Rev bras Coloproct Janeiro/Maro, 2008

A Biologia Molecular das Doenas Inflamatrias Intestinais Mauro Pinho

Vol. 28 N 1

GENTICA E BIOLOGIA MOLECULAR ________________________________

A Biologia Molecular das Doenas Inflamatrias Intestinais

Molecular Biology of Inflammatory Bowel Diseases
MAURO PINHO1
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Laboratrio de Biologia Molecular e Disciplina de Clnica Cirrgica do Departamento de Medicina da UNIVILLE, Joinville, SC e Departamento de Cirurgia do Hospital Municipal So Jos, Joinville, SC.

PINHO M. A Biologia Molecular das Doenas Inflamatrias Intestinais. Rev bras Coloproct, 2008;28(1): 119-123. RESUMO: Com elevada prevalncia, a Doena de Crohn e a retocolite ulcerativa apresentam mecanismos fisiopatolgicos os quais permanecem como um grande desafio apesar de muitas dcadas de pesados investimentos em pesquisa. Entretanto, o desenvolvimento de tcnicas de anlise da biologia molecular tem proporcionado a identificao de um grande nmero de molculas relacionadas a estas doenas as quais podero representar um importante auxlio na compreenso de seus complexos aspectos. Existem fortes evidncias hoje, de que as doenas inflamatrias intestinais (DII) so o resultado de um desequilbrio entre a flora bacteriana comensal e o aparato imunolgico da mucosa intestinal. Um dos achados mais consistentes neste sentido refere-se elevada incidencia de mutaes do gene NOD2/CARD15 em pacientes portadores de Doena de Crohn, alm da comprovao de sua correlao fenotpica com esta doena. Alm desta protena, diversas outras molculas apresentam-se alteradas nas DIIs, envolvendo diversos aspectos como imunidade inata, resposta inflamatria e funo de barreira mucosa. A observao das variaes de expresso destas molculas correlacionadas evoluo clnica e respostas teraputicas ir contribuir para que possamos em um futuro obter resposta a histricos questionamentos sobre estas complexas doenas. Descritores: Doena de Crohn; retocolite ulcerativa; biologia molecular.

Apesar de sua elevada prevalncia, a compreenso dos mecanismos fisiopatolgicos da doena de Crohn e da retocolite ulcerativa permanece como um grande desafio apesar de muitas dcadas de pesados investimentos em pesquisa. Estudos clnicos em grande escala, assim como anlises em cincias bsicas mostraram-se insuficientes para superar a complexidade destas doenas as quais, apesar de apresentar uma profunda similaridade entre si, possuem uma extensa variedade no que diz respeito incidncia, stio anatmico de envolvimento, formas de apresentao, evoluo e resposta teraputica. O grande avano tecnolgico, ocorrido ao longo dos ltimos anos que permitiu o desenvolvimento de tcnicas de anlise da biologia molecular dos tecidos, trouxe tambm uma renovao de esperanas quanto possibilidade de obteno de respostas na rea das doenas inflamatrias intestinais. De fato, um grande nmero de estudos realizados nos principais centros

de pesquisa internacionais dedicam-se desde ento, a compreender os vrios aspectos envolvidos nestas doenas. Embora estejamos ainda bastante distantes de alcanar estes objetivos, comeam a ser definidas algumas bases, sobre as quais podero ser erguidas as linhas de pesquisa necessrias para proporcionar uma viso futura deste complexo mosaico. O objetivo deste artigo ser, apresentar uma breve reviso sobre o estado atual dos conceitos e resultados gerados at o momento pela anlise biomolecular dos mecanismos fisiopatolgicos responsveis pela ocorrncia das doenas inflamatria intestinais. Intestinos e bactrias: um equilbrio delicado Embora o tubo digestivo inteiro seja amplamente colonizado por bactrias, existe entre seus diversos segmentos uma grande variedade na concentrao destas. A presena de secrees cidas e biliares no estmago e intestino delgado proximal, e a presena de

Trabalho realizado no laboratrio de Biologia Molecular - Disciplina de Clnica Cirrgica do Departamento de Medicina da UNIVILLE Joinvile - SC - Brasil.

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um trnsito mais acelerado contribuem para uma reduo da quantidade de bactrias nestes segmentos. A colonizao bacteriana aumenta de forma exponencial no intestino delgado dista,l devido ausncia das referidas secrees e pelo retardo de trnsito pela ao da vlvula ileocecal. No clon iremos observar um aumento acentuado da flora bacteriana, na qual coexistem cerca de 400-500 espcies em um volume estimado entre 1010 e 1012 bactrias por grama de contedo fecal ou 60% do total de fezes existentes no intestino grosso. Uma nica camada de clulas epiteliais separa todo este extenso volume de bactrias do maior aparato imunolgico do nosso corpo, formado por uma grande massa de tecido linftico genericamente descrita como GALT (gut associated lymphoid tissue), a qual inclui as placas de Peyer, folculos linfides isolados e linfonodos mesentricos. Sendo assim, realmente notvel que a coexistncia entre estes dois ambientes de natureza to antagnica, seja capaz de preservar na maioria das pessoas um equilbrio no qual este extenso sistema imunolgico possa tolerar a presena do grande volume de bactrias comensais, representando um importante elemento na fisiologia intestinal. Este equilbrio, mantido atravs das imunidades inatas ou adquiridas, impede a ocorrncia de uma resposta inflamatria mediada pela liberao de diversas protenas genricamente classificadas como citocinas, cuja produo estimulada a partir da presena de microrganismos ou outros antgenos com diversos objetivos como: ativao dos diversos tipos de leuccitos, apoptose, sntese heptica de protenas de fase aguda, febre, etc. Embora algumas destas citocinas apresentem nomes especficos como fator de necrose tumoral (TNF), interferon (IFN) ou fator- de transformao do crescimento (TGF-), a grande maioria tambm denominada como interleucinas (IL), sendo ento numeradas sucessivamente a partir de suas descobertas. Doenas inflamatrias intestinais: o desequilbrio Sabe-se que a ocorrncia de uma doena inflamatria crnica representa a perda do equilbrio acima citado, constatando-se uma elevao local dos nveis de diversas citocinas. Na Doena de Crohn, por exemplo, existe uma liberao de TNF-, IFN- , IL12 e IL-17, enquanto que na retocolite ulcerativa ocorre um aumento de IL-13, entre outras.
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Trs hipteses vm sendo examinadas como possveis origens deste desequilbrio imunolgico, incluindo distrbios da flora bacteriana, fatores imunolgicos e defeitos na barreira mucosa. Distrbios da flora bacteriana Existem mltiplas evidncias de que as bactrias desempenham um papel chave no surgimento das doenas inflamatrias intestinais crnicas. Estudos experimentais demonstram a impossibilidade do desenvolvimento desta inflamao na ausncia de bactrias, levando ampla aceitao atual do aforisma sem bactria, no h colite. Baseados nestes achados h muitos anos tenta-se identificar um possvel agente causal das doenas inflamatrias intestinais. Vrias bactrias e vrus foram propostos como agentes etiolgicos, incluindo o Mycobacterium paratuberculosis, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica e a Escherichia coli, mas nenhuma comprovao consistente foi demonstrada. Na verdade, as evidncias atuais sugerem que a atividade inflamatria crnica intestinal parece, paradoxalmente, ser desencadeada a partir de bactrias pertencentes flora comensal normal, as quais assumem, em condies ainda desconhecidas, um papel patolgico capaz de ativar o aparato imunolgico local. Desregulao imunolgica da mucosa e o papel da gentica O equilbrio imunolgico baseia-se em grande parte na existncia de um mecanismo denominado como imunidade inata. Atravs deste, clulas de defesa como macrfagos e clulas dendrticas, existentes na mucosa intestinal, so capazes de detectar a presena de molculas associadas a microrganismos. Estas molculas, genericamente descritas como PAMPs (pathogenassociated molecular patterns), so de natureza distintas entre si como lipopolissacardeos, lipoprotenas, peptoglucanos ou flagelinas. Para que este reconhecimento ocorra, as clulas de defesa possuem em sua superfcie um grande nmero de sensores ou receptores, os quais podem ser classificados em duas grandes famlias denominadas, respectivamente, como TLR (toll-like receptor) e NOD (Nucleotide-binding oligomerization domain). Uma vez ativados pelas molculas bacterianas, os receptores que compem estas famlias desencadeiam seqncias de reaes em cadeia, que iro levar a uma

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resposta capaz de manter o equilbrio bactria x epitlio na mucosa intestinal. Dentre os receptores da famlia NOD, destacam-se as protenas NOD-1 e NOD-2 as quais so capazes de detectar componentes de bactrias Gram positivas e negativas. Alm desta importante funo, estas protenas desempenham hoje um papel fundamental nos estudos sobre doenas inflamatrias intestinais, uma vez que suas alteraes tm sido consistentemente relacionadas fisiopatologia destas doenas no apenas na sua incidncia, mas tambm influindo em fatores importantes como suas caractersticas e evoluo clnica, como analisaremos a seguir. Protena NOD2 (CARD 15): o fator gentico Em 2001 foi descrita uma associao entre mutaes no gene CARD15, o qual codifica a protena NOD-2, com a ocorrncia de doenas inflamatrias intestinais, mais especificamente a Doena de Crohn. Desde ento, um grande nmero de estudos tem confirmado de forma consistente esta relao, a qual pode ser melhor demonstrada da seguinte forma: - Estima-se que 20-30% dos portadores de Doena de Crohn apresentem alguma mutao no gene NOD-2/CARD15. Riis e cols encontraram uma incidncia de 23.9% de mutaes deste gene entre portadores desta doena, enquanto a incidncia observada entre pacientes com retocolite ulcerativa e indivduos saudveis foi de 9,6% e 14,4%, respectivamente, sem diferena significativa entre estes dois ltimos grupos; - Segundo uma metanlise publicada por Economou e cols envolvendo 42 estudos, indivduos com mutao em apenas um alelo do gene NOD-2/ CARD15 (heterozigticos) apresentam um risco 2.3 vezes maior de apresentar a Doena de Crohn, sendo que este risco se amplia para 17.1 vezes (10-27) em portadores de mutaes nos dois alelos (homozigticos). Outros autores relatam este risco como sendo ainda maior, estimando-o entre 20 e 40%; - Radford-Smith e Pandeya publicaram outra metanlise incluindo 12 estudos que buscaram correlacionar a presena de mutaes NOD-2/CARD15 com aspectos relacionados localizao e o comportamento da Doena de Crohn, e confirmaram uma associao significativa com a forma ileal ou ileoclica e a presena de leses estenosantes, alm de uma possvel precocidade na idade de surgimento da doena. Alm de comprovar esta importante relao com fatores genticos, estes achados demonstram ainda, a pos121

svel origem do desequilbrio bactrias/hospedeiro observado nas doenas inflamatrias intestinais, uma vez que a protena NOD-2 tem por funo a ativao de uma resposta inflamatria moderada a partir do reconhecimento de um produto bacteriano especfico, denominado como MDP. A partir destes achados, suspeita-se, entre outras hipteses, que esta deficincia na resposta imunolgica inata facilitaria uma infeco da lmina prpria, desencadeando um quadro inflamatrio crnico de maiores propores. Protena NOD1/CARD4 Alm da protena NOD2/CARD15, outra protena da famlia NOD tem sido associada fisiopatologia das doenas inflamatrias intestinais, embora existindo ainda poucas evidncias a respeito. Trata-se da protena NOD1/CARD4, expressa no intestino delgado e clon, a qual tambm exerce papel no reconhecimento no epitlio de agentes bacterianos como Shigella flexeneri e E.coli invasiva. Mc Govern e cols testaram a associao entre mutaes deste gene em uma coorte de portadores de doenas inflamatrias intestinais e controles e comprovaram, de forma semelhante ao NOD2/CARD15, uma relao significativa nos casos de Doena de Crohn, mas no em casos de retocolite ulcerativa. De qualquer forma, trata-se de outra evidncia no sentido de que estas doenas sejam o resultado da alterao de reatividade a alguns antgenos presentes na mucosa intestinal. Famlia TLR Alm dos receptores NOD, outra famlia importante de receptores de membrana em clulas de defesa no epitlio intestinal pertence ao grupo denominado como TLR (Toll-like receptor). Estes receptores reconhecem os lipopolisacardeos produzidos por bactrias, em sua grande maioria comensais gram negativas, sendo possivelmente responsveis na diferenciao entre estas e as bactrias patognicas. Onze tipos diferentes de TLR j foram identificados, e diversos estudos tm demonstrado uma variao na expresso destes entre indivduos normais e pacientes portadores de Doena de Crohn e retocolite ulcerativa. Outros genes Embora os segmentos gnicos referentes expresso das protenas NOD tenham recebido uma maior ateno devido consistncia e reprodutibilidade dos resultados, diversos outros segmentos cromossomiais tm sido citados como possveis codificantes de prote-

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nas relacionadas s doenas inflamatrias intestinais. Estes segmentos IBDs (inflammatory bowel disease) , conforme demonstrados na tabela 1, tm sido bastante estudados com o objetivo no apenas de identificar possveis componentes hereditrios destas doenas, mas tambm visando a compreenso dos mecanismos moleculares envolvidos em sua etiopatogenia e mesmo na resposta aos diferentes esquemas teraputicos utilizados em seu tratamento. Defeitos na barreira mucosa Alm das alteraes ocorridas na flora bacteriana e na resposta imune presena de bactrias, o comprometimento da barreira mucosa considerado como um terceiro aspecto capaz de contribuir para a fisiopatologia das doenas inflamatrias intestinais. Responsvel pela mediao entre as bactrias do lumen intestinal e o sistema linfide, a integridade da camada epitelial tem por funo atuar seletivamente para limitar a penetrao de antgenos e permitir a passagem de lquidos, nutrientes e alguns microrganismos. Os estudos de biologia molecular demonstram que um grande nmero de protenas so necessrias para que esta fun-

o de barreira ocorra de forma adequada. Dentre estas, poderamos destacar como exemplos a protena transportadora de ctions orgnicos (OCTN) e a DGL5, ambas expressas pelo cromossomo 5 (IBD5, na tabela acima), cujas alteraes esto associadas Doena de Crohn. Outras protenas de grande relevncia na integridade da barreira epitelial so as defensinas, as quais apresentam ao antibacteriana e cuja expresso alterada tem sido demonstrada em pacientes portadores de doenas inflamatrias intestinais, podendo contribuir para o desequilbrio dos mecanismos de defesa, possibilitando uma intensificao da invaso bacteriana e a conseqente inflamao crnica da mucosa. Assim sendo, observamos que a aplicao de tcnicas de biologia molecular ao estudos das doenas inflamatrias intestinais tem possibilitado a identificao de um grande nmero de molculas envolvidas em diferentes possveis mecanismos fisiopatolgicos destas doenas. A observao das variaes de expresso destas molculas correlacionadas evoluo clnica e respostas teraputicas ir contribuir para que possamos em um futuro obter resposta a histricos questionamentos sobre estas complexas doenas.

Tabela 1 - Regies e genes relacionados s doenas inflamatrias intestinais. Regio IBD1 IBD 2 IBD 2 IBD 4 IBD 5 IBD 6 IBD 7 IBD 8 IBD 9 Local Cromossomo 16 Cromossomo 12 Cromossomo 6 Cromossomo 14 Cromossomo 5 Cromossomo 19 Cromossomo 1 Cromossomo 16 Cromossomo 9 Genes envolvidos NOD2/CARD15, IL-4R, CD11B Receptor de Vitamina D (VDR), STAT6, Interferon , integrina Complexo de histocompatibilidade, classes I, II, III Receptor de linfcito T (TCR), leucotrieno b4 OCTN, DLG5, MDR1, IL-6, CD14 Tromboxane A2, leucotrieno B4, ICAM-1 TGF, TNF A definir CCR-5, CCR9, IL-12

ABSTRACT: Despite its high prevalence and many years of basic and clinical research, pathophysiology of Crohns disease and ulcerative colitis remains a great challenge. The recent advances in molecular biology techniques have provided identification of a great number of molecules related to these diseases that may help in a near future to understand its still obscure aspects. Many evidences have recently demonstrated that inflammatory bowel diseases (IBD) result from an imbalance between bowel commensal bacterial flora and the immunological mucosal apparatus. The very consistent finding that mutations in NOD2/CARD15 gene occur in a high percentage of Crohns disease patients and its phenotype correlation have boosted further research to identify other IBD-related molecules. Indeed, many other variations in gene expression have been demonstrated to be related to pathophysiology of IBD including different aspects such as inate immunity, inflammatory response and mucosal barrier disfunction. The observation of the correlation between these gene expression variation, disease behaviour and response to therapeutics may contribute in a near future to understand most questions regarding these complex diseases. Key words: Crohns disease; Ulcerative colitis; molecular biology.

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