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Filogenia, introgressão e história demográfica de sapos verdadeiros sul-americanos (Rhinella)

Artigo em Ecologia Molecular · Novembro de 2021

DOI: 10.1111/mec.16280

CITAÇÕES LÊ

2 452

6 autores, incluindo:

Danielle Rivera Ivan Prates

Universidade Estadual da Carolina do Norte Universidade de Michigan

6 PUBLICAÇÕES 467 CITAÇÕES 39 PUBLICAÇÕES 876 CITAÇÕES

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Thomas J.Firneno Miguel Trefaut Rodrigues

Universidade de Denver Universidade de São Paulo

15 PUBLICAÇÕES 38 CITAÇÕES 437 PUBLICAÇÕES 11.555 CITAÇÕES

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Recebido: 3 de julho de 2021 | Revisado: 24 de outubro de 2021 | Aceito: 11 de novembro de 2021

DOI: 10.1111/mec.16280

ARTIGO ORIGINAL

Filogenia, introgressão e história demográfica de

Sapos verdadeiros sul-americanos (Rhinella)

Danielle Rivera1,2 | Ivan Prates3 | Thomas J.Firneno Jr1,2 |

Miguel Trefaut Rodrigues4 | Janalee P. Caldwell5 | Matthew K. Fujita1,2

1
Departamento de Biologia, Universidade de
Texas em Arlington, Arlington, Texas, EUA Abstrato
2
Diversidade de Anfíbios e Répteis Os efeitos da introgressão genética nos limites das espécies e como eles afetam
Centro de Pesquisa da Universidade do Texas em
integridade e persistência das espécies ao longo do tempo evolutivo receberam
Arlington, Arlington, Texas, EUA
3
Departamento de Ecologia e Evolução atenção. A crescente disponibilidade de dados genômicos revelou padrões contrastantes
Biologia e Museu de Zoologia,
termos de fluxo gênico entre regiões genômicas, o que impõe desafios às inferências
Universidade de Michigan, Ann Arbor,
Michigan, EUA de relacionamentos evolutivos e de padrões de mistura genética entre linhagens.
4
Departamento de Zoologia, Instituto de Ao caracterizar padrões de variação em milhares de loci genômicos em uma ampla
Biociências, Universidade de São Paulo,
complexo de sapos verdadeiros (Rhinella), avaliamos a verdadeira extensão da introdução genética
São Paulo, SP, Brasil
5
Museu Sam Noble e Departamento de progressão entre espécies que se pensa hibridizar em graus extremos com base em
Biologia, Universidade de Oklahoma, Norman, observações de história e análises multilocus. Amostragem geográfica abrangente
Oklahoma, EUA
de cinco táxons neotropicais de grande distribuição revelaram múltiplas linhagens evolutivas distintas
Correspondência que abrangem grandes áreas geográficas e, às vezes, biomas distintos. O principal inferido
Danielle Rivera, Departamento de Biologia,
Universidade do Texas em Arlington, Arlington, Texas,
clados e agrupamentos genéticos correspondem em grande parte aos táxons atualmente reconhecidos; Contudo,
EUA. também encontramos evidências de diversidade críptica dentro dos táxons. Enquanto a filogenia anterior
E-mail: drivera2288@gmail.com
estudos revelaram extensa discordância mitonuclear, nossas análises de agrupamento genético
Informações de financiamento descobriu vários indivíduos misturados dentro dos principais grupos genéticos. De acordo com isso, seu
Divisão de Biologia Ambiental, Grant/
Número do Prêmio: DEB 1343578 e DEB análises demográficas históricas apoiaram que a história evolutiva desses sapos
1754398; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado envolveu fluxo gênico entre táxons tanto em tempos antigos quanto recentes. Por fim, ABBA-BABA
de São Paulo, Bolsa/Prêmio
Número: 2003/10335-8, 2011/50146- testes revelaram amplo compartilhamento de alelos entre as fronteiras das espécies, um padrão que pode
6, 2011/50206-9, 2012/15754-8, ser atribuído com confiança à introgressão genética em oposição à linhagem incompleta
2017/08357-6 e BIOTA 2013/50297-0
Ordenação. Esses resultados confirmam afirmações anteriores de que a história evolutiva da

Rhinella foi caracterizada por vários níveis de hibridização mesmo em ambientes

regiões totalmente heterogêneas, levantando questões interessantes sobre quais fatores impedem

fusão completa de linhagens evolutivas divergentes, mas altamente interdependentes.

PALAVRAS-CHAVE

modelagem demográfica, hibridização, introgressão, filogenia, Rhinella

1 | INTRODUÇÃO divergência e limites estáveis entre espécies intimamente relacionadas (Avise

et al., 1998; Mayr, 1963; Rabosky, 2016). Quando populações intimamente
Como a introgressão afeta o isolamento reprodutivo e a especiação é uma relacionadas entram em contato, no entanto, o fluxo gênico via hibridização
questão persistente na biologia evolutiva. O isolamento reprodutivo tem sido pode levar à introgressão de alelos (Mallet, 2005; O'Connell et al., 2021). Os
visto há muito tempo como o principal fator por trás da linhagem níveis de introgressão podem variar drasticamente entre as regiões do genoma.

Ecologia Molecular. 2021;00:1–15. wileyonlinelibrary.com/journal/mec © 2021 John Wiley & Sons Ltd | 1
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RIVERA et al.
2 |ÿÿ

Em particular, na presença de forte seleção divergente, esses loci subjacentes aos atenção do que as biotas da floresta tropical (Fonseca et al., 2018; Gehara et al.,

fenótipos adaptativos podem manter uma diferenciação marcada mesmo com fluxo gênico 2017; Werneck, 2011).

extensivo entre populações intimamente relacionadas (Feder et al., 2012). Assim, esses Um exemplo de clado neotropical cuja história biogeográfica permanece pouco

graus variados de isolamento ao longo do genoma podem contribuir para a manutenção conhecida são os verdadeiros sapos sul-americanos, gênero Rhinella (Bufonidae). Apesar

dos limites das espécies, apesar dos efeitos homogeneizadores do fluxo gênico (Yeaman de ser o foco de um punhado de estudos filogeográficos, as relações evolutivas e os limites

& Whitlock, 2011). das espécies entre esses sapos permanecem elusivos, talvez devido a padrões muito

variados de introgressão e hibridização entre as espécies (Maciel et al., 2010; Pereyra et

A introgressão diferencial entre regiões genômicas pode levar a uma dramática al., 2016 , 2021; Sequeira et al., 2011; Vallinoto et al., 2010). Como tal, não só a história

discordância topológica entre genealogias inferidas de genes distintos, como ilustrado por evolutiva deste grupo não é clara, mas também os fatores ambientais e geográficos que

instâncias de discordância mitonuclear (Bernardo et al., 2019; Bessa-Silva et al., 2020; podem ter favorecido a introgressão e sua variação, ou como a hibridização pode ter

Firneno contribuído para a divergência ou fusão de linhagens (Azevedo et al., 2003). ; Correa et

e outros, 2020). Essa heterogeneidade da árvore genealógica deve ser considerada, pois al., 2012; Malone & Fontenot,

pode tornar desafiadora a reconstrução das relações evolutivas e da demografia histórica

(Carstens & Knowles, 2007; Firneno et al., 2020; Liu et al., 2010). A crescente

disponibilidade de conjuntos de dados de sequenciamento de alto rendimento para 2008; Pereyra et al., 2016; Sequeira et al., 2011). Rhinella é composto de múltiplos

organismos não-modelo melhorou nossa capacidade de discernir padrões de introgressão complexos de espécies, cada um distribuído em grande parte dos Neotrópicos. Esses

em espécies ou populações intimamente relacionadas (Firneno et al., 2020; Graham et al., grupos são conhecidos por abrigar altos níveis de diversidade de linhagens crípticas,

2018; Lavretsky et al., 2016) e, assim, esclarecer as relações filogenéticas e os limites das conforme revelado por análises genéticas de um único e multilocus (Maciel et al., 2010;

espécies. Isso é especialmente verdade em complexos de espécies grandes e amplamente Pereyra et al., 2016, 2021; Vallinoto et al., 2010). Entre eles está o grupo Rhinella marina ,

distribuídos com variação limitada em características morfológicas externas e hibridização mais conhecido pela espécie globalmente invasora R. marina. Estudos anteriores deste

que obscurece os limites das espécies (Guo et al., 2016; Phuong et al., 2017; Potter et al., grupo identificaram introgressão mitocondrial e nuclear entre espécies (Azevedo et al.,

2016). 2003; Maciel et al., 2010; Vallinoto et al., 2010). No entanto, a falta de dados sobre a

persistência de populações geneticamente misturadas na natureza torna difícil avaliar a

A crescente disponibilidade de conjuntos de dados em escala genômica também magnitude da suposta hibridização e como ela afeta os limites das espécies (Azevedo et

promoveu o desenvolvimento de abordagens baseadas em modelos para inferir eventos al., 2003; Malone & Fontenot, 2008;

demográficos históricos, como mudanças no tamanho da população e pulsos de fluxo

gênico (Portik et al., 2017; Prates, Xue, et al., 2016).

Essas abordagens transformaram nossa compreensão de como as mudanças na paisagem Pereyra et al., 2021). Apesar da diversidade ecológica observada em Rhinella, com táxons

e no clima contribuíram para a montagem de pools regionais de espécies, por exemplo, que abrangem savanas, florestas tropicais e matagais xéricos, as análises biogeográficas

limitando a dispersão, promovendo a especiação ou levando à fusão de linhagens (Graham têm se concentrado em grande parte em táxons que ocorrem dentro de um único bioma

et al., 2018; Lavretsky et al., 2016; Leaché et al., 2019; Portik et al., 2017). Uma abordagem (Sequeira et al., 2011; Thomé et al., 2010), que é também o caso de outros clados de

flexível envolve simular histórias populacionais para comparar o ajuste de dados empíricos anuros sul-americanos (Fonseca et al.,

em escala genômica com dados simulados em cenários biogeográficos alternativos (Portik 2018; Gehara et al., 2017; Oliveira et al., 2018). Como resultado, como hab

et al., 2017; Prates et al., 2016; Dal Vechio et al., 2019). Essa estrutura de modelagem As transições itat podem contribuir para os padrões de fluxo gênico e os limites de alcance

pode facilitar o teste de hipóteses, por exemplo, como as mudanças de habitat causadas das espécies permanecem obscuros.

pelo clima podem ter levado à migração, introgressão ou isolamento entre regiões Nesta investigação, focamos no grupo R. marina para investigar as relações

geográficas. Essas abordagens têm sido fundamentais para esclarecer os fatores históricos evolutivas, quantificar a extensão da hibridização e examinar se as transições da paisagem

por trás dos padrões atuais de biodiversidade espacial em regiões que concentram grandes entre os biomas da América do Sul impõem limites ao fluxo gênico e às variedades de

proporções de biodiversidade. Este é o caso dos Neotrópicos, onde a inferência espécies. Para isso, focamos em R. marina, R. poeppigii, R. horribilis, R. jimi e R.

demográfica apoiou que as flutuações climáticas do final do quaternário e as mudanças schneideri (também conhecido como R. diptycha), que estabeleceram zonas de contato

geomorfológicas do Neógeno desempenharam um papel importante na definição dos em todo o continente. Inferimos estrutura populacional, fluxo gênico e relacionamentos

limites de distribuição das espécies, níveis de diversidade genética e divergência de com base em amostragem geograficamente abrangente da variação genômica dentro de

linhagem (Gehara et al., 2017; Pirani et al., 2020; Prates, Xue, et al., 2016). No entanto, cada táxon. Em seguida, passamos a testar hipóteses históricas alternativas para

investigações biogeográficas na região Neotropical têm frequentemente mostrado viés quantificar eventos demográficos plausíveis, como mudanças no tamanho da população e

geográfico e taxonômico, o que questiona a generalidade dos mecanismos invocados para fluxo gênico histórico.

explicar a riqueza e distribuição de espécies. Por exemplo, táxons com ampla distribuição

nos biomas de vegetação aberta da América do Sul – Cerrado, Caatinga e Chaco, secos Com esta abordagem, procuramos responder às seguintes questões: quais são os níveis

e altamente marinhos – receberam relativamente menos de estrutura genética entre e dentro de cada espécie? Os dados genômicos corroboram

um padrão de ampla mistura ou introgressão entre essas espécies, como sugerido

anteriormente com base em apenas alguns loci? Por último, que processos demográficos

históricos podem explicar a distribuição de espécies e os padrões de diversidade genética

dentro deste clado?

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RIVERA et al. ÿÿ

|3

2 | MATERIAIS E MÉTODOS polimorfismos (SNPs). Como referência, usamos o genoma de Rhinella marina

(Edwards et al., 2018). Uma pontuação mínima de qualidade Phred (= 33), cobertura

2.1 | Coleta de amostras de sequência (= 6×), comprimento de leitura (= 35 pb) e proporção máxima de sítios

heterozigotos por locus (= 0,5) foram impostos, garantindo que os sítios variáveis não

Nossa amostragem incluiu 191 indivíduos pertencentes ao grupo de espécies Rhinella tivessem mais de dois alelos (ou seja, um genoma diplóide). Após a montagem inicial,

marina , sendo: 72 R. marina, 39 R. schneideri, 23 R. horribilis, 11 R. jimi e nove R. cf. usamos o Matrix Condenser (de Medeiros & Farrell, 2018) para avaliar o nível

poeppigii, bem como quatro R. veredas, oito R. rubescens e 25 R. icterica que foram

utilizados apenas na análise mitocondrial. Também incluímos amostras dos clados els de dados ausentes em todas as amostras e, em seguida, reagrupamos nosso

Rhinella granulosa e R. margaritifera major dentro de Rhinella como grupos externos conjunto de dados para garantir uma cobertura de amostra mínima de menos de 35%

nas análises de estimativa de tempo de divergência (veja abaixo). de loci ausentes em cada amostra e pelo menos 75% de amostras em cada locus.

Essa estratégia resultou em um conjunto de dados final composto por 49.376 SNPs

Dentro de cada espécie do grupo focal composto por R. marina, R. horribilis, R. em 3.318 loci RAD com menos de 12% de dados perdidos. Além disso, as estimativas

schneideri, R. jimi e R. poeppigii, amostramos vários indivíduos de cada localidade em de FST médias de Weir e Cockerham para o conjunto de dados ddRADseq usando
suas áreas de distribuição conhecidas, com exceção de R. cf . poeppigii, que foi VCFTools (Danecek et al., 2011) e GST de Nei para o conjunto de dados mitocondrial
identificada como distinta de R. marina a posteriori com base nos dados genéticos (ver foram calculadas usando o pacote R mmod (Winter, 2012).

Resultados)

(Acevedo et al., 2016; Maciel et al., 2010; Vallinoto et al., 2010).

Amostras de tecido foram obtidas da coleção de tecidos herpetológicos do MTR 2.3 | Inferir estrutura populacional e mistura
hospedada no Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IBUSP) com genética
vouchers no Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo, bem como do Centro

de Pesquisa em Diversidade de Anfíbios e Répteis (ARDRC), e o Museu de Ciências Com base nos dados do ddRAD, usamos uma abordagem de agrupamento genético

Naturais da Louisiana State University (LSUMNS) (Tabela S1). para estimar o número de demes e se a mistura estava presente entre
eles. Montamos um conjunto de dados SNP conforme descrito acima, mas excluímos

grupos externos e usando apenas um SNP por locus RAD para maximizar a

amostragem de SNPs independentes. Essa abordagem resultou em um conjunto de

2.2 | Extração, amplificação e sequenciamento de DNA dados composto por 3314 SNPs. O agrupamento genético foi realizado usando o

método de máxima verossimilhança ADMIXTURE, testando até 15 populações com

Extraímos o DNA genômico usando um protocolo padrão de extração de fenol- 20 repetições por K e uma validação cruzada de 10 vezes (Alexander et al., 2009;

clorofórmio (Sambrook & Russell, 2006). Fragmentos do 16S mitocondrial foram Portik, 2016). O melhor K foi determinado

amplificados usando primers 16Sar e 16Sbr e sequenciados em um ABI 3730xL avaliando a réplica com o menor erro de validação cruzada. Para caracterizar ainda

(informações do primer e condições de PCR no Text S1). As sequências foram mais a estrutura populacional, utilizou-se o método não paramétrico de análise

editadas e alinhadas no Geneious Prime 2020.0.4 (identificação e números de acesso discriminante de componentes principais (DAPC), implementado no pacote R adegenet

em (Jombart & Ahmed, 2011; Jombart et al., 2010). A função find.clusters foi usada para

Tabela S1). Geramos dados de sequenciamento de DNA associado ao sítio de

restrição de dupla digestão (ddRADseq) a seguir (Peterson et al., 2012), com teste o ajuste de 1–15 clusters (K). O K com a pontuação mais baixa do critério de

modificações conforme descrito em Streicher et al. (2014). Resumidamente, 200-500 formação Bayesiano (BIC) foi considerado o número de melhor ajuste

ng de DNA foram digeridos usando as enzimas de restrição SbfI (local de restrição 5'- de demos. As matrizes de coeficiente de ancestralidade resultantes (Q-matrices) foram

CCTGCAGG-3') e MspI (local de restrição 5'-CCGG-3') em uma única reação usando então importadas para o QGIS (QGIS Development Team, 2020, QGIS Geographic

o tampão recomendado pelo fabricante (Novo England Biolabs) por 5 h a 37°C. O Information System. Open Source Geospatial Foundation Project. http://qgis.osgeo.org)

DNA digerido foi purificado antes de ligar os códigos de barras e os adaptadores de para fazer a torta média por localidade -gráficos indicando os níveis de mistura em

índice, então as amostras com o mesmo índice foram agrupadas e selecionadas por cada localidade amostrada para cada espécie.

tamanho (415-

515 bp) em um seletor de tamanho Blue Pippin Prep (Sage Science). A preparação

final da Biblioteca foi analisada e quantificada em um BioAnalyser (Agilent) e Qubit

Fluorometer 4 (Thermo Fisher Scientific). As bibliotecas de extremidade única de 100 2.4 | Análises filogenéticas
pb resultantes foram sequenciadas no MedGenome em um Illumina HiSeq2500.

Reconstruímos as filogenias de máxima verossimilhança para os conjuntos de dados

Usamos a versão de linha de comando do ipyrad v. 0.9.45 (Eaton & Overcast, de loci mi tocondrial e ddRADseq não vinculados usando o IQTREE v2.1.2, utilizando

2020) (disponível em https://ipyrad.readthedocs.io) para demultiplexar e atribuir leituras a ferramenta de seleção de modelo incorporada ModelFinder Plus, implementando

a indivíduos com base em códigos de barras de sequência (não permitindo 1000 bootstraps ultrarrápidos (Hoang et al., 2018; Kalyaanamoorthy et al. , 2017;

incompatibilidades de códigos de barras), por montagem de leitura de referência de Nguyen et al., 2015). Especificamos que todas as partições compartilham os mesmos

formulário (limite mínimo de similaridade de agrupamento = 0,90), alinhar leituras em comprimentos de ramificação e selecionamos o esquema de particionamento mais

loci e chamar nucleotídeo único adequado ao mesclar partições (que implementa

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RIVERA et al.
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o algoritmo guloso do PartitionFinder), testando o conjunto de modelos de substituição testou uma variedade de tamanhos de grade de extrapolação (40-100 em incrementos

de MrBayes e considerando os 10% dos melhores esquemas de partição usando o de 10 unidades, por exemplo, 50, 60, 70 a 100, 110, 120) no modelo de divergência sem

algoritmo de clustering relaxado rápido do PartitionFinder2 para economizar tempo migração para determinar o tamanho de grade apropriado selecionando o modelo com

computacional (Chernomor et al., 2016; Lanfear et al., 2012, 2014, 2017). Além disso, maior verossimilhança de log, implementando quatro rodadas de otimização totalizando

realizamos inferência filogenética sob uma estrutura Bayesiana para ambos os conjuntos 100 réplicas. Uma vez que um tamanho de grade ideal foi determinado, cada modelo

de dados usando MrBayes 3.2.6 (Ronquist et al., 2012), implementando três corridas testado foi executado 3 vezes de forma independente.

independentes de quatro cadeias de Markov de 10 milhões de gerações cada e Para o subconjunto composto por R. marina, R. horribilis e R. jimi, usamos um 3D-

amostrando a cada 1.000 gerações com a primeira 25% das gerações descartadas como JSFS para testar modelos incorporando fluxo gênico em diferentes momentos, incluindo

burnin. aqueles que representam migração antiga, contato secundário recente e divergência

Usamos o Tracer 1.7 (Rambaut et al., 2018) para avaliar se Markov simultânea passada de todas as linhagens (Figura S5). Além de um modelo de (1)

a mistura de cadeias foi adequada (tamanhos de amostra efetivos >200) e para avaliar divergência sem migração, testamos os seguintes modelos: (2) divergência com fluxo

visualmente a estacionaridade dos parâmetros do modelo e a convergência entre as gênico simétrico contínuo entre todas as populações, (3) divergência com fluxo gênico

corridas. Em seguida, resumimos uma árvore de consenso de 50% da regra da maioria. simétrico contínuo entre populações geograficamente adjacentes, (4) ) isolamento seguido

Para estimar as datas de divergência e informar a delimitação dos limites das de contato secundário, (5) divergência simultânea no isolamento seguido de contato

espécies, realizamos análises de datação de divergência Bayesiana com base no secundário mais recente entre populações adjacentes, (6) divergência simultânea com

conjunto de dados de mtDNA no BEAST2 usando um modelo HKY de substituição de migração simétrica contínua entre populações adjacentes, (7) migração antiga com

nucleotídeos, um relógio molecular relaxado log-normal e um tamanho populacional isolamento muito recente, ( 8) migração antiga com um período mais longo de isolamento

constante coalescente anterior. Seguimos Pramuk et al. (2008) ao impor uma idade recente, (9) um curto período antigo de migração seguido por um longo período de

mínima para o nó radicular entre os complexos de espécies Rhinella marina e R. granulosa isolamento e 10) migração antiga seguida de isolamento de linhagem e mudança no

com base em um fóssil de Rhinella marina do estágio norte-americano do Clarendonian tamanho da população em duas épocas (Barratt et al. , 2018; Portik et al., 2017).

do Mioceno médio (c. 11 Ma), descrito por Sanchiz ( 1998), e empregou uma distribuição

log-normal a priori com um desvio padrão de 0,5. Fizemos essa análise por 20 milhões

de gerações, amostrando a cada 1.000 gerações. As corridas foram avaliadas usando o

TRACER v1.7 (Rambaut et al., 2018) para examinar a convergência. Em seguida, Para o subconjunto composto por R. schneideri e R. cf. poeppigii, testamos modelos

resumimos uma árvore de credibilidade máxima de clado usando TreeAnnotator 2D-JSFS incorporando diferentes níveis de migração em diferentes períodos de tempo

descartando os primeiros 25% de árvores como burnin (Bouckaert et al., 2019; Stamatakis, (Figura S6). Além de um modelo de (1) divergência sem migração, testamos os seguintes

2014). Todos os métodos filogenéticos baseados em árvores foram analisados no Cipres modelos: (2) divergência com migração simétrica contínua, (3) divergência com migração

(Miller et al., 2010). assimétrica contínua, (4) divergência com migração simétrica contínua e taxa de migração

ao longo de duas épocas, (5) divergência com migração assimétrica contínua e uma taxa

variável de migração ao longo de duas épocas, (6) divergência isolada, seguida de

contato secundário simétrico, (7) divergência isolada, seguido de secundário assimétrico

2.5 | Modelagem demográfica com ÿaÿi contato, (8) migração simétrica antiga seguida de isolamento subsequente, (9) migração

assimétrica antiga seguida de isolamento subsequente, (10) divergência no isolamento

Usamos o método de aproximação de difusão ÿaÿi (Gutenkunst et al., 2009) para testar seguido de contato secundário simétrico com isolamento subsequente e (11) divergência

hipóteses alternativas de história populacional dentro do clado Rhinella marina com base no isolamento seguido de contato secundário assimétrico com isolamento subsequente

em faixas de espécies, eventos de hibridização potenciais relatados anteriormente, (Charles et al., 2018; Portik et al., 2017).

padrões biogeográficos comuns exibidos por anfíbios em todo este região, bem como

limitações computacionais. Usando espectros de frequência de sítio de junção

bidimensional e tridimensional (2D- e 3D-JSFS), dividimos o conjunto de dados em dois

subconjuntos populacionais: um composto por R. marina, R. horribilis e R. jimi; e outro

composto por R. schneideri e R. cf. poeppigii. Os modelos de melhor ajuste foram escolhidos com base nos valores de probabilidade

logarítmica, que assumimos ser a verossimilhança verdadeira (e não a verossimilhança

Conjuntos de dados JSFS dobrados foram usados em todas as análises de ÿaÿi. composta), uma vez que mantivemos apenas um SNP por locus RAD.
Filtramos os dados do ddRAD para cada subconjunto para não permitir mais As réplicas com as pontuações de probabilidade mais altas consistentemente foram

mais de 35% de dados ausentes de qualquer amostra, removeu singletons e selecionou usadas para calcular e comparar modelos usando o critério de informação de Akaike

um SNP por locus usando VCFtools (Danecek et al., 2011; Gutenkunst et al., 2009; Portik (AIC).

et al., 2017). Usamos então o

stacks_pipeline Script Python de Portik et al. (2017) para criar o arquivo de entrada SNP

para ÿaÿi. Usamos o script python easySFS (https:// 2.6 | Inferindo o fluxo gênico
github.com/isaacovercast/easySFS) para determinar o tamanho da projeção de cada

população, que foi determinado pelo balanceamento de um tamanho de amostra reduzido Para explorar ainda mais a potencial hibridização entre táxons, inferimos

que maximizou o número de locais de segregação (Gutenkunst et al., 2009; Marth et al., A estatística D de Patterson, ou a estatística ABBA-BABA, e o anúncio relacionado

2004). Em ÿaÿi, temos então estimativas de fração de mistura, ou estatísticas f 4-ratio, com base no ddRAD
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RIVERA et al. ÿÿ

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dados usando Dsuite (Malinsky et al., 2021; Patterson et al., 2012). Os testes
foram projetados com uma filogenia fixa de 4 táxons (((P1,P2)P3)O), em que
um padrão de alelo ancestral (“A”) e derivado (“B”) típico deve seguir BBAA.
Sob classificação de linhagem incompleta, padrões ABBA e BABA conflitantes
devem ocorrer em frequências iguais, resultando em uma estatística D = 0.
Se, no entanto, ocorreu introgressão entre P3 e P1 ou P2, deve haver um
excesso desses padrões e uma estatística D significativamente diferente de 0,
com significância detectada usando uma abordagem de jackknifing de bloco
(Durand et al., 2011; Green et al. al., 2010; Malinsky et al., 2021; Patterson et

al., 2012). Usamos a métrica f-branch ou f b(C) para separar estatísticas f 4-ratio
potencialmente correlacionadas e estimar eventos de fluxo gênico entre ramos
internos na filogenia (Malinsky et al., 2018; Martin et al., 2013). O Dsuite usa um
arquivo VCF e uma abordagem jack knifing para avaliar as correlações nas
frequências alélicas entre espécies intimamente relacionadas (Malinsky et al.,
2021). Dentro do Dsuite, usamos os programas Dtrios e Fbranch para identificar
a introgressão entre todas as combinações de espécies, bem como a direção
potencial do fluxo gênico, especificando Rhinella veredas como um grupo
externo e aplicando a correção de Benjamini Hochberg (BH) para controlar a
taxa de falsa descoberta .

3 | RESULTADOS

3.1 | Relações filogenéticas

A filogenia 16S (160 indivíduos; 481 pares de bases) sugeriu pouca estrutura
filogenética dentro do complexo Rhinella marina . Um clado incluiu a maioria FIGURA 1 (a) Filogenia de máxima probabilidade de Rhinella marina

das amostras de R. horribilis , enquanto indivíduos dos táxons restantes
formaram uma politomia (Figura S1). Máxima verossimilhança e filogenias
Bayesianas baseadas no conjunto de dados ddRADseq (128 em indivíduos)
resultaram em filogenias totalmente concordantes (Figura 1). Essas análises
inferiram seis clados altamente suportados, dois correspondentes a R. marina e
os outros quatro correspondentes a Rhinella schneideri, R. horribilis, R. jimi, e
um clado provisoriamente atribuído a R. cf. poep pigii (BS = 100; PP = 1,0;
Figuras 1–3). Esses supostos R. poeppigii
as amostras foram originalmente identificadas como R. marina, o que tornaria
R. marina parafilética; no entanto, após reexaminar morfologicamente esses
espécimes, fomos capazes de identificar positivamente amostras do oeste da
Amazônia no estado do Acre como R. poeppigii, enquanto amostras intimamente
relacionadas de localidades do leste do estado do Pará foram morfologicamente
mais semelhantes a R. marina (Figura S7).
espécies focais complexas usando dados ddRADseq e gráfico ADMIXTURE
correspondente (K = 7). Círculos pretos na filogenia denotam suporte de
bootstrap ML (BS) >95 e probabilidade posterior Bayesiana (PP) >0,95. (b)
Gráfico DAPC (K = 7)
o norte dos Andes, que se agrupou com outras amostras de R. marina (Figura
4). Um clado altamente suportado consistia em dois clados com uma data de
divergência de 0,67 Ma (95% HPD: 0,18–1,48 Ma): um clado consistia em
Rhinella cf. poeppigii do leste da Amazônia, e outro consistiu na amostra de R.
poeppigii da Amazônia ocidental , bem como R. marina do sul da Amazônia
(Figura 4). Além disso, R. granulosa
estima-se que seja irmão do complexo R. marina , com R. margaritifera
parentes mais distantes. Devido à falta de variação dentro da R. marina
grupo, interpretamos as datas dentro deste complexo com cautela.

As estimativas de GST de Pairwise Nei para os dados de 16S foram muito

menores do que as estimativas de FST ponderadas de Weir e Cockerham para
os dados de ddRADseq. Em todos os táxons, o GST médio de pares para os
dados mitocondriais foi de 0,117 (0,025-0,228), enquanto o FST médio de pares
para os dados nucleares foi de 0,506 (0,379-0,843) (Tabela S2).
A filogenia calibrada no tempo com base nos dados mitocondriais 16S
datou a raiz de Rhinella marina em 5,58 Ma (95% HPD: 2,75–
9,40 milhões de anos atrás (Ma); Figura 4). Embora muitas relações tenham
suporte ruim devido à falta de variabilidade dentro do locus, alguns clados
mostraram alto suporte, incluindo um clado com a maioria das amostras de R.
horribi lis , que foi datado em 1,03 Ma (95% HPD: 0,35–2,04 Ma) .
Duas amostras não incluídas neste clado foram amostras distribuídas em
3.2 | Estrutura da população
Apesar das altas probabilidades posteriores de cada clado em nossa árvore
ddRAD, os resultados de ADMIXTURE apoiaram a mistura genética dentro e
entre vários táxons dentro do complexo Rhinella marina (Figura 1), com um K
de melhor ajuste de 7. Cada clado ddRAD correspondeu a um cluster, exceto
para o clado Rhinella schneideri que consistia em duas unidades monofiléticas
não recíprocas. Rhinella horribilis (azul, Figuras 1 e 2) mostrou mistura do
aglomerado norte de R. marina
em uma localidade do norte dos Andes. Um cluster de Rhinella marina foi
relegado ao norte da Amazônia (verde claro, Figuras 1 e 2), enquanto
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RIVERA et al.
6 |ÿÿ

FIGURA 2 Mapa de localidade para o subconjunto

que descreve as atribuições médias de agrupamentos
ADMIXTURE por localidade (K = 7) para Rhinella
horribilis, R. marina e R. jimi.
As cores correspondem à Figura 1. Mapa
dividido em biomas (América Central, Andes Norte,
Amazônia Norte, Amazônia Ocidental, Amazônia
Oriental, Amazônia Meridional, Pantanal, Chaco,
Cerrado, Caatinga, Mata Atlântica Norte)

FIGURA 3 Mapa de localidade para o subconjunto

que descreve as atribuições médias de agrupamentos
ADMIXTURE por localidade (K = 7) para Rhinella
poeppigii e R. schneideri. As cores correspondem à
Figura 1. Mapa dividido em biomas (Norte dos Andes,
Norte da Amazônia, Oeste da Amazônia, Leste da
Amazônia, Sul da Amazônia, Pantanal, Chaco,
Cerrado, Caatinga, Mata Atlântica Norte, Mata
Atlântica Sul).

Gama de R. poeppigii adaptada de De la Riva (2002);

Venâncio et al. (2017); Venegas e Ron (2014)

o outro aglomerado mostrou um cline de mistura em seu oeste e espécies geograficamente adjacentes após a divergência entre R. marina e R. jimi,

clados do sul da Amazônia (verde claro a roxo, Figuras 1 e 2) e mistura de R. jimi e e posterior isolamento da linhagem. As estimativas dos parâmetros indicaram um

R. cf. poeppigii (verde escuro e laranja, Figura 1). Os dois agrupamentos genéticos período antigo de migração muito mais longo entre todas as linhagens com menores

dentro de R. schneideri (rosa e amarelo, Figuras 1 e 3) seguiram um gradiente de taxas de migração (T1 = 10,82; mA = 0,05) em comparação com o menor tempo de

mistura leste-oeste através do Cerrado até o norte da Mata Atlântica, bem como migração de espécies adjacentes com maiores taxas de migração (T2 = 0,12; m1 =

1,36 ; m2 = 0,85) e o menor período de isolamento (T3 = 0,10) (Tabela 1, Tabela S3).

ecótonos. Rhinella jimi ocorre principalmente nas terras arbustivas da Caatinga semi-

árida do nordeste do Brasil, mas também na floresta tropical litorânea adjacente Para o subconjunto composto por R. schneideri e R. cf. poeppigii, o melhor

(verde escuro, Figuras 1 e 2). A análise DAPC também apoiou esse esquema de modelo 2D-JFSF incorporou divergência isoladamente seguida de contato secundário

agrupamento; no entanto, as pontuações do BIC sugeriram suporte semelhante para com fluxo gênico assimétrico, com log-likelihood de –539,27 e AIC de 1090,54 (Figura

seis a oito clusters (Figura S4). Os sete clusters recuperados foram concordantes com 5, Tabela 1, Tabela S3). As estimativas dos parâmetros inferiram um período de

a estrutura filogenética (Figura 1). divergência isoladamente (T1 = 0,07) com um menor período de contato secundário

(T2 = 0,01) e uma taxa de migração muito maior de R. cf. poeppigii

3.3 | Inferência demográfica em R. schneideri (m12 = 15,5) do que de R. schneideri em R. cf. poep pigii (m21 =

1,82) (Tabela 1, Tabela S3).

Para o subconjunto composto por R. marina, R. horribilis e R. jimi, o melhor modelo

3D-JFSF foi aquele que incorporou migração antiga com um curto período de

isolamento recente desde a divergência, com probabilidade log de –1572,69 e AIC de 3.4 | Estatísticas D
3165,38 (Figura 5, Tabela 1, Tabela S3). Este modelo incluiu um antigo período de

migração entre todas as linhagens (mA, Figura 5), depois outro período de migração Quase todos os trios topológicos testados (((P1,P2)P3)O) tiveram

entre Estatísticas D (Tabela S4), indicando que a maioria do fluxo gênico

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RIVERA et al. ÿÿ

|7

*
FIGURA 4 Filogenia calibrada no tempo com base em dados 16S mitocondriais. Os círculos pretos indicam PP >0,95, indica a calibração fóssil,
e as barras representam o HPD 95%, que também está entre parênteses. As cores correspondem à filogenia na Figura 1

dentro deste grupo não é devido à classificação de linhagem incompleta. O
trio R. jimi-marina-horribilis não foi significativo (p > 0,05), indicando que
não poderíamos rejeitar a hipótese nula de ausência de fluxo gênico, com
padrões ABBA-BABA surgindo apenas devido à ordenação incompleta da
linhagem (Malinsky et al. ., 2021). As estatísticas D para todos os trios
significativos variaram de 0,12 a 0,49 (Tabela S4). As maiores estatísticas
D foram para R. horribilis-jimi-schneideri (0,49), R. marina-jimi-schneideri
(0,37) e R. schneideri-poeppigii-marina (0,30). A estatística fb(C) é um
resumo das razões de mistura de f4 e mostra o excesso de compartilhamento
de alelos entre o ramo no eixo y e a amostra no eixo x (Malinsky et al.,
2018). As estatísticas fb(C) indicaram as maiores porcentagens de genes
fluxo entre R. cf. poeppigii e R. marina (11%), entre R. cf. po eppigii e R.
horribilis (8%), e entre R. jimi e R. schneideri (7%)
(Figura 6, Tabela S5).
4 | DISCUSSÃO
Com base em amostragem geográfica e genômica abrangente dentro de
um clado de sapos sul-americanos, esta investigação encontrou evidências
de várias linhagens evolutivas distintas que abrangem grandes áreas
geográficas e, às vezes, biomas distintos. Os principais clados inferidos e
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RIVERA et al.
8 |ÿÿ

FIGURA 5 Modelos demográficos ideais e gráficos residuais para a (a) análise 3D-JSFS de Rhinella horribilis, R. marina e R. jimi, e (b)
Análise 2D-JSFS de R. poeppigii e R. schneideri

os agrupamentos genéticos correspondem em grande parte aos táxons espécies, corroborando afirmações anteriores de que a história evolutiva
atualmente reconhecidos dentro de Rhinella; no entanto, também de Rhinella foi caracterizada por vários níveis de hibridização (Pereyra et
encontramos evidências de diversidade potencialmente críptica em R. al., 2016; Sequeira et al., 2011).
marina, R. schneideri e potencialmente R. poeppigii. Análises de
agrupamento genético sugeriram que muitos dos grupos inferidos incluem
indivíduos misturados. Assim, análises demográficas apoiaram que a 4.1 | Padrões filogenéticos e limites de espécies
história evolutiva desses sapos envolveu fluxo gênico entre táxons tanto
no antigo (no caso de R. marina, R. horribilis e R. jimi) quanto recente (no Os achados filogenéticos deste estudo melhoram nosso conhecimento
caso de R. sch neideri e R. cf. poeppigii) vezes. Ambos os testes de sobre a diversidade e distribuição de espécies na América do Sul. Nossa
amostragem
inferência demográfica e ABBA-BABA inferiram padrões de introgressão genética em valida relatos anteriores de Rhinella poeppigii presente no oeste
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RIVERA et al. ÿÿ

|9

T3 0,10

T2 0,01 T2 0,12

T1 0,07 T1 10,82

m2 0,85

m1 1,36

m21 1,82 mA 0,05

FIGURA 6 A estatística fb (resumo de f proporções de mistura).

4
A cor cinza corresponde a testes que não são possíveis devido a restrições
na filogenia. *Indica um resultado significativo
m12 15,5 nuA 6.15

Amazônia (Venâncio et al., 2017). Rhinella poeppigii tem um histórico de incerteza

taxonômica e identificação errônea, devido à sua semelhança com R. marina (De
nu3 1,31

la Riva, 2002; Venâncio et al., 2017; Venegas & Ron, 2014). Depois que os
primeiros indivíduos foram identificados e coletados
no Equador, espécimes subsequentes coletados na região que foram
nu2 nu2
anteriormente identificados erroneamente foram descobertos no Museo de
0,05 0,15

Zoología, Pontificia Universidad Católica del Ecuador (QCAZ) (Venegas & Ron,
2014). Neste estudo incluímos outro indivíduo de Porto Walter, Acre, Brasil, o
nu1 0,01 nu1 0,57 que corrobora ainda mais a extensão de R. poeppigii no Brasil. Além disso,
descobrimos um grupo de R. cf. poeppigii
espécimes no leste da Amazônia perto da hidrelétrica de Belo Monte no rio Xingu

ÿ ÿ (Figura 3). Essas amostras, no entanto, não apresentam morfologia distinta de

R. poeppigii , e de fato são mais semelhantes morfologicamente a R. marina, à
qual foram originalmente atribuídas (Figura S7). Infelizmente, como a amostragem
deste clado foi inicialmente não intencional, amostramos apenas alguns indivíduos
1424,5 AIC
1090,54 3165,38
95,33 AIC

que poderiam ser chamados com segurança de R. poeppigii que não ocorreram
em toda a faixa de R. poep pigii, o que pode estar deturpando a mistura genética
visualizada dentro deste clado (Figuras 1 e 3). Dada essa amostragem restrita e
a distância de mais de 2.000 km nos indivíduos amostrados, pode ser que R. cf.
LL ÿ539,27 ÿ1572,69 LL

oriental. poeppigii é na verdade uma espécie enigmática ainda não descrita

dentro do complexo Rhinella marina .

O marcador mitocondrial 16S rRNA tem sido amplamente utilizado para

identificação e código de barras de anfíbios (Maya-Soriano et al., 2012; Rockney
et al., 2015; Vences et al., 2005). Apesar desse marcador ser extremamente útil
na identificação taxonômica de várias espécies intimamente relacionadas
(Firneno & Townsend, 2019), mesmo dentro do gênero Rhinella (Pereyra et al.,

demográficos
parâmetros
estimados
Modelos
ideais
e
2016), há uma inerente falta de diversidade recuperada em todas as focais.
espécies do complexo R. marina (Figuras S1 e S2). É possível que a seleção
assimétrico
secundário
contato isolamento
purificadora tenha atuado nesta região do genoma mitocondrial, reduzindo
Divergência
isolamento
com
em
grandemente a diversidade genética em todo o complexo (Charlesworth et al.,
Modelo 2D 3D Migração
menor
antiga
com
TABELA
1
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10 |ÿÿ
1995; Cvijovic et al., 2018). Considerando que processos como a seleção
de purificação também podem reduzir a diversidade genética em locais
neutros vinculados, estimativas anteriores de introgressão potencial dentro
de espécies de Rhinella usando dados mitocondriais podem ser afetadas
de maneira semelhante (Cvijoviÿ et al., 2018). Esse fenômeno pode ter
resultado em uma superestimação de loci compartilhados por qualquer
outro meio, como hibridização, em oposição a uma restrição em loci
específicos. Com o fragmento 16S sequenciado sendo relativamente curto
(~480 pb), uma análise de todo o gene 16S rRNA ou mesmo todo o genoma
mitocondrial neste grupo pode ser útil para desvendar as razões para a
baixa diversidade genética vista aqui.
Por outro lado, apesar da evidência de mistura dentro e entre espécies,
os dados nucleares estimaram uma filogenia com estrutura e suporte
substanciais (Figura 1). Quando comparado a outras filogenias geradas
com conjuntos de dados simples ou multilocus, o sequenciamento de alto
rendimento do complexo Rhinella marina revelou uma quantidade
surpreendente de complexidade genética, introgressão e resolução
interespecífica (Bessa-Silva et al., 2020; Maciel et al., 2010; Vallinoto
e outros, 2010). Esses padrões sugerem que em grupos com histórias
demográficas tão complexas, e especialmente aqueles com probabilidade
de hibridização entre populações ou espécies divergentes, dados genéticos
em larga escala podem ser muito úteis para desvendar relacionamentos e
histórias. Esses tipos de dados podem ser utilizados em estudos futuros
para identificar regiões potencialmente adaptativas do genoma que se
correlacionam com diferenças fenotípicas ou ecológicas entre populações.
4.2 | Fatores biogeográficos dos limites de alcance das espécies ocidental e seu clado irmão, R. cf. poeppigii, da Amazônia oriental brasileira,
Os limites de distribuição de espécies inferidos podem ser atribuídos tanto
aos gradientes ambientais espaciais atuais quanto à história da mudança
topográfica na América do Sul, como sugerido para vários outros táxons
sul-americanos (Carnaval et al., 2009; Fonseca et al., 2018; Gehara
et al., 2014; Prates, Rivera, et al., 2016). As análises de tempo de
divergência mitocondrial são consistentes com a ideia de que a elevação
andina contribuiu para a divergência entre R. marina e R. horribilis
(Figura 4); divergência genética pronunciada entre populações de cada
lado da cadeia andina suporta o recente reconhecimento de R. horribilis
como um táxon distinto de R. marina (Vallinoto et al.,
2010). Embora os Andes provavelmente limitem o fluxo gênico
contemporâneo entre esses dois táxons, nossa descoberta de mistura entre
eles sugere que o norte dos Andes pode ser uma barreira semipermeável
(Figura 2), de acordo com padrões observados em outros organismos
(Acevedo et al. , 2016; Bessa-Silva et al., 2020; Maciel et al., 2010).
Adicionalmente, assim como outros anfíbios (Noonan & Wray, 2006) e
répteis (Gamble et al., 2008), a extensa rede fluvial formada na Amazônia
ocidental por inundações periódicas do Mioceno, conhecida como formação
Pebas, pode ter contribuído para a divergência não apenas entre R.
horribilis e R. marina, mas também entre o norte
clados leste e sul-sudoeste da Amazônia dentro de R. marina
(Vallinoto et al., 2010; Wesselingh & Salo, 2006). Rhinella marina, que é
composta por dois clados bem sustentados, distribui-se por climas
amazônicos, que são conhecidos por apresentarem características assíncronas. gênico contínuo entre as espécies (Figura 5).
RIVERA et al.
ciclos climáticos históricos leste-oeste e tiveram um efeito sobre a
composição de espécies e diversidade genética dentro do bioma (Cheng et
al., 2013; Prates, Rivera, et al., 2016). Considerando que os distintos clados
têm uma distribuição norte-sul, em oposição a uma distribuição leste-oeste,
no entanto, pode ser mais plausível que barreiras geográficas, como redes
fluviais flutuantes do Mioceno ao Pleistoceno (Cooke et al., 2012; Lundberg
et al., 1998), tiveram um impacto maior na promoção da divergência
entre esses clados dentro de R. marina.
Semelhante ao observado em R. marina, vemos padrões de espécies
distribuídas em gradientes ambientais repetidos ao longo da filogenia; R.
schneideri distribui-se pelo Cerrado, através dos ecótonos Cerrado-Caatinga-
Mata Atlântica, e no norte da Mata Atlântica, com gradiente leste-oeste de
mistura e mistura (Figuras 1 e 3). As Florestas Tropicais Sazonalmente
Secas e savanas da América do Sul são conhecidas por abrigar diversidade
genética complexa e críptica e foram especialmente afetadas por flutuações
climáticas quaternárias (Bandeira et al., 2021; Fonseca et al., 2018; Gehara
et al., 2017). ; Prado et al., 2012; Vasconcellos
et al., 2019; Werneck et al., 2015). Considerando o padrão filogenético que
vemos dentro de R. schneideri, podemos afirmar que esta espécie se
expandiu para leste durante a mudança climática do Plio-Pleistoceno
(Bandeira et al., 2021; Lisiecki & Raymo, 2007). A modelagem paleoclimática
da história biogeográfica e nicho de R. schneideri em uma escala mais fina
é recomendada para validar esta hipótese.
Um padrão biogeográfico intrigante que emergiu de nossos resultados
é a distribuição extremamente disjunta entre R. poeppigii na Amazônia
a mais de 2.000 km de distância. Este padrão misterioso também foi
relatado para outras espécies herpetofaunísticas, incluindo os lagartos
Anolis trachyderma (Ribeiro-Júnior, 2015) e Potamites ecpleopus (Ribeiro-
Júnior & Amaral, 2017) e a perereca Hemiphractus scutatus (de Lima
Moraes & Pavan, 2018). ).
Apesar dessa grande distância geográfica, bem como dos efeitos da
sazonalidade climática contrastante entre as localidades leste e oeste
dessa região sobre outras herpetofaunas (Cheng et al., 2013; Prates,
Rivera, et al., 2016; Wang et al., 2017), este e outros estudos indicam
divergência genética limitada em regiões disjuntas (de Lima Moraes &
Pavan, 2018). Uma análise abrangente de espécimes de museus e tecidos
disponíveis dessas áreas, em conjunto com uma amostragem mais
completa de R. poeppigii em toda a sua distribuição, será necessária para
confirmar esse padrão inesperado de divergência genética dentro desse
grupo.
4.3 | Hibridação e introgressão
As relações interespecíficas inferidas com a modelagem demográfica
histórica sugerem padrões extremamente variados de migração e
hibridização ao longo do tempo dentro do complexo Rhinella marina .
Nosso estudo indica que as espécies desse grupo divergiram em vários
biomas e acumularam diferenças genéticas significativas, apesar do fluxo
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RIVERA et al.
Muitas das espécies dentro do complexo Rhinella marina também têm uma história
introgressiva compartilhada (Figuras 1 e 6; Tabelas S4 e S5). Testes de hipóteses de
modelos demográficos sugerem que o clado R. marina-horribilis-jimi continuou a trocar
genes ao longo de sua dispersão pelo continente, e espécies dentro deste clado
trocaram genes com outras espécies dentro do complexo (Figuras 1, 5 e 6, Tabela
S5). As espécies de Rhinella têm sido observadas há muito tempo como tendo
intervalos sobrepostos com potencial de hibridização, especialmente devido à
propensão desses sapos a participar de “bolas de acasalamento”, em que diferentes
espécies de sapos – e às vezes de diferentes gêneros – aparentemente se acasalam.
Fontenot et al., 2011; Maciel et al., 2010; Pereyra et al., 2016; Sequeira et al., 2011;
Thomé et al., 2012). Há uma relativa falta de dados, no entanto,
arredondando aspectos comportamentais de interações intraespecíficas entre espécies
fora dessas bolas de acasalamento. Apesar da evidência de fluxo gênico entre
espécies, não houve evidência de hibridização em toda a população ou a presença de
espécies híbridas em nossa amostragem.
Eventos potenciais de hibridização propostos foram relatados dentro ou entre grupos
de espécies de Rhinella , como dentro da R. granulosa
complexo (Guerra et al., 2011; Pereyra et al., 2016) e o complexo R. crucifer (Júnior
et al., 2004; Thomé et al., 2012), onde quer instâncias de indivíduos morfologicamente
intermediários ou populações híbridas têm foi relatado. Grande parte da especulação
em torno da hibridização em sapos neotropicais tem sido acompanhada pela falta de
dados de populações naturais para avaliar a realidade biológica de supostas espécies
híbridas (Fontenot et al., 2011; Malone & Fontenot, 2008; Thomé et al., 2012 ). Dentro
do grupo R. marina , no entanto, descobrimos que o fluxo gênico recorrente entre
espécies em níveis baixos é muito mais prevalente do que a persistência de fluxo
gênico repetido em eventos de acasalamento multiespécies massivos.
CONFLITO DE INTERESSES
Os autores não têm nenhum conflito de interesse a declarar.
RECONHECIMENTOS
Agradecemos a todos os catadores brasileiros que tornaram este estudo possível e
particularmente aos alunos do laboratório do MTR pela coleta de campo e apoio. O
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade do Brasil emitiu licenças
de coleta (SISBIO 36753-1, 36753-4 e 27290-3). Este trabalho foi cofinanciado pela
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; BIOTA
2013/50297-0), a National Science Foundation (DEB 1343578) e o National Science
Foundation
Administração Aeronáutica e Espacial por meio do Programa Dimensões da
Biodiversidade. O MTR reconhece financiamento adicional das bolsas FAPESP
2003/10335-8, 2011/50146-6, 2011/50206-9, 2012/15754-8 e 2017/08357-6. DR foi
financiado pela NSF GRFP. IP foi financiado pela concessão NSF DEB 1754398.
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
Danielle Rivera e Matthew K Fujita conceberam e projetaram o estudo. Danielle
Rivera, Matthew K Fujita, Miguel Trefaut Rodrigues e Ivan Prates adquiriram
financiamento. Miguel Trefaut Rodrigues, Ivan Prates e Janalee P. Caldwell forneceram
amostras. Danielle Rivera,
| 11
ÿÿ
Ivan Prates e Thomas J. Firneno escreveram o software usado para análise.
Danielle Rivera e Thomas J. Firneno analisaram os dados. Danielle Rivera, Ivan
Prates e Matthew K Fujita escreveram o manuscrito com a colaboração de todos os
autores.
DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
Sequências 16S e dados genéticos demultiplexados foram
disponibilizados através do NCBI (BioProject PRJNA772164; Tabela
S1) e scripts associados e arquivos de entrada foram disponibilizados
através da dríade: https://doi.org/10.5061/dryad.7pvmcvdtp.
ORCID
Danielle Rivera https://orcid.org/0000-0002-9100-9945
Ivan Prates https://orcid.org/0000-0001-6314-8852
Thomas J. Firneno Jr https://orcid.org/0000-0002-4975-2794
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