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Progresso em Neuropsicofarmacologia e Psiquiatria Biológica 120 (2023) 110624

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Progresso em Neuropsicofarmacologia e Biológica

Psiquiatria
página inicial da revista: www.elsevier.com/locate/pnp

A atividade da metaloproteinase-9 da matriz cerebral é alterada no modelo de depressão

em camundongos com corticosterona

Silvia
´ Breviario a,1,2 , Julia Senserrich´a,b,2, Eva Florensa-Zanuy a,b , Emily Garro-Martinez a,b ,
Álvaro Diaz a,b,c, Elena Castro a,b,c, Anjo Mansões a,b,c, Fuencisla Pilar-Cu´ellar a,b,c,*
uma ´
Departamento de Sinalização Molecular e Celular, Instituto de Biomedicina e Biotecnologia da Cantábria (IBBTEC), Universidade da Cantábria-CSIC, Santander, Espanha Rede
b
Centro de Investigação Biomédica de Saúde Mental (CIBERSAM), Instituto de Saúde Carlos III, Santander, espanha
c
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade da Cantábria, Santander, Espanha

INFORMAÇÕES DO ARTIGO RESUMO

Palavras-chave: O transtorno depressivo maior é uma condição psiquiátrica altamente prevalente. A metaloproteinase 9 (MMP-9), uma
MMP-9 gelatinase envolvida nos processos de plasticidade sináptica, aprendizado e memória, está elevada tanto em modelos animais
Modelo de corticosterona
de estresse crônico quanto em amostras de sangue periférico humano de pacientes deprimidos. Neste estudo, avaliamos a
Depressão
atividade da MMP-9 e a expressão da proteína em áreas cerebrais relevantes para a depressão usando o modelo crônico de
Córtex
depressão em camundongos com corticosterona. Esses camundongos mostram um comportamento depressivo e ansioso. A
Hipocampo
atividade de MMP-9 e os níveis de proteína são significativamente elevados no hipocampo e no córtex, e os níveis de
nectina-3 são mais baixos nessas áreas do cérebro neste modelo. Em particular, esses camundongos exibem um aumento
da atividade da gelatinase nos subcampos CA1 e CA3 do hipocampo e na camada interna do córtex pré-frontal. Além disso,
o tempo de imobilidade no teste de suspensão da cauda apresenta correlação positiva com a atividade cortical da MMP-9 e
negativa com os níveis de nectina-3.
Em conclusão, o modelo crônico de depressão com corticosterona leva a um aumento na expressão e atividade da proteína
MMP-9 e uma redução de seu substrato nectina-3 em áreas relevantes implicadas nesta doença. A atividade da MMP-9 se
correlaciona com o desespero comportamental neste modelo de depressão. Todos esses achados apóiam o papel da MMP-9
na fisiopatologia da depressão e como um possível alvo para o desenvolvimento de novos medicamentos antidepressivos.

1. Introdução associa a depressão a uma diminuição dos fatores neurotróficos e da plasticidade

O transtorno depressivo maior (TDM) é uma condição psiquiátrica generalizada que
afeta mais de 250 milhões de pessoas em todo o mundo, e a incidência dessa doença
aumentou 14% nos últimos 10 anos (COVID-19 Mental Disorders Collaborators, 2021).
Também está associada a um risco aumentado de morte prematura, incluindo uma alta
taxa de suicídio e um alto custo econômico e social.
A etiopatogenia do TDM não é totalmente conhecida e diferentes hipóteses
neurobiológicas foram propostas até o momento. Inicialmente, postulou-se a hipótese da
monoamina, que propõe a existência de um sistema monoaminérgico cerebral disfuncional
em pacientes deprimidos (Schildkraut, 1965). Então, uma hipótese neurotrófica foi
proposta, que
sináptica em áreas límbicas e a uma redução da proliferação celular no hipocampo
(Duman et al., 1997; Duman e Monteggia, 2006). Nos últimos anos, vários estudos
demonstraram a correlação entre inflamação e doenças neuropsiquiátricas, incluindo a
depressão (Bower et al., 2002; Meyers et al., 2005), o que resultou no desenvolvimento
da hipótese neuroinflamatória da depressão. Além disso, o aumento de marcadores
inflamatórios está associado a uma diminuição de marcadores de plasticidade sináptica,
como o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) (Barrientos et al., 2003; Wu et al.,
2007; Ben Menachem Zidon et al., 2008 ; Koo e Duman, 2008) e com redução da
proliferação hipocampal (Zonis et al., 2015).
As metaloproteinases (MMPs) são um grupo de enzimas que compartilham uma

* Autor correspondente em: Instituto de Biomedicina e Biotecnologia da Cantábria, IBBTEC (Universidade da Cantábria, CSIC, SODERCAN), Avda. Albert Einstein,
22, 39011 Santander, Espanha.
Endereço de e-mail: pilarmf@unican.es (F. Pilar-Cu´ellar).
1 `
Endereço atual: Departamento de Biotecnologia Médica e Medicina Translacional, Universidade de Milão, Itália Estes autores contribuíram
2
igualmente para este trabalho.

https://doi.org/10.1016/j.pnpbp.2022.110624 Recebido
em 4 de maio de 2022; Recebido no formulário revisado em 11 de agosto de 2022; Aceito em 23 de
agosto de 2022 Disponível online em 28 de agosto de 2022 0278-5846/© 2022 Os autores. Publicado
pela Elsevier Inc. Este é um artigo de acesso aberto sob a licença CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by nc-nd/4.0/).
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S. Breviário et al. Progresso em Neuropsicofarmacologia e Psiquiatria Biológica 120 (2023) 110624

motivo de ligação de zinco conservado em seu sítio ativo catalítico. São responsáveis pela
clivagem das proteínas da matriz extracelular, receptores de superfície celular e moléculas de
adesão celular, como as nectinas. Curiosamente, nos últimos anos, eles ganharam importância,
pois atuam não apenas como reguladores de redes de sinalização extracelulares, mas também
intracelulares (Xie et al., 2017). Dentre elas, a MMP-9 é uma gelatinase expressa tanto no
pacientes diagnosticados com TDM e estresse crônico no hipocampo e córtex pré-frontal
(Belleau et al., 2019) e outras áreas corticais como o lobo temporal (Papmeyer et al., 2015).
2. Métodos

sistema nervoso periférico quanto no central (SNC), desempenhando um papel fundamental na

regulação da plasticidade sináptica. 2.1. animais

A MMP-9 é traduzida localmente e é liberada das sinapses excitatórias glutamatérgicas em
resposta à atividade neuronal mediada pelos receptores NMDA (Vafadari et al., 2016). No SNC,
a MMP-9 extra-sináptica está envolvida em processos como o crescimento e maturação de
espinhas dendríticas, e o acúmulo e imobilização de receptores AMPA, que tornam as sinapses
excitatórias mais eficientes na modulação da relação receptores AMPA/NMDA (Vafadari et al .,
2016). Nesse sentido, a superexpressão de MMP-9 em ratos promove maior proporção de
sinapses silenciosas, menor relação AMPA/receptor NMDA e potencialização de longo prazo
(LTP) prejudicada (Nagy et al., 2006). Pelo contrário, a administração de inibidores de MMP-9
restaura essas alterações (Vafadari et al., 2016). Essas MMPs também participam da modulação
Camundongos machos C57BL/6J, com 2 a 3 meses de idade, foram alojados em grupos
(4 a 5 camundongos por gaiola) com um ciclo claro-escuro de 12 horas e com comida e água
ad libitum. Todos os procedimentos foram realizados com a aprovação prévia do Comitê de
Cuidados com Animais da Universidade da Cantábria e de acordo com a legislação espanhola
(RD 53/2013) e a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias sobre “Proteção de Animais
Utilizados para Fins Experimentais e Outros Fins Científicos” (2010/63/UE).
2.2. Modelo de corticosterona

de processos inflamatórios, bem como da neurogênese, crescimento e regeneração axonal e

formação de mielina (Reinhard et al., 2015). Todas essas funções biológicas justificam o
envolvimento da MMP-9 na etiopatogenia de certas doenças neurodegenerativas, como
epilepsia (Michaluk e Kaczmarek, 2007) e esclerose múltipla, entre outras (Milward et al., 2008).
Camundongos C57BL/6J foram randomizados em dois grupos e tratados cronicamente
com hemisuccinato de corticosterona (4-Pregnen-11ÿ, 21-diol-3, 20-diona 21-hemisucunate) na
água potável por 4 semanas (45 mg/l, equivalente a uma dose de 6–10 mg/kg/dia por animal).
A solução de corticosterona foi colocada em frascos opacos para evitar a degradação e trocada
a cada 4 dias (Gourley e Taylor, 2009; Amigo et al., 2021) e o grupo veículo recebeu água. Em
seguida, os camundongos foram avaliados comportamentalmente em paradigmas relacionados
à ansiedade e à depressão (Fig. 1).

O envolvimento destes MMPs estendeu-se ao campo da Após avaliação comportamental, os animais foram randomizados em dois conjuntos que foram
doenças neuropsiquiátricas, como a depressão. Poucos estudos humanos realizados em utilizados para: a) experimentos de zimografia em gel e western blot; e b) experimentos de
amostras de sangue periférico relatam um aumento nas loproteinases metálicas MMP-2, zimografia in situ .
MMP-7 e MMP-9 (Domenici et al., 2010; Rybakowski et al., 2013; Bobinska et al., 2016) , e uma
´
redução nos inibidores teciduais de metaloproteinases
pacientes
(TIMPs)
com depressão
(Bobinska maior.
et al., 2016)
Os níveis
em 2.3. testes comportamentais
séricos de MMP-9 mostraram uma correlação positiva com a gravidade´ da depressão
et al., 2012;
(Yoshida
Shi
basaki et al., 2016). Além disso, a terapia eletroconvulsiva reduz os níveis séricos de MMP-9 Os camundongos foram submetidos a uma bateria de testes comportamentais realizados
em pacientes deprimidos nos respondedores, mas não no grupo de pacientes com recaída durante a fase de luz e foram transportados para a sala experimental 1 h antes de cada
(Shibasaki et al., 2018). No entanto, esses resultados devem ser vistos com cautela, pois os experimento para deixá-los aclimatados. 24 h após o teste de preferência por sacarose, os
achados em amostras periféricas nem sempre se correlacionam com os observados no SNC. animais foram sacrificados.
De fato, apenas um estudo usando amostras de cérebro post-mortem confirmou a existência
de atividade enzimática MMP-9 hipocampal mais alta em pacientes com TDM que cometeram 2.3.1. Teste de campo aberto (OF)
suicídio (Bijata et al., 2022). A alta atividade de MMP-9 também está associada a outras Os camundongos foram colocados em um dos cantos da arena (50 × 50 × 30 cm)
doenças, como epilepsia (Konopka et al., 2013) e câncer de ovário (Lutgendorf et al., 2008), iluminados com 350 lx e monitorados por um sistema computadorizado (software Any-maze
que podem apresentar comorbidade com depressão maior. Todas essas descobertas destacam Video-Tracking, Stoelting Co., EUA) por 5 min . Os parâmetros analisados foram a distância
a MMP-9 como um possível marcador diagnóstico de depressão (Jonsson et al., 2014), que se ambulatória total e o tempo gasto no centro da caixa versus o tempo total.
correlaciona com a resposta ao tratamento e a progressão da doença.

2.3.2. Teste de suspensão da cauda (TST)

¨ Os camundongos foram suspensos pela cauda com fita adesiva colocada a 1 cm da ponta
da cauda e a uma distância de 20 a 25 cm do chão (conforme descrito anteriormente em Garro-
Em relação aos níveis cerebrais de MMP em modelos animais de depressão, existem Martínez et al., 2021). O comportamento dos animais foi registrado durante uma sessão de 5
apenas dois estudos relatando um aumento da atividade de MMP-9 em um modelo de estresse min. O tempo gasto imóvel foi anotado por um observador cego ao grupo experimental.
crônico (van der Kooij et al., 2014) e modelo de estresse crônico imprevisível (CUS) em
camundongos (Bijata et al., 2022). Além disso, há também um artigo relatando a modulação da
expressão e atividade de MMP-9 após a terapia eletroconvulsiva no hipocampo versus a falta 2.3.3. Teste de alimentação suprimida de novidade (NSF)
de efeito da administração crônica de três anti-repressores clinicamente usados em ratos naïve Os camundongos foram privados de comida por 24 horas antes de realizar o teste. Os
(Benekareddy et al., 2008). animais foram colocados em um canto de uma arena de campo aberto iluminada no centro (40
lx), com o chão coberto com cama de lascas de madeira limpa e uma pelota de comida colocada
Uma compreensão mais profunda do papel da MMP-9 na neurobiologia da depressão no centro. O tempo de latência para comer o pellet foi registrado por um tempo máximo de 10
ajudaria a detectar novos alvos terapêuticos para obter drogas antidepressivas mais rápidas e min, usando um software de rastreamento de vídeo
eficazes. Portanto, neste estudo, avaliamos a expressão proteica e a atividade da
metaloproteinase MMP-9 no hipocampo e no córtex usando o modelo de depressão em
camundongos com corti costerona (CORT), um paradigma experimental dotado de validade de
construto, face e preditiva (Gourley e Taylor, 2009). O hipocampo e o córtex são as principais
áreas envolvidas na regulação do humor e da cognição. Vários estudos indicam que essas
áreas apresentam diminuição das sinapses neuronais (Duman e Agha Janian, 2012) e uma
redução no volume e plasticidade neural em Fig. 1. Horário experimental: veh: veículo; CORT; corticosterona; DE: Campo Aberto;
TST: Teste de Suspensão da Cauda; NSF: Alimentação Suprimida de Novidade; SPT:
Teste de Preferência de Sacarose. †: sacrifício.

2
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S. Breviário et al.
(Software Any-maze Video-Tracking, Stoelting Co., EUA). Após o teste, os camundongos foram
transferidos para suas gaiolas e um pós-teste de 5 min foi feito para verificar a quantidade de
alimento consumido. Os animais que não apresentaram ingestão de alimentos em suas gaiolas
foram excluídos da análise dos dados.
2.3.4. Teste de preferência por sacarose (SPT)
Os camundongos foram alojados individualmente e habituados por 48 h ao consumo de
sacarose colocando duas garrafas em sua gaiola, uma contendo sacarose em água (1% p/ v) e
outra contendo água da torneira. Durante o período de habituação, a posição das garrafas foi
trocada a cada 12 horas para evitar possíveis preferências de lugar. No dia seguinte, a
preferência por sacarose foi avaliada como a porcentagem de ingestão da solução de sacarose
versus ingestão total (sacarose + água) durante um período de 24 horas.
2.4. Zimografia em gel
Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e os cérebros foram
rapidamente removidos e dissecados em uma plataforma gelada para obter o córtex e o
hipocampo, e mantidos a - 80 ÿC até serem usados para experimentos de western blot ou
zimografia em gel.
2.4.1. Extração de proteínas por zimografia A
extração de proteínas foi realizada seguindo o protocolo de Szklarczyk (Szklarczyk et al.,
2002). Resumidamente, os tecidos foram homogeneizados (1:20 p/v) em tampão de amostra
(10 mM CaCl2; 0,25% Triton X-100 em água) e então centrifugados a 6000 xg por 30 min a 4
ÿC. O sobrenadante foi removido e o pellet foi ressuspenso em 100 ÿl de tampão de pellet (50
mM Tris pH 7,4; 0,1 M CaCl2), aquecido por 15 min a 60 ÿC e depois centrifugado a 10.000 xg
por 30 min a 4 ÿ C. O pellet foi descartado e 4 ÿl de tampão pellet contendo 10% de triton X114
foi adicionado ao sobrenadante para aumentar a resolução da banda digerida.
2.4.2. Zimografia em gel
A proteína foi quantificada pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951) e as amostras foram
preparadas usando tampão Laemmly sem ÿ-mer captoetanol. 75 ÿg de proteína foram
carregados por duplicata em um gel SDS-PAGE 8,5% contendo 0,1% de gelatina. Como
controle positivo, 10% de soro fetal bovino (FBS) foi preparado em tampão de extração [2%
Triton X114; Tris-HCl 10 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; 1 ÿM inibidores de protease aprotinina e
fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)]. O gel foi executado a 100 V durante 15 min, depois a 160
V durante 50 min em tampão de execução [Tris-HCl 25 mM, pH 7,4; glicina 20 mM; 0,1%
dodecil sulfato de sódio, (SDS)] a 4 ÿC. Após a eletroforese, o gel foi lavado duas vezes em
tampão de lavagem (2,5% Triton X100) à temperatura ambiente com agitação suave por 15
min. Em seguida, o tampão de lavagem foi descartado e o gel foi incubado por 30 min à
temperatura ambiente em tampão de incubação (50 mM Tris HCl, pH 7,4; 200 mM NaCl; 6,7
mM CaCl2; 1 ÿM ZnCl2; 0,2% Brij35).
Posteriormente, o gel foi incubado com tampão de incubação fresco a 37 ÿC por 48 horas.
Após esta incubação, o gel foi lavado 3 vezes com água por 5 min cada à temperatura ambiente.
Antes da coloração, o gel foi escaneado para registrar a posição exata das bandas padrão de
proteína. O gel foi corado com Coomassie Blue R-250 por 1 h em temperatura ambiente e
então foi descorado (10% de metanol; 5% de ácido acético) em temperatura ambiente até que
bandas de atividade proteolítica fossem claramente visíveis. Finalmente, o gel foi digitalizado
usando um scanner SnapScan 1236 AGFA e o software AGFA FotoLook. As bandas foram
quantificadas com o software ImageJ (NIH, EUA).
2.5. Zimografia in situ
Fatias do cérebro (14 ÿm de espessura) foram obtidas com um criostato e mantidas a -80
ÿC até o momento do uso. A zimografia in situ foi realizada seguindo protocolos previamente
descritos (George e Johnson, 2010).
As fatias de cérebro foram secas por 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, foram
reidratadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 min. os diapositivos foram
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incubado com 20 ÿg/ml DQ™ Gelatina conjugada com fluoresceína (Molec ular Probes, Inc.,
Eugene, OR, EUA), em tampão de atividade MMP (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 10
mM CaCl2, 20 ÿM ZnCl2, azida sódica 0,2 mM e Brij35 0,05%, em água MilliQ), em câmara
escura e úmida, a 37 ÿC por 18 h. Como controle negativo, 50 mM de EDTA foi adicionado à
solução de gelatina. Após incubação durante a noite, as lâminas foram lavadas com PBS 1×
três vezes por 5 min cada, com agitação suave. Em seguida, as lâminas foram fixadas com
paraformaldeído a 4% em PBS por 5 min e lavadas 3 × 5 min com PBS. Os slides foram
montados
usando Vectashield® (Vector Laboratories, EUA). O sinal fluorescente foi detectado usando um
microscópio de fluorescência Zeiss Axio Imager M1, câmera P&B de 12 bits (AxioCam MRm).
As imagens foram analisadas com o software ImageJ (NIH, EUA).
2.6. Western blot
2.6.1. Extração de proteínas sinaptoneurossomais A
extração de proteínas foi realizada seguindo o protocolo de Van der Kooij (Van der Kooij et
al., 2014). Resumidamente, os tecidos foram homogeneizados (1:15 p/ v) em tampão de
homogeneização (10 mM HEPES pH 7,4; 1 mM EDTA; 2 mM EGTA; 0,5 mM DTT; 0,1 mM
PMSF), contendo um coquetel inibidor de protease (Sigma) . O homogeneizado foi filtrado com
filtro de 40 ÿm e centrifugado a 1000 xg por 10 min a 4 ÿC. O pellet foi ressuspenso em 100 ÿl
de tampão SDS a 1% (SDS em tampão de homogeneização mais inibidores) e fervido por 1
min. A concentração de proteína foi quantificada pelo método de Lowry. As amostras foram
preparadas com tampão de carga contendo ÿ-mercaptoetanol, fervidas a 100 ÿC por 5 min e
colocadas no gelo por 3 min. Em seguida, as alíquotas foram centrifugadas a 956 xg por 5 min
a 4 ÿC e o sobrenadante foi armazenado a - 20 ÿC até ser utilizado.
2.6.2. Western blot
35 ÿg de proteína por amostra foram carregados por duplicata em um gel SDS-PAGE
8,5%. A eletroforese foi realizada a 100 V por 15 min e depois a 160 V por 50 min, e então
transferida para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare Europe GmbH, Munique,
Alemanha). A membrana foi bloqueada com leite em pó desnatado 5% (p/v) em TBST por 1 h.
Em seguida, a membrana foi incubada durante a noite a 4 ÿC com anti-MMP9 de coelho
(1:3000) (RayBiotech, RayBiotech Life, Georgia, GA, EUA) ou anti-nectina-3 de coelho (1:10000)
(MBL, MBL International , Woburn, MA, EUA) anticorpos primários em solução de bloqueio. No
dia seguinte, a membrana foi lavada com TBST e então incubada em anticorpo secundário anti-
coelho IRDye 800CW conjugado com fluoróforo (LI-COR Bio sciences, Lincoln, NE, EUA)
(1:15000 em leite 5%) por 1 h à temperatura ambiente. Após a lavagem, o sinal específico foi
visualizado usando um Odyssey CLx Imaging System (LI-COR Bioscience, Lincoln, EUA). Os
valores densitométricos foram normalizados usando anti-tubulina de camundongo (1:20000)
como limpeza. As imagens foram analisadas com o uso do software Image StudioTM Lite
(LICOR Bioscience, Lincoln, EUA).
2.7. Análise de dados
Os valores são expressos como média ± desvio padrão (DP). A normalidade dos dados foi
verificada por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov para normalidade.
Quando a normalidade foi confirmada, os dados foram analisados usando um teste t de Student
bicaudal, dados não pareados. Para os estudos de correlação, foi utilizado o coeficiente de
correlação de Pearson (r). As análises estatísticas foram realizadas com o programa GraphPad
Prism 6 versão 8.4.3 para Windows (GraphPad Software, Inc., La Jolla, EUA). A significância
estatística foi estabelecida em p < 0,05.
3. Resultados
3.1. Comportamento do tipo depressivo e ansioso no modelo da corticosterona
Os camundongos tratados com corticosterona exibiram maior tempo de imobilidade em
relação ao grupo controle no TST (174,7 ± 19,6 s no
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S. Breviário et al.
corticosterona vs 148,6 ± 21,0 s em animais tratados com veículo, p < 0,05; Fig. 2A) e
mostraram uma diminuição significativa na preferência de sacarose em comparação
com o grupo controle (74,4 ± 12,5% na corticosterona vs 89,1 ± 2,6% nos animais
tratados com veículo, p < 0,01; Fig. 2B).
Em relação ao comportamento do tipo ansioso, os camundongos tratados com
corticosterona apresentaram um tempo de latência de alimentação aumentado em
comparação com o grupo controle no NSF (441,9 ± 111,2 s em corticosterona vs 334,2
± 83,7 s em animais tratados com veículo, p < 0,05; Fig. 2C). Não foram observadas
diferenças na alimentação ingerida na gaiola (Fig. 2D), no tempo de congelamento e
na deambulação, conforme evidenciado pela velocidade média dos animais durante o
teste (Fig. S1). Camundongos tratados com corticosterona também apresentaram
redução no tempo de permanência no centro do FO em comparação
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ao grupo controle (4,4 ± 1,9 s na corticosterona vs 8,3 ± 3,1 s nos animais tratados
com veículo, p < 0,01; Fig. 2E). A distância total percorrida nos camundongos tratados
com corticosterona também foi menor em comparação com os camundongos tratados
com veículo (14,1 ± 2,1 m em corticosterona vs 17,1 ± 2,1 m em animais tratados com
veículo, p < 0,01; Fig. 2F).
Nenhuma correlação foi observada entre o tempo de imobilidade no TST e a
distância percorrida no OF (Fig. S2).
3.2. Expressão das proteínas MMP-9 e nectina-3 no córtex e hipocampo
Os camundongos tratados cronicamente com corticosterona mostraram um
aumento significativo nos níveis de proteína MMP9 em comparação com o grupo controle em
Fig. 2. Comportamento do tipo depressivo e ansioso no CORT. Tempo de
imobilidade no teste de suspensão da cauda (A); porcentagem de sacarose
consumida versus ingestão total no teste de preferência por sacarose (B); latência
da alimentação (C) e alimentos ingeridos no teste pós-NSF (D) do teste de
supressão da novidade; tempo gasto no centro (E) e distância percorrida (F) no
teste de campo aberto. Os dados são expressos como média ± DP. Teste t de
Student bicaudal, dados não pareados. *p < 0,05, **p < 0,01. n = 9 animais por
grupo. Veh: grupo de veículos; CORT: modelo de corticosterona; TST: teste de
pensão alimentícia; SPT: teste de preferência por sacarose; NSF: teste de
alimentação suprimida por novidade; OF: teste de campo aberto.
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o córtex (117,8 ± 14,7% na corticosterona vs 100,0 ± 2,4% nos animais
tratados com veículo, p < 0,01) (Fig. 3A) e no hipocampo (151,1 ± 61,0% na
corticosterona vs 100,0 ± 6,7% no veículo animais tratados, p < 0,05) (Fig.
3B).
Uma redução significativa do nível da proteína nectina-3, um dos
principais substratos da MMP-9, foi observada no córtex de camundongos
tratados com corticosterona em comparação ao grupo controle (78,5 ±
13,9% na corticosterona vs 100,0 ± 7,0% no veículo animais tratados, p < 0,05)
(Fig. 3C), e no hipocampo (67,3 ± 23,7% na corticosterona vs 100,0 ± 9,0%
nos animais tratados com veículo, p < 0,05) (Fig. 3D).
3.3. Atividade de metaloproteinase no córtex e hipocampo
A zimografia em gel foi utilizada para avaliar a atividade da gelatinase no
CORT. Camundongos tratados cronicamente com corticosterona exibiram
um aumento significativo na atividade da MMP-9 gelatinase em comparação
com seu grupo controle no córtex (338,3 ± 219,5% nos animais tratados
com corticosterona versus veículo, p < 0,01) (Fig. 4A). No hipocampo,
também observamos uma tendência ao aumento da atividade da gelatinase
no modelo de corticosterona (169,0 ± 89,9% nos animais tratados com
corticosterona vs veículo, p = 0,07) (Fig. 4B).
A atividade da MMP-2 também foi analisada no córtex (101,5 ± 25,5%
na corticosterona vs 100,0 ± 36,5% nos animais tratados com veículo, ns) e
no hipocampo (159,0 ± 161,3% na corticosterona vs 100,0 ± 31,3%
Fig. 3. Níveis de expressão da proteína MMP-9 e nectina-3 no córtex (A e C, respectivamente) e no hipocampo (B e D, respectivamente) de camundongos tratados com
corticosterona. Imagens representativas de western blots de MMP-9 e nectina-3 são mostradas abaixo dos gráficos correspondentes. Os dados são expressos como média ± DP.
Teste t de Student bicaudal , dados não pareados. * p < 0,05; **p < 0,01. n = 7–9 animais por grupo. Veh: grupo de veículos; CORT: modelo de corticosterona; St: padrão de proteína.
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nos animais tratados com veículo, ns), não se observando diferenças
estatísticas entre os grupos experimentais. Além disso, a razão MMP-9/
MMP-2 no córtex ( 1,564 ± 0,681 em corticosterona vs 1,936 ± 1,106 em
animais tratados com veículo, ns) e hipocampo (2,754 ± 1,638 em
corticosterona vs 2,724 ± 1,231 em animais tratados com veículo, ns), não
apresentaram diferenças estatísticas.
Uma zimografia in situ também foi realizada para estudar a localização
regional da atividade gelatinolítica. Camundongos tratados cronicamente
com corticosterona apresentaram maior atividade gelatinolítica em relação
ao grupo controle em diferentes regiões do hipocampo: campo CA1 (178,8
± 66,9% na corticosterona vs 100,0 ± 48,2% no veículo tratado
animais, p < 0,05; Fig. 5A, B e C); Campo CA3 (179,5 ± 70,9% na
corticosterona vs 100,0 ± 41,0% nos animais tratados com veículo, p < 0,05;
Fig. 5D, E e F). No entanto, nenhuma alteração foi observada no giro
denteado (Fig. 4G, H e I).
No córtex, os animais tratados com corticosterona também apresentaram
maior atividade gelatinolítica em comparação com seu grupo controle na
camada 5 (152,1 ± 38,2% na corticosterona vs 100,0 ± 45,2% nos animais
tratados com veículo, p < 0,05). As camadas externas 2/3 apresentaram
tendência ao aumento da atividade (139,4 ± 36,8% na corticosterona vs
100,0 ± 37,3% nos animais tratados com veículo, p = 0,07; Fig. 5J, K, L).
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S. Breviário et al.
Fig. 4. Atividade da MMP-9 gelatinase em CORT e camundongos veículo no córtex
(A) e no hipocampo (B). Imagens representativas da zimografia em gel mostrando as
bandas MMP-9 e MMP-2 são mostradas. Os dados são expressos como média ± DP.
Teste t de Student bicaudal, dados não pareados. **p < 0,01. n = 7–9 animais por
grupo. Veh: grupo de veículos; CORT: modelo de corticosterona; St: padrão de proteína.
3.4. Correlação da expressão/ atividade da proteína MMP-9 e desespero
comportamental no TST
Uma análise de correlação foi realizada entre diferentes parâmetros comportamentais
e moleculares no córtex (Fig. 6). O tempo de imobilidade no TST correlacionou-se
positivamente com a atividade da MMP-9 (Fig. 6B) e negativamente com os níveis de
proteína nectina-3 (Fig. 6C). No entanto, nenhuma correlação foi encontrada entre os
marcadores moleculares e anedonia
(teste de preferência de sacarose) (Fig. 6D-F), ou ansiedade avaliada como o tempo
central no teste de campo aberto (Fig. 6G-I) e a latência para alimentação no teste de
alimentação supressa (dados não mostrados).
A análise realizada entre os dados comportamentais e moleculares
no hipocampo não mostrou nenhuma correlação (Fig. S3).
4. Discussão
Este é o primeiro estudo relatando um aumento na atividade da MMP-9 e na
expressão da proteína no modelo animal crônico de depressão com corticosterona
(CORT), em áreas cerebrais relevantes para a neurobiologia dessa doença. Além disso,
encontramos uma associação entre os níveis de atividade da MMP-9 e o desespero
comportamental neste modelo animal.
Está bem estabelecido que o CORT é dotado de validade construtiva, facial e
preditiva (Gourley e Taylor, 2009) , pois se assemelha ao comprometimento do eixo
HPA e mostra algumas das manifestações dos transtornos de depressão/ansiedade
(Johnson et al., 2006) . Este modelo também apresenta alterações neuroquímicas e
moleculares semelhantes às relatadas em pacientes deprimidos (Murray et al., 2008;
David et al., 2009).
Em nosso estudo, os animais tratados com corticosterona crônica apresentaram
anedonia, manifestada por redução da preferência por sacarose (Belovi cova et al.,
2017), e comportamento do tipo depressivo evidenciado por aumento do desespero
comportamental no TST (Porsolt et al., 2001; Belovicova et al., 2017). A menor
deambulação encontrada no teste de campo aberto dificultaria a interpretação do TST.
No entanto, a falta de correlação entre o tempo de imobilidade e a distância percorrida
pode ser interpretada como indicativa do comportamento do tipo depressivo, e não
associada à menor mobilidade em modelos animais de depressão (Florensa-Zanuy et
al., 2021). Além disso, essa atividade locomotora reduzida é mostrada no teste de
campo aberto, e não no NSF. Um dos fatores que pode contribuir para essa diferença é
a intensidade de luz utilizada na arena (350 lx no OF e 40 lx no NSF), que pode resultar
em um tempo de congelamento maior no
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Progresso em Neuropsicofarmacologia e Psiquiatria Biológica 120 (2023) 110624
teste de campo aberto, conforme relatado anteriormente em associação ao medo
condicional (Warthen et al., 2011).
Este modelo também manifestou ansiedade baseada em conflito no teste NSF
(Belovicova et al., 2017) e ansiedade inata no teste OF (Amigo et al., 2021), de acordo
com estudos anteriores. Esses resultados comportamentais estão de acordo com os
resultados relatados por outros autores no CORT (Murray et al., 2008; David et al.,
2009) e em vários modelos de estresse crônico (revistos em Willner, 2016). Em
contraste, Demuyser et al. (2016) relataram que o modelo CORT não apresenta
manifestações do tipo ansioso, discrepância que pode ser decorrente de diferenças nos
procedimentos metodológicos utilizados em seu estudo, principalmente as condições
de moradia (alojados individualmente os animais) e as doses mais altas de corticosterona
utilizadas durante períodos mais curtos de tratamento (20 mg/kg/dia, sc, 21 dias).
Este é o primeiro estudo relatando um aumento na atividade gelatinolítica e na
expressão da proteína MMP-9 em CORT no córtex. Vale a pena notar que esse aumento
na atividade cortical de MMP-9 também foi relatado em um modelo de camundongo
com transtorno de estresse pós-traumático (Chevalier et al., 2021). Além disso, o
aumento da atividade da MMP-9 também foi observado nas sub-regiões CA1 e CA3 do
hipocampo, sem alterações no giro denteado, confirmando achados anteriores em
outros modelos animais de depressão, o modelo de estresse crônico imprevisível (Bijata
et al., 2022).
Em contraste, outros estudos usando um modelo e espécie diferentes —o estresse
crônico de contenção em ratos—, relataram apenas o aumento de MMP-9 na sub-região
CA1 (van der Kooij et al., 2014). Um aumento de MMP-9 no CA1 e no giro denteado
também foi relatado após 24 horas de estresse agudo de contenção (Aguayo et al.,
2018). A sub-região CA1 do hipocampo parece estar associada ao aumento da
expressão de MMP 9 mediada pelo estresse crônico, ativando especificamente os
receptores 5-HT7 (Bijata et al., 2022). As discrepâncias encontradas na atividade da
MMP-9 nas diferentes áreas do pocampo do quadril podem estar ligadas a uma ativação
diferencial dos receptores glutamatérgicos em modelos animais de estresse, uma vez
que a área CA3 experimenta um aumento da transmissão dependente do receptor
NMDA (Kole et al., 2002), e o giro denteado um aumento na transmissão sináptica
dependente do receptor AMPA (Karst e Jo¨els, 2003). Curiosamente, nossos resultados
mostraram uma correlação significativa entre o tempo de imobilidade no TST e a
atividade de MMP-9 ou a expressão da proteína nectina-3 no córtex, mas não no
hipocampo, indicando que uma maior atividade de MMP-9 em áreas corticais poderia
levar a um aumento do desespero comportamental.
Esse aumento da proteína MMP-9 e da atividade observada no CORT está de
acordo com a excitotoxicidade ligada ao estresse crônico (Popoli et al., 2011).
Nesse sentido, o aumento da atividade glutamatérgica mediada pela ativação de NMDA
tem sido associado a maior atividade de MMP-9 em culturas celulares primárias (van
der Kooij et al., 2014).
Além disso, o aumento da atividade da MMP-9 observado no modelo CORT também
é evidenciado pela redução dos níveis de nectina-3 —um dos substratos dessa
metaloproteinase— no córtex e no hipocampo. De fato, alguns autores relataram uma
redução semelhante da nectina-3 em modelos animais associados ao estresse, em que
essa redução foi associada a alterações no comportamento social e na cognição (Wang
et al., 2011; van der Kooij et al., 2014 ). No entanto, não encontramos uma correlação
significativa entre a atividade da MMP-9 e os níveis da proteína nectina-3 (dados não
mostrados), pois a MMP-9 degrada não apenas a nectina-3, mas também outras
moléculas como a neuroligina-1 (Peixoto et al. , 2012) e ÿ-distroglicano (Michaluk e
Kaczmarek, 2007). Além disso, não há evidências claras se a MMP-9 é a única enzima
capaz de degradar a nectina-3 (van der Kooij et al., 2014).
A superativação de MMP-9 tem sido associada à geração de espinhos imaturos e
sinapses silenciosas, menor relação de receptores AMPA/NMDA e LTP prejudicada,
levando à depressão e outras neuropatologias (Magnowska et al., 2016). Estas
alterações neuronais vão ao encontro da teoria da neuroplasticidade da depressão que
relaciona os níveis elevados de glucocorticóides, associados ao stress crónico, à atrofia
dos neurónios maduros, ao encurtamento e à diminuição da densidade das espinhas
dendríticas no hipocampo, conduzindo a uma plasticidade neuronal prejudicada ( Boku
e outros, 2018).
Os resultados obtidos aqui e em outros modelos animais se assemelham
aqueles observados em estudos humanos. Estudos iniciais em sangue periférico
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(legenda na próxima página)

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Fig. 5. Atividade da gelatinase nas regiões do hipocampo: A–C) campo CA1; D–F) campo CA3 e G–I) campo DG do hipocampo e córtex pré-frontal: camadas 2/3 e camada 5
(J–L). Imagens representativas da zimografia in situ no campo CA1 no veículo (B) e camundongos tratados com corticosterona (C); no campo CA3 no veículo (E) e camundongos
tratados com corticosterona (F); no giro denteado no veículo (H) e camundongos tratados com corticosterona (I); no córtex pré-frontal no veículo (K) e camundongos tratados
com corticosterona (L). Em K, a seta vermelha mostra as camadas 2–3 e a seta branca mostra a camada 5. Os dados são expressos como média ± DP. Teste t de Student
bicaudal, nãodepareado.
figura, o* leitor
p < 0,05.
deveVeh: grupoade
consultar veículos;
versão webCORT: modelo de corticosterona. Barra de escala 100 ÿm. (Para interpretação das referências a cores nesta legenda
deste artigo.)

Fig. 6. Correlação no grupo corticosterona entre os resultados comportamentais (TST, teste de suspensão da cauda; SPT, teste de preferência por sacarose; e OF, teste de
campo aberto) e: níveis de proteína MMP-9 (A, D e G), MMP- 9 (B, E e H) e níveis de proteína nectina-3 (C, F e I) no córtex. n = 7–9 animais por grupo. r: coeficiente de
correlação de Pearson.

indicaram níveis mais elevados de MMP-9 em pacientes deprimidos em essa correlação é observada apenas entre a atividade da MMP-9 e o
comparação com indivíduos saudáveis (Domenici et al., 2010; Rybakowski et desespero comportamental, e não com anedonia ou ansiedade. De fato,
al., 2013;
´ Bobinska
gravidadeetda
al.,doença
2016; Che et al., 2019),
os sintomas que foram
depressivos associados
(Yoshida et al., à alguns autores propõem uma associação da expressão de MMP9 apenas
2012; Shibasaki et al., 2016). Portanto, a correlação atividade-comportamento com manifestações específicas (Chevalier et al., 2021), o que pode explicar
relatada aqui suporta a importância do nível de atividade da MMP-9 na as diferentes correlações aqui observadas para desespero comportamental e anedonia.
gravidade dos sintomas depressivos, conforme relatado anteriormente Essas diferenças também podem estar associadas à área do cérebro
(Shibasaki et al., 2016). Nesta linha, nossos dados, juntamente com a redução estudada. Neste sentido, a anedonia está mais associada a outras áreas
do nível de MMP-9 periférico após terapia eletroconvulsiva (Shibasaki et al., cerebrais como a área tegmental ventral, núcleo accumbens (NAc), estriado
2018), suportam o papel putativo dos níveis de MMP-9 como um marcador ventral (vias VTA-NAc) (Dunlop e Nemeroff, 2007; revisado em Hoflich ¨ et
da gravidade do TDM ou da capacidade de resposta ao tratamento al., 2019) , ou amígdala central (Pu´scian et al., 2021), e ansiedade para
antidepressivo. No entanto, em nosso estudo, áreas como a amígdala e o núcleo leito dos terminais da estria

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S. Breviário et al.
(Moreira et al., 2007; Duvarci et al., 2009; revisado em Adhikari, 2014).
De fato, uma redução da atividade da MMP-9 na amígdala central induzida
pela administração crônica do antidepressivo fluoxetina a camundongos
não estressados está associada ao aparecimento de anedonia (Pu´scian et
al., 2021).
Uma das limitações do nosso estudo é a falta de dados em áreas mais
associadas a outras manifestações depressivas como anedonia e
ansiedade, conforme indicado acima. Outra limitação do estudo é a
impossibilidade de discriminar entre MMP-9 e proMMP-9 na zimografia em gel.
Este fato tem sido amplamente descrito por diferentes autores, assumindo
que a atividade enzimática obtida nesta técnica pode estar associada a
ambas as formas enzimáticas (Cauwe e Opdenakker, 2010; Bijata et al., 2022).
Outra limitação do nosso estudo é a falta de especificidade da zimografia
in situ , pois esta técnica permite apenas a avaliação da atividade da gelat
inase, que se deve principalmente às enzimas MMP-9 e MMP-2.
5. Conclusão
O modelo crônico de corticosterona exibe um aumento na atividade e
proteína MMP-9 e uma redução de seu substrato nectina-3 em áreas
relevantes implicadas na depressão como o córtex e o hipocampo. O nível
de atividade da MMP-9 se correlaciona com o desespero comportamental
neste modelo de depressão. Nossos dados suportam o papel da MMP-9
na fisiopatologia da depressão e na gravidade desta doença, e atuam como
um possível alvo para desenvolver drogas antidepressivas mais eficazes.
Fontes de financiamento
´
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência, Inovação e
Universidades (bolsa número RTI2018-097534-B-I00).
declaração ética
Declaramos que este trabalho é original e não foi submetido a outro
lugar para publicação, total ou parcialmente.
Declaração dos autores
SB: realizar experimentos, analisar e interpretar dados, redigir o
rascunho original; JS realizando experimentos, analisando e interpretando
dados, escrevendo o rascunho original; EF-Z: metodologia e análise de
dados; EG-M: metodologia; AD: conceituação e revisão da redação; EC:
conceituação e revisão da redação; AP: aquisição de financiamento, revisão
de redação; e FP-C: conceituação, obtenção de financiamento, administração
do projeto, redação do rascunho original.
Declaração de Interesse Concorrente
Nenhum dos autores relata potenciais conflitos de interesse.
Reconhecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo Ministério da Ciência e Universidades
´
Inovação (RTI2018-097534-B-I00) e pelo Centro de Investigacion ´Biom
´edica en Red de Salud Mental (CIBERSAM).
Apêndice A. Dados suplementares
Dados complementares a este artigo podem ser encontrados online em https://doi.
org/10.1016/j.pnpbp.2022.110624.
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