TCC - Janaina Dias Da Costa

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

CURSO DE BIOMEDICINA
JANAINA DIAS DA COSTA
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS ENZIMAS

LIGNOCELULOLÍTICAS SECRETADAS PELO FUNGO MICORRÍZICO
Waitea circinata, ISOLADO DE ORQUIDIAS DO CERRADO, EM DIFERENTES
FONTES DE CARBONO E NITROGÊNIO
Goiânia-G0
2018
JANAINA DIAS DA COSTA
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS ENZIMAS

LIGNOCELULOLÍTICAS SECRETADAS PELO FUNGO MICORRÍZICO
Waitea circinata, ISOLADO DE ORQUIDIAS DO CERRADO, EM DIFERENTES
FONTES DE CARBONO E NITROGENIO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao

Curso de Biomedicina da Universidade Federal de
Goiás como requisito para obtenção do título de
Bacharel em Biomedicina.
Orientadora:
Prof.ª Dr.ª Rosália Santos Amorim Jesuíno
Goiânia – GO
2018
Aos meus pais por todo amor, carinho,
paciência, compreensão e por não terem
medido esforços para que eu chegasse até
aqui.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, meu pai todo poderoso, pelo dom da vida, pela força, pela
esperança, pela fé, e por mais pouca FÉ que eu tenha demonstrado e fraquejado durante
essa caminhada ele não me deixou desamparada, a ele toda honra e toda glória.
À minha mãe, Mônica Dias da Silva e ao meu pai Joaquim José da Costa, por ter
sido meu porto seguro em todos os momentos, não medindo esforços para a realização
desse sonho, por terem sonhado comigo, chorado e me aturado, pelo seu amor, carinho,
paciência e acreditado em mim todos os momentos, até nos momentos os quais eu mesma
desacreditava, amo vocês!
Á meu irmão, minha família, amigos, colegas que torceram por mim, contribuindo
de forma direta e indireta para essa conquista.
À Profª. Drª Rosália Amorim Jesuino, que aceitou o desafio de me orientar, se
tornando não só minha orientadora, mas uma mãe/amiga, obrigada pela paciência, pela
atenção, pela dedicação, pelos conselhos, pelos ensinamentos, por ter me apresentado o
caminho da ciência e da pesquisa, por ter me transmitido todo conhecimento, serei
eternamente grata. E desculpe-me por todo trabalho que lhe dei.
Aos meus amigos de Jataí, os quais tive a oportunidade de conhecer e compartilhar
todos os momentos, sendo eles bons ou ruins, não irei citar nome para não ser injusta
esquecendo de alguém. É aos amigos que conquistei aqui em Goiânia, Sanayara Kenia
Souza Silva, Igor Marques Calassa e Amanda Ferreira Paes Landim.
Ao meu irmão Luis Augusto Dias da costa e minha irmã do coração Viviane
Pimentel da Silva, com os quais, nos momentos mais difíceis durante esse percurso,
sempre pude contar, nos momentos de alegria e tristeza. Me ouviram, me suportaram,
aguentaram meus choros, minhas lamúrias, meu mau humor e minhas manias. Serei
eternamente grata a vocês.
Aos meus avós em especial os maternos, que cuidaram de mim nos últimos 3 anos
da minha graduação, minha avó Aparecida Sebastiana da Silva que cuida de mim no dia
a dia, e meu avô Manuel Dias da Silva que cuida e olha por mim no reino do céu.
À equipe do Laboratório de Biotecnologia de Fungos - Universidade Federal de
Goiás-UFG, pelo apoio, pela infraestrutura e pela oportunidade da realização desse
trabalho. À professora Prof.ª Dr.ª Fabrícia Paula de Faria, pelo convívio e ensinamentos.
Dos amigos que cultivei, durante este período, quero agradecer a Izadora Cristina Moreira
de Oliveira, por todo o conhecimento oferecido e ter sido esse exemplo de pessoa e
profissional a ser seguido. Muito obrigada!
“Some people got the real problems
Some people out of luck
Some people think I can solve them
Lord heavens above
I'm only human after all
I'm only human after all.”
Rag'n'Bone Man – Human
RESUMO
Os fungos são excelentes produtores de enzimas extracelulares hidrolíticas, destacando-

se os filamentosos. Estes fungos são muito empregados em ensaios de hidrólise
enzimática por apresentarem elevada taxa de produção destas enzimas, versatilidade de
crescimento em meios de cultura, variabilidade genética e metabólica. A ação sinérgica
das celobiohidrolases, endoglucanases, beta-glucosidases e xilanases promove a
conversão dos substratos lignocelulósicos em compostos de fácil assimilação. Assim a
produção destas enzimas pode ser estimulada pela fonte de carbono presente no meio de
cultura, como o bagaço de cana- de-açúcar (BCA), farelo de trigo (FT) e de nitrogênio,
como peptona e cloreto de amônia. Este trabalho objetivou determinar a melhor fonte de
carbono e otimizar a produção de enzimas lignocelulolíticas por Waitea circinata na
presença de fontes de nitrogênio. W. circinata foi cultivado em meio mínimo por
fermentação, utilizou-se como fonte de carbono BCA, palha de arroz (PA), FT a 1% e
glicose a 0,1%. Alíquotas do meio de cultura foram retiradas com 96 e 120 horas de
cultivo. Ensaios de atividade de Avicelase, CMCase, FPase e Xilanases foram realizados
com o sobrenadante de cultura. Em seguida foi determinada a melhor fonte de nitrogênio,
utilizando o cloreto de amônio, peptona e ureia, retirou-se alíquotas nos tempos de 48,
72, 96 e 120 horas. Todas as fontes de carbono foram capazes de induzir a produção e
secreção de celulases e xilanases por W. circinata, sendo o FT o melhor indutor da
produção destas enzimas, no tempo de 96 horas de cultivo. Obteve-se 58,11 U/mL para
xilanases e 0,39 U/mL para endoglucanases. A adição de fonte nitrogênio ao meio
contendo FT otimizou a produção destas enzimas. As fontes de carbono e composição do
meio de cultura influenciam bastante a produção de enzimas lignocelulolíticas pelos
fungos filamentosos. O mesmo pôde ser observado para W. circinata, que foi capaz de
produzir e secretar xilanases e celulases por processo de fermentação líquida contendo
diferentes fontes de carbono. As enzimas secretadas pelo fungo se mostraram eficientes
na hidrólise de substratos lignocelulósicos. O fato da maior atividade enzimática
observada no meio de cultura, contendo FT, ter sido de xilanase, se justifica, pois, o FT
apresenta em sua composição um considerado teor de hemicelulose (45 %), desta forma
o fungo produziu e secretou esta enzima em maior quantidade em relação as demais. A
adição de fontes de nitrogênio ao meio, como peptona e cloreto de amônia, promoveu
uma maior produção das enzimas pelo W. circinata. Existem relatos de que a adição de
peptona e cloreto de amônio ao meio de cultura promovem um aumento na produção de
enzimas. Por meio deste trabalho, conclui-se que o FT foi a melhor fonte de carbono para
produção de lignocelulases por W. circinata; a atividade de xilanases e endoglucanases
foram superiores as de as de celobiohidrolases e as celulases totais, e a adição de
nitrogênio favoreceu a maior produção destas enzimas pelo fungo.
Palavras-chaves: micorrízico, enzimas hidrolíticas, lignocelulose, carbono, nitrogênio.

ABSTRACT
Fungi are excellent producers of hydrolytic extracellular enzymes, especially filaments.

These fungi are widely used in enzymatic hydrolysis assays because they present high
rates of enzyme production, growth versatility in culture media, genetic and metabolic
variability. The synergistic action of cellobiohydrolases, endoglucanases, beta-
glucosidases and xylanases promotes the conversion of the lignocellulosic substrates to
easily assimilated compounds. Thus the production of these enzymes can be stimulated
by the carbon source present in the culture medium, such as sugarcane bagasse, wheat
bran and nitrogen, such as peptone and ammonium chloride. This work aimed to
determine the best carbon source and to optimize the production of lignocellulolytic
enzymes by Waitea circinata in the presence of nitrogen sources. W. circinata was
cultivated in a minimal medium by fermentation. Sugarcane bagasse, rice straw, wheat
bran, and 0.1% glucose were used as the source of carbon. Aliquots of the culture medium
were withdrawn with 96 and 120 hours of culture. Assays of Avicelase activity, CMCase,
FPase and Xylanases were performed with the culture supernatant. The best source of
nitrogen was then determined using ammonium chloride, peptone and urea, aliquots were
withdrawn at 48, 72, 96 and 120 hours. All carbon sources were able to induce the
production and secretion of cellulases and xylanases by W. circinata, wheat bran being
the best inducer of the production of these enzymes, in the time of 96 hours of cultivation.
58.11 U/mL for xylanases and 0.39 U/mL for endoglucanases were obtained. The
addition of nitrogen source to the medium containing wheat bran optimized the
production of these enzymes. The carbon sources and composition of the culture medium
strongly influence the production of lignocellulolytic enzymes by filamentous fungi. The
same could be observed for W. circinata, which was able to produce and secrete xylanases
and cellulases by liquid fermentation process containing different carbon sources. The
enzymes secreted by the fungus proved to be efficient in the hydrolysis of lignocellulosic
substrates. The fact that the highest enzymatic activity observed in the culture medium
containing wheat bran was xylanase, therefore, wheat bran presents in its composition a
content of hemicellulose (45%), in this way the fungus produced and secreted this enzyme
in greater quantity in relation to the others. The addition of nitrogen sources to the
medium, such as peptone and ammonium chloride, promoted a higher production of the
enzymes by W. circinata. There are reports that the addition of peptone and ammonium
chloride to the culture medium promotes an increase in the production of enzymes. By
means of this work, it is concluded that wheat bran was the best carbon source for the
production of lignocelluloses by W. circinata; the activity of xylanase and
endoglucanases were higher than those of cellobiohydrolases and celulases totals, and the
addition of nitrogen favored the higher production of these enzymes by the fungus.
Keywords: mycorrhizal, hydrolytic enzymes, lignocellulose, carbon, nitrogen.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Plântulas com o isolado fúngico (Waitea circinata) sessenta dias após a
micorrização, em raízes de Epidendrum nocturnum, orquídea rupícola de
Cerrado.………………………………… ……...……………………………………....18
Figura 2. Isolado fúngico micorrízico de orquídeas Waitea circinata, em placa contendo
meio BDA, em 15 dias de cultivo……………………………………………………….19
Figura 3. Isolados fúngicos patogênicos (Ro88 e Rh24F1) e fungo micorrízico
orquidoide W. circinata (FMO) utilizados no pareamento in vitro, em meio DBA
observando a inibição dos fungos patogênicos………………………………………….21
Figura 4. Imagem demonstrativa de como é estruturada a lignocelulose……...………..23
Figura 5. Moléculas de glicose unidas entre si por ligações glicosídicas do tipo β-1,4,
mostrando o sistema de numeração dos carbonos e a configuração da ligação
glicosídica……………………………………………………………………………....25
Figura 6. Estrutura química da molécula de xilana……………………..………………26
Figura 7. Principais monômeros que constituem a molécula de lignina…………….….27
Figura 8. Ilustração do complexo enzimático das celulases, demonstrando o mecanismo
de ação de cada enzima no processo de hidrólise da celulose. CBH – celobiohidrolases,
EG – endoglucanases, β-glicosidases, CBM - modulo de ligação aos carboidratos e AA9
– enzimas auxiliares………………………………………………………………….....28
Figura 9. Sinergismo entre endoglucanases, exoglucanases e celobiohidrolases na
degradação da estrutura da celulose……………...……………………………………..29
Figura 10. Esquema da composição da xilana e sistema enzimático envolvido na
degradação da xilana…………………………………………………………...……….30
Figura 11. Quantificação da atividade enzimática das celobiohidrolases do sobrenadante
de cultura do fungo W. circinata cultivado em diferentes fontes de carbono a 1%, pelo
ensaio de Avicelase. Os sobrenadantes foram retirados nos tempos de 96 h e 120 h e
analisados quanto a atividade enzimática. O gráfico demonstra a atividade enzimática
versus o tempo de cultivo……………………………………………………...………..45
Figura 12. Quantificação da atividade enzimática das endoglucanases dos sobrenadantes
de cultura do fungo W. circinata cultivado em diferentes fontes de carbono a 1%, pelo
ensaio de CMCase. Os sobrenadantes foram retirados nos tempos de 96 h e 120 h e
analisados quanto a atividade enzimática. O gráfico demonstra a atividade enzimática
versus o tempo de cultivo……………………………………………………………….47
Figura 13. Quantificação da atividade enzimática das celulases totais dos sobrenadantes
de cultura do fungo W. circinata cultivado em diferentes fontes de carbono a 1 %, pelo
ensaio de FPase. Os sobrenadantes foram retirados nos tempos de 96 h e 120 h e
analisados quanto a atividade enzimática. Os gráficos demostram a atividade enzimática
versus o tempo de cultivo…………………………………………...…………………..48
Figura 14. Quantificação da atividade enzimática das xilanases dos sobrenadantes de
cultura do fungo W. circinata cultivado em diferentes fontes de carbono a 1 %, pelo ensaio
de Xilanase. Os sobrenadantes foram retirados nos tempos de 96 h e 120 h e analisados
quanto a atividade enzimática. Os gráficos demostram a atividade enzimática versus o
tempo de cultivo…………………………………………….…………………………..49
Figura 15. Efeito do pH na atividade enzimática de endoglucanases presentes no
sobrenadante de cultura contendo 1% de FT. A concentração iônica para todos os tampões
foi de 50 mM: citrato de sódio - CS (pH 3 a 5,5), fosfato de sódio - FS (pH 6 a 7,4), Tris-
HCl - T (pH 7,7 e 8,2), Glicina Citrato Fosfato – GCF (pH 2 a 11)……………………52
Figura 16. Efeito do pH na atividade enzimática de xilanases presentes no sobrenadante
de cultura contendo 1% de FT. A concentração iônica para todos os tampões foi de 50
mM: citrato de sódio - CS (pH 3 a 5,5), fosfato de sódio - FS (pH 6 a 7,4), Tris-HCl - T
(pH 7,7 e 8,2), Glicina Citrato Fosfato – GCF (pH 2 a 11)………………………………53
Figura 17. Efeito da temperatura na atividade enzimática de endoglucanases do
sobrenadante de cultura do fungo induzido com 1% de FT……………………………...54
Figura 18. Efeito da temperatura na atividade enzimática de xilanase do sobrenadante de
cultura do fungo induzido com 1% de FT……………………………………………….54
Figura 19. Perfil de proteínas secretadas pelo fungo W. circinata, presentes no
sobrenadante de cultura frente as diferentes fontes de carbono Gel de poliacrilamida SDS-
PAGE (12,5%), corado com azul de coomassie. MM – Marcador de Massa Molecular; 1
– 0,1% de Glicose 96 horas; 2 – 0,1% de Glicose 120 horas; 3 – BCA 96 horas; 4 – BCA
120 horas; 5 – PA 96 horas; 6 – PA 120 horas; 7 –FT 96 horas e 8 – FT 120 horas……...55
Figura 20. Quantificação da atividade das celobiohidrolases dos sobrenadantes obtidos
do cultivo W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de nitrogênio em
concentrações diferentes (1, 1,5 e 2 %), pelo ensaio de Avicelase. Foram coletadas
amostras da cultura nos tempos de 48, 72, 96 e 120 horas. C. EXP – Controle do
experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura; PEP – Peptona; UR
– Ureia…………………………………………………………………………………..57
Figura 21. Quantificação da atividade das Endoglucanases dos sobrenadantes obtidos do
cultivo W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de nitrogênio em
concentrações diferentes (1, 1,5 e 2 %), pelo ensaio de CMCase. Foram coletadas
amostras da cultura nos tempos de 48, 72, 96 e 120 horas. C. EXP – Controle do
experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura; PEP – Peptona; UR
– Ureia…………………………………………………………………………………..58
Figura 22. Quantificação da atividade das celulases totais dos sobrenadantes obtidos do
cultivo W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de nitrogênio em
concentrações diferentes (1, 1,5 e 2 %), pelo ensaio de FPase. Foram coletadas amostras
da cultura nos tempos de 48, 72, 96 e 120 horas. C. EXP – Controle do experimento; C.A
– Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura; PEP – Peptona; UR – Ureia………….60
Figura 23. Quantificação da atividade das xilanases dos sobrenadantes obtidos do cultivo
W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de nitrogênio em
concentrações diferentes (1, 1,5 e 2 %), pelo ensaio de xilanase. Foram coletadas amostras
da cultura nos tempos de 48, 72, 96 e 120 horas. C. EXP – Controle do experimento; C.A
– Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura; PEP – Peptona; UR – Ureia……….61
Figura 24. Perfil de proteínas secretadas pelo fungo W. circinata nos sobrenadantes de
cultura frente as diferentes suplementações de nitrogênio. Gel de poliacrilamida SDS-
PAGE (12,5%), corado com azul coomassie. MM – Marcador de Massa Molecular; 1 -
C. EXP; 2 – C.A 1%; 3 – C.A 1.5 %; 4 – C.A 2%; 5 – E. L 1%; 6 – E.L 1.5%; 7 – E.L
2%; 8 – PEP 1%; 9 – PEP 1,5%; 10 – PEP 2%; 11 – UR 1%; 12- UR 1,5% e 13 – UR
2%....................................................................................................................................66
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição de alguns resíduos agroindustriais……………………………...24

Tabela 2. Atividade enzimática dos ensaios realizados a partir do sobrenadante de cultura
de W. circinata cultivado em meio mínimo em 96 e 120 horas de cultivo……………….50
Tabela 3. Atividade enzimática das celobiohidrolases dos sobrenadantes obtidos do
cultivo W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de nitrogênio. C. EXP
– Controle do experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura; PEP –
Peptona; UR – Ureia………………………………………...…………………………..57
Tabela 4. Atividade enzimática das endoglucanases dos sobrenadantes obtidos do cultivo
W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de nitrogênio. C. EXP –
Controle do experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura; PEP –
Peptona; UR – Ureia………………………………………...…………………………..59
Tabela 5. Atividade enzimática das celulases totais dos sobrenadantes obtidos do cultivo
W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de nitrogênio. C. EXP –
Controle do experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura; PEP –
Peptona; UR – Ureia………………………………………...…………………………..60
Tabela 6. Atividade enzimática das Xilanases dos sobrenadantes obtidos do cultivo W.
circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de nitrogênio. C. EXP – Controle
do experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura; PEP – Peptona;
UR – Ureia……………………………………………………..……………………….62
Tabela 7. Análise de variância (ANOVA) para atividades enzimáticas………...………63
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA - Análise de Variância segundo método de Fisher

AR - Açúcares Redutores
BCA - Bagaço da Cana-de-Açúcar
BDA - Meio Ágar Batata Dextrose
C.A - Cloreto de amônio
C.EXP - Controle do Experimento
CBFs - Controle Biológico Fúngico
CMC – Carboximetilcelulose
DNS - Ácido dinitrosalicílico
E.L - Extrato de Levedura
FM - Fungos Micorrízicos
FMO - Fungos Micorrízicos de Orquídea
FS - Fermentação Submersa
FSL - Fermentação Submersa Líquida
FT - Farelo de Trigo
GLI - Glicose
kDa – Unidade de Massa Atômica
MM - Meio Mínimo
NaNO3 - Nitrato de sódio
NaOH - Hidróxido de sódio
P.A - Persulfato de amônio
PA - Palha de Arroz
PEP - Peptona
PT - Palha de Trigo
RA - Resíduos Agroindustriais
SDS - Dodecil Sulfato de Sódio
SM - Sabugo de Milho
TCA - Ácido tricloroacético
UR - Ureia.
SUMARIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 16
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................................. 17
2.1 Waitea circinata ....................................................................................................... 17
2.1.1 Fungos Micorrízicos .............................................................................................. 19
2.1.3 Fungos de controle biológico ................................................................................ 20
2.2 BIOMASSA VEGETAL .......................................................................................... 22
2.2.1 Celulose ................................................................................................................. 24
2.2.2 Hemicelulose ......................................................................................................... 25
2.2.3 Lignina ................................................................................................................... 26
2.3 Sacarificações enzimática da lignocelulose .............................................................. 27
2.3.1 Ação das celulases ................................................................................................. 27
2.3.2 Ação das hemicelulases ......................................................................................... 29
2.4 Produção de enzimas fúngicas por fermentação submersa ...................................... 31
3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 32
3.1 Geral ......................................................................................................................... 32
3.2 Específicos: ............................................................................................................... 32
4. METODOLOGIA DO PLANO DE TRABALHO .................................................... 33
4.1 Cultivo do Micro-organismo .................................................................................... 33
4.1.1 Caldo de Batata ...................................................................................................... 33
4.1.2 Meio ágar batata dextrose (BDA) .......................................................................... 33
4.2 Preparo do substrato ................................................................................................. 34
4.3 Produção de celulases e xilanases por fermentação submersa ................................. 34
4.3.1 Meio Mínimo – MM (Pontecorvo et al., 1953) ..................................................... 34
4.4 Dosagem enzimática ................................................................................................. 35
4.4.1 Soluções necessárias para a realização das dosagens enzimáticas ........................ 35
4.4.2 Reações Enzimáticas ............................................................................................. 36
4.5 Caracterização Bioquímica das Enzimas .................................................................. 40
4.5.1 Determinação do pH ótimo ................................................................................... 40
4.5.2 Determinação da temperatura ótima ...................................................................... 41
4.6 Dosagem de proteínas............................................................................................... 41
4.7 Análise de proteínas em gel de Poliacrilamida Desnaturante (SDS-PAGE) ............ 41
4.7.1 Soluções:................................................................................................................ 41
4.7.2 Preparo dos géis ..................................................................................................... 43
4.7.3 Revelação das proteínas por coloração do gel com Azul de Coomassie ............... 43
4.7.4 Procedimento ......................................................................................................... 44
4.8 Análise Estatística .................................................................................................... 44
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 45
5.1 Fontes de carbono ..................................................................................................... 45
5.1.1 Atividade de celobiohidrolases .............................................................................. 45
5.1.2 Atividade de endoglucanases................................................................................. 46
5.1.3 Atividade de celulases totais ................................................................................. 47
5.1.4 Atividade de xilanases ........................................................................................... 48
5.1.5 Análise estatística .................................................................................................. 50
5.1.6 Determinação do pH ótimo ................................................................................... 52
5.1.7 Determinação da temperatura ótima ...................................................................... 53
5.1.8 Análise do perfil proteico em SDS-PAGE ............................................................ 55
5.2 Otimização da produção enzimática – suplementação do meio com diferentes fontes
de nitrogênio ................................................................................................................... 56
5.2.1 Atividade de celobiohidrolases .............................................................................. 56
5.2.2. Atividade das endoglucanases .............................................................................. 58
5.2.3 Atividade de celulases totais ................................................................................. 59
5.2.4 Atividade das xilanases ......................................................................................... 61
5.2.5 Análise estatística .................................................................................................. 63
6. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 67
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................... 68
8. REFERENCIAS ......................................................................................................... 69
16
1. INTRODUÇÃO
No Brasil, além de existir uma abundante diversidade de resíduos

lignocelulolíticos, há também uma vasta variedade de micro-organismos a serem
estudados, estimulando a busca por fungos que sejam capazes e eficientes na degradação
desses substratos (BASSO; GALLO; BASSO, 2011).
Os materiais lignocelulósicos são fontes de carbono oriundos de resíduos
agroindustriais, urbanos e de madeiras de angiosperma e gimnospermas (JARDINE;
DISPATO; PERES, 2009; KUMAR; SINGH; SINGH, 2008), sendo que a agroindústria
é o maior contribuinte de resíduos lignocelulósicos. Por não serem reaproveitados, estes
resíduos apresentam perda de biomassa e nutrientes de alto valor, além de elevar o preço
do produto a ser produzido. Atualmente, conceitos de recuperação, aproveitamento de
subprodutos e bioconversão de resíduos são cada vez mais difundidos e necessários para
garantir a viabilidade econômica e biocompatibilidade das cadeias agroindustriais, assim
como reduzir o impacto ambiental que o acúmulo destes resíduos provoca (WANG et al.,
2012).
A biomassa lignocelulósica é constituída por três principais frações poliméricas:
celulose (40-50%), hemicelulose (15-30%) e lignina (10-30%), além de proteínas,
lipídios e composto inorgânicos. Sua composição, em quantidade, depende de diversos
fatores como o tipo de vegetal, condições de crescimento e tempo de colheita, entre outros
(PANDEY; SOCCOL; MITCHELL, 2000; SILVA, 2010).
Os substratos lignocelulósicos são degradados por meio da ação de várias enzimas
como as celulases, β-glicosidases, xilanases, lacases, manganês – peroxidases e lignina
peroxidases (AGUIAR; FERRAZ, 2011). Como os fungos produzem estas enzimas, os
mesmos são capazes de hidrolisar a lignocelulose em compostos de fácil assimilação para
o seu metabolismo. Estas enzimas agem em conjunto e sinergisticamente, destacando-se
a ação das celobiohidrolases, endoglucanases, β-glucosidases e xilanases
(VALÁŠKOVÁ; BALDRIAN, 2006).
Dentre os micro-organismos produtores de enzimas lignocelulolíticas, destacam-
se os fungos, em especial os fungos filamentosos destacam por serem capazes de secretar
eficientemente as enzimas que conseguem degradar celulose e hemicelulose. Eles são
preferencialmente utilizados em pesquisas de hidrólises, por apresentarem um elevado
potencial de produção e secreção de enzimas, alcançando até 20 g/L de cultura,
versatilidade em meios de cultura líquido e sólidos e variabilidade de manipulação
17
genética e metabólica (KNOWLES, et al., 1987; GILKES et al., 1991). Esses micro-
organismos são geralmente encontrados em ambientes onde se acumulam estes resíduos,
tendo potencial para serem aplicados na degradação da lignocelulose (BÉGUIN;
AUBERT, 1994).
A produção e secreção de enzimas por fungos filamentosos é estimulada pelas
fontes de carbono e de nitrogênio presentes no meio de cultivo. Estudos demonstram que
algumas celulases têm a sua produção influenciada pela fonte de carbono e pela
composição do meio de crescimento (LAURUENGTANA; PINPHANICHAKARN,
2006). Meios enriquecidos com peptona e cloreto de amônio, que são fontes de
nitrogênio, apresentam aumentos de 34,7 e 67,8%, na produção de enzimas, quando
comparadas ao controle (ZIMBARDI, 2014). Fungos do gênero Aspergillus e
Trichoderma são amplamente utilizados em processos de hidrólise, por serem excelentes
fontes de enzimas comerciais (GILKES et al., 1991; KUMAR; SHUKLA, 2016).
Sabe-se que fungos micorrizos como W. circinata (telemórfico do Rhizoctonia)
atuam como ótimos agentes no controle biológico, isso ocorre devido ao fato do micro-
organismo conseguir produzir enzimas hidrolíticas e produtos não-voláteis, os quais
atuam diretamente no biocontrole de fitopatógenos (CARVALHO et al., 2015).
Neste estudo pretende-se avaliar a produção de celulases e xilanases pelo fungo
W. circinata, com intuito de compreender os mecanismos de ação desse fungo frente a
alguns fitopatógenos, e de utilizar estas enzimas na hidrólise de substratos
lignocelulósicos.
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Na fundamentação teórica serão apresentadas características importantes do

micro-organismo utilizado, principais constituintes da biomassa vegetal, tratamento da
fonte de carbono utilizada, importância de alguns parâmetros dos ensaios, produção de
enzimas lignocelulolíticas, e o mecanismo de ação na degradação da biomassa vegetal.
2.1 Waitea circinata
O Waitea circinata foi isolado das raízes de Epidendrum nocturnum (Orquídeas

do cerrado), coletadas na Reserva Biológica Prof. José Ângelo Rizzo - Serra Dourada
18
(16o 4’36,4”S, 50o 11’16,9”W, 1006 m de altitude), Goiás – Brasil, como pode ser
observado na figura 1 (DE SOUSA SILVA et al., 2016).
W. circinata (Warcup & Talbot), é teleomorfo do Rhizoctonia oryzae (Ryker &
Gooch) e Rhizoctonia zeae (Voorhees). É um fungo patogênico do tipo necrótico, que
causa a queima da bainha em várias plantações no Brasil, em especial no cultivo do arroz
(NUNES; RIBEIRO; TERRES, 2004).
Figura 1. Plântulas com o isolado fúngico (Waitea circinata) sessenta dias após a
micorrização, em raízes de Epidendrum nocturnum, orquídea rupícola de Cerrado.
Adaptado: de (DE SOUSA SILVA et al., 2016).
O W. circinata é um Fungo Micorrízicos de Orquídea (FMO), isolado de raízes

da orquídea rupícola do Cerrado é cultivado em meio BDA (figura 2) no qual são vitais
para a germinação destas plantas, e os mesmos também são relatados como possíveis
Fungo de Controle Biológico (FCBs) tanto por antagonismo direto aos patógenos, quanto
por indução de resistência no hospedeiro (CARVALHO et al., 2015; MOSQUERA-
ESPINOSA et al., 2013).
Fungos micorrízicos, como o W. circinata auxiliam na germinação das sementes,
no estabelecimento das plântulas e na nutrição da orquídea adulta na
natureza(AGARWAL, 2010; DEARNALEY; MARTOS; SELOSSE, 2012).
Estudos realizados visualizaram a eficiência na indução no desenvolvimento
simbiótico in vitro de plântulas de E. nocturnum (Figura 1) (DE SOUSA SILVA et al.,
2016). Este mesmo micro-organismo também foi eficiente em germinar sementes de uma
19
orquídea epífita, Cyrtopodium saintlegerianum, que também é encontrada no Cerrado

brasileiro (SOUSA et al., 2017).
Figura 2. Isolado fúngico micorrízico de orquídeas Waitea circinata, em placa

contendo meio BDA, em 15 dias de cultivo.
2.1.1 Fungos Micorrízicos
Os fungos micorrízicos (FM) ao se associarem com plantas, como as orquídeas

facilitam a absorção de nutrientes (PETERSON; MASSICOTTE; MELVILLE, 2004).
Além disso, os FM oferecem às orquídeas aumento na absorção da água, de nutrientes
essenciais, como fósforo, zinco, manganês e cobre, e também as protegem contra o ataque
por fungos patogênicos e nematoides (LIMA; KAPLAN; CRUZ, 2003).
Segundo (OGOSHI, 1987) o gênero Rhizoctonia sp. foi descrito em 1815 por De
Candolle, e a espécie R. solani é a mais conhecida por ser um fitopatógeno de importância
agrícola e florestal. Rhizoctonia sp. engloba espécies micorrízicas, fitopatogênicas e
saprófitas (AGARWAL, 2010). Sabe-se que o gênero Rhizoctonia sp. pode ocorrer em
associação endofítica com espécies florestais, como por exemplo Pinus spp. (SEN;
HIETALA; ZELMER, 1999), e também em associações micorrízicas com E. nocturnum
(SOUSA, 2012).
São poucos os trabalhos encontrados na literatura sobre uso de fungos
rizoctonioides micorrízicos de orquídeas utilizados no biocontrole de fitopatógenos,
sendo que Mosquera-espinosa et al. (2013) avaliaram a patogenicidade de isolados
micorrízicos de orquídeas de Ceratobasidium spp. em arroz e verificaram que alguns
isolados produziram sintomas de queima da bainha, mas com incidência
20
significativamente menor que na testemunha (R. solani). Entre os isolados de orquídeas

Ceratobasidium spp. e Tulasnella spp., não houve diferença quanto a incidência de
queima da bainha.
2.1.3 Fungos de controle biológico
A definição de controle biológico, segundo, (MÉNDEZ; MONDINO, 1999) é o

uso de micro-organismos antagônicos que, de alguma forma, interferem na vida dos
patógenos ou no desenvolvimento de atividades determinantes da doença, tornando-se
uma estratégia sustentável para a proteção de plantas (CHAN; MCCORMICK; SEIFERT,
2003).
O controle biológico (CB) é uma medida de controle que pode ser somada ao
controle químico, possibilitando a diminuição do número de aplicações de fungicidas
(MELO & AZEVEDO, 1988; KUPPER; GIMENES-FERNANDES; GOES, 2003) e que
quando inserido no manejo integrado pode assegurar uma agricultura sustentável
resultando em uma maior viabilidade econômica (LAHLALI; HIJRI, 2010).
O biocontrole abrange a interação entre patógeno, hospedeiro e micro-organismos
não patogênicos, sob a influência do ambiente (MELO & AZEVEDO, 1988). Este pode
ser alcançado por práticas que favoreçam os micro-organismos nativos ou selecionados
pelas propriedades antagônicas (ANGONESE et al., 2009). O controle biológico possui
algumas vantagens e desvantagens em relação ao controle químico. A principal vantagem
é a ausência de resíduos químicos nos alimentos e no ambiente. Já a desvantagem é a
ineficiência do antagonista contra alguns patógenos (MIZUBUTI & MAFFIA, 2009), e a
reprodução dos resultados em condições de campo nem sempre ser consistente
(BEDENDO et al., 2011).
Um exemplo de controle biológico exercido por W. circinata pode ser observado
em estudo realizado por Souza (2018), onde observou-se que a inibição de isolados
fúngicos patogênicos, utilizando este FMO (Figura 3).
O CB tem como o objetivo de estudar a relação entre a ecologia e os seus
mecanismos de ação pode atuar como uma alternativa para a redução de agroquímicos no
controle de fitopatógenos (LANNA FILHO; FERRO; DE PINHO, 2010). Ademais, o
conhecimento sobre métodos de controle da doença que sejam seguros ainda é restrito
(CÔRTES et al., 2014). Alguns fungos são considerados importantes agentes de
biocontrole de doenças de plantas e apresentam a capacidade de controlar alguns agentes
21
fitopatogênicos, assim como de atenuar o estresse abiótico. Os benefícios ocorrem devido

a capacidade destes agentes de reprogramarem a expressão de genes na planta,
possivelmente através da ativação de um número limitado de rotas metabólicas no
hospedeiro (SHORESH; HARMAN; MASTOURI, 2010).
Figura 3. Isolados fúngicos patogênicos (Ro88 e Rh24F1) e fungo micorrízico

orquidoide W. circinata (FMO) utilizados no pareamento in vitro, em meio DBA
observando a inibição dos fungos patogênicos.
Adaptado: de (SOUSA, 2018).

a) Pareamento em BDA dos isolados Ro88 e FMO; b) Pareamento em BDA dos isolados Rh24F1
e FMO.
Com o objetivo de aumentar a produção agrícola com sustentabilidade, destaca-

se o uso de Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas, actinomicetos, fungos
micorrízicos e metabólitos secundários. Os FM favorecem a absorção de água e nutrientes
pelas plantas e podem constituir uma barreira física para patógenos, atuando como
supressores de doenças em plantas (LIMA; KAPLAN; CRUZ, 2003). Já existem relatos
que a simbiose com fungos micorrízicos desencadeia alterações sistêmicas na expressão
gênica e conferem maior resistência a doença do arroz, brusone (CAMPOS-SORIANO;
GARCÍA-MARTÍNEZ; SEGUNDO, 2012).
Segundo Mizubuti & Maffia (2009) existem diferentes mecanismos para que um
organismo possa exercer o controle biológico sobre os patógenos, como a antibiose,
competição, hiperparasitismo, indução de resistência, alelopatia e hipovirulência. Ainda
de acordo com (FILIPPI et al., 2011), o uso de indutores bióticos e abióticos de resistência
é uma das principais estratégias de controle biológico da brusone do arroz para aumentar
a durabilidade da resistência e reduzir os resíduos tóxicos provocados pelos fungicidas.
Além disso, outros mecanismos de ação foram observados no controle biológico
de fitopatógenos, como a produção de enzimas hidrolíticas, produção de compostos
antifúngicos voláteis e não voláteis, indução de resistência, produção de sideróforos e
22
compostos promotores de crescimento vegetal, além de micoparasitismo (EL-

TARABILY & SIVASITHAMPARAM, 2006).
As enzimas líticas presentes na parede celular dos microrganismos são muito
utilizadas no biocontrole de doenças de plantas. Os fungos produtores dessas enzimas
podem inibir o crescimento de muitas doenças fúngicas e dessa forma, podem contribuir
para a formulação de biofungicidas e assim contribuir para uma agricultura mais
sustentável (BRZEZINSKA et al., 2014).
Fungos que decompõem substâncias celulósicas são amplamente encontrados no
solo, colonizando vegetais e reciclando nutrientes (RUEGGER; TAUK-TORNISIELO,
2004), além de que sua característica patogênica pode ser sugerida pela caracterização de
enzimas extracelulares (DE OLIVEIRA SILVA et al., 2006). (LOPES et al., 2012) ao
avaliar a produção enzimática por isolados de Trichoderma na presença da parede celular
de Sclerotinia sclerotiorum concluiu que todos os isolados testados secretaram enzimas.
As celulases produzidas por micro-organismos podem também atuarem sobre a
parede celular vegetal desestruturando-a e facilitando o processo de invasão do vegetal
(FARINAS, 2011; ORLANDELLI et al., 2012).
2.2 BIOMASSA VEGETAL
Anualmente são produzidas cerca de 150 a 200 milhões de toneladas de matéria

orgânica, derivado da vegetação das florestas, pastos, pântanos, indústrias, entre outros.
Esta matéria é a biomassa vegetal, sendo composta principalmente por materiais
lignocelulósicos (DEKKER, et al.,1985).
Sendo que os resíduos agroindustriais (RA), se destacam no Brasil, devido a sua
obtenção após o processamento de matérias primas, como o bagaço da cana-de-açúcar
(BCA), oriundo da produção açucareira. Somente este resíduo gera anualmente cerca de
147 milhões de toneladas, se somada com a palha de cana, soja, arroz e o sabugo de milho
juntos produzem cerca de 606 milhões de toneladas em um ano, sendo que
aproximadamente 105 milhões de toneladas correspondem a celulose (CASTRO;
PEREIRA JR, 2010; ROSAN; ALCÂNTARA, 2016).
O termo biorrefinaria tem se difundido nos últimos tempos, é um conjunto de
instalações industriais que integra processos de conversão de biomassa e equipamentos
para a produção de combustíveis, energia e produtos químicos oriundos da biomassa.
Uma biorrefinaria tem como objetivo utilizar de forma completa os componentes da
23
biomassa disponível, para produção de alimentos, combustíveis, produtos químicos,

energia e calor, de forma a maximizar o retorno econômico do investimento realizado
(DA SILVA JÚNIOR, [s.d.]).
O BCA é um resíduo lignocelulósico muito abundante, entretanto muito pouco
aproveitado. A cada tonelada de cana-de-açúcar utilizada nas usinas, 75% do resíduo
produzido é destinado à incineração para obtenção de energia elétrica e os outros 25%
são depositados em aterros, sendo que poderiam ser reutilizados para a produção de etanol
de segunda geração, demonstrando a necessidade que se tem de reaproveitar os resíduos
lignocelulósicos (ANDRIETTA, 2009; BOOPATHY; DAWSON, 2008).
Além do BCA, diversos resíduos e produtos agroindustriais, como mandioca, soja,
beterraba, batata doce, farelo e palha de trigo e arroz, casca de soja, milho e arroz, resíduos
da indústria de processamento de café (polpa e casca), entre outros, ricos em materiais
lignocelulósicos, também podem ser utilizados em bioprocessos (PANDEY; SOCCOL;
MITCHELL, 2000; SILVA, 2018). Esta tamanha diversidade de resíduos tem sido
aplicada como substrato para a produção de biocombustíveis, reduzindo os impactos
ambientais causados pelo acúmulo dos mesmos na natureza (JOHNSON, 2016).
Figura 4. Imagem demonstrativa de como é estruturada a lignocelulose.
Fonte: Adaptado de (RUBIN, 2008).
A lignocelulose é responsável por conferir força, suporte e rigidez, constituído

pela celulose, hemicelulose, lignina e pectina (figura 4). Esses polissacarídeos não são
distribuídos de maneira uniforme nas plantas, sendo que sua composição difere de uma
região morfológica a outra nas plantas (QUEIROZ, 2017), se encontram estruturados de
24
forma complexa e estabelecendo uma rede muito resistente, contra a ação de micro-
organismos (CASTRO; PEREIRA JR, 2010). A celulose e hemicelulose são
macromoléculas constituídas por diferentes açúcares; e a lignina é uma macromolécula
aromática sintetizada a partir de precursores fenilpropanóides. Estes polímeros
encontram-se conectados por ligações covalentes e não covalentes, formando uma malha
entrelaçada na parede das células vegetais (SÁNCHEZ, 2009).
A composição de vários materiais lignocelulósicos tem sido reportada na literatura
e pode variar dependendo da espécie, do tecido vegetal, da fase de crescimento, idade,
dentre outros. O BCA e o Farelo de Trigo (FT), bem como os demais resíduos
lignocelulósicos, apresentam teor de celulose, hemicelulose e lignina que pode se
diferenciar dependendo das variedades, como mostrado na Tabela 1.
Tabela 1. Composição de alguns resíduos agroindustriais.

Biomassa Celulose Hemicelulose Lignina Referência
Bagaço de cana 35 – 42,2 % 25 – 27,6% 22% (DE MORAES
de açúcar (BCA) ROCHA et al.,
2015; REZENDE
et al., 2011)
Palha de Trigo 35 – 46% 23 – 27% 19 -21% (CHEN et al.,
(PT) 2015; ZHONG et
al., 2015)
Palha de Arroz 32-41% 21-24% 09-18% (VAN DYK;
(PA) PLETSCHIKE,
2012)
Sabugo de milho 45% 35% 15% (HOWARD et al.,
(SM) 2004)
Farelo de trigo 11% 39% 5% (CRIPWELL et

(FT) al., 2015)
Fonte: Adaptado de CINTRA (2016).
A lignocelulose é altamente resistente à hidrólise e ao ataque biológico devido a

conformação estrutural da celulose e a sua associação com a lignina, hemicelulose, amido,
proteínas e minerais (SILVA, 2018; ZIMBARDI, 2014).
2.2.1 Celulose
25
A celulose é um homopolissacarídeo constituído por até 15.000 unidades de

monômeros de β-D-glicose unidas por ligações O-glicosídicas do tipo β,1-4, formando
uma estrutura linear, como pode ser observado na figura 5 (ARANTES; SADDLER,
2010). A existência de ligações β-1,4, ligações de hidrogênio inter e intramoleculares
torna a celulose altamente cristalina, insolúvel em água, resistente a tensão e não digerível
pelo ser humano (FARINAS, 2011; ZIMBARDI, 2014; SILVA, 2018).
Figura 5. Moléculas de glicose unidas entre si por ligações glicosídicas do tipo β-

1,4, mostrando o sistema de numeração dos carbonos e a configuração da ligação
glicosídica.
Adaptado: por Farinas (2011).
2.2.2 Hemicelulose
A hemicelulose é o segundo maior componente da lignocelulose, e também o

segundo polissacarídeo natural mais abundante do mundo. A hemicelulose é um
heteropolissacarídeo complexo e altamente ramificado, constituída por diferentes
açúcares como resíduos de pentoses (β-D-xilose, α-L-arabinose), de hexoses (D-glicose,
D-galactose, D-manose), e ácidos urônicos (COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005;
GÍRIO et al., 2010).
A cadeia principal ou linear é constituída por resíduos de monossacarídeos, como
pentoses ou hexoses, formadas por 2 a 6 açúcares diferentes unidos por ligações do tipo
β-1,4 glicosídicas e, às vezes, por ligações do tipo β-1,3-glicosídicas (ASPINALL, 1959;
SÁNCHEZ, 2009).
Já as ramificações e as cadeias laterais presentes, são compostas por resíduos de
ácidos urônicos (α-D-glucurônico, α-D-4-O-metilgalacturônico e α-D-ácidos
galacturônico, D-galactose), grupos acetil, que ao interagirem com a celulose, acabam
por conferir estabilidade e flexibilidade à lignocelulose (figura 6) (COLLINS; GERDAY;
FELLER, 2005; PAULY; KEEGSTRA, 2016).
26
Por ser um polissacarídeo altamente ramificado e amorfo, à hemicelulose

apresenta uma facilidade em ser hidrolisada liberando seus monossacarídeos (FARINAS,
2011; PAULY; KEEGSTRA, 2016).
Figura 6. Estrutura química da molécula de xilana.
Fonte: Adaptado de Collins; Gerday; Feller, (2005) e Farinas (2011).
A hemicelulose é designada, de acordo com os açúcares prevalentes, como

glucanas, xilanas, mananas e galactanas. Também estão presentes em pequenas
quantidades os α-L-ramnose e α-L-fucose e os grupos hidroxilas dos açúcares podem ser
parcialmente substituídos por grupos acetil (GÍRIO et al., 2010).
Dentre os polissacarídeos presentes na hemicelulose a xilana é a mais abundante,
sendo constituída principalmente por xilose conectados por ligações β-1,4, apresenta
estrutura variável podendo encontrar-se como um homopolissacarídeo não ramificado, ou
como um heteropolissacarídeo altamente ramificado, e são suas ramificações que
determinam sua organização, solubilidade e a reatividade da molécula de xilana
(COLLINS; GERDAY; FELLER, 2005; GÍRIO et al., 2010; SÁNCHEZ, 2009).
2.2.3 Lignina
Outro constituinte da lignocelulose é a lignina, é um heteropolímero aromático

(figura 7), composto por unidade de fenilpropano, insolúvel em água, apresenta estrutura
amorfa e altamente ramificada. Sua estrutura aromática lhe confere rigidez a parede
celular, coesão a estrutura celular e proteção contra ação de micro-organismos(EMMEL,
2012; FENGEL; WEGENER, 1983; PEREIRA, 2013; ZIMBARDI, 2014), sua estrutura
e composição química varia de acordo com a fonte de origem (CALVO-FLORES et al.,
2015; SILVA, 2010).
27
Figura 7. Principais monômeros que constituem a molécula de lignina.
Fonte: Adaptado de Fengel; Wegener (1983).
2.3 Sacarificações enzimática da lignocelulose
A degradação da lignocelulose pela ação das enzimas, ocorre em meio

heterogêneo, no qual as enzimas estão dissolvidas na fase líquida e a lignocelulose
constitui a fase sólida (GAN; ALLEN; TAYLOR, 2003). A degradação ocorre pela ação
enzimática, a qual é realizada sob condições mais brandas de pH e temperatura, devido à
alta especificidade das enzimas pela biomassa vegetal, o que favorece a formação do
complexo enzima-substrato. Assim, torna-se possível a degradação das cadeias de
celulose e hemicelulose em monômeros de glicose e xilose, a uma taxa de conversão de
quase 100% (CASTRO; PEREIRA JR, 2010)
Fatores relacionados tanto à enzima quanto ao substrato podem influenciar o
processo de hidrólise, de forma que a composição do substrato, o tipo de pré-tratamento
empregado, e a carga e eficiência das enzimas utilizadas devam ser combinados da melhor
forma para que ocorra uma eficiente sacarificação do material lignocelulósico (ALVIRA
et al., 2010)
2.3.1 Ação das celulases
A hidrólise enzimática da celulose pelas celulases ocorre em três etapas principais,

que são: a adsorção das celulases na superfície da celulose, a quebra da celulose através
da ação sinérgica das celulases, e a dessorção da celulase do resíduo de celulose no
sobrenadante (OGEDA, 2011).
As celulases constituem um complexo de enzimas envolvidas na conversão da
celulose a glicose. As enzimas do sistema celulolítico foram classificadas com base no
28
modo de catálise sobre a fibra de celulose e em fungos há três classes principais de

enzimas hidrolíticas: endoglucanases, exoglucanases e β-glicosidases (JUTURU; WU,
2014).
Figura 8. Ilustração do complexo enzimático das celulases, demonstrando o

mecanismo de ação de cada enzima no processo de hidrólise da celulose. CBH –
celobiohidrolases, EG – endoglucanases, β-glicosidases, CBM - modulo de ligação
aos carboidratos e AA9 – enzimas auxiliares.
Fonte: Adaptado de Silveira et al. (2014).
A degradação da celulose se inicia, com a ação das endoglucanases (figura 8),

através da clivagem das ligações glicosídicas do tipo β-1,4, presentes na parte mais
amorfa da fibra, liberando cadeias menores e com extremidades redutoras e não redutoras.
A função dessas enzimas é reduzir o grau de polimerização da celulose, isso ocorre devido
ao sítio de ação das endoglucanases ser em forma de fenda, que quebra as ligações
presentes entre as fibras de celulose (DA SILVA; FRANCO; GOMES, 1997; FARINAS,
2011; OGEDA, 2011; TEERI, 1997).
Já as exoglucanases ou também denominadas celobiohidrolases, apresentam o
sitio catalítico em forma de túnel, necessitando que ocorra a penetração na cadeia de
celulose, forçando o deslocamento da celulose, podendo atuar nas extremidades redutoras
e não redutoras da celulose, liberando moléculas de celobiose (figura 8)(LYND et al.,
2002; SHARMA et al., 2016; ZHANG; HIMMEL; MIELENZ, 2006) .
As β-glicosidases atuam nos celo-oligossacarídeos e celobiose liberados e os
hidrolisam a glicose (LYND et al., 2002; SHARMA et al., 2016; ZANCHETTA, 2016),
29
sendo fundamental a sua ação enzimática, pois impede a modulação inibitória da

celobiose sobre as celobiohidrolases (SINGH et al., 2016).
Figura 9. Sinergismo entre endoglucanases, exoglucanases e celobiohidrolases na

degradação da estrutura da celulose.
Adaptado: por Farinas (2011).
Assim as endoglucanases, exoglucanases e β-glicosidases atuam de forma

sinergística sobre o substrato (HU et al., 2015), fazendo com que a velocidade de
formação de produtos aumente significativamente, quando comparado à velocidade de
ação isolada das enzimas. Enquanto que as endoglucanases aumentam a disponibilidade
de pontos de ação para as exoglucanases, as β-glicosidases diminuem a inibição das
exoglucanases pelo consumo da celobiose liberada, como pode ser observado na figura 9
(LASER et al., 2002).
No entanto, o acúmulo de glicose como principal produto de reação inibe
gradualmente as β-glicosidases, promovendo o acúmulo de celobiose e motivando os
efeitos inibitórios secundários mencionados (FOCKINK, [s.d.]).
2.3.2 Ação das hemicelulases
A degradação da hemicelulose, ocorre através do sistema de enzimas denominado

xilanolítico, que pela ação sinérgica dessas enzimas, vão degradar a cadeia de xilana em
30
unidades de xilose. Inicialmente atuam a endoxilanases, hidrolisando as ligações

glicosídicas internas de tipo β-1,4 da cadeia da xilana de forma aleatória, liberando xilo-
oligossacarídeos. Em seguida atuam as β-xilosidases, que hidrolisam os xilo-
oligossacarídeos, nas extremidades não redutoras liberando a xilose; ainda atuam as
endomananases que clivam ligações internas na cadeia de mananas, liberando os mano-
oligossacarídeos, e as β-manosidases que atuam nos mano-oligossacarídeos liberando
manose (SHALLOM; SHOHAM, 2003; KIRIKYALI; CONNERTON, 2015).
Figura 10. Esquema da composição da xilana e sistema enzimático envolvido na

degradação da xilana.
Fonte: Adaptado de Ratanakhanokchai et al. (2013).
Entretanto para que ocorra a hidrólise da xilana em xilose, esse sistema

xilanolítico, requer a ação de enzimas acessórias que auxiliam nesse processo, pois são
elas que removem as ramificações presentes na cadeia central de xilana, como a α-
arabinofuranosidases, que degradam as ligações do resíduo lateral de arabinofuranose
presente na cadeia principal de xilana; glucuronidases que clivam as ligações glicosídicas
do tipo α-1,2 entre o ácido glucurônico lateral e a cadeia central de xilana; as acetil xilana
esterases, que rompem as ligações entre o ácido acético e os C-2 e C-3 dos resíduos de
xilose; feruloil esterases, clivam as ligações do tipo éster entre ácido cumárico e ácido
fenólico e os resíduos de arabinofuranose. Assim todas estas enzimas atuam
sinergisticamente para converter a xilana em unidades de xilose, como pode ser observado
na figura 10 (SHALLOM; SHOHAM, 2003; POLIZELI et al., 2005; SÁNCHEZ, 2009;
GÍRIO et al., 2010).
31
2.4 Produção de enzimas fúngicas por fermentação submersa
A produção de enzimas fúngicas pode ser induzida pela fermentação submersa

(FS), definida como sendo aquela onde a fase aquosa é abundante. Este tipo de produção
apresenta a vantagem de possibilitar um melhor controle dos parâmetros do processo,
como temperatura, pH, aeração, agitação e concentração de nutrientes. Pode ser realizada
em frascos sob agitação, fermentadores de bancada ou fermentadores em escala
industrial. Todos esses fatores são importantes para o rendimento do produto de interesse,
e por esse motivo a fermentação submersa tem sido a mais empregada na indústria. São
conhecidos como inconvenientes do processo: a maior probabilidade de contaminação,
devido à maior quantidade de água; e o favorecimento à repressão catabólica, quando
comparada à fermentação em estado sólido, pelo fato de os açúcares (glicose) estarem
dispersos em todo o meio líquido (VAIDYANATHAN et al., 1999; LIMA; KAPLAN;
CRUZ, 2003; PANDEY, 2003; PAPAGIANNI, 2004; SÁNCHEZ, 2009).
Os fungos filamentosos vêm sendo empregados em diversos estudos visando à
produção de celulases em cultivo submerso, utilizando materiais lignocelulósicos como
substratos, como o: Aspergillus niger A12 (FLORENCIO et al., 2016), A. niger A12
(CUNHA et al., 2014), Trichoderma reesei Rut-C30 (FLORENCIO et al., 2016), T. reesei
ZU-02 (LIMING; XUELIANG, 2004), T. viride NCIM 1051 (ADSUL et al., 2004)
Penicillium echinulatum 9A02S1(CAMASSOLA; DILLON, 2014), P. janthinellum
NCIM 1171 (ADSUL et al., 2004), P. janthinellum (SINGHANIA et al., 2014) e P.
citrinum (DUTTA et al., 2008).
Estudos realizados com fungos filamentosos endofíticos isolados de plantas da
região Amazônica, buscaram testar a capacidade da produção de enzimas que degradam
material lignocelulósico pela FS (DA SILVA et al., 2013), em conjunto com os resultados
alcançados nestas e em outras pesquisas confirmam o potencial celulolítico e xilanolítico
dos fungos endofíticos, credenciando-os para a produção de produtos biotecnológicos,
como a obtenção do etanol de segunda geração (ALBANO, 2012).
32
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Avaliar a produção de celulases e xilanases pelo fungo micorrízico W. circinata em meios
enriquecidos com fontes de carbono e de nitrogênio.
3.2 Específicos:
• Analisar a produção de celulases e xilanases pelo fungo micorrízico W. circinata em

meio contendo bagaço de cana-de-açúcar (BCA), farelo de trigo (FT), glicose (GLI)
e palha de arroz (PA);
• Realizar a caracterização bioquímica das celulases e xilanases produzidas pelo fungo

W. circinata quanto a atividade em diferentes faixas de pH e temperatura;
• Avaliar o perfil proteico do sobrenadante de cultura do W. circinata em SDS-PAGE;
• Analisar a produção de celulases e xilanases pelo fungo micorrízico W. circinata em

meio lignocelulósico enriquecido com fontes de nitrogênio (extrato de levedura,
peptona, ureia, cloreto de amônio).
33
4. METODOLOGIA DO PLANO DE TRABALHO
4.1 Cultivo do Micro-organismo
Inicialmente o fungo W. circinata foi isolado da raiz de orquídeas do cerrado. W.

circinata foi cultivado em ágar batata dextrose (BDA), a 25 a 30 ºC, por 15 dias. Para a
obtenção do ágar batata dextrose, foi necessário a extração do amido da batata.
4.1.1 Caldo de Batata
Água destilada 500 mL

Batata (em pedaços) 200 g
A batata foi cozida por 20 min, deve-se mexer para que o amido seja extraído. O
caldo do cozimento da batata é coado e congelado para o posterior uso.
4.1.2 Meio ágar batata dextrose (BDA)
Ágar 20 g
Dextrose 20 g
Caldo de batata 500 mL
Homogeneizar todos os componentes e em seguida submeter a

autoclavagem. O meio e as placas de petri, utilizadas no cultivo do micro-organismo,
foram autoclavados a 120 ºC por 20 min. O meio foi distribuído nas placas de petri, para
o cultivo do fungo. O fungo foi inoculado nas placas contendo o BDA em câmara de
fluxo, seguindo as recomendações de assepsia e esterilização para que se evite
contaminação.
Após a realização do repique o W. circinta foi colocada na estufa em suas condições
propricias de
34
4.2 Preparo do substrato
Os substratos utilizados, foram submetidos a várias lavagens com água normal e

água destilada, para que fossem removidos todos os açúcares e resíduos presentes. Para
verificar se a remoção de açúcares do substrato foi eficiente realizou-se dosagem de
açúcar redutor pelo método do DNS (MILLER, 1959).
Tubos Água de lavagem Água destilada DNS

Controle ---- 500 µL 250 µL
Teste 500 µL ---- 250 µL
O ensaio foi incubado por 5 min à 100 ºC e após deixar 5 min no gelo. A leitura
foi realizada em espectrofotômetro a 550 nm.
Em seguida os substratos foram submetidos a secagem sobre o papel em
temperatura ambiente, para que a água fosse extraída, depois de totalmente secos, os
mesmos foram moídos no moinho, em 20 mersh, fragmentando os substratos em
pequenos pedaços, permitindo que o fungo degradasse facilmente o substrato.
4.3 Produção de celulases e xilanases por fermentação submersa
Inicialmente O fungo W. circinata foi cultivado por fermentação submersa líquida

(FSL) em Meio Mínimo (MM) (Pontecorvo et al., 1953), contendo as fontes de carbono
e nitrogênio nas diferentes concentrações testadas. Após 24, 48, 72, 96 e 120 h de cultivo,
o meio de cultura foi submetido a centrifugação (3.000 g, 15 min) e o sobrenadante de
cultura analisado quanto a atividade de FPAse, CMCase, Avicelase e Xilanase.
4.3.1 Meio Mínimo – MM (Pontecorvo et al., 1953)
NaNO3 0,6% (p/v)

KCl 0,05% (p/v)
KH2PO4 0,15% (p/v)
ZnSO4 0,001% (p/v)
FeSO4 0,001% (p/v)
(NH4)2SO4 0,25% (p/v)
35
Extrato de Levedura 0,25% (p/v)

Aferir o pH para 6,8
4.4 Dosagem enzimática
As atividades das endoglucanases, celobiohidrolases, β-glicosidases e

endoxilanases foram determinadas pelo método de detecção de açúcares redutores (AR)
liberados a partir de carboximetilcelulose, papel de filtro whatman n.1, celulose
microcristalina e xilana “beechwood” respectivamente – DNS (MILLER, 1959).
4.4.1 Soluções necessárias para a realização das dosagens enzimáticas
Tampão citrato de sódio 50 mM - pH 4,8
Ácido cítrico 0,1 M 23 mL

Solução de citrato de sódio 0,1 M 27 mL
Solução de Xilana 1% (p/v)
Xilana Beechwood (Sigma) 1 g (p/v)

Tampão citrato de sódio 50 mM, pH 4,8 (q.s.p) 100 mL
A xilana beechwood também foi dissolvida em tampão citrato de sódio 0,05 M pH

4,8 e, posteriormente, submetida a agitação constante por 10 min até a completa
solubilização.
Solução de Carboximetilcelulose CMC 2%
Carboximetilcelulose (CMC low viscosity - Sigma) 2 g (p/v)

36
A Carboximetilcelulose low viscosity foi dissolvida em tampão citrato de sódio

0,05 M pH 4,8 e, posteriormente, submetida a agitação constante por 10 min até a
completa solubilização.
Solução de Avicel 1%
Avicel (Sigmacell – Sigma) 1g

Solução glicose 20 µmol/mL

A solução foi preparada em tampão citrato de sódio 0,05 M pH 4,8.
DNS (ácido dinitrosalicílico)
Ácido 3,5-dinitrosalicílico 10,0 g

NaOH 19,8 g
Tartarato de sódio e potássio 300 g
Fenol 7,6 mL
Água destilada (q.s.p.) 1000 mL
Inicialmente, o DNS e o NaOH foram dissolvidos em água destilada.

Posteriormente foram adicionados o tartarato de sódio e potássio e o fenol. A solução foi
deixada sob agitação até ser observada a completa dissolução dos reagentes quando o
volume de água foi completado para 1000 mL. A solução final foi titulada com HCL 0,1
M, utilizando fenolftaleína como indicador (MILLER, 1959).
4.4.2 Reações Enzimáticas
Dosagem de xilanases
Reagentes Teste Branco do Experimento Branco do Aparelho

Amostra 10 µL --- ---
37
Tampão Citrato de --- --- 40 µL

Sódio
Xilana 1% 50 µL 50 µL ---
Foi incubado a 50 ºC durante 5 min e, em seguida, realizado choque térmico com

água gelada por 5 min e adicionou-se os reagentes a seguir:
Reagentes Teste Branco Branco

Experimento Aparelho
Amostra --- 10 µL ---
DNS 150 µL 150 µL 150 µL
Foi incubado a 100 ºC durante 5 min, em seguida interrompida a reação em banho

maria de água gelada, por 5 min. A leitura foi realizada no espectrofotômetro no
comprimento de onda de 540 nm.
Curva Padrão
Curva padrão foi estabelecida a partir de uma solução de xilose.
Reagentes Teste Branco

Aparelho
Solução de xilose 50 µL –
Tampão Citrato de sódio 40 µL 90 µL
DNS 150 µL 150 µL
Foi incubado a 100 ºC durante 5 min, em seguida a reação foi interrompida em

banho maria de água gelada por 5 min. Realizou-se a leitura no espectrofotômetro no
comprimento de onda de 540 nm e os valores obtidos foram aplicados, em um gráfico
(absorbância x concentração de xilose).
Dosagem de CMCase
38

Carboximetilcelulose 2% 50 µL --- 50 µL
Foi incubado a 50 ºC durante 1h e, em seguida, realizado o choque térmico em

banho maria de água gelada por 5 min e adicionou-se os reagentes a seguir.

DNS 150 µL 150 µL 150 µL
Foi incubado a 100 ºC durante 1 h, em seguida a reação foi interrompida em banho

maria de água gelada por 5 min. Realizou-se a leitura no espectrofotômetro no
Dosagem de FPase

Tampão de citrato de sódio 250 µL --- 500 µL
Papel de Filtro* 1 fita --- ---
*Papel filtro nº 1, 1,0 x 6,0 cm (50 mg), enrolado na forma de espiral
Foi incubado a 50 ºC durante 1 h e, em seguida, foi realizado choque térmico em

banho maria de água gelada por 5 min e adicionou-se os reagentes a seguir.

39
DNS 500 µL 500 µL 500 µL
Foi incubado a 100 ºC durante 5 min, em seguida foi interrompida a reação em

Dosagem de avicelase

Tampão citrato de sódio --- --- 375 µL
Avicel 1% 250 µL 250 µL ---
Foi incubado a 50 ºC durante 1 h sob agitação, em seguida foi interrompida a

reação em banho de água fria, e submetida a centrifugação a 10.000 g durante 10 min, foi
coletado o sobrenadante e adicionou-se os reagentes a seguir, em novos tubos, exceto o
“branco aparelho”, que permaneceu o mesmo.

Sobrenadante 375 µL 250 µL ---
coletado
DNS 250 µL 250 µL 250 µL

banho maria de água gelada por 5 min. A leitura foi realizada no espectrofotômetro no
comprimento de onda de 540 nm
Curva Padrão para Avicelase, FPase, CMCase

40
A curva padrão para Avicelase, FPase e CMCase, foi estabelecida a partir de uma
solução de glicose.
Reagentes Teste Branco

Aparelho
Solução de Glicose 50 µL –
Tampão de citrato de 450 µL 500µL
sódio
DNS 500 µL 500 µL

comprimento de onda de 540 nm e os valores obtidos foram aplicados, em um gráfico
(absorbância x concentração de glicose).
4.5 Caracterização Bioquímica das Enzimas
4.5.1 Determinação do pH ótimo
Avaliou-se o efeito do pH na atividade das enzimas, pelo ensaio de DNS,

realizando as reações descritas no 4.4.2, utilizando os tampões e seus respectivos pH,
descritos a seguir:
Tampão (50 mM) pH

Citrato de sódio 3,0 / 4,0 / 5,0 / 5,5
Fosfato de sódio 6,0 / 7,0 / 8,0
Tris-HCL 7,2 / 8,2
Carbonato de sódio 9,0 / 10,0 / 10,1
Glicina Citrato Fosfato 5,2 / 6,2 / 7,2
Para cada valor de pH foi determinada a atividade enzimática e, o maior valor de

atividade foi considerado como 100 %. Os demais valores foram correlacionados com
41
este, determinando assim a atividade enzimática relativa para cada pH. Plotou-se os
valores de atividade enzimática relativa versus o valor do pH.
4.5.2 Determinação da temperatura ótima
Avaliou-se o efeito da temperatura na atividade das enzimas, pelo ensaio de DNS,

realizando as reações descritas no 4.4.2, realizando nas temperaturas de 30, 40, 50, 60 e
70 °C.
A temperatura ótima foi determinada plotando os valores de atividade enzimática
relativa versus a temperatura de incubação.
4.6 Dosagem de proteínas
A concentração de proteínas foi determinada pelo método descrito por Bradford

(1976), utilizando albumina de soro bovino (BSA-Sigma) como padrão. Um volume de
10 μL da amostra de sobrenadante da cultura foi adicionado a 190 mL do reagente de
Bradford. Após incubação por 15 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz,
realizou-se a leitura de absorbância das amostras à 595 nm.
4.7 Análise de proteínas em gel de Poliacrilamida Desnaturante (SDS-PAGE)
4.7.1 Soluções:
Ácido tricloroacético (TCA)
Um volume de 1 mL de água destilada foi adicionado a 50 g de ácido

tricloroacético. Após todo o ácido ser dissolvido, adicionou-se água destilada suficiente
para um volume final de 50 mL e a solução obtida foi estocada a 4 ºC.
Persulfato de amônio (P.A.) 10% (P/V)
P.A. 1g
42
Dodecil sulfato de sódio (SDS) - 20%
SDS 20,0 g
Tampão de amostra para proteína (2x)
Tris-HCl 1 M pH 6,8 200 mM

SDS 4,0% (p/v)
β-Mercaptoetanol 4,0% (v/v)
Glicerol 20,0% (v/v)
Azul de bromofenol 0,1% (p/v)
Acrilamida: Bis-acrilamida (39:1)
Acrilamida 39% (p/v)

Bis-acrilamida 1% (p/v)
A solução foi filtrada em papel de filtro e estocada ao abrigo da luz a 4 ºC.
Tampão de corrida – Tris-glicina 5X (estoque)
Trizma Base 15,1 g

Glicina 72,0 g
SDS 5,0 g
Água destilada (q.s.p) 1L
Tris-HCl 1,5 M - pH 6,8
Trizma Base 12,1 g

Água destilada (q.s.p) 100 mL
O pH foi ajustado com HCl fumegante.
Tris-HCl 1 M - pH 8,8
43
Trizma Base 18,2 g

O pH foi ajustado com HCl fumegante.
4.7.2 Preparo dos géis
Os géis foram preparados conforme descrito na tabela a seguir:
Soluções Concentrador 4 % Separador 13 %

Acrilamida: Bis-acrilamida (39:1) 500 µL 4,1 mL
Tampão Tris-HCl pH 8,8 - 3,1 mL
Tampão Tris-HCl pH 6,8 630 µL -
Água destilada 3, 80 mL 5,150 mL
SDS 10 % 50 µL 125 µL
Persulfato de amônia 10 % 50 µL 125 µL
TEMED 5 µL 5 µL
4.7.3 Revelação das proteínas por coloração do gel com Azul de Coomassie
Solução corante
Coomassie blue R-250 0,2% (p/v)

Etanol 40% (v/v)
Ácido Acético Glacial 10% (v/v)
Solução descorante para gel corado com Coomassie Blue
Metanol (99,8%) 30 mL
Ácido Acético Glacial (99,7%) 7 mL
Água destilada (q.s.p) 100 mL
44
4.7.4 Procedimento
Preparo das amostras
As amostras proteicas foram precipitadas na presença de 10 % de TCA,

homogeneizadas e incubadas em banho de água fria e gelo durante 1 h, em seguida, foram
submetidas a centrifugação a 8.000 g a 4 ºC durante 10 min. O sedimento foi lavado duas
vezes com 500 µL de acetona P.A. gelada e centrifugado nas mesmas condições
anteriores. O sedimento obtido foi ressuspenso em 15 a 30 µL de tampão de amostra 2x,
em seguida foi submetido à fervura (100 °C) durante 5 min, e aplicado imediatamente no
gel ou estocado a -20 ºC.
Corrida eletroforética
A corrida foi conduzida em tampão de corrida 1x com a voltagem constante de
100 V, utilizando o sistema de eletroforese vertical.
Coloração com azul de Coomassie
Ao término da corrida, as bandas proteicas presentes no gel foram visualizadas

após a incubação deste durante 2 h sob agitação, na solução corante Azul de Coomassie,
em seguida pela descoloração, incubando o gel durante 30 min sob agitação, na solução
descorante.
4.8 Análise Estatística
Os resultados obtidos vão ser plotados em gráficos e tabelas para a melhor

visualização dos dados. E em seguida será realizada a análise de variância segundo
método de Fisher (ANOVA) pareado com o método baseado na estatística t de Student,
com nível de significância de 5%.
45
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inicialmente foram testadas as fontes de carbono, o sobrenadante de cultura foi

coletado nos tempos de 96 e 120 horas, e em seguida foram feitas dosagens enzimáticas.
5.1 Fontes de carbono
O fungo W. circinata foi capaz de crescer e produzir enzimas quando cultivado

em meio MM, contendo glicose a 0,1%, e BCA, PA e FT a 1%, como fontes de carbono.
Estes dados são importantes, visto que o principal objetivo deste estudo foi analisar se
esse micro-organismo era capaz de produzir celulases e xilanases nestas condições. Os
sobrenadantes de cultura do fungo apresentaram atividades para Avicelase (figura 11),
CMCase (figura 12), FPase (figura 13) e Xilanase (figura 14).
Todos os resultados foram plotados em gráficos, expressando os resultados da
atividade enzimática em U/mL que corresponde a quantidade de enzima que é capaz de
transformar 1 µmol de substrato em produto em 1 minuto por mL.
5.1.1 Atividade de celobiohidrolases
Figura 11. Quantificação da atividade enzimática das celobiohidrolases do

sobrenadante de cultura do fungo W. circinata cultivado em diferentes fontes de
carbono a 1%, pelo ensaio de Avicelase. Os sobrenadantes foram retirados nos
tempos de 96 h e 120 h e analisados quanto a atividade enzimática. O gráfico
demonstra a atividade enzimática versus o tempo de cultivo.
Celobiohidrolases
Atividae Enzimatica em U/mL
0,02
0,016
0,015
0,010
0,01 0,008
0,006 0,006 0,006 0,006 0,006
0,005
0
96 h 120 h
Tempo de Cultivo
GLI BCA PA FT
46
Nos ensaios de Avicelase, observou-se maior atividade enzimática das

celobiohidrolases, nos ensaios que continham o FT a 1%, sendo que em 96 horas de
cultivo obteve-se atividade de 0,016 U/mL e em 120 horas 0,010 U/mL, sendo superior
as demais fontes de carbono, sendo que os somente o ensaio que contém PA (0,008 U/mL)
em 96 horas consegui atividade superior aos seu respectivo controle, os demais ensaios
apresentaram atividade semelhante aos controles (0,006 U/mL).
Pereira (2013), ao cultivar variantes do fungo A. niger em meio MM por 168
horas, dosou atividade de celobiohidrolases de 0,009 U/mL em meio contendo BCA a 1%
e 0,009 U/mL em meio contendo FT 1%. Assim os resultados de atividade apresentados
neste trabalho se mostraram superiores quando cultivado em meio contendo FT a 1 %,
obtendo-se uma atividade 1,8 vezes maior (0,016 U/mL) que a apresentada por A. niger.
Entretanto os resultados de atividade celulolítica de fungos filamentosos, isolados
do solo da região norte do estado do Mato Grosso apresentados por Gerhardt et al. (2015),
se mostraram bem superiores aos apresentados por W. circinata. Os ensaios de avicelase,
com as linhagens Penicillium I produziram atividade de 0,64 U mL-1, Penicillium II de
0,57 U mL-1 e Penicillium V de 0,51 U mL-1. As demais linhagens analisadas também
produziram valores de atividade consideráveis desta enzima, acima de 0,25 U mL-1, com
exceção de Trichoderma I que apresentou atividade de 0,07 U mL-1, em 96 horas de
cultivo e contendo o BCA 2 %, como fonte de carbono.
5.1.2 Atividade de endoglucanases
Nos ensaios de CMCase, foi possível detectar uma maior atividade de

endoglucanases no sobrenadante de cultura de W. circinata cultivado em MM contendo
FT, quando comparado com os demais resultados na presença de outras fontes de carbono.
Com o tempo de cultivo de 96 horas obteve-se 0,395 U/mL e em 120 horas obteve-se
0,271 U/mL, como pode ser observado na figura 12.
Gerhardt et al. (2015) ao avaliar a atividade de endoglucanases de oito linhagens
de fungos filamentosos na presença de BCA a 2%, observou para a linhagem de
Penicillium IV atividade de 0,11 U mL-1 e para de Penicillium III 0,07 U mL-1, resultados
aproximadamente de 5,6 a 2,5 vezes inferiores aos obtidos no presente estudo, somente a
linhagem de Aspergillus I apresentou atividade (0,37 U mL-1) equivalente a apresentada
por W. circinata. Lião et al., (2015) também utilizaram uma linhagem do gênero
47
Penicillium para a avaliar atividade de endoglucanases em diferentes resíduos

agroindustriais, como o BCA e FT e obteve resultados de 2 U mL-1.
Figura 12. Quantificação da atividade enzimática das endoglucanases dos

sobrenadantes de cultura do fungo W. circinata cultivado em diferentes fontes de
carbono a 1%, pelo ensaio de CMCase. Os sobrenadantes foram retirados nos
tempos de 96 h e 120 h e analisados quanto a atividade enzimática. O gráfico
demonstra a atividade enzimática versus o tempo de cultivo.
Endoglucanases
Atividade Enzimatica em U/mL
0,500
0,395
0,400
0,300 0,262 0,271
0,199
0,200 0,160 0,167 0,177 0,152
0,100
0,000
96 h 120 h
Tempo de Cultivo
GLI BCA PA FT
No trabalho de Aguiar & Menezes (2000) cultivando Aspergillus niger IZ-9 em

meio de cultura com BCA obtiveram atividade máxima de 0,25 U mL-1, menor que o
obtido neste estudo, entretanto sendo superior a atividade obtida pelo cultivo de W.
circinata em BCA a 1% (0,017 U/mL) e inferior a obtida na presença de FT (0,395
U/mL). Isso indica que o FT é um bom indutor para a produção de endoglucanases pelo
fungo W. circinata.
5.1.3 Atividade de celulases totais
Nos ensaios de FPase também se observou que o farelo de trigo foi o melhor
indutor para a produção de enzimas lignocelulolíticas, sendo que em 96 horas de cultivo
obteve-se atividade de celulases de 0,019 U/mL e em 120 horas 0,010 U/mL, em seguida
o BCA obtendo 0,009 U/mL em 96 e 120 horas de cultivo e a PA em 96 (0,008 U/mL) e
em 120 (0,007 U/mL) horas de cultivo sendo superior aos seus respectivos controles.
Em seus ensaios de celulases totais (GERHARDT et al., 2015), em meio contendo BCA
com 96 horas de cultivo, as linhagens Aspergillus I, Penicillium III, Penicillium IV, não
apresentaram variações de atividades de celulases entre si, com atividade de 0,02 U/ mL,
48
apresentando resultados 2,2 vezes superiores aos que foram apresentados no presente
estudo, uma vez que a atividade em BCA com 96 horas de cultivo foi de 0,009 U/mL.
Figura 13. Quantificação da atividade enzimática das celulases totais dos

sobrenadantes de cultura do fungo W. circinata cultivado em diferentes fontes de
carbono a 1 %, pelo ensaio de FPase. Os sobrenadantes foram retirados nos
tempos de 96 h e 120 h e analisados quanto a atividade enzimática. Os gráficos
demostram a atividade enzimática versus o tempo de cultivo.
Celulases totais
Atividade Enzimático em U/mL
0,025
0,020 0,019
0,015
0,010
0,009 0,008 0,009
0,010 0,007 0,007
0,006
0,005
0,000
96 h 120 h
Tempo de cultivo
GLI BCA PA FT
Enquanto Pereira (2013) ao cultivar suas variantes de A. niger em meio contendo

BCA, observou atividade de celulases entre 0,04 a 0,06 U/mL e em meio com FT,
observou-se uma atividade entre 0,06 a 0,18 U/mL. Uma vez que as atividades obtidas
para W. circinata, neste estudo, na presença de FT foram de 0,019 U/mL (96 h) e 0,010
U/mL (120 h), constata-se que tanto nos estudos de Pereira (2013) quanto neste trabalho
o FT foi o melhor indutor de celulases em ambos os fungos analisados.
5.1.4 Atividade de xilanases
Nos ensaios de xilanases, observou-se maior atividade enzimática nos ensaios

com FT, sendo que em 96 horas obteve 51,475 U/mL e em 120 horas de cultivo 60,907
U/mL. Os demais substratos também apresentaram atividade superiores que seus
controles, sendo que a atividade do BCA e a PA em 96 horas de cultivo obteve
aproximadamente 50 U/mL e em 120 horas 51 U/mL.
Cunha (2012) obteve 16,8 U/mL de atividade xilanolítica através do cultivo de A.
niger em meio contendo BCA, ao passo que Pereira (2013) ao cultivar seus variantes de
A. niger obteve atividade de xilanases de 0,61 a 7,33 U/mL em meio contendo BCA, e os
49
mesmos variantes ao serem cultivados em meio contendo farelo de trigo apresentaram

atividade de 0,51 a 34,39 U/mL, enquanto que os resultados obtidos nesse estudo foram
superiores, sendo possível observar que todas as fontes de carbono induziram uma maior
produção destas enzimas e consequentemente uma elevada atividade enzimática.
Figura 14. Quantificação da atividade enzimática das xilanases dos sobrenadantes

de cultura do fungo W. circinata cultivado em diferentes fontes de carbono a 1 %,
pelo ensaio de Xilanase. Os sobrenadantes foram retirados nos tempos de 96 h e
120 h e analisados quanto a atividade enzimática. Os gráficos demostram a
atividade enzimática versus o tempo de cultivo.
Xilanases
Atividadde enzimatica em U/mL
70,000 60,907
60,000 51,475 50,001 51,893 51,973
47,359 50,807 50,435
50,000
40,000
30,000
20,000
10,000
0,000
96 h 120 h
Tempo de cultivo
GLI BCA PA FT
Zimbardi (2014) testou várias fontes de carbono para a indução da produção de

xilanases, e a maior atividade observada foi em meio contendo 5 g de farelo de trigo sendo
de 37,9 U/mL, em 192 horas de cultivo, e de 2,3 U/mL em meio contendo BCA. Pal et
al. (2011) verificaram produção de xilanase pelo fungo A. niger DFR-5 utilizando o
substrato FT, registrando atividade de 37,84 U/mL em 6 dias de cultivo. Em contrapartida,
os ensaios realizados com W. circinata, em 120 horas de cultivo e utilizando 1g de FT,
apresentaram atividade de xilanases (60,907 U/mL) superior as descritas por outros
autores.
Em estudo realizado por Cintra (2016) com hemicelulases recombinantes em
Pichia pastoris, o melhor indutor da produção de xilanases foi o BCA a 3% após 120 h
de cultivo, com atividade total de 0,19 U/mL, seguido por FT a 3%, após 72 h de cultivo,
com atividade total de 0,047 U/mL. Por se tratar de uma levedura que expressa
eficientemente as hemicelulases recombinantes, os resultados de atividade de xilanases
de W. circinata apresentados neste trabalho são significativos. O fungo filamentoso
Acremonium sp. também é capaz de secretar diversas enzimas do complexo xilanolítico
50
quando cultivado na presença de BCA 4%, apresentando atividade de 0,01 U/mL (DE
ALMEIDA et al., 2011).
Tabela 2. Atividade enzimática dos ensaios realizados a partir do sobrenadante de

cultura de W. circinata cultivado em meio mínimo em 96 e 120 horas de cultivo.
Avicelase CMCase FPase Xilanase
Tempo de cultivo 96 h 120 h 96 h 120 h 96 h 120 h 96 h 120 h
Glicose 0,1% 0,0060 0,0059 0,1600 0,2625 0,0074 0,0058 47,3589 50,0009
BCA 1% 0,0063 0,0059 0,1669 0,1525 0,0088 0,0086 50,8069 50,6929
PA 1% 0,0076 0,0060 0,1769 0,1994 0,0078 0,0070 50,4349 50,8809
FT 1% 0,0156 0,0105 0,3951 0,2710 0,0186 0,0105 51,4749 60,9069
Os resultados apresentados nesta pesquisa demonstram que diferentes substratos

lignocelulósicos, incluindo os resíduos BCA, FT e PA, podem ser usados para a produção
de hemicelulases como também descrito por Sharma et al. (2016b).
A tabela 2, traz um demonstrativo de todos os resultados obtidos a partir dos
ensaios realizados na presença das diferentes fontes de carbono testadas. Nesta tabela,
nota-se que dentre as fontes de carbono utilizadas, o farelo de Trigo foi o melhor indutor
da produção de celulases e xilanases por W. circinata.
5.1.5 Análise estatística
A aplicação do Teste – T foi realizada com os dados apresentados na tabela 2 e

baseia-se em verificar se as diferentes fontes de carbono utilizadas, ao serem comparadas
com o controle (Glicose), induziram a produção de enzimas lignocelulolíticas ou não pelo
W. circinata. Para isso foram estipuladas hipóteses, sendo que H0 (as atividades obtidas
com fontes de carbonos utilizadas são iguais às do controle) e H1 (as atividades obtidas
com as fontes de carbono são superiores às obtidas pelo controle), e para se aceitar H0, o
valor de P tem que ser maior que o nível de significância de 0,05 %. As análises indicam
que somente as atividades enzimáticas obtidas pelos ensaios de xilanase em 96 horas de
cultivo apresentaram o valor de p menor que 0,05 % (0,01).
Desta maneira, das fontes de carbono utilizadas o FT se destacou, por ser o melhor
indutor da produção de enzimas pelo W. circinata. Nos ensaios enzimáticos realizados de
Avicelase, CMCase, FPase e Xilanase, observou-se a maior atividade, em especial nos
ensaios de xilanase, de 60,907 U/mL (Figura14), quando comparadas com as demais
fontes de carbono, após 120 horas de indução.
51
Fontes de carbono complexas como, os resíduos lignocelulósicos, tem se mostrado

melhores indutores da produção de enzimas do que açúcares solúveis como glicose, xilose
e arabinose ou ainda, polissacarídeos purificados como a xilana. Ademais, esses resíduos
agroindustriais são uma opção na redução de custos durante a produção dessas enzimas,
além de trazer o benefício de seu consumo, reduzindo os impactos causados ao meio
ambiente(WAEONUKUL et al., 2008).
Com relação a produção de endoglucanases, o ensaio de CMCase revelou a maior
atividade, 0,39 U/mL (Figura 12), em relação a produção nas demais fontes de carbono,
destacando que o fungo na presença de farelo de trigo é capaz de produzir uma maior
quantidade de endoglucanases. Os resultados de atividade enzimática obtidos nos ensaios
de Avicelase e FPase também foram maiores se comparados ao controle do experimento,
podendo ser observado na figura 11 e 13.
Portanto, o fungo W. circinata foi capaz de produzir xilanases e celulases, de
acordo com o que foi observado pelos resultados obtidos por meio dos ensaios
enzimáticos. Estas enzimas produzidas pelo fungo foram capazes de hidrolisar substratos
lignocelulósicos. Dados experimentais utilizando fungos filamentosos cultivados na
presença de fontes de carbono e de nitrogênio demonstram que a produção de celulases é
influenciada pela fonte de carbono e pela composição do meio de cultura
(LAURUENGTANA; PINPHANICHAKARN, 2006; ZIMBARDI, 2014).
Como foi observado nos resultados e na análise estatística realizada, o BCA, PA
e FT apresentaram melhor produção de enzimas no sobrenadante de cultura quando
comparados aos resultados obtidos pelo ensaio do sobrenadante de cultura de W. circinata
cultivado em meio contendo glicose, sendo o FT o que apresentou maior atividade
enzimática se comparado com as demais fontes de carbono em estudo.
De acordo com Pereira (2013) a produção de enzimas por fungos em meio de
cultura está relacionada com a fonte de carbono utilizada para o cultivo dos mesmos,
porém em meios contendo glicose, ocorre a repressão da síntese de xilanases e celulases;
enquanto fontes alternativas de carbono e que contenham xilana e celulose em sua
composição, induzem a secreção de xilanases e celulases..
Cunha et al. (2012) analisaram a produção de tais enzimas por A. niger, utilizando
como fonte de carbono o BCA, os autores obtiveram uma atividade de 1,36 U/mL nos
ensaios de CMCase e 16,8 U/mL nos de xilanase. O BCA neste estudo não se mostrou
tão eficiente quanto para A. niger. Para o ensaio de CMCase em 1 % de BCA de W.
circinata a atividade obtida foi de 0,167 U/mL, bem inferior, enquanto para ensaio de
52
xilanase a eficiência do BCA ficou evidente (50, 806 U/mL), bem superior ao apresentado
por A. niger (Tabela 2).
5.1.6 Determinação do pH ótimo
Figura 15. Efeito do pH na atividade enzimática de endoglucanases presentes no

sobrenadante de cultura contendo 1% de FT. A concentração iônica para todos os
tampões foi de 50 mM: citrato de sódio - CS (pH 3 a 5,5), fosfato de sódio - FS (pH
6 a 7,4), Tris-HCl - T (pH 7,7 e 8,2), Glicina Citrato Fosfato – GCF (pH 5,2 a 7,2).
pH ótimo das endoglucananses
0,2 0,179 0,176
atividade Enzimatica em U/mL
0,18 0,156 0,156 0,158

0,16 0,141 0,173 0,181
0,14 0,126 0,169
0,149 0,152
0,12 0,140 0,143
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
2 3 4 4,2 5 5,2 5,5 6 6,2 7,2 8 9 10 11
pH
Em seguida, foi realizada a caracterização bioquímica das enzimas presentes nos

sobrenadantes, determinando o pH ótimo (figura 15 e 16). Esse parâmetro foi estimado
por meio dos ensaios de CMCase e Xilanases, e o sobrenadante obtido do meio contendo
o FT, foi escolhido para a realização dessa caracterização, por apresentar atividade
enzimática elevada em relação as outras fontes de carbono testadas.
Na figura 15 e 16, observa-se a influência do pH, sobre a atividade apresentada
pelo sobrenadante, na atividade xilanolítica e de endoglucanases, onde a faixa de pH entre
5 a 8 proporcionou os melhores resultados em ambos os ensaios. Nos dois ensaios, o pH
em que as enzimas apresentaram melhor atividade foi no tampão Glicina Citrato Fosfato
(GCF) em pH 7,2. Observa-se, em pH 7,2, a atividade enzimática de 0,18 U/mL para
endoglucanase (Figura 15) e 51,767 U/mL para as xilanases (Figura 16), também se
observou que no tampão Citrato de Sódio em pH 5,5, a atividade apresentada se aproxima
ao pH ótimo, sendo de 0,17 U/mL para endoglucananases e de 51,20 U/mL para as
xilanases.
53
No presente estudo o sobrenadante apresentou melhores resultados de atividade

xilanolítica e de endoglucanases, na faixa de pH 5 a 8, sendo que pH ótimo para ambas
enzimas foi em pH 7,2.
Carvalho (2008) demonstrou que a enzima xilanase recombinante purificada

(HXYN2r), na faixa de pH 5 a 9, apresentou os melhores resultados de atividade,
apresentando pH ótimo de 6,5. Sendo que Pereira (2013), analisou o sobrenadante do
cultivo de Aspergillus, para a atividade de endoglucanase que apresentou maior atividade
nos pH 5 e 7, sugerindo que em seu sobrenadante há, pelo menos, duas CMCases que
atuam em pH diferentes.
Figura 16. Efeito do pH na atividade enzimática de xilanases presentes no

sobrenadante de cultura contendo 1% de FT. A concentração iônica para todos os
tampões foi de 50 mM: citrato de sódio - CS (pH 3 a 5,5), fosfato de sódio - FS (pH
6 a 7,4), Tris-HCl - T (pH 7,7 e 8,2), Glicina Citrato Fosfato – GCF (pH 5,2 a 7,2).
pH ótimo das xilanases
Atividade Enzimática em U/mL
53
52 51,207 50,977
50,647 50,397
51
49,697 51,767
50 48,880 50,967
49 49,827 50,187 48,334
48 49,197
48,634 48,300
47
46
45
2 3 4 4,2 5 5,2 5,5 6 6,2 7,2 8 9 10 11
pH
5.1.7 Determinação da temperatura ótima
O efeito da temperatura pode ser observado na figura 17 e 18, no qual o

sobrenadante sofre influência das temperaturas testadas, mostrou que, nos ensaios de
Xilanases e CMCase, 40 ºC foi a melhor temperatura.
Nos ensaios de CMCase, 40 ºC apresentou melhor atividade de endoglucanases
(figura 17), sendo 0,16 U/mL, e nas temperaturas de 30, 50 e 60 ºC apresentaram atividade
semelhante (0,14 U/mL).
54
Figura 17. Efeito da temperatura na atividade enzimática de endoglucanases do

sobrenadante de cultura do fungo induzido com 1% de FT.
Dosagem de CMCase em diferentes temperaturas
Atividade Enzimática em U/mL 0,18 0,165
0,16 0,142 0,149
0,141
0,132
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
30ºC 40ºC 50ºC 60ºC 70ºC
Temperatura
Figura 18. Efeito da temperatura na atividade enzimática de xilanase do

sobrenadante de cultura do fungo induzido com 1% de FT.
Dosagem de Xilanase em diferentes temperaturas
51,5
Atividade Enzimática em U/mL
50,827
51
50,147
50,5
49,727
50 49,307
49,367
49,5
49
48,5
48
47,5
30ºC 40ºC 50ºC 60ºC 70ºC
Temperatura
Já nos ensaios de xilanase, as enzimas apresentaram atividade de 50,82 U/mL em

40 °C e nas temperaturas 50 ºC e 60 ºC apresentarem resultados semelhantes,
respectivamente, 50,14 U/mL e 49,72 U/mL, sendo possível concluir que as enzimas são
estáveis entre as temperaturas de 40 e 60 ºC, como pode ser observado no gráfico da
figura 18.
Os ensaios de Xilanases e endoglucanases, na faixa de 40 ºC, 50 ºC e 60 ºC,
obtiveram os melhores resultados, sendo que a temperatura ótima para ambos os ensaios
foi de 40 ºC.
55
Em estudos realizados por Pal et al. (2011) verificou-se que a maior atividade
enzimática de xilanase foi a 37 ºC produzida pelo fungo A. niger DFR-5. Liu et al. (2011),
observaram que a atividade enzimática se manteve acima de 80% nas temperaturas entre
40 a 60 ºC em ensaio de CMCase. Farinas et al. (2010), observaram que o sobrenadante
do A. niger, apresentou atividade de 100% à temperatura de 37 ºC para xilanases. Estes
valores de temperatura são próximos aos observados, neste estudo, tanto para xilanases,
quanto para endoglucanases, de 40 ºC.
5.1.8 Análise do perfil proteico em SDS-PAGE
Figura 19. Perfil de proteínas secretadas pelo fungo W. circinata, presentes no

sobrenadante de cultura frente as diferentes fontes de carbono Gel de
poliacrilamida SDS-PAGE (12,5%), corado com azul de coomassie. MM –
Marcador de Massa Molecular; 1 – 0,1% de Glicose 96 horas; 2 – 0,1% de Glicose
120 horas; 3 – BCA 96 horas; 4 – BCA 120 horas; 5 – PA 96 horas; 6 – PA 120
horas; 7 –FT 96 horas e 8 – FT 120 horas.
As amostras do sobrenadante de cultura provenientes da produção em diferentes

fontes de carbono após 96 e 120 horas de cultivo de W. circinata foram avaliadas quanto
ao perfil proteico em gel de Poliacrilamida Desnaturante (SDS-PAGE), mostrado na
figura 19, para que isso ocorresse as amostras foram quantificadas pelo método de
Bradford.
Ao analisar o perfil proteico, várias bandas de proteínas de diferentes tamanhos
são identificadas. As 4 fontes de carbono induziram a produção de diferentes proteínas, o
56
que pode justificar a discrepância nas dosagens enzimáticas dos diferentes sobrenadantes
de cultura.
O tempo de cultivo também provocou uma alteração no perfil proteico, que pode
ser observado nas canaletas 1 e 2, 3 e 4, onde o mesmo padrão foi apresentado, porém
com uma intensidade maior das bandas, e por este motivo pode-se inferir que houve um
aumento na produção dessas proteínas em 120 horas. Enquanto o perfil proteico da
produção de proteínas em PA e FT pelo W. circinata não se manteve nos diferentes
tempos.
De acordo com Pereira (2013) as xilanases correspondem as proteínas com massa
molecular de 33 a 25 kDa. Na análise do perfil proteico do sobrenadante de W. circinata
observou-se proteínas nesta faixa de massa, que podem corresponder às xilanases
secretadas pelo fungo estudado.
Ncube et al. (2012) utilizaram a torta da semente de pinhão - manso e obtiveram
seis tipos de celulases com as massas moleculares variando de 20 a 43 kDa. Sendo que
(DA SILVA DELABONA et al., 2013) relataram três celulases quando utilizaram farelo
de soja e farelo de trigo como substrato, utilizando Aspergillus fumigatus como produtor,
e as massas moleculares não foram detalhadas.
Pode-se observar, por análise do perfil proteico do sobrenadante de cultura de W.
circinata, que este fungo foi capaz de produzir enzimas com massas moleculares nas
faixas descritas pelos autores citados acima.
5.2 Otimização da produção enzimática – suplementação do meio com diferentes

fontes de nitrogênio
O fungo W. circinata foi capaz de crescer e produzir enzimas quando cultivado

em meio MM, contendo 1% de Farelo de Trigo, como fonte de carbono, e em seguida o
meio foi enriquecido com fontes suplementares de nitrogênio nas concentrações de 1,0,
1,5 e 2,0 % de cloreto de amônio, extrato de levedura, peptona e ureia.
Os sobrenadantes de cultura do fungo apresentaram atividades nos ensaios de
Avicelase, CMCase, FPase e Xilanase. Os dados obtidos pelos ensaios enzimáticos estão
apresentados nos gráficos a seguir.
5.2.1 Atividade de celobiohidrolases

57
Figura 20. Quantificação da atividade das celobiohidrolases dos sobrenadantes

obtidos do cultivo W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de
nitrogênio em concentrações diferentes (1, 1,5 e 2 %), pelo ensaio de Avicelase.
Foram coletadas amostras da cultura nos tempos de 48, 72, 96 e 120 horas. C. EXP
– Controle do experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura;
PEP – Peptona; UR – Ureia.
Tabela 3. Atividade enzimática das celobiohidrolases dos sobrenadantes obtidos do

cultivo W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de nitrogênio.
C. EXP – Controle do experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L – Extrato de
levedura; PEP – Peptona; UR – Ureia.
*FN [ ] Tempo de Cultivo
48 h 72 h 96 h 120 h
C. EXP 0,016 0,011 0,011 0,012
C. A 1% 0,011 0,016 0,011 0,016
C. A 1,5% 0,010 0,010 0,012 0,015
C. A 2% 0,011 0,017 0,012 0,015
E. L 1% 0,017 0,005 0,011 0,012
E. L 1,5% 0,012 0,010 0,011 0,010
E.L 2% 0,011 0,002 0,012 0,031
PEP 1% 0,001 0,018 0,011 0,017
PEP 1,5% 0,006 0,020 0,011 0,013
PEP 2% 0,009 0,010 0,011 0,005
UR 1% 0,015 0,006 0,012 0,013
UR 1,5% 0,006 0,014 0,011 0,011
UR 2% 0,009 0,011 0,011 0,011
* FN= Fonte de Nitrogênio
Atividade enzimática expressa em U/mL
58
Nos ensaios de Avicelase (figura 20 e tabela 3), constatou-se aumento e inibição

da produção das enzimas em alguns dos ensaios, se compararmos aos seus respectivos
controles. No cultivo de 48 horas, somente o extrato de levedura 1% (0,017 U/mL)
apresentou atividade superior ao controle (0,015 U/mL). Já após 72 horas de cultivo, o
ensaio com o sobrenadante de cultura suplementado com peptona 1,5% (0,020 U/mL) se
destacou quando comparado ao controle (0,011 U/mL). Em 120 horas de cultivo
observou-se a maior atividade enzimática na presença de extrato de levedura a 2% (0,030
U/mL), quando comparado ao controle (0,011 U/mL).
5.2.2. Atividade das endoglucanases
Figura 21. Quantificação da atividade das Endoglucanases dos

sobrenadantes obtidos do cultivo W. circinata com 1% de farelo de trigo em
diferentes fontes de nitrogênio em concentrações diferentes (1, 1,5 e 2 %), pelo
ensaio de CMCase. Foram coletadas amostras da cultura nos tempos de 48, 72, 96
e 120 horas. C. EXP – Controle do experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L –
Extrato de levedura; PEP – Peptona; UR – Ureia.
Nos ensaios para a detecção de atividade de endoglucanases (figura 21), notou-se

que todas as suplementações de nitrogênio apresentaram aumento da atividade
enzimática, sendo que a maior atividade obtida foi na presença de cloreto de amônio 1%
(6,042 U/mL) no tempo de cultivo de 24 horas, quando comparado ao controle (0,2993
U/mL), seguida do extrato de levedura a 2% (5,1728 U/mL) após 48 horas de cultivo,
quando comparado ao controle (0,5255 U/mL). Gomathi et al., (2012) ao analisarem a
59
influência de diferentes fontes de carbono e nitrogênio na produção de endoglucanases

pelo fungo Aspergillus flavus, por fermentação submersa. Os melhores resultados foram
obtidos utilizando farelo de trigo na concentração de 3% (1.015 U/mL) e peptona na
concentração de 1% (1,643 U/mL) em 7 dias de cultivo.
Tabela 4. Atividade enzimática das endoglucanases dos sobrenadantes obtidos do

*FN [ ] Tempo de Cultivo
48 h 72 h 96 h 120 h
C. EXP 0,299 0,526 0,388 0,512
C. A 1% 6,043 4,262 2,450 3,662
C. A 1,5% 2,664 4,003 2,535 2,222
C. A 2% 2,162 5,008 2,338 1,149
E. L 1% 2,162 2,334 2,298 1,854
E. L 1,5% 2,128 2,102 2,372 2,387
E.L 2% 2,158 5,173 2,287 2,979
PEP 1% 2,109 2,349 2,315 3,324
PEP 1,5% 2,184 2,252 2,304 3,857
PEP 2% 2,278 2,345 2,315 2,492
UR 1% 1,955 2,207 2,304 2,589
UR 1,5% 2,184 2,364 2,332 2,964
UR 2% 2,267 2,285 2,355 1,074
Nesse estudo observou-se que o W. circinata com 120 horas de cultivo na presença
de FT a 1% apresentou 0,551 U/mL e em meio enriquecido com peptona 1% apresentou
atividade de 3,32 U/mL, assim em menos tempo de cultivo e em meio contendo 1% de
FT suplementado com peptona a 1%, obteve-se mais da metade de atividade obtida por
Gomathi et al. (2012). Este resultado sugere que a suplementação do meio de cultura
com peptona, induz uma maior produção de endoglucanases pelo fungo micorrízico W.
circinata.
5.2.3 Atividade de celulases totais
Nos ensaios de detecção da atividade de celulases totais, FPase, (figura 22),

observou-se aumento da atividade e ausência da produção das enzimas em alguns dos
ensaios, quando comparados ao controle.
60
Figura 22. Quantificação da atividade das celulases totais dos sobrenadantes

obtidos do cultivo W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de
nitrogênio em concentrações diferentes (1, 1,5 e 2 %), pelo ensaio de FPase. Foram
coletadas amostras da cultura nos tempos de 48, 72, 96 e 120 horas. C. EXP –
Controle do experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura;
Tabela 5. Atividade enzimática das celulases totais dos sobrenadantes obtidos do

*FN [ ] Tempo de cultivo
48 h 72 h 96 h 120 h
C. EXP 0,010 0,014 0,016 0,011
C. A 1% 0,021 0,013 0,011 0,014
C. A 1,5% 0,015 0,016 0,011 0,012
C. A 2% 0,016 0,011 0,011 0,006
E. L 1% 0,009 0,014 0,011 0,013
E. L 1,5% 0,005 0,013 0,010 0,020
E.L 2% 0,044 0,022 0,012 0,018
PEP 1% 0,009 0,011 0,010 0,017
PEP 1,5% 0,009 0,012 0,011 0,015
PEP 2% 0,024 0,015 0,011 0,019
UR 1% 0,008 0,008 0,011 0,014
UR 1,5% 0,010 0,006 0,012 0,007
UR 2% 0,018 0,021 0,011 0,007
61
No tempo de cultivo de 48 horas, o sobrenadante de cultura suplementado com

2% de extrato de levedura (0,044 U/mL) foi o que apresentou maior atividade, quando
comparado com os demais ensaios realizados e o controle do experimento (0,010 U/mL),
que também se destacou após 72 horas de cultivo (0,023 U/mL).
A ausência da produção das enzimas foi observada após 96 horas de cultivo nos
ensaios contendo sobrenadante de cultura de todas as suplementações, já que não houve
diferença na atividade enzimática quando comparado ao controle (0,0135 U/mL).
5.2.4 Atividade das xilanases
Nos ensaios para a detecção de atividade em xilana (figura 23), foi possível
observar que todas as suplementações de nitrogênio apresentaram aumento na produção
das xilanases, se comparado ao controle (22,59 U/mL), sendo que a maior atividade
obtida foi na presença de extrato de levedura a 2% (243,94 U/mL), em seguida do cloreto
de amônio 2% (231,34 U/mL) no tempo de cultivo de 72 horas.
Figura 23. Quantificação da atividade das xilanases dos sobrenadantes obtidos do

cultivo W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de nitrogênio
em concentrações diferentes (1, 1,5 e 2 %), pelo ensaio de xilanase. Foram
coletadas amostras da cultura nos tempos de 48, 72, 96 e 120 horas. C. EXP –
Controle do experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura;
62
Tabela 6. Atividade enzimática das xilanases dos sobrenadantes obtidos do cultivo

W. circinata com 1% de farelo de trigo em diferentes fontes de nitrogênio. C. EXP
– Controle do experimento; C.A – Cloreto de amônio; E. L – Extrato de levedura;
FN [ ] Tempo de cultivo
48 h 72 h 96 h 120 h
C. EXP 23,855 22,595 28,760 32,753
C. A 1% 217,303 211,003 201,643 191,113
C. A 1,5% 189,853 205,243 205,603 175,183
C. A 2% 166,633 231,343 221,623 168,523
E. L 1% 179,323 179,413 168,253 171,943
E. L 1,5% 164,743 173,383 166,543 171,943
E.L 2% 177,703 243,943 162,313 170,683
PEP 1% 171,043 174,013 180,043 171,223
PEP 1,5% 164,113 168,703 173,023 169,783
PEP 2% 177,883 173,293 180,043 171,133
UR 1% 163,033 165,193 169,063 169,063
UR 1,5% 182,203 168,523 165,913 171,313
UR 2% 168,523 179,323 171,223 170,683
Assim, oito dos ensaios apresentaram atividade superior a 200 U/mL, sendo que
no cultivo de 48 horas, somente cloreto de amônio 1% (217,30 U/mL) superou esse valor.
Após 72 horas de cultivo, cloreto de amônio 2% (231,34 U/mL) e extrato de levedura 2%
(243,94 U/mL) se destacaram por apresentarem as maiores atividades, indicando uma
maior produção de xilanases nestas condições.
Zimbardi (2014) observou também o efeito das diferentes suplementações de
nitrogênio sobre as produções das xilanases em 120 horas de cultivo, sendo que, das
fontes testadas, a melhor foi o sulfato de amônio, levando a um aumento de 30% da
atividade (39,7 U/mL) em relação ao controle (30,5 U/mL). A peptona a 1% apresentou
36,5 U/mL, o extrato de levedura a 1% 32,8 U/mL e o cloreto de amônio a 0,8%
apresentou 25,1 U/mL, em especial a ureia a 0,8% inibiu em cerca de 36% a atividade
enzimática (19,4 U/mL).
Em relação a análise da ação das beta-xilanases, suplementações como o extrato
de levedura (8,8 U/mL) e com caseína (7,4 U/mL) mantiveram os resultados mais
próximos, se comparados ao controle (15,2 U/mL), e as demais suplementações de
nitrogênio inibiram fortemente sua produção, chegando a 3,9 U/mL utilizando 1% de
ureia (ZIMBARDI, 2014). Efeito contrário advindo das suplementações do meio com
63
nitrogênio foram demonstrados nesse estudo, ocorrendo incremento da produção das

xilanases por W. circinata.
5.2.5 Análise estatística
Tabela 7. Análise de variância (ANOVA) para atividades enzimáticas obtidas a

partir de sobrenadante de cultura de W. circinata cultivado em meio suplementado
com fontes de nitrogênio.
Ensaios Enzimáticos Soma dos Grau de Média F valor-P
Quadrados Liberdade Quadrática
Avicelase 0,00009 12,0000 0,00001 0,30744 0,98412
CMCase 31,7225 12,0000 2,64354 3,76567 0,00081
FPase 0,00121 12,0000 0,00010 1,39413 0,19875
Xilanases 89570,82 3,00000 29856,94 85,1259 0,00000
Posterior a realização das dosagens enzimáticas, foi realizada análise estatística,

para validar se ocorreu ou não a otimização da produção das enzimas produzidas pelo
fungo W. circinata por suplementação do meio com nitrogênio. Foi realizado o teste de
ANOVA pareado com o Teste-T, com o nível de significância a 5%, para averiguar se
ocorreu aumento significativo na produção das enzimas em relação ao controle, perante
a suplementação de nitrogênio realizado no meio liquido de fermentação. Primeiramente
foi realizada a análise de variância (ANOVA), na qual se compara todas os resultados
obtidos, permitindo verificar a diferença da atividade enzimática entre os grupos a serem
estudados, sendo necessário a realização do Teste-T, para se determinar qual grupo
apresentou diferença estatística em relação ao controle do experimento.
A aplicação do Teste – T nos grupos de estudos das enzimas se comparadas aos
seus respectivos controles das diferentes suplementações de nitrogênio e as
concentrações, todos comparados com o controle dos experimentos buscando identificar
se houve ou não aumento da atividade enzimática. Para isso foram estipuladas hipóteses,
sendo que H0 (as atividades obtidas com as suplementações de nitrogênio são iguais às
do controle) e H1 (as atividades obtidas com as suplementações de nitrogênio são
superiores às obtidas pelo controle), e para se aceitar H0, o valor de P tem que ser maior
que o nível de significância de 0,05%. Logo após a análise, somente as atividades
enzimáticas obtidas pelos ensaios de xilanase e CMCase obtiveram valor de P menor que
0,05%, aceitando-se H1 e os ensaios de FPase e Avicelase foram maiores que os níveis
significância.
64
Desta forma, os resultados obtidos pela ANOVA, estão de acordo com os

apresentados na análise realizada pelo método baseado na estatística t de Student.
O fungo W. circinata apresentou uma otimização na produção de xilanases e
endoglucanases, por meio da suplementação de nitrogênio utilizando (cloreto de amônio,
extrato de levedura, peptona e ureia), sendo que o cloreto de amônio a 1, 1,5 e 2 % e
extrato de levedura a 2% foram os melhores indutores da produção enzimática, de acordo
com os resultados obtidos por meio dos ensaios e pela análise estatística realizada, sendo
o fungo W. circinata considerado um bom produtor destas enzimas, as quais foram
capazes de hidrolisar substratos lignocelulósicos.
Experimentos utilizando fungos filamentosos cultivados na presença de fontes de
carbono e de nitrogênio presentes no meio de cultivo, demonstraram que a produção de
celulases foi influenciada pela fonte de carbono e pela composição do meio de
crescimento (LAURUENGTANA; PINPHANICHAKARN, 2006; ZIMBARDI, 2014).
Meios enriquecidos com fontes de nitrogênio como peptona e cloreto de amônio,
apresentam um aumento de 34,7 e 67,8% na produção de enzimas (ZIMBARDI, 2014).
A fonte de carbono empregada neste estudo foi o farelo de trigo, considerado um
bom indutor da produção de enzimas pelo fungo W. circinata. Atualmente o farelo de
trigo tem sido amplamente empregado como fonte de carbono para o cultivo de micro-
organismos, almejando a produção de enzimas para serem empregadas em processos
biotecnológicos (QIAN et al, 2012; MASUI et al, 2012; ZIMBARDI et al., 2013).
A elevada utilização do FT ocorre devido sua composição, por apresentar cerca
de 14% de proteínas, 27% de carboidratos (64% de celulose e 36% hemicelulose), 6% de
lipídeos, vitaminas B, além de cálcio, magnésio, fosforo, potássio e enxofre. Além disso,
o tamanho e a porosidade das partículas de farelo de trigo também são fatores importantes,
pois auxiliam na fixação pelos micro-organismos, absorção de água e secreção de enzimas
(KAR et al., 2013).
Como foi observado todas as suplementações de nitrogênio elevaram a produção
das xilanases e endoglucanases, em especial o cloreto de amônio e o extrato de levedura
foram os melhores indutores da produção destas enzimas, alcançando níveis muito
elevados se comparados aos controles dos experimentos.
Xu et al. (2008) analisaram a variação das fontes de carbono e concentrações de

nitrogênio no cultivo do A. niger XY-1, e concluiu-se que a maior produção de xilanases
foi com 4% de NaNO3, que é uma fonte inorgânica de nitrogênio, e ao se utilizar uma
65
forma orgânica de nitrogênio como o extrato de levedura, foi necessário a adição de 30%
dessa fonte para obter o mesmo resultado da suplementação com fonte inorgânica.
Enquanto neste estudo o extrato de levedura a 2% foi a fonte de nitrogênio mais eficiente
na indução da produção de endoglucanases (5,173 U/mL) e xilanases (243,943 U/mL)
pela produção do fungo micorrízico W. circinata.
O aumento das concentrações de amônio no meio de cultura inibe o crescimento

de células e, consequentemente, a produção de proteínas (YANG; ZHOU; ZHANG,
2004), como foi observado, neste estudo, em ensaios utilizando a ureia, que em alguns
casos, como nos ensaios de Avicelase e FPase, houve inibição da produção das enzimas
se compararmos aos seus respectivos controles.
De acordo com Figueiró; Graciolli (2011), o nitrogênio é indispensável para a

vida, sendo a base para muitos processos biológicos com a síntese de ácidos nucleicos,
aminoácidos e de proteínas, entretanto a evidencias que seu excesso pode ter modulação
negativa sobre o crescimento micelial fúngico, por inibir a síntese de enzimas que
degradam a quitina.
Mais no caso do W. circinata além de induzir o aumento da produção das celulases

e xilanases, de acordo com Carvalho (2013) os compostos nitrogenados do seu
metabolismo secundário podem atuar contra fitopatógenos nas plantas. Sendo que Buzeto
(2001), a adubação nitrogenada em excesso e em conjunto com elevado teor de matéria
orgânica, são maléficos para os fitopatógenos.
Em testes realizados por Carvalho (2008) foi observado que o meio de cultura
suplementado com peptona, extrato de levedura e ureia aumentou a produção da xilanase
recombinante (HXYN2), quando comparado com a fonte de nitrogênio, normalmente,
utilizada para P. pastoris, o YNB (Yeast Nitrogen Base). Devido a este resultado, optou-
se por trabalhar com essas fontes de nitrogênio orgânico (peptona e extrato de levedura)
e inorgânico (ureia). O W. circinata, por ser um fungo micorrizo e também poder atuar
como um fungo de controle biológico, de acordo com (CARVALHO et al., 2015) em
cultivos em que ocorreu a suplementação de nitrogênio no solo, amentaram atuação desse
fungo.
66
Figura 24. Perfil de proteínas secretadas pelo fungo W. circinata nos sobrenadantes
de cultura frente as diferentes suplementações de nitrogênio. Gel de poliacrilamida
SDS-PAGE (12,5%), corado com azul coomassie. MM – Marcador de Massa
Molecular; 1 - C. EXP; 2 – C.A 1%; 3 – C.A 1.5 %; 4 – C.A 2%; 5 – E. L 1%; 6 –
E.L 1.5%; 7 – E.L 2%; 8 – PEP 1%; 9 – PEP 1,5%; 10 – PEP 2%; 11 – UR 1%;
12- UR 1,5% e 13 – UR 2%.
Na figura 24 é possível analisar no perfil proteico do sobrenadante de cultura de

W. circinata em FT a 1 % suplementado com fontes de nitrogênio. Observa-se várias
bandas de proteínas de diferentes tamanhos nas diferentes suplementações de nitrogênio
do meio. Nas canaletas 2, 3 e 4, que continham o cloreto de amônio respectivamente em
1, 1,5 e 2%, foram observadas bandas de 66, 45, 25 e 18 kDa, nas canaletas 5, 6 e 7
referentes ao sobrenadante de cultura suplementado com extrato de levedura em 1, 1,5 e
2% observa-se bandas de 35 e 25 kDa, nas canaletas 8, 9 e 10 correspondentes a peptona
em 1, 1,5 e 2% é possível identificar bandas de 35, 25 e 18 kDa e nas canaletas 11, 12 e
13 respectivos a ureia em 1, 1,5 e 2% verifica-se bandas de 35 kDa.
Assim observa-se padrão proteico de secreção de proteínas nos sobrenadantes de cultura
de W. circinata suplementados com nitrogênio semelhante ao padrão observado no ensaio
utilizando os sobrenadantes de cultura na presença das diferentes fontes de carbono
(Figura 9).
67
6. CONCLUSÃO
Todas as fontes de carbono foram capazes de induzir a produção de celulases e

xilanases, pelo fungo W. circinata, sendo o farelo de trigo o melhor indutor da secreção de
enzimas celulolíticas e xilanolíticas, comparado com as demais fontes de carbono estudadas.
O pH ótimo dos sobrenadantes nos ensaios de Xilanases e CMCase foi 7,2. A
temperatura ótima em ambos os ensaios, de Xilanases e CMCase, foi de 40 ºC.
As suplementações de nitrogênio foram eficientes na otimização da produção das
endoglucanases e xilanases, pelo fungo W. circinata, e por meio da análise estatística
realizada os resultados obtidos foram significativos.
Das suplementações utilizadas, o cloreto de amônio e o extrato de levedura, nos
ensaios de Xilanases e CMCase, foram os que apresentaram maior atividade enzimática.
Os resultados obtidos nos ensaios de Avicelase e FPase, não foram significativos
e em alguns casos houve a ausência da produção das enzimas nos sobrenadantes.
O perfil proteico dos sobrenadantes de cultura obtidos do cultivo de W. circinata,
SDS-PAGE, sugerem a presença de celulases e xilanases de diferentes tamanhos
produzidas pelo fungo, na presença das diferentes fontes de carbono e de nitrogênio
testadas.
68
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados obtidos, neste estudo, contribuirão para o estudo da aplicação dessas

enzimas produzidas por W. circinata em testes de hidrólise de BCA, PA e FT e a
purificação das mesmas. E também para elucidação dos prováveis mecanismos de ação
deste fungo, como um agente de controle biológico fúngico (CBFs), contra fitopatógenos
presentes nas plantações de cereais.
69
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

JANAINA DIAS DA COSTA

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS ENZIMAS

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS ENZIMAS

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao

Os fungos são excelentes produtores de enzimas extracelulares hidrolíticas, destacando-

Palavras-chaves: micorrízico, enzimas hidrolíticas, lignocelulose, carbono, nitrogênio.

Fungi are excellent producers of hydrolytic extracellular enzymes, especially filaments.

Keywords: mycorrhizal, hydrolytic enzymes, lignocellulose, carbon, nitrogen.

Tabela 1. Composição de alguns resíduos agroindustriais……………………………...24

ANOVA - Análise de Variância segundo método de Fisher

No Brasil, além de existir uma abundante diversidade de resíduos

Na fundamentação teórica serão apresentadas características importantes do

2.1 Waitea circinata

O Waitea circinata foi isolado das raízes de Epidendrum nocturnum (Orquídeas

Adaptado: de (DE SOUSA SILVA et al., 2016).

O W. circinata é um Fungo Micorrízicos de Orquídea (FMO), isolado de raízes

orquídea epífita, Cyrtopodium saintlegerianum, que também é encontrada no Cerrado

Figura 2. Isolado fúngico micorrízico de orquídeas Waitea circinata, em placa

2.1.1 Fungos Micorrízicos

Os fungos micorrízicos (FM) ao se associarem com plantas, como as orquídeas

significativamente menor que na testemunha (R. solani). Entre os isolados de orquídeas

2.1.3 Fungos de controle biológico

A definição de controle biológico, segundo, (MÉNDEZ; MONDINO, 1999) é o

fitopatogênicos, assim como de atenuar o estresse abiótico. Os benefícios ocorrem devido

Figura 3. Isolados fúngicos patogênicos (Ro88 e Rh24F1) e fungo micorrízico

Adaptado: de (SOUSA, 2018).

Com o objetivo de aumentar a produção agrícola com sustentabilidade, destaca-

compostos promotores de crescimento vegetal, além de micoparasitismo (EL-

2.2 BIOMASSA VEGETAL

Anualmente são produzidas cerca de 150 a 200 milhões de toneladas de matéria

biomassa disponível, para produção de alimentos, combustíveis, produtos químicos,

Figura 4. Imagem demonstrativa de como é estruturada a lignocelulose.

Fonte: Adaptado de (RUBIN, 2008).

A lignocelulose é responsável por conferir força, suporte e rigidez, constituído

Tabela 1. Composição de alguns resíduos agroindustriais.

Farelo de trigo 11% 39% 5% (CRIPWELL et

A lignocelulose é altamente resistente à hidrólise e ao ataque biológico devido a

A celulose é um homopolissacarídeo constituído por até 15.000 unidades de

Figura 5. Moléculas de glicose unidas entre si por ligações glicosídicas do tipo β-

Adaptado: por Farinas (2011).

A hemicelulose é o segundo maior componente da lignocelulose, e também o

Por ser um polissacarídeo altamente ramificado e amorfo, à hemicelulose

Figura 6. Estrutura química da molécula de xilana.

Fonte: Adaptado de Collins; Gerday; Feller, (2005) e Farinas (2011).

A hemicelulose é designada, de acordo com os açúcares prevalentes, como

Outro constituinte da lignocelulose é a lignina, é um heteropolímero aromático

Figura 7. Principais monômeros que constituem a molécula de lignina.

Fonte: Adaptado de Fengel; Wegener (1983).

2.3 Sacarificações enzimática da lignocelulose

A degradação da lignocelulose pela ação das enzimas, ocorre em meio

2.3.1 Ação das celulases

A hidrólise enzimática da celulose pelas celulases ocorre em três etapas principais,

modo de catálise sobre a fibra de celulose e em fungos há três classes principais de

Figura 8. Ilustração do complexo enzimático das celulases, demonstrando o

Fonte: Adaptado de Silveira et al. (2014).

A degradação da celulose se inicia, com a ação das endoglucanases (figura 8),

sendo fundamental a sua ação enzimática, pois impede a modulação inibitória da

Figura 9. Sinergismo entre endoglucanases, exoglucanases e celobiohidrolases na

Adaptado: por Farinas (2011).

Assim as endoglucanases, exoglucanases e β-glicosidases atuam de forma

2.3.2 Ação das hemicelulases