DinorahZilbersztajnGotlieb Mestrado

DINORAH ZILBERSZTAJN GOTLIEB
Estudo da expressão da miostatina em modelos murinos para

doenças neuromusculares
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação Interunidades em Biotecnologia
USP/Instituto de Biociências, para obtenção do
Título de Mestre em Biotecnologia.
São Paulo
2011
Dinorah Zilbersztajn Gotlieb
ESTUDO DA EXPRESSÃO DA MIOSTATINA EM MODELOS MURINOS PARA

DOENÇAS NEUROMUSCULARES.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação Interunidades em Biotecnologia
USP/Instituto de Biociências, para obtenção do
Título de Mestre em Biotecnologia.
Área de concentração:Genética
Orientadora: Profa. Dra. Mariz Vainzof
São Paulo
2011
Ao meu querido marido e aos
meus anjos chamados pai e mãe.
AGRADECIMENTOS
Agradeço especialmente à orientadora Prof. Dra. Mariz Vainzof pela oportunidade de

realizar o mestrado em seu laboratório do Centro de Estudos do Genoma Humano na USP,
me ensinando com seu próprio exemplo o que é ser uma pesquisadora justa, cativante e
por ter muita paciência comigo.
A FAPESP e ao CNPq pelo fomento deste estudo.
Aos meu colegas e amigos do laboratório de proteínas André, Áurea, Danielle Ayub,
Lydia Yamamoto, Paula Onofre, Poliana , Camila e Vanessa por doarem alguns instantes ou
horas do seu tempo se dedicando para me ajudarem em varias etapas deste estudo, e por
contribuir para uma rotina de trabalho harmoniosa.
Aos recém chegados no laboratório Amanda, Henrique, Letícia, Priscila, Stephanie e
Thais, que já demonstraram o quanto são capazes e podem crescer muito dentro da
pesquisa acadêmica.
Aqueles que passaram, deixando suas marcas na minha vida profissional e pessoal,
contribuindo para aumentar meu conhecimento em diversas áreas.
Agradeço aos demais pesquisadores e trabalhadores do Centro de Estudos do
Genoma Humano por contribuir com a dinâmica, informática, atendimento, limpeza,
contabilidades e segurança do espaço onde foi realizado o presente estudo.
A Clarice Gotlieb, que é uma ótima sogra e ajuda em tudo que é possível.
Agradeço ao meu marido pela ajuda na revisão deste trabalho, pela compreensão e
apoio nos dias que eu precisava de concentração para finalizar o trabalho e por todos os dias
que virão e estaremos juntos colhendo os frutos de muita dedicação e carinho.
Aos meus queridos irmãos Victor (por ajudar efetivamente na dissertação)e Renato
que contribuíram de forma expressiva na minha personalidade, me ensinando muito sobre a
vida, fé e perseverança.
As minhas cunhadas e amigas Denise e Karen que participam da vida familiar com
muita alegria.
A minha sobrinha Tamar Victoria, nova integrante da família, que desde tão tenra
idade já me alegra com sua serena presença despertando muita alegria no meu coração.
Ao Todo Poderoso que provê todas as minhas necessidades.
O último porem o agradecimento mais importante:
Aos meus pais pelo amor infinito, por estarem sempre ao meu lado em todas as
situações, pela paciência, dedicação integral para a minha formação intelectual e moral,
através do exemplo de pessoas maravilhosas cuja honestidade, responsabilidade, trabalho,
esperança, espiritualidade estão sempre presentes, e porque sem eles eu não teria
alcançado este estágio da vida.
Ao acender uma tocha, reúnem-se os que buscam a luz.
Rebe de Lubavitch.
RESUMO
Zilbersztajn-Gotlieb D. Estudo da expressão da miostatina em modelos murinos para

doenças neuromusculares. [dissertação (Mestrado em Biotecnologia)]. São Paulo: Instituto
de Biociências da Universidade de São Paulo; 2010.
As afecções neuromusculares humanas constituem um grupo heterogêneo de doenças

genéticas caracterizadas por degeneração muscular progressiva, levando ao
desenvolvimento de fraqueza muscular e perda de capacidade motora. Mutações em
vários genes resultam na deficiência ou perda de função de diversas proteínas musculares
de importância significativa para o bom funcionamento do músculo. Algumas das doenças
associadas a alterações nestas proteínas são as distrofias musculares progressivas e as
miopatias congênitas.Entre os modelos naturais conhecidos para distrofias musculares
humanas estão: o camundongo Dmdmdx, que apresenta deficiência total da proteína
distrofina no músculo, modelo da distrofia muscular de Duchenne; o camundongo Lama2dy-
2J
/J, que apresenta deficiência da proteína α2-laminina, modelo da DM congênita 1A; o
camundongo Largemyd, com defeito na via de glicosilação da proteína α-DG, modelo da DM
congênita tipo 1D; e o camundongo SJL/J, com deficiência da proteína disferlina, modelo
da distrofia das Cinturas tipo 2B. Todos constituem excelentes modelos para estudos
histológicos e fisiopatológicos e vêm sendo utilizados para testar terapias. A proteína
miostatina, é um membro da superfamília de fatores de crescimento TGF-β. Ela age como
regulador negativo (inibidor) do crescimento muscular. Diversos estudos sugerem a
inibição da miostatina como parte de tratamentos para recuperação de massa muscular
degenerada em doenças como as distrofias musculares. Entretanto, ainda não é
conhecido o real papel da miostatina no quadro distrófico. Portanto, o presente trabalho
teve como objetivo avaliar a expressão desta proteína nos diversos modelos de
degeneração muscular através da avaliação de diferentes músculos de camundongos das
linhagens distróficas Dmdmdx, SJL/J, Largemyd e Lama2dy-2J/J. Para tal, quantificamos o
mRNA da miostatina e do gene endógeno GAPDH por técnica de PCR em tempo real, e
comparamos os resultados de expressão com o padrão de degeneração e regeneração de
cada músculo e linhagem, através da avaliação histopatológica.Observamos que em
camundongos normais, a miostatina é menos expressa no músculo gastrocnêmio do que
no diafragma, refletindo um músculo mais sujeito a lesão. Nas quatro linhagens de
camundongos distróficos, independentemente da mutação ou do grau de degeneração do
músculo, a miostatina é menos expressa do que em camundongos normais. No músculo
distrófico, a expressão da miostatina é inibida tanto no músculo gastrocnêmio como no
diafragma, sem diferença entre os dois. A analise comparativa da degeneração e
regeneração muscular com a expressão da miostatina mostrou uma maior correlação com
o padrão de degeneração do que com a regeneração.Nossos resultados sugerem que o
processo de degeneração, quando iniciado, e independentemente de seu grau, causa
molecular primária, ou músculo afetado, parece atuar de forma similar na inibição da
expressão da miostatina, possivelmente como estímulo a regeneração do dano.
Palavras-chave: Distrofias musculares. Camundongos Modelos. Miostatina.

ABSTRACT
Zilbersztajn-Gotlieb D. Myostatin expression in mouse models of neuromuscular

diseases.[Masters thesis (Human Genetic)]. São Paulo: Instituto de Biociências da
Universidade de São Paulo;2010.
Human neuromuscular disorders are a heterogeneous group of genetic diseases, caused by

mutations in genes coding sarcolemmal, sarcomeric, and cytosolic muscle proteins.
Deficiencies or loss of function of these proteins leads to variable degrees of progressive
loss of motor ability. Several animal models, displaying phenotypes observed in
neuromuscular diseases, have been identified. These models generally present physiological
alterations observed in human patients and can be used as important tools for genetic, clinic,
and histopathological studies. Among them, the Dmdmdx mouse, which has total deficiency of
dystrophin in the muscle, is a model for Duchenne muscular dystrophy; Lama2dy2J/J mouse,
which has a deficiency of protein α2-laminin, is a model of congenital DM 1A; Largemyd
mouse, defective in α-DG protein glycosylation pathway, is a model of congenital DM type
1D, and SJL/J mouse, with deficiency of the protein dysferlin, is a model of the limb girdle
muscular dystrophy type 2B. The protein myostatin, a member of the growth factors TGF-β
superfamily, is a negative regulator (inhibitor) of muscle growth. Several studies have
suggested the inhibition of myostatin as a therapeutic strategy for the stimulation of the
regeneration of the dystrophic muscle. However, the expression and role of myostatin in the
dystrophic muscle is still not totally elucidated. Therefore, the main objective of this work was
to evaluate the expression of this protein in two different muscles of four mouse models for
muscle degeneration, as compared to normal controls. The included dystrophic mice strains
were: Dmdmdx, SJL / J, Largemyd and Lama2dy2J/J. The relative expression of the myostatin
mRNA was analyzed in the gastrocnemius and diaphragm muscles by real time PCR, the
results were correlated with the histopathological findings of each muscle. It was
observed that in normal mice muscles, myostatin is less expressed in the gastrocnemius
than in the diaphragm, reflecting a muscle most prone to lesions. In the four strains of
dystrophic mice myostatin expression is reduced, independently of the primary molecular
defect or the degree of degeneration of the studied
muscles, with a similar pattern in both gastrocnemius as diaphragm muscles. The
comparative analysis of the histopathology of the muscles with the expression of myostatin
showed a stronger correlation with the pattern of degeneration then regeneration. Our results
suggest that, when started, the process of degeneration of the muscle, independently of the
primary molecular defect, or degree, seems to act in a similar pathway leading to the
inhibition of the expression of myostatin in the affected muscles, possibly as a stimulus to
regeneration of damage.
Keywords: Muscular dystrophies. Mouse models. Myostatin.

SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 17
1.1 O MÚSCULO NORMAL ..................................................................................................... 17
1.1.2 O tecido muscular no desenvolvimento embrionário .......................................... 17
1.1.3 O tecido muscular maduro .......................................................................................... 18
1.1.4 Regeneração muscular ................................................................................................. 22
1.2 O MÚSCULO DISTRÓFICO .............................................................................................. 23
1.2.1 Distrofias musculares progressiva ........................................................................... 23
1.2.2 Modelos animais para distrofias musculares ......................................................... 25
1.2.2.1 Distrofinopatias ........................................................................................................... 26
1.2.2.2 Deficiência de alfa 2 laminina .................................................................................. 26
1.2.2.3 Disferlinopatias ........................................................................................................... 27
1.2.2.4 Defeitos de glicosilação ............................................................................................ 27
1.3 MIOSTATINA ....................................................................................................................... 28
1.3.2 Expressão da Miostatina durante o desenvolvimento ........................................ 29
1.3.3 Função da miostatina e associação com doenças .............................................. 30
1.3.4 Inibição da Miostatina como abordagem terapêutica .......................................... 31
2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 33
3 MATERIAL E METODOLOGIA ...................................................................................... 34
3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA.................................. 34
3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEM....................................................................... 34
3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DOS MÚSCULOS .......................................................... 36
3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS .......................................................... 36
3.5 HISTOLOGIA ....................................................................................................................... 37
3.5.1 Coloração de Hematoxilina-Eosina (HE) .................................................................. 37
3.5.2 Coloração com Picro Sirius® ....................................................................................... 37
3.6 ESTUDOS MOLECULARES ............................................................................................. 38
3.6.1 Extração de RNA total ................................................................................................... 38
3.6.2 Síntese de cDNA total ................................................................................................... 38
3.6.3 Análise de Expressão da miostatina ......................................................................... 38
3.6.4 PCR em Tempo Real (Q-PCR)- quantificação relativa da expressão
da miostatina ............................................................................................................................ 39
4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 40
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA .............................................................................. 40
4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA ............................................................. 41
4.2.1 Análise semiquantitiva.................................................................................................. 41
4.2.2 Análise quantitativa da expressão da miostatina por PCR em tempo real

(qRT-PCR) ................................................................................................................................. 45
4.2.2.1 Padronização da metodologia para os genes em estudo ................................ 45
4.2.2.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio
do grupo controle..................................................................................................................... 47
dos diferentes grupos de animais distróficos................................................................. 49
4.2.2.4 Teste com normalizador específico para cada músculo .................................. 50
4.2.2.5 Análise da miostatina por linhagem (diafragma + gastrocnêmio) ................ 52
4.2.2.6 Análise comparativa da miostatina nos músculos diafragma e
gastrocnêmio em cada linhagem distrófica (um só normalizador – C5746D) ........ 52
4.3 Análise Histopatológica ................................................................................................... 53
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 61
5.1 A MIOSTATINA COMO ALVO PARA TERAPIAS ........................................................ 61
5.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA .............................................................................. 62
5.3 ESTUDO DA EXPRESSÃO RELATIVA DA MIOSTATINA ......................................... 64
5.3.1 Escolha do gene endógeno ......................................................................................... 64
5.3.2 Análise Semi quantitativa da miostatina.................................................................. 65
5.3.3 Análise por PCR em tempo real ................................................................................. 65
do grupo controle..................................................................................................................... 66
dos camundongos afetados ................................................................................................. 67
5.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ....................................................................................... 69
5.5 CORRELAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA E PADRÃO
DE DEGENERAÇÃO E REGENERAÇÃO MUSCULAR .................................................... 70
6 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 72
REFERÊNCIAS........................................................................................................................ 73
17
1INTRODUÇÃO
1.1O MÚSCULO NORMAL

NORMAL
1.1.2 O tecido muscular no desenvolvimento embrionário
No início do estágio embrionário, na fase de nêurula, na parte paraxial da
mesoderme forma-se os somitos, dos quais originam os tecidos muscular, ósseo,
cartilaginoso e dérmico. O destino de cada região dos somitos é especificada por fatores
secretados pelos tecidos adjacentes e sua localização em relação a eles.
Figura 1-A mesoderme de um embrião no estágio de nêurula pode ser dividida em partes que darão origem
aos diversos compartimentos, órgãos e tecidos do corpo. Em laranja esta destacada a região
paraxial de onde serão formados grupos de células mesodérmicas chamadas somitos. Duas regiões
dos somitos sofrem influencia de fatores secretados nas suas proximidades que induzem a formação
do miótomo e consequentemente das células precursoras musculares.
FONTE: modificado Gilbert (2000).
A secreção parácrina de fatores específicos induz duas regiões dos somitos a
sintetizarem fatores de transcrição miogênica bHLH (Basic helix-loop-helix) se
caracterizando em miótomos assim dando origem aos mioblastos.
Os mioblastos, células precursoras do músculo,tornam-se alongados, se alinham e
se fundem para formação de miotubos multinucleados, resultando em células muito longas
chamadas fibras musculares.

18
Figura 2-No
o miotoma os mioblastos, células precursoras musculares, proliferam, sintetizam proteínas
miogênicas bHLH, se alinham e se fundem para a formação de miotubos multinucleados.
FONTE: modificado Gilbert (2000)
A determinação dos mioblastos,

mioblastos, e sua diferenciação em miotubos são controladas
por diversos fatores de transcrição miogênicos (MYFs) pertencem à família protéica HLH
(helix-loop-helix),
helix), que têm um papel fundamental na miogênese e na regeneração. Dentre
estes, o MyoD (antígeno de dif

diferenciação miogênico – MYF3) atua na regulação da
expressão de genes em tempos diferentes durante a miogênese e é essencial no reparo
de lesões musculares, uma vez que participa da ativação das células satélite (CS) (Hawke
e Garry, 2001). O MYF5, estruturalmente

estruturalmente relacionado ao MyoD, também atua na
determinação dos mioblastos durante o desenvolvimento embrionário, auxiliando na
proliferação das CS (Hawke e Garry, 2001). A miogenina (MYF4) é um fator essencial
para a diferenciação de células totipotentes em músculo. A miogenina e MYF6 determinam
a linhagem miogênica e modulam a diferenciação final das CS; O Pax7 (paired box
transcription factor 7), expresso em CS quiescentes e em proliferação. A expressão da
miostatina é detectada nos miótomos, desde o início

início da miogênese e permanece até a
formação do músculo esquelético adulto.

adulto Acredita-se
se que este gene deve controlar o
número de fibras, seu calibre e tamanho durante a miogênese embrionária, fetal e pós-
pós
natal (Kambadur et al.,

., 1997).
1.1.3O
1.1.3O tecido muscular
muscular maduro
As fibras musculares constituem três tipos de tecidos musculares: estr

estriado
esquelético, estriado
ado cardíaco e liso.
Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra tem
diâmetro que varia entre 10 e 100μm, é formada por muitas miofibrilas de diâmetro
di de 1 a
19
2μm, que correm longitudinalmente à fibra muscular. Por sua vez as miofibrilas são
compostas por miofilamentos. É nos miofilamentos que se encontram as estruturas
contráteis do músculo chamadas sarcômeros.
Figura 3-Organização do músculo esquelético. Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras
musculares. Cada fibra muscular é composta por muitas miofibrilas, as quais são compostas por
miofilamentos.
FONTE: modificado Johnson e Raven, 2002.
Os sarcômeros são constituidos principalmente por dois tipos de filamentos:
filamento espesso, composto pela proteína miosina; filamento fino, formado por
monômeros de actina, nebulina, tropomiosina e troponina. A organização destas proteínas
revela sob microscopia eletrônica um padrão de bandas claras e escuras que se repetem
ao longo dos miofilamentos (Figura 4).
Banda A
Filamentos finos Filamentos espessos
Figura 4-Eletronmicrografia de fibra muscular. A linha Z serve como bordas dos sarcômeros claramente
visualizados em cada miofibrila. Os filamentos espessos compõem a banda A, os filamentos finos
fazem parte da banda I e da banda A, sobrepondo os filamentos espessos. Na região central da
banda A chamada por banda H, não há sobreposição dos filamentos, por isso a aparência mais
clara.
20
As bandas espessas e escuras, denominadas bandas A, são compostas por
filamentos de miosina combinadas em feixes. A miosina consiste de seis cadeias
polipeptídicas – duas cadeias pesadas, de 220kD, cuja porção N-terminal, chamada
cabeça, possui atividade ATPásica, e dois pares de cadeias leves diferentes, chamadas
cadeias leves essenciais e cadeias leves regulatórias, cujo peso varia de 15 a 22kD,
dependendo da sua proveniência.
Região N-terminal
denominada cabeça
Molécula de miosina
Feixe de miosina
Figura 5-Representação de uma molécula de miosina representando 2 cadeias pesadas, parte torcida, e 2
cabeças parte globular. Parte de um feixe de miosinas na disposição que compõem o fila espesso
das miofibrilas.
As bandas finas e claras, também chamadas por bandas I, são compostas de dois
filamentos de actina torcidos em hélice. A actina é uma proteína globular com 375
aminoácidos.
Moléculas de actina
Filamento fino
Figura 6-Filamento fino. Duas cadeias de actina torcidas juntas na forma de hélice.
FONTE: Modificado Johnson e Raven, 2002.
Através de ligações protéicas ocorre a conexão da actina com a membrana
plasmática. Um modelo proposto descreve um importante papel da proteína distrofina
nesta ligação. A distrofina estaria organizada em um dímero antiparalelo com o domínio N-
terminal como ponto de ligação com os filamentos de actina, no interior da fibra muscular e
o domínio C-terminal como sítio de ligação à membrana, através de um complexo de

21
proteínas e glicoproteínas associadas integrais à membrana (Complexo Distrofina

Distrofina-
Glicoproteínas Associadas - DGC) (Ervasti e Campbell, 1993; Ozawa et al., 1995).
O DGC é um complexo oligomérico, formado pelos sub-complexo

sub complexos distroglicano ( α-,
β-DG), sarcoglicano ( α−, β−, γ− e δ−SG), sintrofinas, e distrobrevinas. A associação da
distrofina ao complexo DGC é feita através de sua ligação à proteína -DG. A proteína β β-
DG está associada ao complexo transmembranoso sarcoglicano, e também à proteína
periférica de membrana α-DG. A proteína α-DG

DG é altamente glicosilada e estudos
relacionados a este processo sugerem que este mecanismo teria importante função na
ligação e interação da α-
-DG com a laminina na matriz extracelular, e conseqüentemente,
conseq
no bom funcionamento do músculo esquelético (Muntoni e Voit, 2004). Desta forma, o
DGC promove a ligação entre as proteínas internas da fibra muscular (ligação actina-
distrofina), e a matriz extracelular (associação α-DG-laminina

laminina 2). A laminina 2 é composta
por três cadeias, sendo uma delas a cadeia α2 (Ervasti e Campbell, 1993; Ozawa et al.,
1995).
Figura 7- Complexo Distrofina Glicoproteínas

Glicoproteínas associadas. Ligação do citoesqueleto com a matriz extracelular
da fibra muscular é feita por interações protéicas, em que a proteína distrofina tem um papel central,
ligada na sua porção N terminal à actina, e na sua porção C terminal à Beta Be Distroglicana
associando-se àss demais proteínas do complexo.
FONTE: Modificado de Khurana e Davies (2003).
As fibras musculares podem ser divididas com base na velocidade da contração
exercida: lenta, tipo I , tem rico abastecimento

abastecimento de capilares, muitas mitocôndrias
mitocô e enzimas
respiratórias aeróbicas,
bicas, alta
al concentração de mioglobinas e por isso são
s chamadas de
fibras vermelhas; e rápida, tipo II, com menor quantidade de capilares, mitocôndrias
mitocô e
22
mioglobinas, são chamadas de fibras brancas e são adaptadas

daptadas para respiração
anaeróbica, pois usam glicogênio

glicogê e possuem altas concentrações de enzimas glicolíticas.
glicol
O músculo humano também

també possui uma forma intermediári
ria de fibras que são
rápidas mas também

m tem uma alta capacidade oxidativa, portanto mais resistentes a
fadiga.
1.1.4
1.1.4Regeneração muscular
A regeneração é comandada pelas células satélites

satélite (CS) do músculo. Estas células
c
têm forma alongada e são uninucleadas, e tem papel importante na hipertrofia e no reparo
de lesões sofridas pela fibra muscular. As CS se localizam na periferia dos miotubos e
representam cerca de 30% dos núcleos sublaminares dos músculos

músculos dos membros
membro ( Hawke
e Garry, 2001).
Figura 8- Ativação, diferenciação e proliferação de células satélites na resposta ao a dano muscular. Vários
fatores liberados pelo exercício ou lesão ativam as células satélites fazendo com que estas deixem o
estado quiescente. Neste
Neste estado as células podem proliferar e/ou migrar, nesse caso ao fundir-se
fundir
aos miócitos “danificados”, contribuem para a regeneração da célula.
célula
FONTE: modificado adaptado de Hawke e Garry(2001).
A quantidade de CS depende da idade, espécie e tipo de fibras.

fib As fibras do tipo
glicolítico (rápidas) apresentam quantidade menor de CS, já que estas aparecem em maior
número quando próximas a capilares, mionúcleos e junções neuromusculares (JNM). Isto
significa que as fibras oxidativas possuem aproximadamente 5 vezes mais CS que as
glicolíticas.
Geralmente, as CS se encontram quiescentes no músculo adulto, porém explosões
de atividade muscular após treinamento de resistência ocasionam hipertrofia em

23
decorrência da ativação das CS. A lesão muscular causada pelo exercício intenso provoca
a migração de macrófagos para a região lesada, com conseqüente liberação de citocinas.
As CS são atraídas por quimiotaxia e se fundem a miofibras já existentes, causando
aumento da massa muscular (Hawke e Garry, 2001).
Sugere-se que miostatina no músculo danificado deve agir como um chamariz
químico de fagócitos e células inflamatórias e deve modular o processo de regeneração
através de seu efeito nessas células (Kirk et al., 2000; Sharma et al., 2001).
1.2 O MÚSCULO DISTRÓFICO
1.2.1 Distrofias musculares progressiva
As afecções neuromusculares humanas constituem um grupo heterogêneo de
doenças genéticas caracterizadas por degeneração muscular progressiva, levando ao
desenvolvimento de fraqueza muscular e perda de capacidade motora (Vainzof e Zatz,
2003). Na última década, foram identificadas mutações em vários genes, resultando na
deficiência ou perda de função de diversas proteínas musculares de importância
significativa para o bom funcionamento do músculo. Estudos bioquímicos e
imunohistológicos têm localizado estas proteínas nos diversos compartimentos da fibra
muscular. Associadas à membrana sarcolemal, encontra-se a distrofina, as 4 sarcoglicanas
α−, β−, γ−
( e δ-SG), disferlina e caveolina 3; na matriz extracelular, a α2-laminina e
colágeno VI; nos sarcômeros, a teletonina, miotilina, titina, actina e tropomiosina; no citosol
muscular, a calpaína 3, FKRP, TRIM32, miotubularina; e nos núcleos, a emerina, lamina
A/C, proteína SMN. Algumas das doenças associadas a alterações nestas proteínas são
as distrofias musculares progressivas e as miopatias congênitas.
Dentre as diferentes miopatias, a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é a mais
comum, com uma incidência de 1 em cada 3000 nascimentos do sexo masculino. Os
sinais clínicos iniciam-se entre 3 e 5 anos de idade (com quedas freqüentes, dificuldades
para subir escadas, correr e levantar do chão), o confinamento em cadeira de rodas se dá
até os 12 anos de idade e os afetados raramente sobrevivem após a terceira década (Zatz,
2001). O gene responsável pela DMD localiza-se no braço curto do cromossomo X (Xp21).
24
O produto do gene é uma proteína de 427-kDa, denominada distrofina, que se localiza na
face interna da membrana das fibras musculares esqueléticas e cardíacas, como visto
anteriormente. Recentemente foram identificadas mutações em diversos genes que atuam
na cascata de glicosilação da α-DG resultando em doenças neuromusculares (Martin,
2003).
A ausência de distrofina no músculo distrófico resulta na deficiência secundária dos
componentes do DGC (Ohlendieck et al., 1991; Ervasti e Campbell, 1993). Como
conseqüência, ocorre a instabilidade desse complexo, e as fibras musculares ficam mais
suscetíveis ao estresse mecânico causado pela contração muscular, levando ao processo
de degeneração em pacientes com DMD. Portanto, as proteínas do complexo DGC
também são de extrema importância para o bom funcionamento do músculo, e assim como
a deficiência de distrofina leva às distrofias de Duchenne, alterações nas proteínas do
complexo DGC causam as distrofias musculares tipo Cinturas (DMC). As formas
autossômicas recessivas mais graves e de início mais precoce são as sarcoglicanopatias,
causadas por mutações nos genes que codificam as 4 proteínas sarcoglicanas
α−, β−, γ− e δ-SG).

( Dentre as formas de distrofias das Cinturas mais benignas, a
deficiência da enzima calpaína 3 causa DMC2A, a deficiência da proteína sarcolemal
disferlina causa a forma DMC2B e a deficiência da proteína sarcomérica teletonina causa
DMC2G. Além disso, mutações no gene LAMA2 que codifica a cadeia α2 da laminina
muscular (laminina2) causam uma forma de distrofia muscular congênita muito grave, a
CMD1A. A α2-laminina é expressa em vários tipos celulares, entre eles células musculares
esqueléticas e cardíacas, células de Schwann, trofoblastos e células de origem
mesenquimal (Vilquin et al., 1999). Em 1994, Tomé et al. identificaram a proteína merosina
ou α2-laminina como a responsável pela patogênese da doença.

Por outro lado, novas formas de distrofias musculares foram recentemente
associadas a mutações em genes que codificam enzimas glicosiltransferases, que
contribuem para a glicosilação da proteína α-DG. Curiosamente, a análise de proteínas em

biópsias musculares destes pacientes mostra uma hipo-glicosilação da α-DG e redução
significativa de numerosos ligantes da matriz extracelular (Muntoni et al ., 2004). Dentro
deste grupo de doenças, nota-se a distrofia das cinturas tipo 2I e forma congênita 1C,
ambas causadas por mutações no gene FKRP que codifica uma possível
25
glicosiltransferase. Além disso, uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma
DMC1D, também foi associada

assoc a mutações no gene LARGE. Este gene está envolvido na
glicosilação da proteína α-DG,
DG, membro essencial na formação e funcionamento do
complexo DGC muscular. Portanto, o estudo da via de glicosilação de proteínas
musculares se tornou muito importante na compreensão de novos mecanismos
causadores de doenças neuromusculares humanas.
Figura 9- Complexo distrofina glicoproteínas associadas

FONTE: Byrne et al.(2003
2003).
1.2.2Modelos
1.2.2Modelos animais para distrofias musculares
Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com
características já observadas em doenças hereditárias

hereditárias enquanto outros são modificados
geneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas que
aparecem em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos
genéticos, clínicos, histopatológicos e terapêuticos ajudando na compreensão da origem
das doenças e suas manifestações nos indivíduos afetados (Vainzof et al , 2007). .

Os modelos murinos são os mais estudados e utilizados para as distrofias
musculares. Porém, outros animais com diferentes miopatias já foram identificados

identificad tais
como os cães Golden Retriever, Beagle, Rottweiler, modelos para DMD e Boston Terrier,
Cocker Spaniel e Chihuahua, modelos para deficiência das proteínas sarcoglicanas
(Shelton
Shelton e Engvall, 2005).
26
1.2.2.1 Distrofinopatias
O camundongo Dmdmdx é modelo mais usado para DMD (Bulfield et al.,1984). O
Dmdmdx tem uma mutação de ponto no gene da distrofina no cromossomo X que causa
uma terminação prematura do polipeptídio (Sicinski et al., 1989), e conseqüentemente
ausência total da proteína no músculo. Esse fato o torna um bom modelo molecular. No
entanto, além de apresentar menor degeneração e maior regeneração muscular, o Dmdmdx

não tem fraqueza muscular significativa e por isso não é usado como modelo clínico de
DMD. O músculo mais afetado, que melhor representa a progressão de fraqueza e
reproduz as transformações de distrofia muscular humana no Dmdmdx é o diafragma,
(Stedman et al., 1991) por esta razão ele é amplamente usado em análises histológicas.
1.2.2.2 Deficiência de alfa 2 laminina
Diversos camundongos modelos com deficiência de alfa 2 lamina foram produzidos.
Dentre eles, dois modelos, com mutações espontâneas no gene LAMA2 foram
identificados no Laboratório Jackson: o camundongo dy/dy (dystrophia-muscularis) e seu
mutante alélico dy2J/dy2J.No modelo dy2J/dy2Ja distrofia é mais branda que no modelo
dy/dy. Ambos exibem deficiência parcial de alfa 2 lamina e são modelos para distrofia
muscular congênita com deficiência de merosina (CMD1A) (Jackson Laboratories).
Estudos moleculares da expressão do gene Lama2 nos camundongos dy/dy

revelaram deficiência de seu mRNA nos músculos esquelético e cardíaco e no nervo
periférico, porem não se sabe ainda qual é a mutação para esse fenótipo (Jackson
Laboratories). Clinicamente esses camundongos são considerados menores e mais fracos.
Geralmente são estéreis. O acometimento muscular começa aproximadamente em 3 ½
semanas de vida, em que ocorre paralisia primeiramente nos músculos posteriores, depois
nos axiais e por último nos anteriores. Eles apresentam defeitos na mielinação de nervos
periféricos e morte prematura, antes dos 6 meses de idade (Vainzof et al , 2007). .

A mutação que ocorre nos modelos Lama2dyJ/J é uma substituição de um G por A,
o que causa splicing anormal e conseqüentemente expressão de múltiplos mRNA. Um
mRNA é traduzido num polipeptídio alfa2 com uma deleção no domínio IV (Sumada et al , .
27
1995). Os efeitos desta mutação são mais brandos que no camundongo dy/dy, porem nos
dois casos as alterações clínicas e histológicas são similares. Os camundongos Lama2dyJ/J
são maiores e mais ativos que os camundongos dy/dy, têm expectativa de vida normal e
são férteis. Foi observado que ao levantar o animal pela cauda ele recolhe os membros em
direção ao tronco (Allamand e Campbell, 2000).
1.2.2.3 Disferlinopatias
Disferlinopatias
O camundongo SJL/J é um modelo natural para diferentes doenças humanas.
Recentemente identificou-se nele uma deleção de 171pb no gene da disferlina, na região
que codifica a maioria dos domínios C2. Essa mutação causa a deleção de 57
aminoácidos, resultando numa molécula 6.5 kD menor que a proteína normal de
aproximadamente 230 kD (Bittner et al., 1999) e provocando sua instabilidade. O SJL/J

apresenta uma redução média de 85% nos níveis de disferlina, tornando-o um bom modelo
para LGMD2B (Vainzof et al.,2003).
Ele desenvolve uma miopatia espontânea caracterizada por progressão lenta de
perda muscular (Bittner et al., 1999) e força correspondente a um aumento da patologia do
músculo incluindo fibras musculares com núcleos centrais, variação de calibre, splitting,
infiltração inflamatória, necrose e eventual substituição de músculo por tecido gorduroso
(Vainzof et al.,2003). Este quadro afeta primeiramente os músculos proximais enquanto os
músculos distais permanecem menos afetados. Cruzamentos subseqüentes de
SJLxC57BL/10 revelaram que o fenótipo muscular apresentado é herdado como caráter
autossômico recessivo(Bittner et al., 1999).
Este camundongo é extremamente suscetível a doenças autoimune, linfoma e
infecções virais. Geralmente os machos (Jackson Laboratories) têm um comportamento
agressivo (Hoet al., 2004).
1.2.2.4 Defeitos de glicosilação
No camundongo, o gene que codifica uma possível glicosiltransferase é o Large.

Deleções que retiram os exons 4-6 resultam na alteração da glicosilação da alfa
28
distroglicana e são responsáveis pelo fenótipo miodistrófico Largemyd),

( destacando
comprometimento do músculo esquelético, coração, retina, sistema nervoso periférico e
sistema nervoso central (Vainzof et al , 2007). .

Os camundongos homozigotos Largemyd apresentam distrofia muscular progressiva
grave e cardiomiopatia branda. Podem ser reconhecidos com 12-15 dias pelo seu tamanho
reduzido e postura anormal (Browning et al., 2005). Defeitos neuronais aparecem no
cérebro principalmente no córtex e cerebelo, também presentes no camundongo deficiente
de fukutina.
1.3
1.3 MIOSTATINA
A miostatina, também conhecida como GDF-8, é um membro da superfamília de
β
fatores de crescimento TGF- , que é composta por fatores de crescimento e diferenciação
do desenvolvimento embrionário e manutenção da homeostase tecidual (McPherron e Lee,
1997).
A miostatina é codificada pelo gene MSTN, localizado em 2q32.2 em humanos e
em camundongo esta em 1 27.8 cM (Szabo et al.,1998). O gene MSTN foi seqüenciado
por Ferrel et al.(1999), e é constituído por três exons intercalados por dois introns,
contendo 7,7 kb e um mRNA de 3,1 kb. Vários polimorfismos foram identificados em
humanos.
A miostatina é uma proteína com 375 aminoácidos, contendo uma seqüência
sinalizadora de secreção, um sítio de processamento proteolítico e nove resíduos de
cisteínas na sua porção C-terminal. Em eletroforese realizada em condições não redutoras,
pode-se observar duas bandas de massas de 101 kDa e 25 kDa, consistentes com o
tamanho esperado para as formas diméricas não-processadas e processadas,
respectivamente (McPherron e Lee, 1997).
Normalmente a miostatina está em estado inativo, no qual a região madura C-
terminal da molécula fica ligada não covalentemente ao seu pró-peptideo na região N-
terminal. O pró-peptideo tem função inibitória sobre a proteína, pois inibe a sua ligação ao
receptor (Lee e McPherron, 2001). Esse complexo latente pode ser ativado in vitro pela
29
clivagem do pró-peptideo com membros da família das metaloproteinases BMP-1/TLD
(bone morphogeneticprotein-1/tolloid)(Wolfman et al., 2003).
Após a ativação de seu estado latente, o dímero C-terminal da miostatina é capaz
de ligar aos receptores e ativar uma cascata de transdução de sinal na célula-alvo.
Estudos com miostatina recombinante purificada demonstraram que ela é capaz de se ligar
aos receptores activina tipo II(receptores transmembrana serina/treonina quinase): ActRIIA
e ActRIIB in vitro (Lee e McPherron 2001; Rebbapragada et al., 2003). A ligação ao ActRII
leva a fosforilação e ativação do receptor Activina tipo I, que por sua vez inicia uma
cascata de sinalização pela fosforilação das proteínas Smad2 e Smad3. Após a
fosforilação as Smads formam heterodimeros com a CoSmad4. Esses complexos de
Smads ativados são translocados do citoplasma para o núcleo onde eles regulam a
transcrição de genes alvos(Langley et al., 2002) (Shi e Massague, 2003).
A localização celular da miostatina parece depender do estado anatomo-patológico
do músculo e do estágio de diferenciação muscular. Acredita-se também que a miostatina
deve desempenhar diferentes papéis na dinâmica de desenvolvimento e do processo de
degeneração/regeneração musculares (Sharma et al., 2001). Wehling et al. (2000)
encontraram a proteína nas junções miotendinosas em músculo normal e em processo de
reposição de massa muscular perdida por falta de uso. A miostatina foi encontrada
também no citoplasma de fibras musculares e nos mionúcleos de músculo denervado, em
processo de degeneração/regeneração e de ganho de massa muscular (Sakuma e cols.,
2000). Por outro lado, marcação positiva para miostatina foi também encontrada em
células não musculares, como os macrófagos e fibroblastos no tecido muscular em
processo de regeneração (Yamanouchi et al., 2000).
1.3.2
1.3.2 Expressão da Miostatina
Miostatina durante o desenvolvimento
A análise da expressão de miostatina nos diferentes estágios de desenvolvimento
embrionário mostrou que nos estágios mais incipientes, sua expressão é restrita aos
somitos em desenvolvimento. O mRNA da miostatina pode ser detectado desde 9,5 dias
post-coitum (p.c.), em cerca de um terço dos somitos. Por volta do dia 10,5 p.c. a
expressão parece estar localizada no miótomo. Em estágios mais avançados de

30
desenvolvimento a miostatina é encontrada em uma ampla gama de músculos em
desenvolvimento (McPherron et al., 1997).
Em animais adultos, a miostatina continua a ser expressa quase que
exclusivamente na musculatura esquelética. Entretanto, quantidades residuais de
miostatina foram detectadas também em tecido adiposo. A expressão no músculo
esquelético é disseminada, embora, exista variação de expressão em músculos diferentes
(McPherron et al., 1997). A miostatina é expressa também na musculatura cardíaca
(Sharma et al., 1999).
1.3.3
1.3.3 Função da miostatina e associação com doenças
Diversos estudos tentam explicar a interação da miostatina com os tecidos do
corpo, e sua relação com doenças humanas.
Recentemente a miostatina foi relacionada com doenças como obesidade e
diabetes. Administrando uma dieta rica em gordura para camundongos selvagens e
transgênicos para a miostatina, et al.(2005) constataram que nesta dieta o camundongo
selvagem apresentou resistência a insulina. Em seu sangue havia maior concentração de
glicose, enquanto o animal transgênico, com inibição da miostatina, conseguiu manter os
mesmos níveis de glicose que os camundongos transgênicos e selvagens alimentados
com uma dieta balanceada de nutrientes. Em outro estudo Hitell et al.(2009) observaram
um aumento da secreção de miostatina em miotubos em cultura de mulheres obesas.
Resultados encontrados por Feldman et al.(2006) revelaram que a miostatina, a
semelhança com a dexametasona, também tem a capacidade de induzir a adipogenese de
uma linhagem de células pluripotentes. Entretanto, os adipócitos formados são menores,
expressam marcadores de adipócitos imaturos e teriam a sensibilidade a insulina
aumentada.
Um estudo realizado por Roth et al.(2003) verificou que a expressão da miostatina
estava reduzida em 37% em indivíduos sedentários que participaram de um programa de
treinamento físico intenso, concluindo que a miostatina responde à carga muscular em
alguns casos, e, portanto é um regulador do tamanho celular. A expressão da miostatina

31
parece, portanto, depender do tipo de contração muscular realizada, bem como a
freqüência, intensidade e duração dos estímulos (Sakuma et al ., 2000).

Aumento da quantidade de miostatina foi observado em humanos em conseqüência
da inatividade (Zimmers et al., 2002) e em casos de perda de massa muscular, como
verificado em homens portadores de HIV (Gonzales-Cadavid et al., 1998).
Durante o processo de regeneração muscular é observado uma elevação na
replicação de células satélites. A expressão de miostatina em fibras em processo de
regeneração é diferente entre fibras que sobreviveram ao processo de degeneração e
fibras danificadas em regeneração. Nas primeiras a expressão é alta o que deve inibir a
multiplicação de mioblastos, nas outras a expressão é baixa, ou seja, a multiplicação de
mioblastos não é inibida (Kirk et al., 2000; Sharma et al., 2001).
Estudos em cultura de mioblastos demonstraram que a miostatina atua bloqueando
as fases G1 e G2 do ciclo celular, regulando proteínas importantes ao ciclo como Cdk2,
p21 e Rb sem afetar o mecanismo de apoptose dos mioblastos. Em resposta à sinalização
da miostatina, a proteína p21 é hiper-regulada inibindo a atividade ciclina E/Cdk2 causando
a hipofosforilação da proteína Rb e parando o ciclo celular na fase G1 (Thomas et al.,
2000).
1.3.4
1.3.4 Inibição da Miostatina como abordagem terapêutica
terapêutica
Muitos estudos enfatizam a inibição da miostatina porque o tratamento de doenças
musculares pela maioria das abordagens farmacológicas tem sido decepcionante (Rodino-
Klapac, 2009). Por causa do importante papel da miostatina no desenvolvimento e
regeneração do músculo, terapias com bloqueio de miostatina estão sendo testadas em
modelos animais de distrofias musculares (Bogdanovich et al , 2002). . Outros ainda focam
no objetivo de produzir animais com maior massa muscular, o que seria vantajoso para a
pecuária.
.
Lee et al (2005) descreveram um potente inibidor da miostatina (ACVR2B) que
quando injetado em camundongos selvagens resulta em aumento de massa muscular. Em
seu estudo demonstraram que o efeito do ACVR2B é atenuado em indivíduos nulos para a
32
miostatina, sugerindo que existe pelos menos uma outra substância que normalmente
funciona limitando o crescimento da musculatura.
Em pesquisa realizada por Parsons et al.(2006), comparou-se a inibição da
miostatina com anticorpos monoclonais em estágios iniciais de desenvolvimento com
estágios tardios em animais nulos para delta sarcoglicana. Eles observaram aumento de
massa muscular, regeneração e redução de fibrose em estágios iniciais e sugeriram que a
inibição pode ser benéfica em período inicial de vida ou quando a doença é branda.
Heineke et al.(2010) após induzirem danos cardíacos em camundongos,
detectaram aumento das concentrações plasmáticas de miostatina e conseqüente
diminuição da massa muscular esquelética. Com estes dados os autores apontam a
miostatina liberada na circulação sistêmica por cardiomiócitos como causadora da
caquexia que ocorre em pacientes que sofrem de falhas cardíacas.
Em experimentos realizados com camundongos deficientes para alfa-laminina2 e
nulos para a miostatina, Li et al.(2005) observaram maiores taxas de morte pós-natal, o
aumento de musculatura e regeneração muscular concomitantemente ao aumento da
formação de gordura, demonstrando que a ausência desta proteína não reduziu a
patologia muscular dos indivíduos afetados.
Haidet et al.(2008) testaram a injeção intramuscular pós-natal de vírus adeno-
associado (AAV) codificando proteínas que inibem a miostatina. Em camundongos
selvagens ocorreu o aumento da musculatura e da força. Interessante que em Dmdmdx o
tratamento reverteu a patologia muscular e melhorou a força, mesmo quando administrada
para animais de 6 meses.
Ainda que ocorra o aumento da musculatura na ausência de miostatina, a força
muscular é menor em camundongos deficientes de miostatina que em camundongos
.
selvagens (Amthor et al , 2007).
Visto que o papel da miostatina no processo distrófico não está bem estabelecido,
este trabalho se faz de extrema importância na tentativa de explicar uma possível relação
desta proteína com o processo distrófico.

33
2 OBJETIVOS
OBJETIVOS
Avaliar e comparar a expressão da miostatina em quatro modelos murinos para
distrofias musculares com diversos padrões de fraqueza muscular: Dmdmdx, SJL, Largemyd,
Lama2dyJ/J.
Objetivos Específicos:
• Avaliar e comparar a expressão do mRNA da miostatina, por PCR em tempo real
no músculo gastrocnêmio e diafragma dos animais das diferentes linhagens.
• Comparar a expressão da miostatina com as alterações histopatológicas dos
músculos estudados e correlacionar com o grau de fraqueza muscular
característico de cada linhagem.

34
3 MATERIAL E METODOLOGIA
3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA.
Os animais deste projeto são mantidos no biotério do Centro de Estudos do
Genoma Humano, o qual está devidamente equipado para abrigar estes animais, em
temperatura constante e boas condições de higiene e saúde. Os animais recebem
alimentação e água ad libidum .

Foram utilizadas as linhagens de camundongos Dmdmdx (Bulfieldet al., 1984),
B6.WK- Lama2dyJ/J (Meier e Southard, 1970), SJL/J (Welleret al., 1997), Largemyd
(Grewal e Hewitt, 2002), e C57Black6 (camundongo normal).
Os camundongos Lama2dyJ/J (000524), SJL/J (000686) e Largemyd/J (000226)
foram importados do laboratório Jackson (www.jaxmice.org).
3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEM

GENOTIPAGEM
Duas linhagens são genotipadas em nosso laboratório: modelo Largemyd e o modelo

Lama2dyJ/J. Para estas genotipagens os animais foram identificados previamente com
furos na orelha, fragmentos de cauda foram colocados em tubos identificados com solução
de extração e Proteinase K e incubados a 55ºC over night. Após incubação o DNA foi
precipitado com isopropanol e ressuspendido com TE.
Para o modelo Largemyd, utilizou-se uma reação de PCR multiplex que amplifica o
alelo mutado e o alelo normal simultaneamente. Se o indivíduo for homozigoto para a
mutação, a reação amplifica apenas o alelo mutado (421 pb). Se ele for normal, apenas o
alelo normal (162 pb). Se for heterozigoto, os dois alelos são amplificados. Os
oligonucleotideos usados (Browning, 2005) nesta etapa estão no quadro 1. O resultado
desta reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de agarose 2%.
35
Quadro 1-Oligonucleotídeos
ligonucleotídeos utilizados pra genotipagem do modelo Largemyd.
Mouse wild type forward (MWTF) GGC CGT GTT CCA TAAA GTT CAA
Mouse wild type reverse (MWTR) GGC ATA CGC CTC TGT GAA AAC
Mutation forward (MUTF) ATC TCA GTC CCA AAG GGT GAAG
Mutation reverse (MUTR) GCC AAT GTA AAA TGA GGG GAA A
421pb
162pb
myd
Figura 10- Genotipagem dos camundongos Large . Eletroforese dos produtos
dutos do PCR multiplex em gel de
agarose 2% corado com brometo de etideo.
Para o modelo Lama2dyJ/J, utilizou-se

se uma reação de PCR que amplifica um
fragmento de 170pb contendo a mutação. Após o PCR é feito uma reação de digestão com
a enzima NDE1, pois esta mutação cria um sítio de restrição que é possível
poss digerir com
esta enzima. Após a eletroforese

elet dos produtos, se o indivíduo
duo for normal aparece uma
banda referente
nte ao alelo normal. Se o indivíduo
indivíduo for homozigoto para a mutação, aparecem
duas bandas referentes

rentes a digestão do alelo mutado. Se for heterozigoto,os dois alelos são
amplificados e o mutado é digerido, portanto aparecem três bandas. O resultado desta
reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de acrilamida.
377pb
213pb
164pb
dy-2J
Figura11- Genotipagem de Lama2 /J,, após digestão. Gel de acrilamida corado com brometo de etídio. 1-
1
camundongo normal; 2-
2 camundongo heterozigoto; 3- camundongo afetado.
36
Após a genotipagem, os animais afetados foram separados em nova gaiola para
envelhecerem até atingirem as idades requisitadas nos experimentos do laboratório.
Quando necessário são formados novos casais de heterozigotos. Os normais podem ser
destinados como indivíduo controle em alguns estudos.
Foram utilizados:
Seis camundongos SJL/J com 3 meses.

Cinco camundongos Largemyd com 3 meses.
Seis camundongos Lama2dy-2J/J com 3 meses.
Seis camundongos Dmdmdx com 3 meses.
Seis camundongos normais C57BL 3 meses.
Os indivíduos selecionados foram eutanaziados em cubas de CO2.
3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DOS

DOS MÚSCULOS
A partir de necropsia foram coletados diafragma e gastrocnêmio de cada animal.
Os fragmentos musculares foram destinados à histologia e a estudos moleculares.
3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS
Os fragmentos destinados a histologia foram crioprotegidos com talco,
subseqüentemente envoltos por resina Tissue-tec®(Sakura, Japão) e montados em uma
rolha de cortiça previamente identificada, mantendo as fibras musculares na orientação
vertical em relação à superfície da rolha. O conjunto foi congelado e armazenado em
nitrogênio líquido.
As lâminas de vidro foram cobertas com polilisina para aumentar a aderência do
corte histológico à lâmina.
Os fragmentos musculares foram seccionados transversalmente com espessura de
6μm num micrótomo criostato à temperatura de –25oC. Em seguida as lâminas foram
armazenadas em freezer –70oC.

37
3.5 HISTOLOGIA
3.5.1 Coloração de Hematoxilina-

Hematoxilina-Eosina (HE)
A coloração de HE permite analisar a morfologia das fibras musculares e dos
tecidos adjacentes, podendo-se observar se existe ou não hiperplasia, hipertrofia,
presença de regeneração/degeneração, estruturas anormais, entre outros. Esta reação foi
realizada de acordo com a descrita em Dubowitz, 1985.
3.5.2 Coloração com Picro Sirius ®
A coloração com Picro Sirius ® permite a visualização dos tecidos conjuntivos
perimisial e endomisial de tecidos musculares. Através de um microscópio óptico com
câmera fotográfica acoplada e conectada a um computador é possível fazer a
quantificação proporcional entre a área de tecido conjuntivo e a área total de um campo
selecionado. Esta reação foi realizada de acordo com as seguintes etapas:
Primeiramente as lâminas com os cortes histológicos ficam submersas por 20
minutos em Bouim para a fixação do tecido. Depois elas passam por um banho de água
corrente para retirar o excesso de Bouim. Em seguida são submersas em solução de Sirius
Red® com ácido pícrico. Após aproximadamente 30 minutos é feita a desidratação em
série de 2 minutos em cada desidratante seguinte: em álcool 90%, álcool 100%, solução
de álcool mais xilol e por ultimo xilol. As lâminas são retiradas uma por vez para serem
montadas com resina para montagem histológica e lamínula.
Para a quantificação utiliza-se o software KS 300 (2002) da Carl Zeiss, o qual
calcula a área relativa ao tecido conjuntivo (corado em vermelho) em relação à área total
do corte.
38
3.6 ESTUDOS MOLECULARES
Cada fragmento destinado a estudos moleculares foi congelado em nitrogênio
líquido, macerado com pistola em banho de nitrogênio líquido e dividido em duas partes,
uma para extração de proteínas e outra para extração de DNA e RNA.
3.6.1Extração
3.6.1Extração de RNA total
O RNA total foi extraído dos músculos coletados, a partir de material macerado com
pistola em banho de nitrogênio líquido e estocado também em nitrogênio líquido. A
extração de RNA do material pulverizado foi realizada com o reagente Trizol® (Invitrogen
Inc Brasil), conforme as especificações do fabricante. O RNA foi diluído em água tratada
com dietilpirocarbonato 0,01% (DEPC) (livre de ribonucleases) e guardado em freezer –
70oC.
3.6.2 Síntese de cDNA total
O RNA foi quantificado em espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm,
1 µg de RNA total foi utilizado para a síntese de cDNA, a qual foi realizada conforme
protocolo da enzima MMLV (Invitrogen).
3.6.3Análise
3.6.3Análise de Expressão da miostatina
Em um primeiro momento os cDNAs foram testados através da reação em cadeia
da polimerase convencional (PCR), com um par de “oligonucleotideos” que amplificam o
gene endógeno GAPDH. µ

De cada amostra 2 l. do produto de PCR foi misturado com o
mesmo volume de tampão de corrida e aplicado em gel de poliacrilamida. Como todos
amplificaram, foi feito o PCR Real Time para os pares de oligonucleotideos dos genes da
miostatina e do endógeno GAPDH.

39
3.6.4 PCR em Tempo Real (Q-

(Q-PCR)-
PCR)- quantificação relativa da expressão da miostatina
As amostras de cDNA foram aplicadas em triplicatas em placa ótica de 96 poços. A
cada amostra foi adicionado o par de primers do gene de interesse e o MasterMix contendo
Sybr Green (Applied Biosystems), num volume total de 25μL. A corrida das placas foi feita
no termociclador para Real-Time 7500 da Applied Biosystems.
Quadro2- Pares dos oligonucleotideos para amplificação do gene alvo da miostatina e o gene
endógeno GAPDH.
MIOSTATINA forward (MSTN F) AACCTTCCCAGGACCAGGAG
MIOSTATINA reverse (MSTN R) CATCGCAGTCAAGCCCAAAG
GAPDH forward AGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GAPDH reverse TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
Para quantificação relativa da expressão da miostatina, foi necessário realizar uma
curva padrão com diferentes diluições de um cDNA controle. Nesta etapa é determinado o
threshold, o qual é um valor arbitrário do limiar que determina o ciclo onde é medida a
fluorescência em cada reação (Ct). O valor Ct é usado pelo programa para calcular a
expressão de um gene da amostra alvo.
Os valores obtidos foram comparados quanto à sua significância estatística com o
auxílio do programa MiniTab. O teste realizado foi o não-paramétrico de Mann-Whitney.

40
4 RESULTADOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

AMOSTRA
Foram avaliados no total 36 animais, pertencentes a 5 diferentes linhagens: C57Bl,

SJL/J, Dmdmdx, Largemyd e Lama2dy2J/J,conforme ilustrado no Quadro 3. De acordo com os
resultados obtidos e da viabilidade de material, o número de animais nos diferentes testes
variou.
Quadro3- Animais avaliados por cada metodologia
SEMI QUANTITATIVO QPCR HISTOLOGIA

DIAFRAGMA GASTROCNÊMIO DIAFRAGMA GASTROCNÊMIO DIAFRAGMA GASTROCNÊMIO
C57Bl C19 C19
C20 C20 C 20 D C 20 G C20G
C21 C21D C21G
C22 C22 C22D C22G
C23 C23 C 23 D C 23 G C23D C23G
C24 C24 C 24 D C 24 G
C25 C25 C 25 G C25D C25G
C46 C46 C 46 D C 46 G C46D C46G
C47 C47 C 47 D C 47 G
C48 C48
SJL/J S1
S2 S2 S 2D S 2 G S2D
S3 S3 S 3D S 3 G S3D S3G
S7 S7 S 7D S 7 G S7D
Dmdmdx M8
M9 M9 M 9D M 9 G M9D M9G
M10 M18G
M25 M 25D M 25 G M25D M25G
M26 M26 M 26D M 26 G M26D M26G

41
M27 M27 M 27D M 27 G M27D M27G
M28 M28 M 28D M 28 G M28D M28G
M29 M29 M 29D M 29 G M29D M29G
Largemyd L118 L118 L 118D L 118 G L118G
L121 L121 L 121D L 121 G L121D L121G
L123 L123 L 123D L 123 G L123D L123G
L129 L129 L 129D L129D L129G
L130 L130 L 130D L 130 G L130G
L131
L132
Lama2dy2J/J 2J61 2J61 2J 61D 2J 61 G 2J61D 2J61G
2J69 2J69 2J 69 G 2J69G
2J70 2J70 2J 70 G 2J70D 2J70G
2J79 2J79 2J 79D 2J 79 G
2J88 2J88 2J 88D 2J 88 G 2J88D 2J88G
2J92 2J92 2J 92D 2J92D 2J92G
4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA

MIOSTATINA
4.2.1 Análise
Análise semiquantitiva.
A avaliação do nível de expressão da miostatina nos diferentes grupos de modelos
murinos para distrofias musculares, foi realizado através do método semiquantitativo, com
reações de PCR para amplificação do cDNA da miostatina em 27 e 30 ciclos. Utilizou-se
como gene endógeno o GAPDH. Um exemplo representativo do padrão de amplificação e
corrida em gel de acrilamida estão ilustrados na figura 12.

42
GAPDH
110pb
101pb
MSTN
Figura12-Exemplo de gel de acrilamida com produtos da amplificação do cDNA dos gene GAPDH(110pb)e
MSTN(101pb), com 27 e 30 ciclos, no músculo gastrocnêmio de 3 camundongos modelos. S6 e S7
mdx
são SJL/J, M28 é Dmd .
As bandas geradas foram quantificadas quanto à sua intensidade através do
software Scion Image. Os resultados estão apresentados no Quadro 4.
Quadro 4- Análise da intensidade das bandas resultantes da eletroforese dos produtos de PCR de
27 e 30 ciclos para os genes GAPDH e MSTN no músculo diafragma, quantificadas pelo
software Scion Image, e a relação MSTN/GAPDH entre as bandas de miostatina com
GAPDH.
DIAFRAGMA GASTROCNÊMIO
27 ciclos 30 ciclos 27 ciclos 30 ciclos
MSTN/GAPDH MSTN/GAPDH MSTN/GAPDH MSTN/GAPDH
C19 0,08 0,145 C19 0,265 0,296
C20 0,324 0,435 C20 0,278 0,258
C22 0,193 0,479 C21 0,375 0,219
C23 0,025 0,079 C22 0,135 0,366
C57BL C24 0,399 0,711 C23 0,349 0,332
C25 0,016 0,101 C24 0,186 0,299
C46 0,203 0,368 C25 0,414 0,471
C47 0,172 0,405 C46 0,285 0,335
C48 0,11 0,293 C47 0,235 0,567
C48 0,232 0,333
S2 0,176 0,49 S1 0,13 0,288
S3 0,241 0,527 S2 0,257 0,388
SJL/J S4 0,153 0,372 S3 0,211 0,409
S5 0,2 0,276 S4 0,252 0,448
S6 0 0,083 S5 0,322 0,5
S7 0,138 0,373 S6 0,181 0,234
43
S7 0,227 0,372
M9 0,18 0,423 M8 0,206 0,462
M25 0,109 0,464 M9 0,212 0,343
M26 0,15 0,258 M10 0,259 0,385
Dmdmdx M27 0,22 0,364 M25 0,288 0,439
M28 0,362 0,418 M26 0,156 0,401
M29 0,299 0,812 M27 0,367 0,384
M28 0,234 0,406
M29 0,152
L118 0,027 0,133 L121 0,24 0,303
L121 0,024 0,109 L123 0,146 0,328
Largemyd L123 0 L129 0,139 0,216
L129 0,154 0,183 L130 0,114 0,216
L130 0,135 0,372 L131 0,115 0,236
L132 0,183 0,381
L118 0,273 0,342
2J61 0,251 0,501 2J61 0,251 0,355
2J69 0,118 0,364 2J69 0,235 0,496
dy2J
Lama2 /J 2J70 0,281 0,377 2J70 0,193 0,286
2J79 0,186 0,506 2J79 0,161 0,317
2J88 0,131 0,503 2J88 0,32 0,376
2J92 0,322 0,636 2J92 0,257 0,295
Como esta técnica não demonstrou ser muito sensível para o número de ciclos
escolhidos para a reação de PCR, possivelmente porque algumas amostras atingiram as
proximidades do platô da curva de amplificação, decidimos selecionar apenas amostras
onde houvesse uma diferença na relação MSTN/GAPDH entre 27 e 30 ciclos de pelo
menos 0,100 unidades de medida.
Desta forma, identificamos 32 animais onde o teste foi considerado semiquantitativo.
Quadro5- relação de animais selecionados para a análise semiquantitativa da miostatina

(MSTN/GAPDH>0,100 unidades)
C20
C22 C22G
C24 C24G
C46
C47 C47G
C48 C48G
S1G
44
S2 S2G
S3 S3G
S4 S4G
S5G
S6
S7 S7G
M8G
M9 M9G
M10G
M25 M25G
M26 M26G
M27
M28G
M29
L123G
L118
L121
L130 L130G
L131G
2J61 2J61G
2J69 2J69G
2J70G
2J79 2J79G
2J88
L132G
2J92
As medidas das expressões semiquantitativas da miostatina foram agrupadas em
médias de cada grupo de animais e músculos e foi realizada analise por teste de Mann
Whitney, que não mostrou diferenças estatisticamente significativas entre os grupos
afetados, quando comparados ao controle conforme observado nas figuras13 e 14.

45
Figura 13-Comparação gráfica entre as médias das semiquantificações da expressão da miostatina dos
controles normais e animais afetados no diafragma.
mdx myd dy2J

C57BL SJL/J Dmd Large Lama2 /J
Figura 14- Comparação gráfica entre as médias das semiquantificações da expressão da miostatina dos
controles normais e animais afetados no gastrocnêmio.
4.2.2 Análise
Análise quantitativa da expressão
expressão da miostatina por PCR em tempo real (qRT-
(qRT-PCR)
4.2.2.1
4.2.2.1 Padronização da metodologia para os genes em estudo
Os pares de oligonulcleotideos GAPDH e MSTN passaram por uma padronização
prévia para a confirmação de sua especificidade e determinação da concentração ideal de
cDNA a ser utilizada nas reações seguintes no equipamento de Q-PCR.

46
Na figura 15 abaixo pode-se observar respectivamente: as curvas geradas pela
amplificação de 5 concentrações do cDNA controle: puro, 1:1, 1:3, 1:7, 1:15, para os pares
de oligonulcleotideos GAPDH e MSTN. Nesta etapa estabeleceu-se o threshold, o limiar
que intercepta a curva de amplificação no ciclo quantitativo, e posteriormente, as
informações dos valores do slope e do R2 de cada uma (Quadro 6). Esses valores revelam
respectivamente, a inclinação da curva e a eficiência da curva gerada, e são importantes
para os cálculos das quantificações das expressões.
GAPDH
Threshold
0.1948304
MSTN
Threshold
0.0896150
Figura 15-Curvas de amplificação para padronização do Q-PCR. No eixo X estão números de ciclos e no eixo
Y está a fluorescência emitida na amplificação. Foram testados pares de oligonulcleotideos GAPDH
e MSTN em cDNA de camundongo normal C57BL47 nas concentrações puro, 1:1, 1:3, 1:7 e 1:15.
Quadro 6- Valores obtidos do Threshold na padronização do PCR de tempo real. Slope:

inclinação da curva de amplificação e respectivo R2.
GENE Threshold
Slope R2
-
GAPDH 0.1948304 3,642031 0,996546
-
MSTN 0.08961505 3,633197 0,970398
47
4.2.2.2
4.2.2.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio do grupo controle
Para a análise relativa do qRT-PCR, deve-se determinar uma amostra que será
considerada como normalizadora para o grupo avaliado. Neste teste, determinamos a
média de ddCT de todas as amostras avaliadas, e definimos como normalizador a amostra
de valor mais próximo a esta média. Esta corresponde ao cDNA da amostra C57BL46D.
Os resultados da expressão relativa de cada amostra estão demonstrados no Quadro7, e a
distribuição, na figura 16.
Quadro7- Expressões relativas da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos animais
C57BL usados como controles normais.
Controles Expressão relativa
normais D e G ddCT da miostatina
C57BL 20 D 1,27 0,74
C57BL 23 D -0,09 1,15
C57BL 24 D 0,42 0,99
C57BL 46 D 3,72 0,00
C57BL 47 D 3,87 -0,04
C57BL 20 G 4,76 -0,31
C57BL 23 G 5,27 -0,47
C57BL 24 G 3,74 -0,01
C57BL 25 G 5,02 -0,39
C57BL 46 G 5,03 -0,39
C57BL 47 G 4,78 -0,32
Média 3,43
48
EXPRESSÃO RELATIVA DA MIOSTATINA NOS MÚSCULOS

DIAFRAGMA E GASTROCNÊMIO DE ANIMAIS CONTROLE
C57Bl
1,5
0,5
0
C57BL 20 D
C57BL 23 D
C57BL 24 D
C57BL 46 D
C57BL 47 D
C57BL 20 G
C57BL 23 G
C57BL 24 G
C57BL 25 G
C57BL 46 G
C57BL 47 G
-0,5
-1
Figura 16-Gráfico das expressões relativas da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio de animais
controle. Os dados foram normalizados para a amostra C57BL 46 D, a qual obteve valor mais
próximo da média das expressões entre os dois grupos musculares dos animais controles.
Os valores obtidos foram agrupados, obtendo-se a média para cada grupo. Os
resultados estão demonstrados na figura 17. Para verificar a significância entre as
diferenças apresentadas pelos valores de diafragma e gastrocnêmio das amostras
controles, foi feito o teste Mann-Whitney, em que observou-se diferença na expressão de
miostatina entre os músculos gastrocnêmio e diafragma nos animais normais (p<0,05).
MÉDIAS DAS EXPRESSÕES DOS MUSCULOS DIAFRAGMA E

GASTROCNÊMIO EM NORMAIS
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1 DIAFRAGMA
DIAPHRAGMA GASTROCNÊMIO
-0,2
-0,3
P= 0,0137
-0,4
Figura 17-Comparação gráfica entre as médias das expressões dos músculos diafragma e gastrocnêmio em
controles normais.
49
4.2.2.3 Análise da
da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos diferentes
grupos de animais distróficos
Como houve diferença significativa na expressão da miostatina no diafragma
quando comparado ao gastrocnêmio, decidimos realizar as análises dos dois músculos
de forma separada, mas continuando a usar como normalizador a mesma amostra do
controle normal C57BL46D, para permitir uma melhor comparação dos resultados. A
figura 18 mostra os resultados comparativos no músculo diafragma, e a figura 19, no
músculo gastrocnêmio. Todos os grupos experimentais apresentaram expressão mais
reduzida da miostatina em ambos os músculos.
DIAFRAGMA
1,5
0,5
0
SJL 2D
SJL 3D
SJL 4D
SJL 5D
SJL 6D
SJL 7D
MDX 25D
MDX 26D
MDX 27D
MDX 28D
MDX 29D
MDX 9D
LARGE 118D
LARGE 121D
LARGE 123D
LARGE 129D
LARGE 130D
C57BL 20D
C57BL 23D
C57BL 24D
C57BL 46D
C57BL 47D
2J 61D
2J 69D
2J 70D
2J 79D
2J 88D
2J 92D
-0,5
-1
-1,5
Figura18- Gráfico das expressões relativas da miostatina no músculo diafragma de todos os animais avaliados.
Os dados foram normalizados para a amostra C57BL46D.
Gastrocnêmio
0
SJL 2 G
SJL 3 G
SJL 4 G
SJL 5 G
SJL 6 G
SJL 7 G
MDX 25 G
MDX 26 G
MDX 27 G
MDX 28 G
MDX 29 G
MDX 9 G
LARGE 118 G
LARGE 121 G
LARGE 123 G
LARGE 130 G
C57BL 20 G
C57BL 23 G
C57BL 24 G
C57BL 25 G
C57BL 46 G
C57BL 47 G
2J 61 G
2J 69 G
2J 70 G
2J 79 G
2J 88 G
2J 92 G
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
Figura 19-Gráfico das expressões relativas da miostatina no músculo gastrocnêmio de todos os animais
avaliados. Os dados foram normalizados para a amostra C57BL46D.
50
Um novo gráfico (figura 20) foi construído para representar a média da expressão
relativa da miostatina de cada grupo muscular em cada linhagem. Assim foi possível
observar e comparar estes dados quanto às diferenças significativas entre os grupos
afetados e seus respectivos controles.
COMPARAÇÃO ENTRE AS MEDIAS DAS EXPRESSÕES RELATIVAS DA

MIOSTATINA COM O MESMO NORMALIZADOR
1,0
0,5
0,0
C57BL D SJL D MDX D LARGE D 2J D C57BL G SJL G MDX G LARGE G 2J G
-0,5
-1,0
-1,5
P = ** * * ** ** ** **
Figura 20-Comparação gráfica das médias das expressões relativas da miostatina entre diafragma e
gastrocnêmio por linhagem, com base na normalização dos dados para o valor da amostra
C57BL46D.*= P< 0,05 e ** = P<0,01
4.2.2.4 Teste com normalizador específico para cada

cada músculo
Para verificar se os resultados obtidos se confirmavam na análise de cada músculo
independentemente, estabeleceu-se o melhor normalizador controle para o músculo
diafragma (C5720D) e gastrocnêmio (C5720G), com base na média do ddCT de cada
músculo do grupo de camundongos normais (figuras 21 e 22).

51
DIAFRAGMA - normalizador específicoC57BL20D

1
0,5
2J 61D
2J 69D
2J 70D
2J 79D
2J 88D
2J 92D
C57BL 20D
C57BL 23D
C57BL 24D
C57BL 46D
C57BL 47D
SJL 2D
SJL 3D
SJL 4D
SJL 5D
SJL 6D
SJL 7D
MDX 25D
MDX 26D
MDX 27D
MDX 28D
MDX 29D
MDX 9D
LARGE 118D
LARGE 121D
LARGE 123D
LARGE 129D
LARGE 130D
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
Figura 21- Gráfico das expressões relativas da miostatina no músculo diafragma dos controles normais e
animais afetados. Estes dados foram normalizados para a amostra C57BL 20 D, a qual obteve
valor mais próximo da média das expressões neste grupo muscular entre os animais controles.
GASTROCNÊMIO - normalizador específico C57BL20G

0,5
0
C57BL 20 G
C57BL 23 G
C57BL 24 G
C57BL 25 G
C57BL 46 G
C57BL 47 G
SJL 2 G
SJL 3 G
SJL 4 G
SJL 5 G
SJL 6 G
SJL 7 G
MDX 25 G
MDX 26 G
MDX 27 G
MDX 28 G
MDX 29 G
MDX 9 G
LARGE 118 G
LARGE 121 G
LARGE 123 G
LARGE 130 G
2J 61 G
2J 69 G
2J 70 G
2J 79 G
2J 88 G
2J 92 G
-0,5
-1
-1,5
-2
Figura 22- Gráfico das expressões relativas da miostatina no músculo gastrocnêmio dos controles normais e
animais afetados. Estes dados foram normalizados para a amostra C57BL 20 G, a qual obteve valor
mais próximo da média das expressões neste grupo muscular entre os animais controles.
0
MDXD
C57BLD
SJLD
LARGED
2JD
C57BlG
SJLG
MDXG
LARGEG
2JG
-0,5
-1
-1,5
P = ** ** * ** P = ** ** **
-2
Figura 23- Gráfico comparativo das expressões relativas da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio
entre os controles normais e animais afetados.
52
Os resultados desta comparação confirmaram que as amostras são
significativamente diferentes e que a expressão de miostatina é menor nos dois músculos
com exceção do músculo gastrocnêmio da linhagem Largemyd.
4.2.2.5 Aná
Análise da miostatina por linhagem (diafragma + gastrocnêmio)
Para comparar as linhagens quanto à expressão relativa da miostatina geral foi feito
um gráfico somando os dados obtidos nos dois grupos musculares (figura 24).
mdx myd dy2J

C57BL SJL/J Dmd Large Lama2 /J
/J
P= 0,001 0,002 0,017 0,001
Figura 24-Comparação gráfica das médias das expressões relativas da miostatina dos músculos diafragma e
gastrocnêmio por linhagem, com base na normalização dos dados para o valor da amostra
C57BL46D.
Como visto anteriormente os controles normais C57BL apresentaram maiores níveis
da expressão da miostatina, enquanto em todas as linhagens de camundongos afetados, a
miostatina está aparentemente mais inibida.
4.2.2.6 Análise
Análise comparativa da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio em
cada linhagem distrófica (um só normalizador – C5746D)
Para cada grupo de modelos murinos, fizemos uma analise comparativa da
expressão da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio. Todos os modelos
murinos apresentaram uma redução da expressão quando comparados com os normais,
sem diferenças no tipo de músculo, conforme pode ser observado na figura 25. Não houve
53
diferença na expressão de miostatina entre diafragma e gastrocnêmio nas linhagens. No
2J a diferença é significativa (p<0,05).
COMPARAÇÃO ESTATÍSTICA ENTRE AS EXPRESSÕES DA MIOSTATINA NOS

MÚSCULOS DIAFRAGMA E GASTROCNÊMIO DE CADA LINHAGEM
C57BL SJL/J Dmdmdx Largemyd Lama2dy2J/J
P= 0,01 0,17 0,09 0,39 0,02

Figura 25-Médias das expressões relativas da miostatina comparadas por grupo muscular em cada linhagem.
4.3 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
A análise histopatológica dos músculos gastrocnêmio e diafragma de cada animal
foi feita em lâminas com coloração HE. Os critérios de avaliação se basearam na
definição do grau de degeneração e regeneração, conforme descrito por Dubowitz,et al.,
2007.
Nesta análise, verificou-se: a variação no calibre das fibras e na forma (+ normal,
++ pouca variação, +++ muita variação), Presença de tecido conjuntivo perimisial e
endomisial (+ normal, ++ pouca substituição, +++ muita substituição), fibras fendidas (0
nenhuma, + de 1-3 fibras, ++ mais ) fibras centronucleadas, necrose, Fibras basofílicas
em regeneração (0 nenhuma, + uma a 3 fibras, +++ mais que 3 fibras).
Os resultados obtidos estão representados na figura 26.
Os dados qualitativos foram convertidos em números, e foi calculada a média de
cada variável em cada linhagem(Quadro 8).

54
Quadro 8-Avaliação das características musculares de degeneração e regeneração na histologia

dos músculos diafragma e gastrocnêmio por amostra.
DEGENERAÇÃO REGENERAÇÃO
ANIMAL
VARIAÇÃO DE TECIDO FIBRAS NÚCLEOS FIBRAS
CALIBRE FORMA CONJUNTIVO FENDIDAS CENTRAIS NECROSE BASOFÍLICAS
C57BL
DIAFRAGMA
C21D + + + 0 + 0 0
C22D + + ++ 0 + + 0
C23D + + + 0 + 0 0
C25D + + + 0 + 0 0
C46D + + + 0 0 0 0
GASTROCNÊMIO
C20G + + + 0 0 0 0
C21G + + + 0 0 0 0
C22G + + + 0 0 0 +
C23G + + + 0 + 0 0
C25G + + + 0 + ++ 0
C46G + + + + ++ + 0
SJL/J
DIAFRAGMA
S2D ++ + + + + ++ 0
S3D + + + + + + 0
S4D + ++ + 0 + 0 0
S5D + ++ + + + + 0
S6D + ++ + 0 + 0 0
S7D + ++ + 0 0 0 0
GASTROCNÊMIO
S3G ++ + + 0 + ++ 0
S4G ++ + + 0 + ++ +
S5G + + + 0 + + 0
S6G + + + 0 + ++ 0
mdx
Dmd
DIAFRAGMA
M25D +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++
M26D +++ ++ +++ + +++ +++ +++
M27D +++ +++ ++ + +++ + +
M28D +++ +++ ++ 0 ++ 0 0
M9D +++ +++ +++ ++ +++ + +
M29D +++ +++ ++ + +++ 0 0
GASTROCNÊMIO
M9G +++ + + 0 +++ ++ ++
55
M18G +++ + + 0 +++ 0 0

M25G +++ ++ + 0 +++ ++ ++
M26G +++ ++ ++ + +++ + +
M27G +++ ++ + + +++ 0 0
M28G +++ ++ ++ + +++ ++ ++
M29G +++ ++ ++ ++ +++ 0 0
myd
Large
DIAFRAGMA
L121D +++ +++ + + +++ + 0
L123D +++ +++ +++ ++ +++ +++ 0
L129D +++ +++ +++ +++ +++ ++ 0
GASTROCNÊMIO
L118G +++ + ++ 0 +++ + ++
L121G +++ ++ +++ + +++ ++ +
L123G +++ ++ ++ + +++ ++ +
L129G +++ ++ +++ 0 +++ +++ ++
L130G +++ +++ +++ + +++ + 0
dyJ
Lama2 /J
DIAFRAGMA
2J61D ++ + ++ + + + 0
2J70D +++ ++ ++ 0 + + 0
2J88D ++ ++ ++ 0 + +++ +
2J92D ++ +++ ++ 0 + ++ ++
GASTROCNÊMIO
2J61G +++ +++ +++ +++ ++ ++ 1,00
2J69G +++ +++ +++ +++ ++ ++ 1,00
2J70G +++ +++ ++ + + +++ 1,00
2J88G +++ ++ +++ 0 ++ ++ 1,00
2J92G +++ +++ ++ 0 ++ + 2,00
56
Quadro 9- Avaliação das características musculares de degeneração e regeneração na histologia

dos músculos diafragma e gastrocnêmio por linhagem
DEGENERAÇÃO REGENERAÇÃO
ANIMAL
VARIAÇÃO TECIDO FIBRAS NÚCLEOS MÉDIA FIBRAS
DE CALIBRE FORMA CONJUNTIVO FENDIDAS CENTRAIS NECROSE TOTAL BASOFÍLICAS
C57BL
DIAFRAGMA 1,00 1,00 1,20 0,00 0,80 0,20 0,70 0,00
GASTROCNÊMIO 1,00 1,00 1,00 0,17 0,67 0,50 0,72 0,17
SJL/J
DIAFRAGMA 1,17 1,67 1,00 0,50 0,83 0,67 0,97 0,00
GASTROCNÊMIO 1,50 1,00 1,00 0,00 1,00 1,75 1,04 0,25
mdx
Dmd
DIAFRAGMA 3,00 2,83 2,33 1,17 2,67 1,17 2,19 0,50
GASTROCNÊMIO 3,00 1,71 1,43 0,71 3,00 1,00 1,81 1,43
myd
Large
DIAFRAGMA 3,00 3,00 2,33 2,00 3,00 2,00 2,56 0,00
GASTROCNÊMIO 3,00 2,00 2,60 0,60 3,00 1,80 2,06 1,40
dyJ
Lama2 /J
DIAFRAGMA 2,25 2,00 2,00 0,25 1,00 1,75 1,54 0,75
GASTROCNÊMIO 3,00 2,80 2,60 1,40 1,80 2,00 2,11 1,20
57
Figura 26- Diafragma e gastrocnêmio em cortes histológicos transversais feitos em micrótomo criostato com
espessura de 6um , corados com HE. Observa-se no controle normal a presença de fibras com
calibre semelhante, citoarquitetura com angularidade entre as fibras, fino tecido conjuntivo entre as
58
fibras, núcleos periféricos. Nos músculos dos animais modelos observa-se fibras de calibre
variado, perda da citoarquitetura angular, infiltração de tecido conjuntivo, núcleos centrais,
mdx
necrose. No modelo SJL/J e no gastrocnêmio do Dmd essas observações são menos
expressivas e muitas vezes ausentes.
DEGENERAÇÃO
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
DIAFRAGMA
DIAFRAGMA
DIAFRAGMA
DIAFRAGMA
DIAFRAGMA
C57BL
GASTROCNÊMIO
SJL/J
GASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIO
Dmdmdx
Largemyd
Lama2dyJ/J
Figura 27-Distribuição comparativa dos dados de degeneração nos músculos diafragma e gastrocnêmio em
cada uma das linhagens
Segundo as avaliações histológicas, entre os afetados o músculo mais degenerado
foi o diafragma da linhagem Largemyd e o menos degenerado foi o diafragma da linhagem

SJL/J.
REGENERAÇÃO
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
DIAFRAGMA
DIAFRAGMA
DIAFRAGMA
DIAFRAGMA
DIAFRAGMA
C57BL
GASTROCNÊMIO
SJL/J
GASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIO
Dmdmdx
Largemyd
Lama2dyJ/J
Figura 28-Distribuição comparativa dos dados de regeneração nos músculos diafragma e gastrocnêmio em
cada uma das linhagens.
Segundo as avaliações histológicas, a regeneração foi registrada pela presença de
fibras basofílicas e entre os afetados o músculo que mais apresentou este tipo celular foi o
gastrocnêmio da linhagem Dmdmdx. Nos músculo diafragma das linhagens SJL/J e Largemyd
estas fibras não foram encontradas.
59
Como um dos objetivos do presente trabalho é verificar a relação da expressão da
miostatina dentro dos modelos distróficos comparando com o padrão de degeneração e
regeneração apresentado por eles, em seguida a análise histológica, foi feito a
comparação das expressões relativas da miostatina nos dois músculos com a
degeneração e em outro gráfico com a regeneração.
A degeneração foi avaliada de acordo com as características histológicas que
indicam degeneração como necrose, substituição de tecido muscular por tecido conjuntivo,
variação de calibre das fibras e perda da angularidade das fibras. A regeneração foi
avaliada de acordo com a presença de fibras basofílicas que são típicas de fibras em
regeneração.
MSTN E DEGENERAÇÃO -DIAFRAGMA MSTN E DEGENERAÇÃO-GASTROCNÊMIO

3,00 2,50
2,50 2,00
2,00
1,50
1,50
1,00
1,00 DEGENERAÇÃO DEGENERAÇÃO
0,50 0,50
MSTN MSTN
0,00 0,00
-0,50 -0,50
-1,00
-1,00
-1,50
Figura 29- Comparação da expressão relativa da miostatina com a degeneração no músculo diafragma e
gastrocnêmio.
MSTN E REGENERAÇÃO -DIAFRAGMA MSTN E REGENERAÇÃO -GASTROCNÊMIO
1,00 2,00
1,50
0,50 1,00
REGENERAÇÃO 0,50 REGENERAÇÃO
0,00
MSTN 0,00 MSTN
-0,50 -0,50
-1,00
-1,00 -1,50
Figura 30-Comparação da expressão relativa da miostatina com a regeneração no músculo diafragma e

gastrocnêmio.
Nos gráficos onde a expressão relativa da miostatina é comparada com a
degeneração nos modelos murinos observa-se que onde há degeneração aumentada a
expressão da miostatina está inibida.

60
Não foi possível observar alguma relação de aumento ou inibição na expressão
relativa da miostatina com a regeneração nos modelos murinos.

61
5 DISCUSSÃO
5.1 A MIOSTATINA
MIOSTATINA COMO ALVO PARA TERAPIAS
Desde a identificação da mutação no gene da miostatina como responsável pela
musculatura dupla em bovinos (Grobet, 1997), muitas estratégias tem sido desenvolvidas
para estimular o crescimento muscular através de interferência na expressão da proteína
miostatina (Patel, 2005). A primeira tentativa de inibição da miostatina ocorreu em 1997
quando McPherron et al. produziram um camundongo knockout para miostatina. Nas
analises histológicas destes camundongos, foi revelado que o aumento da massa muscular
ocorreu devido à hiperplasia e à hipertrofia das fibras musculares, sugerindo um importante
papel da miostatina no controle do crescimento muscular.
Posteriormente, diversos métodos foram testados para inibir a miostatina, incluindo a
produção de animais geneticamente modificados com mutações no gene da miostatina, ou
animais com expressão de RNA antisense da miostatina ou através do uso de anticorpos
anti-miostatina. Wagner et al.(2002) geraram um camundongo Dmdmdx deficiente em
miostatina pelo cruzamento do camundongo Dmdmdx com o camundongo nulo para
miostatina. O camundongo gerado tinha aumento de massa e força muscular, por outro
lado não teve redução significativa de necrose ou inflamação. Bogdanovich et al.(2002)
também observaram uma melhora funcional no camundongo Dmdmdx, mas com o uso de
anticorpos anti-miostatina.
Recentemente um anticorpo anti-miostatina (MYO-029) foi administrado a pacientes
com distrofias do tipo Becker (BMD), Facioescapulohumeral (FSHD) e das Cinturas
(LGMD), com o objetivo de testar a tolerância e a segurança deste anticorpo. O teste
clínico que está em fase I/II demonstrou que a droga usada, MYO-029 era segura
(Wagner et al., 2008).
Magee et al.(2006) obtiveram resultados positivos após administração de siRNA
em ratos: 27% do mRNA da miostatina foi suprimido, causando um aumento de 10% da
massa muscular esquelética. Este estudo comprovou sugestão anterior de que o sistema
de RNAi oferece a possibilidade de controlar e silenciar genes eficientemente, e deveria
ser explorado como metodologia de silenciamento da miostatina. (Novina e Sharp, 2004).

62
Existem muitas doenças em que a perda muscular ou a falta de desenvolvimento
do músculo são a conseqüência direta ou efeito secundário da doença, e a miostatina
parece estar envolvida. Como nos estudos com homens HIV positivos, Gonzalez-Cadavid
et al.(1998) correlacionou a perda de massa muscular com a concentração sérica de
miostatina. Eles observaram que quanto maior a perda muscular maior a concentração de
miostatina.
Portanto, a inibição da miostatina parece ser um ponto chave na ajuda da
manutenção muscular em doenças com perda de massa muscular. Porem, há muito o que
estudar em relação aos mecanismos que envolvem sua ação no músculo normal e
distrófico.
Desta forma, com o objetivo de procurar uma relação entre a expressão da
miostatina e o processo de degeneração/regeneração observado nas distrofias
musculares, sem a interferência de agentes externos para sua inibição ou ativação, foi feita
a comparação da expressão relativa da miostatina nos modelos murinos Dmdmdx, SJL/J,

Largemyd e Lama2dyJ/J, nos músculos diafragma e gastrocnêmio, e analise histológica
quanto ao grau de degeneração e regeneração destes músculos.
5.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com
características já observadas em doenças hereditárias enquanto outros são modificados
geneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas semelhantes
às observadas em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos
genéticos, clínicos, histopatológicos e terapêuticos ajudando na compreensão da origem
das doenças e suas manifestações nos indivíduos afetados (Vainzof et al , 2008). . Neste
estudo, incluímos quatro modelos para distrofias musculares, pois cada um apresenta
mutação em gene que codifica proteína diversa, com localização variável nos
compartimentos da fibra muscular.
A mutação no gene DMD leva à ausência da proteína distrofina na região sub-
sarcolemal da fibra muscular, provocando em humanos a Distrofia Muscular de Duchenne
que é a forma mais comum das doenças neuromusculares em crianças. A ausência desta
63
proteína também foi observada em camundongos, que assim como os pacientes com
DMD, apresentam uma mutação recessiva no cromossomo X. Estes camundongos
pertencem a linhagem Dmdmdx, tem curso de vida normal e podem sobreviver até mais que
2 anos (http://jaxmice.jax.org/strain/001801.html). São rotineiramente usados como
modelo animal molecular e histopatológico para a doença, mas não como modelo clínico.
A miopatologia do camundongo Dmdmdx é muito menos grave quando comparada ao
curso da doença em humanos pois os camundongos afetados não apresentam a fraqueza
observada em pacientes com DMD. Por histologia é possível verificar que os músculos
posteriores do camundongo Dmdmdx conseguem compensar a falta de distrofina, enquanto

o diafragma se torna progressivamente afetado e pode ser comparado pela semelhança
aos músculos degenerados de pacientes com DMD (Rouger et al., 2002). A explicação
para esta diferença ainda não foi esclarecida. Por isso investigamos a histologia muscular
e a expressão da miostatina no camundongo Dmdmdx nos músculos diafragma e
gastrocnêmio. Escolhemos o gastrocnêmio por ser um músculo posterior de composição
heterogênea de fibras rápidas e lentas (Delp e Duan, 1996). Os resultados histológicos do
presente trabalho foram concordantes com o padrão de degeneração e regeneração dos
dois músculos nesta linhagem, havendo uma maior degeneração no diafragma, e uma
maior regeneração no músculo gastrocnêmio.
O camundongo SJL/J é um modelo natural para diferentes doenças humanas.
Devido a uma mutação identificada no gene da disferlina (Bittner et al., 1999) ele
apresenta uma redução média de 85% nos níveis desta proteína no sarcolema das fibras
musculares, tornando-o um bom modelo para LGMD2B (Vainzof et al., 2003). Ele tem
expectativa de vida ligeiramente reduzida sendo de 472 dias para os machos e 395 para
as fêmeas, mas de um modo geral, o padrão de fraqueza muscular é leve (Storer, 1966).
Os machos dessa linhagem são conhecidos por serem agressivos (Page e Glenner, 1972).
Em concordância que o quadro clínico é leve, a analise histológica do camundongo SJL/J

mostrou alterações muito discretas.
Existem muitos modelos para as distrofias musculares congênitas relacionados com
defeitos em proteínas da lâmina basal, e já foram identificadas mutações distintas no gene
LAMA2, codificante da cadeia α2 da laminina 2 em diversos destes modelos. Algumas
mutações levam à ausência total da proteína α2-laminina, enquanto outras levam à

64
.
deficiência parcial desta proteína (Vilquinet al , 1999; Vilquinet al , 2000). . Em ambos os
casos, há presença de uma distrofia muscular com comprometimento muscular variando
de grave a extremamente severo. O camundongo Lama2dyJ/J é modelo para DMC1A
(Jackson Laboratories),tem expectativa de vida normal e significante fraqueza muscular,
que também foi comprovada na análise histopatológica realizada.
Uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma DMC1D, foi associada a
mutações no gene LARGE. Este gene está envolvido na glicosilação da proteína α-DG,
membro essencial na formação e funcionamento do complexo DGC muscular. O
camundongo Largemyd, com defeito na via de glicosilação da proteína α-DG, é modelo da
DM congênita tipo 1D. Histologicamente foi observado grande infiltração de tecido
conjuntivo, fibras com calibre bastante variado e citoarquitetura muito afetada. O padrão
de degeneração foi significativo tanto no músculo gastrocnêmio como diafragma, mas de
forma interessante, só se observou um pouco de regeneração no músculo gastrocnêmio.
5.3
5.3 ESTUDO DA EXPRESSÃO RELATIVA DA MIOSTATINA NO MÚSCULO
5.3.1 Escolha do gene endógeno
A seleção de um gene endógeno para avaliar a expressão da miostatina envolve a
escolha de gene que mantém a expressão inalterada tanto no músculo diafragma como no
gastrocnêmio, em todas as linhagens estudadas. O gene ideal de referencia é aquele que
é expresso no mesmo nível em todas as amostras, não importando o tipo de tecido,
estágio da doença, medicação ou condições experimentais (Suzuki et al., 2000). No
entanto, muitos estudos mostraram que a expressão de genes normalmente usados como
referência, variam com o tipo de tecido e com o seu estado fisiológico (Thellin et al.,1999).
O gene GAPDH é um gene endógeno vastamente utilizado em estudos de
expressão, e foi usado como normalizador endógeno no estudo da expressão da
miostatina em fetos bovinos (Milazzoto, 2006). Além disso, este gene foi também utilizado
com sucesso em estudos realizados em nosso laboratório, no trabalho de mestrado de
Paula Onofre-Oliveira (2009), onde o gene GAPDH apresentou a menor variação da

65
expressão nos diferentes modelos e músculos analisados. Portanto, foi escolhido como
controle endógeno para os nossos experimentos posteriores.
5.3.2 Analise Semi quantitativa da miostatina
Enquanto aguardávamos a implantação da analise da expressão gênica por técnica
de PCR em tempo real, realizamos a analise semi-quantificativa da expressão da
miostatina, avaliando o padrão de amplificação por PCR, utilizando diferentes números de
ciclos. Optamos pela analise em 27 e 30 ciclos pois como a miostatina é um gene pouco
expresso, esperávamos obter nestes ciclos, valores de amplificação localizados na parte
exponencial da curva de amplificação. Se as amostras atingissem essa região da curva,
seria possível detectar quantidades diferentemente amplificadas entre os produtos de
PCR. Porém, quando feita a relação entre as intensidades das bandas da miostatina e do
GAPDH, e a comparação estatística pelo teste Mann-Whitney, em grande parte das
amostras estudadas obtivemos um padrão de amplificação similar com os 2 valores de
ciclos utilizados, sugerindo que a metodologia não estava permitindo uma análise
quantitativa. Mesmo quando realizamos a analise somente nas amostras onde houve
diferença de amplificação entre estes ciclos, não encontramos diferenças significativas
entre os controles normais e os afetados de cada grupo muscular. Portanto, este
procedimento não foi informativo.
5.3.3
5.3.3 Analise por PCR em tempo real
O qPCR foi realizado de acordo com as instruções do equipamento 7500 Applied
Biosystems. Primeiramente a curva padrão serviu para estabelecer os valores de threshold

de cada gene. O threshold é o limiar que corta a curva de amplificação na região onde as
reações se tornam quantitativas. Com esse valor estabelecido é possível calcular nas
futuras reações a expressão de cada amostra.
Os valores obtidos da expressão da miostatina estão vinculados à sua relação ao
gene endógeno do mesmo músculo e animal, sendo, portanto, uma expressão relativa.
Além disso, é necessária a escolha de uma amostra considerada padrão, ou

66
normalizadora, para que a expressão das amostras teste sejam calculadas em relação a
esta. Para a escolha do normalizador, que precisa ser uma única amostra das testadas,
calculamos a média de expressão do grupo controle, incluindo tanto as amostras dos
músculos gastrocnêmio como de diafragma, e foi escolhido um normalizador com valor de
expressão mais próximo deste valor médio. Desta forma, a comparação da expressão
nos dois músculos nos camundongos controle foi realizada com a amostra C57Bl46D
(Quadro 7).
5.3.3.1 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio do grupo controle
Na análise comparativa dos músculos gastrocnêmio e diafragma de camundongos
normais, encontramos a expressão relativa da miostatina mais inibida no gastrocnêmio em
comparação ao diafragma, que foi estatisticamente significativa (figura 17).
A diferença poderia ser explicada pela anatomia e funções heterogêneas destes
músculos. O músculo gastrocnêmio origina-se no fêmur e caudalmente se une ao tendão
do músculo sóleo (Hebel et al.,1983). Ele atua na flexão dos pés para baixo e também
agindo na flexão dos joelhos. Está principalmente relacionado com a locomoção e postura.
É um músculo mais exposto e sujeito a sofrer danos causados por movimentação e
exercícios. Danos à fibra muscular após exercício levam normalmente à desorganização
na estrutura das fibras musculares, mais especificamente a ruptura, alargamento ou
prolongamento da linha Z (Friden e Lieber, 1992; Clarkson e Newham, 1995), visto que a
linha Z do sarcômero é o ponto de contato das proteínas contráteis, fornecendo suporte
estrutural para a transmissão de força quando as fibras musculares são encurtadas
(Mchugh, 2003). As alterações no músculo sob trauma ativam uma cascata de citosinas,
estimulando a sua regeneração.
O diafragma pode sofrer dano muscular de outra forma, quando ocorre ventilação
forçada. Sobretudo em indivíduos suscetíveis a miopatias, distrofias musculares e sepse
(Hamid et al., 2005). O diafragma difere em função e anatomia do músculo gastrocnêmio
pois é o único entre os músculos esqueléticos em que as fibras radiam a partir do tendão
central para se inserirem perifericamente nas estruturas esqueléticas (Hamid et al., 2005).
Seu papel é relacionado com a respiração. Quando as fibras são estimuladas durante a
67
inspiração, elas são tensionadas e se encurtam, provocando a expansão da cavidade
torácica no eixo craniocaudal, então a pressão pleural diminui, conseqüentemente o ar
preenche o espaço alveolar dos pulmões. Secundariamente ocorre um deslocamento das
vísceras abdominais e um aumento da pressão abdominal, que por sua vez empurra a
parede do ventre para fora (Hamid et al., 2005).
Para que algum dano ocorra nas fibras do gastrocnêmio basta um movimento
diferente ou mais forçado. Por outro lado, o diafragma apresenta contração ritmada e
constante, sendo necessária uma intervenção como a ventilação forçada para causar uma
lesão. Portanto, um maior controle para a inibição da miostatina no músculo gastrocnêmio
normal é importante para que as células satélites entrem em proliferação, e atuem para a
reconstrução de eventuais lesões nas fibras lesionadas. Estes dados são compatíveis com
resultados da literatura em que a miostatina está mais inibida em músculos de indivíduos
submetidos a treinamento e exercício físico (Chargé e Rudnik, 2003; Ruth et al., 2003; Kim
et al., 2005; Muniz, 2005). Como exemplo recente Matsakas et al.(2006) encontraram
inibição da miostatina no músculo gastrocnêmio de ratos sujeitos a natação.
Em patologias humanas como a doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD),
estudos que comparam as vias de sinalização no músculo diafragma com o músculo
quadriceps indicam que o balanço entre a sinalização de atrofia e hipertrofia entre
músculos respiratórios e músculos inferiores é heterogeneo. (Doucet et al., 2010).
Portanto, os mecanismos de degeneração e regeneração da musculatura esquelética
e do músculo diafragma aparentemente obedecem a vias de regulação diversas.

gastrocnêmio dos camundongos
afetados
Nas quatro linhagens distróficas analisadas, observamos que a expressão relativa da
miostatina, tanto nos músculos gastrocnêmio como no diafragma, estava
significativamente inibida em relação aos respectivos músculos dos camundongos
normais. Esta diferença foi significativa em todos, com exceção do músculo
gastrocnêmio da linhagem Largemyd. Comparando-se todas as linhagens entre si, não
houve diferença significativa, mostrando que em todos os processos distróficos,

68
independentemente do defeito molecular primário, ocorre um estímulo para a inibição da
miostatina.
O fato de ter encontrado menor inibição na expressão relativa da miostatina na
linhagem Largemyd, apesar do músculo gastrocnêmio desta linhagem ser um dos mais
afetados pela degeneração, complementa os dados encontrados por Onofre (2009). Neste
trabalho, foi observada baixa expressão dos genes MyoD e Myf5 nos camundongos
Largemyd, sugerindo baixa atividade proliferativa das células-satélite nestes animais
.
(Yablonka-Reuveniet al , 2008). Se há pouca inibição da miostatina, as células satélites
não são estimuladas a se diferenciarem, expressando os fatores MyoD e Myf5 para
repararem o músculo, resultando num quadro histopatológico muito grave como observado
na histologia. O mecanismo que está defeituoso nesta linhagem é o da glicosilação da α-
distroglicana. Estudo realizado em camundongo knockout temporal para a proteína α-

distroglicana mostrou que como resultado do silenciamento deste gene no músculo,
houve uma intensa degeneração, mas regeneração surpreendente. Isto porque o gene da
α-distroglicana não estava silenciado nas células satélites e estas conseguiram reparar o
músculo. A partir destes resultados os autores sugerem que um mecanismo de glicosilação
da α-DG funcional constitui importante requisito para o bom funcionamento e renovação
das células-satélite (Cohn et al ., 2002).

Por causa das já descritas diferenças no padrão de degeneração e regeneração dos
músculos diafragma e gastrocnêmio no camundongo Dmdmdx, comparamos as expressões
relativas da miostatina nestes músculos neste modelo bem como nas demais linhagens
distróficas. Também não encontramos diferenças significativas na inibição da miostatina
nos músculos diafragma e gastrocnêmio de cada linhagem, indicando que
independentemente do defeito molecular primário que leva a distrofia muscular nestes
modelos, em todos ocorre a inibição da miostatina em relação ao músculo normal. Pode-
se justificar que a fibra em estado de degeneração tenta regenerar, e para que isto ocorra
a miostatina deve estar inibida para que as células satélites possam reparar o dano
muscular.
Lembrando que embora não houve diferenças significativas nas expressões relativas
da miostatina entre os camundongos afetados nos músculos diafragma e gastrocnêmio,
ela estava diferente no controle. Portanto, para avaliar este efeito, escolhemos um
69
normalizador para cada músculo (o valor médio encontrado no grupo controle) e fizemos
as comparações das linhagens separadas por grupo muscular. O resultado se repetiu,
confirmando as observações originais.
5.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓ

HISTOPATOLÓGICA
A coloração de HE permite analisar a morfologia das fibras musculares e dos tecidos
adjacentes, podendo-se observar se existe ou não degeneração, necrose, fibras fendidas,
fibras centronucleadas, e regeneração visualizada através de fibras pequenas basofílicas.
Estas variáveis foram quantificadas em cruzes, em função de maior freqüência, ou
predomínio em cada músculo, nas quatro linhagens, e comparadas a controles normais da
mesma idade.
Os resultados da analise histopatológica do presente trabalho, mostraram no
músculo gastrocnêmio e no diafragma dos camundongos Dmdmdx a presença de muitas
fibras com núcleos centrais com padrão de degeneração muito grande em ambos os
músculos, quando comparados com os controles normais. Por outro lado, as fibras
basofílicas, que são indicativas de intensa regeneração muscular, mostraram um padrão
de regeneração mais significativo no músculo gastrocnêmio do que no diafragma,
resultados compatíveis com a literatura (DiMarioet .

al , 1991). Diversos trabalhos da
literatura tem mostrado neste modelo deficiente em distrofina, que os músculos envolvidos
na locomoção sofrem processo de degeneração, mas com um pico de regeneração ao
redor dos 2 meses de idade, que leva a melhor preservação destes músculos (Anderson
et al., 1988). Já o músculo diafragma não passaria por este processo de regeneração,
apresentando, portanto, características mais acentuadas de degeneração (Louboutin et al.,
1993).
No camundongo SJL/J, em concordância com o seu quadro clínico leve, a análise
histológica mostrou a presença de discreta variação de calibre das fibras e um pequeno
aumento do tecido conjuntivo. Tanto o padrão de degeneração, como o de regeneração
foram muito próximos aos observados nos camundongos normais. Os resultados são
semelhantes aos encontrados por Bittner et al . (1999). Os achados histopatológicos leves

são compatíveis com os dados da literatura que descrevem uma progressão lenta da
70
doença, distribuição da fraqueza muscular predominante nos músculos proximais à cintura
pélvica, enquanto que a cintura escapular é discretamente afetada ao longo do tempo. Nos
estágios iniciais as mudanças distróficas podem ser mínimas, já nos estágios mais tardios
ocorre substituição de tecido muscular por tecido adiposo, alem de fibras fendidas, núcleos
centrais e necrose. (Urtizberea et al., 2008). Considerando-se que os músculos estudados
não são os predominantemente afetados na LGM2B, e a idade dos animais estudados (3
meses) os classifica como jovens adultos, os dados histopatológicos são compatíveis
com os esperados para músculos não acometidos gravemente.
No modelo Lama2dyJ/J que tem significante fraqueza muscular (Jackson
Laboratories), a análise histológica mostrou uma intensa degeneração e maior
regeneração no músculo gastrocnêmio do que no diafragma, compatíveis com o grau de
fraqueza observado em seus membros posteriores.
Já no camundongo Largemyd, o padrão de degeneração foi significativo tanto no
músculo gastrocnêmio como no diafragma, mas de forma interessante, só se observou
regeneração no músculo gastrocnêmio. Como discutido anteriormente, Yablonka-Reuveni
et al.(2008) sugerem que o camundongo Largemyd tenha baixa atividade proliferativa das
células-satélite, que somado ao defeito de glicosilação da α-distroglicana justificariam a
gravidade da degeneração muscular observada no músculo gastrocnêmio desta linhagem.
5.5 CORRELAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA E PADRÃO DE

DEGENERAÇÃO
DEGENERAÇÃO E REGENERAÇÃO MUSCULAR
A análise comparativa dos resultados da regeneração com a expressão da
miostatina nos quatro modelos distróficos estudados mostrou que não há uma aparente
relação entre a presença da regeneração, ou sua intensidade e a expressão da miostatina.
Isto pode ser melhor observado no músculo diafragma, onde a expressão da miostatina
esta inibida nos quatro modelos, sendo que somente no Dmdmdx e Lama2dy2J/J foi possível
identificar a presença de regeneração.
Já quanto ao padrão de degeneração, houve uma relação entre aumento de
degeneração acompanhado de redução da expressão da miostatina nos quatro modelos
distróficos. Todos os modelos apresentaram degeneração e também inibição da

71
miostatina. Entretanto, os gráficos da degeneração e expressão relativa da miostatina
revelam que o grau de degeneração observado em cada linhagem não influencia na maior
ou menor expressão da miostatina. Além disso, a semelhança no padrão de inibição da
miostatina nos músculos gastrocnêmio e diafragma de cada linhagem reforça esta
hipótese.
Portanto, o processo de degeneração, quando iniciado, e independentemente de seu
grau, causa molecular primária, ou músculo afetado, parece atuar de forma similar na
inibição da expressão da miostatina.

72
6 CONCLUSÕES
- Em camundongos normais, a miostatina é menos expressa no músculo gastrocnêmio do
que no diafragma, refletindo um músculo mais sujeito a lesão.
- Nas quatro linhagens de camundongos distróficos, independentemente da mutação ou do
grau de degeneração do músculo, a miostatina é menos expressa do que em
camundongos normais.
- No músculo distrófico, a expressão da miostatina é inibida tanto no músculo gastrocnêmio
como no diafragma, sem diferença entre os dois.
- A análise comparativa da degeneração e regeneração muscular com a expressão da
miostatina mostrou uma maior correlação com o padrão de degeneração do que com a
regeneração.
Nossos resultados sugerem que o processo de degeneração, quando iniciado, e
independentemente de seu grau, causa molecular primária, ou músculo afetado, parece
atuar de forma similar na inibição da expressão da miostatina, possivelmente como
estímulo a regeneração do dano.

73
REFERÊNCIAS*1
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DinorahZilbersztajnGotlieb Mestrado

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DINORAH ZILBERSZTAJN GOTLIEB

Estudo da expressão da miostatina em modelos murinos para

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

ESTUDO DA EXPRESSÃO DA MIOSTATINA EM MODELOS MURINOS PARA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Orientadora: Profa. Dra. Mariz Vainzof

Agradeço especialmente à orientadora Prof. Dra. Mariz Vainzof pela oportunidade de

Zilbersztajn-Gotlieb D. Estudo da expressão da miostatina em modelos murinos para

As afecções neuromusculares humanas constituem um grupo heterogêneo de doenças

Palavras-chave: Distrofias musculares. Camundongos Modelos. Miostatina.

Zilbersztajn-Gotlieb D. Myostatin expression in mouse models of neuromuscular

Human neuromuscular disorders are a heterogeneous group of genetic diseases, caused by

Keywords: Muscular dystrophies. Mouse models. Myostatin.

4.2.2 Análise quantitativa da expressão da miostatina por PCR em tempo real

1.1O MÚSCULO NORMAL

1.1.2 O tecido muscular no desenvolvimento embrionário

No início do estágio embrionário, na fase de nêurula, na parte paraxial da

mesoderme forma-se os somitos, dos quais originam os tecidos muscular, ósseo,

secretados pelos tecidos adjacentes e sua localização em relação a eles.

A secreção parácrina de fatores específicos induz duas regiões dos somitos a

sintetizarem fatores de transcrição miogênica bHLH (Basic helix-loop-helix) se

caracterizando em miótomos assim dando origem aos mioblastos.

Os mioblastos, células precursoras do músculo,tornam-se alongados, se alinham e

se fundem para formação de miotubos multinucleados, resultando em células muito longas

chamadas fibras musculares.

A determinação dos mioblastos,

estes, o MyoD (antígeno de dif

expressão de genes em tempos diferentes durante a miogênese e é essencial no reparo

e Garry, 2001). O MYF5, estruturalmente

determinação dos mioblastos durante o desenvolvimento embrionário, auxiliando na

proliferação das CS (Hawke e Garry, 2001). A miogenina (MYF4) é um fator essencial

para a diferenciação de células totipotentes em músculo. A miogenina e MYF6 determinam

transcription factor 7), expresso em CS quiescentes e em proliferação. A expressão da

miostatina é detectada nos miótomos, desde o início

formação do músculo esquelético adulto.

natal (Kambadur et al.,

As fibras musculares constituem três tipos de tecidos musculares: estr

compostas por miofilamentos. É nos miofilamentos que se encontram as estruturas

contráteis do músculo chamadas sarcômeros.

Os sarcômeros são constituidos principalmente por dois tipos de filamentos:

monômeros de actina, nebulina, tropomiosina e troponina. A organização destas proteínas

ao longo dos miofilamentos (Figura 4).

Filamentos finos Filamentos espessos

As bandas espessas e escuras, denominadas bandas A, são compostas por

filamentos de miosina combinadas em feixes. A miosina consiste de seis cadeias

polipeptídicas – duas cadeias pesadas, de 220kD, cuja porção N-terminal, chamada

dependendo da sua proveniência.

Através de ligações protéicas ocorre a conexão da actina com a membrana

plasmática. Um modelo proposto descreve um importante papel da proteína distrofina

nesta ligação. A distrofina estaria organizada em um dímero antiparalelo com o domínio N-

o domínio C-terminal como sítio de ligação à membrana, através de um complexo de

proteínas e glicoproteínas associadas integrais à membrana (Complexo Distrofina

Glicoproteínas Associadas - DGC) (Ervasti e Campbell, 1993; Ozawa et al., 1995).

O DGC é um complexo oligomérico, formado pelos sub-complexo

periférica de membrana α-DG. A proteína α-DG

no bom funcionamento do músculo esquelético (Muntoni e Voit, 2004). Desta forma, o

distrofina), e a matriz extracelular (associação α-DG-laminina

Figura 7- Complexo Distrofina Glicoproteínas

As fibras musculares podem ser divididas com base na velocidade da contração

exercida: lenta, tipo I , tem rico abastecimento

mioglobinas, são chamadas de fibras brancas e são adaptadas

anaeróbica, pois usam glicogênio

O músculo humano também