 relacionados a carbonos aromáticos; e três
sinais de carbonilas: δ 167,46 (C-10) e δ 167,66 (C-10’) pertencentes a grupos amida
e δ 172,14(C-1’) referente a função éster.
O espectro de RMN COSY (Figuras 46 e 47) exibiu correlação entre os

hidrogênios em NH ligados ao carbono 2 e 2’ do peptideo em δ 6.67 e 6.58 com os
hidrogênios H-2 e H-2’ em δ 4,63 e 4,93, além das correlações entre estes e os
hidrogênios diasterotópicos H-3 (δ 2,90 e 3,01) e H-3’ (δ 3,22 e 3,30),
respectivamente.
O espectro de correlação heteronuclear HSQC (Figura 48) exibiu as

correlações 1J entre os núcleos de carbono e hidrogênio utéis para confirmação
estrutural. O espectro de RMN HMBC (Figuras 49 e 50) mostrou correlação entre os
hidrogênios exibidos na Tabela 22. Essas informações aliadas aos dados presentes
na literatura permitiram identificar a estrutura como o dipeptídeo N-benzoil-L-
fenilalaninato de N-benzoil-2- amino-3-fenilpropila, também conhecido como
auranamida, um alcaloide já identificado em outras espécies vegetais e também em
77
micro-organismos, porém, inédito para o gênero Waltheria. A literatura relata sua

moderada atividade anti-HIV (WU, 2004).
Figura 40: Espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3)

78
Figura 41: Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3)
Figura 42: Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3)
79
Figura 43: Espectro de RMN 13C para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3)
Figura 44: Expansão do espectro de RMN 13C para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3)
80
Figura 45: Espectro de RMN DEPT 135 para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3)
Figura 46: Expansão [1] do espectro de RMN COSY para WfCH ppt 14
81
Figura 47: Expansão [2] do espectro de RMN COSY para WfCH ppt 14
Figura 48: Espectro de RMN HSQC para WfCH ppt 14

82
Figura 49: Espectro de RMN HMBC para WfCH ppt 14
Figura 50: Expansão do espectro de RMN HMBC para WfCH ppt 14

83
Tabela 22: Dados de RMN de 1H e 13C para WfCH ppt 14 comparados com a literatura
POSIÇÃO δ 1H δ 13C δ 13C (lit)*
1 4,05, dd (4,3 e 11,3); 65,66 65,4
4,55, dd (3.35 e11,3)
2 4,63, m 50,51 50,2
3 2,90, dd (8,4 e 8,3); 37,50 37,0
3,01, dd (6,5 e 6,5)
4 - 137,38 137,2
5e9 7,24, m 129,40 129,0
6e8 7,40, t (7,8) 128,65 128,3
7 7,33, m 127,62 127,2
10 - 167,46 168,0
11 - 134,44 134,0
12 e 16 7,67, dd (7,8 e1,3) 127,28 127,0
13 e 15 7,33, m 128,89 128,5
14 7,51, tt (6,8 e 1,15) 132,64 131,9
1’ - 172,14 172,0
2’ 4,93, q (6,7) 54,69 54,5
3’ 3,22, dd (7,1 e 7,1); 37,77 37,2
3,3, dd (6,5 e 6,5)
4’ - 135,99 136,0
5’ e 9’ 7,24, m 129,53 129,2
6’ e 8’ 7,24, m 129,10 128,7
7’ 7,24, m 127,03 126,6
10’ - 167,66 168,1
11’ - 133,56 133,0
12’ e 16’ 7,70, dd (7,7 e 1,3) 127,34 127,1
13’ e 15’ 7,33, m 128,92 128,6
14’ 7,44, tt (6,8 e 1,15) 131,62 131,4
2‘- NH 6,58, d (6,,4) - -
2 - NH 6,67, d (8,3) - -
* CDCl3/MeOD 500 MHz
84
5.2 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS SAPONIFICÁVEIS E INSAPONIFICÁVEIS

DAS ESPÉCIES DE Waltheria
5.2.1 Compostos insaponificáveis
A análise dos compostos insaponificáveis das espécies de Waltheria permitiu a

identificação de 20 constituintes dentre as partes clorofórmio e acetato de etila, onde
p-Hidroxifenilactato e fitol foram identificados em todas as espécies estudadas. Além
da identificação de um flavonoide isolado neste estudo, no entanto, a identificação foi
em W. douradinha (Tabela 23 e Figura 51)
O álcool diterpenico fitol é majoritário para as quatro espécies estudadas e a

literatura relata que o mesmo apresenta uma boa atividade antitumoral,
antinflamatória (HARADA, 2002;SILVA et al. 2014). Além deste, o p-hidroxifenilactato
nunca identificado para família foi encontrado para as quatro espécies, e sua atividade
antimicrobiana relatada (FEDOTCHEVA et al. 2008).
5.2.2 Compostos saponificáveis
O procedimento permitiu a identificação de 10 compostos na fração

saponificável (Tabela 24 e Figura 52) entre as partes clorofórmio e acetato de etila
para W. cinerescens, W. douradinha, W. ferrugínea e W. indica.
A partir disso, foi possível identificar o hidroxitolueno butilado, 14-metil

hexadecanoato e 2-benzamido-3-fenilpropanoato como sendo os compostos
majoritários. O hidroxitolueno butilado já foi relatado para família, no entanto foi
identificado pela primeira vez em Waltheria, e apresenta atividade antioxidante
(ELMASTAS et al. 2003). Já 14-metil hexadecanoato foi identificado pela primeira vez
na família e gênero, e não apresenta atividade biológica relatada. Além do
ciclopeptídeo 2-benzamido-3-fenilpropanoato inédito para a família Malvaceae.
85
Tabela 23: Compostos insaponificáveis identificados via CG/MS
Nº Substâncias W. cinerescens W. douradinha W. ferruginea W. indica

RT %área RT %área RT %área RT %área
1 Dibutilamina 7,59 3,9 - - 7,6 4,91 - -
2 (2,3,3-Trimetil-2-oxiranil) metanol 10,2 6,02 - - 10,2 6,06 - -

3 Ácido vanílico - - - - 22,93 41,07 - -
4 (3E, 7E) -10-Isopropenil-3,7-ciclodecadien-1-ona - - 23,76 5,71 - - - -
5 1-Metil-4-metileno-2- (2-metil-1-propenil) -1-
vinilcicloheptano - - 25,33 5,8 - - - -
6 Epoxido de Humuleno II - - 25,83 12,63 - - - -
7 Óxido de cariofileno - - 26,32 14,28 - - - -
8 Ácido 3-(4-hidroxifenil)-2-propenóico 28,16 64,42 28,16 11,56 28,16 39,09 13,7

28,17
9 Zerumbona - - 28,71 17,27 - - - -
10 6,10,14-trimetilpentadecan-2-ona 30,35 3,95 - - 30,35 5,15 - -
11 Geranilfenol 31,08 8,62 - - - - - -
12 12-heptadecinol - - 32,21 2,62 - - - -
13 Triacrilato de trimetilolpropano 34,01 6,16 34,01 3,62 34,01 14,93 - -
14 7-hexadecin-1-ol - - 34,05 6,93 - - - -
15 Fitol 36,11 86,38 35,75 12,72 35,74 61,68 35,74 86,3
16 Geranilgeraniol - - 38,42 5,58 - - - -
86
Continuação da Tabela 23
17 2- (7-Hidroximetil-3,11-dimetil-dodeca-2,6,10-trienil) - [1,4] - - - - - -
benzoquinona 38,53 10,84
18 Ácido 5-benzamido-4-oxo-6-fenil-hexanóico - - - - 39,69 30,48 - -
19 Adipato de dioctila 40,27 2,73 - - 40,27 2,69 - -
20 3'-Hidroxi-3,4 ', 7-trimetoxiflavona - - 40,95 76,32 - - - -
Fonte: Autor, 2018

87
Figura 51: Estrutura dos compostos insaponificáveis de Waltheria

88
Tabela 24: Compostos saponificáveis identificados via CG/MS

Nº Substâncias W. cinerescens W. douradinha W. ferruginea W. indica
RT %área RT %área RT %área RT %área
1 N-butil-N-nitroso-1-butanamina 16,19 7,04 - - - - - -
2 2-metil-2-propil-hexanoato 16,38 12,4 - - - - - -
3 2,4-dinitrofenol 22,71 36,52 - - - - - -
4 Hidroxitolueno butilado 22,94 100,0 22,94 100,0 22,95 12,39 - -
5 3-nitro-4-hidroxibenzoato de metila 23,13 10,37 - - - - - -
6 Azelato de dimetila 23,38 26,5 - - - - - -
7 Dimetil undecanodioato 28,12 6,53 - - - - - -
8 14-metil hexadecanoato 31,93 8,06 31,94 3,84 31,94 82,23
9 3-hidroxi-hexadecanoato de metila - - - - - - 34,95 11,32
10 2-benzamido-3-fenilpropanoato - - - - 38,65 83,77 - -
Fonte: Autor, 2018
89
Figura 52: Estrutura dos compostos saponificáveis de Waltheria
5.3.1 Avaliação da atividade antioxidante com DPPH
Para cada extrato foram testadas sete concentrações distintas (conforme

item 4.5.1) fornecendo graficamente sete pontos, dentre os quais foram
selecionados apenas seis pontos para traçar a curva, onde os mesmos foram
escolhidos em função do índice de correlação (R2) que mais se aproximasse de
1, Para otimização dos valores de CI50.
Os diferentes extratos das espécies de Waltheria tiveram sua capacidade
de captura do radical livre DPPH testadas. As curvas referentes a esse
procedimento, bem como os valores da concentração inibitória mínima
necessárias para redução de 50% da quantidade dos radicais livres presentes
(CI50) valores dos coeficientes a e b das equações, assim como o desvio padrão,
serão apresentados a seguir.
O efeito antioxidante está diretamente relacionado a classe de metabólitos

presente na matriz complexa e/ou substância pura. Os estudos realizados com
espécies do gênero Waltheria revelam que estas são ricas em flavonoides,
90
terpenos, alcaloides, ciclopeptídeos, flavonas, isoflavonas, flavonoides,

antocianinas, catequinas e isocatequinas dentre outros metabólitos secundários
(TSCHESCHE e KAUSSMAN, 1975; KRISHNA, 2015; MONTEILLIER et al,
2017). O presente estudo possibilitou predominantemente o isolamento de
compostos da classe dos flavonoides, podendo esta atividade ser relacionada a
presença dos mesmos nos extratos estudados.
De acordo com as curvas e dados apresentados na Figura 53, bem como

os valores de CI50 podemos afirmar que os extratos estudados apresentaram
boa atividade antioxidante, apresentando valores de CI 50±DP de 0.06963 ±
0.00154ug/mL, 0,2293 ± 0.0076 ug/mL, 0,7761 ± 0,0219 ug/mL e 0,2338±
0,0051ug/mL ug/mL para W. cinerescens, W. douradinha, W. ferrugínea e W.
indica, respectivamente. Todos os extratos apresentaram boa atividade
antioxidante através do metodo estudado, no entanto, o extrato WCTE se
mostrou com um alto poder antioxidante (CI50 = 0.06963 ± 0.00154ug/mL) frente
aos demais pois apresenta menor concentração inibitória.
Figura 53: Graficos de concentração vs AA% para as espécies W. cinerescens (WcCE), W.

douradinha (WdFM), W. ferrugínea (WfFE) e W. indica (WiFM)
W C CE
100
80
60
AA%
y = 539,76x + 12,229
R² = 0,9996
40
20
AA% 1 AA% 2 AA% 3 Linear (AA% 3)
0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16
CONCENTRAÇÃO (UG/ML)
Y=ax + b
EXP a b CI50 (ug/mL)
1 550.52 12.996 0.0672
2 550.78 11.647 0.0696
3 539.76 12.229 0.0700
CI50 = 0.06963 ± 0.00154ug/mL
R21=0.9983 R22=0.9977 R23=0.9996
91
WfFE
100
80
60
AA%
y = 154,97x + 13,622
40
R² = 0,9989
20
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Concentração
Série1 Série2 Série3 Linear (Série3)
Y=ax + b
1 173.10 11.802 0.2206
2 153.27 14.346 0.2326
3 154.97 13.622 0.2347
CI50 = 0,2293 ± 0.0076 ug/mL
R21=0.9905 R22=0.9964 R23=0.9989
WdFM
45
40
35
30
y = 44,695x + 14,662
25
AA%
R² = 0,9965
20
15
10
5
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Y=ax + b
1 47.299 14.541 0.7508
2 45.171 14.458 0.7868
3 44.695 14.662 0.7906
CI50 = 0,7761 ± 0,0219 ug/mL
R21=0.9952 R22=0.9939 R23=0.9965
92
WiFE
100
80
60 y = 146,73x + 16,103
AA%
R² = 0,9972
40
20
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Concentração
Y=ax + b
1 145.04 16.525 0.2308
2 144.40 15.382 0.2397
3 146.73 16.103 0.2310
CI50 = 0,2338± 0,0051ug/mL
R21=0.9990 R22=0.9992 R23=0.9972
Fonte: Autor, 2018

93
5.3.2 Avaliação da toxidade frente ao microcrustáceo Artemia salina
A figura abaixo expressa a taxa de mortalidade da Artemia salina após o

período de 24h de contato com os extratos das espécies de Waltheria em função da
concentração. Neste procedimento foram analisadas seis concentrações distintas, no
entanto, um ponto foi removido de cada gráfico de todos os ensaios para obtenção de
um melhor comportamento da curva e índice de correlação, R2.
A partir da equação da reta foram obtidos os valores de dose letal para metade
da população (DL50), como mostra a Figura 54, abaixo.
Figura 54: Gráficos de concentração vs % mortalidade para as espécies W. cinerescens

(WcTE), W. ferrugínea (WfFE) e W. indica (WiFM)
WcCE
40
35
30
%MORTALIDADE
25
y = 0,0331x + 1,7846
20 R² = 0,9989
15 DL50= 1456.7
10
5
0
0 200 400 600 800 1000 1200
94
WfFE
25
%MORTALIDADE 20
15
y = 0,0149x + 5,7293
R² = 0,9938
10 DL50= 2971,2
0
0 200 400 600 800 1000 1200
WiFM
25
20
15
y = 0,0149x + 5,7293
R² = 0,9938
10 DL50= 2971,2
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Fonte: Autor, 2018
Através do valor de DL50 obtido é possível avaliar o extrato vegetal como sendo
altamente tóxico, moderadamente tóxico, fracamente tóxico e atóxico, quando
apresentam valores menores que 100 µg/mL, entre 100 e 500 µg/mL, entre 500 e
1000 µg/mL e acima de 1000 µg/mL, respectivamente (NGUTA E
COLABORADORES, 2011). A partir dessa hipótese, verificamos que todos os extratos
de Waltheria são atóxicos.
95
6. CONCLUSÕES
A investigação química e biológica das diferentes espécies de Waltheria

mostrou resultados satisfatórios frente ao objetivo principal do estudo, no qual foi
possível comprovar a predominância de flavonoides frente aos alcaloides como
mostrou os estudos realizados no sul do país. A partir do fracionamento do caule de
W. cinerescens foi possível obter 5-hidroxi-3,3’,4’,7-tetrametoxiflavona, 5-hidroxi-
3,7,4’-trimetoxiflavona e ácido 3-oxolup-20(29)-en-28-óico (ácido betulônico) que
apresentam atividade antiproliferativa contra células de câncer e anti-hipertensiva
relatadas na literatura. Além disso, o estudo permitiu o isolamento de canferol-3-O-β-
(6''-cumaroil)-glicopiranosídeo (tilirosídeo) em três das quatro espécies estudadas, já
isolada de W. indica, no entanto, inédita para W. ferrugínea e W. douradinha. A
literatura relata que a substância apresenta diversas atividades biológicas como anti-
inflamatória, antioxidante, anti hiperlipidemia, hiperglicêmica, antigiardial e
antinociceptiva, como já mencionado. O fracionamento das folhas de W. ferrugínea
ainda permitiu o isolamento de canferol-3-O-β-glicopiranosídeo, que apresenta
atividade antiproliferativa moderada e atividade antioxidante e atividade
antibacteriana, respectivamente, como citado anteriormente. A partir do caule de W.
ferrugínea foi possível isolar o dipeptídeo auranamida, que já foi identificado em outras
espécies vegetais e também em micro-organismos, porém, inédito para o gênero
Waltheria.
A reação de saponificação/esterificação dos extratos permitiu a identificação de
31 compostos via CG/MS, sendo 21 insaponificáveis e 10 saponificáveis, com
destaque para o fitol e p-hidroxifenilactato, ambos majoritários na fração
insaponificável para as quatro espécies estudadas, onde o primeiro apresenta boa
atividade antitumoral e antinflamatória relatadas (HARADA, 2002; SILVA et al. 2014).
Além do hidroxitolueno butilado que foi identificado pela primeira vez em Waltheria, e
apresenta atividade antioxidante, e 4-metil hexadecanoato e 2-benzamido-3-
fenilpropanoato, sendo ambos inéditos para a família.
Os extratos estudados apresentaram atividade antioxidante significativa, com

destaque para o extrato das folhas de W. cinerescens, que apresentou CI50 = 0.06963
± 0.00154ug/mL, sendo, portanto, o que apresentou melhor resultado. O estudo
preliminar de toxidade frente ao microcrustáceo A. salina permitiu avaliar os extratos
96
testados como atóxicos, isso corrobora para continuidade do uso da douradinha do

campo (W. douradinha) na medicina popular como vem sendo comumente utilizada.
97
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

Estudo fitoquímico e biológico de quatro diferentes

Taiza Nayara da Silva Caridade

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE QUATRO DIFERENTES ESPÉCIES

Dissertação submetida à Coordenação do Curso de

Área de concentração: Química Orgânica

Orientadora: Profª. Dra. Renata Mendonça Araújo

Caridade, Taiza Nayara da Silva.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do

1. Waltheria - Dissertação. 2. Malvaceae - Dissertação. 3.

RN/UF/UFRN CDU 639.63

Elaborado por Ana Cristina Cavalcanti Tinôco - CRB-15/262

A todos os professores que passaram pela minha vida acadêmica e que

A Prof. Renata Mendonça pela amizade, risadas, ensinamentos e orientação.

A todos os colegas e professores do LISCO (Laboratório de Isolamento e

Ao Instituto de Química/UFRN pela estrutura cedida para o desenvolvimento

Ao PPGQ/UFRN pelo auxílio financeiro concedido para realização desta

A técnica do instituto de química/UFRN, Elânia, pela boa vontade e prontidão

Ao CENAUREM/UFC pela estrutura fornecida para realização deste trabalho.

A EMBRAPA por ceder a estrutura e equipamentos para realização deste

Ao Prof. Kirley Marques Canuto e ao Paulo pelo auxílio na realização dos

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

A todos, meu muito obrigada!

O gênero Waltheria pertence à família Malvaceae, que é composta por 243

Palavras chave: Waltheria. Malvaceae. Flavonoides. Auranamida. Artemia salina.

Key words: Waltheria. Malvaceae. Flavonoids. Auranamide. Artemia salina. DPPH.

Tabela 1- Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento do extrato

Tabela 3- Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento da sub fração

Tabela 4- Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento da sub fração WCTH

Tabela 5- Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento do extrato WDFM

Tabela 6- Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento do extrato WDFM

Tabela 7- Frações reunidas e suas respectivas massas no fracionamento de WFFE-

Tabela 8- Frações e solventes usados no procedimento cromatográfico de WFCH

Tabela 9- Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento WFCH ................ 46

Tabela 10- Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WFIM-H ....... 48

Tabela 11- Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento de WFIM-H ....... 48

Tabela 12- Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WFIM-H (45-54)

Tabela 13- Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento da subfração WFIM-

Tabela 14- Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WFIM-H (45-54)

Tabela 15- Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento da subfração WFIM-

Tabela 16- Preparo de soluções .............................................................................. 52

Tabela 23- Compostos insaponificáveis identificados via CG/MS ............................ 85

Tabela 24- Compostos saponificáveis identificados via CG/MS .............................. 88

Figura 2- Flavonoides isolados a partir de diferentes partes de W. indica .............. 26

Figura 3- Alcaloides isolados a partir de diferentes partes de W. indica e W.

Figura 4- Derivados de triterpenos pentaciclicos isolados a partir da raiz e partes

Figura 5- Estrutura química de um flavonoide (34) e isoflavonoide (35) ................. 29

Figura 6- Classificação dos flavonoides .................................................................. 30

Figura 7- Formação do ácido chiquímico ................................................................ 31

Figura 8- Formação da fenilalanina .......................................................................... 32

Figura 9- Proposta de mecanismo biossintético para o asperfenamato ................... 33

Figura 10- Redução do radical livre DPPH .............................................................. 34

Figura 11- Esquema de fracionamento para W. cinerescens .................................. 42

Figura 12- Esquema de fracionamento para W. douradinha .................................. 44

Figura 13- Esquema de fracionamento da W. ferrugínea ........................................ 47

Figura 14- Esquema de fracionamento da W. indica. .............................................. 50

Figura 15- Esquema de preparo das amostras a serem analisadas em

Figura 17- Espectro de RMN 1H de WcCH 19 (300MHz; CDCl3) ........................... 57

Figura 20- Espectro de RMN 13C de WcCH 19 (75MHz; CDCl3) ............................ 58

Figura 23- Espectro de RMN HSQC de WcCH 19 ................................................. 60

Figura 24- Espectro de RMN COSY de WcCH 19.................................................... 60

Figura 25- Espectro de RMN 1H de WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3).......... 63

Figura 35- Espectro de RMN HSQC para WdFM-Ac ppt 26 .................................... 70