A matéria orgânica dissolvida (MOD) marinha é o maior reservatório de carbono orgânico no

oceano, contendo uma quantidade semelhante de carbono ao dióxido de carbono

atmosférico. Um componente chave dos processos biogeoquímicos globais. Os fatores de
stress da mudança global, podem influenciar o ciclo oceânico do carbono orgânico
dissolvido, resultando em feedbacks até agora desconhecidos no ciclo biogeoquímico
global. é produzido e transformado principalmente por microrganismos marinhos. A
resistência contra a degradação microbiana pode ser devida às estruturas moleculares
estáveis presentes no DOM. Além disso, concentrações muito baixas de componentes
individuais tornam os encontros entre micróbios e moléculas de DOM um evento raro, o que
retarda a degradação. Mais de dez mil fórmulas moleculares foram identificadas em MOD
marinha com a ajuda de Espectrometria de massa por Transformada de Fourier e
ressonância ciclotrônica de íons (FT-ICR-MS). o DOM marinho consiste em milhares de
diferentes compostos orgânicos em concentrações muito baixas. A maior parte foi
caracterizada em classes estruturais, como aromáticos, olefinas, açúcares, moléculas
acíclicas ricas em carboxila ou material derivado de terpenos lineares.
A análise direcionada de compostos específicos por abordagens de cromatografia
líquida/espectrometria de massa ajuda a identificar seu papel nas interações microbianas no
oceano, mas a fração de moléculas dentro das janelas analíticas direcionadas é pequena
no caso do DOM. As desvantagens da espectrometria de massa são a seletividade das
técnicas de ionização e o fato de os isômeros não serem resolvidos.
A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) supera essas limitações da
espectrometria de massa, produzindo informações estruturais complementares. As
principais desvantagens da RMN são a sua baixa sensibilidade e baixa resolução espectral.
O princípio básico da espectroscopia de RMN, consiste em núcleos atômicos com número
quântico de spin nuclear diferente de zero (1≠ 0), que são basicamente todos os núcleos com um
número ímpar de prótons e/ou nêutrons, possuem um momento magnético, portanto, são ativos em
RMN.
Na prática, a excitação é realizada com um pulso de Radiofrequência (RF), gerado em uma
bobina dentro da sonda de RMN. Os pulsos frequentemente aplicados em experimentos de
RMN são pulsos de 90° (inclinando a magnetização macroscópica no plano xy) e pulsos de
180° (invertendo a magnetização macroscópica ao longo do eixo z ou reforçando-a).
Após excitação pelo pulso RF, a magnetização macroscópica retorna para o equilíbrio
enquanto gira em torno B0. De acordo com a lei de indução de Faraday, isso induz uma
corrente na bobina de RF na forma de um decaimento de indução livre (FID), que é
amplificado e representa o sinal real da medição de RMN. A transformação de Fourier (FT)
do sinal no domínio do tempo (FID) resulta no espectro de RMN em unidades de frequência.
O efeito de um pulso de 90° na magnetização macroscópica é mostrado na Fig.1.

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Para obter espectros de RMN com relação sinal-ruído (SNR) melhorada, geralmente é
necessário um número maior de varreduras (= atraso de relaxamento + pulso RF +
aquisição) são coletados à medida que o SNR aumenta com a raiz quadrada do número de
varreduras. Para garantir que todos os spins retornem ao seu estado de equilíbrio antes da
aplicação do próximo pulso de RF, um tempo de equilíbrio, comumente referido como
relaxamento ou atraso de reciclagem, é aplicado antes do próximo pulso de RF. Espectros
mais complexos são adquiridos usando sequências de pulso que contêm vários pulsos de
RF e atrasos na presença de gradientes de campo magnético.
Como a largura espectral e, portanto, os valores específicos dos sinais em um espectro de
RMN dependem da intensidade do campo do instrumento, ela é geralmente convertida na
escala de deslocamento químico adimensional que é exibida em partes por milhão (ppm,
símbolo de quantidade δ). A escala é representada desde valores de ppm mais altos no
lado esquerdo até valores de ppm mais baixos no lado direito.
Quase todos os elementos possuem pelo menos um isótopo que é ativo em RMN e,
portanto, receptivo para uma medição espectroscópica de RMN. Como o deslocamento
químico de um determinado núcleo depende de seus grupos e/ou átomos vizinhos, a
espectroscopia de RMN permite a oportunidade de analisar seletivamente elementos
específicos e seu ambiente químico. Generosamente,1H, que pode ser encontrado em
quase todos os compostos orgânicos, é o um dos núcleos mais sensíveis de todos os
núcleos ativos de RMN.
A espectroscopia de RMN pode ser aplicada a líquidos (líquidos puros ou amostras
dissolvidas) e sólidos e é então denominada espectroscopia de RMN no estado de solução
e no estado sólido, respectivamente. A configuração instrumental de ambas as técnicas é
diferente. A RMN de estado sólido sofre de baixa resolução e sensibilidade espectral devido
a sinais amplos causados por fortes interações anisotrópicas, como acoplamento dipolo-
dipolo, anisotropia de deslocamento químico e acoplamento quadrupolar. Portanto, a
espectroscopia de RMN em estado de solução é tecnicamente mais fácil de realizar, mas
requer que toda a amostra seja solúvel em um solvente apropriado.
No preparo de amostra, a amostra deve ser dissolvida em um solvente apropriado para
espectroscopia de RMN. Um solvente apropriado e estável, ou seja, que não reage com a
amostra e não produza sinais importantes no espectro. Como o núcleo mais
frequentemente observado em experimentos espectroscópicos de RMN é 1H, geralmente
solventes deuterados, como D2O, DMSO-d6, MeCN-d3, MeOH-d3, MeOD-d4, CDCl3 ou
C6D6, são usados. Esses solventes causam apenas poucos sinais no correspondente
espectro de RMN de 1H, devido a prótons residuais, que são inevitáveis por razões
técnicas. Além disso, o sinal do solvente residual é frequentemente usado como padrão de
referência de deslocamento químico interno. Além disso, são usados para manter estável o
campo magnético externo.
A maioria dos elementos relevantes para o ambiente biogênico possui pelo menos um
núcleo suficientemente receptivo, como 1H,13C,15N e 31P. Em contraste com outras
técnicas espectroscópicas, cada experimento espectroscópico de RMN fornece uma
informação muito específica. Assim, o registro de diferentes espectros de RMN geralmente
aumenta o conhecimento sobre a amostra e facilita atribuições composicionais e estruturais.
O mais simples e mais amplamente aplicado de todos os experimentos espectroscópicos de
RMN é o 1D (RMN 1H). Basicamente, ele contém apenas um pulso de RF (mais
comumente um pulso de 90°) após o qual o sinal induzido é detectado. Se adquirido
corretamente, fornece informações quantitativas sobre os prótons da amostra. Esta
informação é entregue na forma de integral de pico, que corresponde ao número de prótons

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responsáveis pelo sinal específico. Além do componente quantitativo de um espectro de
RMN, o deslocamento químico de um sinal fornece insights estruturais, porque depende
fortemente do ambiente químico de um próton individual. O campo magnético
experimentado por um núcleo específico é influenciado pelos átomos e grupos vizinhos. Os
grupos de retirada de elétrons diminuem a densidade do elétron no núcleo observado, o
que é denominado desblindagem. Como consequência da desproteção, o campo magnético
causado pelos elétrons ao redor do núcleo é reduzido e o campo magnético externo
experimentado, portanto, aumenta. Os grupos doadores de elétrons causarão o efeito
oposto, denominado deslocamento para cima (mudança para valores mais baixos de ppm).
Além das propriedades de atração de elétrons dos grupos circundantes, a
blindagem/desblindagem dos núcleos também é afetada por efeitos anisotrópicos e ligações
de hidrogênio.
Caso os sinais de prótons individuais sejam suficientemente resolvidos, eles também
fornecem informações sobre átomos vizinhos na forma da estrutura multipleta do respectivo
sinal. O aparecimento de multipletos é causado por acoplamentos escalares, também
chamados de acoplamento spin-spin indireto ou acoplamento J. A magnitude do
acoplamento diminui com o aumento do número de ligações entre os núcleos acoplados.
Em princípio, o acoplamento J pode ser observado entre spins heteronucleares e
homonucleares. Os núcleos são quimicamente equivalentes se forem interconversíveis por
operações simétricas e, além disso, magneticamente equivalentes se tiverem exatamente
os mesmos parceiros de acoplamento. Núcleos quimicamente equivalentes têm o mesmo
deslocamento químico e podem ser divididos em prótons homotópicos e enantiotópicos. Os
prótons diastereotópicos são quimicamente inequivalentes e, portanto, apresentam
diferentes
deslocamentos químicos.
Um segundo espectro de RMN 1D frequentemente registrado é o espectro de RMN 13C.
Devido à baixa abundância natural de 13C homonuclear, o acoplamentos J geralmente não
são relevantes. No entanto, o acoplamento a núcleos de 1H ocorrem, o que leva a uma
divisão de sinais em multipletos. Para reduzir a complexidade espectral, os espectros de
RMN de 13C são frequentemente registrados desacoplados com prótons, o que significa
que a divisão do sinal devido ao acoplamento com núcleos de 1H é suprimida.
O registro dos espectros de 13C com aprimoramento sem distorção por transferência de
polarização (DEPT), causa um aumento da sensibilidade, bem como a possibilidade de
distinguir entre CH- (metino), CH2- (metileno) e CH3- grupos (metil). Carbonos sem
hidrogênio ligado (por exemplo, carbonos quaternários e carbonílicos) não mostram sinal no
experimento DEPT regular.
O RMN 1D de 1H é o experimento mais sensível, muitas vezes sofre com a baixa
resolução espectral devido à sobreposição multipletos de acoplamento J espalhados pela
limitada faixa de deslocamento químico 1H (~ 10 ppm), mesmo nos campos magnéticos
ultra-altos atualmente disponíveis.
A introdução de uma segunda dimensão em experiências espectroscópicas de RMN tem a
vantagem de uma resolução melhorada que muitas vezes permite a separação de picos que
de outra forma se sobreporiam num espectro de RMN 1D. Além disso, experimentos de
RMN 2D podem fornecer evidências detalhadas sobre a ligação direta e/ou através do
espaço, conectividade de átomos, facilitando assim a análise estrutural em nível atômico de
moléculas individuais, bem como de misturas complexas. Eles podem ser registrados de
forma homonuclear (são observadas correlações entre o mesmo tipo de núcleo) ou
heteronuclear (são observadas correlações entre dois tipos diferentes de núcleo). Um dos

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experimentos espectroscópicos de RMN 2D mais proeminentes é a espectroscopia de
correlação (COSY).
Um experimento muito semelhante ao COSY é denominado TOCSY (espectroscopia de
correlação total), Ele mostra correlações de um determinado próton para todos os prótons
de
uma rede de spin ininterrupta e não apenas para aqueles que estão conectados através de
duas ou três ligações. Há também, o HMQC (coerência quântica múltipla heteronuclear),
HSQC (coerência quântica única heteronuclear) ou HMBC (correlação de ligações múltiplas
heteronucleares). Os espectros HMQC e HSQC exibem sinais para acoplamentos através
de uma ligação e, assim, mostram qual hidrogênio está conectado a qual carbono. Em
contraste, o espectro HMBC exibe sinais para acoplamentos de longo alcance, geralmente
através de duas a quatro ligações (sendo três ligações as mais comuns).
Este tipo de informação é especialmente útil para conectar fragmentos estruturais que foram
definidos pelos espectros 1D, COSY, HSQC e HMQC.
Um espectro clássico de RMN 3D é normalmente registrado em poucos dias e um espectro
de RMN 4D geralmente leva semanas para ser registrado, os espectros de RMN com mais
de três dimensões são de relevância prática limitada. Experimentos de RMN 3D podem ser
construídos aplicando dois experimentos consecutivos de RMN 2D de até dois tipos de
núcleos ou como experimentos de ressonância tripla, correlacionando três núcleos
diferentes. Por tradição, experimentos de RMN 3D são usados para a determinação da
estrutura 3D de proteínas.
Na espectroscopia de RMN, o sinal analógico é convertido em sinal digital por meio de um
conversor analógico-digital. Os mais comuns são os conversores analógico-digital que
convertem o sinal analógico em um sinal com ~ 16 bits. Em geral, deve ser ajustado em
relação ao maior sinal. Ao gravar um espectro de RMN de 1H sem usar um solvente
deuterado, o sinal de longe maior será o do solvente (pelo menos no caso de o solvente
possuir prótons, que é o caso da maioria dos solventes orgânicos comuns). Caso a amostra
a ser medida seja muito pouco concentrada, o(s) sinal(es) da amostra serão representados
pelo último bit junto com o ruído. É por esta razão que ao usar solventes não deuterados ou
medir amostras com concentração muito baixa, o sinal do solvente deve ser reduzido. A
maneira mais fácil de remover o sinal do solvente é saturá-lo por um pulso de RF seletivo
de baixa potência e longa duração antes de aplicar a sequência de pulso real do
experimento de RMN.
A espectroscopia de RMN é uma ferramenta essencial para a análise molecular de material
orgânico (DOM). Embora as principais características estruturais do DOM tenham sido
identificadas pelo RMN, seu potencial ainda não foi totalmente explorado devido à
insensibilidade da técnica em relação a pequenas detalhes de amostra, resultando em
longos tempos de medição. Avanços técnicos, como campos magnéticos mais intensos e
sondas criogênicas, tornaram a RMN multidimensional mais viável para o estudo do DOM.
Além disso, a combinação com estratégias de aquisição de dados, como amostragem não
uniforme, permite tempos de medição reduzidos sem comprometer a qualidade dos
espectros. A aplicação de métodos estatísticos multivariados também pode se tornar padrão
à medida que conjuntos de dados maiores se tornem disponíveis. A derivatização isotópica
é outra abordagem promissora para a caracterização do DOM. Em resumo, melhorias
técnicas, estratégias de aquisição de dados inovadoras e métodos estatísticos têm o
potencial de revolucionar a análise molecular do DOM.