UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ – UFPI

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS

BACHARELADO EM ODONTOLOGIA

LUIZ FELIPE CAMPOS BATISTA

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO PÓS-BIOTICO DE Lacticaseibacillus rahmnosus

E SEU EFEITO NO DESENVOLVIMENTO DE BIOFILME MICROCOSMO IN
VITRO

TERESINA –PI
2024
 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ – UFPI
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS
BACHARELADO EM ODONTOLOGIA

LUIZ FELIPE CAMPOS BATISTA

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO PÓS-BIOTICO DE Lacticaseibacillus rahmnosus

E SEU EFEITO NO DESENVOLVIMENTO DE BIOFILME MICROCOSMO IN
VITRO

Trabalho de Conclusão de Curso desenvolvido como

requisito parcial para obtenção do Título de Cirurgião-
Dentista do Curso de Odontologia da Universidade
Federal do Piauí.

Orientador: Prof. Dr. Glauber Campos Vale

TERESINA-PI
2024
 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ – UFPI
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA RESTAURADORA

TERESINA – PI, 26 de Janeiro de 2024

Prezado(a) professor(a),

Ao tempo em que agradeço a colaboração, encaminho o trabalho de conclusão de curso do

aluno Luiz Felipe Campos Batista intitulado “Caracterização química do pós-biotico de
lacticaseibacillus rahmnosus e seu efeito no desenvolvimento de biofilme microcosmo in
vitro”.
”.

Data da apresentação: 06 de fevereiro de 2024

Local: Sala interna do Bloco SG-5 Odontologia UFPI.
Horário: 9h30.

Atenciosamente,

Prof. Dr. Glauber Campos Vale

Banca examinadora:
Prof. Dr. Glauber Campos Vales – Orientador
Prof. Dr. Aryvelto Miranda Silva – 1º Examinador
Prof. Dra. Caroline de Deus Tupinambá – 2º Examinador
Lyzia Vitória Mendes Rezende (suplente)
 Caracterização química do pós-biotico de lacticaseibacillus rahmnosus e seu efeito no
desenvolvimento de biofilme microcosmo in vitro

Banca Avaliadora

1) Prof. Dr. Glauber Campos Vale (Orientador)

Titulação: Mestre e Doutor em Odontologia, área de concentração Cariologia -
FOP/UNICAMP.
Julgamento: __________ Assinatura: ___________________________
2) Prof. Dr. Aryvelto Miranda Silva (Avaliador)
Titulação: Mestre e Doutor em Dentística - UNESP
Julgamento: ________ Assinatura: _____________________________
3) Profª. Drª. Caroline de Deus Tupinamba (Avaliadora)
Titulação: Mestre e Doutora em Dentística - UNESP
Julgamento: ________ Assinatura: _____________________________
4) Lyzia Vitória Mendes Rezende (Suplente)
Titulação: Mestranda em Odontologia – UFPI
Julgamento: __________ Assinatura: ___________________________
 AGRADECIMENTOS
Dedico este Trabalho de Conclusão de Curso a todos que foram meu sustento e alicerce
durante toda a vida e de maneira especial ma graduação.
À Deus, que em Seu infinito amor e bondade me alcançou e me fez capaz de enfretar
tudo que se colocou em meu caminho e conseguir êxito, afinal, “Ele tem cuidado de Vós” e por
diversas vezes, essa passagem da Carta de São Pedro se mostrou verdadeira em minha história.
À Nossa Senhora das Graças, título dado a Virgem Maria ao qual sou consagrado e que
também consagrei todo este trabalho, pois a mãe da Divina Providência providenciou tudo que
foi necessário.
À minha mãe, Maria Gorete, que não caberia elogios e nem agradecimentos suficientes
para ela que executa a missão e vocação de ser mãe com tanta maestria, zelo, amor e carinho.
Que me apoiou em meus sonhos e sempre me deixou alçar um livre vôo.
Ao meu pai, Lourival Junior, que nunca deixou o bem material faltar dentro de casa e
que embarcou comigo nesse “cruzeiro” que é o curso de odontologia.
Ao meu irmão, Pedro Campos, que é um cara de inteligência extraordinária e minha
inspiração de que mesmo de onde viemos, podemos ser grande se buscarmos com garra,
dedicação e a graça de Deus.
A minha noiva, Klissia Raynara, que é meu refúgio e porto seguro, onde mesmo em
meu silêncio, sou ouvido, acolhido e posso descansar em um abraço e um sorriso.
A minha cunhada, Ketry Rayane, que junto dela posso ser verdadeiro e agir como a mais
simples das criaturas e que qualquer coisa é motivo de riso e alegria.
Ao meu Grupo de Oração O Caminho para Jesus, que me ensinou o significado da
“verdadeira felicidade” que São Francisco falava com imensa alegria e verdade e que a cada
encontro, me fez retornar à Aquele que tudo pode.
Aos meus avós, José Luis e Terezinha de Jesus, ele que foi meu paciente em diversas
disciplinas na graduação e a ela, que do céu viu se cumprir a sua profecia de que o neto homem
caçula ia cuidar dos dentes de seu avô.
Aos meus amigos, Jeferson, João Paulo, Lara, Luana, Marina e Mayra, que fizeram
desses 6 anos mais leves, descontraídos e suportáveis. Hoje podemos realizar nosso sonho de
ser dentistas juntos.
À minha dupla, Diego Rodrigues, que ficou com a missão mais difícil de me suportar
durante semanas de provas, procedimentos difícies, dias de estresse, mas também de dia felizes
e juntos construir uma boa amizade.
 Aos Professores da Odontologia-UFPI, que foram construtores também de quem eu sou
hoje, em meio a cada clínica, laboratório, conversa, piada, sorriso, abraço e oportunidades.
Em especial ao professor Glauber, pela primeira opotunidade há alguns anos com o ICV,
depois PIBIC e agora, o TCC. Muito obrigado pela orientação !
 SUMÁRIO
Resumo: ...................................................................................................................................... 7

Abstract: ..................................................................................................................................... 8

Introdução ................................................................................................................................... 8

Materiais e Métodos: .................................................................................................................. 9

Obtenção do pós-biótico (meio de cultura condicionado) ...................................................... 9

2. Caracterização química do pós-biótico................................................................................. 10

2.1. Liofilização e dessecação do produto obtido ................................................................. 10

2.2. Cromatografia gasosa acoplada a Espectrometria de massas ........................................ 10

Método de análise ............................................................................................................. 10

Método de Sililação .......................................................................................................... 10

3. Ensaio com biofilme microcosmo .................................................................................... 11

3.1. Obtenção dos blocos de dentina e formação da película ............................................... 11

3.2. Preparo do biofilme microcosmo .................................................................................. 11

3.3. Determinação do peso seco dos biofilmes ..................................................................... 12

3.4. Determinação da contagem das bactérias viáveis.......................................................... 12

4. Análise Estatística ............................................................................................................ 12

Resultados................................................................................................................................. 12

1. Identificação dos constituintes – Perfil cromatográfico do pós-biótico de LR-32 ........ 13

2. Efeito do pós-biótico no Biofilme Microcosmo ............................................................ 14

Discussão .................................................................................................................................. 17

Conclusão ................................................................................................................................. 18

ANEXO .................................................................................................................................... 21
Artigo formatado segunda as normas da editora de revistas
científicas revisadas por pares Hindawi

The Scientific World Journal

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO PÓS-BIOTICO DE Lacticaseibacillus rahmnosus

E SEU EFEITO NO DESENVOLVIMENTO DE BIOFILME MICROCOSMO IN
VITRO

Luiz F. C. Batista¹ e Glauber C. Vale¹

¹Departamento de Odontologia Restauradora (DOR), Centro de Ciências da Saúde (CCS),

Universidade Federal do Piauí (UFPI), Teresina-PI, Brasil

Resumo:
Os pós-bióticos compreendem metabólitos e/ou componentes da parede celular, secretados por
bactérias vivas ou liberados após a lise bacteriana, apresentando atividades benéficas
demonstradas no hospedeiro. Dessa forma, o presente trabalho objetiva realizar a
caracterização química do pós-biótico de Lactobacillus rhamnosus Lr-32 e avaliar os efeitos
sobre o biofilme microcosmo. Os produtos dos probióticos foram obtidos das cepas de L.
rhamnosus Lr32 após filtragem do sobrenadante de sua suspensão. O inóculo inicial foi coletada
de três doadores sem higienização da cavidade bucal por 24 horas. A mistura das salivas foi
inoculada em meio de cultura BHI contendo 1% de glicose, após 18 horas a suspensão foi
adicionada sobre os poços de uma placa de 24 poços contendo um bloco de dentina bovina
esterilizada em cada poço. Os tratamentos ocorreram durante dois dias, três vezes por dia. No
fim de cada dia foram transferidos para uma nova placa de 24 poços contendo novo meio de
cultura. Ao final, os biofilmes foram coletados para determinação de bactérias viáveis (Candida,
Lactobacilos e Estreptocos) e peso seco. Foi observdo que o crescimento de bactérias
cariogênicas (Estreptococos e Lactobacilos) e leveduras (Candida) reduziram na presença do
pós-bióticos. Assim como, o peso seco dos biofilmes que também foram tratados com o pó-
biótico foi inferior e com diferença estatística significativa em relação ao grupo controle
7
negativo. O pós-biótico de L. rhamnosus LR-32 reduziu a contagem dos microrganismos e do
peso seco de biofilme microcosmo, sendo semelhante ao controle positivo com CHX 0.12%.
Logo, esse produto apresenta potencial antimicrobiano e pode ser candidato para o manejo do
biofilme cariogênico.

Abstract:
Postbiotics comprise metabolites and/or cell wall components, secreted by live bacteria or
released after bacterial lysis, with demonstrated beneficial activities in the host. Therefore, the
present work aims to carry out the chemical characterization of the postbiotic Lactobacillus
rhamnosus Lr-32 and evaluate the effects on the microcosm biofilm. Probiotic products were
obtained from L. rhamnosus Lr32 strains after filtering the supernatant of its suspension. The
initial inoculum was collected from three donors without cleaning the oral cavity for 24 hours.
The saliva mixture was inoculated into BHI culture medium containing 1% glucose, after 18
hours the suspension was added to the wells of a 24-well plate containing a block of sterilized
bovine dentin in each well. Treatments took place over two days, three times a day. At the end
of each day, they were transferred to a new 24-well plate containing new culture medium.
Finally, the biofilms were collected to determine viable bacteria (Candida, Lactobacilli and
Streptocci) and dry weight. It was observed that the growth of cariogenic bacteria (Streptococci
and Lactobacilli) and yeast (Candida) reduced in the presence of postbiotics. Likewise, the dry
weight of the biofilms that were also treated with the biotic powder was lower and with a
statistically significant difference in relation to the negative control group. The L. rhamnosus
LR-32 postbiotic reduced the count of microorganisms and the dry weight of microcosm
biofilm, being similar to the positive control with CHX 0.12%. Therefore, this product has
antimicrobial potential and may be a candidate for managing cariogenic biofilm.

Introdução
Pró-bióticos são microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades
adequadas, conferem um benefício à saúde do hospedeiro (8). Exemplo disso, os probióticos
podem restaurar a composição do microbioma intestinal e introduzir funções benéficas nas

8
comunidades microbianas intestinais, resultando na melhora ou prevenção da inflamação
intestinal e outros fenótipos de doenças intestinais ou sistêmicas (7).
Por sua vez, Pós-biótico é o termo usado para definir os fatores solúveis, produtos ou
subprodutos metabólicos liberados pelas bactérias vivas ou após a lise bacteriana(2). Tais
produtos são excretados no sobrenadante livre de células da suspensão bacteriana durante seu
crescimento e são capazes de fornecer benefícios para a saúde através de um mecanismo direto
ou indireto (11).
Os pós-bióticos apresentam vantagem sobre os pró-bióticos por otimizar seus efeitos
benéficos, contornando o desafio técnico de eficiência de colonização e manter os
microrganismos viáveis e estáveis no produto em alta dose, uma vez que são influenciados por
fatores externos, como temperatura e pH (17), porém como a ação específica dos pós-bióticos
depende de níveis de dosagem definidos, a maioria dos estudos não conseguiu fixar uma dose
específica de pós-bióticos/paraprobióticos para garantir os efeitos benéficos dos probióticos
em células viáveis (19).
Dessa, várias moléculas pós-bióticas têm chamado a atenção devido à sua estrutura
química conhecida, longa estabilidade de armazenamento e capacidade de desencadear os
diversos mecanismos no controle da inflamação, adesão de patógenos ao trato gastro-intestinal,
obesidade, hipertensão, doenças das artérias coronárias (DCV), câncer, e estresse oxidativo.
(19). Preparações pós-bióticas também concederam patentes como bioterapêuticos para uma
alegação de saúde específica “imunomodulação” (18). Desta maneira, este trabalho tem como
objetivo avaliar a caracterização química do pós-biotico de lacticaseibacillus rahmnosus e seu
efeito no desenvolvimento de biofilme microcosmo in vitro.

Materiais e Métodos:
Obtenção do pós-biótico (meio de cultura condicionado)

O pós-biótico foi obtido a partir da cepa pró-biótica Lacticaseibacillus rahmnosus LR-

32™, que foi cultivado em caldo e ágar MRS Lactobacilli, em 5% de CO2 (condição de
microaerofilia) a 37°C por 48 horas. O pró-biótico foi cultivado em caldo MRS a 37°C por 18
h e, em seguida, centrifugados a 5.000 × g por 10 min a 4°C. O sobrenadante foi transferido
para um novo tubo e filtrado através de filtro de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com um
tamanho de poro de 0,22 μm (Millipore Co., Billerica, MA, EUA). O produto foi acondicionado
em tubo de 2 ml e congelado em freezer -20°C.
9
2. Caracterização química do pós-biótico
2.1. Liofilização e dessecação do produto obtido

O pós-biótico obtido foi liofilizado usando um liofilizador de bancada por 48 horas

(LS300; Terroni, São Paulo, Brasil), com temperatura de congelamento: −40 °C, pressão da
bomba: 100 mTorr e temperatura da prateleira: −60 °C. Em seguida as mostras foram colocadas
em dessecador contendo Pentóxido de Fósforo para dessecação e posterior análises.

2.2. Cromatografia gasosa acoplada a Espectrometria de massas

Método de análise
Análise de Cromatografia acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) foi realizada
em um cromatógrafo (GCMS-QP2010 SE, AOC-5000 auto injetor da SHIMADZU), seguindo
as seguintes condições de análise: injetor 290 °C, e temperatura inicial do forno de 60 °C,
apresentando uma rampa de aquecimento 4 °C/min até 315 °C permanecendo por 25 minutos,
razão Split de 1:10, temperatura da interface 320 °C e fonte de 230 ºC, faixa de massa de 57 a
700 Daltons, ionização por impactos de elétrons de 70 eV. Para cromatografia dos componentes
foi empregada uma coluna DB5-MS UI (Agilent), 30 m × 0,25 mm, espessura do filme interno
de 0,25 µm com fase estacionária de difenil dimetilpolissiloxano e Hélio como gás arraste. A
identificação e quantificação dos constituintes foram obtidas com base nas áreas dos picos
cromatográficos correspondentes e comparação com os registros de base da literatura.

Método de Sililação
Antes do processo de derivatização, as amostras foram colocadas em um recipiente
contendo pentóxido de fósforo por 24 horas. Para a derivatização foram utilizados
aproximadamente 5,0 mg de amostra em um balão de fundo redondo de 5 mL e limpo com
diclorometano, contendo uma barra magnética. Depois foi adicionado, com auxílio de uma
seringa de vidro, piridina e BSTFA (N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida) na razão 1:1 (v/v),
a fração ácida foi adicionada, obedecendo a proporção de 1 mg de fração para cada 50 µL de
BSTFA e 50 µL de piridina. O balão da derivatização é colocado em um sistema de banho de
areia acoplado com termômetro sob uma chapa aquecedora, mantendo a temperatura entre 50
°C a 70 °C por um tempo de 1 h e 30 min. Após a sililação, as amostras foram filtradas

10
diretamente no viel de injeção com filtro de seringa PTFE (0,22 µm, 13 mm) (Allcrom). Após
a filtração, o volume foi completado até 1,0 mL com acetato de etila.

3. Ensaio com biofilme microcosmo

3.1. Obtenção dos blocos de dentina e formação da película

Blocos de dentina foram obtidos a partir de raízes bovinas que após corte, desgaste e polimento
ficaram com dimensões de 4x4x2 mm (9). Os blocos de dentina foram autoclavados para
posterior formação da película adquirida. Para tal, o pool da saliva de três doadores foi filtrada
com filtro de 0,22 um e 1 ml desse filtrado foi depositado sobre cada bloco de dentina por 2
horas em estufa a 37oC.

3.2. Preparo do biofilme microcosmo

Para o preparo do inóculo inicial, aproximadamente 10 mL de saliva estimulada foi

coletada de três doadores que estavam sem higienização da cavidade bucal por 24 horas. A
mistura das salivas foi inoculada em 100 mL de meio de cultura BHI (Brain Heart Infusion)
contendo 1% de glicose. Após 18h em estufa de CO2 10% a 37oC, a suspensão foi agitada e 2
mL da suspensão foi adicionada sobre os poços de uma placa de 24 poços contendo um bloco
de dentina bovina com a película formada previamente em cada poço. A placa de 24 poços foi
mantida em estufa de CO2 10% a 37oC por 6 horas para adesão bacteriana nos blocos de
dentina. Após esse período os blocos foram transferidos para uma nova placa de 24 poços
contendo 1,5 mL do meio para o crescimento do biofilme microcosmo (BHI caldo, peptona
(2g/L), extrato de levedura (0,35g/L), 0.2% de NaCl e 0,2% de sacarose). Os tratamentos
consistiram na adição de 0,5 ml do pós-biotico de LA-5, clorexidina 0,12% (controle positivo),
e NaCl 0,89% (controle negativo) nos poços contendo os blocos e o meio para crescimento do
biofilme totalizando 2 mL em cada poço. Ao final de cada dia de protocolo experimental os
blocos foram transferidos para uma nova placa de 24 poços contendo novo meio de cultura. Ao
final das 72h do experimento, os biofilmes foram coletados usando pipetação vigorosa com 0,5
ml de solução salina para determinação de bactérias viáveis (Candida, Lactobacilos e

11
Estreptocos) e peso seco.

3.3. Determinação do peso seco dos biofilmes

200 ul das suspensões obtidas da coleta dos biofilmes foram centrifugadas e o

sobrenadante descartado. Os sedimentos dos biofilmes foram secos em dessecador contendo
Pentóxido de Fósforo por 24 horas e o peso seco do biofilme foi determinado em microtubos
pré-pesados em balança analítica de precisão.

3.4. Determinação da contagem das bactérias viáveis

100 ul da suspensão obtida da coleta do biofilme passou por um processo de diluição

seriada com solução salina NaCl 0,85%. As amostras foram homogeneizadas em um agitador
de tubos tipo vórtex vigorosamente por 30s e as diluições realizadas na proporção de 10 -1 a 10-
5
vezes e inoculadas no meio MSA (Mitis Salivarius agar) para contagem de estreptococos
totais, Rogosa agar para contagem de lactobacilos totais e ASD (Ágar Sabouraud Dextrose)
com clorofenicol para contagem de Candida. As unidades formadoras de colônias (UFCs)
foram contadas e os resultados expressos em UFC/ml de biofilme dental úmido.

4. Análise Estatística

Os experimentos foram realizados em duplicata com quatro repetições dentro de cada

experimento. O software Graphpad Prism 9.02 program (Graphpad, La Jolla, Ca, USA) foi
usado para análise estatística. Os dados de UFC foram transformados em log10 para obtenção
da distribuição normal. ANOVA seguida do teste de Tukey foi utilizada para comparar as
variáveis e o nível de significância foi de 5%.

Resultados

12
 1. Identificação dos constituintes – Perfil cromatográfico do pós-biótico
de LR-32
O perfil cromatográfico do pós-biótico de LR-32 está apresentado na Figura 1 e a tabela
2 apresenta a composição química do extrato LR-32, o extrato foi sililado em BSTFA e foram
analisados por meio da técnica de Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
(CG-MS). No cromatograma, figura 1, foram identificados um total de 17 (dezessete)
compostos, de várias classes químicas, incluindo 5 (cinco) açúcares, 2 (dois) aminoácidos, 1
(uma) vitamina, 3 (três) ácidos, dentre outros que constam na Tabela 1. As espécies majoritárias
da amostra são o silanol (03), o ácido cítrico (10) e β-D-Glicopiranose (13), exercendo, assim,
maior influência sobre as características do pós-biótico. Além destes, alguns compostos muito
presentes foram a α-D-Galactopiranose, Lactose e Maltose, mostrando a grande abundância de
açúcares na amostra.

Figura 1. Perfil Cromatográfico (GC-MS) do Extrato LR-32. O Extrato foi sililado em BSTFA e analisado por
GC-MS.

Tabela 1. Composição química do Extrato LR-32. O Extrato foi sililado em BSTFA e analisado por GC-MS.
Fórmula Área Área
Nº RT Similaridade Constituinte Molecular Absoluta Relativa%
Trimethylsilyl Ester of L-
1 10.119 96 valine C11H27NO2Si2 2565504 1,59%

13
 2 15.082 94 Pentanoic acid C5H10O2 712900 0,44%
Silanol, Phosphoric acid-
C9H27O4PSi3
3 16.336 94 tritms 28993178 17,98%

4 16.492 94 3,7-Dioxa-2,8-disilanonane C9H24O2Si2 3325745 2,06%

Trimethylsilyl ester of O-
5 17.056 95 trimethysilyl-L-Threonine C10H25NO3Si2 2381219 1,48%

6 17.821 95 Butanedioic acid C4H6O4 1288829 0,80%

L-Proline, Pyroglutamic
7 24.228 94 acid-ditms C5H7NO3 4212701 2,61%

8 24.978 95 Phenylalanine 1TMS C12H19NO2Si 2606598 1,62%

9 31.267 90 Phosphoric acid, α.-Glycer C3H9O6P 428872 0,27%

10 32.768 87 Citric acid C6H8O7 31491768 19,53%

Glucofuranoside, methyl
2,3,5,6-tetrakis-O-
11 33.372 90 (trimethylsilyl) C19H46O6Si4 6408426 3,98%

12 34.591 96 α-D-Galactopyranose C6H12O6 21217490 13,16%

13 36.844 96 β-D-Glucopyranose C6H12O6 28402983 17,62%

14 39.255 91 myo-Inositol C6H12O6 1018404 0,63%

15 41.648 90 Tryptophan 2TMS C17H28N2O2Si2 724774 0,45%

16 50.705 94 Lactose-Octarms C36H86O11Si8 12470922 7,74%

17 52.994 92 Maltose-Octarms C36H86O11Si8 12963518 8,04%

Fonte: Autoria própria

2. Efeito do pós-biótico no Biofilme Microcosmo

14
Figura 2. Peso seco dos biofilmes de S. mutans formados (mg) com ou sem o pós-biótico de Lactobacillus
rhamnosus LR-32. As barras verticais indicam o desvio padrão e asterisco representa diferença estatística entre os
grupos (p<0.05).

Figura 3. Contagem de Candida sp. viáveis no biofilme microcosmo (UFC/mL) formados com os pós-biótico de
Lactobacillus rhamnosus LR-32. Foi utilizado como controle positivo a clorexidina (CHX 0,12%) e como controle
negativo uma solução fisiológica de NaCl (0,85%). As barras verticais indicam o desvio padrão e asterisco
representa diferença estatística entre os grupos (p<0.05).

15
Figura 4: Contagem de lactobacilos totais viáveis no biofilme microcosmo (UFC/ml) formados com os pós-biótico
de Lactobacillus rhamnosus LR-32. Foi utilizado como controle positivo a clorexidina (CHX 0,12%) e como
controle negativo uma solução fisiológica de NaCl (0,85%). As barras verticais indicam o desvio padrão e
asterisco representa diferença estatística entre os grupos (p<0.05)

Figura 5: Contagem de estreptococos totais viáveis no biofilme microcosmo (UFC/ml) Formados com os pós-
biótico de Lactobacillus rhamnosus LR-32. Foi utilizado como controle positivo a clorexidina (CHX 0,12%) e

16
como controle negativo uma solução fisiológica de NaCl (0,85%). As barras verticais indicam desvio padrão e
asteriscos representa diferença estatística entre os grupos (p<0,05).

É possível observar através do resultados (Figuras 3, 4 e 5) que o crescimento de

bactérias cariogênicas (Estreptococos e Lactobacilos) e leveduras Candida teve redução na
presença do pós-biótico testado de forma similar ao controle positivo de clorexidina quando
comparados ao controle negativo (p < 0,05).
Assim como, o peso seco dos biofilmes (Tabela 2) que também foram tratados com o
pós-biótico foi inferior e com diferença estatística significativa em relação ao grupo controle
negativo.

Discussão
O presente estudo determinou a composição de um pós-biótico e seu efeito sobre o
desenvolvimento de um biofilme microcosmo. Os resultados apontam para uma redução no
desenvolvimento desses biofilmes pelos parâmetros de viabilidade e peso seco. Tal resultado
pode ser devido a presença de exometabólitos presentes no pós-biótico, como ácidos e produtos
antimicrobianos, como o peróxido de hidrogênio (25). De fato, ao observar os compostos
majoritários (Tabela 1), percebe-se que existe uma certa abundância de ácidos orgânicos,
peptídeos e aminoácidos, corroborando com os estudos de Hossain et al., (2021), onde as
mesmas classes de compostos foram encontradas mais frequentemente nas amostras analisadas.
Contudo, ainda pode haver outros tipos de compostos, pois não se pode descartar perda
ou modificação dos metabólitos ao passar pelos processos de purificação e/ou detecção (10).
Sabe-se que LR-32 é capaz de produzir peróxido de hidrogênio (12), entretanto, no processo de
liofilização do meio condicionado, os materiais como peróxido de hidrogênio e metabólitos de
oxigênio perdem sua atividade antimicrobiana (22). Ao se comparar o perfil químico do pós-
biótico estudado com outros de Lactobacillus spp., observa-se uma diversidade de perfis, que
pode ser explicado pelo tipo de bactéria, aos métodos de análise (GC-MS ou HPLC) e a natureza
do meio condicionado.
No presente estudo, foi observado a presença de Silanol (17,98%) no pós-biótico que
pode ter relação com a redução das UFC dos microorganismos avaliados S. mutans (Figuras 3
17
,4 e 5), já que de forma similar foi observado uma redução das UFCs de Escherichia coli (gram
negativa) e Staphylococcus aureus (gram positiva) em estudo que analisou o potencial de
superfície de biomateriais com grupos silanol para prevenir a formação de biofilme bacteriano.
Além disso, na prevenção da formação do biofilme foi demonstrado que o silanol na superfície
do biomaterial evidenciou um efeito positivo somente no biofilme de Staphylococcus aureus,
sugerindo tal efeito apenas em bactérias gram-positivas, resultado semelhante ao observado no
presente estudo em que foi utilizado uma cepa bacteriana gram-positiva (21).
Ácido cítrico, outro composto abundante no pós-biótico avaliado, pode ter relação
também com a redução do número de bactérias viáveis e é considerado um desinfetante seguro
na área da microbiologia. Um estudo de Mahdizadeh, Sawford, van Andel & Browning (2020)
avaliou a eficácia do ácido cítrico e hipoclorito de sódio como desinfetantes contra a bactéria
Mycoplasma bovis, patógeno bovino, e demonstrou que a concentração de 0,5% de ácido cítrico
reduz significativamente a infecciosidade de tal bactéria. Além disso, foi evidenciado em outro
estudo que o efeito antimicrobiano do ácido cítrico decorreu através de dano à membrana e
perda de viabilidade quando foi usado o ácido cítrico na concentração de 1% e 10% em pH 9,5
em bactérias da espécie Escherichia coli e Klebsiella aerogenes (3).
Bactérias ácido láticas podem produzir uma série de inibidores de crescimento, como
ácidos orgânicos, bacteriocinas e peróxido de hidrogênio principalmente contra patógenos
gram-positivos. (16). A diminuição do crescimento de estreptococos (Figuras 5) em nosso
estudo pode ter sido causada por ácidos orgânicos produzidos por Lacticaseibacillus rhamnosus
e presentes no meio condicionado. Além disso, foi observado que os sobrenadantes da cultura
de Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lactobacillus plantarum 299V e Lactobacillus reuteri
PTA 5289 e SD2112 reduziram a viabilidade de Streptococcus mutans (24) e a atividade
antimicrobiana dependeu do nível de acidez da cultura de Lactobacillus, o que pode explicar os
resultados do nosso estudo, visto que o pós-biótico usado não foi neutralizado.

Conclusão
Pode-se concluir que o pós-biótico de Lactobacillus rhamnosus LR-32 reduziu as
contagens dos microrganismos avaliados e do peso seco de biofilme microcosmo, sendo
semelhantes ao controle positivo com CHX 0.12%. Dessa forma, esses produtos apresentam
potencial antimicrobiano e podem ser candidatos para o manejo da cárie dentária.

18
 Referências

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19
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24. SÖDERLING, E. M.; MARTTINEN, A. M.; HAUKIOJA, A. L. Probiotic
Lactobacilli Interfere with Streptococcus mutans Biofilm Formation In
Vitro. Current Microbiology, v. 62, n. 2, p. 618–622, 11 set. 2011.
25. SURENDRAN NAIR, M.; AMALARADJOU, M. A.; VENKITANARAYANAN,
K. Antivirulence Properties of Probiotics in Combating Microbial
Pathogenesis. Advances in Applied Microbiology, v. 98, p. 1–29, 2017.

20
ANEXO

Journal Title

Concise and Informative Article Title

Firstname M. I. Lastname,1 Firstname A. Lastname,2 and Firstname B. Lastname1,2

1
Department, Institute, City ZIP/Post code, Country.
2
Department, Institute, City ZIP/Post code, Country.

Correspondence should be addressed to Firstname B. Lastname; lastname@institution.edu

Abstract

The abstract should be a single, self-contained paragraph which summarises the manuscript.
Ideally it will provide a brief context for the study, before describing the scientific approach
and some key results in a qualitative manner. It should finish with a sentence to describe the
implications for the field. The abstract must not include references, figures or tables.

Introduction

The introduction should be succinct, with no subheadings. Limited figures may be included
only if they are truly introductory, and contain no new results.

Materials and Methods

The materials and methods section should contain sufficient detail so that all procedures can be
repeated. It may be divided into headed subsections if several methods are described.

Results and Discussion

Subheadings

The results and discussion may be presented separately, or in one combined section, and may
optionally be divided into headed subsections.

Advice on Equations

Equations should be provided in a text format, rather than as an image. Microsoft Word’s
equation tool is acceptable. Equations should be numbered consecutively, in round brackets, on
the right-hand side of the page. They should be referred to as Equation 1, etc. in the main text.

−𝑏±√𝑏 2 −4𝑎𝑐
𝑥= (1)
2𝑎

21
Advice on Figures

At the point of submission, authors may provide all figures embedded within the manuscript at
a convenient break near to where they are first referenced or, alternatively, they may be
provided as separate files. All figures should be cited in the paper in a consecutive order. Where
possible, figures should be displayed on a white background. When preparing figures, consider
that they can occupy either a single column (half page width) or two columns (full page width),
and should be sized accordingly. All figures must have an accompanying caption which
includes a title and, preferably, a brief description (see Figure 1).

Figure 1: Basic rocket ship design. The rocket ship is propelled with three thrusters and features a single viewing
window. The nose cone is detachable upon impact.

The caption can also be used to explain any acronyms used in the figure, as well as providing
information on scale bar sizes or other information that cannot be included in the figure itself.
Plots that show error bars should include in the caption a description of how the error was
calculated and the sample size (see Figure 2).

30

25
Particle Size (nm)

20

15

10

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Time (s)

Figure 2: Plot of nanoparticle size with respect to time, recorded over a 90 s period. The error bars represent the

22
 standard deviation of measurements for 20 particles in five separate sample runs (n = 100).

If a figure consists of multiple panels, they should be ordered logically and labelled with lower
case roman letters (i.e., a, b, c, etc.). If it is necessary to mark individual features within a panel
(e.g., in Figure 3a), this may be done with lowercase Roman numerals, i, ii, iii, iv, etc. All labels
should be explained in the caption. Panels should not be contained within boxes unless strictly
necessary.

Figure 3: Representations of some common weather symbols. (a) The sun with (i) core, and (ii) rays. (b) Thunder
bolt. (c) Cloud. (d) Moon.

Upon acceptance, authors will be asked to provide the figures as separate electronic files. At
that stage, figures should be supplied in either vector art formats (Illustrator, EPS, WMF,
FreeHand, CorelDraw, PowerPoint, Excel, etc.) or bitmap formats (Photoshop, TIFF, GIF,
JPEG, etc.). Bitmap images should be of at least 300 dpi resolution, unless due to the limited
resolution of a scientific instrument. If a bitmap image has labels, the image and labels should
be embedded in separate layers.

Advice on Tables

Every table must have a descriptive title and, if numerical measurements are given, the units
should be included in the column heading. Vertical rules should not be used (see Table 1).
Tables should be cited consecutively in the text.

Table 1: Temperature and wildlife count in the three areas covered by the study.
Location T [° C] Turtles Sharks Octopuses Starfish
Blue Lagoon 21.2 5 3 4 543
Regent’s Canal 5.2 8 0 24 312
Shark Bay 12.8 4 7 9 122

Conclusions

The Conclusions section should clearly explain the main findings and implications of the work,
highlighting its importance and relevance.

Data Availability

A data availability statement is compulsory for research articles and clinical trials. Here, authors
must describe how readers can access the data underlying the findings of the study, giving links
23
to online repositories and providing deposition codes where applicable. For more information
on how to compose a data availability statement, including template examples, please visit:
https://www.hindawi.com/research.data/#statement.

Conflicts of Interest

This section is compulsory. A competing interest exists when professional judgment concerning
the validity of research is influenced by a secondary interest, such as financial gain. We require
that our authors reveal any possible conflict of interest in their submitted manuscripts. If there
is no conflict of interest, authors should state that “The author(s) declare(s) that there is no
conflict of interest regarding the publication of this paper.”

Some of the information you choose to provide here may constitute your “sensitive personal
data”. Please read our Privacy Policy for further information on how we handle your personal
data.

Funding Statement

Authors should state how the research and publication of their article was funded, by naming
financially supporting bodies followed by any associated grant numbers in square brackets.

Acknowledgments

An Acknowledgements section is optional and may recognise those individuals who provided
help during the research and preparation of the manuscript.

Supplementary Materials

If Supplementary Materials are provided (e.g., audio files, video clips or datasets) they should
be described here. Note that authors are responsible for providing the final Supplementary
Materials files that will be published along with the article, which are not modified by our
production team. You should remember to reference the Supplementary Materials’ contents at
appropriate points within the manuscript. We recommend citing specific items, rather than
referring to the Supplementary Materials in general, for example: “See Figures S1-S10 in the
Supplementary Material for comprehensive image analysis.”

References

References will be reformatted in house, there is no need to adhere to a specific style at the
point of submission. Authors are responsible for ensuring that the information in each reference
is complete and accurate. All citations in the text must be numbered consecutively in square
brackets, before any punctuation, for example, “as discussed by Smith [1],” and “as discussed
elsewhere [2,3].” All uncited references will be automatically removed. The references should
not contain footnotes. For your information, our citation style is:

[x] Author initials and surname, “Title in sentence style,” Journal title, vol. (volume number), no. (issue
number), pp. (page numbers separated by an en-dash), Year.

24
For example:

[1] J. D. Watson and F. H. C. Crick, “A structure for deoxyribose nucleic acid,” Nature, vol. 171, no. 4356,
pp. 737–738, 1953.

For articles with six or more authors, the first three authors are listed followed by ‘et al.’. When
journals use only article numbers, no page numbers are necessary. For example:

[2] B. P. Abbott, R. Abbott, T. D. Abbott et al., “Observation of Gravitational Waves from a Binary Black
Hole Merger,” Physical Review Letters, vol. 116, no. 6, Article ID 061102, 2016.

25