Biologia Do To

Biologia do
Desenvolvimento
QUINTA EDIÇÃO
Biologia do
Desenvolvimento
QUINTA EDIÇÃO
Scott F. Gilbert
Swarthmore College
Tradução e Revisão
Adolfo Max Rothschild

Zuleika Rothschild
Francisco A. de Moura Duarte
Maria Helena Corrêa Marques
A capa
FOTOGRAFIA DA CAPA: O mRNA para o Fator 8 de Crescimento
Fibroblástico pode ser detectado pela hibridização in situ da montagem
total usando RNA marcado quimicamente que é complementar a
essa mensagem. No embrião de pinto de 3 dias, a mensagem do Fgf8
é encontrada no ectoderma mais distal dos brotos dos membros, no
limite entre o cérebro posterior e o cérebro intermediário, nos somitos,
nos arcos branquiais do pescoço e na cauda em desenvolvimento. O
FGF8 é importante para diversos processos desenvolvimentais e
desempenha papéis críticos no crescimento dos membros e na
padronização do desenvolvimento do cérebro. Capítulos 3, 7 e 18.
(Fotografia cortesia de E. Laufer, C.-Y. Yeo e C. Tabin.)
FOTOGRAFIA DA CONTRACAPA: Fotografia de um embrião de pinto

de 20-21 dias nos estágios de “pipping” (bicando a casca internamente)
Do original: Developmental biology, e pré-eclosão. Note o revestimento peridérmico proeminente na
Fifth Edition extremidade do bico (dente do ovo), usado pelo pinto para fazer
Copyrigth ® 1997 by Sinauer Associates,
Inc. buracos na casca do ovo, a qual se tornou mais fina e mais quebradiça,
como uma conseqüência da utilização de minerais pelo embrião para
Dados Internacionais de Catalogação na seu crescimento esquelético. Esse estágio desenvolvimental marca a
Publicação (CIP)
(Câmara Brasileira do livro, SP, Brasil) transição do embrião em um pinto que respira ar. Capítulos 1 e 5.
_____________________________________ (Fotografia do International Poultry Journal, cortesia de R. Tuan.)
Gilbert, Scott F., 1949-
Biologia do desenvolvimento /
Scott F. Gilbert. -- As páginas de título
5. ed. -- Ribeirão Preto, SP :
FUNPEC Editora, 2003. PÁGINA ESQUERDA: A expressão gênica gera limites nos discos imagi-
Título original : Developmental biology nais da Drosophila. Os discos grandes e pequenos dentro da larva da
Vários tradutores e revisores. mosca formam as asas e os halteres, respectivamente, no adulto. Nes-
Bibliografia. se estágio, a proteína Apterous (vermelho) é expressa somente nos
ISBN 85-87528-61-0 compartimentos dorsais; a proteína Cubitus interruptus (azul) mar-
ca os compartimentos anteriores (mas não os posteriores) (uma linha
1. Biologia do desenvolvimento I. Título.
formando esse limite pode ser observada). A coloração verde (origi-
03-4459 CDD-571.8 nária da proteína Vestigial) no interior demarca o limite entre o mem-
_____________________________________ bro livre e a articulação ligando-o à parede torácica. Capítulo 19. (Fo-
Índices para catálogo sitemático: tografia cortesia de J. Williams, S. Paddock e S. Carroll.)
1. Bilogia do Desenvolvimento: Ciências
da vida 571.8 PÁGINA DIREITA: Expressão do gene paraxis no embrião de pinto no
estágio de 6 somitos. Hibridização in situ da montagem total usando
Direitos para a língua portuguesa cedidos
pela Sinauer Associates, Inc. para a RNA marcado com “digoxygenin” complementar a uma porção da
Fundação de Pesquisas Científicas de mensagem paraxis do pinto mostra a expressão desse gene durante a
Ribeirão Preto que se reserva a formação do somito. A proteína Paraxis é importante no estabeleci-
propriedade desta tradução.
mento da estrutura desses grupos mesodérmicos. Capítulos 2 e 9.
Proibida a reprodução dos textos (Montagem fotográfica cortesia de R. Tuan.)
originais, mesmo parcial e por
qualquer processo, sem autorização
da editora.
Para Daniel, Sarah, e David
Tabela de Conteúdos
PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Introdução ao desenvolvimento Genes e desenvolvimento:
animal 1 1 Introdução e técnicas 35 2
O objetivo da biologia do desenvolvimento 1 As origens embriológicas da teoria dos genes 35
Os problemas da biologia do desenvolvimento 2 Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a
Os estágios do desenvolvimento animal 3 Hereditariedade? 35
Nossa herança eucariótica 5 O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e
Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares 6 Desenvolvimento 37
Controle da Morfogênese no Desenvolvimento em A cisão entre a embriologia e a genética 38
Acetabulária 6 Primeiras tentativas da genética do desenvolvimento 39
Diferenciação em Ameboflagelados Naegleria 10 Evidência para a equivalência genômica 40
As Origens da Reprodução Sexual 12 Metaplasia 40
Eucariotos coloniais: A evolução da diferenciação 16 Clonagem de Anfibios: A Restrição da Potência
As Volvocaceanas 16 Nuclear 42
Q Informações adicionais & Especulações Clonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células
Sexo e Individualidade em Volvox 18 Somáticas 43
Diferenciação e Morfogênese em Dictyostelium 21 Q Informações adicionais & Especulações
Q Informações adicionais & Especulações Clonando Mamíferos por Prazer e Lucro 45
Evidência e Anticorpos 25 Sobre E.coli e elefantes: O modelo operon 47
Q Informações adicionais & Especulações Síntese diferencial de RNA 49
Como o Grex Sabe Qual Lado Está Para Cima 27 Hibridização de ácido nucléico 54
Padrões desenvolvimentais entre metazoários 28 Clonagem de DNA genômico 55
Os Poríferos 29 Hibridização de DNA: entre e intra espécies 58
Protostomatas e Deuterostomatas 30 Seqüenciamento de DNA 59
Análise de mRNA através de bibliotecas de cDNA 61
Técnicas de localização de RNA 63
Hibridização In Situ 63
Transferências Northern 64
Tabela dos Conteúdos vii
Encontrando mensagens raras pela reação da polimerase Identificando moléculas de adesão celular e seu
em cadeia 66 papel no desenvolvimento 92
Determinando a função do gene: células e organismos Caderinas 92
transgênicos 69 CAMs da superfamília de imunoglobulinas 95
Técnicas de inserção de DNA novo em uma célula 69 Moléculas da junção celular: proteínas da junção em
Camundongos quiméricos 70 fenda 97
Experimentos com genes com endereçamento A base molecular da afinidade célula-substrato 99
(Gene targeting ou Knockout) 70 Afinidade diferencial a substrato 99
Determinando a função de uma mensagem: RNA antisense 73 A matriz extracelular 99
Reinvestigação de velhos problemas com novos métodos 73 Receptores celulares para moléculas da matriz
Uma conclusão e um alerta 75 extracelular 104
Adesão diferencial resultante de sistemas de
Base celular da morfogênese: adesão múltipla 106
Afinidade celular diferencial 79 3 Moléculas de receptores e vias de transdução

de sinais 107
A via JAK-STAT 107
Afinidade celular diferencial 80 A via RTK-Ras 108
O modelo termodinâmico de interações celulares 84 Q Informações adicionais & Especulações
Q Informações adicionais & Especulações Mutações negativas dominantes em receptores 110
Evidência para o modelo termodinâmico 87
A via do inositol fosfato 111
A base molecular das adesões célula-célula 88 Cruzamentos entre vias 112
As classes de moléculas de adesão celular 88 A matriz extracelular e a superfície da célula como
Q Informações adicionais & Especulações fontes de sinais críticos para o
Anticorpos monoclonais e genética reversa 89 desenvolvimento 112
Moléculas de adesão celular 92 Interações recíprocas na superfície celular 113
PARTE II Padrões de Desenvolvimento

Fertilização: Iniciando um Prevenção da Polispermia 140
novo organismo 121 4 Q Informações adicionais & Especulações

A Ativação do Metabolismo dos Gametas
Ativação do metabolismo do óvulo 149
147
Estrutura dos gametas 121 Respostas precoces 149

Espermatozóide 121 Respostas tardias 151
O óvulo 125 Fusão do material genético 152
Reconhecimento do óvulo e do espermatozóide: Ação à Q Informações adicionais & Especulações
distância 128 A Não-Equivalência dos Pronúcleos de
Atração do Espermatozóide 128 Mamíferos 154
Ativação Espermática: A Reação Acrossômica no Rearranjo do citoplasma do óvulo 156
Ouriço-do-Mar 129 Preparação para a Clivagem 158
Q Informações adicionais & Especulações
Ação à Distância: Gametas de Mamíferos 131
Clivagem: Criando
Reconhecimento do óvulo e espermatozóide:
Contato de gametas 132
Reconhecimento Espécie-Específico em Ouriços-
multicelularidade 167 5
do-Mar 132 PADRÕES DE CLIVAGEM EMBRIONÁRIA 168
Ligação de Gametas e Reconhecimento em Clivagem holoblástica radial 169
Mamíferos 135 A holotúria, Synapta 169
Fusão de gametas e a prevenção da polispermia 139 Ouriço-do-Mar 170
Fusão entre as membranas do óvulo e do Anfíbios 173
espermatozóide 139 Clivagem holoblástica espiral 175
viii Tabela dos Conteúdos
Q Informações adicionais & Especulações Mecanismos de gastrulação em aves 238

Adaptação pela modificação da clivagem Gastrulação em mamíferos 242
embrionária 178 Modificações para desenvolvimento dentro de
Clivagem Holoblástica Bilateral 179 outro organismo 242
Clivagem holoblástica rotacional 180 Formação de membranas extra-embrionárias 245
Compactação 181
Início do desenvolvimento vertebrado:
A Superfície da Célula e o Mecanismo de
Compactação 184
Formação da massa celular interna 185
Neurulação e ectoderma 253
FORMAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL 254
7
Fuga da Zona Pelúcida 185 Neurulação: aspectos gerais 254
Q Informações adicionais & Especulações Neurulação primária 255
Gêmeos e células embrionárias precursoras 186 A mecânica da neurulação primária 257
Clivagem Meroblástica 188 A formação da placa neural 257
Clivagem discoidal 189 Formação do assoalho da placa neural 258
Clivagem Superficial 192 A modelagem e dobramento da placa neural 259
Q Informações adicionais & Especulações Fechamento do tubo neural 260
Exceções, Generalizações, e Clivagem Q Informações adicionais & Especulações
Parasítica da Vespa 195 A modelagem dorsoventral do sistema nervoso 264
MECANISMO DE CLIVAGEM 196 Neurulação secundária 264
Regulando o ciclo da clivagem 196 Diferenciação do tubo neural 265
Fator promotor de maturação 197 Formação das regiões do cérebro 265
Q Informações adicionais & Especulações Q Informações adicionais & Especulações
MPF e Seus Reguladores 198 Determinando as regiões do cérebro anterior e
O mecanismo citoesquelético da mitose 201 cérebro médio 268
A formação de novas membranas 203 Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central 270
Organização do cerebelo 272
Gastrulação: Reorganizando as Organização cerebral 274
células embrionárias 209 6 Tipos de neurônios 276

Desenvolvimento do olho em vertebrados 279
Dinâmica do desenvolvimento ótico 279
Gastrulação em ouriço-do-mar 210
Diferenciação da retina neural 280
Ingresso do Mesênquima Primário 210
Primeiro estágio da invaginação do arquêntero 215
Porque os bebês não enxergam bem 282
Segundo e terceiro estágios da invaginação do
Diferenciação do cristalino e da córnea 283
arquêntero 217
A CRISTA NEURAL 284
Gastrulação em peixes 218
A crista neural e seus derivados 284
A transição da blástula intermediária e a aquisição
A crista neural do tronco 285
de motilidade celular 218
Vias de migração das células da crista neural do
Formação das camadas germinais 220
tronco 285
Gastrulação de anfíbios 221
A matriz extracelular e a migração da crista neural
Movimentos celulares durante a gastrulação de
do tronco 287
anfíbios 221
Posicionando o blastóporo 224
Análise das mutações que afetam o desenvolvi-
Movimentos celulares e a construção do arquêntero 226
mento das células da crista neural 290
Migração do mesoderma involutivo 229
A potência do desenvolvimento das células da crista
neural do tronco 291
Reguladores moleculares do desenvolvimento:
Diferenciação final das células da crista neural 292
Fibronectinas e as vias da migração
A crista neural cefálica 293
mesodérmica 230
Vias migratórias das células da crista neural
Epibolia do ectoderma 232
cefálica 293
Gastrulação em aves 233
Potência de desenvolvimento das células da crista
Generalidades sobre gastrulação em aves 233
neural cefálica 295
Tabela dos Conteúdos ix
A crista neural cardíaca 296 Início do desenvolvimento

A EPIDERME E A ORIGEM DAS ESTRUTURAS CUTÂNEAS 297
A origem das células epidérmicas 297 vertebrado: Mesoderma e
Apêndices cutâneos 299
Conclusões 300
endoderma 341 9
Especificidade axônica 307 8 MESODERMA 341
Mesoderma dorsal: A notocorda e a diferenciação dos
somitos 341
A geração da diversidade neuronial 307 Mesoderma Paraxial 341
Especificação do Neurônio Motor de Vertebrado 308 Somitômeros e a Iniciação da Formação do
Especificação dos Neurônios Motores em Somito 343
Drosophila 310 Geração de Tipos de Células Somíticas 344
Formação de padrões no sistema nervoso 312 Miogênese: Diferenciação do Músculo
Seleção de trajetórias: Orientação pela matriz Esquelético 347
extracelular 313 Q Informações adicionais & Especulações
Orientação pelo Terreno Físico: Orientação por Construção Muscular e a Família MyoD de
Contato 313 Reguladores Transcricionais 349
Orientação para Gradientes de Adesão: Osteogênese: O Desenvolvimento
Haptotaxia 314 dos Ossos 351
Condução por Sinais Migratórios específicos Q Informações adicionais & Especulações
do Axônio: A Hipótese das Trajetórias Controle da Condrogênese na Placa de
Marcadas 315 Crescimento 357
Orientação pela Repulsão Específica de Cones de Mesoderma da Placa Lateral 358
Crescimento 317 Formação das Membranas
Q Informações adicionais & Especulações Extra-Embrionárias 359
Sexo,Odor e Adesão Específica 319 O Coração 361
Seleção de trajetória: Orientação por moléculas Formação dos vasos sangüíneos 366
difusíveis 320 Q Informações adicionais & Especulações
Sinais para condução múltipla 323 Redirecionando o Fluxo Sangüíneo no
Neurônios Motores Vertebrados 323 Mamífero Recém-nascido 372
Axônios da Retina 325 O Desenvolvimento de células sangüíneas 373
Seleções de alvos 326 O Conceito de Célula-tronco 373
Especificidades Adesivas em Diferentes Regiões Células-tronco Pluripotenciais e Microambientes
do Tectum 328 Hematopoéticos 374
Seleção de endereço: Desenvolvimento dependente de Desenvolvimento Osteoclástico 377
atividade 331 Locais de Hematopoiese 378
Sobrevivência diferencial após a inervação: Fatores ENDODERMA 380
neurotróficos 331 Faringe 380
Q Informações adicionais & Especulações O tubo digestivo e seus derivados 382
Neurônios Fetais em Hospedeiros Adultos 334 Fígado, Pâncreas e Vesícula Biliar 382
O desenvolvimento de comportamentos: constância e O Tubo Respiratório 383
plasticidade 334
x Tabela dos Conteúdos
PARTE III Mecanismo da Diferenciação Celular

Regulação transcricional da expressão Ruptura e reorganização de nucleossomos: o papel
dos complexos de ruptura 436
gênica: Fatores de transcrição Ruptura e reorganização de nucleossomos: o papel
e a ativação de promotores da competição de histonas 437
específicos 391 10 Regiões de controle de loco: transcrição do gene da

globina 437
Éxons e Íntrons 392 Trocas no gene de globina 440
Estrutura e função do promotor 394 Metilação de DNA e atividade gênica 442
Estrutura do promotor 396 Correlações entre metilação do promotor e
Função do promotor 397 inatividade gênica 442
Q Informações adicionais & Especulações Metilação e a manutenção dos padrões de
RNA polimerase e os fatores trans-reguladores transcrição 443
no promotor 399 Q Informações adicionais & Especulações
Estrutura e função dos intensificadores 402 Metilação e impressão gênica 444
Necessidade de intensificadores 402 Compensação de dosagem do cromossomo X de
Função do intensificador: Modelos temporais e mamíferos 446
espaciais de transcrição 403 Q Informações adicionais & Especulações
Fatores de transcrição: Os trans-reguladores dos O mecanismo de inativação do cromossomo X 449
promotores e dos intensificadores 404 Associação do DNA ativo com a matriz nuclear 451
Proteínas de homeodomínio 405 Ligação da cromatina ativa a uma matriz nuclear 451
Os fatores de transcrição POU 406 Topoisomerases e a transcrição gênica 453
Q Informações adicionais & Especulações Isoladores e domínios 454
Regulação da transcrição dos genes de cadeia Resumo 455
leve das imunoglobulinas 409
Fatores de transcrição básicos do tipo hélice-alça-
hélice 415 Controle do desenvolvimento pelo
Q Informações adicionais & Especulações processamento e tradução
Regulando as proteínas bHLH miogênicas:
Governando a troca entre proliferação e
diferenciação de células musculares 416
diferencial do RNA 461 12
Fatores de transcrição do zíper básico da leucina 416 CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO PELO PROCESSAMENTO
Q Informações adicionais & Especulações DIFERENCIAL DE RNA 461
Armadilhas do intensificador: natural e Controle do desenvolvimento precoce pela seleção de
experimental 418 RNA nuclear 462
Fatores de Transcrição Dedo de Zinco 420 Os mecanismos de emenda de RNA: Spliceosomes 465
Receptores Nucleares de Hormônios e Seus Emenda alternativa do RNA: Criando proteínas
Elementos Responsivos a Hormônios 420 alternativas a partir do mesmo gene 466
Proteínas que dobram o DNA 423 Um gene, Muitas Proteínas Relacionadas 466
Ativação dependente de contexto ou silenciamento 423 Processamento Alternativo de RNA e
Regulação da atividade do fator de transcrição 425 Determinação Sexual em Drosophila 468
Uso Disseminado do Processamento de RNA para
o Controle da Expressão Gênica 471
Regulação transcricional da REGULAÇÃO DA TRADUÇÃO DOS PROCESSOS
expressão gênica: A ativação da DESENVOLVIMENTAIS 471
cromatina 431 11 Mecanismos da tradução eucariótica 472

Controle da síntese protéica pela longevidade diferencial
do mRNA 474
Nucleossomos e a ativação da cromatina reprimida 431 Degradação Seletiva de mRNAs 475
Acessibilidade a fatores trans-reguladores 432 Controle da tradução de mensagens do oócito 476
Sítios hipersensíveis à DNAase I 434
Tabela dos Conteúdos xi
Caracterização de RNAs Mensageiros Q Informações adicionais & Especulações

Armazenados em Oócitos 477 A Ativação do Genoma Embrionário 488
Q Informações adicionais & Especulações Regulação dos genes da tradução em larvas e
Determinando o Destino Celular por Meio do adultos 490
mRNA Localizado do Oócito 480 Determinação de Gametas em C. elegans 490
Mecanismos para a regulação da tradução das RNA Antisenso Natural 491
mensagens dos oócitos 481 “Disjuntores” do Controle da Tradução 492
A Hipótese da Mensagem Materna Mascarada 482 Editoração do RNA 493
A Hipótese da Cauda Poli(A) 483 Controle da tradução e síntese protéica coordenada:
A Hipótese da Eficiência da Tradução 486 Produção de Hemoglobina 494
Outros sistemas de ativação do mRNA: Mensagens Epílogo: Regulação Pós-tradução 497
sem “Cap” e Mensagens Seqüestradas 486
PARTE IV Especificação do Destino Celular e os

Eixos Embrionários
Especificação celular autônoma A genética da
por determinantes especificação axial em
citoplasmáticos 505 13 Drosophila 543 14
Comprometimento celular e diferenciação 505 Resumo do desenvolvimento de Drosophila 543
Pré-formação e epigênese 507 AS ORIGENS DA POLARIDADE ÂNTERO-POSTERIOR 545
Os Teratologistas Franceses 509 Visão Panorâmica 545
Especificações autônomas em embriões de tunicados 510 Os genes de efeito materno 546
O determinante formador de músculos do Evidência Embriológica da Regulação da
crescente amarelo 511 Polaridade pelo Citoplasma do Oócito 546
Especificação citoplasmática das linhagens O Modelo Molecular: Gradientes Protéicos no
endodérmicas e epidérmicas e o eixo ântero- Embrião Precoce 547
posterior 514 Q Informações adicionais & Especulações
Localização citoplasmática em embriões de moluscos 515 Modelos de Gradientes da Informação
O lóbulo polar 517 Posicional 551
Especificação celular no nematódeo Caenorhabditis Evidência que o Gradiente da Proteína Bicoid
elegans 521 Constitui o Centro de Organização Anterior 552
Controle maternal da identidade do blastômero: O O Centro de Organização Posterior: Localizando e
controle genético das células progenitoras Ativando o Produto de nanos 556
faríngeas de C. elegans 524 O Grupo Gene Terminal 557
Regulação em C. elegans 527 Os genes da segmentação 559
Q Informações adicionais & Especulações Uma Visão Panorâmica 559
“Ser ou Não Ser: Esse é o Fenótipo” 529 Os Genes de gap 561
Divisões celulares assimétricas no desenvolvimento Os Genes pair-rule 563
tardio 530 Os Genes de Polaridade Segmentar 565
Localização citoplasmática de determinantes de células Os genes de Seleção homeótica 569
germinativas 531 Padrões de Expressão dos Genes Homeóticos 569
Determinação de células germinativas em Iniciando os Padrões da Expressão dos genes
nematódeos 531 Homeóticos 572
Determinação da célula germinativa em insetos 532 Mantendo os Padrões de Expressão dos genes
Componentes do plasma polar da Drosophila 534 Homeóticos 572
Determinação de células germinativas em Os Elementos Cis-Reguladores e o Complexo
anfíbios 536 Bithorax 574
Resumo 538
xii Tabela dos Conteúdos
Q Informações adicionais & Especulações Indução de especificidade mesodérmica ventral e

Regulação Molecular do Desenvolvimento: As lateral 612
Proteínas do Homeodomínio 576 A criação da atividade do organizador 613
A GERAÇÃO DA POLARIDADE DORSOVENTRAL EM Proteínas secretadas do organizador 613
DROSOPHILA 577 Q Informações adicionais & Especulações
A proteína Dorsal: Morfógeno para a polaridade BMP4 e a lagosta de Geoffroy 616
dorsoventral 577 Fatores de transcrição induzidos no
Translocação da Proteína Dorsal 577 organizador 619
Provendo o sinal assimétrico para a translocação da Q Informações adicionais & Especulações
proteína Dorsal 578 Como o Organizador Neuraliza o
Sinal do Núcleo do Oócito para as Células Ectoderma? 621
Foliculares 578 A especificidade regional de indução 621
Sinalização das Células Foliculares para o A determinação das diferenças regionais 621
Citoplasma do Oócito 580 O modelo do duplo gradiente 623
O Estabelecimento do Gradiente da Proteína Correlatos moleculares da caudalização
Dorsal 581 neural 624
PRIMÓRDIOS DE ÓRGÃOS E EIXOS 585 Q Informações adicionais & Especulações
O modelo de coordenadas cartesianas e a especificação Sinais verticais e horizontais do
dos primórdios dos órgãos 585 organizador 626
Resumo: Alguns princípios do desenvolvimento da Genes homeobox na especificação neural 628
Drosophila 586 Competência e cascatas indutivas 628
Especificação do destino celular Estabelecimento dos eixos

por interações célula-célula corporais em mamíferos
progressivas 591 15 e aves 635 16
Desenvolvimento regulativo 591 Iniciando o eixo ântero-posterior 635
Testando a teoria do plasma germinativo 592 Estabelecendo um Centro de Nieuwkoop 635
August Weismann: A teoria do plasma Expressão Gênica em Tecidos Organizadores 636
germinativo 592 Especificando o eixo ântero-posterior de mamífero: A
Wilhelm Roux: Desenvolvimento em mosaico 593 hipótese do código Hox 637
Hans Driesch: Desenvolvimento Regulativo 594 Homologia dos Complexos de Genes Homeóticos
Sven Hörstadius: Potência e gradientes em oócitos 597 entre Drosophila e Mamíferos 637
Formação de um organismo integrado: Restringindo Expressão de Genes Hox no Sistema Nervoso
a potência das células vizinhas 598 Central e seus Derivados 638
Regulação durante o desenvolvimento de anfíbios 600 Análise Experimental de um Código Hox: Gene
Hans Spemann: Determinação progressiva das Alvo 640
células embrionárias 600 Transformação Parcial de Segmentos por
Hans Spemann e Hilde Mangold: Indução Eliminação de Genes Hox Expressos no
embrionária primária 603 Tronco 642
O centro de Nieuwkoop 606 Análise Experimental do Código Hox: Teratogênese
A formação do centro de Nieuwkoop e a polaridade do Ácido Retinóico 643
mesodérmica 606 Evidência para um Código Hox da Anatomia
A especificação da polaridade dorsoventral na Comparada 645
fertilização 607 Q Informações adicionais & Especulações
A base molecular da indução mesodérmica 609 Animais como Variações sobre o Mesmo Tema
Estabelecendo a regionalização dorsal: o possível Desenvolvimental 646
papel da β-catenina 609 Eixos dorsoventral e esquerdo-direito em mamíferos e
O funcionamento do centro de Nieuwkoop: funções aves 647
para Vg1 e Noggin 610
Tabela dos Conteúdos xiii
PARTE V Interações Celulares Durante a

Formação do Órgão
Interações proximais de tecidos: de crescimento dos fibroblastos como
Indução secundária 655 17 indutores do broto do membro 704

Indução da crista ectodérmica apical 704
Produção do eixo próximo-distal dos membros 706
Interações instrutivas e permissivas 655 A crista ectodérmica apical: O componente
Competência e receptores 656 ectodérmico 706
Fatores parácrinos 657 A zona progressiva: O componente mesodérmico 708
Os Fatores de Crescimento Fibroblástico 658 Genes Hox e a especificação do eixo próximo-
A família hedgehog 659 distal do membro 709
A família Wnt 660 Interações entre a AER e a zona progressiva 711
A superfamília TGF-ß 661 Mutações nas interações entre a zona progressiva
Sinalização Justácrina 662 e a AER 711
Interações epitélio-mesênquima 663 Q Informações adicionais & Especulações
Especificidade Regional da Indução 663 A regeneração dos membros da salamandra e a
Especificidade Genética da Indução 666 retenção do eixo próximo-distal 714
Cascatas de indução embrionária: Indução do cristalino 667 Especificação do eixo ântero-posterior dos membros 716
Os Fenômenos da Indução do Cristalino 667 A zona de atividade polarizante 716
A Base Celular da Indução do Cristalino 668 Sonic hedgehog como definidor da ZPA 717
Formação da Córnea 672 Interações entre a AER e a ZPA para integrar
Formação de órgãos parenquimatosos 672 crescimento e padrão 718
Morfogênese do Rim de Mamífero 673 Especificando a ZPA 721
Os Mecanismos da Organogênese Renal 676 A produção do eixo dorsoventral 721
Q Informações adicionais & Especulações Distinguindo o membro anterior do membro posterior 722
Diferenciação Coordenada e Morfogênese no Q Informações adicionais & Especulações
Dente 682 Lições de limbless 724
Mecanismos de ramificação na formação de órgãos Morte celular e a formação de dígitos 724
parenquimatosos 683 Q Informações adicionais & Especulações
A Matriz Extracelular como um Elemento Crítico Evolução do membro tetrápode 726
na Ramificação 684
Fatores Parácrinos Efetuando Padrões de
Ramificação 686 Interações celulares à distância:
Indução ao nível de uma única célula 687 Hormônios como mediadores do
Q
Indução Vulvar no Nematóide Caenorhabditis
elegans 690
Informações adicionais & Especulações
desenvolvimento 733 19
Interações Célula-Célula e Possibilidade na Metamorfose: o direcionamento hormonal do
Determinação de Tipos Celulares 692 desenvolvimento 733
Metamorfose anfíbia 734
Controle hormonal da metamorfose de anfíbios 735
Desenvolvimento do membro
de tetrápode 701 18 Q
Respostas Moleculares aos Hormônios da Tireóide
Durante a Metamorfose 740
Informações adicionais & Especulações
Padronização no membro 701 Heterocronia 743
Formação do broto do membro 702 Metamorfose em insetos 746
O campo do membro 702 Eversão e Diferenciação dos Discos Imaginais 746
Especificação dos campos do membro: Genes Q Informações adicionais & Especulações
Hox e ácido retinóico 703 A determinação dos discos imaginais da perna
Crescimento do broto de membro precoce: fatores e da asa 750
Remodelação do sistema nervoso 753
xiv Tabela dos Conteúdos
Controle Hormonal da Metamorfose de Insetos 754 Hermafroditismo 795

A biologia Molecular da Atividade da Hermafroditismo no Nematóide C. elegans 795
Hidroxiecdisona 757 Hermafroditismo em Peixes 797
Q Informações adicionais & Especulações Determinação ambiental do sexo 798
Controle ambiental sobre a forma e a função da Determinação Sexual Dependente de Temperatura
larva 761 em Reptéis 798
Interações hormonais múltiplas no desenvolvimento da Determinação Sexual Dependente da Localização
glândula mamária 762 em Bonellia viridis e Crepidula fornicata 799
Estágio embrionário 762 Resumo 800
Adolescência 765
Gravidez e lactação 765 Regulação ambiental do
Determinação do sexo 773 20 desenvolvimento animal 805 21
REGULAÇÃO AMBIENTAL DO DESENVOLVIMENTO NORMAL 806
Determinação cromossômica do sexo em mamíferos 774
Sugestões ambientais usadas pelos organismos para
Determinação Sexual Primária 774
completar seus desenvolvimentos 806
Determinação Secundária do Sexo 774
A colonização larval 806
As Gônadas em Desenvolvimento 775
Refeições de sangue 808
Determinação sexual primária dos mamíferos: Genes
Simbiose no desenvolvimento 808
cromossômicos Y para a determinação dos
Diferenças ambientais previsíveis como sugestões para o
testículos 777
desenvolvimento 810
SRY: O Determinante Sexual do Cromossomo Y 778
Sazonalidade e sexo: Afídios e Volvox 810
Determinação sexual primária em mamíferos: Genes
Diapausa 812
autossômicos na determinação de testículos 780
Plasticidade fenotípica: Polifenismo e regras de
SOX9: Reversão Autossômica na Displasia
reação 813
Campomélica 780
Polifenismo sazonal em borboletas 814
SF1: A Ligação Entre SRY e as Trajetórias
Polifenismo nutricional 816
Desenvolvimentais Masculinas 780
Determinação sexual dependente do ambiente 817
Determinação sexual primária em mamíferos:
Fatores ambientais imprevisíveis controlando o
Desenvolvimento ovariano 781
desenvolvimento animal 818
DAX1: Um Potencial Gene Determinante de Ovário
Defesas induzíveis contra a predação 819
no Cromossomo X 781
Plasticidade fenotípica e mudanças no ambiente 820
Wnt4a: Um Potencial Gene Determinante de
Ovário em um Autossomo 781
Assimilação Genética 821
Determinação sexual secundária em mamíferos 782
A contínua plasticidade do desenvolvimento 822
Regulação Hormonal do Fenótipo Sexual 782
O sistema imune: Desenvolvimento no adulto 822
Testosterona e Diidrotestosterona 783
Aprendizado: Um sistema nervoso adaptável ao
Hormônio Anti-Mülleriano 784
ambiente 823
O Sistema Nervoso Central 785
DISTÚRBIOS AMBIENTAIS DO DESENVOLVIMENTO NORMAL 827
Malformações e distúrbios 827
O Desenvolvimento de Comportamentos
Agentes teratogênicos 828
Sexuais 787
Ácido retinóico como um teratogênico 829
Determinação sexual cromossômica em Drosophila 788
Talidomida como um teratogênico 830
A Via do Desenvolvimento Sexual 788
Álcool como um teratogênico 833
O Gene Sex-lethal como o Pivô para a
Outros agentes teratogênicos 835
Determinação do Sexo 790
Os Genes transformer 793
Estrógenos Ambientais 836
doublesex: O Gene Comutador da Determinação
Interações genética-ambiental 837
Sexual 793
Resumo 837
Genes-alvo para a Cascata de Determinação
Sexual 794
Tabela dos Conteúdos xv
A saga da linhagem Mecanismos desenvolvimentais

germinativa 843 22 da mudança evolucionária 883 23
Migração das células germinativas 843 “Unidade de Tipo” e “Condições de Existência” 883
Migração das Células Germinativas em A Síntese de Charles Darwin 883
Anfíbios 843 E. B.Wilson e F. R. Lillie 885
Migração das Células Germinativas em A evolução do desenvolvimento precoce: E. Pluribis
Mamíferos 844 Unum 885
Q Informações adicionais & Especulações A emergência dos embriões 885
Teratocarcinomas e Células-Tronco Formação de um Novo Filo: Modificando os
Embrionárias 847 Caminhos do Desenvolvimento 887
Migração de Células Germinativas em Aves e Modularidade: O pré-requisito para mudança evolutiva
Répteis 848 através do desenvolvimento 891
Migração de Células Germinativas Primordiais em Modularidade 891
Drosophila 849 Dissociação: Heterocronia e Alometria 891
Meiose 850 Duplicação e Divergência 893
Q Informações adicionais & Especulações Co-opção 894
Grandes Decisões: Mitose ou Meiose? Progressão correlacionada 896
Espermatozóide ou Óvulo? 853 Restrições ao desenvolvimento 898
Espermatogênese 855 Restrições Físicas 898
Espermiogênese 857 Restrições Morfogenéticas 898
Q Informações adicionais & Especulações Restrições Filéticas 899
Expressão Gênica Durante o Desenvolvimento Evolução Conjunta do Ligante e Receptor:
do Espermatozóide 858 Isolamento Reprodutivo 901
Oogênese 860 O mecanismo genético do desenvolvimento da
Meiose oogênica 860 mudança evolucionária: Genes reguladores
Maturação do Oócito em Anfibios 861 homólogos 902
Conclusão da meiose: Progesterona e Pax6 e o desenvolvimento do olho 902
Fecundação 864 BMP4 e a Morfogênese dos Membros 904
Transcrição Gênica em Oócitos 865 Genes Hox e a Evolução dos Vertebrados 905
Oogênese Meroística em Insetos 867 Genes Hox e a Evolução dos Artrópodes 907
Q Informações adicionais & Especulações Caminhos homólogos do desenvolvimento 909
A Origem dos Eixos Embrionários de Criando novos tipos de células: O mistério evolucionário
Drosophila Durante a Oogênese 869 básico 911
Oogênese em Mamíferos 870 Uma nova síntese evolucionária 912
O Reinício da Meiose nos Oócitos de Fontes Para as Citações das Aberturas
Mamíferos 875
dos Capítulos C-1
Índice de Autores IA-1
Índice de Assuntos IA-2
Índice de Abreviaturas IA-3
Prefácio
O s últimos anos do século 20 encontram a biologia do desenvolvi-

mento retornando à posição que ela ocupou no início do século: a
disciplina que unifica os estudos da hereditariedade, evolução e
fisiologia. Em 1896, a primeira edição de B. Wilson do The Cell in Development
and Inheritance anunciou “a verdade maravilhosa que uma única célula pode
conter em seu interior sua extensão microscópica da soma-total da herança
das espécies.” Hoje, a biologia do desenvolvimento está na vanguarda desse
estudo de nossa herança natural. Nos seus aspectos moleculares, ela toca a
química física na sua investigação dos mecanismos bioquímicos pelos quais
proteínas diferentes são produzidas em células diferentes do mesmo geno-
ma. Ela também está na liderança dos estudos evolucionários que procuram
entender como mudanças macroevolucionárias ocorreram. Ela abriu recen-
temente uma área nova da biologia do desenvolvimento ecológico, onde mu-
danças ambientais são vistas criando alterações no desenvolvimento do
organismo. Durante os últimos 3 anos, a biologia do desenvolvimento tam-
bém expandiu para a medicina, fundindo-se com a genética clínica para criar
uma ciência revitalizada da embriologia humana, uma ciência que já se
tornou importante na explanação das malformações congênitas.
A quinta edição do Biologia do Desenvolvimento foi revisada e reescrita
para refletir essas revoluções que estão acontecendo. Aconteceram quatro
mudanças importantes na estrutura do livro desde sua última edição. Pri-
meiro, tornou-se impossível discutir os princípios fundamentais da em-
briologia sem o conhecimento da atividade gênica ou vias da transdução de sinais.
Portanto, essa informação foi trazida dentro da seção introdutória do livro
de modo que interações celulares, tais como fertilização e indução, podem
ser apreciadas tanto no âmbito molecular quanto no morfológico.
Segundo, novo interesse nos efeitos do ambiente no desenvolvimento
normal e anormal conduziu a um novo capítulo. O Capítulo 21, “Regulação
Ambiental do Desenvolvimento Animal,” diz respeito às vias pelas quais o
meio ambiente afeta o fenótipo do organismo. Interesse na proteção ambiental
e em controvérsias envolvendo a possibilidade de poluentes teratogênicos
forçaram uma nova percepção das influências que o meio ambiente repre-
senta no desenvolvimento normal e anormal. Na verdade, os biologistas do
desenvolvimento podem rapidamente encontrar-se à frente dos movimen-
tos da conservação ecológica. As primeiras quatro edições deste livro bus-
caram integrar abordagens molecular, celular e orgânica à biologia do de-
senvolvimento; esta edição adiciona a dimensão ecológica.
Terceiro, esta edição introduz novas ênfases nos papéis dos fatores
parácrinos no desenvolvimento. Não somente os estudos da transdução
de sinais estão colocados na seção introdutória deste livro, como a Parte V
Prefácio xvii
da Quinta Edição inicia com uma visão geral das famílias do fator de cres-
cimento fibroblástico, TGF-β, Wnt e Hedgehog dos fatores de crescimento
e diferenciação.
Quarto, este livro está conectado a um website onde estudantes e pro-
fessores podem encontrar mais material em muitos tópicos selecionados.
Tal material inclui (1) detalhes de experimentos que são extremamente
especializados para serem colocados no texto, (2) informação histórica so-
bre áreas particulares da biologia do desenvolvimento e personalidades
envolvidas, (3) implicações médicas de fenômenos particulares do desen-
volvimento, (4) debates ou comentários em questões relevantes para o cam-
po, e (5) atualizações do material do texto nessa área da biologia de cresci-
mento cada vez mais rápido. Filmes e entrevistas gravadas estão incluídas
e esses artigos de destaque poderão ser expandidos à medida que a tecnologia
os tornar mais fáceis para serem usados. Esse website está conectado tam-
bém a outros websites e podem ser usados para enriquecer a perspectiva de
alguém sobre o que está acontecendo no desenvolvimento animal. A presen-
ça de um website nos permite manter o direcionamento deste livro às pesso-
as para as quais isso foi originalmente pretendido: estudantes dos últimos
anos da graduação e do início da pós-graduação. Ele também me ajudou a
não deixar o livro tornar-se um substituto para peso de papel.
A visão de Roux foi que a biologia do desenvolvimento “algum dia cons-
tituiria a base de todas as outras disciplinas biológicas e, em continuada
simbiose com essas disciplinas, desempenharia uma parte proeminente nas
soluções dos problemas da vida.” Essas foram palavras audaciosas, até mes-
mo arrogantes há cem anos atrás; hoje, elas expressam uma aceitação ampla-
mente sustentada. O desenvolvimento integra todas as áreas da biologia e
desempenha um papel crucial em relacionar o genótipo ao fenótipo. O desen-
volvimento pode ser estudado usando qualquer organismo e em qualquer
nível de organização, de moléculas a filos.
À medida que o campo continuar a se expandir e se aprofundar , uma
palavra de advertência é requerida: a biologia do desenvolvimento não pode
ser aprendida ou ensinada em um único semestre. Este texto é uma tentati-
va para prover cada pessoa com material suficiente para seu curso, mas um
instrutor não necessita se sentir culpado por não determinar todos os capí-
tulos, e os estudantes não necessitam se sentir privados se eles não lerem
todos os capítulos. Isto é o começo do caminho, não sua conclusão.
Como usar o website

Qualquer pessoa pode entrar no website através de sua homepage
[http://zygote.swarthmore.edu/index.html] ou através da sua lista de ar-
quivos de capítulos localizada no [http://zygote.swarthmore.edu/info.html].
Alternativamente, nós colocamos acessos específicos endereçados em todo
o livro onde quer que exista uma entrada relevante no momento da publica-
ção. Todos esses endereços começam com [http://zygote.swarthmore.edu/]
e são seguidos por um código dado no livro texto. Assim, a localização
especificada na página 20 do livro é:
http://zygote.swarthmore.edu/intro2.html
Mais localizações estão sendo adicionadas no website, e essas podem

ser acessadas entrando nos arquivos do capítulo. Em adição, clicando no
botão “Outros Arquivos” abaixo de cada capítulo, as conexões para outros
websites serão facilitadas. Divirta-se.
xviii Prefácio
Agradecimentos
Esta edição, como suas precursoras, deve muito às sugestões e críticas dos
estudantes em minhas classes de biologia do desenvolvimento e genética
do desenvolvimento. O grupo de funcionários e docentes extremamente
corporativo da Universidade Swarthmore também desempenharam pa-
péis importantes na produção deste livro, e os bibliotecários da área de
ciência E. Horikawa e M. Spencer merecem agradecimentos especiais por
terem segurado volumes recentes na biblioteca enquanto eu estava escre-
vendo o livro. Os cientistas que revisaram estes capítulos forneceram enor-
me ajuda tanto na precisão técnica dos capítulos quanto nas sugestões
para trabalho futuro. Esses investigadores incluem: S. Carroll, J. Cebra-
Thomas, E. M. De Robertis, S. DiNardo, E. Eicher, C. Emerson, G. Grunwald,
D. J. Grunwald, M. Hollyday, L. A. Jaffe, W. Katz, R. Keller, K. Kemphues, D.
Kirk, G. Martin, H. F. Nijhout, D. Page, R. Raff, R. Schultz, C. Stern, S.
Tilghman, R. Tuan e M. Wickens. Eu também quero agradecer aos muitos
cientistas que desviaram do seu caminho para ajudar a tornar esta edição
melhor lendo porções específicas dos capítulos. Eles incluem: M. Bronner-
Fraser, J. Fallon, N. M. Le Douarin, E. McCloud, J. Opitz, K. Sainio, H. Sariola,
I. Thesleff e T. Valente. Se eu deixei alguém fora, por favor me desculpem. É
desnecessário dizer que os julgamentos editoriais finais foram de minha
responsabilidade. Meus agradecimentos especiais a Judy Cebra-Thomas
que não somente me aconselhou em certos capítulos mas quem deu exce-
lente ajuda durante meu período sabático permitindo-me terminar este
livro. Agradecimentos também aos cientistas e filósofos, especialmente: C.
van der Weele, R. Amundson, L. Nyhart, R. Burian, H. F. Nijhout, A. F.
Sterling, K. Smith e A. I. Tauber, que participaram nos workshops de biolo-
gia do desenvolvimento da Sociedade Internacional para a História, Filo-
sofia e Estudos Sociais da Biologia. Algumas das melhores críticas cons-
trutivas deste livro-texto vieram dessas pessoas.
Andy Sinauer uma vez mais conseguiu reunir as mesmas e extraor-
dinárias pessoas neste projeto, e foi um privilégio trabalhar com eles. Meus
agradecimentos a ele e aos editores Nan Sinauer e Carol Wigg, coordenador
de produção Chris Small, artistas John Woolsey e Gary Welch, designer
Susan Schmidler, editor de texto Janet Greenblatt, e artista de layout Janice
Holabird. As habilidades editoriais de Tinsley Davis são extremamente re-
conhecidas. Devido ao fato de que os prazos finais devem ser cumpridos e
outro trabalho posto de lado, eu tenho que agradecer minha família por
mais uma vez me permitir prosseguir com isso. Em particular, este livro
nunca poderia ter sido completado se não fosse pelo encorajamento de mi-
nha esposa, Anne Raunio, que, como uma obstetra, gosta do lado mais prá-
tico da biologia do desenvolvimento. Meus agradecimentos a todos vocês.
SCOTT F. GILBERT
1 DE MARÇO DE 1997
Introdução à Biologia
do Desenvolvimento
1 Introdução ao desenvolvimento animal 1
2 Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 35
3 Base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial 79
I
CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 1
Introdução ao desenvolvimento animal

1
O
A natureza parece nunca mudar, ainda que CONCEITO DE EMBRIÃO é assombroso, e a formação de um embrião é a
sua aparência esteja sempre mudando. É tarefa mais árdua que alguém haverá de realizar. Para se tornar um embrião,
nosso dever como artistas transmitir junta- você teve que construir a si mesmo a partir de uma única célula. Teve que
mente com todos os seus elementos a emo- respirar antes que tivesse pulmões, digerir alimentos antes que seus órgãos estives-
ção dessa permanente transformação.
sem formados, construir ossos a partir de uma massa e ordenar os neurônios antes
Paul Cezanne (ca. 1900)
mesmo de adquirir a capacidade de pensar. Uma diferença marcante entre você e a
máquina é que a máquina nunca é requisitada para uma função antes que esteja
Feliz é a pessoa que consegue discernir as
causas das coisas. terminada. Todo animal tem que estar em funcionamento enquanto se auto-constrói.
Virgílio (37 A.C.)
O objetivo da biologia do desenvolvimento
Para plantas e animais, o único caminho para o desenvolvimento a partir de uma célula,
é desenvolvendo um embrião. O embrião é o intermediário entre o genótipo e o fenótipo,
ou seja, entre os genes herdados e o organismo adulto. Enquanto a maior parte da
biologia estuda a estrutura adulta e função, a biologia do desenvolvimento encontra
maior interesse nos estágios mais transitórios. Biologia do desenvolvimento é a ciên-
cia do vir a ser, a ciência do processo. Dizer que um inseto efêmero vive apenas um dia
não significa nada para um biologista do desenvolvimento, porque o inseto pode ser
adulto apenas por um dia, mas passou outros 364 dias como um embrião e larva.
As questões levantadas por um biologista do desenvolvimento são freqüente-
mente questões mais ligadas ao vir a ser do que ao ser propriamente dito. Dizer que
mamíferos XX são geralmente fêmeas e mamíferos XY são geralmente machos, não
explica a determinação sexual para um biologista do desenvolvimento. Esse quer sa-
ber como o genótipo XX produz um ser feminino e como o genótipo XY produz um ser
masculino. Da mesma maneira, um geneticista gostaria de saber como os genes globina
são transmitidos de uma geração à outra, e um fisiologista pode fazer perguntas sobre
a função da globina no corpo. Porém, o biologista do desenvolvimento pergunta
porque os genes globina se expressam somente nas hemácias e como essas se tornam
ativas apenas em certas fases do desenvolvimento (ainda não sabemos as respostas).
Biologia do desenvolvimento é uma ciência excelente para pessoas que querem
integrar diferentes níveis da biologia. Diante de um problema, podemos estudá-lo a
1
2 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
níveis molecular e químico (p. ex., Como os genes globina são transcritos, e como os
fatores que ativam sua transcrição interagem uns com os outros e com o DNA?), a níveis
celular e tissular (p. ex., Quais são as células capazes de produzir globina, e como o
mRNA da globina deixa o núcleo?), a nível de órgãos ou sistema de órgãos (p. ex., Como
vasos capilares são formados em cada tecido, e como são instruídos a se conectarem e
ramificarem?) e, até mesmo, a níveis ecológicos e evolucionários (p. ex., Como diferenças
na ativação do gene globina permitem o fluxo de oxigênio da mãe para o feto, e como
fatores ambientais acionam a diferenciação de mais hemácias?). Biologistas do desen-
volvimento podem estudar qualquer organismo e todo tipo de célula.
Biologia do desenvolvimento é um dos campos que mais tem crescido e também
um dos mais emocionantes da biologia. Parte dessa emoção vem dos assuntos estu-
dados, porque estamos apenas começando a entender o mecanismo molecular do
desenvolvimento animal. Outra parte da emoção vem do papel unificador que a biolo-
gia do desenvolvimento assume nas ciências biológicas. A biologia do desenvolvi-
mento está criando uma estrutura que integra a biologia molecular, fisiologia, biologia
celular, anatomia, pesquisa do câncer, neurobiologia, imunologia, ecologia, e biologia
evolucionária. O estudo do desenvolvimento tornou-se essencial para a compreensão
de qualquer área da biologia.
Os problemas da biologia do desenvolvimento

O desenvolvimento é realizado por duas funções principais: gera diversidade e ordem
celular dentro de cada geração, o que assegura a continuidade da vida que passa de
uma geração à outra. Assim, existem duas questões fundamentais para a biologia do
desenvolvimento: Como um ovo fertilizado origina um ser adulto, e como esse ser
adulto produz um outro ser? Cada espécie tem suas próprias respostas, mas algumas
generalizações podem ser feitas. Tradicionalmente, essas questões têm sido subdivi-
didas em quatro problemas gerais da biologia do desenvolvimento:
• O problema da diferenciação. Uma única célula, o ovo fertilizado, se desen-
volve e gera centenas de células de diferentes tipos - células musculares,
células epidérmicas, neurônios, linfócitos, células do sangue, células gorduro-
sas, e assim por diante. Essa geração de diversidade celular é chamada diferen-
ciação. Desde que cada célula do corpo contém o mesmo conjunto de genes,
precisamos entender como esse mesmo conjunto de instruções genéticas pode
produzir diferentes tipos de células.
• O problema da morfogênese. Nossas células diferenciadas não são distribuí-
das aleatoriamente; pelo contrário, são organizadas em intrincados tecidos e
órgãos. Esses órgãos estão dispostos de tal maneira que: dedos estão nas
pontas e não no meio de nossas mãos, os olhos estão na nossa cabeça e não
nos pés ou intestinos. Essa criação de forma ordenada, é chamada morfogêne-
se. Como as células se auto-organizam e formam um arranjo correto?
• O problema do crescimento. Somos maiores do que um ovo, mas como as
células sabem quando devem parar de se dividir? Se cada célula de nossa face
realizasse mais uma divisão celular, seríamos considerados horrivelmente mal
formados. Se cada célula de nossos braços tivesse realizado apenas mais uma
série de divisões, poderíamos amarrar nossos sapatos sem nos abaixar.
• O problema da reprodução. O espermatozóide e o óvulo são células muito
especializadas. Somente eles podem transmitir instruções para produzir um
organismo de uma geração para outra. Como essas células são separadas para
formar a próxima geração, e quais as informações no núcleo e no citoplasma
que permitem tal funcionamento?
Recentemente, tem-se dado grande ênfase a um quinto problema:
• O problema da evolução. A evolução envolve mudanças herdadas durante o
desenvolvimento. Quando dizemos que o cavalo de um dedo só de hoje, teve
um ancestral de cinco dedos, estamos dizendo que mudanças no desenvolvi-
mento da cartilagem e dos músculos ocorreram ao longo de muitas gerações de

embriões nos ancestrais do cavalo. Como mudanças no desenvolvimento cri-
am novas formas de corpo? Quais modificações hereditárias são possíveis,
dadas as restrições impostas pela necessidade do organismo sobreviver en-
quanto se desenvolve?
Os estágios do desenvolvimento animal

De acordo com Aristóteles, o primeiro grande embriologista da história, a ciência
começa com a curiosidade: “é graças a curiosidade que as pessoas começaram a
filosofar, e a curiosidade permanece desde o início do conhecimento.” O desenvolvi-
mento de um ser a partir do ovo tem sido motivo de admiração através da história da
humanidade. O simples procedimento de se abrir um ovo de galinha a cada dia do seu
período de incubação de três semanas proporciona uma notável experiência quando
se observa desde uma fina camada de células até o total desenvolvimento da ave.
Aristóteles realizou esse procedimento e observou a formação dos principais órgãos.
Qualquer um pode se admirar com esse fenômeno, ainda que ordinário, mas cientistas
são os que procuram descobrir como o desenvolvimento realmente ocorre. E ainda
mais do que dissipar essa admiração, novo conhecimento só faz aumentá-la.
Organismos pluricelulares não se formam de imediato, ao contrário, são formados
por um processo relativamente lento de mudança progressiva, o qual chamamos de
desenvolvimento. Em quase todos os casos, o desenvolvimento de um organismo
pluricelular começa com uma única célula - ovo fertilizado ou zigoto, que dividido
através da mitose, produz todas as células do corpo. O estudo do desenvolvimento
animal tem sido tradicionalmente chamado de embriologia, se referindo ao fato de que
entre a fertilização e o nascimento, o organismo em desenvolvimento é conhecido
como embrião. Mas o desenvolvimento não cessa no nascimento, ou mesmo na vida
adulta, porque a maioria dos organismos nunca pára de se desenvolver. A cada dia nós
repomos mais de um grama de células de pele (fazendo com que as células mais velhas
se desprendam assim que nos movemos), e nossa medula óssea sustenta o desenvol-
vimento de milhões de novos eritrócitos a cada minuto de nossas vidas. Portanto, nos
últimos anos tem sido comum se falar em biologia do desenvolvimento, como a discipli-
na que estuda processos embrionários e outros do desenvolvimento.
As principais características do desenvolvimento animal estão ilustrados na Figu-
ra 1.1. A vida de um novo indivíduo é iniciada pela fusão do material genético de dois
gametas, o espermatozóide e o óvulo. Essa fusão, chamada fertilização, estimula o
ovo a iniciar o desenvolvimento. Os estágios subseqüentes do desenvolvimento são
coletivamente chamados de embriogênese. Por todo reino animal existe uma incrível
variedade de tipos embrionários, mas a maioria dos padrões de embriogênese compre-
ende variações em quatro temas:
1. Ocorrência de clivagem imediatamente após a fertilização. Clivagem é uma

série de divisões mitóticas extremamente rápidas, onde o enorme volume cito-
plasmático do zigoto é dividido em numerosas células menores. Essas células
são chamadas blastômeros e, ao fim da clivagem, eles geralmente formam uma
esfera conhecida como blástula.
2. Após a redução na taxa de divisão mitótica, os blastômeros passam por
mudanças dramáticas quanto às suas posições, um em relação ao outro. Essa
série de redistribuição de células é chamada de gastrulação. Como resultado
da gastrulação, o embrião típico contém três regiões celulares chamadas
camadas germinativas*. O ectoderma, a camada exterior, produz as células
da epiderme e do sistema nervoso; o endoderma, camada interior, produz o
*Do Latim germen, significa “broto” ou “rebento” (a mesma raiz da palavra germinação). Os
nomes das três camadas germinativas são do Grego: ectoderma de ektos (“fora”) mais derma
(“pele”); mesoderma de mesos (“meio”) e endoderma de endon (“dentro”).
Esperma-
tozóide
Mórula
Blástula
Oócito Local das células
embrionárias
Célula germinativa
(“Germ plasm”)
Esperma- Blastocele
tozóide
(gameta Oócito
masculino) (gameta
feminino)
GAMETOGÊNESE
Adulto
sexualmente maduro
Blastóporo
Ectoderma
Gônada
Mesoderma
Estágios
Endoderma
larvais
imaturos
INCUBAÇÃO (NASCIMENTO)
Figura 1.1
Histórico do desenvolvimento de um repre-
sentante animal, um sapo. Estágios que vão
da fertilização até o nascimento são coletiva-
mente conhecidos como embriogênese. As
regiões responsáveis por produzir células em-
brionárias são mostradas em cores. Gameto-
gênese, que é completa no adulto sexualmen-
te maduro, começa em épocas diferentes, de-
pendendo da espécie. revestimento do tubo digestivo e órgãos associados (pâncreas, fígado, pul-
mões, etc.); e o mesoderma, camada do meio, dá origem a diversos órgãos
(coração, rins, gônadas), tecidos conjuntivos (ossos, músculos, tendões, va-
sos sangüíneos) e células sangüíneas.
3. Uma vez que as três camadas embrionárias estão estabelecidas, as células
interagem umas com as outras e se reorganizam para produzir tecidos e órgãos.
Esse processo é chamado organogênese. (Nos vertebrados, a organogênese é
iniciada quando uma série de interações celulares induzem as células ectodér-
micas da porção mediana do dorso a formar o tubo neural. Esse tubo originará
o cérebro e a coluna vertebral). Muitos órgãos contêm células de mais de uma
camada embrionária, e não é incomum o exterior de um órgão ser derivado de
uma determinada camada e o interior de outra. Também durante a organogênese,
algumas células sofrem longas migrações do seu lugar de origem até sua loca-
lização final. Essas células migrantes incluem os precursores das células san-
güíneas, células linfáticas, células pigmentadas e gametas. A maior parte dos
ossos de nossa face são provenientes de células que migraram ventralmente
da região dorsal da nossa cabeça.
4. Como observado na Figura 1.1, em muitas espécies, uma parte especializada
do citoplasma do ovo dá origem às células que são precursoras dos gametas.
Essas células são chamadas de células germinativas, sendo destinadas à
função reprodutiva. Todas as outras células do corpo são chamadas células
somáticas. Essa separação entre células somáticas (que dão origem a um
corpo individual) e células germinativas (que contribuem para a formação de
uma nova geração) é freqüentemente uma das primeiras diferenciações que
ocorrem durante o desenvolvimento animal. As células germinativas final-
mente migram para as gônadas, onde se diferenciam em gametas. O desen-
volvimento de gametas, chamado de gametogênese, normalmente não é com-
pletado até que o organismo tenha se tornado fisicamente maduro. Na matu-
ridade, os gametas podem ser liberados e participar de uma fertilização dando
início a um novo embrião. O organismo adulto finalmente sofre envelheci-
mento e morre.
Nossa herança eucariótica

Os organismos estão divididos em dois grupos principais, dependendo apenas se
as células possuem um envoltório nuclear ou não. Os procariotos (do grego karion,
significa “núcleo”), onde estão incluídas as arqueobactérias e as eubactérias, não
possuem um núcleo verdadeiro. Os eucariotos que incluem os protistas, animais,
plantas e fungos, possuem um tegumento nuclear bem formado circundando os
seus cromossomos. Essa diferença fundamental entre os eucariotos e procariotos
influencia a maneira como esses grupos organizam e utilizam seu material genético.
Em ambos os grupos, a informação herdada necessária para o seu desenvolvimento
e metabolismo se encontra codificada nas sequências de ácido desoxirribonucléico
(DNA) dos cromossomos. Os cromossomos procarióticos normalmente são hélices
duplas de DNA, pequenas e circulares consistindo de aproximadamente 1 milhão de
pares de bases. As células eucarióticas geralmente possuem diversos cromosso-
mos, e um simples protista eucariótico possui 10 vezes, ou mais, a quantidade de
DNA encontrada na maioria dos procariotos complexos. Além disso, a estrutura de
um gene eucariótico é mais complexa do que a de um gene procariótico. A seqüência
de aminoácidos de uma proteína procariótica é a reflexão direta da seqüência de
DNA do cromossomo. O DNA de um gene eucariótico que codifica uma proteína,
geralmente, é dividido de tal forma que a seqüência completa de aminoácidos da
proteína é derivada de segmentos descontínuos de DNA (Figura 1.2). O DNA entre
os segmentos freqüentemente contém seqüências que estão envolvidas na regulação
do momento e lugar em que o gene é ativado.
Cromossomos eucarióticos também são muito diferentes dos cromossomos
procarióticos. O DNA eucariótico reveste complexos protéicos específicos, chamados
nucleossomos, compostos por proteínas histonas. Os nucleossomos organizam o
DNA em estruturas compactas e são importantes na designação de qual gene irá se
expressar em qual célula. Nas bactérias não existem histonas. Mais ainda, células
eucarióticas sofrem mitose, na qual o tegumento nuclear se parte e os cromossomos
replicados são igualmente divididos entre as células filhas (Figura 1.3). Nos procariotos,
a divisão celular não é mitótica; não se desenvolve o fuso mitótico e, também, não
existe tegumento celular para se partir. Ao invés disso, os cromossomos filhos perma-
necem ligados a pontos adjacentes na membrana celular. Esses pontos de ligação são
separados entre si pelo crescimento da membrana celular, e finalmente colocam os
cromossomos em diferentes células filhas.
Figura 1.2 (A) CÉLULA PROCARIÓTICA (B) CÉLULA EUCARIÓTICA

Resumo dos passos pelos quais as proteínas
são sintetizadas a partir do DNA. (A) Ex- Envoltório nuclear
pressão procariótica (bacteriana) do gene.
Regiões codificadoras do DNA são colineares
Íntron Íntron
com o produto protéico. (B) Expressão de
Gene 1 2
genes eucarióticos. Os genes são descontínuos DNA
e um envoltório nuclear separa o DNA do Éxon Éxon Éxon
citoplasma. 1 2 3
Núcleo
Transcrição
RNA nuclear
Transcrição
Processamento de RNA
mRNA mRNA
Tradução
Citoplasma Tradução
mRNA mRNA
Proteína Proteína
Procariotos e eucariotos têm mecanismos diferentes de regulação do gene. Em

ambos, o DNA é transcrito por enzimas chamadas RNA polimerases para produzir
RNA. Quando o RNA mensageiro (mRNA) é produzido nos procariotos, ele é imedia-
tamente traduzido em uma proteína enquanto o seu outro terminal está sendo transcri-
to do DNA (Figura 1.4). Sendo assim, nos procariotos, transcrição e tradução são
eventos simultâneos e coordenados. Mas a existência de envoltório nuclear em
eucariotos proporciona a oportunidade de se obter um tipo de regulação celular total-
mente novo. Os ribossomos, que são responsáveis pela tradução, estão de um lado do
envoltório nuclear, e o DNA e a RNA polimerase necessária para a transcrição estão do
outro. Entre a transcrição e a tradução, o RNA transcrito deve ser processado para que
possa passar através do envoltório nuclear. A regulação pela qual o mRNA pode
passar para o citoplasma, torna a célula capaz de selecionar quais das mensagens
recém-sintetizadas serão traduzidas. Assim, um novo nível de complexidade foi adici-
onado, que é extremamente importante para o organismo em desenvolvimento.
Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares

Todos os organismos eucarióticos pluricelulares se desenvolveram de protistas uni-
celulares. É nesses protistas que as características básicas do desenvolvimento apa-
receram primeiro. Eucariotos simples nos deram os primeiros exemplos da morfogênese
direcionada pelo núcleo, o uso da superfície da célula para mediar cooperação entre
células individuais e as primeiras ocorrências de reprodução sexual.
Controle da Morfogênese no Desenvolvimento em Acetabulária

Há um século, ainda não havia sido provado se o núcleo continha alguma informação
hereditária ou de desenvolvimento. Algumas das melhores evidências para essa teoria
vieram de estudos onde organismos unicelulares foram fragmentados em pedaços
Prófase:
O envoltório nuclear
quebra e um fuso se forma
entre dois centríolos.
Prometáfase:
Interfase: DNA é duplicado em Os cromossomos se
preparação para a divisão celular. ligam às fibras dos fusos.
Cromatídeos do
cromossomo
Núcleo Cromatina Nucléolo
Região do centrômero
Fuso em
desenvolvimento
Centríolos
Áster
Envoltório Envoltório
nuclear nuclear
Nucléolo rompe
Cromossomos filhos
Metáfase:
Os cromossomos se
alinham no equador da célula.
Telófase:
Os cromossomos atingem
os pólos mitóticos e a célula
começa a invaginar.
Figura 1.3
Diagrama de mitose em células animais. Du-
Anáfase:
Os cromossomos duplicados
rante a interfase o DNA é duplicado em pre-
(chamados cromatídeos) são paração para a divisão celular. Durante a
separados. prófase, o envoltório nuclear quebra e for-
ma-se um fuso entre os dois centríolos. Na
nucleados e anucleados (revisão por Wilson, 1986). Quando vários protistas foram metáfase, os cromosssomos se alinham no
equador da célula e se inicia a anáfase, os
fragmentados, quase todas as partes morreram. No entanto, os fragmentos que conti-
cromossomos duplicados (cada duplicata de
nham núcleo foram capazes de sobreviver, regenerando todo a complexa estrutura cromossomo é um cromatídeo) são separa-
celular (Figura 1.5) dos. Na telófase os cromossomos atingem
O controle nuclear da morfogênese celular e a interação do núcleo e citoplasma os pólos mitóticos e a célula começa a
estão muito bem demonstrados nos estudos da Acetabulária. Essa enorme célula invaginar. Cada pólo contém o mesmo núme-
individual (2 a 4 cm de comprimento) consiste de três partes: o disco reprodutivo, o ro e tipos de cromossomos que continha a
pedúnculo e o rizóide (Figura 1.6A). O rizóide está localizado na base da célula onde célula antes da divisão.
essa é presa ao substrato. O núcleo individual da célula se localiza dentro do rizóide. O
tamanho da Acetabulária e a localização do seu núcleo permitiram que pesquisadores
DNA Ribossomos RNA
Figura 1.4
Transcrição e tradução simultânea em procariotos. Uma porção de DNA de Escherichia coli se
estende horizontalmente por essa microfotografia eletrônica. Transcrições de RNA mensageiro
podem ser vistas dos dois lados. Ribossomos se juntaram ao mRNA e estão sintetizando
proteínas (que não podem ser vistas). O mRNA pode ser visto aumentando de tamanho, da
esquerda para a direita, indicando a direção da transcrição. (Cortesia de O. L. Miller, Jr.)
removessem o núcleo de uma célula e o substituísse por outro, de outra célula. Nos
anos 30, J. Hämmerling tirou proveito dessa singular característica e trocou núcleos
entre duas espécies morfologicamente distintas, A. mediterranea e A. crenulata. Como
é mostrado na fotografia, essas duas espécies têm discos reprodutivos muito diferen-
tes. Hämmerling descobriu que quando um núcleo de uma determinada espécie era
transplantado para o pedúnculo de outra, o novo disco em formação finalmente assu-
mia a forma associada com o núcleo do doador (Figura 1.6B). Assim, foi considerado
que o núcleo era o controlador do desenvolvimento da Acetabulária.
A formação de um disco reprodutivo é um evento morfogênico complexo, envol-
vendo a síntese de um grande número de proteínas, que devem ser acumuladas em
certa porção da célula e então organizadas em estruturas complexas específicas da
espécie. O núcleo transplantado da célula realmente direciona a síntese de seu disco
reprodutivo espécie-específico, mas é uma tarefa que pode levar semanas para ser
realizada. Além disso, se o núcleo for removido da célula de Acetabulária em estágio
inicial do desenvolvimento, antes de formar o disco reprodutivo, um disco normal se
formará semanas depois, ainda que o organismo irá morrer. Esses estudos sugerem
que (1) o núcleo contém informação específica sobre o tipo de disco reprodutivo
produzido (isto é, contém informação genética que especifica as proteínas necessári-
as para a produção de um certo tipo de disco reprodutivo), e (2) o material contendo
essa informação entra no citoplasma muito antes dessa produção ocorrer. A informa-
ção no citoplasma não será usada por várias semanas.
Fragmento
anucleado morre
Corte
Fragmento
Núcleo nucleado
se regenera
Corte
Figura 1.5
Regeneração do fragmento nucleado do protista unicelular
Stylonychia. Os fragmentos anucleados sobrevivem por al- Fragmento
gum tempo, mas finalmente morrem. anucleado morre
(B)
Disco
reprodutivo
(A)
Disco
reprodutivo
Pedúnculo
A. crenulata A. mediterranea
Pedúnculo Núcleos transplantados
Núcleo Núcleo
Rizóide
Rizóide Rizóide
1 cm 1 cm A estrutura do disco
reprodutivo é a do
núcleo doador
Figura 1.6
(A) Acetabulária mediterranea (esquerda) e A.
crenulata (direita). Cada unidade é uma célula singu-
lar. O rizóide contém o núcleo. (B) Efeitos da troca de
núcleos entre duas espécies de Acetabulária. Núcleos
foram transplantados para fragmentos de rizóides
anucleados. Estruturas de A. crenulata estão sombre-
adas; estruturas de A. mediterranea não estão som-
breadas. (Fotografias cortesia de H. Harris.)
Uma hipótese atual, proposta para explicar essas observações, é que o núcleo sintetiza
um mRNA estável, posicionado em estado dormente no citoplasma até a formação do
disco reprodutivo. Essa hipótese é amparada por uma observação publicada por Hämmerling
em 1934. Hämmerling fracionou uma Acetabulária jovem em diversas partes (Figura 1.7). A
porção com o núcleo finalmente formou um novo disco, conforme esperado; da mesma
forma o fez a extremidade apical do pedúnculo. No entanto, a parte intermediária do pedún-
culo não formou o disco reprodutivo. Por isso, Hämmerling postulou (aproximadamente 30
anos antes de sabermos da existência do mRNA), que as instruções para a formação do
disco reprodutivo se originavam no núcleo, sendo de alguma forma guardadas dormen-
tes próximo à extremidade do pedúnculo. Muitos anos mais tarde, Kloppstech e
Schweiger (1975) estabeleceram que o mRNA derivado do núcleo se acumula nessa
região. Ribonuclease, uma enzima que cliva RNA, inibe completamente a formação do
disco reprodutivo quando adicionada à água marinha na qual cresce a Acetabulária. Em
células anucleadas, esse efeito é permanente; uma vez que o RNA é destruído, não pode
mais haver a formação do disco reprodutivo. Em células nucleadas, no entanto, um novo
disco pode ser formado após a eliminação da ribonuclease, presumivelmente porque um
novo mRNA é então produzido pelo núcleo. Garcia e Dazy (1986) também demonstraram
que a síntese da proteína é especialmente ativa no ápice da Acetabulária.
Fica claro pela discussão anterior, que a transcrição nuclear tem um papel impor-
tante na formação do disco reprodutivo da Acetabulária. Mas deve ser notado que o
Disco reprodutivo e
pedúnculo regenerados
Extremidade
apical do
pedúnculo
Porção central
do pedúnculo Sem regeneração
Rizóide
e núcleo
Regeneração total
Figura 1.7
Habilidade regenerativa de diferentes fragmentos da A. mediterranea
citoplasma também cumpre uma parte essencial na formação desse disco. O mRNA
não é traduzido durante semanas, mesmo estando no citoplasma. Algo no citoplasma
controla quando as mensagens devem ou não ser utilizadas. Portanto, a expressão do
disco reprodutivo é controlada não somente pela transcrição nuclear como também
pelo controle de tradução do RNA citoplasmático. Nesse organismo unicelular, o
“desenvolvimento” é controlado em ambos estágios de transcrição e de tradução.
Diferenciação em Ameboflagelados Naegleria

Um dos casos mais marcantes de “diferenciação” em protistas, é aquele de Naegleria
gruberi. Esse organismo ocupa um lugar especial na taxonomia protista porque pode
mudar sua forma, de uma ameba para a de um flagelado (Figura 1.8). Durante a maior
parte do seu ciclo de vida, a N. gruberi é uma ameba típica, alimentando-se de bacté-
rias do solo e dividindo-se por cisão. No entanto, quando as bactérias são diluídas
(tanto pela água da chuva quanto pela água nos experimentos), cada N. gruberi
desenvolve rapidamente uma forma aerodinâmica e dois longos flagelos anteriores,
que são usados para encontrar regiões mais abundantes em bactérias. Nessas condi-
ções, ao invés de existirem diversos tipos de células diferenciadas em um único orga-
nismo, essa célula única tem estruturas celular e bioquímica diferentes nos diferentes
estágios de sua vida.
Diferenciação para a forma de flagelado ocorre aproximadamente em uma hora
(Figura 1.9). Durante esse período, a ameba tem que criar centríolos para servir como
corpos basais do flagelo (centros organizadores de microtúbulos), assim como criar o
próprio flagelo. Os corpos basais e os flagelos são compostos de diversas proteínas,
das quais a mais abundante é a tubulina. As moléculas de tubulina são organizadas em
microtúbulos; esses são posteriormente arranjados para permitir o movimento flagelar.
Fulton e Walsh (1980) mostraram que a tubulina dos flagelos de Naegleria não existe
(A) (B) (C) (D)
Figura 1.8
Transformação de Naegleria gruberi da forma
em seu estágio de ameba. É produzida de novo (“desde o começo”), começando com amebóide ao estado flagelado. Linha superior
uma nova transcrição no núcleo. Para mostrar isso, os pesquisadores manipularam corada com Iodo/Lugol; linha inferior corada
com um anticorpo fluorescente à proteína tu-
transcrições em vários estágios com actinomicina D, uma droga antibiótica que seleti-
bulina dos microtúbulos. A transformação é
vamente inibe a síntese do RNA. Quando adicionada anteriormente à diluição do iniciada pela eliminação do alimento (bactéri-
alimento, esse antibiótico previne a síntese da tubulina. No entanto, se a actinomicina as) da colônia de Naegleria. (A) 0 minutos;
D é adicionada 20 minutos após a diluição, a tubulina ainda é produzida em tempo (B) 25 minutos, mostrando síntese de nova
normal (aproximadamente 30 minutos mais tarde). Portanto, parece que o mRNA para tubulina; (C) 70 minutos, emergência de
a tubulina foi produzido durante os primeiros vinte minutos após a diluição e usado flagelos visíveis (D) 120 minutos, mostrando
logo em seguida. Essa interpretação foi confirmada quando foi demonstrado que o flagelos maduros e forma aerodinâmica do cor-
mRNA extraído da ameba não continha mensagem alguma, detectável para tubulina po (de Walsh, 1984, cortesia de C. Walsh.)
flagelar, ao passo que mRNA extraído de células diferenciadas continha muitas mensa-
gens desse tipo (Walsh, 1984).
Então, temos aqui um excelente exemplo de controle transcricional de um proces-
so de desenvolvimento: O núcleo da Naegleria responde a mudanças ambientais
sintetizando o mRNA para tubulina flagelar. Notamos também um outro processo que
permanece extremamente importante no desenvolvimento de todos os outros animais
e plantas, que é o agrupamento de moléculas de tubulina para a produção do flagelo.
Esse arranjo, pelo qual a tubulina é polimerizada em microtúbulos, e esses por sua vez
agrupados de forma ordenada, é visto em toda a natureza. Em mamíferos, está evidente
no flagelo do espermatozóide e nos cílios da medula espinhal e do trato respiratório.
Mais ainda, não é somente a tubulina que produz o flagelo. Existem em torno de 300
outras proteínas em cada flagelo, e o movimento flagelar depende da orientação ade-
quada dessas proteínas uma em relação a outra. Até mesmo processos celulares têm a
sua própria “morfogênese” baseada em interações moleculares entre os fragmentos
de proteína. Tal controle pós-tradução, onde uma proteína não é funcional até que
esteja ligada a outras moléculas, será discutido melhor mais tarde. Vimos então, que o
desenvolvimento em eucariotos unicelulares pode ser controlado nos estágios de
transcrição, tradução e pós-tradução.
Figura 1.9 os
Diferenciação do fenótipo flagelado em rp
co m
Naegleria. Amebas que vinham crescendo a de po ça
in o or lar an
em um meio enriquecido com bactéria são ul t
en las
c c
b
tu e ç a ei
s
de ag
e al n t o
lavadas afim de se eliminar as bactérias no da o m p am élu dam s ív o a fl l os m e
u c n v i ã e i
e c
es r gr s, o aç rm ag r
tempo 0. Aos 80 minutos, praticamente toda
í nt e l a A asai rred e lo
s
rm fo Fl o m p l
o
a população desenvolveu flagelo. (Segundo S ag b a ag F m c ta
fl se Fl co to
Fulton, 1977.)
100
Porcentagem da população com flagelo

80
Células de corpo com

60 forma flagelar
40
20
0
0 20 40 60 80 100
Tempo após suspensão (minutos)
As Origens da Reprodução Sexual

A reprodução sexual é outra invenção dos protistas que teve um profundo efeito em
organismos mais complexos. Deve-se notar que sexo e reprodução são dois proces-
sos separáveis e distintos. A reprodução envolve a criação de novos indivíduos.
Sexo envolve a combinação de genes de dois indivíduos distintos em um novo
arranjo. Reprodução na ausência de sexo é uma característica de organismos que se
reproduzem por cisão; não há discriminação nos genes quando uma ameba se divide
ou quando uma hidra brota células para formar uma nova colônia. Sexo sem reprodu-
ção também é comum entre os organismos unicelulares. As bactérias são capazes de
transmitir genes de um indivíduo para o outro por meio dos pilos sexuais (Figura
1.10). Essa transmissão é independente da reprodução. Protistas são também capa-
zes de reorganizar genes sem reprodução. Os paramécios, por exemplo, se reprodu-
zem por cisão, mas o sexo é realizado através de conjugação. Quando dois paramécios
se juntam, eles se unem através de seus aparelhos orais formando uma conexão
citoplasmática através da qual podem trocar material genético (Figura 1.11). Cada
macronúcleo (que controla o metabolismo do organismo) degenera enquanto o
Figura 1.10 micronúcleo passa por meiose para produzir oito micronúcleos haplóides, dos quais
Sexo em bactérias. Algumas células de bactéri- todos, exceto um, degeneram. O micronúcleo remanescente divide-se mais uma vez
as estão cobertas de numerosos apêndices
para formar um micronúcleo estacionário e um micronúcleo migratório. Cada
(pilos) sendo capazes de transmitir genes para
uma célula recipiente (sem pilos) através de
micronúcleo migratório atravessa a ponte citoplasmática e se funde com o micronúcleo
um pilus sexual. Nessa figura, o pilus sexual estacionário (“fertilizante”), criando um novo núcleo diplóide em cada célula. Esse
está realçado por partículas virais que se ligam núcleo diplóide se divide mitoticamente fazendo surgir um novo micronúcleo e um
especificamente àquele estrutura. (Cortesia de novo macronúcleo quando os dois parceiros se separam. Ainda que não tenha
C. C. Brinton, Jr. e J. Carnahan.) ocorrido reprodução, houve sexo.
Micronúcleo Fuso
meiótico
Macronúcleo
Ponte
citoplasmática
Dois paramécios Micronúcleos passam Todos menos um
formam por meiose, formando 8 dos micronúcleos de
ponte citoplasmática núcleos haplóides por célula; cada parceiro degeneram
macronúcleos degeneram
Micronúcleo
estacionário
Micronúcleo
migratório
Micronúcleo restante se Micronúcleos migratórios Núcleo diplóide se forma e

divide para formar um micronúcleo atravessam a ponte citoplasmática sofre divisões mitóticas para
estacionário e um migratório e fertilizam os micronúcleos gerar um novo macronúcleo e
estacionários do parceiro dois micronúcleos quando os
paramécios se separam
Figura 1.11
União de paramécios através da ponte citoplasmática, onde dois paramécios podem trocar
material genético, deixando cada um com genes que diferem daqueles com os quais iniciaram o
processo. (Strickberger, 1985.)
A união desses dois processos distintos, sexo e reprodução, em reprodução

sexual, é visto em eucariotos unicelulares. A Figura 1.12 mostra o ciclo de vida da
Chlamydomonas. Esse organismo é geralmente haplóide, portando apenas uma
cópia de cada cromossomo (como os gametas dos mamíferos). Os indivíduos de
cada espécie, no entanto, estão divididos em dois grupos de parceiros: mais e
menos. Quando se encontram, juntam-se os citoplasmas e seus núcleos se fundem
para formar um zigoto diplóide. Esse zigoto é a única célula diplóide do ciclo de vida
e passará por meiose para formar quatro novas células de Chlamydomonas. Aqui
está uma reprodução sexual, pois cromossomos são realinhados durante as divi-
sões meióticas onde mais indivíduos são formados. Note que nesse tipo de reprodu-
ção sexual protista, os gametas são morfologicamente idênticos e a distinção entre
espermatozóide e óvulo ainda não aconteceu.
Com a evolução da reprodução sexual, dois importantes avanços foram alcança-
dos. O primeiro é o mecanismo da meiose (Figura 1.13), pelo qual o complemento
diplóide dos cromossomos é reduzido ao estado haplóide (discutido em detalhe no
Capítulo 22). O outro avanço é o mecanismo pelo qual os parceiros reprodutivos
diferentes se reconhecem um ao outro. Em Chlamydomonas, o reconhecimento ocorre
primeiro nas membranas flagelares (Figura 1.14; Bergman et al., 1975; Goodenough e
Weiss, 1975). A aglutinação dos flagelos permite que regiões específicas das membra-
nas celulares se juntem. Esses setores especializados contêm componentes
reprodutivos específicos que permitem a fusão dos citoplasmas. Seguindo-se à
aglutinação, os indivíduos mais iniciam a fusão estendendo um tubo de fertilização.
Figura 1.12 Reprodução assexual (mitótica)

Reprodução sexual em Chlamydomonas. Duas Parceiro tipo mais Parceiro tipo menos
linhagens, ambas haplóides, podem se repro- (haplóide) (haplóide)
duzir assexuadamente quando separadas. Res-
peitando certas condições, os dois cordões
podem se unir para produzir uma célula
diplóide que pode sofrer meiose para formar
quatro novos organismos haplóides. (Segundo
Strickberger, 1985.) Reprodução
sexual
Acasalamento
Fusão citoplasmática
Zigoto (diplóide)
Maturação (meiose)
Germinação
Dois parceiros tipo mais e tipo menos
Figura 1.13
Sumário da meiose. O DNA e as proteínas associadas replicam durante a interfase. Durante a
prófase, o envoltório nuclear se rompe e os cromossomos homólogos (cada cromossomo é
duplicado, com os cromatídeos juntos no centrômero) se alinham em pares. Reagrupamentos
cromossômicos podem ocorrer entre quatro cromatídeos homólogos nesse estágio. Após a
primeira metáfase, os dois cromossomos homólogos originais são segregados em células dife-
rentes. Durante a segunda divisão, o centrômero se divide, deixando cada nova célula com uma
cópia de cada cromossomo.
MEIOSE I
Envoltório Cromossomos Cromatídeos

nuclear Cromatina homólogos homólogos
Núcleo
Interfase Prófase I precoce Meia prófase I Prófase I tardia Metáfase I
O envoltório nuclear se rompe e cromossomos homólogos (cada cromossomo

sendo duplo, com os cromatídeos ligados no centrômero) se alinham aos pares.
Rearranjos cromossômicos podem ocorrer entre os quatro cromatídeos homólo-
gos neste momento.
(A) (B) Figura 1.14

Duas etapas do reconhecimento no acasala-
mento de Chlamydomonas. (A) Varredura por
micrografia eletrônica (7000x) de par em aca-
salamento. Os flagelos que interagem, torcem-
se um em torno do outro, aderindo nas pontas
(flexas). (B) Microfotografia eletrônica de
transmissão (20.000x) de uma ponte citoplas-
mática conectando os dois organismos. Os
microfilamentos se estendem da célula doado-
ra (abaixo) para a célula recipiente (acima). (de
Goodenough e Weiss, 1975 e Bergman et al.,
1975; com permissão de U. Goodenough.)
Microfilamentos
Esse tubo conecta e se funde com um local específico no indivíduo menos. É interes-
sante que o mecanismo usado para estender esse tubo - polimerização da proteína
actina - também é usado para estender processos do espermatozóide e óvulo do
ouriço-do-mar. No Capítulo 4, veremos que o reconhecimento e fusão de espermato-
zóide e óvulo ocorrem de uma maneira espantosamente semelhante a desses protistas.
Eucariotos unicelulares parecem ter os elementos básicos do processo de desen-
volvimento que caracterizam os organismos mais complexos: a síntese celular é con-
trolada pela regulação transcricional, por tradução e pós-tradução; existe um mecanis-
mo para processar o RNA através da membrana nuclear; as estruturas de genes indi-
viduais e cromossomos são como serão através da evolução eucariótica; mitose e
meiose são aperfeiçoadas; e a reprodução sexual existe, envolvendo a cooperação
entre células individuais.Tal cooperação intercelular se torna ainda mais importante
com a evolução de organismos multicelulares.
MEIOSE II
Anáfase I Telófase I Metáfase II Anáfase II Telófase II
Os dois cromossomos O centrômero se divide Cada nova célula tem

homólogos originais são uma cópia de cada
segregados em células cromossomo
diferentes
Eucariotos coloniais: A evolução da diferenciação

Um dos mais importantes experimentos da evolução foi a criação de organismos
pluricelulares. Parece ter havido diversos caminhos pelo qual uma única célula evo-
luiu para uma disposição pluricelular; discutiremos apenas dois deles (veja o Capítulo
23 para uma discussão mais completa). O primeiro caminho envolve a divisão ordena-
da da célula reprodutiva e a subseqüente diferenciação da sua progênie em diferentes
tipos de células. Esse caminho para a multicelularidade pode ser visto em uma notável
série de organismos pluricelulares, coletivamente referidos como a família das
Volvocaceas ou volvocaceanas.
As Volvocaceanas
Os organismos mais simples entre as volvocaceanas são reuniões ordenadas de nu-
merosas células, cada uma parecida ao protista unicelular Chlamydomonas. Um único
organismo de volvocacea do gênero Gonium (Figura 1.15), por exemplo, consiste de
uma placa plana contendo de 4 a 16 células, cada uma com seu próprio flagelo. Em um
gênero relacionado, Pandorina, 16 células formam uma esfera; e no Eudorina, a esfe-
ra contém 32 ou 64 células organizadas em um padrão regular. Nesses organismos, um
princípio muito importante tem-se desenvolvido: a divisão ordenada de uma célula
para gerar um número de células que são organizadas de uma maneira previsível.
Como ocorre na maioria dos embriões animais, as divisões celulares pelo qual uma
única célula de volvocacea produz um organismo de 4 a 64 células ocorrem em uma
seqüência muito rápida e com ausência de crescimento celular.
Os dois próximos gêneros da série volvocacea exibem um outro princípio impor-
tante do desenvolvimento: a diferenciação de tipos celulares em organismo indivi-
dual. As células reprodutivas se diferenciam das células somáticas. Em todos os
gêneros já mencionados, toda a célula pode, e normalmente o faz, produzir um organis-
mo novo completo por mitose (Figura 1.16 A,B). Nos gêneros Pleodorina e Volvox,
porém, relativamente poucas células podem se reproduzir. Na Pleodorina californica,
as células da região anterior são restritas à uma função somática; somente aquelas
Figura 1.15
Representante da ordem dos Volvocales. (A)
o protista unicelular Chlamydomonas rei-
nhardtii. (B) Gonium pectorale com oito cé-
lulas Chlamydomonas-símiles em um disco
convexo. (C) Pandorina morum. (D) Eudo-
rina elegans. (E) Pleodorina californica. Aqui
todas as 64 células são originalmente simila-
res, mas as posteriores desdiferenciam e redi- (A) (B) (C)
ferenciam como células assexuadas reprodu-
tivas chamadas gonídios, enquanto as células
anteriores permanecem pequenas e biflagela-
das, como o Chlamydomonas. (F) Volvox
carteri. Aqui, células destinadas a se torna-
rem gonídios são separadas no começo do
desenvolvimento e nunca desenvolvem carac-
terísticas somáticas. As células menores,
somáticas, lembram Chlamydomonas. Todas,
menos o Chlamydomonas, são membros da
família das Volvocaceas. A complexidade au-
menta do Chlamydomonas unicelular ao
Volvox pluricelular. Barra em A é de 5µm; B-
D, 25µm; E, F, 50µm (Cortesia de D. Kirk.) (D) (E) (F)
Figura 1.16
Reprodução assexuada nas volvocaceanas. (A)
Colônia madura de Eudorina elegans. (B) Cada
uma das células de E. elegans se divide e pro-
duz uma nova colônia. (C) Volvox carteri ma-
duro. A maioria das células são incapazes de se
reproduzir. Células germinativas (gonídia) co-
meçaram a se dividir em novos organismos. (A
e B segundo Hartmann,1921; C de Kirk et al.,
(A) (B) (C)
1982, cortesia de D. Kirk.)
células do lado posterior podem se reproduzir. Em P. californica, a colônia normalmen-

te tem 128 ou 64 células, e a relação do número de células somáticas para o número de
células reprodutivas é normalmente 3:5. Dessa maneira, uma típica colônia de 128
células tem 48 células somáticas e uma colônia de 64 células tem 24 células somáticas.
Nos Volvox, quase todas células são somáticas, e muito poucas células são capa-
zes de produzir novos indivíduos. Em algumas espécies de Volvox, células reproduti-
vas como as da Pleodorina, são derivadas de células que originalmente parecem e
funcionam como células somáticas antes de crescer e se dividir para formarem uma
nova progênie. No entanto, em outros membros do gênero, como o V. carteri, existe
uma divisão do trabalho completa: as células reprodutivas que vão criar a nova gera-
ção são colocadas de lado durante a divisão das células reprodutivas que estão
formando um novo indivíduo. As células reprodutivas nunca desenvolvem um flagelo
funcional e nunca contribuem para motilidade e outras funções somáticas do indiví-
duo; são inteiramente especializadas para reprodução. Ainda que as volvocaceas
mais simples sejam consideradas organismos coloniais (porque cada célula é capaz de
existência independente e perpetuação da espécie), no V. carteri temos um organismo
verdadeiramente celular com dois tipos de células independentes e distintos (somático
e reprodutivo), ambos requeridos para a perpetuação da espécie (Figura 1.16C). Embo-
ra nem todos os animais separem suas células reprodutivas das células somáticas (e
as plantas raramente o fazem), essa separação de células germinativas das células
somáticas no início do desenvolvimento é característica de muitos filos animais e será
discutida em maior detalhe no Capítulo 13.
Embora todas as volvocaceas, incluindo seu parente unicelular Chlamydomo-
nas, se reproduzam predominantemente por meios assexuados, também são capazes
de reprodução sexual. Isso envolve a produção e fusão de gametas haplóides. Em
muitas espécies de Chlamydomonas, incluindo a ilustrada na Figura 1.12, a reprodu-
ção sexual é isogâmica, já que os gametas haplóides que se encontram são similares
em tamanho, estrutura e motilidade. No entanto, em outras espécies de Chlamydo-
monas - assim como as várias espécies de volvocaceas coloniais - gametas nadado-
res de diversos tamanhos são produzidos por parceiros de acasalamentos diferen-
tes. Isso é chamado heterogamia. Mas as volvocaceas maiores desenvolveram uma
forma especializada de heterogamia, chamada oogamia, que envolve a produção de
óvulos grandes e relativamente imóveis por um parceiro do acasalamento e esper-
matozóides pequenos e móveis pelo outro parceiro (veja Visões Colaterais & Espe-
culações). Aqui vemos um gameta especializado para retenção de recursos nutricionais
e de desenvolvimento e outro gameta especializado para transporte de núcleos.
Assim, as volvocaceas incluem os organismos mais simples que têm macho e fêmea
distinguíveis, e possuem caminhos diferentes para desenvolver o óvulo ou o es-
permatozóide. Em todas as volvocaceas, a reação da fertilização se assemelha à do
Chlamydomonas porque resulta na produção de um zigoto diplóide dormente, ina-
tivo, capaz de sobreviver a condições ambientais severas. Quando as condições
permitem aos zigotos germinar, eles primeiro sofrem meiose para produzir herdeiros
haplóides dos dois parceiros em números iguais. [other.html#intro1]
Informações adicionais
& Especulações
Sexo e Individulidade em Volvox

S imples como é, o Volvox comparti-
lha muitos traços que caracterizam o
ciclo de vida e histórico de desen-
volvimento de organismos muito mais com-
são parentes. A morte chega para uma
ameba apenas se ela é ingerida ou sofre
um acidente fatal; quando isso acontece,
a célula morta não deixa prole.
conjunto de gonídios. No fim da clivagem,
todas as células que estarão presentes no
adulto, foram produzidas de cada um dos
gonídios. Mas o embrião está “virado de
plexos, incluindo nós mesmos. Como já foi Porém, a morte se torna uma parte es- dentro para fora”: seus gonídios estão do
mencionado, o Volvox está entre os orga- sencial da vida para qualquer organismo lado de fora e os flagelos de suas células
nismos mais simples a exibir a divisão de pluricelular que estabelece divisão de tra- somáticas estão apontando para o interi-
trabalho entre dois tipos de células dife- balho entre células somáticas e células or da esfera oca de células. Essa condição
rentes. Como conseqüência disso, está en- germinativas (reprodutivas). Considere o adversa é corrigida por um processo cha-
tre os organismos mais simples a incluir a histórico de vida do Volvox carteri quan- mado inversão, pelo qual o embrião se vira
morte como uma parte regular, geneticamen- do se reproduz assexuadamente (Figura com o lado certo para fora através de
te programada, da sua história de vida. 1.17). Cada adulto assexuado é um movimentos celulares que fazem lembrar
esferóide contendo aproximadamente movimentos de gastrulação no embrião
Morte e Diferenciação 2000 pequenas células somáticas biflage- animal (Figura 1.18). Um agrupamento de
Organismos unicelulares que se reprodu- ladas ao longo de sua periferia e por volta
zem através de uma simples divisão celu- de 16 grandes células reprodutivas Figura 1.17
lar, tais como as amebas, são potencial- assexuadas, chamadas gonídios, dispos- Reprodução assexual em V. carteri. Quando as
mente imortais. A ameba que vemos sob tas em umas das extremidades do interior. células reprodutivas (gonídios) estão maduras,
um microscópio não tem ancestrais mor- Quando maduro, cada gonídio divide-se entram em um estado semelhante à clivagem do
tos! Quando uma ameba se divide, nenhu- rapidamente 11 ou 12 vezes. Parte dessa desenvolvimento embrionário para produzir se-
ma das duas células resultantes pode ser divisão é assimétrica e produz as 16 célu- res juvenis dentro do adulto. Através de uma
considerada ancestral ou progênie; elas las grandes que irão se tornar um novo série de movimentos celulares semelhantes à
gastrulação, o volvox embrionário se inverte e é
finalmente liberado do progenitor. As células
somáticas do progenitor, sem gonídios, passam
por senescência e morrem, enquanto a colônia
juvenil amadurece. O ciclo sexual total dura dois
Expansão
dias. (Segundo Kirk, 1988.)
de adultos
Embriogênese e juvenis
Adulto com
juvenis
Adulto com
gonídios maduros
Maturação
dos gonídios Expansão continuada
da matriz extracelular
Expansão Morte de células

continuada somáticas - progenitores
de juvenis
Liberação
de juvenis
(A) (F) Figura 1.18

Inversão dos embriões V. carteri produzidos
assexuadamente. A-E são micrografias eletrô-
nicas de varredura de embriões completos. F-
J são cortes sagitais através do centro do em-
brião, visualizado por microscopia diferencial
de interferência. Antes da inversão, o embrião
é uma esfera côncava de células conectadas.
Quando as células mudam a sua forma, um
buraco (o fialoporo) abre-se no topo do em-
brião (A,B,F,G). As células se curvam e se
reúnem em um dos pólos (C-E, H-J). (Kirk et
(B) (G) al., 1982, cortesia de D. Kirk.)
das células que as produzem (Pommerville

e Kochert, 1982). Além do mais, nessa mor-
te, as células liberam para o uso de ou-
tras, incluindo sua própria cria, todo o nu-
triente acumulado durante toda a vida.
“Dessa maneira emerge”, como assinala
David Kirk, “um dos grandes temas da
vida no planeta Terra: Alguns morrem para
(C) (H)
que outros possam viver”.
Em V. carteri, foi identificado um gene*
específico que tem um papel importante re-
gulando a morte das células (Kirk, 1988).
Em linhagens laboratoriais possuindo mu-
tações desse gene, as células somáticas
abandonam suas tendências suicidas,
ganham a habilidade de se reproduzirem
(D) (I) * Esse gene (regA) foi clonado e mostrou

codificar uma proteína que age para reprimir
(direta ou indiretamente) todos os genes cujos
produtos são requeridos pela célula para se de-
senvolver como gonídio. Mutações de perda da
função impedirão a proteína de agir, e as células
serão capazes de se tornarem gonídios (D. Kirk,
comunicação pessoal).
(E) (J)
células em forma de garrafa abre um bura- O que acontece às células somáticas

co em um dos lados do embrião produzindo “progenitor” Volvox agora que as jo- Figura 1.19 “Células garrafas” próxi-
do tensão sobre a camada de células in- vens “deixaram o lar”? Tendo produzido mas à abertura do fialoporo. Essas células
terconectadas (Figura 1.19). O embrião se uma cria e sendo incapazes de uma nova permanecem estreitamente conectadas atra-
utiliza desse buraco para fazer a inversão reprodução, essas células somáticas mor- vés de pontes citoplasmáticas próximas a
seus ápices alongados, desse modo criando
e depois o fecha. Posteriormente, as colô- rem. Para ser mais exato, elas cometem a tensão que causa a curvatura da lâmina ce-
nias juvenis são enzimaticamente soltas suicídio, sintetizando um conjunto de pro- lular interconectada. ( Kirk et al., 1982, cor-
do progenitor e nadam livres. teínas que causam a morte e a dissolução tesia de D. Kirk.)
(A) assexuadamente e se tornam potencialmen- advento da inevitável morte natural

te imortais (Figura 1.20). O fato desses mu- no reino animal, e tudo em nome do
tantes nunca terem sido encontrados na sexo. ”E pergunta: “Vale a pena?”
natureza, indica que a morte das células
tem um papel importante na sobrevivência Para Volvox carteri, certamente que sim.
do V. carteri sob condições naturais. V. carteri vive em pequenas poças rasas
[intro2.html] que temporariamente se enchem com as
águas das chuvas da primavera e secam no
Entra o sexo calor do verão. Durante a maior parte desse
Mesmo o V. carteri se reproduzindo as- tempo, V. carteri nada livremente, reprodu-
sexuadamente a maior parte do tempo, na zindo-se assexuadamente. Esses volvox
(B)
natureza se reproduzem sexualmente uma morreriam em minutos se a poça secasse,
vez por ano. Quando o faz, uma geração mas o V. carteri é capaz de sobreviver se
de indivíduos morre, e uma nova geração tornando sexual pouco antes da secagem
geneticamente diferente é produzida. O das poças, produzindo zigotos inativos que
naturalista Joseph Wood Krutch (1956) sobrevivem ao calor e à seca do alto verão e
colocou isso de uma forma mais poética: ao frio do inverno. Quando a chuva enche
esses pequenos reservatórios na primave-
A ameba e o paramécio são potencial- ra, os zigotos interrompem a sua dormência
mente imortais...Mas para o Volvox a e criam uma nova geração para reproduzi-
morte parece inevitável, assim como o rem-se assexuadamente até que as águas
é para um camundongo ou o homem. ameacem secar novamente. Como esses or-
Volvox deve morrer, como Leeuwenko- ganismos tão simples prevêem a chegada
ek observou, porque teve filhos e não é de condições adversas com acuidade sufi-
Figura 1.20 mais necessário. Quando sua hora ciente para produzir uma geração sexual no
Mutação de um único gene (chamado regene- chegar, tomba em silêncio, vai para tempo certo, ano após ano?
rador somático A) elimina a programação de o fundo juntar-se a seus ancestrais. O estímulo para mudança do modo
morte em células V. carteri. Volvox recém- Como Hegner, o zoologista de Johns assexual para o modo sexual de reprodu-
eclodido carregando essa mutação (A) é Hopkins, escreveu, “Esse é o primeiro ção em V. carteri é devido a uma proteína
indistinguível do esferóide tipo-selvagem. No
entanto, momentos antes das células somáti- Figura 1.21
cas do esferóide tipo-selvagem começarem a Reprodução sexual em V. carteri. Machos e fêmeas são indistiguíveis na sua fase assexuada.
morrer, as células somáticas desse mutante se Quando a proteína indutora sexual está presente, os gonídios de ambos parceiros passam por
rediferenciam como gonídios (B). Finalmente, uma embriogênese modificada que leva à formação de óvulos nas fêmeas e espermatozóides nos
cada célula do mutante irá se dividir para for- machos. Quando os gametas estão maduros, pacotes de espermatozóide (contendo 64 ou 128
mar ( regenerar) um novo esferóide que irá re- espermatozóides cada), são liberados e nadam para as fêmeas. Ao alcançar a fêmea o pacote se
petir esse ciclo do desenvolvimento potenci- rompe em espermatozóides individuais, que podem fertilizar os óvulos. O zigoto resultante tem
almente imortal. paredes duras que podem resistir à seca, calor e frio. Quando as chuvas da primavera fazem o
zigoto germinar, sofrendo meiose para produzir machos e fêmeas haplóides que se reproduzem
assexuadamente até o calor induzir novamente o ciclo sexual.
Pacotes de esperma-
Desenvolvimento tozóide
sexual de gonídios
Indutor
sexual
Espermatozóide
Macho assexuado Desenvolvimento embrionário Macho sexuado

Gonídio modificado dos gonídios resultando
em produção de gametas
Óvulos
Indutor
Zigotos
sexual
Óvulo
Fêmea assexuada Fêmea sexuada

Meiose e germinação
sexual indutiva de 30-kDa. Essa proteína tando placas com V. carteri à temperaturas de aparecer, multiplicar-se, realizando uma
é tão poderosa que concentrações meno- que poderiam ser encontradas em um reser- orgia sexual reprodutiva em poças de água
res que 6x10-17 fazem com que os gonídios vatório raso durante o fim do verão. Quan- da chuva de apenas duas semanas”
sofram um padrão modificado de desen- do isso era feito, as células somáticas dos (Powers, 1908). Ainda que reservatórios tem-
volvimento embrionário que resulta na volvox assexuados produziam a proteína porários formados pela água das chuvas se-
produção de óvulos ou espermatozóides, sexual indutora. Sendo a quantidade da pro- quem sob o calor do verão, Volvox encon-
dependendo do sexo genético do indiví- teína secretada por um indivíduo suficiente trou um meio de sobrevivência: usa o calor
duo (Sumper et al.,1993). Os espermato- para iniciar o desenvolvimento sexual em para induzir a formação de indivíduos sexu-
zóides são liberados para nadar para a fê- mais de 500 milhões de volvox assexuados, ados cujo acasalamento produz zigotos ca-
mea onde fertilizam os óvulos para pro- um único volvox indutor pode converter um pazes de sobreviver sob condições que ma-
duzir zigotos dormentes (Figura 1.21). reservatório inteiro para a sexualidade. Essa tam o organismo adulto. Observamos, tam-
Qual é a fonte dessa proteína indutora descoberta explica uma observação feita há bém, que o desenvolvimento está critica-
sexual? Kirk e Kirk (1986), descobriram que quase 90 anos, de que “na intensa radiação mente ligado ao ecossistema ao qual o or-
o ciclo sexual poderia ser iniciado esquen- solar do verão de Nebraska, Volvox é capaz ganismo se adaptou para sobreviver.
Diferenciação e Morfogênese em Dictyostelium
O CICLO DE VIDA DO DICTYOSTELIUM. Um outro tipo de organização multicelular

derivada de organismos unicelulares é encontrada no Dictyostelium discoideum.* O
ciclo de vida desse organismo fascinante é ilustrado na Figura 1.22. Em seu ciclo
vegetativo, uma solitária ameba haplóide (chamada myxamoebae ou “ameba social”
para distingui-las de espécies de amebas que sempre permanecem solitárias) vive em
troncos caídos, se alimentando de bactérias e se reproduz por cisão binária. Quando
tiver esgotado seu suprimento de comida, dezenas de milhares dessas amebas se juntam
para formar um fluxo corrente de células que convergem em um ponto central. Aqui se
amontoam uma sobre a outra sob forma de um cone chamado de agregado apertado ou
justo. Subseqüentemente, uma ponta surge no topo desse monte, que se dobra forman-
do uma lesma migratória (com a ponta na frente). A lesma (geralmente lhe é dado um
título mais dignificado de pseudoplasmódio ou grex) mede normalmente de 2 a 4 mm de
comprimento e é envolvida por uma bainha viscosa. O grex começa a migrar (se o
ambiente está escuro e úmido) com sua ponta anterior um pouco levantada; quando
atinge uma área iluminada, a migração cessa, e o grex se diferencia em um corpo de
frutificação composto de células esporos e pedúnculo. As células anteriores, represen-
tando 15 a 20 porcento de toda população celular, formam o pedúnculo tubular. O
pedúnculo começa na parte centro-anterior da célula, enquanto as células pré-
pedunculares começam a secretar um revestimento extracelular estendendo um tubo
através do grex. À medida que as células pré-pedunculares se diferenciam, formam
vacúolos e aumentam de tamanho levando a massa de células pré-pedúnculo que
havia ficado nos quatro-quintos posteriores do grex (Jermyn e Williams, 1991). As
células do pedúnculo morrem, mas as células posteriores, elevadas acima do pedún-
culo, transformam-se em células-esporo. Essas se dispersam, cada uma tornando-se
uma nova mixameba.
Em adição a esse ciclo sexual, existe a possibilidade para sexo em Dictyostelium.
Duas amebas podem fundir-se para criar uma célula gigante, que digere todas as
outra células do agregado. Quando tiver ingerido todos seus vizinhos, se enquista
em uma parede grossa e sofre divisões meiótica e mitótica; e por fim, novas mixamebas
são liberadas.
Dictyostelium tem sido um maravilhoso organismo experimental para biologis-
tas do desenvolvimento, porque células inicialmente iguais são diferenciadas em
dois tipos alternativos de células, esporo e pedúnculo. É também um organismo
onde células individuais se juntam para formar uma estrutura coesa composta por
tipos de células diferenciadas, parecido com a formação de tecidos em organismos
* Embora chamado coloquialmente um “fungo celular pegajoso”, Dictyostelium não é um fungo
(como Neurospora), nem é consistentemente pegajoso. É melhor considerá-lo como uma ameba social.
Lesma
(Pseudoplasmódio; grex)
15 h
16 h
14 h
17 h
CULMINAÇÃO 20 h
MIGRAÇÃO
12 h
Esporos
23 h
10 h
AGREGAÇÃO
Mixamebas Fluxos
9 h celulares
Corpo de frutificação maduro
6 h
24h
Figura 1.22
Ciclo vital de Dictyostelium discoideum. Esporos haplóides originam mixamebas, que podem
reproduzir-se assexualmente para formar mais mixamebas haplóides. A medida que diminui o
suprimento alimentar, ocorre agregação em pontos centrais, e forma-se um agregado de
pseudoplasmódio. Finalmente, esse pára de se movimentar e forma um corpo de frutificação
que libera mais esporos. Os números referem-se às horas decorridas desde que a diluição
nutricional iniciou a seqüência desenvolvimental.
mais complexos. A agregação de milhares de amebas em um único organismo é um

feito incrível de organização e convida à experimentação para resolver perguntas
sobre os mecanismos envolvidos.
AGREGAÇÃO DE CÉLULAS DE DICTYOSTELIUM. A primeira pergunta é: O que

induz a ameba a se agregar? Microcinematografia de espaçamento temporal mostrou
que não ocorre movimento direcionado durante as primeiras 4-5 horas após carência
nutricional. Durante as 5 horas seguintes, porém, as células são vistas mover-se por
aproximadamente 20µm / min durante 100 segundos. Esse movimento cessa após
aproximadamente 4 minutos, e em seguida recomeça. Embora o movimento seja
direcionado para um ponto central, não é um simples movimento radial. Antes, as
células se juntam umas às outras para formar correntes; essas convergem em corren-
tes maiores, e finalmente todas se juntam no centro. Bonner (1947) e Shaffer (1953)
mostraram que esse movimento é devido à quimiotaxia: as células são guiadas para os
centros de agregação por uma substância solúvel. Essa substância foi posteriormente
identificada como adenosina 3’,5’ monofosfato cíclico (cAMP) (Konijn et al., 1967;
Bonner et al., 1969), cuja estrutura química está mostrada na Figura 1.23A.
A agregação é iniciada à medida que cada célula começa a sintetizar o cAMP. Não
há células “dominantes” que começam a secreção ou controlam as outras. Antes, os
locais de agregação são determinados pela distribuição das amebas (Keller e Segal,
1970; Tyson e Murray, 1989). Células vizinhas respondem ao cAMP de duas maneiras:
ou iniciando sua movimentação de acordo com as pulsações de cAMP, ou acompa-
nhando a liberação de seu cAMP próprio (Robertson et al., 1972; Shaffer, 1975). Em
seguida, a células não respondem mais aos pulsos de cAMP por vários minutos. O
(A) Adenina (B)
(C)
(D)
Figura 1.23
Quimiotaxia de amebas de Dictyostelium de-
vida à ondas espirais de cAMP. (A) estrutura
resultado é uma onda giratória em espiral de cAMP, que se propaga através da química do cAMP. (B) Visualização de várias
população de células (Figura 1.23B-D). À medida que chega cada onda, as células dão “ondas” de cAMP no meio. Células centrais
secretam cAMP em intervalos regulares, e
mais um passo para o centro.*
cada secreção difunde para fora como um onda
A diferenciação de amebas individuais em células pedunculares (somáticas) ou concêntrica. As ondas são mapeadas saturan-
esporos (reprodutivas) é uma questão complexa. Raper (1940) e Bonner (1957) dedo-se papel de filtro com cAMP radioativo e
monstraram que as células anteriores normalmente formam pedúnculo, enquanto as colocando-o sobre uma colônia em agregação.
células remanescentes, posteriores, em geral estão destinadas a formar esporos. No O cAMP das células secretoras dilui o cAMP
entanto, a remoção cirúrgica da parte anterior da lesma não elimina a capacidade do radiativo. Quando a radioatividade no papel
grex formar um pedúnculo. Em vez disso, as células que agora se encontram no final é registada (colocando-o sobre filme de raios-
anterior após a cirurgia (e que originalmente estavam destinadas a formar esporos), X), as regiões de alta concentração de cAMP
agora formam o pedúnculo (Raper, 1940). De alguma maneira, é tomada uma decisão de na cultura aparecem mais claras que aquelas
de baixa concentração de cAMP. (C,D) On-
modo tal, que células anteriores virem células pedunculares e células posteriores
das espirais de amebas movendo-se em dire-
virem esporos. Essa habilidade de células mudarem seus destinos desenvolvimentais, ção à fonte inicial de cAMP. (C) Essa
microfotografia em campo escuro processa-
da digitalmente mostra cerca de 107 células.
* A bioquímica dessa reação envolve um receptor que liga o cAMP. Quando essa ligação Como células móveis e imóveis dispersam a
ocorre, realiza-se transcrição específica de genes, é iniciada movimentação em direção à fonte de luz diferentemente, a fotografia reflete movi-
cAMP, e enzimas adenilciclases (que sintetizam cAMP a partir de ATP) são ativadas. O cAMP mento celular. As bandas claras são compos-
recém-formado ativa seus receptores próprios, assim como aqueles de seus vizinhos. As células tas de células migratórias alongadas; as ban-
na área permanecem insensíveis às novas ondas de cAMP até que o cAMP ligado seja removido das escuras são células que pararam de se
dos receptores por outra enzima da superfície celular, a fosfodiesterase (Johnson et al., 1989). mover e se arredondaram. (D) As células for-
A matemática de tais reações de oscilação prevê que a difusão de cAMP seria inicialmente mam correntes, a espiral de movimento ainda
circular. Porém, à medida que o cAMP interage com as células que recebem e propagam o sinal, pode ser vista movendo-se em direção ao cen-
as células que recebem a parte frontal da onda começam a migrar com uma velocidade diferente
daquela das células atrás delas. O resultado é a espiral rotatória de cAMP e a migração vistas na tro. (B de Tomchick e Devreotes, 1981, cor-
Figura 1.23. É interessante que as mesmas fórmulas matemáticas predizem o comportamento de tesia de P. Devreotes; C e D de Siegert e Weijer,
certas reações químicas e a formação de novas estrelas em galáxias espirais rotatórias (Tyson e 1989, cortesia de F. Siegert.)
Murray, 1989).
Figura 1.24
Células de Dictyostelium sintetizam um adesivo, glicoproteína 24-kDa, pouco após a inanição
nutricional. Células de Dictyostelium foram coradas com um anticorpo fluorescente que se liga
à glicoproteína 24-kDa e foram em seguida observada sob luz ultravioleta. Essa proteína não foi
vista em amebas que tinham apenas parado de se dividir. No entanto, como mostrado aqui – 10
horas após o fim da divisão celular – amebas individuais são vistas apresentando essa proteína
em suas membranas celulares e são capazes de aderir umas às outras.
de acordo com sua localização dentro do organismo inteiro, e assim compensar por
partes faltantes, é chamada regulação. Veremos esse fenômeno em muitos embriões,
inclusive naqueles dos mamiferos.
MOLÉCULAS DE ADESÃO CELULAR EM DICTYOSTELIUM. Como essas células

individuais aderem entre si para formar um organismo coeso? Este é o mesmo proble-
ma que enfrentam as células embrionárias, e a solução que evoluiu para os protistas é
a mesma que aquela usada pelos embriões: moléculas de adesão celular reguladas
pelo desenvolvimento.
Enquanto estão crescendo mitoticamente em bactérias, células de Dictyostelium
não aderem umas às outras. Porém, uma vez que a divisão celular cessa, as células se
tornam progressivamente mais adesivas, alcançando um patamar de coesividade má-
xima aproximadamente após 8 horas de inanição. A adesão célula-célula é mediada por
uma glicoproteína de 24.0000 Da (24-kDa) que está ausente em células em crescimento
mas pode ser vista pouco depois dessa fase (Figura 1.24; Knecht et al., 1987; Loomis,
1988). Essa proteína é sintetizada a partir de mRNA recém-transcrito e fica localizada
nas membranas celulares das mixamebas. Se essas células são tratadas com anticor-
pos que se ligam a essa proteína e a mascaram, as células não irão aderir umas às
outras e todo desenvolvimento subseqüente cessa.
Uma vez que essa agregação inicial tiver ocorrido, é estabilizada por uma segunda
molécula de adesão celular. Essa glicoproteína de 80-kDa também é sintetizada duran-
te a fase de agregação. Se apresentar defeitos ou estiver ausente nas células, lesmas
pequenas se formarão, e seus corpos de frutificação só atingirão aproximadamente um
terço de seu tamanho normal. Assim, o segundo sistema de adesão celular, parece ser
necessário para a retenção de um número de células suficientemente grande para a
formação de grandes corpos de frutificação (Müller e Gerisch, 1978; Loomis, 1988). Um
terceiro sistema de adesão é ativado tardiamente no desenvolvimento, quando a les-
ma estiver migrando. A proteína ou grupo de proteínas que intervem no terceiro siste-
ma pode existir somente em células pré-esporo e pode ser responsável pela separação
de células pré-esporo de células pré-pedúnculo (Loomis, comunicação pessoal). As-
sim, Dictyostelium evoluiu para três sistemas de adesão célula-célula regulados pelo
desenvolvimento, e que são necessários para a morfogênese de células individuais
para formar um organismo coerente. Como veremos em capítulos subseqüentes, célu-
las de metazoários também usam moléculas de adesão celular para formar os tecidos e
órgãos do embrião.
Dictyostelium é um “organismo multicelular em tempo parcial” que não forma
muitos tipos de células (Kay et al., 1989), e os organismos multicelulares mais comple-
xos não se formam pela agregação de células anteriormente independentes. No entan-
to, muitos dos princípios do desenvolvimento demonstrados por esse “simples” or-
ganismo também aparecem em embriões de filos mais complexos. A habilidade de

células individuais sentir um gradiente químico (como a resposta da ameba ao cAMP)
é muito importante para a migração celular e morfogênese durante o desenvolvimento
animal. Ainda mais, o papel das proteínas da superfície celular para a coesividade
celular pode ser visto através do reino animal, e moléculas indutoras da diferenciação
estão agora começando a ser isoladas de organismos metazoários.
& Especulações
Evidência e Anticorpos
A Biologia, tal como qualquer outra Como então ir para além da mera cor- teínas de membrana em geral). Nesse
ciência, não trata de fatos; antes, relação? No estudo da adesão celular em caso, bloquear a glicoproteína também
trata de evidências. Vários tipos Dictyostelium, o próximo passo foi usar causaria a inibição da agregação celu-
de evidência serão apresentados neste li- aqueles mesmos anticorpos para bloque- lar. Assim, a evidência perda-de–função
vro; não são todos de equivalente vigor. ar a adesão de mixamebas. Usando uma precisa ser amparada por muitos con-
Como exemplo, vamos usar a análise da técnica introduzida pelo laboratório de troles demonstrando que agentes cau-
adesão celular em Dictyostelium. O primei- Gerisch (Beug et al., 1970), Knecht e cola- sadores de perda de função derrubam
ro e mais fraco tipo de evidência é a evi- boradores (1987) tomaram os anticorpos especificamente aquela função em par-
dência correlativa. Aqui, são feitas corre- que ligam essa glicoproteína 24-kDa e iso- ticular, e nada mais.
lações entre dois ou mais eventos, e infe- laram seus sítios ligantes de antígeno (as O tipo mais forte de evidência é evi-
re-se que um evento estimule o outro. partes da molécula do anticorpo que re- dência-de-ganho-de-função. Aqui, o iní-
Como vimos, anticorpos marcados com flu- conhecem o antígeno). Isso foi necessá- cio do primeiro evento estimula um segun-
orescência para uma certa glicoproteína de rio porque o todo da molécula de anticor- do e mesmo em situações onde nenhum
24 kDa, não marcam células vegetativas em po contém dois sítios ligantes de antígeno desses eventos ocorre usualmente. Recen-
divisão; porém, esses mesmos anticorpos que iriam ligar-se artificialmente de manei- temente, da Silva e Klein (1990) e Faix e
acham a proteína em membranas celulares ra cruzada e aglutinar as mixamebas. Quan- colaboradores (1990) obtiveram tal evidên-
de mixameba logo que as células param de do esses fragmentos ligantes de antígeno cia para mostrar que a glicoproteína 80-kDa
se dividir e tornam-se competentes para (chamados Fragmentos Fab) foram adici- é uma molécula adesiva. Isolaram o gene
agregar (veja Figura 1.24). Assim, existe uma onados às células competentes para agre- para essa proteína e o modificaram de uma
correlação entre a presença dessa glico- gação, as células não puderam se agre- maneira a motivá-lo ser expresso continu-
proteína da membrana celular e a capaci- gar. Os fragmentos de anticorpo impedi- amente. Em seguida, recolocaram-no em
dade de agregação. ram as células de aderir entre si, presu– mixameba bem-alimentada, crescendo ve-
Evidência correlativa dá um ponto de mivelmente por ligar–se a glicoproteína getativamente, que usualmente não expres-
partida para investigações, mas não se 24-kDa, bloqueando sua função. Esse tipo sa essa proteína e não tem capacidade de
pode afirmar com certeza que um evento de evidência é chamado evidência-de- adesão. A presença dessa proteína na mem-
estimula outro somente baseado em cor- perda-de-função. Se bem que mais forte brana celular dessas células em divisão foi
relações. Embora se possa inferir que a que a evidência correlativa, ela ainda não confirmada por marcação com anticorpos.
síntese dessa proteína causa a adesão das exclui outras inferências. Por exemplo, é Tais células agora aderiram umas às outras
células, é também possível que adesão ce- possível que os anticorpos tenham mata- mesmo nos estados vegetativos, o que nor-
lular leve as células a sintetizar essa nova do a célula (o que poderia acontecer se a malmente não fazem. Assim, elas tinham
glicoproteína, ou que a adesão celular e a glicoproteína 24-kDa for um crítico canal ganho uma função adesiva somente por
síntese da glicoproteína 24-kDa sejam de transporte). Isso também impediria a expressar essa glicoproteína em particular
eventos separados, iniciados pela mesma adesão celular. Ou talvez, a glicoproteína nas suas superfícies celulares. Essa evi-
causa subjacente. A ocorrência simultâ- 24-kDa nada tinha a ver com a adesão pro- dência de ganho-de-função é mais convin-
nea dos dois eventos pode mesmo ser co- priamente, mas é necessária para o funci- cente que outros tipos de análise. Experi-
incidência e os eventos não terem relação onamento da verdadeira molécula adesi- mentos semelhantes foram recentemente
um com o outro.* va (como através da estabilização de pro- realizados em células de mamíferos (veja
capítulo 3), para demonstrar a presença de
* Em uma carta irônica, caçoando de tais inferências correlativas, Sies (1988) demonstrou uma determinadas moléculas adesivas celula-
notável boa correlação entre o número de cegonhas vistas na Alemanha Ocidental de 1965 até 1980 res no embrião em desenvolvimento.
e o número de bebês nascidos durante esses mesmos anos.
DIFERENCIAÇÃO EM DICTYOSTELIUM. A diferenciação em uma célula-pedúncu-

lo ou em uma célula-esporo reflete um dos principais fenômenos da embriogênese: a
seleção pela célula de uma trajetória desenvolvimental. As células freqüentemente
selecionam um determinado destino desenvolvimental quando alternativas estão dis-
poníveis. Uma determinada célula num embrião de vertebrado por exemplo, pode tor-
nar-se uma célula da epiderme ou um neurônio. Em Dictyostelium, vemos uma decisão
dicotômica simples, porque somente dois tipos celulares são possíveis. Como uma
célula torna-se uma célula de pedúnculo ou uma célula de esporo? Embora os detalhes
não sejam totalmente conhecidos o destino de uma célula parece ser regulado por
certas moléculas difusivas. Os dois principais candidatos são o fator indutor de dife-
renciação (DIF) e o cAMP. DIF parece ser necessário para a diferenciação da célula
peduncular. Esse fator, tal como o fator indutor de sexo em Volvox, é eficaz em concen-
trações muito baixas (10-10M); e, como a proteína de Volvox, parece induzir a diferen-
ciação de um determinado tipo de célula. Quando adicionado às amebas isoladas ou
mesmo às células pré-esporo (posteriores), induz a formação de células pedunculares.
A síntese desse lipídeo de baixo peso molecular é regulada geneticamente, pois há
cepas mutantes de Dictyostelium que formam somente o precursor de células-esporo
e não de células pedunculares. Quando DIF é adicionado a essas culturas de mutantes,
células penduculares conseguem se diferenciar (Kay e Jermyn, 1983; Morris et al.,
1987), e novos mRNAs específicos pré-pedúnculo são encontrados no citoplasma
celular (Williams et al., 1987). O mecanismo pelo qual DIF induz 20 porcento das
células do plasmódio (grex) a tornar-se tecido peduncular ainda é controverso (veja
Early et al., 1995). DIF pode agir através da liberação de íons de cálcio de compartimen-
tos intracelulares no interior da célula (Schaulsky e Loomis, 1995). [other.html#intro3]
Embora DIF estimule amebas a tornarem-se células pré-pedúnculo, a diferencia-
ção de células pré-esporo é mais provavelmente controlada por pulsos contínuos
de cAMP. Altas concentrações de cAMP iniciam a expressão de mRNA pré-esporo
específico, em amebas agregadas. Além disso, quando lesmas são colocadas em um
meio contendo uma enzima que destrói cAMP extracelular, as células pré-esporo
perdem suas características de diferenciação (Figura 1.25; Schaap e van Driel, 1985;
Wang et al., 1988a,b).
(A)
(B)
Figura 1.25
Substâncias químicas que controlam a diferenciação em Dictyostelium. (A) e (C)
(B) mostram os efeitos de se colocar lesmas Dictyostelium em um meio
contendo enzimas que destroem cAMP extracelular. (A) Grex (pseudoplas-
módio) corado para presença de uma proteína pré-esporo específica (regiões
claras). (B) Grex semelhante corado após tratamento com enzimas que de-
gradam cAMP. Não é visto produto pré-esporo específico. (C) Amplifica-
ção maior de uma lesma tratada com DIF (na ausência de amônia). O corante
usado liga-se à parede de celulose das células pedunculares. Todas as células
do grex tornaram-se células pedunculares. (A e B de Wang et al., 1988a; C de
Wang e Schaap, 1989; cortesia dos autores.)
& Especulações
Como o Grex Sabe Qual Lado Está Para Cima

S E TODAS AS AMEBAS do grex
começarem no mesmo nível, como
podem células nos quatro-quintos
posteriores da lesma se diferenciar em cé-
da estão emanando da ponta apical do
agregado. Esses pulsos são quimiotácti-
cos para células pré-pedúnculo, mas não
para células pré-esporo, de modo que atra-
luz solar, cessa de migrar e sofre a diferen-
ciação final em esporos e pedúnculo. Du-
rante esse processo (chamado culmina-
ção), o grex se apóia em um dos terminais
lulas-esporo, enquanto células equivalen- em as células pré-pedúnculo para a ponta fazendo com que as células traseiras se
tes do quinto anterior se tornam células da agregado (Matsukuma e Durston, 1979; tornem sua base. Algumas células pstA
pedunculares? A resposta pode estar na Mee et al., 1986; Siegert e Weijer, 1991; migram para o tubo central de células pstB,
observação de que as células originais não Takeuchi, 1991).Portanto, o AMP cíclico e quando entram em contato com o tubo
são todas iguais. Amebas sujeitas à ina- parece ter várias funções no desenvolvi- central, diferenciam-se em células pstB, sin-
nição durante a parte precoce de seu cimento de Dictyostelium. Agrega as célu- tetizando componentes de uma nova matriz
clo celular tendem a se mover para a por- las umas às outras, induz diferenciação de extracelular. As células novas são adiciona-
ção anterior do pseudoplasmódio, en- células pré-esporo e dirige a migração de das à região anterior do tubo, forçando-o
quanto amebas expostas à inanição du- células pré-pedúnculo para a parte anteri- mais para dentro da estrutura culminativa.
rante o fim do ciclo, tendem a permanecer or do agregado. Esse tubo se diferencia para tornar-se o pe-
na porção posterior (McDonald e Durs- Uma vez completo, o agregado tomba dúnculo. Ao mesmo tempo, as células pstA
ton, 1984; Weijer et al., 1984). Esse traba- sobre um dos lados e forma o grex migra- que tinham ficado na região posterior do
lho foi confirmado e ampliado por Ohmori tório. A maioria das células pré-pedúncu-
e Maeda (1987), que mostraram que célu- lo estão nos 20 porcento anteriores do
Figura 1.26
las não-alimentadas durante a parte tar- grex, porém, há também algumas células
Regulação da diferenciação de células pedun-
dia do ciclo celular, respondem de manei- pré-pedúnculo espalhadas através da par-
culares durante a fase de culminação do cresci-
ra diferente ao cAMP e mostram adesivi- te posterior. Células pré-pedúnculo podem mento de Dictyostelium. Representação
dade muito mais alta que células jejuadas ser distinguidas pela sua secreção de pro- esquemática mostrando que células pré-esporo
imediatamente após a mitose. Williams e teína A da matriz extracelular para espa- e pré-pedúnculo estão em geral misturadas no
colaboradores (1989) acharam que célu- ços intercelulares. No centro da porção estágio precoce da agregação, mas se separam
las pré-esporo e pré-pedúnculo podem ser anterior do grex, um outro grupo de célu- de modo que a maioria das células pré-
diferenciadas em agregados precoces e las pré-pedúnculo começa a secretar uma pedúnculo se encontrem na parte anterior do
que estão distribuídas de modo aleatório segunda nova proteína (proteína B), para grex. As células pré-pedúnculo A constituem
através desses montes hemisféricos. As- sua matriz extracelular. Essas células são a maior parte do anterior do grex, com alguma
sim, as tendências para certos destinos chamadas células pré-pedúnculo B (pstB), células similares no posterior. Células pré-
foram estabelecidas até mesmo antes do enquanto a maioria das células pré-pedún- pedúnculo B são vistas na parte central da
grex começar a migrar. Dentro de cada agre- culo são conhecidas como células pré- porção anterior do grex. Nos estágios preco-
gado, a maioria das células pré-pedúncu- pedúnculo A (pstA) (Figura 1.26). Outro ces da culminação, as células pré-pedúnculo
lo, migram ativamente para o anterior, en- grupo de células pré-pedúnculo, as célu- do posterior migram para formar o disco basal
quanto células pré-esporo permanecem las pstO, estão espalhadas de maneira e os cálices do saco de esporos; as células pré-
no que se tornará a região posterior do esparsa através das células pré-esporo, e pedúnculo A do anterior migram para o centro
e se tornam células pré-pedúnculo B. Isso es-
grex. Essa migração provavelmente é de- migram mais lentamente em direção ao
tende o pedúnculo até que esse eleve a caixa de
vida a repetidos pulsos de cAMP que ain- anterior. Quando o grex se encontra na
esporos acima da superfície. (Segundo
Harwood et al., 1992).
Células pré-pedúnculo A Cálice superior

Células pré-pedúnculo B
Células pré-pedúnculo AB Células
Direção do movimento celular pré-esporo
Células pré-esporo Cálice
Pré-pedúnculo AB
Pré-pedúnculo AB Inferior Pré-pedúnculo AB
Pré-pedúnculo B
Guarda da Pré-pedúnculo A
retaguarda Disco basal interior
Disco basal exterior
Pré-pedúnculo B Pré-pedúnculo B
Agregado Grex Culminante precoce Culminante médio Culminante tardio

grex migram para as bordas da região pré- (Gross et al., 1983; Wang et al., 1990). passa a fosforilar um repressor que esta-
esporo e diferenciam-se no invólucro dos Bonner e colaboradores (1985), sugeriram va inibindo a expressão dos genes de di-
esporos e disco basal (Williams e Jermyn, que como a luz causa difusão mais rápida ferenciação do pedúnculo. No estado fos-
1991; Harwood et al., 1992). Finalmente, da amônia, remove o inibidor permitindo forilado, o inibidor é inativo. Portanto, uma
os esporos são levantados 2 mm acima assim, o progresso da culminação. vez que os níveis de cAMP se elevam (pela
do solo, de onde podem ser dispersos A amônia parece inibir a produção do remoção da amônia), a PKA pode inativar
pelo vento ou um animal que passa. pedúnculo pelos menos de duas manei- o inibidor dos genes formadores do pe-
O gatilho para a culminação parece ser ras. Inibe a ação de DIF (Wang e Schaap, dúnculo (Figura 1.27). [intro.4html]
a luz solar ou a baixa umidade. Experimen- 1989), e inibe a produção de cAMP nas
tos recentes sugerem que esses dois fa- células pré-pedúnculo (Schindler e Sus- Figura 1.27
tores causam a difusão de amônia da les- sman, 1977; Harwood et al., 1992). Esse Uma hipótese para a iniciação coordenada da
ma. A amônia é produzida copiosamente cAMP é necessário para ativar a proteína culminação e diferenciação de células
por lesmas migratórias e reprime a culmi- quinase cAMP-dependente (PKA). Célu- pedunculares em Dictyostelium. A luz solar
dissipa a amônia na parte anterior do grex,
nação. Sempre que a amônia estiver exau- las pré-pedúnculo contendo PKA não- permitindo maior produção de cAMP nas cé-
rida (quer naturalmente ou experimental- funcional, não fosforilam certas proteínas. lulas pré-pedúnculo. A concentração mais alta
mente), a culminação começa (Schindler e Essas células não migram para a região de cAMP ativa a PKA, que fosforila um
Sussman, 1977; Newell e Ross, 1982; central anterior, nem se diferenciam em inibidor da expressão gênica do pedúnculo. O
Bonner et al., 1985). A amônia inibe a con- células do pedúnculo (Firtel e Chapman, inibidor fosforilado não pode mais inibir os
versão de células pstA em pstB e proíbe a 1990; Harwood et al., 1992). Os dados genes pedúnculo-específicos. A seqüência pela
qual a formação de esporos é inibida, não está
continuação da formação do pedúnculo sugerem que quando PKA é ativada, clara. (Baseado em modelos de Bonner et al.,
1985, e Harwood et al., 1992)
cAMP
Amônia
Repressor ativo da
diferenciação e de Migração
genes de migração continuada
peduncular do grex
Luz solar PKA

inativa
cAMP
PKA
ativa
Transcrição
do gene da proteína B
da matriz extracelular;
Repressor inativo
migração de células
(fosforilado)
pré-pedúnculo;
diferenciação e
culminação peduncular
Padrões desenvolvimentais entre metazoários

Como o restante deste livro se ocupa do desenvolvimento de metazoários - animais
multicelulares que atravessam estágios embrionários de desenvolvimento - apre-
sentaremos um visão panorâmica dos seus padrões desenvolvimentais.* A Figura
1.28 ilustra os principais rumos evolutivos do desenvolvimento metazoário. A ob-
servação mais impressionante é que a vida não evoluiu segundo uma linha reta;
apresenta diversos caminhos evolutivos ramificados. Podemos ver que a maioria
das espécies de metazoários pertence a um de dois principais ramos de animais:
protostomatas e deuterostomatas.
*Plantas passam por padrões igualmente complexos e fascinantes de desenvolvimento embri-

onário e pós-embrionário. No entanto, o desenvolvimento das plantas difere significativamente
daquele dos animais; a inclusão de um tratamento abrangente do seu desenvolvimento teria dobrado
a extensão deste livro. Por isso, foi tomada a decisão de enfocar neste texto, o desenvolvimento dos
animais. Para uma revisão, veja Singer, 1997.
BILATERIA RADIATA PARAZOA
DEUTEROSTOMATAS PROTOSTOMATAS
Ascídios Moluscos Artrópodos Platel- Cnidários Poríferos

Nematelmintos
Vertebrados (Tunicados) Equinodermos Anelídeos mintos (Celenterados) (Esponjas)
Segmentados Não-segmentados
Larva
trocófora
Clivagem em
a
ad
espiral gastrulação
m
lo
protostosomal da
ce
ma
do
lo
eu
ce
Larva dipleura
ps
a
izo
ad
em
(tornária)
m
qu
elo
ag
es
ac
nh
em
Li
em
ag
ag
nh
Clivagem radial
nh
Li
gastrulação Li
deuterostomal
L
DIA
RA
SIMETRIA Platelmintos primitivos RIA
ET
BILATERAL (acelomados) SIM
Larvas planulóides
Protozoários coloniais
primitivos
Protistas flagelados
Figura 1.28
Principiais divergências evolucionárias em animais existentes. (Outros modelos são possíveis,
porém, os esquemas em geral são todos semelhantes ao mostrado aqui.)
Os Poríferos
Considera-se que os protistas coloniais deram origem, ao menos, a dois grupos de
metazoários, ambos passando por estágios embrionários. Um desses grupos é o Porífero
(esponjas). Esses animais desenvolvem-se de um modo tão diferente daquele de qual-
quer outro grupo de animais, que alguns taxonomistas sequer consideram-nos
metazoários (chamando-os, “parazoários”). Uma esponja tem três tipos principais de
células somáticas, mas um deles, o arqueócito, pode se diferenciar em todos os outros
tipos. As células de uma esponja quando passadas por uma peneira, podem regenerar
novas esponjas a partir de células individuais. Ainda mais, em alguns casos, tal re-
agregação é espécie-específica: se células individuais de esponja de duas espécies
diferentes forem misturadas, cada uma que se re-forma contém somente células de
uma espécie (Wilson, 1907). Nesses casos, admite-se que os arqueócitos móveis cole-
cionam células de sua espécie, mas não das outras (Turner, 1978). Esponjas não con-
tém mesoderma, não havendo portanto verdadeiros sistemas de órgãos em Porífero;
esses seres não têm tubo digestivo, sistema circulatório, nervos ou músculos. Assim,
apesar de passarem por estágios embrionários e larvais, esponjas são muito pouco
parecidos com a maioria dos metazoários (veja Fell, 1997).
Protostomatas e Deuterostomatas
O outro grupo de metazoários emergindo dos protistas coloniais é caracterizado pela
presença de três camadas germinativas durante o desenvolvimento. Alguns membros
do grupo constituem os Radiatas, assim chamados porque têm simetria radial tal como
um tubo ou uma roda. Os Radiatas incluem os cnidários (medusas, corais e hidras) e
ctenóforos (medusas de crista). Nesses animais, o mesoderma é rudimentar, consistin-
do de células escassamente disseminadas em uma matriz gelatinosa. Porém, a maioria
dos metazoários tem simetria bilateral, constituindo assim, os Bilaterias. Esses filos
bilaterais são classificados como platelmintos, protostomatas ou deuterostomatas.
Pensa-se que todos os Bilateria descendam de um tipo primitivo de platelminto. Esses
platelmintos foram os primeiros a ter mesoderma verdadeiro (embora não tivessem
ficado ocos para formar uma cavidade corpórea), e foram considerados parecidos com
as larvas de certos celenterados contemporâneos. Enquanto os platelmintos são des-
providos de celoma (cavidade corpórea), os nematelmintos (e rotiferas) têm uma cavi-
dade corpórea diferente daquela de todos os outros animais, por ser desprovida de
revestimento mesodérmico. A maioria dos filos são celomados, isto é, possuem uma
cavidade corporal revestida por mesoderma.
As diferenças entre as duas divisões de Bilateria estão ilustradas na Figura 1.29.
Protostomatas (do Grego, “boca primeiro”), incluem os filos dos moluscos, artrópodos
e vermes; são assim chamados porque a boca é formada em primeiro lugar, junto ou
próximo da abertura intestinal, produzida durante a gastrulação. O ânus se forma mais
tarde em outro local.
A cavidade corpórea desses animais se forma a partir de uma previamente sólida
corda de células mesodérmicas, tornadas ocas. A outra grande divisão dos Bilateria é
a linhagem dos deuterostomatas. Os filos nessa divisão incluem os chordatas e os
equinodermos. Embora possa parecer estranho classificar seres humanos e cavalos
no mesmo grupo que estrelas-do-mar e ouriços-do-mar, alguns traços embriológicos
acentuam esse parentesco. Em primeiro lugar, nos deuterostomatas (do Grego signifi-
cando “boca depois”), a abertura bucal é formada depois da abertura anal. Também,
enquanto prostostomatas em geral formam suas cavidades corpóreas tornando oco
um bloco sólido de mesoderma (formação esquizelóide), a maioria dos deuterostomatas
formam suas cavidades corpóreas a partir de bolsas mesodérmicas estendendo-se do
intestino (formação enterocélica). Porém, deve-se mencionar que há muitas exceções
a essas generalizações.
Protostomatas e deuterostomatas diferem na maneira pela qual são clivados. Na
maioria dos deuterostomatas, os blastômeros são perpendiculares ou paralelos uns aos
outros. Isso é chamado clivagem radial. Protostomatas ao contrário, têm uma extensa
variedade de tipos de clivagem. Muitas espécies formam blástulas compostas por célu-
las que estão em ângulos agudos relativamente ao eixo polar do embrião. São por isso
considerados sofrer clivagem espiral. Além disso, os blastômeros em estágio de clivagem,
na maioria dos deuterostomatas, têm maior capacidade de regular seu desenvolvimento
do que os prostostomatas. Se um único blastômero é removido de um embrião
quadricelular de ouriço-do-mar ou camundongo, tal blastômero irá desenvolver-se em
um organismo inteiro, e os três-quartos restantes do embrião também irão se desenvolver
(A) PROTOSTOMATAS (B) DEUTEROSTOMATAS
1. Clivagem espiral 1. Clivagem radial
2. Desenvolvimento esquizocélico 2. Desenvolvimento enterocélico
Celoma Celoma
Bolsa
Blastocele Blastocele
Intestinal
Mesoderma Bolsas se
se divide destacam
Mesoderma Mesoderma
Intestino Intestino Intestino Intestino
3. Tendência a não regulação 3. Tendência à regulação
Embrião de Um blastômero Desenvolvimento

de 4 células excluído interrompido Embrião de Um blastômero Duas larvas normais
de 4 células excluído se desenvolvem
Figura 1.29
Tendências principais dos prostostomatas e
normalmente. Porém, se a mesma operação fosse realizada em um embrião de lesma ou de deuterostomatas. Exceções à todas essas ten-
verme, tanto o blastômero isolado como os restantes se desenvolveriam em embriões dências gerais evoluíram secundariamente em
certos membros de cada grupo. (A maioria dos
parciais – cada um carente daquilo que foi formado a partir dos outros.
vertebrados por exemplo, não tem uma forma-
A evolução dos organismos depende de alterações herdadas em seu desenvolvi- ção estritamente enterocélica da cavidade cor-
mento. Um dos maiores avanços evolucionários – o ovo amniótico – ocorreu entre os poral; e os embriões de certos deuterostomatas,
deuterostomatas. Esse tipo de ovo, exemplificado pelo da galinha (Figura 1.30), é como os tunicados, não sofrem regulação se os
considerado ter-se originado dos ancestrais anfíbios dos répteis, há cerca de 255 blastômeros são deles removidos.)
milhões de anos. O ovo amniótico permitiu aos vertebrados vagar pela terra longe de
suprimentos de água existentes. Ao passo que a maioria dos anfíbios é obrigada a
voltar para a água para procriar e permitir o desenvolvimento de seus ovos, o ovo
amniótico carrega seu próprio suprimento de água e nutrientes. O ovo é fertilizado
internamente e contém a gema para nutrir o embrião em desenvolvimento. Ainda,
contém quatro bolsas: o saco vitelínico, que armazena proteínas nutrientes, o âmnio,
que contém fluido banhando o embrião, a alantóide, na qual restos do metabolismo
embrionário são coletados, e o cório, que interage com o ambiente externo, seletiva-
mente permitindo materiais chegar ao embrião. O todo dessa estrutura está contido em
uma casca que permite a difusão de oxigênio, ao mesmo tempo sendo suficientemente
dura para proteger o embrião de agressões ambientais. Desenvolvimento semelhante
de proteções do ovo permitiram aos artrópodes serem os primeiros invertebrados
sobre a terra. Assim, a travessia final dos limites entre água e terra ocorreu com a
modificação do estágio mais precoce do desenvolvimento – o ovo.
Figura 1.30 Embrião

Diagrama do ovo amniótico do pinto, mos- Intestino
trando o desenvolvimento das membranas en-
Âmnio
volvendo o embrião. (A) Incubação de três dias.
O mesoderma extra-embrionário se estende do Cavidade
embrião para prover vasos sangüíneos para e amniótica
de várias regiões fora do embrião. (B) Incuba-
Alantóide
ção de sete dias. A origem das membranas será
detalhada no capítulo 9. A gema será finalmen- Cório
te rodeada pelo saco vitelínico que permite a
entrada de nutrientes nos vasos sangüíneos. O Gema
cório é derivado em parte do ectoderma e es-
tende-se do embrião até a casca (onde irá tro- Saco vitelino
car oxigênio e gás carbônico e obter cálcio da Alantóide
casca). O âmnio prove o meio fluido no qual
(A) (B)
cresce o embrião, e a alantóide coleta resíduos
nitrogenados que seriam perigosos para o em-
brião. Finalmente, o endoderma se transforma
no intestino e envolve a gema. A evolução do
âmnio e das outras membranas extra-embrio- A biologia do desenvolvimento proporciona um sortimento infinito de fascinantes
nárias constituiu uma grande linha divisória problemas e animais. No presente livro, encontraremos apenas uma pequeníssima
entre aqueles vertebrados cuja reprodução está amostra deles, servindo para ilustrar os princípios mais importantes do desenvolvi-
ligada à água (anamniotas) e aqueles que po- mento animal (para uma cobertura mais completa da diversidade do desenvolvimento
dem se reproduzir em áreas secas (amniotas).
animal através dos filos, veja Gilbert e Raunio,1997). Estamos apenas observando o
conjunto das marés ao nosso alcance, enquanto todo o oceano do desenvolvimento
se estende à nossa frente. Após uma breve visão dos princípios genéticos e celulares
relevantes para a biologia do desenvolvimento, investigaremos os estágios precoces
da embriogênese animal: fertilização, clivagem, gastrulação e construção do plano do
corpo vertebrado. Capítulos posteriores se concentrarão nos mecanismos genéticos e
celulares pelos quais ele é elaborado. Embora uma tentativa de cobrir as variações
importantes que ocorreram no reino animal tivesse sido feita, um certo chauvinismo
deuterostossômico pode ter ficado aparente.
LITERATURA CITADA
Bergman, K., Goodenough, U. W., Coodenough, Bonner, J., Hay, A. and John, D. 1985. pH Firtel, R. A. and Chapman, A. L. 1990. A role
D. A., Jawitz, J. and Martin, H. 1975. Gametic affects fruiting and slug orientation in Dictyos- for cAMP-dependent protein kinase A in early
differentiation in ChIamydomonas reinhardtii. telium discoideum. J. Embryol. Exp. Morphol. Dictyostelium development. Genes Dev. 4:18-28.
II. Flagellar membranes and the agglutination 87: 207-213.
Fulton, C. 1977. Cell differentiation in Naegleria
reaction. J. Cell Biol. 67: 606-622.
da Silva, A. M. and Klein, C. 1990. Cell adhesion gruberi. Annu. Rev. Microbiol. 31: 597-629.
Beug, H., Gerisch, G., Kempff, S., Riedel, V. and transformed D. discoideum cells: Expression of
Fulton, C. and Walsh, C. 1980. Cell differentia-
Cremer, G. 1970. Specific inhibition of cell gp80 and its biochemical characterization. Dev.
tion and flagellar elongation in Naegleria
contact formation in Dictyostelium by univalent Biol. 140: 139-148.
gruberi: Dependence on transcription and
antibodies. Exp. Cell Res. 63: 147-158.
Early, A., Abe, T. and Williams, J. 1995. Evidence translation. J. Cell Biol. 85: 346-360.
Bonner, J. T. 1947. Evidence for the formation for positional differentiation of prestalk celIs
Garcia, E. and Dazy, A.-C. 1986. Spatial
of cell aggregates by chemotaxis in the develop- and for a morphogenetic gradient in Dictyoste-
distribution of poly(A) + RNA and protein
ment of the slime mold Dictyostelium discoi- lium. Cell 83: 91-99.
synthesis in Acetabularia mediterranea. Biol.
deum. J. Exp. Zool. 106: 1-26.
Faix, J., Gerisch, G. and Noegel, A. A. 1990. Cell 58: 23-29.
Bonner, J. T. 1957. A theory of the control of Constitutive overexpression of the contact A
Gilbert, S. F. aned Raunio, A. M. 1997. Embryo-
differentiation in the cellular slime molds. Q. glycoprotein enables growth-phase celIs of Dic-
logy: Constructing the Organism. Sinauer
Rev. Biol. 32: 232-246. tyostelium discoideum to aggregate. EMBO J. 9:
Associates, Sunderland, MA.
2709-2716.
Bonner, J. T., Berkley, D. S., Hall, E. M., Konijn,
Goodenough, U. W. and Weiss, R. L. 1975,
T. M., Mason, J. W., O’Keefe, G. and Fell, P. 1997. Porifera, the sponges. In S. F.
Gametic differentiation in ChIamydomonas rei-
Gilbert and A. M. Raunio (eds.), Embryology:
Wolfe, P. B. 1969. Acrasin, acrasinase and the nhardtii. III. Cell wall lysis and microfilament
Constructing the Organism. Sinauer Associates,
sensitivity to acrasin in Dictyostelium discoi- associated mating structure activation in wild-type
Sunderland, MA.
deum. Dev. Biol. 20: 72-87. and mutant strains. I. Cell Biol. 67: 623-637.
Cross, J., Bradbury, J, Kay, R. and Peacey, M. Krutch, J. W. 1956. The Great Chain of Life. Shaffer, B. M. 1975. Secretion of cyclic AMP
1983. Intracellular pH and the control of cell Houghton Mifflin, Boston. [pp. 28-29] induced by cyclic AMP in the cellular slime mold
differentiation in Dictyostelium discoideum. Dictyostelium discoideum. Nature 255: 549-552.
Loormis, W. F. 1988. Cell-cell adhesion in Dic-
Nature 303: 244-245.
tyostelium discoideum. Dev. Genet. 9: 549-559. Shaulsky, G. and Loomis, W. F. 1995. Mitochon-
Hämmerling, J. 1934. Über formbildended drial DNA replication but no nuclear DNA
Matsukuma, S. and Durston, A. J. 1979. replication during development. Proc. Natl.
Substanzen bei Acetabularia mediterranea, ihre
Chemotactic cell sorting in Dictyostelium dis- Acad. Sci. USA 92: 5660-5663.
rãumliche und zeitfiche Verteilung und ihre
coideum. J. Embryo1. Exp. Morphol, 5O:
Herkunft. Wílhelm Roux Arch. Entwicklungs- Siegert, F. and Weijer, C. J. 1989. Digital image
243-251.
mech. Org. 131: 1-81. processing of optical density wave propagation
McDonald, S. A. and Durston, A. J. 1984. The in Dictyostelium discoideum and analysis of the
Hartmann, M. 1921. Die dauernd agame Zucht
cell cycle and sorting out behaviour in Dictyos- effects of caffeine and ammonia. J. Cell Sci. 93:
von Eudorina elegans, experimentelle Beiträge
telium discoideum. J. Cell Sci. 66: 196-204. 325-335.
zum Be–fruchtungs-und Todproblem. Arch.
Protistk. 43: 223-286. Mee, J. D., Tortolo, D. M. and CoukelI, M. B. Siegert, F. and Weijer, C. J. 1991. Analysis of
1986. Chemotaxis -associated properties of optical density wave propagation anel cell
Harwood, A. J., Hopper, N. A., Simon, M.-N.,
separated prestalk and prespore celIs of Dic- movement in the cellular slime mould Disctyos-
Driscoll, D. M., Veron, M. and Williams, J. G.
tyostelium discoideum. Biochem. Cell Biol. telium discoideum. Physica D 49: 224-232.
1992. Culmination in Dictyostelium is regulated
64:722-732.
by the cAMP-dependent protein kinase. Cell Sies, H. 1988. A new parameter for sex education.
69: 615-624. Morris, H. R., Taylor, G. W., Masento, M. S., Nature 332: 495.
Jermyn, K. A. and Kay, R. R. 1987. Chemical Singer, S. 1997. Plant development. In S. F.
Jermyn, K. A. and Williams, J. 1991. An analysis
structure of the morphogen differentiation-in- Gilbert and A. M. Raunio (eds.), Embryology:
of culmination in Dictyostelium using prestalk
ducing factor from Dictyostelium discoideum. Constructing the Organism. Sinauer Associates,
and stalk-specific cell autonomous markers. De-
Nature 328: 811-814. Sunderland, MA.
velopment 111: 779-787.
Müllier, K. and Gerisch, G. 1978. A specific gly- Strickberger, M. W. 1985. Genetics, 3rd Ed.
Johnson, R. L., Gundersen, R., Lilly, P., Pitt, G.
coprotein as the target of adhesion blocking Fab Macmillan, New York.
S., Pupillo, M., Sun, T. J, Vaughan, R. A. and
in aggregating Dictyostelium cells. Nature 274:
Devreotes, P. N. 1989. G-protein-linked signal Sumper, M., Berg, E., WenzI, S. and Gocil, K.
445-447.
transduction systems control development in 1993. How a sex pheromone might act at a
Dictyostelium. Development [Supp1.1: 75-80. NewelI, P. and Ross, F 1982. Genetic analysis of concentration below 10-16 M. EMBO J. 12:
the slug stage of Dictyostelium discoideurn. J. 831-836.
Kay, R. R. and Jermyn, K. A. 1983. A possible
Genet. Microbiol. 128: 1639-1652.
morphogen controlling differentiation in Dic- Takeuchi, 1. 1991. Cell sorting and pattern for-
tyostelium. Nature 303: 242-244. Ohmori, T. and Maeda, Y. 1987. The develop- mation in Dictyostelium discoideum. In J.
mental fate of Dictyostelium discoideum cells Gerhart (ed.), Ce11-Cell Interactions in Early
Kay, R. R., Berks, M. and Traynor, D. 1989.
depends greatly on the cell-cycle position at the Development. Wiley-Liss, New York, pp.
Morphogen hunting in Dictyostelium. Develop-
onset of starvation. Cell Differ. 22:11-18. 249-259.
ment [Supp1.1: 81-90.
Pommerville, J. and Kochert, G. 1982. Effects Tomchick, K. J. and Devreotes, P. N. 1981.
Keller, E. F. and Segal, L. A. 1970. Initiation of Adenosine 3',5' monophosphate waves in Dictyos-
of senescence on somatic cell physiology in the
slime mold aggregation viewed as an instability. telium discoideum: A demonstration by isotope
green alga Volvox carteri. Exp. Cell Res. 14:
J. Theoret. Biol. 26: 399-415. dilution -fluorography. Science 212: 443-446.
39-45.
Kirk, D. L. 1988. The ontogeny and phylogeny Turner, R. S. Jr. 1978. Sponge cell adhesions. In
Powers, J. H. 1908. Further studies on Volvox,
of cellular differentiation in Volvox. Trends D. R. Garrod (ed.), Specificity of Embryological
with description of three new species. Trans.
Genet. 4: 32-36. Interactions. Chapman and HalI, London, pp.
Am. Micros. Soc. 28: 141-175.
Kirk, D. L. and Kirk, M. M. 1986. Heat shock 199-232.
elicits production of sexual inducer in Volvox. Raper, K. B. 1940. Pseudoplasmodium formati-
Tyson, J. J. and Murray, J. D. 1989. Cyclic AMP
Science 231: 51-54. on and organization in Dietyostelium discoi-
waves during aggregation of Dictyostelium
deum. J. Elisha Mitchell Sci. Soc. 56: 241-282.
Kirk, D. L., Viamontes, G. I., Green, K. J. and amoebae. Development 106: 421-426.
Bryant, J. L. Jr. 1982. Integrated morphogene- Robertson, A., Drage, D. J. and Cohen, M. H. 1972. Walsh, C. 1984. Synthesis and assembly of the
tic behavior of cell sheets: Volvox as a model. In Control of aggregation in Dictyostelium discoi- cytoskeleton of Naegleria gruberi flagellates.
S. Subtelny and P. B. Green (eds.), Developmen- deum by an external periodic pulse of cyclic J. Cell Biol. 98: 449-456.
tal Order: Its Origin and Regulation. Alan R. adenosine monophosphate. Science 175: 333-335.
Liss, New York, pp. 247-274. Wang, M. and Schaap, P. 1989. Ammonia
Schaap, P. and van Driel, R. 1985. The induction depletion and DIF trigger stalk cell differentia-
Kloppstech, K. and Schweiger, H. G. 1975. of post-aggregative differentiation in Dictyos- tion in intact Dictyostelium discoideum slugs.
Polyadenylated RNA from Acetabularia. Diffe- teiíum discoideum by cAMP. Evidence for in- Development 105: 569-574
rentiation 4:115-123. volvement of the cell surface cAMP receptor.
Exp. Cell Res. 159: 388-398. Wang, M., van Driel, R. and Schaap, P. 1988a.
Knecht, D. A., Fuller, D. and Loomis, W. F. Cyclic AMP-phosphodiesterase induces dediffe-
1987. Surface glycoprotein gp24 involved in Schindier, J. and Sussman, M. 1977. Ammonia rentiation of prespore celIs in Dictyostelium
early adhesion of Dictyostelium discoideum. Dev. determines the choice of morphogenetic discoideum slugs: Evidence that cyclic AMP is
Biol. 121: 277-283. pathways in Dictyostelium discoideum. J. Mol. the morphogenetic signal for prespore differen-
Biol. 116:161-169. tiation. Development 103: 611-618.
Konijn, T. M., van der Meene, J. G. C., Bonner,
J. T. and Barkley, D. S. 1967. The acrasin activity Shaffer, B. M. 1953. Aggregation in cellular
Wang, M., Aerts, R. J., Spek, W. and Schaap,
of adenosine -3´,5'-cyclic phosphate. Proc. Natl. slime molds: In vitro isolation of acrasin.
P. 1988b. Cell cycle phase in. Dictyostelium
Acad. Sei. USA 58: 1152-1154. Nature 171: 975.
discoideum is correlated with the expression of Williams, J. G. and Jermyn, K. A. 1991. Cell Williams, J. G., Duffy, K. T., Lane, D. P.,
cyclic AMP production, detection and degrada- sorting and positional differentiation during Dic- McRobbie, S. J., Harwood, A. J., Traynor, D.,
tion. Involvement of cAMP signalling in cell tyostelium morphogenesis. In J. Gerhart (ed.), Kay, R. R. and Jermyn, K. A. 1989. Origins of
sorting. Dev. Biol. 125:410-416. Ce11-Cell Interactions in Early Development. the prestalk-prespore pattern in Dictyostelium
Wiley-Liss, New York, pp. 261-272. development. Cell 59: 1157-1163.
Wang, M., Roelfsema, J. H., Williams, J. G. and
Schaap, P. 1990. Cytoplasmic acidification Williams, J. C., Ceccarelli, A., McRobbie, S., Wilson, E. B. 1896. The Cell in Development
facilitates but does not mediate DIF-induced Mahbubani, H., Kay, R. R., Early, A., Berks, M. and Inheritance. Macmillian, New York.
prestalk gene expression in Dictyostelium dis- and Jermyn, K. A. 1987. Direct induction of
Wilson, H. V. 1907. On some phenomena of
coideum. Dev. Biol. 140: 182-188. Dictyostelium pre-staIk gene expression. of DIF
coalescence and regeneration. in sponges. J. Exp.
provides evidence that DIF is a morphogen. Cell
Weijer, C. J., DuschI, G. and David, C. N. 1984. Zool. 5: 245-258.
49: 185-192.
Dependence of cell-type proportioning and
sorting on cell cycle phase in Dictyostelium dis-
coideum. Exp. Cell Res. 70: 133-145.
Genes e desenvolvimento:
Introdução e técnicas 2
O que gostaríamos de saber é se a estrutura
é determinada diretamente pela informação
codificada no DNA, gravada no ovo... na
extensão em que estrutura pode ser ex-
pressa por informação. JONATHAN
“E NTRE OS CARACTERES que fornecem os dados para a teoria, e os
genes postulados, aos quais os caracteres se referem, está todo o cam-
po do desenvolvimento embrionário”. Aqui Thomas Hunt Morgan (1926)
estava verificando que o único caminho de genótipo para fenótipo, passava através
de processos desenvolvimentais. No começo do século vinte, embriologia e genética
BARD (1990) não eram consideradas ciências separadas. Divergiram na década de 1920, quando
Morgan redefiniu a genética como a ciência que estuda a transmissão dos traços em
Os segredos que me enlaçam e cativam são oposição à embriologia, a ciência que estuda a expressão desses traços. Durante a
em geral segredos da hereditariedade: como última década, porém, as técnicas da biologia molecular realizaram uma reaproximação
uma semente de pêra vira uma pereira em entre embriologia e genética. Na realidade, os dois campos se ligaram novamente a tal
vez de um urso polar. CYNTHIA
ponto que se torna necessário uma discussão prévia da genética molecular neste
OZICK (1989)
texto. Questões do desenvolvimento animal que não poderiam ser consideradas há
uma década, estão sendo agora resolvidas por um conjunto de técnicas envolvendo
síntese de ácidos nucléico e hibridização. Este capítulo procura situar essas novas
técnicas dentro do contexto do diálogo, ora em curso, entre genética e embriologia.
As origens embriológicas da teoria dos genes

Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade?
Mendel chamou-os Formbildungelementen, elementos construtores de formas; nós os
chamamos de genes. Porém, é na terminologia de Mendel que vemos como no século
dezenove os conceitos de herança e desenvolvimento estavam intimamente entrelaça-
dos. Entretanto, as observações de Mendel não indicaram onde na célula ficavam esses
elementos hereditários, nem como eram levados a se expressarem. A teoria dos genes,
que viria a ser a pedra angular da genética moderna, teve origem em uma controvérsia no
campo da embriologia. Em fins século XIX, um grupo de cientistas começou a estudar,
por seu valor intrínseco, como ovos fertilizados davam origem a organismos adultos.
Dois jovens embriologistas americanos, Edmund Beecher Wilson e Thomas Hunt Morgan
(Figura 2.1), tornaram-se parte desse grupo de “embriologistas fisiológicos”, cada um
tornando-se partidário na controvérsia sobre qual dos dois compartimentos do ovo
fertilizado - o núcleo ou o citoplasma - controla a herança.
35
(B)
Figura 2.1
(A) E. B. Wilson (1856-1939; mostrado aqui em
aproximadamente 1899), um embriologista cujo
trabalho, na fase precoce da embriologia e da de-
terminação sexual, muito avançou as hipóteses
cromossômicas do desenvolvimento. (Wilson era
também reconhecido como um dos melhores vio-
loncelistas amadores do país.) (B) Thomas Hunt
Morgan (1866-1945), que desenvolveu a teoria
dos genes a partir da embriologia. Essa fotografia
- tomada em 1915, quando os elementos básicos
da teoria dos genes estavam se encontrando –
mostra Morgan usando uma lente manual para
identificar moscas. (A) cortesia de W. N. Timmins;
(B) cortesia de G. Allen.)
(A)
Quando Morgan e Wilson entraram nesse debate, a disputa já estava bem ativa.
Uma escola associada a Oskar Hertwig, Wilhelm Roux e Theodor Boveri, propunha
que os cromossomos do núcleo continham os elementos construtores de formas.
Esse grupo era desafiado por Eduard Pflüger, T. L. W. Bischoff, Wilhelm His e seus
colegas, que acreditavam que estruturas pré-formadas não poderiam causar tão enor-
mes mudanças durante o desenvolvimento; ao contrário, eles acreditavam que os
padrões herdados de desenvolvimento eram causados pela criação de novas molécu-
las do gameta interativo, citoplasmas. Morgan aliou-se a esse último grupo e obteve
dados que interpretou com sendo consistentes com o modelo citoplasmático da he-
rança. Em seu experimento mais crucial, ele removeu citoplasma do récem-fertilizado
ovo ctenóforo (geléia de crista). Em 1897 Morgan relatou:
Aqui, embora todo o núcleo de segmentação esteja presente, devido à perda de

parte do citoplasma, produz-se embriões com defeito... Parece não haver escape
da conclusão que no citoplasma, e não no núcleo, está o poder de diferenciação
dos estágios precoces do desenvolvimento.
CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 37
Wilson, nesse ínterim, tornou-se o maior proponente do ponto de vista de que os

elementos formadores se encontravam nos cromossomos nucleares. Defendeu
vigorosamente essa idéia em seu livro A Célula no Desenvolvimento e na Herança
(1896), salientando a necessidade da presença do núcleo para regeneração dos
protozoários (veja capítulo 1):
Esse fato presume que o núcleo é, se não o local da formação de energia, ao menos,
o fator controlador dessa energia e, por isso, o fator controlador da herança. Essa
conjectura transforma-se em certeza quando nos voltamos para os fatos da matu-
ração (meiose), fertilização e divisão celular. Todos convergem em direção da
conclusão de que a cromatina é o elemento essencial para o desenvolvimento.
Wilson (1895) não se esquivou das conseqüências dessa conclusão*
Agora, a cromatina é sabida ser intimamente semelhante, se não idêntica, à

substância conhecida como nucleína...que a análise demonstra ser um compos- (A)
to químico toleravelmente bem definido, composto de ácido nucléico (um com-
plexo ácido orgânico rico em fósforo) e albumina. E assim, chegamos à notável
conclusão que a herança pode, talvez, ser efetuada pela transmissão física de um
dado composto químico do progenitor para a descendência.
Wilson pensou que o material formador de órgãos que Morgan havia removido do
citoplasma de ovos de ctenóforo, já havia sido para ali secretado pelos cromossomos
nucleares (Wilson, 1894, 1904). Para Wilson (1905) “Os materiais citoplasmáticos pare-
cem ser apenas o meio imediato ou a causa eficiente da diferenciação, e ainda procu-
ramos sua determinação primária nas causas que residem mais profundamente.”
Parte do maior apoio para a hipótese cromossômica da herança estava vindo dos
estudos embriológicos de Theodor Boveri (Figura 2.2 A), um pesquisador na Estação
Biológica de Nápoles. Boveri fertilizou óvulos de ouriço-do-mar com altas concentra-
ções de seu espermatozóide e obteve ovos que haviam sido fertilizados por dois
espermatozóides. Na primeira clivagem, esses ovos formaram quatro pólos mitóticos e
dividiram o ovo em quatro, em vez de duas células (veja capítulo 4). Boveri então
separou os blastômeros e demonstrou que cada célula se desenvolvia anormalmente
e de maneiras diferentes por ter cada célula diferentes tipos de cromossomos. Assim,
Boveri declarou que cada cromossomo tinha uma natureza individual e o controle de (B)
diferentes processos vitais.
Figura 2.2
O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento O caráter singular do cromossomo foi mostra-
do por Boveri e Stevens. (A) Theodor Boveri
Em adição à evidência de Boveri, E. B. Wilson (1905) e Nettie Stevens (1905a,b) de- (1862-1915) cujo trabalho Wilson (1918) co-
monstraram uma correlação crítica entre cromossomos nucleares e o desenvolvimento mentou: “conseguiu a verdadeira fusão de
organizacional. Stevens (Figura 2.2B), uma ex- estudante de Morgan, mostrou que em citologia, embriologia e genética – um feito bi-
92 espécies de insetos (e um cordato primitivo), as fêmeas tinham dois cromossomos ológico que... não fica atrás de qualquer outro
sexo-específicos em cada núcleo (XX), enquanto machos tinham somente um cromos- de nosso tempo.” Fotografia tirada em 1908,
somo X (XY ou XO). Parecia que uma estrutura nuclear, o cromossomo X, estava quando os estudos cromossômicos e embrio-
controlando o desenvolvimento sexual** . Morgan discordou da interpretação de que lógicos de Boveri estavam no seu apogeu. (B)
Nettie M. Stevens (1861-1912), que treinou
tanto com Boveri como com Morgan, vista
*Note-se que Wilson está escrevendo sobre unidades construtoras de forma na cromatina aqui em 1904 quando era estudante de pós-
em 1896 – antes da redescoberta do trabalhos de Mendel ou do estabelecimento da teoria dos doutorado, realizando a pesquisa que correla-
genes. Para uma análise mais detalhada das interações entre Morgan e Wilson que levaram à cionou o número de cromossomos X com o
teoria dos genes, veja Gilbert (1978, 1987) e Allen (1986). desenvolvimento sexual. [(A) cortesia de
**
Baltzer, 1967; (B) cortesia do Instituto
Wilson era um dos amigos mais íntimos de Morgan, que considerava Stevens sua melhor
estudante de pós-graduação. Ambos estavam contra Morgan nessa questão. Mesmo assim,
Carnegie de Washington.]
Morgan apoiou inteiramente o pedido de Stevens para fundos de pesquisa, confirmando suas
qualidades como as melhores possíveis. Wilson escreveu uma elogiosa carta de recomendação,
apesar de saber que ela seria uma rival na pesquisa (veja Brush, 1978).
os cromossomos determinavam o sexo. Ao contrário, ele considerou o conjunto de

cromossomos como uma característica sexual secundária, controlada por alguma subs-
tância citoplasmática determinadora do sexo.
A “conversão” de Morgan para a hipótese cromossômica ocorreu depois de
obter dados contrários às suas teorias (veja Allen, 1978; Gilbert, 1978; Lederman,
1989). Enquanto criava Drosophila para uma série de experimentos sobre evolu-
ção, Morgan começou a obter várias mutações correlacionadas com o sexo. (Como
ele logo iria mostrar, mutações ligadas ao X apareciam antes de mutações em
outros cromossomos, porque defeitos no cromossomo X não são mascarados
pelo cromossomo homólogo no macho.) Em 1910, Morgan mostrou que os traços
para ambos sexos e cor branca dos olhos estão correlacionados de alguma manei-
ra com a presença de um dado cromossomo X; entretanto, evitou considerá-los
ligados fisicamente. Porém, em 1911mostrou que fatores reguladores da cor dos
olhos, cor do corpo, forma das asas e sexo segregavam-se juntos com o cro-
mossomo X, o que o levou a começar a visualizar os genes como fisicamente
ligados um ao outro no cromossomo. O embriologista Morgan tinha demonstra-
do que cromossomos nucleares eram responsáveis pelo desenvolvimento de
caracteres herdados. [gene1.html]
A cisão entre a embriologia e a genética

A evidência de Morgan proporcionou uma base material para o conceito do gene. A
genética havia sido, em geral, uma ciência empírica sobre procriação de animais e
plantas; Morgan deu-lhe um fundamento científico. Movida pelo desejo de progre-
dir no conhecimento da reprodução de animais e plantas (e seres humanos), e na
capacidade dos geneticistas de obter rapidamente resultados concretos e matemati-
camente verificáveis, a genética logo se tornou a ciência biológica predominante
nos Estados Unidos (veja Allen, 1986; Sapp, 1987; Paul e Kimmelman, 1988). Na
década de 1930, tornou-se disciplina autônoma, desenvolvendo seu vocabulário
próprio, revistas, sociedades, organismos favorecidos, professorados e regras de
evidência. Hostilidade entre embriologia e genética também emergiu. Os geneticis-
tas acreditavam que os embriologistas eram antiquados e que o desenvolvimento
viria a ser inteiramente explicado como o resultado da expressão gênica. Conforme
proclamado por Richard Goldschmidt (1938), “O desenvolvimento, obviamente, é a
produção ordenada de um padrão e assim, em última análise, os genes controlam o
padrão”. Se os embriologistas não olharem para a embriogênese em termos da ativi-
dade dos genes, os geneticistas o farão.
Reciprocamente, os embriologistas consideraram os geneticistas como irrelevantes
e mal-informados. Embriologistas como Frank Lillie (1927), Ross Granville Harrison
(1937), Hans Spemann (1938) e Ernest E. Just (1939) (Figura 2.3), argumentaram que
não poderia haver uma teoria genética do desenvolvimento até que ao menos três
principais desafios fossem resolvidos:
1. Os geneticistas teriam que explicar como cromossomos – que eram considera-

dos idênticos em cada célula do organismo – direcionam tipos diferentes e
variáveis de citoplasmas celulares.
2. Quase todos genes conhecidos na época afetavam a modelagem das etapas
finais (cor dos olhos, forma das cerdas, vascularização alar). Os geneticistas
teriam que produzir evidência que os genes controlam os estágios precoces da
embriogênese. Conforme enunciado por Just (citado por Harrison, 1937), os
embriologistas estavam interessados em saber como uma mosca forma o seu
dorso e não no número de cerdas no seu dorso.
3. Os geneticistas teriam que explicar fenômenos como a determinação do sexo
em certos invertebrados (e vertebrados, como répteis), nos quais o ambiente
determina o fenótipo sexual.
(A) (B)
Figura 2.3 (C)

Embriologistas tentaram impedir a genética de “conquistar” seu território na década de 1930.
(A) Frank Lillie encabeçou o Laboratório de Biologia Marinha em Woods Hole e foi um líder na
pesquisa sobre fertilização e endocrinologia reprodutiva. (B) Hans Spemann (à esquerda) e
Ross Harrison (à direita) aperfeiçoaram operações de transplante para descobrir quando eram
determinados os eixos do corpo e dos membros. Argumentaram que os geneticistas não possu-
íam um mecanismo para explicar como os mesmos genes nucleares podiam criar tipos celulares
diferentes durante o desenvolvimento. (C) Ernest E. Just fez descobertas cruciais sobre fertili-
zação. Rejeitou a genética e enfatizou o papel da membrana celular na determinação dos destinos
das células. (A cortesia de V. Hamburger; B cortesia de T. Horder; C cortesia do Laboratório de
Biologia Marinha, Woods Hole.)
O debate tornou-se deveras veemente. Numa retórica, refletindo as ansiedades

políticas do fim da década de 1930, Harrison (1937) alertou:
Agora que a necessidade de relacionar os dados da genética com a embriologia
está sendo usualmente reconhecida e a sede de conhecimento dos geneticistas
começa a impeli-los em nossa direção, não pareceria impróprio apontar para
um perigo dessa ameaçada invasão. O prestígio do sucesso desfrutado pela
teoria dos genes poderia facilmente tornar-se um obstáculo para a compreensão
do desenvolvimento, por dirigir nossa atenção exclusivamente para o genoma,
enquanto movimentos celulares, diferenciação e todos os processos desenvolvi-
mentais são de fato realizados pelo citoplasma. Já temos teorias que referem os
processos do desenvolvimento à ação dos genes e consideram toda performance
como nada mais que a consecução dos potenciais dos genes. Tais teorias são
totais e demasiadamente unilaterais.
Até que os geneticistas puderam demonstrar a existência de variantes herdadas du-

rante a fase precoce do desenvolvimento e até que os geneticistas tiveram uma bem-
documentada teoria sobre como os mesmos cromossomos podiam produzir diferentes
tipos de células, os embriologistas em geral não sentiram a necessidade de basear sua
embriologia na ação dos genes. [gene2.html]
Primeiras tentativas da genética do desenvolvimento

Porém, alguns cientistas acharam que nem a embriologia nem a genética estavam
completas uma sem a outra. Várias tentativas foram feitas para sintetizar as duas
disciplinas, mas sua primeira integração bem-sucedida veio no fim da década de
1930, por parte de dois embriologistas, Salome Gluecksohn-Schoenheimer (agora

S. Gluecksohn Waelsch) e Conrad Hal Waddington. Ambos haviam sido treinados
em embriologia na Europa e tinham aprendido genética nos Estados Unidos com
estudantes de Morgan. Gluecksohn-Schoenheimer e Waddington, tentaram achar
mutações que afetassem o desenvolvimento precoce e processos afetados por es-
ses genes. Gluecksohn-Schoenheimer (1938, 1940) mostrou que mutações nos genes
de Brachyury do camundongo, causavam desenvolvimento aberrante da porção
posterior do embrião, e atribuiu os efeitos desses genes mutantes a defeitos no
mesoderma axial que normalmente teriam ajudado a induzir o eixo dorsal.* Além
disso, Gluecksohn-Schoenheimer (1938) considerou que no trabalho com camun-
dongos não era possível fazer o que os embriologistas experimentais deveriam estar
fazendo - alterando a estrutura durante seu desenvolvimento e observando quais
eram as conseqüências dessa operação. Em vez disso, um novo tipo de cientista era
necessário, o geneticista do desenvolvimento:
Enquanto o embriologista experimental desenvolve um dado experimento e em
seguida estuda seus resultados, o geneticista do desenvolvimento tem que estu-
dar primeiro o desenrolar do desenvolvimento (isto é, os resultados da pertur-
bação do desenvolvimento) para depois, às vezes, chegar a conclusões sobre a
natureza do “experimento” realizado pelo gene.
Ao mesmo tempo, Waddington (1939) isolava diversos genes que causavam mal-
formações alares na mosca das frutas, Drosophila. Também analisava como esses
genes podiam afetar os primórdios que dão origem a essas estruturas. A asa da Droso-
phila, conforme proclamou corretamente, “parecia favorável para pesquisas sobre a
ação desenvolvimental dos genes”. Assim, uma das principais objeções ao modelo
genético do desenvolvimento levantadas pelos embriologistas - que os genes atuam
somente sobre a modelagem final do embrião e não sobre seus principais esquemas de
construção – foi contrariada. [gene3.html]
Evidência para a equivalência genômica

Ainda permanecia uma outra grande objeção para uma embriologia baseada na genéti-
ca: Como poderiam genes nucleares dirigir o desenvolvimento se os genes eram os
mesmos em cada tipo celular? Essa equivalência genômica não estava provada mas
era assumida (porque cada célula é o descendente mitótico do ovo fertilizado) e um
dos primeiros problemas da genética do desenvolvimento era o de determinar se cada
célula de um organismo tinha o mesmo genoma que outra.
Metaplasia
A primeira evidência para equivalência genômica veio após a 2a Guerra Mundial, por
parte de embriologistas que estavam estudando a regeneração de tecidos excisados.
O estudo da regeneração do olho da salamandra demonstrou que mesmo células
adultas diferenciadas podem reter o seu potencial de produzir outros tipos celulares.
Portanto, os genes para os produtos desses outros tipos de células devem ainda estar
presentes, embora normalmente não expressos. Na salamandra, a remoção da retina
*As observações de Gluecksohn-Schoenheimer levaram 60 anos para ser confirmadas através

da hibridização do DNA. No entanto, quando o gene do T-locus foi clonado e sua expressão
detectada pela técnica da hibridização in situ (discutida mais adiante neste capítulo), Wilkinson e
colaboradores (1990) acharam que “a expressão do gene T tem um papel direto nos eventos
precoces da formação do mesoderma e na morfogênese da notocorda”. Embora uma história
completa do desenvolvimento precoce da genética do desenvolvimento ainda permaneça por ser
escrita, mais informações sobre suas turbulentas origens podem ser encontradas em Oppenheimer,
1981; Sander, 1986; Gilbert, 1988, 1991, 1996; Burian et al., 1991; Harwood, 1993; Keller, 1995;
e Morange, 1996.
neural promove sua regeneração a partir da retina pigmentada, e uma nova lente pode
ser formada a partir das células da íris dorsal. A regeneração do tecido lenticular da íris
(a assim chamada regeneração Wolffiana a partir da pessoa que primeiro a observou
em 1894) foi intensamente estudada. Yamada e seus colegas (Yamada, 1966, Dumont e
Yamada, 1972) acharam que após a remoção de uma lente, uma série de acontecimentos
leva à produção de uma nova lente a partir da íris (Figura 2.4). Os núcleos do lado
dorsal da íris começam a sintetizar quantidades enormes de ribossomos, seu DNA se
replica, e divisões mitóticas se sucedem. As células da íris pigmentada começam, em
seguida, a se desdiferenciar expelindo seus melanossomos (os grânulos pigmentados
que dão ao olho a sua cor; esses melanossomos são ingeridos por macrófagos que
entram no local da ferida). A íris dorsal continua a se dividir, formando um globo de
tecido desdiferenciado na região da lente removida. Essas células começam então a
sintetizar os produtos diferenciados de células lenticulares, as proteínas do cristali-
no. Essas proteínas são fabricadas na mesma ordem que no desenvolvimento normal
da lente. Uma vez formada uma nova lente, as células do lado dorsal da íris cessam sua
atividade mitótica.
Esses eventos não são a via normal pela qual a lente dos vertebrados é formada.
Como será visto em detalhe mais tarde, a lente normalmente se desenvolve a partir de
uma camada de células epiteliais da cabeça, induzida pelas células retinais precursoras
subjacentes. A formação da lente por células diferenciadas da íris representa metaplasia
(ou transdiferenciação), a transformação de um tipo celular diferenciado em outro
(Okada, 1991). A íris da salamandra, portanto, não havia perdido gene algum daqueles
usados na diferenciação das células da lente.
Retina Retina
pigmentada neural
Íris dorsal
Figura 2.4
Lente Regeneração Wolffiana da lente da salamandra
a partir da margem dorsal da íris. (A) Olho
normal, não-operado no estágio larval da sala-
Íris mandra Notophtalmus viridiscens. (B-G) Re-
ventral generação da lente, vista respectivamente nos
dias 5, 7, 9, 16, 18 e 30. A nova lente estará
completa no dia 30. (de Reyer, 1954, cortesia
de R. W. Reyer.)
(A) (B) (C)
(D) (E) (F) (G)

Clonagem de Anfíbios: A Restrição da Potência Nuclear

O teste definitivo sobre se, ou não, o núcleo de uma célula diferenciada sofreu qual-
quer restrição funcional irreversível, seria o de conseguir que esse núcleo gerasse
todo outro tipo de célula diferenciada no organismo. Se cada núcleo fosse idêntico ao
núcleo do zigoto, o núcleo de cada célula deveria ser capaz de direcionar todo o
desenvolvimento do organismo, quando transplantado para um ovo ativado enucleado.
Porém, antes que tal experimento pudesse ser feito, três técnicas tiveram que ser
aperfeiçoadas: (1) um método para enuclear ovos do hospedeiro sem destruí-los; (2)
um método para isolar núcleos doadores intactos; (3) um método para transferir tais
núcleos para dentro do ovo sem danificar o núcleo ou o oócito.
Essas técnicas foram desenvolvidas na década de 1950, em primeiro lugar por
Robert Briggs e Thomas King que combinaram a enucleação com a ativação do ovo.
Quando um oócito de rã-leopardo (Rana pipiens) é perfurado com uma agulha limpa
de vidro, o ovo sofre todas as mudanças citológicas e bioquímicas associadas à
fertilização. Ocorre rearranjo citoplasmático interno e a finalização da meiose perto
do pólo animal da célula. Esse fuso meiótico pode ser facilmente localizado quando
empurra os grânulos pigmentados do pólo animal; a punção do oócito nesse local
induz o fuso e seus cromossomos a fluir para fora do ovo (Figura 2.5). O ovo hospe-
deiro é agora considerado estar ativado (as reações de fertilização necessárias para
iniciar o desenvolvimento foram completadas) e enucleado. A passagem de um nú-
cleo para o ovo é conseguida pela ruptura de uma célula doadora e transferência do
núcleo liberado para o oócito por meio de uma micropipeta. Algum citoplasma acom-
panha o núcleo para seu novo lar, mas a razão do citoplasma doador para o receptor
é somente de 1:105, e o citoplasma do doador não parece afetar o resultado dos
experimentos. Em 1952, Briggs e King demonstraram que núcleos da célula da blás-
tula podiam direcionar o desenvolvimento de girinos completos quando transferi-
dos para o citoplasma do oócito.
O que acontece quando núcleos de estágios mais avançados são transferidos
para oócitos ativados e enucleados? Os resultados de King e Briggs (1956) estão
delineados na Figura 2.6. Enquanto a maioria dos núcleos da blástula podiam produzir
girinos completos, houve um dramático decréscimo da capacidade dos núcleos deri-
vados de estágios mais tardios direcionar o desenvolvimento direto até o estágio de
Pólo animal Fuso

Agulha de vidro meiótico isolado
Micropipeta
Fuso Grânulos Remoção dos cromossomos Ovo ativado Extração e lise da Núcleo doador
meiótico pigmentados e do fuso da célula enucleado célula doadora inserido na célula
enucleada
Figura 2.5
Procedimento para o transplante de núcleos da Membrana
blástula para ovos ativados enucleados de Rana cicatriza
pipiens. As dimensões relativas do fuso meiótico
foram exageradas para demonstrar a técnica. A
bela R. pipiens na fotografia foi derivada dessa
maneira. (Segundo King, 1966; fotografia corte-
sia de M. DiBerardino e N. Hoffner.)
Estágio desenvolvimental dos embriões e girinos Figura 2.6

dos quais foram retirados os núcleos Gráfico de transplantes nucleares bem sucedidos, em fun-
a l
ud
ção da idade do desenvolvimento nuclear. A abscissa repre-
ca co senta o estágio no qual o núcleo doador (de R. pipiens) foi
e o to ía
a oc a br m ard isolado e inserido no oócito ativado e enucleado. A ordena-
nucleares que se desenvolvem normalmente
r di ec r di m co o c
pr
Porcentagem de embriões de transplantes
ta ta c o s t da mostra a porcentagem desses transplantes capazes de

ul
a
ul
a
ul
a la os no e n
st tr tr ru n iri t i m produzir blástulas que podiam em seguida direcionar o de-
á ás ás êu ir i G
ba
Bl G G N G senvolvimento para o estágio do girino nadador (Segundo
McKinnell, 1978.)
Girinos (Rana pipiens)

nadando normalmente
Horas a 18oC
girino. Quando núcleos de células somáticas de girinos no estágio de broto caudal

foram usados como doadores, não ocorreu desenvolvimento normal. Porém, núcle-
os de células germinativas de girinos do estágio de broto caudal (que irão finalmen-
te dar origem a um organismo completo após a fertilização), foram capazes de
direcionar desenvolvimento completo em 40 porcento das blástulas que se desen-
volveram (Smith, 1956). Assim, células somáticas parecem perder sua capacidade de
direcionar desenvolvimento completo à medida que se tornam definidas e diferenci-
adas, e a progressiva restrição da potência nuclear durante o desenvolvimento
parece ser uma regra geral. Porém, é possível que alguns núcleos celulares diferen-
ciados sejam diferentes de outros.
Clonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células Somáticas

John Gurdon e seus colegas, usando métodos ligeiramente diferentes de transplante
nuclear na rã Xenopus, obtiveram resultados sugerindo que os núcleos de algumas
células diferenciadas podem permanecer totipotentes. Gurdon também achou uma
progressiva perda de potência no decorrer do desenvolvimento, embora células de
Xenopus tenham retido suas potências por um período de desenvolvimento mais
longo (Prancha 1). As exceções a essa regra mostraram ser muito interessantes. Gurdon
havia transferido núcleos do endoderma intestinal de girinos Xenopus que se alimen-
tavam, para ovos ativados enucleados. Esses núcleos doadores continham um
marcador genético (um nucléolo por célula, em lugar dos dois usuais), que os distin-
guia dos núcleos do hospedeiro. Entre 276 núcleos transferidos, somente 10 (1.4
porcento) promoveram o desenvolvimento até o estágio do girino que se alimentava.
Transplantes seriados (que requeriam colocar um núcleo intestinal em um ovo e quan-
do o ovo tinha se transformado em blástula, transferia-se o núcleo da blástula para
vários outros ovos), aumentavam o rendimento para 7 porcento (Gurdon, 1962). Em
alguns casos, núcleos das células intestinais dos girinos foram capazes de gerar todas
linhagens de células – neurônios, células do sangue, nervos e assim por diante – de
um girino vivente. Além disso, sete desses girinos (de dois núcleos originais) se
metamorfosearam em rãs adultas férteis (Gurdon e Uehlinger, 1966); esses núcleos
eram totipotentes (Figura 2.7).
King e seus colegas criticaram esses experimentos assinalando que: (1) não havi-
am sido tomadas suficientes precauções para ter certeza que células germinativas
primordiais, que podem migrar até o intestino, não foram usadas como fontes de
núcleos, e (2) as células intestinais de um girino tão jovem poderiam não se qualificarem
Figura 2.7 EXPERIMENTO

Procedimento empregado para obter rãs ma- Ovo não-fertilizado Girino
duras de núcleos intestinais de girinos de Xe- (cepa 2 – nu) (cepa 1 – nu)
nopus. O ovo de tipo selvagem (2 nucléolos
por núcleo; 2-nu) é irradiado para destruir os
cromossomos maternos, e um núcleo intesti-
nal de um girino marcado (1-nu) é inserido. Em
alguns casos não ocorre divisão; em alguns ca- Núcleo intestinal
Irradiação UV destrói epitelial é inserido
sos o desenvolvimento do embrião é sustado;
comossomos do ovo no ovo irradiado
porém, em outros casos, uma rã inteiramente
nova é formada tendo um genótipo 1-nu. (Se-
gundo Gurdon, 1968, 1977.) Micropipeta
Ovo receptor Núcleo intestinal

irradiado
RESULTADOS
Blástula Blástula Blástula Sem divisão
Girino Girino
(morre)
Embrião
anormal
Rã adulta
(Cepa 1 – nu)
como um tipo de célula verdadeiramente diferenciada porque células de girinos que se

alimentam ainda contêm plaquetas de gema (DiBerardino e King, 1967; McKinnell,
1978; Briggs, 1979). Para responder a essas críticas, Gurdon e seus colegas cultivaram
células epiteliais da membrana natatória de rãs adultas. Essas células mostraram estar
diferenciadas; cada uma continha queratina, a proteína característica de células adul-
tas da pele. Quando núcleos dessas células foram transferidos para oócitos ativados
e enucleados de Xenopus, nenhum dos transferidos de primeira geração progrediu
além da formação do tubo neural, pouco após a gastrulação. Por transplantes seria-
dos, porém, numerosos girinos foram gerados (Gurdon et al., 1975). Embora esses
girinos tivessem morrido antes de atingir o estado alimentar, um único núcleo celular
diferenciado ainda retinha potências incríveis. Um único núcleo derivado de uma
hemácia de uma rã adulta (que nem se replica e nem sintetiza RNA) pode sofrer mais de
100 divisões após ser transplantado para um oócito ativado e, ainda, reter a habilidade
de gerar girinos natatórios (Orr et al., 1986; DiBerardino, 1989). Embora DiBerardino
(1987) tenha observado que “até o presente, núcleo algum de uma célula
documentadamente especializada, nem de uma célula adulta tenha mostrado ser
totipotente”, tal núcleo pode no entanto instruir a formação de todos os órgãos do
girino natatório.
Algumas das diferenças entre os resultados dos laboratórios de Briggs e de Gurdon,
podem envolver diferenças na fisiologia do desenvolvimento das rãs Rana e Xenopus.
Quando se transfere um núcleo de uma célula diferenciada para o citoplasma do oócito,
se está pedindo ao núcleo para reverter para condições fisiológicas às quais ele não
está acostumado. Os núcleos da clivagem das rãs dividem-se rapidamente, enquanto
alguns núcleos de células diferenciadas dividem-se raramente, se tanto. Falhas em
replicar DNA rapidamente podem levar a quebras cromossômicas: tais anormalidades
foram vistas em muitas células de girinos clonados. Sally Hennen (1970) mostrou que
o sucesso desenvolvimental de núcleos doadores pode ser ampliado tratando-se
esses núcleos com espermina e resfriando os ovos para dar tempo ao núcleo de se
adaptar ao citoplasma do ovo. Acredita-se que a espermina remova histonas da
cromatina podendo “re-acertar” a atividade dos núcleos. Quando núcleos do endoderma
de girinos de Rana pipiens, no estágio de broto caudal, foram tratados dessa maneira,
62 porcento daqueles núcleos que iniciaram desenvolvimento normal, prosseguiram
até a geração de girinos normais. Em animais controle, nenhum dos núcleos conse-
guiu gerar tais girinos. Assim, os genes para o desenvolvimento do girino completo
não pareceram ter sido perdidos pelas células do endoderma.
Podemos olhar para esses experimentos de clonagem de anfíbios de duas manei-
ras. Primeiro, reconhecer uma restrição geral de potência concomitante ao desenvolvi-
mento. Segundo, facilmente ver que o genoma da célula diferenciada é notavelmente
potente em sua habilidade de produzir todos os tipos celulares do girino anfíbio. Em
outras palavras, mesmo existindo um debate sobre a totipotência de tais núcleos,
existe pouca dúvida de que eles são extremamente pluripotentes. Certamente, muitos
genes não usados na pele ou em células sangüíneas, podem ser reativados para
produzir os nervos, o estômago, ou o coração de um girino natatório. Assim, cada
núcleo no corpo contém a maioria (se não todos) dos mesmos genes.
& Especulações
Clonando Mamíferos por Prazer e Lucro
C LONAR SERES HUMANOS a

partir de células previamente di-
ferenciadas parece ser o objeti-
vo de editores de jornais e novelistas.
dessem ser geradas de núcleos diferencia-
dos, essa habilidade não poderia ser
extrapolada para células humanas. Além
das dificuldades éticas e técnicas do tra-
1983). Esses zigotos reconstruídos come-
çam a se dividir e são então implantados
no útero. Os camundongos resultantes exi-
bem o fenótipo do núcleo doador. Enquan-
Deve ter ficado óbvio da discussão pre- balho com o organismo humano, o cito- to mais de 90 porcento dos zigotos enucle-
cedente que clonar um indivíduo total- plasma do oócito humano pode não res- ados do camundongo, recebendo pronú-
mente desenvolvido, a partir de células ponder a sinais emitidos por um núcleo de cleos de outros zigotos, se desenvolvem
diferenciadas, é uma formidável tarefa. uma célula em estágio avançado. Trans- até o blastócito (blástula), nem um único
Mesmo em anfíbios, os núcleos das célu- plante nuclear foi conseguido em camun- embrião (de 81), desenvolveu-se até esse
las diferenciadas não foram capazes de dongos, pela remoção de pronúcleos estágio quando núcleos de embriões de 4
gerar animais adultos quando colocados (haplóides) de espermatozóide e óvulo de células foram transferidos para zigotos
em células ativadas e enucleadas. um zigoto, e substituição por pronúcleos enucleados (McGrath e Solter, 1984). Simi-
Além disso, mesmo se rãs adultas pu- de outro (Figura 2.8; McGrath e Solter, larmente, núcleos de embriões de 8 células
(A) (C) po de ativação e implantação uterina. Usan-

do modificações técnicas, Willadsen (1986)
produziu carneiros de termo completo a
partir de núcleos transplantados de blas-
tômeros do estágio de 8 células; núcleos
de embriões pré-implantados de gado, por-
cos e coelhos foram capazes de direcionar
o desenvolvimento completo quando
(B) (D) transplantados para oócitos ativados e
enucleados (Prather et al., 1987; Stice e
Robl, 1988; Prather et al., 1989; Willadsen,
1989). Porém, em todos esses casos, os nú-
cleos vieram de embriões pré-implantados.
Recentemente, Wilmut e colaboradores
(1997) mostraram que é possível clonar um
carneiro a partir de um núcleo de célula de
glândula mamária adulta. Esse resultado
Figura 2.8 Procedimento para transferir núcleos para o ovo ativado enucleado de mamifero.
Um embrião de célula única, incubado em colcemida e citocalasina para relaxar o citoesquele- poderá ter importantes conseqüências agrí-
to, é seguro com uma pipeta de sucção. Os núcleos haplóides derivados do espermatozóide e colas e legais (Prather, 1991). [gene4.html]
do óvulo, não se juntaram ainda. A pipeta de enucleação perfura a zona pelúcida (a proteína
que envolve o ovo) e aspira a membrana celular adjacente e a área da célula contendo os Clonagem de Plantas
pronúcleos. (A) A pipeta de enucleação é retirada e o citoplasma contendo os pronúcleos é Somente nas plantas os núcleos de célu-
removido do ovo. A membrana celular não está rompida; a continuidade do citoplasma limita- las diferenciadas de organismos adultos
do pela membrana está indicada pela flexa. (B) A membrana celular forma uma vesícula ao podem ser facilmente vistos como capa-
redor dos pronúcleos no interior da pipeta de enucleação. (C) Essa vesícula é misturada com zes de direcionar o desenvolvimento de
vírus Sendai (que induz a fusão de membranas nucleares) e é inserida no espaço entre a zona outro organismo adulto. Essa habilidade
pelúcida e o outro ovo enucleado. (D) O vírus Sendai proporciona a fusão do ovo enucleado foi dramaticamente demonstrada em célu-
e os pronúcleos envoltos pela membrana, permitindo que os pronúcleos (flexa) penetrem na las de cenouras ou tabaco. Em 1958, F. C.
célula. (Segundo McGrath e Solter, 1983; cortesia dos autores.) Steward e seus colegas estabeleceram um
processo pelo qual os tecidos diferencia-
e massa celular interna (os blastômeros que (cujas células são totipotentes) não dão dos de raízes de cenouras podiam dar ori-
formam o embrião, mas não a placenta*) suporte para o desenvolvimento total. Tais gem a toda uma nova planta (Figura 2.9).
também não puderam apoiar o desenvolvi- experimentos provavelmente fracassam Pequenos pedaços de floema são isola-
mento. Em contraste com núcleos de ouri- porque núcleos de blastômeros não funci- dos da cenoura e rodados em grandes
ços-do-mar ou anfíbios, os núcleos dos onam de maneira normal no citoplasma frascos contendo leite de coco. Esse flui-
blastômeros precoces do camundongo zigótico. Por isso, a clonagem de Elvis do (é realmente o endosperma da semen-
Presley a partir de células diferenciadas não te do coco) contém os fatores e nutrien-
*Cada blastômero da massa celular interna
é algo com que possamos contar. tes necessários para o crescimento da
é totipotente no sentido de reter sua capacida-
de de formar células de qualquer tipo no orga- Nem todos blastômeros mamíferos planta e os hormônios exigidos para a
nismo. Essa capacidade permite o aparecimen- são os mesmos, todavia, as espécies diferenciação. Sob essas condições, os
to de gêmeos. mamíferas diferem muito em termos de tem- tecidos proliferam e formam uma massa
Figura 2.9
Experimento de Steward demonstrando a
totipotência de células do floema da cenoura.
Células livre do calo

continuam a se desenvolver
em suspensão
Floema
de raiz
Corte Planta
Planta de Proliferação de
transversal jovem
cenoura massa celular
da raiz
madura (calo) em meio Planta embrionária
de cultura de transferida para meio Planta de cenoura
leite de coco de cultura de agar madura no agar
desorganizada chamada calo. A continu- de cenoura completa e fértil (Steward et são destacadas como uma linhagem dis-
ação da rotação leva ao desbastamento al., 1964; Steward, 1970). tinta de células no início do desenvol-
de células individuais do calo para o meio Porém, plantas e animais se desen- vimento), as plantas normalmente deri-
de suspensão. Essas células dão origem volvem de maneira diferente; a propa- vam seus gametas de células somáticas.
a nódulos celulares semelhantes a raízes gação vegetativa de plantas por corte Portanto, não é tão surpreendente que
que continuam a crescer enquanto per- (i.e, porções de plantas que quando nu- uma única célula de uma planta possa
manecem em suspensão. A partir desses tridas, regeneram as partes faltantes) é se diferenciar em outros tipos de célu-
nódulos, colocados em um meio solidifi- uma prática agrícola comum. Além dis- las e formar um clone geneticamente
cado com agar, o resto da planta é capaz so, em contraste com anfíbios e mamífe- idêntico (clone, do grego klon, signifi-
de se desenvolver, formando uma planta ros (nos quais as células germinativas cando “ramo”).
Sobre E. coli e elefantes: O modelo operon

Na maioria dos casos estudados, o genoma é o mesmo de célula para célula no orga-
nismo. Os genes para a proteína globina podem ser encontrados em células da pele, e
os genes para as queratinas da pele podem ser encontrados em neurônios cerebrais.
Porém, isso ainda deixa sem resposta outra grande questão levantada pelos
embriologistas: Se o núcleo de cada célula no organismo tem os mesmos genes, como
podem esses genes fazer com que essas células se tornem diferentes? *Pouco tempo
após a 2a Guerra Mundial, muitos biologistas concordaram que:
a maior lacuna, ainda para ser preenchida, entre dois campos da pesquisa em
biologia é provavelmente aquela entre a genética e a embriologia. É o problema
repetidas vezes declarado, porém, até agora não resolvido, de como células com
genomas idênticos podem se tornar diferenciadas, adquirir a propriedade de
confeccionar moléculas com novos, ou no mínimo, diferentes padrões ou confi-
gurações específicos.
Curiosamente, essa citação vem de Jacques Monod (1947), um geneticista

microbiano trabalhando na síntese de enzimas adaptativas, que são proteínas que
embora não sejam usualmente sintetizadas por bactérias ou levedos, serão sinte-
tizadas se os microorganismos encontrarem um novo substrato. Por exemplo, a
bactéria Escherichia coli só sintetiza β-galactosidase e outras enzimas digestoras
de lactose, quando encontram a lactose. Se a lactose está ausente do citoplasma,
essas enzimas não são sintetizadas. Mas, com a introdução de lactose no citoplasma,
esse grupo de novas enzimas aparecem. Em micróbios, ao menos, o mesmo genoma
pode produzir dois estados citoplasmáticos funcionalmente diferentes, depen-
dendo da presença ou não de determinado composto (no caso, a lactose). Monod
lançou a hipótese que o fenômeno da adaptação enzimática podia oferecer a solu-
ção para o problema de como genomas idênticos podem sintetizar diferentes mo-
léculas “específicas”.
*A grande exceção a essa regra da constância dos genes – os genes das imunoglobulinas – é
discutida no Capítulo 10. Cada célula tem todas as subunidades gênicas das imunoglobulinas, mas em
linfócitos, algumas dessas subunidades estão rearranjadas ou mesmo suprimidas do genoma. O
terceiro desafio - a explicação de como o ambiente pode direcionar o desenvolvimento – foi
prontamente compreendida, uma vez que a explicação geral para a expressão diferencial da expres-
são gênica foi estabelecida. Conforme veremos, o modelo do operon demonstrou como uma
substância do ambiente podia efetuar a expresão gênica diferenciada.
Monod não foi o único cientista a achar que micróbios unicelulares poderiam
explicar a diferenciação multicelular. O microbiologista Sol Spiegelman (1947) declarou
que a embriologia estava sendo prejudicada por sua própria terminologia. O problema
da diferenciação não podia mais ser visto como uma propriedade estrutural dos teci-
dos, mas passar a ser considerado uma propriedade bioquímica de células individuais.
A diferenciação deveria ser vista não em termos anatômicos, mas como “produção
controlada de padrões enzimáticos únicos”. Essa redefinição focaliza a atenção para a
relação entre os genes do núcleo e as propriedades do citoplasma. Além disso, a
síntese de uma enzima adaptativa em presença do seu substrato deveria ser discutida
como uma “indução”. Esse é o termo técnico usado em embriologia para descrever a
habilidade de uma célula produzir uma substância capaz de influenciar a diferenciação
de outra. O agente molecular responsável deveria ser chamado “o indutor”. Spiegelman
via uma semelhança fundamental entre a indução de novos tipos celulares no embrião
e a indução de novas enzimas em microorganismos. [gene5.html]
No fim da década de 1950, um grupo de pesquisadores acreditava que micróbios
eram um excelente (e facilmente estudado) modelo para diferenciação embrionária.
Muitos geneticistas microbianos explicitamente ligaram enzimas indutivas a concei-
tos embriológicos. Julgavam ser válida a extrapolação, e apelaram para a unidade da
natureza e, em última análise, as regras simples que esperavam encontrar. Como suge-
rido por Monod (veja Judson, 1979), se alguém entender a bactéria, entenderá o ele-
fante. Muitos embriologistas, porém, permaneceram cépticos a respeito da extrapolação
de bactérias a embriões, enfatizando a complexidade do desenvolvimento e a diversi-
dade da performance embriológica.
Em 1961, Jacob e Monod sintetizaram dados sobre a indução da β-galactosidase
levando à construção do modelo do operon. Esse modelo postula que a pequena
molécula do indutor causava a transcrição de diferentes genes em E. coli (Figura 2.10).
Em sistemas indutivos, uma proteína repressora codificada por genes liga-se ao sítio
operador adjacente aos genes estruturais, impedindo a ligação da RNA polimerase ao
sítio promotor que inciaria a transcrição. Estando presente, o indutor liga-se à proteína
repressora alterando sua conformação de forma a impedir a ligação ao operador. Com
isso, o gene torna-se capaz de transcrever mRNA, que pode ser traduzido formando
proteína. Dessa maneira, o mesmo genoma pode sintetizar diferentes enzimas, depen-
dendo da presença ou não do respectivo indutor. Em um importante trabalho de 1961,
Jacob e Monod enfatizaram que o mecanismo de controle do operon-símile pode ser
parte da regulação gênica universal. Eles conectaram seus resultados ao “problema
fundamental da embriologia química que é a compreensão do porquê células dos
tecidos não expressam constantemente todos os potenciais contidos em seu genoma”.
O modelo do operon foi imediatamente introduzido nos textos de embriologia por
cientistas que procuravam a síntese da genética com a embriologia. O livro de
Waddington (1962), Novos Padrões na Genética e no Desenvolvimento, começa com
um capítulo relacionando o modelo do operon de Jacob e Monod com o controle da
expressão gênica no desenvovimento dos anfíbios. Waddington aprovou especial-
mente esse modelo porque significava que os genes não são apenas ativos, mas
reativos, respondendo às mudanças no citoplasma. Waddington considerou genes e
citoplasma como mutuamente interativos. Essa perspectiva foi também salientada em
Hereditariedade e Desenvolvimento (1963), síntese de embriologia com genética por
John Moore, que conclui:
Na geração anterior, poucos embriologistas ou geneticistas teriam previsto

que a síntese dos seus campos de trabalho teria se tornado possível por estu-
dos com a bactéria Escherichia coli. No entanto, essa criatura microscópica,
sem embrião próprio, mostrou um caminho. Na próxima década, poderá ser
difícil perceber a diferença entre um geneticista e um embriologista, à medida
que eles avançam em sua ciência para além daquilo que cada um poderia ter
conseguido isoladamente.
(A) O operon lac Figura 2.10

Regulação diferencial de genes em E. coli. (A-C) No estado induzível de
tipo-selvagem, não há transcrição de RNA de β-galactosidase a não ser
que a lactose esteja presente. (B) Quando a lactose não está disponível,
uma proteína repressora produzida pelo gene i liga-se ao sítio repressor
Gene indutor Promotor Genes estruturais
para utilização
(o), inibindo a transcrição pela RNA polimerase do promotor (p). (C)
Operador
da lactose Quando o indutor lactose está presente, combina com a proteína repres-
sora, alterando sua forma, o que faz com que a proteína não possa mais
(B) Quando não há lactose disponível se ligar ao DNA operador , fazendo começar a transcrição. (D) A solubi-
Genes estruturais lidade dessa proteína é demonstrada em estudos com o mutante de E.
coli. Quando células bacterianas haplóides com um gene indutor não-
funcional (i-) são tornadas parcialmente diplóides com o gene tipo-
selvagem (i+), forma-se repressor tipo-selvagem capaz de tornar indutível
Não há transcrição o gene original da β-galactosidase.
Proteína repressora de genes estruturais
produzidas por
i liga-se a o
(C ) Quando a lactose está disponível

Genes estruturais
Lactose
RNA
mRNA polimerase
β-galactosidase
mRNA é transcrito
Lactose combinando
com o repressor,
previne ligação a o
(D) O repressor da lactose é solúvel
Genes estruturais
O gene i do tipo selvagem pode produzir

repressor para ambos cromossomos que se
ligam a o na ausência de lactose
Genes estruturais
Síntese diferencial de RNA

A desejada unificação não ocorreu tão rapidamente como esperado por Moore. Po-
rém, baseado na evidência embriológica a favor da equivalência genômica e do mode-
lo do operon de E. coli, emergiu na década de 1960 um consenso de que as células
regulam seu desenvolvimento através da expressão gênica diferencial. Como bactéri-
as eram os modelos para tal atividade, expressão em geral significava transcrição de
mRNA. Os três postulados da expressão gênica diferencial eram os seguintes:
1. Cada núcleo celular contém o genoma completo estabelecido no ovo fertiliza-

do. Em termos moleculares, os DNAs de todas as células diferenciadas são
idênticos.
2. Os genes não-usados das células diferenciadas não são destruídos ou mutados,
retendo o potencial de serem expressos.
3. Só uma pequena porcentagem do genoma está sendo expressa em cada célula,
e uma porção do RNA sintetizado é específica para aquele tipo de célula.
Os dois primeiros postulados já foram discutidos. O terceiro – que só uma pequena

parte do genoma está ativo produzindo produtos específicos dos tecidos – foi primei-
ro testado em larvas de insetos. Após a eclosão, uma larva de inseto tem duas popu-
lações celulares diferentes, formadas por cerca de 10.000 células. A maior parte tem
cromossomos politênicos. Tais cromossomos sofrem replicação de DNA na ausência
de mitose, contendo portanto 512 (29), 1024 (210), ou mesmo mais hélices duplas para-
lelas de DNA em lugar de somente uma (Figura 2.11; Prancha 31). Essas células não
sofrem mitose, e crescem expandindo seu volume até 150 vezes. Durante a metamorfo-
se, tais células morrem sendo substituídas por células diplóides não politênicas agru-
padas em certas regiões da larva (veja Capítulo 19). Beermann (1952) mostrou que o
padrão de distribuição das bandas de cromossomos politênicos era idêntico ao longo
da larva e que não se notavam perdas ou adições de qualquer região cromossômica
quando diferentes tipos de células eram comparados (Figura 2.12). Porém, Beermann
estudando o mosquito Chironomus e Becker (1959) estudando Drosophila, acharam
regiões cromossômicas que estavam “estufadas”. Esses tufos apareciam em lugares
diferentes nos cromossomos em cada tecido; seu aparecimento mudava com o de-
senvolvimento dessas células (Figura 2.13). Ainda mais, alguns tufos podiam ser
Figura 2.11
Cromossomos politênicos. (A) Cromossomos politênicos de células da glândula salivar de
Drosophila melanogaster. Os quatro cromossomos estão conectados em seus centrômeros,
formando um denso cromocentro. Os genes estruturais para a álcool desidrogenase (ADH),
aldeído oxidase (Aldox) e octanol desidrogenase (ODH) foram mapeados nas posições designa-
das nesses cromossomos. (B) Fotografia ao microscópio eletrônico de uma pequena região de
um cromossomo politênico de Drosophila. As bandas escuras estão altamente condensadas
comparadas com as regiões interbandas. (A de Ursprung et al., 1968, cortesia de H. Ursprung;
B de Burkholder, 1976, cortesia de G. D. Burkholder.)
Aldox
estimulados ou inibidos por certas mudanças fisiológicas causadas pelo calor ou por
hormônios (Clever, 1966; Ashburner, 1972; Ashburner e Berondes, 1978).
Beermann (1961) apresentou evidências que esses tufos representam um afrouxa-
mento localizado de cromossomos politênicos (Figura 2.14) e que são sítios de síntese
ativa de RNA. Duas espécies intercruzadas diferentes de Chiromonus foram encon-
tradas: uma produzindo grande quantidade de proteína salivar e a outra não (Figura
2.15). Os produtores tinham uma tufo grande (anel de Balbiani) em determinada banda;
esse tufo não existia nos não-produtores. O cruzamento de produtor com não-produ-
tor resultou em larvas produzindo quantias intermediárias de proteína salivar. Cruzan-
do duas moscas híbridas, a capacidade de produzir proteína salivar segregou-se de
forma Mendeliana: 1 alto produtor: 2 intermediários:1 não-produtor. Altos produtores
tinham dois tufos (um em cada cromossomo homólogo), produtores intermediários
tinham apenas um, e não-produtores nenhum tufo. Beermann concluiu que a informa-
ção genética necessária para a síntese dessa proteína salivar está presente nessa
banda distal do cromossomo e que sua produção dependia de transformação em uma
região estufada.
(A)
Glândula Túbulos de Tecido Intestino

salivar Malpighi retal
(B)
Figura 2.12
Identidade genômica em cromossomos politênicos. (A) Uma região do
conjunto cromossômico da mosca Chiromonus tentans. Notar a constân-
cia do número de bandas nos diferentes tecidos. (B) Hibridização do RNA
de uma proteína da gema com um cromossomo da glândula salivar larval
de Drosophila. Os grãos escuros (flexa) mostram onde a mensagem da
proteína radioativa da gema se ligou aos cromossomos. Notar que o gene
para a proteína está presente no cromossomo da glândula salivar, apesar
da proteína não ser aí sintetizada. (A) Segundo Beermann, 1952; (B) De
Barnett et al., 1980; fotografia cortesia de P. C. Wensink.
Figura 2.13
Seqüência de estufamentos de uma porção do cro-
mossomo 3 da glândula salivar de Drosophila mela-
nogaster. (A,B) larva de 110 horas; (C) larva de 115
horas; (D,E) estágio pré-pupa (após 4 horas). Notar
o estufamento e a regressão das bandas 74EF e 75B.
Outras bandas (71DE, 78D) estufam mais tarde, po-
rém, a maioria não estufa de modo algum durante o
período. (Cortesia de M. Ashburner.)
(A) (B) (C) (D) (E)
Prova adicional de que tufos cromossômicos produzem mRNA vem de estudos

sobre tufos do anel de Balbiani (BR2) em Chironomus tentans. O BR2 pode ser
isolado por microdissecção devido seu tamanho excepcional, e seus produtos po-
dem ser analisados por autoradiografia (Lambert e Daneholt, 1975). A Figura 2.16 A,
B mostra o isolamento de BR2 do cromossomo 4 de C. tentans. Transcrição de BR2
foi demonstrada incubando glândulas salivares isoladas com precursores de RNA
(A)
(B)
Figura 2.14
Terminação proximal do cromossomo 4 da glândula sali-
var de Chiromonus pallidivitatus, mostrando o enorme
tufo BR2. (A) Fotomicrografia em contraste de fase, de
preparações coradas, mostrando o extenso tufo no cro-
mossomo politênico. (B) Diagrama da região passando
por estufamento. (A de Grossbach, 1973, cortesia de U.
Grossbach; B segundo Beermann, 1963)
BR4(SZ)
Alto Não-produtor
produtor
BR2
Todos produtos
intermediários
BR1
BR3
Alto produtor Não-produtor

Produtores
(A) (B) (C) Intermediários
Figura 2.15
Correlação de padrões de estufamento com fun-
ções especializadas nas células das glândulas
salivares de Chironomus pallidivitatus. (A)
radioativos. O RNA radioativo pôde, em seguida, ser extraído da porção BR2 do Cromossomo de uma célula produzindo uma
cromossomo dissecado (Lambert, 1972). Esse RNA era excepcionalmente grande – secreção granular e mostrando um anel de
cerca de 50.000 bases. O grande segmento de RNA radioativo, especificamente Balbiani adicional [BR4(SZ)]. (B) Cromosso-
hibridizado para a região BR2 do cromossomo, mostrou que o DNA estufado (Puff mo 4 de uma célula salivar, mostrando somen-
de DNA) - e nenhum outro local - tinha-o transcrito ativamente (Figura 2.16C). Esse te anéis de Balbiani 1, 2 e 3 (BR1, BR2, BR3).
mesmo RNA pôde ser isolado de polissomos sintetizadores de proteínas, indicando (C) Evidência genética que a síntese de uma
importante proteína salivar depende da for-
que é ativo na síntese protéica (Wieslander e Daneholt, 1977). Assim, um RNA
mação de tufos BR4(SZ). Larvas com altos
transcrito de uma banda específica de DNA, que estufa na glândula salivar larval, níveis de secreções granulares têm células sali-
pode posteriormente ser visto produzindo proteínas em ribossomos citoplasmáticos. vares glandulares com tufos BR4(SZ) em am-
bos cromossomos 4 (coloridos), enquanto lar-
vas sem essas secreções não têm tais tufos.
Produtores intermediários têm somente um
cromossomo 4 com uma região estufada
BR4(SZ) em cada célula salivar realizando a
secreção. (A e B segundo Beermann, 1961, cor-
tesia de W. Beermann.)
(A)
(B) Figura 2.16

BR 2 (A,B) Isolamento da região BR2 de Chirono-
mus tentans por micromanipulação. O cromos-
somo intacto 4 pode ser dividido em três regi-
ões, uma contendo BR2. (C) Transcrição da
região BR2 mostrado por uma auto-radiogra-
fia in situ após hibridização do BR2 RNA com
a preparação cromossômica. (A e B de Lambert
e Daneholt, 1975; C de Lambert, 1972; foto-
(C) grafias cortesia de B. Lambert.)
Portanto, os tufos nos cromossomos salivares estão produzindo mRNA ativamen-

te. Em células que sintetizam essa proteína, o gene está ativado; em células que não
usam essa proteína, o gene permanece reprimido.
Hibridização de ácido nucléico

Poucos genes puderam ser analisados como aqueles nos tufos politênicos de
Chiromonus. E embora esses genes dos tufos eram ativos em células que já se
haviam diferenciado (como aquelas da glândula salivar), não eram os genes cau-
sadores da diferenciação celular. Para encontrar e analisar os genes que são res-
ponsáveis pelo desenvolvimento embrionário, novas técnicas tiveram que ser
aperfeiçoadas.
A maioria das técnicas para análise de genes eucariotos baseia-se na hibridização
de ácidos nucléicos. Essa técnica envolve fortalecimento de pedaços de fitas simples
de RNA e DNA, para permitir a formação de híbridos de fitas duplas. Por exemplo, se
o DNA é cortado em pequenos pedaços e cada pedaço dissociado em duas fitas
simples – desnaturado – cada fita na solução deverá achar e reunir-se com seu parcei-
ro complementar, quando lhe é dado tempo suficiente para isso. As condições de
renaturação devem ser tais que ligação específica entre fitas complementares seja
mantida e combinações não específicas sejam dissociadas. Isso é, em geral, consegui-
do variando a temperatura ou as condições iônicas da solução em que ocorre a
renaturação (Wetmur e Davidson, 1968). De maneira semelhante, RNA sintetizado a
partir de uma região particular do DNA poderia ser esperado ligar-se à fita do qual foi
transcrito (Figura 2.17). Assim, RNA pode ser esperado hibridizar especificamente
com o gene que o codifica. Para medir essa hibridização, uma das fitas de ácido nucléico
(a sonda) é em geral marcada pela incorporação de nucleotídeos radioativos. Um
problema técnico que inicialmente atormentou os estudos de hibridização de ácidos
nucléicos foi a dificuldade em conseguir colocar quantidades suficientes de radioati-
vidade na molécula de RNA. Esse problema foi superado isolando o RNA e fazendo
uma cópia complementar de DNA (cDNA) na presença de precursores radiativos. Isso
pode ser feito em tubo de ensaio contendo o RNA, uma extensão curta de DNA
(chamado de iniciador ou primer), precursores radioativos de DNA e a enzima viral
transcriptase reversa. Essa enzima pode produzir DNA de um molde de RNA (Figura
2.18). O DNA é sintetizado in vitro, não sendo necessário preocupar-se com a diluição
(A)
Condições de Condições de
desnaturação re-anelamento
(calor, álcali)
Figura 2.17
Hibridização de ácidos nucléicos. (A) Se a hé- RNA
(B)
lice de DNA for separada em duas fitas, essas
devem se re-anelar sob condições adequadas
de força iônica e tempo. De maneira semelhan-
te, se o DNA for separado em suas duas fitas,
o RNA deve ficar capacitado a se ligar a genes
que o codificam. Se presente em quantidades Desnaturar; adicionar RNA hibridiza
RNA (em grande com uma
suficientemente grandes em comparação com
quantidade em fita de DNA
o DNA, o RNA irá substituir uma das fitas de comparação com DNA)
DNA nessa região.
dos precursores radiativos. Além disso, o DNA pode hibridizar tanto com o gene que
produziu o RNA (embora a outra fita) e com o próprio RNA, tornando-o extremamente
mRNA
útil para a detecção de pequenas quantidades de RNAs específicos.[other.html#gene6]
Anelar iniciador
Clonagem de DNA genômico
mRNA
Já em 1904 Theodor Boveri desesperava-se, considerando que as técnicas de sua
época nunca seriam suficientes para permitir-lhe estudar como os genes criam embri- Transcriptase
ões. Havia necessidade de uma técnica especial de amplificação gênica: reversa
Porque não é somente o núcleo, nem mesmo cromossomos individuais, mas cer- mRNA
tas partes de certos cromossomos de certas células que precisam ser isolados e
coletados em quantidades enormes para análise; essa seria uma pré-condição cDNA
para colocar o químico em uma posição a qual lhe permitiria analisar (o mate- Álcali
rial hereditário) com mais minúcias que o morfologista.
cDNA
Entretanto, desde a década de 1970 a hibridização de ácido nucléico permitiu aos
biologistas do desenvolvimento realizar o que Boveri aspirava: isolar e amplificar Figura 2.18
regiões específicas do cromossomo. A técnica principal para isolar e amplificar genes Método para preparar DNA complementar
individuais é chamada clonagem de genes. A primeira fase desse processo consiste no (cDNA). A maioria dos mRNA possui uma
corte de DNA nuclear em pedaços distintos, por incubação de DNA com uma longa cadeia de resíduos de adenosina (AAAn)
endonuclease de restrição (geralmente chamada de enzima de restrição). De modo no terminal 3’ da mensagem (a ser discutida no
geral, essas endonucleases são enzimas bacterianas que reconhecem seqüências es- Capítulo 12); por isso, o pesquisador anela
pecíficas do DNA e o clivam nesses sítios (Tabela 2.1; Nathans e Smith, 1975). Por um iniciador consistindo de 15 resíduos de de-
soxitimidina (dT15) ao final 3' da mensagem.
exemplo, quando DNA humano é incubado com a enzima BamHI (de Bacillus
Transcriptase reversa em seguida, transcreve
amyloliquifaciens, cepa H), o DNA é clivado em cada sítio onde aparece a seqüência uma fita de DNA complementar, começando
GGATCC. Os produtos são fragmentos de DNA de vários tamanhos, todos terminan- no iniciador dT15. O cDNA pode ser separado
do com G em um dos lados e GATCC no outro (Figura 2.19). Esses pedaços são aumentando o pH da solução, dessa maneira,
freqüentemente chamados de fragmentos de restrição. desnaturando o híbrido de dupla fita e clivan-
do o RNA.
Tabela 2.1 Enzimas de restrição comumente usadas
Sítio Derivação Reconhecimento e clivagem

enzimático*
EcoRI Escherichia coli G AA T T C

C T TAA G
BamHi Bacillus amyloliquifaciens G G AT C C
C C TAG G
HindIII Haemophilus influenzae A AG CTT
TTC GA A
SalI Streptomyces albus G TC GAC
CAG C T G
SmaI Serratia marcescens CCC GGG
GGG CCC
HhaI Haemophilus haemolyticus GCG C
C GCG
HaeIII Haemophilus aegyptius GG CC
CC GG
AluI Arthrobacter luteus AGCT
T C GA
* Todos os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição têm um centro de simetria. A seqüência

de dupla fita lida em uma direção é idêntica à seqüência lida da frente para trás na outra direção.
O próximo procedimento na clonagem do gene é incorporar esses fragmentos de

restrição em vetores de clonagem. Usualmente esses vetores são moléculas circulares
de DNA, replicadas em células bacterianas, independentemente do cromossomo
bacteriano. São usados plasmídeos resistentes a drogas ou vírus especialmente modi-
ficados (que são muito úteis na clonagem de grandes fragmentos de DNA). Por exem-
plo, um vetor pode ser construído contendo apenas um sítio sensível à BamHI. Esse
vetor pode ser aberto por incubação com essa enzima de restrição. Após a abertura,
ele pode ser misturado com os fragmentos de DNA humano, produzidos também por
BamHI. Em muitos casos, os pedaços do DNA cortado serão incorporados a esses
vetores (porque seus terminais são complementares aos terminais abertos do vetor) e
ligados covalentemente, colocando-os em uma solução contendo a enzima DNA ligase.
O processo total fornece plasmídeos bacterianos, cada um contendo um único pedaço
de DNA humano. Esses são chamados plasmídeos recombinantes ou, geralmente,
DNA recombinante (Cohen et al.,1973; Blattner et al., 1978).
O plasmídeo ilustrado na Figura 2.19 é pUC18, um vetor freqüentemente usado por
biologistas moleculares (Vierra e Messing,1982). Ele contém (1) um gene resistente a
drogas, AmpR, que torna a bactéria imune à ampicilina e permite ao pesquisador sele-
cionar aquelas bactérias que incorporaram um plasmídeo; (2) uma origem para a
replicação de DNA, permitindo ao plasmídeo replicar centenas de vezes em cada
bactéria; e (3) um poli-ligante, um pedaço curto de DNA artificial que contém os sítios
enzimáticos de restrição para várias dessas endonucleases. O poli-ligante se situa
dentro de um gene lacZ que codifica a ß-galactosidase de E. coli. O poli-ligante é
suficientemente curto (e tem o número correto de pares de bases) de modo a não
interferir com a atividade enzimática da β-galactosidase. O processo de clonagem
começa quando os fragmentos de restrição do DNA nuclear são misturados aos
plasmídeos abertos pUC18 e a eles são ligados, ocasionando o fechamento do
plasmídeo. Os plasmídeos recombinantes putativos assim formados são então incu-
bados com células de E. coli sensíveis à ampicilina e sem o gene da β-galactosidase.
Mesmo que as bactérias e os plasmídeos sejam misturados em condições que encora-
jam as bactérias a incorporar os plasmídeos, nem todas as bactérias incorporam um
plasmídeo. Para evidenciar aquelas bactérias que incorporaram plasmídeos, as células
tratadas de E. coli são cultivadas em ágar contendo ampicilina. Somente aquelas
bactérias que incorporaram um plasmídeo (com seu gene dominante, ampicilina-resis-
tente) sobrevivem.
Mas nem todos plasmídeos incorporaram um gene estranho, porque é possível
que os “terminais adesivos” do sítio da enzima de restrição sofram uma renaturação
entre si mesmos. Para distinguir entre colônias bacterianas que incorporaram DNA
estranho e aquelas que não o fizeram, o ágar também contém um corante chamado X-
gal. Esse composto é incolor, mas quando transformado pela β-galactosidase forma
um precipitado azul *.Assim, se um plasmídeo não incorporou um fragmento de restri-
ção ao sítio de enzima de restrição no poli-ligante, o gene da β-galactosidase (lacZ)
está funcional e a β-galactosidase resultante torna o corante azul. O resultado é o
aparecimento de “colônias azuis”. Entretanto, se o plasmídeo incorporou um fragmen-
to de DNA, o gene da β-galactosidase é destruído pela inserção. Essas bactérias não
vão produzir a cor azul do corante; produzem colônias incolores no ágar.
Colônias incolores são então selecionadas quanto a presença de um gene especí-
fico. Células de cada uma dessas colônias são colocadas em um finíssimo filtro de
nitrocelulose ou nylon. Quando essas células são lisadas, seu DNA adere aos filtros.
Em seguida, as fitas de DNA são separadas por aquecimento, e os filtros incubados
em uma solução contendo o RNA radioativo (ou sua cópia de cDNA) do gene que se
*O corante é 5-bromo-4-cloroindol, e é azul a não ser quando está complexado com uma
molécula como galactose. A ß-galactosidase codificada pelo gene do plasmídeo cliva a galactose do
corante permitindo que adquira a conformação azul.
Sítio Sítio BamHI Sítio Eco RI

Hind III
Poli-ligante
Plasmídeo cortado
no gene lacZ
Quebra
endonucleolítica
por BamHI
Fragmentos
de gene Plasmídeo
humano recombinante
incubados e com gene lacZ
ligados em um interrompido
plasmídeo
DNA humano
Quebra endonucleolítica Mistura com bactérias

por BamHI (lacZ–, sensível à amp.)
Figura 2.19
Um protocolo geral para clonar DNA, usando como exemplo a inserção de uma se-
“Colônias
qüência de DNA humano em um plasmídeo com um sítio sensível à BamHI.
incolores”
quer clonar. Em alguns casos, a seqüência do mRNA ou gene não é conhecida, Meio contendo
ampicilina
devendo-se então estimar a seqüência a partir da seqüência de aminoácidos da
proteína). Se o plasmídeo contém aquele gene, seu DNA deve estar no filtro, e
“Colônias azuis”
somente aquele DNA deverá ser capaz de ligar o RNA radioativo ou a sonda de
cDNA. Portanto, somente aquelas áreas serão radioativas. A radioatividade nessas
regiões é determinada por auto-radiografia. Filme sensível a raios-X é colocado Aplicação das colônias
“incolores” nos círculos do
sobre o papel tratado. Os elétrons de alta energia, emitidos pelo RNA radioativo, papel de filtro; lisar para
sensibilizam os grãos de prata no filme, tornando-os escuros quando o filme é reve- expor o DNA
lado. Finalmente, uma mancha escura é produzida sobre cada colônia contendo o
plasmídeo recombinante que carrega o gene específico (veja Figura 2.19). Essa colô-
nia é então isolada e cultivada, produzindo bilhões de bactérias, cada uma contendo
centenas de plasmídeos recombinantes idênticos.
Os plasmídeos recombinantes podem ser separados do cromossomo da E. coli por
centrifugação, e incubando o DNA do plasmídeo com BamHI libera-se o fragmento de
DNA extranho que contém o gene. Esse fragmento pode ser separado do DNA
plasmídico, permitindo ao pesquisador possuir microgramas de seqüências de DNA mRNA
radioativo
purificado contendo o gene específico. Apesar desse procedimento parecer muito
lógico e fácil, freqüentemente o número de colônias a serem selecionadas é astronômi- Papel de filtro incubado com mRNA
co. O número de fragmentos aleatórios que devem ser clonados para a obtenção do radioativo do gene a ser clonado
gene desejado, aumenta com a crescente complexidade do genoma do organismo*.
Para detectar um gene específico de um genoma de mamífero, milhões de clones indi-
viduais devem ser selecionados.
*Complexidade se refere ao número de diferentes tipos de genes no núcleo. Apesar que

milhões de clones precisam ser selecionados, aproximadamente 100.000 colônias podem, agora,
ser selecionadas em uma única placa. Outra maneira comum de selecionar os clones é usar um
plasmídeo que tem seu sítio da enzima de restrição próximo a um vigoroso promotor bacteriano
(tal como aquele para ß-galactosidase). As bactérias transcreverão o cDNA e o traduzirão em
proteína. Após a lise das colônias bacterianas no papel de filtro, as proteínas aderem ao papel e Preparação de auto-radiografia para indicar os
podem ser identificadas por anticorpos dirigidos contra àquela proteína. Isso é chamado clonagem clones bacterianos com fragmento de DNA
de expressão, e os plasmídeos referidos como vetores de expressão. que formou um híbrido com o DNA radioativo
Hibridização de DNA: entre e intra espécies

Clones podem ser selecionados por qualquer segmento de nucleotídeos radioativos.
Portanto, os genes clonados de um organismo podem ser sondados com cDNAs
radioativos derivados do mRNA de outras espécies. Uma das descobertas mais exci-
tantes da moderna biologia do desenvolvimento foi verificar que genes usados para
processos específicos de desenvolvimento em um organismo, podem ser usados para
processos similares em outro organismo. Drosophila teve uma importância crítica na
descoberta desses genes. Iniciando com Morgan, esses genes foram mapeados e, nos
anos 60, E. B. Lewis confirmou que alguns desses genes são responsáveis pela forma-
ção de partes básicas do corpo (veja Capítulo 14). Um deles, Antennapedia, é um gene
cujo produto protéico é essencial para inibir a formação de estruturas da cabeça no
tórax. Se o gene não está presente, antenas crescem onde deveriam estar as pernas. Se
o gene é expresso na cabeça (como sucede em um mutante específico), a mosca
desenvolve um conjunto extra de pernas saindo das cavidades orbitais (veja Figura
14.28). Poderia tal gene existir em vertebrados?
Evidências desses genes em vertebrados apareceram em transferências de DNA,
algumas vezes chamadas de transferências Southern devido a seu inventor, E. M.
Southern (1975). DNA de numerosos organismos vertebrados e invertebrados, foram
tratados com uma enzima de restrição, e os fragmentos de DNA resultantes foram
separados em uma eletroforese em gel. As misturas de fragmentos foram colocadas em
fendas em um dos lados do gel, que foi em seguida submetido à uma corrente elétrica.
Os fragmentos de DNA carregados negativamente migraram em direção ao pólo posi-
tivo, os fragmentos menores movendo-se mais rapidamente do que os maiores. *
Como a hibridização não pode ser feita dentro do gel; o DNA deve ser colocado em
uma superfície plana, e isso é feito por transferência. Após a desnaturação das fitas de
DNA em álcali, os pesquisadores retornaram o gel a um pH neutro e em seguida o
Figura 2.20 colocaram sobre um papel de filtro úmido suportado por uma estrutura de plástico
Transferência Southern. DNA é tratado com (Figura 2.20; Mc Ginnis et al., 1984; Holland e Hogan, 1986). Papel de nitrocelulose
enzimas de restrição e os fragmentos resul-
(capaz de ligar DNA de fita única) foi colocado diretamente sobre o gel e coberto com
tantes são colocados em um gel e separados
por eletroforese. Após a separação, o DNA é múltiplas camadas de papel-toalha secas. O papel de filtro abaixo do gel estava em
desnaturado em fitas únicas. O gel é, em se- comunicação com o interior de uma cuba contendo tampão de alta força iônica. O
guida, colocado sobre um papel de filtro tampão caminhou para cima através do gel e do filtro de nitrocelulose para as toalhas
saturado com tampão de alta força iônica. Pa- de papel. O DNA também foi levado por esse fluxo de tampão, mas foi detido pelo filtro
pel de nitrocelulose ou um filtro de nylon é de nitrocelulose; assim, o DNA foi transferido do gel ao papel de nitrocelulose. Após
colocado sobre o gel e o conjunto coberto fixar pelo calor os fragmentos de DNA no papel de nitrocelulose (de outra forma eles
com toalhas de papel. O tampão de transfe-
rência atravessa o gel, o papel de nitrocelulo-
se e as toalhas por ação capilar, levando jun- *Considerando a mesma relação carga/massa, fragmentos menores adquirem uma maior veloci-
to o DNA. O DNA de fita única é retido pelo dade que os maiores quando impulsionados pela mesma energia. Isso é uma função da equação de
energia cinética, E=1/2 mv2. Resolvendo para velocidade, encontramos que ela é inversamente
papel de nitrocelulose. As posições do DNA
proporcional à raiz quadrada da massa.
no papel diretamente refletem a posição dos Filtro de
fragmentos de DNA no gel. nitrocelulose
ou nylon
Espaçadores Papel-toalha Peso
Contatos de
Desnaturar fragmentos de papel de filtro
DNA à fitas simples em álcali
Suporte
Cuba com
Gel
Digestão com restrição solução tampão Colocar filtro de nitrocelulose
e eletroforese Colocar gel no papel de filtro ou membrana de nylon sobre gel:
em gel de agarose úmido entre 2 espaçadores colocar papel-toalha e peso
Figura 2.21 Drosophila Besouro Galinha Camundongo

Transferência Southern do DNA de vários organismos usando uma sonda radioativa do melanogaster
gene Antennapedia de Drosophila melanogaster. Não se espera que as seqüências de
espécies tão diversas sejam perfeitamente idênticas e por essa razão o rigor da hibridização 10 10 10 10
Ubx
é diminuído trocando as soluções salinas. (Coloquialmente esse baixo rigor das transferên-
cias ao longo dos filos é chamado “transferências de zoológico”, por razões óbvias). Auto- ftz
radiografia mostra que os genes de Drosophila contêm várias porções que são como as do 3 3 3
gene Antennapedia em termos de estrutura; também, muitos organismos contêm vários
3
genes que formarão híbridos com esse fragmento gênico radioativo, sugerindo que genes
Antp
similares a Antennapedia existem nesses organismos. Os números ao lado das transferênci-
as indicam os tamanhos das bandas, em quilobases. (de McGinnis et al.,1984, cortesia de 1
W. McGinnis.) 1 1
1
se desprenderiam), o conjunto foi incubado com cDNA radioativo de uma porção do

gene Antennapedia de Drosophila. Um autoradiograma do papel de nitrocelulose
mostrou onde o DNA radioativo encontrou seu semelhante. Os resultados desses
experimentos (Figura 2.21) mostraram que mesmo vertebrados (camundongos, huma-
nos e pintos) têm genes que hibridizam com essas seqüências. Essa secção radioativa
do gene Antennapedia foi usada para selecionar uma biblioteca genômica de clones
de DNA derivados do genoma dessas diferentes espécies. Como veremos no Capítulo
16, pesquisadores encontraram clones contendo genes que se parecem com o
Antennapedia; esses genes se mostraram extremamente importantes na formação do
eixo do corpo dos vertebrados.
Seqüenciamento de DNA
Dados de seqüência podem dar informações sobre a estrutura da proteína codifi-
cada e podem identificar seqüências regulatórias de DNA que certos genes têm em
comum. A simplicidade da técnica de seqüenciamento “didesoxi” de Sanger (Sanger
et al.,1977) tornou-a um procedimento padrão em muitos laboratórios de biologia
molecular. No início, usa-se um vetor contendo o gene clonado e se isola uma fita
única do DNA circular (Figura 2.22). Funde-se (anela-se) então um iniciador (primer)
radioativo de DNA (aproximadamente 20 pares de bases) complementar ao DNA
do vetor imediatamente 3' ao gene clonado. (Porque essas seqüências dos vetores
são conhecidas, iniciadores oligonucleotídicos podem ser facilmente sintetizados
ou adquiridos comercialmente). O iniciador tem uma ponta 3' livre à qual mais
nucleotídeos podem ser adicionados. Coloca-se o DNA alvo e o iniciador junta-
mente com todos os quatro desoxirribonucleosídeos trifosfatos em quatro tubos
de ensaio. Cada um dos tubos contém a subunidade polimerizante da DNA polime-
rase e um diferente didesoxinucleosídeo trifosfato: um tubo contém didesoxi-G,
outro didesoxi-A e assim por diante. As estruturas dos desoxinucleotídeos e dos
didesoxinucleotídeos estão representadas na Figura 2.23. Enquanto o
desoxirribonucleotídeo não tem um grupo hidroxila (OH) no carbono 2' do seu
açúcar, o didesoxirribonucleotídeo não tem grupos hidroxila em ambos os carbo-
nos, 2' e 3'. Assim, mesmo que um didesoxirribonucleotídeo possa ser ligado a uma
crescente cadeia de DNA pela DNA polimerase, ele interrompe o crescimento da
cadeia por não ter um grupamento 3' ao qual se ligaria um novo nucleotídeo.
Assim, quando a DNA polimerase está sintetizando DNA do iniciador, o novo
DNA será complementar ao gene clonado. No tubo com didesoxi-A, entretanto,
sempre que a polimerase coloca um A na cadeia crescente, existe a possibilidade
de que um didesoxi-A seja colocado em lugar do desoxi-A. Se isso acontecer, a
cadeia pára. Similarmente, no tubo com didesoxi-G, a cadeia tem o potencial de
parar toda vez que um G é inserido. (O processo foi comparado à uma dança
folclórica grega na qual uma pequena porcentagem dos dançarinos em potencial
tem um braço em uma tipóia).
Fita única desnaturada de DNA de plasmídeo recombinante
Iniciador
Subunidade polimerizante de DNA polimerase I

de E. coli + dATP, dGTP, dCTP e dTTP
Seqüência da fita
do iniciador
Seqüência
complementar
Fragmentos
maiores
Fragmentos
menores
Figura 2.22
O método didesoxi de seqüenciar DNA. A fotografia contém a região da auto-radiografia que
mostra essa seqüência (Cortesia de G. Guild).
Base 1
Adenina Adenina
Base 2
Adenina Desoxiadenosina Didesoxiadenosina
trifosfato (açúcar desoxirribose) trifosfato (açúcar
(A) didesoxirribose) (B)
Figura 2.23
Comparação entre desoxinucleotídeos e didesoxinucleotídeos. (A) Estruturas dos dois tipos de
nucleotídeos. A diferença é evidenciada em cores. (B) O terminal 3' de uma cadeia que terminou
pela incorporação de um didesoxinucleotídeo não tem um grupo hidroxila 3' terminal para
continuar a polimerização do DNA.
Em cada tubo estão sendo feitas milhões de cadeias e por essa razão eles conterão
uma população de cadeias, algumas interrompidas no primeiro sítio possível, outras
no último e algumas em sítios intermediários. O tubo com didesoxi-A, por exemplo,
conterá cadeias com diferentes e distintos comprimentos, cada uma terminando com o
resíduo A. Os fragmentos de DNA radioativo resultantes serão separados por eletro-
forese. O resultado é uma “escada” de fragmentos onde cada “degrau” é uma seqüên-
cia de nucleotídeos de comprimento diferente. Lendo escada acima, obtem-se a se-
qüência do DNA complementar àquela do gene clonado.
Análise de mRNA através de bibliotecas de cDNA

Agora podemos retornar à especificidade da transcrição de mRNA: É possível
isolar populações de mRNA que caracterizam certos tipos de células e estão au-
sentes em todas as outras? Para encontrar esses RNAs, podemos “clonar” os
mRNA de diferentes tipos de células e compará-los. Como mostra a Figura 2.24A,
isso é feito tomando os RNAs mensageiros de uma célula ou tecido e converten-
do-os em fitas de DNA complementar. Levando esse procedimento um passo à
frente (com o auxílio de DNA polimerase e S1 nuclease), podemos transformar
essa população de cDNA de fita única em outra contendo pedaços de cDNA com
fitas duplas. Essas fitas de DNA podem ser inseridas em plasmídeos, adicionan-
do-lhes “finais” apropriados com DNA ligase. Acoplando um fragmento GATCC/
G aos terminais rombudos desse pedaço de DNA cria-se um corte artificial de
restrição BamHI, o que permite a inserção em um vírus ou plasmídeo clivado por
essa enzima (Figura 2.24B).
Tais coleções de clones derivados de mRNAs são freqüentemente chamadas de
bibliotecas. Assim, podemos ter uma biblioteca de fígado de embrião de camundongo
de 16 dias, representando todos os genes ativos produzindo proteínas hepáticas
embrionárias. Podemos ter também uma biblioteca de oócitos vegetais de Xenopus,
representando mensagens presentes somente em uma parte específica daquela célula.
Genes clonados dessa maneira são muito importantes porque eles não têm íntrons.
Quando adicionados às células bacterianas, esses genes podem ser transcritos e em
seguida traduzidos nas proteínas que codificam.
Bibliotecas têm sido extremamente úteis no estudo de desenvolvimento como
demonstram os esforços de Wessel e colaboradores (1989) em verificar diferenças nos
RNAs de diferentes partes do embrião, em gastrulação, do ouriço-do-mar. Para encon-
trar mRNAs específicos do endoderma em ouriço-do-mar, Wessel e colaboradores
prepararam uma biblioteca de cDNA de embriões gastrulantes. O mRNA dessas amos-
tras (a maior parte do RNA de células eucarióticas é ribossômico) foi isolado por
passagem em esferas com oligo-dT, as quais capturam as caudas de poli(A) das men-
sagens (veja legenda da Figura 2.19). A população de mRNA foi, então, convertida em
uma de cDNA pelo uso da transcriptase reversa (veja Figura 2.24A). Usando polimerase
I de E. coli o cDNA de fita única foi transformado em fita dupla. No próximo passo, os
cDNAs de fita dupla foram ligados a “finais” de EcoRI que estão disponíveis no comér-
cio. Isso os tornou clonáveis em vetores que foram abertos com a enzima de restrição
EcoRI. O DNA foi misturado com os braços de um fago λ geneticamente modificado
(veja Figura 2.24B). Esse fago é construído de tal maneira que ao ser cultivado em uma
placa de Petri, os fagos que incorporaram o DNA (e assim destruíram o gene da ß-
galactosidase) produzem placas incolores (Figura 2.24C). Dessa forma, foram gerados
aproximadamente 4 milhões de fagos recombinantes, cada um contendo um cDNA re-
presentando uma molécula de mRNA.
O próximo passo envolvia selecionar os fagos recombinantes. Quais deles repre-
sentariam mRNAs encontrados no endoderma e não em outras camadas celulares?
Wessel e seus colegas isolaram populações de mRNAs do mesoderma, ectoderma e
endoderma. Depois prepararam cDNAs marcados de cada uma das populações de
mRNA, usando precursores radioativos. Agora, possuíam três coleções de moléculas
(A)Preparação de cDNA (B) Inserção de cDNA de dupla fita no vetor viral (bacteriófago λ)
clonável
Região codificadora
mRNA DNA de fago λ
Anela iniciador oligo (dT)
BamHI
mRNA
Transcriptase reversa “Braço esquerdo” “Braço direito”
cDNA
Não é necessário para
mRNA a replicação do fago
Hidrólise alcalina Braços contêm todos os

cDNA de dupla fita genes necessários para a
preparado como replicação, mas muito
cDNA descrito em (A) pequeno para o
empacotamento
Inserir cDNA nos
terminais do DNA do
DNA polimerase I fago λ; ligar
cDNA
S1 nuclease
Fita cDNA do
dupla mRNA, agora
cDNA clonado em
vetores virais
Adicionar finais Bam HI
de cDNA radioativos, cada uma representando a população de mRNA de uma das

três camadas germinativas.
Os fagos recombinantes representando os mRNAs do embrião, em gastrulação,
do ouriço-do-mar foram cultivados e amostras de numerosas colônias— cada uma
contendo milhares de fagos— colocadas em dois filtros de nitrocelulose (Figura 2.24D).
O conjunto foi colocado em solução de álcali para a lise dos fagos e obtenção de DNA
de fita única. Um desses papéis de filtro foi incubado com cDNA radioativo feito a
partir do mRNA total do endoderma; o outro papel incubado com sondas radioativas
para ambos, mesoderma e ectoderma. Os filtros foram lavados para a remoção de
cDNA radioativo não hibridizado, secos e expostos em filmes para raios-X. Se um
mRNA estivesse presente no endoderma, mas não no ectoderma ou mesoderma, o
DNA recombinante produzido daquela mensagem deveria ligar cDNA radioativo do
endoderma e não deveria encontrar um mRNA em qualquer outro lugar. Como resulta-
do, aquela mancha de DNA recombinante do endoderma deveria ser radioativa (pois
foi ligado ao cDNA radioativo do endoderma), mas o mesmo clone não deveria ser
radioativo quando exposto a mRNA ectodérmico ou mesodérmico; isso foi confirma-
do. Um fago recombinante, em particular, ligou somente cDNA radioativo produzido
(C) Preparação da biblioteca de clones do fago (D) Seleção da biblioteca de fagos clonados
Transferir alguns
Fago fagos para filtros
híbrido de nitrocelulose
Adicionar à camada de
células de E. coli Filtros de nitrocelulose
Infecção de E. coli pelo fago

Lise
Placa Tratar filtros com
solução alcalina para
lisar os fagos e
Zona de lise desnaturar o DNA
indicando clones liberado
Camada de do fago
bactérias
E. coli Incubar com sonda radioativa Incubar com sonda radioativa
para endoderma para mesoderma e ectoderma
Figura 2.24 Sonda

radioativa
Protocolo usado para organizar bibliotecas de cDNA. (A)
RNA mensageiro é isolado e feito seu cDNA, que é em segui-
da transformado em dupla fita e adicionado de fragmentos DNA de
finais de restrição. (B) Os “genes” cDNA são inseridos em fago de fita
vetores especialmente modificados, nesse caso, bacteriófagos. única ligado
(C) Os fagos contendo o DNA recombinante lisarão E. coli ao filtro
formando placas. Técnicas bioquímicas podem distinguir pla-
cas de fagos recombinantes daquelas que não têm o gene inse- Preparação dos
rido. (D) As placas são transferidas para papel de nitrocelu- autoradiogramas
lose e tratadas com álcali para lisar os fagos e desnaturar
DNA localmente. Esses filtros são então incubados com son-
das radioativas (usualmente cDNA) de um tecido. Para a
seleção da biblioteca diferencial de cDNA, discutida no texto,
a mesma biblioteca de fagos foi selecionada com sondas radi-
oativas de dois tecidos diferentes, permitindo ao pesquisador Clone de DNA representando o mRNA
procurar por um mRNA encontrado em um tipo de tecido encontrado no endoderma mas não no
mas não em outro. mesoderma ou ectoderma
de mRNA do endoderma; portanto, representava um mRNA encontrado no endoderma

e não no mesoderma ou ectoderma. O fago contendo esse gene pode agora ser culti-
vado em grandes quantidades e caracterizado.
Técnicas de localização de RNA

Hibridização In Situ
O processo de hibridização in situ, desenvolvido por Mary Lou Pardue e Joseph

Gall (1970), permite ao pesquisador visualizar as posições de ácidos nucléicos espe-
cíficos dentro de células e tecidos. Se um clone específico é considerado interessan-
te (por exemplo, o clone endoderma-específico que foi mencionado) ele é cultivado em
grandes quantidades, e o gene clonado é isolado tratando o vetor recombinante com

enzimas de restrição. Esse é transformado em fita única e tornado radioativo. Quan-
do o cDNA radioativo é adicionado às células fixadas apropriadamente em lâminas
de microscópio, o cDNA radioativo se liga unicamente onde está presente o mRNA
complementar. Após eliminação do cDNA não fixado, a lâmina é coberta com uma
emulsão fotográfica transparente para auto-radiografia. As manchas resultantes,
diretamente acima de onde o cDNA radioativo foi ligado, parecem escuras quando
visualizadas diretamente, ou brancas quando vistas com iluminação em campo
escuro. Assim, pode-se visualizar aquelas células (ou mesmo regiões dentro das
células) que acumularam um tipo específico de mRNA. A Figura 2.25A,B mostra
hibridização in situ usando o cDNA específico para células endodérmicas. O cDNA
encontra mRNAs somente no endoderma da gástrula precoce do ouriço-do-mar.
Continuando a gastrulação, o cDNA (e portanto o mRNA) se localiza de forma
ainda mais precisa — entre a região do intestino posterior e o intestino médio no
tubo endodérmico.
Trabalhando com sondas radioativas e emulsões, torna-se necessário o uso de
secções microscópicas extremamente finas. Uma técnica mais recente para hibridiza-
ção in situ utiliza sondas que ligam reagentes coloridos. Dessa maneira, cientistas
podem observar órgãos inteiros (e organismos) sem seccioná-los, e com uma visão de
amplas regiões de expressão gênica. A Figura 2.25C mostra uma hibridização in situ,
realizada em montagem integral, em um embrião de camundongo com 10.5 dias. A
sonda reconhece o mRNA codificado pelo gene Brachyury (discutido na página 40),
que sintetiza uma proteína necessária para a produção de células mesodérmicas na
parte posterior do embrião de camundongo.
Transferências Northern
Podemos também determinar a expressão temporal e espacial de RNAs executando
uma transferência de RNA (freqüentemente chamada transferência Northern). En-
quanto transferências Southern transferem fragmentos de DNA do gel para o papel,
transferências Northern (nome não se relaciona com o inventor) transferem RNA
entre os mesmos suportes e da mesma maneira. O pesquisador pode extrair RNAs
mensageiros do embrião em vários estágios de desenvolvimento e submetê-los à
eletroforese lado a lado, em um gel. Após transferência dos RNAs separados para o
papel de nitrocelulose ou membrana de nylon, o conjunto é incubado em uma solu-
ção contendo um fragmento radioativo, mono-fita, de DNA de um determinado gene.
Esse DNA adere somente às regiões onde está localizado o RNA complementar.
Assim, se o mRNA para aquele gene está presente em um determinado estágio
embrionário, o DNA radioativo se liga a ele e pode ser detectado por auto-radiogra-
fia. Autoradiogramas desse tipo, onde vários estágios são comparados simultanea-
mente, são denominados transferências Northern de desenvolvimento. A Figura
2.26A mostra uma transferência Northern de desenvolvimento para a expressão de
um gene endoderma-específico durante o desenvolvimento do ouriço-do-mar. Po-
demos ver que o mRNA para essa proteína endodérmica é inicialmente sintetizado
durante o estágio de blástula mesenquimatosa e continuamente durante todo o
resto do desenvolvimento. A transferência Northern na Figura 2.26B mostra que a
acumulação desse mRNA no estágio de prisma é restrita ao endoderma (Wessel et
al.,1989). Hibridização in situ e transferências Northern fornecem as melhores evi-
dências em favor da transcrição diferencial de RNA, no espaço e no tempo. A trans-
crição de certos genes pode ser específica para tecidos ou tempo.
A distribuição temporal na transcrição de vários genes pode ser visualizada por
transferência de mancha. Por exemplo, Sargent e Dawid (1983) isolaram da gástrula de
Xenopus um mRNA que não estava presente no ovo. Para isso eles extraíram o mRNA
da gástrula e fizeram cópias cDNA dessas mensagens. Os cDNAs da gástrula foram
misturados com grandes quantidades de mRNA de oócitos. Se houvesse hibridização
entre o mRNA dos oócitos e o cDNA da gástrula, significaria que o cDNA era derivado
(B)
(A)
(C)
Figura 2.25
Hibridação in situ. (A,B) Fotomicrografias,
em fundo escuro, de hibridação in situ, mos-
trando a localização de mRNA endoderma-
específico em embrião de ouriço-do-mar. O
cDNA radioativo usado como sonda foi pre-
parado do gene clonado, feito a partir de
mRNA endoderma-específico (veja Figura
2.24). Esse cDNA radioativo se liga ao mRNA
do endoderma da gástrula precoce do ouriço-
do-mar (A) e ao endoderma do intestino mé-
dio e posterior da gástrula tardia do ouriço-
do-mar (B). (C) Hibridização in situ, em mon-
tagem integral, de um embrião de camundon-
go de 9.5-10.5 dias corado para mRNA de
Brachyury. Essa mensagem é transcrita em
células formando novo mesoderma, e nesse
estágio é encontrada na porção posterior do
embrião. Embriões fixados foram incubados
Enzima em uma sonda para mRNA de Brachyury (a
fosfatase Corante fita antisense complementar ao mRNA) que
alcalina (precipitado azul escuro) foi sintetizada usando uridina biotinilada.
Núcleo Após eliminar a parte da sonda que não se
Corante ligou ao mRNA de Brachyury (e inativar qual-
Anticorpo (incolor) quer atividade endógena de fosfatase alcalina
para biotina do embrião), o embrião foi tratado com anti-
Sonda complementar a mRNA de Brachyury corpos para biotina. Esses anticorpos foram
Biotina ligados às enzimas do tipo fosfatase alcalina.
tendo resíduos de biotina em suas uridinas
Colorir para a presença de fosfatase alcalina
permite que se determine a localização de um
mRNA específico. Fotografias coloridas da
mRNA de Brachyury hibridização in situ, em montagem integral,
estão nas Pranchas 22, 23 e 25. (A e B de
Wessel et al.,1989, cortesia de G. Wessel; C
do laboratório do autor.)
(A) Ovo de um mRNA presente em ambos os estágios, oócito e gástrula. Essas moléculas
Clivagem híbridas com dupla fita foram removidas por filtração, deixando uma população de
cDNAs gástrula-específico. Os cDNAs foram transformados na forma de dupla fita
Blástula
(pela DNA polimerase) e inseridos em veículos de clonagem. Essa técnica é denomina-
Blástula da de clonagem de subtração. Como a seleção dupla de bibliotecas de cDNA, a
Mesenquimatosa clonagem de subtração gera um conjunto de clones estágio-específicos cujo mRNA é
Blástula precoce
encontrado em alguns estágios, mas não em outros, ou em alguns tecidos mas não em
Blástula tardia outros (Figura 2.27).
Sargent e Dawid usaram embriões, dos estágios de zigoto a broto caudal do
Prisma
girino e, separadamente, isolaram seus RNAs. Os RNAs foram aplicados direta-
Plúteo mente (sem prévia eletroforese em gel) a filtros de nitrocelulose de modo que cada
filtro tinha RNAs de todos os estágios. Após a fixação (calor) dos RNAs no filtro,
(B) Ectoderma / mesoderma
DNA de fita única derivado de um específico clone “gastrular”, foi marcado radi-
oativamente e incubado com os filtros. Se um gene estava sendo transcrito em um
Endoderma determinado estágio, o cDNA radioativo daquele gene encontraria seu comple-
mento nos mRNAs daquele estágio, no filtro. Após eliminacão do cDNA não liga-
Figura 2.26 do, a ligação do cDNA radioativo foi observado por auto-radiografia. A transfe-
Transferência Northern para um gene especí- rência de manchas na Figura 2.28 mostra o esquema temporal de expressão para 17
fico no endoderma do ouriço-do-mar, Lytechi-
genes que são ativos em vários estágios da gastrulação. Nenhum deles é expresso
nus variegatus. (A) Transferência Northern
de desenvolvimento, mostrando acumulação antes da transição da blástula mediana em 7 horas. Alguns genes (DG64, DG39)
de mRNA de acordo com o estágio específico são expressos imediatamente depois, enquanto outros (DG72, DG81) começam a
desse gene. mRNA total (10 µg por estágio) ser transcritos na gástrula mediana, após aproximadamente 7 horas. Alguns genes
foi submetido à eletroforese em gel de agarose. (DG76, DG81) são mantidos após a ativação, enquanto a atividade de outros (DG56,
O gel foi transferido para papel tratado e os DG21) é muito mais transitória.
mRNAs aderidos ao papel, que foi em seguida
incubado com cDNA radioativo de um clone
endoderma-específico. Mostrou-se que esse
Encontrando mensagens raras pela
mRNA é sintetizado durante o estágio de blás-
reação da polimerase em cadeia
tula do mesênquima e aumentado ao longo do
desenvolvimento. (B) Transferência Northern A reação da polimerase em cadeia (PCR) é um método de clonagem in vitro que pode
no estágio de prisma, mostrando que o mRNA produzir enormes quantidades de um fragmento específico de DNA a partir de uma
está presente no endoderma (com algum me- pequena quantidade de material de partida (Saiki et al.,1985). Esse método pode ser
soderma aderido) mas não no ectoderma. RNA usado para clonar um gene específico ou para determinar se um gene específico está
total do endoderma foi eletroforisado (pista 2) ativamente transcrevendo RNA em um determinado órgão ou tipo de célula. O método
próximo ao mRNA do resto do ouriço-do-mar padrão de clonagem usa microorganismos vivos para amplificar o DNA recombinante.
(pista1). Ligação com cDNA radioativo detec-
PCR, no entanto, pode amplificar uma única molécula de DNA por um fator de vários
tou mRNA somente no endoderma. (de Wessel
et al., 1989, cortesia de G. Wessel.) milhões em poucas horas e o faz em um tubo de ensaio. Essa técnica tem sido extrema-
mente útil em casos onde a quantidade de ácido nucléico para estudo é muito peque-
na. Embriões de camundongos, por exemplo, na fase de pré-implantação têm muito
pouco mRNA e não se pode obter milhões desses embriões para estudo. Se fosse
necessário saber se o embrião de camundongo na fase de pré-implantação contém o
mRNA para uma proteína determinada, seria muito difícil descobrir usando os méto-
dos padrão de clonagem. Entretanto, a técnica do PCR permite encontrar essa mensa-
gem com poucos embriões, por amplificar especificamente somente aquela mensagem,
um milhão de vezes (Rappolee et al., 1988).
O uso de PCR para encontrar mRNAs raros está ilustrado na Figura 2.29. Os
mRNAs de um grupo de células são purificados e convertidos a cDNA por transcriptase
reversa. Usando DNA polimerase e S1 nuclease, a população de DNAs de fita única é
transformada em uma população de fita dupla. Em seguida, escolhe-se um DNA para
ser amplificado. Para isso, separam-se as duplas hélices do DNA, às quais são adici-
onados dois pequenos oligonucleotídeos iniciadores que são complementares a
uma porção da mensagem procurada. Se os oligonucleotídeos reconhecem seqüên-
cias no DNA, então o mRNA estava presente originalmente. Os oligonucleotídeos
foram preparados de forma a permitir uma hibridização com fitas opostas e lados
opostos da seqüência alvo. (Se a tentativa é isolar o gene ou mRNA para uma proteína
específica de seqüência conhecida, essas regiões laterais podem ser preparadas,
cDNA de gástrula que cDNA de gástrula sem

encontra mensagem seqüência complementar
Extrair complementar em a mRNA de oócitos
mRNA mRNA de oócito
Oócito mRNA total

de oócito Hibridizar
Extrair Fazer cDNA DNA polimerase

mRNA de mRNA S1 nuclease
Gástrula mRNA total cDNA de

de gástrula gástrula
cDNA de dupla
Figura 2.27 fita específico de gástrula
Clonagem de subtração de genes de gástrula expressos diferencialmente em Xenopus laevis.
cDNA foi produzido para mensagens isoladas de gástrula e hibridizado com mRNA de oócitos. Adicionar ligantes
Os cDNA de gástrula que não encontraram seqüências complementares nos mRNAs de
oócitos, eram produtos de genes ativos na gástrula mas não nos oócitos. Esses genes foram
clonados fazendo o cDNA de fita dupla e adicionando ligantes para permitir sua inserção em
veículos de clonagem.
Colocar em veículo
de clonagem
Figura 2.28
Transferências de mancha no desenvolvimento mostram os tempos em que 17 genes de Xenopus
estão transcrevendo ativamente. Acumulação específica de mRNA no citoplasma é registrada
embebendo mRNA total, de genes em estágios embrionários, em papel de nitrocelulose e incu- Plasmídeo recombi-
nante contendo DNA
bando a tira de papel com DNA radioativo derivado de um clone de cDNA específico de
para mRNA específico
gástrula. Justapondo essas tiras, obtem-se um esquema temporal para a atividade de genes para gástrula
específicos. A linha r5 representa um controle de RNA ribossômico que deve estar sempre
presente. (de Jamrich et al., 1985, cortesia de I. Dawid e M. Sargent.)
Blástula Gástrula Nêurula Broto de cauda
Estágio
Clone
Horas após a fertilização

Finais da seqüência do polipeptídeo
RNAs que codificam RNAs que codificam

o amino terminal o carboxi terminal
(iniciador 1) (iniciador 2)
RNA
1 cópia iniciador 1 DNA alvo
Aquecer a 95oC para
desnaturar DNA.
Esfriar a 37oC para RNA
permitir hibridização iniciador 2
dos iniciadores a DNA
Primeiro ciclo
Quando aquecido a 72o C, taq

polimerase estende fitas
complementares a partir dos
iniciadores
2 cópias
Primeiro ciclo de sínteses
resulta em duas cópias da seqüência
alvo de DNA
Desnatura DNA
Hibridiza
Segundo ciclo
iniciadores
Estende novas
fitas de DNA
Segundo ciclo de
sínteses resulta em
4 cópias quatro cópias da
seqüência alvo de DNA
Figura 2.29
Protocolo para a reação de polimerase em cadeia (PCR). Para determinar se um tipo particular
de mRNA está presente, todo mRNA é convertido a DNA de dupla fita pela transcriptase
reversa e DNA polimerase. Esse DNA é desnaturado e dois conjuntos de iniciadores são
adicionados. Se a seqüência específica estiver presente, os iniciadores se hibridizarão aos seus
terminais opostos. (Iniciadores específicos são produzidos com base na seqüência que se pro-
cura. Se é conhecida apenas a seqüência da proteína codificada pela mensagem, prepara-se um
conjunto de diferentes iniciadores, cada um possivelmente complementar ao DNA.) Usando
DNA polimerase termoestável de T. aquaticus, cada fita de DNA sintetiza seu complemento.
Essas fitas são, por sua vez, desnaturadas e os iniciadores são hibridizados a elas, iniciando o
ciclo novamente. Dessa maneira, o número de fitas novas com a sequência entre os dois
iniciadores aumenta exponencialmente.
sintetizando oligonucleotídeos que codificam o amino terminal da proteína e

oligonucleotídeos complementares aqueles que codificam o carboxi terminal da prote-
ína). Os finais 3' desses iniciadores estão face a face de modo que a replicação é
através do DNA alvo. Uma vez hibridizado o primeiro iniciador, a DNA polimerase
pode sintetizar uma nova fita.
Essa enzima não é a DNA polimerase normal de E. coli; é uma polimerase de

bactérias como Thermus aquaticus ou Thermococcus litoralis. Essas bactérias vivem Ovário de rato
Adulto
em fontes de água quente (como aquelas do Yellowstone National Park) ou nos respi- Ovário de camundongo
radouros térmicos de submarinos, onde a temperatura atinge valores próximos de
900C. Essas DNA polimerases podem suportar temperaturas próximas à ebulição e o Rim de camundongo
PCR se utiliza dessa adaptação evolucionária. Uma vez sintetizada a segunda fita, ela
Rim de camundongo
Embrião de 14 dias
é separada de seu complemento por desnaturação em alta temperatura. O segundo
iniciador é adicionado e agora ambas as fitas podem sintetizar novo DNA. Sucessivos Salivares de camundongo
ciclos de desnaturação e síntese amplificarão essa região do DNA de forma geométri-
ca. Após vinte turnos, aquela região específica estará amplificada 220 vezes (um pouco Pâncreas de camundongo
mais de um milhão). Quando submetido à eletroforese esse fragmento amplificado é Pulmão de camundongo
facilmente detectado. Isso mostra que o mRNA original com essa seqüência estava
presente na amostra. (A confirmação poderia ser feita por transferência Southern,
como na Figura 2.30). Além disso, pode-se usar essas cópias amplificadas para clona- Sem adição de DNA
gem, colocando-as em vetores de clonagem.
Figura 2.30
Determinando a função do gene: Evidência fornecida por PCR, para a síntese
de um fator de crescimento, activina, de ór-
células e organismos transgênicos gãos embrionários de camundongo. O mRNA
desses órgãos foi convertido em DNA e am-
Técnicas de inserção de DNA novo em uma célula plificado através de 20 ciclos de replicação.
Apesar de ser importante conhecer a seqüência de um gene e seu esquema temporo- O DNA foi submetido sucessivamente à ele-
espacial de expressão, o que é realmente crucial é conhecer a função daquele gene troforese e transferência Southern usando uma
no desenvolvimento. Técnicas recentes permitem estudar a função do gene, tirando sonda radioativa para uma parte do gene de
e repondo certos genes de células embrionárias. Pedaços de DNA clonados podem activina. mRNA de activina foi encontrado
ser modificados (se desejado), e colocados em células por vários meios. Uma técni- no ovário do camundongo adulto (como es-
ca muito direta é a microinjeção, na qual uma solução contendo o gene clonado é perado) e também em vários órgãos embrio-
nários. A possível função de activina nesses
cuidadosamente injetada no núcleo da célula (Capecchi, 1980). Essa é uma técnica
orgãos será discutida no Capítulo 17. (Corte-
especialmente útil para injetar genes em ovos recentemente fertilizados, pois os sia de O. Ritvos.)
núcleo haplóides do espermatozóide e do óvulo são relativamente grandes (Figura
2.31). Em transfecção, o DNA é incorporado diretamente na célula por incubação em
uma solução determinada onde a célula o incorpora. A probabilidade de incorpora-
ção de tal fragmento de DNA no cromossomo é relativamente pequena, sendo ne-
cessário misturar o DNA com outro gene que permite a sobrevivência das raras
células que o incorporaram, em condições de cultura onde as outras células são
destruídas (Perucho et al.,1980; Robins et al.,1981).
Outra técnica é a eletroporação, onde pulsos de alta voltagem “empurram” o DNA
para dentro da célula. Um método mais “natural” para introduzir genes na célula é
colocar o gene clonado em um elemento transponível ou vetor retroviral. Esses são
regiões móveis de DNA, de ocorrência natural, que podem ser integrados no genoma.
Retrovírus são vírus contendo RNA. Dentro da célula hospedeira eles produzem uma
cópia de seu DNA (usando sua própria transcriptase reversa); a cópia se transforma
em dupla fita e se integra em um cromossomo do hospedeiro. A integração é consuma-
da devido às duas seqüências idênticas (longas repetições terminais) nos terminais
do DNA retroviral. Vetores retrovirais são produzidos removendo os genes do
empacotamento viral (necessários para a saída dos vírus da célula) do centro de um
retrovírus de camundongo. Essa extração cria um sítio vazio onde outros genes po-
dem ser colocados. Usando enzimas de restrição apropriadas, o pesquisador pode
remover genes de um fago ou plasmídeo clonado e reinserir o gene em vetores retrovirais.
Retrovetores virais infectam células de camundongo com eficiência próxima de 100%.
Em Drosophila, novos genes podem ser introduzidos na mosca, via elementos P.
Essas seqüências de DNA, são elementos transponíveis de ocorrência natural que
podem ser integrados como vírus em qualquer região do genoma da Drosophila.
Ainda mais, eles podem ser isolados, e genes clonados inseridos no centro do elemen-
to P. Quando o elemento P recombinado é injetado em um oócito de Drosophila, ele
pode se integrar ao DNA e prover o embrião de um novo gene (Spradling e Rubin, 1982).
Camundongos quiméricos
As técnicas descritas têm sido usadas recentemente para transferir genes para to-
das as células do embrião de camundongo (Figura 2.32). Durante o desenvolvimen-
to do camundongo existe um estágio onde somente estão presentes dois tipos de
células: as células externas, que formarão a porção fetal da placenta, e as células
internas, que darão origem ao próprio embrião. Essas células internas são chamadas
células embrionárias precursoras (células tronco), porque cada uma delas pode,
se isolada, gerar todas as células do embrião (Gardner, 1968; Moustafa e Brinster,
1972). Essas células podem ser isoladas do embrião de um camundongo e cultiva-
das. Uma vez em cultura, elas podem ser tratadas como descrito, de modo a incorpo-
rar novo DNA. A nova célula embrionária precursora (não somente o DNA, mas a
célula inteira) pode ser injetada em outro embrião de camundongo em fase precoce.
Assim, a célula precursora tratada estará integrada no embrião do hospedeiro. O
resultado é um camundongo quimérico*. Algumas de suas células são derivadas
das células embrionárias precursoras do hospedeiro, mas outra porção de células é
derivada também das células precursoras tratadas. Se as células tratadas se torna-
ram parte da linha germinal do camundongo, alguns dos seus gametas serão deriva-
dos da célula doadora. Quando cruzado com um camundongo do tipo selvagem,
alguns de seus descendentes levarão, portanto, uma cópia do gene inserido. Os
descendentes heterozigotos, no acasalamento produzirão 25% de embriões carre-
Figura 2.31 gando duas cópias do gene inserido em cada célula de seu corpo (Gossler et al.,1986).
Injeção de DNA (de genes clonados) em um
Assim, em três gerações — o camundongo quimérico, o camundongo heterozigoto
núcleo (neste caso, um pronúcleo de um ovo
de camundongo). (de Wagner et al.,1981, cor- e o camundongo homozigoto — um gene que foi clonado de um outro indivíduo,
tesia de T. E. Wagner.) está agora presente em ambas as cópias dos cromossomos dentro do genoma do
camundongo. Camundongos com genes estáveis de outros indivíduos são chama-
dos camundongos transgênicos. Essas linhagens têm sido particularmente úteis na
determinação das funções de regiões reguladoras que ladeiam os genes.
Experimentos com genes com endereçamento

(Gene targeting ou Knockout)
A análise de embriões precoces de mamíferos foi durante muito tempo prejudicada
pela dificuldade em criar e selecionar mutações que afetam a fase inicial do desen-
volvimento embrionário. Esse problema foi superado pela técnica chamada de
endereçamento de genes (às vezes, chamada de “Knockout”). As técnicas são simi-
lares àquelas que produzem camundongos transgênicos, mas em lugar de adicionar
genes, endereçar genes significa trocar alelos do tipo selvagem por outros mutados.
Chisaka e Capecchi (1991) usaram essa técnica para estudar a função do gene Hoxa-
3 no desenvolvimento do camundongo. Hoxa-3 é semelhante a vários genes de
Drosophila que são conhecidos como controladores da expressão gênica de seg-
mentos específicos no embrião precoce; a proteína codificada por Hoxa-3 liga-se ao
DNA, exatamente como sua correspondente na Drosophila. Seria possível que Hoxa-
3 de maneira similar estaria regulando a expressão gênica espaço-específica nos
mamíferos? Chisaka e Capecchi isolaram o gene Hoxa-3, cortaram-no com uma enzima
de restrição e inseriram nesse sítio um gene para resistência à neomicina (Figura
2.33). Em outras palavras, eles mutaram o gene Hoxa-3 pela inserção de um grande
pedaço de DNA que continha um gene resistente à neomicina, destruindo a habili-
dade da proteína Hoxa-3 em se ligar a DNA. Esses genes mutantes Hoxa-3 foram
eletroporados em células embrionárias precursoras que eram sensíveis à neomicina.
* É crítico notar a diferença entre uma quimera e um híbrido. Um híbrido resulta da união de dois
genomas diferentes dentro da mesma célula: o descendente de um genitor de genótipo AA e outro de
genótipo aa é um híbrido Aa. Uma quimera resulta quando células de constituição genética diferente
aparecem no mesmo organismo. O termo é apto: refere-se a um monstro mitológico com cabeça de
leão, corpo de bode e cauda de serpente.
Células embrionárias
precursoras
Gene clonado
no vetor
Cultura de células
Trofoblasto embrionárias precursoras
Mistura de células Seleção de células
embrionárias precursoras embrionárias precursoras
com o gene clonado que incorporaram o transgene
Microinjetar Integração das células Injetar no

células precursoras no hospedeiro útero
transgênicas no Camundongos
embrião hospedeiro quiméricos
Figura 2.32
Produção de camundongos transgênicos. Cé-
lulas embrionárias precursoras de um camun-
dongo são cultivadas e o genoma alterado pela
adição de um gene clonado. As células
transgênicas são selecionadas e injetadas em
um embrião hospedeiro de camundongo na sua
fase precoce. Aqui, as células embrionárias
Camundongos precursoras transgênicas se integram às celulas
transgênicos precursoras do hospedeiro. Esse embrião é
homozigotos colocado no útero de um camundongo fêmea
Camundongos
grávida e se desenvolve em um camundongo
transgênicos
heterozigotos quimérico. Se as células precursoras doadoras
contribuíram para a linha germinativa, e o ca-
mundongo quimérico é cruzado com um do
tipo selvagem, parte dos descendentes serão
Uma vez dentro do núcleo dessas células, o gene Hoxa-3 mutado substituiu um heterozigotos ao alelo adicionado. Cruzando
alelo normal desse gene por um processo chamado recombinação homóloga. Aqui, heterozigotos, pode ser gerada uma linhagem
de camundongos que é homozigota ao alelo
as enzimas envolvidas no reparo de DNA e replicação incorporam o gene mutante
adicionado. Essa seria uma linhagem transgê-
em lugar da cópia normal. Esse é um evento raro, mas tais células podem ser nica. O gene adicionado (o transgene) pode
selecionadas cultivando as células precursoras em neomicina. A maioria das células ser de qualquer fonte eucariótica.
morre com a droga, mas aquelas que adquiriram resistência pelo gene incorporado
sobrevivem. As células resultantes têm um gene Hoxa-3 normal e um Hoxa-3 mutado.
As células precursoras heterozigotas são microinjetadas em um blastócito de ca-
mundongo e se integram nas células do embrião. O camundongo resultante é uma
quimera composta de células do tipo selvagem do embrião hospedeiro e de células
heterozigotas Hoxa-3, das células precursoras. As quimeras são acasaladas com
camundongos do tipo selvagem e se algumas das células doadoras se integraram à
linhagem das células germinativas, alguns dos descendentes serão heterozigotos
(A)
Massa
celular neo r
interna
Cultura de células
Blastócito embrionárias
precursoras (ES) Recombinação
Eletroporação homóloga
(B) Célula
gene Hoxa-3 precursora
embrionária
Hoxa-3
Endonucleases gene Hoxa-3 mutado
de restrição com o gene neor inserido
gene neor
Figura 2.33
Seleção de células ES
Técnica de endereçamento de genes (gene targeting). Nesse caso o gene alvo é o heterozigotas por sua
Hoxa-3. (A) Células embrionárias precursoras (ES) são cultivadas a partir de uma resistência à neomicína
massa celular interna. (B) Os genes Hoxa-3 clonados são cortados com uma enzima
de restrição, e um gene neomicina-resistente é inserido na região que codifica o sítio
de ligação da proteína ao DNA. Esses genes Hoxa-3 mutantes são eletroporados em
células ES, onde recombinação homóloga troca o gene do tipo selvagem pela cópia Injeção de células ES
mutada. As células são selecionadas pela sua resistência à neomicina. (C) As células heterozigotas no
(C)
blastócito
ES heterozigotas selecionadas são inseridas na massa interna de células de um em-
brião do tipo selvagem, e o blastócito é retornado ao útero. O camundongo resultante
é uma quimera composta de tecidos Hoxa-3 heterozigotos e tecidos Hoxa-3 do tipo
selvagem. Cruzando os animais quiméricos com camundongos do tipo selvagem
produz-se descendentes Hoxa-3 heterozigotos se as células ES contribuíram na
linhagem germinativa. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e Injeção dos
aproximadamente 25% de sua cria deve ser de homozigotos mutantes de Hoxa-3. blastócitos no útero
Produção de
camundongos quiméricos
Cruzamento de
quiméricos com
tipo selvagem
Cruzamento de
camundongos
heterozigotos
Hoxa-3¯/ Hoxa-3+
Heterozigotos Heterozigotos
Hoxa-3¯/ Hoxa-3¯
Homozigoto
para o gene Hoxa-3. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e apro-
ximadamente 25% de seus descendentes devem levar duas cópias do gene mutado
Hoxa-3. Esses camundongos mutantes homozigotos não possuem as glândulas
tireóide, paratireóide e timo! Dessa maneira, endereçando genes pode-se analisar as
funções de determinados genes durante o desenvolvimento de mamíferos.
[gene7.html]
Determinando a função de uma mensagem:

RNA antisense
Outro método para determinar a função de um gene é fazer cópias “antisense” de sua
mensagem. Mensagens antisense podem ser produzidas usando cDNA clonado e
fazendo sua reclonagem em reverso, próximo a um vigoroso promotor bacteriano, em
outro vetor. O promotor bacteriano iniciará a transcrição da mensagem na “direção
errada” quando for incubado com RNA polimerase e nucleosídeos trifosfato. Dessa
maneira, é sintetizado um transcrito que é complementar aquele natural (Figura 2.34A).
O transcrito complementar é chamado RNA antisense porque é o reverso da mensa-
gem original. Quando grandes quantidades de RNA antisense são injetadas ou
transfectadas em células contendo o mRNA normal desse gene, o RNA antisense se
liga à mensagem normal; o ácido nucléico dupla-fita resultante é degradado (enzimas Figura 2.34
do citoplasma das células digerem ácidos nucléicos de fita dupla). Isso causa uma Producão de RNA antisense para examinar a
depleção funcional da mensagem, como se houvesse uma mutação eliminatória para função dos genes no desenvolvimento. (A)
aquele gene. Produção da mensagem antisense (neste caso,
Esses resultados foram confirmados quando RNA antisense foi produzido a partir ao gene Krüppel da Drosophila) colocando o
fragmento de cDNA clonado para a mensagem
do gene Krüppel de Drosophila. Krüppel é crítico para a formação do tórax e do
Krüppel entre dois vigorosos promotores. Os
abdômen da mosca. Se esse gene está ausente, as larvas da mosca morrem pela falta promotores estão em orientação oposta com
dos segmentos torácico e abdominal anterior (Figura 2.34B); uma situação semelhante respeito ao cDNA do Krüppel. Nesse caso, o
é criada quando grandes quantidades de RNA antisense contra a mensagem Krüppel promotor T3 está em orientação normal e o
são injetados em embriões precoces da mosca (Rosenberg et al.,1985). RNA antisense promotor T7 está revertido. Os promotores
permite ao biologista do desenvolvimento determinar a função dos genes durante o reconhecem RNA polimerases diferentes (dos
desenvolvimento e analisar a ação dos genes em animais; de outra forma isso seria bacteriófagos T3 e T7, respectivamente). T3
inacessível à análise genética. polimerase permite a transcrição de mRNA de
consenso, ao passo que T7 polimerase pro-
duz transcritos antisense. (B) Resultado da
Reinvestigação de velhos problemas com novos métodos injeção da mensagem Krüppel antisense em um
embrião precoce (estágio blastodérmico
A união da embriologia com a biologia molecular está permitindo ao biologista do sincicial) de Drosophila antes que a mensa-
desenvolvimento uma nova apreciação de como trabalham os genes na construção de gem Krüppel seja produzida. A figura central é
um organismo. Estamos em meio à uma revolução nos nossos conhecimentos sobre um embrião do tipo selvagem pouco antes de
desenvolvimento, e um dos maiores sucessos resultantes de clonagens e eclodir. Acima está o mutante causado pela
seqüenciamentos é a nova “anatomia” do gene eucarioto. Descreveremos a estrutura falta do genes Krüppel. Abaixo está o embrião
do gene com mais detalhe no Capítulo 10, mas é importante ressaltar que os genes do tipo selvagem, injetado com a mensagem
Krüppel antisense no estágio embrionário pre-
eucariotos que codificam proteínas têm vários sítios regulatórios (Figura 2.35). Um
coce. Ambos os embriões, mutante e o tratado
sítio, o promotor, está localizado diretamente a montante do gene (antes do início) e é com antisense, não possuem os segmentos
torácico e abdominal anterior. (B, de acordo
(A) com Rosenberg et al., 1985.)
mRNA de consenso (B) Embrião mutante Krüppel

(sense) Krüppel
promotor
T7
mRNA
antisense Embrião normal
Krüppel
T3 RNA
T3 polimerase polimerase
promotor T7 RNA Embrião normal
infectado com RNA
“antisense” Krüppel
o sítio onde se liga a RNA polimerase. Localizada em algum lugar dentro do gene (a
jusante ou a montante, ou ainda em um íntron dentro do gene), está uma segunda
região chamada intensificadora. Fatores protéicos que se ligam ao intensificador per-
mitem sua interação com o promotor e, conseqüentemente, com a transcrição do gene
pela RNA polimerase. Alguns promotores (como aqueles usados por produtos relaci-
onados ao metabolismo geral da célula) não precisam ser ativados por intensificado-
res, mas a maioria dos genes ligados ao desenvolvimento são ativados em tempos e
células específicos. Esses genes precisam ser ativados por fatores que se ligam ao
intensificador e ao promotor. Como veremos no Capítulo 10, a ligação de diferentes
fatores de transcrição aos promotores e intensificadores de genes específicos é um
dos mecanismos que controlam a produção de proteínas diferentes a partir de genomas
idênticos. Um exemplo é a ativação do gene para ZP3.
Como detalharemos no Capítulo 4, ZP3 é a principal proteína ligante de espermato-
zóide na superfície do óvulo de camundongo. É uma glicoproteína sintetisada pelo
oócito durante sua maturação em óvulo (Roller et al.,1989). Uma transferência Northern
mostra que o mRNA para essa proteína é sintetizado somente em oócitos em cresci-
mento e não pode ser detectado em nenhum outro tipo de célula (Figura 2.36). O que
permite a esse gene ser ativado somente nos oócitos? Lira e colaboradores (1990)
isolaram o gene para ZP3, determinaram sua seqüência e encontraram um sítio promo-
tor, 28 pares de bases a montante do sítio onde a transcrição do gene é iniciada. Como
hipótese, consideraram que seqüências responsáveis por ativação oócito-específica
podem existir até mais longe, a montante do gene. Eles usaram enzimas de restrição
para isolar o DNA da região 5', a montante, (com 150 pares de bases) e o fundiram ao
gene para a luciferinase de vaga-lume. (Não é necessário dizer que essa enzima produ-
tora de luz não é encontrada em camundongos. Está sendo usada aqui como um “gene
repórter” para monitorar onde o DNA a montante pode causar sua expressão.) O gene
recém-construído, contendo a região a montante do gene ZP3 ligada ao gene estrutu-
ral para luciferinase, foi injetado em zigotos de camundongo para criar animais
transgênicos, levando em cada núcleo o gene luciferinase com a região regulatória
ZP3. Em camundongos transgênicos fêmeas, a hibridização in situ localizou mRNA de
luciferinase em um único tipo de célula, o oócito (Figura 2.37). Assim, a seqüência de
DNA com 150 pares de bases foi necessária e suficiente para ativar o gene (qualquer
gene!) no oócito. Dentro dessa região de 150 pares de bases (de 99 a 86 pares de bases
a montante do gene estrutural ZP3) existe a seqüência 5’-GATAA-3' que liga uma
proteína chamada OSP-1. OSP-1 é encontrada somente em oócitos em maturação; ela
ativa o gene ZP3 ligando-se a essa sequência de DNA no promotor. Parece, então, que
ZP3 é sintetizado em oócitos porque eles têm a proteína OSP-1 que se liga a certas
seqüências de DNA que são parte de seu promotor (Schickler et al.,1992). No momen-
to, está sendo investigado como é regulado o gene codificador de OSP-1.
Figura 2.35
Estrutura básica de um gene regulado pelo de-
senvolvimento. O promotor da maioria dos
genes codificadores de proteínas é encontrado
no terminal 5' (a montante) do gene. O intensi-
ficador freqüentemente está mais acima, a mon-
tante, mas pode ser encontrado dentro de um Intensificador
íntron ou no terminal 3'. Proteínas que se li- Promotor Éxon Íntron Éxon Íntron Éxon
gam ao promotor e aos intensificadores
interagem para regular a transcrição do gene.
(No exemplo ZP3, o sítio OSP-1, GATAA,
está localizado no promotor, aproximadamen-
te 95 pares de bases a montante do sítio de Intensificador Intensificador
início da transcrição. Um sítio intensificador
sensível a estrogênios é encontrado no primei- “a montante “a jusante”
ro íntron do gene ZP3.) do gene” do gene
Figura 2.36 Oócito

Transferência Northern de RNA de ZP3 acumulado no camundongo. RNA de vários tecidos
Ovário
(10µg por pista) e oócitos (125ng) foram submetidos à eletroforese e transferidos para papel de
nitrocelulose. Um fragmento radioativamente marcado do gene ZP3 foi usado como sonda do Cérebro
mRNA. A mensagem ZP3 foi encontrada somente no ovário, especialmente dentro dos oócitos. Embrião de 13 dias
(de Roller et al.,1989, cortesia de P. Wassarman).
Coração
Intestino
Rim
Uma conclusão e um alerta
Fígado
Depois de quase um século, estamos começando a entender como as células regulam Músculo
a expressão diferenciada de seus genes, permitindo que genes diferentes possam se Testículos
tornar ativos em diferentes células. Esse conhecimento está ajudando a explicar como Útero
a informação herdada é utilizada para construir os planos básicos do corpo e os tipos
específicos de células do organismo em desenvolvimento.
Entretanto, uma palavra de alerta. Caso o tom celebratório deste capítulo deixou a
impressão de que desenvolvimento é somente uma função da atividade gênica é
necessário relembrar do Capítulo 1, que a distinção entre talo e esporo (Dictyoste-
lium), estado amebóide e flagelado (Naegleria) e gonídios sexual e assexual (Volvox)
é determinada pelo ambiente. Em capítulos posteriores (especialmente Capítulo 21),
veremos outros exemplos do controle ambiental do desenvolvimento: determinação
de sexo temperatura-dependente em répteis, desenvolvimento em insetos dependente
da dieta, e a diferenciação, dependente de experiência, dos neurônios e linfócitos em
mamíferos. Nesses casos o organismo herda a habilidade para responder aos sinais
do ambiente, mas não é possível predizer o fenótipo a partir do genótipo.
(A) (B)
Figura 2.37
Hibridização in situ da expressão do gene repórter luciferinase, quando luciferinase foi
ligado ao promotor do gene ZP3. A sonda radioativa era dirigida à mensagem luciferinase,
a qual apareceu onde foi expressa sob a direção do promotor de ZP3. (A) Visão do
ovário inteiro (60x). (B) Magnificação (160x) de dois folículos ovarianos contendo
oócitos em maturação. (de Lira et al., 1990, cortesia de P. Wassarman.)
LITERATURA CITADA
Allen, G. E. 1978. Thomas Hunt Morgan: The Brush, S. 1978. Nettie Stevens and the discovery Gilbert, S. F. 1991. Induction and the origins
Man and His Science. Princeton University of sex determination. Isis 69: 132-172. of developmental genetics. In S. Gilbert
Press, Princeton, NJ. (ed.), A Conceptual History of Modern
Burian, R., Gayon, J. and Zallen, D. T. 1991.
E m b r y o l o g y. P l e n u m , N e w Yo r k , p p .
Allen, G. E. 1986. T. H. Morgan and the split Boris Ephrussi and the synthesis of genetics and
181-206.
between embryology and genetics, 1910-1935. embryology. In S. Gilbert (ed.), A Conceptual
In T. J. Horder, J. A. Witkowski and C. C. Wylie History of Modern Embryology. Plenum, New Gilbert, S.F. 1996. Enzyme adaptation and the
(eds.), A History of Embryology. Cambridge York, pp. 207-227. entrance of molecular biology into embryology.
University Press, New York, pp. 113-146. In S. Sarkar (ed.), The Molecular Philosophy
Burkholder, G. D. 1976. Whole mount electron
and History of Molecular Biology: New
Ashburner, M. 1972. Patterns of puffing activity microscopy of polytene chromosome from Dro-
Perspectives, Kluwer Academic Publishers,
in the salivary glands of Drosophila. VI. sophila melanogaster. Can. J. Genet. Cytol. 18:
Dordrecht, pp. 101-123.
Induction by ecdysone in salivary glands of D. 67-77.
melanogaster cultured in vitro. Chromosoma Gluecksohn-Schoenheimer, S. 1938. The deve-
Capecchi, M. R. 1980. High efficiency trans-
38: 255-281. lopment of two tailless mutants in the house
formation by direct microinjection of DNA into
mouse. Genetics 23: 573-584.
Ashburner, M. and Berondes, H. D. 1978. Puffing cultured mammalian cells. Cell 22: 479-488.
of polytene chromosomes. In The Genetics and Gluecksohn-Schoenheimer, S. 1940. The effect
Chisaka, 0. and Capecchi, M. R. 1991. Regionally
Biology of Drosophila, Vol. 2B. Academic Press, of an early lethal (to) in the house mouse. Gene-
restricted developmental defects resulting from
New York, pp. 316-395. tics 25: 391-400.
targeted disruption of the homeobox gene box
Baltzer, F. 1967. Theodor Boveri: Life and Work 1.5. Nature 350: 473-479. Goldschmidt, R. B. 1938. Physiological Gene-
of a Great Biologist. (Trans. D. Rudnick.) tics. McGraw-Hill, New York. [p. 1]
Clever, U. 1966. Induction and repression of
University of California Press, Berkeley.
a puff in Chironomus tentans. Dev. Biol. Gossler, A., Doetschman, T., Korn, R., Serfling,
Barnett, T., Pachl, C., Gergen, J. P. and Wensink, 14:421-438. E. and Kemler, R. 1986. Transgenesis by means
P. C. 1980. The isolation and characterization of blastocyst -derived stem cell lines. Proc. NatI.
Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., Boyer, H. W. and
of Drosophila yolk protein genes. Cell 21: Acad. Sci. USA 83: 9065-9069.
Helling, R. B. 1973. Construction of biologically
729-738.
functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Grossbach, U. 1973. Chromosome puffs and gene
Becker, H. J. 1959. Die Puffs der Speicheldrü- Acad. Sci. USA 70: 3240-3244. expressions in polytene cells. Cold Spring
senchromosomen von Drosophila melanogas- Harbor Symp. Quant. Biol. 38: 619-627.
DiBerardino, M. A. 1987. Genomic potential of
ter. I. Beobachtungen zum Verhalten des Puff-
differentiated cells analyzed by nuclear trans- Gurdon, J. B. 1962. The developmental capacity
musters im Normalstamm und bei zwei
plantation. Am. Zool. 27: 623-644. of nuclei taken from intestinal epithelial cells
Mutanten, giant- und lethal-giant Larvae. Chro-
of feeding tadpoles. J. Embryol. Exp. Morphol.
mosoma 10: 654-678. DiBerardino, M. A. 1989. Genomic activation
10: 622-640.
in differentiated somatic cells. In M. A.
Beermann, W. 1952. Chromomerenkonstanz
DiBerardino and L. D. Etkin (eds.), Develop- Gurdon, J. B. 1968. Transplanted nuclei and cell
und spezifische Modifikationen der Chromo-
mental Biology: A Comprehensive Synthesis. differentiation. Sci. Am. 219(6): 24-35.
somenstruktur in der Entwicklung und Organ-
Plenum, New York, pp. 175-198.
differenzierung von Chironomus tentans. Chro- Gurdon, J. B. 1977. Egg cytoplasm and gene
mosoma 5: 139-198. DiBerardino, M. A. and King, T. J. 1967. Deve- control in development. Proc. R. Soc. Lond.
lopment and cellular differentiation of neural [B] 198: 211-247.
Beermann, W. 1961. Ein Balbiani -ring als
nuclear transplants of known karyotypes. Dev.
Locus einer Speicheldrüsen -Mutation. Chro- Gurdon, J. B. and Uehlinger, V. 1966. “Fertile”
Biol. 15:102-128.
mosoma 12: 1-25. intestinal nuclei. Nature 210: 1240-1241.
Dumont, J. N. and Yamada, T. 1972. Dediffe-
Beermann, W. 1963. Cytological aspects of Gurdon, J. B., Laskey, R. A. and Reeves, 0. R.
rentiation of iris epithelial cells. Dev. Biol.
information transfer in cellular differentiation. 1975. The developmental capacity of nuclei
29:385-401.
Am. Zool. 3: 23-28. transplanted from keratinized cells of adult frogs.
Gardner, R. L. 1968. Mouse chimeras obtained J. Embryol. Exp. Morphol. 34: 93-112.
Blattner, F. R. and eight others. 1978. Cloning
by the injection of cells into the blastocyst.
human fetal g-globin and mouse a-type globin Harrison, R. G. 1937. Embryology and its
Nature 220: 596-597.
DNA: Preparation and screening of shotgun relations. Science 85: 369-374.
collections. Science 202:1279-1283. Gilbert, S. F. 1978. The embryological origins
Harwood, J. 1993. Styles of Scientific Thought:
of the gene theory. J. Hist. Biol. 11: 307-351.
Boveri, T. 1904. Ergebmisse über die Konstitu- The German Genetics Community 1900-1933.
tion der chromatischen Substanz des Zelkerns. Gilbert, S. F. 1987. In friendly disagreement: The University of Chicago Press, Chicago.
Gustav Fisher, Jena. [p. 123] Wilson, Morgan, and the embryological origins
Hennen, S. 1970. Influence of spermine and reduced
of the gene theory. Am. Zool. 27: 797-806.
Briggs, R. 1979. Genetics of cell type deter- temperature on the ability of transplanted nuclei to
mination. Int. Rev. Cytol. [Suppl.] 9: Gilbert, S. E 1988. Cellular politics: Ernest Everett promote normal development in eggs of Rana
107-127. just, Richard B. Goldschmidt, and the attempts to pipiens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66: 630-637.
reconcile embryology and genetics. In R. Rainger,
Briggs, R. and King, T. J. 1952. Transplan- Holland, P. W. H. and Hogan, B. L. M. 1986.
K. R. Benson and J. Maienschein (eds.), The
tation of living nuclei from blastula cells Phylogenetic distribution of Antennapedia-like
American Development of Biology. University of
into enucleated frogs’ eggs. Proc. Natl. Acad. homeoboxes. Nature 321: 251-253.
Pennsylvania Press, Philadelphia, pp. 311-346.
Sci. USA 38:455-463.
Jacob, F. and Monod, J. 1961. Genetic regulatory Morange, M. 1996. Construction of the develo- Roller, R. J., Kinloch, R. A., Hiraoka, B. Y.,
mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. pmental gene concept. The crucial years: Li, S. S.-L. and Wassarman, P. M. 1989. Gene
Biol. 3: 318-356. 1960-1980. Biol. Zent. bl. 115:132-138. expression during mammalian oogenesis and
early embryogenesis: Quantification of three
Jamrich, J., Sargent, T. D. and Dawid, I. 1985. Morgan, I H. 1897. The Frog’s Egg. Macmi- messenger RNAs abundant in fully grown
Altered morphogenesis and its effects on gene llan, New York. [p. 135]. mouse oocytes. Development 106:251-261.
activity in Xenopus laevis embryos. Cold Spring
Morgan, T. H. 1926. The Theory of the Gene. Rosenberg, U. B., Preiss, A., Seifert, E., Jäckle,
Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 31-35.
Yale University Press, New Haven. H. and Knüpple, D. C. 1985. Production of
Judson, H. F. 1979. The Eighth Day of Creation. phenocopies by Kriippel antisense RNA
Moustafa, L. A. and Brinster, R. L. 1972. Induced
Simon & Schuster, New York. injection into Drosophila embryos. Nature 313:
chimaerism by transplanting embryonic cells into
Just, E. E. 1939. The Biology of the Cell Surface. mouse blastocysts. J. Exp. Zool. 181: 193-202. 703-706.
Blakiston, Philadelphia. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.
Nathans, D. and Smith, H. 0. 1975. Restriction
Keller, E. F. 1995. Refiguring Life: Metaphors endonucleases in the analysis and restructuring B., Horn, G. T., Erlich, H. A. and Arnheim, N.
of Twentieth-Century Biology. Colorado of DNA molecules. Annu. Rev. Biochem. 44: 1985. Enzymatic amplification of β-globin
University Press. 273-293. genomic sequences and restriction site analysis
for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:
King, T. J. 1966. Nuclear transplantation in Okada, T. S. 1991. Transdifferentiation. Oxford 1350-1354.
amphibia. Methods Cell Physiol. 2: 1-36. University Press, New York.
Sander, K. 1986. The role of genes in ontogene-
King, T. J. and Briggs, R. 1956. Serial transplan- Oppenheimer, J. M. 1981. Walter Landauer and sisevolving concepts from 1883 to 1983 as
tation of embryonic nuclei. Cold Spring Harbor developmental genetics. In S. Subtelny and U. perceived by an insect embryologist. In T. J.
Symp. Quant. Biol. 21: 271-289. K. Abbott (eds.), Levels of Genetic Control in Horder, J. A. Witkowski and C. C. Wylie (eds.),
Development. Alan R. Liss, New York, pp. 1-13. A History of Embryology. Cambridge University
Lambert, B. 1972. Repeated DNA sequences in
Press, New York, pp. 363-395.
a Balbiani ring. J. Mol. Biol. 72: 65-75. Orr, N. H., DiBerardino, M. A. and McKinnell,
R. G. 1986. The genome of frog erythrocytes Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R.
Lambert, B. and Daneholt, B. 1975. Microa-
displays centuplicate replications. Proc. Natl. 1977. DNA sequencing with chain-termina-
nalysis of RNA from defined cellular compo-
Acad. Sci. USA 83: 1369-1373. ting inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
nents. Methods Cell Biol. 10: 17-47.
74:5463-5467.
Pardue, M. L. and Gall, J. G. 1970. Chromoso-
Lederman, M. 1989. Research note: Genes on
mal localization of mouse satellite DNA. Science Sapp, J. 1987. Beyond the Gene: Cytoplasm
chromosomes: The conversion of Thomas Hunt
168: 1356-1358. Inheritance and the Struggle for Authority in
Morgan. J. Hist. Biol. 22: 163-176.
Genetics. Oxford Universtiy Press.
Paul, D. B. and Kimmelman, B. A. 1988. Mendel
Lillie, F. R. 1927. The gene and the ontogenetic
in America: Theory and practice, 1900-1919. Sargent, T. D. and Dawid, I. 1983. Differential
process. Science 64: 361-368.
In R. Rainger, K. R. Benson and J. Maienschein gene expression in the gastrula of Xenopus laevis.
Lira, A. A., Kinloch, R. A., Mortillo, S. and Was- (eds.), The American Development of Biology. Science 222: 135-139.
sarman, P. A. 1990. An upstream region of the University of Pennsylvania Press, Philadelphia,
pp. 281-310. Schickler, M., Lira, S., Kinloch, R. A. and
mouse ZP3 gene directs expression of firefly
Wassarman, P. A. 1992. A mouse oocytes-
luciferinase specifically to growing oocytes in
Perucho, M., Hanahan, D. and Wigler, M. 1980. pecific protein that binds to a region of
transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
Genetic and physical linkage of exogenous mZP3 promoter responsible for oocyte
7215-7219.
sequences in transformed cells. Cell 22: 309-317. -specific mZP3 gene expression. Mol. Cell
McGinnis, W., Garber, R. L., Wirz, J. Kurioiwa, Biol. 122:120-127.
Prather, R. S. 1991. Nuclear transplantation and
A. and Gehring, W. J. 1984. A homologous
embryo cloning in mammals. Int. Lab. Animal Smith, L. D. 1956. Transplantation of the nuclei
protein-coding sequence in Drosophila homeotic
Res. News 33: 62-68. of primordial germ cells into enucleated eggs of
genes and its conservation in other metazoans.
Rana pipiens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54:
Cell 37: 403-408. Prather, R. S., Barnes, F. L., Sims, M. M., Robl,
101-107.
J. M., Eyestone, W. H. and First, N L. 1987.
McGrath, J. and Solter, D. 1983. Nuclear trans-
Nuclear transplantation in the bovine embryo: Southern, E. M. 1975. Detection of specific
plantation in the mouse embryo by microsur-
Assessment of donor nuclei and recipient oocyte. sequences among DNA fragments separated by
gery and cell fusion. Science 220: 1300-1302.
Biol. Reprod. 37: 859-866. gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503-517.
McGrath, J. and Solter, D. 1984. Inability of
Prather, R. S., Sims, M. M. and First, N. L. 1989. Spemann, H. 1938. Embryonic Development
mouse blastomere nuclei transferred to enuclea-
Nuclear transplantation in early porcine and Induction. Yale University Press, New
ted zygotes to support development in vitro.
embryos. Biol. Reprod. 41: 414-418. Haven.
Science 226: 1317-1319.
Rappolee, D. A., Brenner, C. A., Schultz, R., Spiegelman, S. 1947. Differentiation as the
McKinnell, R. G. 1978. Cloning: Nuclear Trans-
Mark, D. and Werb, Z. 1988. Developmental controlled production of unique enzymatic
plantation in Amphibia. University of Minne-
expression of PDGF, TGF- α and TGF- β genes patterns. In J. F. Danielli and R. Brown
sota Press, Minneapolis.
in preimplantation mouse embryos. Science 241: (eds.), Growth in Relation to Differentiati-
Monod, J. 1947. The phenomenon of enzymatic 1823-1825. on and Morphogenesis. Cambridge Univer-
adaptation and its bearing on problems of genetics sity Press, Cambridge, p. 287.
Reyer, R. W. 1954. Regeneration in the lens in
and cellular differentiation. Growth Symp. 11:
the amphibian eye. Q. Rev. Biol. 29: 1-46. Spradling, A. C. and Rubin, G. M. 1982.
223-289.
Transposition of cloned P elements into
Robins, D. M., Ripley, S., Henderson, A. S. and
Moore, J. A. 1963. Heredity and Development. Drosophila germ line chromosomes. Science
Axel, R. 1981. Transforming DNA integrates
Oxford University Press, Oxford. [p. 236] 218:341-347.
into the host chromosome. Cell 23: 29-39.
Stevens N. M. 1905a. A study of the germ cells Waddington, C. H. 1939. Preliminary notes on Willadsen, S. M. 1986. Nuclear transplantation
of Aphis rosae and Aphis oenotherae. J. Exp. the development of wings in normal and mutant in sheep embryos. Nature 320: 63-65.
Zool. 2: 371-405; 507-545. strains of Drosophila. Proc. NatI. Acad. Sci.
Willadsen, S. M. 1989. Cloning of sheep and
USA 25:299-307.
Stevens, N. M. 1905b. Studies in Spermato- cow embryos. Genome 31: 956-962.
genesis with Especial Reference to the Waddington, C. H. 1962. New Patterns in Gene-
“Accessory Chromosome.” Carnegie Institute Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind,
tics and Development. Columbia University
of Washington, Washington, D.C. A. J. and Campbell, K. H. S. 1997. Viable
offspring from fetal and adult mammalian cells.
Steward,F. C. 1970. From cultured cells to whole Wagner, T. E., Hoppe, P., Jollick, J. D., Scholl, Nature 385: 810-813.
plants: The induction and control of their growth D. R., Hodinka, R. L. and Gault, J. B. 1981.
Wilson, E. B. 1894. The mosaic theory of de-
and morphogenesis. Proc. R. Soc. Lond. [B] Microinjection of rabbit β-globin gene into
175:1-30. velopment. Biol. Lect. Marine Biol. Lab. Woods
zygotes and its subsequent expression in adult
Hole 2:1-14.
mice and offspring. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Steward, F. C., Mapes, M. 0. and Smith, J. 1958.
78: 6376-6380. Wilson, E. B. 1895. An Atlas of the Fertilization
Growth and organized development of cultured
cells. I. Growth and division of freely suspended and Karyogenesis of the Ovum. Macmillan, New
Wieslander, L. and Daneholt, B. 1977. Demons-
cells. Am. J. Bot. 45: 693-703. York. [p. 4]
tration of Balbiani ring RNA sequence in
polysomes. J. Cell Biol. 73: 260-264. Wilson, E. B. 1896. The Cell in Development
Steward, F. C., Mapes, M. 0., Kent, A. E. and
Holsten, R. D. 1964. Growth and development and Inheritance. Macmillan, New York. [p. 262]
Wessel, G. M., Goldberg, L., Lennarz, W. J.
of cultured plant cells. Science 143: 20-27. and Klein, W. H. 1989. Gastrulation in the sea Wilson, E. B. 1904. Experimental studies on
urchin is accompanied by the accumulation of germinal localization. I. The germ regions in
Stice, S. J. and Robl, J. M. 1988. Nuclear re-
an endoderm-specific mRNA. Dev. Biol. 136: the egg of Dentalium. J. Exp. Zool. 1: 1-72.
programming in nuclear transplant rabbit
526-538.
embryos. Biol. Reprod. 39: 657-664. Wilson, E. B. 1905. The chromosomes in re-
Wetmur, J. G. and Davidson, N. 1968 . Kinetics lation to the determination of sex in insects.
Ursprung, H., Smith, K. D., Sofer, W. H. and
of renaturation of DNA. J. Mol. Biol. 31:349-370. Science 22: 500-502.
Sullivan, D. T 1968. Assay systems for the study
of gene function. Science 160: 1075-1081. Wilkinson, D. G., Bhatt, S. and Herrmann, B. Yamada, T. 1966. Control of tissue specificity:
G. 1990. Expression pattern of the mouse T The pattern of cellular synthetic activities in
Vierra, J. and Messing, J. 1982. The pUC
gene and its role in mesoderm formation. tissue transformation. Am. Zool. 6:21-31.
plasmids, an M13mp7-derived system for
Nature 343: 657-659.
insertion mutagenesis and sequencing with
synthetic universal primers. Gene 19: 259-268.
A base celular da morfogênese:
Afinidade celular diferencial
3
Mas a natureza não é atomizada. Sua pa-
dronização é inerente e primária, e a ordem
subjacente à beleza é nela demonstrada; mais
ainda, a natureza só pode ser percebida pela
mente humana, porque ela mesmo é parte
U m corpo não é meramente uma coleção de tipos de células distribuídas ao
acaso. Desenvolvimento envolve não só a diferenciação celular, mas tam-
bém sua morfogênese em arranjos multicelulares tais como tecidos e órgãos.
Quando observamos a anatomia detalhada de um tecido como a retina neural, vemos
um arranjo preciso e intrincado de muitos tipos diferentes de células. Neste Capítulo,
integrante e majoritária daquela ordem. introduziremos as vias de mudança pelas quais as células do embrião em desenvolvi-
Paul Weiss (1960) mento criam órgãos funcionais do corpo. Existem quatro questões majoritárias partici-
pando do arcabouço de discussões sobre morfogênese:
Eu fui criado terrivelmente e maravilhosa-
• Como se formam tecidos a partir de células? De que modo células da retina
mente. Salmo 139 (ca. 500 a.c).
neural aderem a outras células da retina neural e não se associam às celulas da
retina pigmentada ou da íris que estão próximas a elas? De que modo, os vários
tipos de células presentes na retina neural (as três camadas distintas de fotore-
ceptores, neurônios bipolares e células ganglionares) estão organizados para
permitir que a retina seja funcional?
• Como são os órgãos construídos a partir de tecidos? As células retinais do
olho estão situadas atrás da córnea e da lente a uma distância exata. A retina
seria inútil se estivesse situada atrás de um osso ou outro lugar qualquer, onde
a lente não pudesse nela focalizar os raios de luz. Além disso, os neurônios da
retina devem penetrar no cérebro para inervar as regiões do córtex cerebral que
analisam a informação visual. Todas essas conexões devem estar precisamente
ordenadas.
• Como células migrantes atingem seu destino, e como se formam órgãos em
determinados locais? Olhos se desenvolvem na cabeça, mas em nenhum ou-
tro lugar. O que impede a formação de um olho em outras partes do corpo, se
todas as células têm o mesmo potencial genético? Em alguns casos, como o de
precursores de nossas células pigmentadas, células germinativas e glândula
supra-renal, as células devem percorrer longas distâncias para alcançar seu
destino final. Como as células são instruídas para percorrer certas rotas e parar
quando atingem uma região específica do corpo?
• Como crescem órgãos e suas células, e como é esse crescimento coordenado
ao longo do desenvolvimento? As células do olho devem crescer juntas, e as
células da retina raramente dividem-se após o nascimento. Nosso intestino,
entretanto, está constantemente descartando células e regenerando outras, e
79
ainda assim, sua velocidade mitótica é cuidadosamente controlada. Se mais

células fossem regeneradas do que aquelas descartadas, seriam produzidos
crescimentos cancerosos. Se o número de células regeneradas fosse menor, o
intestino não poderia digerir o alimento. O que controla essas diferenças na
velocidade de crescimento?
Todas essas perguntas se referem a aspectos do comportamento celular. Existem

dois grupos principais de células no embrião: células epiteliais, fortemente ligadas
umas às outras em camadas ou tubos, e as células mesenquimatosas, isoladas e
funcionando como unidades individuais. A morfogênese nessas duas classes de célu-
las se dá através de um limitado repertório de processos celulares: (1) direção e núme-
ro de divisões celulares; (2) mudanças na forma das células; (3) movimento celular; (4)
crescimento celular; (5) morte celular; e (6) mudanças na composição da membrana
celular e da matriz extracelular. A maneira pela qual esses processos se completam
pode diferenciar entre células epiteliais e mesenquimatosas (Figura 3.1).
Parecem existir duas vias principais pelas quais células se comunicam umas com as
outras para que se efetue a morfogênese. A primeira é através de substâncias difusíveis
que são sintetizadas por um tipo de célula e que mudam o comportamento de outros
tipos celulares. Essas substâncias incluem hormônios, fatores de crescimento e
morfógenos; cada um será detalhado em capítulos subseqüentes. O segundo método
involve contato entre superfícies de células adjacentes. Células podem seletivamente
reconhecer outras, aderindo a algumas células ou migrando sobre outras. Os eventos
moleculares que intermediam o reconhecimento seletivo de células e sua transforma-
ção em tecidos e órgãos, ocorrem na superfície celular. Enquanto o paradigma domi-
nante na genética do desenvolvimento é a expressão diferencial do gene, o paradigma
dominante na morfogênese envolve afinidade celular diferencial. Essas afinidades
podem ser para superfícies de outras células ou para moléculas da matriz extracelular
secretadas pelas células. Neste capítulo veremos como superfícies de células adjacen-
tes interagem durante o desenvolvimento, visando localizar as células em sítios apro-
priados dentro de tecidos e órgãos.
Afinidade celular diferencial

Assim como a demonstração da importância dos genes no desenvolvimento gerou
desentendimentos entre pesquisadores, também se desenvolveu um debate sobre o
papel da superfície celular na formação do embrião. A superfície celular parece a mes-
ma em todos tipos de células, e muitos pesquisadores mais antigos pensavam até que
a superfície celular não era uma parte vital da célula. Observações sobre fecundação e
desenvolvimento embrionário precoce feitas por E. E. Just (1939) sugeriam que a
superfície celular diferia em tipos diferentes de células, mas a análise moderna da
morfogênese se inicia com os experimentos de Townes e Holtfreter em 1955. Conside-
rando a descoberta de que tecidos de anfíbios se dissociavam em células isoladas
quando colocados em soluções alcalinas, eles prepararam suspensões de células
isoladas provenientes de cada uma das três camadas germinativas dos anfíbios, logo
após a formação do tubo neural. Duas ou mais dessas suspensões de células isoladas
poderiam ser combinadas de várias maneiras, e quando o pH era normalizado, as
células aderiam umas às outras, formando agregados em placas de Petri cobertas com
agár. Usando embriões de espécies que tinham células de diferentes tamanhos e co-
res, Townes e Holtfreter conseguiram observar o comportamento das células
recombinadas (Figura 3.2).
Figura 3.1 ➧
Sumário dos principais processos morfogenéticos em células mesenquimatosas e epiteliais
PROCESSO AÇÃO MORFOLOGIA EXEMPLO
CÉLULAS MESENQUIMATOSAS
Condensação Mesênquima se Mesêquina da

cartilagem torna epitélio cartilagem
Divisão Mitose para produzir Mesênquima

celular mais células (hiperplasia) dos membros
Morte Célula morre Mesênquima

celular interdigital
Migração Célula se move em tempos Mesênquima

e lugares determinados do coração
Secreção de Síntese ou remoção da Mesênquima

matriz e degradação camada extracelular da cartilagem
Crescimento Células ficam Células

maiores (hipertrofia) gordurosas
CÉLULAS EPITELIAIS
Dispersão Epitélio mesênquima Degeneração do

(estrutura inteira) ducto Mülleriano
Delaminação Epitélio mesênquima Hipoblastos de

(parte da estrutura) de galinha
Mudança de Células permanecem ligadas Neurulação

forma ou crescimento com alteração da morfologia
Migração celular Linhas do epitélio se fundem Gastrulação

(intercalação) para formar menos linhas de vertebrados
Divisão celular Mitose dentro da linha ou Gastrulação de

outra direção vertebrados
Secreção de matriz Síntese ou remoção da Formação de

e degradação camada extracelular órgãos vertebrados
Migração Formação de bordas Ectoderma de

livres galinha
Células epidérmicas
presuntivas
Segregação de
tipos de células
Reagregação
espontânea
Dissociação
de células
Células da placa neural

Seção através da bola de
células segregadas
Figura 3.2
Reagregação de células da nêurula de anfíbi-
os. Células epidérmicas presuntivas de em- Os resultados de seus experimentos foram surpreendentes. Em primeiro lugar,
briões pigmentados e células da placa neural verificaram que células reagregadas se tornavam espacialmente segregadas. Ou seja,
de embriões não pigmentados são dissociadas em lugar de permanecerem misturadas, cada tipo de célula se posicionava em sua
e misturadas entre si. As células reagrupam- própria região. Assim, quando células epidérmicas (ectodérmicas) e mesodérmicas
se de tal forma que um tipo (aqui, a epiderme foram ajuntadas para formar um agregado misto, as células epidérmicas foram encon-
presuntiva) cobre o outro. (Modificado de tradas na periferia do agregado e as células mesodérmicas no seu interior. Em nenhum
Townes e Holtfreter, 1955.) caso as células permaneceram misturadas ao acaso, e na maioria dos casos, um tipo de
tecido envolvia o outro completamente.
Em segundo lugar, os pesquisadores observaram que as posições finais das célu-
las reagregadas refletiam suas posições embriônicas. O mesoderma migra centralmen-
te à epiderme, aderindo à sua superfície interna (Figura 3.3A). O mesoderma também
migra centralmente em relação ao intestino ou endoderma (Figura 3.3B). Entretanto,
quando as três camadas germinativas são misturadas entre si, o endoderma se separa
do ectoderma e mesoderma e é então envolvido por eles (Figura 3.3C). Na sua configu-
ração final, o ectoderma está na periferia, o endoderma é interno e o mesoderma se
situa na região entre eles. Holtfreter interpretou esse fato em termos de afinidade
seletiva. A superfície interna do ectoderma tem uma afinidade positiva pelas células
mesodérmicas e uma afinidade negativa para o endoderma, enquanto o mesoderma
tem afinidades positivas para ambas as células, ectodérmicas e endodérmicas. A
mimetização da estrutura embrionária normal por agregados celulares também pode
ser vista na recombinação de células da epiderme e da placa neural (Figura 3.3D). As
células epidérmicas presuntivas migram para a periferia, como antes; as células da
placa neural migram para o centro, formando uma estrutura reminescente do tubo
neural. Quando células axiais mesodérmicas (notocorda) são adicionadas à suspen-
são de células presuntivas, epidérmicas e neurais, a segregação celular resulta em uma
camada epidérmica externa, um tecido neural localizado centralmente, e uma camada
de tecido mesodérmico entre eles (Figura 3.3E). De alguma maneira, as células têm a
capacidade de distribuirem-se em suas próprias posições embriológicas.
Tais afinidades preferenciais foram também observadas por Boucaut (1974),
que injetou células individuais de específicas camadas germinativas de volta na
cavidade gastrular de anfíbio. Ele verificou que essas células migram para sua
camada germinativa apropriada. Células endodérmicas encontram posições no
endoderma do hospedeiro, enquanto que células ectodérmicas se localizam em seu
CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 83
Epiderme Placa neural

+ +
Epiderme Mesoderma Mesoderma Placa neural Mesoderma axial
+ + + + +
mesoderma endoderma endoderma epiderme epiderme
Epiderme Endoderma Mesoderma Epiderme Epiderme Mesoderma
Mesoderma Mesoderma Endoderma Placa Epiderme Placa

neural neural
(A) (B) (C) (D) (E)
Figura 3.3
ectoderma. Assim, afinidade seletiva parece ser importante para fornecer informação Distribuição e reorganização de relacionamen-
posicional às células embrionárias. tos embrionários espaciais em agregados de
A terceira conclusão de Holtfreter e seus colegas foi que afinidades seletivas células embrionárias de anfíbios. (Modificado
mudam durante o desenvolvimento. Isso deveria ser esperado, pois células embrioná- de Townes e Holtfreter, 1955.)
rias não mantêm uma única relação estável com outras células. Para que ocorra o
desenvolvimento, células precisam interagir de forma diferente com outras popula-
ções celulares em tempos específicos. Essas mudanças na afinidade celular foram
dramaticamente confirmadas por Trinkaus (1963), que mostrou uma clara correlação
entre mudanças de adesão in vitro e o comportamento da célula embrionária. Mais
recentemente, os experimentos de Fink e McClay (1985) demonstraram esse comporta-
mento no ouriço-do-mar, durante seu desenvolvimento. Na blástula, todas as células
parecem ter a mesma afinidade umas pelas outras. Cada célula tem também uma alta
afinidade para a matriz extracelular (camada hialina) que cobre o embrião, e uma baixa
afinidade para as proteínas dentro da cavidade embrionária (blastocele). Entretanto,
ao iniciar-se a gastrulação, um grupo específico de células, no pólo vegetal da blástu-
la, perde sua afinidade pelas células vizinhas e pela matriz extracelular externa, en-
quanto adquire simultaneamente afinidade pelas fibrilas protéicas que forram a blasto-
cele (Figura 3.4). Essas mudanças de afinidade causam a perda de contato das células
Figura 3.4 (A) (B)

Sumário das modificações na adesão celular de células precursoras Camada hialina
do esqueleto (encaixadas). (A) Na blástula do ouriço-do-mar, cada
Células da
célula tem alta afinidade por suas vizinhas e por seu substrato, a
blástula
camada hialina. (B) Enquanto progride o desenvolvimento, mu-
danças na superfície celular produzem um enfraquecimento das
afinidades pelas células vizinhas e camada hialina e um aumento de
afinidade pelas proteínas da cavidade interna da blastocele. O
resultado é que essas células migram para a blastocele (flechas) e
formarão o esqueleto.
Fibrilas
da
blastocele
Alta afinidade por células Decréscimo de afinidade por

vizinhas e camada hialina células vizinhas e camada
hialina. Aumento de afinidade
por fibrilas da bastocele.
com suas vizinhas e a migração para dentro da blastocele, onde elas formarão o
esqueleto da larva. Quando elas começam a formar esse esqueleto, suas proprieda-
des adesivas terão que mudar novamente. Essas células, que tinham sido “anti-
sociais” entre si desde seu ingresso na blastocele, devem agora aderir para formar
os rudimentos do anel esquelético. Essas mudanças na adesão são específicas
temporalmente e também específicas para as células precursoras esqueléticas
(McClay e Ettensohn, 1987). Tais mudanças na afinidade celular são extremamente
importantes nos processos da morfogênese.
A reconstrução de agregados de embriões tardios de aves e mamíferos foi
obtida pelo uso da protease tripsina para dissociar as células entre si (Moscona,
1952). Quando as células isoladas resultantes foram misturadas em um frasco e
agitadas de modo que a força de cisalhamento destruísse adesões não específi-
cas, as células se distribuíram de acordo com seu tipo celular. Dessa maneira, elas
reconstruíram a organização do tecido original (Moscona, 1961; Giudice, 1962). A
Figura 3.5 mostra a “reconstrução” do tecido da pele de um embrião de camundon-
go de 15 dias. As células da pele são separadas por enzimas proteolíticas e depois
agregadas em uma cultura rotatória. As células epidérmicas migram para a perife-
ria, e as dérmicas migram para o centro. Em 72 horas, a epiderme foi reconstituída,
formou-se uma camada de queratina e folículos de pêlo são vistos na região dermal.
Essa reconstrução de tecidos complexos a partir de células únicas é chamada de
agregação histotípica.
O modelo termodinâmico de interações celulares

A células, então, não se distribuem ao acaso, mas se movem ativamente para criar
organização tissular. Quais forças dirigem o movimento celular durante a morfogêne-
se? Em 1964, Malcolm Steinberg propôs um modelo que explicava o direcionamento da
Figura 3.5 Epiderme Derme Folículo piloso

Reconstrução da pele a partir de uma suspensão de células de pele de um embrião de camundon- primário
go de 15 dias. (A) Seção através da pele embrionária, mostrando a epiderme, derme e folículos
pilosos primários. (B) Suspensão de células isoladas de pele tanto da derme como da epiderme.
(C) Agregados após 24 horas. (D) Seção através de um agregado mostrando migração de células
epidérmicas para a periferia. (E) Nova diferenciação dos agregados (72 horas), mostrando
epiderme e derme reconstituídas, completa com folículos de pêlo e camada queratinizada. (de
Monroy e Moscona, 1979, cortesia de A. Moscona.)
distribuição celular baseado em princípios termodinâmicos. Usando células derivadas

de tecidos embrionários tripsinisados, Steinberg mostrou que certos tipos de células
sempre migram para o centro quando combinadas com determinados tipos de células, (A)
mas migram perifericamente quando combinadas com outras. A Figura 3.6 ilustra as
interações entre culturas de células pigmentadas e células neurais da retina. Quando
suspensões de células isoladas desses dois tipos são misturadas, elas formam agre-
gados de células organizadas ao acaso. Entretanto, após algumas horas, já não se
observa células pigmentadas da retina na periferia dos agregados; em dois dias, duas
distintas camadas são vistas, com as células pigmentadas localizadas internamente às
células neurais da retina. Os mesmos tipos de interações podem ser observados quan-
do agregados esféricos de tecidos são colocados em contato, uns com os outros. Um (B)
dos tecidos finalmente envolve o outro, e a topografia final é independente das posi-
ções de partida (Figura 3.7).
Além disso, tais interações obedecem a uma hierarquia (Steinberg, 1970). Se a
posição final de um tipo de célula, A, é interna em relação a um segundo tipo, B, e a
posição final de B é interna a um terceiro tipo, C, então a posição final de A será sempre
interna a C. Por exemplo, células pigmentadas da retina migram internamente às células
neurais da retina, e células do coração migram centralmente em relação à retina
pigmentada. Portanto, células do coração migram internamente às células neurais da (C)
retina. Essa observação levou Steinberg a propor que as células misturadas, interagem
para formar um agregado com a menor energia livre interfacial (Figura 3.8). Em outras
(D) Derme
Derme Epiderme Camada queratinizada
(A) (B) (C)
Figura 3.6
Agregados formados pela mistura de células da retina neural (não pigmentada) de um embrião de (E)
galinha de 7 dias com células pigmentadas da retina (escuras). (A) Cinco horas após a mistura Folículos de pêlo
das suspensões de células isoladas, são vistos agregados de células distribuídas ao acaso. (B) Em
19 horas, as células pigmentadas da retina não são mais vistas na periferia. (C) Após dois dias,
a maioria das células pigmentadas da retina estão localizadas em uma massa central interna
rodeadas pelas células da retina neural. (As células pigmentadas espalhadas são provavelmente
células mortas). (de Armstrong, 1989, cortesia de P. B. Armstrong.)
Figura 3.7
Espalhamento de um tipo de célula sobre outro tipo. A posição final de agregados compostos de
dois tipos de tecidos é independente de sua posição inicial. Uma condição final idêntica é
Tecido Tecido obtida, se os tecidos são transformados em suspensões de células isoladas e, então, reagregadas
A B ou os tecidos são mantidos intactos e colocados em contato. (De acordo com Armstrong, 1989.)
Colocar tecidos Dissociar os

juntos, bem tecidos palavras, as células se rearranjam na forma termodinamicamente mais estável. Se as
encaixados e reagregar células dos tipos A e B têm diferentes forças de adesão, e se a força da conexão A-A é
maior do que aquela entre A-B ou B-B, vai haver distribuição com centralização das
células do tipo A. Se a força da conexão A-A é menor ou igual a da conexão A-B, o
agregado permanecerá com uma mistura de células ao acaso. Finalmente, se a conexão
A-A tiver uma força muito maior do que a conexão A-B – em outras palavras, as células
A e B não mostram basicamente nenhuma adesividade entre si – então as células A e B
formarão agregados separados.
Para que as células sejam distribuídas, o essencial é que tenham diferenças em
suas forças de adesão. Na forma mais simples desse modelo, todas as células
poderiam ter o mesmo tipo de “cola” distribuída na sua superfície. A quantidade
desse produto da superfície celular, ou a arquitetura celular que permite à subs-
Movimento do Movimento das tância ser concentrada diferencialmente, originará diferentes números de conta-
tecido B para células A para dentro,
envolver o tecido A distante da periferia
tos estáveis entre tipos de células. Alternativamente, as diferenças termodinâmicas
poderiam ser causadas por vários tipos de moléculas de adesão. Esse modelo
termodinâmico é chamado hipótese da adesão diferencial. Nessa hipótese, o em-
brião precoce pode ser considerado como existindo em um estado de equilíbrio até
que alguma mudança na atividade gênica altere as moléculas na superfície celular.
Os movimentos que ocorrem visam restaurar uma nova configuração de equilíbrio
para as células.
Células A localizadas
centralmente às células B
(A) DISTRIBUIÇÃO
(B) AO ACASO
(C) SEPARAÇÃO
Figura 3.8
Distribuição como um processo tendendo à estabilidade termodinâmica máxima. (A) Distribui-
ção ocorre quando a força adesiva média entre diferentes tipos de células (ωab) é menor que a
força adesiva média homotípica (A-A ou B-B) (ωaa, ω bb). As células mais adesivas se localizam
centralmente. (B) Se a força das adesões A-B é maior ou igual à média das adesões homotípicas,
não vai haver distribuição, porque o sistema já atingiu o equilíbrio termodinâmico, e a mistura
dos tipos de células será ao acaso. (C) Se as ligações A-B são muito mais fracas que a média das
adesões homotípicas, haverá uma completa separação, como é característico para óleo e água.
& Especulações
Evidência para o modelo termodinâmico
E vidências recentes para a hipóte-

se da adesão diferencial surgiram
em pesquisa com o objetivo de
responder duas questões: (1) pode o fe-
nômeno da distribuição ser explicado pela
Membros de salamandra têm alguns
atributos surpreendentes. Quando um
membro anterior é amputado no antebra-
ço, o toco remanescente forma na sua
ponta, uma massa de células desdiferen-
sas células formam um gradiente ao lon-
go do eixo proximodistal; essas proprie-
dades são maiores no pulso e menores no
antebraço.
Crawford e Stocum (1988) conseguiram
tensão superficial gerada pela adesão ce- ciadas (blastema regenerativo), que se relacionar essa distribuição de células in
lular?, e (2) essa distribuição realmente divide e diferencia formando um novo vitro ao processo de regeneração de mem-
ocorre durante o desenvolvimento? membro. O novo tecido do membro se ini- bro ao vivo. Blastemas do pulso, cotovelo
Foty e colegas no laboratório de cia no local da amputação, nesse caso, ou antebraço foram enxertados na junção
Steinberg (1994) analisaram a tensão su- formando o resto do membro, do antebra- blastema-toco de um membro posterior re-
perficial interfacial em vários tecidos em- ço para baixo. Quando o membro é ampu- generando a partir da meia coxa. Os
brionários. Eles comprimiram amostras de tado no pulso, forma-se um blastema re- blastemas de membro anterior migraram
tecido entre as placas de vidro de um generativo parecido. Entretanto, não é re- distalmente até o nivel correspondente do
tensiômetro, e mediram a tensão superfi- formado o tecido do antebraço, cotovelo membro posterior do hospedeiro e regene-
cial dos tecidos em termos da habilidade e cúbito; em lugar disso, o local “sendo raram uma nova estrutura (Figura 3.10). O
desses em retornar à forma esferóide ori- conhecido” regenera somente o pulso e blastema do antebraço imediatamente re-
ginal. Dessa maneira, a tensão superficial os dígitos. generou um membro completo a partir do
de cada tecido poderia ser calculada em Como é armazenada essa “memória nível da meia coxa; o blastema do cotovelo
dines por centímetro. Foty e seus colabo- posicional”? Nardi e Stocum (1983) dese moveu ao nível do joelho e formou o
radores encontraram uma completa corre- monstraram que colocando junto dois resto do braço a partir desse ponto; o
lação entre a tensão superficial do tecido blastemas de membros de salamandra com blastema do pulso foi deslocado até o fim
e sua tendência de distribuir-se no centro o mesmo nível de origem eles se fundem, do membro posterior em regeneração, onde
ou na periferia de um agregado misto. Te- mas nenhum envolve o outro (Figura 3.9). formou um pulso ao nível do tarso do pé.
cidos com uma maior tensão superficial Entretanto, quando os blastemas são de Esses dados sugerem que as hierarquias
sempre se localizavam internamente quan- níveis diferentes, o mais proximal (perto da distribuição celular, vistas in vitro, re-
do misturados com outros de menor tendo corpo) envolve o mais distal. Parece, fletem diferenças que são usadas pelo cor-
são superficial. Parece que a distribuição então, que as propriedades adesivas des- po, in vivo, na construção de novos órgãos.
pode ser explicada unicamente pelas ten-
sões superficiais das células justapostas. Blastema marcado
[cell1.html]
Pulso Cotovelo Antebraço
Até recentemente, era muito difícil pla-
nejar experimentos para testar, in vivo, esse
modelo de distribuição celular; entretanto,
Pulso
estão surgindo evidências para essa hipó-

tese em estudos de regeneração de mem-
bros na salamandra. Aqui, o tecido mais
proximal (perto do corpo) envolverá o mais
Blastema não marcado
distal (Nardi e Stocum, 1983).

Cotovelo
Figura 3.9
Distribuição quando blastemas de níveis iguais
ou diferentes, de membros anteriores, são co-
locados juntos em cultura. (Um membro de
cada par foi marcado com tritio para distinguí-
lo do outro). Depois de três dias em cultura,
os agregados foram fixados e secionados.
Antebraço
Blastemas do mesmo nível fundiram em uma

linha reta. Quando os blastemas eram de dife-
rentes níveis, o blastema proximal parecia ten-
tar envolver as células mais distais. (de Nardi e
Stocum, 1983, cortesia de D. Stocum.)
Figura 3.10 Blastema Blastema Blastema

Distribuição in vivo, onde blastemas de mem- de pulso de cotovelo de antebraço
bros anteriores em regeneração (em cores) en-
xertados em blastemas da coxa mediana (cin-
za) são deslocados para a região correspon-
dente do membro posterior em regeneração
(pulso ao tarso; cotovelo ao joelho; antebraço
à coxa mediana) onde iniciam a formação do
membro anterior, distalmente daquele ponto.
(de Crawford e Stocum, 1988.) Enxertar blastema no
blastema em regeneração
da coxa mediana
Blastema de
coxa mediana
Permitir crescimento
externo dos enxertos
A base molecular das adesões célula-célula

As classes de moléculas de adesão celular
A formação de tecidos e órgãos é mediada por eventos que ocorrem na superfície de
células adjacentes. A superfície celular inclui a membrana plasmática, as moléculas
diretamente abaixo dela e a ela associadas, e as moléculas encontradas no espaços
extracelulares. Células eucarióticas são envolvidas por uma complexa borda molecular
chamada membrana plasmática (ou celular). A membrana plasmática é uma bicamada
fluida lipídica que contém proteínas capazes de interagir com o ambiente externo.
Certas proteínas têm seus sítios ativos apontando para fora, em direção a outras
células; existem três classes de moléculas da membrana celular (principalmente prote-
ínas) que estão particularmente envolvidas no controle de interações específicas com
outras células (Edelman e Thiery, 1985):
• Moléculas de adesão celular. Essas proteínas participam da adesão célula-
célula. Elas podem unir células em lâminas epiteliais e condensar células me-
senquimatosas em agregados coesos. Elas têm um papel crítico na separação
de diferentes tecidos entre si.
• Moléculas da junção celular. Essas moléculas fornecem vias de comunicação
entre o citoplasma de células adjacentes e fornecem barreiras de permeabilidade
e força mecânica às lâminas epiteliais.
• Moléculas de adesão a substrato. Essas moléculas permitem ligação das célu-
las às suas matrizes extracelulares. Elas incluem componentes da matriz extra-
celular e seus receptores situados na superfície da célula. Moléculas de ade-
são a substrato permitem o movimento de células do mesênquima e neurônios,
e permitem a separação espacial das lâminas epiteliais.
Os padrões locais de expressão dessas moléculas da superfície celular, propiciam uma
conexão importante entre o código genético unidimensional e o organismo tri-
dimensional. Modulando o aparecimento dessas moléculas, o potencial genético pode
se manifestar no processo mecânico da morfogênese.
& Especulações
Anticorpos monoclonais e genética reversa

Monitoramento de modificações da mem-
brana celular através de anticorpos mo- Imunização Células mutantes de mieloma,
noclonais. sem enzima HPRT
A expressão de componentes da membra-
na muda no espaço e no tempo. Diferen-
tes tipos de células possuem componen-
tes da superfície celular que são diver-
sos, e que mudam enquanto a célula se
desenvolve. Esses componentes da mem-
brana, tecido-específicos, são freqüente- Células de baço Células de mieloma
mente reconhecidos por antisoros e, por de camundongo
essa razão, denominados antígenos de
diferenciação (Boyse e Old, 1969).
Antígenos de diferenciação específicos
podem atualmente ser identificados por
anticorpos monoclonais (Figura 3.11). Ge-
Fusão
ralmente, esses anticorpos são produzi-
dos injetando celulas estranhas em ca-
mundongos (ou células de camundongos
de uma linhagem em animais de outra li-
nhagem). Os linfócitos B do camundon- Seleção em meio HAT;
go começarão a produzir anticorpos con- selecionar anticorpos
tra cada um dos componentes estranhos
dessas células, sendo que cada linfócito
B produz um único tipo de anticorpo. Es-
ses linfócitos são tornados “imortais” pela Cultivar clones de hibridomas
fusão com células cultivadas de linfócito individuais de poços positivos
B de tumores (mielomas), que foram
mutados de modo a: (1) não sintetizar seus
próprios anticorpos e (2) não ter a enzima
de recuperação de purinas, hipoxantina
fosforribosiltransferase (HPRT). Devido a
essa última alteração, as células do
mieloma só podem produzir nucleotídeos
de purina de novo, não podendo usar as Secionar e cultivar clones
purinas do meio de cultura. Após a fusão, cujos sobrenadantes testam
as células são cultivadas em um meio con- positivo
tendo aminopterina, uma droga que inibe
a via de síntese de novo da purina. Assim,
células do mieloma não fundidas morrem
por fome de purinas. Elas não podem pro-
duzir nucleotídeos de purina usando a via Figura 3.11
de recuperação mediada por HPRT e a Protocolo para preparar anticorpos monoclonais. Células do baço de um camundongo imuniza-
do são fundidas com células mutadas de mieloma, sem a enzima HPRT. Células são cultivadas
aminopterina bloqueia também a via de
em um meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT). Células de mieloma não
novo. Linfócitos B normais também não
fundidas não podem crescer nesse meio porque a aminopterina bloqueia a única via para sinte-
dividem-se em cultura, de modo que eles
tizar nucleotídeos purínicos. Células B morrem nesse meio, mesmo contendo a enzima (HPRT)
morrem igualmente. O produto da fusão que lhes permitiria utilizar a hipoxantina do meio. As células fundidas (hibridomas) crescem e se
do linfócito B e da célula do mieloma – o dividem. Os poços nos quais crescem os hibridomas são selecionados quanto à presença do
hibridoma – prolifera, porque possui a anticorpo efetivo, e as células de poços positivos são semeadas em densidade suficientemente
enzima de recuperação de purina do baixa para permitir que células individuais originem clones discretos. Esses clones são isolados
linfócito B e as propriedades de cresci- e selecionados para o anticorpo efetivo. Tal anticorpo é monoclonal. Os hibridomas produzindo
mento do tumor. Mais ainda, cada um esse anticorpo podem ser cultivados e congelados. (de Yelton e Scharff, 1980.)
Segmentos externos de Mas logo em seguida, a célula começa a

fotorreceptores expressar outra molécula da membrana, o
Somas de fotorreceptores
antígeno 24B10. Essa molécula é encon-
(camada nuclear externa)
trada somente nos neurônios que se trans-
Camada sináptica externa formarão em fotorreceptores. Nos estági-
Camada nuclear interna os seguintes (aproximadamente 80 horas
(soma interneuronal) mais tarde), o antígeno 21A6 é expresso
em certas regiões de fotorreceptores em
Camada sináptica interna maturação, e outro antígeno, 28H9, é ca-
racterístico de fotorreceptores retinais ter-
minalmente diferenciados (Zipursky et
Soma das células al.,1984). Assim, membranas celulares de
ganglionárias diferentes tipos de células contêm molé-
culas diferentes, e essas podem mudar du-
Axônios das células
ganglionárias
rante a maturação da célula.
(A) (B) (C) (D) Da proteína ao gene

Figura 3.12 Como antígenos de diferenciação são pro-
Especificidade da superíficie celular da retina neural de galinha. (A) Fotografia de contraste de teínas cuja expressão é regulada no tem-
fase de uma seção da retina neural de um pinto recém-eclodido. (B) Seção de retina marcada com po e no espaço, e como essas mudanças
um anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece células retinais (mas não outras neuronais). são freqüentemente correlacionadas com
(C) Seção retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece processos mudanças morfológicas específicas (como
neuronais mas não corpos celulares na retina. (D) Seção retinal marcada com anticorpo mono- mostra a Figura 3.13), seria interessante
clonal fluorescente que reconhece antígeno em um subconjunto de processos em células nervo- saber como seus genes são regulados. Por
sas nas camadas sinápticas externas e internas. (Cortesia de G. Grunwald.)
exemplo, o conhecimento de como a pro-
teína 24B10 se expressa poderia dar
desses hibridomas secreta o anticorpo es- celular de uma única célula epitelial de indicacões sobre os mecanismos genéti-
pecífico do linfócito B. O meio no qual Drosophila enquanto ela se desenvolve cos da diversidade neuronal. Como po-
estão crescendo os hibridomas é testado em um fotorreceptor retinal. Anticorpos demos realizar essa “genética reversa”
quanto à presença de anticorpos que se monoclonais foram obtidos após injetar indo da proteína para o gene?
ligam à população original das células es- camundongos com homogenatos de teci- Em primeiro lugar, ligamos anticorpos
tranhas. Tais anticorpos, tendo um único do da cabeça de Drosophila, e um painel monoclonais às particulas de resinas e
linfócito B como sua fonte original, é de- de anticorpos foi testado em células do passamos homogenatos de retina em
nominado anticorpo monoclonal. Anticor- disco imaginal do olho larval que se dife- colunas contendo esse material (Figura
pos monoclonais podem ser produzidos renciavam em estruturas do olho. Assim 3.14). (Essa é uma coluna de imunoafini-
em grandes quantidades e podem reco- que as células epiteliais, não diferencia- dade.) O anticorpo se liga somente ao
nhecer antígenos (proteínas, lipídeos e das, do disco mostram propriedades antígeno reconhecido originalmente, e a
carboidratos) que são fracamente expres- neuronais, elas expressam o antígeno proteína ligada à resina é eluída (por so-
sos (Köhler e Milstein, 1975). 22C10. Esse antígeno é também encontra- luções salinas) e submetida à eletrofore-
Anticorpos monoclonais dirigidos do em outros tipos de células neuronais. se em gel para separá-la de um possível
contra tipos específicos de células, de-
monstraram numerosos antígenos de di-
Célula epitelial Fotorreceptor
ferenciação aparecendo em diferentes não diferenciada Fotorreceptor maduro
tempos e lugares durante o desenvolvi-
mento. A Figura 3.12 mostra diferentes Neurônio sensorial
moléculas da superfície celular, em dife- Neurônio fotorreceptor
rentes camadas espaciais da retina neural
de um pinto recém-eclodido. Cada um dos
anticorpos monoclonais reconhece uma
molécula diferente na membrana celular.
Vários antígenos
Como está evidente nesta fotografia com- não específicos 22C10
posta, as membranas de todas as células antígeno
da retina neural não são iguais. Na verda-
24B10 21A6 28H9
de, regiões da mesma membrana celular antígeno antígeno antígeno
podem ser diferentes; as membranas dos Figura 3.13
axônios e da soma do nervo, por exemplo, Mudanças temporais na membrana celular correlacionadas com a morfogênese de uma célula
contêm moléculas diferentes. A Figura 3.13 retinal fotorreceptora da Drosophila. Enquanto se procede a diferenciação, diferentes antígenos
mostra mudanças temporais na membrana se expressam na membrana celular. (de Venkatesh et al., 1885.)
Anticorpo Juntar anticorpo marcado

monoclonal ao ao antígeno 24B10, na
antígeno 24B10 seção retinal
1 Cobrir partículas de resina

com anticorpo monoclonal
Localização de 24B10 por

anticorpo monoclonal
marcado com fluoresceína
2 Preparar coluna de
imunoafinidade com
partículas cobertas
Figura 3.14
Protocolo para encontrar o gene que codifi-
3 Adicionar homogenato
de retina contendo ca a proteína identificada por um anticorpo
antígeno 24B10 ( ) e• monoclonal. O oligonucleotídeo decodificado
outros antígenos ( )• pela estrutura da proteína não precisa ser
um par perfeito com a verdadeira seqüência.
Homogenato (de Venkatesh et al., 1985; fotografia corte-
retinal
sia de S. Benzer.)
4 Depois que outros antígenos contaminante. A região do gel contendo

•
( ) passam através da coluna, a proteína é separada, a proteína eluída
•
eluir material ( ) remanescen- da matriz do gel é parcialmente seqüen-
te nas partículas, separar por ciada. É necessário sintetizar oligonucle-
eletroforese em gel e corar gel otídeos radioativos que se ligariam a uma
para proteína
Proteína purificada,
seqüência de DNA capaz de codificar tal
antígeno 24B10 proteína. No caso da 24B10, essas son-
das radioativas foram usadas para sele-
cionar uma biblioteca de clones de DNA
recombinante contendo regiões do ge-
5 Eluir proteína purificada
noma de Drosophila. O DNA de Droso-
24B10 do gel e seqüenciar
o amino terminal phila de cada clone positivo foi seqüen-
ciado para verificar se esse complemen-
tava a seqüência da proteína original iso-
Met-Glu-Glu-Thr-His-Tyr-Pro lada pelo anticorpo monoclonal. Por essa
via, podemos ir de uma rara proteína
6 Gerar uma seqüência AUG - GAA - GAA - AGG - CAG - AAC - CC identificada por um anticorpo monoclo-
mensageira possível e TAC - C T T - C T T - TCC - GTC - T T G - GG nal a um pedaço específico do DNA
sintetizar uma seqüência genômico. (Zipursky et al.,1984; Venka-
complementar radioativa tesh et al., 1985.)
7 Usar essa sonda para selecionar a

biblioteca de fago do genoma da Droso-
phila; seqüenciar o clone positivo
TCC ATG T T C GAT CGC GAG ATG GAG GAG ACG CAT TAC CCG CCC TGC ACC TAC AAC GTG ATG TGC
Ser Met Phe Asp Arg Glu Met Glu Glu T h r His Ty r P r o P r o Cys T h r Ty r Asn Val Met Cys
Seqüência esperada
8 Isolar e caracterizar gene

Moléculas de adesão celular

Identificando moléculas de adesão celular e seu papel no
desenvolvimento
Os estudos de distribuição de Holtfreter e Steinberg não identificaram as moléculas
envolvidas na adesão celular diferenciada. Roth (1968; Roth et al., 1971) demonstrou
que diferentes tipos de células mostram uma adesão celular seletiva independente da
distribuição das células. Ele modificou o ensaio de agregação rotatório, incubando
células de cartilagem marcadas com 3H e hepatócitos marcados com 14C em uma solu-
ção em rotação, contendo pequenos agregados de células de cartilagem não marcadas.
Medindo as células marcadas com 14C e 3H nesses agregados, ele demonstrou que os
agregados de cartilagem escolheram especificamente células de cartilagem. Experi-
mentos similares estenderam essas conclusões às células do músculo e do fígado
(Figura 3.15). Esses estudos indicaram que tipos diferentes de células podiam usar
diferentes moléculas de adesão.
A tarefa seguinte é identificar as moléculas mediadoras da adesão celular e desco-
brir como conseguem realizar esse feito. Várias moléculas de adesão celular (CAMs),
foram identificadas e agrupadas em duas categorias gerais: as caderinas, cujas propri-
edades de adesão celular dependem de íons cálcio e as CAMs da superfamília de
imunoglobulinas, cujos domínios de ligação às células se parecem aqueles de molécu-
las de anticorpos. A Tabela 3.1 lista algumas CAMs recentemente descobertas.
Caderinas
Íons de cálcio são freqüentemente necessários para a adesão celular. Os íons esta-
bilizam as conformações adesivas de certas proteínas da superfície celular chama-
das caderinas. Caderinas têm um papel crítico no estabelecimento e manutenção de
conexões intercelulares, e parecem ser cruciais para a segregação espacial de célu-
las e para a organização da forma animal (Takeichi, 1987). Caderinas interagem com
outras caderinas de células adjacentes e são ancoradas na célula por complexos de
proteínas chamados cateninas (Figura 3.16). O complexo caderina-catenina forma a
clássica junção aderente que liga as células epiteliais entre si. Mais ainda, como as
cateninas se ligam ao citoesqueleto de actina, elas integram as células epiteliais em
uma unidade mecânica. Em embriões de vertebrados, quatro classes principais de
caderinas foram identificadas:
Figura 3.15 Célula isotípica

Especificidade da associação célula-célula. Agregados coletores, cada um consistindo de um tipo marcada com
3
de célula, são colocados em um frasco de cultura giratório contendo células isoladas do mesmo H (cartilagem)
tipo (isotípico) e de tipos diferentes (heterotípico). As células isoladas, isotípicas e heterotípicas,
foram previamente marcadas com diferentes radioisótopos. Após seis horas, os agregados Célula
heterotípica
foram colhidos, lavados e determinados os números de células isotípicas e heterotípicas que
marcada com
aderiram ao agregado, como mostra a tabela abaixo. (Dados de Roth, 1968.) 14
C (fígado)
Contagem das células radioativas que aderiram ao agregado Agregado

(cartilagem)
Células isoladas marcadas em suspensão*
Tipo de agregado Cartilagem Fígado Músculo peitoral Rotação por seis horas
Cartilagem 100 6 48
Fígado 10 100 0
Músculo peitoral 38 49 100 Contar células
radioativas que
* Porcentagem do número médio de células coletadas pelos agregados isotípicos. aderiram ao agregado
Tabela 3.1 Classificação geral das principais moléculas de adesão celular (CAMs)
Classe CAM Tipo celular
Caderinas N-caderina (a.k.a. A-CAM) Nervos, rins, lentes, coração

(cálcio-dependente) P-caderina Placenta, epitélio
E-caderina (a.k.a. L-CAM, Epitélio, blástula de camundongo
uvomorulina)
CAMs da super N-CAM Músculos, nervos, rins

família de imuno- Ng-CAM (a.k.a. L1, NILE) Glia, neurônios
globulinas Neurofascina Neurônios de Drosophila
(cálcio-independente) CAM-celular Hepatócitos
LFA-1 Linfócitos
CD4 glicoproteína (HIV receptor) Indutor de células T
• E-caderina (caderina epitelial, também chamada uvomorulina e L-CAM) é ex-

pressa em todas as células embrionárias precoces de mamíferos, mesmo no
estágio de uma célula. Mais tarde, essa molécula é restrita a tecidos epiteliais
de embriões e adultos.
• P-caderina (caderina de placenta) parece ser expressa primariamente em célu-
las placentárias do embrião de mamífero, que fazem contato com a parede
uterina (as células trofoblásticas) e o próprio epitélio da parede uterina (Nose
e Takeichi, 1986). É possível que a P-caderina facilita a conexão do trofoblasto
com o útero, pois a P-caderina nas células uterinas é visualizada em contato
com a P-caderina das células trofoblásticas de embriões de camundongos
(Kadokawa et al., 1989).
Sítios de fosforilação Figura 3.16

Reconhecimento Representação esquemática da adesão celular
do sítio de adesão mediada por caderina. Caderinas estão associ-
adas com três tipos de cateninas. As cateninas
podem se associar com o sistema de microfila-
mentos de actina. A importância dessas intera-
Membrana
Sítio de celular ções para o desenvolvimento normal é vista na
ligação Cateninas Figura 3.18; caderinas que não têm o domínio
de cálcio Actina extracelular podem interferir com o desenvol-
vimento. Presumivelmente, elas competem
com as caderinas normais, ligando as cateninas
disponíveis com seus domínios citoplasmáti-
cos. (de Takeichi, 1991).
Caderina
Ligação
caderina-caderina
Caderina
• N-caderina (caderina neural) é vista inicialmente nas células mesodérmicas no

embrião em gastrulação enquanto elas perdem sua expressão de E-caderina. É
intensamente expressa nas células do sistema nervoso central em desenvolvi-
mento (Figura 3.17; Hatta e Takeichi, 1986).
• EP-caderina (C-caderina) é crítica na manutenção da adesão celular entre
os blastômeros da blástula de Xenopus e é necessária para os movimen-
tos normais de gastrulação (Figura 3.18; Heasman et al., 1994; Lee e
Gumbiner, 1995).
(A)
Caderinas promovem a aderência celular, ligando-se ao mesmo tipo de caderina em
outra célula. Assim, células com E-caderina grudam em outras células que têm E-
caderina, e se separarão de outras células contendo N-caderinas em suas membranas.
Essa ligação é chamada ligação homofílica. Células expressando N-caderinas rapida-
mente se isolam de células N-caderina-negativas in vitro, e anticorpos univalentes
contra caderinas converterão um agregado de células tridimensional histotípico, em
uma camada única (Takeichi et al., 1979). Mais ainda, quando genes ativados de E-
caderina são transfectados em fibroblastos de camundongo cultivados e neles ex-
pressos (usualmente eles não expressam essa proteína), E-caderina é vista em suas
(B) superfícies celulares, e os fibroblastos tratados passam a se ligar fortemente uns aos
Ectoderma Crista Neural outros (Nagafuchi et al.,1987). Na verdade essas células começam a se portar como
células epiteliais.
Expressão de caderinas é freqüentemente correlacionada com agregação e disper-
são. Células da crista neural (que estão na porção mais dorsal do tubo neural), inicial-
mente expressam N-caderina. Em seguida, enquanto deixam o tubo neural, migrando
como células individuais (para formar células pigmentadas, neurônios sensoriais e
outros tipos de células), elas perdem a expressão de N-caderina (veja Figura 3.17; veja
também Capítulo 7). Entretanto, quando as células migrantes chegam ao seu destino e
Células começam a se agregar entre si para formar gânglios nervosos, elas tornam a expressar
migratórias N-caderina (Hatta et al.,1987).
Tubo neural Expressão diferencial de caderina pode também explicar os dados de distribuição
homotípica discutida anteriormente. Como foi discutido, Roth e colaboradores de-
E-caderina monstraram que células de fígado tendem a coletar células de fígado e que células
(C) N-caderina
retinais coletam outras células retinais. Takeichi (1987) demonstrou que células retinais
Figura 3.17
expressam N-caderina e células hepáticas expressam E-caderina, e que a distribuição
Localização de duas diferentes caderinas du- seria a esperada devido a essa diferença na expressão de caderinas. Ele também suge-
rante a formação do tubo neural no camun- riu que as observações de Townes e Holtfreter poderiam ser, da mesma forma, explicadas
dongo. Foi usada marcação imunofluorescen- por expressão diferencial de caderinas. Suporte para essa idéia veio de estudos nos
te dupla para localizar E-caderina (A) e N- quais diferentes genes de caderina foram transfectados em fibroblastos de camun-
caderina (B) na mesma seção transversal do dongo, que não expressam habitualmente qualquer tipo de caderina. Fibroblastos
cérebro posterior de um embrião de camun- expressando E-caderina aderiram a outros contendo E-caderina, enquanto fibroblastos
dongo de 8.5 dias. Anticorpos para E-caderi- de P-caderina se ligavam a outros que expressavam P-caderina. Também, quando
na foram marcados com um tipo de corante
tecido pulmonar embrionário foi dissociado e sua recombinação permitida na presen-
fluorescente (o qual fluoresce em um interva-
lo de comprimento de onda), enquanto anti-
ça de fibroblastos levando E-caderina ou de fibroblastos sem tratamento, os
corpos para N-caderina foram marcados com fibroblastos expressando E-caderina foram integrados nos túbulos epiteliais pulmo-
um segundo tipo de corante (que emite sua nares (que expressam E-caderina), enquanto que os fibroblastos não tratados se asso-
cor em outros comprimentos de onda). Foto- ciaram às células mesenquimatosas (que não expressam caderinas) (Nose et al.,1988).
grafias obtidas em diferentes comprimentos Todos esses experimentos foram realizados com células cultivadas. Recentemen-
de onda. mostram que o ectoderma externo te, estudos in vivo mostraram que caderinas podem ter um papel crítico nos fenôme-
expressa E-caderina predominantemente, ao nos de distribuição ocorrendo dentro do embrião. Quando o mRNA para N-caderina
passo que a invaginante placa neural cessa a de galinha é injetado em um dos dois blastômeros da primeira clivagem em embrião da
expressão de E-caderina, mas passa a expres-
rã Xenopus, N-caderina é freqüentemente expressa em células que normalmente não a
sar N-caderina. (C) quando se forma o tubo
neural, ele expressa N-caderina, a epiderme
possuem. Os embriões que expressam N-caderina extra são muitas vezes caracteriza-
expressa E-caderina e as células da crista dos por amontoados de células e camadas tissulares engrossadas. Normalmente, o
neural nenhuma das duas. (Fotografias de K. tubo neural (que expressa N-caderina) se separa das células que se transformarão em
Shimamura e H. Matsunami, cortesia de M. epiderme (a qual expressa E-caderina). Em embriões nos quais a epiderme e o tubo
Takeichi; C de Rutishauser, 1988.) neural expressam a N-caderina extra, o tubo neural não se separa da epiderme (Detrick
(A)
(B)
Figura 3.18
Importância de caderinas em manter a coesão entre células em desenvolvimento. (A) Quando
oócitos são injetados com oligonucleotídeos antisense contra uma mensagem de caderina herda-
da maternalmente, as células centrais dispersam quando o hemisfério animal é removido. Em
embriões controle (direita), as células internas permanecem juntas. (B) No estágio de quatro
células, os blastômeros que formam o lado esquerdo do sapo são injetados com um mRNA para
N-caderina que não tem a região extracelular da caderina. Durante a neurulação as células com a
proteína mutante não formam uma camada coerente. (de Heasman et al., 1994; B de acordo com
Kintner et al, 1992; fotografias cortesia de J. Heasman e C. Kintner.)
et al., 1990; Fujimori et al., 1990). Assim, as caderinas estão, provavelmente, tendo um
papel principal na organização das células em tecidos. [cell2.html]
CAMs da superfamília de imunoglobulinas

Como discutimos no Capítulo 1, anticorpos foram usados inicialmente para identificar
moléculas de adesão celular em Dictyostelium. Gerisch e colegas (Beug et al.,1970),
prepararam anticorpos contra Dictyostelium e os quebraram quimicamente de modo
que somente suas regiões monovalentes ligantes de antígeno permanecessem – os
fragmentos Fab. (Os anticorpos bivalentes tiveram que ser quebrados, porque de
outra maneira eles poderiam artificialmente agrupar células e o efeito não poderia ser
medido). Isso levou à descoberta de uma glicoproteína de 80-kDa que é mediadora da
adesão célula-célula durante a agregação no fungo pegajoso. A mesma estratégia foi
usada por Edelman e seus colaboradores (Brackenbury et al., 1977) que levou ao
isolamento de uma molécula de adesão de células neurais (N-CAM). [cell3.html]
N-CAM é um membro de uma classe de CAMs que não necessitam íons de cálcio
e que têm uma estrutura semelhante (Figura 3.19). Essa estrutura extracelular com seus
domínios globulares imobilizados por pontes dissulfeto, se assemelha à molécula de
imunoglobulina, e é mesmo possível que as imunoglobulinas sejam derivadas desse
grupo de CAMs (Williams e Barclay, 1988; Lander, 1989). Assim, essas glicoproteínas
são chamadas CAMs da superfamília de imunoglobulinas*.
As CAMs da superfamília de imunoglobulinas podem ter um papel importante
no desenvolvimento do sistema nervoso. N-CAM é necessária para uma ligação
adequada de axônios às células musculares alvos (Covault e Sanes, 1986; Tosney et
al.,1986). Além disso, N-CAM parece ser crítica para o empacotamento (fasciculação)
de axônios para que se movimentem como uma unidade. Anticorpos à N-CAM po-
dem quebrar essas ligações, permitindo que os axônios se dispersem (Fraser et al.,
1988; Landmesser et al.,1988). Uma situação similar parece ocorrer em insetos, onde
* A designação superfamília é freqüentemente usada porque as diferentes classes de mo-

léculas de imunoglobulinas também constituem, elas mesmas, uma “família”. Esses outros
membros da superfamília têm estruturas semelhantes às imunoglobulinas, mas não são exata-
mente família “próxima”.
Figura 3.19 (B)

Moléculas de adesão da superfamília de imunoglobulinas. (A) Três membros da superfamília de
imunoglobulinas. A forma da molécula de IgM ligada à membrana tem duas cadeias pesadas,
cada uma com cinco domínios, e duas cadeias leves, cada uma com dois domínios. N-CAM é um
polipeptídeo com cinco domínios. Sua âncora na membrana pode ser a seqüência de aminoáci-
dos de uma proteína transmembrana ou um lipídeo. L1 é uma proteína transmembrana com seis ou
domínios globulares. Fasciclina II, a molécula de adesão celular de insetos, e neurogliana se
assemelham a N-CAM e L1, respectivamente. (B) Modelo para a adesão das CAMs da super-
família de imunoglobulinas.
(A) N N
N N N
N N
Domínios semelhantes
à imunoglobulina
Domínios semelhantes N
à fibronectina
Extracelular
ou ou
Citoplasma CC
C C C
IgM N-CAM ou fasciclina II L1 ou neurogliana Interações de N-CAM célula-célula
as CAMs da superfamília de imunoglobulinas, chamadas fasciclinas (Figura 3.20)

ajudam a migração de axônios (Harrelson e Goodman, 1988). L1 é necessária para
a produção de certos axônios (Lemmon et al., 1989), e mutações de L1 no homem
causam um espectro de anomalias caracterizada por hidrocefalia, retardamento
mental e inabilidade em controlar movimentos dos membros (Vits et al., 1994).
Expressão diferencial de CAM é crítica nos limites entre dois grupos de células.
Nesses lugares, o corpo segrega diferentes células em diferentes regiões. Células da
Figura 3.20 notocorda não entram no tubo neural e nem células dermais trespassam para a epiderme.
Expressão de fasciclina no sistema nervoso do
gafanhoto em desenvolvimento. (A) Estrutura
em andaime dos axônios fasciculados em um
embrião de gafanhoto como visto em um
microscópio de Nomarski. A com e P com são
as comissuras anterior e posterior cujos axônios
atravessam o segmento; ISN é um neurônio
intersegmental e con é um neurônio conectivo.
(B,C) Sistema nervoso embriônico como em
(A), mas marcado com anticorpos monoclonais
feitos para as glicoproteínas fasciclinas da
superfície celular. O anticorpo em (B)
reconhece um subconjunto de axônios nas
comissuras anterior e posterior, enquanto o
anticorpo em (C) se liga a uma glicoproteína
de membrana dos mais longitudinais fascículos
de axônios. As flechas mostram os mesmos
locais em (B) e (C). Note que o anticorpo marca
somente uma porção de cada axônio. (de
Bastiani et al., 1987, cortesia de C. Goodman.) (A) (B) (C)
Figura 3.21
Distribuição de diferentes CAMs em bordas tissulares. Enquanto as células mesodérmicas se
reúnem para induzir o broto das penas no ectoderma, as células mesenquimatosas recém-
agregadas expressam N-CAM (A) e as células ectodérmicas expressam E-caderinas (B) nas
suas respectivas membranas celulares. (de Chuong e Edelman, 1985a, cortesia de G. Edelman).
Essa segregagação pode ser conseqüência da diferença de CAMs nas populações

adjacentes. Por exemplo, penas são induzidas quando células mesenquimatosas deri-
vadas do mesoderma se agrupam para formar uma bola de células imediatamente
abaixo da epiderme da pele da galinha. As células ectodérmicas estão ligadas entre si
por E-caderina, enquanto as células mesenquimatosas, CAM-negativas anteriormen- (A)
te, começam a expressar N-CAM e se juntam para formar um agregado (Figura 3.21).
Através do desenvolvimento da pena, diferentes grupos de células se separam umas
das outras, como resultado de sua habilidade para expressar N-CAM, E-caderina, ou
ambas as proteínas (Chuong e Edelman, 1985a,b).
Moléculas da junção celular:

proteínas da junção em fenda
Junções em fenda são regiões intercelulares especializadas onde células adjacentes
se encontram entre 15-40 nm de distância. Finas conexões servem como canais de
comunicação entre células adjacentes (Figura 3.22A,B). Células assim ligadas são (B)
chamadas “acopladas”, e pequenas moléculas (MW<1500) e íons podem passar
livremente de uma célula para outra. Na maioria dos embriões, pelo menos alguns
(B) (D)
Figura 3.22
Proteínas das junções em fenda. (A) Micro-
grafia eletrônica de uma fileira de junções em
Espaço intracelular
(15-40 nm) fenda ligando duas células justapostas. (B) Mi-
crografia fluorescente de junções em fenda em
túbulo renal de embrião de camundongo de 17
dias. (C) Compartimento formado por prote-
Canais de ínas da junção de fenda entre células que se
comunicação comunicam umas com as outras. Esse com-
partimento na gástrula de camundongo pode
ser visto injetando o corante Lucifer Yellow
em um célula e observando sua transferência a
um pequeno grupo de células. (D) Estrutura
da subunidade da junção em fenda. (A de
Membranas Peracchia e Dulhunty, 1976, cortesia de C.
celulares
Peracchia; B de Sainio et al., 1992, cortesia de
Conexões K. Sainio; C de Kalimi e Lo, 1988, cortesia de
(A) (D) C. Lo; D conforme Darnell et al., 1986.)
dos blastômeros precoces estão ligados por junções em fenda, dessa forma permi-
tindo que íons e pequenas moléculas solúveis passem livremente entre eles. A habi-
lidade de células em formar junções em fenda com algumas células, e não com
outras, cria “compartimentos” fisiológicos dentro do embrião em desenvolvimento
(Figura 3.22 C).
A importância de junções em fenda no desenvolvimento foi demonstrada em
embriões de anfíbios e mamíferos (Warner et al., 1984). Quando anticorpos contra
proteínas da junção em fenda foram microinjetados em uma célula específica de uma
blástula de Xenopus de oito células, a progênie daquela célula que usualmente está
ligada por junções de fenda, agora não podia permitir a passagem de íons ou molé-
culas pequenas de uma célula à outra. Ainda mais, os girinos que resultaram das
blástulas tratadas mostraram defeitos especificamente relacionados ao destino de-
senvolvimental da célula injetada (Figura 3.23). A progênie de tal célula não morreu,
mas foi incapaz de se desenvolver de maneira normal (Warner et al., 1984). No em-
brião de camundongo, os oito primeiros blastômeros são conectados entre si por
junções em fenda. Apesar de frouxamente associadas entre si, essas oito células se
movem juntas para formar um embrião compacto. Se a compactação for inibida por
anticorpos contra proteínas da junção em fenda, o desenvolvimento posterior ces-
sa. Os blastômeros tratados continuam a dividir-se, mas a compactação não ocorre
(Lo e Gilula, 1979; Lee et al., 1987). Se RNA antisense contra as mensagens da junção
em fenda é injetado em um dos blastômeros de um embrião normal de camundongo,
aquela célula não formará junções em fenda e não será incluída no embrião (Bevilacqua
et al., 1989).
Os canais da junção em fenda são feitos de proteínas chamadas conexinas. Em
cada célula, seis conexinas idênticas da membrana se agrupam para formar um canal
transmembrana contendo um poro central. O complexo de junção em fenda de uma
célula se conecta ao complexo de junção em fenda de outra célula, permitindo que se
juntem os citoplasmas de ambas as células (Figura 3.22D). Existem aproximadamente
doze tipos de conexinas, e algumas podem ser reguladas por caderinas. Jongen e
colaboradores (1991) observaram que em células acopladas por E-caderina, a comu-
nicação entre células, mediada por junções em fenda, depende da função de caderinas.
Evidências sugerem que caderinas permitem não só o contato entre as células como
também modificam as proteínas tipo conexina. Os diferentes tipos de proteína
conexina têm papéis separados, mas parcialmente sobrepostos, no desenvolvimen-
to normal. Por exemplo, a proteína de junção em fenda conexina-43 é encontrada em
quase todos os tecidos do embrião do camundongo em desenvolvimento. Entretan-
to, se os genes da conexina-43 forem derrubados por endereçamento de genes, o
embrião ainda se desenvolverá. Parece que a função da proteína conexina-43 pode
ser assumida por outras conexinas. Mas, logo após o nascimento, esses camundon-
gos têm respiração convulsiva, se tornam cianóticos e morrem. Autópsia desses
animais mostra que o ventrículo direito – a câmara que bombeia sangue aos pulmões
através da artéria pulmonar – está cheio de tecido que fecha a câmara e impede o
fluxo de sangue (Reaume et al.,1995). Mesmo que a perda da proteína conexina-43
(A) possa ser compensada em muitos tecidos, parece que ela é crítica para o desenvol-
vimento normal do coração. [cell4.html]
A membrana celular tem, então, vários mecanismos pelos quais pode fazer liga-
ções com membranas de outras células. Podem ser usadas CAMs da superfamília de
Figura 3.23
Efeitos da junção em fenda no desenvolvimento. Seção de um girino de Xenopus no qual um dos
blastômeros, no estágio de oito células, foi injetado com (A) um anticorpo controle ou (B) um
anticorpo contra a proteína da junção em fenda. O lado formado pelo blastômero injetado não tem
(B) o olho e tem uma morfologia cerebral anormal. (de Warner et al., 1984, cortesia de A. E. Warner.)
imunoglobulinas, CAMs dependentes de cálcio e proteínas de junção. Mas isso

não esgota seu repertório. Como já mencionado, a célula também pode se ligar a
componentes específicos da matriz extracelular. Agora voltamos nossa atenção para
esses componentes.
A base molecular da afinidade célula-substrato

Afinidade diferencial a substrato
A migração de células, como a migração de pássaros e borboletas monarca, depende
da percepção de quando começar a migração, quando cessar a migração e qual rota
tomar. Existem muitos sinais que o ambiente pode dar às células, mas os principais
parecem envolver substâncias na matriz extracelular. A hipótese da afinidade diferen-
cial a substrato postula que diferentes células reconhecem diferentes moléculas em
várias matrizes extracelulares. Cada tipo de célula migratória prefere certas combina-
ções de moléculas da matriz a outras combinações, e essas moléculas orientam a célula
para quando e onde migrar. Weiss (1945) e Tyler (1946) sugeriram que a célula, por
vezes, pode interagir com seus substratos através do sistema chave-fechadura, ou
seja, entre a membrana celular e a matriz extracelular. O relacionamento entre a proteína
da membrana celular e a molécula da matriz seria semelhante aquele entre enzima e
substrato ou anticorpo e antígeno. Durante a última década foi demonstrado que esse
tipo de interação é muito importante para a migração celular. [cell5.html]
A matriz extracelular
A matriz extracelular consiste de macromoléculas secretadas pelas células no seu
ambiente imediato. Essas moléculas interagem de modo a formar uma estrutura insolú-
vel que pode ter várias funções no desenvolvimento. Em algumas situações, ela pode
separar dois grupos adjacentes de células e prevenir qualquer interação. Em outros
casos, a matriz extracelular pode servir como o substrato no qual as células migram, ou
pode até induzir diferenciação em certos tipos celulares. Um tipo de matriz é mostrado
na Figura 3.24. Aqui, uma lâmina de células epiteliais está adjacente a uma camada de
tecido mesenquimatoso frouxo. As células epiteliais formaram uma apertada camada
extracelular chamada lâmina basal; as células mesenquimatosas secretam uma frouxa
lâmina reticular. Juntas, essas camadas constituem a membrana basal da lâmina de
células epiteliais. Existem três componentes principais na maioria de matrizes
extracelulares: colágeno, proteoglicanos e glicoproteínas grandes que são chamadas
moléculas de adesão a substrato (Tabela 3.2).
Epitélio Figura 3.24

Localização e formação da ma-
triz extracelular no embrião de
galinha. A micrografia eletrônica
de varredura mostra a matriz ex-
tracelular na junção das células
Lâmina basal epiteliais (acima) e mesenquima-
tosas (abaixo). As células epite-
liais sintetizam uma lâmina den-
sa com base de glicoproteína,
enquanto as células mesenquima-
tosas secretam a lâmina reticular
Colágeno
feita primariamente de colágeno.
(Cortesia de R. L. Trelsted.)
Tabela 3.2 Principais constituintes da matriz extracelular

Matriz extracelular mesenquimatosa Lâmina basal das células epiteliais
COLÁGENOS COLÁGENO IV
Moléculas longas e delgadas (Tipo I é o mais comum; Tipos II, Os componentes estruturais majoritários da lâmina basal. Ao contrá-
III, e V-XIII são também encontradas) que se organizam para rio de outros colágenos, suas fibrilas são como um fino “arame de
formar fibrilas, usualmente com 60-70 nm de diâmetro. galinheiro” e se organizam em um substrato semelhante a feltro.
Colágenos proporcionam força e estabilidade aos tecidos.
PROTEOGLICANOS DA MATRIZ
PROTEOGLICANOS DA MATRIZ
Ácido hialurônico e proteoglicanos sulfatados são freqüentes na lâmi-
Compostos de proteínas e dissacarídeos repetitivos (glicosaminogli- na basal. Sua presença pode facilitar a passagem de produtos
canos). Glicosaminoglicanos incluem ácido hialurônico, uma enorme secretados pela lâmina.
molécula (108 Da) que liga grandes quantidades de água. Proteoglica-
nos sulfatados compreendem uma proteína linear interna à qual estão MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO
ligadas cadeias de um ou mais glicosaminoglicanos sulfatados
(condroitina, heparan, queratan e dermatan sulfato). Laminina, o componente funcional majoritário da lâmina basal. Um
Proteoglicanos estimulam e modulam movimentos celulares; sua trímero de glicoproteína com sítios de adesão para a membrana celu-
disponibilidade sugere que podem ter outras propriedades não lar, colágeno IV e glicosaminoglicanos.
conhecidas. Lâmina basal pode conter fibronectina, tenascina, nidogen e outras
glicoproteínas adesivas.
MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO
Moléculas às quais células aderem permitindo-lhes que se movam.

Elas incluem fibronectina, condronectina e tenascina.
Fonte: Adaptado de Bard, 1990.
COLÁGENO. Colágeno é uma família de glicoproteínas contendo altas porcenta-

gens de resíduos de glicina e prolina. Quase metade das proteínas do corpo são
constituídas de colágeno, que é o principal suporte estrutural de quase todos os
órgãos dos animais. Existem numerosos tipos de colágeno servindo funções espe-
ciais. Colágeno Tipo I, encontrado nas matrizes extracelulares da pele, tendões e
ossos, perfaz quase 90 porcento do colágeno do corpo. Colágeno Tipo II é mais
evidente como secreção das células cartilaginosas, mas também é encontrado na
notocorda e no corpo vítreo do olho. Vasos sangüíneos apresentam colágeno Tipo
III, e o Tipo IV é encontrado na lâmina basal produzida por células epiteliais (Vuorio,
1986). Outros tipos de colágeno são encontrados ao longo do corpo, especialmente
em cartilagem. Colágeno é importante para a formação da lâmina basal, e também
está implicado na ramificação dos túbulos epiteliais nas glândulas salivares, pul-
mões e outros órgãos. [cell6.html]
PROTEOGLICANOS. São tipos específicos de glicoproteínas nas quais: (1) o peso

dos resíduos de carboidratos é muito maior do que o da proteína; (2) os carboidratos
são cadeias lineares compostas de dissacarídeos repetitivos. Usualmente, um dos
açúcares do dissacarídeo tem um grupo amino e a unidade repetitiva é chamada glico-
saminoglicano (GAG). A Tabela 3.3 lista os glicosaminoglicanos mais comuns; a es-
trutura básica dos proteoglicanos é mostrada na Figura 3.25. A interconexão de proteí-
na e carboidrato forma uma matriz semelhante a uma rede, e em muitos tipos de células
móveis, o proteoglicano envolve as células impedindo que elas se juntem (Figura
3.26). A consistência da matriz extracelular depende da relação entre colágeno e prote-
oglicanos. Cartilagem, que tem uma alta porcentagem de proteoglicanos, é macia,
enquanto tendões, que contêm predominantemente fibras de colágeno, são rígidos.
Na lâmina basal predominam os proteoglicanos que formam uma peneira molecular
além de propiciar suporte estrutural.
Monômeros de proteoglicanos
Pequenos glicosaminoglicanos
(tal como condroitina sulfato)
Proteína
esqueleto
Ácido D-glucurônico N-acetil-D-glucosamina
Ácido
hialurônico
Ácido hialurônico
Glicosaminoglicano Figura 3.25

A estrutura da subunidade e a montagem de
um proteoglicano complexo. O dissacarídeo
repetitivo do glicosaminoglicano (tal como
condroitina sulfato; veja Tabela 3.3) se liga a
um esqueleto protéico relativamente peque-
Glicoproteínas no (colorido), para produzir as cadeias de pro-
ligantes teoglicanos. Essas cadeias podem ser conec-
tadas por glicosamino-glicanos mais longos
Agregados de (mostrado aqui como ácido hialurônico) para
proteoglicanos produzir redes complexas. Glicoproteínas
ligantes estabilizam essas últimas associações.
(Modificado de Cheney e Lash, 1981.)
Tabela 3.3 Unidades dissacarídicas repetitivas de glicosaminoglicanos mais comuns

encontradas em proteoglicanos da matriz
Glicosaminoglicano Unidade dissacarídica repetitivaa Distribuição
Ácido hialurônico Ácido glucurônico-N- Tecidos conjuntivos, osso,

acetilglucosamina corpo vítreo
Condroitina sulfato Ácido glucurônico-N- Cartilagem, córnea, artérias
acetigalactosamina sulfato
Dermatan sulfato [Ácido glucurônico ou idurônico] Pele, coração, vasos sangüíneos
N-acetilgalactosamina sulfato
Queratan sulfato Galactose-N-acetilglucosamina Cartilagem, córnea
sulfato
Heparan sulfato [Ácido glucurônico ou idurônico] Pulmão, artérias, superfície celular
N-acetilglucosamina sulfato
a
Essas são unidades repetitivas típicas desses glicosaminoglicanos. Entretanto, algumas regiões de cada GAG podem ter
sacarídeos ligeiramente modificados.
(A)
(B)
(D)
(C)
Proteoglicanos também são importantes como mediadores de conexões entre
Figura 3.26 tecidos adjacentes em um órgão. No órgão, eles reúnem células soltas para formar
Capa de proteoglicanos envolvendo células mó-
uma lâmina epitelial* (San Antonio et al.,1987; Thesleff et al., 1989; Vainio et al.,
veis. (A) Capa de hialuronidato envolve
mioblastos de galinha. Mioblastos em cultura
1989; Bernfield e Sanderson, 1990). Em alguns casos, proteoglicanos secretados por
excluem pequenas partículas (nesse caso, um tipo de célula são essenciais para o crescimento de células vizinhas. Axônios
hemácias fixadas) em distância significante da dos gânglios da raiz dorsal têm proteoglicanos de heparan sulfato entre suas prote-
borda celular. (B) quando os mioblastos são ínas da superfície celular; a remoção desses proteoglicanos impede a proliferação
tratados com hialuronidase (a qual dissolve áci- ao seu redor, das células de Schwann associadas (Ratner et al.,1985). Uma maneira
do hialurônico), essa capa extracelular desapa- pela qual cadeias de glicosaminoglicanos, de proteoglicanos, podem funcionar é
rece. (C) A capa também desaparece quando reter e apresentar fatores de crescimento para receptores celulares. Fatores de cres-
os mioblastos cessam a divisão e se juntam cimento são proteínas semelhantes a hormônios que regulam mitose ou diferencia-
enquanto se diferenciam. (D) Micrografia ele-
ção quando se ligam a determinadas células. Entretanto, o receptor celular para o
trônica de hialuronidato em solução aquosa
mostra uma rede fibrilar ramificada. (A-C de
fator de crescimento freqüentemente não liga o fator com grande afinidade. Na
Orkin et al., 1985, cortesia de B. Toole; D de verdade, o fator é inicialmente ligado pelos carboidratos do proteoglicano, e isso
Hadler et al., 1982, cortesia de N. M. Hadler.) concentra o fator de crescimento localmente, de modo a ser possível a ligação com
o receptor (Massagué, 1991; Yayon et al.,1991).
GLICOPROTEÍNAS EXTRACELULARES. Matrizes extracelulares contêm uma va-

riedade de outras moléculas especializadas, tais como: fibronectina, laminina e te-
nascina. Essas glicoproteínas grandes provavelmente são responsáveis pela orga-
nização de colágeno, proteoglicanos e células em uma estrutura ordenada. Fibro-
nectina é um dímero de glicoproteína, muito grande (460-kDa), sintetizada por
fibroblastos, condrócitos, células endoteliais, macrófagos e certas células epiteliais
(como hepatócitos e amniócitos). Uma função da fibronectina é servir como adesivo
*Proteoglicanos de heparan sulfato são considerados como agregadores de condrócitos, as

células produtoras de cartilagem. Níveis excessivos de glicose inibem a síntese do esqueleto de
proteína do proteoglicano, inibindo a formação da cartilagem. Leonard e colaboradores (1989)
propuseram esse como um possível mecanismo para explicar problemas esqueléticos em crianças
nascidas de mães severamente diabéticas.
molecular em geral, ligando células a substratos, tais como: colágeno e proteoglica-

nos. Fibronectina também organiza a matriz extracelular por ter vários pontos de
ligação distintos, que interagindo com as moléculas apropriadas produz um alinha-
mento adequado de células e sua matriz extracelular (Figura 3.27).
Como será visto em capítulos posteriores, fibronectina tem também um papel im-
portante na migração celular. As “rodovias” pelas quais se movem certas células
migratórias são pavimentadas com essa proteína. A migração de células mesodérmicas
na gastrulação é vista na superfície de fibronectina em muitas espécies, e o movimento
dessas células cessa quando a fibronectina é localmente removida. Em embriões de
galinha, os precursores do coração, as células precardíacas, migram na fibronectina
para se mover das laterais do embrião para a linha mediana. Se embriões de galinhas
são injetados com anticorpos à fibronectina, as células precardíacas não migram para
a linha mediana e desenvolvem dois corações separados. Anticorpos fluorescentes à
fibronectina demonstraram um gradiente da proteína no caminho de migração entre o
endoderma e o mesoderma. Se essa região for cortada e sofrer uma rotação, as células
do coração seguem o gradiente para novas posições se afastando da linha mediana
(Linask e Lash, 1988a,b). Assim, a fibronectina parece ter um papel principal na migra-
ção das células precardíacas para a linha mediana do embrião. Outros tipos de células,
como as células germinativas, precursoras de embriões do sapo, também migram so-
bre células que secretam fibronectina em suas superfícies (Heasman et al.,1981).
Laminina é um componente principal da lâmina basal. É composta de três cadeias
peptídicas, e, como fibronectina, pode se ligar ao colágeno, glicosaminoglicanos e célu-
las. O colágeno ligado por laminina é do Tipo IV (específico para lâmina basal), e a região
ligante de células da laminina reconhece principalmente células epiteliais e neurônios. A
adesão de células epiteliais à laminina (na qual elas se assentam e usam) é muito maior do
que a afinidade de células mesenquimatosas pela fibronectina (à qual elas devem se ligar
e liberar se deverá haver migração). Como a fibronectina, a laminina tem um papel na
montagem da matriz extracelular, promovendo adesão celular e crescimento, mudando a
forma da célula e permitindo a migração celular (Hakomori et al.,1984).
Nem todas grandes glicoproteínas celulares promovem adesão celular. Tenascina
(também chamada citotactina) se assemelha a fibronectina em mais ou menos metade
Figura 3.27
Fibronectina no embrião de galinha em desen-
volvimento. (A) Anticorpos fluorescentes para
(A) fibronectina mostram que a deposição de pro-
teína no embrião de 24 horas se situa ao longo
da lâmina basal de muitos órgãos. (B) Estrutu-
ra e domínios de ligação na fibronectina. Os
retângulos representam domínios resistentes
a proteases. O domínio para a ligação de fibro-
blastos compreende duas unidades, o sítio
RGD e o sítio de alta afinidade; ambos são
essenciais para ligação da célula. Células da
crista neural de aves têm outro sítio necessário
para sua mobilidade em um substrato de fibro-
nectina. Outras regiões na fibronectina permi-
tem ligações com colágeno, heparina* e outras
moléculas da matriz extracelular. (A cortesia
Domínios para ligação
de J. Lash; B conforme Dufour et al., 1988.)
de células da crista
neural de aves
Sítio de alta *Heparina é uma porção de um proteogli-
(B)
afinidade cano de heparina secretada por mastócitos e
RGDS CS1
basófilos. Heparan e heparan sulfato são nomes
H 2N COOH dados a glicosaminoglicanos similares encontra-
Domínio dos na matriz extracelular ou na superfície da
ligante Domínio Domínios ligantes Sítio II Sítio II célula. Presume-se que os sítios de ligação para
de fibrina e ligante de células para ligante de ligante de heparina sejam os mesmos que os para heparan
heparina de colágeno fibroblastos heparina fibrina sulfato (Bernfield e Sanderson, 1990).
do comprimento da molécula, e é encontrada transitoriamente em várias matrizes

extracelulares durante o desenvolvimento embrionário. Entretanto, diferentes células
reagem de maneira diferente à tenascina. Algumas células aderem a ela, outras são
arrebanhadas e se desligam da tenascina (Figura 3.28; Spring et al., 1989). Diferentes
quantidades relativas de fibronectina e tenascina podem gerar substratos de vários
graus de adesividade. Além disso, tenascinas parecem aumentar a síntese e secreção
de proteases das células que nela se localizam (Werb et al., 1990). Ambas as caracterís-
ticas podem ser importantes na geração de vias para a migração celular, e na remode-
lação da matriz extracelular durante o desenvolvimento (Tan et al., 1987; Bronner-
Fraser, 1988; Wehrle e Chiquet, 1990).
Receptores celulares para moléculas da matriz extracelular

INTEGRINAS. A habilidade de uma célula em ligar essas glicoproteínas adesivas
depende da sua capacidade em expressar um receptor da membrana, que se torna o
lugar de ligação na célula para essas grandes moléculas. Os principais receptores de
Figura 3.28
fibronectina foram purificados usando anticorpos monoclonais que bloqueiam a
Inibição de adesão celular por tenascina.
ligação das células à fibronectina (Chen et al.,1985; Knudsen et al., 1985). Foi obser-
Fibronectina e tenascina foram colocadas em
placas de cultura de tecidos, dispostas em forma vado que o complexo receptor de fibronectina é capaz não só de ligar fibronectina
de letras. Fibroblastos foram adicionados às no exterior da célula, como também proteínas do citoesqueleto dentro da célula.
placas podendo aderir e migrar. O resultado Então, parece que o complexo receptor de fibronectina atravessa a membrana celular
mostra que fibronectina foi o substrato preferido e une dois tipos de matrizes. Dentro da célula, serve como um sítio de ancoragem
no plástico da cultura de tecidos, enquanto que para os microfilamentos de actina que movimentam a célula; fora da célula, se liga à
as células não aderiram ou migraram bem sobre fibronectina da matriz extracelular (Figura 3.29). Horwitz e colaboradores (1986;
a tenascina. (Cortesia de M. Chiquet.) Tamkun et al., 1986) denominaram essa família de receptores protéicos como
integrinas porque elas integram as plataformas intra e extracelulares permitindo que
funcionem conjuntamente. Proteínas integrinas foram encontradas atravessando a
membrana de numerosos tipos de células. No lado extracelular, integrina se liga à
seqüência arginina-glicina-aspartato (RGD) de várias proteínas adesivas em matri-
zes extracelulares, incluíndo vitronectina (encontrada na lâmina basal do olho), fi-
bronectina e laminina (Ruoslahti e Pierschbacher, 1987). No lado citoplasmático, a
integrina se liga à talina e α-actinina, duas proteínas que se ligam aos microfilamen-
tos de actina. Essa ligação dupla permite o movimento da célula pela contração dos
microfilamentos de actina contra a matriz extracelular fixa (veja Wang et al., 1993).
Tipos diferentes de células podem ter diferentes moléculas de integrinas com dife-
rentes afinidades por moléculas da matriz extracelular (Hemler et al., 1987; Hemler,1990).
Cada molécula de integrina tem duas subunidades distintas, α e β, e diferentes
combinações binárias das subunidades α e β permitem que a integrina se ligue a
determinadas moléculas extracelulares. Por exemplo, α2β1 se liga ao colágeno e
laminina, enquanto α4β1 se liga somente à fibronectina.
Ambas as unidades α e β são necessárias para a ligação com fibronectina ou
laminina, mas somente a unidade β conecta com o citoesqueleto interno. Durante a
migração, as ligações unindo a unidade β da integrina ao citoesqueleto, podem ser
continuamente quebradas e refeitas por uma protease que cliva talina e está especifi-
camente localizada em sítios da membrana celular onde a integrina se liga ao substrato.
É possível que essa protease quebre a ponte entre o receptor de fibronectina e o
citoesqueleto (Beckerle et al., 1987).
A importância de integrinas é dramaticamente ilustrada durante a embriogênese
de Drosophila. Como as integrinas de vertebrados, as integrinas de Drosophila são
compostas de subunidades α e β que atravessam a membrana celular. Nas duas
integrinas de Drosophila que são conhecidas, as subunidades β são idênticas, mas
as subunidades α são diferentes. Essas duas integrinas freqüentemente funcionam
em conjunto efetuando adesão tissular e celular durante o desenvolvimento. No
desenvolvimento da asa da Drosophila, duas lâminas epiteliais são aproximadas. A
integrina PS1 está situada na superfície basal do epitélio na asa presuntiva dorsal,
enquanto a integrina PS2 está na superfície superior do epitélio na asa presuntiva
(A) RGD
Fibronectina
Sítios de
ligação
Sítio de ligação de RGD de cálcio
Subunidade ß
Subunidade ß Subunidade
de integrina
de integrina α de
integrina
Extracelular
Citoplasma
α Actinina Vinculina
Talina
ventral. Durante a metamorfose, esses dois epitélios se encontram e aderem para

formar a lâmina de duas camadas da asa. Mutações nas integrinas produzem asas
com regiões onde os dois epitélios se separam, como evidenciado por bolhas α Actinina Microfilamento de actina
entre as duas lâminas (Brower e Jaffe, 1989; Wilcox et al.,1989). Algumas mutações
de integrinas em Drosophila são letais, porque integrina é necessária para anexar
músculos à epiderme e à parede do intestino. Na mutação letal (1) myospheroid,
Figura 3.29
existe uma deficiência nos genes codificando a subunidade β das integrinas de Dupla função de integrinas ao se ligar com
Drosophila. Na ausência dessa subunidade, nenhuma integrina se forma, e os matrizes extracelulares e com o citoesqueleto
músculos somáticos se contraem em esferas sem ligantes para a parede do corpo interno. (A) Imunofluorescência indireta co-
e do intestino (Leptin et al.,1989). rando os microfilamentos de actina de uma
Integrinas não são as únicas moléculas capazes de se ligar à laminina e à fibronec- célula extendendo um lamelapódio. As fibras
tina. Enquanto o receptor integrina se liga a uma seqüência RGD na cadeia A de de actina irradiam da grade ordenada do cito-
laminina, outro receptor protéico de laminina na membrana celular se liga a uma se- esqueleto para o lamelapódio. (B) Diagrama
qüência diferente (Y1GSR) na cadeia B1 (Graf et al.,1987; Yow et al., 1988). Os recepto- especulativo relacionando a ligação do cito-
esqueleto à matriz extracelular através da mo-
res têm afinidade diferente por laminina, e essas podem ser importantes para sua
lécula de integrina. (A de Lazarides, 1976,
função (Horwitz et al., 1985). A integrina a3β1 de fibroblastos, por exemplo, tem uma cortesia de E. Lazarides; B conforme Luna e
afinidade relativamente baixa por laminina (Kd = 10-6 M), enquanto a afinidade por Hitt, 1992.)
laminina de seu receptor epitelial é muito mais alta (Kd=2 x10-9 M). O receptor usado
pode ser importante em permitir que as células usem laminina ou como membrana
basal (nesse caso a afinidade do receptor seria alta) ou como um substrato para a
migração (na qual receptores de afinidade menor seriam usados).
GLICOSILTRANSFERASES. Outro grupo de proteínas que pode aderir células a

proteínas da matriz extracelular são as glicosiltransferases da superfície celular.
Essas enzimas ligadas à membrana são rotineiramente encontradas no retículo en-
doplasmático e nas vesículas de Golgi, onde elas são responsáveis por adicionar
resíduos de açúcar a peptídeos para produzir glicoproteínas. Existem numerosas
glicosiltransferases, cada uma específica para um dado açúcar e algumas mostrando
também especificidade de substrato. Assim, galactosiltransferase é uma enzima
capaz de transferir galactose de um molécula doadora ativada (UDP-galactose) a
uma unidade aceptora. Devem existir muitas galactosiltransferases com afinidades
para diferentes moléculas aceptoras.
Galactosiltransferases são enzimas funcionais da membrana celular, e sua adesão
à matriz extracelular representa uma catálise “frustrada” (Figura 3.30). A enzima neces-
sita de dois substratos para completar a catálise, o carboidrato aceptor e o açúcar
ativado. As glicosiltransferases de membrana reconhecem o carboidrato receptor nas
Glicosil transferase
(A) NDP-açúcar + aceptor NDP + açúcar-aceptor
Doador de açúcar
(B) ativado (NDP-açúcar)
(C)
Enzima
glicosil- Aceptor
transferase insolúvel
Ligação Ligação de Catálise cliva

NDP-açúcar à açúcar de NDP e
glicosiltransferase o adiciona ao
Figura 3.30 aceptor
Interações da superfície celular através de gli-
cosiltransferases. (A) A reação padrão de gli-
cosiltransferase, na qual um açúcar é transferi-
do de um carregador nucleosídeo difosfato a
um receptor. (B) Interação entre glicosiltrans-
ferases e o grupo carboidrato (aceptor) na gli- proteínas da matriz extracelular tal como a laminina. Isso causa adesão. Quando o
coproteína da matriz extracelular. Se o açúcar segundo substrato aparece, essas adesões podem ser quebradas pela catálise. Em
ativado está ausente, ocorre a adesão (consi- algumas instâncias (como fertilização no camundongo, onde a galactosiltransferase
dera-se que isso ocorra durante a fertilização).
na membrana celular do espermatozóide interage com componentes carboidrato da
Se o açúcar ativado está presente em pequenas
quantidades, a migração é permitida. (C) Mar-
matriz extracelular secretada pelo óvulo), a adesão é crítica e a catálise não ocorre. Em
cação da glicosiltransferase da superfície celu- células migratórias, tanto adesão como catálise são observadas (Toole, 1976; Shur,
lar, incubando seções microscópicas de um em- 1977a,b; Turley e Roth, 1979; Eckstein e Shur, 1989).
brião de galinha de 10-somitos, com UDP-[3H]
galactose. Radioatividade insolúvel vista por Adesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltipla
radioautografia mostra que esse açúcar radioa- Apesar de estarmos discutindo sistemas de adesão como unidades separadas, os
tivo foi transferido às superfícies celulares, es- processos morfogenéticos de interação célula-célula são provavelmente realizados
pecialmente das células mesodérmicas migra- por combinações de moléculas de adesão celular. Por exemplo, a fixação inicial do
tórias. (A e B modificado de Pierce et al., 1980;
embrião de camundongo à parede uterina parece ser mediada por vários sistemas de
C de Shur, 1977a, cortesia de B. Shur.)
adesão. Primeiro, as células de fora do embrião (as células trofoblásticas) têm recepto-
res para o colágeno e os proteoglicanos de heparan sulfato do endométrio uterino, e
interferência com essa ligação pode impedir a implantação (Farach et al.,1987; Carson
et al., 1988, 1993). Segundo, Dutt e colaboradores (1987) mostraram que as células
trofoblásticas podem também aderir às células uterinas através das glicosiltransfera-
ses da superfície celular. Terceiro, Kadokawa e colaboradores (1989) mostraram que P-
e E-caderinas estão presentes tanto no tecido uterino como no trofoblástico no local
da implantação. Assim, células podem ter muitos sistemas adesivos que lhes permitem
ligar e/ou migrar em substratos específicos.
As células também usam sistemas múltiplos para remodelar tecidos por digestão. Por
exemplo, quando embriões de mamíferos se embebem no útero, eles “digerem” seu cami-
nho através do epitélio do útero e através de sua membrana basal de laminina, fibronectina
e colágeno Tipo IV (Behrendtsen et al., 1992). Crescimento do osso, regressão da cauda do
girino e formação de órgãos ramificados (tais como: glândulas salivares, rins e pulmões)
também requerem quebra da membrana basal. Essa degradação controlada de moléculas
da matriz extracelular é completada por um conjunto de enzimas coletivamente chamadas
de Metaloproteinases degradativas de matrizes (Matrisian, 1992; Sato et al., 1994). Algu-
mas dessas enzimas estão ligadas à membrana celular, enquanto outras são secretadas
diretamente pelas células para dentro da matriz que será dissolvida. Essas metaloproteinases
incluem: (1) colagenases que digerem colágenos dos Tipo I, II e III; (2) gelatinases que
digerem elastina e colágenos IV e V; e (3) estromelisinas que digerem proteoglicanos,
fibronectina e laminina. A ativação dos genes das metaloproteinases é realizada
coordenativamente, e várias dessas enzimas interagem para amplificar a intensidade das
enzimas digestivas (Figura 3.31). Logo após a ativação das metaloproteinases, as células
ativam os genes para os inibidores dessas proteínas. A produção e degradação controlada
da matriz extracelular é parte essencial do desenvolvimento normal.
Procolagenase Colagenase
Plasminogênio
Ativação Colagenase
Uroquinase Plasmina Ativa
transcricional muito ativa
Prostromelisina Estromelisina
Figura 3.31
Cascata de ativação de metaloproteinases de membrana. Uroquinase é um ativador de
plasminogênio, que cliva o plasminogênio dando plasmina. Plasmina ativa as formas precurso-
ras de estromelisinas e colagenases produzindo uma mistura de enzimas muito ativa capaz de
digerir matrizes extracelulares. (Conforme Matrisian, 1992.)
Moléculas de receptores e vias de transdução de sinais

Os destinos das células são freqüentemente determinados pelas interações em suas
superfícies, onde uma molécula de receptor encontra seu ligante complementar. Mas
como que certas interações na superfície da célula causam a transcrição de genes
específicos dentro do núcleo? As vias entre a membrana celular e o genoma são
chamadas vias de transdução de sinais. Várias vias foram descobertas, aqui serão
mencionadas as principais. Como veremos, elas parecem ser variações de um mesmo
tema. O tema é deveras elegante: cada receptor se estende através da membrana
tendo uma região extracelular, uma região transmembrana e uma região citoplasmáti-
ca. Quando um ligante é acoplado na região extracelular, sua forma muda e a porção
citoplasmática passa a ter atividade enzimática. Essa atividade é usualmente a de
uma quinase, que pode usar ATP para fosforilar proteínas, inclusive a si mesmo. O
receptor ativo pode agora catalizar reações que fosforilam outras proteínas, e final-
mente, a fosforilação ativa um fator de transcrição, antes dormente. Esse fator de
transcrição pode agora ativar (ou reprimir) um novo conjunto de genes. O ligante
iniciador da reação pode estar ligado a uma célula ou matriz extracelular ou, ainda,
ser uma molécula difusível. Quando a molécula difusível vem do sangue é conside-
rada um sinal endócrino. Se o sinal vem de células vizinhas difundindo-se de uma
para outra é chamado parácrino.
JAK--ST
A via JAK STAAT
No Capítulo 2 discutimos um conjunto de fatores de transcrição inativos até que
um sinal de outra célula produz sua fosforilação. Esses fatores de transcrição são
as proteínas STAT (transdutores de sinais e ativadores de transcrição) (Ihle,1995,
1996). As STATs são fosforiladas pela forma ativa da uma família de quinases, a
JAK. A via JAK-STAT é muito importante na diferenciação de células sangüíneas
e na ativação do gene de caseína na produção de leite (Briscoe et al., 1994; Groner
e Gouilleux, 1995). Nesses casos, um certo fator de diferenciação se liga a seus
receptores membrana-abrangente, fazendo com que esse se dimerize (que forme
dímeros) (Figura 3.32). Proteínas JAK estão ligadas a cada um dos receptores (em
suas respectivas regiões citoplasmáticas), e agora ao serem aproximadas fosforilam
o receptor em vários sítios. Os receptores ativados têm agora sua própria ativida-
de quinásica e podem fosforilar certos STATs inativos, induzindo sua dimerização.
Os dímeros são a forma ativa dos STAT que são translocados para o núcleo onde
se ligam às regiões específicas do DNA.
Figura 3.32 Receptores de prolactina Prolactina Receptores

A via JAK-STAT— nesse caso, a via de ativa- dimerizados
ção do gene de caseína por prolactina. O gene ativos
de caseína é ativado durante a última fase do Extracelular
desenvolvimento da glândula mamária (lacto-
gênica) e seu sinal é a secreção de prolactina,
um peptídeo de 9 aminoácidos da glândula
Citoplasma
pituitária anterior. Prolactina causa a dimeri-
zação dos receptores de prolactina nas células
epiteliais do ducto mamário. Uma proteína
JAK específica (Jak2) está “atrelada” nesses
receptores. Quando os receptores são dimeri-
zados, as proteínas JAK fosforilam umas as
outras e os receptores vizinhos, ativando a
quinase dormente desses receptores. Esses
adicionam um grupo fosfato a um resíduo de Envoltório nuclear
tirosina (Y) de uma proteína STAT específica
(nesse caso Stat5). Isso permite que a proteí-
na se dimerize e seja translocada para o núcleo Núcleo
onde se liga a regiões específicas de DNA. Em
combinações com outros fatores de transcri-
ção (que presumivelmente esperavam sua che-
gada), a proteína STAT ativa a transcrição do Inicio da
gene de caseína. GR é o glucocorticóide recep- transcrição
tor, OCT1 um fator de transcrição geral, e TBP
o conjunto de proteínas responsável pela liga-
ção de RNA polimerase. (Para detalhes, veja
Groner e Gouilleux, 1995.) Promotor do
gene de caseína
A via RTK
RTK-R-R as
-Ras
A via de transdução de sinais RTK-Ras foi uma das primeiras vias a unir as várias áreas
da biologia do desenvolvimento. Pesquisadores estudando olhos de Drosophila,
vulvas de nematódeos e cânceres humanos chegaram à conclusão que estudavam o
mesmo gene. A via RTK-Ras começa na superfície celular, onde o receptor tirosina
quinase liga seu ligante específico. Ligantes que se ligam a RTKs incluem fatores de
crescimento fibroblásticos, fatores de crescimento epidérmico e fatores de crescimen-
to derivados de plaquetas. O receptor tirosina quinase abrange a membrana e, quando
conectado com seu ligante, sofre uma mudança conformacional que permite sua
dimerização. Esses dímeros têm uma atividade quinásica latente, ativada por mudança
conformacional fazendo com que os receptores se fosforilem um ao outro em resíduos
particulares de tirosina. Assim, a introdução de um ligante no receptor causa uma
autofosforilação no domínio citoplasmático do receptor.
A tirosina fosforilada no receptor é reconhecida por uma proteína adaptiva (Figura
3.33)—especificamente, as tirosinas fosforiladas são reconhecidas por uma porção da
proteína adaptativa chamada domínio SH2. As proteínas adptativas servem como uma
ponte que liga a quinase fosforilada do receptor a um poderoso sistema intracelular de
sinalização. Enquanto ligada ao receptor fosforilado pelo seu domínio SH2, a proteína
adaptativa usa seu domínio SH3 para regular o ativador de uma proteína Ras G. Normal-
mente, a proteína de tipo selvagem Ras está na sua forma inativa e ligante de GDP.
Quando ativada pelo receptor ligante-acoplado, ela troca um fosfato de outro GTP
para transformar o GDP ligado em GTP. Essa catálise é ajudada pelo fator de troca
guanina nucleotídeo. A Ras ligada a GTP é a forma ativa da proteína que transmite o
sinal. Após a transmissão, o GTP é hidrolizado a GDP. Essa catálise é muito estimulada
Ligante Receptor Figura 3.33

A via RTK-Ras amplamente usada. O recep-
tor tirosina quinase é dimerizado pelo ligante.
Extracelular
Isso causa a autofosforilação do receptor. A
proteína SH3 reconhece as fosfotirosinas e
Citoplasma ativa as proteínas intermediárias (GRB2 e
SOS), as quais ativam a proteína Ras G por
permitir a fosforilação da porção GDP da Ras.
Ao mesmo tempo, as proteínas GAP estimu-
lam a hidrólise dessa ligação fosfato. A Ras
ativa é capaz de ativar a proteína quinase C
(PKC), que ao seu turno fosforila uma série de
quinases. Por fim, a MAP quinase altera a ex-
Ativação de pressão gênica, fosforilando certos fatores de
eventos transcrição (que podem penetrar no núcleo
dependentes de
para mudar os tipos de genes transcritos) e
cálcio e PKC
certos fatores de tradução (que alteram o nível
Fator de de síntese de proteínas). Em muitos casos, essa
Fator de transcrição ativo via é reforçada pela liberação de íons cálcio.
transcrição inativo
Núcleo Modulação da
transcrição
pela complexação normal da proteína Ras à proteína ativadora de GTP-ase (GAP).

Essa proteína de 120-kDa aumenta a atividade hidrolizante de GTP mais de 100 vezes,
e retorna a Ras à sua forma inativa (Trahey e McCormick, 1987; Gibbs et al., 1988).
Realmente, mutações no gene RAS estão relacionadas com uma grande proporção de
tumores humanos (Shih e Weinberg, 1982), e as mutações que tornam o gene
oncogênico inibem a ligação da proteína GAP. Sem a proteína GAP, a proteína Ras não
catalisa eficientemente a hidrólise de GTP permanecendo em sua configuração ativa
(Cales et al., 1988; McCormick,1989).
A proteína Ras ativa associa-se com uma quinase chamada Raf. A proteína Ras
coloca a proteína inativa Raf na membrana celular onde ela se torna ativa (Leevers et
al.,1994; Stokoe et al., 1994). A proteína Raf é chamada MAP-quinase-quinase-quinase
(MAPKKK). (MAP quer dizer proteína associada à mitose, mas atualmente é conside-
rada como um conjunto maior de fatores de transcrição). A MAPKKK fosforila a
MAPKK que, por sua vez, pode fosforilar a MAP quinase. Essa última quinase fosforila
os fatores de transcrição que especificam o destino da célula ou a proliferação. Em
olhos de Drosophila, por exemplo, considera-se que a cascata ativa o fator de trans-
crição Sina (Sevenless-in-Absentia), cuja presença é necessária para a diferenciação
do fotorreceptor 7 (Carthew e Rubin, 1990; Dickson et al., 1992).
Como veremos mais tarde neste livro, essa via é crítica em numerosos processos
desenvolvimentais. Em humanos, mutações nessa via dão origem às formas mais
comuns de nanismo, incluindo acondroplasia, que ocorre em 1 entre 50.000 nascimen-
tos. Aqui, o tórax e a cabeça crescem normalmente, mas os braços e as pernas são
encurtados proximalmente. A deficiência reside na proliferação mínima da cartilagem
da placa de crescimento dos ossos longos. A lesão genética parece estar no gene que
codifica o receptor 3 do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3) (Figura 9.19;

Rousseau et al., 1994; Shiang et al., 1994). Esse gene é expresso nas células da cartila-
gem em desenvolvimento na placa de crescimento dos ossos longos. Quando ativado
por um FGF, o FGFR3 sinaliza o condrócito para parar de dividir e começar a diferenci-
ação. As mutações nesse gene causam um fenótipo de ganho de função onde o
mutante FGFR3 é ativo constitutivamente (isto é, sem a necessidade de ser ativado
por um FGF)* (Deng et al., 1996; Webster e Donoghue, 1996). [cell7.html]
* Nomes podem ser perigosamente ilusivos. Muitos compostos têm mais de uma função na
célula, e o que fazem depende do contexto da célula. Certos “fatores de crescimento” podem inibir
o crescimento, e alguns “fatores de transcrição” podem ser utilizados para inibir a transcrição.
Realmente, alguns fatores de transcrição podem ser usados para regular a tradução. Aqui vemos que
moléculas de adesão celular podem ser usadas para transdução de sinais. Proteínas celulares não
respeitam nossas fronteiras disciplinares.
& Especulações
Mutações negativas dominantes em receptores
O significado funcional de uma

molécula ligante pode ser veri-
ficado eliminando seu receptor.
Uma maneira de fazer isso é criando mu-
(A)
FGF
FGFR normal:
FGF se liga causando dimerização
do receptor de FGF
(B) FGFR dominante negativo
FGFR FGFR
tações dominantes negativas de recep- Receptor de FGF normal mutante
tores. Esse tipo de experimento será bem
sucedido se a dimerização for crítica para
a função do receptor. Os receptores FGF
ativos, em um caso, são dímeros de duas
moléculas idênticas embebidas na mem-
brana celular. O mutante dominante ne-
gativo não formará um dímero ativo, mes-
mo com um parceiro do tipo selvagem.
Portanto, quando presente em concen- Receptores
trações suficientemente altas, o receptor sem domínios Excesso do receptor
Domínio
intracelulares mutante pode
mutante compete com receptores FGF da tirosina Sinal
são inativos seqüestrar o receptor
normais impedindo que suas proteínas quinase
normal do fator de
sejam ativadas. Isso pode ocorrer em Sem sinal
crescimento. Esse
mutações naturais ou provocadas. heterodímero é inativo.
Amaya e colaboradores (1991) injetaram
Sem sinal
mRNA de uma forma mutante de um re-
Figura 3.34
ceptor FGF em embriões de duas células
Ensaio para receptor dominante negativo para a importância de um determinado receptor. O
de Xenopus. Essas blástulas não conse-
receptor de FGF (FGFR) é uma RTK transmembrana. (A) Quando dímeros de FGF se ligam à
guem responder ao FGF (Figura 3.34).
porção extracelular desses receptores, esses se dimerizam e seus dois domínios de proteína
Nesse experimento, embriões que não ti- quinase se fosforilam mutuamente. Quando fosforilados, acionam um sinal através do citoplas-
nham receptores FGF funcionais tinham ma. (B) O receptor dominante negativo não tem o domínio da proteína quinase. Quando liga
mesoderma posterior e lateral dramatica- FGF, produz um dímero inativo, mesmo se o outro parceiro é do tipo selvagem. Assim, o efeito
mente reduzido (Prancha 3). de FGF não é transmitido à célula.
A via do inositol fosfato

Algumas vezes, a transdução de um sinal da superfície celular causa tantas mudanças,
que alterações na expressão do gene constituem somente um pequeno subconjunto
do que faz o sinal. A ativação da via do inositol fosfato promove mudanças drásticas na
fisiologia da célula pela liberação de íons cálcio do retículo endoplasmático. Essa via
é extremamente importante na ativação do espermatozóide e do óvulo, ambos neces-
sitando de um aumento na concentração intracelular de íons cálcio.
Figura 3.35
A via do inositol fosfato. (A) A reação de
(A) fosfolipase C, transformando PIP2 em DAG e
IP3. (B) Essa reação pode ser iniciada em dois
Extracelular pontos principais na membrana celular. Pri-
meiro, a via é iniciada quando o receptor trans-
Fosfolipase C membrana ligado à proteína G é ativado pela
introdução do ligante. Essa ativação resulta na
ligação de GTP à proteína heteromérica G e
Citoplasma sua dissociação em subunidades ativas. Essas
subunidades ativam enzimas fosfolipase C
(PLC) que podem catalizar a formação de DAG
e IP3. Em segundo lugar, a via pode ser ativada
pela via RTK. IP3 pode se ligar a um receptor
para liberar íons cálcio do retículo endoplas-
mático. Neste ínterim, DAG (em presença dos
íons cálcio liberados) ativa a proteína quinase
C. A proteína quinase estimula o transporta-
dor sódio/hidrogênio a trocar íons hidrogênio
celulares por íons sódio extracelulares, assim
levando a um aumento do pH.
(B)
RECEPTORES LIGADOS À PROTEÍNA G RECEPTORES LIGADOS À TIROSINA QUINASE (PDGF, EGF, etc).
Ligante
Ligante
Extracelular
Citoplasma
Proteína G
Via IP 3 PATHWAY
PKC MAP quinase
Atividade
Receptor celular e
IP 3 mitogênese
Retículo
endoplasmático
A via pode ter dois pontos iniciais (Figura 3.35; Berridge, 1993; Shilling et al.,
1994). Um ponto de iniciação é o receptor tirosina quinase, mencionado anterior-
mente. Além de ativar a proteína Ras G, as tirosina quinases ativadas podem
interagir com um tipo de enzima, fosfolipase C (PLC1-y1, que também tem um
domínio SH2 que reconhece as tirosinas autofosforiladas). Fosfolipase C pode
catalisar a hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em dois segundos
mensageiros: inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). IP3 é capaz de
abrir canais de cálcio do retículo endoplasmático, liberando uma grande quantida-
de de íons cálcio no citoplasma. DAG ativa a proteína quinase C, que por sua vez
ativa a bomba de proteína que troca íons sódio por íons hidrogênio (Swann e
Whitaker, 1986; Nishizuka, 1986). O resultado é a elevação de íons intracelulares
de cálcio e um aumento no pH intracelular.
Um segundo ponto de iniciação é outra classe de receptores, algumas vezes cha-
mado de receptores serpentina, porque têm sete domínios transmembrana e “serpen-
teiam” através da membrana. Esses receptores estão relacionados com outro tipo de
proteína G, a proteína G heteromérica. Quando o ligante liga-se ao seu receptor, esse
ativa a proteína G. Essa ativação dissocia a proteína G em suas subunidades, as quais
ativam outro conjunto de fosfolipase C, ou seja, PLC-β1 e PLC-β2. Esses dois tipos de
fosfolipase C podem clivar PIP2 em inositol 1,4,5-trifosfato e diacilglicerol. Como vere-
mos em capítulos posteriores, as mudanças nos íons hidrogênio e cálcio, efetuadas
por essa via, alteram não somente a transcrição de genes, mas também a tradução de
mRNA e a replicação de DNA.
Cruzamentos entre vias

Representamos as vias principais como se fossem cadeias lineares, onde a informa-
ção flui em conduítes únicos. Na verdade, essas vias são apenas as principais
estradas pelas quais se escoa a informação, pois entre elas existem ruas e avenidas
que fazem as conexões entre elas. (Essa pode ser a razão da existência de tantos
passos entre a superfície da célula e o núcleo. Cada passo é um ponto de regulação
em potencial e um potencial ponto de interseção). Essa comunicação cruzada pode
ser vista na Figura 3.35, onde duas vias reforçam uma a outra. Deve-se lembrar
também que a célula tem numerosos receptores e está constantemente recebendo
muitos sinais simultaneamente. Em alguns casos, a transcrição de genes requer dois
sinais. Isso é visto durante o desenvolvimento de linfócitos, onde dois sinais são
necessários, cada um produzindo um dos dois peptídeos de um fator de transcrição
envolvido na produção de interleucina 2 (IL-2, também conhecida como fator de
crescimento da célula T). Um fator, c-Fos, é produzido pela ligação do receptor da
célula T ao antígeno (Figura 3.36). Isso ativa a cascata Ras, criando um fator de
transcrição, Elk-1, ativador do gene c-fos que sintetiza c-Fos. O segundo sinal vem
da glicoproteína B7 na superfície da célula que apresenta o antígeno. Esse sinal
ativa uma segunda cascata de quinases, finalmente produzindo c-Jun. Os dois
peptídeos, c-Fos e c-Jun, podem produzir a proteína AP-1, um fator de transcrição
que se liga ao intensificador de IL-2 e ativa sua expressão (Liet al., 1996).
A matriz extracelular e a superfície da célula como

fontes de sinais críticos para o desenvolvimento
Bissell e colegas (1982; Martins-Green e Bissell, 1995) propuseram que a matriz
extracelular é capaz de induzir expressão gênica específica em tecidos em desenvol-
vimento, especialmente aqueles do fígado e da glândula mamária, onde a indução de
fatores de transcrição específicos dependem da ligação célula-substrato (Liu et al.,
1991; Streuli et al., 1991; Notenboom et al.1996). Muitas vezes, a presença de integri-
na ligada previne a ativação de genes que especificam a morte celular (Brooks et al.,
1994; Montgomery et al., 1994). Portanto, a matriz extracelular é uma fonte importante
de sinais que podem ser transduzidos para o núcleo para dar expressão gênica espe-
cífica. Estudos recentes mostraram que a ligação de integrinas à matriz extracelular
CÉLULA APRESENTADORA DO ANTÍGENO
SINAL 1 SINAL 2
Citoplasma
MHC II
Antígeno Receptor B7
da célula T CD28
Extracelular
Citoplasma
RAF
T-LINFÓCITO
ELK-1 ativa
transcrição de c-fos
Intensificador de Fator de transcrição AP-1

interleucina 2
Núcleo
Transcrição de IL-2
Figura 3.36
Dois sinais são necessários para efetuar a diferenciação de linfócitos T. O primeiro sinal vem de
receptores que ligam o antígeno apresentado na superfície das células B ou macrófagos. O
segundo sinal vem da ligação da proteína CD28 à proteína B7 que está na superfície da célula
apresentante do antígeno. O primeiro sinal dirige a síntese de uma subunidade do fator de
transcrição AP-1. A outra subunidade é sintetizada sob direção do segundo sinal. As duas
subunidades, c-fos e c-jun, formam o fator de transcrição AP-1 que pode ativar intensificadores
específicos para a célula T como os que regulam a produção de interleucina 2.
pode estimular a via RTK-Ras, como também pode estimular a interação da célula
com o L1, N-CAM e caderinas de uma célula vizinha (Bixby et al., 1994; Williams et
al., 1994a; Clark e Brugge, 1995). Caderinas (mesmo as solúveis) podem dimerizar
receptores FGF exatamente como os ligantes normais de FGF, causando a liberação
de íons cálcio, ativação transcricional e fenômenos de desenvolvimento caracterís-
ticos das respostas do FGF celular (Figura 3.37; Williams et al., 1994b; Doherty et al.,
1995). Comunicação cruzada é quase certa acontecer quando as moléculas de ade-
são celular são também transdutores de sinais.
Interações recíprocas na superfície celular

Quando duas células interagem durante o desenvolvimento, ambas são modificadas
na maioria das vezes. Essa indução recíproca é mediada por interações na membrana
Citoplasma
Molécula de
adesão celular Receptor FGF
Extracelular
Citoplasma
Sinal
Figura 3.37
Possíveis interações de moléculas de adesão celular com receptores de FGF. Os receptores FGF
podem ser “seqüestrados” pelas moléculas de adesão e colocados juntos. Isso pode ser feito
pela interação de moléculas de adesão opostas, ou “ligações cruzadas” de receptores de FGF das
membranas celulares opostas podem ativar seus domínios quinase.
celular. Uma via intensamente usada é o sistema Wingless-Hedgehog. Nessa via,

duas células (ou grupo de células) são adjacentes; uma delas produz a proteína
Hedgehog e a secreta. O peptídeo age na célula vizinha ocasionando a produção da
proteína Wingless (Wnt). A proteína Wingless, por sua vez, é também secretada e se
liga à célula vizinha, estimulando-a a continuar a síntese de Hedgehog. O resultado
é a estabilização de uma borda onde o tecido em um lado secreta proteína Hedge-
hog, enquanto o tecido no outro lado produz Wingless. Essa borda é crítica na
produção de segmentos e apêndices em Drosophila, como também, subdivisões
cerebrais e membros em mamíferos (Figura 3.38; Ingham, 1994; Niswander et al.,
1994; Wilder e Perrimon, 1995). [cell8.html]
A superfície celular é um lugar extremamente importante para interações desenvol-
vimentais. Essas incluem adesão diferencial de uma célula a outras, a adesão diferen-
cial de um tipo de célula a uma matriz extracelular e a comunicação de sinais para a
diferenciação e divisão celulares. Em 1782, o ensaista francês Denis Diderot pôs a
questão da morfogênese no sonho febril de um físico. Esse elemento podia imaginar
que o corpo era formado por uma miríade de “pequenos corpos sensíveis” que se
juntavam para formar um agregado, mas ele não podia imaginar como esse agregado
poderia se tornar um animal. Estudos recentes mostraram que essa ordenação é devi-
da às moléculas na superfície dessas células. Em capítulos subseqüentes, veremos
com mais detalhes essas interações morfogenéticas. Estamos agora no estágio onde
podemos iniciar o estudo da embriogênese precoce e ver a integração entre os proces-
sos orgânicos, genéticos e celulares no desenvolvimento animal.
Receptor Frizzled Wingless / proteína Wnt Proteína Figura 3.38

DPP Interações recíprocas entre células na via
wingless-hedgehog em Drosophila. A pro-
teína Wingless é secretada por uma célula e
se difunde a uma curta distância. A célula
Prot. Dishevelled vizinha liga a proteína Wingless originando
wingless
patched a ativação da proteína, que bloqueia a ação
Quinase Zw3 decapentaplegic inibidora da quinase Zeste-white-3 sobre a
proteína Armadillo (uma catenina). A pro-
Prot. Armadillo (ß-catenina) teína Armadillo ativada induz a célula a
transcrever o gene hedgehog (hh). Essa pro-
teína é secretada e ligada pela célula vizi-
Proteína nha. Ligando a proteína Hedgehog faz com
Smoothened Ci ativo que a célula transcreva o gene wingless e
engrailed
secrete a proteína.
Ci inativo
hedgehog
Proteína G
Proteína
engrailed
Receptor
Patched
Proteína
Hedgehog
LITERATURA CITADA
Ayama, E., Musci. T. J. and Kirschner, M. W. contact formation in Dictyostelium by univalent Bronner-Fraser, M. 1988. Distribution of
1991. Expression of a dominant negative mutant antibodies. Exp. Cell Res. 63: 147-158. tenascin during cranial neural crest development
of the FGF receptor disrupts mesoderm forma- in the chick. J. Neurosci. Res. 21: 135-147.
tion in Xenopus embryos. Cell 66: 257-270. Bevilacqua, A., Loch-Caruso, R. and Erick-
son, R. P. 1989. Abnormal development and Brooks, P. C. Montgomery, A. M. P., Rosenfeld,
Armstrong, P. B. 1989. Cell sorting out: The dye coupling produced by antisense RNA to M., Reisfeld, R. A., Hu, T., Klier, G. and Cheresh,
self-assembly of tissues in vitro. CRC Crit. Rev. gap junction protein in mouse preimplanta- D. A. 1994. Integrin α v β 3 antagonists promote
Biochem. Mol. Biol. 24: 119-149. tion embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. USA tumor regression by inducing apoptosis of
86: 5444-5448. angiogenic blood vessels. Cell 79: 1157-1164.
Bastiani, M. J., Harrelson, A. L., Snow, P. M.
and Goodman, C. S. 1987. Expression of fasciclin Bissell, M. J., Hall, H. G. and Parry, G. 1982. Brower, D. L. and Jaffe, S. M. 1989. Require-
I and II glycoproteins on subsets of axon How does the extracellular matrix direct gene ment for integrins during Drosophila wing de-
pathways during neuronal development in the expression? J. Theoret. Biol. 99: 31-68. velopment. Nature 342: 285-287.
grasshopper. Cell 48: 745-755.
Bixby, J. L., Grunwald, G. B. and Bookman, R. J. Cales, C., Hancock, J. F., Marshall, C. J. and
Beckerle, M. C., Burridge, K., DeMartino, 1994. Ca++ influx and neurite growthin response Hall, A. 1988. The cytoplasmic protein GAP is
G. N. and Croall, D. E. 1987. Colocalization to purified N-cadherin and laminin. J. Cell Biol. implicated as a target for regulation by the ras
of calcium-dependent protease II and one 127: 1461-1475. gene product. Nature 332: 548-551.
of its substrates and sites of adhesion. Cell
Boucaut, J. C. 1974. Étude autoradiographique Carson, D. D., Tang, J.-P. and Gay, S. 1988.
51: 569-577.
de la distribution de cellules embryonnaires Collagens support embryo attachment and
Behrendsten, 0., Alexander, C. M. and Werb, isolées, transplantées dans le blastocèle chez Pleu- outgrowth in vitro: Effects of the Arg-GlyAsp
Z. 1992. Metalloproteinases mediate extra- rodeles waltii Michah (Amphibien, Urodele). sequence. Dev. Biol. 127: 368-375.
cellular matrix degradation by cells from Ann. Embryol. Morphol. 7: 7-50.
Carson, D. D., Tang, J.-P. and Julian, J. 1993.
mouse blastocyst outgrowths. Development
Boyse, E. A. and Old, L. J. 1969. Some aspects Heparan sulfate proteoglycan (perlecan) expres-
114: 447-456.
of normal and abnormal cell surface genetics. sion by mouse embryos during acquisition of at-
Bernfield, M. and Sanderson, D. 1990. Syndecan, Annu. Rev. Genet. 3: 269-289. tachment competence. Dev. Biol. 155: 97-106.
a morphogenetically regulated cell surface pro-
Brackenbury, R., Thiery, J.-P., Rutishauser, U. Carthew, R.W. and Rubin, G.M. 1990. Seven
teoglycan that binds extracellular matrix and
and Edelman, G. M. 1977. Adhesion among -in-absentia, a gene required for the speci-
growth factors. Philos. Trans. R. Soc. Lond. [A]
neural cells of the chick embryo. I. Immunolo- fication of R7 cell fate in the Drosophila
327: 171-186.
gical assay for molecules involved in cell-cell eye. Cell 63: 561-577
Berridge, M. J. 1993. Inositol triphosphate and binding. J. Biol. Chem. 252: 6835-6840.
Chen, W. T., Hasegawa, E., Hasegawa, T.,
calcium signalling. Nature 361: 315-325.
Briscoe, J., Guschin, D., and Müller, M. 1994. Weinstock, C. and Yamada, K. M. 1985. Deve-
Beug, H., Gerisch, G., Kempff, S., Riedel, V. and Just another signalling pathway. Curr. Biol. 4: lopment of cell-surface linkage complexes in
Cremer, G. 1970. Specific inhibition of cell 1033-1035. cultured fibroblasts. J. Cell Biol. 100: 1103-1114.
C h e n e y, C . M . a n d L a s h , J . W. 1 9 8 1 . Edelman, G. M. and Thiery, J.-P. 1985. The Cell early morphogenetic events in chick develop-
Diversification within embryonic chick in Contact: Adhesions and Junctions as Mor- ment. Nature 320: 447-449.
somites: Differential response to notochord. phogenic Determinants. Wiley, New York.
Hatta, K. Takagi, S., Fujisawa, H. and Takeichi,
Dev. Biol. 81: 288-298.
Farach, M. C., Tang, J. P., Decker, G. L. and M. 1987. Spatial and temporal expression
Chuong, C.-M. and Edelman, G. M. 1985a. Ex- Carson, D. D. 1987. Heparin/heparan sulfate is pattern of N-cadherin cell adhesion molecules
pression of cell adhesion molecules in embryo- involved in attachment and spreading of mouse correlated with morphogenetic processes of
nic induction. I. Morphogenesis of nestling embryos in vitro. Dev. Biol. 123: 401-410, chicken embryos. Dev. Biol. 120: 215-227.
feathers. J. Cell Biol. 101: 1009-1026.
Fink, R. and McClay, D. R. 1985. Three cell Heasman, J., Hines, R. D., Swan, A. P., Thomas,
Chuong, C.-M. and Edelman, G. M. 1985b. Ex- recognition changes accompany the ingression V. and Wylie, C. C. 1981. Primordial germ cells
pression of cell adhesion molecules in embryo- of sea urchin primary mesenchyme cells. Dev. of Xenopus embryos: The role of fibronectin in
nic induction. II. Morphogenesis of adult Biol. 107: 66-74. their adhesion during migration. Cell 27: 437-447.
feathers. J. Cell Biol. 101: 1027-1043.
Fraser, S., E., Carhart, M. S., Murray, B. A., Heasman, J., Ginsberg, D., Goldstone, K., Pratt,
Clark, E. A. and Brugge, J. S. 1995. Integrin and Chuong, C.-M. and Edelman, G. E. 1988. T., Yoshidanaro, C., and Wylie, C. 1994. A
signal transduction pathways: The road taken. Alterations in the Xenopus retinotectal functional test for maternally inherited cadherin
Science 268: 233-239. projection by antibodies to Xenopus N-CAM. in Xenopus shows its importance in cell adhesion
Dev. Biol. 129: 217-230. at the blastula stage. Development 120: 49-57.
Covault, J. and Sanes, J. R. 1986. Distribution of
N-CAM in synaptic and extrasynaptic portions Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M. and Hemler, M. E. 1990. VLA proteins in the integrin
of developing and adult skeletal muscle. J. Cell Steinberg, M. S. 1994. Liquid properties of em- family: Structures, functions, and their role on
Biol. 102: 716-730. bryonic tissues: Measurements of interfacial leukocytes. Annu. Rev. Immunol. 8: 365-400.
tensions. Physic. Rev. Lett. 72: 2298-2301. Hemler, M. E., Huang, C. and Schwartz, L. 1987.
Crawford, K. and Stocum, D. L. 1988. Retinoic
acid coordinately proximalizes regenerate pattern Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G. and The VLA protein family. Characterization of
and blastema differential affinity in axolotl limbs. Steinberg, M. S. 1996. Surface tensions of em- five distinct cell surface heterodimers each with
Development 102: 687-698. bryonic tissues predict their mutual envelopment a common 130,000 molecular weight β subunit.
behavior. Development 122: 1611-1620. J. Biol. Chem. 262: 3300-3309.
Darnell, J., Lodish, H. and Baltimore, D. 1986.
Molecular Cell Biology. Scientific American Fujimori, T., Miyatani, S. and Takeichi, M. Horwitz, A., Duggan, K., Greggs, R., Decker,
Books, New York. 1990. Ectopic expression of N-cadherin perturbs C. and Buck, C. 1985. The cell substrate
histogenesis in Xenopus embryos. Development attachment (CSAT) antigen has properties
Deng, C., Wynshaw-Boris, A., Zhou, F., Kuo, A. of a receptor for laminin and fibronectin J.
110: 97-104.
and Leder, P. 1996. Fibroblast growth factor Cell Biol. 101: 2134-2144.
receptor-3 is a negative regulator of bone growth. Gibbs, J. B., Scaber, M. D., Allard, W.J., Sigal, I.
Cell 84: 911-921. S. and Scolnick, E. M. 1988. Purification of ras Horwitz, A., Duggan, K., Buck, C., Beckerle,
GTPase activating protein from bovine brain. M. C. and Burridge, K. 1986. Interaction of
Detrick, R. J., Dickey, D. and Kintner, C. R. plasma membrane fibronectin receptor with
Proc. Natt. Acad. Sci. USA 85: 5026-5030.
1990. The effects of N-cadherin misexpres- talin-a actinin transmembrane linkage. Nature
sion on morphogenesis in Xenopus embryos. Giudice, G. 1962. Restitution of whole larvae 320: 531-533.
Neuron 4: 493-506. from disaggregated cells of sea urchin embryos.
Dev. Biol. 5: 402-411. Ingham, P. W. 1994. Hedgehog points the way.
Dickson, B., Sprenger, F, Morrison, D. and Curr. Biol. 4:1-4.
Hafen, E. 1992. Ras1 functions downstream of Graf, J., Ogle, R. C., Robey, F A., Sasaki, M.,
Rasl in the Sevenless signal transduction pathway Martin, G. R., Yamada, Y. and Kleinman, H. K. Jongen, W, M. F. and seven others. 1991.
Nature 360: 600-603. 1987. A pentapeptide from the laminin B1 chain Regulation of connexin 43-mediated gap junction
mediates cell adhesion and binds to the 67000 intercellular communication by Ca2+ in mouse
Diderot, D. 1782. D’Alembert’s Dream. Reprin- epidermal cells is controlled by E-cadherin. J.
laminin receptor. Biochemistry 26: 6896-6900.
ted in J. Barzun and R. H. Bowen (eds.), Cell Biol. 114: 545-555.
Rameau’s Nephew and Other Works (1956). Groner, B. and Gouilleux, F. 1995. Prolactin-
Doubleday, Garden City, NY [p. 114] mediated gene activation in mammary epithelial lhle, J. N. 1995. Cytokine receptor signalling.
cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 587-594. Nature 377: 591-594.
Doherty, P., Williams, E. and Walsh, F. S. 1995.
lhle, J. N. 1996. STATs: Signal transducers and
A soluble chimeric form of the Ll glycoprotein Hadler, N. M., Dourmash, R. R., Nermut, M. V.
activators of transcription. Cell 84: 331-334.
stimulates neurite outgrowth. Neuron 14: 57-66. and Williams, L. D. 1982. Ultrastructure of a
hyaluronic acid matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. Just, E. E. 1939. The Biology of the Cell Surface.
Dufour, S., Duband, J.-L., Humphries, M. J.,
USA 79: 307-309. Blackiston, Philadelphia.
Obara, M., Yamada, K. M. and Thiery, J. P. 1988.
Attachment, spreading and locomotion of avian Hakomori, S., Fukuda, M., Sekiguchi, K. and Kadokawa, Y., Fuketa, I., Nose, A., Takeichi,
neural crest cells are mediated by multiple Carter, W. G. 1984. Fibronectin, laminin, and M. and Nakatsuji, N. 1989. Expression of E-
adhesion sites on fibronectin molecules. EMBO other extracellular glycoproteins. In K. A. Picz and P-cadherin in mouse embryos and uteri du-
J. 7: 2661-2671. and A. H. Reddi (eds.), Extracellular Matrix Bio- ring the periimplantation period. Dev. Growth
chemistry. Elsevier, New York, pp. 229-275. Diff. 31: 23-30.
Dutt, A., Tang, T.-P. and Carson, D. D. 1987. Lacto-
saminoglycans are involved in uterine epithelial cell Harrelson, A. L. and Goodman, C. S. 1988. Kalimi, G. H. and Lo, C. 1988. Communication
adhesion in vitro. Dev, Biol. 119: 27-37. Growth cone guidance in insects: FasciclinII is a compartments in the gastrulating mouse embryo.
member of the immunoglobulin superfamily. J. Cell Biol. 107: 241-255.
Eckstein, D. J. and Shur, B. D. 1989. Laminin
Science 242: 700-708.
induces the stable expression of surface glycosyl- Kintner, C. 1992. Regulation of embryonic cell
transferases on lamellipodia of migrating cells. Hatta, K. and Takeichi, M. 1986. Expression of adhesion by the cadherin cytoplasm domain. Cell
J. Cell Biol. 108: 2507-2517. N-cadherin adhesion molecules associated with 69: 225-236.
Knudsen, K., Horwitz, A. F. and Buck, C. 1985. Liu, J-K., Di Persio, M. C., and Zaret, K. S. Nose, A., Nagafuchi, A. and Takeichi, M.
A monoclonal antibody identifies a glycopro- 1991. Extracellular signals that regulate liver 1988. Expressed recombinant cadherins
tein complex involved in cell-substratum transcription factors during hepatic differentia- mediate cell sorting in model systems. Cell
adhesion. Exp. Cell Res. 157: 218-226. tion in vitro. Mol. Cell Biol. 11: 773-784. 54: 993-1001.
Köhler, G. and Milstein, C. 1975. Continuous Lo, C. and Gilula, N. B. 1979. Gap junctional Notenboom, R. G. E., de Poer, P. A. J.,
cultures of fused cells secreting antibody of communication in the preimplantation mouse Moorman, A. F. M. and Lamers, W. H. 1996.
predefined specificity. Nature 256: 495-497. embryo. Cell 18: 399-409. The establishment of the hepatic architecture
is a prerequisite for the development of a
Lander, A. D. 1989. Understanding the Luna, E. J. and Hitt, A. L. 1992. Cytoskele-
lobular pattern of gene expression. Develop-
molecules of neural cell contacts: Emerging ton-plasma membrane interactions. Science
ment 122: 321-332.
patterns of structure and function. Trends 258: 955-964.
Neurosci. 12: 189-195. Orkin, R. W., Knudson, W. and Toole, P. T. 1985.
Martins-Green, M. and Bissell, M. J. 1995. Cell-
Loss of hyaluronidate-clependent coat during
Landmesser, L., Dahm, L., Schultz, K. and Ru- ECM interactions in development. Semin. Dev.
myoblast fusion. Dev. Biol. 107: 527-530.
tishauser, U. 1988. Distinct roles for adhesion Biol. 6: 149-159.
molecules during innervation of embryonic Peracchia, C. and Dulhunty, A. F. 1976. Low
chick muscle. Dev. Biol, 130: 645-670. Massagué, J. 1991. A helping hand from
resistance junctions in crayfish: Structural
proteoglycans. Curr. Biol. 1: 117-119.
changes with functional uncoupling. J. Cell Biol.
Lazarides, E. 1976. Actin, a actinin, and
Matrisian, L. M. 1992. The matrix-degrading 70: 419-439.
tropomyosin interaction in the structural
organization of actin filaments in nonmuscle metalloproteinases. BioEssays 14: 455-463.
Pierce, M., Turley, E. A. and Roth, S. 1980. Cell
cells. J. Cell Biol. 68: 202-219. McClay, D. R. and Ettensohn, C. A. 1987. Cell surface glycosyltransferase activities. Int. Rev.
recognition during sea urchin gastrulation. In W. Cytol. 65: 1-47.
Lee, C.-H. and Gumbiner, B. M. 1995. Disruption
of gastrulation movements in Xenopus by a F. Loomis (ed.), Genetic Regulation of Deve-
Ratner, N., Bunge, R. P. and Glaser, L. 1985. A
dominant-negative mutant for C-cadherin. Dev. lopment. Alan R. Liss, New York, pp. 111-128.
neuronal cell surface heparan sulfate proteogly-
Biol. 171: 363-373. McCormick, F. 1989. ras GTPase activating can is required for dorsal root ganglion neuron
Lee, S., Gilula, N. B. and Warner, A. E. 1987. protein: Signal transmitter and signal terminator. stimulation of Schwann cell proliferation. J. Cell
Gap junctional communication and compaction Cell 56: 5-8. Biol. 101: 744-754.
during preimplantation stages of mouse deve- Monroy, A. and Moscona, A. A. 1979. Intro- Reaurne, A. G. and eight others. 1995. Cardiac
lopment. Cell 51: 851-860. ductory Concepts in Developmental Biology. malformation in neonatal mice lacking connexin
Leevers, S. J., Paterson, H. F., and Marshall, C. University of Chicago Press, Chicago. 43. Science 267: 1831-1834.
J. 1994. Requirement for Ras in Raf activation Montgomery, A. M. P., Reisfeld, R. A., and Roth, S. 1968. Studies on intracellular adhesive
is overcome by targeting Raf to the plasma Cheresh, D. A. 1994. Integrin α v β 3 rescues selectivity. Dev. Biol. 18: 602-631.
membrane. Nature 369: 411-414. melanoma cells from apoptosis in a threedimen-
Roth, S., McGuire, E. J. and Roseman, S. 1971.
Lemmon, V., Farr, K. L., and Lagenauer, C. sional dermal collagen. Proc. NatI. Acad. Sci.
An assay for intercellular adhesive specificity. J.
1989). Ll-mediated axon growth occurs via USA 91: 8856-8860.
Cell Biol. 51: 525-535.
homophilic binding mechanism. Neuron 2: Moscona, A. A. 1952. Cell suspension from
1597-1603. Rousseau, F. and seven others. 1994. Muta-
organ rudiments of chick embryos. Exp. Cell
tions in the gene encoding fibroblast growth
Leonard, C. M., Bergman, M., Frenz, D. A., Res. 3: 535-539.
factor receptor-3 in achondroplasia. Nature
Macreery, L. A. and Newman, S. A. 1989. Moscona, A. A. 1961. Rotation-mediated 371: 252-254.
Abnormal ambient glucose levels inhibit pro- histogenetic aggregation of dissociated cells: A
teoglycan core protein gene expression and Ruoslahti, E. and Pierschbacher, M. D. 1987.
quantifiable approach to cell interaction in vitro.
reduce proteoglycan accumulation during chon- New perspectives in cell adhesion: RGD and
Exp. Cell Res. 22: 455-475.
drogenesis: Possible mechanism for teratogenic integrins. Science 238: 491-497.
effects of maternal diabetes. Proc. Natl. Acad. Nagafuchi, A., Shirayoshi, Y., Okazaki, K.,
Rutishauser, U., Acheson, A., Hall, A., Mann, D.
Sci. USA 86: 10113-10117. Yasuda, K. and Takeichi, M. 1987. Transforma-
M. and Sunshine, J. 1988. The neural cell
tion of cell adhesion properties of exogenously
Leptin, M., Bogaert, T., Lehmann, R. and Wilcox, adhesion molecule (N-CAM) as a regulator of
introduced E-cadherin cDNA. Nature 329: 341-343.
M. 1989. The function of PS integrins during cell-cell interactions. Science 240: 53-57.
Drosophila embryogenesis. Cell 56: 401-408. Nardi, J. B. and Stocum, D. L. 1983. Surface
Sainio, K., Gilbert, S. F., Lehtonen, E., Nishi,
properties of regenerating limb cells: Evidence
Li, W., Whaley, C. D., Mondino, A. and Mueller, M., Kumar, N. M., Gilula, N. B. and Saxén, L.
for gradation along the proximodistal axis. Dif-
D. L. 1996. Blocked signal transduction to the 1992. Differential expression of gap junction
ferentiation 25: 27-31.
ERK and JNK protein kinases in anergic CD4+ mRNAs and proteins in the developing murine
T cells. Science 271: 1272-1274. Nishizuka, Y. 1986. Studies and perspectives of kidney and in experimentally induced nephric
protein kinase C. Science 233: 305-312. mesenchymes. Development 115: 827-837.
Linask, K. L. and Lash, J. W. 1988a. A role for
fibronectin in the migration of avian precardiac Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R. and San Antonio, J. D., Winston, B. M. and Tuan, R.
cells. I. Dose-dependent effects of fibronectin Tickle, C. 1994. A positive feedback loop S. 1987. Regulation of chondrogenesis by
antibody. Dev. Biol. 129: 315-323. coordinates growth and patterning in the verte- heparan sulfate and structurally related glycosa-
brate limb. Nature 371, 609-612. minoglycans. Dev. Biol. 123: 17-24.
Linask, K. L. and Lash, J. W. 1988b. A role for
fibronectin in the migration of avian precardiac Nose, A. and Takeichi, M. 1986. A novel cadherin Sato H., Takino, T, Okada, Y., Cao, J., Shinagawa,
cells. II. Rotation of the heartforming region adhesion molecule: Its expression patterns A., Yamamoto, E. and Seiki, M. 1994. A matric
during different stages and its effects. Dev. Biol. associated with implantation and organogenesis metalloproteinase expressed on the surface of
129: 324-329. of mouse embryos. J. Cell Biol. 103: 2649-2658. invasive tuomour cells. Nature 370: 61-65.
Shiang, R. and seven others. 1994. Mutations in nipulation of cell surface to affect cellular re- Warner, A. E., Guthrie, S. C. and Gilula, N. B.
the transmembrane domain of FGFR3 cause the cognition mechanisms. Dev. Biol. 70: 195-205. 1984. Antibodies to gap junctional protein selectively
most common genetic form of dwarfism, achon- disrupt junctional communication in the early
Tamkun, J. W., DeSimone, D. W., Fonda, D.,
droplasia. Cell 78: 335-342. amphibian embryo. Nature 311: 127-131.
Patel, R. S., Buck, C, Horwitz, A. F. and Hynes,
Shih, C. and Weinberg, R. A. 1982. Isolation of R. 0. 1986. Structure of integrin, a glycoprotein Webster, M. K. and Donoghue, D. J. 1996.
a transforming sequence from a human bladder involved in transmembrane linkage between fi- Constitutive activation of fibroblast growth
carcinoma cell line. Cell 29: 161-169. bronectin and actin. Cell 46: 271-282. factor receptor 3 by the transmembrane
domain point mutation found in achondro-
Shilling, F. M., Carroll, D. J., Muslin, A. J., Tan, S.-S., Crossin, K. L., Hoffman, S. and Edelman,
plasia. EMBO J. 15: 520-527.
Escobodo, J. A., Williams, L. T. and Jaffe, G. M. 1987. Asymmetric expression of somites of
L. A. 1994. Evidence for both tyrosine kinase cytotactin and its proteoglycan ligand is correlated Wehrle, B. and Chiquet, M. 1990. Tenascin is
and G-protein-coupled pathways leading to with neural crest cell migration. Proc. Natl. Acad. accumulated along developing peripheral nerves
starfish egg activation. Dev. Biol. 162: 590-599. Sci. USA 84: 7977-7981. and allows neurite outgrowth in vitro. Develop-
ment 110: 401-415.
Shur, B. D. 1977a. Cell surface glycosyl- Thesleff, I., Vainio, S. and Jalkanen, M. 1989.
transferases in gastrulating chick embryos. Cell-matrix interactions in tooth development. Weiss, P. 1945. Experiments on cell and
I. Temporally and spatially specific patterns Int. J. Dev. Biol. 33: 91-95. axon orientation in vitro: The role of
of four endogenous glycosyltransferase colloidal exudates in tissue organization. J.
Toole, B. P. 1976. Morphogenetic role of glycosa-
activities. Dev. Biol. 58: 23-29. Exp. Zool. 100: 353-386.
minoglycans (acid mucopolysaccharides) in brain and
Shur, B. D. 1977b. Cell surface glycosyltransfe- other tissues. In S. H. Barondes (ed.), Neuronal Re- Werb, Z., Tremble, P. and Damsky, C. H. 1990.
rases in gastrulating chick embryos. II. Bioche- cognition. Plenum, New York, pp. 276-329. Regulation of extracellular matrix degradation
mical evidence for a surface localization of by cell-extracellular matrix interaction. Cell
Tosney, K. W., Watanabe, M., Landmesser, L. and
endogenous glycosyltransferase activities. Dev. Differ. Dev. 32: 299-306.
Rutishauser, U. 1986. The distribution of N-CAM in
Biol. 58: 40-55.
the chick hindlimb during axon outgrowth and Wilcox, M., DiAntonio, A. and Leptin, M.
Spring, J., Beck, K. and Chiquet-Ehrismann, R. synaptogenesis. Dev. Biol. 114: 468-481. 1989. The functions of the PS integrins in
1989. Two contrary functions of tenascin: Drosophila wing morphogenesis. Develop-
Townes, P. L. and HoItfreter, J. 1955. Directed
Dissection of the active sites by recombinant ment 107: 891-897.
movements and selective adhesion of embryo-
tenascin fragments. Cell 59: 325-334.
nic amphibian cells. J. Exp. Zool. 128: 53-120. Wilder, E. L. and Perrimon, N. 1995. Dual
Steinberg, M. S. 1964. The problem of functions of wingless in the Drosophila leg
Trahey, M. and McCormick, F. 1987. A cyto-
adhesive selectivity in cellular interactions. imaginal disc. Development 121: 477-488.
plasmic protein stimulates normal N-ras p2l.
In M. Locke (ed.), Cellular Membranes in
GTPase, but does not affect oncogenic mutants. Williams, A. F. and Barclay, A. N. 1988. The
Development. Academic Press, New York,
Science 238: 542-544. immunoglobulin superfamily: Domains for
pp. 321-434.
cell surface recognition. Annu. Rev. Immu-
Trinkaus, J. P. 1963. The cellular basis of
Steinberg, M. S. 1970. Does differential adhesion nol. 6: 381-405.
Fundulus epiboly. Adhesivity of blastula and
govern self-assembly processes in histogenesis?
gastrula cells in culture. Dev. Biol. 7: 513-532. Williams, E. J., WaIsch, F. S. and Doherty, P.
Equilibrium configurations and the emergence
1994a. Tyrosine kinase inhibitors can differen-
of a hierarchy among populations of embryonic Turley, E. A. and Roth, S. 1979. Spontaneous
tially inhibit integrin-dependent and CAM-
cells. J. Exp. Zool. 173: 395-434. glycosylation of glycosaminoglycan substrates
dependent neurite outgrowth. J. Cell Biol. 124:
by adherent fibroblasts. Cell 17: 109-115.
Stokoe, D., Macdonald, S. G., Cadwallader, K., 1029-1037.
Symons, M. and Hancock, J. F. 1994. Activation Tyler, A. 1946. An auto-antibody concept of
Williams, E. J., Furness, J., Walsh, F. S. and
of raf as well as recruitment to the plasma cell structure, growth, and differentiation. Growth
Doherty, P. 1994b. Activation of the FGF
membrane. Science 264: 1463-1467. 10 (Symposium 6):7-19.
receptor underlies neuriote outgrowth stimu
Streuli, C. H., Bailey, N. and Bissell, M. J. 1991. Vainio, S., Jalkanen, M., Lehtonen, E. and lated by L1, N-CAM, and N-cadherin.
Control of mammary epithelial differentiation: Bernfield, M. 1989. Epithelial-mesenchymal in- Neuron 13: 583-594.
Basement membrane induces tissue specific gene teractions regulate stage-specific expression of
Yayon, A., Klagsbrun, M., Esko, J. D., Leder, P.
expression in the absence of cell-cell interacti- a cell surface proteoglycan, syndecan, in the
and Ornitz, D. M. 1991. Cell surface heparin-
ons and morphological polarity J. Cell Biol. 115: development kidney. Dev. Biol. 134: 382-391.
like molecules are required for binding of basic
1383-1395.
Venkatesh, T. R., Zipursky, S. L. and Benzer, S. fibroblast growth factor to its high affinity re-
Swann, K. and Whitaker, M. 1986. The part 1985. Molecular analysis of the development ceptor. Cell 64: 841-849.
played by inositol trisphosphate and calcium in of the compound eye in Drosophila. Trends
Yelton, D. E. and Scharff, M. D. 1980. Mono-
the propagation of the fertilization wave in sea Neurosci. 8: 251-257.
clonal antibodies. Am. Sci. 68: 510-516.
urchin eggs. J. Cell Biol. 103: 2333-2342.
Vits, L., Van Camp, G., Couke, P., Wilson, G.,
Yow H., Wong, J. M., Chen, H. S., Lee, C., Steei,
Takeichi, M. 1987. Cadherins: A molecular Schrander-Stumpel;C., Schwarz, C. and Willems,
G. D. Jr. and Chen, L. B. 1988. Increased mRNA
family essential for selective cell-cell P. J. 1994. MASA syndrome is due to mutations
expression of a lamininbinding protein in human
adhesion and animal morphogenesis. Trends in the LlCAM gene. Nature Genet. 7: 408-413.
colon carcinoma: Complete sequence of a full-
Genet. 3: 213-217.
Vuorio, E. 1986. Connective tissue diseases: length cDNA encoding the protein. Proc. Natl.
Takeichi, M. 1991. Cadherin cell adhesion Mutations of collagen genes. Ann. Clin. Res. Acad. Sci.. USA 85: 6394-6398.
receptors as a morphogenetic regulator. Science 18: 234-241.
Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B.
251: 1451-1455.
Wang, N., Butler, J. P. and Ingber, D. E. 1993. and Benzer, S. 1984. Neuronal development in
Takeichi, M., Ozaki, H. S., Tokunaga, K. Mechanotransduction across the cell surface and the Drosophila retina: Monoclonal antibodies
and Okada, T. S. 1979. Experimental ma- through the cytoskeleton. Science 260: 1124-1127. as molecular probes. Cell 36: 15-26.
Padrões de Desenvolvimento
4 Fertilização: Iniciando um novo organismo
5 Clivagem: Criando multicelularidade

121
167
6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 209

II
7 Início do desenvolvimento vertebrado: Neurulação e ectoderma 253
8 Especificidade axônica 307
9 Início do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma 341

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 121
Fertilização:
Iniciando um novo organismo
4
Desejo e desejo e desejo
Sempre o desejo procriativo do mundo.
Saindo da obscuridade iguais opostos
avançam,
Sempre substância e aumento, sempre sexo,
F ERTILIZAÇÃO (FECUNDAÇÃO) é o processo pelo qual duas células sexuais
(gametas) se fundem para criar um novo indivíduo com potenciais genéticos
derivados dos dois genitores. A fecundação, portanto, realiza duas atividades
separadas: sexo (a combinação de genes derivados dos dois pais) e a reprodução
(criação de novos organismos). Assim, a primeira função da fecundação é a de trans-
Sempre uma tessitura de identidade, sempre mitir genes dos pais para a prole, e a segunda é a de iniciar no citoplasma do ovo
distinção, aquelas reações que permitem o desenvolvimento.
Sempre uma criação de vida.
WALT WHITMAN (1855)
Embora os detalhes da fecundação variem de espécie para espécie, os eventos da
concepção consistem, em geral, de quatro atividades principais:
O objetivo final de todas as intrigas amoro- • Contato e reconhecimento entre espermatozóide e óvulo. Na maioria dos
sas, sejam elas cômicas ou trágicas, é na casos, isso assegura que o espermatozóide e o óvulo sejam da mesma espécie.
realidade mais importante que todas as ou- • Regulação da entrada do espermatozóide para o interior do óvulo. Somente
tras finalidades na vida humana. um espermatozóide pode, em última análise, fecundar um óvulo. Isso é geral-
Ele se volta para nada menos que a compo- mente conseguido com a permissão de somente um espermatozóide entrar no
sição da próxima geração. óvulo e a inibição da entrada de qualquer outro.
A SCHOPENHAUER • Fusão do material genético do espermatozóide e do óvulo.
(CITADO POR C. DARWIN, 1871)
• Ativação do metabolismo do ovo para começar o desenvolvimento.
Estrutura dos gametas

Existe um diálogo complexo entre óvulo e espermatozóide. O óvulo ativa o metabolis-
mo do espermatozóide que é essencial para a fecundação, e o espermatozóide retorna
a mensagem ativando o metabolismo do óvulo necessário para o início do desenvol-
vimento. Porém, antes de investigar esses aspectos da fecundação, temos que consi-
derar as estruturas do espermatozóide e do óvulo – dois tipos de células especializadas
para a fertilização.
Espermatozóide
Foi somente no século XIX que o papel do espermatozóide na fertilização tornou-se
conhecido. Anton van Leeuwenhoek, o microbiologista holandês que co-descobriu o
espermatozóide em 1678, acreditou inicialmente que ele continha animais parasitas vi-
vendo em seu interior (daí o termo espermatozóides, significando “animais do esper-
ma”). Assumiu originalmente que esses nada tinham a haver com a reprodução do
organismo onde se encontravam, porém, posteriormente chegou a acreditar que cada
espermatozóide continha um embrião pré-formado. Leeuwenhoek (1685) escreveu que
121
122 PARTE II Padrões de Desenvolvimento
espermatozóides eram sementes (tanto sperma como sêmen significam “semente”), e

que a fêmea meramente proporcionava o solo nutriente no qual as sementes eram
plantadas. Sob esse aspecto, ele estava voltando a uma noção da procriação enunci-
ada por Aristóteles 2000 anos antes. Por mais que tentasse, Leeuwenhoek era continu-
amente desapontado em suas tentativas de achar um embrião pré-formado nos esper-
matozóides. Nicolas Hartsoeker, o outro co-descobridor do espermatozóide, dese-
nhou uma figura do que pretendia encontrar: um ser humano pré-formado
(“homúnculo”) dentro do espermatozóide (Figura 4.1). Essa crença de que o esperma-
tozóide continha um organismo embrionário inteiro, nunca recebeu muita aceitação,
porque implicava num enorme desperdício de vida em potencial. A maioria dos inves-
tigadores consideravam o espermatozóide como sem importância (Veja Pinto-Correia,
1997, para detalhes sobre essa extraordinária história). [fert1.html]
A primeira evidência sugerindo a importância do espermatozóide na reprodução
veio de uma série de experimentos realizados por Lazzaro Spallannzani em fins de 1700.
Spallanzani demonstrou que sêmen filtrado de rã, livre de espermatozóide, não fecun-
dava óvulos. Concluiu, porém, que o fluido viscoso retido pelo papel de filtro, e não o
espermatozóide, era o agente da fertilização. Ele acreditava, também, que os “animais
espermáticos” eram parasitas.
A combinação das melhores lentes de microscópio e da teoria celular, levaram a
uma reapreciação da função espermática. Em 1924, J. L. Prevost e J. B. Dumas afirma-
ram que os espermatozóides não eram parasitas, mas sim os agentes ativos da fertili-
zação. Notaram a existência universal de espermatozóides em machos sexualmente
maduros e sua ausência em indivíduos imaturos ou idosos. Essas observações,
acopladas à conhecida ausência de espermatozóides na mula estéril, os convenceram
que “existe uma íntima relação entre sua presença nos órgãos e a capacidade
fecundadora do animal”. Eles propuseram que o espermatozóide penetra o óvulo e
contribui materialmente para a geração seguinte.
Essas assertivas não foram em geral levadas em consideração até a década de 1840,
quando A. von Kolliker descreveu a formação do espermatozóide a partir de células
contidas em testículos adultos. Kolliker ridicularizou a idéia que o sêmen poderia ser
Figura 4.1 normal e ainda assim tolerar a presença de um número enorme de parasitas. Mas ainda
A criança humana pré-formada no espermato- assim, negou que haveria qualquer contato físico entre espermatozóide e óvulo. Acredi-
zóide, conforme representada por Nicolas tava que o espermatozóide excitava o desenvolvimento do óvulo de maneira semelhante
Hartsoeker (1964). aquela pela qual o ímã comunica sua presença ao ferro. Somente em 1876, Oscar Hertwig
e Hermann Fol, independentemente, demonstraram a entrada do espermatozóide no
óvulo e a união de seus núcleos. Hertwig procurou um organismo adequado para obser-
vações microscópicas detalhadas e descobriu que o ouriço-do-mar Mediterrâneo,
Toxopneustes lividus, era perfeito para isso. Não somente era freqüente na região e
sexualmente maduro a maior parte do ano, como seus óvulos eram abundantes e trans-
parentes, mesmo sob alto aumento. Após misturar espermatozóide e óvulo em suspen-
sões, Hertwig repetidas vezes observou o espermatozóide entrando no óvulo e viu a
união dos núcleos dessas células. Notou também que apenas um espermatozóide era
visto penetrar em cada óvulo e que todos os núcleos do embrião derivavam dos núcleos
fundidos por ocasião da fertilização. Fol fez observações semelhantes e detalhou o
mecanismo de penetração do espermatozóide. A fertilização estava finalmente reconhe-
cida como a união de espermatozóide e óvulo, e a união dos gametas do ouriço-do-mar
permanece como um dos exemplos de fertilização melhor estudado. [fert2.html]
Cada espermatozóide consiste de um núcleo haplóide, um sistema de propulsão
para movimentar o núcleo, e um saco de enzimas que permitem a entrada do núcleo no
óvulo. A maior parte do citoplasma do espermatozóide é eliminada durante o amadure-
cimento, deixando somente certas organelas modificadas para exercer a função esper-
mática (Figura 4.2). Durante o transcorrer do amadurecimento, o núcleo haplóide se
torna muito aerodinâmico e seu DNA altamente comprimido. Na parte frontal desse
núcleo haplóide comprimido está a vesícula acrossômica, derivada do aparelho de
Golgi, contendo enzimas que digerem proteínas e açúcares complexos; por isso, pode
ser considerado como uma vesícula secretória modificada. Essas enzimas armazena-
das são usadas para lisar os invólucros externos do óvulo. Em muitas espécies, tais
como os ouriços-do-mar, existe uma região de moléculas globulares de actina entre o
núcleo e a vesícula acrossômica. Essas proteínas são usadas para estender um pro-
cesso de forma semelhante a um dedo durante os estágios precoces da fertilização. Em
ouriços-do-mar e várias outras espécies, o reconhecimento mútuo entre espermatozói-
de e óvulo envolve moléculas desse processo acrossômico. Juntos, o acrossomo e o
núcleo constituem a cabeça do espermatozóide.
Os meios pelos quais o espermatozóide é impulsionado variam de acordo com o
modo pelo qual a espécie se adaptou às condições ambientais. Em algumas espécies
(como o nematelminto parasitário Ascaris), o espermatozóide viaja por movimentação
amebóide de extensões lamelipodiais da membrana celular. Na maioria das espécies,
porém, um espermatozóide é capaz de viajar por longas distâncias agitando o seu
flagelo. Os flagelos são estruturas complexas. A sua principal porção motora é chama-
da axonema. Um axonema é formado pelos microtúbulos que emanam do centríolo na
base do núcleo do espermatozóide (Figuras 4.2 e 4.3). O centro do axonema consiste
de dois túbulos centrais rodeados por uma fileira de nove duplas de microtúbulos.
Realmente, só um microtúbulo está completo, contendo 13 protofilamentos; o outro
tem forma de C e tem apenas 11 protofilamentos (Figura 4.3B). Um modelo tridimensi-
onal de um microtúbulo completo está apresentado na Figura 4.3C. Aqui vemos os 13
protofilamentos interligados; os quais consistem exclusivamente da proteína dimérica,
a tubulina.
Embora a tubulina seja a base da estrutura do flagelo, outras proteínas também
são críticas para a função do flagelo. A força para a propulsão do espermatozóide é
proporcionada pela dineína, uma proteína apensa aos microtúbulos (Figura 4.3B). A
dineína hidrolisa moléculas de ATP e pode converter a energia química liberada em
Golgi
remanescente
Centríolo
Flagelo
Microtúbulos
Centríolo
Flagelo
Vesícula Porção
acrossômica final
e grânulo
Núcleo
Aparelho Mitocôndrias
de Golgi Cauda
Mitocôndrias
Figura 4.2
Axonema A modificação de uma célula germinativa para formar um espermatozóide de ma-
Mitocôndrias mífero. O centríolo produz um longo flagelo na parte que virá a ser a extremidade
Porção mediana
Centríolo posterior do espermatozóide, e o aparelho de Golgi forma a vesícula acrossômica
Pescoço na futura extremidade anterior. As mitocôndrias (pontos abertos) agrupam-se ao
Núcleo Cabeça do redor do flagelo perto da base do núcleo haplóide e são incorporadas na parte
espermatozóide mediana do espermatozóide. O citoplasma remanescente é descartado e o núcleo
Membrana plasmática
se condensa. O tamanho do espermatozóide maduro foi aumentado em relação às
Vesícula acrossômica outras figuras. (Segundo Clermont e Leblond, 1955.)
Figura 4.3 (A) (C)

O aparelho de movimentação do espermato-
zóide. (A) Seção transversal do flagelo de um
espermatozóide mamífero, mostrando o
axonema central e as fibras externas. (B) Dia-
grama interpretativo do axonema, mostrando o
arranjo “9 + 2” dos microtúbulos e outros com-
ponentes flagelares. O diagrama esquemático
mostra a associação de protofilamentos de
tubulina em um microtúbulo duplo. A primeira
(“A”) porção do par duplo é um microtúbulo
normal compreendendo 13 protofilamentos. A
segunda (“B”) porção da dupla contém somen-
te 11 (ocasionalmente 10) protofilamentos. (C)
Um modelo tridimensional do microtúbulo “A”.
As subunidades α-tubulina e β-tubulina são
semelhantes, porém, não idênticas, e o
microtúbulo pode mudar de tamanho polimeri-
zando e despolimerizando subunidades de tu-
bulina em qualquer um dos lados. (A cortesia de (B)
D. M. Phillips; B segundo De Robertis et al., Membrana plasmática
1975, e Tilney et al., 1973; C de Amos e Klug, Trave radial
1974, cortesia dos autores.)
Cabeça da trave
Nexina
Subfibra A
Subfibra B
Microtúbulo central
Braço interno de dineína MICROTÚBULO DUPLO
Braço externo de dineína

AXONEMA
energia mecânica que propulsiona o espermatozóide. Essa energia pemite o

deslizamento ativo das duplas externas de microtúbulos, levando o flagelo a se
curvar (Ogawa et al., 1977; Asai, 1996). A importância da dineína pode ser avaliada
em indivíduos com a síndrome genética chamada de tríade de Kartagener. Esses
indivíduos não têm dineína em suas células ciliadas e flageladas, o que as torna
estruturas imóveis. Machos com essa doença são estéreis (espermatozóide imóvel),
susceptíveis à infeções brônquicas (cílios respiratórios imóveis), e têm 50 porcento
de probabilidade de ter o coração do lado direito de seu corpo (Afzelius, 1976).
Outra importante proteína flagelar parece ser a histona H1. Essa proteína é geral-
mente vista dentro do núcleo, onde dobra e aperta a cromatina em agregados. No
entanto, Multigner e colaboradores (1992), mostraram que essa mesma proteína
estabiliza os microtúbulos flagelados impedindo seu espalhamento.
O arranjo “9 + 2” dos microtúbulos com os braços de dineína foi conservado nos
axonemas em todo o reino eucarioto, sugerindo que é extremamente adequado na
transmissão de energia para a movimentação. A energia para mover o flagelo e assim
impulsionar o espermatozóide vem dos anéis de mitocôndrias localizadas na região
do pescoço do espermatozóide (veja Figura 4.2). Em muitas espécies (notavelmente
mamíferos) uma densa camada de fibras se interpôs entre a bainha mitocondrial e o
axonema. Essa camada fibrosa enrijece a cauda do espermatozóide. Como sua es-
pessura diminui na direção apical, as fibras provavelmente previnem que a cabeça
do espermatozóide balance abruptamente. Assim, o espermatozóide sofreu extensa

modificação para assegurar a passagem de seu núcleo para o óvulo.
Entretanto, a diferenciação do espermatozóide não se completa nos testículos.
Após sua expulsão para a luz dos túbulos seminíferos, os espermatozóides são arma-
zenados no epidídimo, onde adquirem a capacidade de se mover. Essa mobilidade é
conseguida através de mudanças no sistema gerador de ATP (possivelmente através
da modificação da dineína), assim como de alterações da membrana plasmática que
permitem que ela se torne mais fluida (Yanagimachi, 1994). Os espermatozóides libera-
dos durante a ejaculação podem se mover, mas ainda não têm a capacidade de se ligar
ao óvulo e fertilizá-lo. Esses estágios finais do amadurecimento espermático (chama-
do capacitação) não ocorrem antes do espermatozóide ter permanecido no interior do
trato reprodutivo feminino durante um certo tempo.
O óvulo
Todo o material necessário para o começo do crescimento e desenvolvimento tem
que estar armazenado no óvulo maduro. Enquanto o espermatozóide eliminou a
maior parte do seu citoplasma, o óvulo em desenvolvimento (chamado de oócito
antes de tornar-se haplóide) não somente conserva seu material, mas continua a
acumulá-lo ativamente. Sintetiza ou absorve proteínas, como a gema, que atuam
como reservatórios de alimento para o embrião em desenvolvimento. Assim, game-
tas femininos das aves são enormes células singulares que se tornaram entumecidas
pela acumulação de gema. Mesmo óvulos com gema relativamente esparsa são com-
parativamente grandes. O volume do óvulo do ouriço-do-mar é de aproximadamente
2 x 10-4 µm3, mais de 10.000 vezes aquele do espermatozóide. A representação do
óvulo do ouriço-do-mar e do espermatozóide na Figura 4.4 mostra seus tamanhos
relativos, assim como os vários componentes do óvulo maduro. Assim, enquanto o
espermatozóide e o óvulo têm componentes nucleares haplóides iguais, o óvulo tem
ainda um notável reservatório citoplasmático acumulado durante seu amadureci-
mento. Esse armazém citoplasmático inclui proteínas, RNAs, substâncias químicas
protetoras e fatores morfogenéticos:*
• Proteínas. Será longo o período a transcorrer antes do embrião ser capaz de se
alimentar ou obter alimento de sua mãe. As células embrionárias precoces
precisam de um certo suprimento armazenável de energia e aminoácidos. Em
muitas espécies isso é conseguido pelo acúmulo de proteínas na gema do ovo.
Muitas proteínas da gema são sintetizadas em outros órgãos (fígado, corpo
gorduroso) e viajam através do sangue materno para o ovo.
• Ribossomos e tRNA. O embrião precoce precisa produzir muitas de suas própri-
as proteínas; em algumas espécies, ocorre um surto de síntese protéica pouco
após a fecundação. A síntese protéica é conseguida pelos ribossomos e tRNA,
preexistentes no óvulo. O óvulo em desenvolvimento tem mecanismos especi-
ais para sintetizar ribossomos, e certos oócitos de anfíbios produzem até 1012
ribossomos durante a prófase meiótica.
• RNA mensageiro. Na maioria dos organismos, as mensagens para proteínas
sintetizadas durante o desenvolvimento inicial já estão acondicionadas no
oócito. Estima-se que os óvulos do ouriço-do-mar contêm de 25.000 a 50.000
tipos diferentes de mRNA. Porém, esse mRNA permanece dormente até após a
fertilização (veja Capítulo 12).
• Fatores morfogenéticos. Essas moléculas dirigem a diferenciação celular
em certos tipos de células. Parecem estar localizadas em diferentes regiões
do óvulo e se segregam em células diferentes durante a clivagem (veja
Capítulo 13).
* Os conteúdos do óvulo variam muito de espécie para espécie. A síntese e a colocação desses
materiais será tratada no Capítulo 22, quando discutirmos a diferenciação das células germinativas.
Figura 4.4 Membrana

Estrutura do óvulo do ouriço-do-mar durante Envoltório vitelínico plasmática
a fertilização. (Segundo Epel, 1977.)
Camada gelatinosa Grânulo de gema
Grânulo cortical
Espermatozóide
Mitocôndria
Núcleo
• Substâncias químicas protetoras. O embrião não pode fugir de predadores ou

movimentar-se para um ambiente mais seguro, necessitando, por isso, estar
equipado para enfrentar esses fatores. Muitos óvulos contêm filtros ultravioleta
e enzimas de reparos de DNA que os protegem da luz solar; alguns óvulos
contêm moléculas que predadores potenciais acham desagradáveis; a gema de
óvulos de aves contém até mesmo anticorpos. [fert3.html]
Dentro desse enorme volume de citoplasma reside um grande núcleo. Em algumas
espécies (por exemplo, ouriços-do-mar), o núcleo já é haplóide no momento da fertili-
zação. Em outras espécies (incluindo muitos vermes e a maioria dos mamíferos), o
núcleo do óvulo ainda é diplóide, e o espermatozóide penetra antes das divisões
meióticas estarem completas. O estágio do núcleo do óvulo no momento da entrada
do espermatozóide está ilustrado na Figura 4.5.
Envolvendo o citoplasma está a membrana plasmática do óvulo. Essa mem-
brana deve regular o fluxo de certos íons durante a fertilização e deve ser capaz de
se fundir com a membrana plasmática do espermatozóide. Acima da membrana
plasmática está o envoltório vitelínico (Figura 4.6). O componente principal desse
envoltório forma uma esteira fibrosa sobre o óvulo. Essa esteira é suplementada
por extensões de glicoproteínas da membrana plasmática e pontes proteináceas
vitelínicas que aderem a esteira à membrana (Mozingo e Chandler, 1991). O
envoltório vitelínico é essencial para a ligação espécie-específica do espermato-
zóide. Nos mamíferos, o envoltório vitelínico é uma matriz extracelular separada e
grossa chamada zona pelúcida. O óvulo do mamífero é também rodeado por uma
camada de células, as células do cumulus (Figura 4.7). A camada cumular repre-
senta células foliculares ovarianas que estavam alimentando o óvulo quando da
sua liberação do ovário. O espermatozóide dos mamíferos tem que passar por
essas células para fertilizar o óvulo*.
Imediatamente abaixo da membrana plasmática do óvulo está uma fina casca (de
aproximadamente 5µm) de um citoplasma gel-símile chamado de córtex. O citoplasma
nessa região é mais duro que o citoplasma interno e contém altas concentrações de
moléculas globulares de actina. Durante a fertilização, essas moléculas polimerizam-se
*Em mamíferos, as coberturas extracelulares do óvulo estão divididas em duas regiões: A zona
pelúcida e o cumulus. O termo corona radiata refere-se àquelas células foliculares imediatamente
adjacentes à zona pelúcida; são as células mais internas do cumulus.
Corpos
polares Pronúcleo
Vesícula
germinal feminino
Oócito Oócito primário Primeira metáfase Segunda metáfase Meiose completa

primário totalmente
jovem crescido
Os vermes anelídeos O nematelminto O verme nemerteano O anfioxo Cnidários

Dinophilus e Ascaris Cerebratulus Branchiostoma (e.g., anêmonas)
Sacocirrrus O mesozoário Dicyema O verme poliqueta Anfíbios Ouriços-do-mar
O verme poliqueta A esponja Grantia Chaetopterus Mamíferos (maioria)
Histriobdella O verme poliqueta O molusco Peixes
O platelminto Myzostoma Dentalium
Otomesostoma O verme concha O verme central
O onicóforo Nereis Pectinaria
Peripatopsis O molusco Spisula Muitos insetos
O verme equiuróide Urechis Estrela-do-mar
Cães e raposas
Figura 4.5
para formar longos fios de actina conhecidos como microfilamentos. Microfilamentos Estágios de maturação do óvulo no momento
são necessários para a divisão celular, e são também usados para estender a superfície da entrada do espermatozóide em diferentes
do óvulo para o interior das microvilosidades, que ajudam a entrada do espermatozói- animais. (Segundo Austin, 1965.)
de para dentro da célula (veja Figura 4.6; veja também a Figura 4.19). Ainda, dentro
desse córtex estão os grânulos corticais (veja Figuras 4.4 e 4.6). Essas estruturas
Microvilosidades Envoltório vitelínico
(A) (B) Grânulo cortical

Figura 4.6
A superfície do óvulo do ouriço-do-mar. (A) Micrografia eletrônica de varredura de um óvulo
antes da fertilização. A membrana plasmática está exposta onde o envoltório vitelínico foi
retirado. (B) Microfotografia eletrônica de transmissão de um ovo não-fertilizado, mostrando
microvilosidades e a membrana plasmática, que estão estreitamente cobertas pelo envoltório
vitelínico. Um grânulo cortical aparece diretamente abaixo da membrana plasmática do óvulo.
(de Schroeder, 1979, cortesisa de T. E. Schroeder.)
Cumulus
Óvulo
Zona
pelúcida
(A) (B)
Figura 4.7
Óvulos de hamster imediatamente antes da fecundação. (A) O ovo do hamster, ou óvulo, está
encaixado na zona pelúcida. Essa, por sua vez, está envolvida por células do cumulus. Uma célula
do corpo polar, produzida durante a meiose, também está dentro da zona pelúcida. (B) Em menor
aumento, um oócito de camundongo é mostrado em relação ao cumulus. Partículas de carbono
coloidal (tinta Nanquim) são excluídas pela matriz de hialuronidase. (Cortesia de R. Yanagimachi.)
ligadas à membrana são homólogas à vesícula acrossômica do espermatozóide, sendo

organelas derivadas do Golgi contendo enzimas proteolíticas. No entanto, enquanto
cada espermatozóide contém uma vesícula acrossômica, cada óvulo do ouriço-do-mar
contém aproximadamente 15.000 grânulos corticais. Além das enzimas digestivas, os
grânulos corticais também contêm mucopolissacarídeos, glicoproteínas adesivas e
proteína hialina. As enzimas e os mucopolissacarídeos atuam na prevenção da entra-
da de outros espermatozóides no óvulo após a entrada do primeiro, e as proteínas
hialinas e adesivas envolvem o embrião precoce providenciando apoio aos blastôme-
ros do estágio de clivagem.
Muitos tipos de óvulos têm uma geléia no exterior do seu envoltório vitelínico
(Figura 4.4). Essa rede de glicoproteínas pode ter numerosas funções, mas é principal-
mente usada para atrair ou ativar o espermatozóide. O óvulo, portanto, é uma célula
especializada para receber o espermatozóide iniciando o desenvolvimento.
Reconhecimento do óvulo e do espermatozóide: Ação à distância

Muitos organismos marinhos liberam seus gametas para o ambiente. Esse ambien-
te pode ser tão pequeno quanto uma poça de maré ou tão grande como o oceano.
Além disso, esse ambiente é compartilhado com outras espécies que podem libe-
rar suas células sexuais no mesmo período. Esses organismos enfrentam dois
problemas: 1) Como podem espermatozóides e óvulos se encontrarem quando em
concentrações tão diluídas, e 2) que mecanismo inibe o espermatozóide da estrela-
do-mar tentar fertilizar os óvulos do ouriço-do-mar? Dois mecanismos principais
evoluíram para resolver essas dificuldades: atração e ativação espécie-específica
do espermatozóide.
Atração do Espermatozóide
A atração espécie-específica do espermatozóide (um tipo de quimiotaxia) foi docu-
mentada em numerosas espécies, incluindo cnidários, moluscos, equinodermos e
urocordados (Miller, 1985; Yoshida et al., 1993). Em 1978, Miller demonstrou que os
óvulos do cnidário Orthopyxis caliculata não somente secretam um fator quimiotáti-
co mas também regulam o período de sua liberação. Oócitos em desenvolvimento, em
(A) (B) (C) (D)
Figura 4.8
vários estágios de amadurecimento, foram fixados sobre lâminas microscópicas, e Quimiotaxia do espermatozóide em Arbacia.
espermatozóides foram adicionados a uma certa distância dos óvulos. Miller encon- Um nanolitro de uma solução 10-nM de
trou que quando o espermatozóide era adicionado a oócitos que ainda não haviam resact é injetado em uma gota de 20ml de
suspensão de espermatozóide. A posição da
completado sua segunda divisão meiótica, não havia atração de espermatozóide pelos
micropipeta está indicada em (A). (A) Uma
óvulos. Porém, após o término da segunda divisão meiótica e os óvulos estarem fotografia de 1 segundo, mostrando esper-
prontos para ser fertilizados, o espermatozóide migrava em sua direção. Assim, esses matozóide nadando em círculos estreitos an-
oócitos não controlam somente o tipo de espermatozóide que atraem, mas também o tes da adição de resact. (B-D) Exposições
momento em que o atraem. semelhantes de 1 segundo mostrando a mi-
Os mecanismos de quimiotaxia são diferentes em outras espécies (veja Metz, 1978; gração do espermatozóide para o centro do
Ward e Kopf, 1993). Uma dessas moléculas quimiotáticas, um peptídio de 14 aminoácidos gradiente de resact 20, 40 e 90 segundos após
chamado resact foi isolado da geléia do óvulo do ouriço-do-mar Arbacia punctulata a injeção. (de Ward et al., 1985, cortesia de
(Ward et al., 1985). Resact difunde facilmente na água do mar e tem um profundo efeito V. D. Vacquier.)
quando adicionado a uma suspensão de espermatozóide de Arbacia, mesmo em con-
centração muito baixa (Figura 4.8). Quando uma gota de água do mar, contendo esper-
matozóide de Arbacia, é colocada em uma lâmina de microscópio, o espermatozóide
geralmente nada em círculos de aproximadamente 50 µm de diâmetro. Se uma quantida-
de mínima de resact for introduzida na gota, em segundos o esperma migra para a
região da injeção e ali se congrega. À medida que o resact continua a difundir-se, mais
espermatozóide é recrutado para dentro do crescente agrupamento. Resact é específi-
co para A. punctulata e não atrai espermatozóide de outras espécies. Espermatozóide
de A. punctulata liga resact a receptores na sua membrana celular (Ramarao e Garbers,
1985; Bentley et al., 1986) e pode nadar através de um gradiente crescente de concen-
tração desse composto até alcançar o óvulo.
Resact também age como um peptídio ativador de espermatozóide. Esses peptídios
(mais de 70 foram isolados de diferentes espécies de ouriços-do-mar) causam au-
mentos dramáticos e imediatos da motilidade espermática e do consumo de oxigênio
(Hardy et al., 1994). O receptor para resact é uma proteína transmembrana. Quando
ela liga o resact ao lado externo da célula, resact causa uma mudança conformacional
que ativa a atividade de guanidil ciclase no lado citoplasmático. Isso aumenta a
concentração de GMP cíclico do óvulo (Shimomura et al., 1986), que parece ativar a
ATPase da dineína estimulando a agitação da cauda no espermatozóide (Cook e
Babcock, 1993).
Ativação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-Mar

Uma segunda interação entre espermatozóide e óvulo envolve a ativação do esperma-
tozóide pela geléia do óvulo. Na maioria dos invertebrados marinhos, essa reação
acrossômica tem dois componentes: a fusão da vesícula acrossômica com a membrana
plasmática do espermatozóide (uma exocitose que resulta na liberação dos componen-
tes da vesícula acrossômica) e a extensão do processo acrossômico (Figura 4.9; Colwin
e Colwin, 1963). A reação acrossômica pode ser iniciada pela geléia do óvulo
solubilizada, pela geléia que envolve o óvulo, ou mesmo em certas espécies, pelo
contato com o próprio óvulo. Também pode ser ativada artificialmente pelo aumento
da concentração de cálcio na água do mar.
Membrana
acrossômica
Enzimas
acrossômicas
Bindina
Membrana do
espermatozóide
Actina
globular Microfilamentos
de actina
Núcleos
Figura 4.9
Reação acrossômica em espermatozóide de Em ouriços-do-mar, o contato com a geléia do óvulo causa a exocitose da vesícula
equinoderma. (A-C) A porção da membrana acrossômica e a liberação de enzimas digestoras de proteínas que podem digerir um
acrossômica diretamente abaixo da membra- caminho através da geléia de revestimento até a superfície do óvulo (Dan, 1967; Franklin,
na do espermatozóide funde-se com essa li- 1970; Levine et al., 1978). A seqüência desses eventos está esquematizada na Figura
berando o conteúdo da vesícula acrossômica. 4.9. A reação acrossômica é considerada ser iniciada por um oligossacarídeo ligado a
(D) Enquanto as moléculas de actina se agre-
uma proteína na geléia do óvulo que permite a entrada de cálcio na cabeça do esperma-
gam para produzir microfilamentos, o pro-
cesso acrossômico se estende para fora. Fo-
tozóide (SeGall e Lennarz, 1979; Schackmann e Shapiro, 1981; Keller e Vacquier, 1994
tografias reais da reação acrossômica no es- a,b). A exocitose da vesícula acrossômica é causada por uma fusão, mediada pelo
permatozóide do ouriço-do-mar são mostra- cálcio, da membrana acrossômica com a membrana plasmática adjacente do esperma-
das em seguida. (Segundo Summers e Hylan- tozóide (Figuras 4.9 e 4.10). Essa exocitose permite que a vesícula acrossômica libere
der, 1974; fotografias por cortesia de G. L. seu conteúdo na cabeça do espermatozóide*.
Decker e W. J. Lennarz.) A segunda parte da reação acrossômica envolve a extensão do processo
acrossômico (veja Figura 4.9). Essa protrusão se origina da polimerização de molécu-
las globulares de actina em filamentos de actina (Tilney et al., 1978). A exposição do
espermatozóide do ouriço-do-mar à geléia do óvulo também ocasiona a rápida utiliza-
ção de ATP e um aumento de 50% da respiração mitocondrial. A energia gerada é
usada primordialmente para motilidade flagelar (Tombes e Shapiro, 1985).
Os fatores da geléia do óvulo que iniciam a reação acrossômica em ouriços-do-mar
são muitas vezes muito específicos. Os espermatozóides dos ouriços-do-mar Arbacia
punctulata e Strongylocentrotus drobachiensis reagem somente com a geléia de
seus próprios óvulos. No entanto, o espermatozóide de S. purpuratus também pode
ser ativado pela geléia de Lytechinus variegatus (mas não de A. punctulata) (Summers
e Hylander, 1975). Portanto, a geléia do óvulo pode prover reconhecimento espécie-
específico em algumas espécies, mas não em outras.
* Tais reações exocitóticas podem ser vistas na liberação de insulina das células pancreáticas e
na liberação de neurotransmissores de terminais sinápticos. Em todos os casos, há uma fusão
mediada pelo cálcio entre a vesícula secretória e a membrana celular. Realmente, a semelhança entre
a exocitose da vesícula acrossômica e a exocitose da vesícula sináptica pode ser bastante profunda.
Estudos recentes de reações acrossômicas em ouriços-do-mar e mamíferos (Florman et al., 1992;
González-Martínez et al., 1992) sugerem que quando os receptores para os ligantes ativadores do
espermatozóide ligam essas moléculas, causam a despolarização da membrana que poderia abrir
canais de cálcio voltagem-dependentes de maneira reminescente à transmissão sináptica. As prote-
ínas que atracam os grânulos corticais à membrana celular também parecem ser homólogas àquelas
usadas na ponta do axônio (Bi et al., 1995).
Membrana celular do
espermatozóide
Fusão entre a
membrana celular
Membrana
do espermatozóide
acrossômica
e a membrana
acrossômica adjacente
Núcleo
Centríolo
Figura 4.10
Reação acrossômica em espermatozóide de hamster. (A) Micrografia de transmissão eletrônica
de um espermatozóide de hamster passando pela reação acrossômica. A membrana acrossômica
pode ser vista formando vesículas. (B) Diagrama interpretativo de micrografias eletrônicas
mostrando a fusão de membranas acrossômica e celular na cabeça do espermatozóide. (A de
Meizel, 1948, cortesia de S. Meizel; B, segundo Yanagimachi e Noda, 1970.)
& Especulações
Ação à Distância: Gametas de Mamíferos
É MUITO DIFÍCIL estudar as inte-

rações que podem estar ocorren-
do entre gametas de mamíferos
antes do contato espermatozóide-óvulo.
Um motivo óbvio para isso é que a fertili-
culas que permitem aos espermatozóides
nadar em direção ao óvulo e serem
ativados. Há muita controvérsia em rela-
ção ao deslocamento do espermatozóide
pico, se confiar somente no poder de seus
flagelos” (Storey, 1995). É mais provável
que o espermatozóide seja transportado
para o oviduto por meio da atividade mus-
mamífero até o oviduto, a capacitação e cular do útero.
zação ocorre dentro dos ovidutos femini- as reações de hiperativação que parecem Espermatozóide mamífero recém-eja-
nos. Embora seja relativamente fácil ser necessárias em algumas espécies para culado é incapaz de sofrer a reação acros-
mimetizar as condições rodeando a fertili- ligá-lo ao óvulo, e a possibilidade que o sômica sem ter residido por algum tempo
zação do ouriço-do-mar (usando água do óvulo possa estar atraindo o espermato- no trato reprodutivo feminino (Chang,
mar natural ou artificial), ainda não conhe- zóide por quimiotaxia. 1951; Austin, 1952). Esse requisito para
cemos os componentes dos vários ambi- capacitação varia de espécie para espécie
entes naturais encontrados pelo esperma- Translocação e Capacitação (Gwatkin, 1976) e pode ser mimetizado in
tozóide dos mamíferos em sua viajem ao O trato reprodutivo de mamíferos femini- vitro pela incubação de espermatozóide
encontro do óvulo. Um segundo motivo nos exerce um papel muito ativo no pro- em meios de cultura de tecidos (contendo
para essa dificuldade é que a população cesso de fertilização. Enquanto a motili- íons de cálcio, bicarbonato e soroalbumi-
de espermatozóide ejaculada para o inte- dade espermática é necessária para que o na) ou em fluido dos ovidutos. Os esper-
rior da fêmea é provavelmente muito he- espermatozóide do camundongo, uma vez matozóides que não foram capacitados
terogênea, contendo espermatozóides em no oviduto encontre o ovo, a motilidade são “segurados” na matriz cumular, não
diferentes estágios de amadurecimento. espermática provavelmente é um fator de atingindo assim o óvulo (Austin, 1960;
Dos 280 x 106 espermatozóides humanos menor importância para entrar no ovidu- Corselli e Talbot, 1987).
normalmente ejaculados para o interior da to. O espermatozóide é encontrado no As alterações moleculares que expli-
vagina, somente 200 atingem a região oviduto de camundongos, hamsters, co- cam a capacitação ainda são desconheci-
ampolar do oviduto, onde ocorre a fecun- baia, vacas e seres humanos dentro de 30 das (veja Yanigamachi, 1994), mas exis-
dação (Ralt et al., 1991). Como menos de 1 minutos após a deposição, um período tem quatro conjuntos de alteraçõess mo-
em 10.000 espermatozóides chegam perto “demasiadamente curto para ser atingido leculares que podem ser importantes. Pri-
do óvulo, é difícil analisar aquelas molé- até mesmo pelo espermatozóide mais olím- meiro, a membrana da célula espermática
pode se alterar, mudando sua composi- Hiperativação e Quimiotaxia possibilidade de que o efeito fosse devido
ção de lipídios. A concentração de As diferentes regiões do trato reproduti- a uma estimulação geral do movimento ou
colesterol no espermatozóide é diminuída vo feminino podem secretar fatores dife- do metabolismo do espermatozóide. No en-
durante a capacitação do espermatozóide rentes, regionalmente específicos. Esses tanto, essas investigações revelaram uma
em várias espécies (Davis, 1981), e duas fatores podem influenciar a motilidade correlação fascinante: o fluido de somente
proteínas encontradas tanto no soro como espermática assim como a capacitação. Por a metade dos folículos testados mostrou
no trato reprodutivo feminino (albumina exemplo, quando os espermatozóides de um efeito quimiotático, e em quase todos
e proteína 1 de transferência lipídica), fo- certos mamíferos (especialmente hams- os casos, o óvulo só era fertilizável se, e
ram verificadas remover colesterol do es- ters, cobaias e algumas variedades de ca- somente se, o fluido demonstrasse habili-
permatozóide humano (Langlais et al., mundongos) passam do útero para os dade quimiotática (P < 0,0001). É possível,
1988; Ravnik et al., 1992). Em segundo lu- ovidutos, ficam “hiperativados”, passan- portanto, que tal como certos óvulos de
gar, certas proteínas ou carboidratos na do a nadar com maior velocidade e geran- invertebrados, o óvulo humano secrete um
superfície do espermaozóide são perdidos do maior força. Suarez e colaboradores fator quimiotático somente quando estiver
durante a capacitação (Poirier e Jackson, (1991) mostraram que enquanto essas re- capacitado para a fertilização.
1981; Lopez et al., 1985; Wilson e Oliphant, ações não são conducentes a viagens em Deve-se notar que “o prêmio da corri-
1987). É possível que essas entidades per- fluidos de baixa viscosidade, parecem ser da não vai sempre para o mais rápido”. Em-
didas durante a capacitação estivessem muito adequadas para o movimento line- bora algum espermatozóide possa alcan-
bloqueando locais de reconhecimento ar do espermatozóide no fluido viscoso çar a região ampolar do oviduto (onde ocor-
para as proteínas que se ligam à zona que poderá encontrar no oviduto. re a fertilização) dentro de meia hora após a
pelúcida. Em terceiro lugar, certas proteí- Além de aumentar a atividade do es- relação sexual, aquele espermatozóide pode
nas são fosforiladas por um caminho permatozóide, fatores solúveis no oviduto ter poucas chances de fertilizar o óvulo.
cAMP-dependente. O AMP cíclico pode também podem prover o componente dire- Wilcox e colaboradores (1995) acharam que
induzir artificialmente a competência atra- cional do movimento do espermatozóide. quase todas os engravidamentos humanos
vés da proteína quinase cAMP-depen- Especulou-se que o óvulo (ou, mais pro- resultam de relacionamento sexual duran-
dente (PKA), que é necessária tanto para vavelmente, o folículo ovariano no qual o te um período de seis dias, terminando no
a aquisição de competência como para a óvulo se desenvolve) pode estar secretan- dia da ovulação. Isso significa que o es-
fosforilação de tirosino-quinases. É pos- do substâncias quimiotáticas que poderi- permatozóide fertilizador poderia demorar
sível que o trato reprodutivo feminino es- am atrair o espermatozóide em direção ao até seis dias para fazer a jornada. Eisenbach
timule a adenilciclase do espermatozóide óvulo durante os últimos estágios da mi- (1995) propôs a hipótese pela qual a
a produzir mais cAMP e que esse ative a gração (veja Hunter, 1989). Ralt e colabora- capacitação é um acontecimento transitó-
proteína quinase que inicia a cascata de dores (1991) testaram essa hipótese usan- rio, e que é dada ao espermatozóide uma
fosforilação, terminando na fosforilação do fluido de folículos humanos cujos óvu- janela de competência relativamente bre-
e ativação das proteínas envolvidas na los estavam sendo usados para fertiliza- ve, durante a qual pode ter sucesso na fer-
ligação do espermatozóide à zona pelúcida ção in vitro. Realizando um experimento tilização do óvulo. Quando os espermato-
e mediando a exocitose da vesícula acros- semelhante aquele descrito anteriormente zóides atingem a ampola, adquirem com-
sômica (Leyton e Saling, 1989a; Visconti com ouriços-do-mar, os autores microinje- petência, mas se aí ficam por um período
et al., 1995a,b). Em quarto lugar, o poten- taram uma gota do fluido folicular em uma demasiadamente longo, perdem-na. O es-
cial da membrana do espermatozóide é gota maior da suspensão de espermato- permatozóide pode também ter diferentes
dramaticamente reduzido (de cerca de – zóides. Feito isso, observaram que parte prazos de sobrevivência, dependendo da
30 para –50 mV; Zeng et al., 1995). Porém, do espermatozóide mudou sua direção de sua localização dentro do trato reproduti-
ainda é incerto se esses eventos são in- movimentação, passando a migrar ao en- vo; isso pode permitir que algum esperma-
dependentes um do outro e até que pon- contro da fonte de fluido folicular. A tozóide chegue mais tarde, porém com uma
to cada um deles produz capacitação do microinjeção de outras soluções não teve melhor probabilidade de sucesso do que
espermatozóide. esse efeito. Esses estudos não eliminam a aquele que chegou dias antes.
Reconhecimento do óvulo e espermatozóide:

Contato de gametas
Reconhecimento Espécie-Específico em Ouriços-do-Mar
Uma vez que o espermatozóide do ouriço-do-mar tiver penetrado na geléia do óvulo,
o processo acrossômico do espermatozóide faz contato com o envoltório vitelínico do
óvulo (Figura 4.11). Um importante passo do reconhecimento espécie-específico ocorre
nesse ponto. A proteína acrossômica mediando esse reconhecimento é chamada bin-
dina. Em 1977, Vacquier e colaboradores isolaram essa proteína insolúvel, de 30.500-
Da, do acrossomo de Strongylocentrotus purpuratus. Essa proteína é capaz de se
Figura 4.11
Contato do processo acrossômico do espermatozóide do ouriço-do-mar com uma Figura 4.12
microvilosidade do óvulo. (de Epel, 1977, cortesia de F. D. Collins e D. Epel.) Aglutinação espécie-específica por bindi-
na de óvulos desgeleificados . (A) aglutina-
ção promovida pela adição de 212 µg de
bindina em um recipiente plástico conten-
ligar a óvulos desgeleificados de S. purpuratus (Figura 4.12; Vacquier e Moy, 1977).
do 0.25 ml de suspensão a 2% (volume/
Ainda mais, sua interação com óvulos é relativamente espécie-específica (Glabe e volume) de óvulos. Após 2-5 min de agita-
Vacquier, 1977; Glabe e Lennarz, 1979); a bindina isolada dos acrossomos de S. ção branda, os recipientes foram fotografa-
Purpurata aglutina seus próprios óvulos desgeleificados, mas não aqueles de Arbacia dos. Cada bindina somente se ligou a seus
puctulata. Usando técnicas imunológicas, Moy e Vacquier (1979) demonstraram que próprios óvulos. (B) Fotomicrografia de
a bindina está especificamente localizada no processo acrossômico, exatamente onde fluorescência de óvulos de S. purpuratus
deve estar para o reconhecimento espermatozóide-óvulo (Figura 4.13). ligados entre si por partículas de bindina
Estudos bioquímicos mostraram que as bindinas de espécies proximamente relaci- de S. purpuratus marcadas por fluorescên-
onadas de ouriço-do-mar são mesmo diferentes. Esse achado implica na existência de cia. As partículas de bindina estavam inva-
riavelmente nos lugares onde dois óvulos
se encontravam. (A baseado em fotografias
de Glabe e Vacquier, 1977; B de Glabe e
(A) BINDINA DO ESPERMATOZÓIDE (B) Lennarz, 1979, cortesia dos autores.)
S. purpuratus S. fransciscanus
S. purpuratus
Partículas
de bindina
OVOS DESGELEIFICADOS
Aglutinação Sem aglutinação

Óvulos
S. fransciscanus
Sem aglutinação Aglutinação

(A) DAB + H2O2 (B) (C)

Imunoglobulina Membrana
Precipitado Precipitado DAB vitelínica do óvulo Acrossomo
porcina anti-coelho
denso
conjugada com a
enzima peroxidase Anti-bindina
de coelho
Núcleo
Processo acrossômico
Bindina
Espermatozóide
Figura 4.13
Localização de bindina no processo acrossômico. (A) a técnica de localização
imunoquímica coloca um anticorpo de coelho nos lugares onde a bindina está exposta.
Os anticorpos do coelho foram produzidos contra a proteína bindina, e esses anticorpos
foram incubados com espermatozóide que tinha sofrido a reação acrossômica. Quando a
bindina estava presente, os anticorpos do coelho permaneciam ligados ao espermato-
zóide. Depois de todo anticorpo não-ligado ser removido por lavagem, o espermatozói-
de foi tratado com anticorpos de porco capazes de ligar-se a anticorpos de coelho.
Esses anticorpos de porco haviam sido ligados covalentemente à enzima peroxidase.
Dessa maneira, moléculas de peroxidase foram colocadas em todos os lugares onde havia
bindina. Peroxidase catalisa a formação de um precipitado escuro de diaminobenzidina
(DAB) e água oxigenada. O precipitado só se forma onde há bindina. (B) Localização de
bindina no processo acrossômico após a reação acrossômica (33.200x). (C) Localização
de bindina no processo acrossômico na junção do espermatozóide com o óvulo. (B e C de
Moy e Vacquier, 1979, cortesia de V. D. Vacquier.)
receptores espécie-específicos de bindina no envoltório vitelínico. Tais receptores

também foram sugeridos pelos experimentos de Vacquier e Payne (1973), que satura-
ram óvulos de ouriço-do-mar com espermatozóide. Como pode ser visto na Figura 4.14
A, a ligação do espermatozóide não se dá sobre a superfície inteira do óvulo. Mesmo
(A)
Figur
Figuraa 4.14
Receptores de bindina no óvulo. (A) Mi-
crografia eletrônica de varredura do esper-
matozóide do ouriço-do-mar ligado ao
envoltório vitelínico de um óvulo. (B) liga-
ção do espermatozóide de S. purpuratus a
partículas de polistireno que foram cober-
tas com a proteína purificada do receptor de
bindina. (A cortesia de C. Glabe, L. Perez e
W. J. Lennarz; B de Foltz et al., 1993.)
(B)
a níveis saturantes de espermatozóide (aproximadamente 1500), parece haver espaço

no óvulo para mais cabeças de espermatozóide, indicando haver um número limitante
de locais ligantes de espermatozóide. Um grande complexo de glicoproteínas dos
envoltórios vitelínicos de óvulos de ouriço-do-mar foi isolado e mostrou ligar bindina
radioativa de maneira espécie-específica (Glabe e Vacquier, 1978; Rossignol et al.,
1984). Essa glicoproteína é também capaz de competir com óvulos pelo espermatozói-
de da mesma espécie. Isto é, se espermatozóide de S. purpuratus é misturado com o
receptor de bindina de envoltórios vitelínicos de S. purpuratus, o espermatozóide se
liga a ele e não irá fertilizar os óvulos. O receptor isolado de S. purpuratus, porém, não
irá interferir com a fertilização de outros ouriços-do-mar relacionados. Esse receptor
de bindina é uma glicoproteína transmembrana com quase 1300 aminoácidos (Foltz et
al., 1993). A região ligante de bindina se estende para o espaço extracelular e provavel-
mente se torna um componente do envoltório vitelínico. Esses receptores de bindina
se agregam em complexos, e centenas deles são provavelmente necessários para
amarrar o espermatozóide no óvulo (Figura 4.14B). Assim, reconhecimento espécie-
específico dos gametas do ouriço-do-mar ocorrem ao nível da atração, ativação e
adesão do espermatozóide à superficie do óvulo. [fert4.html]
Ligação de Gametas e Reconhecimento em Mamíferos

ZP3: A PROTEÍNA LIGANTE DA ZONA PELÚCIDA DO CAMUNDONGO. A zona
pelúcida tem nos mamíferos um papel análogo aquele do envoltório vitelínico nos
invertebrados. Essa matriz de glicoproteínas é sintetizada e secretada pelo oócito em
crescimento, e tem dois papéis importantes durante a fertilização: liga o espermatozóide, e
inicia a reação acrossômica após essa ligação (Saling et al., 1979; Florman e Storey, 1982;
Cherr et al., 1986). A ligação de espermatozóide à zona é relativamente, porém não absolu-
tamente, espécie-específica (especificidade por espécie não deveria ser um grande proble- Figura 4.15
ma quando a fertilização ocorre internamente), e a ligação do espermatozóide do camun- Ligação do espermatozóide à zona pelúcida.
dongo à zona dessa espécie pode ser inibida pela incubação prévia de espermatozóide (A) ensaio de inibição mostrando a dimi-
nuição específica da ligação do esperma-
com glicoproteínas da zona. Bleil e Wassarman (1980, 1986, 1988) isolaram da zona pelúcida
tozóide do camundongo às zonas pelúcidas
do camundongo uma glicoproteína ZP3, de 83-kDa, que é o competidor ativo nesse ensaio
quando espermatozóide e zonas são incu-
de inibição. As outras duas proteínas da zona, ZP1 e ZP2, não puderam competir pela bados com aumentos crescentes da porção
ligação do espermatozóide (Figura 4.15). Ainda mais, ZP3 radiativamente marcada ligou-se carboidrato da glicoproteína ZP3. A im-
às cabeças do espermatozóide do camundongo que tinha acrossomos intactos. Assim, portância da porção carboidrato de ZP3 é
ZP3 é a proteína específica na zona pelúcida à qual se liga o espermatozóide do camundon- também, indicada por essa figura. (B) Li-
go. ZP3 também inicia a reação acrossômica após os espermatozóides terem se ligado a ela. gação de ZP3 marcada radioativamente a
O espermatozóide do camundongo pode, dessa forma, concentrar suas enzimas espermatozóide capacitado do camundon-
proteolíticas diretamente no ponto de fixação à zona pelúcida. go. (A segundo Bleil e Wassarman, 1980, e
Florman e Wassarman, 1985; B de Bleil e
Wassarman, 1986, cortesia dos autores.)
Ligação do espermatozóide (%)
ZP3 sem
carboidratos
(A) Equivalentes da zona pelúcida por µl (B)

O mecanismo molecular pelo qual a zona pelúcida e o espermatozóide do mamí-

fero se reconhecem mutuamente está sendo estudado. A hipótese corrente sobre
a ligação dos gametas de mamíferos postula um conjunto de proteínas do esper-
matozóide capazes de reconhecer regiões específicas de carboidratos na zona ZP3
do óvulo (Florman et al., 1984; Florman e Wassarman, 1985; Wassarman, 1987;
Saling, 1989). A remoção desses grupos de carboidratos ligados por treonina ou
serina suprime a habilidade de ligar o espermatozóide.
PROTEÍNAS DE ADESÃO ESPERMATOZÓIDE-ZONA. O espermatozóide do camun-

dongo não “fura” para chegar ao interior da zona. Na realidade, os espermatozóides se
aproximam paralelamente ao plano da superfície da zona e aí são ativamente fixados
(Baltz et al., 1988). Como é a zona capaz de ligar e conservar esses espermatozóides
contorcedores? Parece que ZP3 pode ligar-se a pelo menos três proteínas adesivas na
membrana do espermatozóide, e milhares desses sítios podem ser necessários para
prevenir que essas duas células se separem. Há uma controvérsia significativa sobre a
questão de se todas as três proteínas no espermatozóide são necessárias para ligação à
zona, e quais as suas respectivas funções (veja Figura 4.16: Snell e White, 1996). Parece
que cada uma delas tem papéis específicos, mas um tanto sobrepostos na adesão do
espermatozóide e na reação acrossômica. Essas três proteínas são: a proteína ligante de
galactose, a galactosil-transferase e a quinase do receptor da zona.
A PROTEÍNA LIGANTE DE GALACTOSE 56-KDA (SP56). Uma proteína crítica

ligante da zona do espermatozóide parece ser a proteína que especificamente se liga
aos resíduos de galactose de ZP3. Bleil e Wassarman (1980) mostraram que um dos
carboidratos críticos da glicoproteína ZP3 é o grupo galactose terminal. Se essa galactose
terminal for removida ou modificada quimicamente, a atividade ligante de espermatozói-
de é perdida. Esses pesquisadores posteriormente isolaram essa proteína, ligando
Zona pelúcida
Óvulo
ZP3 (proteína ligante de

Espermatozóide espermatozóide) na Zona
ZP3
Proteínas candidatas N-acetil Galactose

a ligação à zona no glicosamina Membrana
acrossomo celular do
espermatozóide
GALACTOSILTRANSFERASE SP 56 P95
(proteína
Ligação periférica da Ativação
cruzada ativa membrana) de
proteínas G tirosinoquinase Figura 4.16
Ligação de espermatozóide à zona pelúcida do
Ativação de síntese Regulação de camundongo: alguns possíveis participantes.
de IP3 na canais iônicos A proteína ZP3 da zona pelúcida liga esper-
membrana ou síntese matozóide. Há evidência da ligação de três pro-
acrossômica de IP3 teínas espermáticas – a galactosiltransferase
da superfície, sp56 e P95 – à ZP3. Essa liga-
Liberação de Ca++ ção induz a reação acrossômica através da ati-
vação do fluxo de cálcio. Os detalhes ainda
terão que ser elucidados. (Segundo Snell e
Reação acrossômica White, 1996.)
Figura 4.17
Sp56 purificada liga-se à zona pelúcida e ini-
be a ligação de espermatozóide a óvulos de
camundongo. (A) Ligação de sp56 à zona
pelúcida de ovos não-fertilizados. A pista 1 é
o resultado da lise de ovos não-fertilizados,
fazendo migrar as proteínas extraídas em um
gel, transferindo o gel, e sondando para a pre-
sença de sp56 com anticorpo marcado. Não
se vê sp56. A pista 2 mostra o resultado po-
sitivo obtido quando o ovo não-fertilizado é
pré-incubado com sp56, indicando que sp56
se liga aos óvulos. A pista 3 mostra os resul-
tados negativos obtidos quando sp56 foi adi-
cionada a embriões bicelulares. A pista 4 mos-
tra o controle quando sp56 purificada é feita
migrar no gel. (O anticorpo reconhece a for-
ma não-reduzida de sp56, que migra em 40
ZP3 à uma coluna de afinidade, passando em seguida, por essa coluna, as proteínas kDa). (B) Espermatozóide ligando-se normal-
isoladas da membrana de espermatozóides de camundongo (Bleil e Wassarman, mente a ovos não-fertilizados de camundon-
1990). A maioria das proteínas passou pela coluna; porém um peptídio de 56- go (aproximadamente 76 espermatozóides
kDa, ligou-se às partículas recobertas com ZP3, mas não se ligou a partículas por óvulo). Os embriões bicelulares (aqui
recobertas com ZP2 em experimento semelhante. Essa proteína foi encontrada marcados por asteriscos) são controles inter-
nos mostrando não ocorrer ligação. (C ) Na
exposta na membrana espermática; ligava-se a resíduos de galactose, sugerin-
presença de sp56, o espermatozóide foi im-
do fortemente ser um receptor de espermatozóide ligante à entidade terminal de pedido de se ligar à zona. (de Bookbinder et
galactose na glicoproteína ZP3. A proteína sp56 liga-se à zona pelúcida de al., 1995; cortesia de J.D. Bleil.)
ovos não-fertilizados (porém não dos fertilizados), bloqueando a ligação es-
permatozóide-óvulo (Figura 4.17; Bookbinder et al., 1995).
GALCTOSILTRANSFERASE. A Segunda proteína do espermatozóide que parece

ser importante para ligação espermatozóides-zona é a enzima da membrana celular do
espermatozóide, glicosiltransferase. No laboratório de Shur foi demonstrado que esse
receptor para a zona é uma enzima que reconhece o açúcar N-acetilglicosamina na ZP3
(Shur e Hall, 1982a,b; Lopez et al., 1985; Miller et al., 1992). Essa enzima, N-
acetilglicosamina:galactosiltransferase, está embebida na membrana plasmática do
espermatozóide, diretamentre acima do acrossomo, com seu sítio ativo apontando
para fora. A função enzimática dessa enzima de 60-kDa seria a de catalisar a adição de
um açúcar galactose (de UDP-galactose) para uma cadeia de carboidrato terminando
em um açúcar N-acetilglicosamina (veja Capítulo 3). No entanto, não há resíduos de
UDP-galactose no trato reprodutivo feminino. Embora a enzima possa se ligar aos
resíduos de proteínas da zona, exatamente como qualquer enzima se ligaria a um
substrato, ela não pode catalisar a reação porque o segundo reagente está faltando.
Portanto, as enzimas (no espermatozóide) ficam ligadas a seus substratos (na zona).
Se essa hipótese estiver correta, poderíamos esperar que a ligação óvulo-es-
permatozóide seria inibida ou pela inibição da enzima, ou pela adição do segundo
reagente, UDP-galactose. Isso é exatamente o que Shur e colaboradores acharam
ser o caso. A ligação espermatozóide-zona foi bloqueada por: (1) adição de UDP-
galactose, (2) remoção de resíduos de N-acetilglicosamina de ZP3, (3) adição de
anticorpos que bloqueiam a atividade da galactosiltransferase, e (4) colocação de
um excesso de galactosiltransferase no meio (a enzima em excesso iria ligar-se à zona
e inibir o espermatozóide de se ligar) (Lopez et al., 1985; Shur e Neely, 1988). Além
disso, membranas de espermatozóide de camundongo irão transferir um açúcar de
UDP-galactose especificamente para ZP3 (Miller et al., 1992). Assim, a galactosil-
transferase da superfície do espermatozóide parece reconhecer um grupo carboidrato
na proteína ZP3 da zona pelúcida do camundongo. A agregação dessas
galactosiltransferases ocasiona a ativação de uma proteína G que pode ser impor-
tante na iniciação da reação acrossômica (Gong et al., 1995).
RECEPTOR DE QUINASE DA ZONA (ZRK). Uma terceira proteína espermática

que se liga à zona pelúcida do camundongo parece ser uma proteína transmembra-
na de 95-kDa com dois sítios funcionais. O sítio extracelular liga especificamente
ZP3, enquanto o sítio intracelular tem atividade enzimática de tirosina quinase
(Leyton et al., 1992). Essa atividade é estimulada quando a proteína liga ZP3. Isso
implica que a proteína de 95-kDa é uma tirosina quinase de receptor, e que pode
iniciar a reação acrossômica através da fosforilação das suas proteínas alvo (veja
Capítulo 3). O espermatozóide humano tem uma proteína semelhante, e a ZP3 hu-
mana estimula a atividade da quinase. Além disso, peptídios sintéticos que
mimetizam o domínio extracelular (que liga ZP3) dessa proteína, inibem a ligação
do espermatozóide à zona pelúcida humana, sugerindo possível uso como
contraceptivo (Burks et al., 1995).
INDUÇÃO DA REAÇÃO ACROSSÔMICA EM MAMÍFEROS POR ZP3. Uma vez

que o espermatozóide capacitado ligou-se à zona pelúcida, como ocorre a reação
acrossômica nos mamíferos? A reação é induzida pela porção protéica de ZP3
(Endo et al., 1987; Leyton e Saling,1989a), e ZP3 parece atuar perfazendo ligação
cruzada com seus receptores na membrana espermática. Esse tipo de ligação abre
os canais de cálcio, aumentando a concentração do íon no espermatozóide (Leyton
e Saling, 1992b). O mecanismo pelo qual age o ZP3 e a subseqüente exocitose do
acrossomo permanece controversa, mas pode envolver a trajetória IP3 (Florman,
1994; Suarez e Dai, 1995). [fert5.html]
LIGAÇÃO SECUNDÁRIA DO ESPERMATOZÓIDE À ZONA PELÚCIDA. Durante

a reação acrossômica, a parte anterior da membrana plasmática do espermatozóide é
solta (veja Figura 4.10). É ali que estão localizadas as proteínas ligantes de ZP3 e,
ainda assim, o espermatozóide deve permanecer ligado à zona para abrir, por lise, um
caminho através dela. Em camundongos, parece que uma ligação secundária à zona
é conseguida por proteínas na membrana acrossômica interna que se ligam especi-
ficamente a ZP2 (Bleil et al., 1988). Enquanto espermatozóide com acrossomo intacto
não irá se ligar à ZP2 glicoproteína, o espermatozóide cujo acrossomo reagiu o fará.
Além disso, anticorpos contra a proteína ZP2 não irão impedir a ligação do esper-
matozóide com acrossomo intacto à zona, mas irão inibir a fixação do espermatozóide
que já tenha reagido. A estrutura da zona consiste de unidades repetitivas de ZP3 e
ZP1 ZP2, ocasionalmente ainda ligadas por ZP1 (Figura 4.18). Parece que os espermato-
zóides com acrossomo que reagiram, transferem sua ligação com ZP3 para as molé-
culas adjacentes de ZP2. Após a entrada de espermatozóide de camundongo no óvulo,
ZP2 os grânulos corticais do ovo liberam seu conteúdo. Uma das proteínas liberadas é a
protease que especificamente altera ZP2 (Moller e Wassarman, 1989). Isso inibe ou-
tros espermatozóides, cujo acrossomo já reagiu, de mover-se mais para perto do óvulo.
Resíduos de Não é conhecido quais das proteínas do espermatozóide do camundongo se
ZP3 carboidratos
ligam à ZP2. No espermatozóide porcino, ligação secundária à zona parece ser medi-
ada por proacrosina. Proacrosina torna-se a protease acrosina, há muito tempo co-
nhecida por estar envolvida na digestão da zona pelúcida. No entanto, proacrosina
é também uma proteína ligante da fucose que mantém a conexão entre espermatozói-
de que reagiu com acrosina e a zona pelúcida (Jones et al., 1988). É possível que a
proacrosina se ligue à zona, sendo depois convertida na enzima ativa que digere
localmente a zona pelúcida.
Figura 4.18 Na cobaia, ligação secundária à zona é considerada ser mediada pela proteína
Diagrama da estrutura fibrilar da zona pelúcida PH-20. Quando essa proteína da membrana acrossômica interna foi injetada em
do camundongo. Filamentos principais da
cobaias macho ou fêmea, 100% desses animais tornaram-se estéreis por vários me-
zona pelúcida são compostos por dímeros
repetitivos das proteínas ZP2 e ZP3. Esses ses (Primakoffet al., 1988). O soro sangüíneo dessas cobaias estéreis tinha uma
filamentos estão ocasionalmente ligados por concentração extremamente alta de anticorpos para PH-20. O anti-soro de cobaias
ZP1, formando uma esteira de malhas. (Se- esterilizadas por injeções de PH-20 não só se ligou especificamente a essa pro-
gundo Wassarman, 1989.) teína, como também bloqueou a adesão espermatozóide-zona in vitro. O efeito
contraceptivo perdurou por vários meses, após os quais a fertilidade foi restabelecida.
Os animais foram temporariamente esterilizados por esses anticorpos. O análogo
humano da proteína PH-20 não é ainda conhecido, porém, certos antígenos do es-
permatozóide apresentam um padrão semelhante de localização no espermatozóide.
As proteínas da zona pelúcida humana e suas funções ainda não foram estabeleci-
das tão claramente como no camundongo. Ainda assim, esses experimentos mos-
tram que o princípio da contracepção imunológica está bem fundamentado.
Fusão de gametas e a prevenção da polispermia

Fusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóide
O reconhecimento do espermatozóide pelo envoltório vitelínico ou zona é seguido

pela lise da porção do envoltório ou zona na região da cabeça do espermatozóide
(Colwin e Colwin, 1960; Epel, 1980). Essa lise é seguida pela fusão da membrana
espermática com a membrana do óvulo.
A entrada do espermatozóide no óvulo do ouriço-do-mar está ilustrada na Figura
4.19. A superfície do óvulo está coberta de pequenas microvilosidades; a fusão
espermatozóide-óvulo parece causar a polimerização da actina e a extensão de várias
microvilosidades para formar o cone de fertilização (Summers et al., 1975; Schatten
e Schatten, 1980, 1983). A homologia entre óvulo e espermatozóide é novamente
(A) (B)
Figura 4.19
Varredura ao microscópio eletrônico da entrada
do espermatozóide em óvulo de ouriço-do-mar.
(A) Contato da cabeça do espermatozóide com
microvilosidades do óvulo através do processo
acrossômico. (B) Formação do cone de fertili-
zação. (C) Internalização do espermatozóide no
óvulo. (D) Micrografia de transmissão ao mi-
croscópio eletrônico da internalização do es-
permatozóide através do cone de fertilização.
(A-C de Schatten e Mazia, 1976, cortesia de G.
Schatten; D cortesia de F. J. Longo.)
(C) (D)
demonstrada, porque o cone de fertilização transitório, tal como o processo

acrossômico, parece se prolongar pela polimerização da actina. Após a junção, pode-
se encontrar material do espermatozóide na membrana do óvulo (Gundersen et al.,
1970). O núcleo e a cauda do espermatozóide passam pela ponte citoplasmática, que
é alargada pela polimerização da actina. Yanagimachi e Noda (1970) mostraram que
processo semelhante ocorre na fusão de gametas de mamíferos (Figura 4.20).
No ouriço-do-mar, todas as regiões do óvulo são capazes de se fundir com o
espermatozóide; em várias outras espécies, existem regiões especializadas na mem-
brana para o reconhecimento e fusão com o espermatozóide (Vacquier, 1979). A
fusão é um processo ativo, freqüentemente mediado por proteínas “fusogênicas”
específicas. Proteínas como a HA do vírus da influenza e a proteína F do vírus
Sendai promovem a fusão celular, sendo possível que a bindina também seja uma
dessas proteínas. Glabe (1985) mostrou que a bindina do ouriço-do-mar promove a
fusão de vesículas fosfolipídicas e que, tal como as proteínas fusogênicas virais, a
bindina contém uma longa região de aminoácidos hidrofóbicos perto do terminal
amino. Em abalones, a lisina que dissolve o envoltório vitelínico também demons-
trou ter atividade fusogênica (Hong e Vacquier, 1986).
As proteínas fertilinas da membrana do espermatozóide dos mamíferos são
essenciais para fusão espermatozóide-óvulo (Primakoff et al., 1987; Blobel et al.,
1992; Myles et al., 1994). A fertilina do camundongo tem regiões hidrofóbicas seme-
lhantes às das proteínas fusogênicas virais, além de uma seqüência que sugere
ligação com uma integrina da membrana do óvulo. Evidência atual sugere que a
fertilina do camundongo liga-se à integrina α6β1 da membrana assumindo-se que a
região hidrofóbica da fertilina pode, em seguida, mediar a união das duas membra-
nas (Almeida et al., 1995). Quando as membranas se fundem, o núcleo, mitocôndrias,
centríolo e flagelo podem penetrar no ovo.
Prevenção da Polispermia
Assim que um espermatozóide tiver penetrado o óvulo, a capacidade de fusão da
membrana do óvulo, que fora tão necessária para conseguir a penetração, torna-se
um risco. No ouriço-do-mar, como na maioria dos animais estudados, qualquer es-
permatozóide que penetra o óvulo, pode prover um núcleo haplóide e um centríolo
para o óvulo. Na monospermia normal, na qual somente um espermatozóide penetra
o óvulo, um núcleo haplóide do espermatozóide e um do óvulo se combinam para
formar o núcleo diplóide do ovo fertilizado (zigoto), restaurando o número de cro-
mossomos apropriado para a espécie. O centríolo, provindo do espermatozóide, se
dividirá para formar os dois pólos do fuso mitótico durante a clivagem.
A entrada de múltiplos espermatozóides – polispermia – conduz à conse-
qüências desastrosas na maioria dos organismos. No ouriço-do-mar, a fertiliza-
ção por dois espermatozóides resulta em um núcleo triplóide, no qual cada
cromossomo está representado não duas, mas três vezes. Pior ainda, como o
centríolo se divide para formar os dois pólos do aparelho mitótico, aqui, em
vez de um fuso mitótico bipolar separar os cromossomos em duas células, os
cromossomos triplóides se dividiriam em quatro células. Como não há meca-
nismos para assegurar que cada uma das quatro células receba o número e o
tipo apropriado de cromossomos, esses serão distribuídos de maneira desigual.
Algumas células receberiam cópias extra de certos cromossomos e outras cé-
lulas não os teriam. Theodor Boveri demonstrou em 1902 que tais células ou
morreriam ou se desenvolveriam anormalmente (Figura 4.21). [fert6.html]
As espécies desenvolveram maneiras de prevenir a união de mais de dois
núcleos haplóides. A mais comum é a de impedir a entrada de mais de um
espermatozóide no óvulo. O óvulo do ouriço-do-mar tem dois mecanismos que
evitam a polispermia: uma reação rápida, efetivada por uma mudança elétrica
na membrana plasmática do óvulo, e uma reação mais lenta, causada pela
exocitose dos grânulos corticais.
(A) (B) (C)
Zona
Segmento
(E) Núcleo equatorial do
Membrana
acrossomo
acrossômica
interna
Figura 4.20
Entrada de espermatozóide no óvulo do hamster dourado. (A) Micrografia eletrônica de
varredura do ato da fusão. O ponto “calvo” (sem microvilosidades) é o local abandona-
do pelo corpo polar. (B) Vista próxima da ligação espermatozóide-zona. (C ) Microgra-
fia eletrônica de transmissão mostrando a cabeça do espermatozóide atravessando a
zona. (D) Micrografia eletrônica de transmissão, do espermatozóide fundindo em para-
lelo a membrana do plasma do óvulo. (E) Diagrama da fusão do acrossomo do esper-
matozóide e membranas plasmáticas com as microvilosidades do óvulo. (Segundo
Yanagimachi e Noda, 1970; Yanagimachi, 1994; fotografias cortesia de R. Yanagimachi.)
O BLOQUEIO RÁPIDO DA POLISPERMIA. A membrana celular do óvulo é notável

não somente por sua habilidade de se fundir com a membrana espermática, mas tam-
bém por sua capacidade de resistir a uma ulterior fusão imediatamente após a entrada
de um espermatozóide (Just, 1919).
O bloqueio rápido à polispermia, é conseguido pela mudança do potencial elétrico
da membrana do óvulo. Essa provê uma barreira seletiva entre o citoplasma e o ambi-
ente exterior; a concentração iônica do óvulo difere muito daquela do ambiente, uma
diferença especialmente pronunciada para os íons de sódio e potássio. A água do mar
tem uma alta concentração do íon sódio, ao passo que o citoplasma do óvulo tem
relativamente pouco sódio. O oposto acontece com os íons potássio. Essa condição
é mantida pela membrana celular, que constantemente inibe a entrada de sódio no
(A) Figura 4.21

Centrossomo do Desenvolvimento aberrante de um óvulo de ouriço-do-mar fecundado por dois espermato-
espermatozóide
Oócito zóides. (A) Fusão de três núcleos haplóides, cada um contendo 18 cromossomos, e
divisão dos dois centríolos espermáticos para formar quatro pólos mitóticos. (B, C) Os
Pronúcleos 54 cromossomos se distribuem aleatoriamente nos quatro fusos. (D) Na anáfase da
do esperma- Pronúcleos
primeira divisão, os cromossomos duplicados são arrastados para os quatro pólos. (E)
tozóide do oócito Quatro células contendo números e tipos diferentes de cromossomos são formadas,
causando a morte prematura do embrião (F). (Segundo Boveri, 1907.)
Fusão pronuclear
(B)
oócito e impede o escoamento de íons de potássio para o ambiente. Quando inse-

rimos um eletrodo no óvulo e colocamos um outro fora do oócito, podemos medir
a constante diferença potencial da membrana plasmática do óvulo. Esse potencial
1a clivagem de repouso da membrana é geralmente cerca de 70 mV, e usualmente expresso
(C)
como –70 mV porque o interior da célula está carregado negativamente em relação
ao exterior. [fert7.html]
Dentro de 1-3 segundos após a ligação do primeiro espermatozóide, o potencial
da membrana muda para um nível positivo (Longo et al., 1986). Um pequeno influxo
de íons de sódio no óvulo é permitido, trazendo a diferença de potencial para +20 mV
(Figura 4.22 A). Embora o espermatozóide possa se fundir com membranas tendo um
potencial de –70 mV, não pode se fundir com membranas com um potencial de repou-
so positivo. Não é conhecido como a ligação ou a entrada do espermatozóide sina-
(D) liza a abertura dos canais de sódio; porém, Gould e Stephano (1987, 1991) fornece-
ram o que poderá ser uma pista importante para a compreensão desse processo. Os
autores isolaram do espermatozóide de Urechis (um verme equiuróide marinho) uma
proteína cromossômica capaz de abrir canais de sódio de óvulos de Urechis. Quan-
do tais óvulos são expostos a essa proteína, a mudança da velocidade do influxo de
sódio e do potencial de membrana resultante são muito parecidos com aqueles
produzidos pelo espermatozóide vivo. A abertura dos canais de sódio no óvulo,
parece ser causada pela ligação do espermatozóide ao óvulo.
Jaffe e seus colaboradores mostraram que a polispermia podia ser induzida
quando óvulos foram supridos artificialmente com uma corrente elétrica que man-
(E)
tinha negativo o seu potencial de membrana. Reciprocamente, a fertilização podia
ser inteiramente prevenida conservando tal potencial positivo (Jaffe, 1976). O
bloqueio rápido da polispermia podia também ser evitado baixando-se a concen-
tração do sódio da água (Figura 4.22B-D). Se os íons de sódio não forem suficien-
tes para ocasionar um deslocamento positivo do potencial de membrana, ocorre a
polispermia (Gould-Somero et al., 1979; Jaffe, 1980). Não é conhecido como dife-
renças no potencial de membrana atuam sobre o espermatozóide bloqueando a
segunda fecundação. Muito provavelmente, o espermatozóide conduz um compo-
(F) nente (possivelmente uma proteína fusogênica carregada positivamente), sendo a
inserção desse componente na membrana do óvulo, provavelmente, regulada pela
carga elétrica transmembrana (Iwao e Jaffe, 1989). Um bloqueio elétrico à polispermia
também ocorre em rãs (Dross e Elinson, 1980), mas provavelmente não na maioria
dos mamíferos (Jaffe e Cross, 1983).
Células em desintegração; O BLOQUEIO LENTO DA POLISPERMIA. Óvulos do ouriço-do-mar (e muitos ou-

morte do embrião tros) têm um segundo mecanismo para assegurar que múltiplos espermatozóides não
penetrem no citoplasma do óvulo (Just, 1919). O bloqueio rápido é transitório, o po-
tencial de membrana do óvulo do ouriço-do-mar somente permanece positivo por
cerca de um minuto. Essa curta mudança de potencial não é suficiente para prevenir a
polispermia de maneira permanente. Carroll e Epel (1975) demonstraram que a
Figura 4.22
Potencial de membrana de óvulos de ouriço-do-mar antes
e após a fertilização. (A) antes da adição do espermato-
zóide, a diferença de potencial através da membrana celu-
lar do óvulo é de aproximadamente –70 mV. De 1 a 3 se-
gundos após o espermatozóide fertilizante ter entrado em
Adição de contato com o óvulo, o potencial se desloca na direção
espermatozóide positiva. (B) Ovos controle desenvolvendo-se em Na+
490 mM. (C) Polispermia em ovos fertilizados em Na+
(A) 120 mM (colina foi substituída por sódio). Os ovos de
Segundos Lytechinus foram fotografados durante a primeira
clivagem. (D) Tabela mostrando a elevação da polispermia
com o decréscimo da concentração do íon sódio. (de Jaffe,
1980, fotografias cortesia de L. A. Jaffe.)
Porcentagem de
[Na+] (mM) ovos polispérmicos
(B) (C) (D)
polispermia ainda pode ocorrer se os espermatozóides ligados ao envoltório

vitelínico não forem removidos de alguma maneira. Essa remoção é conseguida
pela reação dos grânulos corticais, um bloqueio mecânico mais lento da polispermia
que se torna ativo cerca de 1 minuto após a primeira ligação bem sucedida esper-
matozóide-óvulo.
Diretamente abaixo da membrana do óvulo do ouriço-do-mar existem 15.000
grânulos corticais, cada um com 1 um de diâmetro (veja Figura 4.6B). Com a entra-
da do espermatozóide, esses grânulos se fundem com a membrana plasmática do
óvulo, liberando seu conteúdo para o espaço entre a membrana e a esteira fibrosa
das proteínas do envoltório vitelínico. Há várias proteínas associadas com esse
processo de exocitose de grânulos corticais. As primeiras são proteases. Essas
enzimas dissolvem os postos vitelínicos que conectam as proteínas do envoltório
vitelínico à membrana celular, secionando o receptor de bindina e todo espermato-
zóide a ele ligado (Vacquier et al., 1973; Glabe e Vacquier, 1978). Outras proteínas,
mucopolissacarídeos liberados dos grânulos, produzem um gradiente osmótico
que permite a entrada da água no espaço entre a membrana celular e o envoltório
e, dessa forma, o envoltório vitelínico se expande e passa a ser chamado de
envoltório de fertilização (Figuras 4.23 e 4.24). Uma terceira proteína, produto dos
grânulos corticais, uma peroxidase, enrijece o envoltório de fertilização através de
ligações cruzadas entre resíduos de tirosina em proteínas adjacentes (Foerder e
Shapiro, 1977; Mozingo e Chandler, 1991). Como mostra a Figura 4.23, o envoltório
de fertilização começa a se formar no local da entrada do espermatozóide e conti-
nua sua expansão ao redor do óvulo. À medida que esse envoltório se forma, os
espermatozóides são liberados. O processo se inicia cerca de 20 segundos após a
fixação do espermatozóide e se completa ao fim do primeiro minuto da fertilização.
Finalmente, uma quarta proteína granular, a hialina, forma uma capa em volta do
óvulo (Hylander e Summers, 1982). A célula estende microvilosidades alongadas
cujas extremidades se ligam a essa camada hialina, que fornece apoio para os
blastômeros durante a clivagem.
Em mamíferos, a reação granular não cria um envoltório de fertilização, porém, o
efeito é o mesmo. Enzimas liberadas modificam os receptores de espermatozóide da
Figura 4.23 (A) (B)

Formação do envoltório de fertilização e remo-
ção do excesso de espermatozóide. Espermato-
zóide foi adicionado a óvulos de ouriço-do-mar,
e a suspensão foi fixada em formaldeído para
evitar futuras reações. (A) Dez segundos após
a adição de espermatozóide, esses foram vistos
rodeando o óvulo. (B,C) 25 e 35 segundos após
a inseminação, um envoltório de fertilização se
forma em volta do óvulo, iniciado no ponto de
entrada do espermatozóide. (D) O envoltório
de fertilização está completo, e o excesso de
espermatozóide é removido. (de Vacquier e
Payne, 1973, cortesia de V. D. Vacquier.)
(C) (D)
zona pelúcida de maneira que esses não mais podem ligar-se a espermatozóide (Bleil
e Wassarman, 1980). Essa modificação é chamada reação da zona. Durante essa
reação, tanto ZP3 como ZP2 são modificadas. Florman e Wassarman (1985), propu-
seram que os grânulos corticais do óvulo do camundongo contêm uma enzima que
corta os resíduos terminais de açúcares de ZP3, com isso liberando espermatozóide
ligado à zona e evitando a fixação de mais espermatozóide. Esses grânulos corticais
contêm N-acetilglicosaminidases capazes de clivar N-acetilglicosamina de cadeias
de carboidrato de ZP3. Miller e colaboradores (1992, 1993) demonstraram que após
a fertilização, o resíduo de N-acetilglicosamina é removido, ZP3 não serve como
substrato para a ligação de galactosiltransferase. ZP2 é cortada pelas proteases
granulares perdendo também sua habilidade de ligar espermatozóide (Moller e Was-
sarman, 1989). Assim, o espermatozóide não pode mais iniciar ou manter sua ligação
à zona pelúcida e é rapidamente descartado.
CÁLCIO COMO O INICIADOR DA REAÇÃO GRANULAR CORTICAL . O meca-

nismo da reação dos grânulos corticais é semelhante aquele da reação acrossômica.
Após a fertilização, a concentração intracelular de cálcio do ovo aumenta muito.
Nessas concentrações, as membranas corticais se fundem com aquelas do ovo,
causando exocitose de seu conteúdo (veja Figura 4.24). Após a fusão dos grânulos
corticais ao redor do ponto de entrada do espermatozóide, uma onda de exocitose se
propaga ao redor do corte até o lado oposto do ovo.
A liberação de cálcio armazenado na região intracelular, pode ser monitorada visu-
almente pelo uso de corantes luminescentes (isolados da água-viva luminescente)
como a aequorina ativado pelo cálcio, ou de corantes como fura-2. Esses corantes
emitem luz quando ligam íons livres de cálcio. Os óvulos são injetados com o corante
e fecundados. A Prancha 12 mostra a notável onda de liberação de cálcio que se
propaga através do óvulo do ouriço-do-mar; começando no ponto de entrada do
(i) Membrana plasmática Figura 4.24

Envoltório do óvulo Microvilosidade Exocitose de grânulos corticais. (A) Diagrama
vitelínico esquemático mostrando os eventos levando à
formação do envoltório de fertilização e a ca-
mada hialina. À medida que os grânulos
corticais sofrem exocitose, liberam proteases
que cortam as proteínas que ligam o envoltório
vitelínico à membrana celular. Mucopolissa-
Grânulo carídeos liberados pelos grânulos formam um
cortical
(B) gradiente osmótico, causando a entrada de água
Espermatozóide
supranumerário no e tumefação do espaço entre o envoltório
(ii)
envoltório vitelínico vitelínico e a membrana celular. Outras enzimas
liberadas dos grânulos corticais endurecem o
envoltório vitelínico (agora o envoltório de fer-
tilização) e liberam espermatozóide a ele liga-
do. (B,C) Micrografias eletrônicas de trans-
missão e de varredura do córtex de um ovo não
fertilizado de ouriço-do-mar. (D, E) Microgra-
Enzimas proteolíticas e fias eletrônicas de transmissão e varredura da
mucopolissacarídeos são liberados (C) mesma região de um ovo recém-fertilizado,
(iii) mostrando a elevação do envoltório de fertili-
zação e os pontos nos quais os grânulos
corticais fundiram com a membrana plasmáti-
ca do ovo (flechas em D). (A segundo Austin,
1965; B-E de Chandler e Heuser, 1979, corte-
sia de D. E. Chandler.)
Microfilamentos
Hialina
(iv) Envoltório de (D)
fertilização
Espermatozóide é liberado
Membrana
Camada hialina celular
(A) (E)
espermatozóide um feixe de luz atravessa a célula (Steinhardt et al., 1977; Gilkey et al.,
1978; Hafner et al., 1988). Como documentado pelas fotografias, os íons de cálcio não
se difundem simplesmente através do óvulo a partir do ponto da entrada do esperma-
tozóide. Ao contrário, a liberação de cálcio inicia-se de um lado da célula e termina do
outro. O mecanismo dessa onda será discutido logo adiante (veja Informações adici-
onais & Especulações, página 147). A total liberação de íons de cálcio é completada, a
grosso modo, em 30 segundos no ovo do ouriço-do-mar; os íons livres de cálcio são
re-seqüestrados pouco após sua liberação. Quando dois espermatozóides entram no
citoplasma do óvulo, a liberação de cálcio pode ser vista começando em dois pontos
separados da superfície celular (Hafner et al., 1988).
Vários experimentos demonstraram que íons de cálcio são responsáveis diretos
pela propagação da reação cortical e que são armazenados dentro do próprio óvulo.
A droga A23187 é um ionóforo que transporta íons de cálcio através de membranas,
permitindo a esses cátions atravessar barreiras antes impermeáveis. A colocação de
ovos não-fertilizados de ouriço-do-mar em água do mar contendo A23187, leva à

reação granular cortical e à elevação do envoltório de fertilização, mesmo na ausên-
cia de íons de cálcio na água do mar. Portanto, A23187 provoca a liberação de íons
de cálcio já seqüestrados em organelas dentro do óvulo (Chambers et al., 1974;
Steinhardt e Epel, 1974). Estudos posteriores (Hollinger e Schuetz, 1976; Fulton e
Whittingham, 1978; Hamaguchi e Hiramoto, 1981; Kline, 1988) mostraram que o íon
de cálcio inicia reações granulares corticais quando injetado em ovos de ouriço-do-
mar, camundongo e rã.
Os íons de cálcio internos são armazenados no retículo endoplasmático do
óvulo (Eisen e Reynolds, 1985; Terasaki e Sardet, 1991). No ouriço-do-mar e na rã,
cujos óvulos sofrem uma reação granular cortical, esse retículo é pronunciado no
córtex e rodeia os grânulos (Figura 4.25; Gardiner e Grey, 1983; Luttmer e Longo,
1985). Na rã Xenopus, o retículo endoplasmático cortical fica 10 vezes mais abun-
dante durante o amadurecimento do óvulo e desaparece localmente dentro de um
minuto após a ocorrência da onda de exocitose em qualquer região do córtex. Jaffe
(1983) compara esse retículo endoplasmático seqüestrador de cálcio, ao retículo
sarcoplasmático do músculo esquelético ou cardíaco. Uma vez iniciada, a libera-
ção de cálcio é autopropagada. Cálcio livre é capaz de liberar cálcio seqüestrado
de seus locais de armazenamento, causando assim uma onda libertadora do íon
cálcio e exocitose granular cortical.
Variações em estratégias preventivas da polispermia existem em toda a nature-
za. Nos mamíferos, a polispermia é minimizada pelo pequeno número de esperma-
tozóides que atingem o local da fecundação (Braden e Austin, 1954). O bloqueio à
polispermia em hamsters parece ser controlado somente pela liberação de sítios
que ligam o espermatozóide na zona pelúcida (Miyazaki e Igusa, 1981; Jaffe e
Gould, 1985). Coelhos, no entanto, se apoiam num bloqueio da polispermia a nível
da membrana, e ninguém iria disputar o seu grau de sucesso. Finalmente, certos
mamíferos têm defesas para a polispermia sobre as quais pouco sabemos. Nos
óvulos ricos em gema de certas aves, répteis e salamandras, vários espermatozói-
des realmente penetram o citoplasma do óvulo. De uma maneira desconhecida,
todos menos um são induzidos a se desintegrar no citoplasma após a fusão do
pronúcleo do óvulo com um dos pronúcleos do espermatozóide (Ginzburg, 1985;
Elinson, 1986). Qualquer que seja o mecanismo, somente um núcleo haplóide de
espermatozóide pode fundir-se com o núcleo haplóide do óvulo.
Figura 4.25
Retículo endoplasmático rodeando grânu-
lo cortical no óvulo de ouriço-do-mar. (A)
O retículo foi corado com ósmio-iodeto de
zinco para permitir a visualização por mi-
crografia de transmissão eletrônica. O grâ-
nulo é visto rodeado pelo retículo. (B) Re-
trato de um óvulo inteiro corado por anti-
corpos fluorescentes para os canais de li-
beração de cálcio. Os anticorpos mostram
esses canais no retículo endoplasmático
cortical. (A de Luttmer e Longo, 1985, cor-
tesia de S. Luttmer; B de McPherson et
al., 1992, cortesia de F. J. Longo.) (A) (B)
& Especulações
A Ativação do Metabolismo dos Gametas

S e a liberação do íon cálcio é neces-
sária para ativação do oócito, como
o espermatozóide motiva essa libe-
ração? Realmente não se sabe. Como se
toda célula, começando no ponto da en-
trada do espermatozóide; os grânulos
corticais se fundem com a membrana
celular na presença de concentrações
nio das células. O resultado disso é a ele-
vação de cálcio e do pH intracelulares.
O outro segundo mensageiro, DAG,
é considerado ativar a proteína quinase
pronunciou um investigador (Berridge, altas de cálcio, respondem com uma C (PKC) da membrana, que é transferida
1993): “Exatamente como o espermatozói- onda de exocitose que segue os íons do citosol para a membrana plasmática
de dispara o processo explosivo da libe- de cálcio. do ovo pouco após a fecundação, e pode
ração do cálcio no óvulo, ainda permane- IP 3 é também capaz de liberar íons ser responsável pela ativação da proteí-
ce algo misterioso”. Dados recentes su- de cálcio em óvulos de vertebrados, e o na que troca íons de sódio por íons de
gerem que produção do inositol 1,4,5, tri- bloqueio do seu receptor em óvulos de hidrogênio (Swann e Whitaker, 1986;
fosfato (IP3) é o evento primário para a hamster impede a liberação de cálcio no Nishizuka, 1986; Shen e Burgart, 1986;
liberação de íons cálcio do seu local de ato da fertilização. Como em ouriço-do- Olds et al., 1995). O bloqueio da PKC em
armazenamento intracelular. mar IP3 também parece mediar a libera- óvulos de ouriços-do-mar inibe a alcali-
IP3 injetado pode liberar íons cálcio ção de cálcio de sítios no retículo en- nização do citosol observada durante a
seqüestrados no óvulo e muitos outros doplasmático (Lechleiter e Clapham, fertilização normal (Shen e Buck, 1990).
tipos de células (Swann e Whitaker, 1992; Miyazaki et al., 1992; Ayabe et al., A proteína que faz a troca Na + /H+, tam-
1986; Berridge, 1993); o aumento na con- 1995). Xu e colaboradores (1994) mos- bém necessita de íons cálcio para sua
centração de IP 3 intracelular é visto traram que o bloqueio da mediação por atividade. Assim, tanto DAG como IP 3
ocorrer dentro de 10 segundos após a IP3 da saída de cálcio, impede todos os estão envolvidos nas ativação do óvu-
fecundação de ovos do ouriço-do-mar aspectos da ativação do óvulo pelo es- lo. A etapa regulatória chave é a ativa-
(Ciapa e Whitaker, 1986). A libertação permatozóide incluindo exocitose gra- ção da fosfolipase C, que produz esses
de íons cálcio e a reação dos grânulos nular, recrutamento de mRNA e recome- dois compostos. Jaffe e seus colabora-
corticais rapidamente seguem a forma- ço do ciclo celular. dores encontraram a proteína G em óvu-
ção ou injeção de IP3 (Whitaker e Irvine, A questão então é: o que inicia a pro- los de ouriço-do-mar e rã; e quando in-
1984; Busa et al., 1985). Os efeitos me- dução de IP3? Há dois caminhos que pa- jetaram ativadores da proteína G nes-
diados por IP3 podem ser abortados pela recem estimular a liberação de cálcio: aque- ses óvulos, causaram exocitose granu-
pré-injeção de agentes quelantes de le do receptor ligado à proteína G, larga- lar na ausência de espermatozóide
cálcio no óvulo (Turner et al., 1986), mente conhecido como liberadora de íons (Turner et al., 1986; Kline et al., 1991).
confirmando que IP3 estimula a libera- de cálcio na contração muscular, cresci- Tal ativação foi inibida por quelantes
ção de cálcio armazenado. mento celular, secreção hormonal, percep- de cálcio, como o EGTA. [fert8.html]
Canais de cálcio respondendo ao IP3 ção sensorial e liberação de neurotrans- Parece, portanto, que uma proteína
foram encontrados no retículo endo- missores (Berridge, 1993). O outro cami- G pode estar envolvida na regulação de
plasmático do óvulo. O IP3 formado no nho é o do receptor da tirosinoquinase íons seqüestrados de cálcio, e na exoci-
local da entrada do espermatozóide é em cascata, que também é usado na proli- tose de grânulos corticais. Existem vári-
considerado ligar-se a esses receptores feração e diferenciação celular. Conforme as maneiras pelas quais isso pode acon-
de IP3 no retículo endoplasmático, oca- apresentado no Capítulo 3, o primeiro ca- tecer. Em primeiro lugar, a ligação do es-
sionando uma liberação local de cálcio minho se inicia pela ligação de um ligante permatozóide a um receptor na membra-
(Ferris et al., 1989; Furuichi et al., 1989; extracelular (como a acetilcolina ou a na celular do óvulo pode mudar a sua
Terasaki e Sardet, 1991). Uma vez libera- serotonina) à uma proteína receptora conformação de modo a ativar a proteí-
dos, os íons de cálcio podem difundir transmembrana. No interior da membrana na G e iniciar a cascata (Figura 4.26A),
diretamente, ou facilitar a liberação de plasmática esse receptor é ligado à prote- conforme demonstrado por Kline e co-
mais íons de cálcio de receptores sensí- ína trimérica G. Esse receptor ativa a pro- laboradores (1988, 1991). Eles levanta-
veis ao cálcio localizados no retículo en- teína G (veja Figuras 3.33 e 3.35), levando ram a hipótese que se essa proteína
doplasmático (McPherson et al., 1992). à sua dissociação em subunidades, capa- mediar a fertilização por ser ativada por
A ligação de íons de cálcio a esses re- zes de ativar um conjunto de enzimas cha- um receptor ligante de espermatozóide,
ceptores libera mais cálcio, e esse pode madas de fosfolipase C. Essa cataliza a então a mesma proteína G poderia ser
continuar a onda, ligando-se a mais re- hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato ativada por um neurotransmissor se o
ceptores e assim por diante. Mohri e co- (PIP2) em dois segundos mensageiros: ovo contiver um receptor para neuro-
laboradores (1995) mostraram que o cál- inositol 1,4,5 trifosfato (IP3) e diacilglicerol transmissor capaz de ativar a proteína
cio liberado por IP3 é necessário e sufi- (DAG). O primeiro é capaz de abrir canais G. Eles injetaram mRNA para o receptor
ciente para liberação de cálcio. Essa de cálcio. DAG estimula a troca de prótons de serotonina ou de acetilcolina em óvu-
onda de íons de cálcio é propagada por que permite o efluxo de íons de hidrogê- los de rã. Esses receptores da superfície
celular foram sintetizados e foram de- Entretanto, a cascata ligada à proteí- PDGF) foi injetado em oócitos de estre-
tectados na membrana celular do óvu- na-G não é o único caminho capaz de ge- la-do-mar, o receptor PDGF foi sintetiza-
lo. Os óvulos puderam ser “fertilizados” rar IP3 (veja Capítulo 3). Evidências re- do e incorporado nas membranas celula-
por serotonina e acetilcolina e foi ob- centes (Moore et al., 1994; Shilling et al., res desse organismo. Quando, após a
servado a reação cortical. Experimentos 1994; Yim et al., 1994) demonstram que a maturação dos oócitos, PDGF foi adicio-
semelhantes mostraram que quando ativação do receptor da tirosinoquinase nado à água banhando os óvulos, esses
neurotransmissores ativam o caminho também produz IP3 e ativa a onda de cál- apresentaram aumento de cálcio intrace-
da proteína G–IP3 em oócitos de camun- cio e a reação granular cortical (Figura lular livre, exocitose de grânulos corticais
dongo, são induzidos os eventos da fer- 4.26b). Quando o mRNA para o receptor e síntese de DNA. Alguns se desenvol-
tilização (Williams et al., 1992; Moore et dessa quinase (o receptor para o fator de veram em larvas. Quando o mRNA con-
al., 1993). crescimento derivado das plaquetas, tinha um ponto de mutação que impedia
Figura 4.26
Mecanismos possíveis da ativação do óvulo. (A) Trajetória do fosfatidilinositol medi-
ado pela G-proteína. (B) Trajetória do receptor da tirosinoquinase (RTK). (C) Trajetó-
ria da tirosinoquinase citoplasmática. (D) Trajetória na qual a G proteína ou
tirosinoquinase ativadas na membrana espermática ativam trajetórias no óvulo. (E)
Trajetórias de ativadores solúveis.
CAMINHOS ANTERIORES À FUSÃO DO ESPERMATOZÓIDE
(A) (B) (C)

Espermatozóide
Fosfolipase C (PLC)
Receptor
G-proteína
Receptor de Tirosinoquinase
Tirosinoquinase
Receptor de IP3
Retículo endoplasmático
APÓS A FUSÃO DO ESPERMATOZÓIDE

(D)
Fator solúvel Fatores solúveis

do óvulo do Espermatozóide
G-proteína
Receptor de IP3
Retículo endoplasmático
o receptor interagir com a fosfolipase C, Outra possibilidade é que a ativa- gura 4.26 D, a bindina meramente liga o
nenhuma dessas reações ocorreu (Shilling ção do caminho do IP3 não é devida à óvulo ou, talvez, motive a fosforilação
et al., 1994). Assim, tanto o caminho liga- ligação do espermatozóide e óvulo, mas de proteínas necessárias em fases mais
do ao receptor proteína-G como aquele à fusão das membranas do óvulo e do avançadas do desenvolvimento.)
do receptor da tirosinoquinase, parecem espermatozóide. Mc Culloch e Chambers Ainda outra possibilidade é que o
ser capazes de ativar essa fosfolipase, (1992) obtiveram evidência eletrofisio- agente ativo na liberação de cálcio ligado
criar IP3 e induzir o fluxo de cálcio no lógica que a ativação dos óvulos do venha do citosol do espermatozóide.
óvulo. O receptor da bindina não ofere- ouriço-do-mar não ocorre até depois da Parrington e colaboradores (1996) isola-
ce pistas para explicar como ocorre essa junção do espermatozóide com o óvulo. ram uma proteína de 33-kDA, chamada
ativação, por não ter semelhante em ou- Eles sugerem que os componentes oscilina, localizada no escasso citoplas-
tras proteínas transmembrana. No entan- ativadores do óvulo se localizam na ma da cabeça do espermatozóide (Figura
to, 5 segundos após ligar a bindina, fica membrana ou no citoplasma do esper- 4.26 E). A microinjeção dessa proteína em
fosforilado em um dos seus resíduos matozóide. É até mesmo possível que óvulos de camundongo pode iniciar libe-
tirosina citoplasmáticos (Abassi e Foltz, por ocasião da fusão das membranas, ração de cálcio, porém, os outros parâme-
1994). Isso sugere que o receptor de as proteínas G da membrana espermáti- tros da ativação do óvulo (exocitose dos
bindina ligado, pode interagir com a ca ou as tirosinoquinases (ativadas pela grânulos, recrutamento de mRNA e reto-
tirosinoquinase plasmática tal como geléia do óvulo para iniciar a reação a- mada do ciclo celular) não são observa-
aqueles que medeiam a liberação de cál- crossômica) ativem a cascata polifosfo- dos. Não é conhecido qual o papel que
cio durante a ativação de células T (Fi- inositídica para liberação de cálcio do essa proteína pode ter na fisiologia da ati-
gura 4.26 C; Hall et al., 1993). óvulo. (No cenário apresentado na Fi- vação do óvulo.
Ativação do metabolismo do óvulo

Embora a fertilização seja freqüentemente descrita como mero meio de junção de dois
núcleos haplóides, ela tem um papel igualmente importante na iniciação de processos
que iniciam o desenvolvimento. Esses eventos acontecem no citoplasma e ocorrem
sem o envolvimento dos núcleos.*
O óvulo do ouriço-do-mar maduro é uma célula metabolicamente lenta, reativada
pelo espermatozóide. Essa ativação é apenas o estímulo; aciona um conjunto de
eventos metabólicos pré-programados. As respostas do óvulo ao espermatozóide
podem ser divididas em “precoces” que ocorrem em poucos segundos após a
reação cortical e “tardias” que acontecem vários minutos após o inicio da fertiliza-
ção (Tabela 4.1).
Respostas precoces
O contato entre o espermatozóide do ouriço-do-mar ativa dois principais bloqueios à
polispermia: o bloqueio rápido, iniciado pelo influxo de sódio na célula, e o bloqueio
lento, iniciado pela liberação intracelular de íons de cálcio. A ativação de todos os
óvulos parece depender do aumento da concentração de íons livres de cálcio dentro
do óvulo. Em protostomatas, como lesmas e vermes, ao menos parte do cálcio geral-
mente entra no óvulo vindo de fora. Em deuterostomatas, tais como: peixes, rãs,
ouriços-do-mar e mamíferos, a ativação é acompanhada pela liberação de íons de
cálcio do retículo endoplasmático, resultando na onda de cálcio varrendo o óvulo
(Jaffe, 1983; Terasaki e Sardet, 1991).
*Em certas salamandras, essa função desenvolvimental da fertilização está totalmente divor-
ciada da função genética. A salamandra prateada (Ambystoma platineum) é uma espécie híbrida
que consiste somente de fêmeas. Cada uma produz um ovo com um número não-reduzido de
cromossomos. Esse ovo, porém, não pode se desenvolver sozinho; assim, a salamandra prateada
copula com o macho da salamandra Jefferson (A. jeffersonianum). O espermatozóide desse macho
somente estimula o desenvolvimento do ovo; não contribui com material genético (Uzzell,
1964). Para detalhes desse complexo mecanismo de procriação veja Bogart et al., 1989.
Tabela 4.1 Eventos da fertilização do ouriço-do-mar

Tempo apro ximado
aproximado
Evento após a inseminaçãoa
Ligação espermatozóide-óvulo O segundos

Elevação do potencial de fertilização (bloqueio rápido da polispermia) dentro de 1 sec
Fusão das membranas espermatozóide-óvulo dentro de 6 sec
Primeira detecção de aumento de cálcio 6 sec
Exocitose das vesículas corticais (bloqueio lento da polispermia) 15-60 sec
Ativação da NAD quinase começa em 1 min
Aumento de NADH e NADPH começa em 1 min
Aumento do consumo de O2 começa em 1 min
Entrada do espermatozóide 1-2 min
Efluxo de ácido 1-5 min
Aumento de pH (permanece alto) 1- 5 min
Descondensação da cromatina do espermatozóide 2-12 min
Migração do núcleo do espermatozóide para o centro do óvulo 2-12 min
Migração do núcleo do óvulo para o núcleo do espermatozóide 5-10 min
Ativação da síntese protéica começa em 5-10 min
Ativação do transporte de aminoácidos começa em 5-10 min
Iniciação da síntese de DNA 20-40 min
Mitose 60-80 min
Primeira clivagem 85- 95 min
Principais fontes: Whitaker e Steinhardt, 1985; Mohri et al., 1995.

a
Tempos aproximados baseados em dados de S. purpuratus (15-17oC), L. pictus (16-18oC), A .
punctulata (18-20oC) e L. variegatus (22-24oC). A contagem de tempo para os eventos dentro do
primeiro minuto é melhor conhecida para Lytechinius variegatus, assim os tempos apresentados
referem-se à essa espécie.
Essa liberação de cálcio é essencial para a ativação do desenvolvimento do embrião.

Se o quelante de cálcio EGTA for injetado no óvulo do ouriço-do-mar, não ocorre exoci-
tose dos grânulos corticais, mudança do potencial da fertilização, descondensação do
espermatozóide, nem reinício da divisão celular (Kline, 1988). Reciprocamente, óvulos
podem ser ativados artificialmente na ausência de espermatozóide por procedimentos
que liberam cálcio livre no oócito. Steinhardt e Epel (1974) acharam que quantidades
micromolares do ionóforo A23187 induzem no óvulo a maioria das respostas caracterís-
ticas de um ovo fertilizado normalmente. A elevação do envoltório de fertilização, o
aumento do pH intracelular, o surto de utilização de oxigênio e o aumento da síntese de
proteína e DNA são todos gerados com sua seqüência própria. Essa ativação acontece
na ausência total de íons de cálcio na água do mar. Na maioria desses casos, o desenvol-
vimento cessa antes da primeira mitose porque os ovos ainda são haplóides e desprovi-
dos do centríolo espermático necessário para a divisão.
Essa liberação de cálcio ativa uma série de reações metabólicas (Figura 4.27). Uma
delas é a ativação da enzima NAD+ quinase, que converte o NAD+ em NADP+ (Epel et
al., 1981). Essa mudança pode ter importantes conseqüências para o metabolismo
lipídico, pois NADP+ (mas não o NAD+) pode ser utilizado como coenzima para
biossíntese lipídica. Assim, a mudança de NAD+ em NADP+ pode ser importante na
construção de novas membranas exigidas durante a clivagem. Outro efeito dessa
mudança se refere ao consumo de oxigênio. Um surto de redução de oxigênio é visto
ocorrer durante a fertilização, e muito desse “surto respiratório” é usado para cruza-
mento ligado da membrana de fertilização. A enzima responsável por essa redução do
oxigênio (para água oxigenada) também é dependente de NADPH (Heinecke e Shapiro,
1989). Por último, o NADPH ajuda na regeneração da glutationa e de ovotiois (ovothiols)
que podem ser cruciais para remoção de radicais livres que poderiam de outra maneira
prejudicar o DNA do ovo e do embrião precoce (Mead e Epel, 1995).
Alteração do potencial Bloqueio rápido

Influxo de Na+ da membrana da polispermia
Ativação da Conversão de
NAD+ quinase NAD+ em NADP+
Ligação e/ou fusão de Bloqueio lento

espermatozóide à da polispermia
Liberação Exocitose
membrana celular do óvulo Produção
de Ca2+ de grânulos
de IP3
corticais Formação da
Estimulação de camada hialina
Ativação de
proteína G ou
fosfolipase C
de tirosinoquinase?
Estimulação de síntese
Produção de Ativação de protéica, replicação de
diacil-glicerol proteíno-quinase C DNA, e movimentos
citoplasmáticos de
material morfogenético
Troca Aumento do pH
Figura 4.27 Na+/H+ intracelular
Modelo de um possível mecanismo de ativa-
ção do óvulo do ouriço-do-mar. (Segundo Epel,
1980 e L. A. Jaffe, comunicação pessoal.)
Respostas tardias
Pouco tempo após o aumento dos níveis de íons cálcio, o pH intracelular também
aumenta. Acredita-se que essas duas condições iônicas (> [Ca2+], < [H+] ajam em
conjunto para fornecer o espectro completo dos eventos da fertilização, incluindo a
síntese de proteínas e de DNA (Winkler et al., 1980; Whitaker e Steinhardt, 1982). O
aumento do pH intracelular começa com o segundo influxo de íons de sódio, causan-
do uma troca 1:1 entre íons de sódio da água do mar e os íons hidrogênio do óvulo*.
Essa perda de hidrogênio faz o pH elevar-se de 6.8 a 7.2, ocasionando enormes mudan-
ças na fisiologia do ovo (Shen e Steinhardt, 1978).
As respostas tardias da fertilização produzidas por essas alterações iônicas, inclu-
em a ativação da síntese de DNA e da proteína. O surto de síntese de proteína ocorre
vários minutos após a entrada do espermatozóide e não depende da síntese de novo
RNA mensageiro (Figura 4.28). Em seu lugar, a síntese de proteína nova utiliza mRNAs
já presentes no citoplasma do oócito (muito mais sobre isso será mencionado no
Capítulo 12). Esses RNAs incluem aqueles que codificam proteínas como histonas,
tubulinas, actinas e fatores morfogenéticos que são utilizados durante o desenvolvi-
mento precoce. Tal surto de síntese protéica pode ser induzido pelo aumento artificial
do pH citoplasmático por íons amônio (Winkler et al., 1980). Reciprocamente, agentes
que bloqueiam o aumento do pH inibem eventos da fertilização tardia como a síntese
de DNA e proteína. Quando ovos recém-fertilizados são colocados em soluções con-
tendo baixas concentrações de íons de sódio e amiloride (uma droga que inibe a troca
Na+/H+), a síntese protéica falha, os movimentos dos pronúcleos do óvulo e do esper-
matozóide são prevenidos, e a divisão celular não ocorre (Dube et al., 1985).
*Novamente, a variação espécie-para-espécie está à solta. No óvulo muito menor do camun-

dongo, não há elevação do pH após a fertilização. Similarmente no camundongo, não há um
aumento dramático na síntese protéica imediatamente em seguida à fertilização.
Figura 4.28
proteína/mg proteína (cpm x 10-3)

Surto de síntese protéica na fertilização emprega mRNA armazena-
Incorporação de valina[14C] na
do no citoplasma do oócito. (A) Síntese protéica em óvulos do ouri- água do mar
normal
ço-do-mar Arbacia punctulata fertilizada na presença ou ausência
de actinomicina D, um inibidor da transcrição. Durante as primeiras
horas, a síntese protéica ocorre sem nova transcrição dos núcleos
do zigoto ou embrião. Um segundo surto de síntese protéica ocorre
durante os estágios medianos de blástula, e isso representa tradu-
ção de mensagens recém-transcritas (e, portanto, não é visto em
embriões crescendo em actinomicina). (B) Aumento na porcenta- Água do mar tratada
gem de ribossomos recrutados para polissomos durante as primei- por actinomicina
ras horas do desenvolvimento do ouriço-do-mar, especialmente du-
rante o primeiro ciclo celular. (A segundo Gross et al., 1964; B
segundo Humphreys, 1971.)
Horas após a fertilização
Porcentagem de ribossomos
em polissomos
Tempo de desenvolvimento (horas)
Fusão do material genético

Em ouriços-do-mar, o núcleo do espermatozóide penetra o óvulo perpendicular-
mente à superficie do óvulo. Após a fusão das membranas do espermatozóide e do
óvulo, o núcleo do espermatozóide e seu centríolo se separam das mitocôndrias e
do flagelo. A mitocôndria e o flagelo se desintegram dentro do óvulo; assim,
poucas, se tanto, mitocôndrias derivadas do espermatozóide são encontradas em
organismos em desenvolvimento ou em adultos (Dawid e Blackler, 1972; Giles et
al., 1980). Em camundongos estima-se que 1 em cada 10.000 mitocôndrias são
derivadas do espermatozóide (Gyllensten et al., 1991). Assim, embora cada gameta
contribua para o zigoto com um genoma haplóide, o genoma mitocondrial é trans-
mitido principalmente pelo parente materno. Reciprocamente, em quase todos os
animais estudados (o camundongo sendo a principal exceção), o centrossomo
necessário para a produção do fuso mitótico das divisões subseqüentes é deriva-
do do centríolo espermático (Sluder et al., 1989, 1993).
O núcleo do óvulo sendo haplóide é chamado de pronúcleo feminino. Dentro do
citoplasma do óvulo, o núcleo do espermatozóide descondensa para formar o
pronúcleo masculino. Uma vez dentro do óvulo, o pronúcleo masculino sofre uma
dramática transformação. O envoltório pronuclear forma vesículas com pequenos
pacotes, expondo, com isso, a compacta cromatina do espermatozóide ao citoplas-
ma do óvulo (Longo e Kunkle, 1978). As proteínas que prendem a cromatina no seu
estado condensado, inativa, são trocadas por proteínas derivadas do citoplasma do
óvulo. Essa troca permite a descondensação da cromatina do espermatozóide. Em
ouriços-do-mar, a descondensação parece ser iniciada pela fosforilação de duas
(A) (B)
Pronúcleo do óvulo
Ponte internuclear
Tempo (seg) Pronúcleo do

espermatozóide
Figura 4.29
histonas espermatozóide-específicas, que se ligam fortemente ao DNA. Esse pro- Eventos nucleares na fertilização do ouriço-
do-mar. (A) Migração dos pronúcleos do
cesso começa quando o espermatozóide entra em contato com uma glicoproteína na
óvulo e do espermatozóide em um ovo de
geléia do óvulo que eleva o nível da atividade proteinoquinase cAMP-dependente. Clypeaster japonicus. O pronúcleo do es-
(Tais proteino-quinases cAMP-dependentes foram mencionadas no Capítulo 1.) permatozóide está rodeado por microtúbu-
Essas quinases fosforilam vários resíduos básicos das histonas espermatozóide- los do seu áster. (B) Fusão de pronúcleos no
específicas interferindo, desse modo, com sua ligação ao DNA (Garbers et al., 1980, ovo do ouriço-do-mar. (A de Hamaguchi e
1983; Porter e Vacquier, 1986). Esse afrouxamento é considerado facilitar a substitui- Hiramoto, 1980, cortesia dos autores; B cor-
ção das histonas espermatozóide-específicas por outras histonas que haviam sido tesia de F. J. Longo.)
estocadas no citoplasma do oócito (Poccia et al., 1981; Green e Poccia, 1985). Uma
vez descondensado, o DNA pode iniciar a transcrição e a replicação. [fert9.html]
Depois que o espermatozóide do ouriço-do-mar entra no citoplasma do óvulo, o
pronúcleo masculino gira 180o fazendo com que o centríolo fique entre o pronúcleo do
espermatozóide e o pronúcleo do óvulo. Em seguida, o centríolo espermático age
como um centro organizador de microtúbulos, estendendo seus próprios microtúbu-
los e integrando-os com os microtúbulos do óvulo formando um áster*. Esses
microtúbulos se estendem através de todo o óvulo, contatam o pronúcleo feminino, e
trazem os dois pronúcleos um para perto do outro (Hamaguchi e Hiramoto, 1980;
Bestor e Schatten, 1981). A fusão forma o núcleo zigótico diplóide (Figura 4.19). A
iniciação da síntese de DNA pode ocorrer no estágio pronuclear (durante a migração)
ou depois da formação do núcleo zigótico.
Em mamíferos, o processo da migração pronuclear dura aproximadamente 12
horas, comparado com menos de uma hora no ouriço-do-mar. O espermatozóide do
mamífero entra quase tangencialmente à superfície do óvulo em vez de aproximá-la
perpendicularmente, e funde com numerosas microvilosidades (veja Figura 4.20). O
núcleo do espermatozóide mamífero também se parte quando sua cromatina
descondensa, sendo depois reconstruído por vesículas coalescentes. O DNA do
núcleo espermático é ligado por proteínas básicas chamadas protaminas; essas
proteínas nucleares estão firmemente compactadas através de ligações dissulfeto.
Uma vez no óvulo, a glutationa reduz essas ligações de dissulfeto, permitindo o
desdobramento da cromatina do espermatozóide (Calvin e Bedford, 1971; Kvist et
*Quando Oskar Hertwig observou esse arranjo radial de ásteres de espermatozóide no seu
recém-fertilizado ovo de ouriço-do-mar, chamou-o de “sol dentro do ovo”, e considerou-o feliz
indicação de uma fertilização bem-sucedida (Hertwig, 1877). Mais recentemente, Simerly e
colaboradores (1994) descobriram que certos tipos de infertilidade em homens eram devidos a
defeitos na capacidade do centrossoma formar esses ásteres microtubulares. Essa deficiência
causa a falência da migração pronuclear e a interrupção do desenvolvimento.
(A) (B) (C)
Figura 4.30
Movimento pronuclear em hamster. (A)
Entrada de espermatozóide na célula e al., 1980). O pronúcleo masculino dos mamíferos aumenta enquanto o núcleo do
tumefação do pronúcleo do espermatozói- oócito completa sua segunda divisão meiótica (Figura 4.30 A).
de. (B) Aposição dos pronúcleos do es- O centrossomo que acompanha o pronúcleo masculino produz seus ásteres
permatozóide e do óvulo. (C ) Estágio
(principalmente a partir de proteínas armazenadas no oócito) e contata o pronú-
bicelular mostrando duas células de tama-
nhos iguais com núcleos bem definidos.
cleo feminino. Então, cada pronúcleo migra ao encontro do outro, replicando seu
Entulho no espaço perivitelínico são os cor- DNA ao longo do trajeto. No encontro, os dois envoltórios nucleares se desinte-
pos polares em degeneração. (de Bavister, gram (Figura 4.30B). No entanto, em lugar de produzir um núcleo zigótico comum
1980, cortesia de B. D. Bavister.) (como acontece na fertilização do ouriço-do-mar), a cromatina condensa-se para
formar cromossomos que se orientam num fuso mitótico comum. Assim, um núcleo
zigótico verdadeiro em mamíferos é visto primeiro não no zigoto, mas no estágio
bicelular (Figura 4.30 C). [fert10.html]
& Especulações
A Não-Equivalência dos Pronúcleos de Mamíferos
G
ERALMENTE ASSUME-SE que lizando um óvulo no qual o pronúcleo óvulos se desenvolvam na ausência de
machos e fêmeas portam geno- feminino está ausente. Após penetrar no espermatozóide. A habilidade de desen-
mas haplóides equivalentes. óvulo, os cromossomos do espermato- volver um embrião sem contribuição es-
Um dos princípios fundamentais da ge- zóide se duplicam restaurando seu nú- permática é chamada partenogênese (do
nética Mendeliana é que os genes deri- mero diplóide. Assim, todo o genoma é grego, significando “nascimento vir-
vados do espermatozóide são funcional- derivado do espermatozóide (Jacobs et gem”). Os óvulos de muitos invertebra-
mente equivalentes aqueles derivados al., 1980; Ohama et al., 1981). Aqui ve- dos e de alguns vertebrados são capa-
do óvulo. No entanto, estudos recentes mos uma situação em que as células so- zes de se desenvolver normalmente na
mostram que em mamíferos o genoma de- brevivem, se dividem e têm um número ausência do espermatozóide se o óvulo
rivado do óvulo pode ser funcionalmen- normal de cromossomos, porém, apre- for ativado artificialmente. Nessas situa-
te diferente e ter papel complementar du- sentam um desenvolvimento anormal. Em ções, a contribuição do espermatozóide
rante certos estágios do desenvolvimen- vez de formar um embrião, o ovo se trans- para o desenvolvimento parece dispen-
to. A primeira evidência dessa não-equi- forma numa massa de células placento- sável. Os mamíferos, no entanto, não a-
valência veio de estudos de um tumor símiles. Não há desenvolvimento normal presentam a partenogênese. A colocação
humano chamado mola hidatidiforme. quando o genoma inteiro vem do paren- de oócitos de camundongo em um meio
Esses tumores parecem tecido placentá- te masculino. Evidência para a não-equi- de cultura que artificialmente ativa o
rio. A maioria dessas molas se desenvol- valência dos pronúcleos mamíferos vem oócito, ao mesmo tempo suprimindo a for-
ve de um espermatozóide haplóide ferti- também de tentativas de conseguir que mação do segundo corpo polar, produz
ovos diplóides de camundongo cuja Tabela 4.2 Experimentos de transplantes pronucleares

herança deriva somente do óvulo
(Kaufman et al., 1977). Essas célu- Classe de zigotos Número de transplantes Número de
las se dividem para formar embri- reconstruídos Operação bem-sucedidos sobrevivente
ões com medula espinhal, múscu-
los, esqueleto e órgãos, incluindo Bimaternal 339 0
corações latejantes. Porém, o de-
senvolvimento não continua e no Bipaternal 328 0
dia 10 ou 11 (metade do tempo da
gestação), observam-se profundas
diferenças entre os embriões nor- Controles 348 18
mais e os partenogenéticos, esses
deteriorando e ficando grosseira- Fonte: McGrath e Solter, 1984.
mente desorganizados (Figura
4.31). Nem no homem nem no ca-
mundongo o desenvolvimento
pode ser completado com cromossomos se desenvolvem até o nascimento, ao las somente o alelo de genes derivado
derivados somente do óvulo. passo que alguns ovos controle (con- paternalmente é funcional. (Na maioria
A hipótese que pronúcleos masculi- tendo um pronúcleo masculino e um fe- dos genes, naturalmente, os alelos deri-
nos e femininos são diferentes, também minino de zigotos diferentes) que sofre- vados do macho e da fêmea são equiva-
ganha apoio de experimentos de trans- ram tal transplante se desenvolvem nor- lentes e são ativados no mesmo grau
plante pronuclear (Surani e Barton, 1983; malmente (Tabela 4.20). Ainda mais, os em cada célula. Aqui estamos tratando
Surani et al., 1986; McGrath e Solter, embriões bimaternos ou bipaternos ces- de exceções a essa regra Mendeliana.)
1984). Pronúcleos recém-fertilizados de sam o desenvolvimento ao mesmo tem- Por exemplo, o fator de crescimento in-
machos ou fêmeas podem ser removidos po que camundongos partenogenéticos. sulina-símile II (IGF-II) promove o cres-
e adicionados a outros ovos recém-ferti- Portanto, embora os dois pronúcleos cimento de órgãos embrionários e fetais.
lizados. (Os dois pronúcleos podem ser sejam equivalentes em muitos animais, Em embriões de camundongos, o alelo
diferenciados nesse estágio, porque o fe- nos mamíferos existem importantes dife- de IGF-II derivado paternalmente é ati-
minino fica debaixo dos corpos polares.) renças funcionais entre eles. vo em todo o embrião, ao passo que o
Assim, podem ser construídos zigotos A razão para essas mortes embrio- alelo derivado maternalmente é em ge-
com dois pronúcleos masculinos ou dois nárias é que em algumas células somen- ral inativo (exceto em algumas células
femininos. Embora ocorra a clivagem em- te o alelo de certos genes derivado da neurais). Assim, se um camundongo
brionária, nenhum desse tipos de ovos mãe é ativo, enquanto em outras célu- herda um alelo mutante IGF-II de sua
mãe, irá se desenvolver até o tamanho
normal (já que o alelo derivado mater-
nalmente não é expresso); porém, se o
Figura 4.31 mesmo alelo mutante for herdado do pai,
(A) Embriões controle e (B) partenogenéti-
o camundongo terá crescimento preju-
cos (dois pronúcleos femininos) de camun-
dongos no 11 o dia de gestação. Os camun- dicado (DeChiara et al., 1991). O padrão
dongos estavam se desenvolvendo na mes- oposto de expressão alélica se encon-
ma fêmea. Além de serem menores e em de- tra para um dos receptores de IGF-II.
terioração, os embriões partenogenéticos Aqui, o gene paterno para o receptor é
também tinham placentas muito menores. (de mal transcrito, enquanto o alelo mater-
Surani e Barton, 1983, cortesia dos autores.) no é ativo (Barlow et al., 1991). As dife-
renças entre os alelos ativos e inativos
são consideradas ser causadas por mo-
dificações do DNA que ocorrem de ma-
neira diferente nos núcleos do óvulo e
do espermatozóide (serão discutidos
posteriormente no Capítulo 11). Como
certos genes importantes para o desen-
volvimento somente são ativos quando
provindos do espermatozóide e outros
tais genes só são ativos quando vêm do
óvulo, tanto pronúcleos maternos como
paternos são necessários para o desen-
volvimento completo dos mamíferos.
Rearranjo do citoplasma do óvulo

A fertilização pode iniciar deslocamentos radicais nos materiais citoplasmáticos do
óvulo. Esses rearranjos do citoplasma do oócito são muitas vezes cruciais para a
diferenciação nas etapas seguintes do desenvolvimento. Como veremos nos capí-
tulos 13 e 14, o citoplasma do óvulo freqüentemente contém determinantes
morfogenéticos que ficam segregados em células específicas durante a clivagem.
Esse determinantes, em última análise, conduzem à ativação ou repressão de genes
específicos conferindo, dessa maneira, certas propriedades às células que os incor-
poram. O arranjo espacial correto desses determinantes é crucial para o desenvolvi-
mento adequado.
Em algumas espécies, esse rearranjo na orientação pode ser visualizado pela pre-
sença de grânulos pigmentados citoplasmáticos. Um exemplo é o óvulo do tunicado
Styela partita (Conklin, 1905). O ovo não-fertilizado desse animal está apresentado na
Figura 4.32A. Um citoplasma cinzento central está envolvido por uma camada cortical
contendo inclusões lipídicas amarelas. Durante a meiose, a desintegração nuclear
libera uma substância clara que se acumula no hemisfério animal (superior) do óvulo.
Dentro de 5 minutos após a entrada do espermatozóide, o citoplasma interno claro e o
cortical amarelo migram para o hemisfério vegetal (inferior) do óvulo. Quando o pronú-
cleo masculino migra do pólo vegetal para o equador da célula, ao longo do futuro
lado posterior do embrião, as inclusões lipídicas migram com ele. Essa migração forma
um crescente amarelo, que se estende do pólo vegetal ao equador (Figura 4.32B),
trazendo o citoplasma amarelo para a área onde mais tarde células musculares irão se
formar na larva tunicada. O movimento dessas regiões citoplasmáticas depende de
microtúbulos que são gerados pelo centríolo e por uma onda de íons de cálcio que
Figura 4.32 contraem o citoplasma do pólo animal (Sawada e Schatten, 1989; Speksnijder et al.,
Rearranjo citoplasmático no óvulo do 1990; Roegiers et al., 1995).
tunicado Styela partita. (A) Antes da fer- Movimento citoplasmático também é visto em óvulos de anfíbios. Na rã, um único
tilização, citoplasma cortical amarelo ro-
espermatozóide pode entrar em qualquer lugar do hemisfério animal; quando o faz,
deia citoplasma cinzento, tipo gema. (B)
Após a entrada do espermatozóide, o cito-
altera o padrão citoplasmático do óvulo. Originalmente, o óvulo é radialmente simétri-
plasma cortical amarelo e o citoplasma cla- co em torno do eixo animal-vegetal. Após a entrada do espermatozóide, porém, o
ro derivado da degradação do núcleo do citoplasma cortical (externo) se desloca cerca de 30° relativos ao citoplasma interno,
oócito escorrem vegetativamente em dire- em direção ao ponto de entrada do espermatozóide (Manes e Elinson, 1980; Vincent et
ção ao espermatozóide. (C) À medida que al., 1986). Em algumas rãs (como Rana), uma região do óvulo que antes estava coberta
o pronúcleo do espermatozóide migra para pelo citoplasma cortical escuro do hemisfério animal fica agora exposta (Figura 4.33).
o pólo animal em direção ao pronúcleo do Esse citoplasma subjacente, localizado perto do equador, no lado oposto do ponto de
óvulo, os citoplasmas amarelo e claro os entrada do espermatozóide, contém grânulos pigmentados difusos e, por isso, tem
acompanham. (D) A posição final dos ci-
aparência cinzenta. Essa região tem sido referida como o crescente cinzento (Roux,
toplasmas amarelo e claro, marcam os lo-
cais onde as células dão origem ao mesên-
1987; Ancel e Vintenberger, 1948). Como veremos em capítulos subseqüentes, o cres-
quima e aos músculos, respectivamente. cente cinzento demarca a região onde se iniciará a gastrulação em embriões de anfíbios.
(Segundo Conklin, 1905.)
Pólo animal
Citoplasma Núcleo do Material do
Cortical oócito núcleo do oócito
Citoplasma
amarelo claro
Gema cinzenta
(A) (B) (C) (D)

Cório Pronúcleo do Citoplasma Pronúcleo do Citoplasma Crescente Material
Pólo vegetal espermatozóide amarelo espermatozóide amarelo amarelo da gema
(A) (B)
Ponto de
entrada do
espermatozóide Crescente
cinzento
Córtex
Citoplasma
interno Zona de
deslizamento
Figura 4.33
Reorganização do citoplasma no ovo recém-fertilizado da rã. (A) Corte transversal
esquemático de um ovo na metade do primeiro ciclo de clivagem. O ovo tem simetria
radial em torno do seu eixo animal-vegetal. O espermatozóide entrou por um lado e
seu núcleo está migrando para o interior. O córtex está representado como o de Rana,
com um hemisfério animal altamente pigmentado e um hemisfério vegetal transparen-
te. (B) Quando está aproximadamente em 80% de seu caminho na primeira clivagem,
o citoplasma cortical gira cerca de 30 o em relação ao citoplasma interno. Essa rotação é
importante porque a gastrulação irá começar na região oposta ao ponto de entrada do
espermatozóide onde ocorre o maior deslocamento do citoplasma. (Segundo Gerhart
et al., 1989.)
Em rãs como Xenopus, nas quais não se vê um crescente cinzento, podemos assim
mesmo, observar a rotação do citoplasma cortical em relação à camada interna,
subcortical. Esse movimento foi demonstrado por Vincent e seus colaboradores (1986).
Esses investigadores imprimiram uma grade hexagonal de corante (Azul Nilo) sobre o
citoplasma abaixo do córtex enquanto aplicavam outro tipo de corante (uma lectina
ligada à fluoresceína) à superfície do ovo. Quando o ovo foi mantido em sua posição
por inclusão em gelatina, os pontos de Azul Nilo puderam ser vistos rodar de 30° em
relação às manchas da lectina fluorescente (Figura 4.34). Em ovos normais, não inclu-
sos, a superfície do ovo é considerada girar enquanto o citoplasma subcortical, torna-
do pesado pelas plaquetas de gema, permanece estabilizado por gravidade.
O motor para esses movimentos citoplasmáticos em ovos de anfíbios parece ser
um conjunto de microtúbulos paralelos que ficam entre os citoplasmas interno e cortical
do hemisfério vegetal, na direção da rotação citoplasmática. Os rastros dos
microtúbulos são primeiramente vistos imediatamente antes do começo da rotação, e
desaparecem quando esse movimento cessa (Figura 4.35; Elinson e Rowning, 1988).
Tratamento do ovo com colchicina ou radiação ultravioleta interrompe a formação
desses microtúbulos, com isso parando as rotações citoplasmáticas. Usando anticorpos
ligantes desses microtúbulos, Houliston e Elinson (1991a) acharam que esses rastros
eram formados por microtúbulos derivados do espermatozóide e do óvulo, e que o
centríolo espermático direciona sua polimerização, fazendo com que cresçam para o
interior da região vegetal do ovo. Ao atingir o córtex vegetal, esses microtúbulos se
desviam do ponto de entrada do espermatozóide, em direção ao pólo vegetal. A posi-
ção descentralizada do centríolo espermático quando esse inicia a polimerização
microtubular, proporciona direção à rotação. A força motriz para a rotação é possivel-
mente, fornecida pela ATPase cinesina. Tal como a dineína e a miosina, a cinesina
pode fixar-se às fibras e produzir energia pela hidrólise de ATP. Essa ATPase está
localizada nos microtúbulos vegetais e nas membranas do retículo endoplasmático
cortical (Houliston e Elinson, 1991b).
O movimento do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno causa profunda
movimentação nesse último. Danilchik e Denegre 1991) marcaram plaquetas da gema
(A) (B)
(C) (D)
Figura 4.34
Rotação do citoplasma subcortical relativa ao citoplasma de superfície da célula. (A)
Um ovo recentemente fertilizado foi marcado com uma grade hexagonal de corante
Azul Nilo (que cora os lípidios nas plaquetas de gema). O ovo foi embebido em
gelatina, e as posições originais de alguns dos pontos marcados na superfície celular
com fluoresceína (círculos em A). O ponto de entrada do espermatozóide está marcado
com um S. (B,C) Com o progredir do primeiro ciclo, os pontos do citoplasma
subcortical mudaram de aproximadamente 30 o em relação à superfície externa imobili-
zada do ovo. O local no ovo designando a futura superfície dorsal do embrião está
marcado com um D. (D) Sumário desses movimentos na região vegetal (inferior) do
ovo. (de Vincent et al., 1986, fotografias cortesia de J. C. Gerhart.)
com Azul Nilo e observaram seu movimento por microscopia fluorescente (o corante
ligado emite fluorescência vermelha). Durante a parte intermediária do primeiro ciclo
celular, a massa do citoplasma central do ovo flui do presumível lado ventral (abdome),
para o futuro lado dorsal (posterior) do embrião (Prancha 7). Ao fim da primeira divi-
são, o citoplasma presumivelmente do lado dorsal do embrião, é distintamente diferen-
te daquele do provável lado ventral. O que havia sido um embrião radialmente simétri-
co, é agora um embrião bilateralmente simétrico.
Como veremos nos Capítulos 6 e 15, esses movimentos citoplasmáticos iniciam
uma cascata de eventos que determina o eixo dorso-ventral da rã. Realmente, os
microtúbulos paralelos que permitem esses rearranjos parecem estender-se ao longo
do futuro eixo dorso-ventral (Klag e Ubbels, 1975; Gerhart et al., 1983).
Preparação para a Clivagem

O aumento dos níveis de íons livres de cálcio intracelular também inicia a movimen-
tação de aparelhagem para a divisão celular. O mecanismo iniciador da clivagem
provavelmente difere entre espécies, dependendo do estágio de meiose em que
Figura 4.35
Arranjo paralelo de microtúbulos se esten-
dem ao longo do hemisfério vegetal, ao longo
do futuro eixo dorso-ventral. (A) Arranjo pa-
ralelo de microtúbulos vistos na segunda par-
te do primeiro ciclo celular por anticorpos
fluorescente à tubulina. (B) Antes da rotação
citoplasmática (cerca de metade do ciclo) ne-
nhum arranjo pode ser visto. (C) No término
da rotação do citoplasma, os microtúbulos
despolimerizam. (de Elinson e Rowning,
(B) 1988, cortesia de R. Elinson.)
(A) (C)
ocorre a fecundação. No entanto, em todas as espécies estudadas, o ritmo das

divisões celulares é regulado pela síntese e degradação de ciclina. A ciclina mantém
as células em metáfase, e a sua degradação permite às células voltarem para interfase.
Além de suas outras atividades, os íons de cálcio também parecem iniciar a degrada-
ção da ciclina (Watanabe et al., 1991). Uma vez degradada a ciclina, os ciclos de
divisão celular podem se reiniciar.
A clivagem tem uma relação especial com essas regiões citoplasmáticas. Em embri-
ões tunicados, a primeira clivagem secciona o ovo em imagens duplicadas em um
espelho. Desse estágio em diante, cada divisão em um lado do sulco de clivagem tem
uma imagem em espelho do lado oposto. De maneira semelhante, o crescente cinzento
é seccionado pelo sulco da primeira clivagem em ovos de anfíbios. Assim, a posição
da primeira clivagem não é aleatória, mas tende a ser especificada pelo ponto de
entrada do espermatozóide e a subseqüente rotação do citoplasma do ovo. A coorde-
nação do plano de clivagem e dos rearranjos citoplasmáticos é provavelmente media-
da pelos microtúbulos do áster do espermatozóide (Manes et al., 1978; Gerhart et al.,
1981; Elinson, 1985).
Portanto, perto do fim do primeiro ciclo celular , o citoplasma se rearranja, os
pronúcleos se encontram, o DNA está se replicando e novas proteínas estão sendo
sintetizadas. O palco está preparado para o desenvolvimento de um organismo
multicelular. [fert11.html], [other.html#fert13]
LITERATURA CITADA
Abassi, Y. A. and Foltz, K. R. 1994. Tyrosine Amos, L. A. and Klug, A. 1974. Arrangement Asai, D. J. 1996. Functional and molecular
phosphorylation of the sperm receptor at ferti- of subunits in flagellar microtubules. J. Cell diversity of dynein heavy chains. Semin. Cell
lization. Dev. Biol. 164: 430-443. Sci. 14: 523-549. Dev. Biol. 7: 311-320.
Afzelius, B. A. 1976. A human syndrome caused Ancel, P. and Vintenberger, P. 1948. Re- Austin, C. R. 1952. The “capacitation” of
by immotile cilia. Science 193: 3173-19. cherches sur le determinisme de la mammalian sperm. Nature 170: 326.
symmetrie bilatérale dans l’oeuf des
Almeida, E. A. C. and ten others. 1995. Mouse Austin, C. R. 1960. Capacitation and the
amphibiens. Bull. Biol. Fr. Belg. [Suppl.]
egg integrin a α P β functions as a sperm recep- release of hyaluronidase. J. Reprod. Fert. 1:
31: 1-182.
tor. Cell 81: 1095-1104. 310-311.
Austin, C. R. 1965. Fertilization. PrenticeHall, 1992. A potential fusion peptidle and an integrin Ciapa, B. and Whitaker, M. 1986. Two
Englewood Cliffs, New Jersey. domain in a protein active in spermegg fusion. phases of inositol polyphosphate and
Nature 356: 248-251. diacylglycerol production at fertilization.
Ayabe, T., Kopf, G. S. and Schultz, R. M. 1995. FEBS Lett. 195: 347-351.
Regulation of mouse egg activation: presence Bogart, J. P., Elinson, R. P. and Licht, L. E.
of ryanodine receptors and effects of microin- 1989. Temperature and sperm incorporation in Clermont, Y. and Leblond, C. P. 1955. Spermi-
jected ryanodine and cyclic ADP ribose on polyploid salamanders. Science 246: 1032-1034. ogenesis of man, monkey, and other animals as
uninseminated and inseminated eggs. Develop- shown by the “periodic acidSchiff” technique.
ment 121: 2233-2244. Bookbinder, L. H., Cheng, A., and Bleil, J. D. Am. J. Anat. 96: 229-253.
1995. Tissue- and species-specific expression
Baltz, J. M., Katz, D. F. and Cone, R. A. 1988. of sp56, a mouse sperm fertilization protein. Colwin, A. L. and Colwin, L. H. 1963. Role of
The mechanics of sperm-egg interaction at the Science 269: 86-87. the gamete membranes in fertilization in
zona pellucida. Biophys. J. 54: 643-654. Saccoglossus kowalevskii (Enteropneustra). I.
Boveri, T. 1902. On multipolar mitosis as a means The acrosome reaction and its changes in early
Barlow, D. P., Stöger, R., Herrmann, B. G., Saito, of analysis of the cell nucleus. (Translated by S. stages of fertilization. J. Cell Biol. 19: 477-500.
K. and Schweifer, N. 1991. The mouse insulin- Gluecksohn-Waelsch.) In B. H. Willier and J. M.
like growth factor type-2 receptor is imprinted Oppenheimer (eds.), Foundations of Experimen- Colwin, L. H. and Colwin, A. L. 1960. Formation of
and closely linked to the Time locus. Nature tal Embryology. Hafner, New York, 1974. sperm entry holes in the vitelline membrane of
349: 84-87. Hydroides hexagonis (Annelida) and evidence of their
Boveri, T. 1907. Zellenstudien VI. Die Entwi- lytic origin. J. Biophys. Biochem. Cytol. 7: 315-320.
Bavister, B. D. 1980. Recent progress in the cklung dispermer Seeigeleier. Ein Beiträge zur
study of early events in mammalian fertilizati- Befruchtungslehre und zur Theorie des Kernes. Conklin, E. G. 1905. The orientation and cell-
on. Dev. Growth Differ. 22: 385-402. Jena Z. Naturwiss. 43: 1-292. lineage of the ascidian egg. J. Acad. Nat. Sci.
Phila. 13: 5-119.
Bentley, J. K., Shimomura, H. and Garbers, D. L. Braden, A. W. H. and Austin, C. R. 1954. The
1986. Retention of a functional resact receptor number of sperm about the eggs in mammals Cook, S. P. and Babcock, D. F. 1993. Selective
in isolated sperm plasma membranes. Cell 45: modulation by cGMP of the K+ channel activated
and its significance for normal fertilization. Aust.
281-288. by speract. J. Biol. Chem. 268: 22402-22407.
J. Biol. Sci. 7: 543-551.
Berridge, M. J. 1993. Inositol triphosphate and Corselli, J. and Talbot, P. 1987. In vivo
Burks, D. J., Carballacla, R., Moore, H. D. M.
calcium signalling. Nature 361: 315-325. penetration of hamster oocyte-cumulus com-
and Saling, P. M. 1995. Interaction of a tyrosine
plexes using physiological numbers of sperm.
Bestor, T. M. and Schatten, G. 1981. Antitubulin kinase from human sperm with the zona pellucida
Dev. Biol. 122: 227-242.
immunofluorescence microscopy of microtubu- at fertilization. Science 269: 83-86.
les present during the pronuclear movements of Cross, N. L. and Elinson, R. P. C. 1980. A fast
Busa, W. B., Ferguson, J. E., Joseph, S. K.,
sea urchin fertilization. Dev. Biol. 88: 80-91. block to polyspermy in frogs mediated by
Williamson, J. R. and Nuccitelli, R. 1985. changes in the membrane potential. Dev. Biol.
Bi, G.-Q., Alderton, J.M. and Steinhardt, R.A. 1995. Activation of frog (Xenopus laevis) eggs by 75:187-198.
Calcium-mediated exocytosis is required for cell inositol triphosphate. I. Characterization of Ca2+
membrane resealing. J. Cell Biol. 131:1747-1758. release from intracellular stores. J. Cell Biol. Dan, J. C. 1967. Acrosome reaction and lysins. In
100: 677-682. C. B. Metz and A. Monroy (eds.), Fertilization,
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1980. Vol. 1. Academic Press, New York, pp. 237-367.
Mammalian sperm and egg interaction: Identi- Calvin, H. I. and Bedford, J. M. 1971. Formati-
fication of a glycoprotein in mouseegg zonae on of disulfide bonds in the nucleus and accessory Danilchik, M. V. and Denegre, J. M. 1991. Deep
pellucidae possessing receptor activity for sperm. structures of mammalian spermatozoa during cytoplasmic rearrangements during early deve-
Cell 20: 873-882. maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. lopment in Xenopus laevis, Development Ill:
[Suppl.] 13: 65-75. 845-856.
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1986.
Autoradiographic visualization of the mouse Carroll, E. J. and Epel, D. 1975. Isolation and Davis, B. K. 1981. Timing of fertilization in
egg’s sperm receptor bound to sperm. J. Cell biological activity of the proteases released by mammals: Sperm cholesterol/ phospholipid ratio
Biol. 102:1363-1371. sea urchin eggs following fertilization. Dev. Biol. as determinant of capacitation interval. Proc.
44: 22-32. Nall. Acad. Sci. USA 78: 7560-7564.
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1988.
Galactose at the nonreducing terminus of O- Chambers, E. L., Pressman, B. C. and Rose, B. Dawid, I. B. and Blackler, A. W. 1972. Maternal
1974. The activity of sea urchin eggs by the and cytoplasmic inheritance of mitochondria in
linked oligosaccharides of mouse egg zona
divalent ionophores A23187 and X 537A. Xenopus. Dev. Biol. 29: 152-161.
pellucida glycoprotein ZP3 is essential for the
glycoprotein’s sperm receptor activity. Proc. Biochem. Biophys. Res. Commun. 60: 126-132. DeChiara, T. M., Robertson, E. J. and Efstradiatis,
Natl. Acad. Sci. USA 85: 6778-6782. A. 1991. Parental imprinting of the mouse insulin-
Chandler, D. E. and Heuser, J. 1979. Membrane
fusion during secretion: Cortical granule exocytosis like growth factor II gene. Cell 64: 849-859.
Bleil, J. D. and Wassarman, P. M. 1990. Identi-
fication of a ZP3-binding protein on acrosome- in sea urchin eggs as studied by quick-freezing and De Robertis, E. D. P., Saez, F. A. and De Robertis,
intact mouse sperm by photoaffinity crosslin- freeze fracture. J. Cell Biol. 83: 91-108. E. M. F. 1975. Cell Biology, 6th Ed., Saunders,
king. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5563-5567. Philadelphia.
Chang, M. C. 1951. Fertilizing capacity of
Bleil, J. D., Greve, J. M. and Wassarman, P, M. spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Dube, F., Schmidt, T., Johnson, C. H. and Epel,
1988. Identification of a secondary sperm re- Nature 168: 697-698. D. 1985. The hierarchy of requirements for an
ceptor in the mouse egg zona pellucida: Role in elevated pH during early development of sea
Cherr, G. N., Lambert, H., Meizel, S. and Katz,
maintenance of binding of acrosome-reacted urchin embryos. Cell 40: 657-666.
D. F. 1986. In vitro studies of the golden hamster
sperm to eggs. Dev. Biol. 28: 376-385.
sperm acrosomal reaction: Completion on zona Eisen, A . and Reynolds, G. T. 1985. Sources and
Blobel, C. P, Wolfsberg, T. G., Turck, C. W., pellucida and induction by homologous zonae sinks for the calcium release during fertilization of
Myles, D. G., Primakoff, P. and White, J. M. pellucidae. Dev. Biol. 114:119-131. single sea urchin eggs. J. Cell Biol. 100: 1522-1527.
Eisenbach, M. 1995. Sperm changes enabling Fol, H. 1877. Sur le commencement de I’hémo- Glabe, C. G. 1985. Interaction of the sperm
fertilization in mammals. Curr. Opin. Endocri- génie chez divers animaux. Arch. Zool. Exp. Gén. adhesive protein, bindin, with phospholipid
nol. Diabetes 2: 468-475. 6: 145-169. vesicles. II. Bindin induces the fusion of mixed-
phase vesicles that contain phosphatidylcholine
Elinson, R. P. 1985. Changes in levels of Foltz, K. R., Partin, J. S. and Lennarz, W. J.
and phosphatidylserine in vitro. J. Cell Biol.
polymeric tubulin associated with activation and 1993. Sea urchin egg receptor for sperim:
100: 800-806.
dorsoventral polarization of the frog egg. Dev. Sequence similarity of binding domain to hsp70.
Biol. 109: 224-233. Science 259: 1421-1425. Glabe, C. G. and Lennarz, W. J. 1979. Species-
specific sperm adhesion in sea urchins: A
Elinson, R. P. 1986. Fertilization in amphibians: Franklin, L. E. 1970. Fertilization and the role
quantitative investigation of bindin-mediated egg
The ancestry of the block to polyspermy. Int. of the acrosomal reaction in non-mammals.
agglutination. J. Cell Biol. 83: 595-604.
Rev. Cytol. 101: 59-100. Biol. Reprod. [Suppl.] 2:159-176.
Glabe, C. G. and Vacquier, V. D. 1977. Species-
Elinson, R. P. and Rowning, B. 1988. A transient Fulton, B. P. and Whittingham, D. G. 1978.
specific agglutination of eggs by bindin isolated
array of parallel microtubules in frog eggs: Activation of mammalian oocytes by intracellu-
from sea urchin sperm. Nature 267: 836-838.
Potential tracks for a cytoplasmic rotation that lar injection of calcium. Nature 273: 149-151.
specifies the dorso-ventral axis. Dev. Biol. Glabe, C. G. and Vacquier, V. D. 1978. Egg
Furuichi, T., Yoshikawa, S., Miyawaki, A., Wada,
128:185-197. K., Maeda, N. and Mikoshiba, K. 1989. Primary surface glycoprotein receptor for sea urchin
structure and functional expression of the sperm bindin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Endo, Y. G., Kopf, G. S. and Schultz, R. M.
inositol 1,4,5-trisphosphatebinding protein 75: 881-885.
1987. Effects of phorbol ester on mouse eggs:
Dissociation of sperm receptor activity from P400. Nature 342: 32-38. Gong, X., Dubois, D.H., Miller, D. J., and Shur, B.
acrosome reaction-inducing activity of the Garbers, D. L., Tubb, D. J. and Kopf, G. S. 1980. D. 1995. Activation of a G protein complex by
mouse zona pellucida protein, ZP3. Dev. Biol Regulation of sea urchin sperm cAMP-dependent aggregation of β -1,4-galactosyltransferase on the
123: 574-577 protein kinases by an egg associated factor. Biol. surface of sperm. Science 269: 1718-1721.
Epel, D. 1977. The program of fertilization. Reprod. 22: 526-532. González-Martfnez, M. T., Guerrero, A.,
Sci. Am. 237(5): 128-138. Garbers, D. L., Kopf, G. S., Tubb, D, J, and Olson, Morales, E., de la Torre, L. and Darszon, A.
G. 1983. Elevation of sperm adenosine 3':5'- 1992. A depolarization can trigger Ca2+ uptake
Epel, D. 1980. Fertilization. Endeavour N.S. 4: and the acrosome reaction when preceded by a
26-31. monophosphate concentrations by a fucose
sulfate-rich complex associated with eggs. I. hyperpolarization in L. pictus sea urchin sperm.
Epel, D., Patton, C., Wallace, R. W. and Cheung, Structural characterization. Biol. Reprod. 29: Dev. Biol. 150: 193-202.
W. Y. 1981. Calmodulin activates NAD kinase 1211-1220. Gould, M. and Stephano, J. L. 1987. Electrical
of sea urchin eggs: An early response. Cell 23: response of eggs to acrosomal protein similar to
543-549. Gardiner, D. M. and Grey, R. D. 1983. Membrane
junctions in Xenopus eggs: Their distribution those induced by sperm. Science 235: 1654-1656.
Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S. and suggests a role in calcium regulation. J. Cell Biol. Gould, M. and Stephano, J. L. 1991. Peptides
Snyder, S. H. 1989. Purified inositol 1,4,5- 96: 1159-1163. from sperm acrosomal protein that activate de-
trisphosphate receptor mediates calcium flux in velopment. Dev. Biol. 146: 509-518.
reconstituted lipid vesicles. Nature 342: 87-89. Gerhart, J., Ubbels, G., Black, S., Hara, K. and
Kirschner, M. 1981. A reinvestigation of the Gould-Somero, M., Jaffe, L. A. and Holland, L.
Florman, H. M. 1995. Sequential focal and glo- role of the grey crescent in axis formation in Z. 1979. Electrically mediated fast polyspermy
bal elevations of sperm intracellular Ca2+ are Xenopus laevis. Nature 292: 511-516. block in eggs of the marine worm, Urechis
initiated by the zona pellucida during acrosomal caupo. J. Cell Biol. 82: 426-440.
exocytosis. Dev. Biol. 165: 152-164. Gerhart, J., Black, S., Gimlich, R. and Scharf, S.
1983. Control of polarity in the amphibian egg. Green, G. R. and Poccia, E. L. 1985. Phos-
Florman, H. M. and Storey, B. T. 1982. Mouse In W. R. Jeffery and R. A. Raft (eds.), Time, phorylation of sea urchin sperm H1 and H2B
gamete interactions: The zona pellucida is the Space, and Pattern in Embryonic Development. histories precedes chromatin decondensation
site of the acrosome reaction leading to fertili- Alan R. Liss, New York, pp. 261-286. and H1 exchange during pronuclear formation.
zation in vitro. Dev. Biol. 91:121-130. Dev. Biol. 108: 235-245.
Gerhart, J., Danilchik, M., Doniach, T.,
Florman, H. M. and Wassarman, P. M. 1985. Roberts, S., Rowning, B. and Stewart, R. 1989. Gross, P. R., Malkin, L. I., and Moyer, W. 1964.
O-linked oligosaccharides of mouse egg ZP3 Cortical rotation of the Xenopus egg: Conse- Templates for the first proteins of embryonic
account for its sperm receptor activity. Cell quences for the anterioposterior pattern of development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51:
41: 313-324. embryonic dorsal development. Development 407-414.
1989 [Suppl.]: 37-51.
Florman, H. M., Bechtol, K. B. and Wassarman, Gundersen, G. G., Medill, L. and Shapiro, B. M.
P. M. 1984. Enzymatic dissection of the Giles, R. E., Blanc, H., Cann, H. M. and Wallace, 1986. Sperm surface proteins are incorporated
functions of the mouse egg’s receptor for sperm. D. C. 1980. Maternal inheritance of human into the egg membrane and cytoplasm after fer-
Dev. Biol. 106: 243-255. mitochondrial DNA. Proc. Natl, Acad. Sci. USA tilization. Dev. Biol. 113: 207-217.
77: 6715-6719.
Florman, H, M., Corron, M. E., Kim, T. D. H. Gwatkin, R. B. L. 1976. Fertilization. In G.
and Babcock, D. F. 1992. Activation of voltage- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. G. and Poste and G. L. Nicolson (eds.), The Cell
dependent calcium channels of mammalian Reynolds, G. T. 1978. A free calcium wave Surface in Animal Embryogenesis and
sperm is required for zona pellucida-induced traverses the activating egg of the medaka, Deveopment. Elsevier North-Holland, New
acrosomal exocytosis. Dev. Biol. 152: 304-314. Oryzias latipes. J. Cell Biol. 76: 448-466. York, pp. 1-53.
Foerder, C. A. and Shapiro, B. M. 1977. Release Ginzburg, A. S. 1985. Phylogenetic changes in Gyllensten, U., Wharton, D., Josefson, A.
of ovoperoxiclase from sea urchin eggs hardens the type of fertilization. In J. Mlékovsky and V. and Wilson, A. 1991. Paternal inheritance
fertilization membrane with tyrosine crosslinks. J. A. Novák (eds.), Evolution and Morphogene- of mitochondrial DNA in mice. Nature 352:
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4214-4218. sis. Academia, Prague, pp. 459-466. 255-258.
Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. Jacobs, P. A., Wilson, C. M., Sprenkle, J. A., Kvist, U., Afzelius, B. A. and Nilsson, L. 1980.
B., Kramp, D. and Schatten, G. 1988. Wave of Rosenshein, N. B. and Migeon, B. R. 1980. The intrinsic mechanism of chromatin decon-
free calcium at fertilization in the sea urchin egg Mechanism of origin of complete hydatidiform densation and its activation in human sperma-
visualized with Fura-2. Cell Motil. Cytoskel. 9: moles. Nature 286: 714-716. tozoa. Dev. Growth Differ. 22: 543-554.
271-277.
Jaffe, L. A. 1976. Fast block to polyspermy Langlais, J., Kan, F. W. K., Granger, L.,
Hall, C. G., Sancho, J., and Terhorst, C. 1993. in sea urchins is electrically mediated. Nature Raymond, L., Bleau, G. and Roberts, K. D.
Reconstitution of T cell receptor ζ -mediated 261: 68-71. 1988. Identification of sterol acceptors that
calcium mobilization in nonlymphoid cells. stimulate cholesterol efflux from human
Jaffe, L. A. 1980. Electrical polyspermy block
Science 261: 915-918. spermatozoa during in vitro capacitation.
in sea urchins: Nicotine and low sodium
Gamete Res, 20: 185-201.
Hamaguchi, M. S. and Hiramoto, Y. 1980. Fertili- experiments. Dev. Growth Differ. 22: 503-507.
zation process in the heart-urchin, Clypaester Lechleiter, J. D. and Clapham, D. E. 1992. Molecular
Jaffe, L. A. 1996. Egg membranes during fertili-
japonicus, observed with a differential interferen- mechanisms of intracellular calcium excitability in
zation. In S. G. Schultz et al. (eds.), Molecular
ce microscope. Dev. Growth Differ. 22: 517-530. X. laevis oocytes. Cell 69: 283-294.
Biology of Membrane Transport Disorders.
Hamaguchi, M. S. and Hiramoto, Y. 1981. Plenum, NY, pp. 367-378. Leeuwenhoek, A. van. 1685. Letter to the Royal
Activation of sea urchin eggs by microinjection Society of London. Quoted in E. G. Ruestow,
Jaffe, L. A. and Cross, N. L. 1983. Electrical
of calcium buffers. Exp. Cell Res, 134: 171-179. 1983, Images and ideas: Leeuwenhoek’s
properties of vertebrate oocyte membranes. Biol.
perception of the spermatozoa. J. Hist. Biol.
Hardy, D. M., Harumi, T. and Garbers, D. L. Reprod. 30: 50-54.
16:185-224.
1994. Sea urchin sperm receptors for egg
Jaffe, L. A. and Gould, M. 1985. Polyspermy-
peptides. Sem. Dev. Biol. 5: 217-224. Levine, A. E., Walsh, K. A. and Fodor, E. J. B.
preventing mechanisms. Biol. Fert. 3: 223-250.
1978. Evidence of an acrosin-like enzyme in
Hartsoeker, N. 1694. Essai de dioptrique. Paris.
Jaffe, L. F. 1983. Sources of calcium in egg sea urchin sperm. Dev. Biol. 63: 299-306.
Heinecke, J. W. and Shapiro, B. M. 1989. activation: A review and hypothesis. Dev, Biol.
Leyton, L. and Saling, P. 1989a. 95 kd sperm
Respiratory oxygen burst of fertilization. Proc. 99: 265-276.
proteins bind ZP3 and serve as tyrosine kinase
Natl. Acad. Sci. USA 86: 1259-1263.
Jones, R., Brown, C. R. and Lancaster, R. T. substrates in response to zona binding. Cell 57:
Hertwig, 0. 1877. Beiträge zur Kenntniss der 1988. Carbohydrate-binding properties o boar 1123-1130.
Bildung, Befruchtung, und Theilung des sperm proacrosin and assessment of its role in
Leyton, L. and Saling, P. 1989b. Evidence that
theirischen Eies. Morphol. Jahr. 1: 347-452. sperm-egg recognition and adhesion during fer-
aggregation of mouse sperm receptors by ZP3
tilization. Development 102: 781-792.
Hollinger, T. G. and Schuetz, A. W. 1976. triggers the acrosome reaction. J. Cell Biol. 108:
“Cleavage” and cortical granule breakdown in Just, E. E. 1919. The fertilization reaction in 2163-2168.
Rana pipiens oocytes induced by direct micro- Echinarachinus parma. Biol. Bull. 36: 1-10.
Leyton, L., Leguen, P., Bunch, D. and Saling, P.
injection of calcium. J. Cell Biol. 71: 395-401.
Kaufman, M. H., Barton, S.C. and Surani, M. A. M. 1992. Regulation of mouse gametic interac-
Hong, K. and Vacquier, V. D. 1986. Fusion of H. 1977. Normal postimplantation development tion by a sperm tyrosine kinase. Proc. Natl. Acad.
liposomes induced by a cationic protein from of mouse parthenogenetic embryos to the Sci. USA 93: 1164-1169.
the acrosomal granule of abalone spermatozoa. forelimb bud stage. Nature 265: 53-55.
Longo, F. J. 1986. Surface changes at fertilizati-
Biochemistry 25: 543-549.
Keller, S. H. and Vacquier, V. D. 1994a. Nlinked on: Integration of sea urchin (Arbacia punctu-
Houliston, E. and Elinson, R. P. 1991a. Patterns oligosaccharides of sea urchin egg jelly induces lata) sperm and oocyte plasma membranes. Dev.
of microtubule polymerization relating to the sperm acrosome reaction. Dev. Growth Biol. 116: 143-159.
cortical rotation in Xenopus laevis eggs. Deve- Differ. 36: 551-556.
Longo, F. J. and Kunkle, M. 1978. Transforma-
lopment 112:107-117.
Keller, S. H. and Vacquier, V. D. 1994b. The tion of sperm nuclei upon insemination. In A.
Houliston, E. and Elinson, R. P. 1991b. isolation of acrosome-reaction-inducing A. Moscona and A. Monroy (eds.), Current Topics
Evidence for the involvement of microtubu- glycoproteins from sea urchin egg jelly. Dev. in Developmental Biology, Vol. 12. Academic
les, endoplasmic reticulum, and kinesin in Biol. 162: 304-312. Press, New York, pp. 149-184.
cortical rotation of fertilized frog eggs. J. Cell
Klag, J. J. and Ubbels, G. A. 1975. Regional Longo, F. J., Lynn, J. W., McCulloh, D. H. and
Biol. 114: 1017-1028.
morphological and cytochemical differentiati- Chambers, E. L. 1986. Correlative ultrastructural
Humphreys, T. 1971. Measurements of meson of the fertilized egg of Discoglossus pictus and electrophysiological studies of sperm-egg
senger RNA entering polysomes upon fertiliza- (Anura). Differentiation 3: 15-20. interactions of the sea urchin Lytechinus
tion in sea urchins. Dev. Biol. 26: 201-208. variegatus. Dev. Biol. 118: 155-166.
Kline, D. 1988. Calcium-dependent events
Hunter, R. H. F. 1989. Ovarian programming at fertilization of the frog egg: Injection of Lopez, L. C., Bayna, E. M., Litoff, D., Shaper,
of gamete progression and maturation in the a calcium buffer blocks ion channel opening, N. L., Shaper, J. H. and Shur, B. D. 1985. Recep-
female genital tract. Zool. J. Linn. Soc. 95: exocytosis, and formation of pronuclei. Dev. tor function of mouse sperm surface galactosyl-
117-124. Biol. 126: 346-361. transferase during fertilization. I. Cell Biol. 101:
1501-1510.
Hylander, B. L. and Summers, R. G. 1982. An Kline, D., Simoncini, L., Mandel, G., Maue, R., Kado,
ultrastructural and immunocytochemical locali- R. T. and Jaffe. L. A. 1988. Fertilization events Luttmer, S. and Longo, F. J. 1985. Ultrastructural
zation of hyaline in the sea urchin egg. Dev. induced by neurotransmitters after injection of and morphometric observations of cortical
Biol. 93: 368-380. mRNA into Xenopus eggs. Science 241: 464-467. endoplasmic reticulum in Arbacia, Spisula, and
mouse eggs. Dev. Growth Differ. 27: 349-359.
Iwao, Y. and Jaffe, L. A. 1989. Evidence that Kline, D, Kopf, G., Muncy, L. F. and Jaffe, L. A.
the voltage-dependent component in the ferti- 1991. Evidence for the involvement of a pertussis Manes, M.E. and Elinson, R.P. 1980. Ultraviolet
lization porcess is contributed by the sperm. Dev. toxin-insensitive G-protem in egg activation of light inhibits gray crescent formation in the frog
Biol. 134: 446-451. the frog Xenopus laevis. Dev. Biol. 143: 218-229. egg. Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. 189: 73-76.
Manes, M. E., Elinson, R. P. and Barbieri, F. D. pellucida glycoprotein ZP2 following activation Poirier, G. R. and Jackson, J. 1981. Isolation
1978. Formation of the amphibian gray crescent: of mouse eggs. Dev. Biol. 132: 103-112. and characterization of two proteinase inhibitors
Effects of colchicine and cytochalasin-B. from the male reproductive tract of mice.
Moore, G. D., Kopf, G. S. and Schultz, R M. 1993. Gamete Res. 4: 555-569.
Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. 185: 99-104.
Complete mouse egg activation in the absence of
McCulloh, D. H. and Chambers, E. L. 1992. sperm by stimulation of an exogenous G protein- Porter, D. C. and Vacquier, V. D. 1986. Phos-
Fusion of membranes during fertilization. J. Gen. coupled receptor. Dev. Biol. 159: 669-678. phorylation of sperm histone HI is induced by
Physiol. 99:137-175. the egg jelly layer in the sea urchin Strongylo-
Moore, G. D., Ayabe, T., Visconti, P. E., Schultz, centrotus purpuratus. Dev. Biol. 116: 203-212.
McGrath, J. and Solter, D. 1984. Completion of R. M. and Kopf, G. 1994. Roles of heteromeric
mouse embryogenesis requires both the mater- and monomeric G proteins in sperm-induced Prevost, J. L. and Dumas, J. B. 1824.
nal and paternal genome. Cell 37: 179-183. activation of mouse eggs. Development 120: Deuxieme mémoire sur la génération. Ann.
3313-3323. Sci. Nat. 2: 129-149.
McPherson, S. M., McPherson, P. S., Mathews,
L., Campbell, K. P. and Longo, F. J. 1992. Moy, G. W. and Vacquier, V. D. 1979. Immuno- Primakoff, P., Hyatt, H. and Tredick-Kline, J.
Cortical localization of a calcium release channel peroxidase localization of bindin during the 1987. Identification and purification of a sperm
in sea urchin eggs. J. Cell Biol. 116: 111-1121. adhesion of sperm to sea urchin eggs. Curr. Top. cell surface protein with a potential role in
Dev. Biol. 13: 31-44. sperm-egg membrane fusion. 1. Cell Biol. 104:
Mead, K. S. and Epel, D. 1995. Beakers and 141-149.
breakers: how fertisation in the laboratory differs Mozingo, N. M. and Chandler, D. E. 1991.
from fertisation in nature. Zygote 3: 95-99. Evidence for the existence of two assembly Primakoff, P., Lathrop, W., Woolman, L.,
domains within the sea urchin fertilization en- Cowan, A. and Myles, D. 1988. Fully effective
Meizel, S. 1984. The importance of hydro- contraception in male and female guinea pigs
velope. Dev. Biol. 146: 148-157.
lytic enzymes to an exocytotic event, the immunized with the sperm protein PH-20.
mammalian sperm acrosome reaction. Biol. Multigner, L., Gagnon, J., Dorsselaer, A. van Nature 335: 543-546.
Rev. 59: 125-157. and Job, D. 1992. Stabilization of sea urchin
flagellar microtubules by histone H1. Nature 360: Ralt, D. and eight others. 1991. Sperm attraction
Metz, C. B. 1978. Sperm and egg receptors to a follicular factor(s) correlates with human
33-39.
involved in fertilization. Curr. Top. Dev. Biol. egg fertilizability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
12:107-148. Myles, D. G., Kimmel, L. H., Blobel, C. P., 88: 2840-2844.
White, J. M. and Primakoff, P. 1994. Identifi-
Miller, D. J., Macek, M. B. and Shur, B. D. 1992. Ramarao, C. S. and Garbers, D. L. 1985. Recep-
cation of a binding site in the disintegrin domain
Complementarity between sperm surface β-1,4- tor-mediated regulation of guanylate cyclase
of fertilin required for sperm-egg fusion. Proc.
galactosyltransferase and egg-coat ZP3 mediates activity in spermatozoa. J. Biol. Chem. 260:
sperm-egg binding. Nature 357: 589-593. 8390-8396.
Nishizuka, Y. 1986. Studies and perspectives of
Miller, D.L., Gong, X., Decker, G. and Shur, B. Ravnik, S. E., Zarutskie, P. W. and Muller, C. H.
protein kinase C. Science 233: 305-312.
D. 1993. Egg cortical granule N-acetylglucosa- 1992. Purification and characterization of a
minidase is required for the mouse zona block to Ogawa, K., Mohri, T. and Mohri, H. 1977. Iden- human follicular fluid lipid transfer protein that
polyspermy. J. Cell Biol. 123: 1431-1440. tification of dynein as the outer arms of sea stimulates human sperm capacitation. Biol.
urchin sperm axonomes. Proc. Natl. Acad. Sci. Reprod. 47: 1126-1133.
Miller, R. L. 1978. Site-specific agglutination
USA 74: 5006-5010.
and the timed release of a sperm chemoattractant Roegiers, F., McDougall, A. and Sardet, C. 1995.
by the egg of the leptomedusan, Orthopyxis Ohama, K., Kajii, T., Okamoto, E., Fukada Y., The sperm entry point defines the orientation
caliculata. J. Exp. Zool. 205: 385-392. Imaizumi, K., Tsukahara, M., Kobayashi, K. and of the calcium-induced contraction wave that
Hagiwara, K. 1981. Dispermic origin of XY directs the first phase of cytoplasmic reorgani-
Miller, R. L. 1985. Sperm chemo-orientation in
hydaticliform moles. Nature 292: 551-552. zation in the ascidian egg. Development 121:
the metazoa. In C. B. Metz, Jr. and A. Monroy
3457-3466.
(eds.), Biology of Fertilization, Vol. 2. Academic Olds, J. L. and thirteen others. 1995. Imaging
Press, New York, pp. 275-337. protein kinase C activation in living sea urchin Rossignol, D. P., Earles, B. J., Decker, G. L. and
eggs after fertilization. Dev. Biol. 172: 675-682. Lennarz, W. J. 1984. Characterization of the sperm
Miyazaki, S. and Igusa, Y. 1981. Fertilizati-
receptor on the surface of eggs of Strongylocen-
on potential in golden hamster eggs consists Parrington, J., Swann, K., Shevchenko V. I., Sesay,
trotus purpuratus. Dev. Biol. 104: 308-321.
of recurring hyperpolarizations. Nature 290: A. K. and Lai, F. A. 1996. Calcium os cillations
702-704. in mammalian eggs triggered by a soluble sperm Roux, W. 1887. Beiträge zur Entwicklungsmecha-
protein. Nature 379: 364-368. nik des Embryo. Arch. Mikrosk. Anat. 29: 157-212.
Miyazaki, S.-I, Yuzaki, M., Nakada, K.,
Shirakawa, H., Nakanishi, S., Nakade, S. and Perreault, S. D., Barbee, R. R., and Slott, V. L. Saling, P. M. 1989. Mammalian sperm interac-
Mikoshiba, K. 1992. Block of Ca2+ wave and 1988. Importance of glutathione in the acquisition with extracellular matrices of the egg.
Ca2+ oscillation by antibody to the inositol 1,4,5- tion and maintainance of sperm nuclear Oxford Rev. Reprod. Biol. 11: 339-388.
trisphosphate receptor in fertilized hamster eggs. decondensing activity in maturing hamster
Saling, P. M., Sowinski, J. and Storey, B. T. 1979.
Science 257: 251-255. oocytes. Dev. Biol. 125: 181-186.
An ultrastructural study of epididymal mouse
Mohri, T., Ivonnet, P. I. and Chambers, E. Pinto-Correia, C. 1997. The Ovary of Eve: Eggs spermatozoa binding to zonae pellucida in vitro:
L. 1995. Effect of sperm-induced activation and Sperm and Preformation. University of Sequential relationship to acrosome reaction. J.
current and increase of cytosolic Ca 2+ by Chicago Press, Chicago. Exp. Zool. 209: 229-238.
agents that modify the mobilization of
Poccia, D., Salik, J. and Krystal, G. 1981. Sawada, T. and Schatten, G. 1989. Effects of
[Ca 2+] i I. Heparin and pentosan polysulfate.
Transitions in histone variants of the male cytoskeletal inhibitors on ooplasmic segregation
Dev. Biol. 172: 139-157.
pronucleus following fertilization and evidence and microtubule organization during fertilizati-
Moller, C. C. and Wassarman, P. M. 1989. Cha- for a maternal store of cleavagestage histones on and early development in the ascidian
racterization of a proteinase that cleaves zona in the sea urchin egg. Dev. Biol. 82: 287-296. Molgula occidentalis. Dev. Biol. 132: 331-342.
Schackmann, R. W. and Shapiro, B. M. 1981. A Simerly, C. and ten others. 1994. The paternal Swann, K. and Whitaker, M. 1986. The part
partial sequence of ionic changes associated with inheritance of the centrosome, the cell’s micro- played by inositol trisphosphate and calcium in
the acrosome reaction of Strongylocentrotus tubule-organizing center, in humans, and the the propagation of the fertilization wave in sea
purpuratus. Dev. Biol. 81: 145-154. implications for infertility. Nat. Med. 1: 1-10. urchin eggs. J. Cell Biol. 103: 2333-2342.
Schatten, G. and Mazia, D. 1976. The penetration Sluder, G., Miller, F. J., Lewis, K., K., Davison, Terasaki, M. and Sardet, C. 1991. Demonstrati-
of the spermatozoan through the sea urchin egg E. D. and Reider, C. L. 1989. Centrosome on of calcium uptake and release by sea urchin
surface at fertilization: Observations from the inheritance in starfish zygotes: Selective loss of egg cortical endoplasmic reticulum. J. Cell Biol.
outside on whole eggs and from the inside on isolated the maternal centrosome after fertilization. Dev. 115: 1031-1037.
surfaces. Exp. Cell Res. 98: 325-337. Biol. 131: 567-579.
Tilney, L. G., Bryan, J., Bush, D. J., Fujiwara, K.,
Schatten, G. and Schatten, H. 1983. The Sluder, G., Miller, F. J. and Lewis, K. 1993. Mooseker, M. S., Murphy, D. B. and Snyder, D.
energetic egg. The Sciences 23(5): 28-35. Centrosome inheritance in starfish zygotes II. H. 1973. Microtubules: Evidence for 13
Selective suppression of the maternal centrosome protofilaments. J. Cell Biol. 59: 267-275.
Schatten, H. and Schatten, G. 1980. Surface activity
during meiosis. Dev. Biol. 155: 58-67.
at the plasma membrane during sperm incorporation Tilney, L. G., Kiehart, D. P., Sardet, C. and
and its cytochalasin-B sensitivity: Scanning electron Snell, W. J. and White, J. M. 1996. The molecules Tilney, M. 1978. Polymerization of actin.
micrography and time-lapse video microscopy du- of mammalian fertilization. Cell 85: 629-637. IV. Role of Ca 2+ and H + in the assembly of
ring fertilization of the sea urchin Lytechinus actin and in membrane fusion in the
Speksnijder, J. E., Sardet, C. and Jaffe, L. F. 1990.
variegatus. Dev. Biol. 78: 435-449. acrosomal reaction of echinoderm sperm. J.
The activation wave of calcium in the ascidian
Cell Biol. 77: 536-560.
Schroeder, T. E. 1979. Surface area change at egg and its role in ooplasmic segregation. J. Cell
fertilization: Resorption of the mosaic Biol. 110: 1589-1598. Tombes, R. M. and Shapiro, B. M. 1985.
membrane. Dev. Biol. 70: 306-326. Metabolite channeling: A phosphocreatine
Steinhardt, R. A. and Epel, D. 1974. Activation
shuttle to mediate high-energy phosphate
SeGall, G. K. and Lennarz, W. J. 1979. Chemical of sea urchin eggs by a calcium ionophore. Proc.
transport between sperm mitochondrion and tail.
characterization of the component of the jelly Natl. Acad. Sci. USA 71: 1915-1919.
Cell 41: 325-334.
coat from sea urchin eggs responsible for
Steinhardt, R., Zucker, R. and Schatten, G. 1977.
induction of the acrosome reaction. Dev. Biol. Turner, P. R., Jaffe, L. A. and Fein,A. 1986.
Intracellular calcium release at fertilization in
71: 33-48. Regulation of cortical vesicle exocytosis in sea
the sea urchin egg. Dev. Biol. 58: 185-196.
urchin eggs by inositol 1,4,5-trisphosphate and
Shen, S. S. and Buck, W. R. 1990. A synthestic
Storey, B. T. 1995. Interactions between gametes GTP-binding protein. J. Cell Biel. 102: 70-76.
peptide of the pseudosubstrate domain of protein
leading to fertilization: The sperm’s eye view.
kinase C blocks cytoplasmic alakalinization du- Turner, P. R., Jaffe, L. A. and Primakoff, P.
Reprod. Fert. Dev. 7: 927-942.
ring activation of the sea urchin egg. Dev. Biol. 1987. A cholera toxin-sensitive G-protein
140: 272-280. Suarez, S. S. and Dai, X. 1995. Intracellular stimulates exocytosis in sea urchin eggs. Dev.
calcium reaches different levels of elevation in Biol. 120: 577-583.
Shen, S. S. and Burgart, L. J. 1986. 1,2-
hyperactivated and ac rosome-reacted hamster
Diacylglycerols mimic phorbol 12-myristate 13- Uzzell, T. M. 1964. Relations of the diploid and
sperm. Mol. Reprod. Dev. 42: 325-333.
acetate activation of the sea urchin egg. J. Cell. triploid species of the Ambystoma jeffersonia-
Physiol. 127: 330-340. Suarez, S. S., Katz, D. F., Owen, D. H., Andrew, J. num complex. Copeia 1964: 257-300.
B. and Powell, R. L. 1991. Evidence for the
Shen, S. S. and Steinhardt, R. A. 1978. Direct Vacquier, V D. 1979. The interaction of sea
function of hyperactivated motility in sperm.
measurement of intracellular pH during meta- urchin gametes during fertilization. Am.
Biol. Reprod. 44: 375-381.
bolic depression of the sea urchin egg. Nature Zool. 19: 839-849.
272: 253-254. Summers, R. G. and Hylander, B. L. 1974. An
Vacquier, V. D. and Moy, G. W. 1977. Isolation
ultrastructural analysis of early fertilization in
Shilling, F. M., Carroll, D. J., Muslin, A. J., of bindin: The protein responsible for adhesion
the sand dollar, Echinarachnius parma. Cell Tiss.
Escobodo, J. A., Williams, L. T. and Jaffe, L. A. of sperm to sea urchin eggs. Proc. Natl. Acad.
Res. 150: 343-368.
1994. Evidence for both tyrosine kinase and G- Sci. USA 74: 2456-2460.
protein-coupled pathways leading to starfish egg Summers, R. G. and Hylander, B. L. 1975. Vacquier, V. D. and Payne, J. E. 1973. Methods
activation. Dev. Biol. 162: 590-599. Species-specificity of acrosome reaction and for quantitating sea urchin sperm in egg binding.
Shimomura, H., Dangott, L. J. and Garbers, primary gamete binding in echinoids. Exp. Cell Exp. Cell Res. 82: 227-235.
D. L. 1986. Covalent coupling of a resact Res. 96: 63-68.
Vacquier, V. D., Tegner, M. J. and Epel, D.
analogue to guanylate cyclase. J. Biol. Chem. Summers, R. G., Hylander, B. L., Colwin L H. 1973. Protease release from sea urchin eggs
261: 15778-15782. and Colwin, A. L. 1975. The functional anatomy at fertilization alters the vitelline layer and
Shur, B. D. and Hall, N. G. 1982a. Sperm surface of the echinoderm spermatozoon and its inte- aids in preventing polyspermy. Exp. Cell Res.
galactosyltransferase activities during in vitro raction with the egg at fertilization. Am. Zool. 80: 111-119.
capacitation. J. Cell Biol. 95: 567-573. 15: 523-551.
Vincent, J. P., Oster, G. F. and Gerhart, J. C.
Shur, B. D. and Hall, N. G. 1982b. A role for Surani, M. A. H. and Barton, S. C. 1983. Deve- 1986. Kinematics of gray crescent formation in
mouse sperm surface galactosyltransferase in lopment of gynogenetic eggs in the mouse: Im- Xenopus eggs. The displacement of subcortical
sperm binding for the egg zona pellucida. J. Cell plications for parthenogenetic embryos. Science cytoplasm relative to the egg surface. Dev. Biol,
Biol. 95: 574-579. 222: 1034-1036. 113: 484-500.
Shur, B. D. and Neely, C. A. 1988. Plasma Surani, M. A. H., Barton, S. C. and Norris, M. L. Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D.,
membrane association, purification, and 1986. Nuclear transplantation in the mouse: Olds-Clarke, P. and Kopf, G. S. 1995a. Capacitation
partial characterization of mouse sperm β Hereditable differences between parental of mouse spermatozoa I. Correlation between
1,4-galactosyltransferase. J. Biol. Chem. genomes after activation of the embryonic capacitation state and protein tyrosine phospho-
263: 17706-17714. genome. Cell 45: 127-136. rylation. Development 121: 1129-1137.
Visconti, P. E. and seven others. 1995b. Whitaker, M. and Irvine, R. F. 1984. Inositol Xu, Z., Kopf, G. S. and Schultz, R. M. 1994.
Capacitation of mouse spermatozoa II. Protein 1,4,5-triphosphate microinjection activates sea Involvement of inositol-1,4,5-trisphospha-
tyrosine phosphorylation and capacitation are urchin eggs. Nature 312: 636-639. te-mediated Ca 2+ release in early and late
regulated by a cAMP-dependent pathway. De- events of mouse egg activation. Develop-
velopment 121: 1139-1150. Whitaker, M. and Steinhardt, R. 1982. Ionic ment 120: 1851-1859.
regulation of egg activation. Q. Rev. Biophys.
von Kolliker, A. 1841. Beiträge zur Kenntnis 15: 593-666. Yanagimachi, R. 1994. Mammalian fertilizati-
der Geschlectverhdltnisse und der Samenflüssi- on. In E. Knobil and J. D. Neill (eds.), The
gkeit wirbelloser Thiere, nebst einem Versuch Wilcox, A. J., Weinberg, C. R. and Baird, D. D. Physiology of Reproduction, 2nd Ed. Raven
Über Wesen und die Bedeutung der sogenannten 1995. Timing of sexual intercourse in relation Press, NY.
Samenthiere, Berlin. to ovulation: Effects on the probability of con-
ception, survival of pregnancy, and the sex of Yanagimachi, R. and Noda, Y. D. 1970.
Ward, C. R. and Kopf, G. S. 1993. Molecular Electron microscope studies of sperm
the baby. N. Engl. J. Med. 333: 1517-121.
events mediating sperm activation. Dev. Biol. incorporation into the golden hamster egg.
158: 9-34. Williams, C. J., Schultz, R. M. and Kopf, G. S. Am. J. Anat. 128: 429-462.
1992. Role of G proteins in mouse egg activation:
Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L. and Yirn, D. L., Opresko, L. K., Wiley, H. S. and
Stimulatory effects of acetylcholine on the ZP2
Vacquier, V. D. 1985. Chemotaxis of Arbacia Nuccitelli, R. 1994. Highly polarized EGF re-
to ZP2f conversion and pronuclear formation ceptor tyrosine kinase activity initiates egg
punctulata spermatozoa to resact, a pepticle from in eggs expressing a functional ml muscarinic
the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101: 2324-2329. activation in Xenopus. Dev. Biol. 162: 41-55.
receptor. Dev. Biol. 151: 288-296.
Wassarman, P. 1987. The biology and chemistry Yoshida, M., Inabar, K. and Morisawa, M. 1993.
Wilson, W. L. and Oliphant, G. 1987. Isolation Sperm chemotaxis during the process of fertili-
of fertilization. Science 235: 553-560. and biochemical characterization of the subunits zation in the ascidians Ciona savignyi and Ciona
Wassarman, P. M. 1989. Fertilization in mam- of the rabbit sperm acrosome stabilizing factor. intestinalis. Dev. Biol. 157: 497-506.
mals. Sci. Am. 256(6): 78-84. Biol. Reprod. 37: 159-169.
Zeng, Y., Clark, E. N. and Florman, H. M.
Watanabe, N., Hunt, T., Ikawa, Y. and Sagata, Winkler, M. M., Steinhardt, R. A., Grainger, J. 1995. Sperm membrane potential: Hyper-
N. 1991. Independent inactivation of MPF and L. and Minning, L. 1980. Dual ionic controls polarization during capacitation regulates
cytostatic factor (Mos) upon fertilization of for the activation of protein synthesis at ferti- zona pellucida-dependent acrosomal secre-
Xenopus eggs. Nature 352: 247-249. lization. Nature 287: 558-560. tion. Dev. Biol, 171: 554-563.
CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 167
Clivagem: Criando multicelularidade

5
Para nossa limitada inteligência, pode pa-
recer simples dividir um núcleo em partes
iguais. A célula, manifestadamente, abriga
uma opinião muito diferente.
E. B. WILSON, (1923)
N OTÁVEL COMO SÓ ELA É, a fertilização é o passo inicial do desenvolvi-
mento. O zigoto, com o seu novo potencial genético e com sua nova dispo-
sição do citoplasma, inicia agora a produção de um novo organismo
multicelular. Em todas as espécies de animais conhecidas, isso começa por um proces-
so chamado clivagem, uma série de divisões mitóticas pelo qual o enorme volume do
citoplasma do ovo é dividido em numerosas pequenas células nucleadas. Essas células
Deve-se mostrar o máximo respeito por em estado de clivagem são chamadas de blastômeros.
tudo que cresce exponencialmente, não
Na maioria das espécies (mamíferos sendo a principal exceção) a velocidade da
importa o seu tamanho.
divisão celular e a colocação dos blastômeros um em relação ao outro estão comple-
GARRETT HARDIN, (1968)
tamente sob controle das proteínas e dos mRNAs armazenados no oócito pela mãe. O
genoma zigótico transmitido por mitose para todas as outras células, não funciona em
embriões com clivagem precoce. Poucos, se alguns, mRNAs são produzidos mais
tarde durante a clivagem, o embrião pode dividir-se apropriadamente até mesmo quan-
do produtos químicos são usados para inibir a transcrição. Também em muitas espéci-
es, não há aumento do volume embrionário durante a clivagem. Isso difere da maioria
dos casos de proliferação de células, do qual existe um período de crescimento celular
entre as mitoses: a célula se expande para quase o dobro de seu volume, daí se divide.
Esse crescimento produz um aumento total de células enquanto mantém uma razão
relativamente constante entre volume nuclear e volume citoplasmático. Durante a cliva-
gem embrionária, no entanto, o volume citoplasmático não aumenta. Antes, o enorme
volume do citoplasma zigótico é dividido cada vez mais em células menores. O primeiro
ovo é dividido ao meio, em seguida em quartos, em oitavos, e assim por diante. Essa
divisão do citoplasma do ovo, sem o aumento do seu volume, é acompanhada pela
abolição do período de crescimento entre as divisões, enquanto a clivagem dos núcleos
ocorre numa razão tão rápida nunca vista antes (nem mesmo em células de tumor). Um
ovo de rã, por exemplo, pode ser dividido em 37.000 células em apenas 43 horas. A
mitose na Drosophila, em estágio de clivagem, ocorre a cada dez minutos por mais de
duas horas, e em apenas 12 horas forma algo em torno de 50.000 células. Esse aumento
em número de células pode ser apreciado comparando a clivagem com outras fases do
desenvolvimento. A Figura 5.1 mostra o logaritmo de números celulares em um embrião
de rã representado graficamente em função do tempo de desenvolvimento (Sze, 1953).
Ela ilustra uma evidente descontinuidade entre clivagem e gastrulação.
Uma conseqüência dessa divisão rápida é a razão do volume citoplasmático/nucle-
ar se tornar cada vez menor assim que a clivagem progride. Em muitos tipos de embri-
ões, a diminuição da razão entre os volumes citoplasmático e nuclear é crucial na
167
Figura 5.1
Formação de novas células du- Clivagem Gastrulação
rante o desenvolvimento preco-
células por embrião

Log10 do número de
ce da rã Rana pipiens. (Segundo
Sze, 1953.)
Horas a 150C
regulagem do tempo da ativação de certos genes. Por exemplo, na rã Xenopus laevis,

a transcrição de novas mensagens só é ativada após 12 divisões. A essa altura, a razão
da clivagem diminui, os blastômeros tornam-se móveis e os genes nucleares começam
a ser transcritos. É sabido que algo no ovo está sendo titulado pela recém-produzida
cromatina, porque o tempo dessa transição pode ser mudado experimentalmente alte-
rando na célula a razão da cromatina para o citoplasma (Newport and Kirschner,
1982a,b), ainda que a clivagem comece logo após a fertilização e termine assim que o
embrião atinja um novo equilíbrio entre o núcleo e o citoplasma.
Q PADRÕES DE CLIVAGEM EMBRIONÁRIA

Clivagem é um processo muito bem coordenado e é regulado pelas leis genéticas. O
padrão da clivagem embrionária de uma dada espécie é determinado por dois parâme-
tros principais: (1) a quantidade e a distribuição de proteína do vitelo dentro do
citoplasma e (2) aqueles fatores no citoplasma do ovo que influenciam no ângulo do
fuso mitótico e na determinação do tempo de sua formação.
A quantidade e distribuição de vitelo determina onde a clivagem pode ocorrer e o
tamanho relativo dos blastômeros. Quando um pólo do ovo é relativamente livre de
vitelo, a divisão celular ocorre nesse pólo de uma forma mais rápida do que a do pólo
oposto. O pólo rico em vitelo é chamado de pólo vegetal; a concentração de vitelo no
Tabela 5.1 Classsificação dos tipos de clivagem
Simetria
Padrão de clivagem Posição do vitelo de clivagem Animais representativos
Holoblástica Isolécito (oligolécito) Radial Equinodermos, Amphioxus

(clivagem completa) (vitelo escasso, distribuído por igual) Espiral Maioria dos moluscos,
anelídeos, nematelmintos, platelmintos
Bilateral Ascídios
Rotacional Mamíferos
Mesolécito (moderadamente telolécito) Radial Anfíbios
Meroblástica Telolécito (vitelo denso, concentrado Bilateral Moluscos cefalópodos
(clivagem incompleta) em uma extremidade do ovo) Discoidal Répteis, peixes, aves
Centrolécito (vitelo concentrado no Superficial Maioria dos artrópodos
centro do ovo)
pólo animal é relativamente baixa. O núcleo do zigoto é freqüentemente deslocado em

direção ao pólo animal. No geral, o vitelo inibe a clivagem. A Tabela 5.1 fornece a
classificação dos tipos de clivagem e mostra a influência do vitelo no padrão e na
simetria da clivagem. Em zigotos com relativamente pouco vitelo (ovos isolécitos e
mesolécitos) a clivagem é holoblástica, significando que o sulco da clivagem se extende
por todo o ovo. Zigotos contendo grande acúmulo de proteína vitelínica sofrem cliva-
gem meroblástica, onde somente uma porção do citoplasma é clivado. O sulco da
clivagem não chega a penetrar na porção de vitelo do citoplasma. Clivagem meroblástica
pode ser discoidal, como nos ovos das aves, ou superficial, como em zigotos de
insetos, dependendo onde o depósito de vitelo estiver localizado, de um lado (telolécito)
ou no centro do citoplasma (centrolécito), respectivamente.
O vitelo é uma extraordinária adaptação que permite ao embrião se desenvolver na
ausência de uma fonte externa de alimentação. Animais desenvolvidos sem grandes
concentrações de vitelo, como os ouriços-do-mar, normalmente formam o estágio
larval muito rapidamente. Esse estágio larval pode se alimentar por si só, o desenvol-
vimento continua com a larva nadando livre. Embriões de mamíferos, que também
não possuem uma grande quantidade de vitelo, adotam uma outra estratégia: a pla-
centa, como veremos adiante, se torna a primeira diferenciação do embrião mamífero
separando as células que irão formar a placenta. Esse órgão fornece alimento e oxigê-
nio para o embrião durante sua longa gestação.
No outro extremo estão os ovos dos insetos, peixes, répteis e aves. A maior parte
do seu volume celular é vitelo. O vitelo deve ser o suficiente para nutrir esses animais,
sendo que eles se desenvolvem sem um estágio larval ou placentário. A correlação
entre grandes concentrações de vitelo e a falta do estado larval é conhecida em algu-
mas espécies de rãs. Algumas rãs tropicais, tais como as Eleutherodactylus e a
Arthroleptella não passam pelo estágio de girino. Ao contrário, eles provém seus
ovos com quantidades enormes de concentração de vitelo (Lutz, 1947). Os ovos não
necessitam ser colocados na água porque o estágio de girino foi eliminado. (Isso será
discutido mais adiante no Capítulo 19.)
No entanto, o vitelo é somente um fator influenciando o padrão de clivagem em
uma espécie. Existem também padrões herdados de divisões celulares que são adicio-
nados às restrições do vitelo. Isso pode ser prontamente observado em ovos isolécitos,
nos quais muito pouco vitelo está presente. Na ausência de grandes quantidades de
vitelo, quatro tipos principais de clivagem podem ser observados: holoblástica radial,
holoblástica espiral, holoblástica bilateral e clivagem holoblástica rotacional.
Clivagem holoblástica radial

Clivagem holoblástica radial é a forma mais simples de clivagem de se entender. Nesse
tipo de clivagem os sulcos têm orientação paralela e perpendicular ao eixo animal-
vegetal do ovo. Esse tipo de clivagem é característico de equinodermos e do
protocordato Amphioxus, assim como de rãs e salamandras.
A holotúria, Synapta
A clivagem padrão da holotúria, Synapta digita, é ilustrada na Figura 5.2. Após a
união dos pronúcleos, o eixo da primeira haste mitótica é formado perpendicularmen-
te ao eixo animal-vegetal do ovo. Para esse fim, o primeiro sulco da clivagem passa
diretamente através dos pólos animal e vegetal, criando duas células filhas do mesmo
tamanho. Essa clivagem é conhecida como meridional porque passa pelos dois pólos
como um meridiano no globo. Os sulcos da segunda clivagem estão no ângulo reto
dos sulcos da primeira clivagem, mas continuam perpendiculares ao eixo animal-ve-
getal do ovo. Os dois sulcos da clivagem aparecem simultaneamente em ambos
blastômeros e também passam pelos dois pólos. Dessa maneira, as primeiras duas
divisões são, ao mesmo tempo, meridional e perpendicular uma com a outra. A terceira
divisão é equatorial: as hastes mitóticas de cada blastômero estão agora em posição
Figura 5.2 Pólo animal Plano de clivagem Plano de

Clivagem holoblástica no equinodermo Synapta meridional clivagem
digita, levando à formação de uma blástula oca, equatorial
conforme mostrado no corte (último painel).
(Segundo Saunders, 1982.)
Pólo vegetal
Metade Animal Pólo animal
Blástula oca
Metade Vegetal (aberta por corte) Pólo vegetal
paralela ao eixo animal-vegetal, e o sulco resultante da clivagem separa os dois pólos um

do outro, dividindo o embrião em oito blastômeros iguais. Cada blastômero na metade
animal do embrião está agora diretamente acima do blastômero da metade vegetal.
A quarta divisão é meridional novamente, produzindo duas fileiras de 8 células
cada, enquanto a quinta divisão é equatorial, produzindo quatro fileiras de 8 células
cada. Sucessivas divisões produzem embriões de 64,128 e 256 células, com divisões
meridionais alternando com divisões equatoriais. Os embriões resultantes consistem
de blastômeros dispostos em fileiras horizontais ao longo de uma cavidade central.
Em ambos os pólos do embrião, os blastômeros se movem, uns em direção aos ou-
tros, para criar uma esfera oca composta de uma única camada de células. Essa esfera
oca é chamada de blástula, e a cavidade central é referida como blastocele. A qual-
quer momento durante a clivagem da Synapta, um embrião seccionado através de
qualquer meridiano produz a imagem refletida de duas metades. Esse tipo de simetria
é característico de uma esfera ou cilindro e é chamada de simetria radial. Dessa manei-
ra, Synapta tem clivagem holoblástica radial.
Ouriço--do
Ouriço -Mar
do-Mar
O ouriço-do-mar também apresenta clivagem holoblástica radial, mas com algumas
importantes modificações. A primeira e a segunda clivagem são similares as da
Synapta; ambas são meridionais e perpendiculares em relação a outra. Similarmen-
te, a terceira clivagem é equatorial, separando os dois pólos um do outro (Figura
5.3). Na quarta clivagem, no entanto, os eventos são bem diferentes. As quatro
células da camada animal se dividem meridionalmente em oito blastômeros, cada
qual com o mesmo volume. Essas células são chamadas mesômeros. A camada
vegetal, no entanto, sofre uma clivagem equatorial desigual para produzir no pólo
vegetal quatro células grandes, os macrômeros, e quatro pequenas, os micrômeros
(Figura 5.4; Summers et al., 1993). Assim que a célula com 16 embriões clivar, os
oito mesômeros se dividem para formar duas camadas “animais”, an1 e an2, uma se
equilibrando em cima da outra. Os macrômeros se dividem meridionalmente, for-
mando uma camada de oito células abaixo de an2. Os micrômeros também se divi-
dem, produzindo um pequeno grupo abaixo da camada maior. Todos os sulcos de
clivagem da sexta divisão são equatoriais; a sétima clivagem é meridional, produzin-
do uma blástula com 128 células.
(A) Pólo animal Figura 5.3

Clivagem no ouriço-do-mar. (A) Planos de cli-
vagem nas primeiras três divisões e formação
de camadas particulares de células nas divi-
sões 3-6. (B-D) Fotomicrografias de embriões
vivos do ouriço-do-mar Lytechinus pictus, vi-
são de cima para baixo do pólo animal. (B) O
estágio de 2 células. (C) O estágio de 4 células.
Pólo vegetal
(D) O estágio de 32 células, mostrado sem a
membrana de fertilização para permitir a vi-
sualização dos mesômeros do pólo animal, os
Mesômeros an 1 derivados macrômeros centrais e dos micrômeros vege-
Metade animal
tais em ângulo para o centro. (Fotografia cor-
an 2
derivados tesia de G. Watchmaker.)
veg1
veg2
Metade vegetal
Micrômeros Macrômeros
(B) (C) (D)
Em 1939, Sven Hörstadius realizou um experimento simples demonstrando que o

controle do tempo e colocação de cada clivagem de ouriço-do-mar é independente de
clivagens preexistentes. Ele demonstrou que se inibisse a primeira, a segunda e tercei-
ra clivagens, sacudindo os ovos, ou colocando-os em água do mar hipotônica, a
clivagem desigual (quarta) que forma os micrômeros, ainda ocorreria no tempo apro-
priado. Sendo assim, Hörstadius concluiu que existem três fatores que determinam a
clivagem em um embrião de 8 células: (1) existem mudanças progressivas no citoplasma,
Figura 5.4
Formação de micrômeros durante a quarta di-
visão de embriões de ouriços-do-mar. Os pó-
los vegetais dos embriões são visualizados por
baixo. (A) A localização e orientação do fuso
mitótico na parte baixa das células vegetais
são visualizadas com luz polarizada no em-
brião vivo. (B) A clivagem através desses fu-
sos, colocados assimetricamente, produziu mi-
crômeros e macrômeros. (de Inoué, 1982, cor-
(A) (B) tesia de S. Inoué.)
Cílio
Blastocele
(A) Blástula jovem (B) Blástula mais velha com (C)

placa vegetal achatada e tufo ciliar
Figura 5.5
Blástulas de ouriço-do-mar. (A) Esquema de um corte controle através de uma blástula precoce
de ouriço-do-mar, mostrando uma camada única de células arredondadas rodeando uma grande
blastocele. (B) Com a contínua divisão, as células da blástula tardia mostram diferenças de forma
à medida que as células da placa vegetal se alongam, (C) Junções apertadas (flecha) formando–
se entre células de uma blástula de equinodermo com 1024 células. (A e B segundo Giudice,
1973; C de Dan-Sohkawa e Fujisawa, 1980, cortesia dos autores.)
algum tempo após a fertilização, que direcionam os fusos formados para uma certa
direção; (2) deve haver material formador de micrômero no citoplasma vegetal; e (3)
deve haver algum mecanismo pelo qual o material formador de micrômeros seja ativa-
do no tempo correto (Hörstadius,1973).
No desenvolvimento do ouriço-do-mar, o estágio de blástula começa na fase de
128 células. Nesse estágio, as células formam uma esfera oca circundando a blastocele
central (Figura 5.5A,B). Nessa altura, todas as células são do mesmo tamanho, os
micrômeros tendo diminuída sua divisão celular e clivando menos freqüentemente.
Toda a célula está em contato com o fluido proteináceo da blastocele e com a camada
hialina dentro do envoltório de fertilização. Durante esse tempo, os contatos entre as
células são estreitados. Dan-Sohkawa a Fujisawa (1980) analisaram esse método em
embriões de estrela-do-mar e mostraram que o fechamento da cavidade esférica é
contemporânea com a formação de junções apertadas entre os blastômeros. Essas
junções unem as células frouxamente conectadas num tecido epitelial onde a blastocele
é isolada do ambiente externo (Figura 5.5C). Dando prosseguimento a sua divisão, a
camada celular é expandida e se afina. Durante esse período, a blástula permanece
como uma camada unicelular grossa.
Duas teorias surgiram para explicar a concomitante proliferação de células e
formação da blastocele. Dan (1960) conjeturou que o motivo maior dessa expan-
são é o influxo de água na cavidade da blastocele. Já que o blastômero secreta
proteína na blastocele, seu fluido torna-se espesso. Esse fluido absorve grandes
quantidades de água por osmose, exercendo pressão nos blastômeros para se ex-
pandirem. Essa pressão também alinha o longo eixo de cada célula para que a
divisão nunca seja para dentro da blastocele. Isso criaria uma expansão adicional
fazendo com que a população fosse orientada somente para um plano. Wolpert e
Gustafson (1961) e Wolpert e Mercer (1963) propuseram que a pressão da
blastocele não é necessária para se conseguir esse efeito. Eles enfatizaram o papel
de adesividade das células entre si e a camada hialina. Eles mostraram que en-
quanto permanecessem fortemente atracadas na camada hialina, as células não
têm alternativa a não ser a de se expandir. Essa expansão cria a blástula ao invés
do contrário. Certamente, a camada hialina é vital para expansão da blastocele, e
se a adesão de células da camada hialina é inibida por anticorpos para a hialina,
então a expansão da blastocele cessa (Adelson e Humphreys, 1988). Em um tra-
balho recente (Ettensohn e Ingersoll, 1992) concluíram que é provável que ambos
mecanismos expandem a blastocele. Durante a clivagem precoce, a adesão à cama-

da hialina parece ser o fator mais importante, enquanto que em estágios mais
tardios, a pressão osmótica também parece exercer o seu papel.
A células da blástula desenvolvem cílios em sua superfície externa (Figura 5.6),
desse modo, causando a rotação da blástula dentro do envoltório de fertilização. Logo
após, as células da parte animal do embrião sintetizam e secretam uma enzima de
eclosão que lhes permite digerir a membrana fertilizante (Lepage et al., 1992), o em-
brião se torna uma blástula eclodida livre para nadar.
Anfíbios
Clivagem na maioria dos embriões de rãs e salamandras é radialmente simétrica e
holoblástica, como na clivagem do equinodermo. O ovo do anfíbio, no entanto, con-
tém muito mais vitelo. Esse vitelo, que é concentrado no hemisfério vegetal, é um
impedimento à clivagem. Sendo assim, a primeira divisão começa no pólo animal e
vagarosamente se estende até a região vegetal (Figura 5.7). Na salamandra axolotle, o
sulco da clivagem se estende através do hemisfério animal a uma velocidade próxima
de 1mm/min. O sulco da clivagem seciona o crescente cinzento e depois diminui para
menos de 0.02-0.03mm/min ao se aproximar do pólo vegetal (Hara, 1977).
A Figura 5.8A é uma varredura no microscópio eletrônico, mostrando a primeira
clivagem em um ovo de rã. Podemos notar as dobras nos sulcos da clivagem e a
diferença entre os sulcos nos hemisférios animal e vegetal. A Figura 5.8B mostra que
enquanto o sulco da primeira clivagem ainda está tentando clivar o vitelo
citoplasmático do hemisfério vegetal, a segunda clivagem já começou próxima ao
pólo animal. Essa clivagem está em ângulos retos em relação à primeira, e é também
meridional. A terceira clivagem, como era de se esperar, é equatorial. No entanto,
por causa do vitelo vegetalmente colocado, esse sulco da clivagem em ovos anfíbios
é muito mais próximo do pólo animal. Ele divide o embrião de rã em quatro
blastômeros animais pequenos (micrômeros) e quatro grandes blastômeros
(macrômeros) na região vegetal. Essa clivagem holoblástica desigual estabelece duas Figura 5.6
regiões embrionárias principais: uma de divisão rápida de micrômeros, próxima ao Células ciliadas da blástula. Cada célula desen-
volve um único cílio. (Cortesia de W. J.
pólo animal, e outra de macrômeros, mais lenta (Figura 5.8C). Assim que a clivagem
Humphreys.)
progride, a região animal se torna abarrotada com numerosas células pequenas,
enquanto a região vegetal contém uma pequena quantidade de grandes macrômeros
carregados de vitelo (ver Figura 5.7).
Embriões anfíbios contendo de 16 a 64 células são freqüentemente chamados
mórulas (do Latim “amora”, da qual sua forma é vagamente reminiscente). No estágio
de 128 células a blastocele se torna aparente e o embrião é considerado uma blástula.
(A) (B) (C) (D)
Figura 5.7
Clivagem de um ovo de rã. Sulcos de clivagem,
designados por números romanos, estão enu-
Crescente merados por ordem de aparecimento. (A, B)
Cinzento O vitelo vegetal impede a clivagem fazendo
(E) (F) (G) (H) com que a segunda divisão comece na região
Blastocele animal do ovo, antes da primeira divisão ter
dividido o citoplasma vegetal. (C) A terceira
divisão é deslocada em direção ao pólo animal.
(D-H) No final, o hemisfério vegetal contém
blastômeros mais longos e mais escassos que
os da metade animal. (Segundo Carlson, 1981.)
(A) Figura 5.8

Micrografias ao microscópio eletrônico da clivagem de um ovo de rã. (A) Primeira clivagem. (B)
Segunda clivagem (4 células). (C) Quarta clivagem (16 células), mostrando a discrepância de
Pregas tamanho entre as células animais e vegetais aparecendo após a terceira divisão. (A de Beams e
Sulco de Kessel, 1976, cortesia dos autores; B e C cortesia de L. Biedler.)
clivagem
Na realidade, a formação da blastocele foi traçada desde o primeiro sulco de clivagem.

Kalt (1971) demonstrou que na rã Xenopus laevis o primeiro sulco da clivagem se
alarga no hemisfério animal para criar uma pequena cavidade intercelular que é isolada
do ambiente externo por junções intercelulares muito apertadas (Figura 5.9). Essa
cavidade se expande durante clivagens subseqüentes para se tornar uma blastocele.
(B)
A blastocele provavelmente presta duas principais funções no embrião das rãs: (1)
é uma cavidade que permite migração celular durante a gastrulação, e (2) previne
células que estão abaixo interagir prematuramente com as células de cima. Quando
Nieuwkoop (1973) tirou células do topo da blastocele de um embrião de salamandra
aquática e colocou-as junto a células do vitelo vegetal na base da blastocele, essas
células animais se tornaram mesoderma ao invés de ectoderma. Como o tecido meso-
dérmico é normalmente formado dessas células animais, que são adjacentes aos pre-
cursores do endoderma, parece plausível que células vegetais influenciam células ad-
jacentes para se diferenciar em tecidos mesodérmicos. Sendo assim, a blastocele apa-
rece para prevenir o contato do endoderma com células destinadas para dar origem à
pele e aos nervos.
Enquanto essas células estão dividindo-se, numerosas células com moléculas de
(C) adesão mantêm as células juntas. Uma das mais importantes dessas moléculas é a EP-
caderina. O mRNA para essa proteína é fornecido no citoplasma do oócito, e se essa
mensagem é destruída (injetando no oócito oligonucleotídeos antisense complemen-
tares para esse mRNA), a EP-caderina não é produzida e a adesão entre os blastôme-
ros é dramaticamente reduzida (Heasman et al., 1994). Isso resulta na obliteração da
blastocele (Figura 5.10).
Figura 5.9
Formação da blastocele num ovo de rã. (A)
Primeiro plano de clivagem mostrando uma
pequena fenda, que posteriormente se desen-
volve na blastocele. (B) embrião de oito célu-
las mostrando uma pequena blastocele (fle-
cha) na junção de três planos de clivagem. (de
Kalt, 1971, cortesia de M. R. Kalt.) (A) (B)
(A) (B)
Figura 5.10
Depleção de EP-caderina mRNA no oócito de Xenopus, resultando na perda de adesão entre os
blastômeros e na obliteração da blastocele. Oligonucleotídeos antisense complementares à men-
sagem da EP-caderina foram injetados no embrião unicelular, prevenindo a expressão da EP-
caderina. A blastocele é obliterada em embriões depletados de EP-caderina, mas (B) não pelos
controles. (de Heasman et al., 1994; fotografia, cortesia de J. Heasman.)
Clivagem holoblástica espiral

Clivagem espiral é característica de vermes anelídeos, platelmintos turbelários, ver-
mes nemertinos e todos os moluscos, exceto cefalópodos. Difere da clivagem radial
em muitas maneiras. Primeiro, os ovos não se dividem em paralelo ou em orientações
perpendiculares ao eixo animal-vegetal do ovo; de preferência, a clivagem se dá em
ângulos oblíquos, formando a disposição “espiral” de blastômeros filhos. Segundo, as
células se tocam entre si em mais lugares do que em embriões clivados radialmente.
Na realidade, elas assumem o empacotamento com a orientação termodinamicamente
mais estável, parecido com o de bolhas de sabão adjacentes (Figura 5.11). Terceiro,
embriões de clivagem espiral normalmente realizam menos divisões antes de começar
a gastrulação, tornando possível saber o destino de cada célula da blástula. Quando os
destinos das células individuais em embriões de anelídeos, platelmintos turbelários e
moluscos foram comparados, as mesmas células foram vistas no mesmo lugar e o seus
destinos, de uma maneira geral, foram idênticos (Wilson, 1898). As blástulas então
produzidas não têm blastocele e são chamadas de estereoblástulas.
As Figuras 5.12 e 5.13 retratam a clivagem de embriões de moluscos. As duas
primeiras clivagens são quase meridionais, produzindo quatro grandes macrômeros
(marcados A, B, C e D). Em muitas espécies, os blastômeros são de tamanhos diferen-
tes (D sendo o maior), uma característica que permite serem individualmente identifi-
cados. Em cada sucessiva clivagem, cada macrômero origina um pequeno micrômero
no seu pólo animal. Cada quarteto sucessivo de micrômeros é deslocado para a direita
ou para a esquerda de seu macrômero irmão, criando um relacionamento espiral ca-
racterístico da clivagem. Observando o embrião pelo pólo animal, as partes superiores
do eixo mitótico parecem alternar entre o sentido horário e o anti-horário. Isso faz
Figura 5.11
com que micrômeros alternados se formem obliquamente para a esquerda e para a
Diagrama mostrando o arranjo de quatro e oito
direita do seu macrômero. Na terceira clivagem, o macrômero A dará origem a duas bolhas de sabão num prato ligeiramente côn-
células filhas, macrômero 1A e micrômero 1a. As células B, C e D se comportam cavo. O arranjo termodinâmico maximiza o
similarmente, produzindo o primeiro quarteto de micrômeros. Na maioria das espéci- contato e é muito reminiscente daquele de em-
es, os micrômeros estão à direita do seu macrômero (olhando para o pólo animal), briões que se clivam em espiral. (Segundo
uma disposição indicando uma espiral dextra (oposta à sinistra). Na quarta clivagem, Morgan, 1927.)
(A) Vista do pólo animal
(B) Vista lateral
Figura 5.12
Clivagem em espiral do molusco Trochus vista
do pólo animal (A) e de um lado (B). Em B,
as células derivadas do blastômero A estão
coloridas. Os fusos mitóticos, esquematizados o macrômero 1A se divide para formar o macrômero 2A e o micrômero 2a; e o micrômero
nos estágios precoces, dividem as células de- 1a se divide para formar mais dois micrômeros, 1a1 e 1a2. Mais clivagens irão produzir
sigualmente e em ângulo aos eixos vertical e
blastômeros 3A e 3a a partir do macrômero 2A; e micrômeros, como por exemplo o 1a2,
horizontal.
se dividem para produzir células tais como as 1a21 e 1a22.
A orientação da clivagem plana para a esquerda ou para a direita é controlada por
fatores citoplasmáticos dentro do oócito. Isso foi descoberto analisando mutações da
espiral do caracol. Alguns caracóis têm sua espiral aberta à direita da concha, enquan-
to outros têm sua abertura para à esquerda. Normalmente, a rotação da espiral é a
mesma para todos os membros de uma determinada espécie. Todavia, ocasionalmen-
te, ainda são encontrados mutantes. Exemplificando, em espécies em que a espiral
abre para a direita, serão encontrados alguns indivíduos com a abertura espiral para a
esquerda. Crampton (1984) analisou os embriões desses caracóis aberrantes e obser-
vou que sua clivagem precoce difere da normal.
Figura 5.13
Clivagem espiral do caracol Ilyanassa. O blas-
tômero D é maior que os outros, permitindo a
identificação de cada célula. A clivagem é dextra.
(A) estágio de 8 células. PB é o corpo polar.
(B) Metade da quarta clivagem; os macrômeros
já se dividiram em células grandes e pequenas
orientadas espiralmente. (de Craig e Morrill,
1986, cortesia dos autores.)
(A) Enrolamento sinistrogiro
(B) Enrolamento dextrogiro
Figura 5.14
Olhando do pólo animal de caracóis enrolados para a direita e para a esquerda. A origem do
enrolamento para direita e para a esquerda do caracol pode ser reconhecida pela orientação do
fuso mitótico na segunda clivagem. Os caracóis sinistrogiros e dextrogiros se desenvolvem como
imagens espelhares uma da outra. (Segundo Morgan, 1927.)
A orientação das células após a segunda clivagem estava diferente (Figura 5.14),
graças a uma orientação diferente do aparelho mitótico nos caracóis com enrolamento
sinistrogiro. Todas as subseqüentes divisões em embriões de espiral para a esquerda
são imagens espelhares daqueles embriões com espirais dextras. Na Figura 5.14, pode-
mos notar que a posição do blastômero 4d (o qual é muito importante, já que sua
progênie irá formar os órgãos mesodérmicos) é diferente nos dois tipos de espirais
dos embriões. Geralmente, os dois caracóis são formados com seus corpos em lados
diferentes da abertura da espiral.
A direção da abertura na espiral da concha do caracol é controlada por um único
par de genes (Sturtevant, 1923; Boycott et al., 1930). No caracol Limnaea peregra a
maioria dos indivíduos são espiralados para a direita. Raros mutantes, exibindo aber-
tura esquerda, foram encontrados e acasalados com caracóis tipo-selvagem. Esses
acasalamentos mostraram que existe um alelo D “dextrogiro” que é dominante em
relação ao alelo d “sinistrogiro”. No entanto, a direção da clivagem não é determinada
pelo genótipo do caracol em desenvolvimento, mas pelo genótipo da mãe do caramujo.
Caramujo fêmea do tipo dd pode produzir somente herdeiros de espiral sinistra, mes-
mo quando o genótipo dos herdeiros é Dd. Um indivíduo Dd irá se espiralar tanto
para a direita quanto para a esquerda dependendo do genoma de sua mãe. Esses cru-
zamentos produzem o seguinte quadro:
Os fatores genéticos envolvidos no enrolamento do caracol são trazidos ao

embrião no citoplasma do oócito. É o genótipo do ovário, no qual o fenótipo se
desenvolve, que determina em que direção a clivagem vai ocorrer. Quando Freeman
e Lundelius (1982) injetaram no ovo de mães dd, uma pequena quantidade de cito-
plasma proveniente de caracóis com espirais dextras, os embriões resultantes apre-
sentaram espirais para a direita. Citoplasmas de caracóis com espiral esquerda não
afetaram os embriões com a espiral direita. Isso confirma a observação que mães do
tipo selvagem estavam colocando um fator em seus ovos que estava ausente ou
defeituoso nas mães dd. [cleave1.html]
Outra descoberta emocionante com relação a clivagem dos moluscos está na co-
municação entre os blastômeros. Nos moluscos de blastômeros de igual tamanho no
estágio de quatro células*, a determinação de que a célula que originará a célula pre-
cursora mesodérmica será alcançada entre a quinta e a sexta clivagem. Nessa altura, o
macrômero 3D se estende para dentro entrando em contato com os micrômeros do
pólo animal. Sem esse contato, a célula 4d produzida pelos macrômeros 3D não pro-
duz mesoderma (van den Biggelaar e Guerrier, 1979). Injetando corantes de baixo
peso molecular, de Laat e colegas (1980) demonstraram que na hora do contato (e
não antes), pequenas moléculas são capazes de difundirem-se entre os macrômeros
3D e os micrômeros centrais. Imagens ao microscópio eletrônico mostram que nesse
momento, aparecem junções de fenda na superfície dessas células.
*Não se preocupe, daremos no Capítulo 16 mais informações sobre embriões de moluscos com
blastômeros de tamanhos desiguais.
& Especulações
Adaptação pela modificação da clivagem embrionária
E VOLUÇÃO é causada pela altera-

ção hereditária do desenvolvimen-
to embrionário. Às vezes, somos
capazes de identificar uma modificação da
embriogênese que impediu o organismo de
tos são sedentários e as larvas que nadam
livremente seriam sempre carregadas cor-
renteza abaixo. Essas ostras, no entanto, re-
solveram esse problema efetuando duas mo-
dificações no seu desenvolvimento. A pri-
dula capaz de produzir uma concha maciça.
Essas larvas (chamadas gloquídias) asse-
melham-se a pequenas armadilhas para
urso; possuem pêlos sensíveis que permi-
tem as válvulas da concha fecharem-se
sobreviver diferentemente em ambientes meira altera a clivagem embrionária. Na típi- abruptamente quando tocadas pelas guel-
hostis. Uma dessas modificações, descober- ca clivagem dos moluscos, ou todos os
Figura 5.15 Formação de larvas de gloquídia
ta por Frank Lillie em 1898, é causada pela macrômeros são iguais em tamanho, ou o
pela modificação da clivagem em espiral. Após
alteração do padrão típico da clivagem es- blastômero 2D é a maior célula no estágio
formação do embrião de 8 células (A), a dispo-
piral na família unionídeo das ostras. embrionário. No entanto, a divisão desse sição do fuso mitótico motiva a maioria do
Ao contrário da maioria das ostras, Unio Unio é tal que o blastômero 2d fica com a citoplasma D penetrar no blastômero 2d (B).
e seus aparentados vivem em locais de água maior parte do citoplasma (Figura 5.15). Essa Esse blastômero grande 2d se divide (C), para
corrente. As correntes criam um problema célula se divide para produzir a maior parte finalmente originar a grande concha “armadi-
para a dispersão das larvas, porque os adul- das estruturas larvais, incluindo uma glân- lha de urso” da larva (D). (Segundo Raff e
Kaufman, 1983.)
(A) (B) (C) (D)

ras ou barbatanas dos peixes que por ali Figura 5.16 Peixe falso sobre o molusco
estiverem passando. Elas “pegam uma ca- unionídeo lampsilis ventricosa. O “peixe” é,
rona” com o peixe até estarem prontas para na verdade, a bolsa da cria e o manto do
cair e, através de metamorfose, transformar- molusco. (Fotografia, cortesia de J. H. Welsh.)
se em moluscos adultos. Dessa maneira,
podem se espalhar correnteza acima. imitam o comportamento e a forma de pe-
Em algumas espécies, as gloquídias são quenos peixes nadando. Para tornar a ilu-
liberadas da bolsa de criação da fêmea e são mais completa, desenvolveram uma
meramente aguardam um peixe passar. Ou- mancha preta em forma de olho (ocelo) de
tras espécies, tal como a Lampsilis ventri- um lado e uma nadadeira do outro. O “pei-
cosa, aumentaram as chances de suas lar- xe” visto na Figura 5.16 não é um peixe real,
vas encontrarem um peixe realizando outra mas sim a bolsa de criação e o manto abaixo
modificação no seu desenvolvimento dela. Quando o peixe que estiver ao alcance
(Welsh, 1969). Muitos moluscos desenvol- for atraído, o molusco despeja as gloquídias
vem um manto fino e saliente em volta da da bolsa de criação. Dessa maneira, a modi-
concha circundando a bolsa de criação. Em ficação de padrões de comportamentos já
alguns unionídeos, a forma da bolsa de cri- existentes permitiram moluscos unionídeos
ação (marsúpio) e as ondulações do manto sobreviver em ambientes hostis.
Clivagem Holoblástica Bilateral

Clivagem holoblástica bilateral é encontrada primariamente nos ascídios (tunicados).
A Figura 5.17 mostra a clivagem padrão de um tunicado, Styela partita. O fenômeno
mais admirável nesse tipo de clivagem é que o primeiro plano de clivagem estabelece
o único plano de simetria no embrião, separando o embrião do que será o seu futuro
lado direito e esquerdo. Cada divisão sucessiva orienta-se em relação a esse plano de
simetria, e o meio embrião formado de um lado da primeira clivagem é a imagem espelhar
do meio embrião do outro lado. A segunda clivagem é meridional, como a primeira Figura 5.16
divisão; mas ao contrário da primeira divisão, não passa através do centro do ovo. Em Simetria bilateral em um ovo de tunicado.
vez disso, ela cria duas grandes células anteriores (blastômeros A e D) e duas peque- (A) Ovo não-clivado, mostrando os desti-
nas células posteriores (blastômeros B e C). Cada lado tem agora um blastômero nos das várias regiões citoplasmáticas. (B)
embrião de oito células, mostrando os blas-
grande e um pequeno. Durante as três próximas divisões, as diferenças no tamanho e
tômeros e os destinos das várias células.
na forma destacam a simetria bilateral desses embriões. No estágio de 32 células, uma Pode ser visualizado como duas metades de
pequena blastocele se forma e começa a gastrulação. 4 células; daqui em diante, cada divisão no
Como foi mencionado no capítulo 4, certos tunicados (incluindo S. partita) con- lado direito do embrião tem uma divisão
têm regiões citoplasmáticas coloridas. Durante a clivagem, essas se tornam fracionadas espelhar do lado esquerdo. (C, D) Vistas de
em células diferentes. Além do mais, o tipo de citoplasma que a célula recebe determi- embriões mais tardios do pólo vegetal. (As
na seu destino. Células recebendo citoplasmas claros se tornam ectoderma; aquelas regiões do citoplasma destinadas a formar
contendo citoplasma amarelo se transformam em células mesodérmicas; as células determinados órgãos estão marcadas em A e
são codificadas por cor em todo o diagra-
ma.) (Segundo Balinsky, 1981.)
(A (B) (C) (D)
Ectoderma
Ectoderma
neural
Músculo
Notocorda
Mesênquima
Endoderma
Pólo vegetal Pólo vegetal Vista do pólo vegetal

que incorporam inclusões ardósia se tornam endoderma e as células cinza claro, o

tubo neural e a notocorda. Esses plasmas coloridos estão localizados bilateralmente
em volta do plano de simetria e, assim, eles serão divididos pelo sulco da primeira
clivagem em metades direita e esquerda do embrião. A segunda clivagem motiva o
provável mesoderma se posicionar nas duas células posteriores, enquanto o provável
tubo neural e cordomesoderma serão formados pelas duas células anteriores. Mais
adiante, a terceira divisão irá repartir essas regiões citoplasmáticas, de modo que as
células formadoras do mesoderma são confinadas aos dois blastômeros vegetais pos-
teriores, e as células do cordomesoderma são restritas as duas células vegetais anteri-
ores. O destino de cada célula do embrião precoce de Styela tem sido acompanhado e
será discutido em detalhe no Capítulo 13.
Clivagem holoblástica rotacional

Não é surpresa alguma que o estudo da clivagem em mamíferos tenha-se tornado um
desafio. Os ovos de mamíferos estão entre os menores do reino animal, tornando
difícil seu manuseio experimental. O zigoto humano, por exemplo, tem somente 100
µm de diâmetro, praticamente invisível, sendo seu volume menor de um milésimo do
ovo de Xenopus. Também, zigotos de mamíferos não são produzidos em números
comparáveis aos embriões do ouriço-do-mar ou de rãs. Normalmente, menos de 10
ovos são ovulados por uma fêmea em um determinado tempo, tornando difícil a ob-
tenção de material para estudos bioquímicos. E como uma barreira final, o desenvol-
vimento dos embriões dos mamíferos se completa dentro de outro organismo ao invés
de um ambiente externo. Só recentemente foi possível a duplicação de algumas dessas
condições internas e observar o desenvolvimento in vitro.
Com todas essas dificuldades, valeu a pena esperar o conhecimento da clivagem
de mamíferos, já que a clivagem nos mamíferos é completamente diferente de ou-
tros padrões de divisão celular embrionária. O oócito dos mamíferos é liberado pelo
ovário e varrido pelas fímbrias até o oviduto (Figura 5.18). A fertilização ocorre na
ampola do oviduto, região próxima ao ovário. A meiose é então completada, e a
primeira clivagem começa um dia depois. A clivagem nos mamíferos está entre as
mais lentas do reino animal – de 12 a 24 horas de separação. Enquanto isso, os cílios
no oviduto empurram o embrião em direção ao útero; a primeira clivagem ocorre
durante essa jornada.
Existem várias características da clivagem dos mamíferos que as distinguem de
outros tipos de clivagem. A primeira é relativa a lentidão das divisões. A segunda
diferença fundamental é a singular orientação dos blastômeros dos mamíferos um em
relação ao outro. A primeira clivagem é uma divisão meridional normal; no entanto, na
Estágio de 2 células
Zona pelúcida
Útero
Primeira clivagem
Figura 5.18 Oviduto
Desenvolvimento de um embrião humano des-
de a fertilização até a implantação. A compac- Mórula
tação em embriões humanos ocorre no dia 4,
quando ele está no estágio de 10 células. O ovo Blastocisto
“eclode” da zona quando alcança o útero, e é Ovário
provável que a zona evite a adesão das células Estágio precoce Fertilização
em clivagem de se colarem ao oviduto, em lu- da implantação
Ovulação
gar de viajar para o útero. (Segundo Tuchmann-
Duplessis et al., 1972.)
Plano de Plano de Figura 5.19

Plano de clivagem I Plano de clivagem I Comparação da clivagem precoce (A) em
clivagem II clivagem IIA
equinodermos (clivagem radial) e (B) em mamí-
feros (clivagem rotacional). Nematóides também
têm uma forma rotacional de clivagem, porém,
não formam a estrutura blastocística caracterís-
tica dos mamíferos. Detalhes sobre a clivagem
dos nematóides serão fornecidos no Capítulo 13.
(Segundo Gulyas, 1975.)
Plano de
clivagem IIB
(A) EQUINODERMO (B) MAMÍFERO

(Ouriço-do-mar) (Coelho)
segunda clivagem um dos dois blastômeros se divide meridionalmente e o outro se

divide equatorialmente (Figura 5.19). Esse tipo de clivagem é chamada de clivagem
rotacional (Gulyas, 1975).
A terceira principal diferença entre a clivagem nos mamíferos e a da maioria dos
outros embriões é marcada pela falta de sincronização das divisões precoces. Os
blastômeros de mamíferos não se dividem ao mesmo tempo. Dessa maneira, embriões
de mamíferos não aumentam por igual do estágio de 2 para 4 e para 8 células, mas
freqüentemente contêm números ímpares de células. Também, diferente dos outros
genomas animais, o genoma mamífero é ativado durante a clivagem precoce, sendo o
responsável pela produção de proteína necessária para a clivagem. No camundongo e
na cabra, a mudança do controle maternal para o zigótico ocorre no estágio de duas
células (Piko e Clegg, 1982; Prather 1989). [cleave2.html]
Compactação
Talvez a diferença mais crucial entre a clivagem de mamífero e todos os outros tipos
envolva o fenômeno da compactação. Como mostra a Figura 5.20, blastômeros mamí-
feros, atravessando o estágio de 8 células, formam um arranjo solto com espaço sufi-
ciente entre eles. Seguindo a terceira clivagem, no entanto, os blastômeros passam
(A) (B) (C )
Figura 5.20
Clivagem de um único embrião de camundon-
go in vitro. (A) estágio de 2 células. (B) estágio
de 4 células. (C) início do estágio de 8 células.
(D) Estágio de 8 células compactado. (E)
Mórula. (F) Blastocisto. (de Mulnard, 1967,
(D) (E) (F) cortesia de J. G. Mulnard.)
(A) (B)
Figura 5.21
Micrografia ao microscópio eletrônico de embriões de camundongos de 8 células. (A) não-
compactados e (B) compactados. (Cortesia de C. Ziomek.)
por uma mudança espetacular em seu comportamento. De repente, se amontoam,

maximizando seu contato com outros blastômeros, formando uma bola compacta de
células (Figuras 5.20C,D e 5.21). Esse pacote é estabilizado por junções apertadas
que se formam entre as células, selando o interior da esfera (Figura 5.22). As células
no interior da esfera formam junções com espaços, desse modo, permitindo pequenas
moléculas e íons passarem entre elas.
As células do embrião compactado se dividem para produzir uma mórula de 16
células. Essa mórula consiste de um pequeno grupo de células internas rodeadas por
um grupo maior de células externas (Barlow et al.,1972). A maior parte dos descen-
dentes das células externas se tornam células do trofoblasto (trofectoderma). Esse
grupo de células não produz estruturas embrionárias. Ao invés disso, formam o tecido
do cório, a parte embrionária da placenta. O cório permite ao feto conseguir oxigênio
e nutrientes da mãe. Também secreta hormônios para que o útero da mãe retenha o
feto e produza reguladores de resposta imune, fazendo com que a mãe não rejeite o
embrião como faria com um órgão transplantado. No entanto, células do trofoblasto
não são capazes de produzir células do próprio embrião. Elas são necessárias para
implantar células do embrião na parede uterina (Figura 5.23).
O embrião do camundongo é derivado dos descendentes das células internas do
estágio de 16 células, suplementada por células divididas do trofoblasto durante a
transição para o estágio de 32 células (Pedersen et al., 1986; Fleming, 1987). Essas
células geram a massa celular interna que dará origem ao embrião, acompanhada da
bolsa com vitelo, alantóide e âmnio. Essas células não aparentam ser somente diferen-
tes das células do trofoblasto, mas também sintetizam proteínas diferentes nesse está-
gio do desenvolvimento precoce. Durante o estágio de 64 células, a massa celular
interna (aproximadamente 13 células) e as células do trofoblasto se tornam camadas
de células separadas, nenhuma delas contribuindo para células do outro grupo (Dyce
et al., 1987; Fleming, 1987). Dessa forma, a distinção entre os blastômeros do trofo-
blasto e da massa celular interna representa o primeiro evento diferenciado no desen-
volvimento dos mamíferos.
Inicialmente, a mórula não tem uma cavidade interna. No entanto, durante um
processo chamado cavitação, a célula do trofoblasto secreta um fluido para dentro da
mórula para criar a blastocele. A massa celular interna fica posicionada de um lado do
anel de células do trofoblasto (veja Figuras 5.20, 5.22 e 5.23). Essa estrutura é chamada
blastocisto e é outro marco da clivagem de mamíferos.
(A) Estágio precoce de 8 células: não-polar, porém com efeitos de contato local Figura 5.22
Compactação e formação do blastocisto de
camundongo. (A,B) embrião de 8 células, (C)
mórula de 16 células, (D) blastocisto de 32
células. O lado esquerdo representa o organis-
mo inteiro ou sua visão em corte. O lado direi-
to detalha as mudanças associadas com o ama-
durecimento do trofoblasto. (Figuras à direita
segundo Fleming, 1992.)
(B) Compacto de 8 células: polar, correntes iônicas.

Basolateral: adesão de E-caderina; junções de fendas, ZO-1. Microtúbulos acetilados.
Apical: microvilosidades, actina cortical, endossomos, actina citoplasmática, microtúbulos
Apical
Junções apertadas
Lateral
Basal
(C) 16 células:
Adesão basolateral intensificada, laminina, cingulina, mitocôndria, vesículas lipídicas.
Basal: lisossomos, Golgi
Junções apertadas
entre células exteriores
Junções de fendas
entre células interiores
(D) 32 células: transporte vetorial de fluido.

Basolateral: desmossomos. Basal: Na+, K+ - ATPase. Apical: transportadores e canais
Microvilosidades
Massa celular
interna (ICM)
Blastocele
Trofoblasto
E-caderinaDesmossomos Desmossomos Junções apertadas (ZO-1)
Direção da corrente iônica Lisossomos secundários (ZO-1) + cingulina
Na+, K+ - ATPase Golgi Actina cortical

Junções de fendas Filamentos de Microvilosidades
citoqueratina
Proteínas da membrana Microtúbulos e actina Mitocôndrias
apical citoplasmática
Figura 5.23
Implantação de blastocistos de mamíferos
no útero. (A) Blastocistos de camundongo
entrando no útero. (B) Implantação inicial
do blastocisto no útero de um macaco
Rhesus. (A de Rugh, 1967; B cortesia da
Carnegie Institution of Washington, Chester
Reather, fotógrafo.)
(A) (B)
& Especulações
A Superfície da Célula e o Mecanismo de Compactação
C OMPACTAÇÃO CRIA AS cir-

cunstâncias que trazem á tona a pri-
meira diferenciação no desenvolvi-
mento de mamíferos: a separação do trofo-
bém conhecida como uvomorulina), uma
glicoproteína adesiva de 120-kDa, sinteti-
zada no estágio de 2 células é distribuída
uniformemente por toda a membrana celu-
blasto da massa celular interna. Como isso é lar. No entanto, com a ocorrência da
feito? Existe uma crescente evidência que a compactação, a E-caderina se torna restrita
compactação é realizada por intermédio de aqueles sítios da membrana celular que es-
eventos que ocorrem na superfície das célu- tão em contato com os blastômeros adjacen-
las dos blastômeros adjacentes. No primeiro tes. Anticorpos para essa molécula causam
estágio da compactação, cada um dos oito a descompactação da mórula (Figura 5.25;
blastômeros interage com os seus vizinhos (A) Peyrieras et al., 1983; Johnson et al., 1986).
para sofrer polarização da membrana. A porção de carboidrato dessa glicoproteí-
Componentes diferentes da superfície das cé- na pode ser essencial para o seu funciona-
lulas migram para regiões diferentes da cé- mento, sendo a tunicamicina (droga que ini-
lula (veja Figura 5.22; Ziomek e Johnson, be a glicosilação das proteínas) também é
1980). Isso pode ser observado, marcando capaz de prevenir a compactação.
certas moléculas da superfície celular com Experimentos recentes mostraram que
corantes fluorescentes. Uma dessas marca- a via do fosfatidilinositol também pode ser
ções, que reconhece a classe das glicoprote- importante para inicializar a compactação.
ínas, mostra que no estágio de 4 células, es- Se embriões de 4 células de camundongo
sas glicoproteínas são aleatoriamente distri- forem colocados em um meio contendo dro-
buídas por toda a membrana (Figura 5.24A). gas que ativam a proteína quinase C, ocorre
No entanto, na metade do estágio de 8 célu- compactação prematura. Similarmente
las, essas moléculas são encontradas predo- diacilglicerídeos podem momentaneamen-
minantemente nos pólos mais distantes do (B) te provocar a compactação de embriões de
centro do agregado (Figura 5.24B). A pola- 4 células. Quando isso ocorre, a E-caderina
Figura 5.24 Polarização de componentes
rização da membrana é influenciada por in- acumula-se especificamente nas junções
da membrana em blastômeros de camundongo
terações célula a célula porque acontece so- durante o estágio de 8 células. (A) Distribui- entre os blastômeros (Winkel et al., 1990).
mente quando a célula está em contato, no ção homogênea, não-polar, de componentes Esses resultados sugerem que a ativação da
mínimo, com um outro blastômero. Se um da membrana marcados com concanavalina A proteína quinase C pode iniciar a compac-
blastômero for separado do resto do embrião fluorescente no estágio de 4 células. (B) Dis- tação mudando a localização da E-caderina.
perde sua polarização. tribuição heterogênea, polar, desses compo- E finalmente, a membrana celular pode
Proteínas específicas da superfície ce- nentes no estágio de 8 células. (A de Fleming também ser modificada durante a compac-
lular cumprem o seu papel na compactação. et al., 1986; B de Levy et al., 1986. Fotografi- tação, por meio de reorganização do citoes-
Uma dessas moléculas, E-caderina (tam- as cortesia dos autores.) queleto. As microvilosidades, extendidas
por actino-filamentos, aparecem na superfí-

cie de células adjacentes, unindo uma célu-
la à outra. Essas microvilosidades podem
ser os sítios onde a E-caderina está funcio-
nando para mediar adesão intercelular. O
achatamento dos blastômeros um contra o
outro pode, portanto, ter acontecido em vir-
tude do encolhimento do blastômero atra-
vés da despolimerização da actina (Pratt et
al., 1982; Sutherland e Calarco-Gillam, 1983).
Dessa maneira, existem evidências cres- (A) (B)
centes de que a compactação é causada
por mudanças na arquitetura da superfície Figura 5.25
celular dos blastômeros. No entanto, não Prevenção da compactação por anti-soro contra a glicoproteína da superfície celular, E-caderina,
está totalmente certo como esses eventos promotora da adesão. (A) Compactação normal ocorrendo em ausência do anti-soro. (B) Proli-
se relacionam um com o outro, ou como feração sem compactação ocorrendo na presença de anticorpos contra a E-caderina. (Fotografias
são coordenados e integrados na cadeia cortesia de C. Ziomek.)
de eventos que causa a compactação.
Formação da massa celular interna

O processo crucial para o precoce desenvolvimento dos mamíferos é a criação da
massa celular interna distinta do trofoblasto. Como a célula é direcionada para um ou
outro desses caminhos? Como a célula é informada que dará origem a uma porção do
mamífero adulto ou que dará origem a um singular tecido de sustentação que será
descartado no nascimento? As observações de embriões vivos sugerem que essa im-
portante decisão está meramente no fato de a célula estar no lugar certo na hora certa.
Até o estágio de 8 células, não existem diferenças óbvias na bioquímica, morfologia
ou potência de qualquer um dos blastômeros. No entanto, a compactação forma célu-
las internas ou externas com propriedades muito diferentes. Marcando os vários blas-
tômeros, muitos investigadores descobriram que as células que estavam do lado de
fora formariam o trofoblasto, enquanto que as células do lado de dentro formariam o
embrião (Tarkowski e Wróblewska,1967; Sutherland et al.,1990).*Hillman e colegas
(1972) mostraram que quando cada blastômero de um embrião de camundongo de 4
células é colocado na superfície externa de uma massa de blastômeros agregados, as
células externas transplantadas somente darão origem ao tecido trofoblasto. Portanto,
a opção da célula transformar-se em trofoblasto ou embrião depende se essa célula era
externa ou interna após a compactação.
Fuga da Zona P elúcida

Pelúcida
Enquanto o embrião está se movendo através do oviduto, rumo ao útero, o blastocis-
to se expande dentro da zona pelúcida (a matriz extracelular do óvulo foi essencial
para a ligação do espermatozóide durante a fertilização). As membranas celulares das
células trofectodérmicas contêm uma bomba para o sódio (a Na+/K+-ATPase) de fren-
te para a blastocele; as proteínas bombeiam sódio para a cavidade central. Essa acu-
mulação de íons de sódio permite que a água entre por osmose, dessa maneira, dila-
tando a blastocele (veja Figura 5.22; Borland, 1977; Wiley, 1984). Durante esse perío-
do, é essencial que a zona pelúcida previna o blastocisto de aderir às paredes do
oviduto. Quando tal aderência acontece em humanos, é chamada de ectópica ou
* As células internas mostraram virem mais freqüentemente da primeira célula a se dividir no estágio
de 2 células. Essa célula normalmente produz o primeiro par de blastômeros a alcançar o estágio de 8
células, e essas células se dividem de tal modo que elas estão soltas dentro dos blastômeros agregados
(Graham e Kelly, 1977).
gravidez tubária. Essa condição é especialmente grave, porque a implantação do

embrião no oviduto pode causar uma hemorragia com perigo de morte. Quando o
embrião alcança o útero, no entanto, ele deve “livrar-se” da zona pelúcida para que
possa aderir à parede uterina.
O blastocisto do camundongo se livra da zona pelúcida perfurando um pequeno
buraco e se espremendo através dele enquanto se expande (Figura 5.26). Uma protease
semelhante à tripsina, a estripsina, localizada na membrana celular lisa a matriz fibrilar
da zona pelúcida (Perona e Wassarman, 1986; Yamazaki e Kato, 1989). Uma vez fora,
o blastocisto pode fazer contato direto com o útero. O epitélio uterino “agarra” o
blastocisto em uma matriz extracelular contendo colágeno, laminina, fibronectina, ácido
hialurônico e receptores heparan sulfato. As células do trofoblasto contêm os elemen-
tos que irão se juntar ao colágeno uterino, fibronectina e laminina; eles sintetizam o
proteoglicano heparan sulfato dramaticamente no momento anterior à implantação
(veja Carson etal., 1983). Uma vez na célula epitelial uterina, o trofoblasto secreta
outro conjunto de proteases, incluindo colagenase, estromelisina e ativador de
Figure 5.26 plasminogênio. Essas enzimas digestoras de proteínas digerem a matriz extracelular
Blastocisto de camundongo eclodindo da zona do tecido uterino, impedindo o blastocisto de cobrir a si mesmo com a parede uterina
pelúcida. (Fotografia de Mark et al., 1985, cor-
(Strikland et al., 1976; Brenner et al.,1989).
tesia de E. Lacy.)
& Especulações
Gêmeos e células embrionárias precursoras
A S CÉLULAS PRECOCES do em-

brião podem substituir uma à
outra e compensar uma célula
ausente. Isso foi primeiramente demons-
Gêmeos humanos são classificados
em dois grandes grupos: gêmeos mono-
zigóticos (um ovo ou idênticos) e gême-
os dizigóticos (dois ovos ou fraternos).
nária, o âmnio. Esse tecido forma a bolsa
amniótica (ou bolsa de água), envolvendo
o embrião com fluido amniótico, protegen-
do-o da dessecação e movimentos brus-
trado em 1952, quando Seidel destruiu Gêmeos fraternos são o resultado de dois cos (veja Capítulo 6). Se a separação do
uma célula de um embrião de coelho e eventos separados de fertilização, ao pas- embrião acontecesse após a formação do
demonstrou que a célula remanescente so que, gêmeos idênticos são formados cório, no quinto dia, mas antes da forma-
poderia produzir o embrião por inteiro. de um único embrião cujas células, de al- ção do âmnio, no nono dia, os embriões
Uma vez que a massa celular interna guma forma, dissociam uma da outra. Gê- resultantes deveriam ter um cório e dois
(ICM) se separou do trofoblasto, as cé- meos idênticos são provavelmente pro- âmnios (Figura 5.27B). Isso acontece em
lulas da ICM constituem um “grupo de duzidos pela separação de blastômeros aproximadamente dois terços dos casos de
equivalência” onde cada célula da ICM precoces ou mesmo pela separação da gêmeos humanos idênticos. Uma pequena
tem a mesma potência (nesse caso, cada massa celular interna em duas regiões no porcentagem de gêmeos idênticos nascem
célula pode originar todos os tipos de mesmo blastocisto. [cleave3.html] com um único cório e âmnio (Figura 5.27C).
células do embrião, menos o trofoblas- Casos de gêmeos idênticos ocorrem em Isso significa que a divisão do embrião
to), e seus respectivos destinos serão aproximadamente 25% dos nascimentos aconteceu após o nono dia, e tais recém-
determinados por interações entre os humanos. Cerca de 33 % dos gêmeos idên- nascidos correm o risco de serem gêmeos
seus descendentes. Gardiner e Rossant ticos têm dois córios completos e separa- ligados (“Siameses”). [cleave4.html]
(1976) também mostraram que se as célu- dos, indicando que a separação ocorreu A habilidade de produzir um embrião
las da massa celular interna (mas não cé- antes da formação do tecido trofoblasto, completo, a partir de células que normal-
lulas do trofoblasto) são injetadas no no quinto dia (Figura 5.27A). O restante mente iriam produzir somente uma porção, é
blastocisto, também contribuem para um dos gêmeos idênticos compartilham do chamada de regulação e é discutida no
novo embrião. Já que seus blastômeros mesmo cório, sugerindo que a separação Capítulo 15. Regulação é também vista na
podem gerar qualquer tipo de célula no ocorreu dentro da massa celular interna, habilidade que dois ou mais embriões pre-
corpo, a massa celular interna tem sido após a formação do trofoblasto. No nono coces têm para formar um camundongo qui-
referida, às vezes, como pluriblasto dia, o embrião humano já completou a cons- mérico ao invés de gêmeos, trigêmeos ou
(Johnson e Selwood, 1996). trução de uma outra camada extra-embrio- um monstro de múltiplas cabeças. Camun-
Embrião Saco vitelínico 2 Córios
Âmnio
(A)
2 Âmnios
Massa celular interna
1 Cório
(B)
2 Âmnios
Embrião
bicelular
Blastocele
1 Cório
(C)
1 Âmnio
Cório
Figura 5.27
Diagrama mostrando a relação entre a formação de gêmeos monozigóticos humanos e as mem-
branas extra-embrionárias. (A) A cisão ocorre antes da formação da trofectoderma, de modo que
cada gêmeo tem o seu próprio cório e âmnio. (B) A cisão ocorre após a formação da trofectoderma,
porém, antes da formação do âmnio, resultando em gêmeos que têm sacos amnióticos individu-
ais, porém, compartilhando um cório. (C) Cisão após a formação do âmnio conduz a gêmeos em
um saco amniótico, e um único cório. (Segundo Langman, 1981.)
dongos quiméricos são o resultado de duas humanos podem formar quimeras (de la Além disso, eles mostraram que cada um
ou mais clivagens precoces (normalmente Chappelle et al.,1974; Mayr et al.,1979). Es- dos três embriões deram origem a precur-
4- ou 8-células) de embriões que foram agre- ses indivíduos têm dois tipos de células di- sores dos gametas. Quando um quiméri-
gados artificialmente para formar um embrião ferentes (XX e XY) dentro do mesmo cor- co (preto/marrom/branco) fêmea de ca-
composto. Como é mostrado na Figura po, cada uma com o seu conjunto de carac- mundongo acasalava com um macho de
5.28A, as zonas pelúcidas de dois embriões terísticas genéticas. A explicação mais sim- pelugem de cor branca (recessivo), a ni-
geneticamente diferentes são removidas e ples para tal fenômeno é que esses indiví- nhada era um de cada cor.
os embriões são unidos para formar um duos resultaram da agregação de dois em- De acordo com nossas observações
blastocisto em comum. Esses blastocistos briões, um macho e outro fêmea, que esta- sobre formação de gêmeos e camundon-
preparados são implantados no útero da mãe vam se desenvolvendo ao mesmo tempo. gos quiméricos, cada blastômero da mas-
adotiva. Quando nascem, os descendentes Se essa explicação estiver correta, então dois sa celular interna deve ser capaz de pro-
quiméricos têm algumas células de cada em- gêmeos fraternos se fundem para criar um duzir qualquer célula do corpo. Essa hi-
brião. Isso é prontamente observado quan- único indivíduo composto. pótese tem sido confirmada, e terá impor-
do os blastômeros agregados vêm de uma Markert e Petters (1978) mostraram que tantes conseqüências no estudo do de-
linhagem que difere na cor da pelugem. embriões precoces de 8-células podem se senvolvimento dos mamíferos.
Quando blastômeros de linhagem preta e unir para formar uma mórula compactada Quando as massas celulares internas
branca são agregados o resultado é normal- comum (Figura 5.29) e que o camundon- são isoladas e crescem sob certas condi-
mente um camundongo malhado (Figura go resultante pode ter a cor da pelugem ções, permanecem indiferentes e continu-
5.28B). Existe até evidência que embriões de três linhagens diferentes (prancha 21). am a se dividir em cultura (Evans e Kaufman,
(A) Figura 5.28

Produção de camundongos quiméricos. (A)
Procedimento experimental para a produção
de camundongos quiméricos. Embriões de ca-
Zona mundongos geneticamente distintos (aqui
Pronase aqueles com diferentes cores do pêlo) no iní-
pelúcida
cio do estágio de 8 células são isolados dos
ovidutos dos camundongos e reunidos após
remoção de suas zonas pelúcidas por ação de
enzimas proteolíticas. As células formam um
blastocisto composto, que é implantado no
útero de uma mãe de criação. (B) Um camun-
dongo adulto quimérico mostrando contribui-
Blastômeros ções dos embriões pigmentados (pretos) e
não-pigmentados (brancos). (Fotografia cor-
(A)
tesia de B. Mintz.)
1981; Martin, 1981). Essas células são cha-

madas de células-tronco embrionárias (cé-
Blastocisto lulas ES). Como foi mostrado no capítulo
2, essas células podem ser alteradas na pla-
Blastocistos implantados ca de Petri. Genes clonados podem ser in-
na mãe de criação seridos dentro de seu núcleo, ou genes
existentes podem ser mutados. Quando
essas células ES são injetadas nos
blastocistos de um outro gene de camun-
dongo, elas podem integrar a sua massa
(B)
celular interna hospedeira. O embrião re-
sultante tem células vindas de ambos teci-
dos, hospedeiro e doador. Essa técnica se
tornou extremamente importante para de-
terminar a função dos genes durante o de-
senvolvimento de mamífero.
(B)
(C )
Figura 5.29
Agregação e compactação de três embriões de ca-
mundongo, no estágio de 8 células, para formar um
única mórula compactada. Células de três diferen-
tes embriões (A) são agregadas para formar uma
mórula (B) que sofre compactação para formar um
blastocisto único (C). O camundongo quimérico re-
sultante é mostrado na Prancha 21. (de Markert e
Petters, 1978, cortesia de C. Markert.)
Clivagem Meroblástica
Como já foi mencionado anteriormente, concentrações de vitelo cumprem um papel
importante na clivagem celular. Em parte alguma isso está tão aparente como nos tipos
de clivagem meroblástica. Aqui, as grandes concentrações de vitelo proíbem a clivagem
no seu todo, exceto em uma pequena porção do citoplasma do ovo. Na clivagem
discoidal, a divisão celular é limitada a um pequeno disco de citoplasma sem vitelo no

topo de um monte formado por vitelo. Na clivagem superficial, o vitelo centralizado
permite a clivagem somente na borda periférica do ovo.
Clivagem discoidal
Clivagem discoidal é uma característica de aves, peixes e répteis.
AVES. A Figura 5.30 mostra a clivagem de um ovo de ave. A massa do oócito é Sulcos de clivagem
tomada pelo vitelo, permitindo que a clivagem ocorra somente no blastodisco, uma
região de citoplasma ativo de aproximadamente 2-3mm de diâmetro no pólo animal
do ovo. Porque essas clivagens não se estendem para o vitelo citoplasmático, as
células da clivagem precoce são, na realidade, contínuas nas suas bases. O primeiro
sulco de clivagem aparece centralizado no blastodisco, e outras clivagens se seguem
para criar um blastoderma de camada única. Num primeiro instante, essa camada
celular está incompleta, já que as células permanecem contínuas ao vitelo subjacente.
Daí por diante, clivagens equatoriais e verticais dividem o blastoderma em um teci-
do de cinco a seis camadas celulares. Essas células permanecem ligadas com jun-
ções apertadas (Bellairs et al.,1975; Eyal-Giladi, 1991). Entre o blastoderma e o
vitelo existe um espaço chamado cavidade subgerminal, criado quando uma célula
blastodérmica absorve fluido da albumina (“branco do ovo”) e secreta-o entre si e o
vitelo (New, 1956). Nesse estágio, as células mais profundas do centro do blastoderma
são descartadas para criar uma zona pelúcida unicelular (as células descartadas
Blastoderma
parecem morrer). O anel periférico das células blastodérmicas que não são descarta-
das constituem a zona opaca.
Quando uma galinha se considera pronta para botar um ovo, o blastoderma já
contém 60.000 células. Algumas dessas células são delaminadas em cavidades
subgerminais para formar uma segunda camada (Figura 5.31). Dessa maneira, logo
após a galinha ter botado o ovo, esse contém duas camadas de células: a superior
epiblasto e a inferior hipoblasto. Entre elas está a blastocele. Detalharemos a forma- Figura 5.30
ção do hipoblasto no próximo capítulo. Clivagem discoidal em um ovo de galinha,
vista do pólo animal. Os sulcos de clivagem
PEIXES. Nos últimos anos, o peixe zebra, Danio rerio, se tornou o organismo favo- não penetram no vitelo, e é produzido um
rito para quem deseja estudar o desenvolvimento dos vertebrados. Esses peixes têm blastoderma formado por uma única camada
grandes crias, procriam o ano inteiro, são facilmente mantidos, têm embrião transpa- de células.
rente que se desenvolve fora da mãe (uma característica importante para a microscopia),
e pode ser criado para que mutantes possam ser protegidos e propagados. Ademais,
eles se desenvolvem rapidamente, para que 24 horas após a fertilização, o embrião já
tenha formado a maior parte de seus tecidos e órgãos primordiais, apresentando como
característica a forma semelhante ao girino (veja Granato e Nüsslein-Volhard, 1996;
Langeland e Kimmel, 1997).
Os ovos de peixes com muito vitelo desenvolvem-se similarmente aos das aves,
Figura 5.31
com a divisão celular ocorrendo somente no blastodisco do pólo animal. Observa-
Formação de um embrião do pinto com duas
ções da clivagem de ovos de peixe através de micrografia ao microscópio eletrônico camadas. Essa seção sagital próxima à margem
posterior, mostra uma camada superior con-
sistindo de um epiblasto central que irá entrar
nas células da foice de Koller (ks) e na zona
marginal posterior (mz). Certas células do epi-
blasto caem (delaminam) da camada superior
para formar ilhas de polinvaginação (pi) com 5
a 20 células cada. Essas células serão acresci-
das por aquelas células hipoblásticas (hyp)
que migraram anteriormente da foice de Koller
para formar a camada inferior (hipoblástica).
(Sc é a cavidade subgerminal; gwm é a margem
da parede germinal). (de Eyal-Giladi et al.,
1992, cortesia de H. Eyal-Giladi.)
(A) (B) (C)
(D)
Figura 5.32
Clivagem discoidal em um peixe-zebra, cri-
ando uma região celular acima do vitelo den- (E) (F)
so. Em (A), BD significa a região do
blastodisco. (de Beams e Kessel, 1976, cor-
tesia dos autores.)
de varredura mostram, de uma bela maneira, a natureza incompleta da clivagem
discoidal (Figura 5.32). Como nos embriões de anfíbios e de ouriços-do-mar, divi-
sões com clivagens precoce seguem um padrão altamente reprodutível de clivagem
meridional e equatorial. Essas divisões são rápidas, com periodicidade de aproxima-
damente 15 minutos cada. As primeiras 12 divisões ocorrem sincronicamente, for-
mando um monte celular situado no pólo animal de uma grande célula de vitelo.
Inicialmente, todas as células mantêm conexões abertas umas com as outras e com a
célula de vitelo subjacente para que células de tamanho moderado (17-kDa) passem
livremente de um blastômero ao outro (Kimmel e Law, 1985). Começando por vol-
ta da décima divisão, pode ser detectado o início da transição da blástula intermedi-
ária: começa a transcrição do gene zigótico, desaceleração das divisões celulares e o
movimento celular é evidente (Kane e Kimmel, 1993).
Neste ponto, duas populações de células podem ser distinguidas. A primeira é a
camada de vitelo sincicial (YSL). A YSL é formada no nono ou décimo ciclo, quan-
do as células da parte vegetal do blastoderma se fundem com a célula do vitelo adja-
cente. Isso produz um anel de núcleos com essa parte do citoplasma da célula do
vitelo localizado bem embaixo do blastoderma. Expandindo vegetalmente, o
blastoderma envolve a célula do vitelo, parte do vitelo sincicial se moverá para baixo
do blastoderma, para formar a YSL interna e parte dos núcleos se moverá vegetalmente,
ficando à frente da margem do blastoderma, para formar a YSL externa (Figura 5.33A,B).
A função da YSL ainda não foi esclarecida.
A segunda população celular distinguida na transição da blástula intermediária é a
camada envolvente (EVL; veja Figura 5.33A). Essas são as células mais superficiais do
(A) (B)
Camada
envolvente (EVL)
Blastoderma
Células
profundas
YSL interna
Núcleos
sinciciais
do vitelo
YSL externa
Microtúbulos
Célula do vitelo
Figura 5.33
(C) Pólo animal A blástula do peixe–zebra. (A) antes da gastrulação, células profun-
Nariz, das estão rodeadas pelo EVL. A superfície animal do vitelo é achatada
olho e contém os núcleos do YSL. Microtúbulos se estendem através do
citoplasma vitelínico e da região externa do YSL. (B) Estágio tardio de
Epiderme Cérebro
Ectoderma blástula, mostrando a YSL. Os núcleos dessas células são derivados
Crista neural Medula espinhal de células da margem do blastoderma, que liberou seus núcleos para o
Mesoderma citoplasma vitelínico. (C) Mapa do destino das células profundas
Somito do músculo Cabeça depois que a mistura de células cessou. A vista lateral é mostrada, e
Ventral Prônefron Dorsal
Sangue Nadadeiras Coração Músculo Notocorda não todos os destinos dos órgãos estão identificados (para clareza). O
Intestino Faringe Endoderma mapa é gerado injetando células com corante de alto peso molecular,
Fígado
Margem do blastoderma
determinando em seguida, quais órgãos as células carregadas de corante
geraram. (A e C segundo Langeland e Kimmel, 1996; B de Trinkaus,
1993, cortesia do autor.)
Célula do vitelo
Pólo vegetal
blastoderma, e a EVL é uma cobertura epitelial fina composta apenas de uma camada
de células. A EVL finalmente forma a periderme, uma proteção extra-embrionária co-
brindo o que se pensa ser descartado mais tarde durante o desenvolvimento.
Entre a EVL externa e a YSL interna estão as células profundas, das quais surgirá
o embrião propriamente dito. Os destinos das células blastodérmicas precoces não
estão determinados, e os estudos de linhagem celular (onde um corante fluorescente
não difusível é injetado em uma das células e os descendentes daquela célula podem
ser seguidos) mostram que existe muita mistura de células durante a clivagem. Além
do mais, qualquer célula pode dar origem a uma variedade imprevisível de descenden-
tes de tecido (Kimmel e Warga, 1987; Helde et al., 1994). O destino da célula
blastodérmica parece ser fixado pouco antes do começo da gastrulação. Nesse perío-
do, células em regiões específicas do embrião originam certos tecidos de uma maneira
altamente previsível, permitindo que um mapa do destino possa ser traçado (Figura
5.33C; Kimmel et al., 1990).
O processo pelo qual a célula contribui para o tecido envolve uma narrativa progressi-
va de possíveis destinos para o desenvolvimento de uma determinada célula. Esse com-
portamento pode ser observado em algumas das primeiras células a terem seu destino
estabelecido - as células precursoras do coração (Stainer et al., 1993; Lee et al., 1994).
Figura 5.34 (A) (B)

Mapa do destino das células profundas da
blástula do peixe-zebra. Injeção de um único
blastômero na blástula precoce (estágio de
256-512 células) com rodamino-dextrano. Se Ventral Dorsal Célula do vitelo
a célula estiver perto da margem, a meio ca-
minho entre os pólos dorsal e ventral, a pro-
gênie da célula está restrita a formar parte do Saco
coração. Nesse estágio, as células marcadas vitelínico
formam descendentes que podem popular
tanto a aurícula como o ventrículo. Se a inje-
ção em tais células for feita em um estágio
mais tardio da blástula, seus descendentes irão
popular uma câmara somente. (Segundo
Células individuais que margeiam na metade do caminho as futuras superfícies
Stainier et al., 1993.)
dorsal e ventral de um embrião em estágio de meia clivagem, podem dar origem às
células que povoam ambos, o endocárdio e o miocárdio (Figura 5.34A,B). Um
pouco mais tarde, os descendentes de qualquer célula podem povoar somente o
miocárdio ou o endocárdio. Mais tarde ainda, os descendentes de uma célula so-
mente serão capazes de povoar subcompartimentos específicos de tecido. Por
exemplo, células da blástula intermediária podem contribuir para a progênie de
ambos, átrio e ventrículo do coração.
Figura 5.35
Clivagem superficial em embrião de Droso-
phila. O numeral acima de cada embrião Clivagem Superficial
corresponde ao número de minutos decorrido A maior parte dos ovos dos insetos passa por clivagem superficial, onde uma grande
após a deposição do ovo; o numeral abaixo de quantidade de vitelo centralizada confina a clivagem para a borda citoplasmática do
cada embrião indica o número de núcleos pre- ovo. Um dos detalhes fascinantes desse tipo de clivagem é que as células não se for-
sentes. Células polares (que formarão as célu- mam até que os núcleos tenham se dividido. A clivagem de um ovo de inseto é mostra-
las germinativas) são vistas no estágio de 512 da na Figura 5.35. O núcleo do zigoto sofre várias divisões mitóticas dentro da parte
núcleos, embora o blastoderma celular se for-
central do ovo. Na Drosophila, 256 núcleos são produzidos por uma série de divisões
me 3 horas mais tarde. Os tempos são repre-
nucleares durando, em média, 8 minutos cada. Depois o núcleo migra para a periferia
sentativos, já que a duração de cada ciclo de
divisão depende, em parte, da temperatura em do ovo, onde as mitoses continuam, embora com uma velocidade diminuída. O em-
que o ovo está sendo incubado.
Núcleos
(enérgides)
Enérgides migram Células Blastoderma Células polares

para a periferia polares celular
brião é chamado agora de blastoderma sincicial, significando que todas clivagens

nucleares estão contidas em um único citoplasma. Nenhuma membrana celular existe
a não ser a do próprio ovo. Aqueles núcleos migrando para o pólo posterior do ovo
logo ficam envolvidos pelas novas membranas celulares para formar o pólo de células
do embrião. Essas células dão origem às células germinativas dos adultos. Dessa ma-
neira, um dos primeiros eventos do desenvolvimento dos insetos é a separação das
futuras células germinativas do resto do embrião.
Após as células polares terem sido formadas, a membrana do oócito dobra-se para
dentro, entre os núcleos, conseqüentemente, separando cada núcleo somático para
uma única célula (Figura 5.36). Isso forma o blastoderma celular, com todas as
células arranjadas como uma cobertura de camada única envolvendo o núcleo do ovo.
Como qualquer outra formação celular, a criação do blastoderma celular envolve uma
interação delicada entre microtúbulos e microfilamentos. A primeira fase da
celularização do blastoderma é caracterizada pela invaginação das membranas celula-
res e sua rede de actina subjacente nas regiões entre o núcleo. Esse processo é inibido
por drogas que bloqueiam os microtúbulos. Após as membranas e sua actina terem
passado o nível do núcleo, a segunda fase da celularização ocorre. Aqui a velocidade
da invaginação aumenta, e o complexo de actino-membranas começa a apertar o que
será o terminal basal da célula (Schejter e Wieschaus, 1993; Foe et al., 1994). Na
Drosophila, essa camada é composta por aproximadamente 6000 células e é formada
4 horas após a fertilização. [cleave5.html]
Embora os núcleos se dividam originalmente dentro de um citoplasma em comum,
isso não significa que o citoplasma seja uniforme. Karr e Alberts (1986) mostraram que
cada núcleo dentro do blastoderma sincicial está contido dentro de seu próprio pe-
queno território de proteínas citoesqueléticas. Quando o núcleo alcança a periferia
durante o décimo ciclo da clivagem, cada núcleo fica cercado por microtúbulos e
Superfície do ovo
Fuso mitótico
Sulco de clivagem
Áster
Núcleo
Canal do sulco
Microtúbulos
Figura 5.36
Alongamento nuclear e celularização do blas-
toderma de Drosophila. (Segundo Fullilove e
Membrana vitelínica Jacobson, 1971.)
(A) (B) (C)

Prófase 12
Núcleos Microfilamentos Microtúbulos
Figura 5.37
Localização do citoesqueleto em volta de núcleos no blastoderma sincicial de Drosophila. Um
embrião de Drosophila entrando na prófase da décima-segunda divisão mitótica, foi secionado
e corado triplamente. (A) Os núcleos foram localizados por um corante que se liga ao DNA. (B)
Microfilamentos foram identificados usando anticorpo fluorescente para actina. (C) Microtú-
bulos foram reconhecidos por um anticorpo fluorescente para tubulina. Domínios do citoesque-
leto podem ser vistos em volta de cada núcleo. (de Karr e Alberts, 1986, cortesias de T. L. Karr.)
microfilamentos. O núcleo e suas ilhas citoplasmáticas associadas são chamados

enérgides. A Figura 5.37 mostra o núcleo e seu microfilamento essencial e os domínios
do microtúbulo na prófase da décima segunda divisão mitótica.
Após o núcleo alcançar a periferia, o tempo necessário para completar cada uma
das próximas quatro divisões se torna gradualmente maior. Enquanto os ciclos de 1 a
10 duram 8 minutos cada, o ciclo 13, o último ciclo no blastoderma sincicial, leva 25
minutos para se completar. O embrião de Drosophila forma células no ciclo 14 (i.e.
após 13 divisões), e o ciclo 14 é assincrônico. Alguns grupos de células completam
esse ciclo em 75 minutos, enquanto outro grupo leva 175 minutos (Foe, 1989). A
transcrição desses núcleos (que começa por volta do décimo primeiro ciclo) é muito
intensificada. A desaceleração da divisão celular da Drosophila e o aumento
concomitante na transcrição do RNA é freqüentemente referido como transição da
blástula intermediária (midblastula transition). Tais transições também são vistas
nos embriões de inúmeros vertebrados e de filos invertebrados. O controle dessa
desaceleração mitótica (em embriões de Xenopus, ouriço-do-mar, estrela-do-mar e
Drosophila) aparenta sofrer efeito da razão da cromatina para o citoplasma (Newport
e Kirshner, 1982a; Edgard et al., 1986). Edgard e seus colegas compararam o desen-
volvimento inicial de embriões de Drosophila do tipo selvagem com os do mutante
haplóide. Os embriões haplóides de Drosophila têm a metade da cromatina a cada
divisão celular, em comparação com os do tipo selvagem. Daqui para frente, um em-
brião haplóide no oitavo ciclo celular tem a mesma quantidade de cromatina quanto
um embrião do tipo selvagem no sétimo ciclo. Esses investigadores descobriram que
enquanto embriões do tipo selvagem formam sua camada celular imediatamente após
a décima terceira divisão, os embriões haplóides passaram por uma divisão extra, a
décima quarta, antes da celularização. Além do mais, a duração dos ciclos 11 a 14 em
embriões do tipo selvagem, corresponde aos ciclos 12 ao 15 em embriões haplóides.
Dessa maneira, os embriões haplóides seguem um padrão similar aos embriões do tipo
selvagem, porém, com defasagem de uma divisão celular.
Se essa defasagem fosse devida ao fato dos mutantes haplóides terem uma
razão de cromatina para o citoplasma de metade, em relação a do tipo selvagem,
em um determinado ciclo, então seria possível acelerar a celularização amarrando
(ligando) algum citoplasma, fazendo com que os núcleos se dividam em um volu-
me menor. Quando essa ligação foi realizada, o padrão mitótico do embrião foi
acelerado. A divisão final do blastoderma, sinalizando o fim do período de clivagem,
é alcançada quando existe um núcleo para cada 61 µm3 de citoplasma. Em Xeno-

pus, uma desaceleração similar na taxa mitótica é observada após a décima segun-
da divisão celular. Aqui também, as divisões daqui para frente se tornam
assincrônicas. Experimentos de ligação sugerem que o tempo de duração da tran-
sição dessa blástula intermediária também é função da razão volumes cromatina/
citoplasma (Newport e Kirschner, 1982a,b).
Em ambos, Drosophila e Xenopus, a iniciação da transcrição pode ser induzida
prematuramente aumentando artificialmente a duração do ciclo celular. Quando
cicloheximida (um inibidor da síntese protéica) atrasa a divisão celular, a transição da
blástula intermediária é induzida precocemente em Xenopus, e uma explosão de trans-
crições ocorre em Drosophila (Edgard et al., 1986; Kimelman et al., 1987).
& Especulações
Exceções, Generalizações,
e Clivagem Parasítica da Vespa
O QUE CONSIDERAMOS “nor-
mal” e o que marginalizamos
como “exceções”, freqüentemen-
te reflete quais animais são mais acessí-
volvimento conhecem apenas o desenvol-
vimento de uma espécie: Drosophila me-
lanogaster. A Drosophila ganhou proe-
minência somente depois que se fez ne-
tro do ovo de uma outra espécie. Com o
desenvolvimento do ovo hospedeiro (nor-
malmente de uma mariposa), o mesmo acon-
tece com o ovo do parasita. No entanto,
veis para o estudo e mais facilmente do- cessário relacionar fenômenos embrioló- enquanto o ovo do hospedeiro começa o
mesticados para o laboratório. Não é ne- gicos com genes particulares. Em 1941, o seu desenvolvimento no padrão superfici-
cessário dizer, que isso não reflete neces- maior compêndio do desenvolvimento de al usual, o ovo da vespa divide holoblas-
sariamente as condições do mundo natu- insetos (Embriologia dos insetos e ticamente. Ademais, ao invés de diferenci-
ral. Pelo contrário, nossas discussões de Miriápodes, Johannsen e Butt) sequer ar o eixo do corpo, as células do embrião
desenvolvimento animal são freqüente- mencionava essa espécie em seu índice. parasita dividem-se repetidamente para se
mente dificultadas por certos organismos Insetos são um excepcionalmente bem- tornar uma massa de células não diferenci-
em particular. O desenvolvimento de anfí- sucedido e espalhado subfilo, não sendo adas chamadas poligerme. Em duas sema-
bios é geralmente representado pelo Xe- surpreendente encontrar uma grande vari- nas, a poligerme em crescimento fica
nopus laevis, e o camundongo e o ho- abilidade no seu desenvolvimento. O de- suspensa no hospedeiro, permanecendo
mem são os únicos mamíferos cujos desenvolvimento da vespa parasita Copido- frouxamente atada ao cérebro e traquéia
senvolvimentos são usualmente estuda- somopsis tanytmemus difere marcadamente larvais (Figura 5.38A; Cruz, 1986a).
dos. Similarmente, embora haja mais de daquele da Drosophila canônica. Como Figura 5.38 Desenvolvimento de vespas
800.000 espécies de insetos conhecidas, muitas outras espécies parasitárias, a fê- parasitárias (Encyrtidae). (A) Clivagem
a maior parte dos biologistas do desen- mea C. tanytmemus deposita seu ovo den- holoblástica do ovo de Copidosomopsis
tanytmenus produz uma poligerme de células
não-diferenciadas. (B) Larvas precoces de um
Olho/cabeça da gênero relacionado, Pentalitomastix, atacam a
lagarta hospedeira larva de Trathala dentro do mesmo hospedei-
ro. A fotografia é de um hospedeiro recém-
aberto. (A segundo Cruz, 1986a; B de Cruz,
1981, cortesia de Y. Cruz.)
Mórula de Esôfago
4 dias
Corpo gorduroso
do hospedeiro
Ovo
(A)
Poligerme
Poligerme
precoce
(B)
Poligerme em expansão
Com o crescimento, a poligerme se divi- reproduzem, morrendo assim que as larvas pulam (a maioria das vezes sobre o corpo
de em dúzias (às vezes milhares, dependen- normais se formam. Enquanto elas vivem, no do hospedeiro morto), acham um novo
do da espécie) de discretos grupos de célu- entanto, vão até o embrião hospedeiro ma- hospedeiro para depositar os seus ovos
las. Cada um desses grupos se torna um tando as larvas parasitas de outros indivídu- e morrem logo em seguida.
embrião! A vespa poliembrionária Copido- os (de espécies diferentes e de outros clones Tal ciclo de vida incomodava Charles
soma floridanum produz até 2000 indivídu- da mesma espécie). Em outras palavras, as Darwin, fazendo-o questionar o conceito de
os de um único ovo fertilizado (Grbic et al., larvas precoces são formas predatórias que uma divindade benigna conhecida por to-
1996). Essa habilidade que um ovo tem para eliminam possíveis competidores (Cruz, 1981, dos. Em 1860 ele escreveu ao biologista
se transformar em uma massa de células, 1986b; Grbic and Strand, 1992). americano Asa Gray: “Eu não consigo me
que rotineiramente forma numerosos embri- Com a morte das larvas precoces (e convencer de que o benevolente e onipo-
ões, é chamada de poliembrionia. (Poliem- suas presas), a larva normal emerge da tente Deus tenha planejado e criado a
brionia é característica de certos grupos de sua primeira mudança de pele, começa a Ichneumonidae com a expressa intenção
insetos e certas espécies de mamíferos, tais se alimentar vorazmente dos órgãos da delas se alimentarem dentro dos corpos vi-
como o tatu de nove bandas, cujos ovos larva hospedeira. Em 40 dias, a criação vos de lagartas”. No entanto, além de sua
formam quádruplos idênticos.) A maior par- parasita já se alimentou dos músculos do utilidade de provocar noções de descon-
te desses embriões de vespa parasita se de- hospedeiro, gordura corporal, gônadas, forto no que se refere a ordem natural e na-
senvolvem em larvas normais que levam glândulas de seda, intestinos, cordões tureza da “individualidade”, as vespas pa-
aproximadamente 30 dias para se desenvol- nervoso e hemolinfa, e o hospedeiro é um rasitas podem ter conseqüências econômi-
ver. Um grupo menor, de cerca de 10 pouco mais do que um saco de pele segu- cas importantes. Macrocentrus grandii é
porcento do número total de embriões, se rando cerca de 70 larvas pupantes de ves- uma vespa poliembrionária que parasita a
tornam larvas precoces (Figura 5.38B), que pa. Após outros 5 ou 6 dias, os novos broca Européia do milho. A habilidade de
se desenvolvem em uma semana. Elas não adultos perfuram o tegumento do hospe- um inseto se formar de um embrião por cli-
só se desenvolvem precocemente, como têm deiro e, em uma cena recordando o filme vagem holoblástica, deve também nos en-
muito pouca estrutura e não sofrem meta- Alien, provocam a abertura e a saída do corajar a apreciar a plasticidade da natureza,
morfose. São essencialmente um conjunto hospedeiro, literalmente por comer o seu desencorajando generalizações precipitadas
de mandíbulas móveis. Essas larvas não se corpo. Esses adultos freqüentemente co- sobre um completo subfilo de organismos.
■ MECANISMO DE CLIVAGEM
Regulando o ciclo da clivagem
O ciclo celular das células somáticas é funcionalmente dividido em quatro estágios
(Figura 5.39A). Após a mitose (M), temos o intervalo da pré-replicação (G1), em
seguida acontecendo a síntese do DNA (S). Após o período da síntese, temos o inter-
valo pré-mitótico (G2), seguido pela mitose. A progressão dessas fases é regulada por
fatores de crescimento. Em blastômeros de clivagem precoce, no entanto, a divisão
celular pode ser muito simples. Blastômeros precoces de ouriço-do-mar não têm G1
replicando o seu DNA durante a última parte (telófase) da mitose prévia (Hinegardner
et al., 1964). Os núcleos de Xenopus e Drosophila eliminaram as fases G1 e G2 duran-
te a clivagem precoce. (Embriões de Xenopus adicionam essas fases ao ciclo celular,
algum tempo após a décima segunda clivagem. Drosophila adiciona G2 durante o ciclo
14 e G1 durante o ciclo 17.) Nas primeiras 12 divisões, Xenopus divide-se sincronica-
mente em um ciclo celular bifásico: S para M e M para S (Figura 5.39B; Laskey et al.,
1977; Newport e Kirschner, 1982a).
Os fatores que regulam esse ciclo bifásico estão localizados no citoplasma. Oócitos
normais de Xenopus, quando aumentam, são detidos na primeira prófase meiótica. São
incapazes de se dividirem. Se os núcleos de células divididas forem transplantados
para esses oócitos, também param a divisão. Quando oócitos normais são estimulados
por progesterona, retomam sua divisão meiótica e param na metáfase da segunda
meiose. Se o núcleo de células não divididas (como neurônios) são colocados no
citoplasma de oócitos tratados com progesterona, também iniciam a divisão e param
(A) (B)
Ciclina B
Ciclina D
Ciclina A
Ciclina E
Ciclina A
Figura 5.39
Ciclos celulares de células somáticas e blastômeros precoces. (A) Ciclo celular de uma célula
somática típica. A Mitose (M) é seguida por uma condição de “interfase”. Esse último período
é subdividido em fases G1, S (síntese) e G2. Células que estão se diferenciando são geralmente
“removidas” do ciclo celular e estão numa fase G1 estendida chamada G0. As ciclinas e suas
respectivas quinases, responsáveis para progressão através do ciclo celular, são mostradas no
seu ponto de regulação do ciclo celular. (B) Ciclo celular bifásico mais simples dos blastômeros
precoces de anfíbios, tendo somente dois estados, S e M. (A segundo Nigg, 1995.)
na metáfase (Gurdon, 1968). O citoplasma de oócitos estimulados com progesterona

ainda passam por contrações corticais periódicas (característica da divisão), mesmo
na ausência de núcleos ou centríolos. Se fragmentos clonados de DNA são injetados
nesses embriões anucleados, sua replicação sofre o controle desse ciclo (Hara et al.,
1980; Harland e Laskey, 1980; Karsentiket al.,1984). Dessa maneira, a capacidade de
divisão celular é regulada pelo citoplasma.
Fator promotor de maturação

Alguns dos fatores que governam a síntese do DNA e a divisão celular foram iden-
tificados. O fator induzido por progesterona que permite o núcleo do oócito reto-
mar suas divisões é uma fosfoproteína de duas subunidades chamada de fator de
promoção da maturação (MPF, também conhecida como fator promotor da mitose.
O MPF foi primeiro descoberto como o principal fator responsável pela retomada
das divisões celulares meióticas no ovo ovulado de rã (Smith e Ecker, 1969; Masui
e Markert, 1971). Esse mesmo fator continua realizando o seu papel após a fertili-
zação, regulando o ciclo bifásico dos blastômeros precoces de Xenopus. Gerhart e
colegas (1984) mostraram que o MPF sofre mudanças cíclicas nos níveis de ativida-
de nas células mitóticas. A atividade do MPF de blastômeros precoces de rãs é
maior durante M e não detectável durante S. Durante essa fase S, o MPF existe em
estado inativo. Essa ciclicidade também é observada em blastômeros anucleados.
Newport e Kirschner (1984) demonstraram que a replicação do DNA (S) e mitose
(M) são dirigidas somente pelo ganho ou perda de atividade do MPF, mesmo na
ausência de síntese protéica. As células em clivagem pode ficar presas na fase S,
incubando-as com um inibidor de síntese protéica. Quando o MPF é microinjetado
nessas células, elas entram em M. Seus envoltórios nucleares se partem e suas
cromatinas condensam-se em cromossomos. Após uma hora, o MPF é degradado e
os cromossomos retornam à fase S.
& Especulações
MPF e Seus Reguladores

A pequena subunidade do MPF: (Cisek e Corden, 1989), e a fosforilação da A pequena subunidade de MPF tem
A cdc2 Quinase (Quinase- RNA polimerase pode ser a responsável sido notavelmente conservada através da
Ciclina-dependente, CDK) pela inibição da transcrição durante a evolução e é quase idêntica àquela da fos-
MPF tem uma subunidade grande e outra mitose. Um quarto alvo da quinase pare- foproteína indutora de mitose, p34, sinteti-
pequena. A pequena subunidade de MPF é ce ser a subunidade reguladora de miosina zada pelo gene cdc2 da levedura (Dunphy
uma proteína quinase que, quando ativada, citoplasmática. Quando essa proteína é et al., 1988; Gautier et al., 1988). De fato, o
pode fosforilar uma variedade de proteínas. fosforilada, ela se torna inativa e incapaz gene humano que codifica a proteína cor-
Dessa forma, MPF funciona adicionando de funcionar como uma ATPase dirigindo respondente à pequena subunidade do
grupos fosfatos às proteínas específicas. os filamentos de actina envolvidos na di- MPF de Xenopus pode ser inserido no ge-
Um desses alvos é a histona H1, que se liga visão celular (Satterwhite et al., 1992). A noma da levedura e causar divisão nos
ao DNA. A fosforilação dessa proteína pode inibição dessa miosina durante os estági- mutantes de levedura deficientes em cdc2
levar à condensação cromossômica. Outro os iniciais da mitose, pode prevenir divi- (Lee e Nurse, 1987). A proteína p34 pode
alvo é o envoltório nuclear. Quinze minutos sões da célula até depois dos cromosso- existir em formas fosforiladas e desfosfori-
após a adição do MPF, as três proteínas mos terem-se separado. lada. A forma ativa parece ser fosforilada
principais (as lâminas) do envoltório nucle-
ar se tornam hiperfosforiladas, e nos próxi-
mos 15 minutos, o envoltório se despolime- Figura 5.40 O desenvolvimento da regulação do ciclo celular na embriogênese de Drosophila.
rizou e está se desfazendo (Miake-Lye e (A) Ciclina e proteína cdc25 (cordão) são abundantes antes da fertilização. Portanto, durante os
Kirschner, 1985; Arion et al., 1988). A MPF primeiros sete ciclos celulares, a atividade da MPF quinase permanece constante e as divisões
quinase purificada já foi mostrada fosforilar celulares prosseguem tão rapidamente quanto funcionam as enzimas e os substratos. À medida
que a ciclina é degradada, sua síntese (de mRNA estocado no citoplasma) torna-se limitante no
esses envoltórios nucleares de proteínas, e
ciclo 8. No ciclo 14, o mRNA materno para ciclina desapareceu, e deve ser sintetizado de genes
realizar sua despolimerização in vitro (Peter
nucleares. Além disso, a degradação das proteínas do cordão comanda nova síntese a partir do
et al., 1990; Ward e Kirschner, 1990). Um
núcleo. Pré-MPF acumula mas não é ativado até que a fosfatase cordão cliva os fosfatos T-14 e
terceiro alvo parece ser a RNA polimerase Y-15 da cdc2 quinase. O mecanismo que relaciona a atividade do MPF com o término da síntese
de DNA e a iniciação da citocinese estão sendo investigados. (Segundo Edgar et al., 1994.)
Regulado maternalmente Regulado zigoticamente
Ciclina maternal Proteína maternal de cordão presente

e proteínas de
cordão presentes Ciclina
Pré-MPF MPF ativo
Ciclina Desfosforilação Ciclina
MPF ativo Ciclina mRNA Ciclina
Degradação Síntese de
Proteína Ciclina ciclina cdc 25/cordão
(zigótica) fosfatase (zigótica)
Ciclina Ciclina
Síntese de MPF ativo

ciclina
Ciclina
Degradação da ciclina
Mitose Mitose Mitose Mitose
Quinase ativa de Ciclo dirigido pela tradução de Ciclo dirigido pela cdc25/fosfatase de cordão
proteínas maternas nova ciclina de mRNA materno
(limita substrato)
Ciclo
Divisões nucleares
em treonina-161 (T-161) e desfosforilada em xo MPF. A ciclina permite a subunidade ximo ciclo, o cordão mRNA materno é de-
tirosina-15 (Y-15). Ambas condições são quinase cdc2 tornar-se fosforilada nos re- gradado; se o núcleo não transcrever seu
importantes para a atividade da quinase síduos treonina-14 (T14), tirosina-15 (Y15) próprio cordão mRNA, as células não se
(Gould e Nurse, 1989; Solomon, 1993). e treonina-161 (Figura 5.40). A fosforilação dividirão. Edgard e O’Farrel (1989) mos-
no T-161 é necessária para a atividade do traram que aquelas células que se divi-
A maior subunidade do MPF: MPF, mas fosforilações nos T-14 e Y-15 a dem estão sintetizando a sua própria
Ciclina inibem. Dessa forma, quando fosforilada fosfatase cdc25, enquanto aquelas que
Então, como é regulado o MPF? Desde que nessas posições a quinase permanece ina- não são capazes de se juntar a esse ciclo,
a clivagem de Xenopus parecia ser regulada tiva, porém, potencialmente funcional. O não realizarão a divisão (Figura 5.41). Essa
por uma proteína similar àquela que regula a suprimento de moléculas MPF potencial- degradação e a necessidade de re-sinteti-
divisão celular da levedura, pensou-se que mente funcionais (pré-MPF) acumula du- zar essa proteína explicariam a mudança
qualquer regulador da proteína da levedura rante o período tardio de S. de controle citoplasmático para controle
teria contrapartida no embrião animal. Um nuclear da divisão como visto no ciclo 14.
dos principais reguladores da proteína MPF A Fosfatase cdc25: Em Drosophila, existe uma maturação
de levedura é o produto do gene cdc13, uma Iniciadora de Mitose desenvolvimental da regulação da quinase
proteína 56-kDa chamada p56cdc13. Esse gene A mitose se inicia com uma abrupta MPF ativa (veja Figura 5.40; Edgard et al.,
foi clonado, e a seqüência de sua proteína co- desfosforilação de todas essas subunidades 1994). Na ovulação, o complexo pré-MPF
dificada foi considerada muito semelhante às MPF quinase na posição 15. Isso é conse- armazenado no ovo é desfosforilado em T-
proteínas ciclina B encontradas em numero- guido pelo aparecimento da fosfatase cdc25 14 e Y-15 pelo recém-traduzido cordão
sos animais (Goebl e Byers, 1988; Solomon (Edgar e O’Farrell, 1989; Gautier et al., (cdc25) da proteína. Durante os primeiros
et al., 1988). As proteínas ciclina B em célu- 1991; Jessus e Beach, 1992; Lee et al., sete ciclos nucleares, o MPF ativo perma-
las em estágio de clivagem mostram um com- 1992). Dessa maneira, a acumulação gra- nece em níveis altos, e o núcleo divide-se
portamento periódico, acumulando duran- dual do MPF é convertida em uma breve tão rapidamente quanto as enzimas sinte-
te a fase S e sendo degradada durante a explosão de atividade quinase que inicia tizadoras de DNA permitem. Durante os
mitose (Evans et al., 1983; Swenson et al., a mitose. Essa fosfatase (que tem sido en- ciclos 8-13, a ciclina começa a ser degrada-
1986). Ciclinas são freqüentemente codifi- contrada em inúmeros organismos) é ela da na metáfase, levando a flutuações peri-
cadas pelo mRNA armazenado no citoplas- própria regulada pelo desenvolvimento. ódicas de atividade MPF-quinase. A sínte-
ma do oócito, e se sua transformação em Na Drosophila, a fosfatase cdc25 (pro- se da ciclina do mRNA armazenado no
proteínas é seletivamente inibida, a célula duto do gene string, de cordão) é inicial- oócito armazenado se torna o passo
não entrará em mitose (Minshull et al., mente sintetizada pelo mRNA armazena- limitante para a mitose. A degradação do
1989). A proteína ciclina B combina com a do no oócito durante os 13 primeiros ci- cordão da oócito-proteína leva à parada
quinase cdc2 do MPF para criar o comple- clos celulares. No entanto, durante o pró- do ciclo celular na interfase do ciclo 14.
Figura 5.41 Correlação da expressão do gene string (cordão) com

a divisão celular em embriões de Drosophila. (A) Nesse exemplo, um
embrião de estágio tardio 14 é corado com uma seqüência nucleotídica
radioativa que especificamente reconhece e liga o mRNA cordão (visto
aqui como pontos brancos na auto-radiografia). (B) Um embrião ligei-
ramente mais velho é corado com anticorpos fluorescentes para tubu-
lina para mostrar os microtúbulos dos fusos mitóticos. Uma compara-
ção da microfotografia de fluorescência com a auto-radiografia obtida
da ligação da sonda radioativa mostra que somente aquelas células
capazes de se dividirem, sintetizam mRNA string. (C) Anticorpos
para a proteína ciclina A mostram que ela é degradada após a mitose e
(A) não é vista nas regiões que contêm a proteína de cordão. (de Edgar e
O’Farrell, 1989, cortesia de B. A. Edgar.)
(B) (C)
Grandes concentrações de pré-MPF se replicação do DNA (Duronio e O’Farrell, começo da mitose; mas a própria monta-
acumulam. As mitoses para as divisões 14, 1994). Certamente, quando as células saem gem do fuso é necessária para o funciona-
15 e 16 são iniciadas somente quando essa normalmente do ciclo para começar a se dimento apropriado da ciclina B (Minshull et
pré-MPF é desfosforilada nas posições T- ferenciarem, expressam a proteína Dacapo, al., 1994). Se os fusos são formados incor-
14 e Y-15 pela proteína cordão. Essa prote- um inibidor de ciclina E/cdk2 (Lane et al., retamente, a ciclina B cessa seu funciona-
ína é derivada de transcrição nuclear ao 1996; de Nooij et al., 1996). mento, e a mitose pára. Também parece ha-
final de cada período G2. A mitose passou A regulação das ciclinas é uma função ver retroalimentação entre a cromatina re-
do controle citoplasmático para o nuclear. crítica no desenvolvimento. Primeiro, ima- plicante e as quinases ciclina-dependen-
gine as células da cartilagem de nossas per- tes, fazendo com que a mitose não comece
Outras ciclinas e quinases ciclina- nas sofrendo mais uma divisão celular; serí- até que o DNA tenha começado a replicar-
dependentes amos muito maiores do que agora. Pior, ima- se, e somente uma rodada de replicação é
MPF é o primeiro membro descoberto de gine que essa desregulação ocorresse em normalmente permitida durante a divisão
uma família de proteínas diméricas que têm somente uma de nossas pernas. Ainda pior, celular (Chong et al., 1995; Madine et al.,
estruturas muito similares. Cada uma des- imagine se a divisão da cartilagem não fos- 1995). As moléculas que mediam essas tro-
sas proteínas contém uma ciclina e uma se coordenada com a divisão da pele e dos cas estão agora sendo estudadas.
quinase ciclina-dependente, que quando de- vasos sangüíneos. A regulação desses
pendente do MPF é chamada cdk1. Pelo eventos é coordenada através de hormôni- Fator Citostático
menos outras sete quinases ciclina-depen- os e fatores de crescimento que, por fim, A síntese e a degradação do MPF leva a
dentes estão envolvidas em células madu- regulam as ciclinas que controlam a passa- ciclagem das células. No entanto, se a de-
ras de vertebrados, e mais de uma dúzia de gem através dos ciclos das células. Segun- gradação da ciclina for prevenida, o MPF
ciclinas foram identificadas. Os papéis de do, quando a ciclina se torna ativa sem re- permanece ativo e a célula é travada na
algumas dessas quinases foram determina- gulação externa ou quando ciclinas se tor- metáfase (Murray et al., 1989). Isso é o que
dos (como mostra a Figura 5.39). Entre es- nam estimuladas por proteínas mutantes, o acontece, aparentemente, durante o desen-
sas enzimas, uma das mais críticas é a ciclina crescimento das células continua sem con- volvimento do oócito da rã. O oócito ma-
E/cdk2. Enquanto MPF (ciclina B/cdk1) é trole externo, e se desenvolve um tumor. Em duro da rã cessa a divisão celular produ-
crítica para a entrada na mitose (M), ciclina células maduras de vertebrados, as ciclino- zindo uma proteína chamada fator citostá-
E/cdk2 é crítica para a habilidade da célula enzimas D/cdk4,6 cumprem um papel crucial tico (CSF), que mantém o oócito preso na
entrar na fase S, permitindo a ocorrência de no desenvolvimento. Em diversos tipos de metáfase da segunda divisão meiótica (Fi-
síntese do DNA. A regulamentação do de- células, controlam a dicotomia entre a divi- gura 5.42). Essa proteína contém os pro-
senvolvimento dessa proteína é uma fase são e a diferenciação celular. [cleave6.html] dutos dos genes c-mos e cdk-2, e parece
crítica no desenvolvimento da Drosophila. agir bloqueando a degradação da ciclina
Embriões de Drosophila adicionam um Pontos de Controle para Divisão Ce- (veja o Capítulo 22). Uma vez que a ciclina
estágio G2 antes da mitose, quando a prote- lular: DNA e Fusos não é degradada, MPF permanece ativo, e
ína de cordão se torna limitante no ciclo 14. O ciclo celular exige uma excepcional intri-
A fase G1 é adicionada ao ciclo 17 quando cada coreografia da citocinese, replicação
ciclina E se torna o fator limitante para a de DNA, montagem de fusos e metabolis-
replicação do DNA. Em embriões precoces, mo celular. Nesse conjunto, ciclinas e Figura 5.42
ciclina E e cdk2 estão sempre presentes, quinases ciclina-dependentes são alvos e Níveis do fator promotor de amadurecimento
seus mRNA sendo fornecidos pelo oócito e causadores da regulação. O sistema ciclina- (MPF) durante o desenvolvimento precoce da
traduzidos através de todos os primeiros 15 quinase parece coordenar esses eventos. rã Xenopus laevis. O sinal normal de matura-
ciclos de divisão. A mensagem para ciclina Por exemplo, a fibra do fuso mitótico não ção é o hormônio progesterona, que estimula a
é degradada durante o ciclo 16, levando à pode formar até a ciclina B/cdk1 sinalizar o ovulação dos oócitos e o início da meiose. (Se-
deficiência dessa proteína no ciclo 17. Des- gundo Murray e Kirschner, 1989.)
sa forma, a maioria das células param no G1
desse ciclo, não entrando no período de sín- Entrada de espermatozóide, aumento
Estímulo para amadurecimento de Ca2+ livre, inativação de CSF
tese do DNA. Aí começam a diferenciar-se. (progesterona ou MPF)
(As exceções são as células precursoras CSF estabiliza MPF
dos nervos que continuam a proliferar, e as Alta
células do intestino, que continuam a pro-
duzir DNA na ausência de divisão celular. Atividade
Nesses casos, a ciclina E é derivada dos de MPF
genes zigóticos.) Se ciclina E é induzida
ectopicamente, as células retidas sofrem uma Baixa
nova rodada de síntese de DNA (Knoblich
et al., 1994). Pensa-se que a ciclina E contro-
la a síntese do DNA, fosforilando certos
fatores de transcrição que regulam as trans- Oócito Meiose Meiose Oócito Primeira Segunda
crições das proteínas necessárias para a Imaturo I II maduro clivagem clivagem
o oócito permanece na metáfase. A libera- liberação de íons de cálcio na fertilização é Enquanto os íons de cálcio estão ocupa-
ção de íons de cálcio durante a fertilização de iniciar a degradação da ciclina e permitir dos desligando a mitose, os sinais da fer-
ativa a protease que especificamente inati- que a célula comece a replicação do DNA. tilização que ativam a proteína quinase C
va o CSF (Watanabe et al., 1991). Quando Em seguida, os ritmos da divisão celular estão estabelecendo condições de inter-
o CSF é degradado, a ciclina pode então são controlados pela atividade do MPF, fase: descondensação da cromatina e re-
ser degradada, e a célula pode retornar à que por sua vez é baseada nos ritmos forma do envoltório nuclear (Bement e
fase S. Dessa maneira, um dos efeitos da cíclicos da síntese e degradação da ciclina. Capco, 1991).
O mecanismo citoesquelético da mitose

Clivagem na verdade é o resultado de dois processos coordenados. O primeiro desses
processos cíclicos é a cariocinese, a divisão mitótica do núcleo, cujo agente mecânico
é o fuso mitótico, com seus microtúbulos compostos de tubulina (o mesmo tipo de
proteína componente do flagelo do espermatozóide). O segundo processo é a
citocinese, a divisão da célula. O agente mecânico da citocinese é o anel contrátil de
microfilamentos feitos de actina (o mesmo tipo de proteína que alonga os microvilos
do óvulo e o processo acrossômico do espermatozóide). A Tabela 5.2 apresenta uma
comparação desses sistemas de divisão. O relacionamento e coordenação entre os
dois sistemas durante a clivagem é representado na Figura 5.43A, onde o ovo do
ouriço-do-mar é mostrado passando pela primeira clivagem. O fuso mitótico e o anel
contrátil estão perpendiculares um com o outro, e o fuso é interno ao anel contrátil. O
sulco da clivagem finalmente seciona o plano da mitose criando, portanto, dois blastô-
meros geneticamente equivalentes.
Os microfilamentos de actina são encontrados no córtex do ovo ao invés do cito-
plasma central. Sob o microscópio eletrônico, o anel de microfilamentos pode ser visto
formando uma banda cortical distinta de 8-10 µm de espessura (Figura 5.43B). Esse
anel contrátil existe somente durante a clivagem e se estende por 0.1µm para o centro
do ovo. É responsável por exercer a força que separa o zigoto em blastômeros; se
interrompido, a citocinese pára. Schroeder (1973) propôs um modelo de clivagem em
que o anel contrátil parte o ovo como um “fecho de bolsa” apertando o ovo, enquanto a
clivagem continua. Esse aperto dos anéis de microfilamentos cria o sulco da clivagem.
Embora a cariocinese e a citocinese sejam normalmente coordenadas, elas são, às
vezes, separadas por condições naturais ou experimentais. Nos ovos dos insetos, a
cariocinese ocorre diversas vezes antes da citocinese. Outra maneira de induzir esse
estado é tratar os embriões com a droga citocalasina B, que inibe a formação e a
organização de microfilamentos no anel contrátil, assim, interrompendo a clivagem
sem parar a cariocinese (Schroeder, 1972). Em alguns momentos, o núcleo continua a
se dividir e expressar proteínas reguladoras do desenvolvimento, mesmo quando a
clivagem é bloqueada (Lillie, 1902; Whittaker, 1979).
Tabela 5.2 Cariocinese e citocinese
Principal Principal droga

Processo Agente mecânico composição protéica Localização disruptora
Cariocinese Fuso mitótico Microtúbulos de tubulina Citoplasma central Colchicina, nocodazola

Citocinese Anel contrátil Microfilamentos de actina Citoplasma cortical Citocalasina B
a
Como foi verificado que a colchicina inibe independentemente várias funções da membrana, incluindo a osmorregulação e o transporte de íons e
nucleosídeos, nocodazol tornou-se a principal droga usada para inibir processos mediados por microtúbulos (veja Hardin, 1987).
Figura 5.43 (A) (B)

Papel dos microtúbulos e microfilamentos na Microfilamentos
divisão celular. (A) Diagrama da telófase da (anel contrátil)
primeira clivagem. Os cromossomos estão sen-
do arrastados para os centríolos por microtú-
bulos, enquanto o citoplasma está sendo aper-
tado pela contração dos microfilamentos. (B)
Localização de microfilamentos da actina no
sulco de clivagem. Marcação fluorescente dos
microfilamentos de actina mostra o anel
contrátil no sulco da primeira clivagem (fle-
cha) de um ovo de ouriço-do-mar na telófase.
(C) marcação fluorescente da tubulina mostra Centríolo Microtúbulos
os ásteres microtubulares de um ovo de ouri- Cromossomo
ço-do-mar durante a telófase da primeira cli-
vagem. (B de Bonder et al., 1988; C de White (C)
et. al., 1987.)
Um dos mais intrigantes problemas não resolvidos da clivagem embrionária, é

como a citocinese e a cariocinese são coordenadas entre si. Pesquisas in vitro
sugerem que a replicação do DNA pode controlar a fosforilação da subunidade
quinase cdc2 do MPF e que essa fosforilação pode controlar a habilidade da actina
de se contrair (Smythe e Newport, 1992). No entanto, essas observações podem
não ser consistentes com as observações feitas em células embrionárias precoces
(Ferrell et al., 1991). O número e o local desses sulcos de clivagem parecem ser
controlados pelos ásteres dos microtúbulos. Esses ásteres (Figura 5.43C) são “rai-
os” microtubulares que se estendem dos pólos do fuso mitótico para a periferia da
célula. Clivagem normal ocorre somente se um par de ásteres está presente (Wil-
son, 1901), e ovos polispérmicos (obtendo centríolos de cada espermatozóide)
formam sulcos de clivagem múltiplos no mesmo ovo (veja Figura 4.20). Em estudos
mais recentes, Raff e Glover (1989) mostraram que no embrião de Drosophila, se
os centríolos migram ao pólo posterior, eles podem formar células polares, mesmo
na ausência de núcleo. Dessa maneira, parece que os ásteres são elementos sine
qua non da clivagem.
O segundo tipo de evidência ligando os ásteres com a formação do sulco de
clivagem vem de experimentos nos quais a direção de clivagem é mudada pela coloca-
ção do ovo sob pressão. Pflüger (1884) descobriu que quando um zigoto de rãs é
levemente comprimido entre duas placas de vidro, as direções das primeiras três
clivagens são todas perpendiculares ao plano das placas. Ambos, Driesch e Morgan
(revisto por Morgan, 1927) fizeram observações semelhantes com embriões de ouriço-
Zigotos Sulco de clivagem normal Sulco extra de clivagem extra

(A) (B) (C) (D)
Bola de vidro Ásteres Interrupção do Fuso

deslocando o sulco de clivagem Figura 5.44
aparelho mitótico Criação de um novo sulco de clivagem pelo
deslocamento dos ásteres. (A,B) Pela inter-
rupção de um sulco de clivagem com uma bola
de vidro, cria-se uma célula com forma de fer-
do-mar. Em ambos os casos, o plano da terceira clivagem (que é normalmente paralelo
radura. Na próxima divisão (C,D), cria-se um
ao equador do oócito) foi deslocado em 90o. Dessa maneira, com a mudança do local novo sulco de clivagem, apesar de não haver
do fuso mitótico, pode-se alterar a direção do sulco de clivagem. fuso mitótico que o atravessa. (de Rappaport,
Rappaport (1961) estendeu esse tipo de experimento, deslocando os fusos 1961, cortesia de R. Rappaport.)
mitóticos para os lados das células. Na Figura 5.44, uma bola de vidro foi usada para
deslocar os ásteres do centro da célula em direção à periferia. O sulco de clivagem
resultante se estende somente enquanto a bola não aparece do outro lado. Dessa
maneira, é formada uma célula binucleada, em forma de ferradura. Na próxima divi-
são, dois aparelhos de fuso se formam entre quatro ásteres, mas são gerados três
sulco de clivagem! Cada braço da ferradura tem o seu próprio fuso mitótico e sulcos
de clivagem como esperado, mas um terceiro sulco aparece entre os dois ásteres no
topo da ferradura (Figura 5.44C). Isso demonstra claramente que se os dois ásteres
estiverem próximos um do outro, suas interações causam a formação de um sulco de
clivagem, mesmo na ausência de um fuso mitótico entre eles. Novamente nós obser-
vamos que a divisão celular pode ocorrer sem divisão nuclear enquanto os ásteres
estiverem presentes.
A formação de novas membranas

Nossa última consideração sobre clivagem embrionária envolve a formação de novas
membranas celulares. Serão essas membranas recém-sintetizadas ou são meras exten-
sões da membrana celular do oócito? A resposta é que provavelmente ambos mecanis-
mos contribuem para as membranas celulares internas.
Embriões de anfíbios fornecem evidências que novos componentes da membrana
estão sendo sintetizados durante a clivagem precoce. A Figura 5.45A mostra o primei-
ro sulco da clivagem de um zigoto pigmentado de rã. Ao passo que a membrana
original tem uma região cortical pigmentada associada a ela, a nova membrana é bran-
ca. Essa nova membrana tem também propriedades de condutividade elétrica diferen-
tes daquelas da membrana original. Byers e Armstrong (1986) radiorotularam compo-
nentes de membrana de ovos de Xenopus recém-fertilizados e seguiram a redistribuição
dessas moléculas através da clivagem, por auto-radiografia. Durante a primeira clivagem,
a membrana da superfície externa do embrião e a membrana da borda principal do
sulco de clivagem são altamente marcadas (mostrando serem as regiões originais da
membrana). Entre elas há uma grande região desprovida de rótulo radioativo (Figura
5.45B). Dessa maneira, a membrana do sulco é um mosaico de diferentes partes. A
membrana da parte onde o sulco termina é derivada de uma superfície externa
preexistente do ovo, marcada, mas a maior parte da membrana do sulco é derivada de
regiões que são inacessíveis aos marcadores de superfície. Byers e Armstrong especu-
lam que o domínio da membrana intensamente marcada, na borda do sulco, contém as
membranas âncoras para o anel subjacente de microfilamentos corticais. A borda do
(A) Nova membrana não-pigmentada (B) Figura 5.45

Formação de novas membranas na primeira clivagem
do ovo de Xenopus. (A) A membrana antiga tem grânu-
los de pigmento. A nova membrana aparece clara por-
que não tem esses grânulos. (B) Auto-radiografia de
proteínas de membrana no sulco da primeira clivagem.
A superfície celular foi radiativamente marcada antes
da divisão. (A de Laat e Bluemink, 1974; B de Byers e
Armstrong, 1986, cortesia dos autores.)
sulco em embriões precoces de Xenopus, também contém microtúbulos curtos, dis-

postos radialmente. Pensa-se que esses microtúbulos poderiam fornecer um caminho
para o movimento de vesículas das membranas em direção ao lugar onde são inseridos
na membrana (Danilchik e Funk, 1996).
Esses processos de clivagem dividem o citoplasma do zigoto em numerosas
células. Cada célula pode ter os mesmos genes nucleares, mas seus respectivos
citoplasmas podem diferir significativamente. No próximo capítulo veremos como
esses blastômeros se locomovem e interagem um com o outro para iniciar a estru-
tura do corpo.
LITERATURA CITADA
Adeslon, D. C. and Humphreys, T. 1988. Sea Boycott, A. E., Diver, C., Garstang, S. L. and development in embryos of Ilyanassa obsoleta.
urchin morphogenesis and cell-hyalin adhesion Turner, F. M. 1930. The inheritance of sinestrality Int. J. Invert. Reprod. Dev. 9: 209-228.
are perturbed by a monoclonal antibody specific in Limnaea peregra (Mollusca: Pulmonata).
Crampton, H. E. 1894. Reversal of cleavage
for hyalin. Development 104: 391-402. Philos. Trans. R. Soc. Lond. [B] 219: 51-131. in a sinistral gastropod. Ann. N.Y. Acad. Sci.
Arion, D., Meijer, L., Brizuela, L. and Beach, Brenner, C. A., Adler, R. R., Rappolee, D. A., 8: 167-170.
D. 1988. cdc2 is a component of the M phase- Pedersen, R. A. and Werb, Z. 1989. Genes for Cruz, Y. R. 1981. A sterile defender morph in a
specific histone H1 kinase: Evidence for identity extracellular matrix-degrading metalloproteases
polyembryonic hymenopteran parasite. Nature
with MPF. Cell 55: 371-378. and their inhibitor, TIMP, are expressed during
294: 446-447.
early mammalian development. Genes Dev. 3:
Balinsky, B. 1. 1981. Introduction to Embryology, 848-859. Cruz, Y. P. 1986a. Development of the polyem-
5th Ed. Saunders, Philadelphia. bryonic parasite Copidosomopsis tanytmemus
Byers, T. J. and Armstrong, P. B. 1986. (Hymenoptera: Encyrtidae). Ann. Entomol. Soc.
Barlow, P., Owen, D. A. J. and Graham, C. 1972. Membrane protein redistribution during Xenopus
DNA synthesis in the preimplantation mouse Am. 79: 121-127.
first cleavage. J. Cell Biol. 102: 2176-2184.
embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 27: 432-445. Cruz, Y. P. 1986b. The defender role of the
Carlson, B. M. 1981. Patten’s Foundations of
Beams, H. W. and Kessel, R. G. 1976. Cytoki- precocious larvae of Copidosomopsis tanytmemus
Embryology. McGraw-Hill, New York. Caltagirone (Encyrtidae, Hymenoptera). J. Exp.
nesis: A comparative study of cytoplasmic
division in animal cells. Am. Sci. 64: 279-290. Carson, D. D., Tang, J.-P. and Julian, J. 1993. Zool. 237: 309-318.
Heparan sulfate proteoglycan (perlecan) ex- Dan, K. 1960. Cytoembryology of echinoderms
Bellairs, R., Breathnach, A. S. and Gross, M. pression by mouse embryos during acquisiti-
1975. Freeze-fracture replication of junctional and amphibia. Int. Rev. Cytol. 9: 321-367.
on of attachment competence. Dev. Biol. 155:
complexes in unincubated and incubated chick 97-106. Danilchik, M. and Funk, C. 1996. Abstracts of
embryos. Cell Tissue Res. 162: 235-252. the Sixth InternatI. Xenopus Conference. Wind
Chong, J. P. J., Mahbubani, H. M., Khoo,
Bement, W. M. and Capco, D. G. 1991. Parallel Rivers Lodge, Estes Park, CO.
C.Y., and Blow, J. J. 1995. Purification of
pathways of cell cycle control during Xenopus an MCM-containing complex as a compo- Dan-Sohkawa, M. and Fujisawa, H. 1980. Cell
egg activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: nent of the replication licensing system. dynamics of the blastulation process in the starfish,
5172-5176. Nature 375: 418-421. Asterina pectinifera. Dev. Biol. 77: 328-339.
Bonder, E. M., Fishkind, D. J., Henson, J. H., Cisek, L. J. and Corden, J. L. 1989. Phosphory- Darwin, C. 1860. Letter to Asa Gray, May 22,
Cotran, N. M. and Begg, D. A. 1988. Actin in lation of RNA polyrnerase by the murine homo- 1860. In F. Darwin (ed.), The Life and Letters
cytokinesis: Formation of the contractile logue of the cell-cycle control protein cdc2. of Charles Darwin, Vol. 2. Appleton, New York.
apparatus. Zool. Sci. 5: 699-711. Nature 339: 679-684 [p.105]
Borland, R. M. 1977. Transport processes in the Craig, M. M. and Morrill, J. B. 1986. Cellular de Laat, S. W. and Bluemink, J. G. 1974. New
mammalian blastocyst. Dev. Mammals 1: 31-67. arrangements and surface topography during early membrane formation during cytokinesis in
normal and cytochalasin B-treated eggs of Ferrell, J. E., Wu, M., Gergart, J. C. and Martin, velopment of the mouse. In M. Karkinen-
Xenopus laevis. II. Electrophysical observa- G. S. 1991. Cell cycle tyrosine phosphorylation Jaaskelainen, L. Saxén and L. Weiss (eds.),
tions. J. Cell Biol. 60: 529-540. of p34cdc2 and a microtubule associated protein Cell Interactions in Differentiation. Academic
kinase hornologue in Xenopus oocytes and eggs. Press, New York, pp. 45-57.
de Laat, S. W., Tertoelen, L. G. J., Dorresteijn, A.
Mol. Cell. Biol. 11: 1965-1971.
W. C and van der Biggelaar, J. A. M. 1980. Granato, M. and Nüsslein-Volhard, C. 1996.
Intercellular communication patterns are involved Fleming, I P. 1987. Quantitative analysis of cell Fishing for genes controlling development. Curr.
in cell determination in early muscular develop- allocation to trophectoderm and inner cell mass Opin. Gen. Dev. 6: 461-468.
ment. Nature 287: 546-548. in the mouse embryo. Dev. Biol. 119: 520-531.
Grbic, M. and Strand, M. R. 1992. Sibling rivalry
de la Chappelle, A., Schroder, J., Rantanen, Fleming, T. P. 1992. Trophectoderm biogenesis and brood sex ratios in polyembryonic wasps.
P., Thomasson, B., Niemi, M., Tilikainen, A., in the preimplantation mouse embryo. In T. P. Nature 360: 254-256.
Sanger, R. and Robson, E. E. 1974. Early Fleming, (ed.) Epithelial Organization and De-
fusion of two human embryos? Ann. Hum. velopment. Chapman and Hall, London, pp. Grbic, M., Nagy, L. M., Carroll, S. B. and Strand,
Genet. 38: 63-75. 111-134. M. 1996. Polyernbryonic development: insect
pattern formation in a cellularized environment.
de Nooij, J.C., Letendre, M.A. and Hariharan, Fleming, T. P., Pickering, S. J., Qasim, F. and Maro
Development 122: 795-804.
I.K. 1996. A cyclin-dependent kinase inhibitor, B. 1986. The generation of cell surface polarity in
Dacapo, is necessary for timely exit from the cell mouse 8-cell blastomeres: The role of cortical Gulyas, B. J. 1975. A reexamination of the
cycle during Drosophila embryogenesis. Cell 87: microfilaments analyzed using cytochalasin D. J. cleavage patterns in eutherian mammalian
1237-1247. Embryol. Exp. Morphol. 95: 169-191. eggs: Rotation of the blastomere pairs during
Foe, V. 1989. Mitotic domains reveal early second cleavage in the rabbit. J. Exp. Zool.
Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D. and
committment of cells in Drosophila embryos. 193: 235-248.
Newport, J. 1988. The Xenopus cdc2 protein is
a component of MPF, a cytoplasmic regulator of Development 107: 1-25. Gurdon, J. B. 1968. Changes in somatic nuclei
mitosis. Cell 54: 423-431. Foe, V. E., Odell, G. M., and Edgar, B. A. 1994. inserted into growing and maturing amphibian
Duronio, R. J. and O’Farrell, P. 1994. Develop- Mitosis and morphogenesis in the Drosophila oocytes. J. Embryol. Exp. Morphol. 20: 401-414.
mental control of a GI-S transcription program embryo: point and counterpoint. In The Deve- Hara, K. 1977. The cleavage pattern of the axolotl
in Drosophila. Development 120: 1503-1515. lopment of Drosophila melanogaster, B. M. egg studied by cinematography and cell counting.
Bate, (ed.). Cold Spring Harbor Press, Cold Wilhelm Roux Arch. Entwicklungsmech. Org.
Dyce, J., George, M., Goodall, H. and Fleming, Spring Harbor.
T. P. 1987. Do trophectoderm and inner cell mass 181: 73-87.
cells in the mouse blastocyst maintain discrete Freeman, G. and Lundelius, J. W. 1982. The de-
Hara, K., Tydeman, P. and Kirschner, M. W.
lineages? Development 100:685-698. velopmental genetics of dextrality and sinistrality
1980. A cytoplasmic clock with the same period
in the gastropod Limnea peregra. Wilhelm Roux
Edgar, B. A. and O’Farrell, P. H. 1989. Genetic Arch. Dev. Biol. 191: 69-83. as the division cycle in Xenopus eggs. Proc. Natl.
control of cell division patterns in the Drosophi- Acad. Sci. USA 77: 462-466.
la embryo. Cell 57: 177-187. Fullilove, S. L. and Jacobson, A. G. 1971. Nu-
clear elongation and cytokinesis in Drosophila Hardin, J. D. 1987. Archenteron elongation in
Edgar, B. A., Kiehle, C. P. and Schubiger, G. montana. Dev. Biol. 26: 560-577. the sea urchin embryo is a microtubule indepen-
1986. Cell cycle control by the nucleo-cytoplas- dent process. Dev. Biol. 121: 253-262.
mic ratio in early Drosophila development. Cell Gardiner, R. C. and Rossant, J. 1976. Determi-
nation during embryogenesis in mammals. Ciba Harland, R. M. and Laskey, R. A. 1980. Regula-
44: 365-372.
Found. Symp. 40: 5-18. ted replication of DNA microinjected into eggs
Edgar, B., Sprenger, F., Duronio, R. J., Leopold, of X. laevis. Cell 21: 761-771.
P. and O’Farrell, P. 1994. MPF regulation during Gautier, C., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P.
and Maller, J. 1988. Purified maturationpromo- Heasman, J., Ginsberg, D., Goldstone, K., Pratt,
the embryonic cell cycles of Drosophila. Genes
ting factor contains the product of Xenopus T., Yoshidanaro, C. and Wylie, C. 1994. A
Dev. 8: 440-453.
homolog of the fission yeast cell cycle control functional test for maternally inherited cadherin
Ettensohn, C. A. and Ingersoll, E. P. 1992. gene cdc2. Cell 54: 433-439. in Xenopus shows its importance in cell adhesion
Morphogenesis of the sea urchin embryo. In E. at the blastula stage. Development 120: 49-57.
F. Rossomondo and S. Alexander (eds.), Gautier, J., Solomon, M. J., Booher, R. N.,
Morphogenesis. Marcel Dekker, New York, pp. Bazan, J. F. and Kirschner, M. W. 1991. cdc25 Helde, K. A., Wilson, E. T., Cretekos, C, J. and
189-262. is a specific tyrosine phosphatase that directly Grunwald, D. J. 1994. Contribution of early cells
activates p34cdc2. Cell 67: 197-211. to the fate map of the zebrafish gastrula. Science
Evans, M.J. and Kaufman, M. H. 1981. Esta- 265: 517-520.
blishment in culture of pluripotent cells from Gerhart, J. C., Wu, M. and Kirschner, M. 1984.
mouse embryos. Nature 292: 154-156. Cell dynamics of an M-phase-specific cytoplas- Hillman, N., Sherman, H. I. and Graham, C. F.
mic factor in Xenopus laevis oocytes and eggs. 1972. The effects of spatial arrangement of cell
Evans, T., Rosenthal, E., Youngblom, J., Distel, J. Cell Biol. 98: 1247-1255. determination during mouse development. J.
D. and Hunt, T. 1983, Cyclin: A protein speci- Embryol. Exp. Morphol. 28: 263-278.
fied by maternal mRNA in sea urchin eggs that Giudice, A. 1973. Developmental Biology of the
is destroyed at each cleavage division. Cell 33: Sea Urchin Embryo. Academic Press, New York. Hinegardner, R. T., Rao, B. and Feldman, D. E.
389-396. Goebl, M. and Byers, B. 1988. Cyclin in fission 1964. The DNA synthetic period during early
yeast. Cell 54: 739-740. development of the sea urchin egg. Exp. Cell Res.
Eyal-Giladi, H. 1991. The early embryonic de-
36: 53-61.
velopment of the chick, an epigenetic process. Gould, K. and Nurse, P. 1989. Tyrosine phos-
Crit. Rev. Poultry Biol. 3: 143-166. phorylation of the fission yeast cdc2 protein Hörstadius, S. 1939. The mechanics of sea urchin
kinase regulates entry into mitosis. Nature 342: development, studied by operative methods. Biol.
Eyal-Giladi, H., Debby, A. and Harel, N. 1992.
39-45. Rev. 14: 132-179.
The posterior section of the chick’s area pellucida
and its involvement in hypoblast and primitive Graham, C. F. and Kelly, S. J. 1977. Interacti- Hörstadius, S. 1973. Experimental Embryology
streak formation. Development 116: 819-830. ons between embryonic cells during early de- of Echinoderms. Clarendon Press, Oxford.
Inoué, S. 1982. The role of self-assembly in the proliferation during Drosophila development. Mayr, W. R., Pausch, V. and Schnedl, W. 1979.
generation of biologic form. In S. Subtelny and Cell 87: 1225-1235. Human chimaera detectable only by investigation
B. P. Green (eds.), Developmental Order: Its Langman, J. 1981. Medical Embryology, 4th Ed. of her progeny. Nature 277: 210-211.
Origin and Regulation, Alan R. Liss, New York,
Williams & Wilkins, Baltimore. Miake-Lye, R. and Kirschner, M. W. 1985.
pp. 35-76. Induction of early mitotic events in a cellfree
Laskey, R. A., Mills, A. D. and Morris, N. R.
Jessus, C. and Beach, D. 1992. Oscillation of system. Cell 41: 165-175.
1977. Assembly of SV40 chromatin in a cellfree
MPF is accomplished by periodic association system from Xenopus eggs. Cell 10: 237-243. Minshull, J., Blow, J. J. and Hunt, T. 1989.
between cdc25 and cdc2-cyclin B. Cell 68: Translation of cyclin mRNA is necessary for
323-332. Lee, M. and Nurse, P. 1987. Complementation
used to clone a human homologue of the fission extracts of activated
Joharnnsen, O.A. and Butt, F.H. 1941. Embryo- yeast cell cycle control gene cdc2+. Nature 335: Xenopus eggs to enter mitosis. Cell 56: 947-956.
logy of Insects and Myriapods. McGrawHill, NY.
251-254. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K. and Murray,
Johnson, M. H. and Selwood, L. 1996. The
Lee, M. S., Ogg, S., Xu, M., Parker, M., A. W. 1994. A MAP kinase-dependent spindle
nomenclature of early development in mammals.
Donoghue, D. J., Maller, J. L. and Piwnica- assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.
Reprod. Fert. Dev. 8: 759-764. Worms, H. 1992. cdc25 encodes a protein Cell 79: 475-486.
Johnson, M. H., Chisholm, J. C., Fleming, T. P. phosphatase the dephosphorylates p34cdc2. Mol. Mintz, B. 1970. Clonal expression in allophenic
and Houliston, E. 1986. A role for cytoplasmic Biol. Cell 3: 73-84. mice. Symp. Int. Soc. Cell Biol. 9: 15.
determinants in the development of the early
Lee, R. K., Stainier, D. Y. R., Weinstein, B. M. Morgan, T. H. 1927. Experimental Embryology.
mouse embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. and Fishman, M. C. 1994. Cardiovascular deve-
[Suppl.]: 97-117. Columbia University Press, New York.
lopment in the zebrafish. II. Endocardial
Kalt, M. R. 1971. The relationship between progenitors are sequestered within the heart field. Mulnard, J. G. 1967. Analyse microcinematogra-
cleavage and blastocoel formation in Xenopus Development 120: 3361-3366. phique du developpement de l’oeuf de souris du
laevis. I. Light microscopic observations. J. stade II au blastocyste. Arch. Biol. (Liege) 78:
Lepage, T., Sardet, C. and Gache, C. 1992. 107-138.
Embryol. Exp. Morphol. 26: 37-49. Spatial expression of the hatching enzyme gene
Kane, D. and Kimmel, C. B. 1993. The midblas- in the sea urchin embryo. Dev. Biol. 150: 23-32. Murray, A. W. and Kirschner, M. W. 1989. Cyclin
tula transition in zebrafish. Development 119: synthesis drives the early embryonic cell cycle.
Levy, J. B., Johnson, M. H., Goodall, H. and
447-456. Nature 339: 275-280.
Maro, B. 1986. The timing of compaction:
Karr, T. L. and Alberts, B. M. 1986. Organization Control of a major developmental transition in Murray, A. W., Solomon, M. J. and Kirschner,
of the cytoskeleton in early Drosophila embryos. mouse early embryogenesis. J. Embryol. Exp. M. W. 1989. The role of cyclin synthesis and
J. Cell Biol. 102: 1494-1509. Morphol. 95: 213-237. degradation in the control of maturation
promoting factor activity. Nature 339: 280-286.
Karsenti, E., Newport, J., Hubble, R. and Lillie, F. R. 1898. Adaptation in cleavage.
Kirschner, M. 1984. The interconversion of In Biological Lectures of the Marine Biolo- New, D. A. T. 1956. The formation of subblasto-
metaphase and interphase microtubule arrays, as gical Laboratory of Woods Hole. Ginn, dermic fluid in hens’ eggs. 1. Embryol. Exp.
studied by the injection of centrosomes and nuclei Boston, pp. 43-67. Morphol. 43: 221-227.
into Xenopus eggs. J. Cell Biol. 98: 1730-1745. Newport, J. W. and Kirschner, M. W. 1982a. A
Lillie, F. R. 1902. Differentiation without
Kimelman, D., Kirschner, M. and Scherson, T. cleavage in the egg of the annelid Chaetopterus major developmental transition in early Xenopus
1987. The events of the midblastula transition in pergamentaceous. Wilhelm Roux Arch. Entwi- embryos: I. Characterization and timing of
Xenopus are regulated by changes in the cell cklungsmech. Org. 14: 477-499. cellular changes at midblastula stage. Cell 30:
cycle. Cell 48: 399-407. 675-686.
Lutz, B. 1947. Trends towards non-aquatic and
Kimmel, C.B. and Law, R.D. 1985. Cell lineage direct development in frogs. Copeia 4: 242-252. Newport, J. W. and Kirschner, M. W. 1982b. A
of zebrafish blastomeres. II. Formation of the yolk major developmental transition in early Xenopus
Madine, M. A., Khoo, C.-Y., Mills, A. D. and embryos: II. Control of the onset of transcripti-
syncytial layer. Dev. Biol. 108: 86-93. Laskey, R. A. 1995. MCM3 complex required on. Cell 30: 687-696.
Kimmel, C. B. and Warga, R. M. 1987. Indeter- for cell cycle regulation of DNA replication in
minate cell lineage of the zebrafish embryo. Dev. vertebrate cells. Nature 375: 421-424. Newport, J. W. and Kirschner, M. W. 1984.
Biol. 124: 269-280. Regulation of the cell cycle during Xenopus laevis
Mark, W. H., Signorelli, K. and Lacy, E. 1985.
development. Cell 37: 731-742.
Kimmel, C. B., Warga, R. M. and Schilling, T. An inserted mutation in a transgenic mouse line
F. 1990. Origin and organization of the zebrafish results in developmental arrest at day 5 of Nieuwkoop, P. D. 1973. The “organization
fate map. Development 108: 581-594. gestation. Cold Spring Harbor Symp. Quant. center” of the amphibian embryo: Its origin,
Biol. 50: 453-463. spatial organization, and morphogenetic action.
Knoblich, J. A., Sauer, K., Jones, L., Richardson,
Adv. Morphogenet. 10: 1-39.
H., Saint, R. and Lehner, C. F. 1994. Cyclin E Markert, C. L. and Petters, R. M. 1978.
controls S phase progression and its down- Manufactured hexaparental mice show that adults Nigg, E. A. 1995. Cyclin-dependent protein
regulation during Drosophila embryogenesis is are derived from three embryonic cells. Science kinases: key regulators of the eukaryotic cell
required for the arrest of cell proliferation. Cell 202: 56-58. cycle. BioEssays 17: 471-480.
77: 107-120. Martin, G. R. 1981. Isolation of a pluripotent cell Pedersen, R. A., Wu, K. and Batakier, H. 1986.
Langeland, J. and Kimmel, C. 1997. The line from early mouse embryos cultured in Origin of the inner cell mass in mouse embryos:
embryology of fish. In S. F. Gilbert and A. M. medium conditioned by teratocarcinoma stem Cell lineage analysis by microinjection. Dev. Biol.
Raunio (eds.), Embryology: Constructing the cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7634-7638. 117: 581-595.
Organism. Sinauer Associates, Sunderland, MA. Masui, Y. and Markert, C. L. 1971. Cytoplasmic Perona, R. M. and Wassarman, P. M. 1986.
Lane, M.E., Sauer, K., Wallace, K., Jan, Y N., control of nuclear behavior during meiotic Mouse blastocysts hatch in vitro by using a
Lehner, C.F. and Vaessin, H. 1996. Dacapo, a maturation of frog oocytes. J. Exp. Zool. 177: trypsin-like proteinase associated with cells of
cyclin-dependent kinase inhibitor, stops cell 129-146. mural trophectoderm. Dev. Biol, 114: 42-52.
Peter, M., Nakagawa, J., Dorée, M., Labbé, J. Säugetierei. Naturwissenschaften 39: 355-356. van den Biggelaar, J. A. M. and Guerrier, P. 1979.
C. and Nigg, E. A. 1990. In vitro disassembly of Smith, L. D. and Ecker, R. E. 1969. Role of the Dorsoventral polarity and mesentoblast determi-
the nuclear lamina and M phasespecific phos- oocyte nucleus in the physiological maturation nation as concomitant results of cellular
phorylation of lamins by cdc2 kinase. Cell 61: interactions in the mollusc Patella vulgata. Dev.
in Rana pipiens. Dev. Biol. 19: 281-309.
591-602. Biol. 68: 462-471.
Smythe, C. and Newport, J. W. 1992. Coupling
Peyrieras, N., Hyafil, F., Louvard, D., Ploegh, H. Ward, G. E. and Kirschner, M. W. 1990. Identi-
of mitosis to the completion of S phase in
L. and Jacob, F. 1983. Uvomorulin: A non-inte- Xenopus occurs via modulation of the tyrosine fication of cell cycle-regulated phosphorylation
gral membrane protein of early mouse embryo. kinase that phosphorylates p34cdc2. Cell 68: cites on nuclear lamin C. Cell 61: 561-577.
Proc. NatI. Acad. Sci. USA 80: 6274-6277.
787-797. Watanabe, N., Hunt, T., Ikawa, Y. and Sagata,
Piko, L. and Clegg, K. B. 1982. Quantitative Solomon, M. J. 1993. Activation of the various N. 1991. Independent inactivation of MPF and
changes in total RNA, total poly(A), and cytostatic factor (Mos) upon fertilization of
cyclin/cdc2 protein kinases. Curr. Opin. Cell
ribosomes in early mouse embryos. Dev. Biol. Biol. 5: 180-186. Xenopus eggs. Nature 352: 247-249.
89: 362-378. Welsh, J. H. 1969. Mussels on the move. Nat.
Solomon , M., Booher, R., Kirschner, M. and
Pflüger, E. 1884. Uber die Einwirkung der Beach, D. 1988. Cyclin in fission yeast. Cell 54: Hist. 78: 56-59.
Schwerkraft und anderer Bedingungen auf die
738-739. White, J. C., Amos, W. B. and Fordham, M. 1987.
Richtung der Zeiltheilung. Arch. Ges. Physiol. 3: 4.
Stainier, D. Y. R., Lee, R. K. and Fishman, M. An evaluation of confocal versus conventional
Prather, R. S. 1989. Nuclear transfer in mammals imaging of biological structures by fluorescence
C. 1993. Cardiovascular development in the
and amphibia. In H. Schatten and G. Schatten zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube light microscopy. J. Cell Biol. 105: 41-48.
(eds.), The Molecular Biology of Fertilization. formation. Development 119: 31-40. Whittaker, J. R. 1979. Cytoplasmic determinants
Academic Press, New York, pp. 323-340.
Strickland, S., Reich, E. and Sherman, M. I. 1976. of tissue differentiation in the ascidian egg. In S.
Pratt, H. P. M., Ziomek, Z. A., Reeve, W. J. D. Plasminogen activator in early embryogenesis: Subtelny and 1. R. Konigsberg (eds.), Determi-
and Johnson, M. H. 1982. Compaction of the nants of Spatial Organization. Academic Press,
Enzyme production by trophoblast and parietal
mouse embryo: An analysis of its components. J. endoderm. Cell 9: 231-240. New York, pp. 29-51.
Embryol. Exp. Morphol. 70: 113-132. Wiley, L. M. 1984. Cavitation in the mouse pre-
Sturtevant, M. H. 1923. Inheritance of direction
Raff, J. W. and Glover, D. M. 1989. Centrosomes, of coiling in Limnaea. Science 58: 269-270. implantation embryo: Na/K ATPase and the
not nuclei, initiate pole cell formation in Droso- origin of nascent blastocoel fluid. Dev. Biol. 105:
phila embryos. Cell 57: 611-619. Summers, R. G., Morrill, J. B., Leith, A., Marko, 330-342.
M., Piston, D. W. and Stonebraker, A. T. 1993.
Raff, R. A. and Kaufman, T. C. 1983. Embryos, Wilson, E. B. 1898. Cell lineage and ancestral
A stereometric analysis of karyogenesis, cytoki-
Genes, and Evolution: The Developmental- reminiscences. In Biological Lectures of the
nesis, and cell arrangements during and following
Genetic Basis of Evolutionary Change. Macmi- fourth cleavage period in the sea urchin, Lyte- Marine Biological Laboratory of Woods Hole.
llan, New York. chinus variegatus. Dev. Growth Diff. 35: 41-57. Ginn, Boston, pp. 21-42.
Rappaport, R. 1961. Experiments concerning Sutherland, A. E. and Calarco-Gillam, P. G. 1983. Wilson, E. B. 1901. Experiments in cytology.
cleavage stimulus in sand dollar eggs. J. Exp. II. Some phenomena of fertilization and cell
Analysis of compaction in the preimplantation
Zool. 148: 81-89. division in etherized eggs. III. The effect on
mouse embryo. Dev. Biol. 100: 327-338.
Rugh, R. 1967. The Mouse. Burgess, Minnea- cleavage of artificial obliteration of the first
Sutherland, A. E., Speed, T. P. and Calarco, P. G. cleavage furrow. Wilhelm Roux Arch. Entwi-
polis. 1990. Inner cell allocation in the mouse morula: cklungsmech. Org. 13: 353-395.
Satterwhite, L. L., Lohka, M. J., Wilson, K. L., The role of oriented division during fourth
Winkel, G. K., Ferguson, J. E., Takeichi, M. and
Scherson, T. Y., Cisek, L. J. and Pollard, T. D. cleavage. Dev. Biol. 137: 13-25.
1992. Phosphorylation of myosin-II light chain Nuccitelli, R. 1990. Activation of protein kinase
Swenson, K. L., Farrell, K. M. and Ruderman, C triggers premature compaction in the 4-cell
by cyclin-p34cdc2: A mechanism for the timing of
J. V. 1986. The clam embryo protein cyclin A stage mouse embryo. Dev. Biol. 138: 1-15.
cytokinesis. J. Cell Biol. 118: 595-605. induces entry into M phase and the resumption
Saunders, J. W., Jr. 1982. Developmental of meiosis in Xenopus oocytes. Cell 47: 861-870. Wolpert, L. and Gustafson, T. 1961. Studies in
the cellular basis of morphogenesis of the sea
Biology. Macmillan, New York. Sze, L. C. 1953. Changes in the amount of urchin embryo: The formation of the blastula.
Schejter, E. D. and Wieschaus, E. 1993. deoxyribonucleic acid in the development of Rana Exp. Cell Res. 25: 374-382.
Bottleneck acts as a regulator of the microfila- pipiens. J. Exp. Zool. 122: 577-601.
Wolpert, L. and Mercer, E.H. 1963. An electron
ment network governing cellularization. of the
Tarkowski, A. K. and Wróblewska, J. 1967. De- microscope study of the development of the
Drosophila embryo. Cell 75: 373-385.
velopment of blastomeres of mouse eggs isolated blastula of the sea urchin embryo and its radial
Schroeder, T. E. 1972. The contractile ring. II. at the 4- and 8-cell stage. J. Embryol. Exp. polarity. Exp. Cell Res. 30: 280-300.
Determining its brief existence, volumetric Morphol. 18: 155-180.
Yamazaki, K. and Kato, Y. 1989. Sites of zona
changes, and vital role in cleaving Arbacia eggs. Trinkaus, J. P. 1993. The yolk syncytial layer of pellucida shedding by mouse embryo other
J. Cell Biol. 53: 419-434.
Fundulus: Its origin and history and its signifi- than mural trophectoderm. J. Exp. Zool. 249:
Schroeder, T. E. 1973. Cell constriction: cance for early embryogenesis. J. Exp. Zool. 265: 347-349.
Contractile role of microfilaments in division and 258-284.
Ziomek, C. A. and Johnson, M. H. 1980. Cell
development. Am. Zool. 13: 687-696. Tuchmann-Duplessis, H., David, G. and Haegel, surface interactions induce polarization of
Seidel, F. 1952. Die Entwicklungspotenzen einer P. 1972. Illustrated Human Embryology, Vol. 1. mouse 8-cell blastomeres at compaction. Cell
isolierten Blastomere des Zweizellenstadiums im Springer-Verlag, New York. 21: 935-942.
Gastrulação:
Reorganizando as células embrionárias
6
Meu querido amigo..... a vida é infinitamen-
te mais complexa do que qualquer coisa que
a mente humana possa imaginar. Não ou-
saríamos sequer conceber as coisas que são
meros detalhes da existência.
G ASTRULAÇÃO é o processo pelo qual movimentos altamente integrados
de células e tecidos, dramaticamente, reorganizam as células da blástula. A
blástula consiste de numerosas células, cujas posições foram estabelecidas
durante a clivagem. Durante a gastrulação, essas células recebem novas posições e
novos vizinhos, e é estabelecido o multifacetado plano do corpo do organismo. As
A. CONAN DOYLE (1891) células que formarão os órgãos endodérmicos e mesodérmicos são trazidas para den-
tro do embrião, ao passo que as precursoras da pele e do sistema nervoso são distri-
Não é o nascimento, o casamento ou a mor- buídas na superfície externa. Assim, as três camadas germinativas – ectoderma exter-
te, mas é a gastrulação que é verdadeira- no, endoderma interno e mesoderma intersticial – são produzidas inicialmente durante
mente a parte mais importante de nossa vida. a gastrulação. Ainda, o palco está montado para as interações desses tecidos recém-
LEWIS WOLPERT (1986)
posicionados.
Os movimentos da gastrulação envolvem o embrião inteiro, e migrações celula-
res em uma parte do organismo gastrulante devem estar intimamente coordenadas
com outros movimentos ocorrendo simultaneamente. Mesmo que o padrão de
gastrulação seja extremamente variado em todo o reino animal, relativamente pou-
cos mecanismos estão envolvidos. A gastrulação, geralmente, envolve os seguintes
tipos de movimentos:
• Epibolia. O movimento de camadas epiteliais (usualmente de células ectodér-
micas) que se espalham como uma unidade e não individualmente, para envol-
ver as camadas mais profundas do embrião.
• Invaginação. O dobrar para dentro de uma região de células, de maneira seme-
lhante à cavidade formada quando se empurra com o dedo a superfície de uma
bola de borracha macia.
• Involução. A internação ou movimento de interiorizarão de uma camada exter-
na em expansão, de modo a se espalhar na superfície interna das células exter-
nas remanescentes.
• Ingresso de células. A migração de células individuais da camada superficial
para o interior do embrião.
• Delaminação. A separação de uma camada celular em duas ou mais camadas
mais ou menos paralelas.
Ao considerarmos gastrulação em diferentes tipos de embrião, devemos levar em
conta as seguintes questões (Trinkaus, 1984a):
• Qual é a unidade da atividade migratória? É a migração dependente do
movimento de células individuais, ou são as células parte de uma camada
migrante? Por mais extraordinário que possa parecer, propriedades migratórias
regionais podem ser totalmente controladas por fatores citoplasmáticos que
209
são independentes da celularização. F. R. Lillie (1902) conseguiu ativar, parte-

nogeneticamente, óvulos do anelídeo Chaetopterus e suprimir sua clivagem.
Muitos eventos do desenvolvimento precoce ocorreram mesmo na ausência
de células. O citoplasma do zigoto se separou em regiões definidas, e os cílios
se diferenciaram nas partes apropriadas do ovo. Ainda mais, o citoplasma claro
externo migrou para baixo em direção à região vegetativa, de uma maneira
muito parecida à epibolia das células do hemisfério animal durante o desenvol-
vimento normal. Isso ocorreu precisamente no momento em que ocorreria a
epibolia durante a gastrulação. Assim, a epibolia pode ser (pelo menos em
alguns aspectos) independente das células que formam a região migratória.
• A expansão ou dobramento de uma camada celular deve-se a fatores intrín-
secos próprios, ou às forças extrínsecas que a estendem ou a distorcem? É
essencial conhecer a resposta a essa pergunta se queremos entender como os
vários movimentos celulares da gastrulação são integrados. Por exemplo, es-
tão as células involutivas puxando as células epibolizantes para baixo em sua
direção, ou são os dois movimentos independentes?
• Existe uma expansão ativa do tecido total, ou é a margem limitante que se
expande e arrasta o resto da camada celular, passivamente?
• São as mudanças na forma e na motilidade celular, durante a gastrulação,
conseqüências de mudanças nas propriedades da superfície celular, tais como
adesividade ao substrato ou a outras células?
Considerando essas questões, observaremos os vários padrões de gastrulação en-
contrados em equinodermos, anfíbios, peixes, aves e mamíferos*.
Gastrulação em ouriço-do-mar
A blástula do ouriço-do-mar consiste de uma única camada de mais ou menos 1000
células. Essas células derivadas de diferentes regiões do zigoto têm tamanhos e pro-
priedades diferentes. As Figuras 6.1 e 6.2 mostram o destino das várias regiões do
zigoto enquanto ele se desenvolve através da clivagem e da gastrulação na larva
pluteus, característica dos ouriços-do-mar. O destino de cada camada pode ser visto
através de seus movimentos durante a gastrulação.
Ingresso do Mesênquima Primário

FUNÇÃO DAS CÉLULAS PRIMÁRIAS DO MESÊNQUIMA. Logo após a eclosão
da blástula da membrana de fecundação, o seu hemisfério vegetal começa a se espes-
sar e achatar (Figura 6.2, 9 horas). No centro dessa placa vegetativa achatada, um
aglomerado de pequenas células começa a se modificar. Essas células apresentam
movimentos de vibração em suas superfícies internas, estendendo e contraindo lon-
gos e finos processos (30x5 µm) chamados filopódios. As células então se dissociam
da monocamada epitelial e ingressam na blastocele (Figura 6.2, 9-10 horas). Essas
células são chamadas de mesênquima primário e são derivadas dos micrômeros. As
64 ou mais células mesenquimatosas primárias do ouriço-do-mar são as descendentes
dos quatro blastômeros que se formaram pela quarta clivagem assimétrica.
Gustafson e Wolpert (1961) usaram filmes com exposição contínua para seguir os
movimentos microscópicos das células mesenquimatosas dentro da blastocele. No
*A discussão da gastrulação de Drosophila será transferida para o Capítulo 14, quando ela ocorre
no contexto da formação do eixo. Lembre-se do alerta feito pelo pesquisador de gastrulação, Ray
Keller (comunicação pessoal) “Estudantes NÃO deveriam ler esse material apressadamente, ao
contrário uma cena típica é aquela em que um pobre coitado está debruçado sobre este texto às 2.30
horas da madrugada com uma xícara de café, examinando desesperadamente as figuras para ver se ele
ou ela podem entender o que está se passando”. Gastrulação é (como diz Wolpert na citação no
começo deste capítulo) a época mais importante da sua vida. Vale a pena examiná-la criticamente
e apreciá-la vagarosamente.
CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 211
Animal
(A) (B) (C) (D) (E) (F) (G)
Mesômeros
Macrômeros
veg1
Vegetal Micrômetros veg2
Tufo ciliar
(H) (I) (J) (K) (L)
Mesênquima (Vista lateral)
secundário Estomodeu
Mesênquima (boca)
primário
Envoltório
Endoderma (M) ectodérmico
invaginante
Bastonetes
Figura 6.1 esqueléticos
Desenvolvimento normal do ouriço-do-mar, seguindo o destino das camadas celulares da blás- (mesoderma)
tula. (A-F) Clivagem até o estágio de 60 células (omitindo o estágio de 2-células). (G) Blástula Intestino
precoce com cílios. (H) Blástula tardia com tufo ciliar e placa vegetal achatada. (I) Blástula com (endoderma)
mesênquima primário. (J) Gástrula com mesênquima secundário. (K) Larva em estágio prismático.
(L,M) Larva pluteus. Os destinos do citoplasma zigótico podem ser seguidos pelas variações
no sombreamento. (N) Fotomicrografia de uma larva pluteus viva de ouriço-do-mar. (A-M (Vista ventral)
segundo Hörstadius, 1939; N cortesia de G. Watchmaker.) (N)
Boca
Ânus
Bastonetes
esqueléticos
9 hs. 9.5 hs. 10 hs. 10.5 hs.
11 hs. 11.5 hs. 12 hs. 13 hs.
Figura 6.2
Seqüência completa da gastrulação em
Lytechinus variegatus. O tempo mostra
15 hs. 17 hs. 18 hs.
a duração do desenvolvimento a 25oC.
13.5 hs. (Cortesia de J. Morrill.)
(A)
(B)
Figura 6.3
Formação dos cordões sinciciais por células mesenquimatosas do ouriço-do-mar. (A) Células
mesenquimatosas primárias da gástrula precoce se alinham e se fundem para depositar a matriz
da espícula de carbonato de cálcio. (B) microfotografia eletrônica de varredura de espículas
formadas pela fusão das células mesenquimatosas primárias para formar os cordões sinciciais.
(C) Anel de células mesenquimatosas em volta do arquêntero (intestino primitivo). A metade
animal e todo o arquêntero foram removidos. (D) Colocação das células mesenquimatosas
primárias na larva precoce de Lytechinus variegatus. (A e D de Ettensohn, 1990; B e C de
Morrill e Santos, 1985; todas as fotografias, cortesia dos autores.)
começo, as células parecem se movimentar ao acaso, ao longo da superfície interna da

(C) blastocele, ativamente produzindo e quebrando conexões filopódicas com a parede da
blastocele. Finalmente, essas células tornam-se localizadas dentro da provável região
Agregados Ventrolaterais ventrolateral da blastocele, onde considera-se que sua aderência seja maior. Aqui, as
células mesenquimatosas primárias se fundem em cordões sinciciais, que formarão o
eixo das espículas de carbonato de cálcio do esqueleto larval (Figura 6.3). Estudos
mais recentes (Cherr et al., 1992) sugerem que a migração inicial das células mesenqui-
matosas primárias é dirigida pela parede da blastocele e pelas fibrilas paralelas do
material da matriz extracelular que invadem a blastocele. As células mesenquimatosas
primárias parecem migrar ao longo da superfície da blastocele e são envolvidas no
emaranhado dessas fibrilas (Figura 6.4).
IMPORTÂNCIA DA LÂMINA EXTRACELULAR NO INTERIOR DA BLASTOCELE.

Os eventos que se dão no citoplasma e na superfície celular são fundamentais para o
Cadeia Cadeia Espícula ingresso e a migração das células mesenquimatosas primárias. Gustafson e Wolpert
dorsal ventral (1967) propuseram um modelo no qual o ingresso dos micrômeros se dá através de
(D) modificações de sua adesão a outras células e às matrizes extracelulares que os rodei-
am. Em 1985, Fink e McClay confirmaram as especulações de Gustafson e Wolpert,
medindo as forças de adesão dos blastômeros de ouriço-do-mar, em relação à camada
hialina, à lâmina basal e a outras células. Originalmente todas as células da blástula
estão ligadas pela sua superfície externa à camada hialina e sua superfície interna
ligada à lâmina basal secretada pelas células (veja Capítulo 3). Na sua lateral, cada
célula tem outra célula como vizinha. Fink e McClay verificaram que os futuros
ectoderma e endoderma (descendentes dos macrômeros e mesômeros, respectiva-
mente) se ligam fortemente entre si e à camada hialina, mas aderem fracamente à lâmina
basal (Tabela 6.1). Os micrômeros da blástula mostram, originalmente, um padrão simi-
lar de ligação. Entretanto, o padrão de ligação dos micrômeros muda na gastrulação.
(A)
(B)
Figure 6.4 (C)
Fotografias ao estéreo-microscópio eletrônico de varredura de células mesenquimatosas primá-
rias dentro da matriz extracelular de fibrilas da blastocele. (A) Células mesenquimatosas primá-
rias enredadas na matriz extracelular da gástrula precoce de Strongylus centrotus. (B,C) migra-
ção de células mesenquimatosas em estágio de gástrula. As fibrilas da matriz extracelular da
blastocele ficaram paralelas ao eixo animal-vegetal e estão intimamente associadas com as célu-
las mesenquimatosas primárias. (de Cherr et al., 1992; cortesia de G. Cherr.)
Enquanto outras células mantêm sua forte ligação à camada hialina e às células vizi-
nhas, as precursoras do mesênquima primário perdem sua afinidade a essas estruturas
(para aproximadamente 2% do valor original), enquanto que sua afinidade aos compo-
nentes da lâmina basal e matriz extracelular aumenta 100 vezes. Essa mudança na
afinidade faz com que os micrômeros percam suas ligações com a camada hialina
externa e com as células circundantes e, atraídos pela lâmina basal, migram para o
interior da blastocele (Figura 6.5). As modificações na afinidade celular foram
Tabela 6.1 Afinidades de células mesenquimatosas e não-mesenquimatosas

aos componentesa celulares e extracelulares
Força de deslocamento (em dinas)
Tipo celular Hialino Monocamadas de Lâmina basal

células gastrulares
Micrômeros em
estágio de 16 células 5.8 x 10-5 6.8 x 10-5 4.8 x 10-7
Células mesenquimatosas
em estágio migratório 1.2 x 10-7 1.2 x 10-7 1.5 x 10-5
Ectoderma e
endoderma gastrular 5.0 x 10-5 5.0 x 10-5 5.0 x 10-7
Fonte: Segundo Fink e McClay, 1985.
a
Células testadas foram colocadas em placas contendo hialino, lâmina basal extracelular, ou
monocamadas celulares. As placas foram invertidas e centrifugadas a várias forças para deslocar
as células. A força de deslocamento é calculada pela força centrífuga necessária para remover as
células teste do substrato.
Matriz Células
extracelular fibrilar Mesenquimatosas primárias
Blastocele
Lâmina basal
(A) (B) (C) (D) (E)

Camada Cílios
hialina
Figure 6.5
Ingresso de células mesenquimatosas primárias. (A-E) Diagramas interpretativos descrevendo
alterações nas interações adesivas nas presumidas células mesenquimatosas primárias (cor).
Essas células perdem suas afinidades pelo hialino e por seus blastômeros vizinhos enquanto
adquirem afinidade pela lâmina basal. Blastômeros não-mesenquimatosos retêm suas originais
afinidades pelo hialino e células vicinais. (F) Montagem de micrografia eletrônica de varredura
mostrando o ingresso de células primárias de Lytechinus variegatus. (F cortesia de J. B. Morrill
e D. Flaherty.)
correlacionadas com modificações nas moléculas da superfície celular que ocorreram

durante esse período (Wessel e McClay, 1985).
Como mostra a Figura 6.4, há uma alta concentração de material da lâmina extracelular
ao redor das células mesenquimatosas primárias ingressantes (Galileo e Morrill, 1985;
Cherr et al., 1992). Além disso, uma vez dentro da blastocele, as células mesenquimato-
sas primárias parecem migrar ao longo da matriz extracelular da parede da blastocele,
(F) extendendo seus filopódios a sua frente (Galileo e Morrill, 1985; Karp e Solursh, 1985). A
orientação das fibrilas, ao longo do eixo animal-vegetal, pode estar guiando as células
em sua migração. Três proteínas parecem ser importantes nessa migração. Uma é a
fibronectina, uma grande glicoproteína (400-kDa), que é um componente comum das
lâminas basais, incluindo aquela da blastocele do ouriço-do-mar (Wessel et al., 1984).
Fink e McClay mostraram que durante a gastrulação, a afinidade dos micrômeros por
essa molécula específica aumenta dramaticamente. O segundo grupo de moléculas con-
siste de proteoglicanos sulfatados encontrados na superfície das células mesenquima-
tosas ingressantes (veja Capítulo 3; Sugiyama, 1972; Lane e Solursh, 1991). Se a síntese
(ou sulfatação) desses proteoglicanos é inibida, as células mesenquimatosas entram na
blastocele, mas não continuam a migrar* (Figura 6.6; Karp e Solursh, 1974; Anstrom et
al., 1987). A terceira proteína, ECM18, é encontrada nas matrizes extracelulares das célu-
las da blastocele e é expressa somente durante a gastrulação. Bloquear ECM18 com
anticorpos previne tanto a migração mesenquimatosa primária quanto a invaginação
secundária do endoderma (Berg et al., 1996).
Porém, esses sinais de orientação não são suficientes, pois os micrômeros “sabem”
quando parar seu movimento e formar espículas perto do equador da blastocele. As
células mesenquimatosas primárias se organizam em forma de anel em uma posição
específica ao longo do eixo animal-vegetal. Em dois sítios perto do futuro lado ventral da
larva, muitas dessas células mesenquimatosas primárias se agrupam para iniciar a forma-
ção de espículas (Figura 6.3). Se um micrômero marcado de outro embrião é injetado na
blastocele em gastrulação de um embrião de ouriço-do-mar, ele migra para o local correto
*Em um dos primeiros experimentos em embriologia química, Curt Herbst (1904)

observou que embriões de ouriço-do-mar não gastrulavam adequadamente quando
colocados em água do mar que não continha íons sulfato. Na época, ele não podia
entender o porquê.
(A) (B) Figura 6.6

Efeito da privação de sulfato no movimento
do mesênquima primário do ouriço-do-mar Ly-
techinus. (A) Gástrula normal. (B) Gástrula
anormal formada quando embriões são culti-
vados em água do mar livre de sulfato. (de
Karp e Solursh, 1974, cortesia de M. Solursh.)
e contribui para a formação das espículas embrionárias (Prancha 35). Se células mesen-
quimatosas primárias de embriões mais velhos são injetadas em gástrulas mais jovens,
elas atrasarão sua diferenciação, migrarão como as células mais jovens e serão incorpo-
radas normalmente no mesênquima do hospedeiro. Além disso, se todas as células
mesenquimatosas do hospedeiro são removidas antes da injeção de células mesenqui-
matosas mais velhas, essas repetirão os estágios iniciais de sua migração, formando um
anel mesenquimatoso e o esqueleto, normalmente (Ettensohn, 1990). Considera-se que
essa informação posicional é fornecida pelas futuras células ectodérmicas e suas lâmi-
nas basais (von Übisch, 1939; Harkey e Whiteley, 1980). Somente células mesenquima-
tosas primárias (e não outros tipos de células ou partículas de látex) são capazes de
responder a esses sinais modeladores (Ettensohn e McClay, 1986). Miller e colegas
(1995) observaram a existência de filopódios extremamente delgados (0.3 µm de diâme-
tro) no mesênquima esqueletogênico (skeletonogenic); esses parecem explorar e sentir
a parede da blastocele (Figura 6.7). Esses filopódios contêm actina e não são considera-
dos como locomotores. Em lugar disso, são considerados como sensores do ambiente,
da mesma maneira que os filopódios nas pontas dos cones de crescimento axonal. Essas
extensões delgadas podem ser responsáveis pela captação de sinais modeladores
dorsoventral e animal-vegetal, a partir do ectoderma (Malinda et al., 1995).
Primeiro estágio da invaginação do arquêntero

Enquanto se forma o anel de células mesenquimatosas primárias no pólo vegetal da
blastocele, mudanças importantes estão ocorrendo nas células que permanecem na
Figura 6.7
Videomicrografia de Nomarski mostrando um filopódio longo e fino estendendo-se
de uma célula mesenquimatosa primária até a parede ectodérmica da gástrula,
assim como um filopódio mais curto estendendo-se para dentro do ectoderma. Os
filopódios mesenquimatosos estendem-se através da matriz extracelular e contatam
diretamente a membrana celular das células ectodérmicas. (de Miller et al., 1995;
fotografia cortesia de D. McClay.)
placa vegetativa. Essas células permanecem ligadas umas às outras e à camada hialina
do ovo, e se movem para ocupar os vazios deixados pelo ingresso do mesênquima;
portanto, a placa vegetal se achata ainda mais. Verifica-se, também, que a placa vegetal
se dobra para dentro e se estende por um quarto ou até a metade do seu caminho para
a blastocele (veja Figura 6.2, 10.5-11.5 horas; Figura 6.8A). Então, repentinamente, a
invaginação cessa. A região invaginada é chamada de arquêntero (intestino primitivo)
e sua abertura no pólo vegetal chamada de blastóporo.
Quais forças atuam para invaginar essas células? Lane e colaboradores (1993)
mostraram que o envergamento é semelhante aquele produzido pelo aquecimento de
uma faixa bimetálica. A camada hialina é, na verdade, formada de duas lâminas: uma
externa, formada primariamente de proteína hialina, e uma interna, composta de prote-
ínas fibropelinas* (Hall e Vacquier. 1982; Bisgrove et al., 1991). As células da placa
vegetal (e somente essas células) secretam um proteoglicano de condroitina sulfato
na lâmina interna da camada hialina, diretamente abaixo delas. Essa molécula
higroscópica (absorvente de água) incha a lâmina interna mas não a externa. Isso
causa o envergamento da camada hialina (Figura 6.8B,C). Um pouco mais tarde, uma
*Fibropelinas são armazenadas em grânulos secretores dentro dos oócitos. São secretadas desses
grânulos após a liberação da proteína hialina pela exocitose granular cortical. No estágio de blástula,
as fibropelinas já formaram um envoltório, tipo rede, sobre a superfície do embrião.
(A)
Figura 6.8
Invaginação da placa vegetal. (A) Invaginação da placa vegetal de Lytechinus variegatus vista
por micrografia eletrônica de varredura da superfície externa da gástrula precoce. O blastóporo
está claramente visível. (B) a camada hialina consiste de lâminas internas e externas. Microvi-
losidades da placa vegetal estendem-se através da camada hialina e seu citoplasma contém
vesículas secretoras que armazenam um proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG). (C)
Os grânulos de armazenamento secretam o proteoglicano para dentro da lâmina interna da
camada hialina. O proteoglicano absorve água e entumece a lâmina interna, enquanto a lâmina
externa, ao qual está fixado, não entumece. Isso ocasiona a curvatura para dentro do envoltório
hialino e do epitélio a ele ligado. (A de Morrill e Santos, 1985, cortesia de J. B. Morrill e C
segundo Lane et al., 1993.)
(B) (C) Células da placa vegetal empurradas para cima
Blastocele interior
Células de placa vegetal
Vesículas secretoras CSPG secretado para

com proteoglicano de a lâmina interna absorve
Lâmina interna sulfato de condroitina água, causando tumefação
Camada hialina Microvilosidades
Lâmina externa (CSPG)
Gastrulação precoce Gastrulação tardia Figura 6.9

Rearranjo celular durante a extensão do
arquêntero em embriões de ouriço-do-mar.
Nessa espécie, o arquêntero precoce tem 20 a
30 células ao redor de sua circunferência. Mais
tardiamente na gastrulação, o arquêntero tem
uma circunferência constituída de somente 6
a 8 células. Clones marcados fluorescente-
mente podem ser vistos estendendo-se
blastóporo apicalmente. (Segundo Hardin, 1990.)
segunda força resultante dos movimentos das células epiteliais adjacentes à placa
vegetal, pode facilitar essa invaginação puxando para dentro a camada envergada
(Burke et al., 1991).
Segundo e terceiro estágios da invaginação do arquêntero

A invaginação das células vegetais ocorre em três estágios discretos. Após uma breve
pausa, começa a segunda fase da formação do arquêntero. Durante essa fase, o
arquêntero se estende dramaticamente, algumas vezes triplicando seu comprimento.
No processo de extensão, o largo e curto intestino rudimentar é transformado em um
tubo longo e delgado; mas não são formadas novas células (veja Figura 6.2, 12 horas;
Figura 6.9). Para produzir essa extensão, as células do arquêntero se reorganizam
migrando umas sobre as outras e sofrendo um achatamento (Ettensohn, 1985; Hardin
e Cheng, 1986). Esse fenômeno, onde células se intercalam para estreitar o tecido e, ao
mesmo tempo, levá-lo adiante é chamado extensão convergente.
Em pelo menos algumas espécies de ouriço-do-mar, ocorre um terceiro estágio no
alongamento do arquêntero. Essa última fase é iniciada pela tensão propiciada pelas
células mesenquimatosas secundárias, que se formam na ponta do arquêntero e lá
permanecem (veja Figura 6.2, 13 horas; Figura 6.10). Os filopódios se estendem dessas
células através do fluido da blastocele e fazem o contacto com a superfície interna da
Figura 6.10
Estágio de gástrula intermediária do ouriço-
do-mar Lytechinus pictus, mostrando exten-
sões de filopódios do mesênquima secundá-
rio estendendo-se da ponta do arquêntero até
a parede da blastocele. (A) Células mesen-
quimatosas estendendo filopódios da ponta
do arquêntero. (B) Cabos de filopódios
conectando a parede da blastocele à ponta do
arquêntero. A tensão nos cabos pode ser ava-
liada pela tração exercida sobre a parede da
blastocele no ponto de fixação. (Fotografias
(A) (B) cortesia de C. Ettensohn.)
parede da blastocele (Dan e Okazaki, 1956; Schroeder, 1981). Os filopódios se ligam à

parede nas junções entre as células do blastoderma e, em seguida, se contraem, arras-
tando o arquêntero para cima. Hardin (1988) removeu as células mesenquimatosas
secundárias com um laser, e como conseqüência o arquêntero só pode se alongar
aproximadamente em dois terços do seu comprimento total. Quando algumas células
mesenquimatosas secundárias foram deixadas, o alongamento continuou, embora em
velocidade menor do que nos controles. As células mesenquimatosas secundárias
têm, então, um papel essencial em elevar o arquêntero até a parede da blastocele
durante a última fase da invaginação.
Mas, podem os filopódios mesenquimatosos secundários se ligar a qualquer parte
da parede da blastocele, ou existe um alvo específico no hemisfério animal que precisa
estar presente para que a ligação ocorra? Existe alguma região da parede da blastocele
que é predestinada a se tornar o lado ventral da larva? Estudos de Hardin e McClay
(1990) mostram que existe um “alvo” específico para os filopódios do hemisfério ani-
mal, que difere de outras regiões. Os filopódios das células mesenquimatosas secun-
dárias se estendem, tocam a parede da blastocele ao acaso e, em seguida, se retraem.
Entretanto, quando os filopódios atingem uma região específica da parede, eles per-
manecem ligados naquele local, se achatam contra essa região e puxam o arquêntero
em direção a ela. Quando Hardin e McClay comprimiram o outro lado da parede da
blastocele, de modo que o contato com a região se tornou mais eficiente, os filopódios
continuaram a se estenderem e a se contraírem ao tocar a parede daquela região.
Somente quando os filopódios encontraram o “alvo” é que cessaram os movimentos.
Com a gástrula contraída de modo a impedir que os filopódios jamais atingissem a área
“alvo”, as células secundárias mesenquimatosas continuaram sua exploração até que
finalmente se afastaram do arquêntero e encontraram o tecido alvo, como células
migratórias livres. Parece então, que existe uma região alvo destinada a se transformar
na região ventral da larva, que é reconhecida pelas células mesenquimatosas secun-
dárias e que posiciona o arquêntero na região onde se formará a boca.
Quando o topo do arquêntero encontra a parede da blastocele nessa região, as
células mesenquimatosas secundárias se dispersam no interior da blastocele, onde
proliferam para formar os órgãos mesodérmicos (veja Figura 6.2, 13.5 horas). Onde o
arquêntero contata a parede se formará, finalmente, uma boca que se fundirá a ele
formando um tubo digestivo contínuo. Assim, como é característico para os
deuterostomatas, o blastóporo marca a posição do ânus.
Gastrulação em peixes
A transição da blástula intermediária
e a aquisição de motilidade celular
Durante o décimo ciclo de clivagem do peixe-zebra, as divisões celulares perdem

sua sincronia, novos genes são expressos e as células se tornam móveis. Essa
transição da blástula intermediária (MBT) também é evidente em rãs e em Droso-
phila. Como discutido no Capítulo 5, a MBT parece ser regulada pela relação entre
cromatina e citoplasma. Peixes haplóides entram na MBT um ciclo mais tarde;
peixes tetraplóides entram um ciclo antes (Kane e Kimmel, 1993). Parece que algu-
ma coisa na cromatina está “removendo por titulação” alguma substância (até
agora desconhecida) do citoplasma.
O primeiro movimento celular é a epibolia das células blastodérmicas sobre o
vitelo. Na fase inicial, as células blastodérmicas internas se movem para o exterior e se
intercalam com as células mais superficiais (Warga e Kimmel, 1990). Mais tarde, as
células se movem sobre a superfície do vitelo envolvendo-o completamente (Figura
6.11). Esse movimento não é devido a um arrastão ativo dos blastômeros. Pelo contrá-
rio, o movimento é propiciado pela expansão autônoma da camada sincicial do vitelo
(YSL) “dentro” do citoplasma do hemisfério animal. A camada envolvente (EVL) está
(A) Figura 6.11

30% DE EPIBOLIA (4.7 HS) Movimentos celulares durante a gastrulação do teleósteo Danio rerio. (A) O
blastoderma com epibolia 30 porcento completa. (B) Formação do hipoblasto,
Camada envolvente Pólo animal
por involução de células na margem do blastoderma em epibolização ou por
delaminação de células do epiblasto. (C) Detalhe da região marginal. (D) Com
Camada profunda 90 porcento de epibolia, o mesoderma pode ser visto rodeando o vitelo, entre
o ectoderma e o endoderma. (E) Término da gastrulação. (Segundo Driever,
Camada sincicial 1995, e Langeland e Kimmel, 1997.)
do vitelo
Ventral Dorsal
Célula do vitelo
Núcleo do vitelo
Pólo vegetal
(B) (C)
ESCUDO (6.0 HS.) Pólo animal Ingresso celular
Epiblasto
Hipoblasto
Hipoblasto Camada envolvente

Escudo
Epiblasto
Ventral Dorsal
Células em involução
Células em não-
involução
Sinal indutor Sinais indutores
mesodérmico Camada sincicial
mesodérmicos do vitelo
Pólo Vegetal e dorsais
Grânulo do vitelo
(D) Pólo animal (E) Pólo animal

Mesoderma Anterior Região cefálica
dorsal
Camada Camada
envolvente envolvente
Somito #1
Ventral Dorsal
Ventral Dorsal
Mesoderma
Ectoderma,
neuroectoderma Coto caudal Região do
Pólo vegetal Mesendoderma: precursores tronco
para mesoderma e endoderma Posterior
Endoderma Pólo animal

(90% EPIBOLIA (9 HS) 1 SOMITO (10.3 HS)
fortemente ligada à YSL e é arrastada junto com ela. As células mais profundas do
blastoderma enchem o espaço entre a YSL e a EVL enquanto a epibolia se desenvolve.
Isso pode ser demonstrado cortando a ligação entre YSL e EVL. Quando isso é feito,
as células blastodérmicas retornam ao topo do vitelo enquanto YSL continua sua
expansão ao redor da célula do vitelo (Trinkaus, 1984b, 1992). A expansão de YSL tem
como base uma rede de microtúbulos em sua estrutura, e radiação ou drogas que
impedem a polimerização de tubulina inibem a epibolia (Strahle e Jesuthasan, 1993;

Solnica-krezel e Driever, 1994).
Durante a migração, um dos lados do blastoderma se torna visivelmente mais
grosso do que o outro. Experimentos com marcação de células indicam que o lado mais
delgado marca o sítio da futura superfície dorsal do embrião (Schmidt e Campos-
Ortega, 1995).
Formação das camadas germinais

Depois que as células blastodérmicas cobrem aproximadamente a metade da célula do
vitelo do peixe-zebra (e mais cedo em ovos de peixes com vitelos maiores) um
espessamento ocorre ao longo de toda a margem. Esse espessamento é chamado de
anel germinativo, e é composto de uma camada superficial, o epiblasto, e uma camada
interna, o hipoblasto. Não entendemos como é produzido o hipoblasto. Alguns labo-
ratórios alegam que o hipoblasto é formado pela involução das células superficiais
abaixo da margem, seguida por sua migração para o pólo animal (veja Figura 6.11). A
involução começa na futura porção dorsal do embrião, mas ocorre na margem inteira.
Outros laboratórios alegam que essas células hipoblásticas ingressam para formar o
hipoblasto (veja Trinkaus, 1996). (É possível que ambos os mecanismos ocorram com
diferentes maneiras de formar o hipoblasto predominando em espécies diferentes.)
Uma vez formado o anel, as células profundas de ambos, epiblasto e hipoblasto, se
intercalam no futuro lado dorsal do embrião, para formar um espessamento localizado,
o escudo embrionário (Figura 6.12). Esse escudo é funcionalmente equivalente ao
lábio dorsal do blastóporo de anfíbios, pois ele pode organizar um eixo embrionário
secundário quando transplantado a um embrião hospedeiro (Oppenheimer, 1936; Ho,
1992; veja discussão de gastrulação em anfíbios).
Assim, enquanto as células realizam a epibolia em torno do vitelo, elas também
estão involuindo nas margens e convergindo anteriormente e dorsalmente em direção
Figura 6.12
(A) Pólo animal
Convergência e extensão no peixe-zebra. (A) Vista dorsal de movimentos de
Extensão convergência e extensão durante a gastrulação do peixe-zebra. A epibolia es-
tende o blastoderma sobre o vitelo; a involução ou o ingresso geram o hipoblasto;
Escudo convergência e extensão trazem células do hipoblasto e epiblasto para o lado
embrionário dorsal para formar o escudo embrionário. Dentro do escudo, a intercalação
estende o cordomesoderma em direção ao pólo animal. (B,C) Extensão con-
vergente do cordomesoderma é mostrada por aquelas células exprimindo o
Convergência
gene no tail (sem cauda), um gene que é expresso pelas células da notocorda.
(D,E) Extensão convergente de células mesodérmicais adaxiais (marcadas pela
Involução
sua expressão de gene snail para flanquear a notocorda. (de Langeland e
Epibolia Kimmel, 1997.)
Célula do
vitelo
(B) (C) (D) (E)

(A) (B) (C)

Manchas de
Vidro para corante no embrião
Discos de ágar
segurar o com corante Lábio dorsal
embrião do blastóporo
Embrião
Figura 6.13 Secção em

Coloração vital de embriões de anfíbios. (A) Método de Vogt para marcação de células especí- plano de
ficas da superfície embrionária com corantes vitais. (B-D) Vistas da superfície do corante em visão (E)
embriões sucessivos. (E) Embrião de tritão dissecado no plano mediano para mostrar células (D)
coradas no interior. (Segundo Vogt, 1929.)
ao escudo embrionário (Trinkaus, 1992). As células hipoblásticas do escudo embrio-

nário convergem e se estendem anteriormente, finalmente estreitando-se ao longo da
linha dorsal média do hipoblasto. Esse é o cordomesoderma, o primórdio da notocorda
(Figura 6.12B,C). As células adjacentes ao cordomesoderma, as células adaxiais, são
as precursoras dos somitos mesodérmicos (Figura 6.12D,E). A convergência e a exten-
são no epiblasto traz as células presuntivas do cérebro de todo o epiblasto para a linha
média dorsal onde formam a quilha neural. O resto do epiblasto se torna a pele do (E)
peixe. O mapa de destino do peixe-zebra, então, não é tão diferente daquele da rã ou
outros vertebrados (como logo veremos). Se abrirmos, conceitualmente, uma blástula
de Xenopus no pólo vegetal e esticarmos a abertura em um anel marginal, o mapa de
destino resultante se parece muito com aquele do embrião do peixe-zebra quando
metade do vitelo estava coberto pelo blastoderma (Langeland e Kimmel, 1997).
Gastrulação de anfíbios
O estudo da gastrulação em anfíbios é ao mesmo tempo uma das mais antigas e uma
das mais novas áreas da embriologia experimental; mesmo considerando que gastru-
lação de anfíbios foi estudada extensamente no século passado, a maior parte de
nossas teorias relacionadas aos mecanismos do movimento no desenvolvimento,
foram revisadas na década passada. O estudo da gastrulação em anfíbios foi compli-
cado pelo fato de existir mais de um tipo de gastrulação nos anfíbios. Espécies diferen-
tes empregam diferentes maneiras para atingir o mesmo objetivo (Smith e Malacinski,
1983; Lundmark, 1986). Nos últimos anos, a pesquisa mais intensa se concentrou em
Xenopus, portanto, daremos ênfase ao seu processo de gastrulação.
Movimentos celulares durante a gastrulação de anfíbios

As blástulas de anfíbios têm as mesmas tarefas que seus companheiros, equinoder-
mos e peixes, ou seja, trazer para dentro aquelas áreas destinadas a formar os órgãos
endodérmicos, envolver o embrião com células capazes de formar o ectoderma e colo-
car as células mesodérmicas no lugar apropriado entre elas. Os movimentos pelos
quais isso é conseguido podem ser visualizados pela técnica de coloração vital. Vogt
(1929) saturou fragmentos de ágar com corante, como vermelho neutro ou sulfato de
azul do Nilo, os quais coram mas não danificam as células embrionárias. Esses frag-
mentos corados de ágar foram pressionados contra a superfície da blástula e uma
parte do corante foi transferida para as células contatadas (Figura 6.13). Os movimen-
tos de cada grupo de células coradas foram acompanhados através da gastrulação, e
Figura 6.14 Epiderme

Mapas do destino da blástula da rã Xenopus
laevis. Mapas de destino (A) de células exte- Placa neural
riores e (B) interiores indicam que a maioria
dos derivados mesodérmicos são formados Endoderma
Mesoderma Notocorda
de células interiores. Nessa vista lateral, o acima do
lateral
ponto em que se forma o lábio dorsal do blastóporo
blastóporo está indicado por uma flecha. (Se- Endoderma Blastóporo Blastóporo
gundo Keller, 1976.) abaixo do blastóporo Somitos
(A) EXTERIOR (B) INTERIOR
os resultados sumariados em mapas de destino. Esses mapas foram recentemente

confirmados e ampliados por técnicas de microscopia eletrônica de varredura e de
injeção de corantes (Smith e Malacinski, 1983; Lundmark, 1986).
Estudos com corantes vitais de Løvtrup (1975; Landstrom Løvtrup, 1979) e de
Keller (1975, 1976) mostraram que as células da blástula de Xenopus têm diferentes
destinos, conforme se encontrem nas camadas profundas ou superficiais do embrião
(Figura 6.14). Em Xenopus, os precursores mesodérmicos existem somente na camada
profunda, enquanto que o ectoderma e endoderma se originam da camada superficial
do embrião. Os precursores da notocorda e outros tecidos mesodérmicos estão loca-
lizados abaixo da superfície, na região equatorial (marginal) do embrião. Em urodelos
(salamandras, tais como: Triturus e Ambystoma) e em algumas rãs sem ser o Xenopus,
os precursores da notocorda e do mesoderma são encontrados em ambas, nas células
da superfície e nas células marginais profundas (Purcell e Keller, 1993).
A gastrulação em embriões de rã é iniciada no futuro lado dorsal do embrião, logo
abaixo do equador na região do crescente cinzento (Figura 6.15). Nesse ponto, as
futuras células endodérmicas locais invaginam dando lugar à formação de um blastóporo
em forma de fenda. Essas células modificam sua forma dramaticamente. O corpo prin-
cipal de cada célula é deslocado na direção interna do embrião, mas o contacto com a
superfície externa é mantido por um delgado filamento semelhante a um pescoço
(Figura 6.16). Essas células garrafa revestem o arquêntero inicial. Assim, como na
gastrulação do ouriço-do-mar, uma invaginação de células inicia a formação do
arquêntero. Entretanto, ao contrário da gastrulação em ouriço-do-mar, a gastrulação
na rã não começa no pólo vegetativo, mas na zona marginal próxima ao equador da
blástula, onde se encontram os hemisférios animal e vegetal. Aqui, as células
endodérmicas não são tão grandes e nem tão ricas em vitelo como os blastômeros do
pólo vegetativo.
A próxima fase da gastrulação envolve a involução das células da zona marginal,
enquanto as células do pólo animal sofrem epibolia e convergem no blastóporo. Quando
as células marginais migratórias chegam ao lábio dorsal do blastóporo, elas se dirigem
para dentro e migram ao longo da superfície interna das lâminas celulares externas.
Dessa forma, as células que constituem o lábio do blastóporo estão constantemente
mudando. As primeiras células que compõem o lábio dorsal são as células garrafa que
invaginam para formar a borda anterior do arquêntero. Essas células, mais tarde, se
tornam as células faríngeas do intestino anterior. Enquanto essas primeiras células
passam para o interior do embrião, o lábio do blastóporo passa a ser composto de
células que involuem para dentro do embrião, tornando-se os precursores do
mesoderma da cabeça. As próximas células involuindo para o embrião, através do
lábio dorsal do blastóporo, são as células cordomesodérmicas. Essas células formarão
a notocorda, uma “espinha dorsal” mesodérmica transitória que é essencial para o
início da diferenciação do sistema nervoso.
À medida que as novas células migram para dentro do embrião, a blastocele é
deslocada para o lado oposto ao lábio dorsal do blastóporo. Enquanto isso, o lábio do
blastóporo se expande lateral e ventralmente, bem como os processos de formação
das células garrafa e involução continuam no blastóporo. O blastóporo em expansão
Pólo animal (AP)

Arquêntero
Blastocele
Lábio dorsal Mesoderma
Células do blastóporo
superficiais
Blastocele
Células deslocada Endoderma
profundas
(A) (B) (C)
Pólo vegetal
Mesoderma dorsal Mesênquima

Ectoderma Ectoderma
Arquêntero
Notocorda Notocorda
Lábio dorsal Lábio dorsal
do blastóporo do blastóporo Lábio lateral
Lábio lateral do blastóporo
do blastóporo
Endoderma
Tampo do
(D) (E) (F)
vitelo
Ectoderma
Endomesoderma Lábio ventral
do blastóporo Mesoderma
anterior ventral
Figura 6.15
Movimentos celulares durante a gastrulação da rã. As seções são cortadas através da
metade do embrião, e são posicionadas de modo que o pólo vegetal seja inclinado na
direção do observador e ligeiramente para a esquerda. Os principais movimentos celula-
res estão indicados por flechas, e as células superficiais do hemisfério animal estão
coloridas para permitir o seguimento de sua movimentação. (A,B) Gastrulação precoce.
Células de garrafa da margem movem-se para o interior para formar o lábio do blastóporo,
e precursores mesodérmicos involuem sob o teto da blastocele. AP marca a posição do
Figura 6.16
pólo animal, que irá mudar à medida que a gastrulação prossegue. (C,D) Gastrulação
Estrutura do lábio do blastóporo. (A) Dia-
intermediária. O arquêntero se forma e desloca a blastocele, e as células migram dos
grama de células de uma seção da gastrula-
lábios lateral e ventral do blastóporo para dentro do embrião. As células do hemisfério
ção do embrião da salamandra, mostrando a
animal migram em direção da região vegetal, movendo o blastóporo para região próxima
extensão das células-garrafa do blastóporo.
do pólo vegetal. (E,F) Perto do fim da gastrulação, a blastocele é obliterada, o embrião
(B) Visão de superfície de um lábio dorsal
fica envolvido pelo ectoderma, o endoderma foi internalizado, e as células mesodérmicas
precoce do blastóporo de Xenopus. A dife-
se posicionaram entre o ectoderma e o endoderma. (Segundo Keller, 1986.)
rença de tamanho entre os blastômeros ani-
mais e vegetais está claramente aparente. (C)
Detalhe da região onde as células do hemis-
fério animal estão involuindo através do lá-
bio do blastóporo. (A segundo Holtfreter,
1943; B e C, micrografias de varredura ele-
(A) (B)
trônica cortesia de C. Phillips.)
(C)
Células-
garrafa
Blastóporo
(A) (B) Lábio dorsal

i ii iii
Obturador Lábio lateral

do vitelo
Lábio do
blastóporo iv v
Lábio ventral Obturador

do vitelo
Figura 6.17
Epibolia do ectoderma. (A) Movimentos morfogenéticos de células migrando para o interior do
blastóporo e em seguida sob a superfície. (B) Mudanças na região ao redor do blastóporo
quando se formam sucessivamente os lábios dorsal, lateral e ventral. Quando o lábio ventral
completa o círculo, o endoderma torna-se progressivamente internalizado. Números ii-v corres-
pondem às Figuras 6.15B-E, respectivamente. (B de Balinsky, 1975, cortesia de B. I. Balinsky.)
como um “crescente”, desenvolve lábios laterais e, finalmente, um lábio ventral sobre

o qual passam células precursoras adicionais, mesodérmicas e endodérmicas. Com a
formação do lábio ventral, o blastóporo forma uma anel ao redor das grandes células
endodérmicas que permanecem expostas na superfície do pólo vegetativo. Esse peda-
ço remanescente de endoderma é chamado de rolha ou obturador do vitelo; ele tam-
bém é finalmente internalizado (Figura 6.17). Naquele ponto, todos os precursores
endodérmicos foram trazidos para o interior do embrião, o ectoderma envolveu a
superfície e o mesoderma foi colocado entre eles.
Posicionando o blastóporo
Tendo visto os aspectos gerais da gastrulação em anfíbios, podemos agora nos ocu-
par de cada passo em detalhe. A gastrulação não existe como um processo indepen-
dente na vida do animal. Na verdade, a preparação para a gastrulação já pode ser
visualizada no preciso momento da fusão óvulo-espermatozóide. O óvulo tem uma
polaridade ao longo do eixo animal-vegetal. O destino geral dessas regiões pode ser
previsto antes da fecundação. A superfície do hemisfério animal se transformará nas
células do ectoderma (pele e nervos), o hemisfério vegetal formará as células do intes-
tino e órgãos associados (endoderma), e as células mesodérmicas serão formadas a
partir do citoplasma interno, ao redor do equador. Assim, as camadas germinativas
podem ser mapeadas no óvulo; porém, isso nada diz sobre qual parte do ovo formará
a frente e qual as costas. Os eixos dorsoventral (dorso-frente), ântero-posterior e
direito-esquerdo ainda não foram determinados.
Os eixos dorsoventral e ântero-posterior são especificados pelo deslocamento
do citoplasma do zigoto durante a fecundação. No Capítulo 4 discutimos a rotação
do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno no ovo da rã. O citoplasma
interno permanece orientado em relação à gravidade devido a sua densa acumula-
ção de vitelo, enquanto o citoplasma cortical gira 30o na direção do hemisfério ani-
mal (para cima) em direção ao ponto de entrada do espermatozóide (veja Figura 4.34).
Essa rotação faz com que o eixo animal-vegetal da superfície do ovo se desloque 30o Normal Girada
relativo ao eixo animal-vegetal do citoplasma interno. Dessa maneira, um novo esta-
Porcentagem de embriões
do de simetria é adquirido. Enquanto que o óvulo era radialmente simétrico em
relação ao eixo animal-vegetal, o ovo fecundado agora tem um eixo dorsoventral e é
bilateralmente simétrico (tem lados direito e esquerdo). O citoplasma interno tam-
bém se move, e microscopia de fluorescência de embriões precoces mostrou que os
padrões citoplasmáticos das células presuntivas dorsais são diferentes daqueles
das células presuntivas ventrais (Prancha 7).
Esses movimentos citoplasmáticos ativam o citoplasma oposto ao ponto de
entrada do espermatozóide, a iniciar a gastrulação (Figura 6.18). O lado pelo qual
entra o espermatozóide marca a futura superfície ventral do embrião; o lado oposto,
onde se inicia a gastrulação, marca o futuro dorso (costas) do embrião (Gerhart et al., Ângulo do lábio do blastóporo
1981; Vincent et al., 1986). Mesmo que o espermatozóide não seja necessário para do ponto de entrada de espermatozóide
induzir esses movimentos no citoplasma do ovo, ele é importante na determinação
da direção dessa rotação. Se um ovo artificialmente estimulado é anucleado, a rota- Figura 6.18
ção cortical ainda se dá no tempo correto. Entretanto, a direção desse movimento é Relação entre o ponto da entrada do esper-
imprevisível. (De fato, em ovos dispérmicos existe uma única direção de rotação.) O matozóide e o lábio dorsal do blastóporo em
espermatozóide parece fornecer um sinal espacial que orienta a rotação autônoma ovos de rã normais e naqueles que sofreram
do citoplasma, mas é a rotação citoplasmática que é essencial para o futuro desen- rotação. Ovos de Xenopus foram fertilizados,
volvimento. Além disso, se essa rotação cortical é bloqueada, não há o desenvolvi- desgeleificados e colocados em Ficoll para de-
sidratar o espaço perivitelino. A entrada do
mento dorsal, e o embrião morre como uma massa de células ventrais (primariamente
espermatozóide foi marcada com corante. Os
intestinais) (Vincent e Gerhart, 1987). A direção do movimento citoplasmático deter- ovos sofreram rotação, foram inclinados em
mina qual lado será o dorsal e qual será o ventral. 900, com o ponto de entrada do espermato-
A direção preferencial fornecida pelo ponto de entrada do espermatozóide pode zóide virado para cima, 50-80 minutos após
ser sobrepujada por um redirecionamento mecânico da relação espacial entre os a fertilização. (Segundo Gerhart et al., 1981.)
citoplasmas cortical e subcortical. Quando se impede a rotação do ovo (por imersão
em um polissacarídeo que provoca o colapso do espaço perivitelino entre o ovo e o
envoltório de fertilização) ele pode sofrer uma rotação de 90o de modo que o eixo
animal-vegetal fique horizontal e não vertical e o ponto de entrada do espermatozói-
de voltado para cima (Gerhart et al., 1981; Kirschner e Gerhart, 1981; Cooke, 1986).
Quando ovos fecundados são inclinados dessa maneira por trinta minutos, partindo
da metade do primeiro ciclo de clivagem, o citoplasma gira de tal maneira que quase
todos os embriões iniciam a gastrulação no mesmo lado da entrada do espermatozói-
de (veja Figura 6.18).
A discussão precedente sugere que deve ser possível ter dois sítios de iniciação
de gastrulação se houver a combinação de rotação orientada pelo espermatozóide
com uma rotação do ovo artificialmente induzida. Black e Gerhart (1985) permitiram a
rotação inicial orientada pelo espermatozóide, mas em seguida imobilizaram os ovos
em gelatina e os centrifugaram levemente, de modo que o citoplasma interno se mo-
vesse para o ponto de entrada do espermatozóide. Quando foi permitido que os ovos
centrifugados se desenvolvessem em água normal, apareceram dois sítios de gastru-
lação, levando ao aparecimento de larvas gêmeas ligadas (Figura 6.19). A hipótese de
Black e Gerhart (1986) é que tal produção de gêmeos é causada pela formação de duas
áreas de interação: um eixo se forma onde a rotação cortical normal deu origem às
interações citoplasmáticas no pólo vegetal da célula; o outro eixo se forma onde o
citoplasma dirigido pela centrifugação interage com os componentes do pólo vegetal.
Gêmeos também podem ser produzidos em gravidade normal, colocando o lado do
ovo onde penetra o espermatozóide voltado para cima, após remover o envoltório de
fertilização (Gerhart et al., 1981).
A possibilidade de se obter dois lábios funcionais dos blastóporos também sugere
que não há nada especial a respeito do crescente cinzento, onde se observa pela
primeira vez o início da gastrulação. Na verdade, os fatores indutores da gastrulação
parecem ser criados pelas interações dos citoplasmas animal e vegetal, interações
essas que, provavelmente, ativam algum componente do citoplasma vegetal. Gimlich
e Gerhart (1984) realizaram uma série de experimentos de transplante que confirmaram
(A) (B)
Figura 6.19
Blastóporos gêmeos produzidos pela rotação
de ovos desgeleificados de Xenopus com o lado
ventral para cima (ponto de entrada do esper-
matozóide), no momento da primeira cliva-
gem. (A) Dois blastóporos são instruídos para
formar: o original (oposto ao ponto de entrada
do espermatozóide) e o novo, criado pelo des-
locamento de material citoplasmático. (B) Es-
ses ovos desenvolvem dois eixos completos, a hipótese de que os fatores que iniciam a gastrulação originalmente estão no cito-
que formam girinos gêmeos, ligados ventral- plasma profundo das células vegetativas dorsais, e não no crescente cinzento. Eles
mente. (Cortesia de J. Gerhart.) demonstraram que em um embrião de Xenopus, no estágio de 64 células, os três
blastômeros vegetais mais dorsais são capazes de induzir a formação do lábio dorsal
do blastóporo e de um eixo dorsal completo em embriões hospedeiros irradiados com
luz ultravioleta (que, de outra maneira, não seriam capazes de iniciar a gastrulação;
Figura 6.20A). Além disso, esses três blastômeros, situados abaixo da região do
prospectivo lábio dorsal, podem também induzir uma invaginação secundária e um
eixo quando transplantados para o lado ventral de um embrião normal, no estágio de
64 células, não irradiado (Figura 6.20B). Esse pequeno grupo de blastômeros vegetais
permite a invaginação de células marginais adjacentes e a formação do eixo mesodér-
mico dorsal do embrião. Holowacz e Elinson (1993) observaram que o citoplasma
cortical, das células vegetativas dorsais do embrião de Xenopus, no estágio de 64
células, era capaz de induzir a formação de eixos secundários quando injetado em
células vegetativas ventrais. Nem o citoplasma cortical de células animais e nem o
citoplasma profundo das células ventrais puderam induzir esses eixos.
Parece, então, que os rearranjos internos do citoplasma, provavelmente orienta-
dos pela entrada do espermatozóide, são responsáveis pela distribuição assimétrica
de fatores subcelulares. Essa assimetria cria uma distinção dorsoventral no ovo que,
em última instância, dirige o posicionamento do blastóporo acima de um conjunto de
blastômeros vegetais e oposto ao ponto de entrada do espermatozóide. As moléculas
que podem estar envolvidas na formação do sítio vegetal de iniciação da gastrulação
(o “centro de Nieuwkoop”) serão discutidas no Capítulo 15.
Movimentos celulares e a construção do arquêntero
O INÍCIO DA GASTRULAÇÃO. A gastrulação em anfíbios é iniciada quando um

grupo de células endodérmicas marginais, na superfície dorsal da blástula, penetra no
interior do embrião. As superfícies externas (apicais) dessas células se contraem dra-
maticamente, enquanto seus terminais internos (basais) se expandem. O comprimento
apical-basal dessas células aumenta bastante, originando a forma característica de
“garrafa”. Na salamandra, essas células parecem ter um papel ativo nos movimentos
iniciais da gastrulação. Johannes Holtfreter (1943, 1944) observou que as células gar-
rafa de gástrulas precoces de salamandra poderiam aderir às lamínulas de vidro e guiar
o movimento das células ligadas a elas. Até mais convincentes foram os experimentos
(A) (B)
DOADOR RECEPTOR DOADOR RECEPTOR

Ponto de Ponto de
NORMAL IRRADIADO POR UV NORMAL NORMAL
entrada do Ponto de entrada entrada do
espermatozóide do espermatozóide espermatozóide
UV
Sem transplante
Transplante
Peça embrionária Novo local de

ventral carente de gastrulação e forma
eixo corporal de eixo corporal
Figura 6.20
Experimentos de transplante demonstrando
que as células vegetativas, abaixo das regiões
de recombinação de Holtfreter, nos quais células da zona marginal dorsal (que dariam do futuro lábio dorsal do blastóporo, são res-
origem ao lábio dorsal do blastóporo) foram combinadas com o tecido endodérmico ponsáveis pelo início da gastrulação. (A) Sal-
interno. Quando as células da zona marginal dorsal foram removidas e colocadas no vamento de embriões irradiados pelo trans-
plante de blastômeros do segmento mais dor-
prospectivo tecido endodérmico interno, as células precursoras do blastóporo forma-
sal (cor) de um embrião, no estágio de 64 célu-
ram células garrafas e se aprofundaram abaixo da superfície do endoderma interno las, para uma cavidade criada pela remoção de
(Figura 6.21). Mais ainda, ao se aprofundarem, criaram uma depressão reminiscente do um número semelhante de células vegetais. Um
blastóporo precoce. Sendo assim, Holtfreter sugeriu que a habilidade de invaginar zigoto irradiado sem tal transplante não sofre
com profundidade para dentro do endoderma é uma propriedade inata das células da gastrulação normal. (B) Formação de um novo
zona marginal dorsal. local para gastrulação e eixo corporal pelo trans-
plante das células vegetativas, mais dorsais,
de um embrião de 64 células, para região vege-
tal mais ventral, de outro embrião de 64 célu-
las. (Segundo Gimlich e Gerhart, 1984.)
Células
Implante endodérmicas Sulco no blastóporo
Figura 6.21
Um implante de células de anfíbios da região do lábio dorsal do blastóporo submerge para
dentro de uma camada de células endodérmicas e forma um sulco do blastóporo. (Segundo
Holtfreter, 1944.)
A situação no embrião da rã é um pouco diferente. R. E. Keller e seus orientados

(Keller, 1981; Hardin e Keller, 1988) mostraram que apesar das células garrafa terem um
papel na iniciação da involução da zona marginal ao adquirem a forma de garrafa, elas
não são essenciais para a continuação da gastrulação. A forma peculiar de garrafa
dessas células é necessária para iniciar a gastrulação; é a constrição das células que
puxa a zona marginal na direção vegetativa, enquanto empurra as células vegetativas
para dentro (Figura 6.22 A,B). O estiramento da zona marginal permite a expansão do
ectoderma em direção ao pólo vegetal e o envolvimento do embrião; empurrar as
células vegetais permite a esses precursores da mesoderme anterior contatar o lado de
Células
(A) (B) (C) (D)
marginais
profundas
Endoderma
Intercalação Células
radial de células garrafa
profundas
Células
Futuro marginais
mesoderma superficiais
posterior Células- Lábio dorsal
garrafa do blastóporo
Morfologia de O lábio se
Futuro Blastóporo mudanças das extende lateral
IMZ mesoderma anterior células profundas e vegetalmente
profunda
Células garrafa
(E) Precursores do (F) Ectoderma Precursores do
mesoderma cefálico do mesoderma cefálico do
endoderma da faringe endoderma da faringe
Células garrafa Pólo animal

re-espalhadas
Blastocele
IMZ superficial
movendo-se em
direção do pólo animal
Endoderma
Intercalação
medianolateral
Figure 6.22
Modelo integrativo dos movimentos celulares durante a gastrulação precoce de Xenopus.
(A) Estrutura da zona marginal involutiva (IMZ) antes da gastrulação. A IMZ profunda
consiste do futuro mesoderma anterior e do futuro mesoderma posterior. (B) Constrição
das células garrafa arrasta o futuro mesoderma anterior para cima e gira a IMZ para fora. (C)
Os precursores do mesoderma anterior conduzem o movimento do mesoderma para dentro
da blastocele. (D) Ocorre intercalação radial (interdigitação) das células profundas da IMZ.
O mesoderma move-se na direção ao pólo animal, arrastando as células superficiais e as
células garrafa por involução. (E) À medida que continua a gastrulação, as células marginais
profundas se achatam, e as células previamente superficiais formam a parede do arquêntero.
(F) Intercalação como em (D), olhando da superfície dorsal para baixo em direção do lábio
dorsal do blastóporo. Na NIMZ (zona marginal não involutiva) e parte superior da IMZ,
células profundas (mesodérmicas) estão se intercalando radialmente, configurando uma fita
estreita de células achatadas. Esse estreitamento de várias camadas em poucas outras causa
extensão na direção lábio do blastóporo. Imediatamente acima do lábio, intercalação
medianolateral das células produz tensões que arrastam a IMZ por cima do lábio, a interca-
lação medianolateral continua, alongando e estreitando o mesoderma axial. (Segundo Hardin
e Keller, 1988; Wilson e Keller, 1991.)
baixo dos precursores mesodérmicos posteriores e começar a migrar no teto da blasto-

cele (Hardin e Keller, 1988).
Entretanto, após começar esses movimentos, as células garrafa do Xenopus não
são mais necessárias. Quando as células garrafa são removidas após sua formação, a
involução, a formação do blastóporo e o fechamento continuam. O fator principal no
movimento das células para dentro do embrião parece ser a involução das células
marginais subsuperficiais mais do que as superficiais. Parece que essas células
subsuperficiais ou células da zona marginal involutiva profunda se viram para dentro
e migram em direção ao pólo animal, ao longo das superfícies internas das células
profundas remanescentes (Figura 6.22C-E), e que a camada superficial forma o reves-
timento do arquêntero unicamente porque ela está ligada às células profundas, que
estão migrando ativamente. O movimento das células garrafa mais profundamente
dentro do embrião depende da sua ligação às células profundas subjacentes. A remo-
ção das células garrafa não afeta a involução das células profundas ou das células
superficiais da zona marginal para dentro do embrião, mas a remoção das células
marginais dorsais profundas e sua substituição por células do hemisfério animal (que
normalmente não sofrem involução) interrompe a formação do arquêntero.
A FORMAÇÃO DO MESODERMA DURANTE A GASTRULAÇÃO DE XENOPUS

A Figura 6.22 (D-F) esboça o comportamento dessas células da zona marginal
involutiva (IMZ) em sucessivos estágios da gastrulação em Xenopus (Keller e
Schoenwolf, 1977; Keller, 1980, 1981; Hardin e Keller, 1988). Pouco antes de sua
involução através do lábio do blastóporo, as várias camadas de células IMZ profun-
das se intercalam radialmente para formar uma fina e larga camada. Essa intercalação
estende ainda mais a IMZ vegetalmente. Ao mesmo tempo, as células superficiais se
espalham se dividindo e achatando. Quando as células profundas atingem o lábio
do blastóporo, elas involuem para dentro do embrião e iniciam um segundo tipo de
intercalação. Essa intercalação causa uma extensão convergente ao longo do eixo
mediolateral (Figura 6.22F) que integra várias correntes mesodérmicas para formar
um longa e estreita banda. A parte anterior dessa banda migra em direção ao hemis-
fério animal. Assim a corrente mesodérmica continua a migrar em direção ao pólo
animal e a camada superposta de células superficiais (incluindo as células garrafa)
são passivamente puxadas em direção ao hemisfério animal, formando o teto do
arquêntero (Figuras 6.15 e 6.22E). Portanto, ainda que as células garrafa possam ser
responsáveis pela indentação inicial, a força motivadora para essa involução parece
vir da camada profunda de células marginais. Mais ainda, a intercalação radial e
mediolateral da camada de células profundas parece ser responsável pelo movimen-
to contínuo do mesoderma para dentro do embrião.
Migração do mesoderma involutivo

Com o progresso dos movimentos mesodérmicos, a expansão convergente também
continua a estreitar e encompridar a zona marginal involutiva. A IMZ contém o
prospectivo teto endodérmico do arquêntero na sua camada superficial (IMZS) e as
prospectivas células mesodérmicas, incluindo aquelas da notocorda na sua região
profunda (IMZD). Durante o terço médio da gastrulação, a lâmina em expansão do
mesoderma converge em direção à linha mediana do embrião. Esse processo é dirigido
pela contínua intercalação mediolateral de células ao longo do eixo ântero-posterior,
estreitando ainda mais a banda. No fim da gastrulação, a notocorda localizada central-
mente se separa do mesoderma somítico em ambos os lados, e as células sofrem
elongação separadamente (Wilson e Keller, 1991). Essa extensão convergente do
mesoderma parece ser autônoma, porque os movimentos dessas células ocorrem mes-
mo se essa região do embrião é isolada do resto (Keller, 1986).
Durante a gastrulação, o pólo animal e as células da zona marginal não-involutiva
(NIMZ) expandem-se por epibolia cobrindo todo o embrião. A porção dorsal das célu-
las marginais não-involutivas expande-se mais rapidamente que a porção ventral,
assim, causando o movimento dos lábios do blastóporo em direção ao lado ventral.

Enquanto essas células mesodérmicas, entrando através do lábio dorsal do blastóporo,
dão origem ao mesoderma dorsal axial, o resto do mesoderma do corpo (o qual forma
o coração, os rins, sangue, ossos e partes de vários outros órgãos) entra através dos
lábios ventral e lateral para criar o manto mesodérmico. O endoderma é derivado das
células da IMZS que formam o revestimento do teto do arquêntero e das células
vegetativas sub-blastoporais que se tornam o assoalho do arquêntero (Keller, 1986).
& Especulações
Reguladores moleculares do desenvolvimento:

Fibronectinas e as vias da migração mesodérmica
C omo é que as células involutivas Figura 6.23
são informadas para aonde ir, uma Fibronectinas e gastrulação de anfíbio. (A) Imunofluorescência revela uma rede fibrilar de
vez que se encontram no interior fibronectina na superfície basal de prospectivas células ectodérmicas forrando o teto da blasto-
do embrião? Na salamandra, parece que cele do embrião da salamandra. (B-E) Micrografias ao microscópio eletrônico de varredura de
os precursores mesodérmicos involutivos gastrulação normal (B,C) e anormal (D,E) da salamandra. A blastocele em (D) e (E) foi injetada
migram em direção ao pólo animal em uma com o fragmento ligante à célula de fibronectina, enquanto a blástula gastrulando normalmente
foi injetada com a solução controle. (B) Seção durante gastrulação intermediária. (C) O obtura-
rede de fibronectina secretada pelas célu-
dor do vitelo ao fim da gastrulação. (D,E) Os estágios finais da gastrulação detida, onde os
las do teto da blastocele. Pouco antes da
precursores mesodérmicos, tendo fixado à fibronectina sintética, não conseguem reconhecer a
gastrulação, o ectoderma presuntivo do
via de migração normal forrada de fibronectina. O arquêntero não se forma, e os precursores não-
teto da blastocele secreta uma matriz ex- involuídos do mesoderma permanecem na superfície. (ar, arquêntero; bc, blastocele; bl, blastóporo;
tracelular que contém fibrilas de fibronec- ec, ectoderma; en, endoderma; mes, mesoderma; yp, obturador do vitelo.) (A de Boucaut et al.,
1985; B-E de Boucaut et al., 1984, cortesia de J. C. Boucaut e J.-P. Thiery.)
(A)
(B) (C)
(D) (E)
tina (Figura 6.23A; Boucaut et al., 1984; cele de gástrulas precoces de salamandra reconheça a fibronectina. Além disso, as
Nakatsuji et al., 1985). O mesoderma e os depositaram em recipientes de plásti- células das DMZ não migraram ao acaso,
involutivo parece migrar nessas fibras de co com suas matrizes extracelulares tocan- mas migraram em direção ao pólo animal
fibronectina. Isso foi confirmado pela sín- do o plástico (Figura 6.24A). O eixo do da matriz extracelular que havia sido ab-
tese química de uma “falsa” fibronectina blastóporo ao pólo animal foi marcado e, sorvida no plástico (Figura 6.24B).
que pode competir com a genuína da ma- após 2 horas, o explante foi removido, dei- Em Xenopus, a extensão convergente
triz extracelular. Células se ligam a uma xando sua matriz extracelular. Um explante empurra as células migratórias para cima,
certa região da proteína fibronectina que menor da zona marginal dorsal foi removi- em direção ao pólo animal. Entretanto, a
contém uma seqüência de três aminoáci- do de outra gástrula precoce e colocado fibronectina parece delinear os limites
dos (Arg-Gly-Asp; RGD). Boucaut e co- sobre a matriz com seu próprio eixo dentro dos quais esses movimentos po-
laboradores injetaram grandes quantida- blastóporo-pólo animal, perpendicular dem ocorrer. A fibronectina das gástrulas
des de um pequeno peptídio contendo àquele da matriz. Seria possível às células de Xenopus não forma grades complexas,
essa seqüência na blastocele de embri- desse explante migrarem na matriz, e se mas se organiza em pequenos aglomera-
ões de salamandra, pouco antes do início migrassem o fariam em uma direção parti- dos fibrilares. Se a fibronectina for sinte-
da gastrulação. Se a fibronectina fosse es- cular? Foi verificado que as células mi- tizada mas não organizada nessas fibrilas,
sencial para a migração celular, então as graram, e que a migração podia ser inibida as células mesodérmicas dorsais vão ade-
células ligadas a esse fragmento solúvel por anticorpos que impedem que a célula rir à superfície basal do ectoderma
de peptídio, em lugar da fibronectina real presuntivo, mas não migrarão (Winklbau-
ligante de células, deveriam parar. Impos- er e Nagel, 1991). As fibrilas de fibronecti-
sibilitadas de encontrar sua “estrada”, as na são necessárias para que as células
células mesodérmicas deveriam cessar sua mesodérmicas da cabeça se achatem e es-
involução. Isso é precisamente o que tendam largos processos (lameliformes)
ocorreu (Figura 6.23B-E). Não foram vis- (A) na direção da migração (Winklbauer et al.,
tas células migratórias ao longo do lado 1991; Winklbauer e Keller, 1996). A impor-
de baixo do ectoderma. Em vez disso, os Pólo animal tância dessas fibrilas de fibronectina é
precursores mesodérmicos permaneceram também vista em híbridos interespecíficos
fora do embrião, formando uma massa ce- que se detém na gastrulação. Delarue e
lular convoluta. Outros pequenos peptí- colegas (1985) mostraram que certos hí-
dios sintéticos (incluindo outros fragmen- bridos inviáveis, entre duas espécies de
tos da molécula de fibronectina) não im- sapos, morrem durante a gastrulação por-
pediram a migração. que não secretam essas fibrilas de fibro-
Considera-se que as células mesodér- nectina. Parece então, que a matriz extra-
micas aderem à fibronectina através da celular do teto da blastocele, e particular-
αvβ1 proteína integrina (Alfandari et al., mente seu componente fibronectina, é im-
1995). A migração mesodérmica pode ser portante na migração das células mesodér-
também interrompida pela microinjeção de micas durante a gastrulação em anfíbios.
anticorpos contra fibronectina ou contra
a subunidade β1 de integrina que funcio-
na como parte do receptor de fibronecti-
na (D’Arribère et al., 1988, 1990). Alfandari Figura 6.24
e colegas (1995) mostraram que logo após A direção da migração das células da zona mar-
a fecundação, a subunidade αv da integri- ginal dorsal (DMZ) depende da orientação da
na é progressivamente perdida das mem- matriz extracelular do teto da blastocele. (A)
branas das células do blastômero. Entre- (B) Explantes do teto da blastocele do blastóforo
tanto, pouco antes e durante a gastrula- (BP) para o pólo animal (AP) foram disseca-
ção, a subunidade αv é expressa na su- dos de embriões de salamandra em estágio pre-
perfície das células mesodérmicas migra- coce de gastrulação e colocados em placas plás-
ticas. A matriz extracelular aderiu à placa, e o
tórias. Parece então, que a síntese desse
tecido foi então removido. Um explante me-
receptor de fibronectina pode sinalizar o
nor de uma gástrula precoce, contendo células
tempo para o mesoderma começar e con-
da DMZ, foi então colocado sobre essa ma-
tinuar a migração. triz, com o seu próprio eixo perpendicular
A matriz extracelular contendo fibro- aquele da matriz. (B) Células da DMZ do
nectina, permite a ligação das células AP
explante migraram para o pólo animal da ma-
mesodérmicas à rede de fibronectina e, triz. A linha pontilhada indica a borda original
além disso, parece fornecer sinais para a do explante, e a flecha branca representa seu
direção da migração celular. Shi e cole- eixo blastóporo-pólo animal. (de Shi et al.,
gas (1989) removeram os tetos da blasto- 1989, fotografia cortesia dos autores.)
Epibolia do ectoderma
Enquanto a involução está ocorrendo no lábios do blastóporo, os precursores
ectodérmicos estão se expandindo sobre todo o embrião. Keller (1980) e Keller e
Schoenwolf (1977) usaram microscopia eletrônica de varredura para observar as mo-
dificações tanto nas células superficiais como nas células profundas das regiões
animal e marginal. O mecanismo principal de epibolia na gastrulação do Xenopus
parece ser um aumento no número de células (através de divisão), acoplado a uma
concomitante integração de várias camadas profundas em uma só (Figura 6.25). Du-
rante a gastrulação precoce, três rodadas de divisão celular aumentam o número de
camadas de células profundas no hemisfério animal. Ao mesmo tempo, completa
integração de numerosas células profundas em uma camada também ocorre. A camada
mais superficial se expande por divisão e achatamento celular. O espalhamento de
células nas zonas marginais dorsal e ventral, se dá provavelmente pelo mesmo meca-
nismo, ainda que mudanças na forma celular parecem ter um papel mais importante do
que no hemisfério animal. O resultado dessas expansões é a epibolia das células
superficiais e profundas do pólo animal e regiões marginais não involutivas sobre a
superfície do embrião (Keller e Danilchik, 1988). A maior parte das células da região
marginal, como mencionado anteriormente, involuem para se juntar à corrente de célu-
las mesodérmicas dentro do embrião.
Gastrulação no Xenopus é uma orquestração de vários eventos distintos. A primei-
ra indicação de gastrulação envolve a invaginação local das células garrafa do
endoderma na zona marginal, em tempo e lugar precisamente definidos. Em seguida, a
involução das células marginais através do lábio do blastóporo, começa a formação
do arquêntero. Essas células involutivas, na margem anterior do manto mesodérmico,
migram ao longo da superfície interna do teto do blastóporo, e o prospectivo cordo-
mesoderma atrás delas, se estreita e se alonga posteriormente, por extensão conver-
gente, na porção dorsal do embrião. Ao mesmo tempo, as células precursoras ectodér-
micas epibolizam vegetalmente por divisão celular e pela integração de camadas celu-
lares previamente independentes. O resultado desses movimentos celulares é o posi-
cionamento adequado das três camadas germinativas em preparação para sua diferen-
ciação em órgãos do corpo. Estudos moleculares (a serem discutidos no Capítulo 15)
estão começando a nos dar pistas relacionadas a mecanismos pelos quais as células
são informadas de como começar e finalizar essas migrações
Estágio
Figura 6.25
Micrografias eletrônicas de varredura do teto da blastocele de Xenopus, mostrando as mudanças
na forma e arranjo das células. Os estágios 8 e 9 são de blástula; estágios 10-11.5 representam
gástrulas progressivamente mais avançadas. (de Keller, 1980, cortesias de R. E. Keller.)
Gastrulação em aves
Generalidades sobre gastrulação em aves
A clivagem em embrião de aves cria um blastodisco acima de um enorme volume de

vitelo. Essa massa subjacente e inerte de vitelo impõe várias restrições aos movimen-
tos celulares, e a gastrulação em aves parece, à primeira vista, ser muito diferente
daquela do ouriço-do-mar ou da rã. Realmente, logo veremos que existem numerosas
similaridades entre a gastrulação em aves e as gastrulações que já estudamos. Além
disso, veremos que embriões de mamíferos - que não tem vitelo- retém movimentos de
gastrulação muito parecidos com aqueles dos embriões de aves e répteis.
FORMAÇÃO DO HIPOBLASTO E EPIBLASTO. As células centrais do blastodisco

das aves são separadas do vitelo por uma cavidade subgerminativa e parecem mais
claras - por isso, o centro do blastodisco é chamado de área pelúcida. Em contraste, as
células da margem da área pelúcida parecem opacas, devido a seu contato com o
vitelo, formam a área opaca (Figura 6.26). Enquanto a maioria das células permanece na
superfície formando o epiblasto, certas células migram individualmente para a cavida-
de subgerminativa, para formar as ilhas de polinvaginação (hipoblasto primário), um
arquipélago de aglomerados desconectados contendo cada um de 5 a 20 células (veja
Figuras 6.26 e 5.33). Pouco tempo depois, uma lâmina de células da margem posterior
do blastoderma (crescente de Koller e a zona marginal atrás dele) migra em direção
anterior para se juntar às ilhas de polinvaginação e formar o hipoblasto secundário
(Eyal-Giladi et al.,1992). O blastoderma de duas camadas (epiblasto e hipoblasto) tem
as camadas unidas na margem da área opaca, e o espaço entre as camadas é uma
blastocele. Assim, a estrutura do blastodisco das aves não é diferente da blástula de
anfíbios ou equinodermos.
Blastoderma
Anterior Epiblasto
Zona marginal
posterior
Área opaca
Espaço subgerminativo Vitelo
Células do hipoblasto
delaminando-se do epiblasto
Área pelúcida
Figura 6.26
Formação do blastoderma de duas camadas
do embrião da galinha. As primeiras células
hipoblásticas delaminam individualmente,
para formar ilhas de células sob o epiblasto.
Área opaca Área opaca
Células da margem posterior (células de foice
de Koller e células marginais posteriores) pro-
duzem uma população de células que migra
Epiblasto
Blastocele abaixo do blastodisco e incorpora as ilhas
poli-invaginadas. Essa camada inferior torna-
se o hipoblasto. A camada superior é o
epiblasto. À medida que o hipoblasto se move
no sentido anterior, células do epiblasto se
Células do hipoblasto migrando de agregam na região anterior à foice de Koller
células profundas da região posterior para formar a linha primitiva.
O mapa de destino para o embrião de aves é restrito ao epiblasto. Ou seja, o

hipoblasto não contribui com células para o embrião em desenvolvimento (Rosenquist,
1966, 1972). Em lugar disso, as células do hipoblasto formam porções da membrana
externa, especialmente o saco vitelínico e o pedúnculo, que liga a massa do vitelo ao
tubo digestivo endodérmico. Todas as três camadas germinativas do embrião propri-
amente dito (mais uma quantidade considerável de membrana extra-embrionária) são
formadas das células epiblásticas. Mapas de destino de epiblasto de galinha estão
representados na Figura 6.27. Esses mapas integram vários tipos de mapeamento.
Corantes vitais e transplantes de células radioativas foram úteis no mapeamento de
tendências prioritárias, pois com esses métodos se marcam grupos de células que se
difundem ao prosseguir o desenvolvimento. Transplantar células marcadas genetica-
mente, tais como células de codorna colocadas em embriões de galinha, contornou o
problema de difusão, mas ainda assim marcava aglomerados relativamente grandes de
células. Recentemente, o uso de vírus ou corantes fluorescentes permitiu aos pesqui-
sadores acompanhar células individuais através do desenvolvimento (Schoenwolf,
1991). Como pode ser visto nessas figuras, existe uma significante extensão conver-
gente enquanto a linha primitiva progride anteriormente. Mesmo que células em uma
região específica da gástrula tendam a se transformarem em tipos específicos de célu-
las, elas ainda podem produzir diferentes tipos celulares se transplantadas a uma outra
região do embrião.
FORMAÇÃO DA LINHA PRIMITIVA. A estrutura majoritária característica da gas-

trulação em aves, répteis e mamíferos é a linha primitiva. Essa linha é visível inicial-
mente como um espessamento de uma camada de células do epiblasto, na região
posterior do embrião, imediatamente anterior ao crescente de Koller (Figura 6.27A).
Esse espessamento é causado pelo ingresso de células mesodérmicas do epiblasto
para dentro da blastocele, e pela migração de células da região lateral do epiblasto
posterior em direção ao centro (Figura 6.27B; Vakaet, 1984; Bellairs, 1986; Eyal-Giladi
et al., 1992). À medida que a área espessada se estreita, ela se move anteriormente e
se contrai para formar a linha primitiva definitiva. Essa linha se estende em 60-75%
do comprimento da área pelúcida e marca o eixo ântero-posterior do embrião (Figura
6.27C-E). Enquanto as células convergem para formar a linha primitiva, se forma uma
depressão na linha. Essa depressão é chamada fenda primitiva, e serve como um
blastóporo, através do qual as células migratórias passam para a blastocele. Assim,
a fenda primitiva é análoga ao blastóporo de anfíbios. Na ponta anterior da linha
primitiva há um espessamento regional de células chamado nódulo primitivo ou
nódulo de Hensen. O centro desse nódulo contém uma depressão em forma de funil
(algumas vezes chamada cova primitiva), através da qual as células passam para a
blastocele. O nódulo de Hensen é o equivalente funcional do lábio dorsal do
blastóporo de anfíbios. [gast1.html]
Tão logo se forma a linha primitiva, as células do epiblasto começam a migrar sobre
os lábios dessa e para dentro da blastocele (Figura 6.28). De maneira similar ao
blastóporo de anfíbios, a linha primitiva tem uma população celular se modificando
constantemente. Células migrando através do nódulo de Hensen passam para dentro
da blastocele, migram anteriormente formando o intestino anterior, o mesoderma da
cabeça e a notocorda; células passando através das porções laterais da linha primitiva
dão origem à maioria dos tecidos endodérmicos e mesodérmicos (Schoenwolf et al.,
1992). Em contraste com o mesoderma de Xenopus, o qual migra como lâminas de
células para a blastocele, células entrando no embrião de aves o fazem individualmen-
te. Em lugar de formar uma lâmina de células fortemente organizadas, a população
ingressante cria um mesênquima fracamente conectado. Além disso, não se forma um
verdadeiro arquêntero na gástrula de aves.
Enquanto as células entram na linha primitiva, essa se estende na direção da futura
região da cabeça. Ao mesmo tempo, as células do hipoblasto secundário estão conti-
nuando a migrar da margem posterior do blastoderma, na direção anterior. A elongação
(A) Anterior (B) (I) Endoderma
Área opaca Ectoderma

Mesoderma
Axial
Paraxial (vértebras, rins, musculatura)
Área pelúcida
Placa lateral (incluindo o coração)
Área de Extra-embrionária
Posterior engrossamento
(C) do blastoderma (D)
(J)
Área opaca
Área
pelúcida
Figura 6.27
Linha primitiva
Movimentos celulares da linha primitiva do
tomando forma
embrião de galinha. (A-E) Visão dorsal da for-
(E) Anterior (F) (K) mação e alongamento da linha primitiva. O blas-
toderma é visto em (A) 3-4 horas, (B) 5-6
Nódulo Processo
horas, (C) 7-8 horas, (D) 10-12 horas e (E) 15-
de Hensen cefálico
16 horas. O movimento precoce das células
Área epiblásticas HNK-1+ é mostrado por flechas.
pelúcida (F-H) A formação da notocorda e somitos
mesodérmicos à medida que a linha primitiva
Área regride é mostrada em (F) 19-22 horas, (G)
opaca Nódulo 23-24 horas e (H) no estágio de quatro somitos.
de Hensen (I-K) Mapas do destino do epiblasto em dois
estágios da gastrulação. Extensão convergente
Sulco primitivo é mostrada na linha mediana, e as células pre-
Ectoderma da cursoras endodérmicas ingressam mais rapi-
(G) Borda anterior
do mesoderma dobra cefálica (H) damente que as células precursoras mesodér-
Dobra cefálica
micas. (Adaptado de várias fontes, especial-
Intestino mente Spratt, 1946, e Balinsky, 1975; I-K se-
Dobra neural anterior gundo Vakaet, 1985.)
Somito
Notocorda
Nódulo Placa
de Hensen segmental
Linha primitiva
da linha primitiva parece ser coincidente com a migração em direção anterior dessas
células do hipoblasto secundário.
MIGRAÇÃO ATRAVÉS DA LINHA PRIMITIVA: FORMAÇÃO DO ENDODERMA E

MESODERMA. As primeiras células a migrarem através da linha primitiva são
aquelas destinadas a se transformarem no intestino anterior. Essa situação, novamen-
te, é similar àquela vista nos anfíbios. Uma vez dentro da blastocele, essas células
migram anteriormente e finalmente deslocam as células do hipoblasto na porção ante-
rior do embrião. As células hipoblásticas estão confinadas a uma região na porção
anterior da área pelúcida. Essa região, o crescente germinativo, não forma estruturas
Figura 6.28 (A)

Migração de células endodérmicas e mesodér-
micas através da linha primitiva. (A) Micro-
grafia eletrônica de varredura mostra células
epiblásticas passando para a blastocele, es-
tendendo seus terminais apicais para transfor-
marem em células garrafa. (B) Estereograma
de um embrião gastrulante de galinha, mos-
trando a relação da linha primitiva, das células
migratórias e das duas camadas originais do
blastoderma. A camada inferior se transforma
em um mosaico de células hipoblásticas e
endodérmicas; porém, as células hipoblásticas
finalmente se separam para formar uma cama-
da abaixo daquela do endoderma e contribuem
para o saco vitelínico. (A de Solursh e Revel,
1978, cortesia de M. Solursh; B segundo
Balinsky, 1975.)
Nódulo de Hensen
(B) Linha primitiva
Epiblasto
Blastocele
Hipoblasto
Endoderma
Células migratórias
(mesênquima)
embrionárias, mas contém os precursores das células germinativas, que mais tarde
migram através dos vasos sangüíneos até as gônadas. As próximas células que en-
tram na blastocele através do nódulo de Hensen (e o primeiro quarto anterior da linha
primitiva) também se movem anteriormente, mas não se movem tão ventralmente como
as células presuntivas endodérmicas do intestino anterior. Essas células permanecem
entre o endoderma e o epiblasto para formar as células do mesoderma da cabeça e do
cordomesoderma (notocorda) (veja Psychoyos e Stern, 1996). Essas células de ingres-
so precoce se moveram todas anteriormente, empurrando para cima a região mediano-
anterior do hipoblasto, a fim de formar o processo cefálico (Figura 6.29). Enquanto
isso, as células continuam a migrar para dentro, através da porção lateral da linha
primitiva. Quando entram na blastocele, essas células se separam em duas correntes.
Uma corrente se move mais profundamente e encontra o hipoblasto em sua região
mediana, deslocando as células hipoblásticas para os lados. Essas células de movi-
mento profundo dão origem a todos os órgãos endodérmicos do embrião, assim como
a maioria das membranas extra-embrionárias (o hipoblasto forma o restante). A segun-
da corrente migratória se espalha através da blastocele como uma camada frouxa, mais
ou menos a meio caminho entre o hipoblasto e o epiblasto. Essa camada origina as
porções mesodérmicas do embrião e das membranas extra-embrionárias. Após 22 ho-
ras de incubação, a maior parte das células presuntivas endodérmicas estão no interi-
or do embrião, apesar das células presuntivas mesodérmicas continuarem a migrar
para o interior por um tempo mais longo.
Endoderma Ilhas
faríngeo de sangue Dobra
cefálica
Processo cefálico Intestino anterior
(notocorda anterior)
Sulco neural
Nódulo de Somito
Hensen
Linha primitiva
Área
pelúcida
Linha primitiva
Área opaca
(A) (B) (C)
Alongamento da notocorda
Linha de
referência
Regr
es
da li s ã o
p r i m nha
itiva
Borda posterior da área pelúcida
Horas
(D) (E) Figura 6.29
Gastrulação do embrião de galinha de aproxi-
madamente 24 até perto de 28 horas. (A) A
Agora começa uma nova fase da gastrulação. Enquanto continua o ingresso do linha primitiva totalmente estendida (24 ho-
mesoderma, a linha primitiva começa a regredir, movendo o nódulo de Hensen de uma ras). O processo cefálico (notocorda anterior)
posição próxima do centro da área pelúcida, para uma posição mais posterior (veja pode ser visto estendendo-se a partir do nó-
Figura 6.29). Ela deixa em seu lugar o eixo dorsal do embrião e o processo cefálico. Ao dulo de Hensen. (B) Estágio de dois somitos
mesmo tempo que o nódulo avança posteriormente, a porção remanescente (posteri- (25 horas). Anteriormente vê-se o endoderma
or) da notocorda é estabelecida. Finalmente, o nódulo regride para sua posição mais faríngeo, enquanto a notocorda anterior em-
posterior, formando a região anal. Nesse ponto, o epiblasto é composto inteiramente purra para cima o processo cefálico que estava
de células ectodérmicas presuntivas. embaixo. A linha primitiva está regredindo. (C)
Estágio de quatro somitos (27 horas). (D) Após
Como uma conseqüência desse processo de gastrulação em duas etapas, os em-
28 horas, a linha primitiva regrediu até a por-
briões de aves (e mamíferos) exibem um distinto gradiente de maturidade de desenvol- ção caudal do embrião. (E) Regressão da linha
vimento ântero-posterior. Enquanto células das porções posteriores do embrião estão primitiva, deixando a notocorda em seu rastro.
gastrulando, células da porção anterior já estão começando a formar órgãos. Pelos Vários pontos da linha foram acompanhados
próximos dias, a ponta anterior estará mais avançada no seu desenvolvimento (pode- após atingir seu comprimento máximo. O tem-
se dizer que teve uma “vantagem” inicial) do que a porção posterior. po representa as horas decorridas após atingir
Enquanto as células presuntivas do mesoderma e do endoderma se moviam para o comprimento máximo em aproximadamente
dentro, os precursores ectodérmicos proliferavam para se tornar a única população de 18 horas. (Fotografias cortesia de K. Linask; E
células remanescente na camada superior. Ainda mais, células ectodérmicas migraram segundo Spratt, 1947.)
para fora do blastodisco para envolver o vitelo por epibolia. O enclausuramento do
vitelo (novamente reminiscente da epibolia do ectoderma de anfíbios) é uma tarefa de
Hércules, que dura 4 dias para ser completada e envolve a produção contínua de novo
material celular e a migração das células ectodérmicas presuntivas ao longo da super-

fície inferior do envoltório vitelínico. Assim, chegando ao fim da gastrulação em aves,
o ectoderma envolveu o vitelo, o endoderma substituiu o hipoblasto e o mesoderma
se posicionou entre essas duas regiões.
Mecanismos de gastrulação em aves
O PAPEL DO HIPOBLASTO E A FORMAÇÃO DOS EIXOS EMBRIONÁRIOS. O

eixo dorso-ventral (costa-frente) é crítico para a formação do hipoblasto e para o
contínuo desenvolvimento do embrião. Esse eixo é estabelecido quando as células em
clivagem do blastoderma, produzem uma barreira entre a albumina básica (pH 9.5)
acima do blastodisco e o espaço subgerminativo ácido (pH 6.5), abaixo do disco.
Água e íons de sódio são transportados da albumina através das células para dentro
do espaço subgerminativo criando uma diferença de potencial de membrana de 25 mV
através da camada de células (positivo no lado ventral das células). Isso cria dois
lados para as células: um lado frente à albumina negativa e básica, e outro lado frente
ao fluido do espaço subgerminativo positivo e ácido. O lado frente à albumina se torna
o dorsal, e aquele frente ao espaço subgerminativo se torna o ventral. Isso pode ser
revertido ou invertendo o gradiente de pH ou invertendo a diferença de potencial
através da camada de células (revisão em Stern e Canning, 1988).
A conversão de um blastoderma radialmente simétrico em uma estrutura simétrica
bilateral é determinada pela gravidade. Enquanto o óvulo rola oviduto abaixo, ele gira
a uma velocidade de 10 a 15 revoluções por hora. O citoplasma que deverá se tornar a
camada celular está sempre girando para baixo, mas é deslocado para cima pelo vitelo
mais denso. Portanto, não está em cima do vitelo, mas um pouco deslocado para o
lado. A porção mais alta do blastodisco se transforma na ponta caudal (rabo) do
blastoderma, a parte onde começa a gastrulação (Kochav e Eyal-Giladi, 1971). Assim,
os eixos ântero-posterior e dorsolateral são determinados antes da gastrulação, en-
quanto o óvulo está lentamente rolando oviduto abaixo.
O blastoderma do embrião de galinha age como um sistema único integrado para
formar um único embrião; se o blastoderma é separado em partes, cada uma tendo
sua zona marginal, cada parte vai formar seu próprio embrião (Spratt e Haas, 1960).
O controle desse campo parece residir na zona marginal posterior, a região onde
começa a formação do hipoblasto. Essas células marginais posteriores não só con-
tribuem com as células indutoras do hipoblasto, como também impedem que outras
regiões marginais induzam seus hipoblastos. Khaner e Eyal-Giladi (1989) verificaram
que na transposição da zona marginal posterior para uma área marginal lateral (Figu-
ra 6.30A), o rasgo posterior cicatriza e duas linhas primitivas aparecem. Similarmen-
te, se uma região posterior é reciprocamente transposta com uma região lateral (Fi-
gura 6.30B), somente se forma uma linha primitiva e ela provém da região posterior
original. Entretanto, se uma zona marginal posterior é colocada em um embrião que
retém sua margem posterior original (Figura 6.30C), somente a margem posterior
original do hospedeiro forma o hipoblasto que está subjacente à linha primitiva.
Khaner e Eyal-Giladi sugerem que as células da zona marginal formam um gradiente
de atividade cujo pico está na ponta posterior. As células posteriores formarão o
hipoblasto e, ao mesmo tempo, evitarão que qualquer célula, com menos atividade,
forme hipoblastos próprios.*
*Pesquisadores anteriores (Waddington, 1932; Azar e Eyal-Giladi, 1981) consideravam que o

hipoblasto induzia à formação da linha primitiva e a contemplava com uma polaridade ântero-
posterior. Entretanto, Khaner (1995) girou o epiblasto com relação ao hipoblasto, em diferentes
estágios do desenvolvimento da galinha, e mostrou que o epiblasto inicia a formação da linha
primitiva e mantém sua polaridade independentemente da orientação do hipoblasto.
EXPERIMENTO RESULTADOS INTERPRETAÇÃO
(A)
Anterior
Zona marginal
Área
opaca
Epiblasto
Cicatriz
Posterior Linhas primitivas
(B)
(C)
Figura 6.30
Experimentos de Khaner e Eyal-Giladi de-
monstrando que a porção posterior da zona
ACUMULAÇÃO CELULAR NA LINHA PRIMITIVA. Evidências dos estudos de marginal (PMZ) contribui para as células
Stern e Canning (1990) sugerem que o epiblasto não é um tecido homogêneo, não- indutoras da linha primitiva do hipoblasto e
diferenciado, como foi assumido por muito tempo. Pelo contrário, parece haver dife- impedem outras regiões marginais de criarem
renciação nas células epiblásticas mesmo antes que a formação da linha primitiva se seus próprios hipoblastos. (Segundo Khaner
inicie. Esses estudos mostram que certas células, dispersas ao acaso no epiblasto, e Eyal-Giladi, 1989.)
podem ser distinguidas por uma molécula específica na superfície celular (HNK-1,
uma forma sulfatada do ácido glucurônico). As células expressando HNK-1 ingres-
sam individualmente na blastocele e migram para a região posterior. É provável que
o tecido marginal posterior secrete uma substância que atrai as células que expres-
sam HNK-1, enquanto o tecido marginal anterior secreta uma molécula repelente
(Jephcott e Stern, citado em Stern, 1991). As células expressando HNK-1, que se
juntam na margem posterior, produzirão o endoderma e o mesoderma, e nenhuma
célula expressando HNK-1 formará derivados ectodérmicos. Se as células HNK-1
são seletivamente destruídas (por anticorpos), enquanto ainda estão no epiblasto,
o embrião não formará mesoderma nem endoderma. Essas células HNK-1 positivas
interagem com as células do epiblasto acima delas, para formar o rudimento inicial da
linha primitiva. Esse rudimento de linha sofre um processo de extensão convergente
que o estreita e alonga. Quando a linha chega ao seu comprimento quase total, as
células HNK-1 positivas dissolvem a lâmina basal do epiblasto central para formar
uma canal através da linha primitiva. Isso permite que células do epiblasto (que
nunca expressaram HNK-1) sejam recrutadas para a linha que está se estendendo
anteriomente e, assim, contribuir (junto com as células HNK-1 positivas) para os
mesoderma e endoderma embrionários.
Movimento dentro da blastocele amniota é feito por células individuais, e não por
uma camada epitelial. Mas, como na gastrulação de anfíbios, células de aves passan-
do pelo blastóporo sofrem uma constrição no seu terminal apical e se tornam células
garrafa (Figura 6.28). Na ponta anterior do canal, nódulo de Hensen, a destruição da
lâmina basal e a liberação dessas células do epiblasto pode ser realizada por uma
proteína de 190-kDa chamada fator de espalhamento (Stern et al., 1990). O fator de
espalhamento é secretado somente no nódulo de Hensen, e tem sido implicado na
dissociação de células nessa região e na indução do tecido neural a partir do epiblas-
to, na vizinhança do nódulo (Streit et al., 1995). Quando se implantam resinas conten-
do o fator de espalhamento abaixo do epiblasto de embriões de galinha, em gastrula-
ção precoce, novas regiões da linha primitiva podem ser induzidas. O fator de
espalhamento se liga a receptores tirosina quinase em células adjacentes, e agindo
através da cascata da proteína G, fosforila as β-cateninas que ancoram as E-caderinas
à membrana celular (Hartmann et al., 1994). Na ausência de E-caderina funcional, a
lâmina epitelial se desmonta naquela região e as células se tornam mesênquima. As
células, uma vez liberadas da linha primitiva, entram na blastocele, são achatadas e
passam a fazer parte de uma corrente de células migratórias independentes.
Polissacarídeos extracelulares podem também ter um papel importante nessa migra-
ção. Um desses complexos polissacarídeos é o ácido hialurônico, um polímero linear
de ácido glucurônico e N-acetilglicosamina (veja Figura 3.35). Esse composto é produ-
zido pelas células ectodérmicas e se acumula na blastocele, onde reveste a superfície
das células que estão chegando. Fisher e Solursh (1977) mostraram que quando esse
material é digerido (injetando a enzima hialuronidase na blastocele), as células mesen-
quimatosas se aglomeram e não conseguem migrar adequadamente. Muito estudos
têm mostrado que o ácido hialurônico é importante para manter as células mesenqui-
matosas migratórias separadas umas das outras. Além disso, o ácido hialurônico co-
meça a se acumular precisamente no momento em que as primeiras células entram na
blastocele. O ácido hialurônico é capaz de manter as células separadas, provavelmen-
te devido a sua capacidade de se expandir em água. Em ambiente aquoso, esse polímero
pode expandir em até 1000 vezes o seu volume original. Portanto, o ácido hialurônico
pode ser um fator importante para manter as células mesenquimatosas dispersas du-
rante sua migração, assegurando que a migração continue.
Ácido hialurônico e outros polissacarídeos facilitam a migração de células indivi-
duais (veja Capítulo 3), mas não parecem dirigir o movimento dessas células (Fisher e
Solursh, 1979). Na verdade, o movimento dessas células está ligado, mais uma vez, à
presença de uma rede de fibronectina na lâmina basal extracelular das células do
epiblasto. Essa camada rica em fibronectina aparece na superfície inferior das células
da camada de cima, pouco antes da formação da linha primitiva e desaparece na região
da linha. Dentro da linha, as células se separam e migram lateralmente ao longo da
membrana basal do epiblasto, rica em fibronectina (Duband e Thiery, 1982). Não existe
evidência clara de que essa fibronectina é essencial para o direcionamento do movi-
mento celular que afasta as células lateralmente da linha primitiva.
FORMAÇÃO SECUNDÁRIA DA NOTOCORDA. Enquanto a porção anterior da

notocorda é formada pelo ingresso de células através do nódulo de Hensen e a subse-
qüente migração anterior, a notocorda posterior é formada de maneira diferente. Após
o somito 17 (da galinha), a notocorda se forma pela condensação de tecido mesodérmico
que ingressou através da linha primitiva (isto é, não através do nódulo de Hensen).
Isso se estende posteriormente para o “broto da cauda” do embrião (incluindo os
somitos 28-50) (Le Douarin et al., 1996).
EPIBOLIA DO ECTODERMA. Durante a gastrulação, as células precursoras do ecto-

derma se expandem externamente para envolver o vitelo. Essas células estão ligadas
entre si por ligações firmes e migram como uma unidade, mas não individualmente.
Nas aves, a superfície superior da área opaca adere fortemente à superfície inferior do
envoltório vitelínico e se espalha ao longo dessa superfície interna. O mesmo compor-
tamento é visto em cultura de células. New (1959) demonstrou que o blastoderma
isolado se estende normalmente sobre o envoltório vitelínico isolado, e Spratt (1963)
demostrou que esse espalhamento não ocorre com outros substratos. Essas observa-
ções sugerem que o envoltório vitelínico é essencial para a extensão da lâmina celular.
É interessante observar que somente as células marginais (isto é, as células da área
opaca) se ligam firmemente à superfície vitelínica. A maioria das células blastodérmicas
aderem frouxamente, quando o fazem. As células marginais são inerentemente diferen-
tes das outras células blastodérmicas, pois podem estender longos processos cito-
plasmáticos (500µm) em direção ao envoltório vitelínico. Esses filopódios alongados
são considerados o aparelho locomotor das células marginais.
Existem várias linhas de evidência indicando que as células marginais da área
opaca são os agentes da epibolia ectodérmica. Em primeiro lugar, o blastoderma se
espalha somente quando as margens estão se expandindo. Se as células marginais são
removidas, a epibolia do ectoderma cessa. Segundo, quando as células marginais são
isoladas do resto do blastoderma, elas continuam a migrar sozinhas. Assim, parece
que as células precursoras do ectoderma são levadas junto com as células ativamente
migratórias da área opaca (Schlesinger, 1958). Existe também uma relação específica
entre as membranas celulares das células marginais e a superfície inferior da membrana
vitelínica. New (1959) mostrou que quando o blastoderma é colocado sobre o envoltório
vitelínico de forma invertida (camada profunda em contato com o envoltório vitelínico),
as bordas do blastoderma se curvam para dentro de modo que as células marginais da
camada superior estão, mais uma vez, em contato com a superfície vitelínica (Figura
6.31). Lash e seus colaboradores (1990) expandiram esses resultados mostrando que a
fibronectina está presente na superfície interna do envoltório vitelínico. Então, como
no experimento discutido anteriormente, no qual Boucaut e colaboradores injetaram o
composto sintético contendo a seqüência do sítio de ligação à fibronectina (RGD), na
blastocele de salamandra, Lash e colegas aplicaram a seqüência RGD ao envoltório
vitelínico enquanto as células migravam sobre ele. Esse tratamento quebrou especifi-
camente o contato entre as células marginais e o envoltório vitelínico, causou retração
dos filopódios das células marginais e parou a migração do blastoderma.
Identificamos muitos dos processos envolvidos na gastrulação de aves, mas ig-
noramos como esses processos são realizados; não sabemos ainda como se forma a
cavidade subgerminativa, como certas células são destinadas a se tornarem células do
hipoblasto, como certas células expressam HNK-1, enquanto suas vizinhas não o
fazem, como células expressando HNK-1 migram para a margem posterior e como lá
interagem com as células do epiblasto, como a linha primitiva se estende e se retrai, ou
como as células são designadas aos seus respectivos destinos. Recentemente, Gary
Figura 6.31
Propriedades migratórias dos precursores
ectodérmicos de galinha. (A) Quando um blas-
toderma de galinha é colocado no envoltório
vitelínico, com os precursores em contato com
Endoderma a superfície vitelínica, as células marginais mi-
Presuntivo Ectoderma gram e cobrem o envoltório vitelínico com ec-
(camada Presuntivo toderma. (B) Quando as camadas profundas
profundas) Envoltório Vitelínico são colocadas em contato com o envoltório
vitelínico, a camada blastodérmica se enrola
(A) para permitir que as células da camada super-
ficial possam aderir e migrar sobre a camada
(B) vitelínica. O resultado é uma vesícula fechada.
(Segundo New, 1959.)
Schoenwolf (1991) comentou: “ A despeito de tudo que foi escrito, é certo dizer que o
que sabemos sobre gastrulação e neurulação em aves é consideravelmente menos do
que ainda resta conhecer”.
Gastrulação em mamíferos
Aves e mamíferos são descendentes de espécies de répteis. Portanto, não é sur-
preendente que o desenvolvimento de mamíferos se dá paralelamente ao dos rép-
teis e aves. O que é surpreendente é que os movimentos de gastrulação de embri-
ões de répteis e aves, que evoluíram como uma adaptação a ovos com vitelo, são
mantidos mesmo na ausência de grandes quantidades de vitelo no embrião mamí-
fero. A massa celular interna nos mamíferos pode ser visualizada como assentada
sobre uma bola imaginária de vitelo, seguindo instruções que parecem mais apro-
priadas a seus ancestrais.
Modificações para desenvolvimento dentro de outro organismo

Em lugar de desenvolver-se isoladamente dentro do ovo, a maioria dos mamíferos
evoluiu para uma admirável estratégia de desenvolvimento dentro da própria mãe.
O embrião mamífero obtém seus nutrientes diretamente da mãe e não depende de
vitelo armazenado. Essa evolução ensejou uma dramática reestruturação da ana-
tomia materna (tal como a expansão do oviduto para formar o útero) como tam-
bém o desenvolvimento de um órgão fetal capaz de absorver os nutrientes ma-
ternos. Esse órgão fetal -a placenta- é derivado primariamente de células
trofoblásticas embrionárias, suplementado por células mesodérmicas derivadas
da massa celular interna.
TECIDOS
EMBRIONÁRIOS
Ectoderma
embrionário
Epiblasto Mesoderma
embrionário embrionário
Epiblasto Linha primitiva
Massa celular Ectoderma Endoderma

interna amniótico amniótico
Endoderma Envoltório Mesoderma

Hipoblasto
extra-embrionário vitelínico extra-embrionário
Blastocisto
TECIDOS
EXTRA-EMBRIONÁRIOS
Trofoblasto Citrofoblasto Sinciciotrofoblasto
Figura 6.32
Diagrama esquemático mostrando a derivação de tecidos de embriões humanos e do macaco
rhesus. (Segundo Luckett, 1978, e Bianchi et al., 1993.)
(A) Blastocisto, 7 dias (B) 8 dias

Revestimento uterino
Capilar maternal
Epitélio uterino
(endométrio) Sinciciotrofoblasto
proliferando no
tecido uterino
Massa celular interna
Blastocele
Trofoblasto
Epiblasto
Cavidade amniótica Blastocele

Trofoblasto
(C) 9 dias Lacunas (D) 10-11 dias
trofoblásticas
Cavidade
amniótica
Lacunas
trofoblásticas
(suprimento de
sangue materno)
Epiblasto Sinciciotrofoblasto Retículo

Formação de
Hipoblasto mesoderma extra- extra-embrionário
Blastocele
Cavidade embrionário
Trofoblasto
Amniótica
Figura 6.33
Formação de tecido no embrião humano entre 7 e 12 dias. (A,B) Blastocisto humano imediata-
mente antes da gastrulação. A massa celular interna delaminam células hipoblásticas que forram
o trofoblasto, formando, com isso, o envoltório vitelínico primitivo e um blastodisco de duas
camadas (epiblasto e hipoblasto), semelhante aquele visto em embriões de aves. O trofoblasto
em alguns mamíferos pode ser dividido em trofoblasto polar, que cobre a massa de células
internas, e o trofoblasto mural, que não o faz. O trofoblasto se divide no citotrofoblasto que
forma as vilosidades, e o sinciciotrofoblasto que irá ingressar no tecido uterino. (C) Ao mesmo
tempo o epiblasto se divide em ectoderma amniótico (que rodeia a cavidade amniótica) e epiblasto
embrionário. O mamífero adulto se forma das células do epiblasto embrionário. (D) O endoderma
extra-embrionário forma o saco vitelínico. (Segundo Gilbert, 1989, e Larsen, 1993.)
As origens dos tecidos mamíferos precoces estão sumariadas na Figura 6.32. A

primeira segregação de células dentro da massa celular interna envolve a formação do
hipoblasto (algumas vezes chamado endoderma primitivo) (Figura 6.33). Essas células
se separam da massa celular interna para revestir a cavidade da blastocele onde elas
originam a endoderme do saco vitelínico. Como em embriões de aves, essas células não
produzem partes do organismo neonato. O tecido da massa celular interna remanescen-
te, acima do hipoblasto, é agora chamado de epiblasto. As células do epiblasto são sepa-
radas por pequenas fendas que coalescem para separar o epiblasto embrionário das outras
células do epiblasto, as quais formam o revestimento do âmnio (Figuras 6.33C e 6.34). Uma
Figura 6.34 (A)

Estrutura do âmnio e movimentos celulares
durante a gastrulação humana. (A) Embrião Sinciciotrofoblasto
humano e conexões uterinas após 15 dias de
gestação. Na representação superior, o embrião Mesoderma
Extra-embrionário Disco germinativo
foi cortado sagitalmente através da linha medi- bilaminar
ana; a representação inferior olha de cima para
baixo sobre a superfície dorsal do embrião. (B)
Os movimentos das células epiblásticas para Cavidade amniótica
dentro da linha primitiva e o nódulo de Hensen, Epiblasto
e por baixo do epiblasto estão sobrepostas na Sulco primitivo
visão da superfície dorsal. Aos dias 14 e 15, o
epiblasto ingressante é considerado substituir Hipoblasto
as células hipoblásticas (que contribuem ao Saco vitelínico
forro do saco vitelínico), enquanto no dia 16,
as células ingressantes se espalham como um
leque para formar a camada mesodérmica. (Se-
gundo Larsen, 1993.).
(B)
14-15 dias
Cavidade Sulco
amniótica Primitivo
Nódulo de
Sulco Hensen
Epiblasto
primitivo
Hipoblasto Endoderma
16 dias
Saco
vitelínico
Mesoderma Endoderma
Mesoderma
extra-embrionário
vez completado o revestimento do âmnio, ele se enche com uma secreção chamada
fluido amniótico, que serve como absorvente de choques para o embrião em desen-
volvimento, enquanto impede a sua dessecação.
O epiblasto embrionário parece conter todas as células que vão dar origem ao
próprio embrião e é, de muitas maneiras, semelhante ao epiblasto de ave. Kirstie Lawson
e seus colegas (1991) marcaram células individuais do epiblasto com peroxidase de
rabanete (horseradish) o que lhes permitiu construir um detalhado mapa de destino do
epiblasto de camundongo (Figura 6.35). Como as células do epiblasto de galinha, o
mesoderma e o endoderma de mamífero migram através da linha primitiva. Enquanto
penetram a linha, as células do epiblasto deixam de expressar E-caderina, que mantém
as células unidas, e elas migram como células individuais (Burdsal et al., 1993). As
células migrando através do nódulo de Hensen dão origem à notocorda. Na formação
da notocorda do camundongo, as células devem se integrar no endoderma do intesti-
no primitivo, portanto, de maneira diferente da formação da notocorda da galinha
(Jurand, 1974; Sulik et al., 1994). Essas células podem ser vistas como uma banda de
células pequenas e ciliadas se estendendo para cima do nódulo de Hensen (Figura
6.36). Elas formam a notocorda convergindo mediamente e se dobrando em uma dire-
ção dorsal com afastamento do teto do intestino.
Figura 6.35 (A) Cone ectoplacentário

Mapa do destino do embrião do camundongo. (A) O estágio do ovo cilíndrico, 6 dias após a do trofoblasto
fertilização. Notar que ao contrário dos epiblastos da galinha e humano, o epiblasto do camun- Cavidade amniótica
dongo é firmemente curvado. Os endodermas parietal e visceral são derivados do hipoblasto,
não do trofectoderma. (B) Mapa do destino de um epiblasto de 7 dias na gastrulação precoce. (O
mapa do destino do camundongo foi achatado e deve ser visto como enrolado para cima com a Epiblasto
linha primitiva nas bordas.) (Segundo Lawson et al., 1991.)
Útero
Endoderma
visceral
Os precursores ectodérmicos estão localizados anteriormente à linha primitiva Endoderma parietal
completamente estendida, posição similar que ocupam no epiblasto de galinha; mas
Saco vitelínico
enquanto o mesoderma de galinha se forma de células posteriores ao fim da linha, o
mesoderma de camundongos se forma de células anteriores à linha primitiva. Em al- Trofoblasto
guns casos, clones de células dão origem a descendentes em mais de uma camada
embrionária ou para ambos os derivados, embrionário e extra-embrionário. Assim, no
estágio de epiblasto, as linhagens não se separaram umas das outras. Como nos
embriões de aves, as células migrando entre as camadas de hipoblasto e epiblasto (B)
Anterior Âmnio
parecem estar envolvidas em ácido hialurônico cuja síntese se inicia durante a forma-
ção da linha primitiva (Solursh e Morriss, 1977). Considera-se (Larsen, 1993) que a Ectoderma
substituição das células hipoblásticas pelos precursores endodérmicos ocorre nos Mesoderma
dias 14-15 da gestação, enquanto que a migração de células formando o mesoderma Endoderma
não começa antes do dia 16. Notocorda
Mesoderma
Formação de membranas extra-embrionárias extra-embrionário
Enquanto o epiblasto embrionário está apresentando movimentos celulares Posterior Linha primitiva
reminiscentes daqueles vistos na gastrulação de répteis e aves, as células extra-embri-
onárias estão produzindo os tecidos distintivos dos mamíferos que permitem ao feto
sobreviver dentro do útero materno. Apesar da aparência normal das células
trofoblásticas iniciais no camundongo e no homem, elas dão origem a uma população
de células onde a divisão nuclear se dá em ausência de citocinese. O tipo inicial de
célula trofoblástica constitui uma camada chamada citotrofoblasto, enquanto que o
tipo de célula multinucleada forma o sinciciotrofoblasto. O citotrofoblasto adere à
parede uterina (endométrio) através de uma série de moléculas de adesão que foram
discutidas no Capítulo 3. As células citotrofoblásticas humanas também contêm enzimas
proteolíticas que lhes permitem entrar no útero e remodelar os vasos sangüíneos
uterinos, de modo que o sangue materno possa banhar os vasos sangüíneos fetais. O
Tubo neural
presuntivo
Mesênquima
Endoderma
Notocorda
presuntiva
Figura 6.36
Formação da notocorda no camundongo. (A)
A superfície ventral do embrião de 7.5 dias
vista pelo microscópio eletrônico de varredu-
Tubo neural ra. As células presuntivas da notocorda são
pequenas células ciliadas na linha mediana,
flanqueadas pelas células endodérmicas maio-
Notocorda res do intestino primitivo. (B) Formação da
notocorda pela dobra dorsal das pequenas cé-
lulas ciliadas. (de Sulik et al., 1994, cortesia de
(A) (B) K. Sulik e G. C. Schoewolf.)
tecido do sinciciotrofoblasto parece promover a progressão do embrião para dentro

do útero. A atividade proteolítica cessa após a décima segunda semana de gestação
(Fisher et al., 1989). O útero, por sua vez, supre essa área com vasos sangüíneos
que, por fim, entram em contato com o sinciciotrofoblasto. Pouco depois, o tecido
mesodérmico se estende para fora do embrião em gastrulação (veja Figura 6.33).
Estudos recentes com embriões humanos e de macaco rhesus sugerem que o saco
vitelínico (e portanto o hipoblasto) é a fonte desse mesoderma extra-embrionário
(Bianchi et al., 1993), que se junta às extensões trofoblásticas e dá origem aos vasos
sangüíneos que levam nutrientes da mãe para o embrião. O estreito pedúnculo de
conexão do mesoderma extra-embrionário que liga o embrião ao trofoblasto forma os
vasos do cordão umbilical. O órgão completamente desenvolvido, consistindo de
tecido trofoblástico e mesoderma contendo vasos sangüíneos, é chamado cório e
esse se funde com a parede uterina para formar a placenta. Assim, a placenta tem
uma porção materna (o endométrio uterino que é modificado durante a gravidez) e
um componente fetal, o cório. Esse pode estar fortemente justaposto ao tecido
materno, mas ainda passível de separação (como na placenta de contato no porco),
ou tão intimamente integrado que os dois tecidos não podem ser separados sem
causar dano para a mãe e para o feto em desenvolvimento (como na placenta decídua
da maioria dos mamíferos, incluindo o homem).* [gast2.html]
A Figura 6.37 mostra as relações entre os tecidos embrionários e extra-embrionári-
os de embrião humano de 6 semanas. O embrião encontra-se envolvido pelo âmnio e
protegido pelo cório. Os vasos sangüíneos se estendendo do cório ao embrião e
desse ao cório são facilmente observados, como também as vilosidades que se proje-
tam da superfície externa do cório. Essas vilosidades contém os vasos sangüíneos e
*Existem numerosos tipos de placenta, e as membranas extra-embrionárias se formam de

maneira diferente nas diferentes ordens de mamíferos (veja Cruz e Pedersen, 1991). Mesmo que o
camundongo e o homem gastrulam e implantam da mesma maneira, suas estruturas extra-embrio-
nárias são distintas. É muito arriscado extrapolar fenômenos de desenvolvimento de um grupo de
mamíferos para outro. Até Leonardo da Vinci errou (Renfree, 1982). Seu extraordinário desenho do
feto humano dentro da placenta é excelente arte, mas pobre ciência: a placenta é de vaca.
Figura 6.37
Embrião humano e placenta após 40 dias de gestação. O embrião está deitado
dentro do âmnio, e seus vasos sangüíneos podem ser vistos estendendo-se para
dentro das vilosidades coriônicas. A esfera à direita do embrião é o saco vitelínico.
(Instituto Carnegie de Washington, cortesia de C. F. Reather.)
Para o feto Figura 6.38

Relação entre as vilosidades coriônicas e o sangue materno no útero.
Do feto Do feto
Artérias umbilicais
Veia umbilical
Âmnio
Vilosidades
coriônicas
Cório (porção fetal da placenta)
Células trofoblásticas
Porção maternal da placenta (células deciduais)
Para a mãe Veia maternal

Da mãe Artéria maternal
permitem ao cório ampliar a área exposta ao sangue materno. Assim, apesar de não
haver fusão dos sistemas circulatórios materno e fetal, a difusão de substâncias solú-
veis pode ocorrer através das vilosidades (Figura 6.38). Dessa maneira, a mãe propor-
ciona nutrientes e oxigênio ao feto, e o feto envia seus produtos descartáveis (princi-
palmente dióxido de carbono e uréia) para a circulação materna. Os vasos sangüíneos
das vilosidades coriônicas são formados do mesoderma extra-embrionário que pene-
tra nos pequenos montes de tecido citotrofoblástico chamados vilosidades primárias
(Figura 6.39). As estruturas resultantes, as vilosidades secundárias, se formam na
segunda semana de gestação. No fim da terceira semana, uma parte desse mesoderma
extra-embrionário produziu vasos sangüíneos, e essas vilosidades terciárias estão
aptas a trazer nutrientes e oxigênio da mãe para o embrião. [other.html#gast4]
O trofoblasto é necessário para a aderência e entrada do embrião nos tecidos
uterinos, e o cório permite troca de gases e nutrientes entre a mãe e o feto. Mas o
cório tem uma importância até maior; é também um órgão endócrino. A porção
sinciciotrofoblástica do cório produz três hormônios essenciais para o desenvol-
vimento dos mamíferos. Primeiro, ele produz a gonadotrofina coriônica, um hormô-
nio peptídico que é capaz de induzir outras células da placenta (e do ovário mater-
no) a produzir progesterona. A progesterona é o hormônio esteróide que mantém
a parede uterina espessada e cheia de vasos sangüíneos. Nos primatas, os ovári-
os podem ser removidos depois do primeiro terço da gravidez, sem danos para o
desenvolvimento do feto, porque o cório tem capacidade para produzir os
esteróides necessários para manter a gestação (Zander e von Münstermann, 1956).
A progesterona placentária é também usada pela glândula supra-renal fetal como
um substrato para a produção de hormônios corticosteróides biologicamente
(A) Vilosidade primária (B) Vilosidade secundária (C) Vilosidade terciária
Endométrio Endométrio
Espaço entre
Casca
vilosidades
citotrofoblástica
Sinciciotrofoblasto
Sinciciotrofoblasto
Citotrofoblasto
Espaço entre
Mesoderma extra- vilosidades
embrionário Citotrofoblasto
Capilares das
vilosidades
Figura 6.39 Mesoderma

Desenvolvimento das vilosidades coriônicas extra-embrionário
em humanos. (A) Vilosidade primária compos-
ta de tecido citotrofoblástico encaixado no
sinciciotrofoblasto. (B) Vilosidade secundária
formada quando o mesoderma extra-embrio-
nário subjacente penetra na vilosidade primá-
importantes. O terceiro hormônio produzido pelo cório é a somatomamotropina
ria. Tais vilosidades secundárias juntam-se às coriônica (freqüentemente chamada lactogênio placentário). Esse hormônio é res-
vilosidades adjacentes para formar a casca ponsável pelo desenvolvimento do seio materno durante a gestação, assim, per-
citotrofoblástica que irá ancorar as vilosidades mitindo a produção de leite mais tarde.
ao endométrio. (C) dentro do mesoderma ex- Estudos recentes indicam que o cório pode ter ainda outra função, que é a de
tra-embrionário, formam-se capilares que irão proteger o feto da resposta imune da mãe. Uma pessoa com um sistema imune normal
se conectar aos ramos da artéria e veia umbili- reconhece e rejeita células estranhas dentro do seu corpo; esse fato é demonstrado
cais. (Segundo Gilbert, 1989.) pela rejeição a transplantes de pele e de órgãos de indivíduos geneticamente diferen-
tes. As glicoproteínas responsáveis por essa rejeição são chamadas de antígenos de
histocompatibilidade principais e, provavelmente, diferem de indivíduo a indivíduo.
Uma criança expressa antígenos de histocompatibilidade principais de ambos, o pai e
a mãe, e o corpo da mãe rejeitará a pele ou órgãos de seus descendentes porque eles
contêm antígenos derivados do pai. Como então, pode o feto humano permanecer 9
meses dentro do corpo da mãe? Porque a mãe não rejeita imunologicamente o seu feto,
como ela rejeitaria um órgão daquela criança? Parece que o cório desenvolveu vários
mecanismos pelos quais ele pode inibir a resposta imune contra o feto (Chaouat,
1990). Ele pode secretar proteínas solúveis que bloqueiam a produção de anticorpos,
e pode promover a produção de certos tipos de linfócitos que impedem a resposta
imune normal dentro do útero. As células citotrofoblásticas também contêm uma for-
ma de antígeno de histocompatibilidade principal, específico da placenta, que parece
proteger o embrião de ser reconhecido pelo sistema imune da mãe (Carosella et al.,
1996; Pazmany et al., 1996). Assim, as funções da placenta incluem não só suporte
físico e troca nutricional, mas também a regulação das relações endócrinas e
imunológicas entre a mãe e o feto. [gast3.html]
Na gastrulação, observamos uma série incrivelmente bem coordenada de movi-
mentos celulares pelos quais os blastômeros do estágio de clivagem são rearranjados
e começam a interagir com seus vizinhos. Além disso, apesar de haver diferenças entre
os movimentos na gastrulação de embriões de ouriço-do-mar, anfíbios, aves e mamífe-
ros, certos mecanismos são comuns a todos. Cada grupo tem o problema de trazer as
células precursoras do mesoderma e do endoderma para dentro do corpo, e envolver
o embrião com precursores ectodérmicos. Dadas as diferentes quantidades e distri-
buições de vitelo, como também outras considerações ambientais, cada tipo de orga-
nismo foi capaz de desenvolver uma maneira de conseguir esse objetivo. O palco está,
agora, pronto para a formação dos primeiros órgãos.
LITERATURA CITADA
Alfandari, D., Whittaker, C.A., DeSimone, D. Bursdal, C. A., Damsky, C. H. and Pedersen, R. Ettensohn, C. A. and McClay, D. R. 1986.
W. and Darribère, T. 1995. Integrin av subunit is A. 1993. The role of E-cadherin and integrins The regulation of primary mesenchyme cell
expressed on mesodermal cell surfaces during in mesoderm differentiation and migration at migration in the sea urchin embryo: Trans-
amphibian gastrulation. Dev. Biol. 170: 249-261. the mammalian primitive streak. Development plantations of cells and latex beads. Dev. Biol.
Anstrom, J. A., Chin, J. E., Leaf, D. S., Parks, A. 118: 829-844. 117: 380-391.
L. and Raff, R. A. 1987. Localization and Carosella, E.D., Dausset, J. and Kirszenbaum, Eyal-Giladi, H., Debby, A. and Harel, N. 1992.
expression of msp130, a primary mesenchyme M. 1996. HLA-G revisited. Immunol. Today 17: The posterior section of the chick’s area
lineage-specific cell surface protein of the sea 407-409. pellucida and its involvement in hypoblast and
urchin embryo. Development 101: 255-265. primitive streak formation. Development 116:
Chaouat, G. 1990. The Immunology of the Fetus.
Azar, Y. and Eyal-Giladi, H. 1981. Interaction 819-830.
CRC Press, Boca Raton, FL.
of epiblast and hypoblast in the formation of Fink, R. D. and McClay, D. R. 1985. Three cell
the primitive streak and the embryonic axis in Cherr, G. N., Summers, R. G., Baldwin, J. D. and
recognition changes accompany the ingression
chick, as revealed by hypoblast rotation Morrill, J. B. 1992. Preservation and visualization
of sea urchin primary mesenchyme cells. Dev.
experiments. J. Embryol. Exp. Morphol. 61: of the sea urchin blastocoelic extracellular matrix.
Biol. 107: 66-74.
133-141. Microsc. Res. Tech. 22: 11-22.
Fisher, M. and Solursh, M. 1977. Glycosamino-
Balinsky, B. I. 1975. Introduction to Embryolo- Cooke, J. 1986. Permanent distortion of
glycan localization and role in maintenance of
gy, 4th Ed. Saunders, Philadelphia. positional system of Xenopus embryo by brief
tissue spaces in the early chick embryo. J.
early perturbation in gravity. Nature 319: 60-63.
Bellairs, R. 1986. The primitive streak. Anat. Embryol. Exp. Morphol. 42: 195-207.
Embryol. 174: 1-14. Cruz, Y. P. and Pedersen, R. A. 1991. Origin of
Fisher, M. and Solursh, M. 1979. Influence of
Berg, L. K., Chen, S. W. and Wessel, G. M. 1996. embryonic and extraembryonic cell lineages in
local environment on the organization of
An extracellular matrix molecule that is mammalian embryos. In Animal Applications
mesenchymel cells. J. Embryol. Exp. Morphol.
selectively expressed during development is of Research in Mammalian Development. Cold
49: 295-306.
important for gastrulation in the sea urchin Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, pp.
embryo. Development 122: 703-713. 147-204. Fisher, S. J., Cui, T.-Y, Zhang, L., Grahl, K.,
Guo-Yang, Z., Tarpey, J. and Damsky, C. H.
Bianchi, D. W., Wilkins-Haug, L. E., Enders, A. Dan, K. and Okazaki, K. 1956. Cyto-embryolo-
1989. Adhesive and dlegradative properties of
C. and Hay, E. D. 1993. Origin of extraembryo- gical studies of sea urchins. III. Role of secondary
the human placental cytotrophoblast cells in
nic mesoderm in experimental animals: Relevance mesenchyme cells in the formation of the
vitro. J. Cell Biol. 109: 891-902.
to chorionic mosaicism in humans. Am. J. Med. primitive gut in sea urchin larvae. Biol. Bull.
Genet. 46: 542-550. 110: 29-42. Galileo, D. S. and Morrill, J. B. 1985. Patterns
of cells and extracellular material of the sea
Bisgrove, B. W., Andrews, M. E. and Raff, R. A. D’Arribère, T., Yamada, K. M., Johnson, K. E.
urchin Lytechinus variegatus (Echinoderma-
1991. Fibropellins, products of an EGF repeat- and Boucaut, J.-C. 1988. The 140-kD fibronec-
ta; Echinoidea) embryo, from hatched
containing gene, form a unique extracellular tin receptor complex is required for mesodermal
blastula to late gastrula. J. Morphol. 185:
matrix structure that surrounds the sea urchin cell adhesion during gastrulation in the amphibian
387-402.
embryo. Dev. Biol. 146: 89-99. Pleurodeles waltii. Dev. Biol. 126: 182-194.
Gerhart, J., Ubbels, G., Black, S., Hara, K. and
Black, S. D. and Gerhart, J. 1985. Experimental D’Arribère, T., Guida, K., Larjava, H., Johnson,
Kirschner, M. 1981. A reinvestigation of the
control of the site of embryonic axis formation K. E., Yamada, K. M., Thiery, J.-P. and Bou-
role of the grey crescent in axis formation in
in Xenopus laevis eggs centrifuged before first caut, J.-C. 1990. In vivo analysis of integrin β 1
Xenopus laevis. Nature 292: 511-516.
cleavage. Dev. Biol. 108: 310-324. subunit function in fibronectin matrix assembly.
J. Cell Biol. 110: 1813-1823. Gerhart, J. and seven others. 1986. Amphibian
Black, S. D. and Gerhart, J. 1986. High frequency
twinning of Xenopus laevis embryos from eggs early development. BioScience 36: 541-549.
Delarue, M., D’Arribère, T., Aimar, C. and Bou-
centrifuged before first cleavage. Dev. Biol. 116: caut, J.-C. 1985. Bufonid nucleocytoplasmic Gilbert, S. G. 1989. Pictorial Human Embryolo-
228-240. hybrids arrested at the early gastrula stage lack gy. University of Washington Press, Seattle.
a fibronectin-containing fibrillar extracellular
Boucaut, J.-C., D’Arribère, T., Poole, T. J., Gimlich, R. L. and Gerhart, J. C. 1984. Early
matrix. Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. 194:
Aoyama, H., Yamada, K. M. and Thiery, J. P. cellular interactions promote embryonic axis
275-280.
1984. Biologically active synthetic peptides as formation in Xenopus laevis. Dev. Biol. 104:
probes of embryonic development: A competi- Driever, W. 1995. Axis formation in zebrafish. 117-130.
tive peptide inhibition of fibronectin function Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 610-618.
inhibits gastrulation in amphibian embryos and Gustafson, T. and Wolpert, L. 1961. Studies on
neural crest cell migration in avian embryos. J. Duband, J. L. and Thiery, J. P. 1982. Appearance the cellular basis of morphogenesis in sea urchin
Cell Biol. 99: 1822-1830. and distribution of fibronectin during chick embryos: Directed movements of primary me-
embryo gastrulation and neurulation. Dev. Biol, senchyme cells in normal and vegetalized larvae.
Boucaut, J.-C., D’Arribère, T., Li, S. D, 94: 337-350. Exp. Cell Res. 24: 64-79.
Boulekbache, H., Yamada, K. M. Q Thiery, J. P.
1985. Evidence for the role of fibronectin in Ettensohn, C. A. 1985. Gastrulation in the sea Gustafson, T. and Wolpert, L. 1967. Cellular
amphibian gastrulation. J. Embryol. Exper. urchin embryo is accompanied by the rearran- movement and contact in sea urchin morpho-
Morphol. 89 [Suppl.]: 211-227. gement of invaginating epithelial cells. Dev, Biol. genesis. Biol. Rev. 42: 442-498.
112: 383-390.
Burke, R. D., Myers, R. L., Sexton, T. L. and Hall, H. G. and Vacquier, V. D. 1982. The apical
Jackson, C. 1991 Cell movements during the Ettensohn, C. A. 1990. The regulation of lamina of the sea urchin embryo: Major glyco-
initial phase of gastrulation in the sea urchin primary mesenchyme cell patterning. Dev. Biol. protein associated with the hyaline layer. Dev.
embryo. Dev. Biol. 146: 542-557. 140: 261-271. Biol. 89: 168-178.
Hardin, J. 1988. The role of secondary mesen- cells and their role in directed migration of the Langeland, J. and Kimmel, C. B. 1997. The
chyme cells during sea urchin gastrulation primary mesenchyme in vitro. Dev. Biol. 112: embryology of fish. In Gilbert, S. F. and Raunio,
studied by laser ablation. Development 103: 276-283. A. M. (eds.), Embryology: Constructing the
317-324. Organism. Sinauer Associates, Sunderland, MA.
Keller, R. E. 1975. Vital dye mapping of the
Hardin, J. 1990. Context-dependent cell gastrula and neurola of Xenopus laevis. I. Larsen, W. J. 1993. Human Embryology.
behaviors during gastrulation. Semin. Dev. Biol. Prospective areas and morphogenetic movements Churchill Livingston, New York.
1: 335-345. of the superficial layer. Dev. Biol. 42: 222-241.
Lash, J. W., Gosfield, E, III, Ostrovsky, D. and
Hardin, J. D. and Cheng, L. Y. 1986. The Keller, R, E. 1976. Vital dye mapping of the Bellairs, R. 1990. Migration of chick blastoderm
mechanisms and mechanics of archenteron gastrula and neurula of Xenopus laevis. I. under the vitelline membrane: The role of fi-
elongation during sea urchin gastrulation. Dev. Prospective areas and morphogenetic move- bronectin. Dev. Biol. 139: 407-416.
Biol. 115: 490-501. ments in the deep layer. Dev. Biol. 51: 118-137.
Lawson, K. A., Meneses, J. J. and Pedersen, R.
Hardin, J. D. and Keller, R. 1988. The behaviour Keller, R. E. 1980. The cellular basis of epiboly: A. 1991. Clonal analysis of epiblast fate during
and function of bottle cells during gastrulation An SEM study of deep cell rearrangement du- germ layer formation in the mouse embryo.
of Xenopus laevis. Development 103: 211-230. ring gastrulation of Xenopus laevis. J. Embryol, Development 113: 891-911.
Exp. Morphol. 60: 201-243. Le Douarin, N., Grapin-Botton, A. and Catala,
Hardin, J. and McClay, D. R. 1990. Target re-
cognition by the archenteron during sea urchin Keller, R. E. 1981. An experimental analysis of M. 1996. Patterning of the neural primordium in
gastrulation. Dev. Biol. 142: 87-105. the role of bottle cells and the deep marginal the avian embryo. Semin. Dev. Biol. 7: 157-167.
zone in the gastrulation of Xenopus laevis. J. Lillie, F. R. 1902. Differentiation without
Harkey, M. A. and Whiteley, A. M. 1980.
Exp. Zool. 216: 81-101. cleavage in the egg of the annelid Chaetopterus
Isolation, culture and differentiation of echinoid
primary mesenchyme cells. Wilhelm Roux Arch. Keller, R. E. 1986. The cellular basis of amphibian pergamentaceous. Wilhelm Roux Arch. Entwi-
Dev. Biol. 189: 111-122. gastrulation. In L. Browder (ed.), Developmental cklungsmech. Org. 14: 477-499.
Biology: A Comprehensive Synthesis, Vol. 2. Lφvtrup, S. 1975. Fate maps and gastrulation in
Hartmann, G., Weidner, K. M., Scharz, H. and
Plenum, New York, pp. 241-327. amphibia: A critique of current views. Can. J.
Birchmeier, W. 1994. The motility signal of
scatter factor /hepatocyte growth factor Keller, R. and Danilchik, M. 1988. Regional Zool. 53: 473-479.
mediated through the receptor tyrosine kinase expression, pattern and timing of convergence Luckett, W. P. 1978. Origin and differentiation
Met requires intracellular action of Ras. J. Biol. and extension during gastrulation of Xenopus of the yolk sac and extraembryonic mesoderm
Chem. 269: 21936-21939. laevis. Development 103: 193-209. in presomite human and rhesus monkey
Herbst, C. 1904. Über die zur Entwicklung des Keller, R. E. and Schoenwolf, G. C. 1977. An embryos. Am. J. Anat. 152: 59-98.
Seeigellarven notwendigen anorganischen Stoffe, SEM study of cellular morphology, contact, and Lundmark, C. 1986. Roles of bilateral zones of
ihre Rolle und Vertretbarkeit. II. Wilhelm Roux arrangement as related to gastrulation in ingressing superficial cells during gastrulation of
Arch. Entwicklungsmech. Org.17: 306-520. Xenopus laevis. Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. Ambystoma mexicanum. J. Embryol. Exp.
182: 165-186. Morphol. 97: 47-62.
Ho, R. K. 1992. Cell movements and cell fate
during zebrafish gastrulation. Development Khaner, 0. 1995. The rotated hypoblast of the Malinda, K. M., Fisher, G.W., and Ettensohn, C.
Suppl. 1992: 65-73. chicken embryo does not initiate an ectopic A. 1995. Four-dimensional microscopic analysis
axisin the epiblast. Proc. Natl. Aca Sci. USA 92: of the filopodial behavior of primary mesenchyme
Holowacz, T. and Elinson, R. P. 1993. Cortical
10733-10737. cells during gastrulation in the sea urchin embryo.
cytoplasm, which induces dorsal axis formation
Dev. Biol. 172: 552-566.
in Xenopus, is inactivated by UV irradiation of Khaner, 0. and Eyal-Giladi, H. 1989. The chick’s
the oocyte. Development 119: 277-285. marginal zone and primitive streak formation. Miller, J. R., Fraser, S. E. and McClay, D. R. 1995.
I. Coordinative effect of induction and inhibiti- Dynamics of thin filopodia during sea urchin
Holtfreter, J. 1943. A study of the mechanics of
on. Dev. Biol. 134: 206-214. gastrulation. Development 121: 2505-2511
gastrulation: Part I. J. Exp. Zool. 94: 261-318.
Kirschner, M. W. and Gerhart, J. C. 1981. Spatial Morrill, J. B. and Santos, L. L. 1985. A scanning
Holtfreter, J. 1944. A study of the mechanics of
and temporal changes in the amphibian egg. electron micrographical overview of cellular and
gastrulation: Part II. J. Exp. Zool. 95: 171-212.
BioScience 31: 381-388. extracellular patterns during blastulation and gas-
Hörstadius, S. 1939. The mechanics of sea urchin trulation in the sea urchin, Lytechinus variegatus.
Kochav, S. M. and Eyal-Giladi, H. 1971. Bilate- In R. H. Sawyer and R. M. Showman (eds.), The
development, studied by operative methods.
ral symmetry in the chick embryo determinati- Cellular and Molecular Biology of Invertebrate
Biol. Rev. 14: 132-179.
on by gravity. Science 171: 1027-1029. Development. University of South Carolina Press,
Jurand, A. 1974. Some aspects of the develop- pp. 3-33.
Lane, M. C. and Solursh, M. 1991. Primary
ment of the notochord in mouse embryos. J.
mesenchyme cell migration requires a chondroi- Nakatsuji, N., Smolira, M. A. and Wylie, C. C.
Embryol. Exp. Morphol. 32: 1-33.
tin sulfate/ dermatan sulfate proteoglycan. Dev. 1985. Fibronectin visualized by scanning electron
Kane, D. A. and Kimmel, C. B. 1993. The Biol. 143: 389-397. microscope immunocytochemistry on the
zebrafish midblastula transition. Development substratum for cell migration in Xenopus laevis
119: 447-456. Lane, M. C. Koehl, M. A. R., Wilt, F. and Keller,
gastrulae. Dev. Biol. 107: 264-268.
R. 1993. A role for regulated secretion of apical
Karp, G. C. and Solursh, M. 1974. Acid matrix during epithelial invagination in the sea New, D. A. T. 1959. Adhesive properties and
mucopolysaccharide metabolism, the cell surface, urchin. Development 117: 1049-1060. expansion of the chick blastoderm. J. Embryol.
and primary mesenchyme cell activity in the Exp. Morphol. 7: 146-164.
sea urchin embryo. Dev. Biol. 41: 110-123. Landstrom, U. and Lφvtrup, S. 1979. Fate maps
and cell differentiation in the amphibian embryo: Oppenheimer, J. M. 1936. Transplantation
Karp, G. C. and Solursh, M. 1985. Dynamic An experimental study. J. Embryol. Exp. experiments on developing teleosts (Fundulus
activity of the filopodia of sea urchin embryonic Morphol. 54: 113-130. and Perca). J. Exp. Zool. 72: 409-437.
Pazmany, L., Mandelboim, 0., ValésGómez, M., Solursh, M. and Morriss, G. M. 1977. Glycosa- Trinkaus, J. P. 1984a. Cells into Organs: The
Davis, D.M., Reyburn, H.T. and Strominger, J.L. minoglycan synthesis in rat embryos during the Forces that Shape the Embryo, 2nd Ed. Prentice-
1996. Protection from natural killer cell- formation of the primary mesenchyme and Hall, Englewood Cliffs, NJ.
mediated lysis by HLA-G expression on target neural folds. Dev. Biol. 57: 75-86.
Trinkaus, 1984b. Mechanisms of Fundulus
cells. Science 274: 792-795.
Solursh, M. and Revel, J. P. 1978. A scanning epiboly–a current view. Am. Zool. 24: 673-688.
Psychoyos, D. and Stern, C. D. 1996. Fates and electron microscope study of cell shape and
Trinkaus, J. P. 1992. The midblastula transi-
migratory routes of primitive streak cells in the cell appendages in the primitive streak region
tion, the YSL transition, and the onset of gas-
chick embryo. Development 122: 1523-1534. of the rat and chick embryo. Differentiation
trulation in Fundulus. Development Suppl.,
11: 185-190.
Purcell, S. M. and Keller, R. 1993. A different 1992: 75-80.
type of amphibian mesoderm morphogenesis in Spratt, N. T., Jr. 1946. Formation of the pri-
Trinkaus, J.P. 1996. Ingression during early
Ceratophrys ornata. Development 117: 307-317. mitive streak in the explanted chick blastoderm
gastrulation of Fundulus. Dev. Biol. 177:
marked with carbon particles. J. Exp. Zool. 103:
Renfree, M. B. 1982. Implantation and placen- 356-370.
259-304.
tation. In C. R. Austin and R. V. Short (eds.),
Vakaet, L. 1984. The initiation of gastrula
Embryonic and Fetal Development. Cambridge Spratt, N. T., Jr. 1947. Regression and shorte-
ingression in the chick blastoderm. Am. Zool.
University Press, Cambridge, pp. 26-69. ning of the primitive streak in the explanted
24: 555-562.
chick blastoderm. J. Exp. Zool. 104: 69-100.
Rosenquist, G. C. 1966. A radioautographic study
Vakaet, L. 1985. Morphogenetic movements
of labeled grafts in the chick blastoderm. Deve- Spratt, N. T., Jr. 1963. Role of the substratum,
and fate maps in the avian blastoderm. In G.
lopment from primitive-streak stages to stage supracellular continuity, and differential growth
M. Edelman (ed.), Molecular Determinants of
12. Carnegie Inst. Wash. Contrib. Embryol. 38: in morphogenetic cell movements. Dev. Biol.
Animal Form. Alan R. Liss, New York, pp.
31-110. 7: 51-63.
99-109.
Rosenquist, G. C. 1972. Endoderm movements Spratt, N. T. Jr. and Haas, H. 1960. Integrative
Vincent, J. P. and Gerhart, J. C. 1987. Subcor-
in the chick embryo between the short streak mechanisms in development of early chick
tical rotation in Xenopus eggs: An early step
and head process stages. J. Exp. Zool. 180: blastoderm. I. Regulated potentiality of separate
in embryonic axis formation. Dev. Biol. 123:
95-104. parts. J. Exp. Zool. 145: 97-138.
526-539.
Schlesinger, A. B. 1958. The structural signifi- Stern, C. D. 1991. Mesoderm formation in the
Vincent, J. P., Oster, G. F. and Gerhart, J. C.
cance of the avian yolk in embryogenesis. J. chick embryo revisited. In R. Keller, W. H. Clark,
1986. Kinematics of gray crescent formation in
Exp. Zool. 138: 223-258. Jr. and F. Griffin (eds.), Gastrulation: Movements,
Xenopus eggs. Displacement of subcortical
Patterns, and Molecules. Plenum, New York,
Schoenwolf, G. C. 1991. Cell movements in cytoplasm relative to the egg surface. Dev. Biol.
pp. 29-41.
the epiblast during gastrulation and neurulation 113: 484-500.
in avian embryos. In R. Keller, W. H. Clark, Jr. Stern, C. D. and Canning, D. R. 1988. Gastru-
Vogt, W. 1929. Gestaltungsanalyse am Amphi-
and F. Griffin (eds.), Gastrulation: Movements, lation in birds: A model system for the study
bienkeim mit ortlicher Vitalfarbung. II. Teil Gas-
Patterns, and Molecules. Plenum, New York, of animal morphogenesis. Experientia 44:
trulation und Mesodermbildung bei Urodelen und
pp. 1-28. 651-657.
Anuren. Wilhelm Roux Arch. Entwicklungsmech.
Schoenwolf, G. C., Garcia-Martinez, V. and Diaz, Stern, C. D. and Canning, D. R. 1990. Origin of Org. 120: 384-706.
M. S. 1992. Mesoderm movement and fate cells giving rise to mesoderm and endoderm in
von Übisch, L. 1939. Keimblattchimarenfors-
during amphibian gastrulation and neurulation. chick embryo. Nature 343: 273-275.
chung an Seeigellarven. Biol. Rev. Cambr. Philos.
Dev. Dynam. 193: 235-248.
Stern, C. D., Ireland, G. W., Herrick, S. E., Soc. 14: 88-103.
Schroeder, T. 1981. Development of a “primi- Gherardi, E., Gray, J., Perryman, M. and Stoker,
Waddington, C. H. 1932. Experiments in the
tive” sea urchin (Eucidaris tribuloides): Irregu- M. 1990. Epithelial scatter factor and develop-
development of chick and duck embryos
larities in the hyaline layer, micromeres, and ment of the chick embryonic axis. Develop-
cultivated in vitro. Philos. Trans. R. Soc. Lond.
primary mesenchyme. Biol. Bull. 161: 141-151. ment 110: 1271-1284.
[B] 13: 221.
Shi, D.-L., D’Arribère, T., Johnson, K. E. and Strahle, U. and Jesuthasan, S. 1993. Ultraviolet
Warga, R. M. and Kimmel, C. B. 1990. Cell
Boucaut, J.-C. 1989. Initiation of mesodermal irradiation impairs epiboly in zebrafish embryos:
movements during epiboly and gastrulation in
cell migration and spreading relative to gastru- evidence for a microtubule-dependent mecha-
zebrafish. Development 108: 569-580.
lation in the urodele amphibian Pleurodeles nism of epiboly. Development 119: 451-453.
walti. Development 105: 351-363. Wessel, G. M. and McClay, D. R. 1985.
Streit A., Stem, C. D., Thery, C., Ireland, G. W.,
Sequential expression of germ layer specific
Schmidt, B. and Campos-Ortega, J. 1994. Aparicio, S., Sharpe, M. J. and Gherardi, E. 1995.
molecules in the sea urchin embryo. Dev. Biol.
Dorsoventral polarity of the zebrafish embryo A role for HGF/SF in neural induction and its
111: 451-463.
is distinguishable prior to the onset of gastru- expression in Hensen’s node during gastrulation.
lation. Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. 203: Development 121: 813-824. Wessel, G. M., Marchase, R. B. and McClay, D.
374-380. R. 1984. Ontogeny of the basal lamina in the
Sugiyama, K. 1972. Occurrence of mucopoly-
sea urchin embryo. Dev. Biol. 103: 235-245.
Smith, J. C. and Malacinski, G. M. 1983. The saccharides in the early development of the sea
origin of the mesoderm in an anuran, Xenopus urchin embryo and its role in gastrulation. Dev. Wilson, P. and Keller, R. 1991. Cell rearrange-
laevis, and a urodele, Ambystoma mexicanum. Growth Differ. 14: 62-73. ment during gastrulation of Xenopus: Direct
Dev. Biol. 98: 250-254. observation of cultured explants. Development
Sulik, K., Dehart, D. B., Carson, J. L.,
112: 289-300.
Solnica-Krezel, L. and Driever, W. 1994. Mi- Vrablic, T., Gesteland, K. and Schoenwolf,
crotubule arrays of the zebrafish yolk cell: G. C. 1994. Morphogenesis of the murine Winklbauer, R. and Keller, R. E. 1996. Fibro-
organizationand function during epiboly. Deve- node and notochordal plate. Dev. Dynam. nectin, mesoderm migration, and gastrulation
lopment 120: 2443-2455. 201: 260-278. in Xenopus. Dev. Biol. 177: 413-426.
Winklbauer, R. and Nagel, M. 1991. Directional Winklbauer, R., Selchow, A., Nagel, M., Stoltz, Zander, J. and von Miinstermann, A, M. 1956.
mesoderm cell migration in the Xenopus gastrula. C. and Angres, B. 1991. Mesodermal cell migra- Progesteron in menschlichem Blut und Gewe-
Dev. Biol. 148: 573-589. tion in the Xenopus gastrula. In R. Keller, W. H. ben. III. Klin. Wochenschr. 34: 944-953.
Clark, Jr. and F. Griffin (eds.), Gastrulation:
Movements, Patterns, and Molecules. Plenum,
New York, pp. 147-168.
CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 253

Neurulação e ectoderma
7
Porque a verdadeira maravilha, se você qui-
ser se maravilhar, é este processo. Você ini-
cia como uma única célula derivada da união
entre um espermatozóide e um óvulo; essa
se divide em duas, depois quatro, depois oito
E M 1828 KARL ERNST VON BAER, o mais eminente embriologista de sua
época*, anunciou: Eu tenho dois pequenos embriões preservados em álco-
ol, que esqueci de identificar. No momento, não consigo determinar o gêne-
ro ao qual pertencem. Eles podem ser lagartos, pequenas aves ou mesmo mamífe-
ros”. A Figura 7.1 permite-nos apreciar seu dilema e ilustra as quatro leis gerais da
e assim por diante e, em um certo estágio embriologia propostas por von Baer. De seu estudo detalhado sobre o desenvolvi-
aparece uma única célula, cuja descendên- mento da galinha e da comparação de tais embriões com embriões de outros
cia total é o cérebro humano. A mera exis-
vetebrados, von Baer estabeleceu quatro generalizações, ilustradas aqui com al-
tência de tal célula deveria ser uma das coi-
guns exemplos de vertebrados.
sas assombrosas da Terra. As pessoas deve-
riam vagar o dia inteiro, enquanto acorda-
das, chamando umas às outras, maravilha- 1. As características gerais de um grande grupo de animais aparecem no em-
das, falando de nada exceto da célula. brião mais cedo do que os aspectos especializados. Todos os vertebrados em
LEWIS THOMAS (1979) desenvolvimento (peixes, répteis, anfíbios, aves e mamíferos) são muito seme-
lhantes logo após a gastrulação. Somente mais tarde no desenvolvimento que
Ainda mais atraente do que a mata vir- as características especiais da classe, ordem e, finalmente, espécie aparecem
gem, era a floresta que se estendia a mi- (veja Figura 7.1). Todos os embriões de vertebrados têm arcos de guelras,
nha frente naquele momento: o sistema notocordas, medulas espinhais e rins pronéfricos.
nervoso central. 2. Caracteres menos gerais são desenvolvidos a partir dos mais gerais, até
RITA LEVI-MONTALCINI (1988) finalmente aparecerem os caracteres mais especializados. Inicialmente todos
os vertebrados têm o mesmo tipo de pele. Somente mais tarde se desenvolvem
as escamas de peixes, as escamas de répteis, as penas das aves, ou o pêlo,
garras e unhas dos mamíferos. Da mesma maneira, o desenvolvimento precoce
de membros é essencialmente o mesmo em todos os vertebrados. Somente
mais tarde é que diferenças entre pernas, asas e braços se tornam evidentes.
3. Cada embrião de uma dada espécie, em lugar de passar através de todos os
estágios adultos de outros animais, se afasta mais e mais deles. As fendas
viscerais em embriões de aves e mamíferos não se parecem em detalhe às
fendas das guelras de peixes adultos. Ao contrário, elas se parecem às fendas
viscerais de peixes embrionários e outros vertebrados embrionários. Enquan-
to peixes preservam e elaboram essas fendas tornando-as verdadeiras guelras,
os mamíferos as convertem em estruturas tais como os tubos de Eustáquio
(entre o ouvido e a boca).
4. Assim, o embrião precoce de um animal superior nunca é como um animal infe-
rior, mas somente como seu embrião precoce. Von Baer verificou que diferentes
* K. E. von Baer descobriu a notocorda, o ovo de mamífero e o ovo humano, além de contribuir
para o progresso conceitual aqui descrito. Seu trabalho será mais discutido no Capítulo 23.
253
Figura 7.1
Ilustração das leis de von Baer. Embriões pre-
coces de vertebrados mostram aspectos co-
I
muns ao subfilo inteiro. Com o progresso do
desenvolvimento, os embriões se tornam re-
conhecíveis como membros de sua classe, sua
ordem, sua família e, finalmente, sua espécie.
(de acordo com Romanes, 1901).
II
III
Peixe Salamandra Tartaruga Galinha Porco Boi Coelho Homem
grupos de animais compartilham aspectos comuns durante o desenvolvimento

embrionário precoce e que esses aspectos se tornam mais e mais característi-
cos da espécie à medida que progride o desenvolvimento. Embriões humanos
nunca passam por estágios equivalentes a um peixe ou uma ave adultos; real-
mente, embriões humanos inicialmente compartilham características comuns
com embriões de peixes e aves. Mais tarde, os embriões de mamíferos e outros
divergem, nenhum deles passando pelos estágios dos outros.
Von Baer também reconheceu que existe um modelo comum para todo o desenvol-
vimento de vertebrados: as três camadas germinativas originam diferentes órgãos, e
essa derivação dos órgãos é constante se o organismo é um peixe, uma rã ou uma
galinha. O ectoderma forma a pele e os nervos; o endoderma forma os sistemas respi-
ratórios e digestivos; e o mesoderma forma o tecido conjuntivo, as células do sangue,
o coração, o sistema urogenital e partes da maioria dos órgãos internos. Neste capítu-
lo acompanharemos o desenvolvimento precoce do ectoderma; este, e o capítulo
seguinte enfocam a formação do sistema nervoso nos vertebrados. O Capítulo 9 acom-
panhará o desenvolvimento precoce dos órgãos endodérmicos e mesodérmicos.
Q FORMAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

Neurulação: aspectos gerais
“Talvez a mais intrigante de todas as perguntas é se o cérebro é suficientemente pode-
roso para resolver o problema da sua própria criação.” Assim Gregor Eichele (1992)
terminou, recentemente, uma revisão de pesquisa sobre desenvolvimento do cérebro de
mamíferos. A construção de um órgão que reconhece, pensa, ama, odeia, lembra, troca,
engana a si mesmo, e coordena nossos processos corporais conscientes ou inconscien-
tes é indubitavelmente o mais desafiante dos enigmas do desenvolvimento. Uma combi-
nação de abordagens genéticas, celulares e orgânicas está fornecendo uma compreen-
são preliminar de como a anatomia básica do cérebro se torna ordenada.
O processo pelo qual o embrião forma o tubo neural, o rudimento do sistema

nervoso central, é chamado neurulação, e um embrião sofrendo essas transformações
é chamado nêurula. Existem dois caminhos principais para a formação do tubo neural.
Em neurulação primária, o cordomesoderma estimula o ectoderma, que o recobre, a
se proliferar, invaginar e a se destacar da superfície formando um tubo oco. Na
neurulação secundária, o tubo neural se origina de um sólido cordão de células que
se embebe no embrião e subseqüentemente se torna oco (forma uma cavidade) para
formar o tubo neural (veja Schoenwolf, 1991b). O quanto essas formas de construção
são usadas depende da classe de vertebrados. A neurulação em peixes é exclusiva-
mente secundária. Em aves, as porções anteriores do tubo neural são construídas por
neurulação primária, ao passo que o tubo neural, caudal ao par somito 27 (isto é, tudo
posterior aos membros posteriores), é construído por neurulação secundária (Pasteels,
1937; Catala et al., 1996). Em anfíbios, como o Xenopus, a maior parte do tubo neural do
girino é produzida por neurulação primária, mas o tubo neural caudal é derivado de
neurulação secundária (Gont et al., 1993). Em camundongo (provavelmente no ho-
mem, também), a neurulação secundária começa aproximadamente ao nível do somito
35 (Schoenwolf, 1984; Nievelstein et al., 1993).
Neurulação primária (A)
Em vertebrados, a gastrulação cria um embrião com uma camada endodérmica interna,

uma camada mesodérmica intermediária e um ectoderma externo. A interação entre o
mesoderma dorsal e o ectoderma que a ele se sobrepõem é uma das interações mais
importantes em todo o desenvolvimento de tetrápodes, porque ela inicia a
organogênese, a criação de tecidos e órgãos específicos. Nessa interação, o cordo- Placa neural Prega neural
mesoderma estimula o ectoderma acima dele a formar o tubo neural oco, que se dife-
renciará em cérebro e medula espinhal. Os eventos da neurulação primária estão no
(B)
(C) Crista neural
Figura 7.2 Epiderme

Neurulação em anfíbios e amniotas. (A) Diagrama representativo da formação do tubo neural.
As células ectodérmicas estão representadas como precursoras da crista neural (preto) ou como
precursoras da epiderme (cor). O ectoderma se dobra no ponto mais dorsal, formando a epiderme
externa e um tubo neural interno conectados pelas células da crista neural. (B) Fotomicrografias
de neurulação em um embrião de galinha de 2 dias. (C) Formação do tubo neural vista em seções
transversais do embrião de galinha na região do futuro mesencéfalo (setas em B). Cada fotografia
em C corresponde à outra acima dela. (HF, prega cefálica; HP, processo cefálico; HN, nódulo de
Hensen; M, mesencéfalo; NP, placa neural.) (Fotomicrografias, cortesia de R. Nagele.) Tubo neural
Figura 7.3 diagrama da Figura 7.2. Durante a neurulação primária, o ectoderma original é dividido
Quatro vistas da neurulação em um embrião em três conjuntos de células: (1) o tubo neural posicionado internamente, que formará
de anfíbio, mostrando em cada caso nêurulas o cérebro e a medula espinhal, (2) a epiderme da pele posicionada externamente, e (3)
precoce (esquerda), média (centro) e tardia
as células da crista neural, as quais migram da região de conexão entre o tubo neural e
(direita). (A) Seção transversal no centro do
embrião. (B) A mesma seqüência olhando a
a epiderme, e irão gerar os neurônios periféricos e a glia, as células pigmentadas da
superfície dorsal do embrião inteiro, de cima pele e vários outros tipos de células. O fenômeno de indução embrionária, que inicia a
para baixo. (C) Seção sagital pelo plano medi- neurulação na região dorsal do embrião, será detalhada no Capítulo 15. Neste capítulo
ano do embrião. (D) Simulação computadori- estamos considerando a resposta dos variados tecidos ectodérmicos.
zada em três dimensões da constrição, exten-
são e levantamento da placa neural. (A-C de
acordo com Balinsky, 1975; D de acordo com
Jacobson e Gordon, 1976.)
Placa Placa neural Tubo neural

neural Notocorda
Prega neural Notocorda Mesoderma Notocorda Cavidade
Mesoderma
do intestino
Arquêntero Cavidade do intestino
(A)
SEÇÃO
TRANSVERSAL
Endoderma Endoderma
Mesoderma Endoderma Epiderme
Epiderme Epiderme
Notocorda Notocorda
Tubo neural
Placa neural Placa neural
Prega neural Prega neural
Prega neural
Epiderme Blastóporo
Blastóporo
(B)
SEÇÃO
SAGITAL Cavidade do Cavidade do
Arquêntero intestino intestino
Mesoderma Mesoderma
Mesoderma Epiderme
Resto da Endoderma Epiderme Endoderma
blastocele Endoderma Divertículo
do fígado
Tubo neural
Placa neural Prega neural Placa neural Prega neural
Pregas
neurais
(C) fundidas
VISTA DA
SUPERFÍCIE
DORSAL
Blastóporo Blastóporo
(D)
SIMULAÇÃO
COMPUTADORIZADA
DA DEFORMAÇÃO
DA LÂMINA DE
ECTODERMA (LINHA C)
(A) Formação das pregas neurais (B) Elevação das pregas neurais (C)
Epiderme
presuntiva Notocorda
Placa neural
presuntiva Formação
de cunha
Zona de
transição Formação
de sulco
Placa neural
Epiderme Ancoragem
Notocorda
Figura 7.4
Representação esquemática do dobramento do
epitélio durante a neurulação na galinha. (A)
Formação das pregas neurais ocorre quando as
O processo de neurulação primária em embriões de rã está descrito na Figura 7.3 e células epidérmicas presuntivas se movem para
parece ser similar em anfíbios, répteis, aves e mamíferos (Galera, 1971). A primeira dentro, na direção da linha média do embrião.
indicação que uma região do ectoderma está destinada a se tornar tecido neural é uma Essa epiderme presuntiva empurra a placa
mudança na forma celular (Figura 7.4). As células ectodérmicas da linha média tornam- neural abaixo dela, enquanto se move. (B) En-
se alongadas, enquanto as células destinadas a formar a epiderme se tornam mais quanto as células da linha média da placa neural
(células da placa do assoalho) são ancoradas à
achatadas. O alongamento das células ectodérmicas dorsais causa a elevação dessas
notocorda, as pregas neurais são elevadas. Es-
regiões neurais presuntivas acima do ectoderma circundante, criando assim, a placa ses movimentos parecem continuar enquanto
neural. Até 50% do ectoderma está incluído nessa placa. Logo após, as bordas da a epiderme, se movendo para o meio, puxa
placa neural se engrossam e se movem para cima formando as pregas neurais, en- com ela a placa neural, resultando na justapo-
quanto um sulco neural, em forma de -U- aparece no centro da placa, dividindo os sição das pregas neurais. (C) Nas três regiões
futuros lados direito e esquerdo do embrião (veja Figuras 7.3 e 7.4). As pregas neurais de articulação (no ponto de articulação media-
migram em direção à linha média do embrião, finalmente se fundindo para formar o no MHP e nos dois pontos de articulação
tubo neural abaixo do ectoderma sobreposto. As células da porção mais dorsal do dorsolateral a -DLHP), as células da placa
tubo neural se tornam as células da crista neural. neural mudam seu comprimento e sofrem uma
constrição nos seus ápices. (De acordo com
Moury e Schoenwolf, 1995.)
A mecânica da neurulação primária
A neurulação ocorre com algumas variações em diferentes regiões do corpo. A cabeça,
o tronco e a cauda formam, cada um, sua região do tubo neural de maneira a refletir a
relação da notocorda com o ectoderma que a ela se sobrepõe. Tanto as regiões da
cabeça como as do tronco, sofrem variantes da neurulação primária, e esse processo
pode ser dividido em cinco estágios distintos, mas espacialmente e temporalmente se
superpondo estágios (Schoenwolf, 1991a; Catala et al., 1996): (1) a formação da placa
neural, (2) a formação do assoalho da placa neural, (3) a modelagem da placa neural, (4)
o dobramento da placa neural para formar o sulco neural, e (5) o fechamento do sulco
neural para formar o tubo neural.
A formação da placa neural

A formação da placa neural como uma região distinta de outras células ectodérmicas
será discutida em detalhe nos Capítulos 8 e 15. Em geral, considera-se que o mesoder-
ma dorsal subjacente (em colaboração com outras regiões do embrião) sinaliza às
células ectodérmicas acima dela para se desenvolverem em células colunares da placa
neural (Smith e Schoenwolf, 1989; Keller et al., 1992; discussão posterior neste capítu-
lo). Como resultado dessa indução neural, as células da placa neural presuntiva se
distinguem do ectoderma circundante, a qual se transformará em epiderme. As células
da placa neural e as células da epiderme possuem seus próprios movimentos intrínse-
cos (Moury and Schoenwolf, 1995). Se a epiderme ao redor da placa neural é isolada,
as células se movem em direção ao centro (ou seja, em direção à área onde estava a
placa neural). Se a placa neural é isolada, suas células convergem e se estendem para
formar uma placa mais delgada, mas não se fundem para formar um tubo neural. Esses
movimentos da placa neural e da epiderme originam as pregas neurais. Inicialmente, o
ectoderma é “torcido” e logo a epiderme presuntiva começa a recobrir a placa neural.
(Realmente, se a “região de transição” contendo os dois tecidos é isolada, ela formará
pequenas pregas neurais em cultura). Esses movimentos coordenados finalmente
causarão a elevação e o dobramento do tubo neural (veja Figura 7.4; Jacobson e
Moury, 1995; Moury e Schoenwolf, 1995).
Formação do assoalho da placa neural

Anteriormente, considerava-se que somente as células da linha média da placa neural
formavam a placa do assoalho do tubo neural. Ou seja, no fechamento da placa para
formar o tubo neural, suas células mais centrais se localizariam no fundo do tubo. As
partes mais periféricas, as pregas neurais, se tornariam as porções mais dorsais do tubo
neural. Provavelmente é assim que se forma a região da cabeça. Evidência recente,
entretanto, sugere que o assoalho do tubo neural do tronco tem uma outra origem - que
se origina em parte do nódulo de Hensen e é “inserido” no centro da placa neural.
Esse modelo foi proposto por Catala e colaboradores (1995) baseado nos seus
dados e em estudos anteriores de vários laboratórios. Para acompanhar as células
embrionárias individuais do nódulo eles usaram o sistema de quimera galinha-co-
dorna. Embriões de galinha e codorna se desenvolvem de maneira muito semelhante
(especialmente no desenvolvimento precoce), e quando porções do embrião de
codorna são enxertadas em uma região equivalente do embrião de galinha, as célu-
las se integram no embrião e participam da construção dos órgãos adequados. O
enxerto pode ser feito enquanto o embrião ainda está dentro do ovo, e o pinto que
eclode é uma “quimera”, tendo uma porção do seu corpo composta de células de
codorna (Figura 7.5; Le Douarin, 1969; Le Douarin e Teillet, 1973). As células de
galinha e codorna, entretanto, têm duas diferenças críticas. Primeiro, na codorna a
heterocromatina do núcleo está concentrada ao redor dos nucléolos. Isso cria uma
grande massa que se cora intensamente e é facilmente distinta da heterocromatina
difusa da galinha. Segundo, existem alguns antígenos que são específicos para a
(A)
Figura 7.5
Uma quimera galinha-codorna. (A) Duas quimeras galinha-codorna
e uma galinha controle 4 dias após a eclosão. Nas quimeras, o tubo
neural dorsal anterior da codorna substituiu uma região equivalente
da galinha no embrião de 12-somitos. Melanócitos de codorna,
originários da crista neural, migram para as penas da cabeça, ao
nível do enxerto. (B) Uma região do embrião contendo tanto células
de codorna (com sua cromatina altamente condensada) como célu-
las de galinha (com sua cromatina mais difusa). (de Le Douarin et
al., 1996; fotografias, cortesia de N. M. Le Douarin.)
(B)
Célula de
galinha
Célula
de codorna
(A) Somito 6 (B)
Tubo
neural
Somito
Nódulo
de
Hensen
Codorna Galinha
codorna e não são encontrados em células da galinha. Os dois fenômenos permitem

distinguir células individuais de codorna, mesmo quando a população celular é, na
Endoderma
sua maioria, de galinha. dorsal
Esses pesquisadores removeram o nódulo de Hensen e o término caudal da notocor-
da em alongação de embriões de galinha com 6-somitos (1.5 dias) e os substituiram com
seus equivalentes de codorna. Daquele nível até a cauda, tanto a notocorda como a Figura 7.6
placa do assoalho foram compostas de células de codorna. As paredes do tubo neural A placa do assoalho do tubo neural do tronco
foram produzidas da placa neural da galinha (Figura 7.6). É interessante notar que (como da galinha é derivado do nódulo de Hensen.
previsto pela regressão do nódulo, discutida no Capítulo 6) a placa do assoalho e as (A) Esquema da operação pela qual o nódulo
de um embrião de galinha de 6-somitos é subs-
células da notocorda, associadas com a placa neural, se localizavam mais em direção à
tituído pelo seu correspondente de codorna.
cauda do que o próprio nódulo. Portanto, o nódulo de Hensen contém as células neces- (B) Análise do eixo quimérico (marcado com
sárias para a formação da placa do assoalho caudal e da notocorda. antígeno específico para a codorna) mostran-
As células da placa do assoalho se inserem na parte central do ectoderma dorsal e do células de codorna na notocorda (flecha) e
somente mais tarde é que a notocorda se separa da placa do assoalho pela formação placa do assoalho (cabeças de flecha). (B de
de uma membrana basal entre elas (Figura 7.7).* O tubo neural tem duas fontes distin- Catala et al., 1996; fotografia, cortesia de N.
tas - uma ectodérmica e uma do nódulo de Hensen. M. Le Douarin.)
A modelagem e dobramento da placa neural

Forças intrínsecas à placa neural estão envolvidas na sua modelagem. Ao se tornarem
mais colunares, as células provocam um estreitamento da placa neural, mas a modela-
gem mais importante da placa é produzida pelas suas células da linha mediana que se
situam diretamente acima da notocorda. Em aves e mamíferos, essas células da linha
mediana da placa neural são chamadas células do ponto de articulação mediano (MHP)
e são derivadas da placa neural imediatamente anterior ao nódulo de Hensen e da sua
linha média anterior (do nódulo de Hensen) (Schoenwolf, 1991a,b; Catala et al., 1996).
Tanto em anfíbios como amniotas, as células da placa neural sofrem uma extensão
convergente pela intercalação de várias camadas de células no meio de poucas cama-
das (Jacobson e Sater, 1988; Schoenwolf e Alvarez, 1989). Dessa maneira, elas alon-
gam e estreitam a placa neural (veja Figura 7.3c).
O dobramento da placa neural é conseqüência de forças intrínsecas e extrínsecas
às suas células. Na galinha, a placa neural começa a dobrar-se mesmo quando ainda
está sendo modelada. As células MHP ficam ancoradas à notocorda, abaixo delas,
* A idéia de que a notocorda e a placa do assoalho são derivadas da mesma população de células é
de apreciação recente, mas esse fenômeno já havia sido documentado em um famoso livro de
embriologia. O livro Indução embrionária e desenvolvimento de Hans Spemann em 1938 tem uma
ilustração do famoso experimento de enxerto de Spemann e Mangold. Nas páginas 144 e 146 daquele
livro (e reproduzido aqui na Figura 15.12), o enxerto do lábio dorsal do blastóporo é mostrado como
dando origem ao mesoderma dorsal (notocorda e somitos) e à placa do assoalho do tubo neural.
Placa neural
Poço do nódulo de
Hensen
Articulação cordoneural
Figura 7.7
O nódulo de Hensen contribui tanto para a notocorda como para a placa do assoalho neural.
Seção através do nódulo de Hensen no estágio do somito-6, mostrando que esse contribui
para a camada superior das células embrionárias. (de Catala et al., 1996; fotografia, cortesia
de N. M. Le Douarin.)
originando uma articulação em forma de sulco na linha média dorsal. Essas células são
induzidas pela notocorda a diminuir sua altura e adquirir a forma de cunha (van Straaten
et al., 1988; Smith e Schoenwolf, 1989). As células laterais à MHP não sofrem essas
mudanças (Figuras 7.4 e 7.8). Logo após, duas outras regiões de articulações formam
sulcos próximos à conexão da placa neural ao restante do ectoderma. Essas regiões
são chamadas pontos de articulação dorsolateral (DLHPs), e estão ancoradas ao
ectoderma da superfície da prega neural. Essas células aumentam sua altura e adqui-
rem a forma de cunha. Essa transformação (modelagem como cunha) está intimamente
ligada às modificações da forma celular. Nos pontos de articulação dorsolateral, tanto
microtúbulos como microfilamentos estão envolvidos nessas transformações. A
colchicina, um inibidor de polimerização de microtúbulos, inibe o alongamento dessas
células, enquanto citocalasina B, um inibidor da formação de microfilamentos, impede
a constrição apical dessas células impedindo, assim, a formação de cunha (Burnside,
1971, 1973; Karfunkel, 1972; Nagele e Lee, 1980, 1987). Depois da formação inicial de
sulcos, a placa neural se dobra ao redor dessas regiões com articulações. Cada uma
delas age como um eixo que dirige a rotação das células ao seu redor (Smith e
Schoenwolf, 1991).
Enquanto isso, forças extrínsecas também estão em ação. O ectoderma superfícial
do embrião de galinha empurra na direção central do embrião, fornecendo mais uma
força motora para o dobramento da placa neural (veja Figura 7.4 B,C; Alvarez e
Schoenwolf, 1992). Esse movimento da epiderme presuntiva e a ancoragem da placa
neural ao mesoderma subjacente deve ser também importante para assegurar que o
tubo neural se dobre para dentro do embrião e não para fora. Se pequenos pedaços da
placa neural são isolados do resto do embrião (incluindo o mesoderma) eles tendem a
se enrolar para fora (Schoenwolf, 1991a).
Fechamento do tubo neural

O tubo neural se fecha ao se aproximarem os pares de dobras neurais na linha média
dorsal; as dobras aderem umas às outras e as células das duas partes se reúnem. Em
algumas espécies, as células nessa junção formam as células da crista neural. Mas em
aves, as células da crista neural não migram da região dorsal até que o tubo neural
tenha sido fechado naquele local. Em mamíferos, entretanto, as células da crista neural
cranial (que formam as estruturas da face e do pescoço) migram enquanto as dobras
neurais estão se elevando (ou seja, antes do fechamento do tubo), enquanto que na
região da medula espinhal, as células da crista esperam até que o fechamento ocorra
(Nichols, 1981; Erickson e Weston, 1983).
(A)
(B)
(C)
Figura 7.8
Micrografia eletrônica de varredura da formação do tubo neural no embrião de galinha. (A) Sulco
neural rodeado por células mesenquimatosas. (B) Células neuroepiteliais alongadas formam um
tubo, enquanto as células epidérmicas achatadas são trazidas à linha média do embrião. As
células MHP formam uma articulação no fundo do tubo, enquanto as células da placa neural,
ligadas à área basal do ectoderma da superfície formam as regiões de articulações dorsolaterais.
Essas três articulações podem ser vistas como sulcos. (C) A formação do tubo neural é comple-
tada. As células que eram a placa neural estão agora dentro do embrião. A epiderme presuntiva
se localiza acima do tubo, e o tubo neural é ladeado pelos somitos mesodérmicos e no fundo
limitado pela notocorda. (Fotografias, cortesia de K. W. Tosney.)
A formação do tubo neural não ocorre simultaneamente ao longo do ectoderma.

Isso pode ser melhor observado naqueles vertebrados (como aves e mamíferos) cujo
eixo corporal se alonga antes da neurulação. A Figura 7.9 detalha a neurulação em um
embrião de galinha com 24 horas. A neurulação na região cefálica (cabeça) está bas-
tante adiantada, enquanto a região caudal (rabo) do embrião está ainda gastrulando. A
regionalização do tubo neural também ocorre como resultado de mudanças na forma
Figura 7.9 Ectoderma da cabeça Anterior Ectoderma do blastoderma

Estereograma de um embrião de galinha de 24
horas. As porções cefálicas estão terminando Mesênquima
Prega neural
a neurulação enquanto as porções caudais es- Notocorda
tão ainda gastrulando. (de Patten, 1971; de
Espaço Sulco neural
acordo com Huettner, 1949.)
subcefálico Intestino
Celoma extra- Mesoderma extra-
embrionário embrionário
Vitelo
Prega lateral
do corpo Prega neural
Região Placa neural

pericárdica
do celoma Endoderma
Vitelo
aderente ao Porta
endoderma intestinal
anterior
Sulco
Somito
neural
Prega Mesoderma
neural intermediário
Mesoderma
Placa somático
neural
Celoma
Endoderma do Mesoderma
intestino médio esplâncnico
Somito
Divergência
das pregas
Nó de Hensen
neurais
Poço
primitivo
Ilhota Mesoderma
sagüínea
Sulco
Linha primitivo
primitiva
Margem
primitiva
Posterior
do tubo. Na ponta cefálica (onde se formará o cérebro) a parede do tubo é larga e

grossa. Aqui, uma série de inchaços e constrições definirão os vários compartimentos
do cérebro. Na parte caudal à região da cabeça, entretanto, o tubo neural permanece
um simples tubo que se afina em direção à cauda. As duas pontas abertas do tubo
neural são chamadas neuróporo anterior e neuróporo posterior.
O fechamento do tubo neural nos mamíferos, diversamente da galinha, se inicia
em vários locais ao longo do eixo ântero-posterior (Golden e Chernoff, 1993; Van
Allen et al., 1993). Vários defeitos no tubo neural são causados pelo não fechamento
em alguns segmentos (Figura 7.10). Falha no fechamento na região posterior do
tubo neural humano aos 27 dias (ou a ruptura subseqüente do neuróporo posterior
logo em seguida) resulta na condição denominada espinha bífida, cuja severidade
depende de quanto da medula espinhal permanece aberta. Falha no fechamento do
(A) (B) (C) (D) (E)

Prega neural Neuróporo
Ectoderma Crista anterior
Intumescência
pericardíaca da superfície neural
Placódio Intumescência
ótico pericardíaca
Somitos
Tubo neural
Somitos
Borda
cortada do Sulco
âmnio neural Neuróporo
posterior
22 dias 23 dias Normal Anencefalia Espinha bífida
Figura 7.10
Neurulação em embriões humanos. (A) Seções dorsal e transversal de um embrião humano de 22
dias, iniciando a neurulação. Ambos neuróporos, anterior e posterior, estão abertos ao líquido
amniótico. (B) Vista dorsal de um embrião humano em neurulação, um dia depois. A região do
neuróporo anterior está se fechando, enquanto o neuróporo posterior permanece aberto. (C)
Regiões de fechamento do tubo neural postulado por evidência genética (superimposta ao corpo
do recém-nascido). (D) Anencefalia devido a falta de fusão da placa neural na região 2. (E)
Espinha bífida devida a falta de fusão na região 5 (ou pela falta de fechamento do neuróporo mais
posterior). (C-E de acordo com Van Allen et al., 1993.)
tubo neural anterior resulta em uma condição letal, anencefalia. Aqui, o cérebro
anterior permanece em contato com o líquido amniótico e em seguida degenera. O
desenvolvimento do cérebro anterior fetal cessa, e a abóboda do crânio não se
forma. Essas anormalidades não são raras em humanos, pois estão presentes em
aproximadamente um em cada quinhentos nascimentos viáveis. Defeitos de fecha-
mento do tubo neural podem freqüentemente ser identificados durante a gravidez
por vários testes físicos e químicos.
O fechamento do tubo neural humano envolve uma complexa interação entre fato-
res genéticos e ambientais. Certos genes, Pax3, sonic hedgehog e openbrain, são
essenciais para a formação do tubo neural de mamíferos, mas fatores da dieta como
colesterol e ácido fólico parecem ser críticos.* Foi estimado que aproximadamente
50% dos defeitos do tubo neural poderiam ser evitados se as mulheres grávidas
tomassem suplementos de ácido fólico (vitamina B12), e o Serviço de Saúde Pública
dos Estados Unidos da América recomendam que todas as mulheres em idade fértil
tomem 0.4mg diários de folato para reduzir o risco de defeitos do tubo neural durante
a gravidez (Milunsky et al., 1989; Czeizel e Dudas, 1992; CDC, 1992). [ecto1.html]
O tubo neural finalmente forma um cilindro fechado que se separa do ectoderma da
superfície. Considera-se que essa separação é mediada pela expressão de diferentes
moléculas de adesão celular. As células que se tornarão o tubo neural, originalmente
expressam E-caderina, mas elas param de expressar essa proteína ao se formar o tubo
e, em vez disso, sintetizam N-caderina e N-CAM (veja Figura 3.17). Como resultado,
os dois tecidos não aderem mais um ao outro. Se o ectoderma da superfície passar a
expressar N-caderina (injetando mRNA de N-caderina em uma das células do embrião
de Xenopus de duas cabeças), a separação do tubo neural da epiderme presuntiva é
dramaticamente impedida (Detrick et al., 1990; Fujimori et al., 1990).
*Colesterol parece ser necessário para a autoclivagem da proteína Sonic hedgehog. Mutações da
Sonic hedgehog podem impedir o fechamento do tubo neural em camundongos e no homem (Chiang
et al., 1996; Roessler et al., 1996); a porção ativa da Sonic hedgehog é sua região N-terminal. Essa
região é clivada da molécula precursora em uma reação que requer colesterol como um cofator
(Porter et al., 1996). No homem, certas síndromes envolvendo falhas no fechamento do tubo
neural foram relacionadas às mutações na síntese de colesterol (Kelley et al., 1996).
& Especulações
A modelagem dorsoventral do sistema nervoso
E NQUANTO O TUBO NEURAL

está sendo formado, ele está rece-
bendo sinais de dois outros con-
juntos de tecidos. Esses sinais são instru-
Sonic hedgehog. O destino dorsal do
tubo neural é determinado pelas proteí-
nas morfogenéticas do osso, provavel-
mente BMP4 e BMP7. Essas proteínas são
expressas na epiderme dorsal presuntiva
msx1 e Pax3 na porção dorsal do tubo
neural), além de promover a expressão de
outros genes dorsalmente específicos (Fi-
gura 7.11D). O papel dessas proteínas foi
confirmado por experiências in vitro nas
ções para que o tubo neural tenha uma de-
terminada polaridade dorsoventral. O tubo (Figura 7.11B,C) e foi demonstrado que quais tubos neurais isolados foram expos-
neural ventral parece ser modelado pela elas contrariam o efeito da Sonic hedgehog tos a produtores desses sinais (Yamada et
proteína Sonic hedgehog originária da no- (permitindo a expressão de genes como al., 1993; Liem et al., 1995).
tocorda e das células da placa do assoalho
(veja Figura 7.7B; Ericson et al., 1996). Essa (B) Figura 7.11
proteína induz certas células do lado A modelagem dorsoventral do tubo neural.
ventrolateral do tubo neural a expressar (A) Diferenciação de neurônios motores é vis-
genes que as transformam em neurônios ta nos neurônios ventrolaterais; se as células
motores (Figura 7.11A; Prancha 32). Sonic da placa do assoalho ou as células que ex-
hedgehog também funciona reprimindo a pressam o Sonic hedgehog são transferidas
expressão de genes como dorsalin, Pax3 para uma posição lateral, neurônios motores
e msx1 da porção ventral do embrião. Es- também serão formados. (B) BMP4 expres-
ses genes seriam expressos normalmente so na epiderme dorsal presuntiva durante a
ao longo do tubo neural mas são inibidos (C) formação do tubo neural. (C) Expressão de
pelo sinal, ventralmente produzido pela BMP7 enquanto o tubo neural se fecha. (E)
Resumo das interações pela quais Sonic hed-
gehog promove o desenvolvimento de neurô-
nios motores e inibe sinais de dorsalização.
(de Yamada et al., 1993; Liem et al., 1995;
fotografias, cortesia de K.Liem.)
(A) Conjunto secundário de
neurônios motores
(E)
Placa do assoalho Sinais dorsais
ventral doada
(D)
por outro embrião
Inibição dos sinais
dorsais por Sonic
hedgehog
Neurônios
motores
Indução de neurônios
motores ventrolaterais
Placa do assoalho ventral
Neurulação secundária
A neurulação secundária envolve a formação do cordão medular e seu subseqüente
esvaziamento interno formando o tubo neural. Na rã e na galinha, esse tipo de neuru-
lação é geralmente identificado na formação das vértebras lombar e da cauda. Em
ambos os casos, a neurulação secundária pode ser vista como continuação da gastru-
lação. Entretanto, as células do lábio dorsal do blastóporo continuam a crescer
Canal Medula espinhal

Notocorda ependimário Intestino
Te t o Assoalho
Blastocele Placa neural
presuntiva
Notocorda
Movimentos Movimentos de Articulação
involutivos extensão posterior cordoneural
Parede
posterior
Ectoderma Lábio dorsal tardio
(A) (B) (articulação cordoneural) (C)
Ânus Canal neurentérico
Figura 7.12
Movimentos celulares durante a neurulação secundária em Xenopus. (A) Involuçào da mesoder-
ma no estágio de gástrula média.(B) Movimentos do lábio dorsal do blastóporo nos estágios de
gástrula tardia/ gástrula precoce. A involução cessou e ambos, o ectoderma e o mesoderma do
lábio tardio do blastóporo se movem posteriormente. (C) Estágio de girino precoce, onde as
células revestindo o blastóporo formam o canal neurentérico, parte do qual se torna o lúmen do
tubo neural secundário. (de Gont et al., 1993.)
ventralmente, em lugar de involuir para o embrião (Figura 7.12A,B). A região em cres-

cimento, na ponta do lábio, é chamada articulação cordoneural (Pasteels, 1937), e
contém precursores da porção mais posterior da placa neural e a porção posterior da
notocorda. O crescimento dessa região converte a gástrula aproximadamente esférica,
1.2mm de diâmetro, em um girino linear com 9mm de comprimento. A ponta da cauda é
um descendente direto do lábio dorsal do blastóporo, e as células que revestem o
blastóporo formam o canal neurentérico. A parte proximal do canal neurentérico,
funde com o ânus, enquanto que a porção distal se torna o canal ependimário (isto é,
o lúmen do tubo neural) (Figura 7.12C; Gont et al., 1993).
Na galinha, os tecidos localizados posteriomente ao neuróporo recentemente
fechado são chamados de broto da cauda. Como o broto da cauda da rã, essa
estrutura não é uma massa não diferenciada de células. Enxertando pequenas regi-
ões do broto da cauda da codorna no broto da cauda da galinha, Catala e colabora-
dores (1995) mostraram que o broto de cauda precoce, já tem células com um destino
determinado. Exatamente como no Xenopus, existe uma articulação cordoneural, e
essa região contém as células que dividem-se para formar ambas, a notocorda e a
corda medular. Como se dá na rã, essas células se movem posteriomente. O tubo
neural se forma à medida que a corda medular produz pequenas cavidades, que se
fundem umas às outras (Figura 7.13).
Diferenciação do tubo neural

A diferenciação do tubo neural nas várias regiões do sistema nervoso central ocorre
simultaneamente de três maneiras diferentes. Em nível anatômico macro, o tubo neural
e seu lúmen se expandem e se contraem para formar as câmaras do cérebro e a medula
espinhal. A nível de tecido, a população celular da parede do tubo neural se rearranja
para formar as regiões funcionalmente diferentes do cérebro e da medula espinhal.
Finalmente, no nível celular, as próprias células neuroepiteliais se diferenciam em
numerosos tipos de neurônios e células de suporte (gliais) presentes no corpo.
Formação das regiões do cérebro

O desenvolvimento precoce da maioria dos cérebros de vertebrados é parecido, mas
como o cérebro humano é provavelmente a matéria mais organizada do sistema solar e
o órgão mais interessante do reino animal, nos concentraremos no desenvolvimento
daquele que supostamente faz o Homo sábio.
(A) Figura 7.13

Formação do tubo neural secundário no embrião de galinha de 25-somitos. (A) A formação do
cordão medular na ponta mais caudal do broto da cauda da galinha. (B) Cordão medular pouco
mais anterior no broto da cauda. (C) Formação de cavidades do tubo neural e formação da
notocorda. (D) Lumens coalescem para formar o canal central do tubo neural. (de Catala et al.,
1995; fotografias, cortesia de N. M. Le Douarin.)
O tubo neural precoce de mamíferos é uma estrutura reta. Entretanto, mesmo antes
(B) que a porção posterior do tubo se forme, a porção mais anterior está sofrendo mudan-
ças drásticas. Nessa região anterior, o tubo neural se expande em três vesículas primá-
rias (Figura 7.14): cérebro anterior (prosencéfalo), cérebro médio (mesencéfalo) e cére-
bro posterior (rombencéfalo). Quando se fecha a ponta posterior do tubo neural,
dilatações secundárias -as vesículas ópticas- se estendem lateralmente de cada lado
do cérebro anterior em desenvolvimento.
O cérebro anterior se subdivide no telencéfalo anterior e o diencéfalo mais cau-
dal. O telencéfalo formará os hemisférios cerebrais, e o diencéfalo formará o tálamo
e o hipotálamo e também a região que recebe os impulsos neurais da retina. Na
(C) verdade, a própria retina é uma derivação do diencéfalo. O mesencéfalo não se
subdivide e seu lúmen se tornará o aqueduto cerebral. O rombencéfalo se subdividi-
rá em um mielencéfalo posterior e um metencéfalo mais anterior. O mielencéfalo vai
dar origem à medula oblongata (Bulbo), cujos neurônios dão origem aos nervos que
regulam os movimentos respiratórios, gastrointestinais e cardiovasculares. O
metencéfalo dá origem ao cerebelo, a parte do cérebro responsável pela coordena-
Notocorda ção dos movimentos, postura e equilíbrio. O cérebro posterior (rombencéfalo) de-
senvolve um modelo segmentado que especifica os lugares de onde se originam
certos nervos. Alargamentos periódicos chamados rombômeros dividem o
(D)
Figura 7.14
Desenvolvimento precoce do cérebro humano. As três vesículas cerebrais primárias são subdi-
vididas enquanto o desenvolvimento continua. A direita estão os derivados em adultos, forma-
dos pelas paredes e cavidades do cérebro. (De acordo com Moore e Persaud, 1993.)
Derivados Adultos
Lobos olfativos - Cheiro

3 vesículas primárias 5 vesículas primárias Hipocampo - Armazenamento de memória
Cérebro - Associação
Parede Cavidade
Retina - Visão
Telencéfalo Epitálamo - Glândula pineal
Tálamo - Centro de retransmissão para neurônios
Cérebro anterior Diencéfalo
ópticos e auditivos
(Prosencéfalo) Hipotálamo - Temperatura, sono e
regulação respiratória
Cérebro médio Mesencéfalo
(Mesencéfalo) Cérebro médio - Fibras nervosas entre os cérebro
anterior e posterior,
Metencéfalo lobos ópticos e tectum.
Cérebro posterior
(Rombencéfalo) Cerebelo - Coordenação de movimentos
Mielencéfalo musculares complexos
Ponte - Fibras nervosas entre o cérebro e o
cerebelo (somente mamíferos)
Medula - Centro reflexo de atividades

Medula espinhal involuntárias
rombencéfalo em compartimentos menores. Os rombômeros representam “territóri-

os” separados de desenvolvimento onde células de cada rombômero podem se 2
misturar livremente dentro dele, mas não com células de rombômeros adjacentes
(Guthrie e Lumsden, 1991). Além disso, cada rombômero tem um destino de desen-
volvimento diferente. Isso foi extensivamente estudado na galinha, onde os primei-
ros neurônios aparecem nos rombômeros de número par, r2, r4 e r6 (Figura 7.15;
Lumsden e Keynes, 1989). Neurônios dos gânglios r2 formam o quinto nervo cranial 4
(trigêmeo); aqueles do r4 formam o sétimo nervo cranial (facial) e o oitavo
(vestibuloacústico); o nono nervo cranial (glossofaríngeo) nasce do r6. [ecto2.html]
A expansão do cérebro embrionário precoce é notável em sua velocidade, exten-
6
são e no fato de que isso resulta primariamente em um aumento de tamanho de cavida-
de e não de crescimento de tecido. Em embriões de galinha, o volume do cérebro
expande 30 vezes entre os dias 3 e 5 do desenvolvimento. Considera-se que essa
rápida expansão é causada por uma pressão fluida positiva, exercida contra as paredes
do tubo neural pelo fluido no seu interior. Seria de se esperar que essa pressão do
fluido fosse dissipada pela medula espinhal, mas isso parece não acontecer. Na verda- Figura 7.15
de, enquanto as pregas neurais vão fechando a região entre o cérebro presuntivo e a O cérebro posterior (Rombencéfalo) de um em-
medula espinhal, o tecido dorsal circundante empurra para dentro, produzindo uma brião de galinha de 2 dias, aberto para mostrar
constrição no tubo, na base do cérebro (Figura 7.16; Schoenwolf e Desmond, 1984; as paredes laterais. Neurônios foram visuali-
Desmond e Schoenwolf, 1986; Desmond e Field, 1992). Essa oclusão (que também zados pela marcação com anticorpo para pro-
ocorre no embrião humano) efetivamente separa a região cerebral presuntiva da futura teínas de neurofilamentos. Rombômeros 2, 4 e
medula espinhal (Desmond, 1982). Se for removida a pressão do fluido na porção 6 podem ser identificados pela alta densidade
de axônios nesse estágio precoce do desenvol-
anterior de um tubo neural assim ocluído, o cérebro da galinha aumenta a uma veloci-
vimento. (de Lumsden e Keynes, 1989, corte-
dade muito menor e contém um número menor de células, quando comparado com sia de A. keynes.)
embriões controles, normais. A região ocluída do tubo neural abre novamente após a
expansão inicial, rápida, dos ventrículos cerebrais.
(A) (B) (D)
Figura 7.16
Oclusão do tubo neural para permitir a expan-
são da futura região do cérebro. (A) Corante
injetado na porção anterior do tubo neural de
galinha de 3 dias, enche a região do cérebro
mas não passa para a região espinhal. (B,C)
Seção do tubo neural da galinha na base do
cérebro (B) antes da oclusão e (C) durante a
oclusão. (D) A reabertura da oclusão, após au-
mento inicial do cérebro, permite a passagem
do corante da região do cérebro para a da me-
dula espinhal. (Cortesia de M. Desmond.)
& Especulações
Determinando as regiões
do cérebro anterior e cérebro médio
A
identidade ântero-posterior de pode ser crítica na modelagem da região Prosencéfalo Mesencéfalo
cada vesícula do cérebro de mado cérebro anterior. Essa interface Mes/Met
míferos é especificada durante a corresponde a uma zona limitans e é tam- limite
gastrulação pelo mesoderma precordal e bém a fonte de Sonic hedgehog, uma pro-
pela notocorda. Essa especificação pare- teína difusível considerada indutora de
ce ser estabilizada no estágio de placa modelagem durante a gastrulação e for-
neural, por interações a nível do ectoder- mação de membros (Figura 7.18; Rubens-
Meten-
ma. Somente as moléculas principais en- tein e Puelles, 1994).
céfalo
volvidas na especificação dos cérebros Uma das regiões críticas para o de-
anterior e médio serão aqui discutidas; os senvolvimento do cérebro médio é a bor-
detalhes da especificação do cérebro pos- da entre o metencéfalo/mesencéfalo que Rombencéfalo
terior e da medula espinhal pelo gene Hox normalmente dará origem aos tecidos do
serão discutidos no Capítulo 16. istmo. Aqui não se verifica uma fronteira
As regiões dos cérebros anterior e morfológica, mas ela é marcada pela por-
médio são definidas pelo mesoderma ção mais posterior, onde se expressa o
subjacente e pela notocorda anterior. Os gene Otx2. Quando tecido da junção Medula espinhal
genes Lim1 e Otx2 são expressos por mesencéfalo médio e anterior é transplan-
esses tecidos mesodérmicos anteriores. tado ao diencéfalo ou rombencéfalo, ele En (Engrailed) Fgf8 (Fator de
Se um deles não está presente, o embrião induz as células que o rodeiam a desen- Wnt1 crescimento do fibroblasto)
não forma o cérebro anterior ou o médio. volver destinos mesencefálicos (no shh (Sonic
Na parte caudal, em relação ao rombô- diencéfalo) ou cerebelares (no rombencé- hedgehog)
mero 2, os embriões parecem normais (Fi- falo) (Figura 7.19A; Bally-Cuif e Wassef, Figura 7.18
gura 7.17; Acampora et al., 1995; Shawlot Estrutura neuromérica do cérebro com super-
e Behringer, 1995). posição dos hipotéticos eventos indutivos. A
Rubenstein e Puelles (1994) propu- área limite mesencéfalo/metencéfalo é positi-
seram que o cérebro anterior é composto va para a expressão dos genes Fgf8 e Wnt1. A
por seis regiões neuroméricas chamadas borda p2/p3 é considerada a fonte da proteína
prosômeros. Os prosômeros p1-p3 cor- Sonic hedgehog. (de acordo com Bally-Cuif e
respondem ao diencéfalo e os prosôme- Wassef, 1995.)
ros p4-p6 ao hipotálamo (ventralmente)
e ao telencéfalo (dorsalmente). Os limi-
tes prosoméricos coincidem com os limi-
tes de expressão de vários genes que são
considerados importantes na especifica-
ção neural. Eles também são considera- 1994; Marin e Puelles, 1994). Se a junção
dos como limitantes de respostas a cer- for girada pode se dar uma “triplicação”,
tos estímulos externos. A interface p2/p3 pois tecidos em ambos os lados do enxer-
to são induzidos (Figura 7.19B).
Essa região indutora mes/met parece
ser controlada pelo fator de crescimento
Figura 7.17
de fibroblasto 8 (FGF8). Crossley e cole-
Fenótipo sem cabeça de camundongo defici-
ente em Lim1. Dois camundongos com
gas (1996) verificaram que esse tecido for-
“knockout” de Lim1 estão na parte de baixo mador de istmo secreta FGF8. Mais ainda,
da figura; um filhote do tipo selvagem está na quando transplantaram partículas conten-
parte de cima. A maioria dos mutantes Lim1 do FGF8 para o diencéfalo ou o romben-
morrem antes do nascimento. As pinas do ou- céfalo, eles obtiveram duplicadas as mes-
vido (flechas) são as estruturas mais anterio- mas estruturas do cérebro médio. Partícu-
res nesses mutantes. (de Shawlot e Behringer, las controle embebidas em salina não
1995; cortesia dos autores.) mostraram essa duplicação. As partículas
com FGF8 também induziram a expressão deficientes em Wnt1 não possuem a re- Figura 7.19
de três genes nos tecidos circundantes - gião do cérebro médio e nem o cerebelo A região da junção mesencéfalo/metencéfalo
(“mes/met”) pode agir como um indutor do
Wnt1, Engrailed-2 e o próprio Fgf8. Es- (McMahon e Bradley, 1990; Thomas e
desenvolvimento do cérebro médio e da ex-
ses três genes são normalmente expres- Cappecchi, 1990). Wnt1 parece manter a pressão “engrailed” quando rodada ou trans-
sos na região do istmo. Wnt1 e Engrailed expressão do gene Engrailed nas células plantada a outras regiões do cérebro. (A) O
são considerados importantes na forma- precursoras cerebelares, permitindo a sua transplante da junção mes/met induz a expres-
ção do cerebelo. Mesmo que o cerebelo proliferação (Dickinson et al., 1994; são do gene engrailed e das estruturas do cére-
não expresse genes Wnt1, camundongos Danielian e McMahon, 1996). [ecto3.html] bro médio e cerebelo em posições ectópicas.
(B) Rotação da junção mes/met causa “tripli-
cação” de certas estruturas, como o tectum
óptico. Abreviações: gt, griseum tectale; TS,
torus semicircularis: P1, segmento pre-tectal;
(A) P2, segmento talâmico dorsal; cb, cerebelo; ot,
Mesencéfalo Cérebro médio e cerebelo tectum óptico; ist, istmo; III, terceiro nervo
Tectum
cranial ou oculomotor; IV, quarto nervo cranial
Diencéfalo Mes/Met ou troclear. A polaridade postulada é repre-
limite sentada por flechas. (B de acordo com Ru-
benstein e Puelles, 1994.)
Região expressando En
Telencéfalo Metencéfalo
En (Engrailed) Cérebro médio

Wnt1
Fgf8 (Fator de Cerebelo
Rombencéfalo
crescimento do fibroblasto)
Cérebro posterior
(B)
Peça
invertida
Diencéfalo
Mesencéfalo
ist/cb
istmo/
cerebelo Indução Duplicação e polarização
da estrutura relativa ao tecido cerebelar
mesencefálica En mais próximo
Rombencéfalo
Mesencéfalo Mesencéfalo
Diencéfalo
Diencéfalo
Eixo longo
Rombencéfalo Rombencéfalo
Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central

Tecido
Os neurônios do córtex cerebral estão organizados em camadas, cada uma tendo dife-
rentes funções e conexões. O tubo neural original é composto de um neuroepitélio
embrionário, formado por uma única camada de células. Essa população de células
divide-se rapidamente. Sauer (1935) e outros mostraram que essas células estão presen-
tes na parede do tubo neural continuamente, da borda luminal até a borda externa, mas
como seus núcleos estão em diferentes alturas, tem-se a impressão que a parede do tubo
neural é composta por diversas camadas de células. A síntese de DNA (fase S) ocorre
quando o núcleo está na borda externa do tubo, e o núcleo migra luminalmente enquanto
a mitose continua (Figura 7.20). A mitose ocorre no lado luminal da camada celular.
Durante o desenvolvimento precoce de mamíferos, 100% das células do tubo neural
incorporam timidina radioativa ao DNA (Fujita, 1964). Logo em seguida, certas células
não mais incorporam esses precursores de DNA, indicando que não estão mais partici-
pando da síntese de DNA e da mitose. Essas células neurônicas e da glia podem, agora,
se diferenciar na periferia do tubo neural (Fujita, 1966; Jacobson, 1968).
Se células em divisão são marcadas com timidina radioativa em um único estágio
de seu desenvolvimento e seus descendentes são identificados no córtex externo
do cérebro adulto, isso significa que os neurônios tiveram que migrar para sua
posição cortical a partir do neuroepitélio embrionário. Isso acontece quando a célu-
la se divide “verticalmente” em lugar de “horizontalmente”. Nesses casos, a célula
adjacente ao lúmen fica ligada à superfície ventricular, enquanto a outra célula filha
se afasta (Chenn McConnell, 1995). Essa divisão é a ultima do neurônio e é chamada
de “aniversário” do neurônio. Diferentes neurônios e células gliais têm seus aniver-
sários em tempos diferentes. Marcação em diferentes pontos do desenvolvimento
mostra que células com aniversários mais precoces migram distâncias mais curtas.
Células com aniversários mais tardios, migram através dessas camadas para formar
as regiões superficiais do córtex. A diferenciação que se segue depende da posição
que esses neurônios ocupam uma vez fora da região de células em divisão
(Letourneau, 1977; Jacbson, 1991).
Figura 7.20
Seção esquemática do tubo neural de um embrião de galinha, mostrando a posição do núcleo de
uma célula neuroepitelial como função do ciclo celular. Células mitóticas são encontradas próxi-
mo ao centro do tubo neural, adjacente ao lúmen. (B) Micrografia eletrônica de varredura de um
tubo neural de galinha, recém-formado, mostrando células em diferentes estágios do ciclo celular. (B)
(A de acordo com Sauer, 1935; B, cortesia de K. Tosney.)
(A) Estágio do ciclo celular
Lúmen do tubo neural

Placa cortical (CP) Lâmina dissecans (L)

Zona intermediária (I) Zona marginal (M)
Medula espinhal Camada ependimária (E) Camada granular (GL)
Zona ventricular Zona
germinal (V) subventricular (S)
Camada granular Camada das células
externa (EG) de Purkinje (P)
“Camada molecular”
de axônios das
células granulares
Cerebelo
Tubo neural
Camada molecular
Neocórtex
Córtex cerebral
Massa branca
Enquanto as células adjacentes ao lúmen continuam a se dividirem, as células Figura 7.21

migratórias formam uma segunda camada ao redor do tubo neural original. Essa Diferenciação das paredes do tubo neural. Se-
camada se torna progressivamente mais espessa à medida que mais células do ção de um tubo neural humano de 5 semanas,
neuroepitélio embrionário são adicionadas. Essa nova camada é chamada zona do contendo 3 zonas: ependimária, manto e mar-
ginal. Na medula espinhal e no bulbo (linha
manto (ou intermediária) e o epitélio embrionário é agora chamado de zona
superior), o epêndima é a única fonte de neu-
ventricular (e, mais tarde, epêndima) (Figura 7.21). As células da zona do manto se rônios e células gliais. No cerebelo (linha do
diferenciam em neurônios e células gliais. Os neurônios fazem conexões entre si e meio) uma segunda camada mitótica, a cama-
emitem axônios se afastando do lúmen, criando portanto uma zona marginal pobre da granular externa, se forma na região mais
em células. Células gliais cobrem muitos desses axônios da zona marginal com bai- remota do epêndima. Neuroblastos dessa ca-
nhas de mielina, dando-lhes uma aparência esbranquiçada. Assim, a zona do manto, mada migram de volta para a zona intermediá-
contendo os corpos celulares, é freqüentemente referida como massa cinzenta, e a ria para formar as células do grânulo. No córtex
camada marginal, axonal, como massa branca. cerebral (linha inferior), os neuroblastos ou
O esquema básico de três camadas: a ependimária, a do manto e a marginal é glioblastos em migração formam uma placa
cortical contendo seis camadas. (De acordo com
mantido durante todo o desenvolvimento, tanto na medula espinhal como no bulbo. A
Jacobson, 1991.)
massa cinzenta (manto) gradualmente adquire uma estrutura com forma de borboleta
rodeada pela massa branca; ambas são envolvidas por tecido conjuntivo. À medida
que o tubo neural amadurece, um sulco longitudinal -sulcus limitans- aparece para
dividi-lo em duas partes, dorsal e ventral. A porção dorsal recebe estímulos dos
(A) (B) (C) (D)

Epiderme
Sulcus
Região Região
limitans
presuntiva basal presuntiva alar
(E) Gânglio da Figura 7.22

raiz dorsal Desenvolvimento da medula espinhal huma-
na. (A-D) O tubo neural é funcionalmente di-
Neurônio de associação Nervo vidido nas regiões dorsal (alar, A) e ventral
espinhal (basal, B), separadas pelo sulcus limitans.
Raiz dorsal Enquanto os condroblastos da região escleró-
Neurônio
sensorial toma do somito formam as vértebras espinhais,
o tubo neural se diferencia nas zonas ependi-
mária, do manto e marginal, e o teto e o
Neurônio assoalho se tornam distintos. (E) Um segmen-
somático motor to da medula espinhal com suas raízes senso-
riais (alar) e motoras (basal). (De acordo com
Larsen, 1993.)
Camada marginal Camada Camada ependimária

do manto (ventricular)
neurônios sensoriais, enquanto a porção ventral está envolvida na realização de vári-

as funções motoras (Figura 7.22).
Organização do cerebelo
No encéfalo, a migração celular, o crescimento diferencial e a morte celular seletiva
produzem modificações no modelo de três camadas, especialmente no cerebelo e no
cérebro. Alguns neurônios penetram a massa branca para diferenciarem-se em aglo-
merados de neurônios chamados núcleos. Cada núcleo desempenha o papel de uma
unidade funcional, servindo como uma estação de retransmissão entre as camadas
externas do cerebelo e outras partes do encéfalo. Além disso, as células neurônicas
precursoras, em divisão, neuroblastos, migram para a superfície externa do cerebelo
em desenvolvimento, formando uma nova zona embrionária, camada embrionária
externa, próxima ao limite externo do tubo neural. No limite externo da camada embri-
onária externa (na espessura de uma ou duas células), os neuroblastos proliferam. Na
parte interna da camada estão os neuroblastos pós-mitóticos que são os precursores
dos neurônios mais importantes do córtex do cerebelo, as células granulares. Essas
células neuronais pré-granulares migram de volta para a massa branca do cerebelo em
desenvolvimento para produzir células neurônicas granulares em uma região chamada
camada granular interna. Enquanto isso, a camada ependimária original do cerebelo
origina uma grande variedade de neurônios e células gliais, incluindo os notáveis e
grandes neurônios de Purkinje. Cada um deles tem um enorme aparelho dendrítico,
que se espalha como um leque sobre o corpo celular em forma de bulbo. Uma célula
de Purkinje típica pode formar até 100.000 sinapses com outros neurônios, mais do que
qualquer outro neurônio estudado. Cada neurônio de Purkinje também emite um axônio
delgado que se comunica com outras células nos núcleos cerebelares profundos.
O desenvolvimento de uma organização espacial é crítico para o funcionamento
correto do cerebelo. Todos os impulsos regularão a atividade da células de Purkinje,
que são os únicos neurônios que liberam impulsos para fora do córtex cerebelar. Para
que isso aconteça, as células adequadas devem se diferenciar no tempo e local ade-
quados. Como isso acontece?
Um mecanismo considerado importante para posicionar neurônios jovens dentro
de encéfalo de mamíferos em desenvolvimento é o direcionamento glial (Rakic, 1972;
Hatten, 1990). Através do córtex, os neurônios parecem caminhar no “monotrilho da
glia” para seu respectivo destino. No cerebelo, os precursores das células granulares
caminham nos longos prolongamentos da glia de Bergmann (Figura 7.23; Rakic e
Sidman, 1973; Rakic, 1975). A interação neuroglial consiste em uma complexa e fasci-
nante série de eventos, envolvendo reconhecimento recíproco entre a glia e o
neuroblasto (Hatten, 1990; Komuro e Rakic, 1992). O neurônio mantém sua adesão à
célula da glia através de várias proteínas, a mais importante sendo uma proteína de
adesão chamada astrotactina. Se a astrotactina na célula nervosa é mascarada pelo
seu respectivo anticorpo, a célula nervosa não adere ao prolongamento da glia
(Edmondson et al., 1988; Fishell e Hatten, 1991).
A análise de mutações neurológicas no camundongo poderá, em breve, fornecer Figura 7.23
conhecimentos novos sobre os mecanismos de ordenação espacial. Mais de 30 muta- Migração neurônica em prolongamentos gliais.
ções conhecidas afetam o arranjo de neurônios cerebelares. Muitos dos mutantes (A) Diagrama com um neurônio cortical mi-
cerebelares foram encontrados porque o fenótipo de tais mutantes - principalmente a grando em um prolongamento da célula glial.
(B) Micrografia eletrônica da região onde a
inabilidade de manter o equilíbrio ao andar - pode ser facilmente reconhecido. Por
soma do neurônio adere ao prolongamento glial.
razões óbvias essas mutações são identificadas na língua inglesa com nomes como (C) Fotografias seqüenciais de um neurônio
weaver, reeler, staggerer e waltzer. [ecto4.html], [ecto5.html] migrando em um prolongamento de glia
cerebelar. A extremidade anterior do neurônio
apresenta várias extensões filopódicas. Ela
atinge velocidades de 60 µm/hora em sua mi-
gração nos prolongamentos gliais. (A de acor-
do com Rakic, 1975; B de Gregory et al., 1988;
C de Hatten, 1990, cortesia de M. Hatten.)
(B)
(A)
Processo condutor
do neurônio
(C)
Neurônio em
migração
Processo da
célula glial
Organização cerebral
A disposição em três zonas é também modificada no cérebro, que é organizado de

duas maneiras distintas. Primeiro, de maneira análoga ao cerebelo, a organização ver-
tical é feita em camadas que interagem entre si (veja Figura 7.21). Certos neuroblastos
da zona do manto migram na glia através da massa branca para dar origem a uma
segunda zona de neurônios. Essa nova zona de manto é chamada córtex do neopáleo.
Esse córtex se estratifica em seis camadas de corpos celulares e a forma adulta desses
neurônios do neopáleo só se completa na metade da infância. Cada camada do córtex
cerebral é diferente da outra em relação às suas propriedades funcionais, os seus tipos
de neurônios e os conjuntos de conexões que produzem. Por exemplo, neurônios da
camada 4 recebem seu principal estímulo do tálamo (a região que se forma do
diencéfalo), enquanto os neurônios na camada 6 enviam sua maior produção de volta
para o tálamo. Segundo, horizontalmente o córtex cerebral está organizado em mais de
40 regiões que regulam, anatomica e funcionalmente, processos distintos. Por exem-
plo, neurônios da camada cortical 6 do córtex visual projetam axônios para o núcleo
lateral geniculado do tálamo, enquanto neurônios da camada 6 do córtex auditivo
(localizado mais anteriormente que o córtex visual) projetam axônios ao núcleo médio
Figura 7.24 geniculado do tálamo.
“Gradiente invertido” na formação do córtex Nem a organização vertical e nem a horizontal são especificamente clonadas. Na
cerebral no macaco rhesus. Os “aniversários” verdade, existe um grande número de movimentos celulares que misturam a descen-
dos neurônios corticais foram determinados dência de várias células precursoras. Após sua mitose final, a maioria dos neurônios
injetando [3H]-timidina endovenosamente nos recém- gerados migram radialmente, ao longo dos prolongamentos da glia, para fora
animais em determinados tempos de gestação. da zona ventricular (ependimária) e formam a placa cortical abaixo da pia-mater do
Após o nascimento dos animais, verificou-se cérebro. Assim como no córtex cerebelar, os neurônios com os “aniversários” mais
que as células mais fortemente marcadas eram
cedo formam a camada mais próxima do ventrículo. Os neurônios subseqüentes cami-
aquelas que estavam na fase S do seu último
nham distâncias maiores para formar as camadas mais superficiais do córtex. Isso
ciclo de divisão. Essas células migraram para
várias regiões e foram detectadas por auto- forma um gradiente de desenvolvimento “ao avesso” (ou “invertido”) (Figura 7.24;
radiografia de cortes microscópicos. A figura Rakic, 1974). Uma única célula germinativa pode produzir neurônios (e células gliais)
representa a posição desses neurônios indica-
dos no córtex visual. O tempo de gestação no
macaco rhesus é de 165 dias. Os neurônios
mais jovens estão na periferia do tubo neural
(De acordo com Rakic, 1974.)
Injeções de [3H] - timidina
Camadas
corticais
Massa
branca
Camada
ventricular
Dias de gestação Nascimento

(A) [3H]-timidina no dia embrionário 29 (C) (D)
Migração neural
do hospedeiro
Migração
neural do
Porcentagem de neurônios marcados com [3H]-timidina
hospedeiro
Camadas corticais
Camada
intermediária
Massa
branca
Camadas corticais
[3H]-timidina no dia pós-natal 1 Camada

ventricular Célula glial
Destino independente da Destino condicionado ao

célula quando transplantada hospedeiro quando
após última fase S. transplantado na fase S.
Figura 7.25
Determinação de identidade laminar em cérebro de doninha. (A) Precursores neuronais “pre-
coces” (aniversários no dia embrionário 29) migram para a camada 6. (B) Precursores neuronais
“tardios” (aniversários no dia pós-natal 1) migram mais adiante para as camadas 2 e 3. (C)
Quando os precursores precoces (vermelho) são transplantados em zonas ventriculares mais
velhas, após sua última fase S mitótica, os neurônios que eles formam migram para a camada
Massa 6. (D) Se esses precursores são transplantados antes ou durante sua última fase S, seus
branca neurônios migram (com os neurônios do hospedeiro) para a camada 2. (De acordo com
Camadas corticais McConnell e Kaznowski,1991.)
em qualquer das camadas corticais (Walsh e Cepko, 1988). Mas, como é que a célula
reconhece a camada na qual deve entrar? McConnell e Kaznowski (1991) mostraram
que a determinação da identidade laminar (isto é, para qual camada a célula migrará) é
feita durante a divisão celular final. Células transplantadas de cérebros jovens (onde
elas formariam a camada 6) para cérebros mais velhos, cujos neurônios migratórios
estão formando a camada 2 após sua última divisão, mantêm seu destino e migram
somente para a camada 6. Entretanto, se as células são transplantadas antes de sua
divisão final (na metade da fase S), elas não têm destino fixo e podem migrar para a
camada 2 (Figura 7.25). Os destinos de células progenitoras mais velhas são mais
determinados. As células cerebrais corticais progenitoras precoces têm o potencial
para transformarem-se em qualquer neurônio (nas camada 2 ou 6, por exemplo), mas as
células corticais progenitoras tardias dão origem somente a neurônios da camada
superior (camada 2) (Frantz e McConnell, 1996). Ainda não conhecemos a natureza da
informação transmitida à célula ao ser fixado o seu destino.
Nem todos os neurônios migram radialmente. O’Rourke e seus colegas (1992)
marcaram neurônios jovens com corante fluorescente e seguiram sua migração atra-
vés do cérebro. Enquanto mais ou menos 80% dos jovens neurônios migraram radial-
mente em processos gliais, da zona ventricular para a placa cortical, aproximadamente
12% deles migraram lateralmente de uma região funcional do córtex para outra. Essas
observações estão de acordo com aquelas de Walsh e Cepko (1992), que infectaram
células ventriculares com um retrovírus e conseguiram corar essas células e seus
descendentes após o nascimento. Eles descobriram que os descendentes neurais de
uma única célula ventricular estavam dispersos através das regiões funcionais do
córtex. Quando neurônios do córtex do cérebro anterior foram transplantados para a
região que formaria o corpo estriado, essas células adquiriram a morfologia do estriado
(Fishell, 1995). Portanto, a especificação de funções determinadas pelas áreas corticais
ocorre após a neurogênese. Considera-se que chegando a seu destino final, as células
produzem moléculas adesivas específicas que as organizam e as agrupam como núcle-
os cerebrais (Matsunami e Takeichi, 1995).
O cérebro é bastante plástico e o desenvolvimento do córtex neopáleo humano é
particularmente notável a esse respeito. O cérebro humano continua a se desenvolver
na velocidade do desenvolvimento fetal, mesmo após o nascimento (Holt et al., 1975).
Baseado em critérios morfológicos e de comportamento, Portmann (1941, 1945) suge-
riu que, comparada com outros primatas, a gestação humana deveria durar 21 meses
em lugar de 9. Entretanto, nenhuma mulher poderia dar à luz um feto de 21 meses, pois
sua cabeça não passaria pelo canal do parto; assim a espécie humana dá à luz após 9
meses. Montagu (1962) e Gould (1977) sugeriram que durante o primeiro ano de vida,
somos essencialmente fetos extra-uterinos, e eles especulam que a inteligência huma-
na vem da estimulação do sistema nervoso que está se formando durante aquele
primeiro ano.*
Tipos de neurônios
O cérebro humano consiste de mais de 1011 células nervosas (neurônios) associadas
com mais de 1012 células gliais. Aquelas células que permanecem como componentes
integrais do revestimento do tubo neural se transformam em células ependimárias.
Essas células podem dar origem a precursores de neurônios e células gliais. Conside-
ra-se que a diferenciação dessas células precursoras é principalmente determinada
pelo ambiente no qual elas entram (Rakic e Goldman, 1982) e que, em pelo menos
alguns casos, uma determinada célula precursora pode formar ambos, neurônios e
células gliais (Turner e Cepko, 1987). Existe uma grande variedade de tipos de neurô-
nios e células gliais (como fica evidente pela comparação entre uma célula granular
relativamente pequena e o enorme neurônio de Purkinje). As delgadas extensões das
células, usadas para captar impulsos elétricos são chamadas dendritos (Figura 7.26).
Alguns neurônios desenvolvem somente alguns dendritos, enquanto outras células
(como os neurônios de Purkinje) desenvolvem extensas áreas para interações celula-
res. Muito poucos dendritos são encontrados em neurônios corticais no nascimento,
mas uma das coisas maravilhosas, a respeito do primeiro ano de vida do ser humano,
é o aumento do número dessas regiões receptivas nos neurônios corticais. Durante
esse ano, cada neurônio cortical desenvolve um número suficiente de dendritos (ou
superfície dendrítica) para acomodar até 100.000 conexões com outros neurônios. O
neurônio cortical, em média, se conecta com 10.000 outros neurônios. Esse padrão de
conexões neurais (sinapses) permite ao córtex humano funcionar como o centro para
o aprendizado, raciocínio e memória, e a desenvolver a capacidade de expressão sim-
bólica, bem como a produção de respostas a estímulos interpretados.
Outra característica importante de um neurônio em desenvolvimento é seu axônio
(às vezes chamado um neurito). Enquanto os dendritos são freqüentemente numero-
sos e não se extendem muito além do corpo da célula nervosa, ou soma, os axônios
podem se alongar por vários centímetros. Os receptores da dor no dedo grande (hálux)
do pé, por exemplo, precisam transmitir suas mensagens por um longo caminho até a
* Ao contrário do que afirma um filme antiaborto, amplamente divulgado, o córtex cerebral

humano não tem conexões neurônicas na 12a semana de gestação (e, portanto, não pode se mover
em resposta a um pensamento, nem mostrar consciência ou medo). A atividade elétrica mensurável,
característica de células neurais (o padrão do eletroencefalograma, ou EEG) é verificada inicialmen-
te aos 7 meses de gestação. Morowitz e Trefil (1992) sugeriram provocativamente que tendo a
sociedade, nos Estados Unidos, aceito que a definição de morte é a perda do padrão de EEG, talvez
ela devesse aceitar a aquisição do padrão de EEG como o começo da vida humana.
Dendritos Figura 7.26

Diagrama de um neurônio motor. Impulsos recebidos pelos dendritos e o neurônio estimula-
do podem transmitir impulsos elétricos através do axônio (que podem ter 60 a 90 cm de
comprimento) para o tecido alvo. A bainha de mielina que promove o isolamento do axônio
é formada pelas células de Schwann adjacentes. (De acordo com Bloom e Fawcett, 1975.)
RECEPTOR
Cone do
axônio
Segmento
inicial
do axônio Chegada de impulsos
via axônios de outros
neurônios
CONDUTOR Nó de
Ranvier
Impulso
nervoso
Célula de
Schwann
Bainha de mielina
EFETOR
Músculo esquelético
medula espinhal. Um dos conceitos fundamentais da neurobiologia é que o axônio é

uma extensão contínua do corpo da célula nervosa. Na virada do século vinte, várias
teorias competiam para explicar a formação de axônios. Schwann, um dos fundadores
da teoria celular, acreditava que numerosas células neurais se ligavam umas às outras,
em forma de cadeia, para formar um axônio. Hensen, o descobridor do nódulo embrio-
nário, admitia que o axônio se formava ao redor de fibras citoplasmáticas pré-existen-
tes entre as células. Wilhelm His (1886) e Santiago Ramón y Cajal (1890) postularam
que o axônio era, na verdade, uma projeção (apesar de extremamente grande) do corpo
celular (soma). Em 1907, Ross Harrison demonstrou a validade da teoria da projeção
com um elegante experimento que foi a pedra fundamental tanto da ciência do desen-
volvimento neurobiológico como da técnica de cultura de tecidos. Harrison isolou
uma porção de um tubo neural de um girino de rã de 3mm; nesse estágio, logo após o
fechamento do tubo neural, não há uma diferenciação visível dos axônios. Ele colocou
esses neuroblastos em uma gota de linfa de rã sobre uma lamínula e a inverteu sobre
outra lâmina com depressão, de modo a poder observar o que se passava nessa “gota
pendente”. O que Harrison viu foi a emergência de axônios como projeções dos neu-
roblastos, alongando a 56 µm/hora.
Esse prolongamento do nervo é liderado pela ponta do axônio, chamada de cone
de crescimento (Figura 7.27). Esse cone não progride em linha reta, mas vai “abrindo
caminho” ao longo do substrato. O cone de crescimento se move por elongação e
contração de filopódios afilados, chamados microespículas. Essas microespículas
contêm microfilamentos, orientados paralelamente ao eixo longo do axônio (essa é
uma situação similar àquela dos microfilamentos filopódicos das células mesenquima-
tosas secundárias em equinodermos). Tratando os neurônios com citocalasina B, as
microespículas de actina são destruídas, inibindo seu avanço ulterior (Yamada et al.,
1971; Forscher e Smith, 1988). Dentro do próprio axônio, o suporte estrutural é
Microespículas
Cone de crescimento
(A) (B) (C)
Figura 7.27
Microespículas de actina em cones de crescimento de axônios como vistos por (A) microscopia
eletrônica de transmissão, (B) microscopia de contraste da interface diferencial e (C) microscopia
de fluorescência com anticorpos fluorescentes à actina. (A de Letourneau,1979; B e C de
Forscher e Smith, 1988. Todas fotografias, cortesia dos autores.)
fornecido por microtúbulos, e o axônio se retrairá se for colocado em uma solução de

colchicina. Assim, o neurônio em desenvolvimento retém as mesmas cartacterísticas
que foram observadas nas regiões de articulação dorsolateral do tubo neural, a saber,
alongamento por microtúbulos e modificações da forma apical pelos microfilamentos.
Como na maioria das células migratórias, os filopódios exploratórios do axônio aderem
ao substrato e exercem uma força que puxa o resto da célula para frente. Os axônios
não crescerão se o cone de crescimento não conseguir avançar (Lamoureux et al.,
1989). Além da função estrutural na migração de axônios, os filopódios têm também
uma função sensorial. Explorando o ambiente à frente do cone de crescimento, cada
filopódio faz a amostragem dos microambientes e manda sinais de volta para o corpo
da célula (Davenport et al., 1993). Como veremos no Capítulo 8, os filopódios são as
organelas fundamentais envolvidas na determinação do caminho do neurônio.
Neurônios transmitem impulsos elétricos de uma região a outra. Usualmente esses
impulsos vão dos dendritos à soma do nervo, de onde são focalizados nos axônios.
Para impedir a dispersão do sinal elétrico e facilitar a sua condução, o axônio, no
sistema nervoso central é isolado em intervalos por processos que se originam de um
tipo de célula glial chamada oligodendrócito. Um oligodendrócito se enrola ao redor
do axônio em desenvolvimento; produz, então, uma membrana especializada que é rica
em proteína básica mielina e se espirala ao redor do axônio central (Figura 7.28). Essa
membrana especializada é chamada bainha de mielina. (No sistema nervoso periférico,
uma célula glia chamada célula de Schwann realiza essa mielinização.) A bainha de
mielina é essencial para uma adequada função neural, e a desmielinização das fibras
nervosas está associada à convulsões, paralisia e vários outros problemas de saúde,
debilitantes ou mortais. No mutante trembler do camundongo, as células de Schwann
não conseguem produzir um determinado componente protéico da bainha de mielina,
fazendo com que a mielinização do sistema nervoso periférico seja deficiente, mas
normal no sistema nervoso central. Ao contrário, em outro mutante de camundongo,
jimpy, o sistema nervoso central é deficiente em mielina, enquanto o periférico não é
afetado (Sidman et al., 1964; Henry e Sidman, 1988).
O axônio também precisa ser especializado na secreção de neurotransmissores
específicos nos pequenos espaços (fendas sinápticas) que separam o axônio da su-
perfície da célula alvo (soma, dendritos, ou o axônio de um neurônio receptor ou um
Figura 7.28
Mielinação nos sistemas nervosos central e periférico. (A) No
Célula oligodendroglial sistema nervoso periférico, as células de Schwann se enrolam ao
redor do axônio; no sistema nervoso central, a mielinaçào é reali-
zada por prolongamentos de oligodendrócitos. (B) O mecanismo
desse enrolamento leva à produção de um enorme complexo de
membrana. (C) Micrografia de um axônio envolvido pela mem-
Axônio MIELINIZAÇÃO brana de mielina de uma célula de Schwann. (Fotografia cortesia
NO SISTEMA
de C. S. Raine.)
NERVOSO CENTRAL
Nó de Ranvier
Axônio MIELINIZAÇÃO NO
SISTEMA NERVOSO PERIFËRICO
(A) Célula de Schwann
(B) Célula de Schwann
Axônio (C)
sítio receptor em um órgão periférico). Alguns neurônios são capazes de sintetizar e

secretar acetilcolina, enquanto outros desenvolvem vias enzimáticas para sintetizar e
secretar epinefrina, norepinefrina, octopamina, serotonina, ácido γ−aminobutírico,
dopamina, ou algum outro neurotransmissor. Cada neurônio precisa ativar aqueles
genes responsáveis pela produção de enzimas capazes de sintetizar seus
neurotransmissores. Portanto, o desenvolvimento neurônico envolve diferenciação
tanto estrutural como molecular.
Desenvolvimento do olho em vertebrados

O indivíduo conhece seu ambiente pelos seus órgãos sensoriais. Os principais órgãos
do sentido da cabeça se desenvolvem a partir das interações do tubo neural com uma
série de espessamentos epidérmicos chamados de placódios ectodérmicos cranianos.
Os placódios mais anteriores são os dois placódios olfativos que formam os gânglios
dos nervos olfativos, responsáveis pelo sentido do olfato. Os placódios auditivos, da
mesma maneira, se invaginam para formar o labirinto do ouvido interno, cujos neurô-
nios formam o gânglio acústico que nos permite ouvir. Nessa parte, focalizaremos o
olho porque esse órgão, mais que qualquer outro do corpo, precisa se desenvolver
com uma coordenação exata.
Dinâmica do desenvolvimento ótico
A história do desenvolvimento ótico começa na gastrulação, quando o endoderma

involutivo e o mesoderma interagem com o adjacente, prospectivo ectoderma da cabe-
ça. Essa interação induz o ectoderma da cabeça à formação de lentes (cristalino) (Saha
et al., 1989). *Mas, nem todas as partes do ectoderma da cabeça formam os cristalinos,
e o cristalino deve ter uma relação precisa com a retina. A ativação dessa habilidade
* As induções que permitem a formação do olho serão detalhadas no Capítulo 17.

Ectoderma Parede do
Camada
da cabeça cérebro anterior
pigmentada
Vesícula Camada
óptica neural
primária Vesícula
óptica Cristalino
Vesícula
do
Placódio cristalino
do
cristalino
(A) Embrião de 4-mm (B) Embrião de 4.5-mm (C) Embrião de 5-mm (D) Embrião de 7-mm
Figura 7.29
Desenvolvimento do olho de vertebrado. (A)
A vesícula óptica evagina do cérebro e contata latente na formação do cristalino e o posicionamento do cristalino em relação à retina
o ectoderma sobreposto. (B,C) O ectoderma é realizado pela vesícula óptica. No homem, as vesículas ópticas têm início como duas
sobreposto diferencia-se em células do crista- protuberâncias nas paredes laterais do diencéfalo em embriões de 22 dias (Figura
lino enquanto as vesículas ópticas se dobram 7.29). Essas protuberâncias continuam a crescer lateralmente ao tubo neural e estão
sobre si mesmas e os placódios do cristalino ligadas ao diencéfalo por pedúnculos ópticos. Subseqüentemente, quando essas
se tornam vesículas do cristalino. (C) A vesícula vesículas atingem o ectoderma da cabeça, essa se espessa formando o placódio do
óptica se torna a retina neural e pigmentada,
cristalino. A necessidade de um contato íntimo entre as vesículas ópticas e o ectoder-
enquanto o cristalino é internalizado. (D) A
vesícula do cristalino induz o ectoderma so-
ma superficial é comprovada experimentalmente e em certos mutantes. Por exemplo, no
breposto a se tornar córnea. (Ilustrações su- mutante de camundongo, eyeless, as vesículas ópticas não fazem contato com a su-
periores de acordo com Mann, 1964; micro- perfície e a formação do olho cessa (Webster et al., 1984).
grafias A-C de Hilfer e Yang, 1980, cortesia de Uma vez formado, o placódio do cristalino causa, de maneira recíproca, modifica-
S. R. Hilfer; D, cortesia de K. Tosney.) ções na vesícula óptica que sofre uma invaginação formando um cálice óptico de
parede dupla (veja Figura 7.29C). À medida que a invaginação continua, a conexão
entre o cálice óptico e o cérebro é reduzida, tornando-se alongada e estreita. Ao
mesmo tempo, as duas camadas do cálice óptico começam a se diferenciar em direções
diferentes. As células da camada externa produzem pigmentos e finalmente se trans-
formam na retina pigmentada (um dos poucos tecidos, além das células da crista
neural, que podem sintetizar sua própria melanina). As células da camada interna
proliferam rapidamente e dão origem a uma variedade de glia, neurônios ganglionários,
interneurônios e neurônios fotorreceptores sensíveis à luz. Coletivamente, essas cons-
tituem a retina neural. Os axônios das células ganglionares da retina neural se encon-
tram na base do olho e se dirigem para baixo, pelo pedúnculo óptico. O pedúnculo é
então chamado nervo óptico.
Diferenciação da retina neural

Como os córtices cerebral e cerebelar, a retina neural se desenvolve em uma sucessão
de camadas com diferentes tipos de neurônios (Figura 7.30). Essas camadas incluem
as células fotorreceptoras sensíveis à luz e à cor (bastonetes e cones), os corpos
celulares das células ganglionárias e os interneurônios bipolares que transmitem o
Bastonetes e cones
dos fotorreceptores
Corpos celulares
Camada dos fotorreceptores
neuroblástica
externa Camada
plexiforme externa
Camada dos
nervos bipolares
Camada
neuroblástica Camada
interna plexiforme interna
Camada de células ganglionares
Fibras do nervo óptico
Células ganglionares Luz
(A) (B) (C) (D)
estímulo elétrico dos bastonetes e cones às células ganglionárias. Além disso, existem Figura 7.30
numerosas células gliais de Müller que mantêm a integridade da retina, bem como Desenvolvimento da retina humana. Neurô-
neurônios amácrinos (sem grandes axônios) e neurônios horizontais que transmitem nios da retina se distribuem em camadas fun-
impulsos elétricos no plano da retina. cionais durante o desenvolvimento. (A,B)
Separação inicial de neuroblastos dentro da
Nos estágios iniciais do desenvolvimento da retina, a divisão celular de uma cama-
retina. (C) As três camadas de neurônios na
da embrionária e a migração e morte diferencial das células resultantes formam o retina adulta e as camadas sinápticas entre
padrão laminar, estriado, da retina neural. A formação desse tecido altamente estruturado elas. (D) Uma apresentação funcional dos
é um dos problemas mais intensamente estudado em neurobiologia do desenvolvi- principais caminhos dos neurônios na retina.
mento. Mostrou-se que (Turner e Cepko, 1987) uma única célula precursora do A luz atravessa as camadas até ser recebida
neuroblasto retinal pode dar origem a pelo menos três tipos de neurônios ou dois pelos fotorreceptores. Os axônios dos fotorre-
tipos de neurônios e uma célula glia. Essa análise foi feita usando uma técnica enge- ceptores fazem sinapse com neurônios bipo-
nhosa para marcar as células geradas por uma célula precursora específica. Ratos lares que transmitem a despolarização para
recém-nascidos (cujas retinas ainda estão se desenvolvendo) foram injetados, no os neurônios ganglionares. Os axônios das
células ganglionares se reúnem para formar o
fundo do olho, com um vírus que se integra ao seu DNA. Esse vírus continha um gene
nervo óptico que entra no cérebro. (A e B
da β-galactosidase (não presente na retina do rato) que seria expresso somente nas segundo Mann, 1964; fotografia cortesia de
células infectadas. Um mês após a infecção dos ratos, as retinas foram removidas e G. Grunwald.)
coradas para detectar a presença de β-galactosidase. Somente os descendentes das
células infectadas deveriam ser coradas de azul. A Figura 7.31 mostra uma fita de
células derivadas de uma célula precursora infectada. A coloração pode ser vista em
cinco bastonetes, um neurônio bipolar e uma célula glia (Müller).
(A) Figura 7.31

(B)
Determinação da linhagem de uma célula pre-
cursora na retina do rato. (A) Técnica pela
qual um vírus contendo um gene de β-
galactosidase funcional é injetado na parte dor-
Remova a
retina, fixe sal do olho para infectar algumas das células
e core e precursoras da retina. Após um mês ou 6 se-
analise os manas, o olho é removido e a retina é corada
clones para β-galactosidase. (B) Células coradas for-
4-6 semanas
Cristalino mando uma banda através da retina neural, in-
cluindo 5 bastonetes (r), um neurônio bipolar
(bp), um neurônio terminal (t) e células gliais
Retina de Müller (mg). As identidades dessas células
foram confirmadas por microscopia de con-
Epitélio traste Nomarski. (Barra de escala, 20 µm). (de
pigmentado Turner e Cepko, 1987, fotografia cortesia de
D. Turner.)
Muitas células do cérebro anterior expressam um fator de transcricão chamado

Pax6. Essa proteína parece ser especialmente importante para o desenvolvimento da
retina. Na verdade, pode ser um denominador comum para células fotorreceptoras em
todos os filos. O gene Pax6 tem provavelmente muitos papéis, e um deles é determinar
tecidos a se tornarem olhos. Se o gene Pax6 do camundongo é inserido no genoma da
Drosophila e ativado casualmente, olhos se formam nas células onde o Pax6 do
camundongo está sendo expresso (Halder et al., 1995)! Apesar do gene ser também
expresso no cérebro anterior e posterior e em placódios nasais murinos, os olhos
parecem ser os mais sensíveis à sua falta. No homem e no camundongo, heterozigotos
Pax6 têm olhos pequenos, enquanto homozigotos nas mesmas espécies (e na Droso-
phila) não têm olhos (Jordan et al., 1992; Glaser et al., 1994; Quiring et al., 1994). Esse
gene será mais discutido no Capítulo 23.
& Especulações
Porque os bebês não enxergam bem
R ecém-nascidos humanos não

têm boa visão. Devem existir vá-
rias razões para isso, mas a que
mais chama a atenção é a imaturidade dos
basais. A Figura 7.32 destaca as diferen-
ças entre os fotorreceptores em retinas
neonatal e adulta. A retina neonatal tem
receptores fracamente diferenciados, e
mero de fotorreceptores por área da reti-
na também impede bebês de discriminar
dois pontos à distância. Essa pode ser a
razão pela qual os bebês apenas respon-
fotorreceptores da retina. Estudos anatô- aqueles que existem são tão largos que dem a estímulos visuais quando esses são
micos realizados por Yuodelis e Hendrick- poucos cabem em uma dada área. Banks e trazidos próximo às suas faces. O desen-
son (1986) e estudos físicos por Banks e Bennett calcularam que isso causa um volvimento dos fotorreceptores da retina
Bennett (1988) mostraram que os cones decréscimo de absorção de luz na região no homem é um excelente exemplo de di-
fotorreceptores da retina central do recém- central da retina do recém-nascido que é ferenciação que começa cedo no desen-
nascido têm mais de 7.5µm de diâmetro, 350 vezes pior do que a absorção de uma volvimento, mas que não se completa até
que diminui até o valor adulto normal de mesma área no adulto. Esse pequeno nú- anos após o nascimento.
2µm em cerca de 3 anos. Durante esse tem-
po, a densidade em cones nessa região
aumenta de 18 fotorreceptores para 42 por
100 µm, e os fotorreceptores desenvol-
vem tanto seus segmentos externos (que
captam a luz) quanto os seus axonais
Figura 7.32
Desenvolvimento de cones fotorreceptores na
região central da retina humana. Seções de
microscopia de luz foram fotografadas e um
cone em cada retina delineado para clareza. O
epitélio pigmentado (PE), a camada plexiforme (A)
externa (OPL), a glia de Müller (M), e os seg-
mentos externos do fotorreceptor (OS) foram
(B)
marcados. (A) Feto de gestação de 22 semanas.
(B) Neonato 5 dias após o nascimento. (C) Pes-
soa de 72 anos. A flecha aponta para a membra-
na limitante externa, que originalmente serviu
como borda para os axônios da retina. O axônio
delineado em (C) é na realidade mais curto que
o normal, permitindo que a sinapse com o
neurônio bipolar possa ser mostrada na figura.
(C)
A sinapse é formada no pedículo sináptico do
cone (CP). (de Yuodelis e Hendrickson, 1986,
cortesia de A. Hendrickson.)
Diferenciação do cristalino e da córnea
Durante o seu desenvolvimento progressivo em cristalino, o placódio do cristalino se

arredonda e contata o novo ectoderma que o recobre (veja Figura 7.29D). O ectoderma
é então induzido pela vesícula do cristalino a formar a córnea transparente. Aqui,
parâmetros físicos têm um papel importante no desenvolvimento do olho. Pressão de
fluido intraocular é necessária para uma correta curvatura da córnea, de modo que a
luz possa ser focalizada na retina. A importância dessa pressão ocular pode ser de-
monstrada experimentalmente; a córnea não desenvolverá sua curvatura característi-
ca quando um pequeno tubo de vidro for inserido através da parede do olho da
galinha em desenvolvimento, para drenar os fluidos intraoculares (Coulombre, 1956,
1965). A pressão intraocular é sustentada por um anel de ossos esclerais (provavel-
mente derivados da crista neural), que funciona como uma restrição sem elasticidade.
A diferenciação do tecido do cristalino em uma membrana transparente capaz de
dirigir a luz na retina envolve modificações na estrutura e forma celulares, assim como
a síntese de proteínas específicas do cristalino chamadas cristalinas (Figura 7.33). As
cristalinas são sintetizadas enquanto a célula muda de forma, assim, fazendo com que
a vesícula do cristalino se torne o cristalino definitivo. As células da porção interna da
vesícula do cristalino se alongam, e sob a influência da retina neural, produzem as
fibras do cristalino (Piatigorski, 1981). Enquanto as fibras continuam a crescer, elas
sintetizam cristalinas, as quais acabam enchendo a célula, causando a extrusão do
núcleo. As fibras sintetizadoras de cristalinas continuando a crescer e preenchem o
espaço entre as duas camadas da vesícula do cristalino. As células anteriores da
vesícula do cristalino constituem um epitélio embrionário que continua a se dividir.
Essas células em divisão se movem em direção ao equador da vesícula, e ao passar
pela região equatorial elas também começam a se alongar (Figura 7.33D). Assim, o
cristalino contém três regiões: uma zona anterior com células epiteliais em divisão,
uma zona equatorial de elongação celular e uma zona posterior e central de células
fibrosas contendo cristalinas. Esse arranjo persiste ao longo da vida do animal, pois
as fibras são continuamente depositadas. Na galinha adulta, a diferenciação de uma
célula epitelial em uma fibra do cristalino leva 2 anos (Papaconstantinou, 1967).
Figura 7.33
Diferenciação das células do cristalino. (A)
Vesícula do cristalino conforme mostrada na
Figura 7.29. (B) Alongamento das células in-
Cavidade teriores, produzindo fibras do cristalino. (C)
oca da Cristalino cheio de células sintetizando o cris-
vesícula do talino. (D) Novas células do cristalino deriva-
cristalino das do epitélio anterior do cristalino. (E) À
medida que o cristalino cresce, novas fibras
se diferenciam e os núcleos degeneram. (Se-
Epitélio gundo Paton e Craig, 1974.)
do cristalino
(A) (B) Cápsula anterior

Fibras primárias
do cristalino
se alongando
Epitélio
anterior
do cristalino
Região
equatorial
Fibras secundárias
Fibras
do cristalino
primárias
(C) (D) (E)
do cristalino Fibras Cápsula Fibras primárias
secundárias do cristalino posterior do cristalino do cristalino
Diretamente à frente do cristalino, está um tecido muscular pigmentado chamado

íris. Esses músculos controlam o tamanho da pupila (e dá ao indivíduo a cor caracte-
rística de seus olhos). Parte da íris é derivada da camada ectodérmica, o que é diferente
de outros músculos do corpo (que são derivados do mesoderma). Especificamente,
essa região da íris se desenvolve de uma porção do cálice óptico que é contínua com
a retina neural, mas não produz fotorreceptores.
Q A CRISTA NEURAL
A crista neural e seus derivados
Embora derivada do ectoderma, a crista neural é algumas vezes considerada a quarta
camada germinativa devido à sua importância. Tem sido dito, talvez hiperbolicamente,
que “a única coisa interessante a respeito dos vertebrados é a crista neural” (citado
em Thorogood, 1989). As células da crista neural se originam na região mais dorsal do
tubo neural. Experimentos com transplantes, onde uma placa neural de codorna é
enxertada no ectoderma não-neural de galinha, mostram que justapondo esses teci-
dos se induz a formação de células da crista neural e que ambas, as prospectivas placa
neural e a epiderme, contribuem para a crista neural (Selleck e Bronner-Fraser, 1995;
Mancilla e Mayor, 1996). As células da crista migram extensivamente dando origem a
um incrível número de tipos de células diferenciadas. Esses incluem (1) os neurônios
e células gliais dos sistemas nervosos sensorial, simpático e parassimpático, (2) as
células produtoras de epinefrina (medula) da glândula supra-renal, (3) as células
pigmentares da epiderme, e (4) muitos dos componentes dos tecidos esqueléticos e
conjuntivos da cabeça. O destino das células da crista neural depende, na sua maioria,
do lugar para onde elas migram e onde se instalam. A crista neural pode ser dividida em
quatro principais (mas parcialmente sobrepostos) domínios:
• A crista neural cefálica (cabeça), cujas células migram dorsolateralmente para
produzir o mesênquima craniofacial que se diferencia em cartilagem, osso, neu-
rônios cranianos, glia e tecidos conjuntivos da face. Essas células também
entram nas bolsas faríngeas para originar as células do timo, odontoblastos
dos primórdios dos dentes e a cartilagem do ouvido interno e o queixo.
• A crista neural do tronco, cujas células tomam um de dois caminhos princi-
pais. Células da crista neural, que se tornam os melanócitos sintetizadores de
pigmentos, migram dorsolateralmente para o ectoderma, e continuam em seu
caminho em direção à linha média ventral do abdômen. Entretanto, a maioria da
células da crista neural do tronco passa ventrolateralmente através da metade
anterior de cada esclerótomo. (Esclerótomos são blocos de células mesodérmi-
cas que cercam o tubo neural e diferenciam-se na cartilagem vertebral da espi-
nha.) Essas células da crista neural do tronco que permanecem nos esclerótomos
formam os gânglios dorsais da raiz. As células que continuam mais ventral-
mente formam os gânglios simpáticos, a medula da supra-renal e o agrupa-
mento de nervos circundando a aorta.
• A crista neural cervical e sacral, cujas células dão origem aos gânglios
parassimpáticos (entéricos) do intestino (Le Douarin e Teillet, 1973; Pomeranz
et al., 1991). A crista cervical tem posição oposta aos somitos 1-7 da galinha,
enquanto que a crista neural sacral é posterior ao somito 28. A ausência de
migração da célula da crista neural para o cólon resulta na falta de gânglios
entéricos e, portanto, a ausência de movimento peristáltico nessa região.
Isso resulta na obstrução funcional, dilatação e aumento da região acima do
cólon (“megacólon”).
Tabela 7.1 Alguns derivados da crista neural
Derivado Tipo de célula ou estrutura derivados
Sistema nervoso periférico Neurônios, incluindo gânglios sensoriais

(PNS) gânglios simpáticos e parassimpáticos,
e plexos
Células neurogliais
Células de Schwann
Derivados endócrinos e Medula supra-renal

paraendócrinos Células secretoras de calcitonina
Células do tipo I do corpo carotídeo
Células pigmentadas Células epidérmicas pigmentadas
Cartilagem facial e ossos Cartilagem facial e ventral anterior do crânio e ossos
Tecido conjuntivo Endotélio e estroma corneano

Papilas dentais
Derme, músculo liso e tecido adiposo da
pele da cabeça e do pescoço
Tecido conjuntivo das glândulas salivares,
lacrimais, do timo, tireóide e pituitária
Tecido conjuntivo e músculo liso nas
artérias originadas do arco aórtico
Fonte: Segundo Jacobson, 1991, baseado em múltiplas fontes.
• A crista neural cardíaca pode estar localizada entre as cristas cefálica e do

tronco. Existem evidências de que essas células da crista neural estão situadas
desde o primeiro até o terceiro somito de embriões de galinha, sobrepondo-se
à porção vagal anterior da crista neural que se estende do primeiro ao sétimo
somito (Kirby, 1987; Kirby e Waldo, 1990). Essas células da crista neural podem
se desenvolver em melanócitos, neurônios, cartilagem e tecido conjuntivo (do
terceiro, quarto e sexto arcos faríngeos). Além disso, essa região da crista
neural produz a parede total do tecido muscular conjuntivo das grandes artéri-
as ao se originarem do coração, como também contribui para o septo que
separa a circulação pulmonar da aorta (Le Lièvre e Le Douarin, 1975).
A Tabela 7.1 sumariza alguns tipos de células derivadas da crista neural.
A crista neural do tronco

Vias de migração das células da crista neural do tronco
Como mostra a Figura 7.2, a crista neural do tronco é uma estrutura transitória, pois
suas células se dispersam logo após o fechamento do tubo neural. Existem duas vias
principais seguidas pelas células migratórias da crista neural (Figura 7.34).
A VIA DORSOLATERAL. Uma via possível para migração das células da crista neural
do tronco é a via dorsolateral, pela qual os precursores dos melanócitos se movem
pela periferia do embrião através do mesoderma subjacente à derme. Elas penetram no
ectoderma através de minúsculos orifícios na membrana basal (as quais elas podem
produzir) e colonizam a pele e os folículos, onde elas se diferenciam em melanócitos
Epiderme
Tubo neural Caudal
Dermomiótomo
Esclerótomo
Notocorda
Células da Via 2 tomam um
rota dorsolateral entre a epiderme
Aorta Post.
e o dermomiótomo
Ant.
Somito
Rostral
Células da Via 1
viajam ventralmente através
Figura 7.34 do miótomo anterior
Migração das células da crista neural no tron-
co do embrião do pinto. Via 1: As células via-
jam ventralmente através do esclerótomo an-
terior (aquela porção do somito que gera a car-
tilagem vertebral). Aquelas células inicialmen-
te opostas às porções posteriores dos
esclerótomos migram ao longo do tubo neural
até alcançar uma região anterior. Essas células
contribuem para os gânglios simpáticos e
parassimpáticos assim como para as células
da medula supra-renal e os gânglios da raiz (Mayer, 1973; Erickson et al., 1992). Essa via foi demonstrada em uma série de experi-
dorsal. Via 2: Algum tempo depois, células pe- mentos clássicos por Mary Rawles e outros (1948), que transplantaram o tubo neural
netram na rota dorsolateral abaixo do ectoder- e a crista de uma linhagem pigmentada de galinha para o tubo neural de um embrião de
ma. Essas células se tornam melanócitos pro- galinha albina. O resultado foi uma galinha branca com penas coloridas em uma região
dutores de pigmento. específica (Figura 7.35A). A crista neural é responsável pela produção de todas as
células contendo melanina no organismo (com exceção de certos derivados neurais
como a retina pigmentada).
A VIA VENTRAL. Enxertando uma parte do tubo neural e a crista associada de embri-
ões de galinha, radioativos ou geneticamente marcados, em outros embriões, foi pos-
sível identificar outra rota principal de migração das células da crista neural do tronco
(Weston, 1963; Le Douarin e Teillet, 1974), investigadores foram capazes de traçar uma
outra rota maior de migração das células da crista neural (Figura 7.35B,C). Estudos
mais recentes estenderam essas pesquisas usando anticorpos fluorescentes, corantes
vitais, ou células transformadas por vírus para marcar e seguir células individuais da
crista neural até seu destino. As células saindo pela via ventral se tornam neurônios
sensoriais (raiz dorsal) e simpáticos, células adrenomedulares e células de Schwann.
Como pode ser visto na Figura 7.36 e Prancha 19, essas células da crista neural do
tronco migram ventralmente através da porção anterior, mas não da porção posterior
dos esclerótomos (Rickmann et al., 1985; Bronner-Fraser, 1986; Loring e Erickson,
1987; Teillet et al. 1987). Teillet e colaboradores associaram o procedimento com
anticorpos a um transplante de células da crista neural de codornas geneticamente
marcadas, a embriões de galinha. O anticorpo marcador reconhece e marca as células
da crista neural de ambas espécies; o marcador genético permite aos pesquisadores
(A) (B)
Hospedeiro
Doador marcado
radioativamente
Figura 7.35 (C)

Migração das células da crista neural. (A) Pinto resultante do transplante de uma região da crista
neural do tronco de uma linhagem pigmentada de galinhas para uma região da crista neural do
tronco de uma linhagem não-pigmentada. As células da crista que deram origem ao pigmento
foram capazes de migrar para a pele da asa. (B) Técnica de enxerto para o mapeamento de células
da crista neural. Um pedaço de eixo dorsal é excisado de um embrião doador; o tubo neural e a
crista associada são isolados e implantados no embrião hospedeiro, cujo tubo neural e crista
haviam sido excisados. Quando as células da crista do doador são marcadas radioativamente
(com timidina tritiada) ou marcadas geneticamente (de uma espécie ou variedade diferentes),
seus descendentes podem ser detectados no embrião hospedeiro durante o processo do desen-
volvimento. (C) Auto-radiografia mostrando localizações de células da crista neural que migra-
ram da crista neural radioativa doadora para formar melanoblastos (M), gânglios simpáticos
(SG), gânglios da raiz dorsal (DRG) e células gliais (G). (A, fotografia original dos arquivos de
B. Willier; B segundo Weston, 1963; C cortesia de J. Weston.)
distinguir entre células de codorna e galinha. Esses estudos mostram que células da
crista neural, antes opostas à região posterior dos somitos, migram anteriormente ou
posteriormente ao longo do tubo neural penetrando, assim, na região anterior de seus
somitos ou de outros adjacentes. Essas células da crista neural se juntam com outras
que inicialmente estavam opostas à porção anterior dos somitos, e formam a mesma
estrutura. Dessa maneira, cada gânglio da raiz dorsal é composto de três populações
de crista neural: uma da crista neural oposta à porção anterior do somito e uma de cada
lado das regiões de crista neural adjacentes, opostas às porções posteriores dos
somitos. Em regiões específicas do tronco, células da crista migrando pela mesma via,
se agregam para formar gânglios simpáticos e as células secretoras de epinefrina da
medula da supra-renal. A divisão parassimpática do sistema nervoso periférico é tam-
bém formada pelas células da crista neural migrando por essa via, mas somente nas
regiões sacral e cervical do embrião.
A matriz extracelular e a migração da crista neural do tronco
Em qualquer análise de migração (seja de pássaros, borboletas ou células da crista

neural) deve-se fazer três perguntas: Como se inicia a migração? Como os agentes
migratórios conhecem a via a ser percorrida? Quais sinais indicam que o destino foi
alcançado e que a migração deve terminar? Mais ainda, deve -se perguntar se o agente
é competente para responder a esses sinais. Células da crista neural, pré-migratórias,
expressam a proteína Slug, um fator de transcrição. Oligonucleotídeos “antisense”
contra o mRNA do slug impedirão a migração da crista neural, sugerindo que a proteína
Esclerótomo Tubo Slug deve ser necessária para que a célula epitelial imóvel se torne um migrante (Nieto
do somito neural et al., 1994). Outro fator em potencial na iniciação da migração da célula da crista neural
é a molécula de adesão N-caderina. Originalmente na superfície da célula da crista
neural, ela é regulada para decrescer na época da migração celular. Células da crista em
Anterior migração não têm N-caderina em sua superfície, mas começam a expressá-la nova-
mente enquanto se agregam para formar a raiz dorsal e os gânglios simpáticos (Takeichi,
1988; Akitaya e Bronner-Fraser, 1992). Ao mesmo tempo que as células da crista neural
Posterior perdem sua N-caderina e se tornam aptas a migrar como células individuais, a superfí-
cie extracelular que as rodeia se torna mais adesiva (Perris et al., 1990). Parece haver
vias específicas que devem ser seguidas pelas células da crista neural e quando as
Anterior células, ou seus derivados, são colocadas (por transplante ou por injeção) em sua via
normal de migração em um embrião hospedeiro, elas migram ao longo dessa (Bronner-
Fraser e Cohen, 1980; Erickson et al., 1980).
O caminho das células da crista neural é controlado pela matriz extracelular do
Posterior
embrião (Newgreen e Gooday, 1985; Newgreen et al., 1986). Pesquisas sobre o desen-
volvimento de salamandra indicaram que a direção de migração das células da crista
neural é determinada pela matriz extracelular sobre a qual elas migram. Em salamandras
Anterior axolotle existe uma mutação onde há formação da crista neural mas suas células não
migram pela via dorsolateral. Isso pode ser visto facilmente pela falta de células
pigmentadas em todos os lugares, com exceção do topo do tubo neural desses ani-
Posterior mais (Figura 7.37), e essas células finalmente degeneram. Quando cristas neurais do
tipo selvagem são transplantadas para embriões mutantes, as células da crista são
incapazes de migrar. Entretanto, quando cristas de embriões mutantes são transplan-
tadas em embriões selvagens, suas células migram normalmente (Spieth e keller, 1984).
Figura 7.36 Assim, o defeito nesse mutante está no ambiente em que as células encontram e não
Migração de células da crista neural. Fotomi- nas próprias células. (A estrada é deficiente mas não o veículo.) Löfberg e colaborado-
crografias de fluorescência de seções longitu- res (1989) usaram essa informação para mostrar que a matriz extracelular contém com-
dinais de um embrião de pinto de dois dias, postos que são críticos na regulação da migração das células da crista neural. Eles
marcadas com anticorpo HNK-1, que reco- adsorveram, em microtransportadores da membrana, a matriz extracelular da região
nhece seletivamente as células da crista neural. subepidérmica da pele (através da qual migrariam as células da crista neural formado-
Extensa marcação é vista na metade anterior,
ras de pigmentos). Os microtransportadores foram então colocados junto às cristas
porém, não na posterior do esclerótomo. (de
neurais de embriões mutantes e do tipo selvagem, pouco antes do momento quando
Bronner-Fraser, 1986, cortesia de M.
Bronner-Fraser.) ocorreria a migração. Os microtransportadores sozinhos não estimularam a migração
em nenhum dos dois embriões. Os microtransportadores contendo matriz extracelular
de mutantes também não estimularam migração primativa de células da crista neural
em nenhum dos embriões. Entretanto, aqueles transportadores contendo a matriz
extracelular do tipo selvagem estimularam a migração de células da crista neural tanto
no embrião mutante como no selvagem, demonstrando assim a importância da matriz
extracelular na migração de células da crista neural.
Uma situação semelhante se dá em embriões de galinha, pois o transplante de
diferentes regiões do mesoderma para a área adjacente à crista neural pode produzir
diferentes modelos de migração (Goldstein et al., 1990; Bronner-Fraser e Stern, 1991).
As regiões que permitem migração de células da crista neural são determinadas no
mesoderma antes que ocorra a migração.
Mas quais são as moléculas que permitem ou impedem a migração de células da
crista neural? A matriz extracelular que suporta essa migração é uma mistura rica em
moléculas como fibronectina, laminina, tenascina, várias moléculas de colágeno e
proteoglicanos. Experimentos programados para estudar esse aspecto devem ser
cuidadosamente planejados, pois as células da crista neural podem ter necessidades
de migração diferentes em diferentes espécies e mesmo em diferentes partes do mes-
mo embrião. Uma solução é preparar anticorpos contra moléculas das regiões da
matriz extracelular às quais as células se ligam. Quando esses anticorpos são injetados
no embrião, bloqueando as regiões da matriz, verifica-se alguma perturbação na migra-
ção das células da crista neural? A migração das células da crista neural craniana de
galinha pode ser severamente alterada quando são injetados, no embrião em desen-
(A) (B)
(C) (D)
Figura 7.37
Deficiência na migração das células da crista neural no mutante d/d do axolotle. (A) As
larvas de axolotles do tipo selvagem são caracterizadas por células pigmentadas por todo o
corpo exceto nas porções mais ventrais. (B) No mutante d/d, as células pigmentadas deri-
vadas da crista neural formam uma estria ao longo da linha mediana dorsal da larva. (C,D)
Micrografias eletrônicas de varredura da crista neural embrionária mostram que (C) as
células da crista dos embriões de tipo selvagem migram sobre o tubo neural para o interior
dos somitos, enquanto (D) aquelas do mutante permanecem sobre o tubo neural. (de Löfberg
et al., 1989, cortesia dos autores.)
volvimento, anticorpos à fibronectina, a receptores de fibronectina, tenascina, ou ao

proteoglicano laminina-heparan sulfato (Poole e Thiery, 1986; Perris e Bronner-Fraser,
1989). Entretanto, esses anticorpos não alteram significativamente a migração de célu-
las da crista neural do tronco na galinha.
No momento, existem dois candidatos principais para o papel de moléculas
modeladoras das células da crista neural do tronco. Uma delas é o receptor de aglutinina
do amendoim, um composto que liga resíduos específicos de carboidratos de glicopro-
teínas. Quando troncos de embrião de galinha são tratados com aglutinina de amendo-
im, as células da crista neural migram na mesma velocidade, tanto para a metade caudal
como para a ventral dos somitos (Krull et al., 1995). A outra molécula é uma tirosina
quinase receptora relacionada à Eph. Essas moléculas são capazes de guiar os axônios
(veja Capítulo 8) e sua expressão está ligada aos rombômeros do cérebro posterior que
excluem as células da crista neural (Irving et al., 1996; Weinstein et al., 1996).
Em 1963, Weston sugeriu que não eram necessárias moléculas específicas para
sinalizar a via de migração das células da crista neural do tronco; na verdade, essas
células seriam capazes de usar qualquer espaço livre para sua migração, desde que
essa não fosse ativamente inibida. Ele girou a crista neural, de modo a colocá-la na
parte de baixo do tubo neural e notou que quando as células emergiam da região
ventral do tubo, elas migravam na direção ventro-dorsal (o inverso da migração normal)
através da metade anterior do esclerótomo. Assim, parece não haver um direcionamento
inerente à migração de células da crista. As células vão para onde há lugar para elas.
Tanto barreiras químicas como físicas podem criar os modelos de migração das células
da crista neural.
& Especulações
Análise das mutações que afetam o

desenvolvimento das células da crista neural
A S PROPRIEDADES MIGRATÓ-
RIAS e a diferenciação das célu-
las da crista neural também estão
sendo estudadas levando em considera-
ção mutações que prejudicam uma ou mais
Lethal-spotting e Piebald-lethal.
Nessas mutações, a deficiência é de
endotelina-3 e seu receptor, o receptor de
endotelina-B. Endotelina-3 é um fator de
crescimento que estimula a proliferação
homem, essa condição é chamada doen-
ça de Hirschsprung. A ausência de
endotelina-3 dá origem ao padrão de man-
chas dos melanócitos e, também, a falta
de gânglios no intestino (Baynish et al.,
linhagens de células da crista neural. As de células como as da crista neural, e é 1994; Hosoda et al., 1994; Puffenberger et
mutações incluem as seguintes: critico para o desenvolvimento de mela- al., 1994; Lahav et al., 1996).
nócitos e neurônios entéricos que cau-
White-spotting. As células da crista sam o peristaltismo no trato digestivo. A Ret e GDNF. Como o receptor de
neural desses camundongos não têm c- ausência homozigótica de genes para o endotelina-B, o receptor tirosina quinase Ret
kit tirosina quinase receptor funcional. A receptor de endotelina-B produz o mega- é necessário para a diferenciação dos neu-
condicão homozigótica é geralmente letal cólon, a distensão do intestino grosso rônios entéricos. Os camundongos que não
mas os heterozigotos sobrevivem e po- devido a impossibilidade de evacuar. No apresentam o receptor não têm neurônios
dem ser reconhecidos pelas manchas sem entéricos nem rins (a importância de Ret para
pigmentos em seu pêlo. No homem, os o desenvolvimento do rim será discutida no
heterozigotos têm um fenótipo com man- Capítulo 17). No homem, a perda de um dos
chas brancas e escuras. onde regiões do genes ret pode produzir outra forma de do-
cabelo e da pele são brancas, por não te- ença de Hirschsprung- um megacólon
rem melanócitos (Spritz et al., 1992). gangliônico (Edery, 1994; Romeo et al., 1994).
O ligante para a proteína Ret parece ser o
Steel. Esses camundongos não têm o fator de crescimento derivado da glia, GDNF
fator da célula germinativa, o ligante para (Pichel et al., 1996). Camundongos sem as
a proteína quinase c-kit. Esse fator é proteínas GDNF também não têm rins nem
secretado por tecidos ao longo da rota de neurônios entéricos.
migração e é usado pelas células migrató-
rias da crista neural, além de estimular a Microphthalmia. Esses camundongos
divisão celular. A condição do homozigo- não têm um fator de transcrição determina-
to é letal na maioria dos casos, e o hetero- do, levando à surdez e deficiências melano-
zigoto tem uma pelagem de cor cinza cíticas. A condição heterozigótica humana
esmaecida (veja White, 1990). induz a síndrome de Waardenburg (tipo II)
(Hemesath et al., 1994; Steingrimsson et al.,
Splotch. Os camundongos não têm o 1994; Tassbehji et al., 1994).
fator de transcrição Pax3. Como já men-
cionado, essa proteína é expressa na re- Silky. Essa mutação na galinha envol-
gião dorsal do tubo neural. Camundon- ve a via da pigmentação. Em adição a um
gos homozigotos para esse gene têm de- fenótipo onde o adulto retém as penas
feitos no fechamento do tubo neural e macias de sua juventude, os órgãos inter-
Figura 7.38
nas estruturas derivadas das células da Superfície ventral de um camundongo heterozi- nos são pigmentados pela migração e pro-
crista neural, especialmente gânglios gótico para a mutação White. O camundongo liferação de melanócitos. Em contraste, as
cranianos e nervos (Figura 7.38). O tem números reduzidos de células sangüíneas, penas permanecem brancas. Estudos com
heterozigoto tem regiões de pigmenta- células germinativas e melanócitos. A mancha transplantes (Hallet e Ferrand, 1984) mos-
ção e outras sem pigmento. No homem, a branca no ventre é característica de heterozigo- traram que esse defeito não é devido aos
condição heterozigótica é conhecida tos, pois esses não têm melanócitos suficientes precursores dos melanócitos, mas sim de-
como síndrome de Waardenburg (tipo I) para circundar o camundongo. Animais White vido ao ambiente para onde migram as
(Tremblay et al., 1995). viáveis não têm pigmento no tronco. células da crista neural. [ecto6.html]
A potência de desenvolvimento das células da crista neural do tronco
EVIDÊNCIA INDICANDO PLURIPOTÊNCIA DAS CÉLULAS DA CRISTA NEURAL

DO TRONCO. Uma das características mais notáveis das células da crista neural é
sua pluripotencialidade. Uma única célula da crista neural pode se diferenciar em
vários tipos diferentes de células, dependendo de sua localização no embrião. Por
exemplo, os neurônios parassimpáticos, formados pelas células da crista neural cervical
(pescoço) (opostas aos somitos 1-7) produzem tanto a acetilcolina como seu neuro-
transmissor; são portanto neurônios colinérgicos. Os neurônios simpáticos forma-
dos pelas células da crista neural torácica produzem norepinefrina; esses são os neu-
rônios adrenérgicos. Mas, quando cristas neurais cervicais e torácicas da galinha são
reciprocamente transplantadas, a crista torácica original produz os neurônios
colinérgicos dos gânglios parassimpáticos, e a crista cervical original forma neurônios
adrenérgicos nos gânglios simpáticos (Le Douarin et al., 1975). Kahn e colaboradores
(1980) mostraram que células da crista neural do tronco, pré-migratórias, tanto da
região cervical como da torácica, têm enzimas para sintetizar tanto acetilcolina como
norepinefrina. Dessa maneira, células da crista torácica são capazes de desenvolve-
rem-se em neurônios colinérgicos quando são colocadas no pescoço, e as células da
crista cervical podem se tornar neurônios adrenérgicos se colocadas no tronco.
A pluripotência de algumas células da crista neural é de tal ordem, que regiões da
crista que nunca produzem nervos em embriões normais podem fazê-lo em certas
condições. Células da crista neural mesencefálica normalmente migram para o olho e
interagem com a retina pigmentada, se diferenciando nas células da esclerótica (Noden,
1978). Entretanto, se essa região da crista neural é transplantada para a região do
tronco, pode formar neurônios dos gânglios sensoriais, células adrenomedulares,
gliais e células de Schwann (Schweizer et al., 1983).
As pesquisas citadas estudaram o potencial de populações de células. Ainda não
está claro se a maioria das células que deixam a crista neural são pluripotentes ou se a
maioria já teve seu destino restrito a certas funções. Bronner- Fraser e Fraser (1988,
1989) mostraram que algumas, se não a maioria das células individuais da crista neural,
são pluripotentes ao deixar a crista. Eles injetaram moléculas de dextrano fluorescente
em células individuais da crista neural, enquanto as células ainda estavam acima do
tubo neural e verificaram em que tipos de células elas se diferenciaram, após a migra-
ção. A progênie de uma única célula da crista neural podia se transformar em neurôni-
os sensoriais, células pigmentares, células adrenomedulares e gliais (Figura 7.39).
Além disso, verificaram que marcando células individuais da crista do tronco enquan-
to migravam ventralmente pelo embrião, a marcação podia ser encontrada mais tarde
em vários tipos de células, incluindo neurônios sensoriais, neurônios simpáticos e
células de Schawnn. Em mamíferos, a célula da crista neural é também vista como uma
célula germinativa que pode dar origem a outras células multipotentes da crista neural.
Entretanto, se algumas das células migratórias da crista neural são pluripotentes ou-
tras têm destinos mais restritos (Stemple e Anderson, 1992).
EVIDÊNCIAS INDICANDO POTÊNCIA RESTRITA DE CÉLULAS DA CRISTA

NEURAL DO TRONCO. Até na época de emigração, algumas células da crista neural
podem estar mais determinadas do que outras. Também, a potência se torna mais
restrita à medida que a célula envelhece. Células da crista neural do tronco na galinha
que migram mais cedo podem formar uma ampla variedade de derivados, incluindo
células pigmentares, neurônios e células adrenérgicas. Células migrando mais tarde,
na sua maioria, se tornam melanócitos (Serbedzija et al., 1989; Artinger e Bronner-
fraser, 1992). Realmente, as emigrantes tardias da crista neural parecem já estar desti-
nadas a se tornarem melanócitos antes de entrarem na via dorsolateral (Erickson e
Goins, 1995). Existe evidência de que alguma restrição de potência pode ser identificada
mesmo em algumas células emigrantes precoces. Vários pesquisadores (veja Sieber-
Blum e Sieber, 1984; Stocker et al., 1991; Weston, 1991) verificaram que um número
Figura 7.39 Injeção Injeção Resultados Resultados

Pluripotência das células da crista neural do Caso 1 Caso 2 Caso 1 Caso 2
tronco. Uma única célula da crista neural é in-
Melanócitos
jetada com uma molécula de dextrano altamen- Dextrano
te fluorescente. A descendência dessa célula fluorescente Gânglios da
Crista neural
irá, cada uma, receber algumas dessas molécu- raiz dorsal
las fluorescentes. (A) Injeção de dextrano flu- Células de Schwann
orescente pouco antes da migração das células da raiz ventral
da crista neural ser iniciada. (B) Após dois
dias, tecidos derivados da crista contêm célu- Gânglios
las marcadas, descendentes do precursor que simpáticos
foi injetado. A figura resume dados de dois Aorta
experimentos diferentes (caso 1 e caso 2). (Se- Medula supra-renal
gundo Lumsden, 1988).
(A) (B)
significante de células da crista neural formam clones contendo relativamente poucos

tipos de células. Além disso, estudos com transplantes por Le Douarin e Smith (1988)
sugerem que muitas células derivadas da crista neural que formam os neurônios sen-
soriais dos gânglios da raiz dorsal, são incapazes de formar os neurônios autonômicos
dos gânglios sensoriais, e vice-versa. Esses estudos sugerem que algumas das célu-
las da crista neural já têm uma potencialidade restrita ao iniciar a migração. Dois tipos
de células da crista neural que teriam papéis pré-determinados seriam o precursor do
melanócito-célula de Schwann (Nichols e Weston, 1977; Ciment, 1990), e um precursor
simpatoadrenal que pode originar somente gânglios simpáticos e células
adrenomedulares (Landis e Patterson, 1981; Anderson e Axel, 1986).
O mecanismo para o sucesso diferencial dessas células pré-determinadas pode
envolver diferentes fatores de crescimento. Os precursores determinados dos neurô-
nios ganglionares da raiz dorsal parecem necessitar de um fator neurotrófico derivado
do cérebro (BDNF), um fator de crescimento produzido pelo próprio tubo neural. Se
uma membrana fina impermeável for colocada entre o tubo neural e a futura região do
gânglio da raiz dorsal, os gânglios não se formarão. Aquelas células da crista neural
que continuaram sua migração ventral para as regiões dos gânglios do simpático,
conseguiram sobreviver. A inibição na produção de gânglios da raiz dorsal pode ser
revertida revestindo a barreira com um extrato de tubo neural ou com BDNF (Kalcheim
et al., 1987; Sieber-Blum, 1991). Essa conclusão é fortalecida pela observação de que o
gene BDNF enfraquecido em embriões de camundongo provoca o desaparecimento
dos gânglios da raiz dorsal e dos neurônios sensoriais dos placódios, mas não afeta
os neurônios motores (Ernfors et al., 1994; Jones et al., 1994). As células da crista
neural determinadas a formar gânglios simpáticos não necessitam do fator de cresci-
mento para sobreviver. Na verdade, sua diferenciação parece ser estimulada pelo fator
de crescimento básico dos fibroblastos e o fator neurotrófico derivado da glia (Kalcheim
e Neufeld, 1990; Maxwell et al., 1996).
Diferenciação final das células da crista neural
A diferenciação final das células autonômicas da crista neural é principalmente deter-

minada pelo ambiente no qual as células se desenvolvem. A diferenciação não envol-
ve a morte seletiva daquelas células já determinadas a secretar outro tipo de neuro-
transmissor (Coulombe e Bronner-Fraser, 1987). As células do coração, por exemplo,
secretam uma proteína, fator de inibição da leucemia (LIF), que pode converter neurô-
nios adrenérgicos do simpático em neurônios colinérgicos, sem mudar sua sobrevi-
vência ou crescimento (Chun e Patterson, 1977; Fukada, 1980; Yamamori et al., 1989).
Figura 7.40
Diferenciação final de uma célula da crista
neural destinada a ser uma célula adrenome-
NGF
dular (cromafim) ou um neurônio simpático.
Incapacidade de Neurônio Glicocorticóides parecem agir em dois luga-
Célula NGF responder a
GF simpático res. Primeiro, inibindo as ações daqueles fa-
bF competente glicocorticóides
tores que promovem a diferenciação neural;
segundo, induzindo as enzimas característi-
cas das células adrenais. As células expostas
Gl seqüencialmente ao fator de crescimento fi-
ico
Célula co broblástico básico (bFGF) e ao fator de cres-
Célula rtic
pluripotente óid cimento nervoso (NGF) se diferenciam em
precursora es
da crista bipotente neurônios simpáticos.
neural Glicocorticóides
Inibição da
diferenciação
neural Promoção
Célula de enzimas Célula cromafim
precursora cromafim (adrenomedular)
cromafim especificas
Analogamente, a proteína morfogenética do osso 2 (BMP2), uma proteína secretada

pelo coração, pulmão e aorta dorsal, influencia células da crista neural do rato a dife-
renciarem-se em neurônios colinérgicos. Esses neurônios formam os gânglios simpá-
ticos na região desses órgãos (Shah et al., 1996). Enquanto BMP2 pode induzir essas
células da crista neural a se tornarem neurônios, o fator de crescimento da glia (GGF;
neuregulina) suprime a diferenciação neurônica e dirige o desenvolvimento para des-
tinos gliais (Shah et al., 1994). É possível que outro fator parácrino, endotelina-3,
estimule a produção de melanócitos (Lahav et al., 1996).
Assim, parece que o destino de uma célula determinada da crista neural pode ser
dirigido pelo ambiente tissular no qual ela se estabelece. As células da crista neural do
tronco da galinha que migram para a região destinada a se tornar a medula da supra-
renal podem se diferenciar em duas direções. A presença da proteína morfogenética
do osso 7 (BMP7) pode induzir essas células a se tornarem produtoras de epinefrina
(Varley et al., 1995). Essas células usualmente se diferenciam em neurônios
noradrenérgicos do simpático. Entretanto, se essas células da crista neural recebem
glicocorticóides, como aqueles produzidos pelas células corticais da glândula supra-
renal, elas se diferenciam em células adrenomedulares (Figura 7.40; Anderson e Axel,
1986; Vogel e Weston, 1990). O tipo de matriz é importante na diferenciação das células
da crista neural da salamandra. Se células da crista de axolotle são cultivadas em
matrizes de regiões subepidérmicas (onde estão as células pigmentares), elas se tor-
nam melanócitos. Entretanto, se as mesmas células da crista são cultivadas em matri-
zes da região dos gânglios da raiz dorsal, elas desenvolvem um fenótipo neuronal
(Perris et al., 1988).
A crista neural cefálica

Vias migratórias das células da crista neural cefálica
O “rosto” é principalmente o produto da crista neural cefálica (cranial), e a evolução

dos maxilares, dentes, cartilagem facial resulta de mudanças na colocação dessas
células (veja Capítulo 23). Como já mencionado, o cérebro posterior é segmentado
ao longo do eixo ântero-posterior em rombômeros. As células da crista neural cefálica
da galinha migram de acordo com sua origem rombomérica e existem três vias princi-
pais usadas por essas células migratórias (Figura 7.41; Lumsden e Guthrie, 1991). Na
(A) Pregas Células migratórias (B)

neurais da crista neural s
ero
ôm
mb
Ro
Tubo
neural
Gânglios IX, X
Bolsa faríngea III
da crista neural
Gânglios Bolsa faríngea II

VII e VIII
Primeiro arco faríngeo
(C) (D)
Bolsa faríngea
da crista neural
Cartilagem
facial
e
Tubo neural
Martelo Bigorna Tronco arterial
Cartilagem Estribo Bulbus cordis

de Meckel Processo
estilóide Aorta descendente
Osso hióide
Artéria vitelínica
Cartilagem tireóide
Cartilagem cricóide
Artéria
Anéis traqueais umbilical
Figura 7.41
Migração de células da crista neural na cabeça de mamíferos. (A) Micrografia de varredura
eletrônica de um embrião de rato com parte de seu ectoderma lateral removido da superfície.
A migração da crista neural pode ser vista sobre o mesencéfalo, e a migração da coluna de
células da crista neural migrando para o futuro arco faríngeo é evidente. (B) A análise da
migração de células cranianas da crista neural de rombômeros 4-6 no camundongo sugere que
há uma migração maior para os arcos faríngeos e uma migração menor para formação de
gânglios dos nervos cranianos. (C) Estruturas formadoras na face humana pelas células ecto-
mesenquimatosas da crista neural. Os elementos cartilaginosos das bolsas faríngeas estão
indicados por cores, e a região pontilhada indica o esqueleto facial produzido pelas regiões
anteriores da crista cefálica. (D) Formação do septo tronco-conal (entre a aorta e a veia
pulmonar) das células da crista neural cardíaca. Células da crista do cérebro posterior humano
migram para os arcos faríngeos 4 e 6 durante a quinta semana da gestação e entram no tronco
arterial para gerar os septos. (A de Tan e Morriss-Kay, 1985, cortesia de S.-S. Tan; B, segundo
Sechrist et al. 1993; D segundo Kirby e Waldo, 1990.)
primeira, células do rombômero 2 migram para a primeira bolsa faríngea (mandibular) e

também geram o gânglio do nervo trigêmeo. Elas também são levadas pela epiderme
em expansão a formar o processo naso-frontal (anterior). Na segunda via, células do
rombômero 4 populam a segunda bolsa faríngea (formando a cartilagem hióide do
pescoço) e também produzem os gânglios para os nervos geniculado e o vestíbulo-
acústico. Na terceira via, células do rombômero 6 migram para a terceira e quarta
bolsas faríngeas para formar as glândulas timo, paratireóide e tireóide, como também
os gânglios dos nervos vago e glossofaríngeo. Se a crista neural é removida dessas
regiões incluindo o rombômero 6, o timo, as glândulas paratiróide e a tireóide não se
formam (Bockman e Kirby, 1984). As células da crista neural dos rombômeros 3 e 5 não
migram através do mesoderma que os envolve, mas sofrem morte celular apoptótica
ou entram nas correntes de células da crista em cada um de seus lados (Graham et al.,
1993; Sechrist et al., 1993; Graham et al., 1994).
Em embriões de mamíferos, células da crista neural cranial migram antes que o
tubo neural se feche (Tan e Morriss-Kay, 1985) e dão origem ao mesênquima facial
(Johnston et al., 1985). As células da crista que se originam nos cérebros anterior e
médio contribuem para o processo nasal, palato e o mesênquima da primeira bolsa
faríngea. Essa estrutura se torna parte do aparelho da guelra dos peixes; no homem
origina os ossos da mandíbula e os ossos martelo e bigorna do ouvido médio. As
células da crista neural, originando na região anterior do cérebro posterior, dão
origem ao mesênquima do segundo arco faríngeo, que produz o osso estribo no
homem, como também a maior parte da cartilagem facial (veja Figura 7.41 C; Tabela
7.2). As células da crista neural cervical dão origem ao mesênquima do terceiro,
quarto e sexto arcos faríngeos (no homem, o quinto degenera) os quais produzem os
ossos do pescoço e os músculos.
Como discutido no Capítulo 2, uma série de genes parecem especificar os destinos
das células da crista neural e suas vias migratórias. Chisaka e Capecchi (1991) elimina-
ram o gene Hoxa-3 de camundongos intracruzados encontrando que esses animais
mutantes tinham as glândulas do timo, paratireóide e tireóide fortemente deficientes
ou ausentes, vértebras do pescoço encurtadas, e os principais vasos do coração mal
formados. É possível que os genes Hoxa-3 sejam responsáveis pela especificação das
células da crista neural cranial que dão origem à cartilagem do pescoço e aos deriva-
dos do arco faríngeo. Entretanto, esse gene não controla a migração menor das células
da crista neural que formam os gânglios neurais cranianos. Essa via migratória é
afetada quando os genes Hoxb-1 são eliminados. Nesse mutante, existem defeitos na
produção do nervo facial* (Goddard et al., 1996; Studer et al., 1996).
Potência de desenvolvimento das células da crista neural cefálica
Pela discussão anterior, pode parecer que todas as células da crista neural são
idênticas na sua potência original. Entretanto, este não é o caso. Aqui, novamente
as células da crista neural cranial são diferentes das células do tronco porque so-
mente as primeiras são capazes de formar a cartilagem da cabeça. Quando a crista
neural craniana é transplantada para a região do tronco, ela participa da formação da
cartilagem do tronco, que normalmente não é produzida a partir de componentes da
crista neural. Em alguns casos, essas células da crista neural craniana são instruídas
precocemente a respeito de quais tecidos estarão aptas a formar. Noden (1983)
removeu regiões da crista neural da galinha, que normalmente deveria gerar o se-
gundo arco faríngeo, e as substituiu por células que migrariam para o primeiro arco
faríngeo. Os embriões hospedeiros desenvolveram dois conjuntos de estruturas
* O fenótipo dos camundongos mutantes, Hoxb-1, se assemelha ao de certas condições huma-

nas como a Paralisia de Bell e a Síndrome de Moebius (paralisia facial congênita) e pode fornecer
possíveis esclarecimentos para essa condição.
Tabela 7.2 Alguns derivados dos arcos faríngeos
Arco faríngeo Elementos Arcos, artérias Músculos Nervos cranianos

esqueléticos (mesoderma) (mesoderma) (tubo neural)
(crista neural mais
mesoderma)
1 Bigorna e martelo Ramo maxilar da Músculos do Divisões maxilares
(da crista neural); artéria carótida queixo, soalho e mandibulares do
mandíbula, maxila (para ouvido, bucal; músculos nervo trigêmeo
e regiões do osso nariz e queixo) do ouvido e do
temporal (da crista palato mole
do mesênquima
dérmico)
2 Osso estribo do Artérias para a Músculos da Nervo facial (VII)
ouvido médio região do ouvido: expressão facial;
apófise estilóide artéria córtico- músculos do
do osso temporal; timpânica (adulto); queixo e pescoço
parte do osso hióide artéria estribal superior
do pescoço (todos (embrião)
da cartilagem da
crista neural)
3 Borda inferior e Artéria carótida Estilofaríngeo Glossofaríngeo
cornos maiores do comum; raiz da (para elevar a (IX)
osso hióide (da carótida interna faringe)
crista neural)
4 Cartilagens laringeanas Arco da aorta; Constritores Ramo superior
(do mesoderma da artéria subclávia da faringe e laringeano do
placa lateral) direita; bicos artérias cordas vocais nervo vago
originais de pulmonares
6 Cartilagens laringeanas Duto arterioso; Músculos Ramo recorrente
(do mesoderma da raízes das artérias intrínsecos laringeano do nervo vago
placa lateral) pulmonares definitivas da laringe
Fonte: Baseado em Larsen, 1992
mandibulares, pois as células derivadas do enxerto também produziram uma mandíbu-

la. A base para essa instrução será discutida no Capítulo 16.
Quando células da crista neural cefálica da galinha ou codorna são cultivadas, se
obtém uma população heterogênea de células (Baroffio et al., 1991). Algumas das
células são pluripotentes, e seus clones contêm células de vários tipos. Outras células
da crista dão derivados mais restritos. É interessante notar que nem todas as combina-
ções de cartilagem, glia, neurônios colinérgicos, melanócitos e neurônios adrenérgicos
são observadas. A Figura 7.42 mostra os tipos de clones que emergem e traça vias
hipotéticas para os tipos restritos de célula
A crista neural cardíaca

Como será detalhado no Capítulo 9, o coração é formado inicialmente na região do
pescoço, diretamente abaixo dos arcos faríngeos, e não é surpreendente que adquira
células da crista neural. Entretanto, as contribuições da crista neural ao coração só
foram consideradas recentemente. A região caudal da crista céfalica é algumas vezes
chamada de crista neural cardíaca, porque essas células da crista neural (e somente
essas células determinadas da crista) podem dar origem ao endotélio das artérias do
arco aórtico e o septo entre a aorta e a artéria pulmonar (veja Figura 7.41D). Na galinha,
a crista neural cardíaca se localiza acima da região do tubo neural a partir do rombôme-
ro 7 até a medula espinhal, oposta ao terceiro somito, e essas células da crista migram
para os arcos faríngeos 3, 4 e 6. Se a crista neural cardíaca for removida e substituída
Neurônios Figura 7.42

colinérgicos Restrição hipotética de linhagem nas cé-
lulas da crista neural cefálica da codor-
na. Um total de 533 clones, cada um
Cartilagem Células adrenérgicas derivado de uma única célula, foram ob-
Células semelhantes
às germinativas
servados para os tipos celulares deriva-
Melanócitos Células gliais dos de cada célula. Os resultados são
consistentes com a restrição progressi-
va do destino celular de célula germina-
Células tiva pluripotente, através de células ger-
germinativas de minativas mais restritas, até uma célula
linhagem restrita progenitora “unipotente”. (A, neurônio
adrenérgico; C, cartilagem; G, células da
glia; M, melanócitos; N, neurônios
colinérgicos.) (Segundo Le Douarin et
al., 1994.)
Progenitores
unipotentes
Tipos celulares
derivados da
Cartilagem Neurônios Células gliais Células Melanócitos
crista neural
colinérgicos adrenérgicas
pela crista neural do tronco ou pela crista cefálica anterior, ocorrem anormalidades
cardíacas (especialmente a falta da separação aórtica-pulmonar). Fica evidente, que a
crista cardíaca já está determinada para gerar células cardíacas, e outras regiões da
crista neural não podem substituí-la (Kirby, 1989; Kuratani e Kirby, 1991). Defeitos
cardíacos congênitos no homem com freqüência ocorrem com defeitos nas glândulas
paratireóide, tireóide e timo. Não seria surpresa se esses estivessem ligados a defeitos
na migração de células da crista neural. [ecto7.html]
Q A EPIDERME E A ORIGEM DAS ESTRUTURAS CUTÂNEAS

A origem das células epidérmicas
As células que cobrem o embrião após a neurulação formam a epiderme presuntiva.
Inicialmente, esse tecido tem a espessura de uma camada de células, mas na maioria
dos vertebrados, logo em seguida se transforma em uma estrutura de duas camadas. A
camada externa dá origem à periderme, uma cobertura temporária que é descartada tão
logo se diferencia a camada inferior para formar a verdadeira epiderme. A camada
interna, chamada camada basal (ou estrato germinativo), é um epitélio germinativo
que dá origem a todas as células da epiderme (Figura 7.43). A camada basal se divide
dando origem a uma outra, composta de uma população de células externas chamada
camada espinhosa. Essas duas camadas epidérmicas são conhecidas como a camada
de Malpighi. As células da camada de Malpighi se dividem para produzir a camada
granular da epiderme, assim chamada porque as células são caracterizadas por grânu-
los da proteína queratina. De maneira diferente das células que permanecem na cama-
da de Malpighi, as células da camada granular não se dividem, mas começam a se
diferenciar em células da pele, ou queratinócitos. Os grânulos de queratina se tornam
mais proeminentes à medida que as células da camada granular envelhecem e migram
para fora. Aqui, elas formam a camada córnea (estrato córneo), na qual as células se
Figura 7.43 Membrana

Diagrama das camadas da epiderme humana. plasmática engrossada Queratina
As células basais são mitoticamente ativas,
enquanto as células totalmente queratinizadas,
características da pela externa, estão mortas Camada córnea
e são descartadas. Os queratinócitos obtêm
esse pigmento pela transferência de melanos-
somos dos processos de melanócitos que res- Grânulos de queratina
Célula de transição
tam na camada basal. (Segundo Montagna e
Parakkal, 1974.)
Melanossomos
Camada granular
Camada
espinhosa
Camada
de Malpighi
Camada
basal
Lâmina basal
Melanócito
transformaram em sacos achatados da proteína queratina. A profundidade da camada

córnea varia de lugar a lugar, mas usualmente tem a espessura de 10 a 30 células. Os
núcleos dessas células são deslocados para uma de suas margens. Logo após o
nascimento, as células da camada córnea são descartadas e substituídas por células
novas da camada granular. Por toda a vida, as células mortas queratinizadas da cama-
da córnea são eliminadas (os seres humanos perdem 1.5 gramas dessas células cada
dia)* e são substituídas por células novas, originárias das células mitóticas da camada
de Malpighi. As células pigmentadas da crista neural também se situam na camada de
Malpighi, onde transferem seus grânulos de pigmentos (melanossomos) aos
queratinócitos em desenvolvimento.
As células germinativas epidérmicas da camada de Malpighi estão ligadas à mem-
brana basal por suas proteínas, integrinas. Entretanto, ao se tornarem determinadas
para diferenciar elas suprimem suas integrinas e as perdem enquanto migram para a
camada espinhosa (Jones e Watt, 1993).
Existem dois fatores de crescimento estimulando o desenvolvimento da epiderme.
O primeiro é o fator de crescimento transformador-α α (TGF-α α). O TGF-α é produzido
pelas células basais e estimula sua própria divisão. Quando um fator de crescimento é
produzido pela mesma célula que o recebe ele é chamado fator de crescimento
autócrino. Esses fatores precisam ser cuidadosamente regulados porque se tiverem
seus níveis aumentados, mais células são rapidamente produzidas. Na pele adulta,
uma célula nascida na camada de Malpighi leva aproximadamente 8 semanas para
* A maior parte dessa pele se transforma em “poeira de casa” em cima de móveis e no assoalho.
Se você tem alguma dúvida, queime uma porção dessa poeira; o cheiro será de pele chamuscada.
alcançar o estrato córneo e permanece na camada córnea mais ou menos duas sema-
nas. Em indivíduos com psoríase, uma doença caracterizada por esfoliação de uma
enorme quantidade de células epidérmicas, o tempo de permanência na camada córnea
é de somente dois dias (Weinstein e van Scott, 1965; Halprin, 1972). Essa condição
está ligada a uma super expressão de TGF-α (a qual ocorre secundariamente a uma
inflamação imune) (Elder et al., 1989). Analogamente, se o gene TGF-α for ligado a um
promotor para queratina 14 (uma das principais proteínas da pele), e inserido no pro-
núcleo do camundongo, os animais transgênicos ativam o gene TGF-α em suas célu-
las da pele e não podem suprimi-lo. O resultado é um camundongo com pele escamosa,
pouco pêlo e um enorme excesso de epiderme queratinizada sobre uma única camada
de células basais (Figura 7.44C; Vassar e Fuchs, 1991).
O outro fator de crescimento necessário para a produção de epiderme é o fator de
crescimento do queranócito (KGF; também chamado fator de crescimento fibroblásti-
co 7) um fator parácrino que é produzido pelos fibroblastos da derme subjacente
(derivada do mesoderma). O KGF é recebido pelas células basais que estão acima dos
fibroblastos da derme e se considera que ele regula a proliferação dessas células
basais. Se o gene KGF é fundido com o promotor de queratina 14 e são produzidos
camundongos transgênicos, o KGF se torna autócrino. Os animais resultantes (Figura
7.44A) têm uma epiderme espessada, pele solta, muitas células basais e não têm folículos
de pêlo, nem mesmo folículos do bigode (Guo et al., 1993). Essas células basais são
“forçadas” a entrar na via de diferenciação da epiderme. A alternativa para a célula
basal é ajudar a gerar o folículo do pêlo.
Apêndices cutâneos
A epiderme e a derme também interagem em sítios específicos para criar as glândulas
sudoríparas e os apêndices cutâneos: pêlos, escamas ou penas (dependendo da espé-
cie). A primeira indicação de que um folículo do pêlo se formará em um local específico
é uma agregação de células na camada basal da epiderme. Essa agregação é dirigida
pelas células dermais subjacentes e ocorre em diferentes tempos e locais no embrião.
As células basais se alongam, se dividem e penetram na derme. As células dermais
(B) (C)
(A)
Figura 7.44
Fatores de crescimento e proliferação epidér-
mica. (A) Um camundongo transgênico ex-
pressando baixos níveis de KGF em seus que-
ratinócitos. Notar a rarefação do pêlo ao re-
dor das patas, olhos e focinho. (B) Um ca-
mundongo de tipo selvagem. (C) Um compa-
nheiro de ninhada de (B) que está expressan-
do altos níveis de TGF-α em seus queratinó-
citos. Tem pele descamada e muito pouco
pêlo. Abaixo de cada camundongo está um
corte através de sua pele. O animal expres-
sando KGF em excesso não tem folículos
pilosos e um número aumentado de células
epidérmicas basais. O camundongo expres-
sando TGF-α tem camadas muito extensas
de epitélio queratinizado, o qual ele descarta.
(de Vassar e Fuchs, 1991, e Guo et al., 1993.
KGF Tipo selvagem TGF-α Fotografias cortesia de E. Fuchs.)
(A) (B) (C) (D)
Ectoderma Canal piloso em Pêlo

epidérmico desenvolvimento
Mesoderma Mesoderma Ponta do pêlo

condensado dérmico
Glândula
Papila dérmica sebácea
Bulbo contendo
células germinativas
pluripotentes do
Figura 7.45 folículo piloso
Desenvolvimento de folículos pilosos na pele
fetal humana. (A) Células epidérmicas basais
tornam-se colunares e se abaulam ligeiramente
para dentro da derme. (B) Células epidérmicas
respondem a esse ingresso de células epidérmicas basais formando um pequeno nó-
continuam a proliferar, e células mesenquima-
dulo (a papila dermal) abaixo do tampão epidérmico. A papila dérmica, em um movi-
tosas da derme se agregam na base do germe
primário do pêlo. (C) Começa a diferenciação mento ascendente, estimula as células basais germinativas a dividirem-se mais rapida-
da haste do pêlo no germe piloso alongado. mente e produzir células pós-mitóticas que se diferenciarão na haste queratinizada do
(D) A haste pilosa queratinizada se estende da pêlo (veja Hardy, 1992; Miller et al., 1993). Melanoblastos, que estavam presentes
raiz do pêlo, o broto secundário forma a glân- entre as células epidérmicas enquanto ingressavam, diferenciam-se em melanócitos e
dula sebácea, e por baixo existe uma região que transferiam seu pigmento à haste (Figura 7.45). Enquanto isso ocorre, duas intumes-
pode conter as células germinativas pilosas cências epiteliais começam a crescer nos lados do folículo. As células da intumescên-
para o próximo ciclo produtor de pêlo. (E) cia inferior podem reter uma população de células germinativas que regenerarão a
Fotografia de um germe piloso alongado. (Se-
haste do pêlo periodicamente, quando ela for descartada (Pinkus e Mehregan, 1981;
gundo Hardy, 1992, e Miller et al., 1993. Fo-
Cotsarelis et al., 1990). As células da intumescência superior formarão as glândulas
tografia cortesia de W. Montagna.)
sebáceas que produzem uma secreção oleosa, o sebo. Em muitos mamíferos, incluindo
o homem, o sebo se mistura com células peridérmicas escamadas para formar a vernix
caseosa, esbranquiçada, que envolve o feto no nascimento. [ecto8.html]
Os primeiros pêlos do embrião humano são finos, localizados muito próximos, e
formam o chamado lanugo. Esse tipo de pêlo é geralmente descartado antes do nasci-
mento e substituído (pelo menos em parte, por novos folículos) por pêlos curtos e
sedosos, o velo. Velo permanece em muitas partes do corpo humano, usualmente
consideradas sem pêlos como a testa e as pálpebras. Em outras partes do corpo, o velo
dá lugar para o pêlo “definitivo”. Durante a vida de uma pessoa, alguns dos folículos
que produziram velo podem, mais tarde, formar pêlos definitivos, depois reverter para
a produção de velo. As axilas das crianças, por exemplo, têm folículos que produzem
velo até a adolescência. Nessa fase, as hastes definitivas são produzidas. Inversa-
mente, em calvície normal masculina, os folículos do couro cabeludo voltam a produzir
pêlos velos muito finos e não pigmentados (Montagna e Parakkal, 1974). A localização
e o padrão de pêlos, penas, escamas e glândulas sudoríparas envolve interações da
epiderme e da derme, e essas serão discutidas em detalhe no Capítulo 17. Da mesma
forma que existe uma célula germinativa neural, cuja descendência se torna células
neurais e células gliais, também parece existir uma célula germinativa epidérmica
pluripotente, cujos descendentes podem se tornar epiderme, glândulas sebáceas e
hastes de pêlo.
Conclusões
Neste capítulo acompanhamos a diferenciação do ectoderma embrionário em uma
ampla variedade de tecidos. Vimos que o ectoderma produz três conjuntos de células
durante a neurulação: (1) O tubo neural que dá origem aos neurônios, às células gliais
e às células ependimárias do sistema nervoso central; (2) as células da crista neural,

que dão origem ao sistema nervoso periférico, células pigmentadas, medula da supra-
renal e certas áreas da cartilagem da cabeça; e (3) a epiderme da pele, que contribui
para a formação das estruturas cutâneas como o pêlo, penas, escamas e glândulas
sudoríparas e sebáceas, como também a cobertura protetora externa dos nossos cor-
pos. Também observamos como as interações das células epidérmicas estão envolvi-
das na origem dos vários tecidos do olho.
Os Capítulos posteriores (16 e 17) discutem com mais detalhe a indução do tubo
neural e o desenvolvimento coordenado do olho. No próximo capítulo discutiremos
os mecanismos pelos quais os neurônios são dirigidos para locais específicos, assim,
permitindo o desenvolvimento de reflexos e comportamentos.
LITERATURA CITADA
Acampora, D., Mazan, S., Lallemand, Y., Yanagisawa, M. 1994. Interaction of endothelin- Centers for Disease Control. 1992. Recom-
Avantaggiato, V., Maury, M., Simeone, A. and 3 with endothelin-B receptor is essential for mendations for the use of folic acid to reduce
Brulet, P. 1995. Forebrain and midbrain regions development of epidermal melanocytes and the number of cases of spina bifida and other
are deleted in Otx2 -/- mutants due to a defective enteric neurons. Cell 79: 1277-1285. neural tube defects. Morb. Mortal. Wkly. Rep.
anterior neuroectoderm specification during Bloom, W. and Fawcett. D. W. 1975. Textbook 41: 1-7.
gastrulation. Development 121: 3279-3290. of Histology, 10th Ed. Saunders, Philadelphia. Chenn, A. and McConnell, S. K. 1995. Cleavage
Akitaya, T. and Bronner-Fraser, M. 1992. Ex- Bockman, D. E. and Kirby, M. L. 1984. orientation and the asymmetric inheritance of
pression of cell adhesion molecules during Dependence of thymus development on de- Notch1 immunoreactivity in mammalian
initiation and cessation of neural crest cell mi- rivatives of the neural crest. Science 223: neurogenesis. Cell 82: 631-641.
gration. Dev. Dyn. 194: 12-20. 498-500. Chiang, C., Litingung, Y., Lee, E.,Young, K. K.,
Alvarez, I. S. and Schoenwolf, G. C. 1992. Bronner-Fraser, M. 1986. Analysis of the early Corden, J. E., Westphal, H. and Beachy, P. A.
Expansion of surface epithelium provides the stages of trunk neural crest migration in avian 1996. Cyclopia and defective axial patterning
major extrinsic force for bending of the neural embryos using monoclonal antibody HNK-1. in mice lacking Sonic hedgehog gene function.
plate. J. Exp. Zool. 261: 340-348. Dev. Biol. 115: 44-55. Nature 383: 407-413.
Anderson, D. J. and Axel, R. 1986. A bipotential Bronner-Fraser, M. and Cohen, A. M. 1980. Chisaka, 0. and Capecchi, M. 1991. Regionally
neuroendocrine precursor whose choice of cell Analysis of the neural crest ventral pathway using restricted developmental defects resulting from
fate is determined by NGF and glucocorticoids. injected tracer cells. Dev. Biol. 77: 130-141. targeted disruption of the mouse homeobox gene
Cell 47: 1079-1090. Hox1.5. Nature 350: 473-479.
Bronner-Fraser, M. and Fraser, S. E. 1988. Cell
Artinger, K. B. and Bronner-Fraser, M. 1992. lineage analysis reveals multipotentency of some Chun, L. L. Y. and Patterson, P. H. 1977. Role
Partial restriction in the developmental potential avian neural crest cells. Nature 335: 161-164. of nerve growth factor in development of rat
of late emigrating avian neural crest cells. Dev. sympathetic neurons in vitro. Survival, growth,
Biol. 149: 149-157. Bronner-Fraser, M. and Fraser, S. 1989. Deve-
and differentiation of catecholamine producti-
lopmental potential of avian trunk neural crest
Balinsky, B. I. 1975. Introduction to Embryolo- on. J. Cell Biol. 75: 694-704.
cells in situ. Neuron 3: 755-766.
gy, 4th Ed. Saunders, Philadelphia. Ciment, G. 1990. The melanocyte/Schwann cell
Bronner-Fraser, M. and Stern, C. 1991. Effects progenitor: A bipotent intermediate in the
Bally-Cuif, L. and Wassef, M. 1994. Ectopic of mesodermal tissues on avian neural crest cell
induction and reorganization of Wnt-1 expres- neural crest lineage. Commun. Dev. Neurobiol.
migration. Dev. Biol. 143: 213-217.
sion in quail/chick chimeras. Development 120: 1: 207-223.
Burnside, B. 1971. Microtubules and microfi-
3379-3394. Cotsarelis, G., Sun, T.-T. and Lavker, R. M. 1990.
laments in newt neurulation. Dev. Biol. 26:
Bally-Cuif, L. and Wassef, M. 1995. Determi- Label-retaining cells reside in the bulge area of
416-441.
nation events in the nervous system of the pilosebaceous unit: Implications for follicular
Burnside, B. 1973. Microtubules and microfila- stem cells, hair cycle and skin carcinogenesis.
vertebrate embryo. Curr. Opin. Genet. Dev. 5:
ments in amphibian neurulation. Am. Zool. 13: Cell 61: 1329-1337.
450-458.
989-1006.
Banks, M. S. and Bennett, P. J. 1988. Optical Coulombe, J. N. and Bronner-Fraser, M. 1987.
Catala, M., Teillet, M.-A. and Le Douarin, N. Cholinergic neurones acquire adrenergic
and photoreceptor immaturities limit the spatial
M. 1995. Organization and development of the neurotransmitters when transplanted into an
and chromatic vision of human neonates. J. Opt.
tail bud analyzed with the quailchick chimaera
Soc. Am. 5: 2059-2079. embryo. Nature 324: 569-572.
system. Mech. Dev. 51: 51-65.
Baroffio, A., Dupin, E. and Le Douarin, N. M. Coulombre, A. J. 1956. The role of intraocular
Catala, M., Teillet, M.-A., De Robertis, E. M.
1991. Common precursors for neural and pressure in the development of the chick eye. I.
and Le Douarin, N. M. 1996. A spinal cord fate
mesectodermal derivatives in the cephalic neural Control of eye size. J. Exp. Zool. 133: 211-225.
map in the avian embryo: while regressing,
crest. Development 112: 301-305. Hensen’s node lays down the notochord and floor Coulombre, A. J. 1965. The eye. In R. DeHaan
Baynish, A. G., Hosoda, K., Giaid, A., Richard- plate thus joining the spinal cord lateral walls. and H. Ursprung (eds.), Organogenesis. Holt,
son, J. A., Emoto, N., Hammer, R. E. and Development 122: 2599-2610. Rinehart & Winston, New York, pp. 217-251.
Crossin, K. L., Chuong, C.-M. and Edelman, G. Erickson, C. A. and Goins, T. L. 1995. Avian Goldstein, R. S., Teillet, M.-A. and Kalcheim, C.
M. 1985. Expression sequences of cell adhesion neural crest cells can migrate in the dorsolateral 1990. The microenvironment created by
molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6942- path only if they are specified as melanocytes. grafting rostral half-somites is mitogenic for
6946. Development 121: 915-924. neural crest cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Crossley, P. H., Martinez, S. and Martin, G. R. Erickson, C. A., Tosney, K. W. and Weston, J. 87: 4476-4480.
1996. Midbrain development induced by FGF8 A. 1980. Analysis of migrating behaviour of Gont, L. K., Steinbeisser, H., Blumberg, B. and
in the chick embryo. Nature 380: 66-68. neural crest and fibroblastic cells in embryonic De Robertis, E. M. 1993. Tail formation as a
tissues. Dev. Biol. 77: 142-156. continuation of gastrulation: The multiple cell
Czeizel, A. and Dudas, I. 1992. Prevention of
first occurence of neural tube defects by Erickson, C. A., Duong, T. D. and Tosney, K. W. populations of the Xenopus tailbud derive from
periconceptional vitamin supplementation. N. 1992. Descriptive and experimenta analysis of the late blastopore lip. Development 119: 991-
Engl. J. Med. 327: 1832-1835. the dispersion of neural crest cells along the 1004.
dorsolateral pathway and their entry into Gould, S. J. 1977. Ontogeny and Phylogeny.
Danielian, P. S. and McMahon, A. P. 1996. En-
ectoderm in the chick embryo. Dev. Biol. 151: Harvard University Press, Cambridge, MA.
grailed-1 as a target of the Wnt-1 signaling
251-272. Graham, A., Heyman, I. and Lumsden, A. 1993.
pathway in vertebrate midbrain development.
Nature 383: 332-334. Ernfors, P., Lee, K. F. and Jaenisch, R. 1994. Even-numbered rhombomeres control the
Mice lacking brain-derived neurotrophic factor apoptotic elimination of neural crest cells from
Davenport, R. W., Dou, P., Rehder, V. and Kater, develop with sensory deficits. Nature 368: 147- odd-numbered rhombomeres of the chick
S. B. 1993. A sensory role for neuronal growth 150. hindbrain. Development119: 233-245.
cone filopodia. Nature 361: 721-724.
Fishell, G. 1995. Striatal precursors adopt cortical Graham, A, Francis-West, P., Brickell, P. and
Desmond, M. E. 1982. A description of the identities in response to local cues. Develop- Lumsden, A. 1994. The signalling molecule
occlusion of the lumen of the spinal cord in ment 121: 803-812. BMP-4 mediates apoptosis in the rhombence-
early human embryos. Anat. Rec. 204: 89-93.
Fishell, G. and Hatten, M. E. 1991. Astrotactin phalic neural crest. Nature 372: 684-686.
Desmond, M. E. and Field, M. C. 1992. provides a receptor system for gliaguided neuronal Guo, L., Yu, Q.-C. and Fuchs, E. 1993. Targetting
Evaluation of neural fold fusion and coincident migration. Development 113: 755-765. expression of keratinocyte growth factor to
initiation of spinal cord occlusion in the chick
Forscher, P. and Smith, S. J. 1988. Actions of keratinocytes elicits striking changes in epithelial
embryo. J. Comp. Neurol. 319: 246-260. differeentiation in transgenic mice. EMBO J.
cytochalasins on the organization of actin
Desmond, M. E. and Schoenwolf, G. C. 1986. filaments and microtubules in a neural growth 12: 973-986.
Evaluation of the roles of intrinsic and cone. J. Cell Biol. 107: 1505-1516. Guthrie, S. and Lumsden, A. 1991. Formation
extrinsic factors in occlusion of the spinal and regeneration of rhombomere boundaries in
Frantz, G. D. and McConnell, S. K. 1996.
neurocoel during rapid brain enlargement in Restriction of late cerebral cortical progenitors the developing chick hindbrain. Development
the chick embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. to an upper-layer fate. Neuron 17: 55-61. 112: 221-229.
97: 25-46.
Fujimori, T., Miyatani, S. and Takeichi, M. Gregory, W. A., Edmondson, J. C., Hatten, M.
Detrick, R. J., Dickey, D. and Kintner, C. R. 1990. Ectopic expression of N-cadherin perturbs E. and Mason, C. A. 1988. Cytology and neural-
1990. The effects of N-cadherin misexpression histogenesis in Xenopus embryos. Development glial apposition of migrating cerebellar granule
on morphogenesis in Xenopus embryos. Neuron 110: 97-104. cells in vitro. J. Neurosci. 8: 1728-1738.
4: 493-506.
Fujita, S. 1964. Analysis of neuron differentiati- Halder, G., Callaerts, P. and Gehring, W. J. 1995.
Dickinson, M. E., Krumlauf, R. and McMa- on in the central nervous system by tritiated Induction of ectopic eyes by targeted expressi-
hon, A. P. 1994. Evidence for a mitogenic thymidine autoradiography. J.Comp. Neurol. on of the eyeless gene in Drosophila. Science
effect of Wnt-1 in the developing mammalian 122: 311-328. 267: 1788-1792.
central nervous system. Development 120:
Fujita, S. 1966. Application of light and electron Hallet, M. M. and Ferrand, R. 1984. Quail
1453-1471. melanoblast migration in two breeds of fowl and
microscopy to the study of the cytogenesis of
Edery, P. and nine others. 1994. Mutations of the forebrain. In R. Hassler and H. Stephen (eds.), their hybrids: Evidence for a dominant genic
the RET proto-oncogene in Hirschsprung’s Evolution of the Forebrain. Plenum, New York, control of the mesodermal pigment pattern
disease. Nature 367: 378-380. pp. 180-196. through tissue environment. J. Exp. Zool. 230:
Edmondson, J. C. Liem, R. K. H., Kuster, J. C. Fukada, K. 1980. Hormonal control of neuro- 229-238.
and Hatten, M. E. 1988. Astrotactin: A novel transmitter choice in sympathetic neuron Halprin, K. M. 1972. Epidermal “turnover
neuronal cell surface antigen that mediates cultures. Nature 287: 553-555. time”-a reexamination. J. Invest. Dermatol. 86:
neuronal-astroglial interactions in cerebellar 14-19.
Gallera, J. 1971. Primary induction in birds. Adv.
microcultures. J. Cell Biol. 106: 509-517. Morphogenet. 9: 149-180. Hardy, M. H. 1992. The secret life of the hair
Eichele, G. 1992. Budding thoughts. The Sciences follicle. Trends Genet. 8: 55-61.
Glaser, T., Jepeal, L., Edwards, J. G., Young, S.
(Jan., 1992): 30-36. R., Favor, J. and Maas, R. L. 1994. PAX6 gene Harrison, R. G. 1907. Observations on the living
Elder, J. T. and eight others. 1989. Overexpres- dosage effect in a family with congenital developing nerve fiber. Anat. Rec. 1: 116-118.
sion of transforming growth factor in psoriatic cataracts, aniridia, anophthalmia and central Hatten, M. E. 1990. Riding the glial monorail: A
epidermis. Science 243: 811-814. nervous system defects. Nat. Genet. 7: 463-471. common mechanism for glialguided neuronal
Ericson, J., Morton, S., Kawakami, A., Roelinck, Goddard, J. M., Rossel, M., Manley, N. R. and migration in different regions of the mammalian
H. and Jessell, T. M. 1996. Two critical periods Capecchi, M. R. 1996. Mice with targeted brain. Trends Neurosci. 13: 179-184.
of Sonic hedgehog signaling required for the disruption of Hoxb-1 fail to form the motor Hemesath, T. J. and nine others. 1994. micro-
specification of motor neuron identity. Cell 87: nucleus of the VIIth nerve. Development 122: phthalmia, a critical factor in melanocyte de-
661-673. 3217-3228. velopment defines a discrete transcription factor
Erickson, C. A. and Weston, J. A. 1983. An SEM Golden, J. A. and Chernoff, G. F. 1993. family. Genes Dev. 8: 2770-2780.
analysis of neural crest migration in the mouse. Intermittent pattern of neural tube closure in Henry, E. W. and Sidman, R. L. 1988. Long
J. Embryol. Exp. Morphol. 74: 97-118. two strains of mice. Teratology 47: 73-80. lives for homozygous trembler mutant mic-e
despite virtual absence of peripheral nerve Kahn, C. R., Coyle, J. T. and Cohen, A. M. 1980. Le Douarin, N. M. 1969. Particularités du noyau
myelin. Science 241: 344-346. Head and trunk neural crest in vitro: Autonomic interphasique chez la Caille japonaise (Coturnix
Hilfer, S. R. and Yang, J.-J. W. 1980. Accumula- neuron differentiation. Dev. Biol. 77: 340-348. coturnix japonica). Utilisation de ces particulari-
tion of CPC-precipitable material at apical cell Kalcheim, C. R. and Neufeld, G. 1990. Expressi- tés comme “marquage biologique” dans les
surfaces during formation of the optic cup. Anat. on of basic fibroblast growth factor in the recherches sur les interactions tissulaires et les
Rec. 197: 423-433. nervous system of early avian embryos. Deve- migrations cellulaires au cours de l’ontogenèse.
lopment 109: 203-215. Bull. Biol. Fr. Belg. 103: 435-452.
His, W, 1886. Zur Geschichte des menschlichen
Rückenmarks und der Nervenwurzeln. Ges. Wiss. Kalcheim, C., Barde, Y.-A., Thoenen, H. and Le Le Douarin, N. M., and Teillet, M.-A. 1973. The
BD 13, S. 477. Dourain, N. M. 1987. In vivo effect of brain- migration of neural crest cells to the wall of the
derived neurotrophic factor on the survival of digestive tract in avian embryo. J. Embryol. Exp.
Holt, A. B., Cheek, D. B., Mellitz, E. D. and Morphol. 30: 31-48.
Hill, D. E. 1975. Brain size and the relation of neural crest precursor cells of the dorsal root
the primate to the non-primate. In D. B. ganglia. EMBO J. 6: 2871-2873. Le Douarin, N. M. and Teillet, M.-A. 1974. Ex-
Cheek (ed.), Fetal and Postnatal Cellular Karfunkel, P. 1972. The activity of microtubu- perimental analysis of the migration and diffe-
Growth: Hormones and Nutrition. Wiley, New les and microfilaments in neurulation in the rentiation of neuroblasts of the autonomic
chick. J. Exp. Zool. 181: 289-302. nervous system and of neuroectodermal mesen-
York, pp. 23-44.
chyme derivatives, using a biological cell marking
Hosoda, K., Hammer, R. E., Richardson, J. A., Keller, R., Shih, J., Sater, A. K. and Moreno, C.
technique. Dev. Biol. 41:162-184.
Baynish, A. G., Cheung, J. C., Gialid, A. and 1992. Planar induction of convergence and
extension of the neural plate by the organizer Le Douarin, N. M., Dupin, E. and Ziller, C. 1994.
Yanagisawa, M. 1994. Targeted and natural
of Xenopus. Dev. Dyn. 193: 218-234. Genetic and epigenetic control in neural crest
(Piebald-lethal) mutations of endothelin-B re-
development. Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 685-
ceptor gene produce megacolon associate with Kelley, R. I. and seven others. 1996 Holopro-
695.
spotted coat color in mice. Cell 79: 1267-1276. sencephaly in RSH/Smith-Lemli-Opitz syndro-
me: Does abnormal cholesterol metabolism Le Douarin, N. M., Dieterlen-Lièvre, F. and
Huettner, A. F. 1949. Fundamentals of Compa-
affect the function of Sonic hedgehog? Am. J. Teillet, M.-A. 1996. Quail-chick transplantati-
rative Embryology of the Vertebrates, 2nd Ed.
Med. Genet. 66: 478-484. ons. Methods Cell Biol. 51: 23-61.
Macmillan, New York.
Kirby, M. L. 1987. Cardiac morphogenesis: Recent Le Douarin, N. M., Renaud, D., Teillet, M.-A.
Irving, C., Flenniken, A., AlIdus, G. and
research advances. Pediatr. Res. 21: 219-224. and Le Douarin, G. H. 1975. Cholinergic diffe-
Wilkinson, D. G. 1996. Cell-cell interactions
rentiation of presumptive adrenergic neuro-
and segmentation in the developing vertebrate Kirby, M. L. 1989. Plasticity and predetermina-
blasts in interspecific chimeras after heteroto-
hindbrain. Biochem. Soc. Symp. 1996: 85-95. tion of mesencephalic and trunk neural crest
pic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Jacobson, A. G. 1981. Morphogenesis of the transplanted into the region of the cardiac neural
72: 728-732.
neural plate and tube. In I. G. Connely et al. crest. Dev. Biol. 134: 401-412.
Le Lièvre, C. S. and Le Douarin, N. M. 1975.
(eds.), Morphogenesis and Pattern Formation. Kirby, M. L. and Waldo, K. L. 1990. Role of Mesenchymal derivatives of the neural crest:
Raven Press, New York, pp. 233-263. neural crest in congenital heart disease. Analysis of chimaeric quail and chick embryos.
Jacobson, A. G. and Moury, J. G. 1995. Tissue Circulation 82: 332-340. J. Embryol. Exp. Morphol. 34: 125-154.
boundaries and cell behavior during neurulation. Komuro, H. and Rakic, P. 1992. Selective role Letourneau, P. C. 1977. Regulation of neuronal
Dev. Biol. 171: 98-110. of N-type calcium channels in neuronal migra- morphogenesis by cell-substratum adhesion. Soc.
Jacobson, A. G. and Sater, A. K. 1988. Features tion. Science 157: 806-809. Neurosci. Symp. 2: 67-81.
of embryonic induction. Development 104: Krull, C. E, Collazo, A., Fraser, S. E. and Letourneau, R C. 1979. Cell substratum adhesion
341-359. Bronner-Fraser, M. 1995. Segmental migration of neurite growth cones, and its role in neurite
Jacobson, M. 1968. Cessation of DNA synthesis of trunk neural crest. Time lapse analysis reveals elongation. Exp. Cell Res. 124: 127-138.
in retinal ganglion cells correlated with the time a role for PNA binding molecules. Development
121: 3733-3743. Liem, K., Tremmi, G., Roelink, H. and Jessell,
of specification of their central connections. T. M. 1995. Dorsal differentiation of neural plate
Dev. Biol. 17: 219-232. Kuratani, S. C. and Kirby, M. L. 1991. Initial cells induced by BMP-mediated signals from
Jacobson, M. 1991. Developmental Neurobio- migration and distribution of the cardiac neural epidermal ectoderm. Cell 82: 969-979.
logy, 2nd Ed. Plenum, New York. crest in the avian embryo: An introduction to
Löfberg, J., Perris, R. and Epperlin, H. H. 1989.
the concept of the circumpharyngeal crest. Am.
Johnston, M. C., Sulik, K. K., Webster, W. S. Timing in the regulation of neural crest cell mi-
J. Anat. 191: 215-227.
and Jarvis, B. L. 1985. Isotretinoin embryopa- gration: Retarded maturation of regional extra-
thy in a mouse model: Cranial neural crest in- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. and Heidemann, cellular matrix inhibits pigment cell migration
volvement. Teratology 31: 26A. S. R. 1989. Direct evidence that growth cones in embryos of the white axolotl mutant. Dev.
pull. Nature 340: 159-162. Biol 131: 168-181.
Jones, K. R., Farinas, I., Backus, C. and Reichart,
L. F. 1994. Targeted disruption of the BDNF Lahav, R., Ziller, C., Dupin, E. and Le Douarin, Loring, J. F. and Erickson, C. A. 1987. Neural
gene perturbs brain and sensory neuron develo- N. M. 1996. Endothelin 3 promotes neural crest crest cell migratory pathways in the trunk of
pment, but not motor neuron development. Cell cell proliferation and mediates a vast increase the chick embryo. Dev. Biol. 121: 220-236.
76: 989-999. in melanocyte number in culture. Proc. Natl.
Lumsden, A. 1988. Multipotent cells in the avian
Acad. Sci. USA. 93:.3892-3897. neural crest. Trends Neurosci. 12: 81-83.
Jones, P. H. and Watt, F. M. 1993. Separation
of human epidermal stem cells from transit Landis, S. C. and Patterson, P. H. 1981. Neural Lumsden, A. and Guthrie, S. 1991. Alternating
amplifying cells of the basis of differences in crest cell lineages. Trends Neurosci. 4: 172-175. patterns of cell surface properties and neural
integrin function and expression. Cell 73: Larsen, W. J. 1993. Human Embryology. crest cell migration during segmentation of the
713-724. Churchill Livingstone, New York. chick embryo. Development [Suppl.] 2: 9-15.
Jordan, T. and seven others. 1992. The human Le Douarin, N. and Smith, J. 1988. Development Lumsden, A. and Keynes, R. 1989. Segmental
PAX6 gene is mutated in two patients with of the peripheral nervous system from the neural patterns of neuronal development in the chick
aniridia. Nat. Genet. 1: 328-332. crest. Annu. Rev. Cell Biol. 4: 375-404. hindbrain. Nature 337: 424-428.
Mancilla, A. and Mayor, R. 1996. Neural crest Microfilament-mediated changes in cell shape specific phenotypes in neural crest cells. Science
formation in Xenopus laevis: Mechanisms of during uplifting of neural folds. J. Exp. Zool. 241: 86-89.
Xslug induction. Dev. Biol. 177: 580-589. 213: 391-398. Perris, R., Löfberg, J. Fällström, C., von Boxburg,
Mann, I. 1964. The Development of the Human Nagele, R. G. and Lee, H. Y. 1987. Studies in the Y, Olsson, L. and Newgreen, D. F. 1990. Structural
Eye. Grune and Stratton, New York. mechanism of neurulation in the chick. and compositional divergencies in the extrace-
Marin, F. and Puelles, L. 1994. Patterning of Morphometric analysis of the relationship llular matrix encountered by neural crest cells in
embryonic avian midbrain after experimental between regional variations in cell shape and the white mutant axlotl embryo. Development
inversion: a polarizing activity for the isthmus. sites of motive force generation. J. Exp. Biol. 109: 533-551.
Dev. Biol. 163: 19-28. 24: 197-205. Piatigorsky, J. 1981. Lens differentiation in
Matsunami, H. and Takeichi, M. 1995. Fetal Newgreen, D. F. and Gooday, D. 1985. Control vertebrates: A review of cellular and molecular
brain subdivisions defined by T- and Ecadherins of onset of migration of neural crest cells in features. Differentiation 19: 134-153.
expressions: evidence for the role of cadherin avian embryos: Role of Ca++-dependent cell Pichel. J. G. and eleven others. 1996. Defects in
activity in region-specific, cell-cell adhesion. adhesions. Cell Tiss. Res. 239: 329-336. enteric innervation and kidney development in
Dev. Biol. 172: 466-478. Newgreen, D. F., Scheel, M. and Kaster, V. 1986. mice lacking GDNF. Nature 382: 73-76.
Mayer, T. C. 1973. The migratory pathway of Morphogenesis of sclerotome and neural crest Pinkus, H. and Mehregan, A. H. H. 1981. A Guide
neural crest cells into the skin of mouse embryos. cells in avian embryos. In vivo and in vitro studies to Dermohistopathology. Appleton Century
Dev. Biol. 34: 39-46. on the role of notochordal extracellular materi- Crofts, New York.
al. Cell Tiss. Res, 244: 299-313.
Maxwell, G. D., Reid, K., Elefanty, A., Bartlett, Pomeranz, H. D., Rothman, T. P. and Gershon,
P. F. and Murphy, M. 1996. Glial cell line- Nichols, D. H. 1981. Neural crest formation in M. D. 1991. Colonization of the postumbilical
derived neurotrophic factor promotes the de- the head of the mouse embryo as observed using bowel by cells derived from the sacral neural
velopment of adrenergic neurons in mouse a new histological technique. J. Embryol. Exp. crest: Direct tracing of cell migration using an
neural crest cultures. Proc. Natl. Acad. Sci. Morphol. 64: 105-120. intercalating probe and a replication-deficient
USA 93: 13274-13279. Nichols, D. H. and Weston, J. A, 1977. retrovirus. Development 111: 647-655.
McConnell, S. K. and Kaznowski, C. E. 1991. Melanogenesis in cultures of peripheral nervous Poole, T. J. and Thiery, J. P. 1986. In H. C.
Cell cycle dependence of laminar determinati- tissue. I. The origin and prospective fates of Slavkin (ed.), Progress in Clinical and Biologi-
on in developing cerebral cortex. Science 254: cells giving rise to melanocytes. Dev. Biol. 60: cal Research, Vol 217. Alan R. Liss, New York,
282-285. 217-225. pp. 235-238.
McMahon, A. P. and Bradley, A. 1990. The Wnt- Nieto, M. A., Sargent, M. G., Wilkinson, D. G. Porter, J. A., Young, K. E. and Beachy, P. A.
1 (int-1) proto-oncogene is required for the de- and Cooke, J. 1994. Control of cell behavior 1996. Cholesterol modification of Hedgehog
velopment of a large region of the mouse brain. during vertebrate development by slug, a zinc signaling proteins in animal development.
Cell 62: 1073-1085. finger gene. Science 264: 835-839. Science 274: 255-259.
Milunsky, A., Jick, H., Jick, S. S., Bruell, C. L., Nievelstein, R. A. J., Hartwig, N. G., Vermeij- Portmann, A. 1941. Die Tragzeiten der Primaten
Maclaughlen, D. S., Rothman, K. J. and Willett, Keers, C. and Valk, J. 1993. Embryonic deve- und die Dauer der Schwangerschaft beim
W. 1989. Multivitamin folic acid supplementa- lopment of the mammalian caudal neural tube. Menschen: Ein Problem der vergleichen
tion in early pregnancy reduces the prevalence Teratology 48: 21-31. Biologie. Rev. Suisse Zool. 48: 511-518.
of neural tube defects. JAMA 262: 2847-2852. Noden, D. M. 1978. The control of avian Portmann, A. 1945. Die Ontogenese des
Miller, S. J., Lavker, R. M. and Sun, T.-T. 1993. cephalic neural crest cytodifferentiation. I. Menschen als Problem der Evolutionsforschung.
Keratinocyte stem cells of corneal, skin, and Skeletal and connective tissue. Dev. Biol. 69: Verh. Schweiz. Naturf. Ges. 125: 44-53.
hair follicle. Semin. Dev. Biol. 4: 217-240. 296-312.
Puffenberger, E. G., Hosoda, K., Washington, S.
Montagna, W. and Parakkal, P. F. 1974. The Noden, D. M. 1983. The role of the neural crest S., Nakao, K., deWilt, D., Yanagisawa, M. and
piliary apparatus. In W. Montagna (ed.), The in patterning of avian cranial skeletal, connec- Chakvarti, A. 1994. A missense mutation of the
Structure and Formation of Skin. Academic tive, and muscle tissues. Dev. Biol. 96: 144-165. endothelin-B receptor gene in multigenic
Press, New York, pp. 172-258. O’Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J. and Hirschsprung’s disease. Cell 79: 1257-1266.
Montagu, M. F. A. 1962. Time, morphology, McConnell, S. K. 1992. Diverse migratory Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., and
and neoteny in the evolution of man. In M. F. pathways in the developing cerebral cortex. Gehring, W. J. 1994. Homology of the eyeless
A. Montagu (ed.), Culture and Evolution of Man. Science 258: 299-302. gene of Drosophila to the Small eye gene in
Oxford University Press, New York. Papaconstantinou, J. 1967. Molecular aspects of mice and Aniridia in humans. Science 265:
Moore K. L. and Persaud, T. V. N. 1993. Before lens cell differentiation. Science 156: 338-346. 785-789.
We Are Born: Essentials of Embryology and Birth Pasteels, J. 1937. Etudes sur la gastrulation des Rakic, P. 1972. Mode of cell migration to su-
Defects. W. B. Saunders, Philadelphia. vertébrés méroblastiques. III. Oiseaux. IV. perficial layers of fetal monkey neocortex. J.
Morowitz, H. J. and Trefil, J. S. 1992. The Facts Conclusions générales. Arch. Biol. 48:: 381-488. Comp. Neurol. 145: 61-84.
of Life: Science and the Abortion Controversy. Paton, D. and Craig, J. A. 1974. Cataracts: De- Rakic, P. 1974. Neurons in rhesus visual cortex:
Oxford University Press, New York. velopment, diagnosis, and management. Ciba Systematic relation between time of origin and
Moury, J. D. and Schoenwolf, G. C. 1995. Clin. Symp. 26(3): 2-32. eventual disposition. Science 183: 425-427.
Cooperative model of epithelial shaping and Patten, B. M. 1971. Early Embryology of the Rakic, P. 1975. Cell migration and neuronal
bending during avian neurulation: Autonomous Chick, 5th Ed. McGraw-Hill, New York. ectopias in the brain. In D. Bergsma (ed.), Mor-
movements of the neural plate, autonomous Perris, R. and Bronner-Fraser, M. 1989. Recent phogenesis and Malformations of Face and
movements of the epidermis, and interactions advances in defining the role of the extracellu- Brain. Birth Defects Original Article Series 11(7):
in the neural plate/epidermis transition zone. lar matrix in neural crest development. 95-129.
Dev. Dyn. 204: 323-337. Commun. Dev. Neurobiol. 1: 61-83. Rakic P. and Goldman, P. S. 1982. Develop-
Nagele, R. G. and Lee, H. Y. 1980. Studies on Perris, R., von Boxburg, Y. and Löfberg, J. 1988. ment and modifiability of the cerebral cortex.
the mechanism of neurulation in the chick: Local embryonic matrices determine region- Neurosci. Rev. 20: 429-611.
Rakic, P. and Sidman, R. L. 1973. Organization Selleck, M. A. and Bronner-Fraser, M. 1995. derived. cells of avian embryos. Development
of cerebellar cortex secondary to deficit of gra- Origins of the avian neural crest: the role of 111: 635-645.
nule cells in weaver mutant mice. J. Comp. neural plate-epidermal interactions. Develop- Studer, M., Lumsden, A., Ariza-McNaughton, L.,
Neurol. 152: 133-162. ment 121: 525-538. Bradley, A. and Krumlauf, R. 1996. Altered
Ramón y Cajal, S. 1890. Sur l’origene et les Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M. and Fraser, segmental identity and abnormal migration of
ramifications des fibres neuveuses de la moelle S. E. 1989. A vital dye analysis of the timing and motor neurons in mice lacking Hoxb-1. Nature
embryonnaire. Anat. Anz. 5: 111-119. pathways of avian trunk neural crest cell 384: 630-634.
Rawles, M. E. 1948. Origin of melanophores migration. Development 106: 809-816. Takeichi, M. 1988. The cadherins: Cell-cell
and their role in development of color patterns Shah, N. M. Groves, A. K. and Anderson, D. J. adhesion molecules controlling animal morpho-
in vertebrates. Physiol. Rev. 28: 383-408. 1996. Alternative neural crest cell fates are genesis. Development 102: 639-656.
Rickmann, M., Fawcett, J. W. and Keynes, R. J. instructively promoted by TGF-bð superfamily Tan, S.-S. and Morriss-Kay, G. 1985. The de-
1985. The migration of neural crest cells and memebers. Cell 85: 331-343. velopment and distribution of the cranial
the growth of motor neurons through the rostral Shah, N. M., Marchionni, M. A., Isaacs, I, neural crest in the rat embryo. Cell Tiss. Res.
half of the chick somite. J. Embryol. Exp. Stroobant, P. and Anderson, D. J. 1994. Glial 240:403-416.
Morphol. 90: 437-455. growth factor restricts mammalian neural crest Tassabehji, M., Newton, V. E. and Read, A. P.
Roessler, E. and seven others. 1996. Mutations stem cells to a glial fate. Cell 77: 349-360. 1994. Waardenburg syndrome type 2 caused by
in the human Sonic hedgehog gene cause Shawlot, W. and Behringer, R. R. 1995. Require- mutations in the human microplithalmia (MITF)
holoprosencephaly. Nat. Genet. 14: 357-360. ment for Lim1 in head-organizer function. Nature gene. Nat, Genet. 8: 251-255.
Romanes, G. J. 1901. Darwin and After Darwin. 374: 425-430. Teillet, M.-A., Kalcheim, C. and Le Douarin,
Open Court Publishing, London. Sidman, R. L., Dickie, M. M. and Appel, S. H. N.M. 1987. Formation of the dorsal root ganglia
Romeo, G. and ten others. 1994. Point mutations 1964. Mutant mice (quaking and jimpy) with in the avian embryo: Segmental origin and
affecting the tyrosine kinase domain of the RET deficient myelination in the central nervous migratory behavior of neural crest progenitor
proto-oncogene in Hirschsprung’s disease. Nature system. Science 144: 309-311. cells. Dev. Biol. 120: 329-347.
367: 377-378. Sieber-Blum, M. 1991. Role of neurotrophic Thomas, K. R. and Cappecchi, M. R. 1990.
Rubenstein, J. L. R. and Puelles, L. 1994. factors BDNF and NGF in the commitment of Targeted disruption of the murine int-1 proto-
Homeobox gene expression during development pluripotent neural crest cells. Neuron 6: 949-955 oncogene resulting in severe abnormalities in
of the vertebrate brain. Curr. Top. Dev. Biol. Sieber-Blum, M. and Sieber, F. 1984. Heteroge- midbrain and cerebellar development. Nature
29: 1-63. neity among early quail neural crest cells. Dev. 346: 847-850.
Saha, M., Spann, C. L. and Grainger, R. M. Brain Res. 14: 241-246. Thorogood, P. 1989. Review of Developmental
1989. Embryonic lens induction: More than Smith, J. L. and Schoenwolf, G. C. 1989. and Evolutionary Aspects of the Neural Crest.
meets the optic vesicle. Cell Differ. Dev. 28: Notochordal induction of cell wedging in the Trends Neurosci. 12: 38-39.
153-172. chick neural plate and its role in neural tube Tremblay, P., Kessel, M. and Gruss, P. 1995.
Sauer, F. C. 1935. Mitosis in the neural tube. J. formation. J. Exp. Zool. 250: 49-62. A transgenic neuroantornical marker identi-
Comp. Neurol. 62: 377-405. Smith, J. L. and Schoenwolf, G. C. 1991. Further fies cranial neural crest deficiencies associated
evidence of extrinsic forces in bending of the with the Pax3 mutant Splotch. Dev. Biol. 171:
Schoenwolf, G. C. 1984. Histological and
neural plate. J. Comp. Neurol. 307: 225-236. 317-329.
ultrastructural studies of secondary neurulation
in mouse embryos. Am. J. Anat. 169: 361-374. Spemann, H. 1938. Embryonic Development Turner, D. L. and Cepko, C. L. 1987. A common
and Induction. Yale University Press, New progenitor for neurons and glia persists in rat
Schoenwolf, G. C. 1991a. Cell movements driving
Haven. retina late in development. Nature 328: 131-136.
neurulation in avian embryos. Development 2
[Suppl.]: 157-168. Spieth, J. and Keller, R. E. 1984. Neural crest Vogel, K. S. and Weston, J. A. 1990. The
cell behavior in white and dark larvae of sympathoadrenal lineage in avian embryos. II.
Schoenwolf, G. C. 1991b. Cell movements in
the epiblast during gastrulation and neurulation Ambystoma mexicanum: Differences in cell Effects of glucocorticoids on cultured neural crest
in avian embryos. In R. Keller et al. (eds)., Gas- morphology, arrangement, and extracellular cells. Dev. Biol. 139: 13-23.
trulation. Plenum, New York, pp. 1-28. matrix as related to migration. J. Exp. Zool. Van Allen, M. I. and fifteen others. 1993.
229: 91-107. Evidence for multi-site closure of the neural tube
Schoenwolf, G. C. and Alvarez, I. S. 1989. Roles
of neuroepithelial cell rearrangement and Spritz, R. A., Gielbel, L. B. and Holmes, S. A. in humans. Am. J. Med. Genet. 47: 723-743.
division in shaping of the avian neural plate. 1992. Dominant negative and loss of function van Straaten, H. W. M., Hekking, J. W. M.,
Development 106: 427-439. mutations of the c-kit (mast/Stem cell growth Wiertz-Hoessels, E. J. L. M., Thors, F. and
factor) proto-oncogene in human piebaldism. Drukker, J. 1988. Effect of the notochord on
Schoenwolf, G. C. and Desmond, N. E. 1984.
Am. J. Hum. Genet. 50: 261-269. the differentiation of a floor plate area in the
Descriptive studies of the occlusion and
reopening of the spinal canal of the early chick Stemple, D. L. and Anderson, D. J. 1992. neural tube of the chick embryo. Anat. Embryol.
embryo. Anat. Rec. 209: 251-263. Isolation of a stem cell for neurons and glia 177: 317-324.
Schweizer, G., Ayer-LeLièvre, C. and Le from the mammalian neural crest. Cell 71: Varley, J. E., Wehby, R. G., Rueger, D. C. and
Douarin, N. M. 1983. Restrictions in develop- 973-985. Maxwell, G. D. 1995. Number of adrenergic and
mental capacities in the dorsal root ganglia du- Steingrimsson, E. and ten others. 1994. islet-1 immunoreactive cells is increased in avian
ring the course of development. Cell Differ. Molecular basis of mouse microphthalmia (mi) trunk neural crest cultures in the presence of
13:191-200. mutations helps explain their developmental human recombinant osteogenic protein-1. Dev.
Sechrist, J., Serbedzija, G. N., Scherson T., Fraser, and phenotypic consequences. Nat. Genet. 8: Dyn. 203: 434-447.
S. E. and Bronner-Fraser, M. 1993. Segmental 256-261. Vassar, R. and Fuchs, E. 1991. Transgenic mice
migration of the hindbrain neural crest does not Stocker, K. M., Sherman, L., Rees, S. and Ciment, provide new insights into the role of TGF-a
arise from its segmental origin. Development G. 1991. Basic FGF and TGF-bð1 influence during epidermal development and differentia-
118: 691-703. commitment to melanogenesis in neural crest- tion. Genes Dev. 5: 714-727.
von Baer, K. E. 1828. Entwicklungsgeschichte Weinstein, G. D. and van Scott, E. J. 1965. factors from notochord and floor plate. Cell 73:
der Thiere: Beobachtung und Reflexion. Turnover times of normal and psoriatic epider- 673-686.
Bornträger, Konigsberg. mis. J. Invest. Dermatol. 45: 257-262. Yamamori, T., Fukada, K., Aebersold, R.,
Walsh, C. and Cepko, C. L. 1988. Clonally Weston, J. 1963. A radiographic analysis of the Korsching, S., Fann, M.-J. and Patterson, P.
related cortical cells show several migration migration and localization of trunk neural crest H. 1989. The cholinergic neuronal differen-
patterns. Science 241: 1342-1345. cells in the chick. Dev. Biol. 6: 274-310. tiation factor from heart cells is identical to
Walsh, C. and Cepko, C. L. 1992. Widespread Weston, J. A. 1991. Sequential segregation and leukemia inhibitory factor. Science 246:
dispersion of neuronal clones across functional fate of developmentally restricted intermediate 1412-1416.
regions of the cerebral cortex. Science 255: cell populations in the neural crest lineage. Curr. Yuodelis, C. and Hendrickson, A. 1986. A
434-440. Top. Dev. Biol. 25: 133-153. qualitative and quantitative analysis of the
Webster, E. H., Silver, A. F. and Gonsalves, N. I. Witte, 0. N. 1990. Steel locus defines new human fovea during development. Vision Res.
1984. The extracellular matrix between the multipotent growth factor. Cell 63: 5-6. 26: 847-855.
optic vesicle and the presumptive lens during Yamada, K. M., Spooner, B. S. and Wessells, N.
lens morphogenesis in an anophthalmic strain K. 1971. Ultrastructure and function of growth
of mice. Dev. Biol. 103: 142-150. cones and axons of cultured nerve cells. J. Cell
Weinstein, D. C., Rahman, S. M., Ruiz, J. C. and Biol. 49: 614-635.
Hemmati-Brivanlou, A. 1996. Embryonic Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T. and Jessell,
expression of EPH signaling factors in Xenopus. T. M. 1993. Control of cell pattern in the neural
Mech. Dev. 57: 133-144. tube: Motor neuron induction by diffusible
Especificidade axônica
8
Assim, para além de questões de quantida-
de, existem questões de padrões que são es-
senciais para a compreensão da Natureza.
ALFRED NORTH WHITEHEAD (1934)
N ÃO SOMENTE AS CÉLULAS PRECURSORAS NEURONIAIS MIGRAM
para os seus locais de atuação, como também o fazem os seus axônios.
Diferentemente da maioria das células cujas partes permanecem no mesmo
lugar, a célula nervosa é capaz de alongar axônios que podem se estender por metros.
O axônio tem seu próprio aparelho locomotor residindo no cone de crescimento, que
Tal como o entomologista à procura de bor- pode responder aos mesmos tipos de sinais que as células migratórias podem perce-
boletas brilhantes coloridas, minha atenção ber. Assim, o movimento axônico pode ser direcionado pela quimiotaxia, galvanotaxia,
perseguiu no jardim da matéria cinzenta, e condução por contato, tal como as células migratórias. Os sinais para a migração
células de formas delicadas e elegantes, as axônica podem, além disso, ser ainda mais específicos que aqueles empregados para
misteriosas borboletas da alma.
conduzir certos tipos de células para determinadas áreas. O cérebro humano, por
S. RAMÓN Y CAJAL (1937)
exemplo, é a matéria mais organizada conhecida. Cada um dos seus 1011 neurônios
tem o potencial de interagir especificamente com milhares de outras células, e um
neurônio grande (tal como uma célula de Purkinje ou um neurônio motor) pode
receber informações de mais de 105 outras células (Figura 8.1; Gershon et al., 1985).
O entendimento da geração dessa complexidade organizada é um dos maiores desa-
fios para a ciência moderna.
Goodman e Doe (1993) enumeram oito estágios de neurogênese: (1) indução e
padronização de uma região formadora de neurônios (neurogênica); (2) nascimento e
migração de neurônios e glia; (3) geração de destinos celulares específicos; (4) condu-
ção de cones de crescimento para alvos específicos; (5) formação de conexões sináp-
ticas; (6) ligação de fatores tróficos para a sobrevivência e diferenciação; (7) rearranjo
competitivo de sinapses funcionais; e (8) continuada plasticidade sináptica durante a
vida do organismo. Os dois primeiros processos foram tópicos do capítulo anterior.
Aqui, continuamos a investigar o processo do desenvolvimento neural. [axon1.html]
A geração da diversidade neuronial

Neurônios são moldados em uma maneira hierárquica. A primeira decisão é se uma
determinada célula deverá ser um neurônio ou algo diferente. Se a célula deve tornar-
se um neurônio, a decisão seguinte informa o neurônio sobre seu tipo. Ele deverá
tornar-se um neurônio motor, um neurônio sensorial, um neurônio comissural, ou
algum outro tipo? Após esse destino ter sido determinado, é ainda tomada outra
decisão, dando ao neurônio um alvo específico. Para ilustrar essa especificação pro-
gressiva, iremos enfocar os neurônios motores de vertebrados e Drosophila.
307
Figura 8.1
Conexões de axônios a um neurônio do
hipocampo cultivado. O neurônio foi delinea-
do pela proteína sináptica sinaptotagmina, que
está presente nos terminais dos axônios que
contatam o neurônio. (Cortesia de M. Matteoli
e P. De Camilli.)
Especificação do Neurônio Motor de V ertebrado

Vertebrado
Vertebrados formam um tubo neural dorsal, enquanto invertebrados, tal como a
Drosophila, formam um tubo neural ventral. No entanto, a especificação do ectoder-
ma neural é mediada pela ligação de proteínas semelhantes. Em Xenopus (e prova-
velmente outros vertebrados) a notocorda secreta as proteínas Chordin e Noggin.
Essas proteínas ligam BMP4, e o ectoderma na vizinhança da notocorda desenvolve
a capacidade de formar neurônios. Se o ectoderma está exposto a BMP4, ele torna-se
epidérmico (Sasai et al., l995; Piccolo et al., 1996; veja Capítulo 16). Na ausência de
estimulação por BMP4 as células ectodérmicas dos vertebrados parecem sintetizar
um fator de transcrição (ou um conjunto de fatores de transcrição) que compromete
as células à uma linhagem neural. Posteriormente, as células irão sintetizar outras
proteínas (tal como a NeuroD) que levam-nas a expressar seu fenótipo neural (Turner
e Weintraub, 1994; Lee et al., 1995).
As decisões relativas ao tipo de neurônio parecem ser controladas pela posição
do precursor neuronial no interior do tubo neural e pelo momento quando esse sofre
sua última divisão celular. Conforme descrito no capítulo anterior, os neurônios na
margem ventro-lateral tornam-se neurônio motores, enquanto os neurônios sensori-
ais são derivados de células na região dorsal do tubo. Como transplante de células da
placa ectópica do assoalho ou notocorda (que secretam a proteína Sonic hedgehog)
para áreas laterais pode re-especificar células dorsolaterais em neurônios motores,
essa decisão quanto ao tipo de neurônio é provavelmente uma função de sua posição
em relação à placa do assoalho. Ericson e colega (1996) mostraram que são necessári-
os dois períodos de sinalização de Sonic hedgehog para especificar os neurônios
motores: um período precoce durante o qual as células são instruídas para se tornarem
neurônios ventrais e um período mais tardio (que inclui a fase S de sua divisão de
aniversário) que especifica que o neurônio ventral está para se tornar um neurônio
motor (em vez de um interneurônio). A primeira fase é provavelmente regulada pela
secreção de Sonic hedgehog pela notocorda, enquanto o estágio mais tardio é mais
CAPÍTULO 8 Especificidade Axônica 309
provavelmente regulado pelas células da placa do assoalho. A Sonic hedgehog parece

especificar os neurônios motores pela indução do fator de transcrição Islet-1. Essa
proteína é encontrada em todos os neurônios motores mas em nenhum outro tipo de
neurônio (Ericson et al., 1992; veja Prancha 32). Outro fator que afeta o tipo neuronial
é a idade da célula por ocasião da última divisão. Como discutido no capítulo anterior,
o aniversário de uma célula determina em que camada do córtex ela irá penetrar.
A próxima decisão envolve a especificidade do alvo. Se uma célula se destina a ser
um neurônio e, especificamente, um neurônio motor, esse neurônio motor irá inervar a
coxa, o membro anterior, ou a língua? A determinação da especificidade parece ser
regulada pela posição do neurônio motor ao longo dos eixos ântero-posterior e media-
no-lateral do tubo neural. O tubo neural tem uma distinta polaridade ântero-posterior do
prosencéfalo ao longo da medula espinhal. No Capítulo 16 iremos discutir o complexo do
gene Hox que determina essa polaridade dentro da medula espinhal e que fornece
especificidade de alvo aos respectivos neurônios motores. Esses genes trabalham em
combinação para definir a identidade posicional de cada região do embrião. Landmesser
(1978) e Holliday (1980b) mostraram que os neurônios motores que têm a mesma especi-
ficidade estão agrupados. Os corpos celulares de neurônios motores que se projetam
para um único músculo estão agregados em uma coluna longitudinal formando um
“pool”. Os “pools” estão agregados formando colunas maiores de acordo com seu alvo.
Neurônios motores na Coluna de Terni (CT) se projetam ventralmente para dentro dos
gânglios simpáticos. “Pools” motores da coluna motora lateral (LMC) se estendem para
a musculatura dos membros, enquanto os neurônios motores na coluna motora mediana
(MMC) se projetam para dentro dos músculos axiais. As colunas dos membros e as
axiais são subdivididas ao longo do eixo mediano-lateral de maneira a se correlacionar
com a posição dorsoventral dos seus respectivos alvos (Figura 8.2; Tosney et al., 1995).
Esse arranjo de neurônios motores é constante para os vertebrados. [axon2.html]
As especificidades dos alvos desses neurônios motores são especificadas antes
de seus axônios se estenderem para a periferia. Isso foi mostrado por Lance-Jones e
Landmesser (1980), que reverteram segmentos da medula espinhal de pintos fazendo
com que os neurônios motores se encontrassem em novos locais. Os axônios se
dirigiram para seus alvos originais, não para aqueles esperados devido suas novas
posições (Figura 8.3). A base molecular dessa especificidade poderia residir em mem-
bros da família de proteínas LIM (veja Figura 8.2; Tsushida et al., 1994). A família LIM
inclui Islet-1. Islet-2, LIM-1, LIM-2 e LIM-3, e cada uma dessas proteínas é um fator de
transcrição. As proteínas LIM foram implicadas na especificação do destino de célu-
las em nematóides (nos quais o gene LIM mec-3 especifica um neurônio receptor de
Colunas de um lado Ordem da Neurônio Projeção de neurônios

Níveis do tubo neural expressão gênica motor dentro de cada coluna
Figura 8.2
Tubo neural Torácica Organização de neurônios motores e especifi-
Cervical
cação LIM. À esquerda está metade da medula
Músculo
espinhal. Os neurônios nessas colunas apre-
Membro Dorsal
sentam conjuntos específicos de genes LIM, e
Parede
anterior do corpo neurônios dentro de cada coluna fazem deci-
sões semelhantes quanto à escolha de trajetóri-
as. Neurônios motores CT projetam-se ven-
Ventral tralmente para os gânglios simpáticos. A colu-
Torácico Membro posterior na MMC projeta-se para os músculos axiais, e
Músculo a LMC envia axônios para a musculatura dos
Dorsal
membros. Quando essas colunas são subdivi-
didas, as subdivisões medianas (m) se proje-
Membro ou
tam para as posições ventrais e as subdivisões
posterior laterais (l) enviam axônios para as regiões dor-
Ventral
sais dos tecidos alvo. (Segundo Tsushida et
Tempo al., 1994; Tosney et al., 1995.)
(A) Estágio 15-16
Estágio 28.5 Estágio 28.5
Plexo Plexo
crural crural
Axial
Axial
Sartório Sartório
(B) Controle (C) Revertido
Figura 8.3
Compensação por pequenos deslocamentos da posição de iniciação axônica no embrião do pinto.
(A) Um pedaço da medula espinhal compreendendo vários segmentos T7-S3 (sétimo torácico ao
terceiro lombo-sacral) é revertido no embrião de 2.5 dias. (B) Padrão normal de projeção axônica
para diferentes músculos aos 6 dias. (C) Projeções axônicas no segmento revertido. Os neurôni-
os localizados ectopicamente finalmente acharam seus caminhos neurais apropriados e inervaram
os músculos apropriados. (de Lance-Jones e Landmesser, 1980.)
toque; Way e Chalfie, 1988) e são importantes para o desenvolvimento cerebral em

camundongos (Shawlot e Behringer, 1995). Por exemplo, todos os neurônios motores
expressam Islet-1 e (um pouco depois) Islet-2. Se nenhum outro desses genes LIM for
expresso, os neurônios se projetam para os músculos da parede ventral do corpo.
Aqueles neurônios na coluna mediana da MMC também expressam LIM-3, o que os
distingue dos outros neurônios motores. Os “pools” laterais da coluna de LMC são
distinguidos pela sua expressão curta de LIM-1, enquanto os neurônios motores CT
param de expressar Islet-2. Assim, cada projeção é caracterizada por uma constelação
particular de fatores de transcrição LIM.
Especificação dos Neurônios Motores em Drosophila

A especificação do ectoderma neural em vertebrados e artrópodes parece ser conduzida
de maneira surpreendentemente semelhante. A especificação do ectoderma neurogênico
em Drosophila envolve a secreção do homólogo de Chordin da Drosophila, a proteí-
na Short-gastrulation. Essa proteína é produzida pelas células ventro-laterais do blas-
toderma, e liga-se ao homólogo da BMP4 da Drosophila, a proteína Decapentaplegic
(veja Figura 15.32; Holley et al., 1995). As células que secretam a proteína Short-
gastrulation são poupadas dos efeitos lateralizantes da Decapentaplegic, e tornam-se
capazes de formar o cordão nervoso ventral. Durante a gastrulação, as células coloca-
das mais vegetalmente, as precursoras do mesoderma, invaginam para o interior da
blastocele vitelínica, causando a localização do ectoderma neurogênico na região
ventral do embrião (Figura 8.4). O ectoderma delamina cerca de 60 células (30 de cada
lado) dentro do embrião, e essas (em conjunto com as células da linha mediana ven-
tral) são as precursoras dos neurônios, os neuroblastos. O compromisso de tornar-se
ectoderma é uma conseqüência do posicionamento ao longo do eixo dorsoventral do
embrião e será discutido em capítulos subseqüentes. O compromisso de tornar-se um
neuroblasto em lugar de uma célula epidérmica é feito por um grupo de genes chamados
Figura 8.4
Desenvolvimento da região neurogênica de in-
setos. No blastoderma, o neuroectoderma
Embrião de Drosophila presuntivo está localizado em um outro lado
dos precursores mesodérmicos. Durante a gas-
trulação e extensão da banda germinativa, o
mesoderma se invagina da superfície para o
interior do embrião. As células precursoras da
linha neural mediana são agora as células mais
ventrais do embrião. O ectoderma delamina
neuroblastos para dentro do embrião (junta-
Alongamento da Delaminação
mente com células da linha mediana ventral)
Blastoderma
Gastrulação para formar o sistema nervoso central. Os neu-
celular banda geminativa do neuroblasto
roblastos geram uma série de células-mãe gan-
Ectoderma glionares, cada uma das quais gera dois neurô-
superficial
nios. No caso, é mostrado o neuroblasto 1-1.
Neuroectoderma (Segundo Goodman e Doe, 1993.)
presuntivo
Células presuntivas
da linha mediana Neuroblastos
Precursores
Mesoderma Ectoderma ventral (do da linha
ectoderma neurogênico) mediana
Neurônios
Célula-mãe do Crescimento
gânglio axônico
Neuroblasto
NB 1-1
Interno
Externo
genes proneurais (Figura 8.5). Esses constituem um conjunto de fatores de transcri-

ção encontrados em arranjos de cerca de quatro a seis células na região ectodérmica.*
Cada arranjo forma uma zona de interação onde uma (e apenas uma) das células se
torna um neuroblasto. Uma célula compromissada para formar um neuroblasto, inibe
as outras células de seu arranjo de se tornarem neuroblastos. Isso é conseguido pela
interação com um grupo de genes chamados de genes neurogênicos. As proteínas
Notch e Delta são críticas nessas reações. Essas proteínas se integram na membrana
celular. Suas interações sugerem que a célula que está destinada a se tornar um
neuroblasto diminui a regulação da sua proteína Notch, que leva suas vizinhas a
diminuir a regulação das suas proteínas Notch. Essa decisão é comunicada através de
proteínas Delta. Dessa maneira, o neuroblasto inibe lateralmente outras células do
agregado de se tornarem neuroblastos (veja Capítulo 17). [axon3.html]
Tal como acontece em vertebrados, a especificação de neuroblasto em Drosophila
é conseguida pela expressão combinatória de diferentes genes. (De maneira interes-
sante, esses genes foram usados anteriormente para especificar cada região do
blastoderma da Drosophila). Se quaisquer desses genes não forem capazes de funci-
onar, os neuroblastos se comportam como se fossem outros tipos de neurônios, fre-
qüentemente formando nervos que enviam seus axônios para alvos errados (Chu-
LaGraff et al., 1995). [axon4.html]
*Esses fatores de transcrição são membros da família achaete-scute. Interessantemente, alguns

dos fatores de transcrição envolvidos na determinação neural de vertebrados são também membros
dessa família (Turner e Weintraub, 1994).
Figura 8.5
Especificação seqüencial da linhagem de neuroblastos. (A) O ectoderma neurogênico é especi-
ficado por sinais posicionais ao longo dos eixos dorsoventral e ântero-posterior. (B,C) Agrega-
dos de neuroblastos potencias estão especificados por genes proneurais como o achaete (mostra-
do em F). (D) Interação entre neuroblastos potenciais seleciona uma célula do agregado para ser
neuroblasto, e essa célula inibe as outras células do agregado de se tornarem neuroblastos. (E) Os
neuroblastos brotam das células-mãe ganglionares (da maneira que será discutida no Capítulo
Ectoderma 13), cada uma indo formar dois neurônios. (F) Embrião de Drosophila corado para o transcrito
superficial
de achaete. Os agregados neurogênicos expressam esse gene. Os parênteses indica um domínio
de atividade neurogênica. (Segundo Goodman e Doe, 1993; fotografia de Skeath e Carrol, 1922;
cortesia de J. Skeath.)
Ectoderma
neurogênico Formação de padrões no sistema nervoso
O funcionamento do cérebro vertebrado não depende somente da diferenciação e do
(A) Sinais posicionais:
posicionamento das células neurais, mas também das conexões específicas dessas
genes de segmentação (A/P),
genes dorso/ventrais
células entre si e seus alvos periféricos. De alguma maneira, os nervos de um órgão
sensorial como o olho devem se conectar a neurônios específicos no cérebro, que
podem interpretar estímulos visuais, e os axônios do sistema nervoso têm que atra-
(B) Especificação neuroblástica
vessar grandes extensões de tecidos antes de inervar o tecido alvo apropriado. Como
genes de identidade neuroblástica
“sabe” o axônio nervoso atravessar numerosas outras células alvos em potencial para
fazer sua conexão especifica? Harrison (1910) sugeriu que a especificidade do cresci-
mento axônico é devida às fibras nervosas pioneiras, que avançam na frente de outros
axônios e servem como guias para elas.* Essa observação simplifica, mas não resolve,
(C) Formação neuroblástica
o problema de como os neurônios formam padrões apropriados de interconexões.
genes proneurais
Harrison também observou que os axônios devem crescer em um substrato sólido, e
especulou que diferenças nas superfícies embrionárias podem permitir aos axônios
viajar em certas regiões específicas. As conexões finais ocorreriam por interações
complementares na superfície celular:
(D) Inibição lateral
Que deve haver uma espécie de reação na superfície entre cada tipo de fibra
genes neurogênicos
nervosa e a estrutura particular a ser inervada parece claro a partir do fato de
que fibras sensoriais e motoras, embora correndo próximas no mesmo feixe,
ainda assim formem conexões periféricas apropriadas, umas com a epiderme e as
outras com o músculo... Esses Fatos sugerem que pode haver aqui certa analo-
(E) Linhagem celular neuroblástica gia com a união do óvulo com o espermatozóide.
células-mãe ganglionares e genes
de identidade neural
Pesquisa sobre a especificidade de conexões neuroniais tem enfocado dois tipos
Neurônios principais de sistemas: neurônios motores, cujos axônios viajam de um nervo para um
Células-mãe
ganglionares músculo específico, e o sistema óptico, cujos axônios originando na retina encontram
Neuroblastos
seu caminho de retorno ao cérebro. Em ambos, a especificidade das conexões axônicas
desenrola-se em três etapas (Goodman e Shatz, 1993):
(F)
• Seleção de trajetória, onde os axônios viajam por uma rota que os conduz a
uma região particular do embrião.
*Os cones de crescimento dos neurônios pioneiros migram para seus tecidos alvos enquanto as
distâncias embrionárias ainda são curtas e o tecido embrionário interveniente é ainda relativamente
não-complicado. Mais tardiamente no desenvolvimento, os outros neurônios que inervam o tecido
alvo se ligam (fasciculam) ao neurônio pioneiro e assim penetram no tecido alvo. Klose e Bentley
(1989) mostraram que em alguns casos, os neurônios pioneiros morrem após outros neurônios
terem atingido sua destinação. No entanto, tivesse esse neurônio pioneiro sido impedido de se
diferenciar, os outros axônios não teriam atingido seu tecido alvo.
• Seleção de alvo, onde os axônios, uma vez atingido a área correta, reconhecem
e ligam-se a um conjunto de células com as quais podem formar conexões
estáveis.
• Seleção de endereço, onde os padrões iniciais são refinados fazendo cada
axônio se ligar a um pequeno subconjunto (às vezes de somente um) de seus
possíveis alvos.
Os dois primeiros processos são independentes da atividade neuronial. O terceiro

envolve interações entre diversos neurônios ativos e converte projeções sobrepos-
tas, em um padrão de conexões finalmente concatenadas. É conhecido desde 1930 que
os axônios motores podem encontrar seus músculos apropriados mesmo quando a
atividade neural dos axônios está bloqueada. Twitty (que havia sido aluno de Harrison)
e seus colegas acharam que os embriões do tritão Taricha torosa secreta uma toxina,
tetrodotoxina, que bloqueava a transmissão neural em outras espécies. Transplantan-
do pedaços de Taricha torosa para outros embriões de salamandra, eles foram capa-
zes de paralisar os embriões hospedeiros por dias enquanto ocorria o desenvolvimen-
to. Aproximadamente no momento em que os girinos iriam se alimentar, a toxina desa-
parecia, e as salamandras nadaram e se alimentaram normalmente (Twitty e Johnson,
1934; Twitty, 1973). Experimentos mais recentes usando mutantes do peixe-zebra ten-
do receptores neurotransmissores não-funcionais, demonstraram de maneira seme-
lhante que os neurônios motores estabeleciam seus padrões normais de inervação na
ausência de atividade neuronial (Westerfield et al., 1990).
Porém, permanecia a questão, Como são instruídos os axônios a respeito do local
para onde devem ir? Conforme mencionado no Capítulo 3, as células migratórias rece-
bem seus sinais de substâncias difusivas, íons, ou da matriz extracelular sobre a qual
viajam. O cone de crescimento é capaz de responder ao mesmo tipo de sinais, e conduz
o axônio da soma da célula neural para o seu tecido alvo. Deve-se recordar do capítulo
anterior que o cone de crescimento arrasta o axônio para frente. O axônio não é estica-
do pelos empurrões vindos do corpo celular.
Seleção de trajetórias: Orientação pela matriz extracelular

A matriz extracelular pode prover informação para a navegação de várias maneiras –
algumas mais específicas que outras. Canais e pregas na matriz extracelular podem
restringir o caminho de crescimento axônico à uma certa região; isso é uma maneira
muito crua de orientação. Além disso, certas proteínas da lâmina basal podem ser mais
adesivas que outras e estender viés para a movimentação axônica ao longo da mem-
brana basal. Finalmente, moléculas na matriz extracelular podem repelir ativamente
certos axônios, causando o colapso do cone de crescimento. Como veremos, todos
esses mecanismos parecem atuar no embrião.
Orientação pelo T erreno Físico: Orientação por Contato

Terreno
Uma das primeiras hipóteses a respeito da especificidade do crescimento axônico
envolve a orientação por contato, ou estereotropismo. Aqui, sinais físicos do substrato
dirigem o crescimento neural. Harrison desenvolveu uma técnica de desenvolver
axônios em coágulos sangüíneos, e usando essa técnica, Weiss (1955) observou que
os axônios em crescimento não somente necessitavam de um substrato sólido para
migrar, mas também que a migração tendia a seguir descontinuidades no coágulo.
Quando as fibras do coágulo se orientavam de maneira aleatória, os axônios seguiam
esse padrão aleatório. Porém, quando as fibras foram produzidas paralelas pela aplica-
ção de tensão sobre o coágulo, os axônios do nervo caminhavam ao longo dessas
fibras, não se afastando da retidão (veja Figura 3.31). Singer e seus colaboradores (1979)
encontraram evidência que tais fatores físicos operam in vivo para guiar os cones de
crescimento. Eles detectaram grandes canais entre células epidérmicas da medula
espinhal da salamandra, através das quais migram os axônios em crescimento. Eles
consideraram a hipótese de que esses canais proviam sinais para guiar os axônios
em direção às regiões apropriadas do cérebro. Canais celulares foram também detec-
tados na retina do camundongo (Silver e Sidman, 1980), e parecem guiar os cones de
crescimento das células ganglionares da retina para o caule óptico durante seu
desenvolvimento.
A presença de canais preexistentes provavelmente não é crítica para o crescimento
da maioria dos axônios. O cone de crescimento parece capaz de digerir seus próprios
canais através de uma matriz extracelular secretando enzimas proteolíticas para sua
vizinhança imediata (Pittman, 1985).
Orientação para Gradientes de Adesão: Haptotaxia

O cone de crescimento de um axônio em desenvolvimento encontra numerosos
microambientes, e alguns locais podem conter moléculas que são mais adesivas que
outras encontradas em outros locais. A capacidade de um cone de crescimento (ou de
uma célula) para migrar subindo um gradiente de adesividade é chamada haptotaxia. O
cone de crescimento tem receptores que reconhecem proteínas encontradas em certas
lâminas basais e o cone conduz o axônio ao longo de caminhos recobertos por essas
proteínas. A hipótese da especificidade adesiva diferencial postula que o cone de cres-
cimento irá encontrar um ambiente irregular e que reconhece o seu caminho por ter
receptores particulares para certas moléculas no ambiente. Isso pode ser visto in vitro.
Quando colocado em cultura, um pedaço de tecido da retina neural não emite facilmente
A B
C
Figura 8.6
Efeitos dos fatores do substrato no crescimento
neural. (A,B) Efeitos de fibronectina no cres-
cimento neural de agregados da retina neural.
O agregado em (A) foi cultivado por 36 horas
em plástico de cultura de tecidos não-tratado.
O agregado em (B) foi cultivado em plástico
tratado com 50µg de fibronectina por milili-
tro. (C) Crescimento de neurônios sensoriais
colocados em substrato padronizado consis-
tindo de faixas paralelas de laminina aplica-
das sobre um fundo de colágeno de tipo IV.
(A e B de Akers et al., 1981, cortesia de J.
Lilien; C de Gundersen, 1987, cortesia de R.
W. Gundersen.)
axônios para a placa de plástico. Porém, se a placa for recoberta com fibronectina ou Cadeia A
laminina, crescimento de longos axônios são observados (Figura 8.6). Reciprocamente,
glicosaminoglicanos, outro conjunto de proteínas associadas com matrizes extracelulares,
Região de ligação Local de fixação
parecem impedir esses crescimentos neurais (Tosney e Landmesser, 1985). de células epiteliais de células RDG
A presença de tais moléculas delineia as trajetórias através do embrião (Akers et
al., 1981; Gundersen, 1987), e muitos dos caminhos percorridos pelos axônios parecem Cadeia B1 Cadeia B2
ser pavimentados por laminina. Letourneau e colaboradores (1988) mostraram que os
axônios de certos neurônios espinhais migram através do neuroepitélio por uma su-
perfície transitoriamente recoberta por laminina que indica precisamente o caminho
desses axônios. De maneira semelhante, existe muito boa correlação entre o alonga- Domínio de
Local YIGSR ligação de
mento dos axônios da retina e a presença de laminina nas células neuroepiteliais e colágeno
de fixação celular
astrócitos no cérebro do embrião do camundongo (Cohen et al., 1986, 1987; Liesi e e migração tipo IV
Silver, 1988). Depósitos puntiformes de laminina são vistos nas superfícies das células
gliais ao longo do caminho levando da retina para o tectum óptico, ao passo que áreas
adjacentes onde o nervo ótico deixa de crescer não há tais depósitos de laminina.
Após os axônios da retina terem alcançado o tectum, as células gliais se diferenciam e
perdem sua laminina. Nesse ponto, os neurônios ganglionares da retina que formaram o Região de
nervo ótico perdem seu receptor integrina para a laminina. Depósitos de laminina podem crescimento
de neuritos
também ser necessários para a regeneração do tecido neural. Células astrogliais conten-
do laminina puntiforme em suas superfícies podem induzir a regeneração quando colo-
cadas em embriões nos quais os caminhos neuroniais do corpo caloso foram rompidos.
Existem ao menos quatro regiões da glicoproteína laminina que podem sustentar
a migração e o crescimento axônico (Figura 8.7). Primeiro, as integrinas do cone de
crescimento podem se ligar à seqüência RGD da proteína laminina. Segundo, outro Região ligante de
receptor do cone de crescimento pode reconhecer a seqüência de aminoácidos YIGSR heparina e axônio
na laminina, enquanto a região de 10 aminoácidos rica em isoleucina do peptídeo B2 é
crítica para o crescimento neurítico de certos neurônios (Matsuzawa et al., 1996). O Figura 8.7
quarto receptor para laminina do cone de crescimento é a glicosiltransferase que Estrutura de laminina e propostas para regiões
ligantes.
reconhece certas cadeias laterais de carboidrato da molécula de laminina (Begovac e
Shur, 1990; Thomas et al., 1990). Esses carboidratos podem residir no domínio de
“crescimentos neuríticos” da cadeia A da laminina.
Condução por Sinais Migratórios Específicos do Axônio:

A Hipótese das Trajetórias Marcadas
Por serem encontradas em muitos lugares através do embrião, moléculas da matriz
extracelular como a laminina e N-CAM podem usualmente proporcionar somente si-
nais gerais para a movimentação dos cones de crescimento. Seria difícil para tais
moléculas generalizadas dirigir cones de crescimento de diferentes tipos em direções
diferentes. Apesar disso, em Drosophila, gafanhotos e Caenorhabditis (e provavel-
mente na maioria dos invertebrados), a padronização do movimento axônico é um
processo surpreendentemente preciso, e os axônios adjacentes estão dando instru-
ções migratórias diferentes de seus ambientes. Por exemplo, de dentro de cada seg-
mento do gafanhoto emergem 61 neuroblastos (30 de cada lado e um no centro). Um
desses, o neuroblasto 7-4, é uma célula germinativa e dá origem a uma família de seis
neurônios, chamados C, G, Q1, Q2, Q5 e Q6. Essa família de neurônios está mostrada na
Figura 8.8, do mesmo modo que os neurônios amarelos na Prancha 20. Os cones de
crescimento axônico desses neurônios alcançam seus alvos seguindo caminhos es-
pecíficos formados por outros neurônios precoces. Q1 e Q2 seguem um caminho reto
juntos, atravessando numerosas outras células, até encontrar o axônio do neurônio
precursor da linha mediana dorsal (dMP2), na qual eles seguem posteriormente. Os
outros quatro neurônios da família 7-4 migram através do axônio dMP2 como se esse
não existisse. Axônios do neurônios C e G progridem juntos por um longo caminho,
mas finalmente C segue os nervos X1 e X2 para a parte posterior do segmento, en-
quanto G adere aos axônios P1 e P2 (que prosseguirão posteriormente) e move-se
anteriormente sobre suas superfícies (Goodman et al., 1984, Taghert et al., 1984).
Precursor da linha mediana
Neuroblasto lateral
Neuroblasto 7-4
Neuroblasto mediano
Neuroblasto 7-4
Células-mãe ganglionares
Progênie:
Neurônios irmãos
Axônios
Cones de
crescimento
Fascículos axônicos
Figura 8.8
Cada um dos 17 segmentos do embrião preco-
ce do gafanhoto tem o mesmo padrão de neu-
roblastos. Existem 30 neuroblastos laterais de O cone de crescimento G terá encontrado mais de 100 superfícies diferentes às quais
cada lado, um neuroblasto mediano e 7 precur- poderia aderir, mas ele é específico para os neurônios P. Se os neurônios P são destruídos
sores na linha mediana. Os neuroblastos da por laser, os cones de crescimento G agem anormalmente, seus filopódios procurando
linha mediana se dividem uma vez, enquanto
aleatoriamente pela superfície migratória apropriada. Se qualquer dos outros cento e
os neuroblastos são células-tronco que divi-
dem-se repetidamente para formar as “células- tantos neurônios forem destruídos, o cone de crescimento G comporta-se normalmente.
mãe ganglionares”. Cada uma das células se Essa formulação de encontro de trajetórias axônicas em insetos foi chamada de
divide uma vez para fornecer dois neurônios hipótese de trajetórias marcadas porque significa que um dado neurônio pode reco-
irmãos. O neuroblasto 7-4 tem uma progênie nhecer especificamente a superfície de outro neurônio que se desenvolveu anterior-
de quase 100 neurônios, dos quais os primei- mente. A evidência para essa especificidade vem de estudos usando anticorpos
ros 6 são aqui mostrados. (Segundo Goodman monoclonais (Bastiani et al., 1987). Neurônios aCC e pCC são neurônios irmãos no
e Bastiani, 1984.) gafanhoto (ambos são derivados do neuroblastos 1-1) que têm destinos muito dife-
rentes. Além disso, conjuntos diferentes de axônios aderem a cada um deles, criando
feixes independentes de axônio, chamados fascículos. A especificidade dessa
fasciculação depende da presença da proteína fasciclina I. Essa proteína é encontra-
da nos dois neurônios aCC de cada segmento do embrião de 10 horas, mas não está
presente nos neurônios pCC. Perto da hora 11, porém, outros neurônios (mas não
pCC) são vistos expressar essa molécula da superfície celular. Esses neurônios são
precisamente aqueles (RP1, RP2, U1, U2 ) cujos axônios fasciculam com aCC. Existem
pelo menos quatro moléculas de fasciclina expressas em diferentes subconjuntos de
neurônios, e cada uma dessas moléculas permite aos cones de crescimento de certos
neurônios reconhecer especificamente aqueles axônios com os quais irão fascicular
(Harrelson e Goodman, 1988; Zinn et al., 1988).
Em outros animais com sistemas nervosos relativamente simples, tal como a san-
guessuga, existe evidência de que cada neurônio teria moléculas de superfície celular
qualitativamente diferentes e que essas moléculas poderiam ser importantes na espe-
cificidade sináptica. O sistema nervoso da sanguessuga consiste de 34 gânglios
(A) (B)
Figura 8.9
Neurônios funcionais específicos corados por
pareados contendo cerca de 400 neurônios cada. Foram identificados neurônios indi- anticorpos monoclonais para componentes da
viduais, e as funções de muitos desses neurônios são conhecidas. Zipser e Mckay superfície celular. (A) Anticorpos Lan 3-1 re-
(1981) injetaram o sistema nervoso da sanguessuga em camundongos e obtiveram conhecem um único par de neurônios em um
determinado gânglio. Esses neurônios funcio-
centenas de anticorpos monoclonais que se ligaram a várias regiões do sistema nervo-
nam na eversão peniana. (B) Um conjunto de
so. Em alguns casos, essas diferenças puderam ser correlacionadas com função. O neurônios reconhecidos pelos anticorpos Lan
anticorpo monoclonal Lan 3-1 se ligou especificamente a um único par de neurônios 3-2; esses neurônios respondem à estimulação
em cada um dos gânglios do corpo mediano (Figura 8.9). Esses pares de neurônios são nociva da pele da sanguessuga. (de Zipser e
conhecidos por controlar o processo da eversão peniana nas sanguessugas em Mckay, 1981, cortesia de B. Zipser.)
copulação. Outro anticorpo monoclonal, Lan 3-2, reconheceu todos os quatro neurô-
nios em cada gânglio, que respondem a estímulos mecânicos nocivos. “A situação”,
de acordo com Zipser e Mckay “parece bastante análoga a cabos elétricos codifica-
dos por cores contendo muitos fios, onde cada fio tem sua própria molécula (corante)
para facilitar o reconhecimento apropriado e conexão à terminais”.
Estudos sobre trajetórias marcadas especificamente em vertebrados estão muito
atrasados em comparação com aqueles em invertebrados, mas estudos recentes nos
neurônios motores do peixe-zebra indicam que as trajetórias marcadas também funci-
onam aqui. O peixe-zebra poderá tornar-se o organismo de escolha em neurobiologia
desenvolvimental em vertebrados, porque tem desenvolvimento muito rápido, muitos
indivíduos podem ser comparados, e os embriões são transparentes, permitindo aos
neurobiologistas observar o crescimento dos axônios em embriões vivos. Neurônios
podem ser identificados pela injeção de substâncias marcadas por fluorescência em
percursores neuroniais (Kimmel e Law, 1985), e o crescimento axônico pode ser segui-
do visualmente ou por registro em vídeo. Eisen e colegas (1986) observaram o alonga-
mento axônico de três neurônios motores pioneiros nesses embriões. Após deixar a
medula espinhal, todos os três seguiram o mesmo caminho ao longo de um músculo
até alcançarem um determinado local no embrião. Nesse ponto, eles divergiram em três
trajetórias específicas levando aos músculos apropriados. A hipótese das trajetórias
marcadas tem sido extremamente importante tanto como modelo para a geração de
pesquisas, como em um contexto no qual podem ser inseridos dados existentes sobre
a especificidade neuronial.
Orientação pela Repulsão Específica de Cones de Crescimento

Além da adesão específica existe também a possibilidade da repulsão específica pela
matriz extracelular. Axônios dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal do tronco pas-
sam somente através da parte anterior da área de cada somito (assim como as células da
crista neural irão migrar somente através dessas regiões e não das regiões posteriores)
(A)
Esclerótomo
Tubo neural Notocorda
(B) (C)
Figura 8.10
Repulsão de cones de crescimento de gânglios da raiz dorsal. (A)
Padrão segmentado do crescimento axônico através do mesoderma
somítico. Axônios (corados de negro com tetróxido de zinco) movem-
se através da porção anterior de cada somito, mas não da posterior. O
limite entre anterior e posterior está assinalado com uma estrela. (B)
Cone de crescimento de um axônio do neurônio ganglionar da raiz
dorsal crescendo sobre laminina. Seus lamelipódios e filipódios po-
dem ser facilmente visualizados. (C) Cone de crescimento colapsado
de um neurônio ganglionar da raiz dorsal quando a proteína inibitória
foi adicionada à cultura. (A segundo Keynes e Stern, 1984; B e C
segundo Raper e Kapfhammer, 1990. Todas as fotografias cortesia
dos autores.)
(Figura 8.10A). A superfície celular da porção posterior do somito pode estar inibin-
do essa migração. Davies e colegas (1990) mostraram que membranas isoladas da
porção posterior do somito causam o colapso dos cones de crescimento dos neurô-
nios dos gânglios da raiz dorsal (Figura 8.10B,C). Além disso, eles isolaram uma
fração de glicoproteína da soma de pinto, que causa o colapso desses cones; e os
componentes dessa fração são especificamente encontrados na porção posterior
dos somitos. Em insetos, a semaforina I (também conhecida como fasciculina IV) é
uma proteína transmembrana que é expressa em uma banda de células epiteliais no
membro em desenvolvimento. Essa proteína parece inibir os cones de crescimento
dos neurônios sensoriais Ti1 moverem-se para frente, levando-os a se virarem (Fi-
gura 8.11; Kolodkin et al., 1992, 1993).
G-Sema I
Figura 8.11
A ação da semaforina I no membro em desenvolvimento
do gafanhoto. Axônios de neurônios sensoriais Ti1 se
projetam para o sistema nervoso central (CNS). (As lon-
gas flechas escuras representam etapas seqüenciais do ca- Ti1
minho.) Quando encontram a banda de células epiteliais Membro em
expressando semaforina-I, eles reorientam seus cones de Desenvolvimento
crescimento e se extendem ventralmente ao longo da borda
distal das células expressando a semaforina I. Quando CNS
seus filipódios se conectam ao par de células Cx1, eles
atravessam a borda e se projetam para o CNS. Quando a
semaforina é bloqueada por anticorpos, os cones de cres-
cimento procuram aleatoriamente as células Cx1. (Segun-
do Kolodkin et al., 1993.) Cordão nervoso ventral
& Especulações
Sexo, Odor e Adesão Específica
E M FINAIS DO SÉCULO DEZENO-

VE, o professor John Mackenzie
da Universidade Johns Hopkins
(1898), o psiquiatra alemão Wilhelm Fliess
(Schwanzel-Fukada e Pfaff, 1989; Wray et
al., 1989) fizeram a supreendente desco-
berta que os neurônios secretores de
GnRH não se originavam no hipotálamo.
migrem primeiro e que os neurônios
secretores de GnRH sigam os fascículos
do nervo olfativo para dentro do cérebro
(Livne et al., 1993). O gene cuja ausência
(1887) e o sexologista vienense Richard Ao contrário, eles se originavam no ou anormalidade causa a síndrome foi
Von Krafft-Ebing (1886) compartilharam a epitélio olfativo (o órgão vomeronasal) no clonado, e sua seqüência de cDNA prediz
visão errônea de que havia semelhanças rudimento nasal e migravam para a região uma proteína de adesão celular da super-
entre o desenvolvimento do pênis e do hipotalâmica do cérebro durante o desen- família das imunoglobulinas (Franco et al.,
nariz. Todos três investigadores usaram volvimento fetal (Figura 8.12). Os neurô- 1991; Legouis et al., 1991). Membros des-
o mesmo estudo de caso como evidência; nios receptores olfativos do nariz origi- sa classe de proteínas são conhecidas por
o relato de um homem que não tinha sen- nam-se do mesmo lugar. Os axônios dos mediar adesão célula-célula ou axônio-
sação de olfato – ausência de nervos ol- neurônios receptores olfativos penetram axônio (Grumet, 1991), e eles incluem N-
fativos ou nasais – e cujos órgão genitais no cérebro para fazer sinapse com o bul- CAM, L1, LFA-1, CD4, fascilina II,
eram muito menores que o normal. bo olfativo, enquanto os corpos celula- contactina e neurogliana. A proteína da
Tais pessoas são agora conhecidas res desses neurônios permanecem no na- síndrome de Kallmann também contém
por ter a síndrome de Kallmann, uma do- riz em desenvolvimento. Pacientes com a regiões que se assemelham à molécula de
ença ligada ao X, caracterizada por síndrome de Kallmann não têm bulbo ol- fibronectina, uma molécula da matriz ex-
anosmia (sem sensação de olfato), geni- fativo no cérebro, pois o desenvolvimen- tracelular de importância crítica para nu-
tália pequena e gônadas estéreis. A to desse bulbo requer inervação dos neu- merosas migrações celulares durante o de-
anosmia é devida a falta de neurônios ce- rônios olfativos (Stout e Gradziadi, 1980). senvolvimento. No entanto, os testes para
rebrais que recebem influxo de axônios O defeito na síndrome de Kallmann verificar se essa proteína se encontra nos
oriundos de neurônios nasais. As gôna- pode ser atribuído à falência dos neurôni- trajetos seguidos pelas células migratóri-
das e a genitália pequenas são resultado os secretores de GnRH e dos cones de as e se os axônios alongam-se do epitélio
da falta do hormônio liberador de gono- crescimento dos neurônios olfativos que olfativo, não foram ainda realizados em
dotrofina (GnRH). GnRH é um hormônio migram para o cérebro de origem do mamíferos; tampouco determinou-se se os
peptídico secretado pelo hipotálamo que placódio olfativo (Scwanzel-Fukada et al., axônios ou células dessa região realmen-
instrui a hipófise anterior a secretar o hor- 1989). Admite-se que o axônios olfativos te se ligam à essa proteína.
mônio luteinizante, necessário para o de-
senvolvimento das gônadas e amadure- Figura 8.12
cimento genital. O que une esses dois pro- Modelo para a etiologia da síndrome de Kallmann. Na ilustração à esquerda, neurônios senso-
blemas? Em 1989, dois laboratórios riais do epitélio olfativo estendem axônios para o bulbo olfativo do cérebro. Na síndrome de
Kallmann, o bulbo olfativo degenerou, e essa perda é considerada secundária à carência de
axônios dos neurônios sensoriais. A série de cortes sagitais da cabeça de camundongos embri-
onários mostra a migração de neurônios secretores de GnRH (colorido) do primórdio nasal
para dentro da porção hipotalâmica do cérebro. Essa migração não ocorre na síndrome de
Kallmann. (Segundo Calof, 1992.)
Lobo Bulbo
Frontal olfativo Hipotálamo Área
Bulbo olfativo
pré-óptica
Epitélio Olfativo
Língua
Cavidade Epitélio Nariz Maxilar

Nasal olfativo
Dia 11 Dia 13 Dia 14 Dia 15
Célula Célula
neurossensorial neurossensorial
primária secundária
(A) Seleção de trajetória: Orientação por moléculas difusíveis

A idéia de que sinais quimiotáticos guiam os axônios no sistema nervoso em desen-
volvimento foi primeiro proposta por Ramón y Cajal (1982). Ele sugeriu que os neurô-
Gradiente de
nios comissurais da medula espinhal poderiam viajar de suas posições dorsais para a
netrina-2
placa ventral do assoalho por meio de fatores difusíveis. Os axônios desse neurônio
começam a crescer ventralmente abaixo do lado do tubo neural. Porém, aproximada-
Neurônio
mente a dois-terços do caminho, sua direção muda, e eles se projetam através da área
comissural do neurônio (motor) ventrolateral do tubo neural em direção às células da placa do
assoalho (Figura 8.13). [axon1.html], [axon5.html]
Em 1994, Serafini e colegas desenvolveram um ensaio que lhes iria permitir seleci-
Gradiente de onar tais moléculas difusíveis. Quando explantes da medula espinhal dorsal foram
netrina-1 colocados sobre placas de colágeno, a presença de células da placa de assoalho nas
Placa do assoalho proximidades promoveria o crescimento dos axônios comissurais desses explantes.
Serafini e seus colegas tomaram frações de cérebro de embriões de pinto e homogenaram
(B) e testaram essas frações para ver se alguma de suas proteínas imitaria essa atividade.
Isso resultou na identificação de duas proteínas, netrina-1 e netrina-2. Netrina-1 é
produzida e secretada pelas células da placa de assoalho, enquanto netrina-2 é sinte-
tizada na região mais inferior da medula espinhal, mas não na placa de assoalho (veja
Figura 8.13). Os efeitos quimiotáticos dessas netrinas foram mostrados pela transfor-
mação de células COS (que em geral não produzem essas proteínas) com um vetor
contendo um gene netrin ativo (Kennedy et al., 1994). Agregados das células COS
secretoras de netrina provocaram o crescimento do axônio comissural de explantes da
espinha dorsal do rato, enquanto aquelas células COS tratadas com o vetor sem o
gene netrin ativo não provocaram tal atividade (Figura 8.14). Ambas netrinas se asso-
ciam à matriz extracelular.* É possível que os neurônios comissurais primeiro encon-
trem um gradiente de netrina-2, que os trazem para os domínios do gradiente mais
Placa do assoalho íngreme da netrina-1 (veja Figura 8-13).
As netrinas têm numerosas regiões de homologia com UNC-6, uma proteína en-
Figura 8.13 volvida no direcionamento da migração circunferencial de axônios ao redor do corpo
Trajetória dos axônios comissurais da medula de Caenorhabditis elegans. No nematóide de tipo selvagem, a UNC-6 induz axônios
espinhal do rato. (A) Desenho esquemático de de certas posições centrais a moverem-se ventralmente, e isso induz alguns corpos
um modelo onde os neurônios comissurais celulares localizados ventralmente a estenderem o axônio dorsalmente (Figura 8.15).
experienciam pela primeira vez um gradiente Em mutações de perda-de-função do gene unc-6, nenhum desses movimentos axônicos
de netrina-2 e depois um gradiente mais íngrime ocorre (Hedgecock et al., 1990; Ishii et al., 1992; Hamelin et al., 1993). Mutações do
de netrina-1. Os axônios comissurais são gui-
gene unc-40 interrompem a migração axônica ventral (mas não a dorsal), enquanto
ados quimiotaticamente em direção ventral des-
mutações do gene unc-5 somente previnem a migração dorsal. Culotti (1994) propôs
cendo a margem lateral da medula espinhal em
direção à placa do assoalho. Ao atingí-la, os que a proteína UNC-6 pode atrair o conjunto de axônios que sintetiza UNC-40 e repelir
axônios comissurais mudam sua direção devi- os axônios que produzem UNC-5. Estudos recentes (Wadsworth et al., 1996) mostram
do à condução por contato das células do que a UNC-6 é restrita espacialmente às células mais ventrais da hipoderme (pele) e
assoalho. (B) Localização auto-radiográfica do sistema nervoso, e que as propriedades atrativas e repulsivas dessa molécula são
mRNA de netrina-1 pela hibridização in situ mediadas pelas regiões diferentes da proteína. Além disso, os sinais da netrina tam-
para o cérebro de um embrião de rato de 16 bém guiam células mesodérmicas assim como axônios.**
dias usando RNA antisenso. A hibridização dá Se a UNC-6 é atrativa para certos neurônios e repulsiva para outros, poder-se-ia
um intenso sinal dos neurônios da placa de
pensar que esse duplo papel também seria atribuído às netrinas. Colamarino e Tessier-
assoalho. (B de Kennedy et al., 1994; fotogra-
Lavigne (1995) mostraram que isso é o caso observando a trajetória do nervo troclear
fia cortesia de M. Tessier-Lavigne.)
*A ligação de um fator solúvel à matriz extracelular cria uma ambigüidade interes-

sante entre quimiotaxia, haptotaxia e trajetórias marcadas. A natureza não se conforma
necessariamente às nossas categorias.
**Não somente UNC-6 é homóloga à netrina, mas UNC-40 é homóloga ao recep-
tor de netrina dos mamíferos e da Drosophila (Chan et al., 1996; Keino-Masu et al.,
1996; Kolodziej et al., 1996). Em todos os tipos de organismos, a molécula de netrina
parece proporcionar orientação para a migração de células portando seu receptor.
(A) (B) Figura 8.14

Agregados de células COS secretando netrinas
provocam o crescimento de axônios comissu-
rais oriundos de explantes de medula espinhal
dorsal de embrião de rato de 11-dias. (A) O
crescimento do neurônio comissural é visto
quando o explante da medula espinhal dorsal
(tecido superior) encontra um explante da pla-
ca do assoalho. (B) Não há crescimento quan-
do o explante dorsal é exposto às células COS
agregadas que foram transfectadas com o vetor
clonador somente (sem o gene netrin). (C,D)
Crescimentos de neurônios comissurais de cé-
lulas COS agregadas, que estavam expressan-
do o gene para netrina-1 (C) e para netrina -2
(D). Sua identidade como neurônios comissu-
rais foi confirmada por imunohistologia mos-
trando antígenos específicos das comissuras
nesses axônios. (Barra de escala, 100 µm.) (de
(C) (D)
Kennedy et al., 1994; fotografias cortesia de
M. Tessier-Lavigne.)
(quarto craniano). Em seu caminho para inervar um músculo do olho, os axônios do

nervo troclear se originam na placa do assoalho do pedúnculo cerebral e migram
dorsalmente afastando-se da região da placa dorsal. Essa trajetória é mantida quando
as regiões do pedúnculo cerebral são explantadas para géis de colágeno. O crescimen-
to dorsal dos neurônios trocleares pode ser impedido colocando as células da placa
do assoalho ou células COS secretoras de netrina-1 dentro de 450µm da porção dorsal
do explante. Esse crescimento dorsal não foi impedido pelos explantes dorsais do
tubo neural ou pelas células COS que não continham o gene netrim-1 ativo (Figura
8.16). Portanto, netrinas e UNC-6 parecem ser quimiotáticas para certos neurônios e
quimiorepulsivas para outros.
A família semaforina compreende outro conjunto de moléculas quimiorepulsivas
(ainda não foram encontrados membros atrativos nessa família). A semaforina I é
encontrada em insetos e é uma proteína ligada à membrana que inibe a ramificação dos
axônios quando a encontram em um membro (Kolodkin et al., 1992). A semaforina é
secretada em Drosophila por único grande músculo torácico. Dessa maneira, o mús-
culo torácico previne a si mesmo de ser inervado por axônios inapropriados (Matthes
Figura 8.15
Expressão de UNC e função na condução axônica. (A) No corpo
do embrião do tipo selvagem de C.elegans, neurônios sensoriais
projetam-se ventralmente e neurônios motores projetam-se dor- C. elegans
salmente. Os epidermoblastos da parede ventral do corpo expres-
sando unc-6 são preenchidos. (B) Nos embriões mutantes unc-6 (A) (B)
não ocorre migração alguma. (C) As mutações de perda-de-
função unc-5 somente afetam os movimentos dorsais dos neurô-
nios motores. (D) As mutações de perda-de-função unc-40 so- neurônios Tipo
mente afetam a migração ventral dos cones de crescimento senso- sensoriais selvagem
de unc 40+
riais. (Segundo Goodman, 1994.)
Epidermoblastos Neurônios
da parede ventral motores unc5+
do corpo
(C) (D)
et al., 1995). A semaforina III, encontrada em mamíferos e aves, também é conhecida

como colapsina (Luo et al., 1993). Essa proteína secretada causa o colapso de
cones de crescimento originários dos gânglios da raiz dorsal (veja Figura 8.10C).
Há vários tipos de axônios nos gânglios da raiz dorsal que penetram na medula
espinhal dorsal. A maioria desses axônios é impedida de viajar adiante e de pene-
trar a medula espinhal ventral. Entretanto, um subconjunto desses neurônios viaja
ventralmente através das células neurais (Figura 8.17). Esses neurônios particula-
res (responsivos à NT-3) não são inibidos pela semaforina III, enquanto os outros
neurônios o são (Messersmith et al., 1995). Isso sugere que semaforina/colapsina
padronizam as projeções sensoriais dos gânglios da raiz dorsal repelindo seletiva-
mente axônios para que terminem dorsalmente.
(A) (B) (C) (D)
Figura 8.16
Netrina inibe o crescimento de axônios trocleares da medula espinhal dorsal. Axônios trocleares,
corados para antígeno específico do axônio troclear, emergem dorsalmente e não são inibidos
pelo explante de medula espinhal dorsal (A) ou pelas células COS (B). Eles são inibidos pelas
células COS secretando netrina-1 (C) ou pela placa do assoalho da medula espinhal (D). (Segun-
do Colamarino e Tessier-Lavigne, 1995; fotografias cortesia de M. Tessier-Lavigne).
(A) Gânglio da raiz dorsal
Neurônios aferentes Ia
(responsivos à NT-3)
Aferente para mecanorreceptores
de baixo limiar
Receptores de temperatura e dor
(B)
Figura 8.17
Semaforina III como inibidor seletivo de projeções axônicas para a medula espinhal
ventral. (A) Trajetória de axônios em relação à expressão de semaforina III na medula
espinhal do embrião de rato de 14 dias. Os neurônios responsivos à neurotrofina-3
podem viajar para a região ventral da medula espinhal, mas os neuritos aferentes para os
mecanorreceptores e neurônios receptores de temperatura e dor terminam dorsalmente.
(B) Células COS secretoras de semaforina III inibem o crescimento de axônios
mecanorrecepores (aqui mostrados crescendo num meio tratado com NGF, mas inibi-
dos de crescer em direção à fonte de semaforina III). (C) Os neurônios que são
responsivos à NT-3 para crescimento não são inibidos de se estenderem em direção à
fonte de semaforina III. (A segundo Marx, 1995; B e C segundo Messersmith et al.,
1995; fotografias cortesia de A. Kolodkin.)
Sinais para condução múltipla

Neurônios Motores V ertebrados
Vertebrados
Um dos mais importantes programas de pesquisa em neurobiologia do desenvolvi-
mento refere-se à inervação dos músculos dos membros. Crescimento axônico de
neurônios motores ocorre muito cedo no desenvolvimento, antes da soma dos neurô-
nios motores ter migrado para suas posições definitivas na medula espinhal e antes
dos músculos terem se condensado fora do mesênquima (Landmesser, 1978; Hollyday,
1980a). Esse estágio pode ser visto na Figura 8.18. Para inervar a musculatura dos
Tubo neural
(medula
espinhal)
Nervos
espinhais
Rudimento
renal
Intestino
Broto de
membro Figura 8.18
Micrografia eletrônica de varredura de um corte
de um embrião de pinto de 4-dias, mostrando a
Sulco emergência de nervos espinhais para dentro do
ectodérmico broto do membro em desenvolvimento. (de
apical
Tosney e Landmesser, 1985, cortesia de
K.Tosney.)
(A) Medula espinhal (B)

Barreira
Neurônios e Esclerótomo posterior
motores
Nervos epaxiais Trajetória
(para o dorso) Esclerótomo
dorso-anterior
Plexo
Barreira
Nervo espinhal precursor do
Trajetória cinturão pélvico
Tronco nervoso Mesênquima
dorso-anterior Barreira
Tronco Nervo do Mesênquima do plexo
nervoso ventro- músculo perinotocordal
anterior
Figura 8.19
Trajetórias de axônios motores na região do
membro posterior do embrião do pinto. (A)
Padrão neural do membro posterior. Axônios membros, o axônio se estende sobre centenas de células em um ambiente complexo
do neurônio motor unem-se no plexo e em se- e cambiante. Pesquisa recente descobriu várias trajetórias e várias barreiras que
guida se separam em troncos nervosos dorsal e ajudam a condução dos axônios para seus destinos apropriados. Conforme mencio-
ventral. Um plexo é anterior; o outro, posterior. nado acima, em cada lado da medula espinhal há blocos de tecido mesodérmico
(B) Os componentes ambientais que criam o
chamados somitos. Pouco antes dos axônios iniciarem seu alongamento, o somito
padrão neural. A segmentação dos nervos es-
pinhais é criada pelo esclorótomo. O escleróto-
se cinde em dois tipos de tecido. A porção dorsal torna-se o dermomiótomo (que
mo dorsal anterior permite a migração, enquanto produz a derme e a musculatura do dorso), enquanto a porção ventral do somito
o esclerótomo dorsal posterior e todo o ventral passa a ser o esclerótomo (que produz a cartilagem vertebral). Lateralmente aos
(o mesênquima perinotocordal) é uma barreira somitos, na base do broto do membro, está o mesênquima do plexo e as
para os axônios do nervo motor. O plexo prospectivas células do cinturão escapular. Os corpos celulares dos neurônios
mesenquimatoso é permissivo, mas o cinturão motores estão nas regiões ventrolaterais do tubo neural (Figura 8.19). Axônios
pélvico forma uma barreira. Os dois orifícios dos neurônios motores que irão inervar os músculos dos membros estão mistura-
nessa barreira permitem a passagem e extensão dos quando emergem da medula espinhal. Populações de axônios de vários níveis
dos troncos nervosos. (Segundo Tosney, 1991.)
segmentais da medula espinhal podem formar um nervo espinhal comum. Esses
nervos espinhais se reúnem em um plexo. Nesses plexos, porém, os axônios de
diferentes regiões percorrem trajetórias diferentes. Por exemplo, na Figura 8.19,
neurônios motores para músculos diferentes divergem para apropriados troncos
nervosos e finalmente se projetam para músculos singulares.
Por meio de várias manipulações cirúrgicas foram descobertas, no embrião pre-
coce do pinto, alguns dos sinais ambientais que direcionam essa migração. A parte
ventral do esclerótomo que circunda a notocorda forma uma barreira contra o alon-
gamento do axônio motor. Apesar das células nessa região parecerem soltas e facil-
mente evitadas, elas repelem os axônios em sua vizinhança. Quando o tubo neural é
girado para fazer com que os neurônios motores emerjam ventralmente para essa
região, eles imediatamente giram para evitá-la, migrando somente através do escle-
rótomo dorsal anterior (Figura 8.19B). Assim, o esclerótomo perinotocordal é uma
barreira para o crescimento do axônio motor, enquanto o esclerótomo anterior dorsal
é uma trajetória (Tosney e Oakley, 1990; Tosney, 1991). Os axônios que progredirem
através do esclerótomo dorsal anterior (juntamente com as células da crista neural
que seguem pela mesma rota) chegam ao plexo mesenquimatoso na base do broto do
membro, também um ambiente favorável para o crescimento axônico. Porém, pouco
além do mesênquima do plexo ficam as células precursoras do cinturão pélvico.
Essas células inibem o crescimento axônico e os axônios se afastam delas. Há dois
orifícios no tecido precursor do cinturão pélvico cheios de plexo mesenquimatoso;
axônios se estendem por esses orifícios para formar os troncos nervosos anterior e
posterior que penetram no membro. Se outros orifícios forem feitos esperimental-

mente no tecido precursor do cinturão pélvico, os axônios os atravessam pronta-
mente (Tosney e Landmesser, 1984, 1985).
Os nervos podem até mesmo alcançar seus respectivos destinos se as células
formadoras de músculos tiverem sido removidas (Phelan e Hollyday, 1990), e é pro-
vável que as outras células mesenquimatosas no broto do membro (tal como aque-
las que formam a derme ou a cartilagem) estejam provendo os sinais direcionais.
Essas trajetórias para as regiões musculares dos membros parecem ser muito bem
definidas. Quando se redireciona axônios de uma origem diferente (como um gânglio
diferente) para o membro, eles se ramificam como o fazem os axônios que original-
mente inervaram o membro. Em outras palavras, o membro é capaz de ditar o padrão
de inervação para um conjunto de axônios que normalmente não o penetrariam
(Hamburger, 1939; Hollyday et al., 1977). Ainda mais, se segmentos da medula espi-
nhal do pinto forem revertidos fazendo com que seus neurônios motores se encon-
trem em novas localizações, seus axônios irão encontrar seus alvos originais (veja
Figura 8.3; Lance-Jones e Landmesser, 1980). No entanto, quando membros se de-
senvolvem com áreas duplicadas (como duas coxas), os neurônios inervando a
segunda coxa não serão neurônios específicos da “coxa”, mas neurônios que usual-
mente inervam a panturrilha (Whitelaw e Holliday, 1983). Esses experimentos apre-
sentam um paradoxo ainda a ser resolvido: “Axônios particulares estão predispos-
tos a crescer para lugares específicos; no entanto, axônios de “pools” de neurônios
motores diferentes podem substituir um outro no estabelecimento de padrões ner-
vosos normais” (Purves e Lichtman, 1985). A explicação mais plausível é que vários
mecanismos atuam simultaneamente para assegurar que os axônios cheguem a seus
lugares apropriados. Um desses mecanismos parece ser a condução da superfície
celular de células mesenquimatosas não formadoras de músculos no broto do mem-
bro, enquanto outro mecanismo provavelmente envolve a quimiotaxia de mioblastos
do broto do membro (Goodman e Shatz, 1993).
Axônios da Retina
Também se postularam sinais de orientação múltipla para explicar como neurônios
retinianos individuais são capazes de enviar axônios para a área apropriada do cére-
bro, mesmo quando transplantados para longe do nervo óptico (Harris, 1986). Essa
capacidade indica que os sinais de orientação não estão distribuídos somente ao
longo da trajetória normal, mas existem através de todo o cérebro embrionário. Orien-
tar um axônio de um corpo celular nervoso para seu destino através do embrião é um
fenômeno complexo, e vários tipos de sinais diferentes podem ser usados simultane-
amente para assegurar que sejam estabelecidas as conexões corretas.
Os primeiros passos para levar os axônios retinianos para suas regiões específi-
cas no tectum óptico se realizam no interior da retina (Figura 8.20A). À medida que
as células ganglionares retinianas se diferenciam, sua posição na margem interna da
retina é determinada pelas moléculas de caderina (N-caderina assim como a R-caderina
específica da retina) das suas membranas celulares (Matsunaga et al., 1988; Inuzuka
et al, 1991). Os axônios dessas células crescem ao longo da superfície interna da
retina em direção à cabeça do nervo óptico (Figura 8.20B). A adesão e o crescimento
dos axônios das células da retina podem ser controlados pela lâmina basal contendo
laminina. Porém, a fixação à laminina não pode explicar o direcionamento do cresci-
mento. É possível que um gradiente da molécula inibidora do proteoglicano de sulfa-
to de condroitina da matriz extracelular tenha um papel na especificação da direção
do crescimento (Hynes e Lander, 1992).
Quando os axônios penetram no nervo óptico, eles crescem sobre as células gliais
em direção ao cérebro. Estudos in vitro sugerem que numerosas moléculas de adesão
celular – N-CAM, caderinas e integrinas – têm funções na orientação do axônio para
o tectum óptico (Neugebauer et al., 1988). N-CAM parece ser especialmente importan-
te aqui, pois a migração direcionada dos cones de crescimento ganglionares retinianos
(A) Estabelecimento das camadas retinianas

(células ganglionares na superfície interna)
Anti-N-caderina causa desarranjo
(B)
Crescimento axônico direcionado
Retina Anti-N-CAM interfere
Forte crescimento neurítico em laminina in vitro
(C) Progressão organizada para o nervo óptico

Nervo óptico Anti-N-CAM rompe. Possíveis papéis para laminina e
caderinas. Enfeixamento axônico específico para posição
Trato óptico (D)

Decisão de atravessar ou girar
Possíveis sinais inibidores e especificidade da fasciculação
(E) Voltando para a região alvo

Possível papel para laminina. Sinais para a posição global
(F)
Chegada ao alvo
Perda de laminina in vivo
Perda de resposta à laminina in vitro
Te c t (G)
um óptic Estabelecimento de um mapa topográfico
o Inibidores específicos para posição. Possibilidade
de outros sinais graduados
Figura 8.20
Sinais para a orientação múltipla direcionam o movimento dos axônios dos gânglios retinianos
para o tectum óptico. (Segundo Hynes e Lander, 1992.)
dependem dos pés terminais gliais expressando N-CAM na superfície interna retiniana
(Figura 8.20C; Stier and Schlosshauer, 1995). Ao chegar no nervo óptico, os axônios
fasciculam com axônios que já estão presentes. N-CAM também é crítica para essa
fasciculação, e anticorpos contra N-CAM (ou remoção do seu componente polisiálico)
faz com que os axônios entrem no nervo óptico de maneira desordenada, causando-os
a emergir em posições erradas no tectum (Thanos et al., 1994; Yin et al., 1995).
Ao entrar no cérebro, os axônios retinianos de mamíferos atingem o quiasma
óptico, onde eles têm que “decidir” se irão continuar diretamente em frente ou se giram
90º e entram do outro lado do cérebro (Figura 8.20D). Parece que aqueles axônios não
destinados a atravessar para o outro lado do cérebro, são repelidos de assim o fazerem
quando entram no quiasma (Godement et al., 1990); a base molecular dessa repulsão
não é conhecida. No trajeto para o tectum óptico, os axônios viajam por uma via (o
trato óptico), sobre células gliais cujas superfícies são recobertas por laminina (Figura
8.20E). Muito poucas áreas no cérebro têm laminina, e a laminina nesse trajeto existe
somente quando as fibras do nervo óptico estão nele crescendo (Cohen et al., 1987).
O axônio que migra da retina para o tectum encontra numerosas outras células e
alvos potenciais para inervação. No entanto, a combinação de vários sinais de orien-
tação, provavelmente envolvendo tanto atração como repulsão, orientam o axônio ao
longo de seu caminho. Nesse ponto, os axônios retinianos alcançaram a região óptica
do cérebro (Figura 8.29F), e começa a seleção de alvos.
Seleção de alvos
Quando os axônios chegam ao fim desse trajeto forrado de laminina, eles se espa-
lham e acham seus alvos específicos. Estudos em rãs e peixes (onde os neurônios
retinianos de cada olho se projetam para o lado oposto do cérebro) indicaram que
cada axônio retiniano envia seu impulso para um local específico (uma célula ou
TECTUM DIREITO TECTUM ESQUERDO
Caudal
Rostral
Dorsal Dorsal
Posterior
Posterior
Anterior
Campo Campo
visual direito visual esquerdo
Ventral Ventral
OLHO ESQUERDO OLHO DIREITO
Figura 8.21
Mapa da projeção retinotectal normal no Xenopus adulto. O olho direito inerva o tectum esquer-
do, e o olho esquerdo inerva o tectum direito. Os números nos campos visuais (retina) e os tecta
mostram regiões de correspondência; isto é, estimulação do ponto 15 na retina direita envia
impulsos elétricos para a região tectal esquerda 15. As flechas negras e coloridas sumariam o
padrão das conexões retinotectais. (de Jacobson, 1967.)
pequeno grupo de células) dentro do tectum (Sperry, 1951). Como mostra a Figura
8.21, existem dois tecta óptico no cérebro da rã. Os axônios do olho direito entram no
tectum óptico esquerdo, enquanto aqueles do olho esquerdo formam sinapses com
as células do tectum óptico direito. O crescimento de neurônios no trato óptico de
Xenopus parece ser mediado por fatores de crescimento fibroblástico secretados
pelas células forrando o trato. Os axônios ganglionares retinianos expressam recep-
tores FGF nos seus cones de crescimento. Porém, à medida que as células ganglio-
nares atingem o tectum, a quantidade de FGF diminui, talvez retardando os axônios
e permitindo-lhes achar seus alvos (McFarlane et al., 1995).
O mapa das conexões retinianas até o tectum óptico da rã (a projeção retinotectal)
foi detalhada por Marcus Jacobson (1967). Jacobson definiu esse mapa lançando um
estreito feixe de luz numa região pequena e limitada da retina e anotou, por meio de um
eletrodo registrador no tectum, quais células tectais estavam sendo estimuladas. A
projeção retinotectal de Xenopus laevis é mostrada na Figura 8.21. A luz iluminando a
parte ventral da retina estimula células na superfície lateral do tectum. Da mesma
maneira, luz focalizada na parte posterior da retina estimula células na porção caudal
do tectum. Esses estudos demonstraram uma correspondência ponto-por-ponto entre
as células da retina e do tectum. Quando um grupo de células da retina é ativado, um
grupo muito pequeno e específico de células tectais é estimulado. Podemos também
observar que os pontos formam um contínuo; em outras palavras, pontos adjacentes
na retina se projetam sobre pontos adjacentes no tectum. Esse arranjo permite à rã ver
uma imagem inteira. Essa intrincada especificidade levou Sperry (1965) a lançar a
hipótese da quimioafinidade:
Os complicados circuitos das fibras nervosas cerebrais crescem, se juntam e se

organizam através de intricados códigos químicos sob controle genético. No
início do desenvolvimento, as células nervosas, contadas em milhões, adquirem
e retêm depois disso, tarjas de identificação individual, de natureza química,

Número de células retinianas dorsais marcadas
pelas quais podem ser distinguidas e reconhecidas de outras.

com 32p aderindo à metade tectal
Teorias atuais não propõem uma especificidade ponto-para-ponto entre cada axônio
e o nervo contatado. Ao contrário, a presente evidência demonstra que gradientes de
adesividade (em especial aqueles envolvendo a repulsão) têm um papel na definição
de territórios nos quais os axônios entram e que a competição gerada pela atividade
entre esses neurônios determina a conexão final de cada axônio.*
Especificidades A desivas em Diferentes R

Adesivas egiões do T
Regiões ectum
Tectum
Existe boa evidência que as células ganglionares retinianas podem distinguir entre
as regiões do tectum. Células preparadas da metade ventral da retina neural do pinto
aderem-se preferencialmente às metades dorsais do tectum (Figura 8.22; Roth e
Tempo de coleta (horas)
Marchase, 1976). Gottlieb e colaboradores (1976) acharam que neurônios retirados
da parte mais dorsal da retina do pinto aderem-se preferencialmente à porção mais
Figura 8.22 ventral do tectum e que os neurônios do extremo ventral da retina aderem-se prefe-
Adesão diferencial de células dorsais radioa- rencialmente aos extremos mais dorsais do tectum. Esses resultados foram confir-
tivas da retina do pinto às metades tectais dor- mados sob outras condições experimentais usando extremidades axônicas em lugar
sal e ventral. Células radioativas da metade de neurônios inteiros (Halfter et al., 1981).
dorsal de retinas de pinto de 7 dias foram adi- Um gradiente que foi identificado funcionalmente é um gradiente de repulsão que
cionadas às metades dorsal (cor) e ventral (ne-
é mais alto no tectum posterior e mais fraco no tectum anterior. Bonhoeffer e colegas
gro) de tecta ópticos de pintos de 12 dias. Os
dados mostram a adesão seletiva das células (Walter et al., 1987) prepararam um “tapete” de membranas tendo tiras alternadas
retinianas dorsais ao tecido tectal ventral. (Se- derivadas dos tecta posterior e anterior. Eles deixaram, então, células das regiões nasal
gundo Roth e Marchase, 1976). (anterior) ou temporal (posterior) da retina estenderem axônios nesse tapete. As célu-
las ganglionares da porção nasal da retina estendem axônios igualmente bem nas
membranas anterior e posterior do tectum. Os neurônios do lado temporal da retina,
porém, estenderam axônios somente nas membranas tectais anteriores (Figura 8.23). A
base dessa especificidade parece ser o fator repulsivo nas membranas das células
tectais posteriores. Quando o cone de crescimento de um axônio retiniano temporal
contata a membrana da célula tectal posterior, os filopódios do cone se retraem, e o
cone de crescimento entra em colapso e se retrai (Cox et al., 1990). Baier e Bonhoffer
(1992) demonstraram que um gradiente de uma substância inibidora isolada da porção
posterior do tectum é capaz de guiar os axônios temporais da retina.
Duas dessas moléculas repulsivas foram identificadas em embriões de pinto.
Chamadas RAGS (sinal repulsivo de orientação axônica) e ELF-1 (família ligante de
Eph 1), estão presentes num gradiente caudal-para-rostral através do tectum, e a
proteína clonada é capaz de repelir axônios (Figura 8.24; Drescher et al., 1995). RAGS
e ELF-1 revelaram ser ligantes para uma família de tirosina quinases receptores
chamadas Quinases receptoras Eph. Essas quinases foram encontradas nas células
ganglionares da retina do pinto, e elas são expressas em um gradiente temporal-
para-nasal ao logo dos axônios da retina (Cheng et al., 1995). Parece haver vários
receptores Eph na retina e ligantes no tectum que podem ter o papel de empurra-e-
puxa na orientação dos axônios retinianos temporais para o tectum anterior e permi-
tir os axônios retinianos se projetarem para a porção posterior do tectum.
*Nos últimos anos, os pesquisadores encontraram dúzias de mutantes no peixe-zebra que

afetam a migração dos axônios retinianos para o tectum ou a especificidade das conexões retinotectais.
Esses mutantes vêm somente sendo analisados agora, porém, prometem fornecer visões da maior
importância dos mecanismos pelos quais nossa descarga sensorial entra no cérebro. A publicação de
dezembro de 1996 (volume 123) de Development contém vários artigos mapeando os genes envol-
vidos na migração do axônio da retina para o córtex óptico. Foram encontrados mais de 30 genes
mutantes que afetam ou a capacidade dos axônios retinianos do peixe-zebra acharem o tectum
óptico, ou a capacidade dos axônios encontrarem suas apropriadas conexões dentro do tectum
(Karlstrom et al., 1997).
Membranas tectais Figura 8.23

Repulsão diferencial de axônios temporais da
Anterior retina sobre membranas tectais. Fitas alterna-
das de membranas tectais anteriores e posterio-
Posterior res foram absorvidas em papel de filtro. Quan-
do os axônios das células ganglionares
Anterior
retinianas temporais (posterior) cresceram em
tais tapetes alternados, elas preferencialmente
estenderam axônios sobre membranas tectais
Posterior
anteriores. (de Walter et al., 1987.)
Anterior
Posterior
Anterior
A possível importância de ELF-1 no tectum óptico foi demonstrada por Nakamoto

e colegas (1996). Quando infectaram regiões do cérebro posterior do pinto com um
vírus expressando ELF, pedaços de ELF-1 ficaram expressos em regiões do tectum que
normalmente pouco expressam essa molécula. Axônio da região temporal (mas não
Nasal
Olho
Cérebro
Temporal Temporal
Tectum
Receptor Eph da
tirosina quinase
(A) (Mek-4) Ligantes (RAGS, ELF-1)
Retina
Anterior Posterior
Nasal Temporal
Tectum
Figura 8.24
(B) Gradiente da proteína ligante Adesão retinotectal diferencial por gradientes
nas membranas tectais receptoras Eph da tirosina quinase e seus
ligantes. (A) Representação dos dois gradien-
tes duplos receptor Eph da tirosina quinase
(Mek-4) na retina, e seu ligante (RAGS, ELF-
1) no tectum. (B) Experimento mostrando que
axônios temporais, mas não nasais, da retina
respondem a um gradiente das membranas
tectais posteriores, se afastando ou se retardan-
Retina temporal Retina nasal do. (Segundo Barinaga, 1995.)
aqueles da região nasal) da retina evitaram as regiões expressando ELF-1. Assim, ELF-
1 pode prover sinais negativos para as regiões temporais da retina.
O aparecimento de RAGS e ELF-1 é regulado pela expressão da proteína Engrailed.
A proteína Engrailed é expressa no dia 2 do desenvolvimento do pinto em uma banda
que inclui a porção caudal (posterior) do futuro tectum óptico (veja Figura 7.18). Se a
proteína Engrailed for induzida experimentalmente na porção rostral do tectum, tam-
bém essa adota um fenótio caudal. Quando isso ocorre, RAGS e ELF-1 são expressos
através de todo o tectum, e os axônios temporais são repelidos das duas metades
(Logan et al., 1996). Assim, a expressão precoce de Engrailed parece induzir a expres-
(A) Cone de crescimento contata miotúbulo (D)
Axônios
Miotúbulo
Receptores de ACh
(B) Agrina neuronial induz agregação (E)

de receptores de ACh
Miotúbulo
(C) Forma-se a lâmina basal sináptica (F)

Envolvimento pelas
células de Schwann
Vesícula
Matriz extracelular neurotransmissora
β2
laminina
Figura 8.25
Diferenciação da sinapse do neurônio motor com o músculo. Partes (E) e (G) estão represen-
tadas em menor aumento que outras para dar uma visão panorâmica da região onde o axônio (G) Na maturidade
encontra o músculo. (A) Um cone de crescimento se aproxima de uma célula muscular em
desenvolvimento. (B) O axônio pára e forma um contato não-especializado na superfície do
miotúbulo. A agrina, liberada pelo tubo neural, causa a agregação de receptores de aceticolina.
(C) Vesículas neurotransmissoras penetram no axônio terminal, e uma matriz extracelular
conecta o axônio terminal com a célula muscular à medida que a sinapse se alarga. Essa matriz
contém uma laminina específica do nervo. (D) Outros axônios convergem para o mesmo local
sináptico. (E) Visão geral da inervação muscular por vários axônios (vista em mamíferos no
nascimento). (F) Todos os axônios menos um são eliminados. O axônio remanescente pode se
ramificar para formar uma junção complexa com o músculo. Cada terminal do axônio está
recoberto por um processo de uma célula de Schwann e dobras se formam na membrana da
célula muscular. (G) Visão panorâmica da inervação muscular várias semanas após o nasci-
mento. (Segundo Hall e Sanes, 1993; Purves, 1994; Hall, 1995.)
são de RAGS e ELF-1, e essas duas proteínas mediam a exclusão dos axônios retinianos
temporais da porção caudal (posterior) do tectum.
Seleção de endereço:
Desenvolvimento dependente de atividade
Quando um axônio contata seu “alvo” (em geral um músculo ou outro neurônio)
forma uma junção especializada chamada sinapse. Neurotransmissores do terminal
do axônio são liberados nessas sinapses para despolarizar ou hiperpolarizar a mem-
brana da célula do outro lado da fenda sináptica. A construção de uma sinapse
envolve vários passos (Figura 8.25). Quando neurônios motores na medula espinhal
estendem axônios para os músculos, os cones de crescimento que contatam as
recém-formadas células musculares migram sobre suas superfícies. Quando o cone
de crescimento adere primeiro à membrana da célula muscular, a especialização não
pode ser vista em membrana alguma. Porém, logo os terminais axônicos começam a
acumular vesículas sinápticas contendo neurotransmissores, as membranas de ambas
as células se engrossam na região de contato, e a fenda entre as células se enche
com matriz extracelular que inclui uma forma específica de laminina. Essa laminina
derivada do músculo, especificamente liga os cones de crescimento dos neurônios
motores e pode agir como um “sinal de parada” para o crescimento axônico (Martin
et al., 1995; Noakes et al., 1995). Após esse primeiro contato, os cones de crescimen-
to de outros axônios convergem para esse local para formar sinapses adicionais.
Durante o desenvolvimento, todos os músculos de mamíferos estudados parecem
ser inervados por, ao menos, dois axônios. No entanto, essa inervação polineuronial
é transitória. Durante a fase precoce da vida pós-natal, todos esses ramos axônicos,
menos um, são recolhidos. Esse rearranjo está baseado na “competição” entre os
axônios (Purves e Lichtman, 1980; Thompson, 1983). Quando um dos neurônios
motores está ativo, ele suprime as sinapses dos outros neurônios, possivelmente
através de um mecanismo dependente de óxido nítrico (Dan e Poo, 1992; Wang et al.,
1995). Finalmente, as sinapses menos ativas são eliminadas. O terminal axônico
remanescente se expande e é revestido pela célula de Schwann.
A formação de sinapse dependente de atividade também parece estar envolvida
nos estágios finais da projeção da retina para o cérebro. Em embriões de rã, ave e
roedor tratados com tetrodotoxina, os axônios irão crescer normalmente para seus
respectivos territórios e irão estabelecer sinapses com os neurônios tectais. Porém,
o mapa retinotectal é grosseiro, carente de resolução fina. Tal como na especificação
final da sinapse do neurônio motor, a atividade neuronial é necessária para a proje-
ção retiniana ponto-por-ponto até os neurônios tectais (Harris, 1984; Fawcett e
O’Leary, 1985; Kobayashi et al., 1990). Essa eliminação de contatos retinianos tran-
sitórios pelo tectum também pode envolver a expressão do óxido nítrico pelas célu-
las tectais alvo (Wu et al., 1994).
Sobrevivência diferencial após a inervação:

Fatores neurotróficos
Refletindo sobre sua vida como um embrião, Lewis Thomas (1992) escreve,
Até o momento do meu nascimento, mais de mim havia morrido do que sobrevivi-
do. Não é de se admirar que eu não possa recordar; durante aquele tempo passei
por cérebro após cérebro durante nove meses, finalmente conseguindo aquele
modelo que podia ser humano, equipado para a linguagem.
Realmente, um dos fenômenos mais intrigantes no desenvolvimento do sistema

nervoso é a morte da célula neuronial. Em muitas partes dos sistemas nervosos
central e periférico de vertebrados, mais da metade dos neurônios morrem durante
o progresso normal do desenvolvimento. Além disso, não parece ter semelhanças

entre as espécies. Por exemplo, na retina do gato, cerca de 80 porcento das células
ganglionares retinianas morrem, enquanto na retina do pinto, esse número é de
somente 40 porcento. Nas retinas de peixes e anfíbios não parece haver morte das
células ganglionares retinianas (Patterson, 1992).
A extinção de um neurônio não é causada por qualquer defeito óbvio. Na realida-
de, esses neurônios se diferenciaram e estenderam com sucesso axônios para seus
alvos. Ao contrário, parece que o tecido alvo regula o número de axônios que o
inerva limitando um suprimento de algum fator crítico de sobrevivência. Parece
haver competição por esse fator limitante. Por exemplo, se mais de um tecido alvo é
transplantado no alvo original, mais axônios sobrevivem, e se o tecido alvo for
removido antes dos axônios o alcançarem, quase todos os neurônios morrem. Esses
fatores neurotróficos foram isolados e mostrados regular a sobrevivência de dife-
rentes subconjuntos de neurônios.
O fator neurotrófico melhor caracterizado é o fator de crescimento do nervo
(NGF), uma glicoproteína composta de duas subunidades 13-kDa idênticas. O
NGF é necessário para a sobrevivência de neurônios simpáticos e sensoriais.
Tratar embriões de camundongo com anticorpos anti-NGF reduz o número de
neurônios ganglionares e da raiz dorsal do trigêmeo simpático para 20% do seus
valores controle (Levi-Montalcini e Booker, 1960; Pearson et al., 1983). O NGF
parece funcionar após ter ocorrido a inervação, já que o NGF não é secretado
pelos tecidos alvos até depois da inervação, e axônios em crescimento carecem de
receptores para NGF, então eles não podem responder antes (Davies et al., 1987).
A remoção desses tecidos alvos causa a morte dos neurônios que os teriam
inervado, e existe uma boa correlação entre a quantidade de NGF secretado e a
sobrevivência dos neurônios que inervam esses tecidos (Korsching e Thoenen,
1983; Harper e Davies, 1990). [axon1.html]
Outras proteínas neurotróficas foram caracterizadas. Duas dessas proteínas – fa-
tor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e neurotrofina 3 (NT-3) – repartem a
mesma estrutura básica que NGF. Porém, elas favorecem a sobrevivência de grupos de
neurônios um tanto diferentes. Enquanto alguns neurônios respondem a todos os
três fatores, outros respondem somente a um ou dois (Figura 8.26; Oppenheim et al.,
1992). O NGF suporta o crescimento e a diferenciação de células ganglionares do
simpático e de certos neurônios sensoriais, mas não parecem influenciar a sobrevi-
vência dos neurônios motores. O BNDF, porém, pode salvar neurônios motores fetais
in vivo da morte celular que ocorre normalmente e da morte celular induzida após
remoção de seus tecidos alvo. Os resultados desses estudos in vitro foram corrobo-
rados por experimentos de eliminação de genes, onde a deleção de determinados
fatores neurotróficos causa a perda de somente certos subconjuntos de neurônios
(Crowley et al., 1994; Jones et al., 1994). A NT-3 produzida pelos tecidos alvo podem
sustentar a sobrevivência de neurônios viscerais que não são responsivos ao NGF
(Hohn et al., 1990; Maisonpierre et al., 1990). BDNF, NT-3 e duas outras moléculas
neurotróficas – neurotrofina 4/5 (NT-4/5) e fator 5 de crescimento de fibroblastos
(FGF5)- são sintetizadas em células musculares dos membros de ratos quando axônios
dos neurônios motores estão crescendo para dentro do músculo e competindo por
tais fatores de sobrevivência. Além disso, BNDF, NT-3, NT-4/5 e vários FGFs previnem
a morte de neurônios motores embrionários de rato em cultura (Henderson et al, 1993,
Hughes et al., 1993). Outra recém-descoberta neurotrofina, fator neurotrófico deriva-
do da linhagem de célula glial (GDNF), estimula a sobrevivência de outro grupo de
neurônios: os neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo cuja destruição caracteriza a
doença de Parkinson (Lin et al., 1993). Esse fator pode evitar a morte desses neurônios
em cérebros adultos (veja Lindsay, 1995). Ainda outra neurotrofina, fator neurotrófico
ciliar (CNTF), parece apoiar a sobrevivência de neurônios motores embrionários; CNTF
é capaz de evitar a degeneração de neurônios motores em um mutante de camundongo
caracterizado pela perda progressiva de neurônios motores (Sendtner et al., 1992).
(A) Simpático (B) Raiz dorsal (C) Nodoso Figura 8.26

Efeitos do NGF (parte superior) e BDNF (em
baixo) no crescimento de neuritos de (A)
gânglios simpáticos, (B) gânglios da raiz dor-
sal, e (C) gânglios nodosos. Enquanto tanto
NGF como BDNF tinham um leve efeito es-
timulante do crescimento axônico do gânglio
da raiz dorsal, os gânglios simpáticos respon-
deram ao NGF e quase de modo algum ao
BDNF, enquanto o contrário se demonstrou
para o gânglio nodoso. (de Ibáñez et al., 1991.)
A sobrevivência real de um dado neurônio no embrião pode depender de uma

combinação de genes. Schmidt e Kater (1993) mostraram que fatores neurotróficos,
despolarização, e interações com o substrato se combinam sinergicamente para
determinar a sobrevivência neuronial. Por exemplo, a sobrevivência de neurônios do
gânglio ciliar do pinto em cultura foi promovida pelo FGF, laminina ou despolarização.
Porém, o FGF não promoveu sobrevivência quando a laminina estava ausente, e os
efeitos combinados da laminina, FGF e despolarização foram maiores do que a soma
dos efeitos de cada um deles (Figura 8.27). Os fatores neurotróficos e os outros
agentes ambientais parecem funcionar pela supressão de um “programa suicida”
que seria expresso constitutivamente se não fosse reprimido por esses fatores (veja
Capítulo 13; Raff et al., 1993). A sobrevivência das células ganglionares retinianas
em cultura está baseada em fatores neurotróficos, mas essas células somente podem
responder a esses fatores se tiverem sido despolarizadas (Meyer-Franke et al., 1995).
Além disso, já que a atividade neuronial estimula a produção de fatores neurotróficos
pelos nervos ativos, é provável que neurônios recebendo um sinal produzam mais
fator neurotrófico (Thoenen, 1995). Esse fator poderia ter um efeito sobre as sinapses
próximas que estão ativas (i.e., capazes de responder a esse fator), com isso estabi-
lizando um conjunto de sinapses ativas com exclusão das inativas.
A descoberta e purificação dessas proteínas neurotróficas e a análise de suas
interações com substratos e condições elétricas pode possibilitar novas terapias para
doenças neurodegenerativas. Numerosas companhias farmacêuticas estão iniciando
testes clínicos de fatores neurotróficos para o possível alívio de lesões na medula
espinhal (NGF), doença de Parkinson (GNDF), esclerose lateral amotrófica (BDNF,
CNTF), neuropatias periféricas (NGF, NT-3) e doença de Alzheimer (NGF, GDNF).
Neurônios revestidos com laminina

Sobrevivência neuronial (%)
Neurônios revestidos com colágeno IV

Figura 8.27
Interações entre substrato, despolarização e fator neurotrófico básico
FGF (FGF2) na sobrevivência de neurônios do gânglio ciliar. Neu-
rônios foram revestidos com laminina (um substrato favorecendo
sobrevivência) ou colágeno IV (que não favorece sobrevivência
neuronial) e observados após 24 horas de cultura na presença ou
ausência de despolarização ou FGF2. Quando as células foram
despolarizadas e se desenvolveram na presença de FGF2, não im-
Sem FGF2 Despolarização FGF2 portou em qual substrato elas cresceram. Todavia, quando o FGF2
adição de + estava presente sem despolarização, o substrato causou uma grande
agentes Despolarização diferença. (de Schmidt e Kater, 1993.)
& Especulações
Neurônios Fetais em Hospedeiros Adultos

E m 1976, Lund e Hauschka implan- dor e recipiente não precisavam ser paren- não são a única maneira de se restaurar a
taram tecido cerebral fetal de rato tes, já que o cérebro é separado do sistema anatomia funcional da substância nigra
no cérebro de um rato recém-nas- imune pela barreira hematoencefálica, que em pacientes com Parkinson. Em primeiro
cido. Os neurônios fetais fizeram as cone- protege transplantes de tecidos no cére- lugar, os estudos de Isacson e colegas
xões apropriadas com o cérebro do hospe- bro da rejeição pelo sistema imune. Dentro (1995) sugerem que as células embrioná-
deiro. Esse estudo ofereceu a possibilidade 5 meses, o transplante tinha restaurado rias do doador não necessitam ser de hu-
de de que transplantes de neurônios fetais muito da dopamina normalmente produzi- manos. Células do mesencéfalo do em-
possam ser capazes de reparar regiões da pela substância nigra, assim como a brião de porco reconstruíram as conexões
danificadas no cérebro humano. Há mui- capacidade para movimentos voluntários neuroniais normais quando injetadas no
tas doenças degenerativas neuroniais, e a do paciente. Dois outros laboratórios rela- estriado de ratos adultos com uma doen-
doença de Parkinson é uma das mais fre- taram restaurações semelhantes de função ça semelhante à doença de Parkinson. Em
qüentes, afetando cerca de um milhão de após transplantes de neurônios fetais em segundo lugar, quando Gash e colegas
pessoas na América. Nessa doença, neu- pacientes (Freed et al., 1992; Spencer et al., (1996) injetaram fator de crescimento de-
rônios produtores de dopamina da subs- 1992). Segundo Björkland (1987), o tecido rivado da glia nos cérebros de macacos
tância nigra (um conjunto de células no doador ótimo é aquele contendo presumi- que haviam sido induzido para ter síndro-
pedúnculo cerebral) são destruídos, e seus dos neurônios secretores de dopamina, que mes semelhantes ao Parkinson pela inje-
terminais axônicos no núcleo caudado e tinham passado pela sua última divisão ção de MPTP, os macacos injetados mos-
putâmen (dois núcleos cerebrais) degene- celular mas ainda não haviam formado ex- traram recuperação funcional de seus sin-
ram. Isso leva a tremores musculares, difi- tensas conexões sinápticas. Em 1992, tomas. Ainda mais, eles tinham substan-
culdade para iniciar movimentos voluntá- Widner e colegas mostraram que enxertos cialmente mais dopamina e neurônios pro-
rios e problemas de cognição. A injeção de de mesencéfalos fetais foram capazes de dutores de dopamina. Como a doença de
L-dopa (que o organismo metaboliza em restaurar funções motoras em dois pacien- Parkinson é progressiva, não é sabido se
dopamina) alivia temporariamente esses tes que haviam destruído suas substânci- os neurônios enxertados ou recém-divi-
sintomas, mas a L-dopa perde seu efeito as nigras injetando-os com uma de heroí- didos serão acometidos pelo mesmo pro-
com o uso prolongado e algumas vezes na sintética contaminada com o biproduto cesso que havia destruído os neurônios
tem efeitos adversos. MPTP. Esse composto havia criado uma endógenos. Porém, parece provável que
Em 1990, Lindvall e colegas implanta- condição que parecia com a severa doen- enxertos fetais e neurônios novos são ca-
ram células neuroniais humanos da subs- ça de Parkinson. pazes de reestabelecer conexões sinápti-
tância nigra de fetos de 8 a 9 semanas, em Dois estudos recentes mostraram que cas que os neurônios destruídos haviam
um paciente com mal de Parkinson. Doa- transplantes de células humanas fetais estabelecido.
O desenvolvimento de comportamentos:
Constância e plasticidade
Um dos aspectos mais fascinantes da neurobiologia do desenvolvimento é a correla-
ção de certas conexões neuroniais com certos comportamentos. Existem dois aspec-
tos notáveis desse fenômeno. Primeiro há aqueles casos nos quais os padrões com-
plexos do comportamento estão inerentemente presentes no “circuito” do cérebro no
nascimento. O ritmo cardíaco de um embrião de pinto de 19 dias se acelera quando ele
escuta o chamado de aflição, e nenhum outro chamado provocará essa resposta
(Gottlieb, 1965). Além disso, um pinto recém-eclodido imediatamente irá buscar abrigo
se apresentado à sombra de um gavião. O gavião verdadeiro não é necessário a
sombra pela sua silhueta em papel será suficiente, mas sombra de nenhuma outra ave
causará essa resposta (Tinbergen, 1951). Parece, portanto, que são certas conexões
neuroniais que levam a comportamentos inerentes em vertebrados.
São igualmente notáveis os exemplos em que o sistema nervoso é tão plástico que
novas experiências podem modificar o conjunto original de conexões neuroniais,
causando a criação de novos neurônios ou a formação de novas sinapses entre neurô-

nios existentes. Iremos discutir a plasticidade neuronial em maior detalhe no Capítulo
21, mas é suficiente dizer neste ponto que o cérebro não cessa de se desenvolver com
o nascimento. O trabalho ganhador do prêmio Nobel de Hubel e Wiesel (1962, 1963)
demonstrou que havia competição entre neurônios retinianos de cada olho por alvos
no córtex, e que suas conexões tinham que ser fortalecidas pela experiência. Em pássa-
ros canoros, além disso, novos neurônios são criados e novas sinapses formadas
quando os pássaros aprendem seu canto (Alvarez-Buylla et al., 1990), e quando ratos
adultos aprendem novas atitudes, seus neurônios corticais desenvolvem novas
sinapses (Black et al., 1990). Assim, o sistema nervoso continua a se desenvolver na
vida adulta, e o padrão de conexões neuroniais é um produto de padronização herdada
e padronização produzida pela experiência. [axon6.html]
Como um investigador (Purves, 1994) recentemente concluiu em sua análise do
desenvolvimento cerebral:
Embora a grande maioria dessa construção deve se originar de programas

desenvolvimentais configurados durante a evolução de cada espécie, a ativida-
de neuronial pode modular e instruir esse processo, armazenando assim a
imensidão de informação idiossincrática que cada um de nós adquire pela expe-
riência individual e prática.
LITERATURA CITADA
Akers, R. M., Mosher, D. F. and Lilien, J. E. of adult rats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: of retinal ganglial cell axons. Dev. Biol. 122:
1981. Promotion of retinal neurite outgrowth 5568-5572. 407-418.
by substratum-bound fibronectin. Dev. Biol. 86:
Calof, A. L. 1992. Sex, nose, and genotype. Curr. Colamarino, S. A. and Tessier-Lavigne, M. 1995,
179-188.
Biol. 2: 103-105. The axonal chemoattractant netrin-1 is also a
Alvarez-Buylla, A., Kirn, J. R. and Nottebohm, chemorepellent for trochlear motor axons. Cell
Chan, S. S.-Y., Zbeng, H., Su, M.-W., Wilk, R.,
F. 1990. Birth of projection neurons in adult 81: 621-629.
Killeen, M. T., Hedgecock, E. M. and Culotti, J.
avian brain may be related to perceptual or
G. 1996. UNC-40, a C. elegans homolog of DCC Cox, E. C., Müller, B. and Bonhoeffer, F. 1990.
motor learning. Science 249: 1444-1446.
(Deleted in Colonorectal Cancer), is required in Axonal guidance in chick visual system: Poste-
Baier, H. and Bonhoeffer, F. 1992. Axon motile cells responding to UNC-6 netrin cues. rior tectal membranes induce collapse of growth
guidance by gradients of a target-derived Cell 87: 186-195. cones from temporal retina. Neuron 2: 31-37.
component. Science 255: 472-475.
Cheng, H.-J., Nakamoto, M., Bergemann, A. D. Crowley, C. and ten others. 1994. Mice lacking
Barinaga, M. 1995. Receptors find work as and Flanagan, J. G. 1995. Complementary nerve growth factor display perinatal loss of
guides. Science. 269: 1668-1670. gradients in expression and binding of ELF-1 sensory and sympathetic neurons yet develop
and Mek4 in development of the topographic basal forebrain cholinergic neurons. Cell 76:
Bastiani, M. J., Harrelson, A. L., Snow, P. M.
retinotectal projection map. Cell 82: 371-381. 1001-1011.
and Goodman, C. S. 1987. Expression of fasciclin
I and II glycoproteins on subsets of axon Chu-LaGraff, Q., Schmid, A., Leidel, J., Brönner, Culotti, J. G. 1994. Axon guidance mechanisms
pathways during neuronal development in the G., Jäckle, H. and Doe, C. 1995. huckebein in Caenorhabditis elegans. Curr. Opin. Genet.
grasshopper. Cell 48: 745-755. specifies aspects of CNS precursor identity Dev. 4: 587-595.
required for motoneuron axon pathfinding.
Begovac, P. C. and Shur, B. D. 1990. Cell surface Dan, Y. and Poo, M.-M. 1992. Hebbian
Neuron 15: 1041-1051.
galactosyItransferase mediates the initiation of depression of isolated neuromuscular synapses
neurite outgrowth from PC12 cells on laminin. Cohan, C. S. and Kater, S. B. 1986. Suppression in vitro. Science 256: 1570-1573.
J. Cell Biol. 110: 461-470. of neurite elongation and growth cone motility
by electrical activity. Science 232: 16318-1640. Davies, A. M., Brandtlow, C., Heumann, R.,
Björkland, A. 1987. Brain implants, trans- Korsching, S., Rohrer, H. and Thoenen, H. 1987.
plants. In G. Adelman (ed.), Encyclopedia of Cohen, J., Burne, J. F., Winter, J. and Bartlett, Timing and site of nerve growth factor synthesis
Neuroscience, Vol. 1. Birkhauser, Boston, pp. P. 1986. Retinal ganglial cells lose responsive- in developing skin in relation to innervation and
165-167. ness to lamina with maturation. Nature 322: expression of the receptor. Nature 326: 353-358.
465-467.
Black, J. E., Issacs, K. R., Anderson, B. J. Davies, J. A., Cook, G. W. M., Stern, C. D. and
Alcantara, A. A. and Greenough, W T. 1990. Cohen, J., Burne, J. F., McKinlay, C. and Winter, Keynes, R. J. 1990. Isolation from chick somites of
Learning causes synaptogenesis, whereas motor J. 1987. The role of laminin and the laminin/ a glycoprotein fraction that causes collapse of dor-
activity causes angiogenesis, in cerebellar cortex fibronectin receptor complex in the outgrowth sal root ganglion growth cones. Neuron 2: 11-20.
Drescher, U., Kremoser, C., Handwerker, C., Goodrnan, C. S. and Bastiani, M. J. 1984. How Harris, W. A. 1986. Homing behavior of axons
Löschinger, J., Noda, M. and Bonhoeffer, F. embryonic nerve cells recognize one another. in the embryonic vertebrate brain. Nature 320:
1995. In vitro guidance of retinal ganglion cell Sci. Am. 251(6): 58-66. 266-269.
axons by RAGS, a 25 kDa protein related to
Goodman, C. S. and Doe, C. Q. 1993. Embryonic Harrison, R. G. 1910. The outgrowth of the
ligands for Eph receptor tyrosine kinases. Cell
development of the Drosophila central nervous nerve fiber as a mode of protoplasmic move-
82: 359-370.
system. In Bate, M. and Martinez Arias, A., The ment. J. Exp. Zool. 9: 787-848.
Eisen, J., Meyers, P. Z. and Westerfield, M. 1986. Development of Drosophila melanogaster. Cold
Hedgecock, E. M., Culotti, J. G. and Hall, D. H.
Pathway selection by growth cones of identified Spring Harbor Press, Cold Springs Harbor, NY
1990. The unc-5, unc-6, and unc-40 genes guide
motoneurones in live zebra fish embryos. Nature pp. 1131-1206.
circumferential migrations of pioneer axons and
320: 269-271.
Goodman, C. S. and Shatz, C. J. 1993. mesodermal cells on the epidermis in C. elegans.
Ericson, J., Thor, S., Edlund, T., Jessell, T. J. and Developmental mechanisms that generate pre- Neunon 2: 61-85.
Yamada, T. 1992. Early stages of motor neuron cise patterns of neuronal connectivity. Neuron
Henderson, C. E. and tweIve others. 1993.
differentiatiory revealed by expression of 10 [SuppL]: 77-98.
Neurotrophins promote motor neuron survival
homeobox gene isIet-1. Science 256: 1555-
Goodman, C. S., Bastiani, M. J., Doe, C. Q., du and are present in embryonic limb bud. Nature
1560.
Lac, S., Helfand, S. L., Kuwada, J. Y. and Thomas, 363: 266-270.
Ericson, J., Morton, S., Kawakarni, A., Roelink, J. B. 1984. Cell recognition during neuronal de-
Hohn, A., Leibrock, J., Bailey, K. and Barde, Y-
H. and Jessell, T. M. 1996. Two critical periods velopment. Science 225: 1271-1287.
A. 1990. Identification and characterization of
of sonic hedgehog signaling required for the
Gottlieb, D. l., Rock, K. and Glaser, L. 1976. A a novel member of the nerve growth factor/
specification of motor neuron identity. Cell 87:
gradient of adhesive specificity in developing avian brain-derived neurotrophic factor family. Nature
661-673.
retina. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 410-414. 344: 339-341.
Fawcett, J. W. and O’Leary, D. D. M. 1985. The
Gottlieb, G. 1965. Prenatal auditory sensitivity Holley S. A., lackson, P. D., Sasai, Y., Lu, B., De
role of electrical activity in the formation of
in chickens and ducks. Science 147: 1596-1598. Robertis, E. M., Hoffmann, F. M. and Ferguson,
topographic maps in the nervous system. Trends
E. L. 1995. A conserved system for dorsal-ven-
Neurosci. 8: 201-206. Grumet, M. 1991. Cell adhesion molecules and
tral patterning in insects and vertebrates involving
their subgroups in the nervous system, Curr. Opin.
Fliess, W. 1897. Quoted in J. Geller, 1992. The sog and chordiii. Nature 376: 249-253.
Neurobiol. 1: 370-376.
cultural constructioti of the other. In H. Eilberg-
Hollyday, M. 1980a. Motoneuron histogenesis
Schwartz (ed.), People of the Body. State Gundersen, R. W. 1987. Response of sensory
and the development of limb innervation. Curr.
University of New York Press, Albany, pp. 243- neurites and growth cones to patterned substrata
Top). Dev. Biol. 15: 181-215.
282. of laminin and fibronectin in vitro. Dev. Biol.
121: 423-431. Hollyday, M. 1980b. Organization of motor
Flor, H. and seven others. 1995. Phantomlimb
pools in the chick lumbar lateral motor column.
pain as a perceptual correlate of cortical reorga- Halfter, W., Claviez, M. and Schwarz, U. 1981.
J. Comp. Neurol. 194: 143-170.
nization following arm amputation. Nature 375: Preferential adhesion of tectal membranes to
482-484. anterior embryonic chick retina neurites. Nature Hollyday, M., Hamburger, V. and Farris, J. M. G.
292: 67-70. 1977. Localization of motor neuron pools
Franco, B. and fifteen others. 1991. A gene
supplying identified muscles in normal and
deleted in Kallmann’s syndrome shares homology Hall, Z. W. 1995. Laminin b (S-laminin): A new
supernumerary legs of chick embryos. Proc. Natl.
with neural cell adhesion and axonal path-finding player at the synapse. Science 269: 362-363.
Acad. Sci. USA 74: 3582-3586.
molecules. Nature 353: 529-536.
Hall, Z. W. and Sanes, J. R. 1993. Synaptic
Hubel, D. H. and Wiesel, T. N. 1962. Receptive
Freed, C. R. and eighteen others. 1992. Survival structure and development: The neuromuscular
fields, binocular interaction and functional
of implanted dopamine cells and neurological junction. Neuron 10 [Suppl.]: 99-121.
architecture in the cat’s visual cortex. J. Physiol.
iprovement 12 to 46 months after transplanta-
Hamburger, V. 1939. The development and 160: 106-154.
tion for Parkinson’s disease. N. EngI. J. Med.
327: 1549-1555. innervation of transplanted limb primordia of
Hubel, D. H. and Wiesel, T. N. 1963. Receptive
chick embryos. J. Exp. Zool. 80: 347-389.
fields of cells in striate cortex of very young,
Gash, D. M. and eleven others. 1996. Functional
Hamelin, M., Zhou, Y., Su, M.-W., Scott, I. M. visually inexperienced kittens. J. Neutropliysiol.
recovery in parkinsonnian monkeys treated with
and Culotti, J. G. 1993. Expression of the unc-5 26: 944-1002.
GDNF. Nature 380: 252-255.
guidance receptor in the touch neurons of C.
Hughes, R. A., Sendtner, M., Goldfarb, M.,
Gershon, M. D., Schwartz, J. H. and Kandel, elegans steers their axons dorsally. Nature 364:
Linholm, D. and Thoenen, H. 1993. Evidence
E. R. 1985. Morphology of chemical synapses 327-330.
that fibroblast growth factor 5 is a major muscle-
and pattern of interconnections. In E. R.
Harper, S. and Davies, A. M. 1990. NGF mRNA derived survival factor for cultured spinal
Kandel and J. H. Schwartz (eds.), Princilyles
expression in developing cutaneous epithelium motoneurons. Neuron 10: 369-377.
of Neural Science, 2nd Ed. Elsevier, New York,
pp. 132-147. related to innervation density. Development 110:
Hynes, R. 0. and Lander, A. D. 1992. Contact
515-519.
and adhesive specificities in the associations,
Godement, P., Salaun, J. and Mason, C. A. 1990.
Harrelson, A. L. and Goodrnan, C. S. 1988. migrations, and targeting of cells and axons. Cell
Retinal axon pathfinding in the optic chiasm:
Growth cone guidance in insects: Fasciclin II is a 68: 303-322.
Divergence of crossed and uncrossed fibers.
Neuron 5: 173-186. member of the immunoglobulin superfamily.
Ibáñez, C. F., Ebendal, T. and Persson, H. 1991.
Science 242: 700-708.
Chimeric molecules with multiple neurotrophic
Goodman, C. S. 1994. The likeness of being:
Harris, W. A. 1984. Axonal pathfinding in the activities reveal structural elements determining
Phylogenetically conserved molecular me-
absence of normal pathways and impulse activity. the specificities of NGF and BDNF EMBO J. 10:
chanisms of growth cone guidance. Cell 78:
J. Neurosci. 4: 1153-1162. 2105-2110.
353-356.
Inuzuka, H., Miyatani, S. and Takeichi, M. 1991. 1992. Fasciclin IV: Sequence, expression, and Biochemical differentiation and intercellular
R-cadherin: A novel Ca2,-dependent cell-cell function during growth cone guidance in the interactions of migratory GnRH cells in the
adhesion molecule expressed in the retina. grasshopper embryo. Neturon 9: 831-845 mouse. Dev. Biol. 159: 643-666.
Neuron 7: 69-79.
Kolodziej, P. A., Timpe, L. C., Mitchell, K. J., Logan, C., Wizenmann, A., Drescher, U.,
Ishii, N., Wadsworth, W. G., Stern, B. D., Culotti, Fried, S. R., Goodman, C. S., Jan, L. Y. and Jan, Monschau, B., Bonhoeffer, F. and Lumsden, A.
J. G. and Hedgecock, E. M. 1992. UNC-6, a Y. N. 1996. Frazzled encodes a Drosophila 1996. Rostral optic tectum acquires caudal
laminin-related protein, guides pioneer axon member of the DCC immunoglobulin subfamily characteristics following ectopic Engrailed
migrations in C. elegans. Neuron 9: 873-881. and is required for CNS and motor axon guidance. expression. Curr. Biol. 6: 1006-1014.
Cell 87: 197 204.
Isacson, O., Deacon, T., Pakzaban, P., Galpern, Lund, R. D. and Hauschka, S. D. 1976.
W. R., Dinsmore, J. and Burns, L. H. 1995. Korsching, S. and Thoenen, H. 1983. Nerve Transplanted neural tissue develops con nection
Transplanted xenogeneic neural cells in growth factor in sympathetic ganglia and with host rat brain. Science 193: 582-584.
neurodegenerative disease models exhibit corresponding target organs of the rat:
remarkable axonal target specificity and distinct correlation with density of sympathetic Luo, Y., Raibile, D. and Raper, J. A. 1993.
growth patterns of glial and axonal fibres. Nat. innervation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: Collapsin: A protein in brain that induces the
Med. 1: 1189-1194. 3513-3516. collapse and paralysis of neuronal growth co-
nes. Cell 75: 217-227.
Jacobson, M. 1967. Retinal ganglion cells: Krafft-Ebing, R. von. 1886. Psychopathia
Specification of central connections in larval Sexualis. Enke, Stuttgart. Mackenzie, J. L. 1898. The physiological and
Xenopus laevis. Science 155: 1106-1108. pathological relations between the nose and the
Lance-jones, C. and Landmesser, L. 1980, Mo- sexual apparatus of man. Johns Hopkins Hosp.
Jones, K. R., Farinas, I., Backus, C. and Reichardt, tor neuron projection patterns in chick hindlimb Bull. 82: 10-17.
L. F. 1994. Targeted disruption of the BDNF following partial reversals of the spinal cord. J.
gene purturbs brain and sensory neuron develo- Physiol. 302: 581-602. Maisonpierre, P. C., Belluscio, L., Squinto, S.,
pment but not motor neuron development. Cell Ip, N. Y., Furth, M. E., Lindsay, R. M. and
Landmesser, L. 1978. The development of Yancopoulos, G. D. 1990. Neurotrophin-3: A
76: 989-999.
motor projection patterns in the chick hindlimb. neurotrophic factor related to NGF and BDNF.
KarIstrom, R. 0., Trowe, T. and Bonhoeffer, J. Physiol. 284: 391 414. Science 247: 1446-1451.
F. 1997. Genetic analysis of axon guidance
Lee, J. E., Hollenberg, S. M., Snider, L., Turner, Martin, P. T., Ettinger, A. J. and Sanes, J. R.
and mapping in the zebrafish. Trends Neurosci.
D. L., Lipnick, N. and Weintraub, H. 1995. 1995. Synaptic localization domain in the
20: 3-8.
Conversion of Xenopus ectoderm into neurons synaptic cleft protein laminin b2 (slaminin).
Keino-Masu, K. Masu, M., Hinck, L. Leonardo, by NeuroD, a basic helixloop-helix protein. Science 269: 413-416.
E. D. Chan, S. S.-Y., Culotti, J. G. and Tessier- Science 268: 836-844.
Lavigne, M. 1996. Deleted in Colonorectal Marx, J. 1995. Helping neurons find their way.
Legouis, R. and fourteen others. 1991. The Science 268: 971-973.
Cancer (DCC) encodes a netrin receptor. Cell
candidate gene for X-linked Kallmann syndrome
87: 175-185. Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L. and
encodes a protein related to adhesion molecules.
Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R. CeIl 67: 423-435. Goodman, C. S. 1995. Semaphorin II can
and Tessier-Lavigne, M. 1994. Netrins are function as a selective inhibitor of specific
Letourneau, P., Madsen, A. M., Palm, S. M. and synaptic arborizations. Cell 81: 631-639.
diffusible chemotropic factors for commissural
Furcht, L. T. 1988. Immunoreactivity for
axons in the embryonic spinal cord. Cell 78: Matsunaga, M., Hatta, K. and Takeichi, M. 1988.
laminin in the developing ventral longitudinal
425-435. Role of N-cadherin cell adhesion molecules in the
pathway of the brain. Dev. Biol. 125: 135-144.
Keynes, R. J. and Stern, C. D. 1984. Segmentation histogenesis of neural retina. Neuron 1: 289-295.
Levi-Montalcini, R. and Booker, B. 1960.
in the vertebrate nervous system. Nature 310: Matsuzawa, M., Weight, F. F., Potember, R. S.
Destruction of the sympathetic ganglia in
786-787. and Liesi, P. 1996. Directional neurite outgrowth
mammals by an antiserum to the nerve growth
Kimmel, C. B. and Law, R. D. 1985. Cell lineage factor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46: and axonal differentiation of embryonic
of zebrafish blastomeres I. Cleavage pattern and 384-390. hippocampal neurons is promoted by a neurite
cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108: outgrowth domain of the B2-chain of laminin.
Liesi, P. and Silver, J. 1988. Is astrocyte laminin Inter. I. Dev. Neurosci. 14: 283-295.
78-101.
involved in axon guidance in the mammalian
Klose, M. and Bentley, D. 1989. Transient CNS? Dev. Biol. 130: 774-785. McFarlane, S., McNeill, L. and Holt, C. E. 1995.
pioneer neurons are essential for formation of FGF signaling and target recognition in the
Lin, L.-F. H., Doherty, D. H., Lile, J. D., developing Xenopus visual system. Neutron 15:
an embryonic peripheral nerve. Science
Bektesh, S. and Collins, F. 1993. GDNF: A glial 1017-1028.
245:982-984.
cell-line derived neurotrophic factor for
Kobayashi, T. Nakamura, H. and Yasuda, M. midbram dopaminergic neurons. Scienct, 260: Messersmith, E. K., Leonardo, E. D., Shatz, C.
1990. Disturbance of refinement of retintectal 1130-1132. J., Tessier-Lavigne, M., Goodrnan, C. S. and
projection in chick embryos by tetrodotoxin Koloclkin, A. 1995. Semaphorin III can
Lindsay, R. M. 1995. Neuron saving schemes. function as a selective chemorepellent to
and grayanotoxin. Dev. Brain Res. 57: 29-35.
Nature 373: 289-290. pattern sensory projections in the spinal cord.
Kolodkin, A. L., Matthes, D. J. and Goodman, Neuron 14: 949-959.
Lindvall, O., Brundin, P. and Widner, H. 1990.
C. S. 1993. The semaphorin genes encode a
Grafts of fetal dopamine neurons survive and Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F.
family of transmembrane and secreted growth
improve motor functions in Parkinson’s disease. W. and Barres, B. A. 1995. Characterization of
cone guidance molecules. Cell 75: 1389-1399.
Science 247: 574-577. the signaling interactions that promote the
Kolodkin, A. L., Matthes, D. J., O’Connor, T. survival and growth of developing retinal
P., Patel, N. H., Bentley, D. and Goodman, C. S. Livne, l., Gibson, M. J. and Silverman, A. J. 1993. ganglion cells in culture. Neuron 15: 805-819.
Nakarnoto, M. and several others. 1996. Roth, S. and Marchase, R. B. 1976. An in vitro Stier, H. and Schlosshauer, B. 1995. Axonal
Topographically specific effects of ELF-1 on assay for retinotectal specificity. In S. H. guidance in the chicken retina. Development
retinal axon guidance in vitro and retinal axon Barondes (ed.), Neuronal Recognition. Plenum, 121: 1443-1454.
mapping in vivo. Cell 86: 755-766. New York, pp. 227-248.
Stout, R. P. and Gradziadi, P. P. C. 1980.
Neugebauer, K. M., Tomaselli, K. J., Lilien, J. and Sasai, Y., Lu, B., Steinbeisser, H. and De Influence of the olfactory placode on the deve-
Reichardt, L. F. 1988. N-cadherin, NCAM, and Robertis, E. M. 1995. Regulation of neural lopment of the brain in Xenopus laevis (Daudin).
integrins promote retinal neurite outgrowth en induction by the Chd and Bmp-4 antagonsistic Neuroscience 5: 2175-2186.
astrocytes in vitro. J. Cell Biol. 107: 1177-1187. patterning signals in Xenopus. Nature 376:
Taghert, P. H., Doe, C. Q. and Goodman, C. S.
333-336.
Noakes, P. G., Gautam, M., Mudd, J., Sanes, J. R. 1984. Cell determination and regulation during
and Merlie, J. P. 1995. Aberrant differentiations Schmidt, M. and Kater, S. B. 1993. Fibroblast development of neuroblasts and neurones in
of neuromuscular junctions in mice lacking s- growth factors, depolarization, and substrate grasshopper embryo. Nature 307: 163-165
laminin/laminin b2. Nature 374: 258-262. interact in a combinatorial way to promote
Thanos, S., Bonhoeffer, F. and Rutischauser, U.
neuronal survival. Dev. Biol. 158: 228-237.
Oppenheim, R. W., Qin-Wei, Y, Prevette, D. and 1984. Fiber-fiber interaction and tectal cues
Yan, Q. 1992. Brain-derived neurotrophic growth Schwanzel-Fukada, M. and Pfaff, D. W. 1989. influence the development of the chicken
factor rescues developing avian motoneurons Origin of luteinizing hormone-releasing retinotectal projection. Proc. Natl. Acad. Sci.
from cell death. Nature 360: 755-757. hormone neurons. Nature 338: 161-164. USA 81: 1906-1910.
Patterson, P. H. 1992. Neuron-target interacti- Schwanzel-Fukada, M., Bick, D. and Pfaff, Thoenen, H. 1995. Neurotrophins and neuronal
ons. In Z. Hall, (ed.), An Introduction to D. W. 1989. Luteinizing hormone-releasing plasticity. Science 270: 593-598.
Molecular Neurobiology. Sinauer Associates, hormone (LHRH)-expressing cells do not
Thomas, L. 1992. The Fragile Species.
Sunderland, MA, pp. 428-459. migrate normally in an inherited hypogo-
Macmillan, New York.
nadal (Kallman) syndrome. Mol. Brain Res.
Pearson, J., Johrison, E. M., Jr. and Brandeis, L.
6: 311-326. Thomas, W. A., Schaeffer, A. W. and Treadway,
1983. Effects of antibodies to nerve growth
R. M. Jr. 1990. Galactosyl transferasedependence
factor on intrauterine development of derivati- Sendtner, M., Schmalbruch, H., StöckIi, K. A.,
of neurite outgrowth on substratum-bound
ves of cranial neural crest and placode in the Carroll, P., Kreutzberg, G. W. and Thoenen, H.
laminin. Development 110: 1101-1114.
guinea pig. Dev. Biol. 96: 32-36. 1992. Ciliary neurotrophic factor prevents
degeneration of motor neurons in mouse Thompson, W J. 1983. Synapse elimination in
Phelan, K. A. and Hollyday, M. 1990. Axon
mutant progressive motor neuropathy. Nature neonatal rat muscle is sensitive to pattern of
guidance in muscleless chick wings: The role of
358: 502-504. muscle use. Nature 302: 614-616.
muscle cells in motoneural pathway selection
and muscle nerve formation. J. Neurosci. 10: Serafini, T., Kennedy, T. E., Galko, M. J., Tinbergen, N. 1951. The Study of Instinct.
2699-2716. Mirayan, C., Jessell, T. M. and Tessier-Lavigne, Clarendon Press, Oxford.
M. 1994. The netrins define a family of axon
Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B. and De Robertis, E. Tosney, K. W. 1991. Cells and cell interactions
outgrowth-promoting proteins homologous to
M. 1996. Dorsoventral patterning in Xenopus: that guide motor axons in the developing chick
C. elegans UNC-6. Cell 78: 409-424.
Inhibition of ventral signals by direct binding of embryo. BioEssays 13: 17-23.
chordin to BMP-4. Cell 86: 589-598. Shawlot, W. and Beliringer, R. R. 1995.
Requirement for Lim1 in head organizer function. Tosney, K. W. and Landmesser, L. T. 1984.
Pittman, R. N. 1985. Release of plasminogen Pattern and specificity of axonal outgrowth
Nature 374: 425-430.
activator and a calcium-dependent metallopro- following varying degrees of limb ablation. J.
tease from cultured sympathetic and sensory Silver, J. and Sidman, R.L. 1980. A mechanism Neurosci. 4: 2158-2527.
neurons. Dev. Biol. 110: 91-101. for guidance and topologic patterning of
retinal ganglion cell axons. J. Comp. Neurol. Tosney, K. W. and Landmesser, L. T. 1985.
Purves, D. 1994. Neural Activity and the Development of the major pathways for neurite
189: 101-111.
Growth of the Brain. Cambridge University outgrowth in the chick hindlimb. Dev. Biol. 109:
Press, New York. Singer, M., Norlander, R. and Egar, M. 1979. 193-214.
Axonal guidance during embryogenesis and
Purves, D. and Lichtman, J. W. 1980. Elimina- Tosney, K. W. and Oakley, R. A. 1990.
regeneration in the spinal cord of the newt:
tion of synapses in the developing nervous Perinotochordal mesenchyme acts as a barrier
The blueprint hypothesis of neuronal
system. Science 210: 153-157. to axon acívance in the chick embryo:
pathway patterning. J. Comp. Neural.
185:1-22. Implications for a general mechanism of axon
Purves, D. and Lichtman, J. W 1985. Principles
guidance. Exp. Neurol. 109: 75-89.
of Neural Development. Sinauer Associates,
Spencer, D. D. and fifteen others. 1992. Unila-
Sunderland, MA. Tosney, K. W., Hotary, K. B. and LanceJones,
teral transplantation of human fetal mesence-
phalic tissue into the caudate nucleus of patients C. 1995. Specificity of motoneurons. BioEssays
Raff, M. C., Barres, B. A., Burne, J. F., Coles, H.
with Parkinson disease. N. Engl. J. Med. 327: 17: 379-382.
S., lshizaki, Y and Jacobson, M. D. 1993.
Programmed cell death and the control of cell 1541-1548. Tsushida, T., Ensini, M., Morton, S. B.,
survival: Lessons from the nervous system. Baldassare, M., Edlund, T., Jessell, T. M. and
Sperry, R. W. 1951. Mechanisms of neural
Science 262: 695-700. Pfaff, S. L. 1994. Topographic organization of
maturation. In S. S. Stevens (ed.), Handbook of
Experimental Psychology. Wiley, New York, pp. embryonic motor neurons defined by expression
Ramón y Cajal, S. 1892. Le Rétine de Vertébrés.
236-280. of LIM homeobox genes. Cell 79: 957-970.
La Cellule 9: 119-258.
Sperry, R. W. 1965. Embryogenesis of behavioral Turner, D. L. and Weintraub, H. 1994. Expression
Raper, J. A. and Kapfhammer, J. P. 1990. The
nerve nets. In R. L. DeHaan and H. Ursprung of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos
enrichinent of a neuronal growth cone collapsing
(eds.), Organogenesis. Holt, Rinehart & converts ectodermal cells to a neural fate. Genes
activity from embryonic chick brain. Neuron 4:
Winston, New York, pp. 161-186. Dev. 8: 1434-1447.
21-29.
Twitty, V. C. 1937. Experiments on the Weiss, P. A. 1955. Nervous system. In B. H. Willier, Wu, H. H., Williams, C. V. and McLoon, S. C.
phenomenon of paralysis produced by a toxin P. A. Weiss and V. Hamburger (eds.), Analysis of 1994. Involvement of nitic oxide in the
occuring in Triturus embryos. J. Exp. Zool. 76: Development. Saunders, Philadelphia, pp. 346-402. elimination of a transient retinotectal projection
67-104. in development. Science 265: 1593-1596.
Westerfield, M., Liu, D. W., Kimmel, C. B. and
Twitty, V. C. and Johnson, H. H. 1934.. Motor Walker, C. 1990. Pathfinding and Yin, X., Watanabe, M. and Rutishauser, U. 1995.
inhibition in Amblystorna produced by Triturus Effects of polysialic acid on the behavior of
transplants. Science 80: 78-79. synapse formation in a zebrafish mutant lacking
retinal ganglion cell axons during growth into
functional acetylcholine receptors. Neuron 4:
Wadsworth, W. G., Bhatt, H. and Hedgecock, E. M. the optic tract and tectum. Development 121:
867-874.
1996. Neuroglia and pioneer neurons express UNC- 3439-3446.
6 to provide global and local netrin cues for guiding Whitelaw, V. and Hollyday, M. 1983. Position-
Zinn, K., McAllister, L. and Goodman, C. S.
migrations in C. elegans. Neuron 16: 35-46. dependent motor innervation of the chick
1988. Sequence analysis and neuronal expression
hindlimb following serial and parallel duplications
Walter, J., Henke-Fahle, S. and Bonhoeffer, F. of fasciclin I in grasshopper and Drosophila.
of limb segments. J. Neurosci. 3: 1216-1225.
Cell 53: 577-587.
1987. Avoidance of posterior tectal membranes
by temporal retinal axons. Development 101: Widner, H. and eight others. 1992. Bilateral fetal
Zipser, B. and McKay, R. 1981. Monoclonal
909-913. mesencephalic grafts in two patients with
antibodies distinguish identifiable neurones in the
parkinsonism induced by 1-methyl-4phenyl-
leech. Nature 289: 549-554.
Wang, T., Xie, Z. and Lu, B. 1995. Nitric oxide 1,2,3,6 tetrahydropryridine (MPTP). N. EngI.
mediates activity-dependent synaptic suppres- J. Med. 327: 1556-1563.
sion at developing neuromuscular synapses.
Nature 374: 262-266. Wray, S., Grant, P. and Gainer, H. 1989.
Evidence that cells expressing luteinizing
Way, J. C. and Chalfie, M. 1988. mec-3, a hormone-releasing hormone mRNA in the mouse
homeobox-containing gene that specifies are derived from progenitor cells on the
differentiation of the touch receptor neurons in olfactory placode. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
C. elegans. CeIl 54: 5-16. 86: 8132-8136
CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 341

Mesoderma e endoderma
9
Da fisiologia de alto a baixo, eu canto,
Nem fisionomia somente nem cérebro somen-
te são dignos da Musa,
Eu digo a forma completa é de longe mais
valorosa,
N OS CAPÍTULOS 7 e 8 acompanhamos os vários tecidos formados pelo ecto-
derma em desenvolvimento. Neste capítulo acompanharemos o desenvolvi-
mento precoce das camadas germinativas mesodérmica e endodérmica. Ve-
remos que o endoderma forma o revestimento dos tubos digestivo e respiratório, com
seus órgãos associados; o mesoderma será observado gerando todos os órgãos entre
A Fêmea igualmente com o Macho eu canto. a parede ectodérmica e os tecidos endodérmicos.
WALT WHITMAN (1867)
Teorias vêm e teorias vão. A rã permanece. QMESODERMA

JEAN ROSTAND (1960)
O mesoderma de um embrião em estágio de nêurula pode ser dividido em cinco regiões
(Figura 9.1). A primeira região é o cordomesoderma. Esse tecido forma a notocorda, um
órgão transitório cuja principal função inclui a indução da formação do tubo neural e
estabelece o eixo corporal ântero-posterior. Como observamos no Capítulo 6, o
cordomesoderma se forma no centro do embrião no futuro lado dorsal. A segunda
região é o mesoderma dorsal somítico. O termo dorsal se refere à observação de que
os tecidos em desenvolvimento originários dessa região estarão na parte de trás do
embrião, ao longo da espinha. As células nessa região formam somitos, blocos de
células mesodérmicas em ambos os lados do tubo neural que irão produzir muitos dos
tecidos conjuntivos das costas (osso, músculo, cartilagem e derme). O mesoderma
intermediário forma o sistema urinário e os dutos genitais; discutiremos essa região
em detalhe em capítulos posteriores. Mais distante da notocorda, o mesoderma da
placa lateral dá origem ao coração, vasos sangüíneos e células sangüíneas do siste-
ma circulatório, como também ao revestimento da cavidade do corpo e de todos os
componentes mesodérmicos dos membros exceto os músculos. Ele também irá formar
uma série de membranas extra-embrionárias que são importantes para o transporte de
nutrientes para o embrião. Por último, o mesênquima da cabeça irá contribuir para os
tecidos conjuntivos e a musculatura da face.
Mesoderma dorsal: A notocorda e a diferenciação dos somitos

Mesoderma Paraxial
Uma das principais tarefas da gastrulação é criar uma camada mesodérmica entre o
endoderma e o ectoderma. Como mostra a Figura 9.2, a formação de órgãos mesodérmicos
341
Zigoto
Células
Gametas germinativas
primordiais Clivagem
Ectoderma embr. ext. Glândulas
do âmnio e cório sudoríparas*
Bexiga urinária
Gastrulação Unhas
Glândulas mamárias*
Alantóide* ENDODERMA Cabelo
Fígado Traquéia* INTESTINO
brônquios* ECTODERMA EPITÉLIO EXTERNO
Pâncreas* PRIMITIVO
Pulmões DO CORPO
NOTOCORDA
Tubo digestivo* (CORDOME-
Cristalino do olho Glândulas
SODERMA)
sebáceas*
Vesícula
Tireóide FARINGE MESODERMA auditiva* Epitélio
estomodeal
Bolsas faríngeas*
Mecanismo do
ouvido interno Epitélio oral
Ouvido médio* Recessos MESODERMA
tubo de eustáquio tonsilares* PARAXIAL Epitélio nasal e olfativo Esmalte dentário
DORSAL e nervo olfativo
Timo primitivo*, Lóbulo anterior da hipófise
Paratireóides*
paratireóides* Epitélio
Corpos proctodeal
pós-branquiais* Pars neuralis
Esqueleto Raízes dos nervos
Esclerótomos motores espinhais da hipófise
axial Canal
Medula espinhal
Esqueleto Brotos dos anal*
Miótomos
apendicular apêndices
TUBO NEURAL
Músculos dos Músculos
apêndices esqueléticos do tronco Retina* e
Vesículas ópticas Cérebro
Camadas de tecido Dermátomos nervo óptico
conjuntivo da pele Nervos motores cranianos
Epidídimo CRISTA NEURAL
vasos deferentes
Divertículo metanéfrico, Nervos e gânglios Raízes dos nervos
ureteres pelve renal, cranianos sensoriais sensoriais espinhais
Dutos mesonéfricos
túbulos coletores
Gânglios da raiz Medula da
Mesonefro, dutos MESODERMA dorsal espinhal supra-renal
eferentes INTERMEDIÁRIO
Dentina
Metanefro, Dutos mulerianos Pronefro Gânglios
dentária Crânio e
túbulos renais* simpáticos
MESODERMA cartilagens
Vagina* Ovidutos* Útero* MESÊNQUIMA branquiais
LATERAL Camadas externas
DA CABEÇA
Mes. embr. ext. do da cabeça
Mês.emb. ext. Tecido conectivo
âmnio e cório cefálico
do saco vitelínico
Mesoderma somático e alantóide
Músculos
Pleura, Mesoderma Córtex da
Mesentérios Peritônio visceral
pericárdio, esplâncnico supra-renal
peritônio Epimiocárdio
Estroma epicárdio Coração
Mesênquima
das gônadas Pleura visceral miocárdio
Tecido hemangioblástico
* O esquema indica somente a origem
da parte epitelial do órgão. Todos esses Tecido conjuntivo e Corpúsculos Endotélio dos Endocárdio
órgãos têm investimentos de sustenta- músculo liso das vísceras e sangüíneos vasos sangüíneos
ção secundária de origem mesodérmica. vasos sangüíneos
¶ Figura 9.1
O esquema ilustra a linhagem das partes especializadas do corpo, derivadas das três camadas
germinativas embrionárias. As células germinativas estão representadas como uma linhagem
de células separada das três camadas germinativas somáticas pois, apesar dos precursores das
células germinativas se localizarem no endoderma ou mesoderrma presuntivos, elas são pro-
vavelmente um único tipo celular. (Segundo Carlson, 1981.)
e ectodérmicos não é subseqüente à formação do tubo neural, mas ocorre sincronica-

mente. A formação da notocorda foi discutida no Capítulo 6. Essa haste epitelial se
estende desde a base da cabeça até a cauda. Em cada lado da notocorda existem faixas
grossas de células mesodérmicas. Essas faixas de mesoderma paraxial são referidas
como as placas segmentares (nas aves) e mesoderma não segmentado (nos mamífe-
ros). Com a regressão dos sulcos primitivos, as dobras neurais começam a se aglome-
rar no centro do embrião, o mesoderma paraxial se separa em blocos de células chama-
das somitos. Embora os somitos sejam estruturas transitórias, elas são muito impor-
tantes na organização do padrão segmentar de embriões de vertebrados. Como vimos
no capítulo anterior, os somitos determinam os caminhos da migração das células da
crista neural e axônios do nervo espinhal. Os somitos geram células que formam (1) as
vértebras e costelas, (2) a derme e a pele dorsal, (3) os músculos esqueléticos das
costas e (4) os músculos esqueléticos da parede do corpo e membros.
Somitômeros e a Iniciação da Formação do Somito

Os primeiros somitos aparecem na parte anterior do embrião, e os novos somitos
“brotam” da extremidade rostral do mesoderma paraxial em intervalos regulares (Figu-
ras 9.2C,D e 9.3). Devido aos embriões poderem se desenvolver em taxas um pouco
diferentes (da mesma maneira que acontece com embriões de galinha quando são
incubados em temperaturas um pouco diferentes), o número de somitos presentes
Sulco primitivo Epiblasto
(A) Endoderma Células mesodérmicas migratórias
Epiderme Placa neural
(B) Endoderma Mesoderma paraxial Notocorda Mesoderma lateral
Tubo neural Mesoderma somático

Epiderme Mesoderma
Esplâncnico
Somito
(C) Mesoderma intermediário Celoma
Esclerótomo do somito Figura 9.2

Miótomo
Dermátomo do somito O desenvolvimento progressivo do embrião
do somito
Notocorda do pinto, enfocando o componente mesodér-
Celoma intra-embrionário mico. (A) Região do sulco primitivo mostran-
do precursores migratórios mesodérmicos e
endodérmicos. (B) Formação da notocorda e
Celoma do mesoderma paraxial. (C,D) Diferenciação
extra-embrionário dos somitos, celoma e das duas aortas (as quais
finalmente irão se fundir). A-C, embrião de
(D) Aortas dorsais 24 horas; D, embrião de 48 horas.
geralmente é o melhor indicador para definir o progresso do desenvolvimento. A

quantidade final de somitos formados é uma característica de cada espécie.
O mecanismo para a formação do somito não foi ainda bem estabelecido, mas
diversos estudos em pintos mostraram que as células da placa segmentar estão orga-
nizadas em espirais de células chamadas somitômeros (Meier, 1979; Packard e Meier,
1983). A conversão de somitômero para somito é observada quando as células mais
anteriores do somitômero se tornam compactas. Essa transição de um somitômero
frouxamente compactado para um somito epitelial está correlacionada com a síntese
de duas proteínas da matriz extracelular, fibronectina e N-caderina (Figura 9.4A;
Ostrosky et al., 1984; Lash e Yamada, 1986; Hatta et al., 1987). Essas proteínas, por sua
vez, podem ser reguladas pela expressão de Notch1 e Paraxis. O gene Notch1 codifi-
ca o fator transcrição que está ativo na região mais anterior do mesoderma dorsal não
segmentado, e camundongos com falta desse fator desenvolvem somitos desalinha-
dos de vários tamanhos (Figura 9.4B,C; Conlon et al., 1995). Paraxis, um gene codifi-
cando um outro fator de transcrição, é expressado na extremidade rostral (anterior) do
mesoderma não segmentado de embriões de camundongos e pintos. A injeção de
oligonucleotídeos antisenso complementares ao Paraxis produz defeitos de
segmentação somítica (Burgess et al., 1995; Barnes et al., 1997). Células de somitos
normais recém-formados são organizadas aleatoriamente, mas logo se tornam organi-
Figura 9.3
zadas em uma bola de células epiteliais colunares que circundam uma pequena cavida-
Tubo neural e somitos. Micrografia ao micros-
cópio eletrônico de varredura, mostrando de repleta de células frouxamente conectadas. As células epiteliais se fixam umas às
somitos bem-formados e mesoderma paraxial outras através de junções apertadas. A Paraxis é uma parte essencial dessa conversão
(embaixo à direita) que ainda não se separou de mesênquima em epitélio (Burgess et al.,1996).
em somitos distintos. Um arredondamento do
mesoderma paraxial em um somitômero pode Geração de Tipos de Células Somíticas
ser visto na parte inferior esquerda, e as células
da crista neural podem ser vistas em migração Quando o somito é primeiro formado, qualquer uma de suas células pode se tornar
ventral, a partir do teto do tubo neural. (Corte- qualquer das estruturas derivadas de somitos. No entanto, com a maturação do
sia de K. W. Tosney.)
somito, as várias regiões do somito se tornam comprometidas em formar somente
certos tipos de células. A células mediano-ventrais do somito (aquelas células loca-
lizadas o mais distante das costas, mas próximas ao tubo neural) sofrem mitose,
perdem sua característica epitelial redonda, se tornando células mesenquimatosas
(A)
(B) Notch1 Mesoderma

presente Somitos paraxial (pré-somítico)
Figura 9.4
Transição de um somitômero para um somito. (A) A expres- Concentração de
são da N-caderina se correlaciona com a conversão de células proteína Notch
( C ) Notch1
mesenquimatosas soltas em um somito epitelial. (B) Nos em- ausente
briões de tipo selvagem, expressão de Notch1 é vista na re- Somitos Transição Mesoderma paraxial
gião mais anterior do mesoderma paraxial não segmentado
(i.e., a porção que está sendo organizada em um somito). (C)
Em embriões deficientes em Notch1, a organização dos
somitos é perturbada. (A de Hatta et al., 1987; cortesia de M.
Takeichi; B e C segundo Conlon et al., 1995.) Anterior Posterior
Células do (A) Condensação (B) Figura 9.5

esclerótomo de condrócitos Diagrama de uma seção transversal através
em migração Dermátomo das células do do tronco de (A) um embrião humano preco-
esclerótomo ce de 4 semanas e (B) um embrião tardio de 4
semanas, mostrando a formação das estrutu-
Miótomo ras do somito. (A) As células do esclerótomo
começam a migrar afastando-se do dermáto-
mo e miótomo. (B) Ao fim da quarta semana,
as células do esclerótomo estão se conden-
Aorta dorsal sando para formar vértebras cartilaginosas, o
Nefrótomo do rim dermátomo começa a formar a derme, e as
em desenvolvimento células do miótomo estendem-se ventralmen-
te ao longo das paredes do embrião. (C-E) A
Celoma estrutura do somito do pinto em mudança
intra-embrionário Camada enquanto ocorrema migrações celulares. (A e
Camada Camada
mesodérmica mesodérmica Intestino mesodérmica B segundo Langman, 1981; C-E segundo
somática esplâncnica somática Ordahl, 1993).
(C) (D) (E)

Tubo neural Dermamiótomo Dermátomo
(Musculatura dos membros
e ventrolateral)
Medial Lateral Esclerótomo Miótomo
Notocorda Esclerótomo
novamente. A porção do somito que dá origem a essas células é chamada de escleró-

tomo, e essas células mesenquimatosas no final se tornam condrócitos vertebrais
(Figuras 9.2 e 9.5). Os condrócitos são responsáveis pela secreção de um tipo especial
de colágeno e GAGs (tais como o sulfato de condroitina) característicos da cartilagem.
Esses condrócitos em particular serão responsáveis pela construção do esqueleto
axial (vértebras, costelas, cartilagem e ligamentos). As células da porção lateral do
somito (a região mais distante do tubo neural) também se dispersam. Essas células
formam os precursores dos músculos, dos membros e da parede do corpo. Ordahl e Le
Douarin (1992) seguiram essas células transplantando porções de somitos de codorna
em somitos de embriões de galinha. As células dos pintos e das codornas podem ser
distinguidas pela sua morfologia nucleolar. Os pesquisadores notaram que aquelas
células que estavam mais distantes do tubo neural migram para formar a parede do
corpo e a musculatura dos membros, mesmo se essas células doadoras forem original-
mente da porção medial do somito.
Uma vez que o esclerótomo e os precursores das células musculares dos mem-
bros e da parede do corpo migraram para longe dos somitos, as células somíticas
próximas ao tubo neural migram ventralmente em direção à porção epitelial remanes-
cente do somito para formar uma sólida camada epitelial dupla chamada
dermamiótomo (veja Figuras 9.2 e 9.5 ). A camada dorsal dessa estrutura é chamada
de dermátomo, sendo a responsável pela geração do tecido conectivo
mesenquimatoso da pele dorsal: a derme. (A derme de outras áreas do corpo se forma
de outras células mesenquimatosas e não de somitos.) A camada interna de células
é chamada de miótomo, e essas células dão origem aos músculos vertebrais que
(A)
Ectoderma dorsal Musculatura apaxial Ectoderma dorsal
Derme Medial Dermamiótomo

Músculos da
NT-3 parede corporal
Derme
Wnt
?Wnt Células
musculares apaxiais
Tubo
Lateral
Tubo neural
Myf5
neural
BMP4 Músculos
?FGF5 dos
Shh membros
Aorta dorsal Esclerótomo
Myf5 c-met, MyoD

Notocorda Mesoderma lateral Notocorda Pax3 Pax1 Mesoderma lateral
Figura 9.6
Modelo das principais interações postuladas
para a modelagem do somito. (A) Sonic hed- circundam as vértebras permitindo que as costas se curvem (Chevallier et al., 1977;
gehog da notocorda e placa do assoalho induz Christ et al., 1977). Dessa maneira, os somitos são essenciais para a formação das
formação do esclerótomo; Wnt do tubo neural costas de nosso corpo: as vértebras que circundam a espinha dorsal, os músculos e
induz a região do miótomo que forma muscu- o tecido conectivo que seguram as junções vertebrais, a subcamada dérmica da pele
latura apaxial, e a combinação da proteína Wnt
das costas, e a musculatura das costas. E o que acontece com a notocorda, aquela
da epiderme e BMP4 (e talvez FGF5) do me-
soderma da placa lateral induz a porção do
estrutura mesodérmica central? Após ter fornecido a integridade axial do embrião
miótomo que dá origem aos músculos da pare- precoce, e induzido a formação do tubo neural dorsal, a maior parte degenera. Em
de corporal. Neurotrofina 3 do tubo neural pode qualquer lugar onde as células do esclerótomo formaram o corpo vertebral, as célu-
causar a diferenciação das células do derma- las da notocorda morrem. No entanto, entre as vértebras, as células da notocorda
miótomo. (B) diferentes fatores de transcrição formam o tecido dos discos intervertebrais, chamados núcleos pulposos. Esses são
nas diferentes regiões do somito anunciam o os discos que se “deslocam” em certos tipos de lesões nas costas.
destino celular. As células do esclerótomo ex- A especificação do somito é completada pela interação de diversos tecidos que
pressam Pax1, enquanto as células medianas formam o seu ambiente. A porção mediana-ventral do somito é induzida a se tornar
do dermamiótomo expressam a proteína
esclerótomo por fatores, especialmente pela proteína Sonic hedgehog, secretada
miogênica Myf5. As células laterais do derma-
miótomo expressam o fator de transcrição
pela notocorda e pela placa do assoalho do tubo neural (Fan e Tessier-Lavigne,
miogênico o MyoD assim como o receptor c- 1994; Johnson et al., 1994). Se porções da notocorda (ou outra fonte de Sonic
met para o fator de espalhamento. A porção hedgehog) forem transplantadas próximas a outras regiões do somito, essas regi-
central do dermamiótomo torna-se a derme e ões, também, se tornarão células do esclerótomo. Essas células expressam um novo
expressa Pax3. (Segundo Cossu et al., 1996b.) fator de transcrição, Pax1, que ativa genes específicos da cartilagem e cuja presença
é necessária para a formação das vértebras (Figura 9.6; Smith e Tuan, 1996). Elas
também expressam I-mf, um inibidor da família de fatores de transcrição MyoD que
dá início à formação muscular (Chen et al., 1996). Por caminhos similares, o miótomo
é induzido por dois sinais distintos. As células musculares epaxiais (que circundam
o eixo do corpo) vêm da porção medial do somito e são induzidas por fatores do tubo
neural dorsal, provavelmente membros da família Wnt (Münsterberg et al., 1995;
Stern et al., 1995). Os músculos hipaxiais (que são formados pela porção medial do
somito e formam a musculatura dos membros e parede do corpo) são provavelmente
induzidos através da combinação de proteínas Wnt procedentes da epiderme e da
proteína-4 morfogenética do osso, (BMP4) da placa lateral do mesoderma (Cossu et
al., 1996a; Pourquié et al., 1996). Esses fatores levam as células do miótomo a expres-
sarem fatores de transcrição particulares (MyoD e Myf5) que ativam os genes espe-
cíficos do músculo. O dermátomo se diferencia em resposta a outro fator secretado
pelo tubo neural, neurotrofina 3 (NT-3). Anticorpos que bloqueiam as atividades da
NT-3 previnem a conversão do dermátomo epitelial em mesênquima dérmico solto

que migra por baixo da epiderme (Brill et al., 1995). Além desses sinais positivos,
existem pelo menos dois outros conjuntos de proteínas necessárias para a padroni-
zação do somito em suas regiões particulares. Um desses fatores previne a ativação
de um grupo de células pelas proteínas inapropriadas. Por exemplo, o sinal BMP4 do
mesoderma da placa lateral é neutralizado por um fator do tubo neural que previne
níveis reduzidos de BMP4 de agir em mais células mediais. O outro conjunto de
proteínas é necessário para a manutenção do padrão da expressão do gene iniciada
pelo sinal original (Pownall et al., 1996). [mesend1.html]
Miogênese: Diferenciação do Músculo Esquelético
A célula do músculo esquelético é extremamente grande, célula alongada que con-

tém muitos núcleos. Em meados da década de 1960, biologistas do desenvolvimento
debateram se cada um dessas células (freqüentemente chamadas de miotubos) era
derivada de uma fusão de diversas células precursoras musculares mononucleadas
(mioblastos) ou de um único mioblasto que sofre divisão nuclear sem citocinese.
Evidência da fusão de mioblastos esqueléticos para a formação de miotubos
multinucleados vem de duas fontes independentes. A evidência crucial para a fusão
do mioblasto esquelético veio de camundongos quiméricos. Esses camundongos
podem ser formados pela fusão de dois embriões precoces, que se ajustam para
produzir um único camundongo contendo duas populações de células distintas
(veja Figura 5.28). Mintz e Baker (1967) fundiram embriões de camundongos que
produziam diferentes tipos da enzima isocitrato desidrogenase. Essa enzima, encon-
trada em todas as células, é composta de duas subunidades idênticas. Dessa manei-
ra, se miotubos são formados de uma célula cujo núcleo se divide sem citocinese,
esperava-se encontrar duas formas distintas de enzimas, isto é, as duas formas
parentais no camundongo alofênico (Figura 9.7). Mas se os miotubos são formados
pela fusão entre as células, a expectativa seria de se encontrar células musculares
expressando não somente os dois tipos parentais de enzimas (AA e BB), mas tam-
bém uma terceira classe composta de uma subunidade procedente de cada tipo
parental (AB). As formas diferentes de isocitrato desidrogenase podem ser separa-
das e identificadas pela sua mobilidade eletroforética. Os resultados demonstraram
claramente que apesar dos dois tipos parentais estarem presentes em todos os
outros tecidos do camundongo alofênico, a enzima híbrida (AB) estava presente em
extratos de tecido muscular esquelético. Dessa maneira, os miotubos devem ter se
formado pela fusão de inúmeros mioblastos.
Essa evidência foi importante para mostrar que a fusão do mioblasto realmente
ocorreu dentro do embrião. A análise de como essa fusão acontece foi baseada em
eventos de fusão ocorridos em cultura. Konigsberg (1963) descobriu que mioblastos
isolados de embriões de pinto proliferariam em placas de Petri revestidas com colá-
geno. Após aproximadamente dois dias, no entanto, esses mioblastos pararam de se
dividir e começaram a se fundir com seus vizinhos para produzir extensos miotubos
sintetizantes de proteínas específicas do músculo. A síntese de DNA e a divisão
nuclear não foram encontradas em miotubos multinucleados. Esse processo de fu-
são é uma complexa orquestração de eventos bioquímicos na superfície da célula
mioblasto. A primeira etapa parece ser a retirada das células do ciclo da primeira
divisão. Enquanto existir fatores de crescimento no meio (particularmente fatores de
crescimento do fibroblasto), o mioblasto vai proliferar sem se diferenciar. Quando
esses fatores são exauridos, o mioblasto cessa de se dividir, secreta fibronectina
para sua matriz extracelular, fixando-se a essa através da sua integrina α5β1 , o
principal receptor de fibronectina (Menko e Boettiger, 1987; Boettiger et al., 1995).
Se essa adesão é bloqueada, não resulta desenvolvimento muscular adicional al-
gum, e parece que o sinal da ligação integrina-fibronectina é decisivo para iniciar a
diferenciação do mioblasto em célula muscular (Figura 9.8). A segunda etapa é o
(A) Modelo de divisão (B) Modelo de fusão
Mioblastos
Músculo
Homogenize e coloque
Músculo na origem de uma
placa de eletroforese
Miotubos
Enzimas de isocitrato
desidrogenase vistas
por eletroforese Enzima híbrida
formada
Origem Origem
AA AA
AB
BB BB
Genótipo AA Polipeptídeo A Enzima AA

Genótipo BB Polipeptídeo B Enzima BB
Enzima AB
Figura 9.7
Os dois mecanismos possíveis da formação do músculo esquelético, e como distinguí-los. Ca-
mundongos quiméricos são produzidos da fusão de embriões de duas raças diferentes de camun-
dongos, cada uma produzindo uma forma diferente da enzima isocitrato desidrogenase. Essa
enzima é composta de duas subunidades; uma raça produz isocitrato desidrogenase AA (indicada
em negro) e a outra produz BB (colorida). (A) Se as enzimas forem produzidas em uma única
célula ou em células multinucleadas surgindo de divisões nucleares dentro de uma única célula, a
enzima será puramente AA ou BB. (B) Se houver dois diferentes núcleos em uma mesma célula,
porém, um poderá codificar para subunidades B enquanto o outro poderá codificar para A, com
o resultado de que algumas moléculas da enzima serão híbridas (AB). Por eletroforese pode-se
separar esses três tipos de moléculas. A presença de moléculas AB no músculo esquelético (mas
não em outro tipos de células) confirma o modelo de fusão. (Segundo Mintz e Bakerr, 1967.)
alinhamento dos mioblastos em cadeias. Essa etapa é mediada por glicoproteínas

das membranas celulares, incluindo diversas caderinas e CAMs (Knudsen,1985:
Knudsen et al., 1990). O reconhecimento e alinhamento entre células acontece
somente se as duas células forem mioblastos. A fusão pode acontecer mesmo
Figura 9.8 entre os mioblastos de rato e galinha (Yaffe e Feldman,1965); as identidades das
Auto-radiografia mostrando síntese de DNA espécies não são cruciais em cultura.
em mioblastos e saída de células em fusão do A terceira etapa consiste no próprio evento da fusão celular. Como na maioria
ciclo celular. Fosfolipase C pode “congelar” das fusões de membranas, íons de cálcio são cruciais, e a fusão pode ser ativada
os mioblastos após eles terem se alinhado com pelos ionóforos de cálcio tais como A23187, que transporta íons de cálcio através
outros mioblastos, mas antes da fusão das das membranas celulares (Shainberg et al., 1969; David et al., 1981). A fusão parece
membranas. Esses mioblastos cultivados fo- ser mediada por um conjunto de metaloproteinases chamadas meltrinas. Essas pro-
ram tratados com fosfolipase C e expostos à
teínas foram descobertas durante uma pesquisa para se encontrar proteínas de
timidina radioativa. Mioblastos não fixados
ainda se dividem e incorporam a timidina ra-
mioblastos que poderiam ser homólogas à fertilina, uma proteína envolvida na fusão
dioativa em seu DNA. Células alinhadas (mas óvulo-espermatozóide. Yagami-Hiromasa e colegas (1995) descobriram que uma des-
ainda não fundidas) (setas) não incorporam o sas meltrinas (meltrina-α) é expressa em mioblastos aproximadamente ao mesmo
marcador. (de Nameroff e Munar, 1976, cor- tempo em que começa a fusão, e que o RNA antisenso para a mensagem meltrina-α
tesia de M. Nameroff.) inibiu a fusão quando adicionado aos mioblastos.
& Especulações
Construção Muscular e a Família MyoD

de Reguladores Transcricionais
C omo uma célula mesenquimatosa Proteínas específicas do músculo

embrionária é instruída a formar (desmina, cadeias pesadas de miosina)
uma célula muscular em lugar de
uma célula da cartilagem, um fibroblasto Gene MyoD
ou uma célula adiposa? Quais moléculas Neuroblastos,
comprometem seu destino para uma linha- células
gordurosas,
gem e não para outra? Em 1986, Lassar e
fibroblastos
colaboradores tomaram DNA de células Promotor viral ativo
mioblastos e o transfectaram em um certo
tipo de célula embrionária de camundon- Núcleo
1
go, a célula C3H10T 2 . Essa célula tem um
aspecto semelhante ao do fibroblasto, mas Receptores específicos do músculo
Miotubo
parece mesênquima primitivo, pois pode e moléculas de membrana
Figura 9.9
se tornar célula adiposa, uma célula mus- Sumário de vários experimentos em que o gene MyoD foi ativado por um promotor viral e
cular ou cartilagem. Quando DNA do mús- transfectado para células não musculares. A proteína MyoD parece não levar em conta os
culo foi adicionado a essas células, as célu- reguladores originais do fenótipo celular, convertendo as células em músculos.
1
las C3H10T 2 foram transformadas em cé-
lulas musculares. DNA isolado de fibro- a proteína MyoD parece ativar diretamente 10). A transfecção de qualquer desses ge-
blastos ou de outros tipos celulares não o gene da fosfoquinase da creatina espe- nes miogênicos para um extenso espectro
pode efetuar essa conversão. Através de cífica do músculo, ligando-se ao DNA de células em cultura também as converte
clonagem de subtração (veja Capítulo 2), imediatamente superior aquele (Lassar et em músculo. A expressão de MyoD leva à
foi encontrado um mRNA específico do al., 1989). De maneira semelhante, há dois expressão da miogenina, e a transfecção dos
mioblasto que também podia efetuar essa sítios ligantes de MyoD no DNA adja- genes da miogenina ativa a expressão de
mudança em um fenótipo diferenciado. O cente à uma subunidade do gene do re- MyoD. Assim, há um enlace de retroalimen-
mRNA mioblasto codificava uma proteína ceptor da acetilcolina do músculo da gali- tação recíproca positiva que faz com que
chamada proteína 1 de determinação do nha (Piette et al., 1990). Ele também ativa a quando miogenina ou MyoD é ativado, tam-
mioblasto ou, mais comumente, MyoD si próprio diretamente. Uma vez que o gene bém o é o outro gene (Thayer et al., 1989).
(Davis et al., 1987). O gene MyoD somente é MyoD está ligado, seu produto protéico No pinto, MyoD é ativado em células
expresso em células das linhagens muscu- liga-se ao DNA imediatamente a montan- somíticas que geram a musculatura abdo-
lares. Parece ser um gene “comutador-mor” te do gene MyoD e o impede de ser desli- minal e dos membros, enquanto myf5 é ati-
pois pode converter outros tipos celulares gado (Thayer et al., 1989). Em outros ca- vado em células produzindo os músculos
em músculo se esse gene nelas for ativo. sos, os efeitos de MyoD podem ser indi- do dorso. Em ambos os casos, essa ativa-
Essa hipótese foi testada clonando o gene retos. Nem todos os genes envolvidos na ção compromete as células somíticas à li-
MyoD em um vetor viral de modo a mantê- produção do fenótipo muscular podem ser nhagem miogênica. Ambos grupos celula-
lo sob o controle de um promotor viral ativados diretamente pela proteína MyoD. res expressam miogenina e MRF4 para
constitutivamente ativo (estava sempre “li- MyoD provavelmente atua indiretamente produzir seus miotubos e miofibras (Figu-
gado”). Quando esse gene de fusão MyoD ativando outros genes reguladores, que ra 9.10; Lyons e Buckingham, 1992; Pownall
foi transfectado em várias células, células em seguida ativam os genes estruturais e Emerson, 1992a,b; Braun e Arnold, 1996;
pigmentadas, células nervosas, células específicos do músculo. Cossu et al., 1996a).
adiposas, fibroblastos e células do fígado, MyoD não é o único gene comutador Em alguns casos, esses fatores de
foram convertidas em células semelhantes de músculo. Há uma família de proteínas transcrição miogênica podem compensar
às musculares (Figura 9.9; Weintraub et al., semelhantes à MyoD que tem estruturas para a perda de um ou de outro. Usando
1989). Assim, MyoD parece ser suficiente muito semelhantes e parecem ser capazes uma técnica de alvejar genes (veja Capí-
para ativar os genes específicos do múscu- de substituir extensamente uma a outra. Essa tulo 2), Rudnicki e colegas (1992) mostra-
lo que compõem o fenótipo muscular. família (algumas vezes chamada a “família ram que Myf5 e MyoD podem realizar as
MyoD codifica uma proteína nuclear MyoD” ou “proteínas miogênicas bHLH”) mesmas funções. Quando camundongos
ligante de DNA que pode se ligar a regi- inclui miogenina, Myf5 e MRF4; essas pro- carecem de ambos genes MyoD, a expres-
ões do DNA adjacentes aos genes especí- teínas parecem ligar-se a sítios semelhan- são do gene myf5 assume o controle. Os
ficos do músculo, e ativá-los. Por exemplo, tes no DNA (a ser discutido no Capítulo camundongos resultantes têm desenvol-
(A)
Myf5
ou
MyoD Miogenina MRF4
Célula no somito Mioblasto Miotubo Miofibra
Mesoderma Paraxial Tubo neural Dermátomo Miótomo
(B) Células do sangue Notocorda (C)

Figura 9.10
Comprometimento e diferenciação muscular mediada pela família MyoD de fatores de transcrição. (A) Papéis
postulados para proteínas miogênicas durante a formação do músculo esquelético no camundongo. (B)
Hibridização in situ indicando a ausência do mRNA myf5 no mesoderma paraxial não segmentado do
embrião. O lado esquerdo mostra fotografia sob o microscópio óptico da área. (C) Hibridização in situ
mostrando a presença do mRNA myf5 no miótomo do somito embrionário do camundongo. (A segundo
Rudnicki et al., 1993; fotografias cortesia de G. Lyons.)
vimento muscular normal. Quando os ca- tos na formação de suas células muscula- al., 1995). O segundo mecanismo envolve
mundongos carecem de seus genes myf5, res (Hasty et al., 1993; Nabeshima et al., a sub-regulação de seus receptores para
eles também têm desenvolvimento mus- 1993). Os somitos se formaram normal- o fator de crescimento. Um dos principais
cular normal. Porém, a ausência da proteí- mente e foram compartimentalizados em fatores de crescimento que promove a di-
na Myf5 atrasa em vários dias a formação miótomo, esclerótomo e dermátomo, mas visão das células mioblastos é o fator de
do miótomo, causando falha no desen- os mioblastos deixaram de se diferenciar crescimento fibroblástico básico. O FGF2
volvimento adequado da porção lateral do em miofibras (Venuti et al, 1995). promove divisão da célula mioblasto, ao
esclerótomo. Embora esses camundongos MyoD e seus parentes parecem ser crí- mesmo tempo que inibe a diferenciação
tenham músculos normais, suas caixas ticos para a remoção de mioblastos do cido mioblasto suprimindo a transcrição de
torácicas estão distorcidas e eles são in- clo celular. Conforme já mencionado, MyoD e myogenina (Vaidya et al., 1989;
capazes de respirar (Braun et al., 1992). mioblastos em divisão não se diferenciam. Brunetti e Goldfine, 1990). Os receptores
Experimentos recentes no laboratório de Essa distinção entre divisão e diferencia- FGF são perdidos quando o mioblasto se
Rudolf Jaenisch (Rudnicki et al., 1993) ção é característica de vários tipos celula- diferencia em uma célula muscular (Olwin
mostram que quando os genes myf5 e res derivados de populações de células e Hauschka, 1988; Moore et al., 1990).
MyoD estão ambos ausentes do embrião, germinativas (Bischoff e Holtzer, 1969; Como são ativadas as proteínas da fa-
não se formam músculos e costelas.* En- Holtzer et al., 1975). Parece haver duas mília MyoD? Novos experimentos forne-
quanto MyoD e Myf5 podem substituir maneiras pelas quais o mioblasto se retira ceram as bases para algumas fascinantes
uma a outra, não parece haver redundân- do ciclo celular. O primeiro mecanismo é especulações. George-Weinstein e seus
cia nas funções da miogenina. Camun- inibir o caminho da divisão celular. Para colegas (1996) demonstraram que quan-
dongos homozigotos para uma mutação isso, a proteína MyoD induz a expressão do epiblastos de galinha são isolados do
alvejada no gene myogenina morrem logo de p21, um inibidor de quinases depen- resto da gástrula e separados em células
após o nascimento por causa dos defei- dentes de ciclina (Figura 9.11; Halevy et individuais, essas células epiblastos se
tornam músculo. Além disso, os pesqui-
*Isso significa que existe alguma redundância no desenvolvimento dos músculos esqueléticos. sadores acharam que o mRNA de MyoD
Tal redundância já é do conhecimento dos embriologistas há longa data (Spemann, 1938), mas os
(e talvez a proteína) está presente nessas
geneticistas a estão redescobrindo (para sua consternação, já que confunde a interpretação de tais
experimentos). Gould (1990) considera a redundância desenvolvimental essencial para evolução células. Parece que células epiblastos têm
ocorrer, já que um dos sócios redundantes fica livre para conseguir uma nova função enquanto o a capacidade “preferencial” de ficarem
outro sócio mantém a função original. comprometidas com os mioblastos, e que
(A) Figura 9.11 ce, mas em seguida se torna especifica-

Proliferação Diferenciação Comutação entre proliferação e diferenciação. mente ausente no miótomo (Spicer et al.,
(A) Condições favorecendo proliferação (como 1996). É possível que MyoD e outras pro-
quando há abundância de fatores de crescimen-
teínas bHLH miogênicas já estejam pre-
Ciclina D1 MyoD to de fibroblastos no meio) favorecem a conti-
nuada expressão da quinase 4 dependente de sentes nas células epioblastos mas que
Cdk4 ciclina. Essa quinase é capaz de reprimir a estejam proibidas de funcionar até que a
expressão de MyoD. (B) Reciprocamente, uma proteína twist fique sub-regulada. Essa
p21 vez formada, o MyoD pode suprimir cdk4 sub-regulação pode possivelmente vir
Ativação através das ativação da proteína p21. Dessa como um resultado da secreção da proteí-
Inibição
maneira, as células em divisão não se diferen- na Wnt (pela epiderme ou tubo neural), que
ciarão e as células diferenciadas não se dividi-
poderia anular um efeito inibitório media-
rão. (Segundo Halevy et al., 1995.)
do por Notch1.
(B)
é somente suas interações com outros Além das proteínas bHLH, outro fator
Proliferação Diferenciação tipos de células que as previnem de se de transcrição, MEF2A, parece ser de im-
tornarem músculos. Nesse caso, os fato- portância para o desenvolvimento muscu-
res que promovem a miogênese (como as lar esquelético. MEF2A também induz fibro-
Ciclina D1 MyoD
proteínas Wnt) podem fazê-lo através da blastos a se tornarem músculos, e parece
Cdk4 repressão dos inibidores. Um desses ini- cooperar com MyoD nos intensificadores
bidores pode ser a proteína Twist. Essa de genes específicos do músculo. Kaushal
p21 proteína é um ligante de DNA muito pare- e colegas (1994) especulam que MEF2A for-
cido com MyoD. Porém, ela parece inibir nece especificidade adicional para a adesão
MyoD e outras proteínas ligadas aos pro- do MyoD de tal forma que MyoD não ative
motores de seus genes-alvo específicos inadvertidamente genes não musculares
do músculo. O gene twist está original- que possuam seqüências de regulação ca-
mente presente em todo o somito preco- pazes de ligar proteínas bHLH.
Osteogênese: O Desenvolvimento dos Ossos
Algumas das estruturas mais óbvias que derivam do mesoderma somítico são os
ossos. Neste capítulo descreveremos em linhas gerais os mecanismos da formação
dos ossos, e estudantes que gostariam de obter maiores detalhes podem fazê-lo ao
consultar livros de histologia os quais dedicam capítulos inteiros a esse tema. Existem
três linhagens que geram o esqueleto. O esclerótomo gera o esqueleto axial, o mesoderma
da placa lateral gera o esqueleto dos membros, e a crista neural craniana dá origem ao
arco branquial e os ossos craniofaciais e a cartilagem.* Existem dois modos principais
de formação dos ossos, ou osteogênese, e ambos envolvem a transformação de um
tecido mesenquimatoso préexistente no tecido ósseo. A conversão direta do tecido
mesenquimatoso em osso é chamada de ossificação intramembranosa. Isso ocorre
primeiramente nos ossos do crânio. Em outros casos, as células mesenquimatosas se
diferenciam em cartilagem, e essa cartilagem posteriormente é reposta pelo osso. Esse
processo pelo qual uma cartilagem intermediária é resposta por células ósseas é cha-
mada de ossificação endocondral.
OSSIFICAÇÃO INTRAMEMBRANOSA. Ossificação intramembranosa é o meio ca-

racterístico pelo qual são formados os ossos chatos do crânio. Células mesenquima-
tosas derivadas da crista neural interagem com a matriz extracelular das células epiteliais
da cabeça para formar o osso. Se as células mesenquimatosas não contatam essa
matriz, não será formado osso algum (Tyler e Hall, 1977; Hall, 1988). Isso foi demons-
trado in vitro por Hall e colegas (1983), que isolaram células mesenquimatosas da
* O desenvolvimento da cartilagem craniofacial foi discutido no Capítulo 7 e será revisado no

Capítulo 23; o desenvolvimento dos membros será detalhado no Capítulo 18.
Figura 9.12 Espículas do

Diagrama esquemático da ossificação mem- Matriz Osso Célula óssea osso parietal
branosa. (A) Células mesenquimatosas, pro- Osteoblastos osteóide calcificado (osteócito)
vavelmente derivadas da crista neural, se con-
densam para produzir osteoblastos, que de- Espículas do
osso frontal
positam matriz osteóide. Esses osteoblastos
ficam enfileirados ao longo da região
calcificada da matriz. Osteoblastos aprisiona-
dos dentro da matriz óssea tornam-se
osteócitos. (B) Espalhamento de espículas
ósseas do local da ossificação primária nos
ossos chatos do crânio de um embrião huma-
no de três meses. Os ossos mostrados em
negro são formados por ossificação endocon-
dral. (Segundo Langman, 1981.) (A) Mesênquima frouxo Osteoblastos (B)
cabeça e as colocaram em placas de cultura. Se nenhuma matriz extracelular estiver

presente na superfície dessas placas, as células permanecem mesenquimatosas. No
entanto, se células epiteliais da cabeça tivessem secretado primeiro uma matriz extra-
celular na superfície, as células se diferenciariam em células ósseas.
Os mecanismos responsáveis pela conversão de células mesenquimatosas em
células ósseas ainda é desconhecido, mas evidências recentes apontam para um gru-
po de moléculas em particular na junção epitélio-mesênquima. Proteínas
morfogenéticas do osso podem ser isoladas do osso adulto e injetadas em músculo
embrionário ou tecidos conjuntivos. Quando isso é realizado, a cartilagem se desen-
volve das células dentro desses tecidos e é posteriormente substituída pelas células
ósseas (Syftestad and Caplan, 1984; Urist et al., 1984; veja Capítulo 17).
Durante a osssificação intramembranosa, as células mesenquimatosas se prolife-
ram e se condensam em nodos compactos. Algumas dessas células se desenvolvem
em capilares, outras mudam sua forma para se tornar osteoblastos, células capazes de
secretar a matriz óssea. A matriz colágeno-proteoglicana secretada é capaz de aglome-
rar sais de cálcio, levados para essa região através dos capilares. Desse modo, a matriz
se torna calcificada. Na maioria dos casos, os osteoblastos são separados da região
de calcificação por uma camada de matriz pré-óssea (osteóide) secretada por eles.
Ocasionalmente, esses osteoblastos ficam presos na matriz calcificada e se tornam
osteócitos - células ósseas. Com a continuidade da calcificação, as espículas ósseas
se irradiam para fora do centro, que é onde começou a ossificação (Figura 9.12).
Ademais, a região inteira de espículas calcificadas fica rodeada por células mesenqui-
matosas compactas que formam o periósteo. As células da parte interna do periósteo
também se tornam osteoblastos e depositam matriz óssea em paralelo com àquela das
espículas já existentes. Dessa maneira, muitas camadas de osso são formadas.
OSSIFICAÇÃO ENDOCONDRAL. Ossificação endocondral envolve a formação de

tecido cartilaginoso de células mesenquimatosas agregadas e a subseqüente reposi-
ção desse tecido por osso (Horton, 1990). O tecido cartilaginoso é um modelo para o
osso que o sucede. Os componentes esqueléticos da coluna vertebral, a pélvis, e as
extremidades são primeiramente formados de cartilagem e posteriormente mudados
para osso. Esse processo notável coordena a condrogênese (produção de cartilagem)
com a osteogênese (crescimento do osso); os elementos esqueléticos estão simulta-
neamente suportando uma carga, crescendo em largura e respondendo a estresses
locais. As células que formam tecidos cartilaginosos expressam Scleraxis, um fator de
transcrição ao qual é atribuída a ativação de genes específicos da cartilagem (veja
Figura 9.13; Página de rosto; Cserjesi et al., 1995). Dessa maneira, a Scleraxis é expres-
sa nos esclerótomos, no mesênquima facial que forma os precursores cartilaginosos
Figura 9.13
Localização da mensagem da scleraxis nos
locais de formação dos condrócitos. (A) Ex-
pressão de scleraxis em somitos de um em-
brião de camundongo de 12,5 dias. Essa seção
foi cortada tangencialmente, e o tubo neural
corre ao longo do eixo ântero-posterior. (B)
Seção através de um embrião de camundongo
de 11,5 dias onde transcrições de scleraxis são
vistas na cartilagem condensada do nariz e face
e nos precursores dos membros e costelas. (Se-
gundo Cserjesi et al., 1995; fotografias corte-
sia do Dr. E. Olson.)
(A) (B)
do osso e no mesênquima do membro. Essa proteína se mantém ativa até a cartilagem

começar a ser substituída por tecido ósseo. [mesend2.html]
A formação da cartilagem pode ser dividida em três fases: proliferação do
mesênquima, condensação do mesênquima pré-cartilaginoso e diferenciação do
condrócito. A condrogênese é iniciada quando as células mesenquimatosas dividi-
das da pré-cartilagem começam a expressar proteínas da matriz extracelular causan-
do-as a se condensarem em nódulos. A N-caderina parece ser importante na inicia-
ção dessas condensações, e N-CAM também aparenta ser essencial para mantê-las
nessa situação (Oberlender e Tuan, 1994; Hall e Miyake, 1995). Uma vez condensadas,
as células se tornam condrócitos e começam a secretar proteoglicanos e colágenos
específicos do condrócito.*
Em humanos, os “ossos longos” dos brotos dos membros embrionários se formam
de células mesenquimatosas que formam nódulos nessa região que irão se transfor-
mar em ossos. Essas células se tornam condrócitos, e secretam a matriz extracelular da
cartilagem. As células mesenquimatosas em sua volta se tornam o periósteo (Figura
* Mutações que afetam a formação de nódulos freqüentemente causam anomalias nos membros.
Nas galinhas, as mutações talpid são caracterizadas pela duplicação e fusão dos membros. Isso, por
sua vez, descobriu-se, ter sido causado por condensações pré-condrogênicas anormalmente grandes.
Esses grandes nódulos são causados pelo excesso de adesividade das células mesenquimatosas nessas
condensações, e foi diretamente ligado a uma super expressão de N-CAM (Ede 1983; Chuong et al.,
1993). Em humanos, o gene SOX9 é expresso por condensações pré-cartilaginosas, e isso codifica
uma proteína ligante de DNA. As mutações do gene SOX9 causa displasia camptomelica, uma
doença rara do desenvolvimento esquelético, causando uma série de deformidades nos ossos do
corpo. A maioria dos bebês afetados morrem de parada respiratória devido a má-formação das
cartilagens traqueobronquiais e das costelas. (Wright et al., 1995).
Cartilagem epifisária
Osteoblastos
Mesênquima Cartilagem Condrócitos (osso) Vasos Condrócitos
hipertróficos sangüíneos proliferando
Placa de
cresci-
mento
Medula
óssea
Osso
Placa de
cresci-
(A) (B) (C) (D) (E) (F) mento
Figura 9.14 (G)

Diagrama esquemático da ossificação endocon-
dral. (A,B) Células mesenquimatosas se con- Centro de
densam em nódulos cartilaginosos que formam (H)
ossificação
o modelo do osso. (C) Condrócitos no centro secundária
da haste sofrem hipertrofia e alteram sua matriz
extracelular, permitindo a entrada de vasos
sangüíneos. (D,E) Vasos sangüíneos trazem
osteoblastos que se ligam à matriz cartilaginosa
em degeneração e deposita matriz óssea. (F-H) 9.14). Logo após o “modelo” cartilaginoso ser formado, as células na parte central do
Formação das placas de crescimento epipifisário
modelo se tornam dramaticamente maiores e começam a secretar um tipo diferente de
pelos condrócitos, que se proliferam antes de
hipertrofiar. Centros secundários de ossificação
matriz, que contém tipos diferentes de colágeno, mais fibronectina e menos inibidor de
também se formam quando vasos sangüíneos protease. Essas células são os condrócitos hipertróficos. A sua matriz é mais suscep-
penetram perto das extremidades do osso. (Se- tível à invasão pelas células de vasos sangüíneos do periósteo. Um capilar do periósteo
gundo Horton, 1990.) invade, em seguida, o centro da haste da cartilagem previamente avascular. Com a
degradação da matriz da cartilagem, as células da cartilagem hipertrófica morrem, e
osteoblastos (células formadoras de ossos), transportados pelos vasos sangüíneos,
começam a secretar matriz óssea sobre a cartilagem parcialmente degradada (Hattori et
al.,1995). Finalmente toda a cartilagem é substituída por osso.
Como o centro do modelo da cartilagem é convertido em osso, é formada uma
frente de ossificação entre o osso recém-sintetizado e o restante da cartilagem. O lado
da cartilagem dessa frente contém a cartilagem hipertrófica que prepara a haste para a
invasão pelos vasos sangüíneos, e o lado do osso contém as células osteoblásticas
depositando a matriz óssea. Essa frente se espalha de dentro para fora em ambas as
direções a partir do centro, enquanto mais cartilagem se transforma em osso. Se isso
fosse tudo, no entanto, não existiria crescimento, e nossos ossos seriam somente do
tamanho do modelo cartilaginoso original. Porém, com a frente de ossificação se apro-
ximando dos finais do modelo cartilaginoso, os condrócitos próximos à frente de
ossificação se proliferam antes de sofrer hipertrofia. Isso estica a parte final cartilaginosa
do osso, fornecendo uma fonte para nova cartilagem. Essas regiões cartilaginosas no
final dos ossos longos são chamadas placas de crescimento epifisário. Essas placas
contêm três regiões: uma região de proliferação de condrócitos, uma região de
condrócitos maduros, e uma região de condrócitos hipertrofiados (Figura 9.15; Chen
et al.,1995). Como essa cartilagem se hipertrofia e a frente de ossificação se estende
mais adiante, a cartilagem remanescente na placa epifisária se prolifera. Essa cartila-
gem forma a área de crescimento do osso. Dessa maneira, o osso se mantém em
crescimento pela produção de novas células cartilaginosas que sofrem hipertrofia,
permitindo aos vasos sangüíneos entrarem, e morrem à medida que a matriz óssea é
(B) (C)
Cartilagem
de reserva
Células
cartilaginosas
em proliferação
Zona de
(A)
condrócitos
maduros
Hipertrofia e
calcificação das
células
cartilaginosas
Zona de
degeneração
e ossificação de
cartilagem
Osso calcificado
Figura 9.15
Proliferação de células na placa epifisária em
resposta ao hormônio de crescimento. (A) Re-
depositada. Enquanto as placas de crescimento epifisário forem capazes de produzir gião cartilaginosa em um rato jovem tornado
condrócitos o osso continua a crescer. deficiente em hormônio de crescimento pela
As placas de células de crescimento epifisário são muito sensíveis a hormônios, e remoção de sua hipófise. (B) A mesma região
sua proliferação é estimulada pelo hormônio de crescimento e fatores de crescimento no rato após injeção de hormônio de cresci-
semelhantes à insulina. Nilsson e colegas (1986) mostraram recentemente que mento. (C) Cartilagem corada em regiões parti-
hormônios de crescimento estimulam a produção do fator I de crescimento semelhan- culares da placa de crescimento. (Fotografias
te à insulina (IGF-I) nesses condrócitos e que esses condrócitos respondem a isso de I. Gersh, de Bloom e Fawcett, 1975: C de
Chen et al., 1995; cortesia de P. Goetinck.)
proliferando-se. Quando eles adicionaram hormônio de crescimento à placa de cresci-
mento da tíbia de um camundongo jovem (que não conseguia fabricar o seu próprio
hormônio de crescimento porque suas hipófises haviam sido removidas), os hormônios
de crescimento estimularam a formação de IGF-I dos condrócitos na zona proliferativa
(veja Figura 9.15). A combinação de hormônios de crescimento e IGF-I parece fornecer
um sinal mitótico extremamente forte. Os pigmeus da floresta Ituri, no Zaire, têm níveis
normais de hormônios de crescimento e IGF-I até a puberdade. No entanto, na puber-
dade, os níveis de IGF-I nos pigmeus caem para aproximadamente um terço em compa-
ração com os de outros adolescentes. Parece que IGF-I é essencial para uma arrancada
normal no crescimento durante a puberdade (Merimee et al., 1987). Hormônios também
são responsáveis pela interrupção no crescimento. No final da puberdade, níveis eleva-
dos de estrógeno e testosterona fazem com que a cartilagem remanescente da placa
epifisária sofra hipertrofia. Essas células cartilaginosas crescem, morrem e são substitu-
ídas por ossos. Sem alguma cartilagem adicional, o crescimento desses ossos cessa.
A reposição de condrócitos por osteoblastos parece depender da mineralização
da matriz extracelular. Em embriões de galinha, a fonte de cálcio é o carbonato de
cálcio da casca do ovo, e durante o seu desenvolvimento, o sistema circulatório da
galinha transloca aproximadamente 120 mg de cálcio da casca do ovo para o esque-
leto (Tuan, 1987). Quando embriões de galinha são removidos de suas cascas no
terceiro dia e crescem em cultura sem a casca (em envelopes plásticos) durante o
restante do seu desenvolvimento, muito do esqueleto cartilaginoso deficiente em
cálcio não se desenvolve em tecido ósseo (Figura 9.16; Tuan e Lynch, 1983). Nos
mamíferos, o cálcio é transferido através da placenta e depositado na matriz pelos
Figura 9.16
Mineralização esquelética em um embrião de
pinto de 17 dias que se desenvolve (A) em
uma cultura sem casca e (B) dentro da casca
durante a incubação normal. Os embriões fo-
ram fixados e corados com vermelho de
Alizarina par mostrar a matriz calcificada. (de
Tuan e Lynch, 1983, cortesia de R. Tuan.)
(A) (B)
condrócitos. Já foi demonstrado que condrócitos hipertróficos mudam a respiração

de aeróbica para anaeróbica (Brighton e Hunt, 1974; Brighton, 1984), causando uma
diminuição no ATP celular e no emprego de uma via para energia mediada pela
fosfocreatina, tal como a usada em músculos esgotados de oxigênio (Shapiro et al.,
1992). Por algum mecanismo ainda desconhecido, imagina-se que essas mudanças
metabólicas resultem em depósito de cálcio na matriz extracelular, dentro de peque-
nas estruturas limitadas por membranas, conhecidas como vesículas da matriz
(Wuthier, 1982). Isso inicia o processo da calcificação e permite os osteoblastos
aderir e iniciar a formação do osso (Figura 9.17).
À medida que novo material ósseo é adicionado perifericamente da superfície
interna do periósteo, ocorre uma cavitação na região interna para formação da cavida-
de da medula óssea. Essa destruição de tecido ósseo é devida aos osteoclastos,
células multinucleadas que adentram o osso através dos vasos sangüíneos (Kahn e
Simmons, 1975; Manolagas e Jilka, 1995). Osteoclastos são provavelmente derivados
dos mesmos precursores que as células sangüíneas, e são responsáveis pela dissolu-
ção de ambas porções da matriz do osso, a inorgânica e a proteína (Ash et al., 1980;
Blair et al., 1986). Os osteoclastos estendem numerosos processos celulares na matriz,
bombeando íons de hidrogênio oriundos do osteoclasto para o material em seu redor,
acidificando-o e solubilizando-o (Figura 9.18; Baron et al., 1985, 1986). Os vasos
sangüíneos também importam as células formadoras de sangue, que irão residir na
medula pelo resto da vida do organismo.
Cálcio na matriz
Condrócitos extracelular
Figura 9.17
Deposição de cálcio pelos condrócitos na região distal da zona hipertrófica. Cálcio (corado em
escuro nesta montagem de micrografia eletrônica) é colocado na matriz pelas células em cresci-
mento. (de Brighton e Hunt, 1974; cortesia de C. T. Brighton.)
Porcentagem do osso solubilizado

45
Ca
[3H] Prolina
(A) (B) (C) Tempo (horas)
Figura 9.18
Atividade osteoclástica na matriz óssea. (A) Micrografia eletrônica da membrana franzida de um
osteoclasto de pinto cultivado em uma matriz óssea reconstituída. (B) Seção da membrana
franzida corada para detectar presença de uma ATPase capaz de transportar íons de hidrogênio da
célula. A ATPase está restrita à membrana do processo celular. (C) Solubilização de componentes
inorgânicos e colagenosos da matriz (conforme medido pela liberação de [45Ca] e prolina [3H],
respectivamente) pelos 10.000 osteoclastos incubados sobre fragmentos ósseos marcados. (A e
C de Blair et al., 1986; B de Baron et al., 1986, cortesia dos autores.)
& Especulações
Controle da Condrogênese na Placa de Crescimento

D
mutação dominante causada por muta- A matriz extracelular da cartilagem
ESCOBERTAS RECENTES de mu- ções na região transmembrana do recep- também é crítica para a diferenciação e
tações do desenvolvimento es- tor 3 do fator de crescimento fibroblásti- organização apropriadas de condrócitos
quelético de seres humanos e murinos for- co (FGFR3). Aproximadamente 95% dos da placa de crescimento. Mutações que
neceram notáveis visões sobre como a di- anões acondroplásicos têm a mesma mu- afetam o colágeno do tipo IV ou a
ferenciação, proliferação e padronização de tação de FGFR3, uma substituição do par sulfatação de proteoglicanos da cartila-
condrócitos são reguladas. de bases que converte glicina em arginina gem podem causar severas anomalias
na posição 380 na região transmembrana esqueléticas. Camundongos com defici-
Receptores do Fator de Crescimento da proteína. Além disso, mutações na por- ência de colágeno de tipo XI morrem ao
Fibroblástico ção extracelular da proteína FGFR3 ou no nascer com anormalidades nas cartila-
A proliferação das células epifisárias das domínio da tirosina quinase intracelular gens dos membros, mandíbula, costelas
células da placa de crescimento e da carti- resultaram na displasia tanatofórica, uma e traquéia (Li et al., 1995). Falência em
lagem facial pode ser interrompida pela forma letal de nanismo que se parece com adicionar grupos sulfato a glicoproteo-
presença de fatores de crescimento fibro- a acondroplasia homozigota (Figura 9.19; glicanos da cartilagem causa displasia
blástico (Deng et al., 1996; Webster e Bellus et al., 1995; Tavormina et al., 1995). distrófica, um nanismo humano caracte-
Donoghue, 1996). Esses fatores parecem Mutações em FGFR1 podem causar a sín- rizado por uma severa curvatura da espi-
instruir os precursores da cartilagem de drome de Pfeiffer, caracterizada por de- nha, pé torto e lóbulos da orelha defor-
se diferenciarem em vez de se dividirem. feitos nos membros e fusão prematura mados (Hästbacka et al., 1994).[cell6.html]
Em humanos, mutações nos receptores das suturas cranianas (craniosinostose),
para fatores de crescimento de fibroblas- resultando em formas anormais do crâ- Receptores de Estrógeno
tos podem fazer com que esses recepto- nio e da face. Mutações diferentes em Hormônios também são conhecidos por ter
res se tornem prematuramente ativados. FGFR2 podem originar várias anomalias um efeito marcado sobre a epífise humana.
Isso dá origem aos principais tipos de nanos membros e/ou face (Park et al., 1995; O surto de crescimento puberal e amadu-
nismo humano. A acondroplasia é uma Wilkie et al., 1995). [cell7.html] recimento subseqüente da placa epifisária
(A) (B) (C)
Figura 9.19
Displasia óssea humana causada por mutações (i.e., a conversão de células em prolifera- ainda possuía proliferação de condrócitos
dominantes ativadoras do receptor 3 do fator ção para cartilagem madura e osso) são aos 28 anos de idade. Sua “idade óssea” - a
de crescimento fibroblástico. (A) Displasia induzidas por hormônios sexuais (Kaplan quantidade de cartilagem epifisária que ha-
tanatofórica, uma condição fatal caracterizada e Grumbach, 1990). Em condições de pu- via retido - era aproximadamente a metade
por severo encurtamento das costelas e mem- berdade precoce, existe uma arrancada no de sua idade cronológica. Descobriu-se que
bros devido à cobertura das epífises por tecido crescimento inicial (tornando o indivíduo nessa pessoa não estava presente qualquer
ósseo. A morte é devido a problemas respira- mais alto do que o seu par), seguido pela receptor de estrógeno funcional. Portanto,
tórios. (B) Fotografia por raios-X de um infan- interrupção da divisão celular epifisária o estrógeno cumpre um papel na maturação
te nascido com displasia tanatofórica. (C) Se- (permitindo que seu par alcance e ultra- epifisária no sexo masculino tanto quanto
ção microscópica mostrando a desorganização passe o seu peso). Não se pensava que, no feminino. Hormônios da tireóide e
de uma epífise na displasia tanatofórica. Notar
no sexo masculino, o estrógeno tivesse al- hormônios relacionados à paratireóide tam-
a ausência de condrócitos em divisão. (de
guma participação nesses eventos. No en- bém são importantes na regulação da matu-
Gilbert-Barness e Opitz, 1996.)
tanto, em 1994 Smith e colegas relataram o ração e no programa de hipertrofia da placa
caso verídico de um homem cujo cresci- de crescimento epifisário (Ballock e Reddi,
mento ainda era linear apesar de ter passa- 1994). Dessa forma, crianças com hipotireoi-
do por uma puberdade normal. Suas pla- dismo são susceptíveis a desenvolver do-
cas epifisárias não haviam maturado, e ele enças da placa de crescimento.[limb3.html]
Mesoderma da Placa Lateral

Nem todos os mantos mesodérmicos são organizados em somitos. Adjacente ao
mesoderma somítico está a região mesodérmica intermediária. Essa corda de célu-
las mesodérmicas se desenvolve no túbulo pronéfrico, que é precursor do rim e dos
dutos genitais. O desenvolvimento desses sistemas de órgãos será discutido em
detalhe nos Capítulos 17 e 19, respectivamente. Mais adiante lateralmente em cada
lado chegamos à placa mesodérmica lateral. Essas placas se dividiem horizontal-
mente em mesoderma (parietal) somático dorsal, abaixo do ectoderma e o mesoderma
(visceral) esplâncnico ventral, que se superpõe ao endoderma (veja Figura 9.2C).
Entre essas camadas está a cavidade corporal - o celoma - que se estende da futura
região do pescoço até a parte posterior do corpo. Mais tarde no desenvolvimento,
os celomas do lado direito e esquerdo se fundem e se dobram alongando-se do
(A) EMBRIÃO DE RÃ
Placa neural Crista neural
Tubo neural
Somito
Notocorda Celoma
Mesoderma
somático
Endoderma
Mesoderma
Esplâncnico
Intestino Mesoderma
médio da placa
lateral
(B) EMBRIÃO DO PINTO

Cortes para remoção do embrião
Figura 9.20
Comparação entre o desenvolvimento meso-
dérmico em embriões de rã e pinto. (A) Em-
Intestino primitivo briões de rã em estágio de nêurula mostrando
Vitelo Rasgo Rasgo desenvolvimento progressivo do mesoderma
e celoma. (B) Seção transversa de um em-
brião de pinto. (C) Quando o embrião de pin-
( C ) PINTO “TRANSFORMADO” EM RÃ
to é separado da sua enorme massa de vitelo,
Tubo neural
parece uma nêurula anfíbia em estágio seme-
Somito lhante. (A segundo Rugh, 1951; B e C segun-
Celoma do Patten, 1951.)
Intestino
primitivo
Vitelo
EMBRIÂO DE PINTO EMBRIÃO DE RÃ

(removido do vitelo;
margens rejuntadas)
mesoderma somático, dividem o celoma em cavidades separadas. Nos mamíferos, o

celoma é subdividido em espaços pleural, pericardíaco e peritoneal, envolvendo o
tórax, coração e abdome, respectivamente. O mecanismo para a criação de somitos
mesodérmicos e revestimento corporais mudou pouco através da evolução dos
vertebrados, e o desenvolvimento do mesoderma da galinha pode ser comparado
com estágios similares nos embriões da rã (Figura 9.20).
Formação das Membranas Extra-Embrionárias
O desenvolvimento embrionário nos répteis, aves e mamíferos tomou uma nova dire-
ção. Os répteis desenvolveram um mecanismo para depositar ovos na terra seca,
dessa forma liberando-os para explorar nichos que não estavam tão perto das águas.
Para conseguir isso, o embrião produziu quatro conjuntos de membranas extra-em-
brionárias para mediá-lo com o ambiente, e mesmo que a maior parte dos mamíferos
tenha desenvolvido placentas ao invés de cascas, o padrão básico das membranas
extra-embrionárias permaneceu o mesmo. Em répteis, aves e mamíferos em desenvolvi-
mento, inicialmente não existe distinção entre domínios embrionários e extra-embrio-
nários. No entanto, como o corpo do embrião toma forma, o epitélio lateral se divide
desigualmente para criar dobras corporais, isolando o embrião do vitelo e delineando
quais áreas deverão ser embrionárias e quais extra-embrionárias (Miller et al., 1994).
(A) (B)
Dobra da
Cabeça do embrião Celoma Celoma
Dobra da cabeça do âmnio cabeça do âmnio Embrião
extra-embrionário extra-embrionário
Ectoderma Ectoderma Dobra caudal
do âmnio
Mesoderma somático Mesoderma somático
Mesoderma esplâncnico Mesoderma esplâncnico
Endoderma Endoderma
Envoltório vitelínico Envoltório vitelínico
Vitelo Vitelo
(C)
Cório Cavidade amniótica
Ectoderma
Âmnio
Tubo neural Cavidade cório-amniótica
Notocorda
Aorta
Intestino médio
Mesênquima Intestino posterior
Endoderma
Mesoderma
Esplâncnopleura
do saco vitelínico Proctódeo
Alantóide adentrando o
Invaginação Alantóica celoma extra-embrionário
(D) (E)
Embrião Membrana
alantóica Embrião
Âmnio Intestino
Alantóide
Intestino Âmnio
Cavidade Cavidade
amniótica amniótica
Cório
Cório
Vitelo Vitelo
Saco vitelínico
Membrana
Figura 9.21 alantóica
Desenho esquemático das membranas extra-
embrionárias do pinto. O embrião está corta-
do longitudinalmente e os revestimentos de
albumina e da casca não são mostrados. (A)
embrião de 2 dias. (B) Embrião de 3 dias. (C)
Diagrama esquemático detalhado da região As dobras membranosas são formadas pela extensão do epitélio ectodérmico e
caudal (posterior) do embrião do pinto, mos- endodérmico escorado pelo mesoderma. A combinação de ectoderma e mesoderma,
trando a formação da alantóide. (D) Embrião freqüentemente referida como somatopleura, forma as membranas do âmnio e cório e
de 5 dias. (E) Um embrião de 9 dias. (Segun- a combinação de endoderma e mesoderma - a esplancnopleura - forma o saco vitelínico
do Carlson, 1981.) e a alantóide. Os tecidos endodérmicos e ectodérmicos agem como células epiteliais
funcionais; e o mesoderma gera o suprimento de sangue essencial para lá e para cá do
epitélio. A formação dessas dobras pode ser observada na Figura 9.21.
O primeiro problema de um ovo vivendo na terra é a dessecação. Células embri-

onárias secariam rapidamente se não estivessem em um ambiente aquoso. Esse
ambiente é suprido pelo âmnio. As células dessa membrana secretam fluido amniótico;
assim, a embriogênese ainda acontece na água. Esse avanço evolucionário é tão
significativo e característico que répteis, aves e mamíferos estão agrupados como
vertebrados amnióticos.
O segundo problema desses ovos é a troca de gases. Essa troca é realizada pelo
cório, a membrana extra-embrionária mais externa. Nas aves e répteis, essa membrana
se adere à casca, permitindo a troca de gases entre o ovo e o ambiente. Nos mamíferos,
como havíamos dito, o cório evoluiu tornando-se placenta, que tem muitas funções
além da respiração.
A alantóide armazena resíduos urinários e media a troca de gases. Nos répteis e
aves, a alantóide se torna um grande saco, já que não existe outro modo para manter os
subprodutos do metabolismo do embrião em desenvolvimento. A camada mesodérmica
da membrana da alantóide freqüentemente alcança e se funde com a camada
mesodérmica do cório para criar a membrana corioalantóica. Esse envelope extrema-
mente vascularizado é crucial para o desenvolvimento da ave, e é o responsável pelo
transporte de cálcio da casca do ovo para o embrião para produção de ossos (Tuan,
1987). Nos mamíferos, o tamanho da alantóide depende do sucesso da remoção dos
resíduos de nitrogênio pela placenta coriônica. Em humanos a alantóide é um saco
vestigial; enquanto nos porcos é um órgão grande e importante.
O saco vitelínico é a primeira membrana extra-embrionária a ser formada, visto que
ele medeia a nutrição em aves e répteis em desenvolvimento. Ele é derivado de células
endodérmicas que crescem sobre o vitelo para englobá-lo. O saco vitelínico é conectado
ao intestino médio por um tubo aberto, o duto vitelínico, para que as paredes do saco
vitelínico e do intestino sejam contínuas. Os vasos sangüíneos dentro do mesoderma
da esplancnopleura transportam nutrientes do vitelo para o corpo, pois o vitelo não é
levado diretamente para o corpo através do duto vitelínico. Ao contrário, células
endodérmicais digerem a proteína em aminoácidos solúveis, que podem então ser
passados aos vasos sangüíneos envolvendo o saco vitelínico. Outros nutrientes,
incluindo vitaminas, íons e ácidos graxos são armazenados no saco vitelínico e trans-
portados pela circulação embrionária. Por esses caminhos, as quatro membranas ex-
tra-embrionárias permitem que o embrião se desenvolva em terra.
O Coração
O sistema circulatório é uma das grandes conquistas do mesoderma da placa lateral.

Consistindo de um coração, células sangüíneas e um intricado sistema de vasos san-
güíneos, o sistema circulatório fornece a nutrição para o embrião vertebrado em de-
senvolvimento. O sistema circulatório é a primeira unidade funcional no embrião em
desenvolvimento, e o coração é o primeiro órgão funcional. O coração vertebrado
surge de duas regiões do mesoderma esplâncnico que interagiu com tecido adjacente
para se tornar específico para o desenvolvimento do coração. Essas células
cardiogênicas migram para uma posição mediana ventral e se fundem para se tornar
um tubo simples de células musculares que se contraem. Esse coração tubular se
contorce formando uma estrutura em forma de S, com um único átrio e um único
ventrículo. Com a continuação do desenvolvimento, o ventrículo forma suas camadas
e se prolifera mais rapidamente que o átrio, os septos separam as câmaras do coração
e as válvulas se desenvolvem.
FUSÃO DOS RUDIMENTOS DO CORAÇÃO. Nos anfíbios, as duas prováveis

regiões formadoras do coração são inicialmente encontradas na posição mais an-
terior da manta mesodérmica. Enquanto o embrião está sofrendo neurulação, es-
sas duas regiões se juntam na região ventral do embrião para formar uma cavidade
pericardial comum. Nas aves e mamíferos, o coração também se desenvolve pela
Células se
tornam
Anterior (rostral) notocorda
µm distante do nódulo de Hensen
Células se
tornam
Nódulo de Hensen coração
Tronco
arterioso
Ventrículo
Bulbus cordis
Seio venoso
(A) Posterior (caudal) (B)
+ = promotor de determinantes cardíacos

- = repressor de determinantes cardíacos
Figura 9.22
Ectoderma Células formadoras do coração no embrião do pinto. (A) Origem de células cardíacas no embrião
precoce do pinto (estágio 3b). O padrão ântero-posterior geral do sulco primitivo é visto no
endocárdio e miocárdio do coração. (B) Modelo para a especificacão do mesoderma cardíaco.
Os caminhos da migração mesodérmica nas várias regiões do sulco primitivo estão representados
por setas. Sinais que induzem miogênese cardíaca estão representados por + , e inibidores da
Mesoderma
indução cardíaca estão representados como - . O mesoderma migratório na região 1 não encontra
indutores ou repressores. Células migrando da região 3 encontram ambos. Somente células
migrando da região 2 encontram o indutor sem o inibidor. (C) Micrografia eletrônica de varredura
do mesoderma formador do coração no embrião de pinto de 24 horas. O mesoderma é facilmente
separado do ectoderma, mas permanece em íntima associação com o endoderma. (A segundo
Garcia-Martinez e Schoenwolf, 1993; B segundo Schultheiss et al., 1995; C de Linask e Lash,
1986, cortesia de K. Linask.)
Endoderma
(C)
fusão de primórdios pareados, mas a fusão desses dois rudimentos ocorre muito
mais tardiamente no desenvolvimento. Nesses vertebrados amnióticos, o embrião
é um disco achatado, e o mesoderma da placa lateral não circunda completamente
o saco vitelínico. As prováveis células do coração se originam no sulco primitivo
precoce, um pouco posterior ao nódulo de Hensen e se estendem até cerca da
metade do seu comprimento (Figura 9.22A). Essas células migram através do sulco
e formam dois grupos de células mesodérmicas laterais ao (e no mesmo nível do)
nódulo de Hensen (Figura 9.22B; Garcia-Martinez e Schoenwolf, 1993). Quando o
embrião do pinto tiver somente 18 a 20 horas de idade, essas prováveis células do
coração se movem anteriormente entre o ectoderma e o endoderma em direção ao
meio do embrião, permanecendo em estreito contato com a superfície endodérmica
(Figura 9.22C; Linask e Lash, 1986). Quando as células alcançam a área onde o
intestino se estendeu até a região anterior do embrião, a migração cessa. O
direcionamento para essa migração parece ser fornecido pelo endoderma. Se o
endoderma da região cardíaca é girado com respeito ao resto do embrião, a migra-
ção das células mesodérmicas pré-cardíacas é invertida. Pensa-se que o compo-
nente endodérmico responsável por esse movimento é um gradiente ântero-pos-
terior de concentração da fibronectina. Anticorpos contra a fibronectina interrom-
pem a migração, enquanto anticorpos contra outros componentes da matriz extra-
celular não o fazem (Linask e Lash, 1988a,b).
O endoderma também faz com que as células pré-cardíacas comecem seu desen-
volvimento como músculos do coração. O endoderma anterior pode fazer com que as
células mesodérmicas não cardíacas expressem proteínas específicas do coração tan-
to em aves como em anfíbios (Jacobson, 1961; Sugi e Lough, 1994; Nascone e Mercola,
1995; Schultheiss et al., 1995). Essa diferenciação ocorre independentemente nos dois
primórdios formadores do coração, um migrando ao encontro do outro. As presuntivas
células do coração de aves e mamíferos formam um tubo de parede dupla consistindo
de um endocárdio interior e um epimiocárdio exterior. O endocárdio formará o revesti-
mento interno do coração, e o revestimento externo formará a camada dos músculos
do coração que irão bombear por toda a vida do organismo.
Com a continuação da neurulação, o intestino anterior é fechado pelo dobramento
interno do mesoderma esplâncnico (Figura 9.23). Esse movimento junta os dois tubos,
finalmente unindo o epimiocárdio em um tubo único. Os dois endocárdios ficam em
uma câmara comum por um curto período, mas também irão se fundir. Nessa altura, a
dupla câmara celômica original se une para formar a cavidade do corpo que aloja o
coração. A origem bilateral do coração pode ser demonstrada através de intervenção
cirúrgica, prevenindo a fusão do mesoderma da placa lateral (Gräper, 1907; DeHaan,
1959). Isso resulta em uma condição chamada cárdia bífida, na qual um coração em
separado se forma em cada lado do corpo (Figura 9.24). A próxima etapa na formação
do coração é a fusão dos tubos endocárdicos para formação de uma única câmara de
bombeamento (veja Figura 9.23C,D). Essa fusão ocorre aproximadamente às 29 horas
do desenvolvimento das aves e na terceira semana da gestação humana. As partes
posteriores não fundidas do endocárdio se tornam as aberturas das veias vitelínicas
para o coração (Figura 9.25). Essas veias vão carregar nutrientes do saco vitelínico
para o seio venoso. O sangue então passa através de uma lâmina semelhante à válvula
de forma achatada, para a região atrial do coração. Contrações do tronco arterioso
aceleram o sangue para a aorta.
As pulsações do coração começam enquanto os primórdios pareados ainda estão
se fundindo. O marcapasso dessa contração é o seio venoso. Contrações começam
aqui e uma onda de contração muscular é então propagada até o coração tubular.
Desse modo, o coração pode bombear sangue mesmo antes do seu intricado sistema
de válvulas ter sido completado. As células musculares do coração têm na sua própria
herança a habilidade de contrair, e células do coração isoladas de um rato com 7 dias
ou de embriões de pintos, vão continuar a bater em placas de Petri (Harary e Farley,
1963; DeHaan, 1967). No embrião, essas contrações se tornam reguladas por estímu-
los elétricos procedentes da medula oblongata via nervo vago, e em 4 dias, o
eletrocardiograma de um embrião de pinto se aproxima daquele de um animal adulto.
FORMAÇÃO DAS CÂMARAS DO CORAÇÃO. Em um embrião de pinto de 3 dias ou

um embrião humano de 5 semanas, o coração é um tubo de duas câmaras, com um átrio
e um ventrículo. Em um embrião de pinto podemos observar a olho nu, o extraordinário
ciclo do sangue entrando na câmara de baixo e sendo bombeado para fora através da
aorta. A separação desse tubo em um átrio e um ventrículo distintos é completada
quando células do miocárdio produzem um fator (provavelmente o fator transforma-
dor de crescimento β3) que faz com que as células do endocárdio adjacente se des-
prendam e entrem na “gelatina cardíaca” rica em hialuronato situada entre as duas
camadas (Markwald et al., 1977; Potts et al., 1991). Nos seres humanos, essas células
causam a formação do colchão endocárdico que divide o tubo nos canais átrio-
ventriculares direito e esquerdo (Figura 9.26). Enquanto isso, o átrio primitivo é dividi-
do pelo crescimento de dois septos que crescem ventralmente em direção aos col-
chões endocárdicos. Os septos, no entanto, possuem orifícios para que o sangue
ainda possa atravessá-los. Esse atravessar do sangue é necessário para a sobrevivên-
cia do feto antes que a circulação para os pulmões funcionais seja estabelecida. Na
primeira respiração, no entanto, esses orifícios se fecham e os circuitos circulatórios
direito e esquerdo ficam estabelecidos (veja Informações Adicionais e Especulações
Figura 9.23 (A)

Formação do coração. Seções transversais atra- Ectoderma da placa neural Sulco Mesênquima cefálico
vés da região formadora do coração do pinto neural
de (A) 25 horas, (B) 26 horas, (C) 28 horas e Notocorda Ectoderma superficial
(D) 29 horas. (Segundo Carlson, 1981.)
Somatopleura
Cavidade
Intestino pericardial Esplâncnopleura
Epimiocárdio (mesoderma Endoderma

esplâncnico engrossado) Conjuntos celulares
angiogenéticos
(B)
Sulco neural (fechando) Mesênquima cefálico
Somatopleura
Cavidade
pericardial Esplancnopleura
Primórdio do Primórdio
epicárdio endocárdio
(C)
Canal neural Intestino anterior
Somatopleura
Cavidade Pericárdica
Esplancnopleura
Tubo endocárdico
Mesocárdio ventral
Epimiocárdio
(D)
Tubo neural Intestino anterior
Somatopleura
Cavidade Pericárdica
Esplancnopleura
Tubo endocárdico
Epimiocárdio Mesocárdio ventral

(desaparecendo)
na página 372). A separação entre esses ventrículos é completada pelo crescimento do

septo ventricular em direção ao colchão endocárdico. Com essa separação (que nor-
malmente ocorre na sétima semana do desenvolvimento humano), o coração é uma
estrutura com quatro câmaras com um tronco pulmonar conectado ao ventrículo direi-
to e a aorta conectada ao esquerdo.
Figura 9.24
Fusão dos rudimentos cardíacos esquerdos e
direitos para formar um tubo cardíaco único.
(A) Embrião de pinto (± 30 horas) mostrando
os primórdios do coração pareados, encon-
trando-se nas linhas medianas ventrais. (B)
Cárdia bífida no embrião do pinto causado pelo
impedimento da fusão de dois primórdios car-
díacos. (A cortesia de K. Linask; B cortesia de
R. L. DeHaan.)
(A) (B)
Uma questão que surge nesses estudos é, como a polaridade direita-esquerda

surge no coração se esses lados começam igualmente? Por que o lado esquerdo do
coração se torna diferente do lado direito? Estudos em fetos com corações mal
formados que possuem dois lados direitos ou dois lados esquerdos, mostram uma
correlação entre a presença do baço e o lado esquerdo do coração. Polisplenia (um
(A) (B) (C)
Raízes aórticas
Bulbus Bulbus
cordis cordis Sulco
bulboventricular Átrio
esquerdo
Ventrículo Ventrículo
Átrio Átrio
Seio Venoso
Veias Seio venoso
vitelínicas
21 dias 22 dias 24 dias
(D) (E) Figura 9.25

Tronco arterioso Formação da câmara cardíaca durante a tercei-
Raízes Átrio direito
ra semana do desenvolvimento humano, mos-
aórticas
Átrio esquerdo Átrio esquerdo trando a formação das câmaras a partir de um
Bulbus tubo simples. Vistas A-D mostram o coração
cordis Ventrículo em desenvolvimento do lado esquerdo; E é
Esquerdo uma visão frontal. Embora os átrios sejam dis-
Ventrículo tintos externamente, não estão separados den-
direito tro do coração. Note que há duas raízes aórticas
Ventrículo e que essas se ramificam para formar os arcos
esquerdo Veias vitelínicas Sulco interventricular aórticos (veja Figura 9.27). (Segundo
25 dias 29 dias Langman, 1981, e Larsen, 1993.)
Veia cava superior

Septo primário Septo atrial
secundário
Forame primário
Septo
Seio venoso atrial
Canal primário
átrio-ventricular
esquerdo Válvula da
veia cava
inferior
Válvula
Colchões do seio
endocárdicos coronário
fundidos
Veia cava inferior

Septo
interventricular
(A) 25 dias (B) 40 dias
Figura 9.26
Formação das câmaras do coração. (A) Corte
diagramático transversal do coração humano
de 4,5 semanas. Os septos do ártrio e do ven-
trículo estão crescendo em direção ao colchão
endocárdico. (B) Seção transversal do cora- baço tanto do lado esquerdo como direito do corpo) está associada a corações com
ção humano antes do nascimento. O sangue dois lados esquerdos, enquanto asplenia (ausência do baço) está associada a cora-
pode passar do lado direito do coração para o ções com dois lados direitos (Anderson et al., 1990; Ho et al., 1991). O mecanismo
esquerdo, através das aberturas nos septos para a assimetria esquerda-direita não é entendido, mas Tsuda e colegas (1996)
primários e secundários do átrio. (Segundo mostraram uma deposição assimétrica precoce da proteína flectina, da matriz extra
Larsen, 1993.) celular, a qual pode predispor um lado do coração a se desenvolver diferentemente
do outro (Prancha 33)*.
Formação dos Vasos Sangüíneos

Vasos
LIMITAÇÕES RELATIVAS À CONSTRUÇÃO DE VASOS SANGÜÍNEOS. Existem

três limitações principais para a construção de vasos sangüíneos. A primeira é
fisiológica. Diferentemente de novas máquinas, que não necessitam funcionar até
terem saído da linha de montagem, os organismos novos precisam funcionar mes-
mo enquanto se desenvolvem. As células embrionárias precisam obter nutrientes
antes que exista um intestino, fazer uso do oxigênio antes que existam pulmões, e
excretar resíduos antes que os rins estejam prontos. Portanto, a fisiologia ciculatória
do embrião em desenvolvimento difere daquela do organismo adulto, e o seu
sistema circulatório reflete tais diferenças. O alimento não é absorvido através do
intestino, mas pelo vitelo ou placenta, e a respiração não é conduzida pelas guel-
ras ou pulmões, mas através da membranas coriônicas ou alantóicas. Os princi-
pais vasos sangüíneos embrionários devem ser construídos para servir a essas
estruturas extra-embrionárias.
A segunda limitação é evolucionária. O embrião mamífero estenderá vasos san-
güíneos até o saco vitelínico mesmo não havendo vitelo no interior. Além disso, o
sangue que deixa o circuito do coração passa por cima do intestino anterior para
formar a aorta localizada dorsalmente. Os seis pares de arcos aórticos passam por cima
da faringe (Figura 9.27). Nos peixes primitivos, esses arcos persistem e permitem que
*Discutiremos polaridade direita-esquerda no Capítulo 16.

Figura 9.27 (A) 29 dias

Os arcos aórticos do embrião humano. (A) Originalmente, o tronco arterioso bombeia sangue
para a aorta, que se ramifica para ambos os lados do intestino anterior. Os seis arcos aórticos
tomam sangue da aorta ventral e o permitem fluir para a aorta dorsal. (B) Os arcos começam a
se desintegrar ou se modificar: as linhas pontilhadas indicam estruturas em degeneração. (C)
Finalmente, os arcos remanescentes são modificados e o sistema arterial adulto é formado.
(Segundo Langman, 1981.) Arcos
aórticos
as guelras oxigenem o sangue. Na ave ou mamífero adultos, onde os pulmões oxige-

nam o sangue, tal sistema faz pouco sentido, mas todos os seis pares de arcos aórticos Tronco arterioso
são formados nos embriões mamíferos e das aves antes que o sistema finalmente seja
Aorta dorsal direita
simplificado em um único arco. Dessa maneira, mesmo que nossa fisiologia não re-
queira tal estrutura, nossa condição embrionária reflita nossa história evolutiva. Aorta dorsal esquerda
O terceiro conjunto de limitações é físico. De acordo com a lei dos movimentos
dos fluidos, o transporte mais efetivo de fluidos é obtido por grandes tubos. Quan-
do o raio dos vasos sangüíneos fica menor, a resistência ao fluxo aumenta de r4 (Lei (B) 49 dias
Artérias
de Poiseuille). Um vaso sangüíneo que é metade da largura de outro tem uma resis- Artéria carótidas externas
tência ao fluxo 16 vezes maior. No entanto, a difusão dos nutrientes ocorre somente carótida
interna
quando o sangue flui vagarosamente e tem acesso à membrana. Então temos aqui
um paradoxo: As restrições na difusão ordenam que os vasos sangüíneos sejam Artéria
pequenos, enquanto que a lei da hidráulica ordena que os vasos sejam grandes. Artéria pulmonar
carótida
Organismos vivos resolveram esse paradoxo desenvolvendo um sistema circulató-
comum
rio com uma hierarquia no tamanho dos vasos (LaBarbera, 1990). Essa hierarquia é Arco
formada muito cedo no desenvolvimento, como pode ser visto em embriões de pinto Artéria da
de 3 dias. Nos cães, o sangue dos vasos grandes (aorta e veia cava) flui 100 vezes subclávia aorta
mais rapidamente do que nos capilares. Havendo vasos grandes especializados direita Duto
para o transporte e pequenos especializados para a difusão (onde o sangue passa a arterioso
maior parte do tempo), nutrientes e oxigênio podem alcançar as células individuais Sétima artéria
do organismo em crescimento. Mas essa não é a estória completa. Se um fluido sob intersegmental
Aorta
pressão constante move-se diretamente de um tubo de grande diâmetro para um
tubo de pequeno diâmetro (como um bico de esguicho), a velocidade do líquido
aumenta. A solução evolucionária para esse problema foi o surgimento de muitos
(C) 56 dias
vasos pequenos ramificados de um vaso sangüíneo de maior tamanho, tornando o
corte secional coletivo de todos os vasos pequenos, maior que o daquele do grande Artéria carótida
Artéria carótida
externa esquerda
vaso. Esse relacionamento (conhecido como lei de Murray) explica que o cubo do externa direita
raio do vaso parental se aproxima da soma dos cubos dos raios de vasos menores. A Artéria carótida
construção de qualquer sistema circulatório precisa negociar entre essas limitações Artéria comum esquerda
físicas, fisiológicas e evolucionárias. subclávia
Artéria
Direita
subclávia
VASCULOGÊNESE: FORMAÇÃO DE VASOS SANGÜÍNEOS DE ILHAS DE SAN- Esquerda
GUE. A criação de vasos sangüíneos de novo a partir do mesoderma é chamada vascu-
logênese (Pardanaud et al., 1989). No intestino, pulmão, aorta e também no revesti-
mento mesodérmico esplâncnico do saco vitelínico, uma rede de vasos capilares sur-
Ligamento
ge independentemente dentro de seus próprios tecidos (Auerbach et al.,1989;
Pardanaud et al., 1989). Nesses casos, os capilares não aparecem como extensões Aorta ascendente
cada vez menores de vasos sangüíneos originados do coração. Pelo contrário, o
mesoderma de cada um desses órgãos contém células chamadas angioblastos que se Artéria pulmonar Aorta descendente
organizam em vasos capilares. Essa rede de capilares específicos do órgão finalmente
se liga às extensões dos principais vasos sangüíneos.
No pinto, existem duas fontes de angioblastos (Figura 9.28; Pardanaud et al.,
1996). A primeira fonte é o mesoderma paraxial. O mesoderma paraxial cefálico fornece
angioblastos para os vasos sangüíneos da cabeça (Couly et al., 1995), enquanto o
mesoderma paraxial somítico do tronco contém angioblastos que migram para formar
os vasos da parede do corpo, membros, rins e porções dorsais da aorta. A segunda
fonte de angioblastos é o mesoderma esplancnopleural. Esses angioblastos colonizam
Figura 9.28 Mesoderma

Somito
Duas fontes de angioblastos no embrião Tubo neural intermediário
Somito Aorta
do pinto formam os endotélios de regi- Somatopleura
ões separadas. Os angioblastos dos Broto dos
somitos migram através do mesoderma membros
intermediário (rim), somatopleura e re-
giões laterais do assoalho da aorta. Os
angioblastos da esplancnopleura formam
os vasos do intestino e órgãos viscerais Notocorda Esplancnopleura Veia
assim como do assoalho da aorta. Os Aorta cardinal
angioblastos do assoalho da orta também 1 ½ dias
produzem células sangüíneas. (Segundo
Pardanaud et al., 1996.)
Intestino
3 dias
os órgãos viscerais, intestino e o assoalho da aorta. Esses angioblastos são na reali-

dade hemangioblastos, porque não só geram revestimento endotelial como também
fornecem os precursores das células sangüíneas (Pardanaud et al.,1996).
A agregação de células do mesoderma esplâncnico é crucial para o progresso do
desenvolvimento amniótico porque esses agrupamentos angiogenéticos (por vezes
chamados de ilhas de sangue) que forram o saco vitelínico produzem as veias vitelínicas
(onfalomesentéricas) que trazem nutrientes para o corpo e transportam os gases de
ida e volta para os lugares onde são realizadas trocas gasosas (Figura 9.29). Essas
células são primeiro vistas na área opaca no estágio da dobra da cabeça na embriogê-
nese do pinto, quando o sulco primitivo está totalmente estendido (Pardanaud et al.,
1987). Esses cordões de células logo cavitam transformando-se em tubos com parede
dupla análogos aos tubos duplos do coração. A parede interna se torna o revestimen-
to liso de células endoteliais do vaso, e as células externas se tornam músculo liso.
Entre essas camadas existe a lâmina basal contendo um tipo de colágeno específico
para vasos sangüíneos. Pensa-se que essa lâmina basal inicia a diferenciação dos
tipos de células no vaso (Murphy e Carson, 1978; Kubota et al., 1988). As células
centrais das ilhas de sangue se diferenciam em células sangüíneas embrionárias. Com
o crescimento, as ilhas de sangue finalmente se juntam para formar a rede capilar
drenando as duas veias vitelínicas, que trazem alimento e células sangüíneas para o
coração recém- formado.
Figura 9.29 Três fatores de crescimento podem ser responsáveis pela iniciação da vasculogê-
Vasculogênese. A formação de vasos sangüí- nese. Um deles, o fator de crescimento fibroblástico básico (FGF2) é necessário para
neos é primeiro vista na parede do saco a geração de angioblastos a partir do mesoderma. Quando as células do blastodisco
vitelínico onde (A) mesênquima indiferen- das codornas são dissociadas em cultura, elas não formam ilhas de sangue ou células
ciado se condensa para formar (B) conjuntos endoteliais. No entanto, quando essas células são cultivadas em FGF2, surgem ilhas
de células angiogenéticas. (C) O centro desde sangue na cultura, e essas formam células endoteliais (Flamme e Risau, 1992). O
ses agregados forma as células sangüíneas, e
FGF2 é sintetizado na membrana corioalantóica do embrião de pinto e é responsável
a parte externa dos agregados desenvolve as
células endoteliais dos vasos sangüíneos. (Se- pela vascularização desse tecido (Ribatti et al., 1995). A segunda proteína é o fator de
gundo Langman, 1981.)
(A) (B) (C)

Endoderma do saco vitelínico Agregado de células angiogenéticas Célula sangüínea primitiva
Células mesenquimatosas Célula endotelial

(A) Mesoderma Sulco Veia

periférico Avascular ectodérmico apical marginal Anterior
Somitos
Estágio
Artéria Subclávia Veia marginal
Figura 9.30 posterior
Vascularização do membro anterior do pinto. (A) Desenvolvimento do sistema vascular durante
o desenvolvimento precoce do broto alar do pinto. A periferia do broto é avascular; e mais
regiões avasculares se formarão nas regiões onde os condrócitos irão se condensar para formar
os precursores cartilaginosos para o osso. (B) Vista dorsal do broto alar injetado com tinta da
China no estágio 22. (A segundo Feinberg, 1991; B de Feinberg e Cafasso, 1995; fotografia
cortesia do Dr. R. N. Feinberg.)
crescimento vascular endotelial (VEGF), que parece ser específica para permitir a
diferenciação dos angioblastos e sua multiplicação para formar os tubos endoteliais.
Além disso, os receptores para VEGF são encontrados nas ilhas de sangue e em
outros lugares onde VEGF pode estar ativo (Millauer et al., 1993). Se embriões de
camundongos não possuem os genes codificando o principal receptor para VEGF
(FlK1 tirosina quinase) as ilhas de sangue do saco vitelínico não aparecem, e a vascu-
(B)
logênese não ocorre. Camundongos carentes de genes para o segundo receptor para
VEGF (Flt1 tirosinoquinase), têm as células endoteliais e ilhas de sangue diferencia-
das, mas essas células não são organizadas em vasos sangüíneos (Fong et al.,1995;
Shalaby et al., 1995). Um terceiro fator, angiopoietina-1, intermedia a interação entre as
células endoteliais e os músculos lisos recrutados para cobri-las. Mutações de cada
uma dessas angiopoietinas ou seus receptores levam a vasos sangüíneos mal-forma-
dos, deficientes em músculos lisos que normalmente os envolvem (Davis et al.,1996;
Suri et al., 1996; Vikkula et al., 1996).
ANGIOGÊNESE: O SURGIMENTO DOS VASOS SANGÜÍNEOS. Vasculogênese não

é o único meio de se produzir vasos sangüíneos. Em outros órgãos (notavelmente nos
brotos dos membros, nos rins e no cérebro), vasos sangüíneos existentes se desen-
volvem e enviam células endoteliais para o órgão em desenvolvimento (Wilson, 1983;
Sariola, 1985). Esse tipo de formação de vaso sangüíneo, no qual novos vasos emer-
gem da proliferação de vasos sangüíneos preexistentes é chamado angiogênese. No
broto do membro anterior, por exemplo, a rede de capilares é derivada do brotamento
de células procedentes da aorta (Evans, 1909; Feinberg, 1991). Dentro dessa rede de
capilares, uma artéria central (que se torna a subclávia) forma o principal vaso de
alimentação. O sangue retorna ao corpo através da veia marginal que se forma dos
capilares anteriores e posteriores (Figura 9.30). Acredita-se que as regiões formadoras
de órgãos secretam fatores de angiogênese que promovem a mitose e a migração de
células endoteliais para aquela área. VEGF (mencionado anteriormente como um fator
de vasculogênese) também promove a migração de células endoteliais procedentes de
vasos sangüíneos da superfície do órgão para esses órgãos. O grau de vascularização
dos membros está ligado aos níveis de VEGF no broto dos membros, e os padrões
espaço-temporais da expressão de VEGF correlacionam-se bem com a hora e o lugar
onde vasos sangüíneos penetram nos rins e no cérebro (Figura 9.31; Breier et al., 1992;
Millauer et al., 1993; Flamme et al., 1995).
Figura 9.31
Produção do fator da angiogênese pelo tecido
fetal de camundongo. Hibridização in situ mos-
tra que mRNA para VEGF secretado é sinteti-
zado pelos glomérulos do rim fetal do camun-
dongo de 15 dias. A fotografia em campo ilu-
minado à esquerda corresponde a auto-radio-
grafia em campo escuro à direita. (de Breier et
al., 1992, cortesia de W. Risau.)
Alguns órgãos parecem produzir seus próprios fatores de angiogênese. A placen-

ta é um órgão cuja função depende do redirecionamento de vasos sangüíneos existen-
tes dentro dela. Quando a placenta é primeiro formada, induz a angiogênese secretan-
do a proliferina (PLF), um fator parecido com o hormônio de crescimento. Quando os
vasos sangüíneos placentários se estabeleceram (no camundongo após o décimo
segundo dia), a placenta secreta uma proteína relacionada à proliferina (PRP), um
peptídeo que age como um inibidor da angiogênese (Jackson et al., 1994). O osso em
desenvolvimento é um outro órgão que redireciona vasos sangüíneos para si enquan-
to está em formação. Como já foi mencionado, a cartilagem é normalmente um tecido
avascularizado, exceto quando os capilares invadem a placa de crescimento para con-
verter cartilagem em osso. Cartilagem hipertrófica (mas não cartilagem em divisão ou
madura) secreta um fator de angiogênese de 120-kDa (Alini et al., 1996). É interessante
que esse fator é produzido somente quando os condrócitos hipertróficos precoces
foram expostos a vitamina D. Isso ajudaria explicar as deformidades nos ossos vistas
em pacientes com raquitismo.
A angiogênese é crucial no crescimento de qualquer tecido, incluindo os tumores.
Os tumores são “bem sucedidos” somente quando são capazes de direcionar para si
os vasos sangüíneos. Portanto, os tumores secretam fatores de angiogênese. A habi-
lidade de inibir tais fatores pode se tornar uma maneira extremamente importante para
prevenir o crescimento de tumores e metástases (Fidler e Ellis, 1994).[mesend3.html]
CIRCULAÇÃO EMBRIONÁRIA. O sistema circulatório embrionário para e do embrião

do pinto e saco vitelínico é mostrado na Figura 9.32. O sangue bombeado através da
aorta dorsal passa sobre os arcos aórticos e se direciona para baixo, entrando no
embrião. Parte desse sangue deixa o embrião através das artérias vitelínicas entrando
no saco vitelínico. Nutrientes e oxigênio são absorvidos, e o sangue retorna através
das veias vitelínicas para o coração através do seio venoso. Nos embriões de mamífe-
ros, alimento e oxigênio são obtidos da placenta. Dessa maneira, embora o embrião de
mamífero possua vasos análogos às veias vitelínicas, o principal suprimento de oxigê-
nio e alimento procede da veia umbilical, que une o embrião com a placenta (Figura
9.33). Essa veia, que leva o sangue oxigenado e carregado de alimento de volta ao
embrião é derivada do que seria nas aves a veia vitelínica direita. A artéria umbilical,
carregando os resíduos da placenta, é derivada do que teria sido a artéria alantóica do
pinto. Ela estende-se da porção caudal da aorta e prossegue ao longo da alantóide e
emergindo depois para a placenta.
Após a sua entrada no coração embrionário do mamífero, o sangue é bombeado
para uma série de arcos aórticos que circundam a faringe para trazer o sangue dor-
salmente. Nos mamíferos, o membro esquerdo dos quarto par de arcos aórticos é o
único que sobrevive para alcançar a aorta. O membro direito desse par se tornou a
raiz da artéria subclávia. O terceiro arco aórtico se modificou para formar artérias
carótidas comuns, que fornecem sangue para o cérebro e cabeça. O sexto arco é
modificado para formar a artéria pulmonar; o primeiro, o segundo e o quinto arcos
degeneram. A aorta e a artéria pulmonar, portanto, têm uma abertura para o coração
em comum, durante a maior parte do seu desenvolvimento. Finalmente, divisões se
(A) (B) Veia vitelínica

anterior
Arcos aórticos
Coração
Aorta Veia
dorsal vitelínica
Artéria
vitelínica
Capilares
Seio terminal
Figura 9.32
Sistema circulatório do embrião de ave pre-
coce. (A) Construção da vasculatura em um
formam dentro do tronco arterioso para criar dois vasos diferentes. Somente quan- somito –7 de embrião de codorna corado com
do a primeira respiração do animal recém-nascido indica que os pulmões estão pre- um anticorpo fluorescente que reconhece cé-
parados para a oxigenação do sangue, o coração se modifica para bombear sangue lulas endoteliais. A ilhas de sangue podem
ser vistas nas margens. (B) Sistema circulató-
separadamente para a artéria pulmonar.
rio de um embrião de pinto de 44 horas. Esta
visão mostra artérias em cor; as veias estão
pontilhadas. O seio terminal é o limite externo
do sistema circulatório e o local da geração
das células do sangue. (Montagem fotográfi-
Veia cardinal ca de Pardanaud et al., 1987; cortesia do Dr.
posterior
Vilosidades F. Dieterlen-Lièvre; B segundo Carlson, 1981.)
Artéria Veia cardinal comum
coriônicas
e veia Aorta dorsal
vitelínica
Broto pulmonar
Bolsa faríngea IV
Arco aórtico III
Raiz aórtica ventral
Veia cardinal anterior
Placenta Veia
umbilical Artéria
carótida Figura 9.33
Artéria Interna Sistema circulatório de um embrião humano de
Umbilical
4 semanas. Embora nesse estágio todos os
vasos sangüíneos principais estejam pareados
à esquerda e à direita, somente são mostrados
os vasos à direita. As artérias estão coloridas.
Saco vitelínico
(de Carlson, 1981.)
& Especulações
Redirecionando o Fluxo Sangüíneo no

Mamífero Recém-nascido
E MBORA O FETO EM DESEN-
VOLVIMENTO divida com o adul-
to a necessidade de conseguir
oxigênio e nutrientes para seus tecidos, a
fisiologia do feto mamífero difere drasti-
Hemoglobina
fetal
H
em
ác
ia
s
fe
ia
ta
s
is
m
at
e rn
ai
s
ác
Saturação com O2 (%)

camente daquela do adulto. A principal em
H
diferença é a falta de pulmões e intestinos
funcionais. Todo oxigênio e nutrientes
devem provir da placenta. Isso levanta
duas questões. Primeiro, como o feto ob-
tém oxigênio do sangue materno? E se-
gundo, como a circulação do sangue é Hemoglobina
redirecionada aos pulmões uma vez que o adulta
cordão umbilical for cortado e a respira-
ção se fizer necessária?
A solução para o problema do feto con-
seguir oxigênio do sangue de sua mãe en-
volve o desenvolvimento de uma hemo- Pressão de O2
globina fetal. A hemoglobina das hemácias Figura 9.34
fetais difere um pouco daquela do corpús- Transferência de oxigênio da mãe para o feto em embriões humanos. Moléculas adultas e fetais
culo adulto. Dois dos quatro peptídeos das de hemoglobina diferem em suas subunidades protéicas. A cadeia γ fetal liga difosfoglicerato
cadeias da hemoglobina do adulto e do feto menos avidamente que o faz a cadeia β adulta. Conseqüentemente, a hemoglobina fetal pode ligar
são idênticos - a cadeia alfa (α) - mas a o oxigênio mais eficientemente que a hemoglobina adulta. Na placenta, há um fluxo líquido de
hemoglobina do adulto tem duas cadeias oxigênio (seta) do sangue materno (que cede oxigênio ao tecido com menor pressão de oxigênio)
beta (β), onde o feto tem duas cadeias gama para o sangue fetal, que ainda o está recolhendo.
(γ) (Figura 9.34). Cadeias β normais fixam o
regulador natural difosfoglicerato, que aju-
da na descarga do oxigênio. As cadeias γ Mas uma vez que o feto não está con- átrio esquerdo, e depois entrar no ventrí-
isoformas não fixam difosfoglicerato tão seguindo oxigênio da mãe, como ele re- culo esquerdo (Figura 9.35). Quando ocor-
bem e portanto têm uma maior afinidade estrutura sua circulação para conseguir re a primeira respiração, o oxigênio no san-
pelo oxigênio. No ambiente de baixa oxigênio de seus próprios pulmões? Du- gue faz com que os músculos que envol-
oxigenação da placenta, o oxigênio é libe- rante o desenvolvimento fetal, uma aber- vem o duto arterioso feche a abertura. O
rado da hemoglobina adulta. Nesse mes- tura - o duto arterioso - direciona a passa- aumento da pressão sangüínea no lado es-
mo ambiente, a hemoglobina fetal não dis- gem do sangue da artéria pulmonar para a querdo do coração causa o fechamento do
tribui oxigênio, mas o fixa. Essa pequena aorta (e conseqüentemente para a placen- septo sobre o forame oval, com isso sepa-
diferença na afinidade pelo oxigênio media ta). Como o sangue não retorna da veia rando a circulação sistêmica e pulmonar**.
a transferência do oxigênio da mãe para o pulmonar no feto, mamíferos em desen- Dessa maneira, quando começa a respira-
feto (Figura 9.34). No feto, a mioglobina dos volvimento têm que ter alguma outra ma- ção, a circulação respiratória é desviada da
músculos fetais tem uma afinidade ainda neira de obter sangue no seu ventrículo placenta para os pulmões. [other.html#4]
maior por oxigênio, fazendo com que molé- esquerdo para ser bombeado. Isso é con-
culas de oxigênio passem de hemoglobina seguido pelo forame oval, uma abertura **Em algumas crianças, o septo não se fe-
fetal para armazenagem e uso pelos múscu- no septo separando o átrio direito do es- cha, e o forâmen oval é deixado aberto. Em
los fetais. A hemoglobina fetal não é nociva geral, a abertura é tão pequena que essas crianças
querdo. O sangue pode entrar no átrio di-
ao recém-nascido, e em humanos, a reposi- não apresentam sintomas físicos, e o forâmen
reito, passar pelo forame em direção ao finalmente acaba se fechando. No entanto, se o
ção de células sangüíneas contendo hemo- segundo septo falha na sua formação, a abertura
globina fetal por células sangüíneas con- *A base molecular para essa mudança septal do átrio pode causar um aumento do lado
tendo hemoglobina adulta não se completa nas globinas será posteriormente discutida direito do coração, que pode levar à falência
até 6 meses após o nascimento.* no Capítulo 11. cardíaca durante a idade adulta jovem.
De e para a cabeça FETO
Veia cava superior De e para o braço

Ducto
Artéria arterioso
pulmonar
De e para o braço
Forame oval
Forame oval
está aberto
Veia cava
inferior
Ducto venoso Pulmão
Parede
corporal
Rim
Fígado
Veia
umbilical De e para o NEONATO
Intestino
Artérias
umbilicais Ducto arterioso
se fecha
De e para as pernas
Forame oval
se fecha
Placenta
Figura 9.35
Redirecionamento do fluxo sangüíneo no nascimento. A expansão de ar para os pulmões causa
alterações de pressão que redirecionam o fluxo de sangue para o neonato. O ducto arterioso se
comprime e se fecha, rompendo a conexão entre a aorta e a artéria pulmonar, e o forame oval, uma
passagem entre os átrios esquerdo e direito, também se fecha. Dessa maneira, a circulação
pulmonar fica separada da circulação sistêmica.
O Desenvolvimento de células sangüíneas

O Conceito de Célula-Tronco
Célula-T
Enquanto muitas das células que possuímos hoje são as mesmas células que adquiri-
mos quando éramos embriões, existem diversas populações de células que estão
constantemente se regenerando. Perdemos e repomos aproximadamente 1011 hemácias
e pequenas células intestinais cada dia. De onde vêm essas células de reposição? Elas
são procedentes de populações de células-tronco. Uma célula-tronco é capaz de
Auto-manutenção Figura 9.36

Modelo da dinâmica da proliferação e diferenciação da célula-tronco. A proliferação está repre-
sentada por círculos horizontais, e a diferenciação se dá ao longo do eixo vertical progredindo
diferenciação
Maturação e
para baixo, para tipos mais diferenciados de células. As células-tronco iniciais (S) podem
permanecer quiescentes (na fase G0 ) ou entrar no ciclo celular. Células-tronco que produzem
mais células-tronco permanecem em um nível, mas podem se dividir para produzir um tipo de
célula de transição que “cai “ para o próximo nível. Em cada nível mais baixo, a probabilidade de
cair ainda mais na próxima divisão aumenta. Finalmente, uma célula madura diferenciada é
gerada. (Segundo Potten e Loeffer, 1990).
Célula-tronco
Fase S extensa proliferação, criando mais células-tronco (auto-renovação) assim como uma
progênie celular mais diferenciada. Células-tronco são, na realidade, uma população
embrionária de células, que sofrem um desenvolvimento posterior dentro de um orga-
Ciclo
celular
nismo adulto. Nossas células sangüíneas, células das criptas intestinais, epiderme e
espermatócitos (em homens) são populações em estado estável de equilíbrio no qual
a produção de células equilibra-se com a perda de células (Hay, 1966). Na maioria dos
casos, as células-tronco podem regular a produção de mais células-tronco ou mais
Mitose (M) Reabastecendo nicho células diferenciadas, quando o equilíbrio é estressado por lesão ou pelo meio ambi-
do tronco (renovação
Diferenciação
/regeneração) ente. (Isso é percebido pelo aumento da produção de uma grande quantidade de
hemácias quando o organismo sofre anoxia.) As células-tronco foram identificadas em
Célula-tronco intermediária
todos os tecidos mencionados anteriormente, mas elas são mais estudadas no desen-
tipo 1 volvimento das hemácias.
Potten e Loeffler (1990) apresentaram uma visão na qual algumas células-tronco
são potencialmente células-tronco não-cíclicas presas em Go, enquanto outras célu-
las-tronco estão ativamente no ciclo celular. Uma célula-tronco em ciclo, normalmente
se divide para criar mais células-tronco, mas também pode gerar um tipo de célula-
tronco transitório intermediário (T1). Uma célula T1 pode regenerar-se, mas normal-
Célula-tronco mente prossegue para produzir um segundo tipo de célula transitória, T2. (Sob certas
intermediária tipo 2
condições, uma célula T1 pode regenerar a célula-tronco original se a população de
células-tronco original estiver muito esgotada.) A célula T2 pode se manter, mas nor-
malmente se divide para criar células T3. Finalmente, um tipo de célula transitória é
produzida, que sempre amadurece para um tipo de célula diferenciada (Figura 9.36).
Assim, o corpo vertebrado retém populações de células-tronco, e essas células-tron-
Célula-tronco co podem produzir tanto populações de células-tronco como de células que passarão
intermediária tipo 3 por um desenvolvimento futuro.
O caminho do desenvolvimento pelo qual uma célula-tronco passa depende do
meio molecular no qual ela reside. Isso se tornou aparente quando evidências experi-
mentais mostrou que hemácias (eritrócitos), células brancas (granulócitos, neutrófilos
Blastocélula comprometida e plaquetas), e linfócitos compartilham de um precursor comum, a célula-tronco
com a diferenciação
hematopoiética pluripotencial (por vezes chamada de célula-tronco hematopoética
repopuladora a longo prazo).
Células--Tronco Pluripotenciais e
Células
Microambientes Hematopoéticos
Célula madura
totalmente diferenciada
O CFU-S. A célula-tronco hematopoética pluripotencial é uma das células mais im-
pressionantes do nosso corpo. A partir dela irão surgir eritrócitos, neutrófilos,
M Reprodução (divisão / mitose) basófilos, eosinófilos, plaquetas, mastócitos, monócitos, macrófagos dos tecidos,
Auto-reprodução / replicação osteoclastos, e os linfócitos T e B. A existência de uma célula-tronco hematopoética
Reprodução / Replicação pluripotencial foi mostrada por Till and McCulloch (1961), que injetaram células da
medula óssea em camundongos fatalmente irradiados, procedentes da mesma linha-
gem genética que os doadores da medula. (A irradiação mata as células
hematopoiéticas do hospedeiro, permitindo que se veja as novas colônias do ca-
mundongo doador.) Algumas dessas células doadoras produzem nódulos discretos
no baço do animal hospedeiro (Figura 9.37). Estudos microscópicos mostraram que
esses nódulos são compostos de precursores de eritrócitos, granulócitos e plaquetas.
Assim, uma única célula oriunda da medula óssea foi capaz de formar muitos dos
diferentes tipos de células sangüíneas. A célula responsável foi chamada de CFU-S,

(colony-forming unit), unidade formadora de colônias do baço. Estudos mais avan-
çados usaram marcadores cromossômicos para provar que os diferentes tipos de
célula em uma colônia foram formados de uma mesma CFU-S. Aqui, células da medu-
la foram irradiadas para que poucas pudessem sobreviver. Muitas das que sobrevi-
veram tinham cromossomos anormais que puderam ser detectados microscopica-
mente. Quando essas células CFU-S irradiadas foram injetadas em um camundongo
cujas células-tronco formadoras de sangue haviam sido destruídas, cada célula da
colônia do baço, fosse precursora de granulócito ou de eritrócito, apresentou a
mesma anormalidade cromossômica (Becker et al., 1963). Uma parte importante do
conceito de célula-tronco é o requisito de que a célula-tronco seja capaz de formar
mais células-tronco além dos seus tipos de células diferenciadas. E realmente isso
tem acontecido. Quando colônias do baço derivadas de uma única CFU-S são
resuspensas e injetadas em outros camundongos, muitas colônias do baço são
vistas emergir (Jursšková e Tkadlecek, 1965; Humphries et al., 1979). Assim, vemos
que uma única célula da medula consegue formar numerosos tipos de células dife- Figura 9.37
rentes e também pode sofrer auto-renovação; em outras palavras, a CFU-S é uma Colônias formadoras de sangue isoladas.
célula-tronco hematopoética pluripotencial. Quando a medula óssea contendo células-
A informação anterior indica que embora as CFU-S possam gerar diversos tipos tronco hematopoiéticas é injetada em um ca-
mundongo irradiado, discretas colônias de
de células sangüíneas, elas não são capazes de gerar linfócitos. Essa conclusão é
células de sangue são vistas na superfície do
amparada pelos experimentos de Abramson e seus colegas (1977), que mostrou que baço desse camundongo. (de Till, 1981, cor-
ambos CFU-S e linfócitos são derivados de uma outra célula-tronco hematopoética tesia de J. E, Till.)
pluripotencial, por vezes chamada de unidade formadora de colônias de células
mielóides e linfóides, ou CFU-M,L. Quando eles injetaram células da medula óssea
irradiadas em camundongos com deficiência hereditária na formação de células san-
güíneas, os pesquisadores encontraram as mesmas anormalidades cromossômicas
em colônias do baço e em linfócitos circulantes. Esse trabalho foi confirmado por
estudos nos quais células da medula foram injetadas com certos tipos de vírus que
se incorporam ao DNA celular aleatoriamente. Os mesmos genes derivados viralmente
foram encontrados nos mesmos lugares do genoma, nos linfócios e células sangüí-
neas (Keller et al., 1985; Lemischka et al., 1986). Em 1995, Berardi e colegas isola-
ram uma fração de células que pode ser a CFU-M,L humana. Eliminando todas as
células que se dividem quando expostas a citocinas que iriam ativar células-tron-
co, foi deixada uma célula nucleada para cada 10.000 originalmente presentes na
medula óssea. Essas células podem gerar ambas linhagens, sangüínea e linfóide.
LINHAGENS SANGÜÍNEAS E LINFOCÍTICAS. A Figura 9.38 sumariza diversos estu-

dos. A primeira célula-tronco hematopoética pluripotencial é a CFU-M. L. O desenvolvi-
mento dessa CFU-M,L parece ser dependente do fator de transcrição SLC. Camundon-
gos carentes dessa proteína morrem por ausência de todas linhagens de células
sangüíneas e linfocíticas. SLC pode especificar o mesoderma ventral como o destino de
uma célula sangüínea ou pode envolver a formação ou manutenção de células CFU-M,L
(Porcher et al., 1996; Robb et al., 1996). Essa célula dá origem às CFU-S (células sangüíneas)
e aos CFU-L (linfócitos). As CFU-S e as CFU-L também são células-tronco pluripotenciais
porque sua progênie pode se diferenciar em numerosos tipos de células. A progênie
imediata da CFU-S, no entanto, são células-tronco restritas às linhagens. Cada uma
pode produzir somente um tipo de célula além de renovar a si mesma. A BFU-E (unidade
formadora de rompimento de eritróide), por exemplo, é formada da CFU-S e ela pode
formar somente um tipo de célula além de si mesma. Essa nova célula é a CFU-E (unidade
formadora de colônia de eritróide), a qual é capaz de responder ao hormônio eritropoetina
para produzir o proeritroblasto, o primeiro membro diferenciado reconhecível da linha-
gem do eritrócito. Eritropoetina é uma glicoproteína que rapidamente induz a síntese do
mRNA para globina (Krantz e Goldwasser, 1965). Ela é produzida predominantemente no
rim, e sua síntese responde às condições ambientais. Se o nível de oxigênio do sangue
cair, a produção de eritropoeitina é aumentada, um evento levando à produção de mais
CÉLULAS-
TRONCO RESTRI-
CÉLULAS-TRONCO CÉLULAS EM CÉLULAS
TIVAS DE LINHA-
PLURIPOTENTES DIFERENCIAÇÃO DIFERENCIADAS
GEM (COMPRO-
METIDAS)
Célula pré-T Célula T Célula T ativada
Célula-tronco
linfóide Célula plasma
Célula pré-B Célula-B
e
F ent
SC mbi
oa
i cr Basófilos
M
Célula-tronco
de granulócitos Eosinófilos
Mic
roa
SCF i e n t e
mb
Neutrófilos
Célula-tronco
totipotente auto- Monócito
renovadora
Célula-tronco
mielóide
Macrófagos
CFC-Meg
Megacariócito
Plaquetas
Eriotroblasto
Células sangüíneas
Proeritroblasto Reticulócito
vermelhas (hemácias)
(Eritrócitos)
Figura 9.38
Um modelo para a origem de células linfóides e de sangue de mamíferos. (Outros modelos são
consistentes com os dados e este sumariza aspectos de diversos modelos). EPO, eritropoietina;
G-CSF, fator estimulador de colônias de granulócitos; GM-CSF, fator estimulador de colônias
de granulócitos-macrófagos; IL, interleucina; LIF, fator inibidor de leucemia; M-CSF, fator
estimulador de colônias de macrófagos; SCF, fator de células-tronco. (Segundo Nakauchi e
Gachelin, 1993.)
hemácias. Com a maturação, as hemácias se tornam eritroblastos, capazes de sinteti-

zar enormes quantidades de hemoglobina. Finalmente, o eritroblasto mamífero expele
o seu núcleo, tornando-se um reticulócito. Os reticulócitos já não conseguem mais
sintetizar mRNA da globina, mas ainda conseguem traduzir mensagens existentes na
globina. O estágio final da diferenciação é o eritrócito. Nesse estágio não há divisão,
síntese de RNA ou síntese de proteína. As células deixam a medula óssea para exercer
o seu papel de fornecedoras de oxigênio aos tecidos corporais. Similarmente, existem
células-tronco restritivas de linhagem para plaquetas e granulócitos (neutrófilos,
basófilos e eosinófilos) e macrófagos.
Alguns fatores de crescimento hematopoiético (tal como o IL-3) estimulam a
divisão e a maturação de outras células-tronco mais primitivas, desse modo au-
mentando o número de tipos de células sangüíneas. Outros fatores (como a
eritropoetina) são específicos somente para algumas linhagens de células. A habi-
lidade da célula em responder a esses fatores depende da presença de receptores
para esses fatores na sua superfície. O número desses receptores é muito baixo.
Existem somente cerca de 700 receptores para eritropoetina em uma CFU-E, e a
maioria das outras células progenitoras tem o mesmo baixo número de receptores
do fator de crescimento. A exceção é o receptor para o fator de estimulação de
colônia de macrófagos -M-CSF, também conhecido como CSF-1- do qual pode
haver até 73.000 por célula em algumas células progenitoras.
MICROAMBIENTES HEMATOPOIÉTICOS INDUTIVOS. Alguns fatores de cresci-

mento hematopoiético são formados por células estromáticas (fibroblastos e outros
elementos do tecido conjuntivo) da própria medula óssea. Outros fatores de cresci-
mento viajam através do sangue e são retidos pela matriz extracelular das células
estromáticas. No baço, as células-tronco estão comprometidas com o desenvolvi-
mento do eritróide. Na medula óssea, o desenvolvimento de granulócitos predomi-
na. O caminho do desenvolvimento percorrido pelos descendentes de uma célula-
tronco pluripotencial depende de quais fatores de crescimento ela encontra, e isso é
determinado pelas células estromáticas da medula óssea. Wolf e Trentin (1968) de-
monstraram que interações de curto alcance entre as células estromáticas e as célu-
las-tronco determinam o destino do desenvolvimento da progênie das células-tron-
co. Esses investigadores colocaram plugues de medula óssea no baço e, em segui-
da, injetaram células-tronco. As colônias no baço eram predominantemente eritróides,
ao passo que aquelas que se formaram nos plugues de medula eram predominante-
mente granulócitos. De fato, aquelas colônias que cobriam as bordas, se tornaram
predominantemente eritróides no baço e granulocíticas na medula. As regiões de
determinação são referidas como microambientes hematopoiéticos indutivos (HIMs)
As células estromáticas da medula óssea criam HIMs através da sua habilidade de
agregar fatores de crescimento hematopoiético (Hunt et al., 1987; Whitlock et al.,
1987). GM-CSF e o fator de crescimento multilinhagens IL-3 ligam-se ao
glicosaminoglicano heparan sulfato do estroma da medula óssea (Gordon et al., 1987;
Roberts et al., 1988). Além disso, eles permanecem ativos quando ligados. Desse
modo, os fatores de crescimento podem ser concentrados e compartimentalizados,
estimulando células-tronco em uma área para se diferenciarem em um tipo de célula,
permitindo que esse mesmo tipo de célula-tronco em outra área se diferencie em outro
tipo de célula. Sem esses fatores de crescimento, as células-tronco morrem.
Desenvolvimento Osteoclástico
Como vimos, as células-tronco são influenciadas por numerosos fatores de cresci-

mento hematopoiético. Além disso, esses fatores são, eles mesmos, influenciados
pelo meio hormonal do organismo. Esse fato pode ser de extrema importância na
osteoporose pós-menopausa. A perda da função ovariana em muitas fêmeas de
mamíferos causa uma perda de massa óssea que pode ser freqüentemente prevenida
pelo fornecimento de estrógeno ao indivíduo, e essa perda óssea foi associada com
o aumento da produção de osteoclastos. Acredita-se que o osteoclasto (célula res-
ponsável para formar buracos nos ossos, como descrito anteriormente) é proceden-
te da mesma célula-tronco que os macrófagos e granulócitos, o CFU-GM (Kurihara
et al., 1990; Hattersley et al., 1991). O fator de crescimento interleucina 6 (IL-6)
estimula a produção de osteoclastos. No entanto, a produção de IL-6 é inibida pelo
estrógeno que, quando é adicionado às células de medula de camundongo em cul-
tura, tanto a produção de IL-6 como a de osteoclastos são inibidas (Girasole et al,
1992). Jilka e colegas (1992) mostraram que a remoção dos ovários do camundongo
causa um aumento no número de CFU-GMs, acentuando o desenvolvimento do
osteoclasto, e um aumento no número de osteoclastos encontrados no osso. Essas
mudanças podem ser prevenidas injetando nesses camundongos estrógeno ou IL-
6. Isso sugere que o estrógeno normalmente suprime a produção de IL-6 e a forma-
ção de osteoclastos em fêmeas de mamíferos, e que a perda óssea pós-menopausa
pode ser devida à produção de novos osteoclastos pela IL-6.* [mesend4.html]
Locais de Hematopoiese
Nas espécies avícolas e anfíbias, as primeiras células do sangue derivam do vitelo ou

saco vitelínico. Essa população celular, no entanto, é transitória; as células-tronco
hematopoiéticas que perduram por toda vida do organismo são derivadas da área
mesodérmica que envolve a aorta. Isso foi demonstrado no pinto através de uma série
de experimentos elegantes por Dieterlen-Lièvre, que enxertou o blastoderma de um
*Então, como os machos - que não têm ovários ou mesmo estrógeno - normalmente não sofrem
perda óssea osteoporótica? Parece que a testosterona também suprime o desenvolvimento osteoclástico
(Bellido et al., 1995). Nos seres humanos machos, a produção de testosterona é normalmente mantida
com a chegada da idade. Dada a fisiologia do osteoclasto, nós podemos apreciar a intuição presciente
de H. L. Menken (1919): “A vida é uma luta, mas não contra o pecado ou o Poder Econômico, ou
contra o malicioso magnetismo animal, mas contra os íons de hidrogênio”.
(B)
Célula
de pinto
Célula
Figura 9.39
de codorna
Mapeamento de células sangüíneas por quime-
ras pinto-codorna. (A) Fotografia de uma “qui-
mera de saco vitelínico” onde o blastoderma de
uma codorna foi transplantado para o saco
vitelínico de um pinto. (B) Fotografia de célu-
las de pinto e de codorna no timo de um animal
quimérico, mostrando a diferença na coloração
nuclear. As células linfóides são todas de pin-
to, enquanto as células estruturais do timo são
originárias da codorna. (C) Seção através da
aorta de um embrião de pinto de três dias, mos-
trando as células (setas) que dão origem às cé-
lulas-tronco hematopoiéticas. Se células dessa
região forem retiradas de embriões de codorna
e colocadas em embriões de pinto, os embriões
de pinto terão sangue de codorna. (de Martin
et al., 1978, e Dieterlen-Lièvre e Martin, 1981,
fotografias cortesia de F. Dieterlen-Lièvre.) (A) (C)
pinto em um vitelo de codorna japonesa (Figura 9.39). As células do pinto são facil-
mente distinguidas daquelas da codorna porque o núcleo celular da codorna escurece
muito mais (devido a seus densos nucléolos), assim fornecendo uma marca permanen-
te para a distinção entre os dois tipos de células. Usando essas “quimeras do saco
vitelínico”, Dieterlen-Lièvre e Martin (1981) mostraram que as células-tronco do saco
vitelínico não contribuem com células para o animal adulto, mas que as verdadeiras
células-tronco são formadas dentro dos nódulos do mesoderma que revestem os
principais vasos sangüíneos e o mesentério. Esses são os hemangioblastos que são
derivados da esplancnopleura (veja Figura 9.28; Pardanaud et al., 1996). No embrião
de pinto de 4 dias, a parede da orta parece ser a fonte mais importante de células
sangüíneas novas, onde foi encontrado numerosas células-tronco hematopoiéticas
(Cormier e Dieterlen-Lièvre, 1988).
Nos mamíferos a situação é mais controversa, mas começa a ficar bem parecida
com a do pinto. As primeiras ilhas sangüíneas no embrião do camundongo aparecem
no mesoderma extra-embrionário e saco vitelínico. Essas células parecem ter ativida-
de de CFU-C. Essa população derivada do saco vitelínico é provavelmente transitó-
ria ou pode suprir somente as necessidades respiratórias do embrião (produzindo
hemácias nucleadas). No décimo primeiro dia, células-tronco hematopoiéticas e cé-
lulas CFU-S podem ser encontradas na região mesodérmica embrionária do camun-
dongo que inclui a aorta, gônadas e mesonefro (a região AGM; Kubai e Auerbach,
1983; Godlin et al., 1993; Medvinsky et al., 1993). Essas são as precursoras das
células sangüíneas que irão colonizar o fígado e constituir o sistema circulatório do
feto e do adulto (Medvinsky e Dzierak, 1996). Müller e colegas (1994) propuseram
(A) (B)
AGM
Saco vitelínico
Aorta dorsal
Prônefro
Mesonefro
Sulco genital
AGM CFU-C no
rudimento hepático
CFU-C
CFU-S
Figura 9.40 Célula-tronco
hematopoiéticas no fígado
Colonização de fígado de camundongo por duas ondas hematopoiética

Iníco das atividades
de células-tronco hematopoiéticas. As duas principais fon- pluripotente

tes das células progenitoras hematopoiéticas são o saco
vitelínico e a região AGM. (A) No dia 9 o saco vitelínico Segunda onda
contribui com uma linha precoce de células CFU-C que
provavelmente não permanecem muito tempo após o nas-
cimento, e que produz um população predominante de Primeira onda
células sangüíneas vermelhas. Essa é considerada a prin-
cipal fonte da primeira onda hematopoiética do fígado.
(B) No dia 10, as células derivadas da AGM fornecem
células CFU-S e células-tronco hematopoiéticas
pluripotentes. Essas constituem as principais células da
segunda onda. (Segundo Dzierzak e Medvinsky, 1995). Dias após o coito
que duas ondas de células colonizam o fígado fetal. A população menor dessas
células viriam do saco vitelínico e seriam predominantemente células CFU-C. A mai-
or parte da população viria de sítios AGM e constituiriam tanto CFU-S como células-
tronco hematopoiéticas pluripotentes (Figura 9.40). Essa proposta foi fortalecida
com a descoberta de que camundongos com deficiência no fator de transcrição
AML1 possuem hematopoiese normal dos sacos vitelínicos, mas não tem
hematopoiese (AGM) definitiva (Okuda et al., 1996). Esses camundongos mutantes,
morrem no dia embrionário 12,5. O seu fígado contém um pequeno número de hemácias
nucleadas primitivas, enquanto os fígados controles estão repletos de células
sangüíneas derivadas da AGM. A proteína AML é essencial para a ativação dos
genes envolvidos na hematopoiese difinitiva. Ao redor da época do nascimento, as
células-tronco do fígado povoam a medula óssea, que assim se torna o principal
local formador de sangue por toda a vida adulta.
QENDODERMA
Faringe
A função do endoderma embrionário é construir o revestimento de dois tubos den-
tro do organismo. O primeiro se estende através do comprimento do corpo; é o tubo
digestivo. Brotos desse tubo formam o fígado, vesícula biliar e o pâncreas. O segun-
do, é o tubo respiratório, que cresce a partir do tubo digestivo, finalmente se bifur-
cando e se transformando nos dois pulmões. Os tubos digestivo e respiratório
dividem uma câmara comum na região anterior do embrião; essa região é chamada de
faringe. Bolsões epiteliais exteriores da faringe dão origem as amígdalas, as glându-
las tireóide, timo e paratireóide.
Os tubos digestivo e respiratório são ambos derivados do intestino primitivo
(Figura 9.41). Com o avanço do endoderma em direção ao centro do embrião, são
formados o intestino anterior e posterior. Antes, a parte terminal oral é bloqueada por
uma região do ectoderma chamada placa oral, ou estomodeu. Finalmente (aproximada-
mente após 22 dias nos embriões humanos), o estomodeu se rompe, criando a abertura
oral do tubo digestivo. Essa abertura é revestida por células ectodérmicas. Esse arran-
jo cria uma situação interessante, porque o ectoderma da placa oral está em contato
com o ectoderma do cérebro, qual se curvou ao redor da porção ventral do embrião. As
duas regiões ectodérmicas interagem mutualmente uma com a outra. A cobertura da
região oral forma a bolsa de Rathke e se torna a parte glandular da glândula pituitária.
O tecido neural no assoalho do diencéfalo dá origem ao processo infundibular, que se
torna a porção neural da pituitária. Assim, a glândula pituitária tem um dupla origem:
essa natureza dupla se reflete em suas funções no adulto.
A porção endodérmica dos tubos digestivo e respiratório, se inicia na faringe.
Aqui, o embrião de mamífero produz quatro pares de bolsas faríngeas (Figura 9.42).
Em vertebrados aquáticos, essas estruturas produzem as guelras, porém, as bolsas
faríngeas humanas foram modificadas para o ambiente terrestre. Como discutido no
Capítulo 7, células da crista neural craniana migram para essas bolsas para formar o
componente mesenquimatoso ou cartilaginoso dessas estruturas revestidas de
endoderma. Entre essas estruturas estão os arcos faríngeos. O primeiro par das
bolsas faríngeas se torna as cavidades auditivas do ouvido médio e os tubos de
eustáquio associados. O segundo par dá origem às paredes das amígdalas. O timo é
derivado do terceiro par de bolsas faríngeas; ele irá direcionar a diferenciação dos
linfócitos T durante os estágios tardios do desenvolvimento. Um par das glândulas
paratireóides também deriva do terceiro par das bolsas faríngeas; o outro par deriva
do quarto. Além dessas bolsas pareadas, um pequeno divertículo central é formado
entre as segundas bolsas faríngeas no assoalho da faringe. Essa bolsa de endoderma
e mesênquima brotará da faringe e migrará descendo pelo pescoço para se tornar a
glândula tireóide.
(A) (B)
Nódulo de Hensen
Notocorda Vilosidade coriônica
Cavidade Pregas neurais

Placa neural amniótica começando a se fundir
Âmnio
Intesti (secionado)
Primórdio Intestino anterior no po
Coração sterio
r Intestino
cardíaco Intestino primitivo
médio
Celoma
Saco vitelínico Divertículo
Ilha pericardíaco Saco
alantóico no Pedúnculo
sangüínea vitelínico
pedúnculo Portal Portal de conexão
de conexão intestinal intestinal
anterior posterior
Sulco neural
Âmnio
Somito
Cavidade
amniótica Mesoderma somático
Mesoderma esplâncnico
Saco vitelínico
Intestino médio
(C) (D) Estômago

Broto pulmonar
Pâncreas
Tireóide
Aorta dorsal
Tireóide Estomodeo
(agora aberto) Notocorda
Placa
Faringe da cloaca Alantóide
Pulmão Bolsa
de Rathke Coração
Estomodeu Fígado Saco
Broto Infundíbulo Proctodeu
Coração Saco vitelínico
Neuróporo caudal
anterior vitelínico Fígado
Pedúnculo Âmnio
Cérebro
corporal (secionado)
Mesentério
Dorsal Tubo Neural
Mesentério Tubo
Mesoderma dorsal
Somático neural
Pâncreas
Intestino Cavidade dorsal
Médio abdominal
Peritônio
visceral
Saco vitelínico Peritônio
Duodeno
parietal
Mesentério
Dorsal
Figura 9.41
Formação do sistema digestivo humano, apresentado após aproximadamente (A) 16 dias, (B) 18
dias, (C) 22 dias e (D) 28 dias. (Segundo Crelin, 1961.)
(A) (B) 29 dias (C) 32 dias

Embrião
Infundíbulo secionado ao
Hipófise Notocorda nível mostrado
Processo
à esquerda
Bolsa de Rathke mandibular Broto
(da bolsa lingual lateral
faríngea I) Broto
lingual mediano
Sulcos Expansão do
faríngeos Arcos segundo arco
faríngeos
Traquéia
Duto hepático
Esôfago Entrada para
Vesícula biliar Fígado o esôfago
Pedúnculo vitelínico Estômago (D) 42 dias

Alantóide Pâncreas dorsal
Abertura
Membrana da cloaca Pâncreas ventral auditiva
externa Tubo auditivo
Seio urogenital
Cavidade peritoneal Amígdala Seio cervical lateral
Intestino caudal
Reto Glândula
paratireóide
inferior
Figura 9.42 Glândula
Desenvolvimento endodérmico de um embrião paratireóide
humano de 6 semanas. (A) visão sagital do superior
embrião. A região estomacal começou a se di-
latar, e o pâncreas está representado por dois
brotos que no final irão se fundir. (B-D) Se- O tubo digestivo e seus derivados
ções através do embrião de 6 semanas nos pla-
nos em (A), mostrando os destinos dos sulcos Posteriormente à faringe, o tubo digestivo se constringe para formar o esôfago, o qual
faríngeos. O primeiro sulco forma as passa- é seguido na seqüência pelo estômago, intestino menor e intestino maior. As células
gens auditivas externas, enquanto o segundo
endodérmicas geram somente o revestimento do tubo digestivo e de suas glândulas,
se expande, para finalmente cobrir os sulcos 2,
3 e 4. (Segundo Larsen, 1993.) pois células mesenquimatosas mesodérmicas irão rodear esse tubo provendo os mús-
culos para o peristaltismo.
A Figura 9.42 mostra que o estômago se desenvolve como uma região dilatada
próxima à faringe. Mais caudalmente, se desenvolvem os intestinos, e a conexão entre
o intestino e o saco vitelínico é posteriormente cortada. Na terminação caudal do
intestino forma-se uma depressão onde o endoderma encontra o ectoderma
sobrejacente. Aqui, uma fina membrana cloacal separa os dois tecidos. Essa por fim
se rompe, formando a abertura que irá originar o ânus. O desenvolvimento das várias
regiões do tubo digestivo será detalhado no Capítulo 17.
Fígado, Pâncreas e Vesícula Biliar

Vesícula
O endoderma também forma o revestimento de três órgãos acessórios que se desen-

volvem imediatamente em posição caudal ao estômago. O divertículo hepático é o
tubo de endoderma que se estende do intestino anterior para dentro do mesênquima
circunjacente. O mesênquima induz o endoderma a se proliferar, ramificar e formar o
epitélio glandular do fígado. Uma porção do divertículo hepático (aquela região mais
próxima do tubo digestivo) continua a funcionar como um duto de drenagem do
fígado e um ramo desse duto produz a vesícula biliar (Figura 9.43).
O pâncreas se desenvolve da fusão dos divertículos dorsal e ventral distintos.
Ambos primórdios nascem do endoderma imediatamente caudal ao estômago, e à
medida que eles crescem se aproximam um do outro, para finalmente se fundirem. Em
seres humanos, somente o duto ventral sobrevive para transportar enzimas para o
intestino. Em outras espécies (tais como o cão), tanto o duto dorsal como o ventral
se esvaziam no intestino. Tal como outros órgão endodérmicos, o pâncreas se
Broto Estômago Duto biliar Duto

Hepático pancreático acessório
Duto
Hepático
Pâncreas Duto
dorsal Duto biliar
pancreático Duto
Vesícula Vesícula biliar Vesícula biliar Dorsal Duodeno pancreático
biliar Broto Broto ventral
Pâncreas Duodeno Duto
pancreático pancreático ventral pancreático ventral Duto
ventral dorsal pancreático principal
(A) (B) (C) (D)
Figura 9.43
Desenvolvimento pancreático em humanos. (A)
Após 30 dias, o broto pancreático ventral está
próximo aos primórdios hepáticos. (B) Aos 35
desenvolve através de interações entre o epitélio e seu mesênquima associado. dias começa a migrar posteriormente e (C) en-
Ambos tecidos têm especificidades proporcionadas por sua posição ao longo do tra em contato com o broto pancreático dorsal
eixo ântero-posterior (a ser discutido nos Capítulos 16 e 17). Se o epitélio pancreáti- durante a sexta semana do desenvolvimento.
co é cultivado num ambiente permissivo na ausência de mesênquima, ele se diferen- (D) Na maioria dos indivíduos, o broto pan-
creático dorsal perde o seu duto para o duodeno;
cia quase inteiramente em células de llhotas, secretoras de insulina e glucagon. Não
porém, em cerca de 10 porcento da população,
são produzidas estruturas acinares (secretoras de quimotripsina ou amilase) nem o sistema duplo de dutos persiste. (Segundo
dutos (Gittes et al., 1996). Isso sugere que a condição de “ausência de comando” do Langman, 1981.)
epitélio pancreático é a de produzir hormônios endócrinos e que as células secretoras
e os dutos característicos de sua função digestiva (exócrina) são resultado de suas
interações com o mesênquima. O gene pdx-1 parece fornecer ao epitélio pancreático
a capacidade de responder a seu mesênquima. Camundongos carentes desse gene
não apresentam pâncreas, embora seu epitélio seja capaz de se diferenciar em
células pré-ilhotas que sintetizam pequenas quantidades de glucagon e insulina
(Johnson et al., 1994; Ahlgren et al., 1996; Offield et al., 1996). O epitélio pancreá-
tico, portanto, pode ter capacidade endócrina autônoma, mas necessita interagir
com o mesênquima para formar células exócrinas e os dutos que transportam suas
secreções para o duodeno.
OTubo R
Tubo espiratório
Respiratório
Os pulmões também são um derivado do tubo digestivo, embora não tenham papel na
digestão. No centro do assoalho faríngeo, entre o quarto par de bolsas faríngeas, o
sulco laringotraqueal estende-se ventralmente (Figura 9.44). Esse sulco se bifurca em
seguida em dois ramos, que formam o par de brônquios e pulmões. O endoderma
laringotraqueal torna-se o revestimento da traquéia, os dois brônquios e os sacos
aéreos (alvéolos) dos pulmões. Como veremos em um próximo capítulo, a ramificação
desse tubo endodérmico depende de interações com os diferentes tipos de células
mesodérmicas ao longo de sua trajetória.
Os pulmões são uma novidade evolucionária, e estão entre os últimos órgãos do
mamífero a se diferenciar totalmente. Os pulmões têm que ser capazes de recolher
oxigênio no momento da primeira respiração do bebê. Para conseguí-lo, as células
alveolares secretam um surfactante para o fluido que banha os pulmões. Esse
surfactante, consistindo de fosfolipídios tais como a esfingomielina e a lecitina, é
secretado muito tardiamente na gestação, e usualmente atinge níveis úteis fisiologica-
mente ao redor da semana 34 da gestação humana. Esses compostos permitem às
células alveolares tocarem-se mutuamente, sem se colarem. Assim, infantes nascidos
prematuramente, freqüentemente têm dificuldade respiratória e têm que ser colocados
em respiradores até o amadurecimento de suas células produtoras de surfactante.
Figura 9.44 Intestino

Divisão do destino anterior em esôfago e anterior
divertículo respiratório durante as terceira e Faringe
quarta semanas de gestação humana. (A) Vi-
são lateral, fim da semana 3. (B,C) Visão ven-
tral, semana 4. (Segundo Langman, 1981.)
Traquéia
Brotos dos
Divertículo respiratório membros
(Sulco laringotraqueal)
Esôfago
(A) (B) (C)
Isso conclui nosso levantamento dos aspectos precoces do desenvolvimento

animal. Agora nos dedicaremos aos mecanismos que permitem a ocorrência desse
desenvolvimento. Na parte III, enfocamos os eventos moleculares que direcionam a
diferenciação celular. Na parte IV, vemos os papéis dessas moléculas na formação dos
eixos do corpo embrionário. A parte V irá discutir as forças genéticas, celulares e
ambientais que interagem durante a formação dos órgãos.
LITERATURA CITADA
Abrarnson, S., Miller, R. G. and Phillips, R. A. in chemically defined medium. J. Cell Biol. 126: Berardi, A. C., Wang, A., Levíne, J. D., Lopez,
1977. The identification in adult bone marrow 1311-1318. P. and Scadden, D. T. 1995. Functional
of pluripotent and restricted stem cells of the Barnes, G. L., Hsu, C. W., Mariani, B. D. and characterization of human hematopoietic stem
rnyeloid and lymphoid systems. J. Exp. Med. Tuan, R. S. 1997. Cloning and characterization cells. Science 267: 104-108.
145: 1567-1579.
of chicken paraxis: A regulator of somite Bischoff, R. and Holtzer, H. 1969. Mitosis and
Ahlgren, U., Jonnson, J. and Edlund, H. 1996. segmentation. Dev. Biol. In press. processes of differentiation of myogenic cells
The morphogenesis of the pancreatic mesen- in vitro. J. Cell Biol. 41: 188-200.
Baron, R., Neff, L., Louvard, D. and Courtoy,
chyme is uncoupled from that of the pancreatic P. J. 1985. Cell mediated extracellular Blair, H. C., Kahn, A. J., Crouch, E. C., Jeffrey, J.
epithelium in IPF/PDX1-deficient mice. Deve-
acidification and bone resorption: Evidence for J. and Teitelbaum, S. L. 1986. Isolated osteoclasts
lopment 122: 1409-1416.
a low pH in resorbing lacuna and localization resorb the organic and inorganic components of
Alini, M., Marriott, A., Chen, T., Abe, S. and of a 100-kD lysosornal membrane protein at bone. J. Cell Biol. 102: 1164-1172.
Poole, A. R. 1996. A novel angiogenic molecule the osteoclast ruffled border. J. Cell Biol. 101:
Bloom, W. and Fawcett, D. W. 1975. Textbook
produced at the time of chondrocyte hypertro- 2210-2222.
of Histology, 10th Ed. Saunders, Philadelphia.
phy during endochondral bone formation. Dev.
Baron, R., Neff, L., Roy, C., Boisvert, A. and
Biol. 176: 124-132. Caplan, M. 1986. Evidence for a high and Boettiger, D., Enomoto-Iwamoto, M., Yoon,
Anderson, C., Devine, W. A., Anderson, R. H., specific concentration of (Na+,K+) ATPase in H. Y., Hofer, U., Menko, A. S. and Chiquet-
Debich, D. E. and Zuberbuhler, J. R. 1990. the plasma membrane of the osteoclast. Cell Ehrismann, R. 1995. Regulation of integrin (a5bl
Abnormalities of the spleen in relation to congenital 46: 311-320. affinity during myogenic differentiation. Dev.
malformation of the heart: A survey of necropsy Biol. 169: 261-272.
Becker, A. J., McCulloch, E. A. and Till, J. E.
findings in children. Br. Heart J. 63: 122-128. 1963. Cytological demonstration of the clonal Braun, T. and Arnold, H.-H., 1996. Myf-5 and
Ash, P. J., Loutit, J. F. and Townsend, K. M. S. nature of spleen cells derived from transplanted myoD genes are activated in distinct mesenchy-
1980. Osteoclasts derived from haematopoietic mouse marrow cells. Nature 197: 452-454. mal stem cells and determine different skeletal
stem cells. Nature 283: 669-670. muscle lineages. EMBO J. 15: 310-318.
Bellido, T. and seven others. 1995. Regulation
Auerbach, R., Alby, L., Morrissey, L., Tu, M. of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone Braun, T., Rudnicki, M. A., Arnold, H.-H. and
and Joseph, J. 1985. Expression of organspecific mass by androgens: The role of the androgen Jaenisch, R. 1992. Targeted inactivation of the
antigens on capillary endothelial cells. Micro- receptor. J. Clin. Invest. 95: 2886-2895. muscle regulatory gene Myf-5 results in abnormal
vasc. Res. 29: 401-411. rib development and perinatal death. Cell 71:
Bellus, G. A. and eight others. 1995. A recurrent 369-382.
Ballock, R. T. and Reddi, A. H. 1994. Thyroxine mutation in the tyrosine kinase domain of
is the serum factor that regulates morphogenesis fibroblast growth factor receptor 3 causes Breier, G., Albrecht, U., Sterrer, S. and Risau, W.
of columnar cartilage from isolated chondrocytes hypochondroplasia. Nat. Genet. 10: 357-359. 1992. Expression of vascular endothelial growth
factor during embryonic angiogenesis and segmentation of somites. Development 121: Evans, H. M. 1909. On the earliest blood vessels
endothelial cell differentiation. Development 1533-1545. in the anterior limbs of bircís and their relation
114:521-532. Cormier, F. and Dieterlen-Lièvre, F. 1988. The to the primary subclavian artery. Am. J. Anat.
9: 281-319.
Brighton, C. T. 1984. The growth plate. Orthop. wall of the chick aorta harbours M-CFC, G-
Clin. North Am. 15: 571-594. CFC, GM-CFC and BFU-E. Development 102: Fan, C. M. and Tessier-Lavigne, M. 1994.
279-285. Patterning of mammalian somites by surface
Brighton, C. T. and Hunt, R. M. 1974. ectoderm and notochord: Evidence for sclero-
Mitochondrial calcium and its role in calcifica- Cossu, G., Kelly, R., Tajbakhsh, S., Di Donna, S.,
tome induction by a hedgehog homolog. Cell
tion. Clin. Orthop. 100: 406-416. Vivarelli, E. and Buckingham, M. 1996a.
79: 1175-1186.
Activation of different rnyogenic pathways:
Brill, G., Kahane, N., Carmeli, C., von myf-5 is induced by the neural tube and MyoD Feinberg, R. N. 1991. Vascular development in
Schack, D., Barde, Y.-A. and Kalcheim, C. by the dorsal ectoderm in mouse paraxial the embryonic limb bud. In R. N. Feinberg, G. K.
1995. Epithelial-mesenchymal conversion mesoderm. Development 122: 429-437. Sherer, and R. Auerbach (eds.), The Developrnent
of dermatome progenitors requires neural of the Vascidar Systein. Issues in Biornedicine
tube-derived signals: Characterization of the Cossu, G., Tajbakhsh, S. and Buckingham, M.
14. Karger, Basel, pp. 136-148.
role of neurotrophin-3. Development 121: 1996b. How is rnyogenesis initiated in the
2583-2594. embryo? Trends Genet. 12: 218-223. Feinberg, R. N. and Cafasso, E. 1995. Macro-
molecular permeability of chick wing microves-
Brunetti, A. and Goldfine, I. D. 1990. Role of Couly, G., Coltey, P., Eichmann, A. and
sels: An intravital study. Anat. Embryol. 191:
rnyogenin in myoblast differentiation and its LeDouarin, N. M. 1995. The angiogenic
337-342.
regulation by fibroblast growth factor. J. Biol. potentials of the cephalic mesoderm and the
Chem. 265: 5960-5963. origin of brain and head blood vessels. Mech. Fidler, I. J. and Ellis, L. M. 1994. The implications
Dev. 53: 97-112. of angiogenesis for the biology and therapy of
Burgess, R., Cserjesi, P., Ligon, K. L. and Olson, cancer metastsis. Cell 70: 185-188.
E. N. 1995. Paraxis: A basic helixlop-helix Creliri, E. S. 1961. Development of the
protein expressed in paraxial mesoderm and gastrointestinal tract. Clin. Symp. 13: 68-82. Flamme, I. and Risau, W. 1992. Induction of
developing somites. Dev. Biol. 168: 296-306. vasculogenesis and hematogenesis in vitro. De-
Cserjesi, P. and seven others. 1995. A basic helix-
velopment 116: 435-439.
Burgess, R., Rawls., Brown, D., Bradley, A. and loop-helix protein that prefigures skeletal
Olson, E. N. 1996. Requirement of the praxis formation during mouse embryogenesis. Deve- Flamme, I., von Reutern, M., Dexter, H. C. A.,
gene for somite formation and musculoskeletal lopment 121: 1099-1110. Syedali, S. and Risau, W. 1995. Overexpression
patterning. Nature 384: 570-573. of vascular endothelial growth factor in avian
David, J. D., See, W. M. and Higginbotham, C.
embryos induces hypervascularization and
Carlson, B. M. 1981. Patten’s Foundations of A. 1981. Fusion of chick embryo skeletal
increased vascular permeability without
Embryolqg,y. McGraw-Hill, New York. myoblasts: Role of calcium influx preceding
alterations of embryonic pattern formation. Dev.
membrane union. Dev. Biol. 82: 297-307.
Chen, C.-M., Kraut, N., Groudine, M. and Biol. 171: 399-414.
Weintraub, H. 1996. I-mf, a novel myogenic Davis, R. L., Weintraub, H. and Lassar, A. B.
1987. Expression of a single transfected cDNA Fong, G.-H., Rossant, J., Gertenstein, M. and
repressor, interacts with members of the MyoD Breitman, M. L. 1995. Role of the Flt-1 recep-
family. Cell 86: 731-741. converts fibroblasts into myoblasts. Cell 51:
987-1000. tor tyrosine kinase in regulating the assembly of
Chen, Q., Johnson, D. M., Haudenschild, D. R. vascular endothelium. Nature 376: 66-70.
and Goetinck, P. F. 1995. Progression and Davis, S. and ten others. 1996. Isolation of
angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, Garcia-Martinez, V. and Schoenwolf, G. C.
recpitulation of the chondrocyte differentiati- 1993. Primitive-streak origin of the cardio-
on program: Cartilage matrix protein is a by secretion trap expression cloning. Cell 87:
1161-1169. vascular system in avian embryos. Dev. Biol.
marker for cartilage maturation. Dev. Biol. 172: 159: 706-719.
293-306. DeHaan, R. 1959. Cardia bifida and the develo-
pment of pacemaker function in the early George-Weinstein, M. and nine others. 1996.
Chevallier, A., Kieny, M., Mauger, A. and Sengel, Skeletal myogenesis: The preferred pathway of
P. 1977. Developmental fate of the somitic chicken heart. Dev. Biol. 1: 586-602.
chick embryo epiblast cells in vitro. Dev. Biol.
mesoderm in the chick embryo. In D. A. Ede, J. DeHaan, R. L. 1967. Regulation of sponta- 173: 279-291.
R. Hinchliffe and M. Balls (eds.), Vertebrate Limb neous activity and growth of embryonic chick
and Somite Morphogenesis. Cambridge Univer- heart cells in tissue culture. Dev. Biol. 16: Gilbert-Barness, E. and Opitz, J. M. 1996.
sity Press, Cambridge, pp. 421-432. 216-249. Abnormal bone development: Histopatholo-
gy and skeletal dysplasias. In M. E. Martini-
Christ, B., Jacob, H. J. and Jacob, M. 1977. Ex- Deng, C., Wynshaw-Boris, A., Zhou, F., Kuo, A. Neri, G. Neri, and J. M. Opitz, (eds.), Gene
perimental analysis of the origin of the wing and Leder, P. 1996. Fibroblast growth factor Regulation and Fetal Development: March
musculature in avian embryos. Anat. Embryol. receptor-3 is a negative regulator of bone growth. of Dimes Birth Defects Fonndation Original
150: 171-186. Cell 84: 911-921. Article Series 30 (1), Wiley-Liss, NY. pp.
Chuong, C.-M., Widelitz, R. B., Jiang, T.-X., Dieterlen-Lièvre, F. and Martin, C. 1981. 103-156.
Abbott, U. K., Lee, Y.-S. and Chen, H.-M. 1993. Diffuse intraembryonic hemopoiesis in normal Girasole, G., Jilka, R. L., Passeri, G., Boswell, S.,
Roles of adhesion molecules NCAM and and chimeric avian development. Dev. Biol. Boder, G., Williams, D. C. and Manolanas, S. C.
tenascin in limb skeletogenesis: Analysis with 88: 180-191. 1992.17-Estradiol inhibits interleukin-6 produc-
antibody pertubations, exogenous gene tion by bone marrow derived stromal cells and
Dzierzak, E. and Medvinsky, A. 1995. Mouse
expression, talpid2 mutants and activin osteoblasts in vitro: A potential mechanism for
embyonic hematopoiesis. Trends Genet. 11:
stimulation. In J. F. Fallon, (ed.) Limb Develo- the antiosteoporotic effect of estrogens. J. Clin.
359-366.
pment and Regeneration. Wiley-Liss, New Invest. 89: 883-891.
York, pp. 465-474. Ede, D. A. 1983. Cellular condensations and
chondrogenesis. In B. K. Hall (ed.), Cartilage, Vo- Gittes, G., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter,
Conlon, R. A., Reaume, A. G. and Rossant, J. lume 2: Development, Differentiation, and Growth. W. J. and Debas, H. T. 1996. Lineagespecific
1995. Notchl is required for the coordinate Academic Press, New York, pp. 143-185. morphogenesis in the developing pancreas:
Role of mesenchymal factors. Development Hay, E. 1966. Regeneration. Holt, Rinehart & Knudsen, K. A. 1985. The calcium-dependent
122: 439-447. Winston, New York. rnyoblast adhesion that precedes cell fusion is
Godlin, I. E., Garcia-Porrero, J. A., Coutinho, mediated by glycoproteins. J. Cell Biol. 101:
Ho, S. Y., Cook, A., Anderson, R. H., Allan, L.
A., Dieterlen-Lièvre, F. and Marcos, M. A. R. 891-897.
D. and Fagg, N. 1991. Isomerism of the atrial
1993. Para-aortic splanchnopleura from early appendages in the fetus. Pediatr. Pathol. 11: Knudsen, K. A., McElwee, S. A. and Myers, L.
mouse embryos contain B1a cell progenitors. 589-608. 1990. A role for the neural cell adhesion
Nahire 364: 67-70. molecule, N-CAM, in myoblast interaction
Holtzer, H., Rubinstem, N., Fellini, S., Yeoh, G.,
during myogenesis. Dev. Biol. 138: 159-168.
Gordon, M. Y., Riley, G. P., Watt, S. M. and Chi, J., Birbaum, J. and Okayama, M. 1975.
Greaves, M. F. 1987. Compartmentalizati- Lineages, quantal cell cycles, and the generation Konigsberg, I. R. 1963. Clonal analysis of
on of a haematopoietic growth factor of cell diversities. Q. Rev. Biophys. 8: 523-557. myogenesis. Science 140: 1273-1284.
(GMCSF) by glycosaminoglycans in the Krantz, S. B. and Goldwasser, E. 1965. On the
Horton, W. A. 1990. The biology of bone
bone marrow microenvironment. Nature
growth. Growth Genet. Horm. 6(2): 1-3. mechanism of erythropoietin induced differen-
326: 403-405. tiation. II. The effect on RNA synthesis.
Humphries, R. K., Jacky, P. B., Dill, F. J., Eaves,
Gould, S. J. 1990. An earful of jaw. Nat. Hist. Biochim. Biophys. Acta 103: 325-332.
A. C. and Eaves, C. J. 1979. CFUs in individual
1990(3): 12-23. Kubai, L. and Auerbach, R. 1983. A new source
erythroid colonies derived in vitro from adult
Gräper, L. 1907. Untersuchungen über die mature mouse marrow. Nature 279: 718-720. of embryonic lymphocytes in the mouse. Nature
Herzbildung der Vögel. Wilhelm Roux Arch. 301: 154-156.
Hunt, P., Robertson, D., Weiss, D., Rennick, D.,
Entwicklungsmech. Org. 24: 375-410. Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R.
Lee, F. and Witte, O. N. 1987. A single bone
Halevy, O. and seven others. 1995. Correlation marrow stromal cell type supports the in vitro and Lawley, T. J. 1988. Role of laminin and
of terminal cell cycle arrest of skeletal muscle growth of early lymphoid and rnyeloid cells. basement membrane in the morphological
with induction of p21 by MyoD. Science 267: Cell 48: 997-1007. differentiation of human endothelial cells into
1018-1021. capillary-like structures. J. Cell Biol. 107:
Jacobson, A. G. 1961. Heart determination in
1589-1598.
Hall, B. K. 1988. The embryonic development the newt. J. Exp. Zool. 146: 139-152.
of bone. Am. Sci. 76: 174-181. Kurihara, N., Chenu, C., Miller, M., Civin, C.
Jackson, D., Volpert, O. V., Bouk, N. and
and Roodman, G. D. 1990. Identification of
Hall, B. K. and Miyake, T. 1995. Divide, Linzer, D. I. H. 1994. Stimulation and
accumulate, differentiate: Cell condensations in committed mononuclear precursors for osteo-
inhibition of angiogenesis by placental
skeletal development revisited. Int.J. Dev. Biol. clast-like cells in long term human marrow
proliferin and proliferin-related protein.
cultures. Endocrinology 126: 2733-2741.
39: 881-893. Science 266: 1581-1584.
Hall, B. K., van Exan, R. J. and Brunt, S. L. LaBarbera, M. 1990. Principles of design of
Jilka, R. L. and eight others. 1992. Increased os-
fluid transport systems in zoology. Science
1983. Retention of epithelial basal lamina teoclast development after estrogen loss:
allows isolated mandibular mesenchyme to 249:992-1000.
Mediation by interleukin-6. Science 257: 88-91.
form bone. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 3: Langman, J. 1981. Medical Embryology, 4th
Jonnson, J., Carlsson, L., Edlund, T., and Edlund,
253-267. Ed. Williams & Wilkins, Baltimore.
H. 1994. Insulin-promote-f actor 1 is required
Harary, I. and Farley, B. 1963. In vitro studies for pancreas development in mice. Nature 371: Larsen, W. J. 1993. Human Embryology.
on single beating rat heart cells. II. Intercellular 606-608. Churchill-Livingstone, New York.
communication. Exp. Cell Res. 29: 466-474. Johnson, R. L., Laufer, E., Riddle, R. D. and Lash, J. W. and Yamada, K. M. 1986. The
Hästbacka, J., de la Chapelle, A. and Mahtani, Tabin, C. 1994. Ectopic expression of Sonic adhesion recognition signal of fibronectin: A
M. M. 1994. The diastrophic dysplasia gene hedgehog alters dorsal-ventral patterning of possible trigger mechanism for compaction
encodes a novel sulfate transporter: Positional somites. Cell 79: 1165-1173. during somitogenesis. In R. Bellairs, D. H. Ede
cloning by fine-structure linkage disequilibrium and J. W. Lash (eds.), Somites in Developing
Jursšková V. and Tkadlecek, L. 1965. Character
mapping. Cell 78: 1073-1087. Embryos. Plenum, New York, pp. 201-208.
of primary and secondary colonies of haemato-
Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, poiesis in the spleen of irradiated mice. Nature Lassar, A. B., Paterson, B. M. and Weintraub, H.
D. G., Venuti, J. M., Olson, E. and Klein, W. H. 206: 951-952. 1986. Transfection of a DNA locus that mediates
1993. Muscle deficiency and neonatal death in the conversion of 10T1/2 fibroblasts into
Kahn, A. J. and Simmons, D. J. 1975. Investiga-
mice with a targeted mutation in the inyogenin myoblasts. Cell 47: 649-656.
tion of cell lineage in bone using a chimaera of
gene. Nature 364: 501-506. chick and quail embryonic tissue. Nature 258: Lassar, A. B., Buskin, J. N., Lockshon, D., Davis,
Hatta, K., Takagi, S., Fujisawa, H. and Takeichi, 325-327. R. L., Apone, S., Hauschka, S. D. and Weintraub.
M. 1987. Spatial and temporal expression of N- H. 1989. MyoD is a sequence-specific DNA
Kaplan, S. L. and Grumbach, M. M. 1990.
cadherin cell adhesion molecule correlated with binding protein requiring a region of myc
Pathophysiology and treatment of sexual
morphogenetic processes of chicken embryo. homology to bind to the muscle creatine kinase
precocity. 1. Clin. Endocrinol. Metab. 71: 785-
Dev. Biol. 120: 218-227. enhancer. Cell 58: 823-831.
789.
Hattersley, G., Kirby, J. A. and Chambers, T. J. Lemischka, I. R., Raulet, D. H. and Mulligan, R.
Kaushal, S., Schneider, J. W., Nadel-Ginard, B.
1991. Identification of osteoclast precursors in C. 1986. Developmental potential and dynamic
and Mahdavi, V 1994. Activation of the
multilineage hematopoietic colonies. Endocri- behavior of hematopoietic stem cells. Cell 45:
myogenie lineage by MEF2A, a factor that
nology 128: 259-262. 917-927.
induces and cooperates with MyoD. Science 266:
Hattori, M., Klatte, K. J., Teixeira, C. C. and 1236-1240. Li, Y. and sixteen others. 1995. A fibrillar
Shapiro, I. M. 1995. End labeling studies of collagen gene, Col11a1, is essential for skeJetal
Keller, G., Paige, C., Gilboa, E. and Wagner, E.
fragmented DNA in avian growth plate: Evidence morphogenesis. Cell 80: 423-430.
F. 1985. Expression of a foreign gene in myeloid
for apoptosis in terminally differentiating and lymphoid cells derived from multipotent Linask, K. K. and Lash, J. W. 1986. Precardiac
chondrocytes. J. Bone Miner. Res. 10: 1960-1968. hematopoietic precursors. Nature 318: 149-154. cell migration: Fibronectin localization at
mesoderm-endoderm interface during directional Moore, J. W., Dionne, C., Jaye, M. and Swain, J. Ordahl, C. P. and Le Douarin, N. 1992. Two
movement. Dev. Biol. 114: 87-101. 1991. The mRNAs encoding acidic FGF, basic myogenic lineages within the developing somite.
Linask, K. K. and Lash, J. W. 1988a. A role for FGF, and FGF receptor are coordinately Development 114: 339-353.
fibronectin in the migration of avian precardiac downregulated during myogenic differentiation.
Ostrovsky, D., Cheney, C. M., Seitz, A. W. and
cells I. Dose-dependent effects of fibronectin Development 111: 741-748. Lash, J. W. 1984. Fibronectin distribution during
antibody. Dev. Biol. 129: 315-323. Müller, A. M., Medvinsky, A., Strouboulis, J., somitogenesis in the chick embryo. Cell Differ.
Linask, K. K. and Lash, J. W. 1988b. A role for Grosveld, F. and Dzierzak, E. 1994. Develop- 13: 217-223.
fibronectin in the migration of avian precardiac ment of hematopoietie stem cell activity in the Packard, D. S., Jr. and Meier, S. 1983. An expe-
cells II. Rotation of the heartforming region mouse embryo. Immunity 1: 291-301.
rimental study of somitomeric organization of
during different stages and their effects. Dev. Münsterberg, A. E., Kitajewski, J., Bumcroft, D. the avian vegetal plate. Dev. Biol. 97: 191-202.
Biol. 129: 324-329. A., McMahon, A. P. and Lassar, A. B. 1995.
Pardanaud, L., Altmann, C., Kitos, P., Dieterlen-
Lyons, G. E. and Buckingham, M. E. 1992. Combinatorial signaling by sonic hedgehog and Lièvre, F. and Buck, C. 1987. Vasculogenesis in
Developmental regulation of myogenesis in the Wnt family members induce myogenic bHLH the early quail blastodisc as studied with a
mouse. Semin. Dev. Biol. 3: 243-253. gene expression in the somite. Genes Dev. 9:
monoclonal antibody recognizing endothelial
2911-2922. cells. Development 100: 339-349.
Manolagas, S. and Jilka, R. L. 1995. Bone marrow,
cytokines, and bone remodeling. N. Engl. I. Med. Murphy, M. E. and Carlson, E. C. 1978.
Pardanaud, L., Yassine, F. and Dieterlen-Lièvre,
332: 305-310. Ultrastructural study of developing extracellu- F. 1989. Relationship between vasculogenesis,
lar matrix in vitelline blood vessels of the early
Markwald, R. R., Fitzharris, T. P. and Manasek, angiogenesis, and hemopoiesis during avian
chick embryo. Am. J. Anat. 151: 345-375.
J. J. 1977. Structural development of endocardial ontogeny. Development 105: 473-485.
cushions. Am. J. Anat 148: 85-120. Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M.,
Pardanaud, L., Luon, D., Prigent, M., Bourcheix,
Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. and Nabeshima, Y. L.-M., Catala, M., and Dieterlen-Lièvre, E 1996.
Martin, C., Beaupain, D. and Dieterlen-Lièvre, 1993. Myogenin gene disruption results in
F. 1978. Developmental relationships between Two distinct endothelial lineages in ontogeny,
perinatal lethality because of severe muscle
vitelline and intraembryonic haemopoiesis one of them related to hemopoiesis. Develop-
defect. Nature 364: 532-535. ment 122: 1363-1371.
studied in avian yolk sac chimeras. Cell Differ. 7:
115-130. Nakauchi, H. and Gachelin, G. 1993. Les cellules
Park, W.-J., Bellus, G. and Jabs, E. W. 1995.
souches. La Recherche 254: 537-541. Mutations in fibroblast growth factor receptors:
Medvinsky, A. and Dzierak,E. 1996. Definitive
hematopoiesis is autonomously initiated by the Nameroff, M. and Munar, E. 1976. Inhibition Phenotypic consequences during eukaryotic de-
AGM region. Cell 86: 897-906. of cellular differentiation by phospholipase C. velopment. Am. I. Hum. Genet. 57: 748-754.
II. Separation of fusion and recognition among Patten, B. M. 1951. Early Embryo1ogy of the
Medvinsky, A. L., Samoy1ina, N. L., Müller, A. myogenie cells. Dev. Biol. 49: 288-293.
M. and Dzierzak, E. A. 1993. An early pre-liver Chick, 4th Ed. McGraw-Hill, New York.
intraembryonic source of CFU-S in the Nascone, N. and Mercola, M. 1995. An inductive Piette, J., Bessereau, J.-L., Huchet, M. and
developing mouse. Nattire 364: 64-67. role for the endoderm in Xenopus cardiogenesis.
Changeaux, J.-P. 1990. Two adjacent MyoD1-
Development 121: 515-523. binding sites regulate expression of the
Meier, S. 1979. Development of the chick
mesoblast: Formation of the embryonic axis and Ni1sson, A., Isgaard, J., Lindahl, A., Dahlström, acetylcholine receptor a-subunit gene. Nature
the establishment of the metameric pattern. Dev. A., Skottner, A. and lsaksson, O. G. P. 1986. 345: 353-355.
Biol. 73: 25-45. Regulation by growth hormone of number of
Porcher, C., Swat, W., Rockwell, K., Fujiwara, Y.,
chondrocytes containing IGFI in rat growth
Mencken, H. L. 1919. Exeunt omnes. Smart Set Alt, F. W. and Orkin, S. H. 1996. The T cell leukemia
plate. Science 233: 571-574. oncoprotein SCL/tal-1 is essential for development
60: l38-l45.
Oberlender, S. A. and Tuan, R. S. 1994. of all hematopoietic lineages. Cell 86: 47-57.
Menko, A. S. and Boettiger, D. 1987. Occupation Expression and functional involvement of N-
of the extracellular matrix integrin is a control point Pourquié, O. and nine others. 1996. Lateral and
cadherin in embryonic limb chondrogenesis.
for myogenic differentiation. Cell 51: 51-57. axial signals involved in somite patterning: A
Development 120: 177-187. role for BMP4. Cell 84: 461-471.
Merimee, T. J., Zapf, J., Hewlett, B. and Cavalli- Offield, M. F. and seven others. 1996. PDX1 is
Sforza, L. L. 1987. Insulin-like growth factors Potten, C. S. and Loeffler, M. 1990. Stem cells:
required for pancreatic outgrowth and differen- attributes, spirals, pitfalls, and uncertainties.
in pygmies. The role of puberty in determining tiation of the rostral duodenum. Development
final stature. N. EngI. J. Med. 316: 906-911. Lessons for and from the Crypt. Development
122: 983-995.
110: 1001-1020.
Millauer, B., Wizigmann-Voos, Schnürch, H., Okuda, T., van Deursen, J., Hiebert, S. W.,
Martinez, R., Müller, N. P. H., Risau, W and Potts, J. D., Dagle, J. M., Walder, J. A., Weeks,
Grosveld, G. and Downing, J. R. 1996. AML, the
Ullrich, A. 1993. High-affinity VEGF binding D. L. and Runyon, R. B. 1991. Epithelial-me-
target of multiple chromosomal translocations senchymal transformation of embryonic cardiac
and developmental expression suggest flk-l as a in human leukemia, is essential for normal fetal
major regulator of vasculogenesis and angioge- endothelial cells is inhibited by a modified
liver hematopoiesis. Cell 84: 321-330.
nesis. Cell 72: 835-846. antisense oligodeoxynucleotide to transforming
Olwin, B. B. and Hauschka, S. D. 1988. Cell growth factor b3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Miller, S. A., Bresee, K. L., Michaelson, C. L. surface fibroblast growth factor and epidermal 88: 1516-1520.
and Tyrell, D. A. 1994. Domains of differential growth factor receptors are permanently lost
cell proliferation and formation of amnion folds Pownall, M. E. and Emerson, C. E., Jr. 1992a.
during skeletal muscle terminal differentiation
in chick embryo ectoderm. Anat. Rec. 238: Sequential activation of three myogenic
in culture. J. Cell Biol. 107: 761-769.
225-236. regulatory genes during somite morphogenesis
Ordahl, C. P. 1993. Myogenic lineages within in quails. Dev. Biol. 151: 67-79.
Mintz, B. and Baker, W. W. 1967. Normal the developing somite. In M. Bernfield (ed.),
mammalian muscle differentiation and gene Pownall, M. E. and Emerson, C. E., Jr. 1992b.
Molecular Basis of Morphogenesis. Wiley-Liss, Molecular and embryological studies of avian
control of isocitrate dehydrogenase synthesis. New York, pp. 165-170.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58: 592-598. myogenesis. Semin. Dev. Biol. 3: 229-241.
Pownall, M. E., Strunk, K. E. and Emerson, C. E. jr. receptor gene in a man. N. Engl. J. Med. 331: Vaidya, T. B., Rhodes, S. J., Taparowsky, E. J.
1996. Notochord signal controls the transcriptional 1056-1061. and Konieczny, S. F. 1989. Fibroblast growth
cascade of myogenic bHLH genes in somites of factor and transforming growth factor-b repress
Spemann, H. 1938. Embryonic Development and
quail embryos. Developmetit 122: 1475-1488. transcription of the myogenic regulatory gene
Induction, Yale University Press, New Haven.
Ribatti, D., Urbinati, C., Nico, B., Rusnati, M., MyoD1. Mol. Cell Biol. 9: 3576-3579.
Spicer, D. B., Rhee, J., Cheung, W. L. and Lassar,
Roncali, L. and Presta, M. 1995. Endogenous basic Venuti, J. M., Morris, J. H., Vivian, J. L., Olson,
A. B. 1996. Inhibition of myogenic bHLH and
fibroblast growth factor is implicated in the E. N. and Klein, W. H. 1995. Myogenesis is
MEF2 transcription factors by the bHLH protein
vascularization of the chick embryo chorioallantoic required for late but not early aspects of
Twist. Science 272: 1476-1480.
membrane. Dev. Biol. 170: 39-49. myogenesis during mouse development. J. Cell
Stern, H. M., Brown, A. M. C. and Hauschka, S. Biol. 128: 563-576.
Robb, L., Elwood, N. J., Elefanty, A. G. Köntgen, D. 1995. Myogenesis in paraxial mesoderm:
F., Li, R., Barnett, L. D. and Begley, C. G. 1996. Vikkula, M. and eleven others. 1996. Vascular
preferential induction by dorsal neural tube and
The scl gene product is required for the dysmorphogenesis caused by an activating
by cells expressing Wnt-1. Development 121:
generation of all hematopoietic lineages in the mutation in the receptor tyrosine kinase TIE2
3675-3686.
adult mouse. EMBO J. 15: 4123-4129. Cell 87:1181-1190.
Sugi, Y. and Lough, J. 1994. Anterior endoderm
Roberts, R., Gallagher, J., Spooncer, E., Allen, Webster, M. K. and Donoghue, D. J. 1996.
is a specific effector of terminal cardiac myocyte
T. D., Bloomifield, F. and Dexter, T. M. 1988. Constitutive activation of fibroblast growth
differentiation of cells from the embryonic heart
Heparan sulphate-bound growth factors: A factor receptor 3 by the transmembrane domain
forming region. Dev. Dyn. 200: 155-162.
mechanism for stromal cell mediated haemo- point mutation found in achondroplasia. EMBO
poiesis. Nature 332: 376-378. Suri, C. and seven others. 1996. Requisite role J. 15: 520-527.
of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 recep-
Rudnicki, M. A., Braun, T., Hinuma, S. and Weintraub, H., Tapscott, S. J., Davis, R. L.,
tor, during embryonic angiogenesis. Cell 87:
Jaenisch, R. 1992. Inactivation of MyoD in mice Thayer, M. J., Adam, M. A., Lassar, A. B. and
1171-1180.
leads to up-regulation of the myogenic HLH Miller, D. 1989. Activation of muscle-specific
gene Myf-5 and results in apparently normal Syftestad, G. T. and Caplan, A. I. 1984. A fraction genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast
muscle development. Cell 71: 383-390. from extracts of demineralized adult bone cell lines by forced expression of MyoD. Proc.
stimulates conversion of mesenchymal cells into Natl. Acad. Sci. USA 86: 5434-5438.
Rudnicki, M. A., Schnegelsberg, P. N. J., Stead, chondrocytes. Dev. Biol. 104: 348-356.
R. H., Braun, T., Arnold, H.-H. and Jaenisch, R. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg,
1993. MyoD or Myf-5 is required in a Tavormina, P. L. and nine others. 1995. C. and Weissman, I. L. 1987. Bone marrow
functionally redundant manner for the formation Thanatophoric dysplasia (types I and II) caused stromal cell lines with lymphopoietic activity
of skeletal muscle. Cell 75: 1351-1359. by distinct mutations in fibroblast growth factor express high levels of a pre-B neoplasia-
receptor 3. Nat. Genet. 9: 321-328. associated molecule. Cell 48: 1009-1021.
Rugh, R. 1951. The Frog: Its Reproduction and
Development. Blakiston, Philadelphia. Thayer, M. J., Tapscott, S. J., Davis, R. L., Wilkie, A. O. M., Morriss-Kay, G. M., Jones, E.
Wright, W E., Lassar, A. B. and Weintraub, H. Y. and Heath, J. K. 1995. Functions of fibroblast
Sariola, H. 1985. Interspecies chimeras: An ex- 1989. Positive autoregulation of the myogenic growth factors and their receptors. Curr. Biol. 5:
perimental approach for studies on embryonic determination gene MyoD1. Cell 58: 241-248. 500-507.
angiogenesis. Med. Biol. 6: 43-65.
Till, J. E. 1981. Cellular diversity in the blood- Wilson, D. 1983. The origin of the endothelium
Schultheiss, T. M., Xyclas, S. and Lassar, A. B. forming system. Am. Sci. 69: 522-527. in the developing marginal vein of the chick
1995. Induction of avian cardiac inyogenesis wing bud. Cell Differ. 13: 63-67.
Till, J. E. and McCulloch, E. A. 1961. A direct
by anterior endoderm. Developmeiit 121:
measurement of the radiation sensitivity of nor- Wolf, N. S. and Trentin, J. J. 1968. Hernopoietic
4203-4214.
mal mouse bone marrow cells. Radiat. Res. 14: colony studies. V. Effect of hemopoietic organ
Shainberg, A., Yagil, G. and Yaffe, D. 1969. 213-222. stroma on differentiation of pluripotent stem
Control of myogenesis in vitro by Ca2+ cells. J. Exp. Med. 127: 205-214.
Tsuda, T., Philp, N., Zile, M. H. and Linask, K.
concentration in nutritional medium. Exp. Cell
K. 1996. Left-right asymmetric localization of Wright, E. and eight others. 1995. te Sry-related
Res. 58: 163-167.
flectin in the extracellular matrix during heart gene Sox9 is expressed Juring chondrogenesis in
Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., looping. Dev. Biol. 173: 39-50. mouse embryos. Nat. Genet. 9: 15-20.
Gertenstein, M., Wu, X.-F., Breitman, M. L.
Tuan, R. 1987. Mechanisms and regulation of Wuthier, R. 1982. A review of the primary
and Schuh, A. C. 1995. Failure of blood-island
calcium transport by the chick embryonic mechanism of endochondral ossification with
formation and vasculogenesis in flk-1deficient
chorioallantoic membrane. J. Exp. Zool. special emphasis on the role of cells, mitochon-
mice. Nature 376: 62-66
[Suppl.] 1: 1-13. dria, and matrix vesicles. Clin. Orthop. Rel. Res.
Shapiro, L, DeBolt, K., Funanage, V., Smith, S. 169: 219-242.
Tuan, R. S. and Lynch, M. H. 1983. Effect of
and Tuan, R. 1992. Developmental regulation
experimentally induced calcium deficiency on Yaffe, D. and Feldman, M. 1965. The formation
of creatine kinase activity in cells of the
the developmental expression of collagen types of hybrid multinucleated muscle fibres from
epiphyseal growth plate. J. Bone Miner. Res. 7:
in chick embryonic skeleton. Dev. Biol. 100: myoblasts of different genetic origin. Dev. Biol.
493-500.
374-386. 11: 300-317.
Smith, C. A. and Tuan, R. S. 1996. Functional
Tyler, M. S. and Hall, B. K. 1977. Epithelial Yagami-Hiromasa, T., Sato, T., Kurisaki, T.,
involvement of Pax-1 in somite development:
influence on skeletogenesis in the mandible of Karnijo, K., Nabeshima, Y.-l. and Fujisawa-
Somite dysmorphogenesis in chick embryos
the embryonic chick. Anat. Rec. 206: 61-70. Sehara, A. 1995. A metalloprotease-disintegrin
treated with pax-1 paired-box antisense
participating in myoblast fusion. Nature 377:
oligonucleotide. Teratology 52: 333-345. Urist, M. R. and eight others. 1984. Purfication
652-656.
of bovine bone morphogenetic protein by
Smith, E. P. and eight others. 1994. Estrogen
hydroxyapatite chromatography. Proc. Natl.
resistance caused by a mutation in the estrogen-
Acad. Sci. USA 81: 371-375.
Mecanismo da
Diferenciação Celular
10 Regulação transcricional da expressão gênica: Fatores de transcrição
e a ativação de promotores específicos 391
III
11 Regulação transcricional da expressão gênica: A ativação da cromatina 431
12 Controle do desenvolvimento pelo processamento e tradução

diferencial do RNA 461
Regulação transcricional
da expressão gênica: Fatores de transcrição
e a ativação de promotores específicos
10
Quaisquer que sejam as operações imedia-
tas dos genes, elas certamente pertencem à
categoria de processos do desenvolvimento
e, portanto, se enquadram no espaço da em-
briologia. Esse problema central da biolo-
D DIFERENTES TIPOS DE CÉLULAS produzem diferentes conjuntos de prote-
ínas, mesmo que seus genomas sejam idênticos. Cada ser humano tem apro-
ximadamente 150.000 genes em cada núcleo, mas cada célula usa somente
um pequeno subgrupo desses genes. Além disso, diferentes tipos de células usam
diferentes subgrupos de genes. As células vermelhas do sangue produzem globinas,
gia básica está sendo, atualmente, tratado as células do cristalino produzem cristalinas, as células nervosas produzem
sob vários aspectos, tanto por fisiologistas neurotransmissores e as glândulas endócrinas produzem seus hormônios específicos.
como bioquímicos e por geneticistas; mas é
Genética do desenvolvimento é a disciplina que examina como o genótipo se transfor-
essencialmente um problema embriológico.
ma no fenótipo, e o paradigma principal da genética do desenvolvimento é a expres-
C. H. WADDINGTON (1956)
são gênica diferencial a partir do mesmo repertório nuclear. A regulação da expres-
Entramos na célula, a mansão onde nasce- são gênica pode ser realizada em vários níveis:
mos e estamos começando o inventário da
riqueza que adquirimos. • Transcrição gênica diferencial, regulando quais dos genes nucleares são trans-
ALBERT CLAUDE (1974) critos em RNA
• Processamento seletivo do RNA nuclear, regulando quais dos RNAs transcri-
tos passarão para o citoplasma tornando-se RNAs mensageiros
• Tradução seletiva de RNA mensageiro, regulando quais dos RNAs mensagei-
ros no citoplasma serão traduzidos em proteína
• Modificação protéica diferencial, regulando quais proteínas permanecerão ou
funcionarão na célula
Alguns genes (tais como aqueles codificando as proteínas globina da hemoglo-

bina) são regulados em cada um desses níveis. Neste e no próximo Capítulo serão
discutidos os mecanismos da transcricão gênica diferencial: como genes diferentes
são ativados em diferentes tipos de células em tempos determinados. Os fenômenos
básicos da transcrição diferencial de genes foram discutidos no Capítulo 2. Os tufos
de cromossomos politênicos representam a ativação de grupos de genes em respos-
ta a um hormônio produzido na larva do inseto. Analogamente, a expressão de genes
específicos do endoderma na larva do ouriço-do-mar foi controlada ao nível da
transcrição do gene. Nestes Capítulos, discutiremos os mecanismos pelos quais
diferentes genes podem ser ativados ou reprimidos em células específicas enquanto
elas se diferenciam.
391
392 PARTE III Mecanismo da Diferenciação Celular
Éxons e Íntrons
Quando genes são observados, a primeira coisa que se torna aparente é que a maioria
dos genes de eucariotos não se parecem à maioria dos genes procariotos. Genes
eucariotos não são colineares com seus produtos peptídicos. Ao contrário, os termi-
nais 3' e 5' do mRNA eucarioto se originam de regiões não-contíguas no cromossomo.
Entre as regiões de codificação de proteínas no DNA-éxons- estão seqüências inter-
caladas-íntrons- que não têm relação com a seqüência de aminoácidos da proteína.*
A estrutura do gene da ß-globina humana está ilustrada na Figura 10.1. Esse gene
consiste dos seguintes elementos:
1. Uma região promotora responsável pela ligação da RNA polimerase e subse-

qüente iniciação da transcrição. Essa região promotora do gene da ß-globina
humana tem três unidades distintas e se estende de 95 a 26 pares de base
antes (“a montante de”) do sítio de iniciação da transcrição (isto é, de -95 a -
26).
2. A seqüência ACATTTG, onde a transcrição se inicia. Essa é freqüentemente
chamada seqüência de capeamento (“cap”) porque representa o terminal 5' do
RNA, que receberá um “capeamento” de nucleotídeos modificados logo após
sua transcrição. A seqüência específica do capeamento varia entre os genes.
3. O códon ATG para o início da tradução. Esse códon está localizado 50 pares
de base depois do ponto de iniciação da transcrição (apesar dessa distância
variar muito em genes diferentes). A seqüência interposta de 50 pares de
nucleotídeos entre os pontos de iniciação da trancrição e a tradução é chama-
da seqüência líder. A seqüência líder pode determinar a velocidade de inicia-
ção da tradução.
4. O primeiro éxon contendo 90 pares de bases codificando para os aminoácidos
1-30 da ß-globina humana.
5. Um íntron contendo 130 pares de bases sem seqüências codificadoras para a
globina. A estrutura desse íntron é importante para permitir que o RNA seja
processado a RNA mensageiro e saia do núcleo.
6. Um éxon contendo 222 pares de bases codificando para os aminoácidos 31- 104.
7. Um grande íntron- 850 pares de bases- sem relação com a estrutura da proteí-
na globina.
8. Um éxon contendo 126 pares de bases codificando para os aminoácidos 105- 146.
9. Um códon de terminação da tradução, TAA.
10. Uma região 3' não-traduzida que, apesar de transcrita, não é traduzida em
proteína. Essa região inclui a seqüência AATAAA, a qual é necessária para
colocar uma “cauda” de cerca de 200 a 300 resíduos adenilados no transcrito
de RNA. Essa cauda de poli(A) confere estabilidade e traduzibilidade ao mRNA,
e é inserida no RNA cerca de 20 bases a jusante da seqüência AAUAAA.
Entretanto, a transcrição continua além do sítio AATAAA por ainda 1000
nucleotídeos aproximadamente, antes de ser terminada. Dentro da seqüência
3' transcrita mas não traduzida (mais ou menos 600 a 900 pares de bases do
sítio AATAAA) está uma seqüência de DNA que serve como um intensifica-
dor. Essa seqüência é necessária para a expressão temporal e específica de
tecido do gene da ß-globina em precursores das células vermelhas do sangue
de adulto (Trudel e Constantin, 1987).
* O termo éxon tem dois significados sobrepostos. No sentido original, isso é definido
anatomicamente como uma seqüência nucleotídica cujo RNA “sai” do núcleo. O termo tomou
também a definição funcional de uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína. Para
discussão aqui, usaremos a primeira definição e definiremos as seqüências líderes e as seqüências 3'
não traduzidas como éxons não traduzidos. Alguns genes eucariotos (como os genes de histonas) não
têm seqüências interpostas, e qualquer hipótese sobre funções de íntrons deve considerar essas
exceções. Por convenção, direções a montante, a jusante, 5' e 3' são específicas em relação ao RNA.
Assim, o promotor está a montante do gene, perto de seu terminal 5'.
CAPÍTULO 10 Fatores de transcrição e promotores específicos 393
(A) Sítio de iniciação Sítio de iniciação da Sítio de terminação Sítio de adição

da transcrição tradução de Aminoácido (aa) 1 da tradução de poli(A)
(capeamento)
Região do promotor
Sítio terminal
da transcrição
Elementos
promotores a
montante Líder (Região não traduzida 5’) Região não traduzida 3’
TATA
Box
Figura 10.1
(B) Seqüência nucleotídica do gene da β-globina
humana. (A) Representação esquemática da
localização da região do promotor, sítio de
iniciação da transcrição (capeamento), se-
qüência líder, éxons e íntrons do gene da β-
globina. Éxons estão coloridos; os números
que os ladeiam, indicam a posição dos ami-
noácidos que codificam na β-globina. (B) A
seqüência nucleotídica do gene da β-globina,
mostrada do terminal 5’ ao terminal 3’ do
RNA. As seqüências promotoras estão en-
quadradas, como também estão os códigos de
início de tradução e terminação, ATG e TAA.
As letras maiúsculas grandes enquadradas em
cores correspondem a éxons, e os aminoáci-
dos para os quais codificam estão abreviadas
acima dos quadros. As letras maiúsculas pe-
quenas são as bases das seqüências interpos-
tas. Os códons representados por letras mai-
úsculas após o término da tradução estão no
mRNA da globina mas não são traduzidas em
proteínas. Dentro desse grupo está a seqüên-
cia considerada necessária para a poliadenila-
ção. Um G no primeiro íntron (seta) é mutado
para um A em uma forma de β+-talassemia.
(Seqüência de Lawn et al., 1980.)
O RNA nuclear original transcrito para tal gene contém a seqüência do capeamento, a
seqüência líder, os éxons, os íntrons e a região 3' não traduzida (Figura 10.2). Em
adição, ambos terminais se modificam. Um capeamento consistindo de guanosina
metilada é colocado no terminal 5' do RNA em polaridade oposta ao próprio RNA.
Assim, enquanto todas as bases no precursor da mensagem estão ligadas 5’a 3', a
ATG: AATAAA:
Iniciação da códon iniciador seqüência de
Região promotora transcrição da tradução TAA: códon adição de poli(A)
terminador da Seqüência
(ligação da RNA
tradução terminadora da
polimerase)
transcrição
GENE (DNA) PARA

Líder β-GLOBINA
Seqüência
ATA
Transcrição Sítio de adição de poli(A)
RNA NUCLEAR
(capeamento) “Cauda”
Processamento
RNA MENSAGEIRO
Líder “Cauda”
Tradução
PROTEÍNA β-GLOBINA
Modificação pós-tradução
Figura 10.2
Sumário das etapas envolvidas na produção
da β-globina e hemoglobina.
HEMOGLOBINA
estrutura do capeamento está ligada 5' a 5'. Isso significa que não há grupo fosfato 5'
livre no RNA nuclear (Figura 10.3). Moléculas de RNA mensageiro estão igualmente
“capeadas”, apesar de não se ter certeza se o capeamento do mRNA é o original
recebido no núcleo. O capeamento 5' é necessário para a ligação do mRNA ao ribossomo
e para a subseqüente tradução (Shatkin, 1976).
O terminal 3' é usualmente modificado no núcleo pela adição de uma cauda de
cerca de 200 resíduos adenilados. Esses resíduos de ácido adenílico são ligados
enzimaticamente e adicionados ao transcrito. Eles não são parte da seqüência do
gene. Ambas as modificações 3' e 5' podem proteger o RNA das exonucleases
(Sheiness e Darnell, 1973; Gedamu e Dixon, 1978), assim estabilizando a mensa-
gem e seu precursor.
Estrutura e função do promotor

Além da estrutura do gene que acabamos de discutir, existem seqüências reguladoras
que podem estar em um ou outro terminal do gene (ou mesmo dentro dele). Essas seqüências,
ANTES DO CAPEAMENTO
Terminal 5’ da molécula
APÓS O CAPEAMENTO
7-metil guanosina
Direção da tradução
Direção da
tradução
Figura 10.3 Terminal 3’

Capeamento do terminal 5’ de um mRNA eucariótico. Um da molécula
capeamento de 7-metil-guanilato é ligado 5’ a 5’ com a primeira
base do mRNA recentemente transcrito. O terminal 5’ original
do mRNA tinha três grupos fosfato. O mecanismo de
capeamento une o GTP com o terminal, usando um grupo fosfato
de GTP e dois grupos fosfato do mRNA. Em seguida, uma
enzima metila a guanosina na posição 7; a primeira e a segunda Terminal 3’
bases de mRNA original são, com certa freqüência, também da molécula
metiladas. (De acordo com Rottman et al., 1974.)
os promotores e intensificadores (introduzidas no Capítulo 2), são necessárias para

controlar onde e quando um determinado gene é transcrito.
Dois tipos de elementos reguladores são necessários para efetuar a transcrição nos
sítios adequados. O primeiro conjunto de elementos reguladores é chamado de cis-
reguladores. Esses representam seqüências específicas de DNA em um dado cromos-
somo. Cis-reguladores agem somente em genes adjacentes. O segundo grupo de
elementos reguladores é chamado trans-reguladores. Esses são moléculas solúveis
(incluindo proteínas e RNAs) que são produzidas por um gene e interagem com genes
no mesmo ou em diferentes cromossomos. Relembrando a indução gênica no operon
lac de E.coli, foi visto que um gene repressor produz uma proteína repressora que
interage com a seqüência operadora dos genes do operon lac. Nesse caso, o DNA
operador é um elemento cis-regulador porque controla somente o operon lac adjacen-
te no seu próprio cromossomo. A proteína repressora, entretanto, é um trans regula-
dor porque ele pode ser produzido por um cromossomo e se ligar ao operador cis-
regulador em outro cromossomo.
Em genes eucariotos que codificam RNA mensageiro, foram descobertos dois
tipos de seqüências de DNA cis-reguladoras que influenciam tais genes serem trans-
critos em tais células. Esses são os promotores e os intensificadores. Promotores,
tipicamente estão localizados imediatamente a montante do sítio onde se inicia a
transcrição e geralmente têm centenas de pares de bases na sua cadeia. Eles são
necessários para a ligação da RNA polimerase II e para a exata iniciação da transcri-
ção. RNA polimerases de eucariotos requerem fatores protéicos adicionais para a
ligação eficiente ao promotor. O intensificador é uma seqüência de DNA que pode
ativar a utilização do promotor, controlando a velocidade e eficiência de transcrição
daquele promotor específico. Intensificadores só podem ativar promotores ligados
aos cis (ou seja, promotores no mesmo cromossomo), mas podem fazê-lo a grandes
distâncias (algumas tão grandes como 50 quilobases além do promotor). Além disso,
intensificadores não precisam estar no lado 5' (a montante) do gene. Eles podem
estar no lado 3', nos íntrons, ou mesmo na fita de DNA complementar (Maniatis et
al., 1987). Como o promotor, os intensificadores funcionam ligando proteínas espe-
cíficas trans-reguladoras chamadas fatores de transcrição.
Um tipo de intensificador é um “intensificador negativo”, também chamado
silenciador. Quando fatores de transcrição se ligam a silenciadores, eles reprimem a
transcrição dos promotores ligados aos cis. Algumas seqüências podem agir como
intensificadores positivos em certas células e como negativos em outras, dependendo
de outros fatores de transcrição presentes na célula.
Estrutura do promotor
Promotores de genes que transcrevem quantidades relativamente grandes de mRNA

têm estruturas similares. Eles têm uma seqüência TATA (algumas vezes chamada TATA
box ou Goldberg-Hogness box) cerca de 30 pares de base a montante do sítio onde
se inicia a transcrição, bem como um ou mais elementos promotores ainda mais a
montante (Figura 10.4; Grosschedl e Birnstiel, 1980; McKnight e Tjian, 1986). A
“anatomia funcional” de uma região promotora pode ser analisada determinando-se
quais de suas bases são necessárias para uma transcrição eficiente. Genes clonados
podem ser precisamente transcritos quando colocados nos núcleos de oócitos de rã ou
de fibroblastos ou quando incubados com RNA polimerase na presença de nucleotíde-
os e extratos nucleares (Wasylyk et al., 1980). Depois que a transcrição de um gene é
confirmada, usa-se enzimas de restrição para fazer deleções específicas no gene ou em
regiões vizinhas. Pode-se observar se um gene assim modificado ainda será transcrito
precisamente. Tais estudos nos genes da ß-globina (Grosveld et al., 1982; Dierks et
al.,1983) mostraram que os primeiros 109 pares de bases precedendo o sítio do
capeamento eram suficientes para a correta iniciação da transcrição do gene da ß-
globina pela RNA polimerase.
Myers e colaboradores (1986) melhoraram essa análise clonando a região de um
gene de ß-globina de camundongo, desde 106 pares de bases a montante do começo da
transcrição (-106) até os primeiros 475 pares de bases (+ 475) do primeiro éxon. Esses
clones foram submetidos a mutagênese in vitro (onde mutações específicas podem ser
colocadas em um gene clonado). Dessa maneira, 130 substituições de base única dife-
rentes foram introduzidas na região do promotor do gene da globina. Esses genes
Elementos clonados foram colocados em plasmídeos contendo um intensificador de um gene nor-
promotores a TATA Iniciação de malmente expresso em todos os tecidos. Os plasmídeos recombinantes foram em segui-
montante box mRNA da introduzidos por transfecção em células cultivadas que normalmente não produzem
globina. Deveriam essas células transcreverem uma mensagem de globina truncada (475
bases) a partir dos clones? A Figura 10.5 mostra os resultados. Na maioria dos casos,
mutando uma base na região flanqueando o terminal 5' não afetou a eficência da transcri-
ção do gene da globina. Entretanto, as mutações reduziram drasticamente as transcri-
ções em três agrupamentos de nucleotídeos. Um agrupamento foi na seqüência TATA,
outro no elemento promotor a montante, CAAT, e um terceiro foi na região CACCC,
aproximadamente 95 a 87 pares de bases a montante do sítio de capeamento.
As seqüências CAAT e TATA foram consideradas elementos críticos em nume-
rosos promotores eucariotos (Efstratiadis et al., 1980), mas a seqüência CACCC é
raramente encontrada a não ser nos promotores do gene da ß-globina em várias
Figura 10.4 espécies. Em humanos, essa seqüência parece ser crítica. Uma mutação natural nes-
Região promotora típica de um gene eucarioto sa seqüência causa a perda total da transcrição do gene da ß-globina (Orkin e
codificando uma proteína. O gene no diagrama Kazazian, 1984), e essa seqüência é reconhecida por um fator de transcrição especí-
contém uma seqüência TATA de elementos
fico de eritrócitos (Mantovani et al., 1988). Duas mutações, nas posições -78 e -79,
promotores a montante. Exemplos de alguns
desses elementos a montante estão ilustrados realmente aumentaram a transcrição a um nível três vezes maior que o tipo selvagem.
abaixo do diagrama. (De acordo com Maniatis Considera-se que essas modificações facilitam a interação do promotor com as pro-
et al., 1987.) teínas trans-reguladoras.
Figura 10.5
Nível relativo de transcrição
O efeito de mutações pontuais específicas no

promotor da β-globina do camundongo na ha-
bilidade do promotor de iniciar a transcrição.
Cada linha representa o nível de transcrição
de um promotor mutante relativo ao nível de
transcrição de um promotor da globina do
tipo selvagem testado simultaneamente. Os
pontos escuros representam nucleotídeos
para os quais não foram produzidas muta-
ções. O diagrama abaixo do histograma mos-
Posição tra a posição da seqüência TATA e os dois
elementos promotores a montante no gene da
Sítio do β-globina do camundongo. (De acordo com
capeamento
Myers et al., 1986.)
Função do promotor
Promotores podem funcionar não somente na ligação da RNA polimerase, mas tam-
bém na especificação do lugar e tempo que a transcrição pode ocorrer daquele gene.
Essa função dos promotores pode ser claramente demonstrada em certos animais
transgênicos. Aqui, um novo gene é construído, onde o promotor normal de um deter-
minado gene é substituído pelo promotor de algum outro gene, e o gene fundido é
colocado no pronúcleo de um zigoto de mamífero. Palmiter e colaboradores (1982)
isolaram o gene do hormônio de crescimento do rato e deletaram sua região promoto-
ra 5'. Nesse espaço, eles substituíram a seqüência promotora de outro gene-Mt-1 por Figura 10.6
metalotioneína 1 de camundongo, uma pequena proteína envolvida na regulação dos Função do promotor vista em camundongos
níveis de zinco no soro. O gene híbrido está ilustrado na Figura10.6A. O gene Mt-1 transgênicos. (A) Plasmídeo recombinante
pode ser induzido pela presença de metais pesados tais como zinco e cádmio, e as contendo o gene estrutural do hormônio de
seqüências responsáveis por essa indução estão no promotor desse gene. Fundindo crescimento do rato, a região reguladora da
metalotioneína do camundongo e o plasmídeo
essa região do promotor de metalotioneína ao gene do hormônio de crescimento do
bacteriano pBR322. O plasmídeo, pMGH, foi
injetado nos oócitos do camundongo. Os
seqüência ladeando 5’ de Mt-1 enquadramentos escuros no plasmídeo inje-
(A) tado correspondem aos éxons do gene GH. A
seqüência ladeando 5’ de GH direção da transcrição é indicada por uma seta.
Seqüências reguladoras do Mt-1 não transcrito Gene GH do rato (B) Um camundongo derivado dos ovos inje-
tados com pMGH (esquerda) e um membro
normal da ninhada (direita). (de Palmiter et
al., 1982; fotografia cortesia de R. L. Brinster.)
Seqüências reguladoras do Mt-1 do camundongo
Gene GH do rato
rato (rGH), esse é colocado sob o controle do promotor da metalotioneína. Nesse

caso, a mensagem para o hormônio de crescimento do rato deve ser concretizada
quando o promotor de Mt-1 for ativado pela presença do zinco ou cádmio.
Um plasmídeo contendo esse gene fundido foi cultivado em bactérias (veja Capí-
tulo 2), o pedaço Mt-1/rGH foi isolado, e cerca de 600 cópias desse fragmento foram
injetadas nos pronúcleos de ovos de camundongos recentemente fertilizados.
Hibridização de DNA mostrou que muitos desses camundongos recém-nascidos havi-
am incorporado, em seus cromossomos, numerosas cópias do gene do hormônio de
crescimento do rato. Esses animais transgênicos foram então alimentados com uma
dieta com suplemento de zinco. Os fígados desses camundongos foram induzidos pelo
zinco a secretar grandes quantidades de hormônio de crescimento do rato. (O fígado
é o local onde usualmente é produzida a metalotioneína, ao passo que o hormônio de
Figura 10.7 crescimento é secretado pela glândula pituitária.) A quantidade de hormônio de cres-
Função do promotor vista em carneiros trans- cimento secretado foi correlacionada com o tamanho desses camundongos. Os ca-
gênicos. O gene estrutural para uma proteína mundongos transgênicos se tornaram enormes, até 80% maiores do que os membros
de importância farmacêutica como a α1- normais da ninhada (Figura 10.6B).* O promotor da metalotioneína regulou a síntese
antitripsina ou peptídeos do fator de coagu-
do hormônio de crescimento nesses camundongos transgênicos.
lação são ligados ao promotor para a β-
lactalbumina (ou caseína) do leite de carnei- Atualmente, essa estratégia está sendo utilizada por indústrias farmacêuticas para
ro. O gene recombinante é injetado no pronú- produzir grandes quantidades de produtos protéicos tais como hormônios peptídicos,
cleo de um ovo de carneiro recentemente fer- α1-antitripsina (usada por pacientes com enfisema) e fatores de coagulação do san-
tilizado, e o ovo é implantado no útero de gue. Pronúcleos de vacas, carneiros e cabras foram injetados com DNA recombinante
uma mãe adotiva. Os carneiros recém-nasci- contendo a seqüência do gene da proteína desejada, fundida aos promotores dos genes
dos são analisados (por PCR ou transferên- para caseína, lactalbumina, ou β-lactoglobulina (três principais proteínas do leite).
cia Southern) para verificar a presença do Vacas em lactação sintetizam enormes quantidades de proteínas do leite, e a maior
transgene. Quando os carneiros transgênicos parte dessa produção é regulada pela transcrição de novas mensagens. A esperança é
fêmeas maturam, o transgene deveria ser ati-
que os animais ao transcreverem os genes para a caseína ou lactalbumina (em resposta
vado na glândula mamária e a proteína
secretada no leite. Do leite pode-se isolar o ao hormônio prolactina) também transcrevam e sintetizem os genes para essas prote-
composto de importância farmacêutica. (De ínas terapêuticas. Por exemplo, em um caso, um gene humano para a proteína α1-
acordo com Watson et al., 1992.) antitripsina foi fundido a um promotor da β-lactoglobulina e injetado nos pronúcleos
de zigotos de carneiro. Um desses embriões de carneiro se desenvolveu em uma fê-
mea cujo leite continha 35 g/L de proteína α1-antitripsina humana (Figura 10.7; Wright
Gene α1-antitripsina (AAT) et al., 1991).** Os promotores, então, exercem um papel na especificação de qual
gene é transcrito em qual célula durante o desenvolvimento.
Promotor da
β-lactoglobulina
*Dois fatos surgiram desse experimento. O primeiro é nossa potencial habilidade para curar
doenças genéticas fertilizando ovos in vitro e injetando um gene normal dentro de um pronúcleo.
Óvulo de Esses ovos podem iniciar seu desenvolvimento e, em seguida, ser retornados ao útero da mulher. O
carneiro segundo fato que surgiu foi nossa responsabilidade (que geralmente é proporcional ao nosso poder,
quer queiramos ou não).
DNA **A maior parte da secreção no leite do animal transgênico não é tão grande assim, provavelmente
recombinante porque os genes não estão ligados aos seus intensificadores apropriados, como veremos mais tarde.
é injetado no
pronúcleo
Implante na mãe adotiva

Pipeta
suporte
Progênie transgênica Obtenção de leite de Fracionamento de

é identificada por PCR animais trransgênicos proteínas do leite
Expressão de AAT restrita Proteína ATT é

ao tecido mamário secretada no leite
Proteína ATT pura

& Especulações
RNA polimerase e os fatores

trans-reguladores no promotor
A TRANSCRIÇÃO REQUER a inte-
ração entre a RNA polimerase e
o DNA promotor. As células eu-
carióticas possuem três tipos de RNA po-
limerases, cada uma com funções e pro-
com RNA polimerase purificada e nucleo-
sídeos trifosfato. É necessário adicionar ex-
tratos nucleares para que se inicie uma
transcrição exata. Quais são esses fatores
que permitem o início da transcrição? Pelo
veremos no próximo capítulo) estabiliza
nucleossomos e impede a transcricão na
região onde ela se liga. A adição de histona
H1 impede que TFIID encontre os sítios de
TATA e, dessa maneira, a transcrição não
priedades específicas (Rutter et al., 1976). menos seis proteínas nucleares foram conse dá; a inibição é superada se TFIID é adi-
RNA polimerase I é encontrada na região sideradas como necessárias para uma ini- cionado antes (Laybourn e Kadonaga,
nucleolar do núcleo e é responsável pela ciação adequada da transcrição pela RNA 1991). A ligação de TFIID é facilitada e esta-
transcrição dos grandes RNAs ribossô- polimerase II (Figura 10.8; Buratowski et bilizada pelo fator de transcrição TFIIA
micos; RNA polimerase II transcreve pre- al., 1989; Sopta et al., 1989). (Buratowski et al., 1989; Maldonado et al.,
cursores do RNA mensageiro; e RNA po- 1990). Muitos fatores de transcrição ativam
limerase III transcreve RNAs pequenos TFIID e TFIIA.** Na primeira etapa da trans- a função transcrição recrutando TFIID e “ati-
tais como RNA de transferência, RNA crição do mRNA, o complexo TFIID se liga vando-o” de modo que TFIID possa ligar
ribossômico 5S e outras pequenas se- à seqüência TATA. Isso foi demonstrado outros membros do complexo de transcri-
qüências de DNA.* Nenhuma das RNA em experimentos de proteção de DNase ção (Chi e Carey, 1996; Stargell e Struhl,
polimerases eucarióticas se ligam eficien- onde TFIID foi adicionado a genes clonados 1996). Assim, a decisão de transcrever ou
temente ao DNA. Na realidade, existem e o DNA, então, foi digerido pela DNase. A não um gene particular depende do equilí-
famílias de proteínas ligantes de DNA que única maneira de “salvar” o DNA da diges- brio entre os fatores inibidores (como as
se ligam inicialmente ao DNA, e uma vez tão é ligá-lo ao TFIID, impedindo o acesso histonas) e TFIID e TFIIA.
ligadas, interagem com a RNA polimerase da DNase. Dessa maneira, Sawadogo e
para iniciar a síntese de RNA. Roeder (1984) demonstraram que TFIID se
liga especificamente à região TATA dos TFIIB e RNA polimerase II. O complexo
O elemento TATA e a RNA polimerase II. genes. TFIID é uma proteína multimérica e TFIID/TFIIA não pode formar um comple-
O diagrama clássico de transcrição mostra um de seus componentes-a proteína ligante xo estável diretamente com a RNA polime-
que o DNA, na presença da RNA polime- da seqüência TATA (TBP)- se liga direta- rase II. Em lugar disso TFIID liga o fator
rase e ribonucleosídeos trifosfato, trans- mente no sulco menor da seqüência TATA TFIIB. A ligação de TFIIB a TFIID parece
creve moléculas de RNA. Mas esse esque- (Lee et al., 1991; Starr e Hawley, 1991). O ser a etapa limitante mais importante da ve-
ma simples não leva em consideração difi- complexo TFIID tem várias atividades; a pri- locidade de transcrição de numerosos genes.
culdades como (1) fazer com que o RNA se meira é ligar a seqüência TATA e servir como Essa velocidade pode ser dramaticamente
inicie no local correto e (2) fazer com que a fundação ao complexo transcricional. Ou- aumentada pela proximidade de certos fa-
transcrição de um gene específico ocorra tro papel do TFIID é impedir a estabilização tores de transcrição ligantes de promotores
somente em tempos e células específicos. de nucleossomos na região do promotor. e intensificadores. Esses fatores de transcri-
Devem existir fatores que permitam que a Quando DNA contendo promotor é incor- ção são específicos de seqüências e podem
RNA polimerase se ligue somente a pro- porado nos nucleossomos, esses genes não determinar quais genes serão transcritos. O
motores de determinados genes. Aqui, dis- podem ser transcritos quando TFIID, RNA domínio ativador desses fatores de trans-
cutiremos aquelas proteínas e seqüências polimerase II e outros fatores são adiciona- crição se liga diretamente com TFIIB e fa-
de DNA que localizam a RNA polimerase dos mais tarde. Entretanto, quando TFIID é cilita sua montagem com TFIID (Lin e
nos sítios promotores. A enzima responsá- adicionado antes ou durante a formação de Greene, 1991; Lin et al., 1991). Uma vez
vel pela transcrição de RNAs mensageiros nucleossomos, a cromatina resultante é que TFIIB está localizado, ele pode ligar a
é a RNA polimerase II. Entretanto, não vai transcricionalmente ativa (Workman e RNA polimetrase II. A maior parte da RNA
haver uma transcrição exata dos genes clo- Roeder, 1987). Bloqueando a formação de polimerase é posicionada pela sua interação
nados, in vitro, se esses forem incubados nucleossomos, TFIID parece agir antago- com TFIIB, mas a cauda carboxiterminal da
nicamente à histona H1. Histona H1 (como subunidade grande da RNA polimerase II
* Na maioria das células, os RNAs ribossômico interage diretamente com TFIID (veja Fi-
e de transferência são sintetizados constitutivamente. gura 10.8D). Dessa maneira, RNA polime-
Entretanto, os animais desenvolveram mecanismos **TF significa fator de transcrição; II indica que
rase II é situada no promotor.
extraordinários para acelerar a síntese de rRNA em o fator foi, inicialmente, considerado necessário para
seus oócitos. Assim, adiaremos a discussão sobre a RNA polimerase II; as designações de letras se
RNA polimerases I e III até o detalhamento de even- referem às frações da coluna de fosfocelulose que TFIIE/F e TFIIH. Imediatamente antes ou
tos na oogênese no Capítulo 22. tinham a atividade. durante sua ligação a TFIIB, a RNA poli-
(A) O complexo TFIID se liga à sequência merase II se associa ao TFIIF e TFIIE

TATA através da subunidade TBP (Buratowski et al., 1991; Conaway et al.,
1991). TFIIF tem uma atividade enzimáti-
+1 ca necessária para desenrolar a hélice do
Sítio de iniciação DNA. TFIIE é uma ATP-ase dependente
da transcrição de DNA e provavelmente é necessária para
gerar a energia para a transcrição (Bunick
et al., 1982; Sawadogo e Roeder, 1984).
(B) Mas qual é a vantagem de tudo isso, se a
TFIID é estabilizado pelo TFIIA
RNA polimerase permanece ligada a esse
complexo na seqüência TATA? Para que
haja transcrição, a RNA polimerase deve
ser liberada da região do promotor. Essa
atividade de liberação parece ser função
do TFIIH. A RNA polimerase está forte-
mente ligada pelo seu domínio carboxi-
terminal (CTD) ao FTIID. Entretanto,
(C) TFIIB e TFIIH se juntam ao TFIID somente se ligará à forma não fos-
complexo na sequência TATA forilada de CTD. Nos mamíferos CTD
contém 52 repetições da seqüência de
sete aminoácidos YSPTSPS. Quando o
complexo de iniciação está formado, o
complexo completo ativa a proteína qui-
RNA
nase serina/treonina do TFIIH, o qual
polimerase II fosforila cada uma das 52 repetições (veja
Figura 10.8E; Koleske et al., 1992; Lu et
al., 1992; Usheva et al., 1992). TFIID não
Domínio carboxi-terminal (CTD)
pode ligar essa região altamente fosfori-
lada e libera a RNA polimerase. Ao passo
Um complexo de RNA polimerase II, TFIIE
que a primeira ligação fosfodiester pode
(D) RNA polimerase II e TFIIF é posicionado pelo TFIIB e seu
domínio carboxi-terminal é ligado pelo TFIID ser feita sem a fosforilação do CTD, essa
fosforilação parece ser essencial para a
transcrição posterior do RNA mensagei-
ro (Akoulitchev et al., 1995).
TAFs e a ativação da transcrição basal.

TFIID é uma proteína multimérica, mas
somente uma de suas unidades se liga à
seqüência TATA. Algumas das outras su-
(E) O CTD é fosforilado pelo TFIIH e é liberado bunidades são chamadas fatores associa-
pelo TFIID; começa a transcrição dos das proteínas ligantes de TATA
(TAFs). Purificação das TAFs, a partir de
TFIID do homem e da Drosophila, mos-
trou que essas são compostas por um con-
junto proteínas (Figura 10.9; Dynlacht et
al., 1991). Considera-se que as TAFs ser-
vem a duas funções: (1) elas podem deter-
Transcrito de RNA minar se TFIID permanece ou não no pro-
motor, e (2) elas podem funcionar como
co-ativadores, fazendo uma ponte entre as
Figura 10.8
proteínas ligadas ao intensificador e o com-
Formação do complexo de iniciação ativo nos eucariotos. O diagrama representa os comple-
xos formados na seqüência TATA pelos fatores de transcrição e RNA polimerase II. (A) O plexo de transcrição através de interações
complexo TFIID se liga à seqüência TATA através de sua subunidade TBP. (B) TFIID é proteína-proteína.
estabilizado pelo TFIIA. (C) TFIIB eTFIIH se juntam ao complexo na seqüência TATA É de importância para o gene se as pro-
enquanto TFIIE e TFIIF se associam à RNA polimerase II. (D) RNA polimerase é posicionada teínas ligantes de TATA permanecem no
pelo TFIIB, e seu domínio carboxi-terminal (CTD) é ligado pelo TFIID. (E) O CTD é promotor. Se elas saírem, o gene não será
fosforilado pelo TFIIH e é liberado pelo TFIID. A RNA polimerase II está agora competente transcrito. Verrijzer e colegas (1995) mos-
a transcrever o mRNA do gene. traram que as TAFs de 250- e 150- kDa
(A) Um complexo mínimo de TBP e um TAF Figura 10.9

não ativa a transcrição (Sp1 e NTF não Esquema de experimentos sugerindo que diferentes TAFs interagem com diferentes fatores de
podem se associar com TBP) transcrição para ativar a transcrição. O complemento total das TAFs é ilustrado em (D). O
“ativador” em (D) é uma proteína ligada à uma seqüência de DNA que foi estabilizada pelas
outras interações. (De acordo com Chen et al., 1994.)
têm importância crítica ao determinar se briões de Drosophila (Sauer et al., 1996).

TBP permanece ligado à seqüência TATA. Da mesma forma, o fator de transcrição
Os TAFs reconhecem elementos a montan- NTF-1 de Drosophila se liga a ambos os
te do promotor, os quais, se presentes, es- TAFs de 60- e 150- kDa, e no homem, a
tabilizam ou desestabilizam o TBP no ativação transcricional pelo receptor de
promotor. Isso significa que alguns pro- estrógeno é consumada pela sua ligação
motores são intrinsicamente mais “difí- ao TAF de 30-kDa (Jacq et al., 1994). Na
(B) Adição do TAF p150 ou TAF p60 permite a
ceis” de serem transcritos e que certos verdade, Jacq e colegas mostraram que
ativação transcricional pelo NTF, mas não
Sp1 fatores deveriam estar presentes para pro- nem todos TBPs tinham o TAF de 30-kDa.
duzir esses promotores transcritáveis. Parece que alguns TAFs são encontra-
Como veremos adiante, alguns promo- dos em todos TFIIDs, enquanto outros
tores (como aquele para interferon-β hu- parecem ser mais específicos.
mano) são transcritos somente após
Iniciação da grande esforço em dobrá-los, contorcê- Promotores sem elementos TATA.
transcrição los de modo a envolver o frágil complexo Existem muitos genes (a maioria codifican-
de transcrição. do proteínas metabólicas gerais e não pro-
A associação de TBP com diferentes teínas específicas em células) que usam
TAFs permite a ativação do complexo de RNA polimerase II, mas cujos promotores
transcrição por proteínas ligadas a sítios de não têm a seqüência TATA. Nesse caso, ou-
intensificadores e a montante dos promoto- tras proteínas se ligam na região do promo-
res. Além disso, diferentes TAFs podem tor; usualmente são proteínas ligantes de
co-ativarem com fatores trans diferentes. promotores tais como o SP1. A proteína Sp1
Iniciação da
transcrição
Por exemplo, um dos fatores de transcri- no promotor rico em GC liga-se ao TFIID,
ção mais comum é o Sp1. Essa proteína diretamente ou através de um TAF. O TFIID
não-TAF se liga às seqüências promoto- está agora apto a iniciar a cascata de fatores
ra ou intensificadora GGGCGG através de que formarão o complexo de iniciação da
seu terminal carboxila mas regula a ativi- transcrição e a ligação de uma proteína da
(C) Adição do TAF p110 e do TAF p150 permite dade transcricional, via seu terminal amino RNA polimerase II à região do promotor
a ativação de ambos, NTF e Sp1 (Dynan e Tjian, 1985; Kadonaga et al., (Figura 10.10; Pugh e Tjian, 1991; Rigby,
1988). Provavelmente, esse fator é encon- 1993). Mesmo que esses promotores não
trado em todas as células e, portanto, não tenham uma seqüência TATA, TFIID é ain-
regula expressão gênica diferencial. Ape- da o fator decisivo para a regulação da
sar disso, ele parece estar envolvido em ocorrência da transcrição.
Iniciação da interações entre as regiões promotora e
transcrição intensificadora de maneira a produzir Proteína ligante
TAFs de TATA
transcrição diferencial de determinados
genes em determinadas células. Sp1 ne-
cessita se ligar ao TAF de 110-kDa para
(D) O holo-TFIID suporta a ativação por que seja ativado o complexo de transcri-
vários fatores e permitirá o acesso de ção. Dessa maneira, esse TAF faz uma
outras proteínas de ativação ao ponte entre o Sp1 e o TBP formando uma
complexo transcricional alça no DNA (Hoey et al., 1993; Chen et
al., 1994). TAFs permitiriam a formação de Sp1 RNA polimerase II
e fatores basais
alças no DNA de maneira que os elemen-
tos Sp1 no intensificador encontrariam a Figura 10.10
proteína TFIID no promotor (veja Figura Configuração possível para fatores de trans-
Iniciação da 10.9). O fator de transcrição Bicoid se liga crição mediando a ligação da RNA polimerase
transcrição aos TAFs de 110- e 60- kDa, e mutações II a um promotor sem TATA contendo um
em quaisquer desses TAFs reduzem a sítio de ligação de Sp1. (De acordo com Pugh e
Proteína de transcrição dependente de Bicoid em em- Tjian, 1991; Comai et al., 1992.)
ativação
ligante de DNA
Estrutura e função dos intensificadores

Necessidade de intensificadores
Além de promotores, os intensificadores também são importantes na regulação da

transcrição de genes vizinhos. Um dos primeiros intensificadores celulares encontra-
do foi demonstrado controlando a especificidade celular da transcrição do gene da
imunoglobulina. As células B são as únicas do corpo que produzem a proteína imuno-
globulina (anticorpo). Gillies e seus colaboradores (1983) transfectaram um gene
clonado da cadeia pesada da imunoglobulina, em células cultivadas de linfócitos B de
tumores que haviam perdido sua habilidade de produzir sua própria cadeia pesada.
Essas células transfectadas passaram a sintetizar a cadeia pesada codificada pelo gene
incorporado. Porém, adicionando o mesmo gene - mas sem uma pequena região de
um determinado íntron- nessas células B defeituosas foi observada apenas uma pe-
quena transcrição do gene inserido. Havia uma região intensificadora dentro do íntron
que era necessária para a transcrição (Figura 10.11).
Intensificadores são também elementos primários responsáveis pela transcrição
específica para tecidos: os genes clonados de imunoglobulina não são transcritos
quando inseridos nos núcleos de células outras que as células B (Banerji et al., 1983;
Linhagem de células de
mieloma produzindo IgG
Figura 10.11 Isolamento e clonagem do gene da

Especificidade tecidual do efeito do elemento cadeia pesada de imunoglobulina
intensificador. O gene da cadeia pesada da imu-
Gene da cadeia
noglobulina foi isolado e clonado de uma li-
pesada de Ig
nhagem de células de mieloma produzindo IgG.
Alguns dos clones foram mantidos intactos,
enquanto em outros, várias regiões do íntron Transfectar com Remover porções do íntron Transfectar com
entre os éxons VDJ e Cg (que serão discutidos gene normal gene normal
mais tarde) foram excisadas com enzimas de
restrição. DNA dos clones resultantes foi
transfectado em células de mieloma que havi-
am perdido seus genes de imunoglobulina. O Mielomas de Transfecção com
mRNA acumulado das células transfectadas camundongos diferentes
sem genes da porções faltantes Sem Fibroblasto de
foi isolado e separado por eletroforese em gel
cadeia pesada do íntron transfecção camundongo
de poliacrilamida, junto com mRNAs de um
fibroblasto normal de camundongo e da célula
original do mieloma. O RNA foi transferido
para papel de nitrocelulose e hibridizado com
um fragmento de enzima de restrição radioati-
va da região Cγ. Se a região Cγ estivesse sendo
transcrita desses genes clonados, a sonda radi- Extrair mRNA, separar em gel, transferir para papel,
oativa deveria se ligar a ela. A sonda detectou a hibridizar com fragmento radioativo Cγ de DNA
mensagem de Cγ somente dos clones que con-
tinham uma certa região do íntron (indicada
pela barra colorida dentro do íntron). Quando
transfectado em células fibroblásticas de ca-
mundongo, entretanto, mesmo o gene clonado
inteiro não transcreveria mRNA de Cγ. ( Pro- Posição do mRNA
tocolo e dados de Gillies et al., 1983.) de Cγ normal
Gillies et al., 1983). Além disso, quando a região do intensificador da cadeia pesada da
imunoglobulina é inserida em um gene clonado de β-globina, ele estimula a transcrição
daquele gene da hemoglobina somente se o gene é inserido em uma célula B. Ambos,
os elementos reguladores cis e os fatores reguladores trans são necessários para a
transcrição de gene específico da célula.
Função do intensificador:
Modelos temporais e espaciais de transcrição
Intensificadores podem regular a expressão temporal e específica do tecido de todos

os genes regulados diferencialmente, e genes ativos em tipos de células adjacentes
têm diferentes intensificadores. No pâncreas, por exemplo, os genes para as proteínas Figura 10.12
exócrinas (para as proteínas quimotripsina, amilase e tripsina) têm intensificadores Especificação tissular de intensificadores de
diferentes daqueles do gene para a proteína endócrina insulina. Esses intensificadores genes pancreáticos. As regiões ladeando o ter-
minal 5’ do gene da insulina (I) e o gene da
se situam nas seqüências ladeando o terminal 5’ dos seus respectivos genes. Walker e
quimotripsina (C) foram separadamente inse-
colegas (1983) colocaram essas regiões de flanco no gene para o cloranfenicol acetill ridos próximo ao gene para CAT bacteriano.
transferase de bactéria (CAT), um gene cujo produto enzimático não é encontrado em Como um controle positivo, o intensificador
células de mamífero. Atividade de CAT é facilmente determinada em células de mamí- do vírus do sarcoma de Rous (V), que parece
feros e é usada como um “gene repórter” para mostrar ao pesquisador se um determi- operar em todos os tipos de células, foi tam-
nado intensificador está funcionando. Em seguida, os pesquisadores transfectaram bém colocado próximo ao gene CAT. Os três
esses genes híbridos em (1) células de ovário (que não secretam insulina ou quimo- clones foram transfectados em três tipos de
tripsina), (2) em uma linhagem de células que secretam insulina, e (3) em uma linha- células, (A) uma linhagem de células ovarianas
gem de células exócrinas, e mediram a atividade da enzima marcadora em cada uma que não produzem nem insulina nem quimo-
tripsina, (B) uma linhagem de células secre-
dessas células. Como mostrado na Figura 10.12, nenhuma das seqüências
tando insulina, ou (C) uma linhagem de células
intensificadoras promoveu a produção da enzima nas células ovarianas. Nas células secretando quimotripsina. A atividade de CAT
secretoras de insulina, a região flanqueando a posição 5’ do gene da insulina permitiu foi ensaiada em todos lisatos celulares. As in-
a expressão do gene da cloranfenicol acetiltransferase, mas a região flanqueando a 5’ serções mostram auto-radiografias típicas do
do gene da quimotripsina, não o permitiu. Inversamente, quando os clones foram ensaio de CAT onde cloranfenicol radioativo
colocados na linhagem de células pancreáticas exócrinas, a região flanqueando a 5’ da (o substrato da reação de CAT) pode ser sepa-
quimotripsina permitiu a expressão de CAT enquanto o intensificador da insulina não rado do cloranfenicol monoacetato (o produto
da reação de CAT) por cromatografia. (De acor-
do com Walker et al., 1983.)
(A) Linhagem de células ovarianas (B) Linhagem de células pancreáticas (C) Linhagem de células pancreáticas
secretando insulina exócrinas (secretando quimotripsina)
Cloranfenicol
monoacetato (produto)
Cloranfenicol
(substrato)
Intensificador
viral
Intensificador de
quimotripsina
Intensificador
de insulina
Tempo de incubação em minutos Tempo de incubação em minutos Tempo de incubação em (horas)

Sítio de ligação de Região do o permitiu. Os intensificadores para 10 proteínas exócrinas compartilham uma seqüên-
proteína específica intensificador
cia de consenso de 20 pares de bases, sugerindo que essas seqüências similares
do sexo yp2
tenham um papel na ativação desses genes nas células exócrinas do pâncreas (Boulet
et al., 1986). Assim, parece que a expressão dos genes em células endócrinas e exócrinas
do pâncreas é controlada por intensificadores diferentes.
yp1
Intensificadores são críticos para a regulação do desenvolvimento normal, durante
Intensificador a última década foram feitas cinco generalizações que enfatizam sua importância para
do ovário
a expressão gênica diferencial:
Intensificador
dos corpos 1. A maioria dos genes requer intensificadores para sua transcrição.
gorduros
2. Intensificadores são os principais determinantes do tempo e do espaço (tipo
celular) na transcrição diferencial.
3. Estando o intensificador a uma distância relativamente grande do promotor
Figura 10.13 isso significa que pode haver múltiplos sinais para determinar se um dado gene
Estrutura modular da região do intensificador é transcrito. Um gene pode ter vários sítios de intensificadores a ele ligados, e
da proteína do vitelo de Drosophila. Os dois cada intensificador pode se ligar a mais de um fator (que pode regular, seja
genes da proteína do vitelo ( yp1, yp2) são
inibindo ou estimulando, a transcrição).
regulados por um intensificador entre eles.
Uma região do intensificador liga fatores de 4. A interação entre as proteínas ligadas aos sítios intensificadores com o sistema
transcrição nos núcleos ovarianos e permite a de transcrição agrupado no promotor é considerada como regulador da trans-
expressão desses genes no ovário. Outra re- crição. O mecanismo dessa associação não é inteiramente conhecido, e nem
gião do intensificador permite a expressão do entendemos como o promotor integra todos esses sinais.
gene nos corpos gordurosos. Dentro da região 5. Intensificadores são modulares. Existem elementos de DNA que conferem ex-
controlando a expressão dos genes das proteí- pressão gênica temporal e espacial, e esses podem ser misturados e pareados.
nas do vitelo nos corpos gordurosos existem Por exemplo, o intensificador da proteína do vitelo da Drosophila melanogaster
seqüências de DNA que ligam fatores de trans- é construído de tal forma que um dos elementos do DNA permite a expressão
crição específicos do sexo.
do gene nos corpos gordurosos, outro elemento de DNA permite a expressão
nos ovários e o terceiro elemento liga proteínas específicas do sexo (as prote-
ínas Doublesex). A proteína Doublesex específica da fêmea estimula a transcri-
ção; a proteína específica do macho inibe a transcrição. Assim, o gene da
proteína do vitelo é ativado somente nos corpos gordurosos e ovários da
mosca fêmea (Figura 10.13; Garabedian et al., 1985; An e Wensink, 1995). O
elemento de DNA para expressão nos corpos gordurosos é compartilhado com
outros genes que são expressos nesse órgão, e o elemento de DNA ligado às
proteínas Doublesex é também compartilhado pelos genes cuja expressão é
específica para o sexo.
Fatores de transcrição:
Os trans-reguladores dos promotores e dos intensificadores
Fatores de transcrição são proteínas que se ligam às regiões intensificadoras ou pro-
motoras e que interagem de tal maneira que a transcrição ocorre somente a partir de um
pequeno grupo de promotores numa dada célula. A maioria dos fatores de transcrição
pode se ligar às seqüências específicas de DNA, e essas proteínas trans-reguladoras
podem ser agrupadas em famílias baseadas em similaridades de estrutura. Dentro de
cada família, as proteínas compartilham uma armação estrutural comum nos seus res-
pectivos sítios de ligação ao DNA, e pequenas diferenças de aminoácidos no sítio de
ligação podem alterar a seqüência do DNA ao qual elas se ligam. Além de terem o
domínio ligante de DNA que é específico para uma seqüência, os fatores de transcri-
ção contêm um domínio envolvido na ativação da transcrição do gene cujo promotor
ou intensificador ele ligou. Freqüentemente, esse domínio trans-ativador permite ao
fator de transcrição interagir com proteínas envolvidas na ligação da RNA polimerase.
Essa interação com freqüência aumenta a eficiência com a qual o complexo transcricio-
nal básico pode ser construído e ligar a RNA polimerase II. Existem várias famílias de
fatores de transcrição; as aqui discutidas são de alguns tipos principais.
Figura 10.14
O homeodomínio da proteína Engrailed se liga em um sítio especí-
fico do DNA. A hélice 3 contata os pares de bases no sulco princi-
pal, enquanto a porção amino-terminal do homeodomínio entra no
sulco menor. (Segundo Pabo e Sauer, 1992.)
Proteínas de homeodomínio
Uma família extremamente importante de fatores trans-reguladores é o conjunto de

proteínas de homeodomínio. Essas proteínas são críticas para a especificação dos
eixos corporais ântero-posteriores em todo o reino animal; elas serão mais detalha-
das nos Capítulos 14 e 16. O homeodomínio consiste de 60 aminoácidos organiza-
dos em hélice-giro-hélice, de tal maneira que a terceira hélice se estende para dentro
do sulco principal do DNA que ela reconhece. Os aminoácidos da porção amino-
terminal do homeodomínio também contactam as bases no sulco menor (Figura
10.14). Esse homeodomínio foi visto pela primeira vez em proteínas que especificam
a identidade de segmentos na Drosophila. Mutações nessas proteínas causaram a
transformação de um segmento do corpo em outro (uma transformação conhecida
como homeosis, que será discutida em detalhe no Capítulo 14). Várias proteínas de
homeodomínio na Drosophila melanogaster foram clonadas, seqüenciadas e testa-
das para sua habilidade de regular a transcrição. A Tabela 10.1 mostra nove proteí-
nas de Drosophila contendo homeodomínios e as seqüências de DNA que elas
reconhecem. O reconhecimento de promotores específicos pelas proteínas conten-
do o homeodomínio tem sido considerado essencial para o desenvolvimento da
Drosophila. A proteína Bicoid, por exemplo, é um fator de transcrição de homeodo-
mínio que se liga aos promotores do gene hunchback. Essa ligação ativa a transcri-
ção desse gene; a proteína Hunchback resultante é também um fator de transcrição,
e se liga aos intensificadores daqueles genes necessários para a formação da cabe-
ça e do tórax da Drosophila (Driever e Nüsslein-Volhard, 1989; Struhl et al., 1989).
Pequenas modificações na composição de aminoácidos do sítio de ligação ao DNA
podem mudar a seqüência de DNA reconhecida pela proteína. Treisman e seus
colegas (1989) demonstraram que alterando um único aminoácido no homeodomínio
podia-se modificar os promotores que essa proteína ativaria.
Tabela 10.1 Principais proteínas de homeodomínio da Drosophila

melanogaster e seus sítios de ligação ao DNA.
Proteína Sítio(s) de ligação ao DNA
Abdominal B TAATTTGCAT
TCAATTAAAT
Antennapedia TAATAATAATAATAA
Bicoid TCCTAATCCC
Engrailed TCAATTAAAT
Even-skipped TCAATTAAAT
TAATAATAATAATAA
TCAGCACCG
Fushi tarazu TCAATTAAAT
TAATAATAATAATAA
Paired TCAATTAAAT
Ultrabithorax TAATAATAATAATAA
Zerknült TCAATTAAAT
Os fatores de transcrição POU
Alguns fatores de transcrição têm tanto um homeodomínio como uma segunda região
de ligação ao DNA (Figura 10.15). Em alguns casos, essa região que compreende o
homeodomínio e a segunda região de ligação ao DNA é chamada domínio POU (Herr
et al., 1988). As iniciais são de quatro proteínas nas quais pela primeira vez foram
vistas contendo tais domínios: Pit-1 (também chamada GHF1), um fator específico da
pituitária que ativa os genes, codificando o hormônio de crescimento, prolactina e
outras proteínas da pituitária; Oct1, uma proteína de ampla distribuição que reconhe-
ce uma certa seqüência de oito pares de bases chamada seqüência octa (octa box), e
Oct2, a proteína específica da célula B que reconhece a octa box e ativa os genes da
imunoglobulina; e UNC-86, um produto genético do nematódeo envolvido na determi-
nação do destino de células neuroniais. O homeodomínio de Pit-1 reconhece a se-
qüência ATATTCAT, enquanto o homeodomínio de Oct2 reconhece a seqüência simi-
lar ATTTGCAT. Se o elemento de DNA reconhecido pela Pit-1 é alterado em dois
lugares, ele se torna um sítio de ligação de Oct-2, e o gene de prolactina é expresso em
linfócitos B (Elsholtz et al., 1990). Assim, uma modificação de duas bases no intensifi-
cador reconhecido pela proteína POU pode converter uma transcrição específica da
pituitária em uma transcrição específica do linfócito.
Domínio POU
Principal POU-específico Homeodomínio

domínio
Alta afinidade, Interação
trans-ativador
sítio-específico, proteína-proteína,
ligante de DNA, ligante de DNA
interação
proteína-proteína
dependente de DNA
Figura 10.15
Os domínios dos fatores de transcrição da família POU
Gene Pit-1 do Figura 10.16

primórdio da Transcrição do gene
Determinação do tipo celular por combina-
pituitária não Pit-1 específico Tradução de Pit-1 Somatotrofos
do órgão específico da célula ções de proteínas trans-reguladoras. O mRNA
expresso para o fator de transcrição Pit-1 é transcrito
em todos tipos de células destinadas a residir
Estrógeno Lactotrofos na pituitária anterior. Entretanto, a proteína
Pit-1 é traduzida somente nas células
tireotróficas, somatotróficas e lactotróficas.
Embrião de Embrião de Tireotrofos Somatotrofos sintetizam hormônio de cres-
14 dias 16 dias cimento após a tradução de Pit-1. Lactotrofos
sintetizam alguma prolactina concomitante
Corticotrofos com a tradução de Pit-1 mas produzem quan-
tidade significante de prolactina quando so-
mente co-estimulados com estrógeno (e sua
Gonadotrofos proteína receptora trans-reguladora). O me-
canismo distinguindo a transcrição do hor-
mônio estimulador da tireóide parece envol-
A proteína Pit-1 é encontrada somente em células da pituitária. Quando genes do ver a região do silenciador (veja Figura 10.17).
hormônio de crescimento (que são ativos na pituitária) são clonados e colocados em (De acordo com Simmons et al., 1990.)
extratos nucleares de células outras que não as da pituitária, esses genes não são
transcritos, ao passo que a transcrição se dará se os genes do hormônio de crescimen-
to forem colocados em extratos nucleares de células da pituitária anterior. Além disso,
a adição de Pit-1 ao extrato nuclear das células não pituitárias permitirá a transcrição
do gene do hormônio de crescimento (Bodner e Karin, 1987). Conclui-se, então, que a
expressão específica do gene do hormônio de crescimento na pituitária anterior é
mediada por uma proteína trans-reguladora específica para o tecido. Inversamente,
quando outros genes (tais como aqueles para a globina) são clonados próximo às
seqüências ligantes de Pit-1 e são usados para produzir camundongos transgênicos,
esses genes mostram uma transcrição específica da pituitária (Behringer et al., 1988).
O intensificador ligante da proteína Pit-1 é, por sua vez, regulado pelo desenvol-
vimento (Dollé et al., 1990; Simmons et al., 1990). Transcrição do gene Pit-1 do
camundongo é detectada dentro de um dia após o aparecimento histológico da bol-
sa de Rathke, o primórdio da pituitária anterior, mas a tradução desse mRNA em
proteína não ocorre antes de 2 ou 3 dias. O mRNA do hormônio de crescimento é
primeiro detectado quando o gene Pit-1 é traduzido. É interessante notar que em
dois tipos de células da pituitária anterior, os corticotrofos que sintetizam a
corticotrofina (também chamada hormônio adrenocorticotrófico, ou ACTH) e os
gonadotrofos que sintetizam gonadotrofinas, o mRNA de Pit-1 é produzido, mas
não traduzido (Figura 10.16). Somente nas células da pituitária dos somatotrofos
(produzem hormônio do crescimento), lactotrofos (produzem prolactina) e tireotrofos
(que sintetizam hormônio estimulador da tireóide) é a mensagem do Pit-1 traduzida
em proteína nuclear que liga DNA. O intensificador ligante da proteína Pit-1 não é
somente mediador da transcrição dos produtos diferenciados dessas células, mas é
necessário para a formação das células da pituitária anterior na bolsa de Rathke.
Duas mutações dwarf em camundongos são causadas por uma mutação na proteína
Pit-1. Esses camundongos não têm as células tireotróficas, lactotróficas e
somatotróficas da pituitária anterior (Li et al., 1990).
INTERAÇÕES COMBINATÓRIAS E FORMAÇÃO DE ALÇAS NA REGULAÇÃO DA

TRANSCRIÇÃO DO GENE DA PROLACTINA. A atividade da proteína Pit-1 no gene
para a prolactina ilustra muitas das características dos fatores de transcrição. Primei-
ro, o intensificador do gene prolactina liga vários fatores diferentes cuja interação
regula a transcrição. O gene prolactina é ativado durante a gravidez para produzir o
hormônio da pituitária (prolactina) que estimula a produção de leite; esse gene é esti-
mulado ao máximo pela combinação de Pit-1 e estrógeno. Essa combinação regula o
lugar (a glândula pituitária) e o tempo (gravidez e logo após) para a síntese de prolac-
tina. Simmons e colegas (1990) mostraram que esse sinergismo ocorre na região do
Figura 10. 17 (A)

Sinergismo combinatório no intensificador da
Pit-1 Estrógeno
prolactina. (A) Sinergismo entre sítios do in-
tensificador da prolactina no rato. O intensi-
ficador da prolactina foi fundido com um gene
repórter (luciferinase) e o nível de atividade
do gene repórter determinado quando o gene
fundido foi adicionado a células cultivadas.
Quando Pit-1 ou estrógeno estavam presen-
tes nessas células havia somente um pequeno
aumento no nível de transcrição. Entretanto,
Número de vezes da estimulação acima da linha de base
a adição de ambas as substâncias causou um
aumento de 1400 vezes no nível da transcri- (B)
ção. (B) Sinergismo entre os sítios intensifi- Especificidade celular na expressão
cadores e promotores do gene da prolactina do transgene da prolactina
Construções do
no camundongo. Genes fundidos foram pro- promotor da prolactina Lactotrofos Tireotrofos
duzidos portando o gene repórter e (1) a re-
Seqüência
gião inteira 5’ do intensificador da prolactina, flanqueadora Promotor
seqüências laterais e o promotor da prolactina;
(2) somente o intensificador específico do te-
cido e o promotor da prolactina; (3) só o
promotor de prolactina; (4) o intensificador Intensificador
da prolactina mais o promotor do gene
timidina quinase (TK); e (5) somente o pro-
motor do gene Tk. Essas construções foram
colocadas em zigotos de camundongos, e a
expressão do gene repórter foi monitorada
em células lactotróficas e tireotróficas da
pituitária. (C) Modelo para a regulação da
expressão do gene da prolactina. Ambos, o
promotor e o intensificador têm quatro sítios
de ligação de Pit-1. O receptor de estrógeno
liga-se ao elemento responsivo de estrógeno (C) Sinergismo promotor–intensificador
(ERE) da região do intensificador. As regiões
que inibem a transcrição de prolactina em
Sinergismo do Promotor
tireotrofos e somatotrofos estão escuras.( A intensificador
de acordo com Simmons et al., 1990; B de
acordo com Crenshaw et al., 1989.) Regiões
Ativantes:
DNA
Regiões Somatotrofos Somatotrofos

restritivas: Tireotrofos Tireotrofos
intensificador do gene. A proteína Pit-1 se liga a uma região do intensificador en-

quanto o estrógeno, através da sua proteína receptora, se liga a outra região do
intensificador. Quando esses fatores estão presentes ao mesmo tempo, a transcrição
é muito maior que aquela resultante da adição de cada um separadamente (Figura
10.17A). Mais ainda, parece haver regiões silenciadoras flanqueando o intensifica-
dor que são necessárias para desligar o gene da prolactina nos tireotrofos (que de
outra maneira ativariam o gene da prolactina) (Figura 10.17B,C; Crenshaw et al.,
1989). Assim, Pit-1 age de forma combinatória com outros fatores de transcrição
para regular seus genes alvos.
Segundo, há um sinergismo entre o intensificador e o promotor do gene da prolac-
tina. O intensificador do gene da prolactina não estimulará o promotor de outro gene
tão eficientemente como estimulará o seu próprio promotor (Figura 10.17B,C; Crenshaw
et al., 1989). Esse sinergismo entre os sítios promotor e intensificador parece ser
causado pela formação de alças no DNA entre os dois sítios. No gene da prolactina do
rato, o intensificador está localizado a mais de 1300 pares de bases a montante do seu
promotor. Usando um ensaio que funde DNA aproximado por interações proteína-
proteína, Cullen e colegas (1993) mostraram que as regiões do promotor e do intensi-
ficador são reunidas somente quando Pit-1 e estrógeno estão presentes. Parece que
o receptor do estrógeno ligado ao hormônio no intensificador é capaz de estabilizar a
interação entre essa região e a do promotor, assim permitindo a interação entre as
proteínas ligadas ao intensificador (Pit-1 e receptor do estrógeno) com o sistema de
transcrição do promotor.
Terceiro, a proteína Pit-1 regula positivamente sua própria síntese. Um dos al-
vos da proteína Pit-1 é o intensificador do próprio gene Pit-1 (Rhodes et al., 1993).
Uma vez que o gene Pit-1 foi ativado (por outros fatores de transcrição), a proteína
Pit-1 se liga ao seu próprio intensificador e mantém a transcrição do gene Pit-1.
Esse tipo de auto-regulação positiva é importante como um mecanismo que compro-
mete a célula a um determinado caminho de desenvolvimento. Assim o gene Pit-1,
uma vez ativo, mantém o fenótipo da pituitária. Tal auto-regulação também se dá para
a proteína MyoD (que envolve a célula na via do desenvolvimento da célula muscu-
lar) e para várias proteínas de Drosophila que mantêm os limites específicos dos
segmentos e individuais do sexo.
& Especulações
Regulação da transcrição dos genes

de cadeia leve das imunoglobulinas
A HABILIDADE de se obter linha-

gens clonadas de células “con-
geladas” em um estágio deter-
minado do seu desenvolvimento nos
permite amostrar os fatores de transcri-
Anticorpos são produzidos quando uma
substância estranha – o antígeno - entra em
contato com as células B, que residem nos
nódulos linfáticos e no baço. Mesmo antes
do contato com o antígeno, cada uma das
pontes de dissulfeto (Figura 10.18). A especi-
ficidade da molécula de anticorpo (isto é, se
ela se ligará a um poliovírus, uma célula de E.
coli ou alguma outra molécula) é determinada
pela seqüência de aminoácidos na região va-
ção presentes naquele momento. Tais células B em repouso produz proteínas riável. Essa região é composta dos amino-
clones são obtidos de tumores de certos imunoglobulinas mas não as secretam. Em terminais das cadeias leve e pesada. As regi-
tecidos, e leucemias de linfócitos B (cé- lugar disso, as moléculas de imunoglobuli- ões variáveis das moléculas de anticorpo são
lulas B) do sistema imune permitiu aos nas são inseridas nas membranas das célu- ligadas às regiões constantes que dão ao an-
pesquisadores identificar muitos dos las B e são usadas como receptores de ticorpo suas propriedades efetuadoras ne-
elementos reguladores cis e trans, ne- antígenos. Esses receptores, ao se ligarem cessárias para inativar o antígeno. Durante dé-
cessários para o desenvolvimento da li- aos antígenos, sinalizam para a célula se di- cadas, os imunologistas se espantavam con-
nhagem de células B. vidir e em seguida se diferenciar. Cada célu- siderando como o sistema imune teria condi-
la B produz um anticorpo que reconhece ção de produzir tantos tipos diferentes de an-
A estrutura dos genes da imunoglobulina. uma e somente uma forma antigênica. Por- ticorpos. Poderiam todos os 107 diferentes ti-
Até agora, nosso modelo tem sido aque- tanto, um anticorpo reconhecendo o pos de proteína de anticorpo serem codifica-
le em que cada célula do corpo contém envoltório protéico de um poliovírus não dos no genoma? Isso tomaria uma quantida-
exatamente os mesmos genes. Isso é pro- deveria reconhecer a toxina da cólera, mem- de enorme de espaço cromossômico. Mais
vavelmente verdade para a maioria dos branas da E. coli ou caspa de zebra. ainda, como o sistema imune “saberia” como
tipos de células, mas os linfócitos são Todas as proteínas do anticorpo na mem- produzir um anticorpo contra uma molécula
diferentes. Em cada célula B, o genoma brana da célula B têm uma estrutura muito se- que nem é encontrada fora do laboratório?
foi organizado de tal forma que cada uma melhante. Cada uma consiste de dois pares de Surpreendentemente, foi descoberto que a
é capaz de produzir um tipo de anticorpo subunidades polipeptídicas. Existem duas ca- produção de moléculas específicas de anti-
(de um repertório contendo possivelmen- deias pesadas idênticas e duas cadeias leves corpos envolve a criação de novos genes du-
te mais de 10 milhões de anticorpos). idênticas; as cadeias estão ligadas entre si por rante a diferenciação da célula B.
Sitio de combinação Sítio de combinação eletroforese, o gel foi cortado em vários

do antígeno do antígeno pedaços, cada um contendo pedaços de
DNA de um certo tamanho. O DNA em cada
segmento de gel foi eluído e desnaturado
em cadeias únicas. Parte desse DNA foi
hibridizado com RNA radioativo, que co-
dificava a cadeia leve inteira e foi isolado
do tumor de célula B original. A outra parte
Cadeia leve foi hibridizada com RNA radioativo codifi-
cando somente a região C da cadeia leve (a
Pontes de dissulfeto metade 3’ da mensagem do RNA). Em dois
segmentos do gel, o DNA do embrião li-
gou o mRNA da cadeia leve. O DNA do
primeiro segmento tinha um peso molecular
Cadeia pesada Sitío efetuador (MW) de aproximadamente 6 milhões; o
peso do DNA do segundo segmento foi
de 3.9 milhões. Quando o DNA do embrião
HOOC COOH de camundongo foi hibridizado com o
Figura 10.18 mRNA da região C da cadeia leve, somente
Estrutura de uma proteína imunoglobulina típica (anticorpo). Duas cadeias pesadas idênticas
são ligadas por pontes de dissulfeto. O sítio de combinação do antígeno é composto de regiões o DNA de peso molecular 6 milhões se li-
variáveis (branco) de cadeias leves e pesadas, enquanto o sítio efetuador do anticorpo (que gou ao RNA. Portanto, no embrião do ca-
controla se aglutina antígenos, se liga aos macrófagos, ou entra em secreções mucosas) é deter- mundongo, a região C estava codificada
minado pela seqüência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada (colorida). dentro de fragmentos de DNA com peso
molecular de 6 milhões (entre os sítios de
Criação dos genes de cadeia seqüência do segmento J, um rearranjo que BamHI), enquanto a região V estava codi-
leve dos anticorpos elimina o DNA interveniente. ficada dentro de uma região de peso
Os genes para as cadeias pesadas e leves Esse rearranjo dos genes foi visto inici- molecular de 3.9 milhões (Figura 10.20).
dos anticorpos estão organizados em seg- almente por Hozumi e Tonegawa (1976), que O DNA do tumor linfocítico, entretan-
mentos. Genes de cadeia leve de mamíferos isolaram DNA de um embrião de camundon- to, deu resultados muito diferentes. O único
contêm três segmentos (Figura 10.19). O go e de uma célula B de tumor secretando a DNA linfocítico que ligou o mRNA de ca-
primeiro segmento do gene, V, codifica os cadeia leve.* Eles digeriram separadamente deia leve tinha um peso molecular de 2.4
primeiros 97 aminoácidos da região variável os dois DNAs com a enzima de restrição milhões, e ele também ligou o mRNA da
da cadeia leve. Existem aproximadamente BamHI (veja Capítulo 2), que cliva o DNA região C da cadeia leve. Assim, tanto a re-
300 seqüências V, unidas umas as outras no sempre que ela localiza a seqüência gião C como a V foram codificadas no mes-
genoma do camundongo. O segundo seg- GGATCC. O resultado foi uma série de frag- mo fragmento de DNA! A explicação mais
mento, J, consiste de 4 ou 5 seqüências pos- mentos de DNA, de tamanho determinado simples (confirmada por numerosos labo-
síveis de DNA para os últimos 15-17 resídu- pelo comprimento da molécula de DNA en- ratórios e métodos; veja Bernard et al., 1978;
os da região variável da cadeia leve do tre dois sítios de clivagem. Os fragmentos Brack et al., 1978) foi a de que dois frag-
anticorpo. O terceiro segmento é a região de DNA foram colocados em uma cavidade mentos de genes, um codificando a re-
constante (C) da cadeia leve. Durante a dina extremidade de um gel e submetidos à gião C da cadeia leve e outro codificando
ferenciação da célula B, um dos 300 seg- eletroforese. Enquanto o DNA migrava para uma região V específica da cadeia leve se
mentos V e um dos cinco segmentos J se o eletrodo positivo, os fragmentos menores fundiram para formar um novo gene du-
combinam para formar a região variável do se moviam mais rapidamente do que os mai- rante o desenvolvimento do linfócito. O
gene do anticorpo. Isso é feito movendo ores, separando efetivamente os fragmen- modelo proposto para tal síntese do gene
uma seqüência do segmento V para uma tos de acordo com o tamanho. Após a está apresentado na Figura 10.21.
* Tumores de célula B (mielomas) foram usa-

Figura 10.19 dos porque produzem uma quantidade enorme de
Rearranjo dos genes da cadeia leve durante o desenvolvimento do linfócito B. Enquanto a célula uma imunoglobulina específica (e do mRNA para
B em desenvolvimento ainda está maturando na medula óssea, um dos 300 ou mais segmentos aquela imunoglobulina).
V do gene, se combina com um dos cinco segmentos J do gene e se aproxima do segmento
constante do gene (C).
Organização original do gene
Organização do gene em linfócitos B

produzindo anticorpos de Vn-1 e J4
Figura 10.20 Células de mieloma Camundongo embrionário

Protocolo e resultados do experimento de Hozumi e Tonegawa. DNAs de cé-
lulas de embrião de camundongo e células B de tumores (mielomas) foram DNA é extraído de células
digeridos separadamente em BamHI, separados por eletroforese e eluídos do de mieloma e
gel. Após a desnaturação, cada amostra de DNA eluído foi hibridizada com camundongos embrionários
mRNA radioativo codificando as regiões V e C da cadeia leve da imunoglobu-
lina (total) ou com um mRNA radioativo fragmentado codificando somente a
região C daquela proteína de cadeia leve (a metade 3’). Para o DNA embrio-
nário, as regiões V e C da proteína de cadeia leve foram encontradas em dois
pedaços diferentes de DNA (região V em um pedaço com peso molecular de
3.9x106, e a região C em um fragmento de DNA de peso molecular de 6x106).
No tumor linfocítico, as regiões V e C foram encontradas juntas em um único
fragmento de DNA de peso molecular 2.4x106.
Criação de genes de cadeia

Enzimas de
pesada do anticorpo
restrição
Os genes de cadeia pesada dos anticorpos
contêm mais segmentos do que a cadeia
leve. Segmentos do gene de cadeia pesada DNA é tratado com enzimas
incluem um segmento V (200 diferentes sede restrição dando fragmentos de
qüências para os primeiros 97 aminoácidos), DNA
um segmento D (10 a 15 seqüências diferen- Sonda
tes codificando de 3 a 14 aminoácidos), e de V-CmRNA
um segmento J (4 seqüências para os últi- ou
sonda
mos 15 a 17 aminoácidos da região V). O de CmRNA
próximo segmento codifica a região C. A re-
gião variável da cadeia pesada é formada Fragmentos são
justapondo um segmento V a um segmento desnaturados e
tratados com a
D e a um segmento J (Figura 10.22A,B). Essa sonda marcada para
seqüência da região variável VDJ está ago- V-C ou C
ra adjacente à primeira região constante dos
genes de cadeia pesada—a região Cµ, es- As duas sondas se ligam aos mesmos
pecificamente para anticorpos que podem fragmentos de DNA do mieloma, mas
ser inseridos na membrana plasmática. As- as sondas se ligam a diferentes
sim é formada uma molécula de imunoglo- fragmentos de DNA embrionário
bulina a partir de dois genes criados duran-
te o desenvolvimento do linfócito B no es-
tágio independente do antígeno. Podem ser
formadas cerca de 103 cadeias leves e 104 DNA de mieloma DNA de embrião
cadeias pesadas. Como cada uma é forma- V-CRNA V-CRNA
da independentemente da outra, cerca de C-RNA C-RNA
107 tipos de anticorpos podem ser criados
cpm no híbrido
cpm no híbrido
pela união de uma cadeia leve e uma cadeia

pesada dentro da célula. Cada célula pro-
duz somente um desses 10 7 tipos de
anticorpos e os coloca na membrana celular
para serem usados como receptores de
antígenos. O genoma de cada clone de
linfócito pode ser bastante diferente daquele
de qualquer outra célula. Tamanho do fragmento Tamanho do fragmento
ligando-se à sonda ligando-se à sonda
Mais tarde no desenvolvimento adulto,
algumas células B sofrem outro arranjo cha-
mado troca de classe. Aqui, toda a seqüên-
cia VDJ do gene de cadeia pesada é transfe- e aparelho digestivo, onde protegem o cor- seu receptor de antígeno (Fujimoto e
rido da região Cµ a outra região C. A nova po contra antígenos no ar e nos alimentos. Yamagishi, 1987). As enzimas responsáveis
região C terá propriedades diferentes. Na A célula B não é o único tipo celular pela mediação dos eventos de recombina-
Figura 10.22C e D, a seqüência VDJ é que altera seu genoma durante a diferenci- ção do DNA parecem ser os mesmos nas
transferida para uma região Cα. A seqüência ação. A outra célula importante do sistema linhagens de células B e T. Chamadas
Cα codifica a região constante que permite imune, o linfócito T, também deleta uma recombinases (Schatz et al., 1989; Oettinger
que anticorpos sejam secretados na mucosa porção do seu genoma na construção do et al., 1990), essas duas proteínas reconhecem
PM 3.9x106 PM 6x106
Sítio Bam HI
DNA embrionário
DNA de célula B de tumor
as regiões sinalizadas de DNA imediatamen-

te a montante do DNA recombinável e for- PM 2.4x106
ma um complexo que inicia as quebras na Figura 10.21
fita dupla (Hiom e Gellert, 1997). Os genes Modelo de modificações no DNA entre células embrionárias e o linfócito B, de acordo com os
para essas enzimas, são ativos somente nas dados de Hozumi e Tonegawa (1976).
células pré-B e células pré-T, onde os genes
estão sendo recombinados. Esses genes de mas relacionados à origem da diversidade Um desses elementos, a montante do pro-
recombinases não são ativos em células mados anticorpos. Entretanto, outros proble- motor, é chamado seqüência octa (octa box)
duras, tanto B como T, e também não estão mas foram criados. Cada segmento V tem (Bergman et al., 1984; Parslow et al., 1984),
na maioria de outros tipos de células.* seu próprio promotor a ele ligado. Por que devido a seus oito pares de bases:
não há expressão de cada gene dos seg- ATTTGCAT. Essa seqüência octa foi en-
Regiões cis-reguladoras dos mentos V? Mapeamentos de deleção em contrada em todos os promotores da ca-
genes de imunoglobulinas. genes clonados mostrou que o promotor deia leve da imunoglobulina estudados. O
A descoberta da junção de V(D)J e a troca da cadeia leve da imunoglobulina contém promotor do gene de cadeia pesada da imu-
de classe resolveu a maioria dos proble- várias regiões críticas para a transcrição. noglobulina tem uma sequência octa in-
(A)
Formação da região variável
(B)
Figura 10.22
Troca de classe
Formação da região variável do gene e troca de classe na produção de cadeias pesadas da
imunoglobulina. (A) uma cadeia pesada contém três segmentos (V, D e J) que se juntam
para formar a região variável (V) e a região constante (C). As quatro principais classes
de anticorpos são classificadas com base na região constante (IgA contém Cα: IgM, Cµ;
(C) IgG, Cγ). (B) Antes da apresentação do antígeno, a região variável se forma pela união
dos segmentos V, D e J. Esse segmento VDJ do gene está adjacente à região Cµ e o
anticorpo resultante está localizado na membrana celular. (C) Após a apresentação do
antígeno, pode ser feita uma alça na região do DNA, de tal maneira que o segmento VDJ
fique adjacente a uma outra região C (nesse caso, a região Cα, que permite a anticorpos
penetrar em secreções mucosas). (D) Essa troca de classes é mediada por uma série de
seqüências (S) de trocas, adjacentes a cada uma das regiões constantes. (De acordo com
Davis et al., 1980a,b.)
* Até recentemente, considerava-se que as pro-
teínas recombinase eram encontradas somente em
linfócitos, mas evidência recente (Chun et al., 1991;
Matsuoka et al., 1991) mostrou que eventos de
recombinação e recombinases existem também no
tecido cerebral. Não se conhece a função nas célu-
las neurais, mas é fascinante especular que alguns
dos receptores que ligam o axônio da célula nervo-
sa ao seu alvo específico podem ser feitos pela
recombinação de várias regiões do gene.
(A) Gene da linhagem germinativa: sem transcrição

Região D Região J Intensificador
Figura 10.23
Modelo para a atividade do intensificador da
(B) Gene rearranjado: transcrição da imunoglobu- imunoglobulina. (A) A região do intensifica-
lina dor do gene de cadeia pesada da imunoglobu-
lina parece envolver seqüências entre o seg-
mento J do gene e as seqüências de troca (Sµ)
Intensificador precedendo Cµ. Se o intensificador é removi-
DNA do, a transcrição é muito diminuída. O promo-
tor 5’ precede cada um dos segmentos da re-
gião V do gene e está originalmente muito dis-
tante do intensificador. (B) O rearranjo VDJ
RNA nuclear do gene trás um promotor para perto do inten-
sificador e permite que a transcrição se con-
cretize. (C) Durante a troca de classe, o inten-
mRNA sificador permanece com os segmentos VDJ
enquanto eles são colocados perto de uma nova
região constante (Cγ).
(C) Gene trocado de classe: Transcrição de nova classe de imunoglobulina
Intensificador O rearranjo no gene coloca um deter-
DNA minado promotor na proximidade de um in-
tensificador. Um evento semelhante ocor-
re com o gene de cadeia pesada, e durante
RNA nuclear a troca de classe (quando uma região do
DNA é transformada em alça e deletada), a
região do intensificador permanece próxi-
mRNA ma ao pedaço VDJ (Figura 10.23).
vertida: ATGCAAAT. Quando a seqüên- cia é translocada para genes de globina trans-Regulação da síntese
cia octa é colocada a montante de um gene clonados, a transcrição desses genes tam- de imunoglobulinas
da globina em um linfócito B cultivado, a bém pode ocorrer especificamente em linfó- O rearranjo de genes em si, não é sufici-
transcrição do gene de globina aumenta citos (Picard e Schaffner, 1984). Para que a ente para sua ativação, pois um gene de
de 11 a 18 vezes. Esse aumento é visto so- transcrição ocorra no linfócito, o promotor imunoglobulina rearranjado não transcre-
mente em células linfóides e não foi obser- deve ser trazido para a proximidade do in- verá ativamente quando colocado em um
vado em fibroblastos (Wirth et al., 1987). tensificador. Todos os segmentos V levam fibroblasto ou célula do fígado. Devem
A seqüência do intensificador do gene um promotor, mas somente o segmento V estar presentes fatores trans-reguladores
de cadeia leve da imunoglobulina está loca- trazido próximo à região constante (com seu específicos para a célula em questão.
lizada no primeiro íntron entre a seqüência intensificador) será ativado (Mather e Perry, Staudt e colaboradores, em 1986, identifi-
VJ e a região C (Queen e Baltimore, 1983; 1982). Essa localização ocorre durante a caram dois fatores que se ligam a promo-
Bergman et al.,1984). Quando essa seqüên- construção do gene da imunoglobulina. tores. Para isso, eles incubaram um pe-
queno pedaço de DNA contendo uma
Pre-B B PC Non-B seqüência octa com extratos nucleares de
várias células. Os produtos resultantes fo-
ram analizados em um gel. Se o extrato
Figura 10.24
Ligação não Ensaio de troca de mobilidade em gel. Extratos nucleares de células
específica da linhagem B [pré-B, B e células de plasma (PC)] e células não-B
(linhagens de células cervicais, de fibroblastos, de células precur-
soras dos glóbulos vermelhos do sangue) foram misturadas com
um pequeno segmento de DNA contendo o octâmero. Após incuba-
Ligação específica ção, as misturas foram separadas eletroforeticamente em um gel,
da linhagem B transferidas para papel de nitrocelulose, e hibridizadas com DNA
radioativo complementar à seqüência do octâmero. Na ausência de
uma ligação, fragmento contendo o octâmero migra rapidamente
para o fundo do gel. Todos os núcleos contêm uma proteína que se
liga não-especificamente ao octâmero e impede fortemente a mi-
Fragmento de DNA gração. Os núcleos da linhagem de células B, entretanto, também
somente contêm outra proteína que inibe a migração ligando-se à seqüência
do octâmero. (de Staudt et al., 1986, cortesia de D. Baltimore.)
Figura 10.25 Receptor de

Regulação de NF-κB por I-κB. I-κB se liga à Receptor de antígeno
lipopolissacarídeo
Receptor do fator de
subunidade maior de NF-κB e impede a entrada de célula T ou B necrose tumoral
Entrada
do complexo no núcleo. I-κB pode ser fosforila-
do vírus
do por várias quinases que são ativadas pela
replicação de vírus, antígenos, lipopolissacarídeos
ou o fator α de necrose tumoral. A fosforilação
de I-κB libera NF-κB que pode então entrar no Proteína Outras
núcleo e se ligar aqueles sítios promotores e in- ds RNA quinase C proteínas quinases
tensificadores que ele reconhece. Esses genes in- quinase
cluem os que codificam a cadeia leve da imuno-
globulina kappa, fator de necrose tumoral, IκB inativo
interleucina 2, e o receptor para interleucina 2. O
Fosforilação
vírus da imunodeficiência humana também tem
de IκB
sítios para ligação de NF-κB. NF-κB ativo
Complexo
nuclear não tivesse uma proteína capaz
de se ligar a esse DNA, o pequeno frag- inativo
Núcleo
mento de DNA deveria migrar rapidamen-
te pelo gel. Mas, se uma proteína se ligou Sítio κB Outros sítios
a esse DNA, a migração deveria ser preju-
dicada. Esse ensaio de mudança de mobi-
lidade (Figura 10.24) demonstrou que cada
núcleo tinha pelo menos um fator capaz
de se ligar ao fragmento de DNA. Entre-
tanto, a linhagem de células B (células pré-
B, células B e células de plasma) conti-
nham, além disso, um outro fator capaz de
se ligar especificamente à seqüência octa
do DNA. Essas proteínas ligantes foram
isoladas, e a proteína específica para lin-
fócitos foi denominada Oct2 (NF-A2).
Ensaios similares foram usados para
encontrar uma proteína nuclear restrita à
linhagem de células B, que se ligasse es-
pecificamente às seqüências intensifica-
doras dos genes de cadeia leve das imu-
noglobulinas (Sen e Baltimore, 1986a; al., 1992). Assim, NF-κB pode reconhecer a ra NF-κB e permite sua entrada no núcleo
Atchinson e Perry, 1987). Uma tal proteí- região do seu intensificador somente na- (Ghosh e Baltimore, 1990; Kerr et al., 1991).
na, NF-κ κB, foi encontrada somente em cé- quelas células que ou não sintetizam ou não Além da regulação positiva na trans-
lulas B maduras e células de plasma, e reativam seu IκB- ou seja, em linfócitos madu- crição do gene da imunoglobulina identi-
conhecia a seqüência de ligação 5’- ros (Sen e Baltimore, 1986b; Baeuerle e ficada nas células B, também existe regu-
GGGACTTTCC-3’ no intensificador da ca- Baltimore, 1988). A síntese de cadeias leves lação negativa da produção de imunoglo-
deia leve. Além disso, quando células pré- de imunoglobulinas é provavelmente inici- bulina em células não-B. Parece haver vá-
B são induzidas a se tornarem células B, ada quando um sinal na superfície celular ati- rios sítios ladeando os genes da imuno-
aparece a proteína ativa NF-κB*. va proteínas quinases que podem fosforilar globulina, que são ligados pelas proteí-
Neste ponto o problema da atividade IκB. Considera-se que essa fosforilação libe- nas que inibem a transcrição dos genes
gênica diferencial é levado a outro nível: O
que controla a síntese dos fatores trans- * As células B são as únicas células que sintetizam imunoglobulinas. A célula pré-B pode produzir
reguladores específicos da célula B, como a cadeia pesada mas não a cadeia leve da proteína imunoglobulina. NF-κB ativo também foi
Oct2 ou NF-κB? (Ou seja, para explicar como encontrado em células T ativadas (mas não em inativadas). Genes específicos para a célula T, tais
como os que codificam a interleucina 2 (fator de crescimento da célula T) e seu receptor têm
são produzidas especificamente em uma cé- intensificadores que ligam NF-κB. Essa responsividade a NF-κB pode ser importante na propagação
lula, devemos explicar como essas proteí- do vírus da imunodeficiência humana (HIV). Quando HIV infecta uma célula T, ele induz a formação
nas nucleares são produzidas nessas célu- do NF-κB ativo (Sen e Baltimore, 1986b; Lenardo e Baltimore, 1989). A produção de NF-κB ativo
las específicas.) Parece que a proteína NF- estimula os genes da célula T, que têm sítios nos intensificadores para essa proteína. Assim, a célula
κB está presente em vários tipos de célula, T é estimulada a se proliferar. Ao mesmo tempo, HIV também tem elementos intensificadores de
NF-κB que também o permitem transcrever seus produtos rapidamente. É óbvio que a NF-κB tem
mas está ligada por uma proteína de 65-kDa
um papel muito importante no desenvolvimento de linfócitos normal ou alterado.
chamada Iκ κB (inibidor de kappa). No esta- Pode-se conjecturar o que a proteína, não específica, ligante da seqüência octa, está fazendo em células
do ligado, NF-κB não pode entrar no núcleo não-B. Embora as proteínas Oct1 e Oct2 possam se ligar à mesma seqüência octa, elas exercem seus efeitos
e se ligar ao DNA (Figura 10.25; Henkel et interagindo com outras proteínas em certos promotores (Tanaka et al., 1992).
(Calame, 1989). Proteínas capazes de se ras, dependendo do histórico do desen- final na diferenciação de uma célula. Sa-
ligar a essas regiões silenciadoras dos volvimento da célula. bemos que a transcrição desse gene da
genes da imunoglobulina também foram A análise da transcrição específica da imunoglobulina depende da atividade an-
identificadas em células não-B. Conclui- célula dos genes de cadeia leve da imu- terior de duas proteínas nucleares, Oct2 e
se que a transcrição pode ser estimulada noglobulina progrediu, então, para um NF-κB, cuja atividade é vista somente em
ou inibida por proteínas trans-regulado- nível onde se considera mais o produto linhagens de células B.
Fatores de transcrição básicos do tipo hélice-alça-hélice. HOOC COOH
Hélice Hélice
Outro arranjo proeminente, identificado em proteínas que se ligam aos promotores e
intensificadores do DNA, é o motivo (“motif”) básico hélice-alça-hélice (bHLH). Os
fatores de transcrição específicos do músculo, MyoD e miogenina (discutidos no
Capítulo 9) contêm esse motivo, tal como várias outras proteínas da Drosophila que Alça Alça
determinam as células do seu sistema nervoso periférico: os produtos dos genes
daughterless, achaete-scute e extramacrochaetae. Como veremos no Capítulo 20, os Hélice Hélice
genes que determinam o sexo na Drosophila também contêm o modelo bHLH. As
proteínas bHLH se ligam ao DNA através de uma região de aminoácidos básicos Domínio de Domínio de
(tipicamente resíduos 10 a 13) que precede a primeira α-hélice (Figura 10.26). A hélice ligação do ligação do
contém aminoácidos hidrofóbicos em cada terceira ou quarta posição, fazendo com DNA DNA
que a hélice apresente uma superfície de resíduos hidrofóbicos ao ambiente. Isso
permite à proteína um pareamento, por interações hidrofóbicas, com a mesma proteína
ou outra relacionada, que apresenta tal superfície (Jones, 1990).
Estudos recentes mostraram que homodímeros (entre duas proteínas bHLH idên- Figura 10.26
ticas) não se ligam adequadamente ao DNA. Na realidade, as proteínas bHLH reco- Domínios dos fatores de transcrição básicos
nhecem suas seqüências promotoras de acordo com o seguinte paradigma (Tabela hélice-alça-hélice.
10.2). Existe uma proteína bHLH ubíqua, sintetizada pela maioria das células que
pode formar um dímero com qualquer um de dois parceiros em potencial. Um deles é
um regulador positivo (que estimula a transcrição); o outro parceiro é um regulador
negativo. Quando o regulador positivo se dimeriza com a proteína bHLH ubíqua,
forma-se um complexo ativador que estimula a transcrição dos genes que ele reconhe-
ce. Quando a dimerização da proteína é com o regulador negativo, o produto resul-
tante reprime a transcrição desses mesmos genes. Por exemplo, a família de proteínas
MyoD é ativa na promoção da miogênese quando complexada com as proteínas E12
ou E 47- duas proteínas bHLH ubíquas (French et al., 1991; Lassar et al., 1991). O
desenvolvimento do músculo é inibido quando as proteínas MyoD, E12 ou E47 estão
ligadas à proteína Id (inibidor da diferenciação). A proteínas Id contém o motivo
HLH, mas não a região básica que se liga ao DNA. Dimerização de Id com MyoD, E12
ou E47 interfere com a habilidade dessas proteínas se ligarem ao DNA, e a expressão
de Id na célula impede a atividade das proteínas MyoD (Benezra et al., 1990). A prote-
ína Id é produzida enquanto os precursores da célula muscular ainda estão se dividin-
do, e desaparecem quando os mioblastos deixam o ciclo celular para começar a se
diferenciarem em miotubos. Se Id for super expressa em mioblastos cultivados, eles
não se diferenciarão em miotubos (Jen et al., 1992).
Tabela 2 Dímeros bHLH no desenvolvimento

Neurogênese de Miogênese de Divisão celular
Dímero Drosophila Mamífero de Mamífero
Proteína onipresente daughterless E12, E47 Max
Regulador positivo achaete-scute Família MyoD myc
Regulador negativo extramacrochaetae Id Mad ou Max
& Especulações
Regulando as proteínas bHLH miogênicas:

Governando a troca entre proliferação e diferencia-
ção de células musculares
E XISTEM DUAS MANEIRAS de regu-
lar proteínas bHLH miogênicas,
além da dimerização com Id. Sabe-
se há muito tempo (Stockdale e Holtzer, 1961;
estão presentes para estimular a mitose, a
miogênese não ocorre mesmo que proteí-
nas MyoD ou Myf-5 estejam presentes na
célula (Olson, 1992). A inativação dessas
mente em certas áreas. Esse parece ser o
caso na expressão de MyoD no somito
onde Twist inibe a expressão de MyoD no
dermátomo e no esclerótomo. (Capítulo 9).
Bischoff e Holter, 1969) que células muscu- proteínas bHLH está associada a sua inabi- MyoD pode também ser suprimida pela
lares geralmente não se diferenciam até que lidade em se ligar à seqüência CANNTG do sinalização da proteína do receptor Notch.
a proliferação esteja terminada. As células DNA (onde N é qualquer base) (Brennan et A proteína Notch ativada estimula a trans-
musculares em proliferação não expressam al., 1991). Por que essas proteínas bHLH crição do gene hes-1 que codifica outra pro-
o fenótipo específico do músculo, enquan- miogênicas não podem funcionar? Fatores teína bHLH. Essa proteína parece se ligar à
to que músculos diferenciados não mais se de crescimento tal como o fator de cresci- MyoD, e inibir sua habilidade de funcionar
dividem. Crescimento e diferenciação são mento de fibroblastos (FGF) não somente como um fator de transcrição indutor do
considerados estados mutuamente exclusi- estimulam a transcrição de Id mas também músculo (Sasai et al., 1992; Kopan et al., 1994;
vos no desenvolvimento do músculo es- ativam a proteína quinase C. Essa quinase Jarriault et al., 1995). Como as células do
quelético, e uma vez que a célula muscular induz a fosforilação das proteínas bHLH epiblasto da galinha expressam MyoD e se
abandonou o ciclo celular, ela não pode miogênicas exatamente no seu sítio de liga- tornam músculos quando dissociados em
voltar, mesmo que sejam fornecidos fato- ção ao DNA (Li et al., 1992). Quando esse cultura, é possível que um sinal, mediado
res de crescimento (Konigsberg et al., sítio é fosforilado as bHLH miogênicas não por contacto de célula justaposta, como o
1960; Nadal-Ginard, 1978). Essa exclusivi- ligarão DNA. Assim, enquanto os fatores de Notch, seja responsável pela inibição des-
dade mútua entre diferenciação e prolife- crescimento estiverem presentes e aptos a sa expressão e retenção da pluripotência do
ração é também vista no desenvolvimen- serem recebidos, a miogênese não ocorrerá. epiblasto (Kopan et al., 1994; George-
to de neurônios, adipócitos, células do O segundo tipo de regulação envolve Weinstein et al., 1996).
sangue e queratinócitos da pele. Os me- o impedimento da expressão de MyoD MyoD é freqüentemente chamado “um
canismos para essas trocas durante a onde ela não é necessária. MyoD é um dos gene regulador mestre”, pois seu produto
miogênese parecem envolver a regulação mais poderosos reguladores de transcri- é capaz de converter quase todas as célu-
das proteínas bHLH miogênicas. ção. Como discutido no Capítulo 9, se o las em músculo. O paradoxo é que qual-
O primeiro desses mecanismos é respon- regulador é expresso dentro da maioria das quer “gene controlador mestre” tem que
sável pela prevenção da diferenciação mus- células, essas células se tornam músculo. ser controlado com maestria. Seus produ-
cular prematura quando as proteínas bHLH Isso significa que ele deve ser fortemente tos são tão poderosos que a célula desen-
miogênicas começam a aparecer. Proteínas controlado. Um mecanismo é fazer as célu- volveu numerosos meios- em diferentes
bHLH miogênicas são extremamente sensí- las sintetizarem um inibidor potente da fun- níveis- para impedir sua expressão nas cé-
veis a fatores de crescimento. Enquanto eles ção de MyoD e liberar esse controle so- lulas erradas e nos momentos impróprios.
Fatores de transcrição do zíper básico da leucina
A estrutura dos fatores de transcrição do zíper básico da leucina é muito semelhante

a das proteínas bHLH. As proteínas bZip são dímeros, cada uma de suas subunida-
des, tendo no carboxi terminal, um domínio básico ligante de DNA logo seguido por
uma α hélice contendo vários resíduos de leucina. Essas leucinas estão colocadas
na hélice de tal maneira que elas interagem com outros resíduos de leucinas similar-
mente espaçados em outras proteínas bZIP, para formar um “zíper de leucina” entre
elas, causando a formação de dímeros. Esse domínio é seguido por um domínio
regulador que interage com o promotor para estimular ou reprimir a transcrição
(Landschulz et al., 1988; Pathak e Sigler, 1992). Os fatores de transcrição C/EBP, AP1
e o GCN4 de levedo são membros da família bZip. Métodos genéticos e de
cristalografia de Raios X convergiram em um modelo de ligação de DNA mostrado
Figura 10.27
Representação estereoscópica da região ligante de DNA da proteí-
na bZip, C/EBP, interagindo com 20 pares de bases contendo a
seqüência CCAAT. (Topo) “Vista dorsal” olhando para baixo,
para uma dupla hélice do DNA e paralelamente ao zíper de leucina.
(Embaixo) “Vista lateral” em ângulo reto ao diagrama acima e per-
pendicularmente ao eixo do DNA. Resíduos de leucina conectando
as duas subunidades podem ser vistas embaixo, como também as
“alças da tesoura” no DNA. (Se você não está acostumado a cru-
zar seus olhos para ver a estéreo imagem composta, use um
estereóptico.) (de Pathak e Sigler, 1992.)
na Figura 10.27 (Vinson et al., 1989; Pu e Struhl, 1991). Na figura, as duas α hélices
contendo a região ligante de DNA estão inseridas no sulco maior desse DNA, cada
hélice encontrando uma idêntica seqüência de DNA. A ligação resultante assume a
aparência de uma tesoura ou hemostato.
Sabe-se que existem várias proteínas bZIP que podem se ligar à seqüência CCAAT;
uma das mais importantes é chamada proteína ligante do intensificador CCAAT
(C/EBP). C/EBP tem um papel na adipogênese semelhante ao das proteínas
miogênicas bHLH na miogênese. Expressão precoce de C/EBP em células pré-
adiposas em divisão causa a cessação da divisão celular e a iniciação do fenótipo
adiposo (Umek et al., 1991). (Ao contrário das proteínas bHLH miogênicas, as quais
podem converter células nervosas e fibroblastos em músculos, C/EBP não parece
converter outros tipos de células na linhagem de adipócitos). A proteína bZIP C/EBP
se liga aos intensificadores de numerosos genes específicos de adipose quando a
adipogênese é iniciada em cultura (Figura 10.28; Christy et al., 1989; Kaestner et al.,
1990). mRNA antisenso contra C/EBP suprime a expressão coordenada de mensa-
gens específicas de adipócitos e a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos.
(Samuelsson et al., 1991; Lin e Lane, 1992).
C/EBP também é enriquecido nas células hepáticas, e é um dos mais importantes
reguladores da expressão gênica específica do fígado. Em hepatócitos de camundongo,
(A) (B) (C)
Figura 10.28
Adipogênese (formação de células gordurosas) mediada pelo fator de transcrição C/EBP.
Coloração de lipídios é mostrada no quadro da direita. A coluna da esquerda mostra os
mRNAs para as proteínas SCD1 e GLUT4 que estão envolvidas na diferenciação de adipócitos.
(A) Adipogênese normal na linhagem de células pré-adipócitos 3T3-L1 em cultura. Os genes
SCD1 e GLUT4 são ativados, e as células sintetizam e acumulam grandes quantidades de
triglicerídeos. (B,C) Duas linhagens de células 3T3-L1 transfectadas com RNA antisenso
contra a mensagem C/EBP. Nenhum dos genes está bem expresso, e os níveis de triglicerídeos
são 15 e 5 % do normal (de Lin e Lane, 1992.)
outros fatores de transcrição se ligam às regiões do promotor e intensificador de

genes específicos do fígado durante o desenvolvimento. Entretanto, esses genes não
transcrevem grandes quantidades de proteína (tal como a albumina) até que C/EBP
seja expresso nessas células imediatamente antes do nascimento (Milos e Zaret, 1992).
Outro gene específico de fígado, ativado por C/EBP, é o gene para o fator IX da
coagulação do sangue. Mutações no gene desse fator da coagulação causam a hemofilia
B. Em alguns pacientes, a causa dessa doença foi relacionada às mutações no sítio de
ligação da C/EBP na região promotora do gene do fator IX. Essas mutações impedem
a ligação de C/EBP ao gene (Crossley e Brownlee, 1990).
& Especulações
Armadilhas do intensificador: natural e experimental

Leucemias induzidas por translocação ao mesmo sítio que o complexo c-Myc/ tinuará a se proliferar, aumentando portan-
Um fator de transcrição crítico muito im- Max, ou seja CACGTG (Ayer et al., 1993). to o risco de formação de tumor.
portante para a regulação da divisão celu- O gene c-myc é o homólogo celular do Considerando que os intensificadores
lar é a proteína c-Myc. Essa é um membro gene produtor de câncer, ou oncogene, v- estão aptos a controlar a expressão dos
da classe de proteínas ligantes ao DNA myc do vírus da mielocitomatose aviária genes repórteres não relacionados aos seus
que incorporaram um zíper de leucina e um (Donner et al., 1982). O gene c-myc sintetiza alvos normais, pareceria que essas seqüên-
motivo básico hélice-alça-hélice. As pro- mRNA de curta duração e produtos protéi- cias são reguladores muito poderosos da
teínas c-Myc funcionam de maneira simi- cos quando estimulado por uma variedade especificidade da transcrição de genes. O
lar às proteínas bHLH e bZIP, formando de fatores de crescimento (Kelly et al., 1983). que aconteceria, se uma transposição cro-
heterodímeros que ligam DNA (veja Tabe- Esses produtos do gene c-myc aparecem mossômica espontânea trouxesse um inten-
la 10.2). A c-Myc forma um complexo repentinamente enquanto as células são sificador para uma proteína adjacente a um
ativador quando unida à proteína de am- induzidas do estado G0 ao estado G1 e são gene estrutural para outra proteína? Na mai-
pla distribuição Max. O complexo entre degradados logo em seguida. As proteínas oria dos casos isso não seria importante.
Max e uma proteína inibidora, Mad, cria a c-Myc sinalizam a divisão celular, e se não Mesmo que o intensificador estimulasse a
proteína repressora Mad-Max, que se liga são degradadas rapidamente, a célula con- expressão do gene na célula “errada”, o pro-
duto de uma única célula seria regulado de (A)

forma anormal. Talvez a célula morresse e
fosse substituída por outra. É também pos- Elemento de transposição
sível que os descendentes dessa célula for- contendo um gene
repórter em um promotor
massem um clone de células expressando Promotor Repórter
fraco
uma proteína que as outras células no teci- fraco
do não produziam. Entretanto, se pela
translocação o gene c-myc fosse colocado
próximo a um intensificador de um gene ati-
vamente transcrito, o gene c-myc seria ati- Ativação Transcrição
vado para transcrever grandes quantidades
da mensagem enquanto a célula se diferen-
ciava. Nesse caso, a célula única daria ori- Intensificador Promotor fraco Repórter Gene normalmente
gem a um tumor. regulado pelo
Translocações cromossômicas envol- intensificador
vendo o gene c-myc parecem ser responsá-
(B)
veis por tumores das células B sintetizado-
ras de imunoglobulinas do nosso sistema
imune (Croce, 1987). Aqui, o gene c-myc no
fim do braço curto do cromossomo 8 huma-
no foi translocado para o cromossomo 14, 22
ou 2. Esses três cromossomos contêm os
genes para as proteínas imunoglobulinas, e
o gene c-myc foi translocado para a região
dos intensificadores do gene da imunoglo-
bulina (Leder et al., 1983; Croce, 1985). A quan-
tidade de mRNA de c-myc transcrito desses
cromossomos translocados se correlaciona
com a ativação dos genes da imunoglobuli-
na. Assim, quando os intensificadores dos
genes da imunoglobulina são ativados (du-
rante o desenvolvimento da célula B), eles
ativam o gene adjacente -que agora é c-myc.
O mRNA de c-myc é produzido em quantida-
des enormes e é traduzido em fator de trans-
crição c-Myc. Esse fator instrui a célula a se Figura 10.29
dividir, o que ela continua fazendo na pre- Técnica da armadilha para intensificadores. (A) um gene repórter é fundido a um promotor fraco
sença contínua do fator, assim, se forma o que não pode dirigir uma transcrição sozinho. A construção é injetada no núcleo do ovo e se
tumor chamado linfoma de Burkitt (Nishikura integra no genoma, aleatoriamente. Se a integração for próxima de um intensificador, o gene
et al., 1983; Croce et al., 1984). Nessas situa- repórter será expresso quando o intensificador for ativado, mostrando um padrão de expressão
ções, a translocação do gene c-myc a um de um gene normalmente associado ao intensificador. (B) Expressão do gene repórter em Dro-
intensificador de imunoglobulina em uma úni- sophila injetada com uma armadilha de intensificador. Esses intensificadores são ativos no
ca célula pode ser o causador de toda a desenvolvimento do sistema nervoso do inseto e não estavam identificados antes deste proce-
dimento. (Fotografias cortesia Y. Hiromi.)
leucemia. Realmente, a maior parte das
leucemias resulta de uma única célula.
Vários tipos de leucemias são causa- Identificação de intensificadores repórter sem a ajuda de um intensificador.
das quando outros genes de fatores de por meio de genes repórteres Essa armadilha de intensificador recombi-
transcrição são translocados a regiões dos A habilidade de um intensificador em ativar nante é então introduzida em um ovo ou
intensificadores dos genes da imunoglo- outros genes foi usada pelos cientistas para oócito de várias maneiras (veja Capítulo 2),
bulina. Esses tipos de rearranjos entre re- encontrar novos intensificadores e os genes onde ele se integra aleatoriamente ao geno-
giões codificando fatores de transcrição que os regulam. Para fazer isso faz-se uma ma. Se o gene repórter for expresso, isso signi-
e regiões reguladoras específicas para lin- armadilha para intensificador. A armadilha fica que ele deve ter entrado no domínio de
fócitos, podem ser erros causados pelas consiste de um gene repórter (como o gene um intensificador ativo (Figura 10.29). Isolan-
recombinases VDJ que são específicas para a β-galactosidade de E. coli ou a prote- do essa região do genoma em moscas do tipo
para linfócitos e explicariam porque essas ína fluorescente verde) fundido a um pro- selvagem ou camundongos, o gene normal
translocações são vistas em tantas motor eucarioto relativamente fraco. Esse ativado por esse intensificador pode ser des-
leucemias (Rabbitts, 1991). promotor não iniciará a transcrição do gene coberto (O’Kane e Gehring, 1987). [trancr1.html]
Transativação Ligação a DNA Transativação

Interface de dimerização,
Figura 10.30 ligação de HSP90,
Domínios funcionais dos fatores de transcrição dedo de zinco. função inibitória, transativação
Cisteína (C) e histidina (D) coordenam um átomo de zinco,
causando a formação de alças, “dedos de zinco”.
Fatores de Transcrição Dedo de Zinco
Outro tipo de domínio ligante a DNA é o motivo dedo de zinco. Proteínas dedo de zinco
incluem: WT-1 (um fator de transcrição importante, crítico na formação dos rins e das
gônadas); o fator de transcrição de ampla distribuição, Sp1; o fator de transcrição de
5S rRNA, TFIIIA de Xenopus; Krox 20 (uma proteína que regula a expressão gênica no
desenvolvimento do cérebro posterior); Egr-1 (que compromete o desenvolvimento
dos leucócitos para a linhagem dos macrófagos); Krüppel (uma proteína que especifi-
ca as células abdominais na Drosophila); e numerosos fatores de transcrição ligantes
de esteróides. Cada uma dessas proteínas tem dois ou mais “dedos ligantes de DNA”,
domínios em α hélice, cujos aminoácidos centrais tendem a ser básicos. Esses domíni-
os estão ligados em fila e são estabilizados por um íon de zinco localizado centralmen-
te e coordenado por duas cisteínas (na base da hélice) e duas histidinas internas
(Figura 10.30). A estrutura cristalina mostra que os dedos de zinco se ligam no sulco
principal do DNA.
A proteína WT-1 contém quatro regiões dedos de zinco, e é usualmente expressa
nos rins e gônadas fetais. Pessoas com um alelo mutante WT1 (geralmente uma deleção
do gene ou da região de dedo de zinco) apresentam malformações urogenitais e de-
senvolvem o tumor de Wilm nos rins (Haber et al., 1990; Bruening et al., 1992; veja
Capítulo 17). Em camundongos, ambos os genes WT1 podem ser deletados por
endereçamento de genes (“gene targeting”), e os camundongos resultantes morrem
no útero, não tendo nem rins nem gônadas (Kriedberg et al., 1993). O fator WT1 se liga
às regiões reguladoras de vários genes que são ativos durante o desenvolvimento dos
rins e também se considera que ele inibe a expressão de certos fatores de crescimento
(especialmente o fator de crescimento II semelhante à insulina) no rim em desenvolvi-
mento (Drummond et al., 1992).
Receptores Nucleares de Hormônios e

Seus Elementos Responsivos a Hormônios
Hormônios esteróide específicos são conhecidos por aumentar a transcrição de deter-

minados conjuntos de genes. Uma vez que o hormônio entra na célula, ele se liga à
proteína de seu receptor específico, que assume uma conformação que lhe permite
penetrar no núcleo e ligar seqüências particulares de DNA (Miesfeld et al., 1986; Green
e Chambon, 1988). A família dos receptores de hormônios esteróides inclui proteínas
que reconhecem estrógenos, progesterona, testosterona e cortisona, como também
lipídios não esteróides como o ácido retinóico, a tiroxina e a vitamina D. As seqüências
de DNA capazes de ligar receptores nucleares de hormônios são chamadas elementos
responsivos a hormônios, e podem ser promotores ou intensificadores. Um grupo de
(A) PROTEÍNA Trans- Ligação Ligação a

ativação a DNA hormônio
(B)
Dedos de zinco
Cadeia principal
da proteína
Módulo 1 Módulo 2
(C) DNA
Elemento responsivo a glicocorticóide
Figura 10.31
Elemento responsivo a estrógeno
Organização estrutural do receptor de hor-
mônios de proteínas ligantes de DNA. (A)
Elemento responsivo à tiroxina
e ao ácido retinóico Estrutura geral de uma proteína ligante de
hormônio esteróides. As funções de cada fra-
ção foram determinadas analisando os efeitos
de mutações em cada uma dessas regiões e
esteróides inclui os hormônios glicocorticóides (cortisona, hidrocortisona e o hormô- produzindo moléculas de proteínas quiméri-
cas tendo regiões derivadas de diferentes pro-
nio sintético dexametasona). Esses se ligam aos receptores de hormônios glicocorti-
teínas receptoras. Uma estrutura similar é
cóides e lhes permitem se ligar aos elementos responsivos aos glicocorticóides nos vista no receptor do ácido retinóico e no re-
cromossomos (Figura 10.31). ceptor do hormônio tireoideano. (B) Região
Os elementos responsivos aos hormônios esteróides são muito semelhantes entre dedo de zinco, ligante de DNA do receptor de
si e são reconhecidos pelas proteínas muito relacionadas. As proteínas receptoras de glicocorticóides. Resíduos enquadrados no
esteróides contêm, cada uma, três domínios funcionais: (1) um domínio ligante de módulo 1 discriminam entre elementos
hormônio, (2) um domínio ligante de DNA que reconhece o elemento responsivo ao responsivos a estrógenos ou glicocorticóides.
hormônio, e (3) um domínio de trans-ativação que está envolvido na mediação do sinal Resíduos nos círculos estão envolvidos na
para o início da transcrição. Essas funções podem sobrepor-se parcialmente, e todos dimerização. (C) A região dedo de zinco do
receptor de glicocorticóide ligada a seu ele-
os domínios parecem ter algum papel na ativação da transcrição (Beato, 1989). Para
mento responsivo. As seqüências de DNA
ocorrer a ativação transcricional, o receptor deve penetrar no núcleo e dimerizar com para os elementos responsivos estão mostra-
uma proteína similar ligante de hormônio. A ligação do hormônio ao seu domínio das à esquerda. Note que elas são palíndro-
ligante de hormônio pode ser necessária para a dimerização, translocação para o nú- mos invertidos, de modo que cada dímero é
cleo, e habilidade da região ligante de DNA em reconhecer o elemento responsivo a exposto ao mesmo sítio. N, qualquer base;
hormônio. (Kumar et al., 1987) GRE, elemento responsivo a glicocorticóide
Os elementos responsivos aos hormônios dentro do DNA foram inicialmente (e progesterona); ERE, elemento responsivo
identificados por ensaios de ligação competitiva (Pfahl, 1982; Karin, 1984), onde a estrógeno; TRE, elemento responsivo à
fragmentos de restrição específicos do DNA foram testados para verificar sua habi- tiroxina e ácido retinóico. A distinção entre
receptores ligando glicocorticóides ou
lidade de ligação a receptores de hormônios carregando hormônios radioativos.
progesterona versus receptores ligando
Usando vários fragmentos derivados de enzimas de restrição do DNA e comparan- tiroxina ou ácido retinóico é determinada pelo
do as seqüências de vários elementos responsivos a glicocorticóides, foi determi- espaçamento dos elementos responsivos, por
nado que a seqüência de consenso do elemento responsivo ao glicocorticóide é quantidades limitantes de receptores, e por
AGAACANNNT-GTTCT (onde N pode ser qualquer base). Mostrou-se que essas outras interações de elementos cis. (De acor-
seqüências ligantes de glicocorticóides agem como intensificadores: quando o do com Kaptein, 1992.)
(A) Gene viral responsivo a hormônio Figura 10.32

Teste para a seqüência do intensificador de gli-
cocorticóide. (A) Um vírus recombinante con-
tendo o intensificador responsivo ao glicocorti-
Seqüência ligante Gene viral não responsivo ao cóide do vírus de tumor mamário de camundon-
de glicocorticóide hormônio (timidina quinase) go e o gene da timidina quinase do vírus de Her-
pes simplex podem se integrar no genoma de
Enzimas de Enzimas de uma célula sem o gene da timidina quinase. Pelo
restrição restrição
tratamento com glicocorticóides, o gene recom-
binante transcreve a timidina quinase viral. P,
região promotora; TK, gene da timidina quinase;
VG, gene viral do vírus do tumor mamário de
Ligação camundongo. (B) Micrografia eletrônica dos ele-
e mentos intensificadores de glicocorticóides,
seleção mostrando o receptor de hormônio ligado àque-
la região do gene. (A modificado de Chandler et
al., 1983: B de Payvar et al., 1983, cortesia de
K. R. Yamamoto.)
Precipitar vírus contendo gene
recombinante com fosfato de cálcio e
sobrepor em células sem timidina quinase
(B)
Algumas células incorporam

o gene recombinante em
seus cromossomos
Estimular com
glicocorticóide
Timidina quinase é induzida
elemento responsivo ao glicocorticóide foi ligado a genes que normalmente não são
dependentes de hormônio, aqueles genes se tornaram responsivos aos glicocorti-
cóides (Figura 10.32; Chandler et al.,1983).
A ligação da proteína receptora ao elemento intensificador responsivo ao hor-
mônio é feita através da região do dedo de zinco no domínio de ligação ao DNA
(Green et al., 1988). Quando são produzidas proteínas quiméricas, onde o domínio
do dedo de zinco do receptor de estrógeno substitui a mesma região do receptor
de glicocorticóide, a proteína reconhece o DNA que tem elementos responsivos a
estrógenos e faz com que o gene seja responsivo aos glicocorticóides. Os amino-
ácidos críticos parecem se localizar na “articulação” do dedo de zinco (Danielsen
et al., 1989; Umesono e Evans, 1989). Mesmo mudando somente dois aminoácidos
na articulação da região do dedo de zinco já haverá mudança na especificidade da
proteína ligante. Assim, mesmo que os domínios de ligação a DNA das proteínas
receptoras de hormônios sejam muito semelhantes, eles podem distinguir diferen-
ças sutis nas seqüências dos intensificadores. Por exemplo, a seqüência
(palindrômica) 5’-GGTCACTGTGACC-3’ é um forte elemento intensificador
responsivo a estrógeno que ligará a proteína receptora contendo estrógeno. Duas
mutações simétricas nessa seqüência, dando 5’-GGACACTGTGTCC-3’, converte-
rá esse DNA em um intensificador responsivo ao glicocorticóide (Klock et al.,
1987; Martinez et al., 1987). Dadas as similaridades entre proteínas receptoras de (A)
“Enhanceosome”
hormônios e as similaridades entre os elementos responsivos a hormônios, é prová-
vel que cada hormônio esteróide é o mediador de sua ativação transcricional usan-
do o mesmo mecanismo geral.
Proteínas que dobram o DNA

Além das proteínas ligantes de DNA, existe um conjunto de fatores de transcrição que
funciona primariamente como proteínas que dobram o DNA. A maioria dessas prote-
ínas se caracteriza por um elemento de ligação ao DNA chamado HMG box, um con-
Sistema basal da transcrição
junto de cerca de 80 aminoácidos que medeia a ligação dessas proteínas ao sulco
menor do DNA. Essas proteínas incluem o fator determinante do sexo do cromosso-
mo Y, SRY (a ser discutido no Capítulo 20), a proteína LEF-1 intensificadora do
linfócito, e as proteínas HMG-1(Y) e HMG-2 da cromatina. Considera-se que essas
proteínas não ativam a transcrição pela interação direta com o aparelho de transcri-
ção. Ao contrário, a hipótese é que elas dobram o DNA de modo que ativadores e
repressores são colocados em contacto. Por exemplo, a ligação de SRY ao DNA
causa uma dobra de 70o-80o na hélice, convertendo o “I” em um “L”. Mutações pon-
tuais que impedem esse dobramento também impedem a proteína de mediar a forma-
ção de testículos. Considera-se que a proteína SRY dobra o DNA de modo que fato-
res que, de outra forma, estariam afastados no cromossomo são colocados em contacto
(veja Figura 20.5; Werner et al., 1995).
As proteínas que dobram DNA podem criar estruturas tridimensionais chamadas
“enhanceosomes” (Thanos e Maniatis, 1995). Um modelo para tal “enhanceosomes”
é mostrado na Figura 10.33A. Thanos e Maniatis mostraram que interações proteína- Figura 10.33
proteína diretas entre fatores de transcrição são muito facilitadas pela presença de Estrutura de um “enhanceosome”. (A) A pro-
teína que dobra DNA, HMG-I(Y), empaco-
HMG-1, uma proteína dobradora de DNA. Existem três sítios para essa proteína dentro
ta uma espiral 60 pares de bases do DNA ao
do intensificador para o gene interferon-β humano (IFNβ), e esses sítios são essenci- redor de ativadores transcricionais NF-κB
ais para a ativação sinérgica do complexo pelos fatores de transcrição. Eles também (o complexo p50/p65), IRF1, e ATF2/c-Jun.
mostraram que a mera presença desses fatores de transcrição não é suficiente para a O HMG-I(Y) está no sulco menor, enquan-
ativação do promotor de IFNβ. Os fatores de transcrição tinham que estar na ordem to os outros fatores de transcrição operam
correta no intensificador. Embaralhando os elementos de ligação do DNA, eles produ- no sulco principal da dupla hélice. Uma vez
ziram diferentes combinações. Somente a combinação do tipo selvagem foi eficiente. que o “enhanceosome” é montado, ele
Thanos e Maniatis mostraram também que a fase helicoidal é importante. Adicionando contata o sistema basal de transcrição em
um pouco de DNA que causava uma meia volta da hélice, o intensificador era inativado. vários sítios. (B) O DNA tem inclinação de
–20o, antes da formação do “enhanceosome”.
Inserindo outra volta de meia hélice, tornava o intensificador novamente ativo. Por-
Após a formação do “enhanceosome” ele se
tanto, o arranjo linear dos fatores de transcrição e sua organização tridimensional era inclina na direção oposta +26o. Esse último
crítica. A proteína HMG-1 ligava todos eles no “enhanceosome”. Quando esse estava complexo estimula a transcrição. (A de acor-
completo, o DNA que antes tinha uma inclinação natural de –20o, agora estava com do com Thanos e Maniatis, 1995; B de acor-
uma inclinação de +26o. Mais ainda, um intensificador inativo foi transformado em um do com Falvo et al., 1995.)
ativador (Figura 10.33B; Falvo et al., 1995).
Ativação dependente de contexto ou silenciamento

As interações entre os receptores de esteróides e outras proteínas reguladoras da
transcrição podem determinar se o efeito do esteróide é positivo ou negativo. Diamond
e colaboradores (1990) demonstraram que o efeito dos hormônios glicocorticóides
na transcrição do gene Proliferin do camundongo pode ser positivo ou negativo
dependendo do estado fisiológico anterior da célula. Uma seqüência de 25 pares de
bases a montante do gene Proliferin pode ligar o receptor de glicocorticóide e o
dímero bZip de c-Jun e c-Jun ou de c-Jun e c–Fos. A ligação de c-Jun a esse sítio é
necessária para a função do receptor de glicocorticóide. Se o dímero c-Jun/c-Jun
estivesse presente nesse sítio (sem o receptor de glicocorticóide) haveria pouca
transcrição. Essa transcrição é dramaticamente aumentada pela adição de glico-
corticóides (Figura 10.34). Entretanto, se o dímero c-Jun/c-Fos estivesse presente
Figura 10.34 Sem glicocorticóide Com glicocorticóide

Efeitos alternativos intensificadores e silenciadores dos elementos
Hormônio
responsivos a glicocorticóides a montante do gene Proliferin do ca-
mundongo. O efeito do glicocorticóide depende da condição anterior Sítio de iniciação Receptor de
da célula (isto é, se altas concentrações de c-Fos estavam sendo da transcrição glicocorticóide
sintetizadas). As setas representam transcrição do gene Proliferin.
O círculo grande representa o receptor de glicocorticóide ligado ao Sem c-Jun
hormônio. A proteína c-Jun é representada como um círculo menor, nem c-Fos
enquanto a proteína c-Fos é um pequeno quadrado. (De acordo com Sem transcrição Sem transcrição
Diamond et al., 1990.)
c-Jun:c-Jun
c-Jun: c-Jun
Pouca transcrição Muita transcrição
c-Jun: c-Fos
c-Jun: c-Fos
Muita transcrição Pouca transcrição
no sítio, ele poderia dirigir uma transcrição extremamente eficiente do gene Proliferin.
Essa transcrição é inibida pela presença de glicocorticóides. Assim, se o
glicocorticóide tem um efeito estimulador ou inibidor na transcrição do gene
Proliferin depende do estado fisiológico anterior da célula. Uma única seqüência de
DNA ligando um determinado receptor de hormônio pode ser tanto um intensifica-
dor como um silenciador para a mesma proteína.
Existem outras maneiras para um elemento cis-regulador ser ativador em algumas
situações e repressor em outras. Por exemplo, o fator de transcrição Krüppel da
Drosophila (uma proteína cuja atividade veremos no Capítulo 14, é responsável
pela formação do tórax e abdômen superior da mosca) é um ativador em baixas
concentrações e um repressor em altas concentrações. Em baixas concentrações, ele
se liga a seu elemento cis-regulador no DNA, e interage com TFIIB para facilitar a
construção do complexo de iniciação da transcrição. Em altas concentrações, ele se
liga a si mesmo, e os dímeros resultantes não complexam com TFIIB (Sauer et al.,
1995). Em lugar disso, os dímeros interagem com TFIIE e podem bloquear sua fun-
ção. Se a proteína p53 supressora de tumor é um ativador ou repressor depende da
estrutura do promotor do gene específico. Se existe no promotor um elemento ligante
de p53, a proteína p53 age como um ativador. Se não existe um elemento p53 no
promotor, p53 pode se ligar a TAF em TFIID e impedir a transcrição. Ela pode tam-
bém interagir com o fator de transcrição WT1. Esse fator usualmente é um ativador
de transcrição, mas se está ligado à p53, se torna um repressor* (Figura 10.35; Seto
et al., 1992; Maheswaran et al., 1993).
*Temos boa e má novidades. A boa novidade é que até o fim desta década, conheceremos a maioria,
senão todos os fatores de transcrição ativos em muitos tipos de células, e como eles interagem para iniciar
ou reprimir a transcrição. A má notícia é que muitos de nós teremos que aprender físico-química para
entender esses dados.
(A) Figura 10.35

Ativação Sem ativação
Proteína Fatores de transcrição podem ser ativadores
Proteína
Krüppel ou repressores, dependendo do contexto. (A)
Krüppel
Proteína Krüppel em baixas concentrações
estimula TFIIB e ativa a transcrição. Em al-
tas concentrações, forma dímeros que não se
Elemento Elemento ligam a TFIIB (e que podem interferir com
ligante de Kr ligante de Kr TFIIE). (B) A proteína p53 é um ativador
onde existem sítios específicos de ligação. Em
(B) Ativação Sem ativação alguns promotores, entretanto, ela pode se
ligar a TFIID e inativá-lo quando tais sítios
estão ausentes. (C) A proteína WT1 é um
ativador quando p53 está ausente. Na pre-
sença de altas concentrações de p53, a ligação
Elemento de WT1 bloqueia a transcrição.
ligante de p53
(C) Ativação Sem

ativação
Elemento Elemento
ligante de WT1 ligante de WT1
Regulação da atividade do fator de transcrição

Se os fatores de transcrição são proteínas que regulam a expressão de determinados
genes, então como os fatores de transcrição são regulados por si próprios? Uma ma-
neira óbvia é regular a síntese dos fatores de transcrição por outros fatores de trans-
crição. Esse método está presente no desenvolvimento de Drosophila, no qual existe
uma cascata de sínteses de fatores de transcrição (veja Capítulo 14). Em mamíferos,
vários fatores de transcrição são igualmente regulados pela síntese de outros fatores
de transcrição. A ativação do fator de transcrição Pit-1 na pituitária de mamíferos, por
exemplo, é realizada pela ligação do fator de transcrição contendo o homeodomínio
Prop1 à seqüência ladeando o terminal 5’ do gene Pit-1 durante um estágio anterior do
desenvolvimento da pituitária (Sornson et al., 1996).
Além disso, fatores de transcrição freqüentemente têm intensificadores muito com-
plexos e promotores que permitem sua expressão somente em certas células. O gene
Myogenin do camundongo, por exemplo, é expresso no miótomo, arcos faríngeos e
brotos dos membros. Parece haver pelo menos três sítios separáveis na região regula-
dora a montante para esse gene. O sítio mais próximo é necessário para a transcrição
desse gene nos brotos dos membros. Se esse sítio é mutado, o gene Myogenin não é
lá transcrito. Um segundo sítio, mais a montante, é necessário para a expressão de
Myogenin nos brotos de membros, arcos faríngeos e células centrais dos somitos
posteriores (Figura 10.36; Cheng et al., 1993; Yeo e Rigby, 1993). Um terceiro sítio,
ainda mais a montante, é necessário para aumentar a eficiência da transcrição do gene.
Esses três sítios ligam diferentes fatores de transcrição. Uma situação semelhante
parece existir para myf-5, onde regiões diferentes do DNA regulam os diferentes ele-
mentos dos padrões de expressão (Prancha 24; Patapoutian et al., 1993).
Outro mecanismo de regulação da atividade de fatores de transcrição é por fosfo-
rilação. Em um grupo de casos, a proteína do fator de transcrição está presente, mas
inativa, e a fosforilação ativa a proteína dormente. Como discutimos antes, a fosforila-
ção de uma fator de transcrição seqüestrado ou seu inibidor (como IκB) pode liberar a
(A) (B) (C)
Figura 10.36
A expressão de Myogenin no embrião de camundongo de 10.5 dias. Um gene repórter da β-
galactosidase foi ligado às seqüências reguladoras a montante do gene Myogenin, e isso foi usado
para produzir camundongos transgênicos. Os embriões transgênicos com 10.5 dias foram cora-
dos para identificar a presença da β-galactosidade bacteriana. (A) Região promotora de Myogenin
selvagem, mostrando todos os lugares onde o gene Myogenin é usualmente expresso. (B) Ex-
pressão de um promotor de Myogenin com uma mutação em um sítio próximo ao gene Myogenin.
Não há transcrição desse gene nos brotos dos membros. (C) Expressão de um promotor de
Myogenin com uma mutação em um sítio mais a montante do gene. Não é vista transcrição do
promotor nos arcos faríngeos, membros ou células centrais posteriores do miótomo. (de Cheng
et al., 1993.)
inibição e permitir ao fator de transcrição (nesse caso NF-κB) penetrar no núcleo e

ligar sua seqüência de DNA. A fosforilação também pode funcionar mais diretamente.
Como discutido no Capítulo 3, os fatores de transcrição JAK/STAT estão presentes
no citoplasma mas somente entram no núcleo quando são fosforilados em resposta a
um sinal na membrana celular. A fosforilação também pode ser usada para reprimir
fatores de transcrição, como quando a ligação de DNA por Pit-1, Oct1, ou miogenina
é inibida por estarem fosforilados (Hunter e Karin, 1992).
Concluímos que a atividade dos fatores de transcrição pode ser regulada em dife-
rentes níveis. Como cada gene é freqüentemente regulado por vários fatores de trans-
crição, a célula tem muitas opções sobre como expressar certos genes em somente
certos tipos de células. Nos últimos cinco anos, nosso conhecimento sobre fatores de
transcrição progrediu imensamente e nos deu uma nova e dinâmica visão da expressão
gênica. O gene, ele próprio, não é mais visto como uma entidade independente con-
trolando a síntese de proteínas. Ao contrário, o gene dirige e é dirigido pela síntese
de proteínas. Angier (1992) escreve:
Uma série de novas descobertas sugere que o DNA é mais parecido a um certo
tipo de político, rodeado por um rebanho de manipuladores e consultores de
proteínas que devem massageá-lo vigorosamente, torcê-lo e, ocasionalmente,
reinventá-lo antes que o grande plano do corpo possa fazer algum sentido.
Certamente, as interações entre o DNA e seus fatores de transcrição estão levando

a relação interativa do núcleo e do citoplasma a novos e esplendidamente complexos
níveis. Até agora, focalizamos nossa atenção no relacionamento dos fatores de trans-
crição ao DNA. Mas os fatores de transcrição não contemplam um mero DNA. Ao
contrário, eles se confrontam com um complexo de proteína e DNA altamente
estruturado chamado cromatina. Para iniciar a transcrição, é necessário considerar
estruturas celulares de ordem maior; continuaremos nossa discussão sobre a regula-
ção transcricional do desenvolvimento no próximo capítulo.
LITERATURA CITADA
Akoulitchev, S., Mäkelä, T. P., Weinberg, R. A. Brack, C., Hirama, M., Lenhard-Schuller, R. and Chun, J. J. M., Schatz, D. G., Oettinger, M. A.,
and Reinberg, D. 1995. Requirement for TFIIH Tonegawa, S. 1978. A complete immunoglobu- Jaenisch, R. and Baltimore, D. 1991. The
kinase activity by RNA polymerase II. Nature lin gene is created by somatic recombination. recombination activating gene 1 (RAG-1) is
377: 557-560. Cell 15: 1-14. present in the murine central nervous system.
Cell 64: 189-200.
An, W. and Wensink, P. C. 1995. Three protein Brennan, T., Edmondson, D. G., Li, L. and Olson,
binding sites form an enhancer that regulates sex- E. N. 1991. Transforming growth factor P Comai, L., Tanese, N. and Tjian, R. 1992.
and fat body-specific transcription of Drosophi- represses the actions of myogenin through a The TATA-binding protein and associated
la yolk protein gene. EMBO J. 14: 1221-1230. mechanism independent of DNA binding. Proc. factors are integral components of the RNA
Nall. Acad. Sci. USA 88: 3822-3826. polymerase I transcription factor, SLI. Cell
Angier, N. 1992. A first step in putting genes 68:965-976.
into action: Bend the DNA. New York Times, Bruening, W. and seven others. 1992. Germline
August 4,1992, pp. C1, C7. intronic and exonic mutations in the Wilms’ Conaway, R. C., Pfeil-Garrett, K., Hanley, J. P.
tumor gene (WTI) affecting urogenital and Conaway, J. W. 1991. Mechanism of promoter
Atchinson, M. L. and Perry, R. P. 1987. The development. Nat. Genet. 1: 144-148. selection by RNA polymerase II: Mammalian
role of K-enhancer and its binding factor NF- transcription factors a and bg promote entry of
KB in the developmental regulation of K gene Bunick, D., Zandomeni, R., Ackerman, S. and
polymerase into the preinitiation complex. Proc.
transcription. Cell 48: 121-128. Weinmann, R. 1982. Mechanism of RNA
polymerase II-specific initiationof transcription
Ayer, D. E., Kretzner, L. and Eisenman, R. N. in vitro: ATP requirement and uncapped runoff Crenshaw, E. B., Kalla, K., Simmons, D. M.,
1993. Mad: A heterodimeric partner for Max transcripts. Cell 29: 877-886. Swanson, L. W. and Rosenfeld, M. G. 1989. Cell-
that antagonizes Myc transcriptional activity. specific expression of the prolactin gene in
Cell 72: 211-222. Buratowski, S., Hahn, S., Guarente, L. and Sharp, P.
transgenic mice is controlled by synergistic
A. 1989. Five initiation complexes in transcription
Baeuerle, P. A. and Baltimore, D. 1988. IKB: A interactions between promoter and enhancer
initiation by RNA polymerase II. Cell 56: 549-561.
specific inhibitor of the NF-kB transcription elements. Genes Dev. 3: 959-972.
factor. Science 242: 540-545. Buratowski, S., Sopta, M., Greenblatt, J. and
Croce, C. M. 1985. Chromosomal translocati-
Sharp, P. 1991. RNA polymerase II-associated
Banerji, J., Olson, L. and Schaffner, W. 1983. A ons, oncogenes, and B-cell tumors. Hosp. Pract.
proteins are required for a DNA conformation
lymphocyte-specific cellular enhancer is located 20(l): 41-48.
change in the transcription initiation complex.
downstream of the joining region in immunoglo- Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7509-7513. Croce, C. M. 1987. Role of chromosome trans-
bulin heavy chain genes. Cell 33:729-740. locations in human neoplasia. Cell 49: 155-156.
Calame, K. L. 1989. Immunoglobulin gene
Beato, M. 1989. Gene regulation by steroid transcription: Molecular mechanisms. Trends Croce, C. M., Thierfelder, W., Erikson, J.,
hormones. Cell 56: 335-344. Genet. 5: 395-399. Nishikura, K., Finan, J., Lenoir, G. M. and
Behringer, R. R., Mathews, L. S., Palmiter, R. Nowell, P. C. 1984. Transcriptional activation
Chandler, V. L., Maier, B. A. and Yamamoto,
D. and Brinster, R. L. 1988. Dwarf mice produced of an unarranged and untranslocated c-myc
K.R. 1983. DNA sequences bound specifically
by genetic ablation of growth hormone- oncogene by translocation of a C2, locus in
by glucocorticoid receptor in vitro render a
expressing cells. Genes Dev. 2: 453-461. Burkitt lymphoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci.
heterologous promoter hormone responsive in
LISA 80: 6922-2926.
Benezra, R., Davis, R. L., Lockshon, D., Turner, vivo. Cell 33: 489-499.
D. L. and Weintraub, H. 1990. The protein Id: A Crossley, M. and Brownlee, G. G. 1990.
Chen, J. -L., Attardi, L. D., Verrijzer, C. P.,
negative regulator of helixloop-helix DNA Disruption of a C/EBP binding site in the factor
Yokomori, K. and Tjian, R. 1994. Assembly of
binding proteins. Cell 61: 49-59. IX promoter is associated with haemophilia B.
recombinant TFIID reveals differential cofactor
Nature 345: 444-446.
Bergman, Y., Rice, D., Grosschedl, R. and requirements for distinct transcriptional
Baltimore, D. 1984. Two regulatory elements for activators. Cell 79: 93-105. Cullen, K. E., Kladde, M. P. and Seyfred, M. A.
immunoglobulin ic light chain gene expression. 1993. Interaction between transcriptional
Chen, P.-L., Scully, P., Shew, J.-Y., Wang, J. Y. J.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045. regulatory regions of prolactin chromatin.
and Lee, W.-H. 1989. Phosphorylation of the
Science 261: 203-206.
Bernard, O., Hozumi, N. and Tonegawa, S. 1978. retinoblastoma gene product is modulated during
Sequences of mouse immunoglobulin light chain the cell cycle and cellular differentiation. Cell Danielsen, M. Hinck, L. and Ringold,G. M. 1989.
genes before and after somatic change. Cell 15: 58: 1193-1198. Two amino acids within the knuckle of the first
1133-1144. zinc finger specify DNA response element
Cheng, T.-C., Wallace, M., Merlie, J. P. and Olson,
activation by the glucocorticoid receptor. Cell
Bischoff, R. and Holtzer, H. 1969. Mitosis and E. N. 1993. Separable regulatory elements
57: 1131-1138.
the processes of differentiation of myogenic cells govern myogenin transcription in mouse
in vitro. J. Cell Biol. 41: 188-200. embryogenesis. Science 261: 215-218. Davis, M. M., Calame, K., Early, P. W., Livant,
D. L., Joho, R., Weissman, 1. L. and Hood, L.
Bodner, M. and Karin, M. 1987. A pituitaryspecific Chi, T. and Carey, M. 1996. Assembly of the
1980a. An immunoglobulin heavy chain gene is
trans-acting factor can stimulate transcription isomerized TFIIA-TFIID-TATA ternary complex
formed by at least two recombinational events.
from the growth hormone promoter in extracts is necessary and sufficient for gene activation.
Nature 283: 733-739.
of non-expressing cells. Cell 50: 267-275. Genes Dev. 10: 2540-2550.
Davis, M. M., Kim, S. K. and Hood, L. 1980b.
Boulet, A. M., Erwin, C. R. and Rutter, W. J. Christy, R. J. and seven others. 1989. Differentiation-
Immunoglobulin class switching: Developmen-
1986. Cell-specific enhancers in the rat induced gene expression in 3T3-Ll preadipocytes:
tally regulated DNA rearrangements during
exocrine pancreas. Proc. Nall. Acad. Sci. USA CCAAT/enhancer binding protein interacts with and
differentiation. Cell 22: 1-2.
83:3599-3603. activates the promoter of two adipocyte-specific
genes. Genes Dev. 3: 1323-1335.
Diamond, M. I., Miner, J. N., Yoshinaga, S. K. Garabedian, M. J., Hung, M.-C. and Wensink, P. Hozumi, N. and Tonegawa, S. 1976. Evidence
and Yamamoto, K. R. 1990. Transcription C. 1985. Independent control elements that for somatic rearrangement of immunoglobulin
factor interactions: Selectors of positive and determine yolk protein gene expression in genes coding for variable and constant regions.
negative regulation from a single DNA element. alternative Drosophila tissues. Proc. Natl. Acad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 3628-3632.
Science 249: 1266-1272. Sci. USA 82:1396-1400.
Hunter, I and Karin, M. 1992. The regulation
Dierks, P., van Ooyen, A., Chochran, M. D., Gedamu, L. and Dixon, G. H. 1978. Effect of of transcription by phosphorylation. Cell 70:
Dobkin, C., Reiser, J. and Weissman, C. 1983. enzymatic clecapping on protamine messenger 375-387.
Three regions upstream from the cap site are RNA translation in wheat-germ S30. Biocheni.
Jacq, X., Brou, C., Lutz, Y., Davidson, I.,
required for efficient and accurate transcription Biophys. Res. Commun. 85: 114-124.
Chambon, P. and Tora, L. 1994. Human
of the rabbit P-globin gene in mouse 3T6 cells.
George-Weinstein, M. and nine others. 1996. Skeletal TAFI130 is present in a distinct TFIID complex
Cell 32: 695-706.
myogenesis: The preferred pathway of chick epiblast and is required for transcriptional activation by
Dollé, P., Castrillo, J.-L., Theill, L. E., Deerinck, cells in vitro. Dev. Biol. 173: 279-291. the estrogen receptor. Cell 79: 107-117.
T., Ellisman, M. and Karin, M. 1990. Expression
Ghosh, S. and Baltimore, D. 1990. Activation in Jarriault, S., Brou, C., Logeat, C., Schroeter, E.
of GHF-1 protein in mouse pituitaries correlates
vitro of NF-KB by phosphorylation of its H. , Kopan, R. and Israel, A. 1995. Signalling
both temporally and spatially with the onset of
inhibitor, IKB. Nature 344: 678-682. downstream of activated mammalian Notch.
growth hormone gene activity. Cell 60: 809-820.
Nature 377: 355-358.
Gillies’ S. D., Morrison, S. L., Oi, V T. and
Donner, P., Greiser-Wilka, 1. and Moelling, K.
Tonegawa, S. 1983. A tissue-specific transcription Jen, Y., Weintraub and Benezra, R. 1992.
1982. Nuclear localization and DNA binding of
enhancer element is located in the major intron Overexpression of Id protein inhibits the muscle
the transforming gene product of avian
of a rearranged immunoglobulin heavy chain gene. differentiation program: In vivo association of
myelocytornatosis virus. Nature 296:262-266.
Cell 33: 717-728. Id and E2A proteins Genes Dev. 6:1466-1479.
Driever, W. and Nüsslein-Volhard, C. 1989. The
Green, S. and Chambon, P. 1988. Nuclear receptors Jones, N. 1990. Transcriptional regulation by
bicoid protein is a positive regulator of
enhance our understanding of transciptional dimerization: Two sides to an incestuous
hunchback transcription in the early Drosophi-
regulation. Trends Genet. 4: 309-314. relationship. Cell 61: 9-11.
la embryo. Nature 337: 138-143.
Green, S., Kumar, V., Thenlaz, I., Wahli, W. and Kadonaga, J. T., Courey, A. J., Ladika, J. and
Drummond, 1. A., Madden, S. L., Rohwer, N. P.,
Chambon, P. 1988. The N-terminal DNA binding Tjian, R. 1988. Distinct regions of Spl modulate
Bell, G. I., Sukhatme, V. P. and Rauscher, E 111.
zinc finger of the oestrogen and glucocorticoid DNA binding and transcriptional activation.
1992. Repression of the insulin-like growth
receptors determines target gene specificity. Science 242: 1566-1570.
factor 11 gene by the Wilms’ tumor suppressor
EM130 f. 7: 30373044.
gene WT1. Science 257: 674-678. Kaestner, K. H., Christy, R. J. and Lane, M. D.
Grosschedl, R. and Birnstiel, M. L. 1980. Spacer 1990. Mouse insulin-responsive glucose
Dynan, W. S. and Tjian, R. 1985. Control of
DNA upstream from the TATAATA sequence transporter gene: Characterization of the gene
eukaryotic messenger RNA synthesis by sequence-
are essential for promotion of H2A histone gene and trans-activation by the CCAAT/enhancer
specif ic DNA-binding proteins. Nature 316:
transcription in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
774-778.
77: 7102-7106. 251-255.
Dynlacht, B. D., Hoey, T. and Tjian, R. 1991.
Grosveld, E , de Boer, E., Shewmaker, C. K. and Kaptein, R. 1992. Zinc-finger structures. Curr.
Isolation of cofactors associated with the TATA-
Flavell, R. A. 1982. DNA sequences necessary Opin. Struct. Biol. 2:109-115.
binding protein that mediate transcriptional
for the transcription of the rabbit P-globin gene
activation. Cell 66: 563-576. Karin, M., Haslinger, A., Holtgreve, H., Richards,
in vivo. Nature 295: 120-126.
R. I., Krautner, P., Westphal, H. M. and Beato,
Efstratiadis, A. and fourteen others. 1980. The
Haber, D. A and seven others. 1990. An internal M. 1984. Characterization of DNA sequences
structure and evolution of the human P-globin
deletion within an 1IpI3 zinc finger gene through which cadmium and glucocorticoid
gene family. Cell 21: 653-668.
contributes to the development of Wilms’tumor. hormones induce human metallothionein-II
Elsholtz, H. P., Albert, V. R., Treacy, M. N. and Cell 61:1257-1269. gene. Nature 308: 513-519.
Rosenfeld, M. G. 1990. A two-base change in a
Henkel, T., Zabel, U., van Zee, K., MiAler, J. Kelly, K., Cochrane, B. H., Stiles, C. D. and
POU factor-binding site switches pituitary
M., Fanning, E. and Baeuerle, P. A. 1992. Leder, P. 1983. Cell-specific regulation of the
specific to lymphoidspecific gene expression.
Intramolecular masking of the nuclear location c-myc gene by lymphocyte mitogens and
Genes Dev. 4: 43-51.
signal and dimerization domain in the precursor platelet-derived growth factor. Cell 35: 603-610.
Falvo, J. V., Thanos, D. and Maniatis, 1995. for the p50 NFvicB subunit. Cell 68:1121-1133.
Kerr, L. D., Inoue, J.-I., Davis, N., Link, E.,
Reversal of intrinsic DNA bends in the IFNP
Herr, W. and eleven others. 1988. The POU Baeurle, P. A., Bose, H. R. Jr. and Verma, 1. M.
gene enhancer by transcription factors and
domain: A large conserved region in the 1991. The rel-associated pp40 protein prevents
the archetectural protein HMG I(Y). Cell 83:
mammalian pit-1, oct-1, oct-2, and Caenorhab- DNA binding at rel and NF-KB: Relationship
1101-1111.
ditis elegans unc-86 gene products. Genes Dev. 2: with IKB and regulation by phosphorylation.
French, B. A., Chow, K.-L., Olson, E.N. and 1513-1516. Genes Dev. 5: 1464-1476.
Schwartz, R. J. 1991. Heterodimers of myogenic
Hiom, K. and Gellert, M. 1997. A stable RAGI- Klock, G., Strdhle, U. and Schtiutz, G. 1987.
regulatory factors and E12 bind a complex
RAG2-DNA complex that is active in V(D)J Oestrogen and glucocorticoid responsive
element governing myogenic induction of the
cleavage. Cell 88: 65-72. elements are closely related but distinct. Nature
avian a-actin promoter. Mol. Cell. Biol. II:
329: 734-736.
2439-2450. Hoey, T, Weinzierl, R. 0. J., Gill, G ., Chen, J -L.,
Dynlacht, B. D. and Tjian, R. 1993. Molecular Koleske, A. J., Buratowski, S., Nonet, M. and
Fujimoto, S. and Yamagishi, H. 1987. Isolation
cloning and functional analysis of Drosophila Young, R. A, 1992. A novel transcription factor
of an excision product of T cell receptor a-
TAF110 reveal properties expected of coacti- reveals a functional link between the RNA poly-
chain gene rearrangements. Nature 327:242-243.
vators. Cell 72: 247-260. merase 11 CTD and TFIID. Cell 69: 883-894.
Konigsberg, I. R., McElvain, N., Tootle, M. Lin, Y.-S. and Green, M. R. 1991. Mechanism Nadal-Ginard, B. 1978. Commitment, fusion,
and Herrmann, H. 1960. The dissociability of action of an acidic transcriptional activator and biochemical differentiation of a myogenic
of deoxyribonucleic acid synthesis from the in vitro. Cell 64: 971-981. cell line in the absence of DNA synthesis. Cell
development of multinuclearity of muscle 15: 855-866.
cells in culture. J. Biophys. Biochem. Cytol. Lin, Y.-S., Ha, L, Maldonado, E., Reinberg, D.
and Green, M. R. 1991. Binding of general Nishikura, K., Rushdim, A., Erikson, J., Watt,
8: 333-343.
transcription factor TF11B to an acidic R., Rovera, G. and Croce, C. M. 1983.
Kopan, R., Nye, J. S. and Weintraub, H. 1994. activating region. Nature 353: 569-571. Differential expression of the normal and of
The intracellular domain of mouse Notch: a the translocated human c-myc oncogenes in B
Lu, FL, Zawel, L., Fisher, L., Egly, M. and
constutively actived repressor of myogenesis cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4822-4286.
directed at the basic helixloop-helix region of Reinberg, D. 1992. Human general transcription
factor 11H phosphorylates the Cterminal Oettinger, M. A., Schatz, D. G., Gorka, C. and
MyoD. Development 120:2421-2430.
domain of RNA polymerase 11. Natu re 358: Baltimore, D. 1990. RAG-1 and RAG-2, adjacent
Kreidberg, J. A., Saviola, H., Loring, J. M., Maeda, 641-645. genes that synergistically activate V(D)J
M., Pelletier, J., Housman, D. and Jaenisch, R. recombination. Science 248: 1517 -1522.
Maheswaran, S. , Park, S., Bernard, A., Morris,
1993. WT-1 is required for early kidney
J., Rauscher, F. J. 111, Hill, D. E. and Haber, D. O’Kane, C. J. and Gehring, W. J. 1987.
development. Cell 74: 679-691.
A. 1993. Physical and functional interactions Detection in situ of genomic regulatory
Kumar, V., Green, S., Stack, G., Berry, M., Jin, between WTI and p53 proteins. Proc. Natl. elements in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci.
J.-R. and Chambon, P. 1987. Functional Acad. Sci. USA 90: 51005104 LISA 84: 9123-9127.
domains of the human estrogen receptor. Cell
51: 941-951. Maldonado, E., Ha, L, Cortes, P., Weis, L. Olson, E. N. 1992. Interplay between prolifera-
and Reinberg, D. 1990. Factors involved in tion and differentiation within myogenic lineage.
Landschulz, W. H., Johnson, P. E and McKnight, specific transcription by mammalian RNA Dev. Biol. 154: 261-272.
S. L. 1988. The leucine zipper: A hypothetical polymerase II: Role of transcription factors
structure common to a new class of DNA-binding Orkin, S. and Kazazian, H. H. 1984. The
IIA, IID, and JIB during formation of a
mutation and polymorphism of the human P-
proteins. Science 240: 1759-1764. transcription competent complex. Mol. Cell
globin gene and its surrounding DNA. Annu. Rev.
Biol. 10: 6335-6347.
Lassar, A. B. and seven others. 1991. Functional Genet. 18:131-171.
activity of myogenic HLH proteins requires Maniatis, T., Goodbourn, S. and Fischer, J. A.
Pabo, C. 0. and Sauer, R. T. 1992. Transcription
hetero-oligomerization with E12/E47-like 1987. Regulation of inducible and fissuespecific
factors: Structural families and principles of
proteins in vivo. Cell 66: 305-315. gene expression. Science 236: 1237-1245.
DNA recognition. Annu. Rev. Biochem. 61:
Lawn, R. M., Efstratiadis, A., O’Connell, C. and Mantovani, R. and eight others. 1988. An 1053-1095.
Maniatis, T. 1980. The nucleotide sequence of erythroid-specific nuclear factor binding to the
Palmiter, R. D., Brinster, R. L., Hamm, R. E.,
the human P-globin gene. Cell 21: 647-651. proximal CACCC box of the P-globin gene
Trumbauer, M. E., Rosenfeld, M. G., Birnberg,
promoter. Nucleic Acid Res. 16: 4299-4313.
Laybourn, P. J. and Kadonaga, J. T. 1991. Role N. C. and Evan, R. M. 1982. Dramatic growth
of nucleosome cores and histone H1 in regulation Martinez, E., Givel, F. and Wahl, W. 1987. An of mice that develop from eggs microinjected
of transcription by RNA polymerase 11. Science estrogen-responsive element as an inducible with metallothionein growth hormone fusion
254: 238-245. enhancer: DNA sequence requirements and genes. Nature 300: 611-615.
conversion to a glucocorticoidresponsive
Leder, P. and seven others. 1983. Translocati- Parslow, T. G., Blair, D. L., Murphy, W. J.
element. EMBO J. 6: 3719-3727.
ons among antibody genes in human cancer. and Granner, D. K. 1984. Structure of the 5'
Science 222: 765-771. Mather, E. L. and Perry, R. P. 1982. Transcrip- ends of immunoglobulin genes: A novel
tional regulation of the immunoglobulin V genes. conserved sequence. Proc. Natl. Acad. Sci.
Lee, D. K., Horikoshi, M. and Roeder, R. G.
Nucleic Acids Res. 9: 6855-6867. USA 81: 2650-2654.
1991. Interaction of TFIID in the minor groove
of the TATA element. Cell 67: 1241-1250. Matsuoka, M., Nagawa, F., Okazaji, K., Patapoutian, A., Miner, J. H., Lyons, G. E. and
Kingsbury, L., Yoshida, K., Muller, U “ Larue, Wold, B. 1993. Isolated sequences from the
Lenardo, M. J. and Baltimore, D. 1989. NFKB:
D.T., Winer, J. A. and Sakano, H. 1991. linked Myf-5 and MRF-4 genes drive distinct
A pleiotropic mediator of inducible and tissue-
Detection of somatic DNA recombination in patterns of muscle-specific expression in
specific gene control. Cell 58: 227-229.
the transgenic mouse brain. Science 254: 81-86. transgenic mice. Development 118: 61-69.
Li, L., Zhou, J., Guy, J., Heller-Harrison, R.,
McKnight, S. and Tjian, R. 1986. Transcriptio- Pathak, D. and Sigler, P. B. 1992. Updating
Czech, M. P. and Olson, E. N. 1992. FGF
nal selectivity of viral genes in mammalian cells. structure-function relationships in the bZip
inactivates myogenic helix-loop-helix proteins
Cell 46: 795-805. family of transcription factors. Curr. Opin.
through phosphorylation of a conserved protein
Struct. Biol. 2: 116-123.
kinase C site in their DNA-binding domains. Cell Miesfeld, R. and seven others. 1986. Genetic
71:1181-1194. complementation of a glucocorticoid receptor Payvar, F. and seven others. 1983. Sequence-
deficiency by a cloned receptor cDNA. Cell 46: specific binding of glucocorticoid receptor to
Li, S., Crenshaw, E. B. 111, Rawson, E. J.,
389-399. MTV DNA at sites within and upstream of the
Simmons, D. M., Swanson, L. W. and Rosenfeld,
transcribed region. Cell 35: 381-392.
M. G. 1990. Dwarf locus mutants lacking three Milos P M. and Zaret, K. S. 1992. A ubiquitous
pituitary cell types result from mutations in the iac’tor is required for C/EBP-related proteins to Pfahl, M. 1982. Specific binding of the
POU-domain gene pit-1. Nature 347: 528-533. form stable transcription complexes on an glucocorticoid-receptor complex to the mouse
ovalbumin promoter segment in vitro. Genes mammary tumor proviral promoter region. Cell
Lin, F.-T. and Lane, M. D. 1992. Antisense
Dev. 6: 183-196. 31: 475-482.
CCAAT/enhancer-binding protein RNA suppresses
coordinate gene expression and triglyceride Myers, R. M., Tilly, K. and Maniatis, T. 1986. Picard, D. and Schaffner, W. 1984. A lympho-
accumulation during differentiation of 3T3-Ll Fine structure genetic analysis of a globin cyte-specific enhancer in the mouse immuno-
pre-adipocytes. Genes Dev. 6:533-544. promoter. Science 232: 613-618. globulin K gene. Nature 307: 80-82.
Pu, W.T. and Struhl, K. 1991. The leucine zipper Sen, R. and Baltimore, D. 1986b. Inducibility of Trudel, M. and Constantmi, E 1987. A 3'
symmetrically positions the adjacent regions for K immunoglobulin enhancer-binding protein NF- enhancer contributes to the stage-specific
specific DNA binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA KB by a posttranslational mechanism. Cell 47: expression of the human P-globin gene. Genes
88: 6901-6905. 921-928. Dev. 1: 954-961.
Pugh, B. F. and Tjian, R. 1991. Transcription from Seto, E. and seven others. 1992. Wild-type p53 Umek, R. M., Friedman, A. D. and McKnight, S.
a TATA-less promoter requires a mulfisubunit binds to TATA-binding protein and represses L. 1991. CCAAT-enhancer binding protein: A
TFIID complex. Genes Dev. 5: 1935-1944. transcription. Proc. Natl, Acad. Sci. LISA 89: component of a differentiation switch. Science
12028-12032. 251: 288-292.
Queen, C. and Baltimore, D. 1983. Immunoglo-
bulin gene transcription is activated by downstream Shatkin, A. J. 1976. Capping of eucaryotic Umesono, K. and Evans, R. M. 1989. Determi-
sequence elements. Cell 33: 741-748. mRNAs. Cell 9: 645-653. nants of target gene specificity for steroid/
thyroid hormone receptors. Cell 57: 1139-1146.
Rabbitts, T, H, 1991. Translocations, master Sheiness, D. and Darnell, J. E. 1973. Polyade-
genes, and the differences between the origins of nylic segment in mRNA becomes shorter with Usheva, A., Maldonado, E., Goldring, A., LuH.,
acute and chronic leukemias. Cell 67:641-644. age. Nat. New Biol. 241: 265-268. Houbavi, C., Reinberg, D. and Alom, Y. 1992.
Specific interaction between the noriphospho-
Rhodes, S. J. and seven others. 1993. A fissue-specific Simmons, D. M., Voss, J. W., Ingraham, IT. A
rylated form of RNA polymerase 11 and the
enhancer confers Pit-l-dependent morphogen Holloway, J. M., Broide, R. S., Rosenfeid, M. G.
TATA-binding protein. Cell 69: 871-881.
inducibility on the pit-I gene. Genes Dev. 7: 913-932. and Swanson, L. W. 1990. Pituitary cell
phenotypes involve cell-specific Pit-I mRNA Verrijzer, C. P., Chen, J.-L. and Yokomori, K.
Rigby, P. W. J. 1993. Three in one and one in
translation and synergistic interactions with 1995. Binding of TAI’s to core elements directs
three: It all depends on TBP Cell 72: 7-10.
other classes of transcription factors. Genes Dev. promoter selectivity by RNA polymerase 11.
Rottman, F. A., Shatkin, A. J. and Perry, R. P. 4: 695-711. Cell 81:1115-1125.
1974. Sequences containing methylated nucleoticles
Sopta, M., Burton, Z. F. and Greenblatt, J. 1989. Vinson, C. R., Sigler, P. B. and McKnight, S. L.
at the 5' termini of messenger RNAs: Possible
Structure and associated DNA helicase activity 1989. Scissors-grip model for DNA recognition
applications for processing. Cell 3: 197-199.
of a general transcription factor that binds to by a family of leucine zipper proteins. Science
Rutter, W., Jr., Valenzuela, P., Ball, G. E., Holland, RNA polymerase II. Nature 341: 410-414. 246: 911-916.
M., Hager, G. L., Degennero, L. J. and Bishop, R. J.
Sornson, M. W. and fourteen others. 1996. Walker, M. D., Edlund, T., Boulet, A. M. and
1976. The role of DNA-dependent RNA polyme-
Pituitarv lineage determination by the Prophet Rutter, W J. 1983. Cell-specific expression
rase in transcriptive specifici~y. In E. M. Bradbury
of Pit-I homeodomain factor defective in Ames controlled by the 5' flanking region of the insulin
and K. Jaucherian (eds.), The Organization and
dwarfism. Nature 384: 327333. and chymotrypsin genes. Nature 306:557-561.
Expression of the Eukaryotic Genome. Academic
Press, New York, pp. 279-293. Stargell, L. A. and Strubl, K. 1996. Mechanism Wasylyk, B., Kedinger, C., Corden, J., Brison,
of transcriptional activation in vivo: Two steps D. and Chambon, P. 1980. Specific in vitro
Samuelsson, L., Str6mberg, K., Vikman, K.,
forward. Trends Genet. 12: 311315. initiation of transcription on conalbumin and
Bjursell, G. and EnerWck, S. 1991. The CCAAT/
ovalbumin genes and comparison with adenovirus
enhancer binding protein and its role in adipocyte Starr, D. B. and Hawley, D. K. 1991. TFIID
2 early and late genes. Nature 285: 367-373.
differentiation: Evidence for direct involvement binds in the minor groove of the TATA box.
in terminal adipocyte development. EMBO J. Cell 67: 1231-1240. Watson, J. D., Gilman, M., Witkowski, J. and
10: 37873793. Zoller, M. 1992. Recombinant DNA, 2nd Ed.
Staudt, L. M., Singh, H., Sen, R., Wirth, T.,
Scientific American Books, New York.
Sasai, Y., Kageyama, R., Tagawa, Y., Shigemoto, Sharp, P. A. and Baltimore, D. 1986. A
R. and Nakanishi, S. 1992. Two mammalian lymphoid-specific protein binding to the Werner, M. H., Huth, J. R., Gronenborn, A. M.
helix-loop-helix factors structurally related to octamer motif of immunoglobulin genes. and Clore, G. M. 1995. Molecular basis of human
Drosophila hairy and Enhancer of split. Genes Nature. 323: 640-643. 46 X,Y sex reversal revealed from the three
Dev. 6: 2620-2634. dimensional solution structure of the human SRY-
Stockdale, F. E. and Holter, H. 1961. DNA
DNA complex. Cell 81: 705-714.
Sauer, F., Wassarman, D. A., Rubin, G. M., and synthesis and myogenesis. Exp. Cell Res. 24:
Tjian, R. 1996. TAF,,s mediate activation of 508-520. Wirth, T., Staudt, L. and Baltimore, D. 1987.
transcription in the Drosophila embryo. Cell An octamer oligonucleotide upstream of a TATA
87:1271-1284. Struhl, G., Struhl, K. and Macdonald, P ‘ M.
motif is sufficient for lymphoid-specific
1989. The gradient morphogen bicoid is a
promoter activity. Nature 329: 174-178.
Sauer, F., Fondell, J. D., Ohkuma, Y., Roeder, R. concentration-dependent transcriptional
G. and Jackle, H. 1995. Control of transcription activator. Cell 57: 1259-1273. Workman, J. L. and Roeder, R, G. 1987. Binding
by KrUppel through interactions with TFIIB of transcription factor TFIID to the major late
and TFIIEP. Nature 375: 162-164. Tanaka, M., Lai, J.-S. and Herr, W. 1992.
promoter during in vitro nucleosome assembly
Promoter-specific activation domains in Oct-l
potentiates subsequent initiation by RNA poly-
Sawadogo, M. and Roeder, R. G. 1984. Energy and Oct-2 direct differential activation of an
merase 11. Cell 51: 613-622.
requirement for specific transcription by the snRNA and mRNA promoter. Cell 68: 755-767.
human RNA polymerase II system. 1. Biol. Wright, G. and eight others. 1991. High level
Chem. 259: 5321-5326. Thanos, D. and Maniatis, T. 1995. Virus induction
expression of active human al-anfitrypsin in the
of human IFNb gene expression requires the
milk of transgenic sheep. BioTech. 9: 830-834.
Schatz, D. G., Oettinger, M. A. and Baltimore, assembly of an enhanceosome., Cell 83: 1091-
D. 1989. The V(D)J recombination activating 1100. Yeo, S. P. and Rigby, P. W. J. 1993. The regulation
gene, RA G-1. Cell 59: 1035-1048. of myogenin gene expression during embryonic
Treisman, J., Gbnczy, P., Vashishta, M., Harris,
development of the mouse. Genes Dev. 7:1277-
Sen, R. and Baltimore, D. 1986a. Multiple nu- E. and Desplan, C. 1989. A single amino acid
1287.
clear I actors interact with the immunoglobulin can determine the DNA binding specificity of
enhancer sequences. Cell 46: 705-716. homeodomain proteins. Cell 59: 553-562.
Regulação transcricional da
expressão gênica: A ativação da cromatina
11
Enquanto meu companheiro contemplava
com seriedade e satisfação a magnífica apa-
rência das coisas, eu me deleitava em investi-
gar suas causas.... Curiosidade, pesquisa sin-
cera para conhecer as leis misteriosas da na-
A TÉ AGORA, limitamos nossa discussão sobre a transcrição de RNA mensa-
geiro à estrutura do próprio gene. Mas genes não existem em uma forma
isolada dentro do núcleo, facilmente acessível à RNA polimerase ou às pro-
teínas ligantes de intensificador ou promotor. Ao contrário, cromossomos eucarióticos
contêm tanta proteína (por peso) quanto ácido nucleico, e esse complexo DNA-proteí-
tureza, satisfação perto do êxtase enquanto na é chamado cromatina. As proteínas mais abundantes da cromatina são polipeptídeos
elas a mim se revelavam, estão entre as sen- básicos chamados histonas, que são organizados em nucleossomos.
sações mais antigas que posso lembrar.
MARY WOLLSTONECRAFT SHELLEY (1817)
Além dos nucleossomos, que são inibidores gerais da transcrição, outros elemen-
tos prioritários na cromatina também podem ser importantes na regulação da expres-
Então, não podemos negar categoricamen- são gênica. Assim, existem regiões controladoras de loco (LCRs) regulando a expres-
te que em última análise poderemos tritu- são de uma região do cromossomo; existem regiões associadas à matriz (MARs)
rar genes em um almofariz e em seguida onde o DNA está ancorado à matriz nuclear e onde podem estar ativas proteínas que
cozinhá-los em um béquer. desenrolam o DNA; e existem insulantes, seqüências que separam “domínios” regu-
H. J. MULLER (1922) ladores e assim impedem que elementos reguladores, positivos e negativos, em um
domínio possam agir em genes no domínio adjacente.
Nucleossomos e a ativação da cromatina reprimida

O nucleossomo é a unidade básica da estrutura da cromatina. É composto de um
octâmero de histona (duas moléculas cada, de histonas H2A-H2B e histonas H3-
H4) envolvido por duas alças de DNA com aproximadamente 140 pares de bases
(Figura 11.1; Kornberg e Thomas, 1974). A cromatina pode então ser visualizada
como um cordão de contas nucleossômicas ligadas por 10 a 100 pares de bases de
DNA. Enquanto geneticistas clássicos consideravam que genes se pareciam a
“contas em um cordão”, geneticistas moleculares acham que os genes se asseme-
lham a “cordão nas contas”.
Os fatores de transcrição devem ser capazes de encontrar seqüências de DNA,
apesar da maior parte desse estar acondicionado nos nucleossomos. Atualmente se
considera que tornar um gene competente para transcrever RNA envolve (1) a liga-
ção de fatores de transcrição ao DNA e (2) a exclusão de nucleossomos da região
promotora do gene. As interações de fatores de transcrição específicos e o DNA que
eles ligam causam o fenômeno da transcrição gênica temporal e tissularmente espe-
cíficos. Assim que a RNA polimerase começa a transcrição, é possível deslocar
431
432 PARTE III Mecanismos da Diferenciação Celular
Figura 11.1 (A) (B)

Estrutura da cromatina e do nucleossomo. (A)
Modelo da estrutura do nucleossomo como Ligante
visto por cristalografia de Raios-X a uma re-
solução de 0.33nm. A unidade protéica H1
bicôncova central (branca) é o tetrâmero H3-
H4. Cada um dos dois ovóides escuros Partícula central:
flanqueando o tetrâmero é um dímero H2A-
H2B. (B) Relacionamento da histona H1 ao 2 H2A;
nucleossomo central (contendo duas cópias de 2H2B;
cada histona, H2A, H2B, H3, e H4). (C) H1 2H3;
pode juntar o DNA em formas compactas e 2H4
pode aglomerar os nucleossomos. Aproxima- (C) (D)
damente 140 pares de bases envolvem o DNA
octâmero da histona, e quase 60 pares de ba- Nucleossomo central
H1
DNA
ses de DNA juntam os nucleossomos. (D)
Modelo para a disposição dos nucleossomos Nucleossomo
em uma estrutura de cromatina em solenóide,
e altamente compacta. Um modelo alternati-
vo, colocando H1 entre o octâmero do nucle-
ossomo e uma alça do DNA foi proposto re-
centemente e está sendo testado (Pruss et al.,
1996). Aqui, uma ponta da H1 se liga ao nucle-
ossomo, enquanto a outra liga o DNA. (A de Histonas H1
Burlingame et al., 1985; B-D de acordo com
Wolfe, 1993.)
Cromatina
DNA ligante
temporariamente o DNA do nucleossomo e sintetizar RNA (Clark e Felsenfeld, 1992;

veja Lewin, 1994). [chrom1.html]
Os nucleossomos não são os únicos impedimentos na ligação dos fatores de trans-
crição às suas seqüências de DNA, porque os próprios nucleossomos estão enrola-
dos como “solenóides” rígidos estabilizados pela histona H1. A histona H1 é encon-
trada nos aproximados 60 pares de bases do DNA “ligante” entre os nucleossomos
(Figuras 11.1 e 11.2; Weintraub, 1984). Essa conformação dos nucleossomos depen-
dente de H1 inibe a transcrição de genes nas células somáticas pelo empacotamento
de nucleossomos adjacentes em conjuntos tão apertados que impedem o acesso de
fatores de transcrição e RNA polimerases (Thoma et al., 1979; Schlissel e Brown, 1984).
Acessibilidade a fatores trans reguladores

trans-reguladores
É realmente incrível que o DNA possa se tornar acessível a fatores trans-reguladores.

Existe DNA suficiente em um único corpo humano para estender o diâmetro do siste-
ma solar (Crick, 1966), e essa enorme extensão precisa estar rigidamente empacotada
nos núcleos de nossas células. Mas apesar disso, nossa biblioteca genética pode ser
especificamente acessada em cada tipo celular. Experimentos de hibridização solúvel
sugerem que no mínimo existem 10.000 genes específicos para tecidos no genoma da
maioria dos vertebrados; de modo que não é surpreendente que em um dado tipo de
célula, a maioria desses genes estejam reprimidos. Geralmente, então, considera-se
que a condição de “ausência” da cromatina é um estado reprimido e que genes
CAPÍTULO 11 A Regulação Transcricional da Expressão Gênica 433
(A) (B)
Figura 11.2
O papel da H1 na compactação da cromatina.
(A) Cromatina de fígado de galinha observada
no microscópio eletrônico. As contas repre-
específicos de tecidos são ativados pela interrupção local de fatores repressivos sentam os nucleossomos. (B) A mesma cro-
matina após a remoção da histona H1 por
(Weintraub, 1985). Como já mencionado, o principal mecanismo de repressão geral do
eluição salina. A cromatina se tornou muito
gene é provavelmente a compactação do DNA em aglomerados de nucleossomos, e a menos compacta (de Oudet et al., 1975; foto-
iniciação da transcrição depende da remoção dos nucleossomos da região promotora grafias cortesia de P. Chambon.)
do gene. Existem duas maneiras pelas quais isso pode ser feito. Primeiro, durante a
síntese de DNA (fase S no ciclo celular), nucleossomos são removidos de uma fita de
DNA e são repostos pouco tempo depois. Nesse tempo de substituição, poderia
haver competição pelos sítios promotores entre histonas e fatores de transcrição tais
como o TFIID ligante de TATA. Segundo, parece haver ativadores transcricionais
(tais como o receptor de glicocorticóide) que podem se ligar aos nucleossomos exis-
tentes e desorganizá-los (Rigaud et al., 1991; Adams e Workman, 1993). Uma vez que
os nucleossomos estão dissociados na região promotora, outros fatores de transcri-
ção podem se ligar (Figura 11.3).
A habilidade dos fatores de transcrição em remover nucleossomos de genes ati-
vos e seus promotores pode ser vista em experimentos com nucleases. A acessibilida-
de de um gene às proteínas nucleares pode ser detectada tratando a cromatina de um
tecido com pequenas quantidades de DNase I. Essa DNase pancreática digere regiões
acessíveis do DNA, mas o DNA coberto pelos nucleossomos é protegido. Após a
digestão, o DNA da cromatina tratada é extraído e misturado com cDNA radioativo de
um determinado gene (Figura 11.4). Se o cDNA encontra seqüências as quais pode se
ligar, então o gene foi protegido da digestão pelas proteínas da cromatina- ou seja, ele
não estava acessível à DNase, e provavelmente não estaria acessível também aos
fatores de transcrição ou à RNA polimerase. Entretanto, se a sonda de cDNA não
encontra seqüências as quais possa se ligar, então o gene foi exposto à DNase e
provavelmente seria acessível à RNA polimerase e a fatores trans-reguladores.
Foi determinado que a susceptibilidade de um determinado gene à ação da DNase I
é dependente do tipo de célula na qual ele reside (Tabela 11.1; Weintraub e Groudine,
1976). Tratando cromatina de células vermelhas do sangue de pinto em desenvolvimen-
to com DNase I, e misturando o DNA extraído com cDNA radioativo de globina, esse
encontrou muito poucas possibilidades de ligação. Os genes da globina na cromatina
foram digeridos por uma pequena quantidade de DNase I. Entretanto, tratando cromati-
na de células de cérebro com as mesmas quantidades de DNase I, essa não destruiu os
genes da globina. Portanto, o gene da globina estava acessível às enzimas externas na
cromatina de células vermelhas do sangue em desenvolvimento mas não na cromatina
de células do cérebro. De modo semelhante, o gene da ovalbumina (clara de ovo) é
suscetível à digestão pela DNase I em cromatina do oviduto mas não na cromatina das
Figura 11.3 Nucleossomo

A ligação de um fator de transcrição (TF) a um nucleos-
somo pode desestabilizá-lo, permitir a remoção de DNA está enrolado ao
redor de um núcleo da
histonas e expor a região a outros fatores de transcri-
histona, formando
ção. (De acordo com Adams e Workman, 1993.) nucleossomos
TF se ligando ao
Um TF (fator de transcrição) nucleossomo
inicial se liga a um nucleossomo
central, deslocando parte do
núcleo da histona
Fatores adicionais podem Histona H1

Outros TFs
se ligar ao complexo,
desestabilizando mais ainda
o núcleo da histona
Quando as histonas são

deslocadas, outros TFs
podem se ligar
Outros TFs
Histona ou
proteínas carreadoras
células vermelhas do sangue. Quando a cromatina é tratada com DNase I e o DNA

extraído, o cDNA da ovalbumina é capaz de encontrar seqüências na preparação de
eritrócitos mas não no DNA da cromatina de oviduto tratada. Temos, aqui, uma clara
correlação entre regulação gênica diferencial e a estrutura da cromatina.
Sítios hipersensíveis à DNase I
Algumas regiões da cromatina são identificadas como sítios hipersensíveis à DNase

I. Esses sítios, identificados em transferências Southern (Southern blots) por peque-
Tabela 11.1 Estudos de ligação com cromatina tratada com DNase I

Porcentagem de
ligação máxima
do cDNA radioativo
Tratamento Sonda de cDNA ao DNA extraído da
Origem (galinha) com DNase radioativo cromatina tratada
DNA da célula - cDNA da globina 94
vermelha do sangue
Cromatina da célula + cDNA da globina 90-100
do cérebro
Cromatina do + cDNA da globina 90-100
fibroblasto
Cromatina da célula + cDNA da globina 25
vermelha do sangue
Cromatina da célula + cDNA da ovalbumina 90-100
vermelha do sangue
Fonte: De acordo com Weintraub e Groudine, 1976.
Eritrócito nucleado Figura 11.4

ou célula do Protocolo para a determinação de especificidade na digestão
oviduto da cromatina por DNase I. Veja na Tabela 11.1 os resultados
Extrair
cromatina do experimento de digestão com DNase I.
Regiões sensíveis
à DNase I
Fibra, 30-nm
Digestão com DNase I até

digetão de 10% do DNA
Isolar DNA da cromatina
Produzir fita única, hibridizar com

sonda
Híbrido de
sonda e DNA
Medida de nucleotídeos
radioativos ligados
nos fragmentos de DNA radioativo, são destruídos por quantidades muito pequenas
de DNase, indicando que eles são altamente acessíveis às moléculas externas. Essa
acessibilidade parece decorrer da quase total ausência de nucleossomos nessa região
de DNA nos tecidos que os expressam (Elgin, 1988). Os sítios hipersensíveis à DNase
I marcam regiões da cromatina, tais como promotores e intensificadores ativos, onde
estão ligadas proteínas ligantes de DNA. Regiões hipersensíveis à DNase I estão
portanto, associadas a genes específicos de tecido regulados pelo desenvolvimento.
(Elgin, 1981; Conklin e Groudine, 1984). Por exemplo, genes da globina nas células
vermelhas do sangue e seus precursores imediatos contêm sítios hipersensíveis à
DNase I, mas genes da globina em outras células não os contêm (Stalder et al.,1980;
Groudine et al., 1983). A região flanqueando a extremidade 5’ do gene da vitelogenina
do pinto contém vários sítios hipersensíveis na cromatina do fígado de galinhas em
postura; mas esses sítios não estão presentes na cromatina do fígado de machos,
fígado embrionário, cérebro ou linfócitos (Burch e Weintraub, 1983).
Os sítios hipersensíveis à DNase I freqüentemente se situam dentro ou nas
adjacências de sítios que têm funções intensificadoras, e certos fatores trans-regu-
ladores são capazes de induzir a formação desses sítios hipersensíveis. Zaret e
Yamamoto (1984), estudando o intensificador responsivo a glicocorticóides do ví-

rus do tumor mamário do camundongo, demonstraram que antes da adição do hor-
mônio às células contendo o vírus, essa seqüência intensificadora não mostrou
sensibilidade especial à DNase I. Após a administração do hormônio, um sítio dis-
cretamente hipersensível à DNase I se desenvolveu nessa região. A formação do
Nucleossomo sítio hipersensível coincidiu com o início da transcrição do gene viral; quando o
hormônio foi retirado, ambos o sítio hipersensível e a transcrição do gene viral
desapareceram. Zaret e Yamamoto especularam que a interação entre o complexo do
receptor de glicocorticóide e o intensificador de DNA altera a configuração da
cromatina para facilitar a transcrição do promotor vizinho. Esse seria o caso se,
como já mencionado, o receptor de glicocorticóide pudesse remover nucleossomos
da região contendo a seqüência de DNA onde ele se liga.
Ruptura e reorganização de nucleossomos:

o papel dos complexos de ruptura
Como é possível remover nucleossomos? Estudos recentes identificaram dois

Fatores de fatores que podem ser importantes nesse processo. O fator de transcrição GAGA
transcrição (uma proteína constitutiva expressa em Drosophila que está ligada a numerosos
promotores tendo seqüências GA) é um desses fatores que podem romper nucle-
ossomos. Quando esse se liga a um nucleossomo contendo a seqüência TATA do
gene hsp70 (codificando a proteína do choque térmico de 70-kDa), o nucleossomo
se rompe e cria um sítio hipersensível à DNase I no sítio da seqüência TATA. Esse
processo é muito eficiente quando o nucleossomo não tem histona H1. O fator
GAGA não produz esse efeito isoladamente, mas funciona em conjunto com uma
proteína contendo quatro peptídios chamada fator de remodelagem de nucleosso-
Figura 11.5 mos (NURF). Na ausência de fatores de transcrição, o NURF pode perturbar o
Modelo para o mecanismo proposto para o nucleossomo em uma maneira dependente de ATP. Isso permite que fatores de
NURF em um nucleossomo. NURF pode transcrição tal como o GAGA se liguem às regiões promotoras, rompendo os nu-
hidrolizar ATP e utilizar a energia para
cleossomos mais distante (Figura 11.5; Tsukiyama et al., 1994; Tsukiyama e Wu,
reconfigurar as interações histona-DNA (ou
histona-histona). Essas perturbações pare- 1995). Outro complexo protéico capaz de romper nucleossomos, o complexo SW1/
cem facilitar a acessibilidade dos fatores de SNF, foi originalmente descoberto no levedo, mas já foi encontrado na Drosophila
transcrição ao DNA nucleossômico. Isso e no homem (Peterson e Tamkun, 1995). Quando a seqüência TATA é incorporada
pode levar a novas modificações na estrutu- no DNA nucleossômico, ela não está acessível à proteína ligante de TATA e a
ra do nucleossomo. (De acordo com transcrição é severamente reduzida. Essa inibição pode ser anulada por modifica-
Tsukiyama e Wu, 1995.) ções do nucleossomo dependentes de ATP, efetuadas por SW1/SNF (Imbalzano
et al., 1994). De maneira semelhante, SW1/SNF pode romper os nucleossomos nas
regiões intensificadoras e permitir a ligação de fatores de transcrição (Kwon et al.,
1994; Pazin et al., 1994). Parece que o complexo SW1/SNF é realmente parte da
RNA polimerase e está ligado ao seu domínio carboxi-terminal (Wilson et al., 1996).
Esse complexo pode ser ativado por fatores de transcrição capazes de romper
nucleossomos.
Uma das principais vias de ruptura de nucleossomos é através de acetilação.
Existe uma boa correlação entre a acetilação de histona e a atividade transcricional de
uma determinada região da cromatina. Regiões transcricionais extremamente ativas
têm nucleossomos que são altamente acetilados, enquanto que domínios de transcri-
ção reprimida têm histonas hipoacetiladas em seus nucleossomos (Braunstein et al.,
1993; Jeppesen e Turner, 1993; Hebbes et al., 1994). Quando grupos acetil são coloca-
dos nas lisinas das caudas das histonas há uma mudança na estrutura total do nucle-
ossomo (Figura 11.6 ; Lee et al., 1993; Garcia-Ramirez et al., 1995). As caudas se movem
para fora, perdendo o contato com a dupla hélice, e também perdendo severamente
seu domínio sobre o DNA. O DNA se torna muito mais acessível ao fatores de trans-
crição. Uma acetiltransferase da histona, que acetila histonas em nucleossomos foi
identificada em Tetrahymena, e é um homólogo de um ativador transcricional do leve-
do (Brownell et al., 1996). Mais ainda, foi demonstrado recentemente que a subunidade
TAF (250-kDa) de TFIID é capaz de acetilar histonas H3 e H4 (Mizzen et al., 1996). Essa
atividade enzimática pode ter um papel importante permitindo que TFIID substitua os Histona
nucleossomos. acetiltransferase
Ruptura e reorganização de nucleossomos:

o papel da competição de histonas DNA
A competição entre histonas e fatores de transcrição foi inicialmente sugerida para a

regulação dos genes de rRNA 5S em Xenopus. Foi demonstrada uma competição entre
o fator de transcrição TFIIIA e a histona H1 pelos sítios regulando a síntese de rRNA Histona
5S. Se esse gene fosse incubado com TFIIIA antes da histona H1, mesmo em presença deacetilase
de histonas centrais, havia a formação do complexo transcricional. Se H1 estivesse
presente antes de TFIIIA, a transcrição era bloqueada (Schlissel e Brown, 1984). Prioleau
e colegas (1994) relacionaram a competição entre histonas e a proteína ligante de Figura 11.6
TATA e a ocorrência da transição da blástula intermediária. Genes ativados na transi- Histona acetiltransferase pode modificar as
caudas da histona e modificar sua conforma-
ção da blástula intermediária são reprimidos durante a clivagem precoce. Quando tais
ção com o DNA nucleossômico. Isso permite
genes são injetados em núcleos de Xenopus na fertilização ou em estágios precoces a soltura do DNA do nucleossomo central. (De
da clivagem, eles são envolvidos pela cromatina e são reprimidos. Após a transição da acordo com Lee et al., 1993.)
blástula intermediária, os genes injetados são transcritos. A repressão durante a
clivagem precoce pode ser aliviada por uma pré-incubação dos genes injetados com a
proteína ligante de TATA. Portanto, em alguns sistemas é possível que a competição
entre fatores de transcrição e histonas possa regular a expressão gênica. O grau de
metilação do DNA (a ser logo discutido) pode ser crítico para essa competição, pois
histona H1 se liga mais avidamente ao DNA metilado do que ao não metilado (McArthur
e Thomas, 1996).
Regiões de controle de loco: transcrição do gene da globina

Regiões controladoras de loco (LCRs) são seqüências de DNA que são essenciais
para o estabelecimento de uma configuração “aberta” da cromatina. Ou seja, essas
regiões podem inibir a repressão normal da transcrição em uma área relativamente
grande contendo vários genes. Uma das LCRs melhor estudada é a que regula a
expressão específica de tecido dos genes da família das β-globinas no homem,
camundongo e pinto.
Em muitas espécies, incluindo o pinto e o homem, a hemoglobina embrionária
ou fetal é diferente daquela encontrada em células vermelhas do sangue de adul-
tos. Um diagrama esquemático dos tipos de hemoglobina humana e dos genes que
as codificam está apresentado na Figura 11.7. Hemoglobina embrionária humana
consiste principalmente de duas cadeias ζ da globina, duas cadeias ε da globina e
quatro moléculas de heme. Durante o segundo mês da gestação humana a síntese
de ζ- e ε-globinas cessa abruptamente, enquanto que a síntese de α e γ globinas
aumenta (Figura 11.8). A associação de duas cadeias de γ-globina com duas de α-
globina produz a hemoglobina fetal (α2γ2). No terceiro mês de gestação os genes
da β e δ globinas começam a ficar ativos, e seus produtos crescem vagarosamente
enquanto que os níveis de γ-globina gradualmente decrescem. Essa troca é alta-
mente acelerada após o nascimento, e a hemoglobina fetal é substituída pela he-
moglobina adulta: (α α2β2). O perfil da hemoglobina adulta normal é de 97 porcento
α2β2, 2-3 porcento α2δ2, e 1 porcento α2γ2. No homem, os genes das globinas ζ- e
α- estão no cromossomo 16, e os genes das ε-, γ-, δ- e β-globinas estão ligados
entre si na ordem de aparecimento, no cromossomo 11. Parece existir, então, um
mecanismo que dirige a troca seqüencial dos genes do cromossomo 11 das globinas
embrionárias às fetais às adultas.
Além dos sítios hipersensíveis à DNase nos promotores e intensificadores perto e
dentro de cada gene de globina, ainda existe uma região controladora do loco bem a
montante do membro mais 5’ (ε) do complexo de genes da β-globina. Essa LCR
Figura 11.7 Cromossomo Cromossomo

Ativação gênica seqüencial na síntese da hemoglobina
durante o desenvolvimento. “Embrionário”
“Fetal”
Genes da globina
Genes da globina
“Adulto
minoritário”
“Adulto
majoritário”
Proteínas
globina
contém quatro sítios que são hipersensíveis à DNase I somente em células precurso-
ras de eritróides e que parecem ser necessários para altos níveis de ativação da trans-
crição específica nessas células, da família inteira dos genes da β-globina (ε-, γ-, β- e
δ-globinas) no cromossomo 11 humano (Grosveld et al., 1987). Deleção ou mutação da
LCR causa o silenciamento de todos esses genes. Inversamente, se a LCR é colocada
adjacente a genes que não são usualmente expressos nas células vermelhas do san-
gue (como o gene específico da célula T, thy-1) e então transfectados nas células
precursoras de eritróides, esses novos genes são expressos nas células vermelhas do
sangue. Esse efeito é específico para precursores das células vermelhas do sangue,
pois somente elas teriam os fatores trans-reguladores apropriados para se ligar a essa
região (Blom van Assendelft et al., 1989; Fiering et al., 1993).
A LCR é responsável por permitir expressão gênica em uma região inteira. Além
disso, se os genes da globina permanecem ligados à LCR, eles podem ser expressos
em células eritróides independentemente de onde elas residem no genoma. Se eles são
separados da LCR, os genes da globina são reprimidos, mesmo nas células eritróides
que transcreveriam os genes da globina. Ryan e colaboradores (1989) produziram
Sítio da eritropoiese
Fígado
Baço Medula óssea
Saco vitelínico
Porcentagem da síntese
total de globina
Figura 11.8
Porcentagens de cadeias polipeptídicas de
hemoglobina em função do desenvolvimento
humano. A importância fisiológica da cadeia
de γ−globina na hemoglobina fetal foi exami-
nada no Capítulo 9. (De acordo com Karlsson Idade pós-concepção Nascimento Idade pós-natal
e Nienhaus, 1985.) (semanas) (semanas)
(A) LCR Sítios hipersensíveis à DNase Figura 11.9

Diagrama da família de genes da β−globina
humana no cromossomo 11. (A) A região LCR
específica para eritróides está localizada de 6 a
22 quilobases a montante do gene da ε−globina.
Deleção nessa área Genes da globina Deleção nessa área causa Os quatro sítios hipersensíveis à DNase I den-
causa a, ε, γ, δ, persistência da hemoglobina tro dessa região estão indicados por setas. Um
β-talassemia fetal quinto sítio hipersensível à DNase I a jusante
do gene da β−globina está também marcado, e
(B) Nucleossomos uma deleção dessa região causa a persistência
da transcrição do gene da γ−globina. Dois ge-
nes quase idênticos da γ−globina (fetal) estão
(i)
LCR Garfo de a jusante do gene da ε−globina (embrionário).
replicação Em seqüência a esses estão os genes da δ− e
β−globinas adultas. (B) Um modelo possível
para a atividade de LCR. Fatores de transcri-
ção ligados a promotores da globina são esta-
Proteínas ligantes do promotor Promotor ou bilizados no garfo de replicação pela ligação à
intensificador
LCR. Dessa forma, o complexo não seria
dissociado, e as regiões associadas à LCR per-
(ii) maneceriam livres de nucleossomos. (A de acor-
Nucleossomo do com Ryan et al., 1989; B de acordo com
O complexo promotor-LCR é formando no DNA Felsenfeld, 1992.)
estabilizado pelas proteínas replicado
ligantes de promotores durante
Promotor
a construção do nucleossomo
LCR
Proteínas ligantes
do promotor
(iii)
LCR
Promotor ou
intensificador
hipersensíveis
camundongos transgênicos contendo o gene da β-globina humana e seus promoto-

res e intensificadores imediatos. Estes animais transgênicos produziram somente pe-
quenas quantidades da β-globina humana (menos de 0.3 porcento da β-globina celu-
lar total). Entretanto, quando os pesquisadores adicionaram LCR, a β-globina humana
correspondia a mais da metade da globina total nesses camundongos. Esse resultado
explica observações clínicas em pacientes que não tinham essa região e mostravam
deficiências de ε-, γ-, δ-, e β-globinas, apesar de seus genes para essas proteínas
estarem intactos e os genes de globinas no outro cromossomo funcionarem normal-
mente (Tuan et al., 1987).
A região controladora do loco está abarrotada com sítios de ligação de fatores
trans-reguladores. Como foi observado por Gary Felsenfeld (1992) “Os domínios pa-
recem ter sido montados por um estudante super-entusiasmado determinado a cons-
truir um poderoso elemento atuante como cis”. Ele sugere que uma das funções da
LCR é formar uma alça ao redor de uma das regiões promotoras durante a replicação do
DNA e se ligar a ela de maneira a impedir que nucleossomos se formem naquele
promotor de globina (Figura 11.9). Realmente, os promotores da globina não são
hipersensíveis à DNase I exceto na presença da LCR.
& Especulações
Trocas no gene de globina
A PESAR DE SER ÓBVIO que a trans-

crição do gene da globina passa
pelas isoformas embrionária, fetal
e adulta durante o desenvolvimento, não
(Behringer et al., 1987; Trudel e Constantini,
1987). Como mostra a Figura 11.10, essas re-
giões cis-reguladoras têm numerosos sítios
para fatores de transcrição ubíquos e espe-
não acontece com algumas pessoas. Es-
ses indivíduos retêm a transcrição de seu
gene da γ-globina e são consideradas como
tendo persistência hereditária da hemo-
conhecemos o mecanismo dessa troca. cíficos para eritróides. Um dos fatores espe- globina fetal ((HPFH). Isso não lhes causa
Modelos recentes da troca de globina fo- cíficos para eritróide mais importante é a pro- dano.* As mutações que dão origem à
calizam a competição e cooperação entre teína dedo de zinco, GATA-1 (Orkin, 1992). HPFH se agrupam nas regiões cis-regula-
intensificadores, promotores e a região con- Esse fator se liga às seqüências GATA, que doras. Mutações deletivas que removem
troladora de loco. [chrom2.html] são encontradas ao longo das LCR bem as regiões promotoras ou intensificadoras
como nos promotores e intensificadores de da β-globina são suficientes para elevar
Regulação do gene da globina humana numerosos genes que são expressos nas cé- os níveis de γ-globinas em células adultas.
lulas vermelhas do sangue (incluindo alguns Mutações pontuais nos promotores de um
O sistema de trocas na expressão gênica dos genes para globina, síntese de heme e o ou outro gene da γ-globina podem tam-
das globinas humanas é complicado. Exis- receptor de eritropoietina). Experimentos de bém causar HPFH (Martin et al., 1989). Uma
tem vários elementos cis-reguladores endereçamento de genes (“gene-targeting”) dessas mutações cria um novo sítio de li-
para a β-globina. Já discutimos a região mostram que camundongos sem o gene para gação para GATA-1, enquanto a outra cria
promotora da β-globina e a região con- GATA-1 não produzem a linhagem de célu- um sítio de ligação forte para o fator ubí-
troladora do loco que mantém toda a re- las eritróides (Pevny et al., 1991). Um segun- quo Sp1 (Ottolenghi, 1992). Assim, parece
gião do cromossomo pronta para ser do fator de transcrição crítico parece ser o
transcrita. Além disso, há um intensifica- NF-E2. Esse fator de transcrição bZIP espe-
*Indivíduos com HPFH são fenotipicamen-
dor 3’ (a montante do gene da β-globina) cífico para eritróides se liga a áreas da LCR e te normais e são identificados através de varre-
que regula a expressão temporal do gene, pode mediar a comunicação entre a LCR e as duras de populações para identificar outras anor-
e existe um outro intensificador intragê- regiões promotoras (talvez se ligando à malidades de globinas (como talassemia e ane-
nico que ajuda a regulação da especifici- GATA-1) (Talbot and Grosveld, 1991; Gong mia falciforme). Pesquisadores gostariam mui-
dade tissular na expressão do gene da β- and Dean, 1993). Gata-1 e NF-E2 são também to de saber reativar o gene da γ−globina em
pessoas sofrendo de β−talassemia, anemia
globina. Esse último intensificador está necessários para a formação de um dos síti- falciforme e outras doenças da β−globina. Se o
realmente localizado dentro do terceiro os hipersensíveis à DNase I na LCR (Stama- gene da γ-globina fosse reativado, mesmo fra-
éxon do próprio gene da β-globina toyannopoulos et al., 1995). camente, muitos dos sintomas dessas doenças
poderiam ser aliviados. Estudos recentes suge-
Persistência hereditária da rem que a administração de butirato ou a com-
Figura 11.10 binação de hidroxiuréia e eritropoietina podem
Representação esquemática do gene da β− hemoglobina fetal
provocar a elevação da hemoglobina fetal em
globina humana e suas regiões regulado- células vermelhas do sangue recém-geradas
ras. As áreas sombreadas representam di- A maioria das pessoas trocam a globina fetal (Perrine et al., 1993; Rodgers et el., 1993).
ferentes fatores de transcrição e as setas pela adulta ao redor do nascimento, mas isso Estão em andamento estudos de avaliação des-
duplas indicam que mais de um fator pode ses procedimentos.
se ligar naquele sítio. (De acordo com
Ottalenghi, 1992.)
Proteínas ligantes de promotor Proteínas ligantes de intensificador
Intensificador intragênico
Promotor Gene da Intensificador flanqueando

β−globina a extremidade 3’
haver uma competição entre os promoto- Fator de transcrição no sítio

Aglomerado de genes
res dos genes de γ- e β-globinas (Enver hipersensível 3
semelhantes à β−globina
et al., 1990). Essa competição é influenci-
ada pela presença de fatores trans-regu-
ladores intensificadores e silenciadores.
Existem também mutações pontuais que
causam HPFH impedindo a ligação de um
regulador negativo ao promotor da γ-
globina em células adultas (Berry et al.,
1992). Bacon e colegas (1995) tiveram evi-
dência de que a relação entre os fatores
de transcrição GATA-1 e Sp1 muda ao lon- Embrionário Fetal Adulto
go do tempo e que o tipo de globina pode
depender da concentração relativa des-
ses fatores. Holocomplexo
A LCR e a troca de globina no homem

Figura 11.11
A principal competição pode não ser para a Mecanismo proposto para ativação da família das β−globinas pela LCR. (A) O sítio hipersen-
ativação pelo intensificador 3’ (que pode sível 3 da LCR é ativado por um fator trans–ativador. (B) Uma vez aberto o sítio 3, os outros
funcionar localmente), mas pela LCR. En- sítios hipersensíveis abrem e ligam seus fatores de transcrição. Interações entre essas proteínas
quanto alguns investigadores consideram formam um “holocomplexo” de DNA e proteína. Esse pode formar uma alça e interagir com os
que o principal efeito da LCR é manter a promotores dos genes da globina. Competição por essa interação, pela presença de diferentes
cromatina contendo locos da globina em concentrações de fatores de transcrição, permitiria a ativação diferencial e seqüencial desses
genes durante o desenvolvimento dos eritrócitos. (De acordo com Ellis et al., 1996.)
uma conformação transcricionalmente per-
missiva (veja Martin et al., 1996), outros pes-
quisadores imaginam interações específicas
entre diferentes promotores do gene da hipersensível à DNase é aberto por um fator γ-globinas são produzidas normalmente.
globina e as regiões da LCR. É interessante de transcrição trans-ativador. Uma vez aber- Entretanto, a troca para β-globina não é
notar que a distância entre a LCR e os genes to esse sítio, os outros três sítios específi- feita. Isso sugere que o holocomplexo da
da globina afetam sua ativação (Hanscombe cos para tecidos também se abrem. Intera- LCR continua a interagir com os promo-
et al., 1991). Quando unido próximo à LCR, ções proteína-proteína entre esses sítios os tores do gene da γ-globina a não ser que
o gene da β-globina humana é expresso em agrupa para formar um “holocomplexo”, que seja estabilizado ao promotor do gene da
células embrionárias de camundongos espalha a alteração na estrutura da cromati- β-globina pelo EKLF (Wijgerde et al.,
transgênicos. Sua ativação correta (somen- na através da região da β-globina. O holo- 1996). Inversamente, fatores de transcri-
te em células adultas) é restaurada somente complexo formaria uma alça de interação com ção tais como GATA1 e YY1 podem inter-
quando ele é colocado mais longe da LCR. cada um dos genes da globina, e interagiria ferir com a ligação de LCR com um promo-
De maneira semelhante, o gene da γ-globina seqüencialmente com as regiões promoto- tor, enquanto eles intensificam a ligação
humana é reprimido mais cedo (como o gene ras de cada gene. Os fatores de transcrição da LCR a outro promotor (Raich et al.,
normal da β-globina) quando ele está mais envolvidos nas síndromes de HPFH podem 1996; Wandersee et al., 1996). As intera-
separado da LCR. Isso sugere que a intera- ser aqueles que são mediadores nas intera- ções entre sítios de LCR e promotores e
ção entre LCR e os genes da globina é pola- ções entre os promotores e os sítios hiper- como essas poderiam ser reguladas por
rizada (veja Figura 11.10; Hanscombe et al., sensíveis da LCR. Além disso, esses sítios diferentes relações e tipos de fatores de
1991): os genes da globina mais perto da não são permutáveis (isto é, o sítio 4 não transcrição ainda devem ser elucidadas,
LCR são ativados mais cedo, enquanto os pode substituir o sítio 3) e, portanto, devem mas essas interações entre intensificado-
mais distantes o são mais tarde. Presumi- ter diferentes papéis nessas interações res, promotores e a LCR devem fornecer
velmente, existe um contato físico entre a (Bungert et al., 1995). uma estória fascinante sobre a expressão
LCR e os promotores e intensificadores es- Nesses modelos, há uma competição gênica diferencial em células humanas.*
pecíficos dos genes. entre os promotores pela LCR. Um fator de * Se você acha que as coisas estão complica-
O mecanismo pelo qual a distância da transcrição recentemente descoberto, das, você está certo. Harold Weintraub, que foi
LCR poderia regular a ativação de diferen- EKLF (fator de eritróide semelhante ao um dos líderes da pesquisa em cromatina disse:
tes promotores em diferentes tempos ainda Krüppel), pode ser crucial na regulação “Um intensificador complexo pode ter 10 sítios
tem que ser explicado. Um modelo (Figura dessa competição por estabilizar as intera- de ligação, uma LCR provavelmente outro tan-
to, um complexo de transcrição pode conter 15
11.11; Ellis et al., 1996) foi recentemente pro- ções entre LCR e o promotor da β-globina.
proteínas e a RNA polimerase talvez 12. Que
posto considerando que camundongos Em camundongos sem EKLF, mas tendo confusão!” (H. Weintraub, comunicação pesso-
transgênicos contêm pedaços de LCR no um sistema funcional do gene da β-globina al). Não sabemos porque existem tantos fatores
seu genoma. Nesse modelo, o terceiro sítio humana (incluindo a LCR humana), as ε- e diferentes regulando a transcrição desses genes.
Metilação de DNA e atividade gênica

Freqüentemente, assume-se que o gene contém exatamente os mesmos nucleotí-
deos na forma ativa ou inativa. Um gene da β-globina em precursores de células
vermelhas do sangue deveria ter os mesmos nucleotídeos que um gene da β-
globina em um fibroblasto ou célula retiniana do mesmo animal. Existem, entretan-
to, diferenças sutis no DNA. Em 1948, R. D. Hotchkiss descobriu uma “quinta
base” no DNA, 5-metilcitosina. Em alguns eucariotos, essa base é produzida
enzimaticamente após replicação do DNA, e aproximadamente 5% das citosinas
em DNA de mamíferos são convertidas em 5-metilcitosina. Essa conversão só
pode ocorrer quando o resíduo de citosina é seguido por uma guanosina (CpG).
Estudos recentes mostraram que o grau de metilação das citosinas em um gene
pode também controlar a transcrição do gene. Em outras palavras, a metilação do
DNA pode mudar a estrutura do gene e, assim fazendo, regula sua atividade. A
metilação da citosina parece ser um mecanismo majoritário na regulação transcrici-
onal em vertebrados. Entretanto, Drosophila, nematódeos e talvez a maioria dos
invertebrados não metilam o seu DNA.
Existem três áreas nas quais a metilação do DNA parece contribuir para a ativi-
dade gênica diferencial. Primeiro, a metilação de seqüências do promotor contribui
para a regulação temporal e espacial dos genes codificando proteínas específicas
de tecidos. Segundo, a metilação do DNA é considerada responsável pela distin-
ção entre certos genes derivados do óvulo ou do espermatozóide nos mamíferos,
assim permitindo a expressão de somente um deles durante o desenvolvimento
precoce. Terceiro, a metilação do DNA é considerada responsável pela repres-
são continuada de genes em um dos dois cromossomos X em cada célula femini-
na de mamíferos.
Correlações entre metilação do promotor e inatividade gênica
A primeira evidência de que a metilação do DNA ajuda a regular a atividade do gene

vem de estudos mostrando correlação entre atividade gênica e baixa metilação da
citosina (hipometilação), especialmente na região promotora do gene. Em células
vermelhas do sangue em desenvolvimento, no homem e no pinto, o DNA envolvido
na síntese da globina está completamente (ou quase completamente) não metilado,
enquanto que os mesmos genes, em células que não produzem globinas, estão
altamente metilados (Figura 11.12). Células de fígado fetal que produzem hemoglobi-
na no desenvolvimento precoce têm genes não metilados para a hemoglobina fetal.
Esses genes são metilados no tecido adulto (van der Ploeg e Flavell, 1980; Groudine
e Weintraub, 1981; Mavilio et al., 1983).
Modelos de metilação com especificidade tissular podem também ser encontra-
dos no gene da ovalbumina do pinto; o gene não está metilado nas células do
oviduto, mas em outros tecidos do pinto está metilado (Mandel e Chambon, 1979).
Desmetilação acompanha a troca de classe na síntese das imunoglobulinas (Rogers
e Wall, 1981) e se correlaciona com a habilidade de linfócitos murinos em produzir a
proteína ligante de metais, metalotioneína I (Compere e Palmiter, 1981). Em somitos
de camundongo, a desmetilação de um intensificador MyoD precede sua transcrição
e é essencial para a especificação dessas células como precursores musculares
(Brunk et al., 1996). Portanto, a ausência de metilação do DNA tem boa correlação
com a expressão específica de tecido de certos genes.
Um segundo tipo de evidência indicando a metilação do DNA como um proces-
so regulador vem de experimentos nos quais a expressão de genes clonados é
alterada pela introdução ou remoção de grupos metila em seus resíduos de citosina.
Quando Busslinger e colaboradores (1983) adicionaram genes de globina clonados
a células (por co-precipitação com fosfato de cálcio), essas absorveram o DNA e, em
muitos casos, o incorporaram em seus núcleos. Em tais casos, os genes da globina
Promotor não Promotor Figura 11.12

metilado metilado Metilação de genes da globina em células
Gene da ε−globina Gene da γ−globina sangüíneas embrionárias em humanos. A ativi-
dade dos genes da globina tem correlação in-
6 semanas DNA versa com a metilação de seus promotores.
Ativo Inativo (De acordo com Mavilio et al., 1983.)
ε−globina
12 semanas
Inativo Ativo
γ−globina
clonados foram transcritos. Se certas regiões dos genes de globina clonados forem
protegidos da metilação, antes de adicioná-los às células, será possível criar clones
nos quais os genes da globina têm seqüências idênticas mas diferentes padrões de
metilação. Um gene completamente não metilado é transcrito, enquanto que um gene
completamente metilado (grupo metila em cada apropriado resíduo C) não é transcrito.
Usando clones parcialmente metilados, Busslinger e colaboradores mostraram que a
metilação na região 5’ do gene da globina (nucleotídeos –760 a +100) previne a
transcrição. Parece, portanto, que a metilação no terminal 5’ de um gene tem um
papel direto na regulação da expressão gênica. De modo geral, a metilação da região
promotora inibe a transcrição de genes.
Metilação e a manutenção dos padrões de transcrição
Diferenças na metilação podem ser responsáveis pela manutenção (como o oposto

à iniciação) de um padrão de atividade transcricional ao longo de várias gerações
de células (Holliday, 1987). Durante a replicação, cada fita de DNA serve como um
molde para sua fita complementar. Nas regiões de metilação, os grupos metila estão
nas duas fitas da dupla hélice, visto que uma CpG em um lado do DNA é refletida por
uma CpG antiparalela no outro lado. Se o C em uma das fitas está metilado, o C na na
outra fita também está (Figura 11.13). Durante a replicação, uma fita de DNA (a fita
molde) teria o padrão de metilação, ao passo que a fita recém-sintetizada não o teria.
Entretanto, a enzima DNA (citosina-5)-metiltransferase tem uma forte preferência
por DNA com uma fita metilada, e quando encontra um metil-CpG em um lado do
DNA, a enzima metila a nova citosina no outro lado (Gruenbaum et al., 1982; Bestor
Replicação
e Ingram, 1983).
É duvidoso que modificações na metilação realmente iniciam modificações na
atividade do gene, pois a DNA metiltransferase não tem uma especificidade ine-
rente em relação a uma seqüência (salvo uma propensão geral para áreas ricas em Novas fitas de DNA
CpG). Como o padrão de metilação deve ser herdado após cada divisão celular,
alguma outra coisa deve reconhecer os genes de células diferenciadas no seu
estado metilado e subseqüentemente desmetilá-los. Isso foi demonstrado
transfectando um gene metilado de α-actina para células cultivadas de mioblastos
(que normalmente transcrevem aquele gene). Quando transfectado para os Metilação de
mioblastos, esse gene foi desmetilado e transcrito. Entretanto, se transferido a novas fitas de DNA
Figura 11.13
Modelo para a propagação de padrões de metilação. Quando o DNA se replica, somente uma
das duas fitas (a fita “velha”) retém o padrão original de metilação. A outra fita (a fita “nova”)
não é metilada. Uma enzima metilante específica para CpG seria capaz de se ligar aos pares de
CpG onde um resíduo C estava metilado, e então metilaria o resíduo C na fita complementar.
(De acordo com Browder, 1984.)
outros tipos de células, esse gene específico para o músculo permaneceu metilado.
A desmetilação específica para o músculo não necessitou de síntese de novo
DNA mas certas seqüências cis-DNA foram necessárias (Yisraeli et al., 1986;
Paroush et al., 1990). Uma situação semelhante foi vista na desmetilação de genes
da imunoglobulina e vitelogenina (proteína do vitelo) (Frank et al., 1990; Jost,
1993). Portanto, a metilação pode ser necessária para estabilizar o padrão de trans-
crição do gene, mas a ativação inicial do gene é provavelmente realizada por
fatores de transcrição específicos para tecidos.
Como que a metilação impede a transcrição? Uma possibilidade é que os fatores
de transcrição não podem se ligar às suas seqüências intensificadoras ou promoto-
ras se o DNA estiver metilado (Iguchi-Ariga e Schaffner, 1989). Outra possibilidade
é que o DNA metilado seja especificamente reconhecido por certas proteínas que
competem contra os fatores de transcrição por esses sítios. Boyse e Bird (1991,
1992) forneceram evidências para esse segundo modelo mostrando que seqüências
promotoras metiladas estão ligadas por uma proteína ligante de metil-CpG. Essa
proteína parece competir com a ligação de fatores de transcrição, desse modo redu-
zindo a transcrição desses sítios.
A metilação do DNA pode também influenciar a formação de nucleossomos. Keshet
e colaboradores (1986) demonstraram que a metilação afeta a estrutura da cromatina e
sugerem que a desmetilação cria sítios hipersensíveis à DNase I. Quando eles
transfectaram genes da globina desmetilados em núcleos de fibroblastos de camun-
dongo, os genes foram empacotados em cromatina sensível à DNase (independente
da habilidade transcricional do gene). Quando os mesmos genes foram metilados em
todos os sítios CpG, as regiões sensíveis à DNase não se formaram, possivelmente
porque sua metilação os levou a um empacotamento de forma inacessível. É possível
que quando os fatores trans-reguladores removem os nucleossomos do DNA, essas
regiões se tornam desmetiladas. Essa desmetilação pode ser necessária para estabili-
zar essas regiões de atividade. Os grupos metila interagiriam com as histonas para
permitir que os nucleossomos se formem somente no DNA metilado e não no DNA
desmetilado, deixando as regiões ativas livres de nucleossomos no DNA (Keshet et
al., 1986). Uma vez estabelecidas essas regiões, seria mais fácil para outros elementos
trans-reguladores encontrar essas regiões livres de nucleossomos.
& Especulações
Metilação e impressão gênica

N O CAPÍTULO 4, vimos que os
genomas do espermatozóide e do
óvulo nos mamíferos não são
equivalentes. Os zigotos não se desenvol-
vem adequadamente se seus núcleos são
tem aproximadamente uma dúzia de genes
para os quais é importante se ele deriva do
espermatozóide ou do óvulo. Em algumas
mutações no camundongo e no homem, uma
situação severa ou letal se desenvolve se o
2r) para uma proteína ligante desse fator de
crescimento no cromossomo 17 é ativo so-
mente quando transmitido pela mãe (Barlow
et al., 1991; DeChiara et al., 1991; Bartolomei
e Tilghman, 1992). Igf-2r age ligando e de-
derivados de dois pronúcleos do óvulo ou gene mutante é derivado de um genitor, mas gradando o excesso de Igf-2. Um filhote de
do espermatozóide. Essa inabilidade de de- o mesmo gene mutante não tem efeito dele- camundongo que herda uma deleção do
senvolvimento é provavelmente devida a tério se herdado do outro genitor. Por exem- gene Igf-2r de seu pai é normal, mas se a
certos genes que somente são ativos se plo, em camundongos, o gene para o fator mesma deleção é herdada da mãe, o cresci-
forem derivados do espermatozóide ou do de crescimento II semelhante à insulina (Igf- mento do feto é intensificado e ele morre
óvulo. Para a maioria dos genes (como foi 2) no cromossomo 7 é ativo em embriões tardiamente na gestação.* No homem, a per-
previsto pela genética Mendeliana) não im- precoces somente no cromossomo trans- da de um segmento específico do braço lon-
porta se ele provem do pai ou da mãe, exis- mitido pelo pai. Inversamente, o gene (Igf- go do cromossomo 15 resulta em diferentes
Tabela 11.2 Evidência que a impressão gênica afeta o fenótipo em temporal e espacialmente a atividade gênica
distúrbios do gene humano no cromossomo 15 (loco 11q13) e o comportamento cromossômico.
Swain e colaboradores (1987) acompa-
Origem genitora nharam esses eventos seguindo um gene
específico que sofre metilação diferencial no
Mãe Pai Fenótipo espermatozóide e no óvulo. Eles produzi-
ram uma linhagem de camundongos trans-
Alelo normal Alelo mutante Síndrome de Prader-Willi
gênicos nos quais um gene particular, c-myc,
Alelo mutante Alelo normal Síndrome de Angelman foi inserido em uma região particular do ge-
noma do camundongo. Quando esse gene
Duas cópias do alelo Alelo ausente Síndrome de Prader-Willi foi herdado do genitor macho, ele foi trans-
crito especificamente no coração e em ne-
Alelo ausente Duas cópias do alelo Síndrome de Angelman
nhum outro tecido. Quando esse gene foi
Fonte: De acordo com Nicholls et al., 1993. herdado do genitor fêmea, ele não se ex-
pressou. O padrão de expressão foi
correlacionado com o grau de metilação;
esse gene é metilado durante a maturação
fenótipos, dependendo se a perda é no cro- A Figura 11.14 mostra o resultado de do óvulo mas permanece hipometilado du-
mossomo derivado do homem ou da mulher um experimento onde DNA de espermato- rante a formação do espermatozóide. Em
(Tabela 11.2). Se o cromossomo com o seg- zóide foi isolado e tratado com HpaII ou animais que herdam o transgene do macho,
mento defeituoso ou ausente vem do pai, a MspI. A sonda foi um DNA radioativo do o gene não está metilado e é expresso no
criança nasce com a síndrome de Prader- segundo éxon do gene da β−globina. A coração. Em animais que adquirem o
Willi, uma doença associada a um ligeiro auto-radiografia de fragmentos da diges- transgene de suas mães, o gene é metilado
retardamento mental, obesidade, gônadas tão com MspI mostra que essa sonda se e silencioso. Em ambos, macho e fêmea, o
pequenas e baixa estatura. Se o gene defei- liga a fragmentos de DNA com 1400 pares padrão de metilação é eliminado nas células
tuoso ou ausente vem da mãe, a criança tem de bases entre os sítios CCGG. A auto- germinativas (Chaillet et al., 1991; Kafri et
a síndrome de Angelman, caracterizada por radiografia da digestão de HpaII mostra al., 1992). No camundongo, diferenças de
severo retardamento mental, convulsões, que no espermatozóide esses sítios (e pro- metilação dos gametas também são vistas
falta de fala e riso inapropriado (Knoll et al., vavelmente numerosos outros) são meti- na impressão dos genes para Igf-2r e H19
1989; Nicholls et al., 1989). [chrom3.html] lados e que essa seqüência de DNA agora (Ferguson-Smith et el., 1993; Stöger et al.,
Atualmente, considera-se que a maio- reside em um pedaço de 25000 pares de 1993). Além disso, se esses genes são colo-
ria, senão todas, as diferenças entre genes bases do DNA onde todos os sítios CCGG cados em uma linhagem de camundongos
pronucleares de machos e de fêmeas em são metilados (Groudine e Conklin, 1985).
mamíferos, envolvem diferenças em seus Essa técnica mostrou que os núcleos Msp I Hpa II
padrões de metilação do DNA. A distribui- das células germinativas primordiais nos
ção dos CG metilados ou não pode ser ana- mamíferos, macho e fêmea, são surpreen-
=25
lisada cortando o DNA com duas enzimas dentemente hipometilados (Monk et al.,
de restrição, HpaII e MspI (McGhee e 1987; Driscoll e Migeon, 1980), mas ambos
Pares de bases (x103)
Ginder, 1979). Ambas as enzimas cortam no os genes do espermatozóide e do óvulo

mesmo sítio-CCGG- mas HpaII não cortará sofrem extensa metilação no amadurecimen-
o DNA se o C central está metilado, en- to dos gametas. Parece que na formação
quanto MspI corta se a seqüência está ou das células germinativas, informações pré-
não metilada. Portanto, o DNA de certo vias sobre metilação são apagadas e, du-
tipo de célula pode ser digerido separada- rante a meiose, nova informação é introdu-
mente com HpaII e MspI e os fragmentos zida no genoma. O padrão de metilação em
1.4
de DNA obtidos transferidos pela técnica um determinado gene pode diferir entre o
Southern e hibridizados com uma sonda espermatozóide e o óvulo, e essas diferen-
radioativa específica para o gene (veja Ca- ças de metilação específicas dos genes Figura 11.14
pítulo 2). Diferenças no padrão de bandas podem ser vistas nos cromossomos das Detenção de sítios de metilação no DNA. DNA
foi isolado de espermatozóide de galinha e di-
na autoradiografia dos fragmentos cliva- células embrionárias (Reik et al., 1987; gerido com MspI (pista 1) ou HpaII (pista 2).
dos por MspI ou HpaII podem ser relacio- Sanford et al., 1987; Sapienza et al., 1987; Os fragmentos foram separados por eletrofo-
nadas às diferenças de metilação. Chaillet et el., 1991; Kafri et al., 1992). Por- rese, transferidos para papel e hibridizados
tanto, diferenças de metilação entre os por uma sonda de DNA radioativo do segundo
*O aumento de 30% no crescimento é cau- genes do espermatozóide e do óvulo po- éxon do gene da β−globina. Essa sonda se li-
sado por um excesso de Igf-2. A letalidade é gou a um fragmento de 1400 bases no digerido
dem especificar um gene vindo do pai ou
provavelmente devida a defeitos lisossômicos, de MspI, mas a um fragmento de 25.000 bases
pois a proteína ligante de Igf-2 também serve da mãe. Essa impressão materna ou paterno digerido de HpaII. (De acordo com
para direcionar enzimas lisossômicas para na adiciona informação aos genomas her- Groudine e Conklin, 1985; fotografia cortesia
aquela organela. (Wang et al., 1994.) dados, informação essa que pode regular de M. Groudine.)
mutantes que não possui a enzima capaz de negativo ou positivo para a transcrição. macho e fêmea, no zigoto. Elas fornecem
metilar os sítios CpG, a transcrição do gene Essas diferenças de metilação específica também um lembrete de que o organismo
H19 ocorre a partir do alelo previamente si- para gametas fornecem uma explicação plau- não pode ser explicado somente na base de
lencioso, enquanto que a transcrição de Igf- sível para a falta de desenvolvimento nos seus genes. São necessários conhecimen-
2r é perdida (Li et al., 1993). Assim, em genes mamíferos partenogenéticos e para a neces- tos tanto de parâmetros desenvolvimentais
impressos, a metilação pode ser um sinal sidade da presença de ambos os pronúcleos, como genéticos.
Compensação de dosagem do cromossomo X de mamíferos

Em animais tão diversos como a Drosophila e o homem, as fêmeas se caracterizam
por terem dois cromossomos X por célula, enquanto os machos só tem um por
célula. Em contraste com o cromossomo Y, o cromossomo X tem milhares de genes
essenciais para a atividade celular. Mas, apesar das células femininas possuírem um
número de cromossomos X que é o dobro das masculinas, as células de ambos têm
quantidades aproximadamente iguais de produtos gênicos codificados pelo cro-
mossomo X. Essa equalização é chamada compensação de dosagem. As taxas de
transcrição dos cromossomos X foram alteradas de tal forma que células masculinas
e femininas transcrevem a mesma quantidade de RNAs de seus cromossomos X. Na
Drosophila, ambos os cromossomos X na fêmea são ativos, mas há uma crescente
transcrição do cromossomo X do macho, de modo que o único cromossomo X das
células do macho produz tanto produto quanto os dois cromossomos nas células
femininas (Lucchesi e Manning, 1987). Isso é possibilitado pela ligação de fatores
de transcrição específicos a centenas de sítios ao longo do cromossomo X do
macho (Kuroda et al., 1991).
Nos mamíferos a compensação de dosagem do cromossomo X ocorre por inativa-
ção de um cromossomo X em cada célula feminina. Dessa forma, cada célula somática
em mamíferos, seja de macho ou de fêmea, tem somente um cromossomo X funcional.
Esse fenômeno é chamado inativação do cromossomo X. A cromatina do cromossomo
X inativo é convertida em heterocromatina- cromatina que permanece condensada ao
longo da maior parte do ciclo celular e se replica após a maior parte da cromatina do
núcleo (a eucromatina). Essa heterocromatina, em uma formação chamada corpo de
Barr (Figura 11.15), é freqüentemente vista no envoltório nuclear de células femininas
(Barr e Bertram, 1949). A inativação do cromossomo X deve ocorrer precocemente no
desenvolvimento. Tagaki e Abe (1990) usando um cromossomo X mutado que não se
inativava, mostraram que a expressão de dois cromossomos X por célula em embriões
de camundongo leva à morte das células ectodérmicas e ausência de formação do
mesoderma, finalmente causando a morte embrionária no 100 dia de gestação.
Figura 11.15
Núcleos de células do epitélio oral humano coloridos com Cresil violeta. (A) Célula de um
homem normal XY, mostrando ausência do corpo de Barr. (B) Célula de uma mulher normal XX,
mostrando um único corpo de Barr (seta). (C) Célula de uma mulher com três cromossomos X.
Dois corpos de Barr podem ser vistos, e somente um cromossomo por célula é ativo. (De acordo
com Moore, 1977.)
CLIVAGEM IMPLANTAÇÃO
PRECOCE
NA FERTILIZAÇÃO
Corpos de Barr
Cromossomo X
materno
Cromossomo
X paterno
Zigoto feminino Os dois cromossomos X Inativação ao acaso de
com dois são ativos em todas um cromossomo X
(A)
cromossomos X as células em todas as
células do embrião
(B)
Figura 11.16
Inativação do cromossomo X em mamíferos. (A) Diagrama esquemático ilus-
trando inativação ao acaso do cromossomo X. Considera-se que a inativação
ocorra aproximadamente na época da implantação. (B) Um camundongo fêmea
heterozigoto para o gene dappled, da coloração da pelagem, ligado ao X. Po-
dem ser observadas regiões distintamente pigmentadas. (Fotografia cortesia
de M. F. Lyon.)
A inativação precoce de um cromossomo X por célula tem conseqüências

fenotípicas importantes. Uma das primeiras análises da inativação do cromossomo
X foi feita por Mary Lyon (1961), que observou os padrões de coloração na pelagem
de camundongos. Se o animal é heterozigoto para um gene autossômico controlan-
do a pigmentação do pêlo, então ele se parece a um dos dois genitores ou tem uma
cor intermediária. Em qualquer caso, o camundongo tem uma cor única. Mas se um
camundongo fêmea é heterozigoto para o gene da pigmentação no cromossomo X, o
resultado é diferente: faixas da cor de um dos genitores se alternam com outras da
cor do outro genitor (Figura 11.16). Lyon propôs a seguinte hipótese para explicar
esses resultados:
1. Muito precocemente no desenvolvimento de mamíferos do sexo feminino, ambos

cromossomos X são ativos.
2. Prosseguindo o desenvolvimento, um cromossomo X é desligado em cada
célula.
3. Essa inativação é ao acaso. Em algumas células, o cromossomo X derivado do
pai é o inativado; em outras é aquele proveniente da mãe.
4. Esse processo é irreversível. Uma vez que um cromossomo X foi inativado, o
mesmo cromossomo X é inativado em toda a progênie daquela célula. (As
áreas de pigmentação nesses camundongos são manchas amplas, não um
padrão de “sal e pimenta”.) Desse modo, todos os tecidos em fêmeas de mamí-
feros são mosaicos de dois tipos de células.
Algumas das evidências mais impressionantes em favor desse modelo vêm de

estudos bioquímicos em clones de células humanas. Em humanos, existe uma
doença genética- Síndrome de Lesch-Nyhan- que se caracteriza pela falta de uma
enzima ligada ao cromossomo X, hipoxantina fosforibosiltransferase (HPRT). A
síndrome de Lesch-Nyhan é transmitida através do cromossomo X – ou seja,
homens que têm essa mutação em seu único cromossomo X sofrem (e morrem) da
doença. Em indivíduos do sexo feminino, entretanto, a presença do gene mutante
HPRT pode ser mascarada pelo outro cromossomo X, que carrega o alelo do tipo
selvagem. Uma mulher que tem filhos com essa doença é considerada uma porta-
dora, pois ela tem um gene HPRT mutante em um cromossomo, e um gene HPRT do
tipo selvagem no outro cromossomo X. Se a hipótese de Lyon é correta, cada
célula dessa mulher deveria estar produzindo HPRT ativa ou inativa, dependendo
de qual cromossomo X está ativo. Barbara Migeon (1971) testou essa possibilida-
de tomando células da pele de uma mulher heterozigota para o gene HPRT e colo-
cando-as em cultura. Cada uma dessas células se dividiu formando clones de
Figura 11.17 células. Migeon usou métodos de coloração para detectar a presença de HPRT
Retenção da inativação do cromossomo X. tipo selvagem nesses clones, verificando que aproximadamente metade dos clones
Aproximadamente 30 células de uma mulher tinham a enzima e a outra metade não ( Figura 11.17).
heterozigota para a deficiência de HPRT fo-
A hipótese de Lyon sobre a inativação do cromossomo X fornece uma excelen-
ram colocadas em uma placa de Petri e permi-
tido o seu crescimento. As células foram te explicação sobre a inativação gênica diferencial a nível da transcrição. Algumas
visualizadas por auto-radiografia após incu- exceções em relação à regra geral mostram ainda mais sua importância. Primeiro, a
bação em um meio contendo hipoxantina radi- inativação do cromossomo X somente se dá em células somáticas, não em células
oativa. Células com HPRT incorporam o com- germinativas. Em células germinativas femininas, o cromossomo X inativo é
posto radiomarcado em seu RNA e escurecem reativado imediatamente antes que as células entrem em meiose (Gartler et al.,
a emulsão fotográfica colocada sobre elas. Os 1973; Migeon e Jelalian,1977; Kratzer e Chapman, 1981). Assim, em oócitos madu-
clones de células sem HPRT parecem mais claros, ambos cromossomos X estão ativos. Em cada geração, a inativação do cro-
ros porque suas células não podem incorporar mossomo X tem que ser renovada.
o composto radioativo. (De acordo com
Segundo, existem algumas exceções à regra do acaso no padrão da inativação. A
Migeon, 1971, cortesia de B. Migeon.)
primeira inativação do cromossomo X no camundongo é vista no trofectoderma,
onde o cromossomo X paterno é especificamente inativado (Tagaki, 1974; West et
al., 1977). Terceiro, a inativação do cromossomo X não se estende a cada gene no
cromossomo X humano. Existem vários genes no braço curto do cromossomo X
(como aquele codificando a sulfatase de esteróides) que “escapam” da inativação
relacionada à dosagem (Mohandas et al., 1980; Brown e Willard, 1990), e mesmo no
braço longo, existem alguns genes que são transcritos de ambos os cromossomos X
em cada célula somática feminina. Portanto, no homem, a heterocromatização não se
estende por todo o cromossomo X.
A quarta exceção, na verdade, acaba provando a regra. Existem alguns mamífe-
ros machos, cujos padrões da cor de pelagem não poderia ser encontrada a não ser
que os animais exibissem inativação do cromossomo X. Felinos machos tipo ma-
lhado e casco de tartaruga estão entre esses exemplos. Esses modelos de pelagem
com manchas são normalmente encontrados em fêmeas e considerados resultan-
tes de uma inativação ao acaso do cromossomo X. Mas raros machos exibem
também esses tipos de pelagem. Como pode ser isso? Acontece que esses felinos
são XXY. O cromossomo Y os torna machos (veja Capítulo 20), mas um cromosso-
mo X é inativado, como nas fêmeas, de modo que há somente um X ativo por célula
(Centerwall e Benirschke, 1973). Dessa forma, esses felinos têm células com um
corpo de Barr e inativação ao acaso do cromossomo X. Está claro, então, que um
dos mecanismos para o controle do nível de transcrição da regulação gênica é
produzir um grande número de genes heterocromáticos e portanto transcricional-
mente inertes.
& Especulações
O mecanismo de inativação do cromossomo X

O de inativação do cro-
MECANISMO
mossomo X ainda não é bem co-
nhecido, mas pesquisa recente
nos dá algumas indicações dos fatores
res humanos, nos locos que escapam à
inativação do cromossomo X, ambos os
cromossomos X sintetizam o transcrito.
Aqui o transcrito provinha somente do X
loco de Xist em uma célula XX impede-
se a inativação do X naquele cromosso-
mo (Penny et al., 1996). Terceiro, a trans-
ferência de um segmento de 450 quiloba-
que podem estar envolvidos na iniciação “inativo”.) Esse transcrito, XIST, estava ses contendo o gene Xist do camundon-
e manutenção de um cromossomo X he- sendo produzido por um gene dentro da go para um autossomo de células pre-
terocromático. região XIC. Além disso, esse transcrito cursoras embrionárias masculinas causa
não parece codificar uma proteína. Ele per- a inativação aleatória daquele autosso-
Iniciação da inativação do cromossomo X: manece dentro do núcleo e interage com mo ou do cromossomo X endógeno (Lee
O gene Xist a cromatina X inativa do corpo de Barr et al., 1996). O autossomo é “contado”
(Brown et al., 1992). Uma situação similar como um cromossomo X. A expressão de
As primeiras indicações sobre a existên- existe no camundongo, onde o gene Xist Xist é somente necessária para a inicia-
cia de um iniciador na inativação do cro- do cromossomo X inativo sintetiza um ção da inativação do cromossomo X.
mossomo X vieram de estudos genéticos RNA nuclear cuja seqüência não pode co- Uma vez ocorrida a inativação ele se tor-
onde cromossomos X rearranjados em dificar uma proteína* (Borsani et al., 1991; na dispensável (Brown e Willard, 1994).
camundongos não podiam ser inativados Brockdorrf et al., 1992). Ainda não se sabe o que o RNA do Xist
(Russell, 1963; Cattanach et al., 1969; O gene Xist é um excelente candida- faz para inativar o cromossomo.
Mattei et al., 1981). Esses cromossomos to para o iniciador da inativação do X. O loco do Xist está impresso nos
não tinham uma certa região, chamada Primeiro, os transcritos do gene Xist são gametas, e a impressão é efetuada pela
posteriormente de centro de inativação do vistos em embriões de camundongo an- metilação diferencial na região promotora
cromossomo X (XIC). Em 1991, Brown e tes da inativação do cromossomo X, o do Xist. Durante a espermatogênese, três
seus colegas encontraram um transcrito que seria de se esperar se o gene tem um sítios CG no promotor do Xist são desme-
de RNA originado unicamente de um cro- papel em iniciar essa inativação (Kay et tilados, enquanto que os mesmos sítios
mossomo X inativo de humano. (Nos se- al., 1993). Segundo, “derrubando” um são completamente metilados durante a
oogênese. Em células somáticas, o gene
Xist ativo (no cromossomo X inativo) é
praticamente não metilado, enquanto que
Células germinativas: o gene Xist inativo (no cromossomo X
ativo) está completamente metilado (Fi-
DNA gura 11.18; Norris et al., 1994; Ariel et al.,
TATA
1995; Zuccotti e Monk, 1995). Esse pa-
Espermato- drão de expressão do Xist é mantido nos
zóide tecidos extra-embrionários do camundon-
TATA go (de tal modo que o Xist de origem pa-
Óvulo terna está desmetilado e ativo, levando à
inativação daquele cromossomo). Entre-
tanto, as células do epiblasto embrioná-
Células somáticas: TATA rio perdem os padrões de impressão de
X-inativo seus ancestrais e reestabelecem as dife-
renças de metilação ao acaso.
TATA
X-ativo *A lista de tipos de RNA está crescendo. Além
dos bem conhecidos mRNA, tRNA, rRNA e pe-
Sítios de correlação quenos RNAs nucleares (envolvidos nas emen-
da transcrição das de RNA), existem também RNA H19 e RNA
do gene Xist, nenhum dos quais codificam proteínas. Em
Capítulos mais adiante discutiremos RNAs de
Figura 11.18 controle de tradução (antisenso natural) e RNAs
Sumário dos padrões de metilação do Xist no espermatozóide, óvulo e dois cromossomos X em como X1srt usados para localizar mensagens para
células somáticas. Quadrados abertos representam sítios CG não metilados; quadrados cheios regiões do citoplasma de oócitos. O embrião usa
representam sítios CG metilados. As áreas sombreadas indicam sítios correlacionados com a RNAs de maneiras muito mais criativas do que
transcrição dos genes. (De acordo com Zuccotti e Monk, 1995.) os organismos adultos.
Impedindo a transcrição: (A) (B)

O nucleossomo não acetilado.
O que está impedindo que a transcrição do

DNA do cromossomo X inativo seja como
aquela do ativo? Um estudo recente de
Jeppeson e Turner (1993) sugere que os cro-
mossomos X ativo e inativo diferem entre
si pela acetilação de suas respectivas
histonas H4. Uma das melhores maneiras
de liberar proteínas do DNA é adicionar
cargas negativas às proteínas. Isso pode
ser feito adicionando grupos fosfato ou
Figura 11.19
acetato às regiões da proteína ligante de
O cromossomo X inativo de células de indivíduos humanos do sexo feminino contêm histonas
DNA. A acetilação de histona H4 tem sido
H4 subacetiladas. (A) Esfregaço metafásico de uma célula fibroblástica feminina humana
correlacionada a genes transcrevendo ati- corada com Hoechst 33258, que cora cromatina. (Cromossomos 7 e 11 estão numerados, e a
vamente. Nucleossomos de regiões pro- seta aponta o X inativo.) (B) A mesma preparação corada com anticorpo fluorescente para a
motoras com CG não metilados têm prote- histona H4 acetilada. Enquanto todos os outros cromossomos estão claramente visíveis o X
ínas H4 altamente acetiladas, e a acetilação inativo não está. (de Jeppesen e Turner, 1993; fotografias cortesia dos autores.)
da histona H4 se correlaciona com a ati-
vação de certos genes (Chahal et al., 1980;
Tazi e Bird, 1990). Além disso, apesar do
fator de transcrição TFIIIA não poder se HPRT estava no cromossomo X inativo, assim que um novo padrão de inativação
ligar ao gene do RNA 5S se esse estiver o DNA não produzia a enzima na célula do cromossomo X ocorra na próxima ge-
envolvido em um nucleossomo, aquele fa- hospedeira deficiente em HPRT. Entretan- ração. Durante o primeiro trimestre do
tor pode se ligar ao gene se as histonas to, se o DNA era derivado do clone de desenvolvimento humano, é estabeleci-
do nucleossomo estiverem acetiladas (Lee células expressando o gene HPRT no seu do de novo o padrão adulto de metilação
et al., 1993). A acetilação de histonas pa- cromossomo X ativo, as células trans- e inativação do cromossomo X (Migeon
rece não ser obrigatória para a transcri- fectadas produziram HPRT desse gene. et al., 1991).*
ção do gene, mas pode facilitar a transcri- Logo em seguida, Mohandas e colegas Ainda não conhecemos o mecanismo
ção em vários sistemas (Turner, 1991). (1981) demonstraram que 5-azacitidina pelo qual o transcrito de Xist regula o esta-
Usando um anticorpo que reconhece a (uma droga que inibe a citosina metiltrans- do da cromatina e como se dá o espalha-
histona H4 acetilada (mas não a não ace- ferase) poderia reativar localmente esses mento da inativação. Também, ainda não
tilada), Jeppesen e Turner encontraram genes no cromossomo X inativo. Pesqui- conhecemos as vias pelas quais a transcri-
que cromossomos X ativos, no homem e sas posteriores, usando enzimas de res- ção de Xist, a modificação dos nucleosso-
no camundongo, têm tanta histona H4 trição e sondas de cDNA, mostraram que mos e a metilação do DNA se relacionam à
acetilada como a maioria dos outros cro- as “ilhas” de CG nos sítios promotores heterocromatização de um cromossomo X.
mossomos. Entretanto, o cromossomo X de vários genes estão metilados no cro- Ainda não sabemos como é feita original-
inativo tem pouquíssima histona H4 ace- mossomo X inativo e não metilados no mente a escolha entre os dois cromosso-
tilada (Figura 11.19). Não se sabe como a cromossomo ativo (Wolf et al., 1982; mos X ou como o RNA de Xist é transcrito
expressão de Xist causaria a ocorrência Keith et al., 1986). Esses modelos de mede uma região rodeada por genes inativa-
de H4 não acetilada nos nucleossomos tilação são removidos durante a formados. Ainda há muito que aprender a respei-
do cromossomo X inativo. ção da célula germinativa, permitindo to desse crítico fenômeno nos mamíferos.
Trancamento dos padrões de transcrição: *Como mencionado em capítulos anteriores, é difícil extrapolar de um grupo de mamíferos para
metilação do DNA outro. Certamente é o caso da inativação do cromossomo X. Somente porque a inativação do
cromossomo X acontece dessa maneira na placenta do camundongo, não significa que acontece da
O trancamento do estágio transcricional mesma maneira na placenta de todos os mamíferos. Nas vilosidades coriônicas humanas, algumas
células contêm dois cromossomos X ativos, e os cromossomos X inativados podem ser reativados
inativo é feito pela metilação. A primeira
(Migeon et al., 1985, 1986). Também a inativação do cromossomo X na placenta humana parece ser
evidência indicando tais “cis” diferenças ao acaso; qualquer um dos dois cromossomos derivados do pai ou da mãe podem ser extintos. Nos
entre o estado ativo e o inativo do DNA marsupiais, o cromossomo X derivado do pai é preferencialmente inativado em todo o embrião
do cromossomo X foi obtida quando (Cooper et al., 1971; Sharman, 1971; Samollow et al., 1987). No homem, existem regiões óbvias do
Liskay e Evans (1980) transfectaram o cromossomo X que escapam à inativação. As diferenças somáticas entre humanos com os cariótipos
gene ligado ao X para HPRT para células XX e XO também predizem que devem existir genes ligados ao X que seriam necessários em duas doses
para o desenvolvimento normal de mulheres. No camundongo, a inativação do cromossomo X parece
de camundongo deficientes em HPRT em se estender ao cromossomo todo (Ashworth et al., 1991). Na determinação do sexo (Capítulo 20), é
cultura. Quando o DNA vinha de um crucial que os genes para a compensação de dosagem do X sejam ligados aos genes responsáveis pelo
clone de células nas quais o gene para fenótipo sexual. Se a dosagem não é equalizada, o embrião geralmente morre.
Associação do DNA ativo com a matriz nuclear

Ligação da cromatina ativa a uma matriz nuclear
As enzimas de replicação dentro do núcleo, de alguma maneira, devem encontrar

seus sítios para a iniciação da síntese de DNA; os fatores de transcrição e as polime-
rases devem encontrar seus promotores e intensificadores; os fatores de
processamento de RNA devem encontrar seus sítios de emendas no RNA; e o RNA
mensageiro deve eficientemente encontrar os poros através dos quais ele sairá do
núcleo. Isso é muito para se esperar de moléculas em solução. Deveria se esperar
que os vários fatores envolvidos na transcrição estivessem flutuando no fluido
nuclear trombando ao acaso no DNA. O RNA assim formado seria então emendado
e estaria se movimentando no ambiente nuclear, ao acaso, até encontrar um poro
através do qual deixaria o núcleo.
Um modelo alternativo sugere que o RNA é transcrito em um substrato sólido no
qual todas as enzimas necessárias para transcrição, processamento e transporte
estão situadas juntamente. Existem precedentes para pensar nesses termos. A ca-
deia de transporte de elétrons das mitocôndrias é um agregado com tal ordenação, e
é conhecido há muito tempo que as enzimas de síntese de DNA em bactérias residem
na face interna da membrana celular. Então, o que se deve perguntar é o seguinte:
Existe um retículo nuclear onde tais enzimas poderiam ser encontradas? Se existe tal
rede, estão os genes transcricionalmente ativos nela localizados? Se tal rede existe,
estão as enzimas de síntese de RNA nela localizados?
Uma matriz nuclear pode ser isolada dissolvendo núcleos em detergentes
lipídicos e solubilizando a maior parte do DNA com DNases (Berezney e Coffey,
1977; Capco et al., 1982). Microscopia eletrônica de transmissão de tais comple-
xos mostra um emaranhado de proteínas que se estende através do núcleo e se
conecta ao citoesqueleto no envoltório nuclear (Figura 11.20). Essa matriz é
vista em todos os núcleos eucariotos até agora examinados (Wilson, 1985; Nel-
son et al., 1986).
Quando se isola tal matriz, a DNase já removeu cerca de 98% do DNA. Está o
DNA ainda ligado a essa matriz (e presumivelmente protegido da DNase por estar
tão fortemente associado à matriz) enriquecida para transcrever genes ativamente?
Existe evidência que isso é verdade para alguns genes. O gene da ovalbumina é
preferencialmente associado com a matriz nuclear em células do oviduto de galinhas
adultas mas não em células do fígado ou eritrócitos na mesma espécie. Os genes da
globina, entretanto, não estão associados com a matriz nuclear das células do oviduto
(Robinson et al., 1982; Thorburn e Knowland, 1993). Ciejek e colaboradores (1983)
confirmaram e estenderam essas observações, mostrando que a unidade inteira da
transcrição induzível por hormônio do gene da ovalbumina está ligado à matriz
nuclear. Dentro de 100.000 pares de bases dessa unidade nenhum outro gene está
associado a essa matriz. Além disso, quando o estrógeno foi retirado dos animais, a
conexão específica desses genes à matriz nuclear foi abolida. Os genes parecem Figura 11.20
estar ligados à matriz nuclear somente quando estão ativados. Micrografia de transmissão eletrônica
Em 1985, Hutchinson e Weintraub mostraram que sítios sensíveis à DNase não (47.000x) de uma porção da matriz nuclear e
são encontrados uniformemente por todo o núcleo. Eles trataram núcleos com DNase citoplasma ao redor. Filamentos do citoes-
I e então repararam os cortes com nucleotídeos radioativos. O DNA marcado deveria queleto são claramente visíveis. As células
representar somente os genes transcrevendo ativamente (ou seja, sensíveis à DNase fibroblásticas do camundongo foram extraí-
I). Os resultados desse tratamento mostraram que o DNA sensível à DNase I estava das com detergente para remover lipídios e
localizado na periferia do núcleo e ao longo dos canais ou fibras que se ligavam ao em seguida tratadas com DNase I. Em 1895,
E. B. Wilson, usando o microscópio de luz,
envoltório nuclear (Figura 11.21). Então, é possível que genes ativos estão especifi-
relatou que o núcleo era atravessado por fi-
camente associados ao envoltório nuclear ou à matriz. bras que eram contínuas com aquelas do
Outro tipo de evidência indicando a participação da matriz nuclear na transcri- retículo citoplasmático e que rodeavam a
ção é a demonstração de que a maioria do RNA recém-sintetizado (alguns conside- cromatina. (de Capco et al., 1982, cortesia
ram 95%) parece estar ligado à matriz nuclear (Herman et al., 1978; Miller et al., 1978; de S. Penman.)
(A) (B) Alças de DNA cromossômico conectadas à matriz

nuclear através de origens de replicação. O empacotamento
em nucleossomos e fibras de 30nm não é mostrado
para simplificação
Genes ativos ligados aos

canais da matriz através de
domínios reguladores e
RNA polimerase
temporariamente imobilizada
Canal da
matriz
Figura 11.21 nuclear
Presença de cromatina ativa ao longo da periferia e canais nucleares. mRNA coberto
(A) Núcleos de eritrócitos tratados com DNase I, que parecem cortar com proteínas
regiões de cromatina transcrevendo ativamente. Esse corte foi “cura-
do” por tradução de corte dentro do núcleo em presença de nucleotí-
deos, cuja presença pode ser detectada por fluorescência. Os nucleo- DNA
tídeos marcados foram encontrados na periferia do núcleo e ao longo
de estruturas levando para dentro a partir do envoltório nuclear. (B)
Modelo especulativo da organização da cromatina na interfase, ima-
RNA sendo Matriz nuclear
ginando a matriz nuclear como uma série de canais internos. (A de transportado
Hutchinson e Weintraub, 1985, cortesia de N. Hutchinson; B de para o citoplasma
acordo com Razin e Gromova, 1995.)
Citoplasma Poro nuclear
van Eekelen e van Venrooij, 1981; Mariman et al., 1982). Essa ligação parece ser
mediada por um conjunto de proteínas da matriz nuclear. Essas proteínas incluem
laminina B1, um componente principal do envoltório nuclear (Ludérus et al., 1992),
uma proteína ligante de DNA específica do timo que desenrola o DNA adjacente ao
seu sítio de ligação (Dickinson et al., 1992), e o fator de transcrição YY1/NF-E1 que
foi considerado idêntico à proteína 1 da matriz nuclear (NMP-1) (Guo et al., 1995).
Considerando que genes ativos, RNA polimerase, e transcritos nascentes parecem
estar ligados a uma matriz nuclear, Jackson e Cook (1985) propuseram que a transcri-
ção não ocorre pela migração de uma polimerase ao longo do gene. Ao contrário,
eles imaginaram uma RNA polimerase acorrentada à matriz nuclear, com o DNA
migrando através dela.
Existe também alguma evidência de que o DNA ativo possa estar ligado à matriz
nuclear através de seqüências de DNA ricas em AT e denominadas regiões associa-
das à matriz (MARs), ou regiões associadas a andaimes (Gasser e Laemmli, 1986). A
maior parte dessas MARs se localizam perto ou dentro de intensificadores ou promo-
tores. A importância dessas regiões foi mostrada por Stief e colaboradores (1989), que
identificaram duas MARs no gene da lisozima do pinto. Nesse caso, as MARs não
estavam no intensificador e por essa razão puderam ser separadas. Quando eles fun-
diram o intensificador e o promotor da lisozima do pinto ao gene CAT repórter e
transfectaram o clone em células produtoras de lisozima, isso não produziu muita
proteína CAT. Então eles produziram um gene similar que continha o promotor, o
intensificador e seqüências CAT e o conjunto foi flanqueado por duas MARs. Quando
Figura 11.22
Importância das regiões associadas à matriz na
Intensificador transcrição. Na transfecção de clones consistin-
Promotor
do de promotor da lisozima, intensificador e o
gene CAT, para uma linhagem celular secretora
de lisozima, muito pouca proteína CAT é pro-
duzida, como determinado pela atividade
enzimática de CAT. Entretanto, se as duas MARs
Gene CAT são incluídas no gene clonado, muito mais pro-
teína CAT pode ser encontrada nessas células.
(De acordo com Stief et al., 1989.)
Região associada à matriz
Topoisomerase II
Produtos
Substrato
Sítios de ligação para
topoisomerase II
Resultados da transfecção
esse clone foi transfectado em células produtoras de lisozima, a síntese de CAT foi
enormemente aumentada (Figura 11.22). Da mesma forma, duas MARs flanqueiam um
intensificador do loco da cadeia pesada µ da imunoglobulina de camundongo, e a
transcrição desse gene requer a presença tanto do intensificador como das duas
MARs. As MARs parecem cooperar com o intensificador para estender uma região de
cromatina acessível a fatores, ao promotor do gene da imunoglobulina (Forrester et al.,
1994; Jenuwein et al., 1997).
Topoisomerases e transcrição gênica
Em vários estudos, foram identificadas regiões associadas à matriz que continham

RNA polimerase
ou eram adjacentes a uma seqüência de DNA que é reconhecida por uma enzima-
topoisomerase II – que pode ser essencial à transcrição (Cockerill e Garrard, 1986;
Adachi et al., 1989; Scheuermann e Chen, 1989). Estudos recentes sugeriram que
desenrolar a hélice de DNA é importante para a facilitação da transcrição. Cromatina
ativa transcricionalmente tem que ser torcida para permitir o desenrolar das fitas
(Ryoji e Worcel, 1984), e a torção é realizada por superespiralamento da hélice de
DNA (Figura 11.23). Villeponteau e colaboradores (1984) mostraram que sítios sensí-
veis à DNase I em genes ativos são formados somente quando os genes estão sob
tensão torcional. A topoisomerase II é a enzima responsável pela torção do DNA e Superespiral
separação das fitas. Usando anticorpos para essa proteína, Berrios e colegas (1985) negativa
Figura 11.23
Superespiralamento do DNA durante a transcrição. Topoisomerase II junta duas regiões do
DNA e introduz o superespiralamento quebrando transitoriamente e recombinando as fitas de
DNA. Como resultante da distorção, uma porção da dupla hélice se separa em duas fitas,
permitindo à RNA polimerase (e presumivelmente a outros fatores trans-reguladores) iniciar a
transcrição. Os sítios de ligação da topoisomerase foram encontrados no DNA ligado à matriz
(Cockerill e Garrard, 1986). (De acordo com Darnell et al., 1986.)
Figura 11.24
Uma das quatro regiões do intensificador do
gene de cadeia pesada da imunoglobulina pro-
tegida pela proteína NF-µNR. NF-µNR foi
adicionada ao DNA da região do intensificador Sítio de ligação da Seqüência de Protegida por
e o DNA foi digerido com DNase. Somente as topoisomerase ligação à matriz NF-µNR
seqüências cobertas pela NF-µNR seriam pre-
servadas. A região protegida (cinza) inclui uma
seqüência associada à matriz e um sítio de liga-
ção da topoisomerase II (colorido). (De acor-
do com Scheuermann e Chen, 1989.)
demonstraram que a topoisomerase II está localizada no complexo matriz nuclear-

envoltório nuclear. A proximidade entre as MARs e as regiões de ligação da
topoisomerase II sugerem que a ancoragem do DNA à matriz deve ser necessária
para impedir a rotação livre do DNA, permitindo assim que as topoisomerases liga-
das à matriz torçam a cromatina (Bode et al., 1992).
Se a ligação à matriz é essencial para a transcrição do RNA, é possível que prote-
ínas reguladoras negativas como os silenciadores possam inibir essa associação.
Essa possibilidade foi sugerida por Scheuermann e Chen (1989), que isolaram uma
proteína que inibe a transcrição do gene de cadeia pesada da imunoglobulina. Essa
proteína, NF-µNR, é expressa em células não B e nos estágios precoces do desenvol-
vimento da célula B, mas está ausente em células B maduras que transcrevem grandes
quantidades de genes da imunoglobulina. Essa proteína se liga em quatro locais
flanqueando o intensificador da cadeia pesada: duas seqüências de consenso MAR e
duas seqüências de consenso topoisomerase II ( Figura 11.24). É possível que, com a
presença de NF-µNR no núcleo, essa se ligue às regiões flanqueando o intensificador
e impeça a associação do gene de cadeia pesada da imunoglobulina com a matriz
nuclear e a topoisomerase. Quando a proteína não está presente, essas associações
não ocorrem resultando na transcrição do gene. A demonstração de que a proteína da
matriz nuclear NMP-1 é a mesma que o fator de transcrição YY1 é especialmente
interessante, pois YY1 foi implicado no silenciamento do gene de ε-globina uma vez
que os genes da γ-globina são expressos (Raich et al., 1995; Wandersee et al., 1996).
Isoladores e domínios
O genoma eucarioto não é meramente parcelado em determinados genes. Na verda-
de, ele parece estar dividido em regiões de desenvolvimento relativamente indepen-
dentes freqüentemente denominadas domínios. Evidência para os domínios veio de
estudos onde blocos de DNA foram colocados próximos a genes repórteres que podi-
am ser normalmente ativados por um intensificador. Certas seqüências impediram o
intensificador de ativar o gene repórter, enquanto que outras seqüências não o fizeram
(Geyer e Corces, 1992). Foi proposto que essas seqüências isoladoras ligam proteínas
que impedem a interação de intensificadores e promotores no seu outro lado. Desse
modo, elas poderiam estabelecer fronteiras: a ativação poderia ocorrer em um de seus
lados, mas não cruzar para o outro lado. Algumas dessas seqüências fronteiriças
foram isoladas de DNA de Drosophila, como também algumas das proteínas ligantes.
Kellum e Schedl (1991) mostraram que o gene hsp70 (para a proteína do choque
térmico em Drosophila) estava confinado por duas seqüências, scs e scs’, que impedi-
am os efeitos da cromatina adjacente de influenciar sua transcrição. Zhao e colegas
(1995) identificaram uma proteína de 32-kDa que se liga ao elemento de fronteira scs’ e
está localizada entre as bandas de numerosos genes na Drosophila (veja Prancha 31;
Zhao et al., 1995). Isso pode ser visto quando os genes formam tufos e a coloração
dessas proteínas as mostram nas bordas dos tufos. O sítio scs’ no complexo Bithorax
parece estar localizado após o último gene (AbdB), de modo que a unidade inteira
possa ser regulada como um único loco genético.
Resumo
A transcrição gênica diferencial é uma via majoritária na regulação do desenvolvi-
mento. As regiões cis-reguladoras no DNA e as proteínas trans-reguladoras que
ativam e reprimem a transcrição estão sendo identificadas e seus mecanismos de
ação delineados. Parece que certos fatores de transcrição rompem ou previnem a
formação de nucleossomos nos intensificadores e regiões promotoras, assim permi-
tindo a ligação da RNA polimerase II ao promotor e a transcrição do gene. Certos
fatores de transcrição estimulam o processo interagindo com o complexo transcrici-
onal e acelerando sua formação. A desmetilação e o desenrolamento de regiões
genéticas na matriz nuclear provavelmente também estão envolvidas na regulação
da expressão gênica. Como disse Albert Claude, nós apenas começamos a apreciar
nossa riqueza adquirida.
LITERATURA CITADA
Adachi, Y., Käs, E. and Laemmli, U. 1989. Berrios, M., Osheroff, N. and Fisher, P. A. 1985. Brockendorrf, N. and seven others. 1992. The
Preferential, cooperative binding of DNA In situ localization of DNA topoiso-merase II, a product of the mouse Xist gene is a 15-kb inactive
topoisomerase II to scaffold-associated re-gions. major polypeptide component of the Droso- X-specific transcript containing no conserved ORF
EMBO J. 8: 3997-4006. phila nuclear matrix fraction. Proc. Natl. Acad. and located in the nu-cleus. Cell 71: 515-526.
Sci. USA 82: 4142-4146.
Adams, C. C. and Workman, J. L. 1993. Nu-cleosome Browder, L. W. 1984. Developmental Biology,
displacement in transcription. Cell 72: 305-308. Berry, M., Grosveld, F. and Dillon, N. 1992. A 2nd Ed. Saunders, Philadelphia.
single point mutation is the cause of the Greek
Ariel, M, Robinson, E., McCarrey, J. R. and Brown, C. J. and Willard, H. F. 1990. Local-
form of hereditary persistence of fetal
Cedar, H. 1995. Gamete-specific methyla-tion ization of a gene that escapes inactivation to
hemoglobin. Nature 358: 499-502.
correlates with imprinting of the murine Xist the X chromosome proximal short arm:
gene. Nat. Genet. 9: 312-315. Bestor, T. H. and Ingram, V. M. 1983. Two DNA Implications for X inactivation. Am. J. Hum.
methyltransferases from murine ery-throleuke- Genet. 46: 273-279.
Ashworth, A., Rastan, S., Lovell-Badge, R. and
mia cells: Purification, sequence specificity, and
Kay, G. F. 1991. X inactivation may ex-plain Brown, C. J. and Willard, H. F. 1994. The human
mode of interaction with DNA. Proc. Natl. Acad.
the difference in viability of XO hu-mans and X-inactivation centre is not re-quired for
Sci. USA 82: 2674-2678.
mice. Nature 351: 406-408. maintenance of X-chromosome inactivation.
Blom van Assendelft, G., Hanscombe, O., Nature 368: 154-156.
Bacon, E. R., Dalyot, N., Filon, D., Schreiber,
Grosveld, F. and Greaves, D. R. 1989. The b-
L., Rachmilewitz, E. A. and Op-penheim, A. Brown, C. J. and six others. 1991a. A gene from
globin dominant control region activates
1995. Hemoglobin switching in humans is the region of the human X inactiva-tion center
homologous and heterologous promoters in a
accompanied by changes in the ratio of the is expressed exclusively from the inactive X
tissue-specific manner. Cell 56: 969-977.
transcription factors GATA-1 and SP1. Molec. chromosome. Nature 349: 38-44.
Med. 1: 295-305. Bode, J., Kohwi, Y., Dickinson, L., Joh, T., Klehr,
Brown, C. J. and nine others. 1991b. Local-
D., Mielke, C. and Kohwi-Shige-matsu, T. 1992.
Barlow, D. P., Stoger, R., Herrmann, B. G., Saito, K. ization of the X chromosome inactivation
Biological significance of unwinding capability
and Schweifer, N. 1991. The mouse insulin-like center on the human X chromosome. Na-ture
of nuclear matrix-as-sociated DNA. Science
growth factor type-2 re-ceptor is imprinted and 349: 82-84.
255:195-197.
closely linked to the Tme locus. Nature 349: 84-87.
Brown, C. J., Hendrich, B. D., Rupert, J. L.,
Borsani, G. and thirteen others. 1991. Char-
Barr, M. L. and Bertram, E. G. 1949. A mor- Lafreniere, R. G., Xing, Y., Lawrence, J. and
acterization of a murine gene expressed from
phological distinction between neurones of the Willard, H. F. 1992. The human XIST gene:
the inactive X chromosome. Nature 351:
male and female, and the behavior of the Analysis of a 17-kb inactive X-specific RNA
325-329.
nucleolar satellite during accelerated nucleopro- that contains conserved repeats and is highly
tein synthesis. Nature 163: 676. Boyse, J. and Bird, A. 1991. DNA methyla-tion localized within the nucleus. Cell 71: 527-542.
inhibits transcription indirectly via a methyl-
Bartolomei, M. S. and Tilghman, S. M. 1992. Brownell, J. E., Zhou, J., Ranalli, T.,
CpG binding protein. Cell 64: 1123-1134.
Parental imprinting of mouse chro-mosome 7. Kobayashi, R., Edmonson, D. G., Roth, S. Y.
Semin. Dev. Biol. 3: 107-117. Boyse, J. and Bird, A. 1992. Repression of genes and Allis, C. D. 1996. Tetrahymena histone
by DNA methylation depends upon CpG density acetytransferase A: A homolog to yeast GCN5
Behringer, R., Hammer, R., Brinster, R.,
and promoter strength: Evi-dence for involve- linking histone acetylation to gene activation.
Palmiter, R. and Townes, T. 1987. Two 3' se-
ment of a methyl-CpG binding protein. EMBO Cell 84: 843-851.
quences direct adult erythroid-specific ex-
J. 11: 327-333.
pression of human b-globin genes in trans-genie Brunk, B. P., Goldhammer, D. J. and Emer-son,
mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7056-7060. Braunstein, M., Rose, A. B., Holmes, S. G., C. P. Jr. 1996. Regulated demethylation of the
Allis, C. D. and Broach, J. R. 1993. Tran- myoD distal enhancer during skeletal myogenesis.
Berezney, R. and Coffey, D. S. 1977. Nuclear
scriptional silencing in yeast is associated with Dev. Biol. 177: 490-503.
matrix: Isolation and characterization of a
reduced nucleosome acetylation. Genes Dev.
framework structure from rat liver nuclei. J. Cell Bungert, J., Davé, U., Lim, K.-C., Lieuw, K. H.,
7: 592-604.
Biol. 73: 616-637. Shavit, J. A., Liu, Q. and Engel, J. D. 1995.
Synergistic regulation of human b-globin gene Crick, F. H. C. 1966. Of Molecules and Men. Garcia-Ramirez, M., Rocchini, C. and Ausio, J.
switching by locus control re-gion elements HS3 University of Washington Press, Seattle. 1995. The modulation of chro-matin folding by
and HS4. Genes Dev. 9: 3083-3096. histone acetylation. J. Biol. Chem. 270: 17923-
Darnell, J., Lodish, H. and Baltimore, D. 1986.
17928.
Burch, J. B. and Weintraub, H. 1983. Tem-poral Molecular Cell Biology. Scientific American
order of chromatin structral changes associated Books, New York. Gartler, S. M., Liskay, R. M. and Grant, N. 1973.
with activation of the major chick vitellogenin Two functional X chromosomes in human fetal
DeChiara, T. M., Robertson, E. J. and Efs-
gene. Cell 33: 64-76. oocytes. Exp. Cell Res. 82: 464-66.
tratiadis, A. 1991. Parental imprinting of the
Burlingame, R. W., Love, W. E., Wang, B.-C., mouse insulin-like growth factor II gene. Cell Gartler, S. M., Rivest, M. and Cole, R. E. 1980.
Hamlin, R., Xuong, N.-H. and Moudri-anakis, 64: 849-859. Cytological evidence for an inactive X
E. N. 1985. Crystallographic struc-ture of the chromosome in murine oogonia. Cytogenet.
Dickinson, L. A., Job, T., Kohwi, Y. and Kohwi-
octameric histone core of the nucleosome at a Cell Genet. 28: 203-207.
Shigematsu, T. 1992. A tissue-spe-cific MAR/
resolution of 3.3 Å. Science 228: 246-253.
SAR DNA-binding protein with unusual binding Gasser, S. M. and Laemmli, U. K. 1986. Co-
Busslinger, M., Hurst, J. and Flavell, R. A. 1983. site recognition. Cell 70: 631-645. habitation of scaffold binding regions with
DNA methylation and the regulation of globin upstream/enhancer elements of three de-
Driscoll, D. J. and Migeon, B. R. 1990. Sex
gene expression. Cell 34:197-206. velopmentally regulated genes in D. melano-
difference in methylation of single-copy genes
gaster. Cell 46: 521-530.
Capco, D. G., Wan, K. M. and Penman, S. 1982 in human meiotic germ cells: Impli-cations for
The nuclear matrix: Three-dimensional architecture X chromosome inactivation, parental imprin- Geyer, P. K. and Corces, V. G. 1992. DNA
and protein composition. Cell 29: 847-858. ting, and the origin of PGC mutations. Somat. position-specific repression of transcription by
Cell Mol. Genet. 16: 267-268. a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev. 6:
Cattanach, B. M., Pollard, C. E. and Perez, J. N.
1865-1873.
1969. Controlling elements in the mouse X Elgin, S. 1981. DNase I-hypersensitive sites of
chromosome. 1. Interaction with the X-linked chromatin. Cell 27: 413-415. Gong, Q. and Dean, A. 1993. Enhancer-de-
genes. Genet. Res. 14: 223-235. pendent transcription of the e-globin pro-moter
Elgin, S. C. R. 1988. The formation and
requires promoter-bound GATA-1 and enhancer
Centerwall, W. R. and Benirschke, K. 1973. Male function of DNase-I hypersensitivity sites in
bound AP-/NF-E2. Mol. Cell Biol. 13: 911-917.
tortoiseshell and calico (T-C) cats. J. Hered. 64: the process of gene activation. J. Biol. Chem.
272-278. 263: 9259-9262. Grosveld, F., Blom van Assendelft, G., Greaves,
D. R. and Kollins, G. 1987. Posi-tion-dependent
Chahal, S. S., Matthews, H. R. and Brad-bury, Ellis, J., Tan-Un, K. C., Harper, A., Michael-
high-level expression of the human b-globin gene
E. M. 1980. Acetylation of histone H4 and its ovich, D., Yannoutsos, N., Philipsen, S. and
in transgenic mice. Cell 51: 975-985.
role in chromatin structure and function. Nature Grosveld, F. 1996. A dominant chromatin-
287: 76-79. opening activity in 5' hypersensitive site 3 of Groudine, M. and Conklin, K. F. 1985.
the human b-globin locus control region. EMBO Chromatin structure and de novo methyla-
Chaillet, J. R., Vogt, T. F., Beier, D. R. and Leder,
J. 15: 562-568. tion of sperm DNA: Implications for acti-
P. 1991. Parental-specific methyla-tion of an
vation of the paternal genome. Science 228:
imprinted transgene is estab-lished during Enver, T., Raich, N., Ebens, A. J., Pa-payanno-
1061-1068.
gametogenesis and progres-sively changes during poulou, T., Costantini, F. and Stamatoyannopou-
embryogenesis. Cell 66: 77-83. los, G. 1990. Develop-mental regulation of human Groudine, M. and Weintraub, H. 1981. Ac-
fetal-to-adult globin gene switching in transgenic tivation of globin genes during chick de-
Ciejek, E. M., Tsai, M.-J. and O’Malley,B. W.
mice. Nature 344: 309-312. velopment. Cell 24: 393-401.
1983. Actively transcribed genes are associated
with the nuclear matrix. Nature 306: 607-609. Felsenfeld, G. 1992. Chromatin as an essen-tial Groudine, M., Kohwi-Shigematsu, T, Geli-nas,
part of the transcriptional mechanism. Nature R., Stamatoyannopoulos, G. and Papayannopou-
Clark, D. J. and Felsenfeld, G. 1992. A nu-
355: 219-224. lo, T. 1983. Human fetal to adult hemoglobin
cleosome core is transferred out of the path of a
switching: Changes in chromatin structure of
transcribing polymerase. Cell 71: 11-22. Ferguson-Smith, A. C., Sasaki, H., Cat-tanach,
the b-globin gene locus. Proc. Natl. Acad. Sci.
B. M. and Surani, M. A. 1993. Parental origin-
Cockerill, P. N. and Garrard, W. T. 1986. USA 80: 7551-7555.
specific epigenetic modifi-cation of the mouse
Chromosome loop anchorage of the Κ immuno-
H19 gene. Nature 362: 751-755. Gruenbaum, Y., Ceder, H. and Razin, A. 1982.
globulin gene occurs next to the en-hancer in a
Substrate and sequence specificity of a eukaryotic
region containing topoiso-merase II sites. Cell Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M. and
DNA methylase. Nature 295: 620-622.
44: 273-282. Groudine, M. 1993. An “in-out” strategy using
gene targeting and FLP recombinase for the Guo, B and eight others. 1995. The nuclear matrix
Compere, S. J. and Palmiter, R. D. 1981. DNA
functional dissection of complex DNA protein NMP-1 is the transcritpion factor YY1.
methylation controls the inducibility of the
regulatory elements: Analysis of the b-globin Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10526-10530.
mouse metallothionein-I gene in lymphoid cells.
locus control region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Cell 25: 233-240. Hanscombe, O., Whyall, D., Fraser, P., Yan-
90: 8469-8473.
noutsos, N., Greaves, D., Dillon, N. and Grosveld,
Conklin, K.F. and Groudine, M. 1984. Chro-
Forrester, W. C., Genderen, C. van, Jenuwein, T. F. 1991. Importance of globin gene order for
matin structure and gene expression. In A. Razin,
and Grosschedl, R. 1994. De-pendence of correct developmental ex-pression. Genes Dev.
H. Cedar and A. D. Riggs (eds.), DNA Methylation.
enhancer-mediated transcrip-tion of the im- 5: 1387-1394.
Springer-Verlag, New York, pp. 293-351.
munoglobulin m gene on nu-clear matrix
Hebbes, T. R., Clayton, A. L., Thorne, A. W.
Cooper, D. W., Vandeberg, J. L., Sharmen, G. B. attachment regions. Science 265: 1221-1225.
and Crane-Robertson, C. 1994. Core his-tone
and Poole, W. E. 1971. Phosphoglyc-erate
Frank, D., Lichtenstein, M., Paroush, Z., acetylation co-maps with generalized DNase I
kinase polymorphism in kangaroos provides
Bergmann, Y, Shani, M., Razin, A. and Ceder. H. sensitivity in the chick b-globin chromsomal
further evidence for paternal X inactivation.
1990. Demethylation of genes in animal cells. domain. EMBO ]. 7: 1395-1402.
Nat. New Biol. 230: 155-157.
Philos. Trans. R. Soc. Land. [B] 326: 241-251.
Herman, R., Weymouth, L. and Penman, S. Keshet, I., Lieman-Hurwitz, J. and Cedar, H. Mariman, E. C. M., van Eekelen, C. A. G., Reinders,
1978. Heterogeneous nuclear RNA-protein fibers 1986. DNA methylation affects the for-mation R. J., Berns, A. J. M. and van Ven-rooji, W. J.
in chromatin depleted nuclei. J. Cell Biol. 78: of active chromatin. Cell 44: 535-543. 1982. Adenoviral heterogenous nuclear RNA is
663-674. associated with the host nuclear matrix during
Knoll, J. H. M., Nicholls, R. D., Magenis, R. E.,
splicing. J. Mol. Biol. 154: 103-119.
Holliday, R. 1987. The inheritance of epige- Graham, J. M., Jr., Lalande, M. and Latt, S. A.
netic defects. Science 238:163-170. Hotchkiss, 1989. Angelman and Prader-Willi syn-dromes Martin, D. I. K., Tsai, S.-F. and Orkin, S. H. 1989.
R. D. 1948. The quantitative sep-aration of share a common chromosome 15 deletion but Increased g-globin expression in a nondeletion
purines, pyrimidines, and nucle-osides by paper differ in the parental origin of the deletion. Am. HPFH mediated by an ery-throid-specific DNA-
chromatography. J. Biol. Chem. 175: 315-332. ]. Med. Genet. 32: 285-290. binding factor. Nature 338: 435-437.
Hutchinson, N. and Weintraub, H. 1985. Kornberg, R. D. and Thomas, J.D. 1974. Martin, D. I. K., Fiering, S. and Groudine, M.
Localization of DNase I-sensitive se-quences to Chromatin structure: Oligomers of his-tones. 1996. Regulation of b-globin gene ex-pression:
specific regions of interphase nuclei. Cell 43: Science 184: 865-868. straightening out the locus. Curr. Opin. Genet.
471-482. Dev. 6: 488-495.
Kratzer, P. G. and Chapman, V. M. 1981. X-
Iguchi-Ariga, S. M. M. and Schaffner, W. 1989. chromosome reactivation in oocytes of Mus caroli. Mattei, M. G., Mattei, J. F., Vidal, I. and Gi-raud,
CpG methylation of the cAMP-re-sponsive Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3093-3097. F. 1981. Structural anomalies of the X chromo-
enhancer/promoter sequence TGACGTCA some and activation center. Hum. Genet. 56:
Kuroda, M. I., Kernan, M. J., Kreber, R.,
abolishes specific factor bind-ing as well as 401-408.
Ganetzky, B. and Baker, B. S. 1991. The
transcriptional activation. Genes Dev. 3: 612-619.
maleless protein associates with the X chro- Mavilio, F. and nine others. 1983. Molecu-lar
Imbalzano, A. N., Kwon, H., Green, M. R. and mosome to regulate dosage compensation in mechanisms for human hemoglobin switching:
Kingston, R. E. 1994. Facilitated bind-ing of Drosophila. Cell 66: 935-947. Selective undermethylation and expression of
TATA-binding protein to nucleo-some DNA. globin genes in embryonic, fetal, and adult
Kwon, H., Imbalzano, A. N., Khavari, P. A.,
Nature 370: 481-485. erythroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:
Kingston, R. E.,and Green, M.R. 1994. Nu-
6907-6911.
Jackson, D. A. and Cook, P. R. 1985. Tran- cleosome disruption and enhancement of
scription occurs at a nucleoskeleton. EMBO J. activator binding by a human SW1/SNF complex. McArthur, M. and Thomas, J. O. 1996. A
4: 919-925. Nature 370: 477-481. preference of histone H1 for methylated DNA.
EMBO J. 15: 1705-1714.
Jenuwein, T., Forrester, W. C., Fernandez- Lee, D. Y, Hayes, J. J., Pruss, D. and Wolffe, A.
Herrero, L. A., Laible, G., Dull, M and Grosschedl, P. 1993. A positive role for histone acety-lation McGhee, J. D. and Ginder, G. D. 1979. Spe-cific
R. 1997. Extension of chro-matin accessibility on transcription factor access to nu-cleosomal DNA methylation sites in the vicinity of the
by nuclear matrix at-tachment regions. Nature DNA. Cell 72: 73-84. chick b-globin genes. Nature 280: 419-420.
385: 269-272. Jeppesen, P. and Turner, B. M.
Lee, J. T., Strauss, W. M., Dausman, J. A. and Migeon, B. R. 1971. Studies of skin fibrob-lasts
1993. The in-active X chromosome in female
Jaenisch, R. 1996. A 450 kb transgene displays from ten families with HGPRT defi-ciency, with
mammals is distinguished by a lack of histone
properties of the mammalian X-inactivation reference to X-chromosomal inactivation. Am.
H4 acetylation, a cytogenetic marker for gene
center. Cell 86: 83-94. J. Hum. Genet. 23: 199-209.
expression. Cell 74: 281-289.
Lewin, B. 1994. Chromatin and gene ex- Migeon, B. R. and Jelalian, K. 1977. Evi-dence
Jost, J. P. 1993. Nuclear extracts of chicken
pression: Constant questions, but changing for two active X chromosomes in germ cells
embryos promote an active demethylation of
answers. Cell 79: 397-406. of female before meiotic entry. Nature 269:
DNA by excision repair of 5-methyldeoxycyti-
242-243.
dine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4684-4688. Li, E., Beard, C. and Jaenisch, R. 1993. The role
of DNA methylation in genomic im-printing. Migeon, B. R., Wolf, S. F., Axelman, J., Kaslow,
Kafri, T. and seven others. 1992. Develop-men-
Nature 36: 362-365. D.C. and Schmidt, M. 1985. Incom-plete X
tal pattern of gene-specific DNA methylation
chromosome dosage compensation in chorionic
in the mouse embryo and germ line. Genes Dev. Liskay, R. M. and Evans, R. 1980. Inactive X
villi of human placenta. Proc. Natl. Acad. Sci.
6: 705-714. chromosome DNA does not function in DNA-
USA 82: 3390-3394.
mediated cell transformation for the hypoxan-
Karlsson, S. and Nieuhaus, A. W. 1985. De-
thine phosphoribosyltransferase gene. Proc. Migeon, B. R., Schmidt, M., Axelman, J. and
velopmental regulation of human globin genes.
Natl. Acad. Sci. USA 77: 4895-4898. Cullen, C. R. 1986. Complete reactiva-tion of
Annu. Rev. Biochem. 54: 1071-1108.
X chromosomes from human chori-onic villi
Lucchesi, J. C. and Manning, J. E. 1987. Gene
Kay, G. P., Penny, G. D., Patel, D., Ash-worth, with a switch to early DNA repli-cation. Proc.
dosage and compensation in Drosophila mela-
A., Brockdorrf, N. and Rastan, S. 1993. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2182-2186.
nogaster. Adv. Genet. 24: 371-29.
Expression of Xist during mouse de-velopment
Migeon, B. R., Holland, M. M., Driscoll, D. J. and
suggests a role in the initiation of X chromosome Ludérus, L. A., M. E. E., de Graaf, A., Mat-tia, E.,
Robinson, J. C. 1991. Programmed demethylation
inactivation. Cell 72: 171-182. den Blaauwen, J. L., Grande, M. A., de Jong, L. and
in CpG islands during human fetal development.
van Driel, R. 1992. Binding of matrix attachment
Keith, D. H., Singersam, J. and Riggs,A. D. 1986. Somatic Cell Molec. Genet. 17:159-168.
regions to lamin Bl. Cell 70: 949-959.
Active X-chromosome DNA is un-methylated
Miller, T. E., Huang, C.-Y. and Pogo, A. O. 1978.
at eight CCGG sites clustered in a guanine-plus- Lyon, M. F. 1961. Gene action in the X chro-
Rat liver nuclear skeleton and ribonu-cleoprotein
cytosine-rich island at the 5' end of the gene for mosome of the mouse (Mus musculus L.)
complexes containing hnRNA. J. Cell Biol.
phosphoglycerate kinase. Mo/. Cell Biol. 6: Nature: 190: 372-373.
76:675-691.
4122-4125.
Mandel, J. L. and Chambon, P. 1979. DNA
Mizzen, C. A. and eleven others. 1996. The
Kellum, R. and Schedl, P. 1991. A position-effect methylation differences: Organ-specific variations
TAF II 250 subunit of TFIID has histone
assay for boundaries of higher order chromatin in methylation pattern within and around
acetyltransferase activity. Cell 87: 1261-
domains. Cell 64: 941-950. ovalbumin and other chick genes. Nucleic Acids
1267.
Res. 7: 2081-2103.
Mohandas, T., Sparkes, R. S., Hellkuhl, B., gene expression in the b-globin disorders. N. Engl. Ryoji, M. and Worcel, A. 1984. Chromatin
Brzeschik, K. H. and Shapiro, L. J. 1980. Ex- J. Med. 328: 81-86. assembly in Xenopus oocytes: In vitro stud-ies.
pression of an X-linked gene from an inac-tive Cell 37: 21-32.
Peterson, C. L. and Tamkun, J. W. 1995. The
human X chromosome in mouse-human hybrid
SW1/SNF complex: A chromatin remodel-ing Samollow, P. B., Ford, A. L. and VandeBerg, J. L.
cells: Further evidence for the non-inactivation
machine? Trends Biochem. Sci. 20: 143-146. 1987. X-linked gene expression in the Virginia
of the steroid sulfatase locus in man. Proc. Natl.
opossum: Differences between the paternally
Acad. Sci. USA 77: 6759-6763. Pevny, L. and seven others. 1991. Erythroid
derived Gpd and Pgk-A loci. Ge-netics 115: 185-
differentiation in chimeric mice blocked by a
Mohandas, T., Sparkes, R. S. and Shapiro, L. J. 195.
targeted mutation in the gene for tran-scription
1981. Reactivation of an inactive human X
factor GATA-1. Nature 349: 257-261. Sanford, J. P., Clark, H. J., Chapman, V. M. and
chromosome: Evidence for X in-activation by
Rossant, J. 1987. Differences in DNA methylation
DNA methylation. Science 211: 393-396. Prioleau, M.-N., Huett, J., Sentenac, A. and
during oogenesis and sper-matogenesis and their
Méchali, M. 1994. Competition between
Monk, M., Boubelik, M. and Lehnert, S. 1987. persistence during early embryogenesis in the
chromatin and transcription complex as-sembly
Temporal and regional changes in DNA mouse. Genes Dev. 1:1039-1046.
regulates gene expression during early develop-
methylation in the embryonic, ex-traembryonic,
ment. Cell 77: 439-449. Sapienza, C., Peterson, A. C., Rossant, J. and
and germ cell lineages dur-ing mouse embryo
Balling, R. 1987. Degree of methylation of
development. Develop-ment 99: 371-382. Pruss, D., Bartholomew, B., Persinger, J., Hayes,
transgenes is dependent on gamete of origin.
J., Arents, G., Moudrianakis, E. and Wolffe, A.
Moore, K. L. 1977. The Developing Human. Nature 328: 251-254.
P. 1996. An asymmetric model for the
Saunders, Philadelphia.
nucleosome: A binding site for link-ing histones Scheuermann, R. H. and Chen, U. 1989. A
Nelson, W. G., Pienta, K. J., Barrack, E. R. and inside the DNA gyres. Science 274: 614-617. developmental-specific factor binds to sup-
Coffey, D. S. 1986. The role of the nu-clear pressor sites flanking the immunoglobulin heavy-
Raich, N., Clegg, C. H., Grofti, J., Roméo, P.-H.
matrix in the organization and func-tion of DNA. chain enhancer. Genes Dev. 3: 1255-1266.
and Stamatoyannopoulos, G. 1995. GATA1 and
Annu. Rev. Biophys. Chem. 15: 457-475.
YY1 are developmental repres-sers of the Schlissel, M. S. and Brown, D. D. 1984. The
Nicholls, R. D., Kroll, J. H. M., Butler, M. G., human e-globin gene. EMBO J. 14: 801-809. transcriptional regulation of Xenopus 5S RNA
Karma, S. and Lalande, M. 1989. Ge-netic im- genes in chromatin: The roles of ac-tive stable
Razin, S. V. and Gromova, I. I. 1995. The
printing suggested by maternal heterodisomy in transcription complex and his-tone H1. Cell 37:
channels model of nuclear matrix structure
non-deletion Prader-Willi syndrome. Nature 903-913.
BioEssays 17: 443-450.
342: 281-285.
Sharman, G. B. 1971. Late DNA replication in
Reik, W., Collick, A., Norris, M. L., Barton, S.
Norris, D. P. Patel, D., Kay, G. F., Penny, G. D., the paternally derived X chromosome of female
C. and Surani, M. A. 1987. Genomic im-printing
Brockdorff, N., Sheardown, S. A. and Rastan, S. kangaroos. Nature 230: 231-232.
determines methylation of pater-nal alleles in
1994. Evidence that random and imprinted Xist
transgenic mice. Nature 328: 248-250. Stalder, J., Larsen, A., Engel, J. D., Dolan, M.,
expression is controlled by preemptive
Groudine, M. and Weintraub, H. 1980. Tissue-
methylation. Cell 77: 41-51. Rigaud, G., Roux, J., Pictet, R. and Grange, T.
specific DNA cleavages in the glo-bin chromatin
1991. In vivo footprinting of rat TAT gene:
Orkin S. H. 1992. GATA-binding transcrip-tion domain introduced by DNase I. Cell 20: 451-460.
Dynamic interplay between gluco-corticoid re-
factor in hematopoietic cells. Blood 80: 575-581.
ceptor and a liver-specific fac-tor. Cell 67: Stamatoyannopoulos, J. A., Goodwin, A., Joyce,
Ottolenghi, S. 1992. Developmental regula-tion 977-986. T. and Lowrey, C. M. 1995. NF-E2 and GATA
of human globin genes: A model for cell diffe- binding motifs are required for the formation
Robinson, S. I., Nelkin, B. D. and Vogel-stein, B.
rentiation in the hematopoietic system. In V. E. of DNase-I hypersensitive site-4 of the human
1982. The ovalbumin gene is asso-ciated with
Russo et al., (eds.), Develop-ment: The Molecu- P-globin locus control region. EMBO J. 14:
the nuclear matrix of chicken oviduct cells. Cell
lar Genetic Approach. Springer-Verlag, New 106-116.
28: 99-106.
York, pp. 519-536.
Stief, A., Winter, D. M., Strätling, W. H. and
Rodgers, G. P., Dover, G. J., Vyesaka, N.,
Oudet, P., Gross-Bellard, M. and Chambon, P. Sippel. A. E. 1989. A nuclear DNA attach-ment
Noguchi, C. T., Schecter, A. N. and Nieuhuis, A.
1975. Electron microscope and biochemi-cal element mediates elevated and posi-tion-
W. 1993. Augmentation by erythropoietin of
evidence that chromatin structure is a repeating dependent gene activity. Nature 341: 343-345.
the fetal hemoglobin re-sponse to hydroxyurea
unit. Cell 4: 281-300.
in sickle cell dis-ease. N. Engl. J. Med. 328: 73- Stöger, R., Kublicka, P, Liu, C.-G., Kafri, T, Razin,
Paroush, Z., Keshet, I., Yisraeli, J. and Cedar, 80. A., Cedar, H. and Barlow, D. P. 1993. Maternal-
H. 1990. Dynamics of demethylation and specific methylation of the im-printed mouse
Rogers, J. and Wall, R. 1981. Immunoglobu-lin
activation of the a-actin gene in my-oblasts. Igf2r locus identifies the ex-pressed locus as
heavy-chain genes: Demethylation ac-compa-
Cell 63: 1229-1337. carrying the imprinting signal. Cell 73: 61-71.
nies class switching. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Pazin, M. J., Kamakaka, R. T.,and Kadon-aga, 78: 7497-7501. Swain, J. L., Stewart, T. A. and Leder, P. 1987.
J. T. 1994. ATP-dependent nucleosome Parental legacy determines methyla-tion and
Russell, L. B. 1963. Mammalian X chromo-some
reconfiguration and transcriptional activa-tion expression of an autosomal trans-gene: A mole-
action: Inactivation limited in spread and region
from preassembled chromatin tem-plates. cular mechanism for parental imprinting. Cell
of origin. Science 140: 976-978.
Science 266: 2007-2011. 50: 719-727.
Ryan, T. M., Behringer, R. B., Martin, N. C.,
Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Tagaki, N. 1974. Differentiation of X chro-
Townes, T. M., Palmiter, R. D. and Brinster, R.
Rastan, S. and Brockendorff, N. 1996. Re- mosomes in early female mouse embryos. Exp.
L. 1989. A single erythroid-specific DNase I
quirement for Xist in X chromosome inacti- Cell Res. 86:127-135.
super-hypersensitivity site acti-vates high levels
vation. Nature 379:131-137.
of human b-globin gene expression in transgenic Tagaki, N. and Abe, K. 1990. Detrimental effects
Perrine, S. P. and eight others. 1993. A short- mice. Genes Dev. 3: 314-323. of two active X chromosomes on early mouse
term trial of butyrate to stimulate fetal globin development. Development 109: 189-201.
Talbot, D. and Grosveld, F. 1991. The 5' HS2 van der Ploeg, L. H. T. and Flavell, R. D. 1980. Wilson, C. J., Chao, D. M., Imbalzano, A. N.,
of the globin locus control region en-hances DNA methylation in the human g-d-b globin Schnitzler, G. R., Kingston, R. E. and Wilson, E. B.
transcription through the interac-tion of a locus in erythroid and non-ery-throid cells. Cell 1895. An Atlas of the Fertiliza-tion and
multimeric complex binding at two functionally 19: 947-958. Karyogenesis of the Ovum. Macmil-lan, New York.
distinct NF-E2 binding sites. EMBO J. 10:
van Eekelen, C. A. G. and van Venrooij, W. J. Wolf, S. F., Jolly, D. J., Lunnen, K., Fried-mann,
1391-1398.
1981. HnRNA and its attachment to a nu-clear T. and Migeon, B. R. 1982. Methyla-tion of the
Tazi, J. and Bird, A. P. 1990. Alternative chro- protein matrix. J. Cell Biol. 88: 554-563. hypoxanthine phosphoribosyl-transferase locus
matin structure at CpG islands. Cell 60: 909-920. on the human X chromosome: Implications for
Villeponteau, B., Lundell, M. and Martin-son,
X chromo-some inactivation. Proc. Natl. Acad.
Thoma, F., Koller, T. and Klug, A. 1979. In- H. 1984. Torsional stress promotes the DNase
Sci. USA 81: 2806-2810.
volvement of histone H1 in the organiza-tion hypersensitivity of active genes. Cell 39:
of the nucleosome and of the salt-de-pendent 469-478. Wolf, S. F., Dintgis, S., Toniolo, D., Persico, G.,
superstructures of chromatin. J. Cell Biol. 83: Lunnen, K. D., Axelman, J. and Migeon, B. R.
Wandersee, N. J., Ferris, R. C., and Ginder, G. D.
403-427. 1984. Complete concordance between glucose-
1996. Intronic and flanking sequences are
6-phosphate dehydrogenase activ-ity and
Thorburn, A. and Knowland, J. 1993. At- required to silence enhancement of an embryonic
hypomethylation of 3' CpG clus-ters: Implication
tachment of vitellogenin genes to the nu- beta-type globin. Mol. Cell Biol. 16: 236-246.
for X chromosome dosage compensation. Nucleic
cleoskeleton accompanies their activation.
Wang, Z.-Q., Fung, M. R., Barlow, D. P. and Acids Res. 12: 9333-9348.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 191: 308-313.
Wagner, E. F. 1994. Regulation of embry-onic
Wolfe, S. L. 1993. Molecular and Cellular Bi-
Trudel, M. and Constantini, F. 1987. A 3' en- growth and lysosomal targeting by the imprinted
ology. Wadsworth, Belmont, CA.
hancer contributes to the stage-specific ex- Igf2/Mpr gene. Nature 372: 464-467.
pression of the human b-globin gene. Genes Dev. Yisraeli, J., Adelstein, R. S., Melloui, D., Nudel,
Weintraub, H. 1984. Histone H1-dependent
1: 954-961. U., Yaffe, D. and Ceder, H. 1986. Muscle-specific
chromatin superstructures and the sup-pression
activation of a methylated chimeric actin gene.
Tsukiyama, T. and Wu, C. 1995. Purifica-tion of gene activity. Cell 38:17-27.
Cell 46: 409-416.
and properties of an ATP-dependent nucleosome
Weintraub, H. 1985. Assembly and propa-gation
remodeling factor. Cell 83: 1011-1020. Young, R. A. 1996. RNA polymerase II
of repressed and derepressed chro-mosomal
holoenzyme contains SWI/SNF regulators
Tsukiyama, T., Becker, P. B. and Wu, C. 1994. states. Cell 42: 705-711.
involved in chromatinremodeling. Cell 84:
ATP-dependent nucleosome disrup-tion at a heat-
Weintraub, H. and Groudine, M. 1976. Chromo- 235-244.
shock promoter mediated by binding of GAGA
somal subunits in active genes have an altered
transcripion factor. Na-ture 367: 525-531. Zaret, K. S. and Yamamoto, K. R. 1984. Re-
configuration. Science 193: 848-856.
versible and persistent changes in chro-matin
Tuan, D., Abeliovich, A., Lee-Oldham, M.
West, J. D., Frels, W. I., Chapman, V. M. and structure accompany activation of a glucocor-
and Lee, D. 1987. Identification of regula-
Papaioannou, V. E. 1977. Preferential ex-pression ticoid-dependent enhancer ele-ment. Cell 38:
tory elements in human b-like globin genes.
of the maternally derived X chro-mosome in the 29-38.
In G. Stamatoyannopoulos and A. W. Nienhuis
mouse yolk sac. Cell 12: 873-882.
(eds.), Developmental Control of Globin Zhao, K., Hart, C. M. and Laemmli, U. K. 1995.
Gene Expression. Alan R. Liss, New York, Wijgerde, M., Gribnau, J., Trimborn, T., Nuez, Visualization of chromosomal do-mains with
pp. 211-220. B., Philipsen, S., Grosvelde, F. and Fraser, P. boundary element-associated factor BEAF-32.
1996. The role of EKLF in human b-globin gene Cell 81: 879-889.
Turner, B. M. 1991. Histone acetylation and
competition. Genes Dev. 10: 2894-2902.
control of gene expression. J. Cell Sci. 99: 13-20. Zuccotti, M. and Monk, M. 1995. Methyla-tion
of the mouse Xist gene in sperm and eggs
correlates with imprinted Xist ex-pression and
paternal X-inactivation. Nat. Genet. 9: 316-320.
Controle do desenvolvimento
pelo processamento e tradução
diferencial do RNA
12
Entre a concepção
E a criação...
Entre a potência
E a existência
Entre a essência
A REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA não está restrita à transcrição dife-
rencial do DNA. Mesmo que um determinado transcrito de RNA seja sinte-
tizado, não há garantia que ele irá criar uma proteína funcional na célula. Para
se formar uma proteína ativa, o RNA tem que ser: (1) processado em um RNA mensa-
geiro pela remoção de íntrons, (2) trasladado do núcleo para o citoplasma, e (3) tradu-
E a origem zido pelo aparelho sintetizador de proteínas. Em alguns casos, a proteína sintetizada
Cai a Sombra. não está em sua forma madura e (4) tem que ser modificada, após a tradução, para
T. S. ELIOT (1936)
tornar-se ativa. A regulação pode ocorrer em qualquer um desses passos durante o
desenvolvimento.
Não há descanso para o mensageiro até
a mensagem ser entregue.
JOSEPH CONRAD (1920) Q CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO
PELO PROCESSAMENTO DIFERENCIAL DE RNA
A essência da diferenciação é a produção de diferentes conjuntos de proteínas em

diferentes tipos de células. Nas bactérias, a expressão diferencial de genes pode ser
efetuada a nível da transcrição, tradução e modificação das proteínas. Nos eucariotos,
porém, outro nível possível de diferenciação existe, a saber, o controle ao nível do
processamento e transporte de RNA. Este capítulo irá apresentar duas maneiras pelas
quais o processamento diferencial do RNA pode regular o desenvolvimento. A primei-
ra envolve a “censura” pela qual transcritos nucleares podem ser processados em
mensagens citoplasmáticas. Aqui, diferentes células podem selecionar diferentes trans-
critos nucleares para ser processados e colocados no citoplasma como o RNA mensa-
geiro. O mesmo “pool” de transcritos nucleares pode, com isso, dar origem a diferen-
tes populações de mRNAs citoplasmáticos em diferentes tipos de células. O segundo
modo de processamento diferencial do RNA se refere a emendar precursores de mRNA
em proteínas diferentes usando diferentes combinações de éxons em potencial. Se um
precursor de mRNA deve passar a ter cinco éxons em potencial, uma célula poderia
usar éxons 1, 2, 4 e 5, uma outra célula poderia utilizar éxons 1, 2 e 3, e ainda outra célula
poderia usar uma combinação diferente. Assim, um gene pode criar uma família de
proteínas relacionadas.
461
Controle do desenvolvimento precoce

pela seleção de RNA nuclear
Em fins da década de 70, numerosos investigadores acharam que o mRNA não era o
transcrito primário dos genes. Ao contrário, os genes transcreviam um RNA nuclear
(nRNA), às vezes chamado RNA nuclear heterogêneo (hnRNA) devido ao seu amplo
espectro de tamanhos. Esse nRNA era freqüentemente várias vezes mais comprido
que a mensagem, e parecia decair mais rapidamente. Hoje sabemos que o RNA nuclear
contém íntrons que são excisados durante a passagem do núcleo para o citoplasma.
Ainda, estudos em ouriços-do-mar sugeriram que transcritos inteiros são degradados
em algumas células e processados para mRNA em outras. Em outras palavras, esses
estudos sugeriram que diferentes tipos celulares podem estar transcrevendo o mesmo
tipo de RNA nuclear, mas que diferentes subconjuntos dessa população estão sendo
processados para mRNA em diferentes tipos de células. [RNA1.html]
Kleene e Humphreys (1977, 1985) mostraram que o RNA nuclear de larvas pluteus
intactas e de blástulas eram (dentro do erro experimental) idênticos. Ambos se ligavam
aos mesmos 30% do genoma. Quando a complexidade foi analisada, o nRNA de célu-
las da blástula ligava-se a 15 porcento desse DNA (i.e., a 30% do DNA de cópia única
do genoma). Semelhantemente, o nRNA do estágio plúteo, mesmo quando presente
em grande excesso, também se ligava aos 30 porcentos do DNA de cópia única. Serão
esses dois conjuntos de seqüências de DNA os mesmos, ou serão diferentes? Essa
questão foi examinada misturando-se RNAs nucleares de blástula e plúteo e adicio-
nando-os ao DNA de cópia única desnaturado. Se as seqüências fossem completa-
mente diferentes, poder-se ia esperar 30 porcento do DNA estar combinado (i. e., 60
porcento do genoma estaria codificando para o conjunto combinado de mensagens
de blástula e plúteo). Se fossem idênticos, poder-se ia esperar 15 porcento do DNA
estar ligado. O resultado está mostrado na Figura 12.1. A mistura ligou-se somente a 15
porcento do DNA. As seqüências de nRNA de blástula e plúteo se ligavam ao mesmo
DNA. Dentro do erro experimental, o nRNA de células da blástula e do plúteo eram
idênticos. Wold e colegas (1978) estenderam essas observações mostrando que se-
qüências presentes no RNA mensageiro da blástula (isolado de polissomos em tradu-
ção) mas ausentes no mRNA da gástrula e do tecido adulto estavam, apesar disso,
presentes no RNA nuclear da gástrula e do tecido adulto. Esses resultados foram
interpretados como indicando que mais genes são transcritos no núcleo do que aque-
les permitidos se tornarem mRNAs no citoplasma (Figura 12.2; Tabela 12.1).
Porcentagem de [3H]DNA nos híbridos RNA:DNA
Figura 12.1
Hibridização de RNA nuclear de embriões de
ouriço-do-mar com [3H]DNA de cópia única.
RNA de
DNA de cópia única radioativo foi misturado blástula + plúteo
com RNA de blástula, RNA de plúteo ou RNA
da mistura de blástula e plúteo. As misturas RNA de blástula
foram incubadas para permitir o pareamento de
todas as seqüências complementares. (O eixo
RNA Cot é a concentração do RNA vezes o RNA de plúteo
tempo deixado para incubar). Nos três casos,
cerca de 15 porcento do DNA hibridizou com
o RNA. (Segundo Kleene e Humphreys, 1977.)
CAPÍTULO 12 Processamento diferencial do RNA e Tradução 463
Tabela 12.1 Comparações entre tecidos das seqüências de genes estruturais em RNA mensageiros e RNA nucleares
Reação normalizada Reação normalizada Reação normalizada

com mRNA parental com outro mRNA com nRNA
Pista referencial
complementar a mRNA % mRNA % nRNA %
OURIÇO-DO-MAR
mRNA de blástula (DNA de cópia única) Blástula 100 Intestino 12 Intestino 97
Celomócito 13 Celomócito 101
CAMUNDONGO
mRNA cerebral (cDNA total) Cérebro 100 Rim 78 Rim 102
mRNA cerebral (cDNA Cérebro 100 Rim 56 Rim 100
representando mensagens raras)
Fonte: Davidson e Britten, 1979.
(A)
Complexidade do RNA (106 nucleotídeos)
mRNA das blástula

Porcentagem de [3H]DNA reativo nos híbridos RNA:DNA
RNA do citoplasma intestinal
Figura 12.2
Seqüências encontradas no RNA nuclear de
(B) (C) vários tipos de células mas não no mRNA. (A)
Célula tipo 1 Especificidade do cDNA mensageiro da
blástula do ouriço-do-mar. Hibridização do
cDNA mensageiro da blástula (cDNA ao
mRNA da blástula) com mRNA de blástula e
RNA do citoplasma intestinal mostra que os
mRNAs são muito diferentes. (B) A hibridiza-
ção do cDNA mensageiro da blástula com
RNAs nucleares (nRNAs) de gástrulas e
celomócitos adultos e células intestinais suge-
re a identidade de todos os RNAs nucleares.
Célula tipo 2 (C) Modelo especulativo baseado no proces-
samento diferencial do RNA. Em ambos tipos
celulares, os mesmos RNAs (a, b, c, d, e) são
nRNA do celomócito transcritos, mas em um tipo celular, as seqüên-
nRNA da gástrula cias c, d e e são processadas para mRNA
nRNA do intestino citoplasmático, enquanto em outro tipo de cé-
lula, seqüências a, b e c são processadas e envi-
adas para o citoplasma. (A e B segundo Wold
et al., 1978.)
Figura 12.3
Ensaios para detecção do acúmulo de uma
mensagem no citoplasma. (A) Ensaio de pro- Dividir o tecido
teção de ribonuclease. RNA é isolado e puri- em duas amostras
ficado de tecido embrionário. Uma sonda de
RNA radioativo é sintetizada, complementar
(A) (B)
a um pequeno trecho do RNA que está sendo Ensaio de proteção de RNase Ensaio “run-on” nuclear
analisado. Se o RNA específico estiver pre-
sente, a sonda radioativa se ligará a ele. RNase
é adicionada em seguida, destruindo todo o
RNA exceto aquele da região de dupla fita
que contém o oligonucleotídeo radioativo.
Esse pode ser submetido à eletroforese em gel Isolar RNA Isolar núcleos
e auto-radiografado. (B) Ensaio nuclear “run-
on” (isola o núcleo e usa marcador radioativo Núcleo
para marcar o transcrito). Núcleos são isola-
dos de tecido embrionário. UTP radioativa é
adicionada aos núcleos. O mRNA que está
sendo sintetizado incorpora a marca radioati-
va enquanto continua sendo transcrito. O
mRNA pode ser isolado e hibridizado com
seqüências complementares de DNA imobi-
lizadas em papel. Se o transcrito radioativo
ligar, será detectado por auto-radiografia. RNA polimerase
Adicionar
oligonucleotídeo Transcrito nascente
radioativo de RNA
Adicionar UTP radioativo
Ajunte RNase; RNA

é degradado
Porção radioativa
de RNA
Isolar RNA; hibridizar

para DNA por
transferência Southern
Eletroforese em gel
Auto-radiografia Filtro de papel Auto-radiograma

Esse controle pós-transcricional do processamento do RNA foi confirmado para (A)

mensagens específicas por ensaios de proteção de ribonuclease e ensaios “run-on”
(isola-se o núcleo e usa-se marcador radioativo para marcar o transcrito) de transcri-
ção nuclear. O ensaio de proteção de ribonuclease é um teste sensível para determinar
a presença (ou ausência) de uma determinada seqüência em uma população de RNAs Íntron Cyllla
(Figura 12.3). Produz-se um RNA relativamente pequeno, marcado radiotivamente,
que é complementar a uma seqüência específica do RNA que se deseja detectar. Essa
Éxon Cyllla
“sonda” de RNA é misturada com o RNA celular que está sendo testado para a presen-
ça de uma determinada sequência. Se a seqüência estiver presente, a sonda se liga à
ela. Então, ribonuclease (RNase, uma enzima que digere RNA de cadeia única) é adicio- Ectoderma Endoderma +
nada à mistura para clivagem e remoção de todo o RNA que não está hibridizado. O mesoderma
Vetor
RNA de dupla fita formado pela hibridização dos RNAs radioativo e celular não é (B)
clivado. Esse RNA de dupla fita pode ser corrido em um gel e detectado por auto- Spec1
radiografia. Se a seqüência de RNA estiver presente, uma banda de um determinado
tamanho deverá aparecer na auto-radiografia. Gagnon e colaboradores (1992) realiza-
ram essa análise nos transcritos dos genes Spec1 e CyllIa do ouriço-do-mar Stron-
gylocentrotus purpuratus. Esses genes codificam proteínas ligantes de cálcio e actina, Figura 12.4
respectivamente, que são expressas somente no ectoderma aboral da larva plúteo. Regulação da expressão do gene específico do
Usando sondas que se ligam a um éxon e a um íntron, eles acharam que esses genes ectoderma por processamento de RNA. (A)
estavam sendo transcritos não apenas nas células ectodérmicas mas também no me- Auto-radiografias do ensaio de proteção de
ribonuclease. A coluna à esquerda representa
soderma e endoderma. A análise do gene CyIIIa mostrou que a concentração de
RNA isolado do tecido ectodérmico da gástrula;
íntrons era a mesma tanto no ectoderma da gástrula como nas amostras de mesoderma a coluna do lado direito representa RNA isola-
e endoderma, sugerindo que esse gene estava sendo transcrito com a mesma veloci- do dos tecidos endodérmicos e mesodérmicos.
dade em todos os tipos celulares (Figura 12.4A). O éxon, porém, se acumulava no A banda superior é o RNA protegido por uma
ectoderma (que expressa a proteína), mas não no mesoderma ou endoderma (que não sonda que se liga a uma seqüência de íntron
o fazem). Assim, enquanto os genes parecem ser transcritos com velocidades seme- (que deve ser encontrada somente no núcleo)
lhantes no ectoderma e outros tecidos, o mRNA para essas proteínas (representado de Cyllla. A banda inferior representa o RNA
pelos éxons) se acumula somente no ectoderma. protegido por uma sonda complementar a uma
Essa conclusão foi confirmada quando núcleos foram isolados de tecidos da seqüência de éxon. (B) Resultados de um en-
saio “run-on” de um transcrito nuclear. RNAs
gástrula. UTP radioativo permitiu aos pesquisadores seguir qualquer RNA que esti-
radioativos sintetizados in vitro por núcleos
vesse sendo transcrito no momento em que os núcleos foram isolados. Tanto os ectodérmicos (esquerda) e núcleos mesodér-
núcleos do ectoderma como endoderma/mesoderma estavam transcrevendo o gene micos e endodérmicos(direita) foram hibridi-
Spec1 no estágio de gástrula (Figura 12.4B). Assim, a expressão dos genes Spec1 e zados com um íntron do gene Spec1 afixado a
CyIIIa está no nível do processamento de RNA na gástrula. Mais tardiamente no um filtro. Núcleos tanto do ectoderma como
desenvolvimento (no estágio plúteo), esses genes ficam sob o controle transcricional, endoderma/mesoderma estavam transcrevendo
no qual a transcrição dos genes cessa nas células que não estão expressando essas esse gene na gástrula do ouriço-do-mar, apesar
proteínas. Parece, assim, que o processamento de RNA tem um papel majoritário no da mensagen Spec1 ser vista somente nas célu-
controle da expressão gênica em embriões precoces do ouriço-do-mar. las do ectoderma. (de Gagnon et al., 1992, cor-
tesia de R. e L. Angerer.)
Os mecanismos de emenda de RNA: “Spliceosomes”
A emenda do pré-mRNA é mediada através de uma partícula nuclear 60S chamada
“spliceosome”. O “spliceosome” é composto de cinco RNAs nucleares pequenos
(sn) (os snRNAs U1, U2, U4, U5 e U6) e numerosas proteínas. Essas proteínas fre-
qüentemente se associam aos snRNAs para formar pequenas partículas nucleares de
ribonucleoproteínas (snRNPs), assim chamadas por seus snRNAs associados (tal
como o snRNP U2). O “spliceosome” não existe como um complexo pré-formado
boiando no núcleo, mas é reunido no pré-mRNA por um processo de múltiplas etapas.
O local da emenda 5’ é primeiramente identificado pelo snRNA U1 por complementari-
dade de bases. O local da emenda 5’ no começo de cada íntron tem uma seqüência
consensual que é reconhecida pelo snRNA U1 (Figura 12.5). O final 3’ do íntron é
reconhecido pelo fator auxiliar snRNA U2, U2AF (Ruskin et al., 1988; Wu e Maniatis,
1993). Esse reconhecimento do local da emenda estabelece um “complexo de compro-
metimento” onde outros snRNAs irão se associar com essas proteínas e finalmente
catalisar a remoção do íntron (Hodges e Beggs, 1994). [RNA2.html]
COMPLEXO DE COMPROMETIMENTO O pré-mRNA vertebrado médio consiste de éxons relativamente curtos (em média
cerca de 140 bases), separados por íntrons que são usualmente muito mais compridos.
Íntron
Qualquer mecanismo coordenador das emendas em um RNA multi-éxon tem que pro-
ver uma explicação de como éxons pequenos são conservados e separados dos íntrons
grandes. Berget (1995) propôs a noção que a emenda é feita de um terminal do éxon
para o outro, em vez de através do íntron. Essa hipótese da definição do éxon sustenta
que o tamanho reduzido dos éxons permite ao snRNA U2 (no terminal 5’ do éxon)
conectar-se com o snRNA U1 no outro terminal. Seguindo essa “definição” dos limi-
tes do éxon, os vários éxons são ajuntados.
O processamento de mRNA maduro também requer a adição de uma cauda poli
(A) ao mRNA nuclear. O terminal 3’ da maioria dos mRNA eucarióticos (mensagens
Éxon de histonas sendo as únicas exceções conhecidas) é formado pela clivagem do
Éxon
transcrito original e adição de segmentos de resíduos de adenilato. A região 3’
não-traduzida da maioria dos precursores do mRNA contém a seqüência AAUAAA,
que é essencial para a clivagem do RNA, 10 a 30 bases a jusante desse sítio
(Proudfoot e Brownlee, 1976). Mutações nessa seqüência previnem a formação do
“SPLICEOSOME”
terminal 3’ do mRNA (Wickens e Stephenson, 1984; Orkin et al., 1985). Outro ele-
Éxon
mento de atuação cis é uma seqüência rica em GU ou U, usualmente localizada
mais a jusante (3’) da clivagem. Essa seqüência parece ser crítica para a clivagem
eficiente do RNA nuclear no sítio de processamento 3’ (McDevitt et al., 1984;
Christofori e Keller, 1988). [RNA3.html]
Emenda alternativa do RNA:

Criando proteínas alternativas a partir do mesmo gene
Éxon
Um Gene, Muitas Proteínas Relacionadas
Em adição à decisão sobre quais RNAs terão entrada no citoplasma, a regulação

do desenvolvimento pelo processamento do RNA também pode ocorrer pela emenda
Éxon Éxon alternativa do RNA. A maioria dos pré-mRNAs mamíferos contém numerosos
íntrons. Pelo seu reconhecimento seletivo pode-se ter uma emenda alternativa do
RNA. Isso pode ocorrer de várias maneiras (ver Figura 12.6). As células podem
diferir em sua habilidade de reconhecer o sítio de emenda 5’ ou o sítio de emenda
3’. Ou algumas células poderiam não reconhecer uma seqüência como um íntron,
conseqüentemente retendo-o dentro da mensagem. Se uma célula vai reconhecer
Íntron
os sítios das emendas, depende de certos fatores no núcleo que podem interagir
com esses sítios e competir ou cooperar com as proteínas que normalmente os
reconhecem. O sítio de emenda 5’ é reconhecido pelo snRNA U1, mas somente
com a cooperação de uma proteína chamada fator 2 de emenda (SF2; fator de
emenda alternativa). Em pelo menos alguns casos, a escolha entre os sítios da
Figura 12.5 emenda 5’ alternativo é influenciada pela razão da proteína SF2 e outra proteína,
Emendar o íntron e conectar os éxons adjacen-
hnRNP-A1. Em geral, um excesso de SF2 resulta na utilização do sítio de emenda 5’
tes. No “complexo de comprometimento” le-
vando à formação do “spliceosome”, as duas
proximal (mais próximo), enquanto um excesso de hnRNP-A1 resulta na utilização
junções de emenda 5’ e 3’ no íntron foram pelo “spliceosome” do sítio de emenda 5’ distal (mais distante) (Mayeda e Krainer,
reconhecidas pelo snRNA U1 e pela proteína 1992). A escolha de sítios de emenda 3’ alternativos é muitas vezes controlada por
U2AF, respectivamente. Ambas são estabili- aquele sítio de emenda que melhor pode ligar U2AF.
zadas por proteínas da família SR. As proteí- O que é um íntron no núcleo de uma célula pode ser um éxon no núcleo de
nas U2AF e SR são consideradas ser substitu- outra célula. Processamento alternativo de RNA foi encontrado controlando as
ídas por riboproteínas nucleares pequenas formas alternativas de expressão de mais de 100 proteínas. Deleção de certos
(snRNPs) que facilitam a clivagem do íntron e éxons em potencial em algumas células mas não em outras permite a um gene criar
a ligação de dois éxons adjacentes. (Segundo
uma família de proteínas estreitamente relacionadas. Em vez de um gene-um
Hodges e Beggs, 1994.)
polipeptídeo pode-se ter um gene-uma família de proteínas. Por exemplo, o precur-
sor mRNA para a molécula de adesão N-CAM pode ser alternadamente processa-
do para mais de 100 formas diferentes, dependendo de quais éxons são incluídos
no mRNA. Embora somente quatro formas principais dessa proteína são usual-
EMENDA CONSTITUTIVA
TIPOS SELECIONADOS DE EMENDA ALTERNATIVA

Éxons emendados
Figura 12.6
Diagrama esquemático da emenda alternativa do pré-mRNA. Éxons estão representados
como caixas sombreadas, éxons emendados alternativamente estão representados por caixas
hachuradas, e íntrons estão representados por linhas grossas. Por convenção, a trajetória da
emenda é mostrada por linhas finas em forma de V. (A) As bordas éxon-íntron, mostrando
as seqüências consensuais nos terminais 3’ e 5’ do íntron. R representa qualquer purina, Y
qualquer pirimidina, e N qualquer nucleotídeo. (B) a emenda de um pré-mRNA com 5
éxons. (C-F) Emenda alternativa por (C) sítios de emenda 5’ alternativa, (D) sítio de emenda
3’ alternativa (em alguns casos isso iria prover terminais diferentes ao mRNA, e ambos
sítios necessitariam de uma seqüência de poliadenilação, aqui mostrada como An), (E) uma
decisão emenda/não emenda, e (F) inclusão de éxon/ exclusão de éxon. (Segundo Horowitz
e Krainer, 1994.)
mente vistas em qualquer embrião, algumas das formas menos importantes são
vistas no cérebro e no coração (Zorn e Krieg, 1992). De maneira semelhante, a
emenda alternativa do RNA permite que o gene para β−tropomiosina codifique
tanto as formas do músculo esquelético como as do fibroblasto dessa proteína. O
RNA nuclear para a β−tropomiosina contém 11 éxons. Éxons 1-5, 8 e 9 são comuns
a todos os RNAs expressos por esse gene. Éxons 6 e 11 são também usados em
fibroblastos e células de músculo liso, enquanto éxons 7 e 10 são usados na
síntese da β−tropomiosina do músculo esquelético (Figura 12.7). Nos músculos
lisos e nos fibroblastos é formada uma proteína que impede “spliceosomes” de se
formarem nos sítios de emenda específicos dos músculos esqueléticos (Guo et al.,
1991; d’Orval et al., 1991). No sistema nervoso, a diversidade do canal de K+ tem
um papel importante na regulação da excitabilidade da membrana. Essas diferen-
ças cinéticas foram correlacionadas com a emenda alternativa de precursores de
mensagens do gene shaker (Mottes e Iverson, 1995).
Figura 12.7 mRNA da β−tropomiosina

Diagrama esquemático da emenda alternati- específico de músculo estriado
va do RNA no precursor do mRNA da β-
tropomiosina. No músculo esquelético, éxons
possíveis 6 e 11 são evitados (e transforma-
dos em íntrons), enquanto em fibroblastos e Processamento de
células do músculo liso, éxons possíveis 7 e célula muscular
10 são tornados íntrons, e 6 e 11 são usados
como éxons.
Processamento de fibroblasto, Precursor RNA nuclear
célula do músculo liso de β−tropomiosina
mRNA de β−tropomiosina de
fibroblasto e músculo liso
Em alguns casos, as propriedades das proteínas emendadas alternativamente po-

dem ter conseqüências importantes durante o desenvolvimento. As cinco diferentes
proteínas fibronectinas humanas são geradas por um par de genes idênticos da
fibronectina. As formas diversas (e em alguns casos específicas de órgãos) da
fibronectina vêm de mRNAs diferentes gerados pela emenda de diferentes éxons dos
precursores do mRNA da fibronectina (Tamkun et al., 1984; Hynes, 1987). Algumas
formas de fibronectina são encontradas nas trajetórias sobre as quais migram células
embrionárias, enquanto outras não o são, o que sugere que formas de fibronectina
emendadas alternativamente têm diferentes funções embrionárias (ffrench-Constant e
Hynes, 1989). Algumas isoformas emendadas do fator 8 de crescimento fibroblástico
(FGF8) somente interagem com receptores gerados da emenda particular de RNA.
Assim, o FGF8b (uma das sete variantes emendadas de FGF8) se ligará a receptores
FGF 2c e 3c, mas não aos receptores FGF 1b, 1c, 2b ou 3b. No camundongo em
desenvolvimento, o FGF8b é produzido do sulco ectodérmico apical no broto dos
membros e dos arcos branquiais e fossas nasais da cabeça. Em cada um desses locais,
o mesênquima subjacente expressa o receptor FGFR2c (Fotografia de rosto, Crossley
e Martin, 1995; MacArthur et al., 1995).
Processamento Alternativo de RNA e Determinação Sexual em Drosophila

A emenda alternativa do RNA pode gerar famílias de proteínas cujos membros
podem ter diferentes funções. Nada previne tal emenda alternativa de produzir prote-
ínas de fatores de transcrições alternativas, e essa técnica foi usada pela Drosophila
para controlar sua diferenciação sexual. Além disso, a diferenciação sexual em
Drosophila é regulada por uma cascata de eventos processadores de RNA (veja
Baker et al., 1987; MacDougall et al., 1995).
Conforme veremos no Capítulo 20, o desenvolvimento do fenótipo sexual em
Drosophila é mediado por uma série de genes que convertem a relação cromosso-
mo X-autossomo em uma célula de macho ou uma de fêmea. Quando a relação é 1
(i.e., quando existem dois cromossomos por célula diplóide), o embrião se desen-
volve em uma mosca fêmea. Quando a relação é de 0.5 (i.e., quando a mosca é XY
com apenas um cromossomo X por célula diplóide), o embrião se desenvolve em
um macho (Figura 12.8).
Um dos genes chave nessa trajetória é o transformer (tra1). Esse gene é neces-
sário para produção de fêmeas, e sua perda resulta em moscas macho, independen-
temente da relação cromossômica. Através de todo o período larval, o gene tra1
sintetiza ativamente um transcrito que é processado em um mRNA geral (que é
encontrado tanto em fêmeas como em machos), ou em um mRNA específico para

XX;AA XY;AA
fêmeas (Figura 12.9). Somente fêmeas contêm a mensagem emendada alternativa-
mente. O mRNA geral encontrado tanto em machos como em fêmeas contém um
códon de parada precoce (UGA) no segundo éxon, e a pequena proteína produzida
por esse mRNA não é funcional. Portanto, o transcrito não-específico geral não está Sex lethal Sex lethal
relacionado com a determinação do sexo (Belote et al., 1989). Porém, na mensagem
mRNA específico mRNA não
específica para fêmeas, esse códon UGA está em um íntron que é desemendado de fêmea funcional
durante a formação do mRNA e não interfere com a tradução da mensagem. Em
outras palavras, o transcrito fêmea é o único transcrito funcional desse gene. De transformer transformer
fato, quando o cDNA desse transcrito específico de fêmea é incorporado nos geno-
mas de moscas XY, essas moscas se tornam fêmeas. A proteína codificada pelo mRNA específico mRNA não
de fêmea funcional
mRNA específico de fêmea parece ser um peptídeo rico em arginina com comprimen-
to de 196 aminoácidos (Boggs et al., 1987). Doublesex Doublesex
O que faz o gene transformer (tra1) processar um transcrito específico de
fêmea em células XX e não em células XY? Parece que a emenda alternativa espe- mRNA específico mRNA específico
cífica do sexo do nRNA tra1 envolve competição entre dois possíveis sítios de de fêmea de macho
emenda 3’ (aceptores) no íntron. Sosnowski e seus colegas (1989) apresentaram
evidência de que essa competição é alterada pela presença ou ausência de um
produto funcional do gene Sex-lethal. O gene Sex-lethal (Sxl) é um dos primeiros Fenótipo Fenótipo
genes na via do fenótipo sexual, e age antes do transformer. Se a relação X-para- feminino masculino
autossomo for 1, a proteína funcional SXl será produzida*. Esse gene não produz
Figura 12.8
uma proteína funcional em embriões XY ou larvas. Quando o gene Sex-lethal é
Determinação do sexo em Drosophila. Esse
funcional, o gene transformer produz tanto o transcrito geral como o transcrito esquema simplificado mostra que a razão X-
específico de fêmea e a mosca se tornará uma fêmea. Se o gene Sex-lethal for autossomo é monitorada pelo gene Sex-lethal.
deletado ou mutado, o gene transformer só produzirá o transcrito não-funcional e Se esse gene estiver ativo, ele processa o pré-
a mosca se tornará um macho. Parece que o produto do gene Sex-lethal controla mRNA transformer em uma mensagem funci-
qual dos sítios de emenda 3’ está sendo usado. onal específica de fêmea. Na presença da pro-
Há duas maneira principais pelas quais a proteína Sex- lethal poderia controlar teína Transformer específica de fêmea, o trans-
qual sítio de emenda 3’ é usado. Uma, é bloquear o uso do sítio geral do aceptor de crito do gene doublesex é processado de forma
modo que somente o sítio alternativo aceptor específico de fêmea pode ser usado. A específica de fêmea, levando à produção do
fenótipo feminino. Se o gene transformer não
outra maneira é ativar o sítio aceptor específico de fêmea de um modo positivo.
produzir um produto específico de fêmea (i.e.,
Valcárcel e colegas (1993) mostraram que a proteína Sex-lethal inibe a emenda no se o gene Sex-lethal não for ativado), o trans-
sítio aceptor (não específico de fêmea), ligando-se especificamente ao seu trato crito double-Sex é emendado da maneira espe-
polipirimidina. Isso bloqueia a ligação de um fator de emenda, U2AF, ao sítio geral, cífica de macho, levando à obtenção de um
levando-o a usar o sítio de menor afinidade específico de fêmea. Portanto, parece fenótipo masculino. (Os detalhes dessa trajetó-
que se o sítio de emenda aceptor geral 3’ do transformer estiver bloqueado (seja por ria serão discutidos no Capítulo 20.)
mutação ou pela proteína Sex-lethal), o sítio aceptor alternativo específico será
usado (veja Figura 12.9). O resultado será uma mosca fêmea.
A proteína Transformer-1 é, ela própria, um fator de emenda alternativo, e regula
a emenda do transcrito nuclear do gene doublesex (dsx). Esse gene é necessário
para a produção de ambos fenótipos sexuais, e mutações de dsx podem reverter o
fenótipo esperado, fazendo com que embriões XX se tornem machos, ou embriões
XY se tornem fêmeas. Durante o estágio de crisálida, doublesex produz um transcri-
to que pode ser processado de duas maneiras alternativas. Pode gerar um mRNA
específico de fêmea ou um mRNA específico de macho (veja Figura 12.9; Nagoshi et
al., 1988). Em fêmeas e machos, os três primeiros éxons são os mesmos. Porém, os
quartos éxons são diferentes. O RNA específico de macho deleta uma grande seção
do RNA precursor que inclui o éxon específico de fêmea.
Tian e Maniatis (1992) mostraram que o processamento específico do sexo do pré-
mRNA dsx envolve a ativação do sítio de emenda 3’ específico de fêmea pelos produ-
tos dos genes transformer e transformer-2. A polipirimidina (rica em U/C) do trato em
*A proteína Sxl é ela própria um produtor de um complexo tipo de emenda alternativa do RNA.
Mais será dito sobre isso no Capítulo 20.
Sítios de emenda alternativa 3’
Éxon Íntron Íntron Éxon

gene tra1
Códon de parada Códon de parada
FÊMEA MACHO
Proteína Sx1 funcional Sem proteína Sx1 funcional
pré- pré-
mRNA mRNA
tra1 tra1
Sx1 bloqueia ligação de U2AF se liga às regiões
U2AF (e “spliceosome”) ao ricas em polipirimidina
sítio mais eficiente; assim, para sítios de emenda 3’
sítio de emenda 3’ menos
eficiente é usado
mRNA transformer
RNA Transformer (macho e fêmea)
feminino constitutivo produz
proteína truncada,
não-funcional
Proteína transformer Proteína degrada
Gene
doublesex
Sítio de emenda 3’ ineficiente
Pré-mRNA Pré-mRNA
doublesex doublesex
Proteínas Tra ajudam ligação

de U2AF ao sítio ineficiente
mRNA doublesex mRNA doublesex

específico de fêmea específico de macho
Proteína
Doublesex (DSX) Proteína
específica de fêmea Doublesex (DSX)
específica de macho
Ativa genes específicos de fêmea Ativa genes específicos de macho

Suprime genes específicos de macho suprime genes específicos de fêmea
Figura 12.9
▲
Representação esquemática de eventos de emenda alternativa na trajetória da determinação

do sexo em Drosophila. A trajetória feminina está à esquerda, a trajetória masculina está à
direita, e os genes transformer-1 e doublesex estão no centro. Na trajetória feminina, a
proteína Sxl ativa é produzida quando a razão X-para-autossomo for 1. (Como isso ocorre
será discutido no Capítulo 20.) A proteína Sxl ativa bloqueia o sítio usual de emenda 3’ do
primeiro íntron do pré-mRNA tra1. Isso obriga o “spliceosome” a usar um outro sítio de
emenda 3’. Na trajetória masculina, não é produzida a proteína Sxl, e o “spliceosome” usa o
sítio mais eficiente. Isso conduz à incorporação no mRNA de seqüências que codificam
precocemente um códon de parada precoce (UAG) na mensagem. O peptídeo truncado
produzido dessa mensagem não parece ter uma função. É como se o gene fosse inativo. Na
trajetória feminina, a proteína Tra1 ativa se combina com a proteína Tra2 para estabilizar
U2AF, e a assembléia de “spliceosome” no sítio de emenda 3’ do terceiro íntron do pré-
mRNA doublesex. Isso leva à formação de um mRNA contendo o quarto éxon. Em machos,
a ausência da proteína Tra1 previne a ligação de U2AF e a assembléia do “spliceosome”
nesse sítio. Em vez disso, éxons 5 e 6 são utilizados no mRNA masculino. (Segundo
MacDougall et al., 1995.)
frente ao éxon 4 no precursor do mRNA doublesex é geralmente um ligante fraco de

U2AF, porque ele é quebrado por um grupo de resíduos de purina (representado pela
linha serrilhada na Figura 12.9). Portanto, ele usualmente não é um eficiente sítio de
emenda 3’. Porém, na presença das proteínas Transformer (e Transformer 2), esse sítio
torna-se um sítio utilizado eficientemente (Tian e Maniatis, 1993). Isso significa que o
sítio de emenda será utilizado em fêmeas (que têm as proteínas Transformer ativas),
mas não em machos (que não as têm). O mRNA doublesex masculino não terá o éxon
4, enquanto o transcrito feminino o tem. As proteínas Doublesex produzidas por esses
mRNAs são ambas fatores de transcrição. Além disso, elas reconhecem a mesma
seqüência de DNA. Porém, enquanto a proteína Doublesex “feminina” irá ativar inten-
sificadores específicos de fêmea (como aqueles que produzem proteínas do vitelo), as
proteínas Doublesex “masculinas” irão inibir a transcrição desses mesmos intensifica-
dores (Coschigano e Wensink, 1993; Jursnich e Burtis, 1993). Reciprocamente, a pro-
teína Doublesex “feminina” pode inibir a transcrição a partir de genes que seriam, de
outra maneira, ativados pela proteína Doublesex “masculina”. A pesquisa sobre a
determinação do sexo em Drosophila mostra que o processamento diferencial do
RNA tem papel extremamente importante ao longo de todo o desenvolvimento.
Uso Disseminado do Processamento

de RNA para o Controle da Expressão Gênica
Ainda sabemos relativamente pouco sobre os mecanismos de processamento alterna-

tivo do mRNA ou sobre as vias pelas quais algumas células processam transcritos que
outras células não seguem. O mecanismo subjacente a tal processamento diferencial
de RNA pode nos fornecer uma visão sobre a verdadeira essência da diferenciação
celular e da determinação embrionária.
Q REGULAÇÃO DA TRADUÇÃO DOS

PROCESSOS DESENVOLVIMENTAIS
Após o RNA mensageiro ter sido transcrito, processado e exportado do núcleo, ele
ainda precisa ser traduzido para formar a proteína codificada no genoma. Nas seções
seguintes, iremos ver que a regulação a nível da tradução é um mecanismo extrema-
mente importante no controle da expressão gênica. Nesses casos, a mensagem já está
presente no citoplasma mas pode ou não ser traduzida, dependendo de certas condi-
ções celulares. Assim, o controle da tradução da expressão gênica pode ser usado
quando uma explosão de síntese protéica é necessária imediatamente (como no caso
de ovos recém-fecundados), ou pode ser usado como um mecanismo afinado para
assegurar que uma quantidade muito precisa de proteína seja produzida do suprimen-
to disponível de mensagens (como a síntese de hemoglobina). Iremos também ver que
há várias maneiras para realizar o controle da tradução e que células diferentes desen-
volveram diferentes meios de o fazerem.
Mecanismos da tradução eucariótica

Tradução é o processo pelo qual a informação contida numa seqüência de
nucleotídeo do mRNA instrui a síntese de um determinado polipeptídeo. Esse
processo, esquematizado na Figura 12.10, foi dividido em três fases - iniciação,
alongamento e terminação - e é regulado por proteínas solúveis chamadas (apro-
priadamente) fatores de iniciação, fatores de alongamento e fatores de terminação
(Hershey, 1989; Safer, 1989).
A iniciação consiste de reações pelas quais o primeiro RNA de transferência
do aminoacil e o mRNA são ligados ao ribossomo. O único RNA de transferência
(tRNA) capaz de iniciar a tradução é um tRNA iniciador especial (tRNAi), que
transporta o aminoácido metionina. Conforme mostrado na Figura 12.11, as primei-
ras reações envolvem a formação de um complexo de iniciação consistindo do
tRNA iniciador do metionil ligado à uma subunidade ribossômica 40S (“pequena”).
Essa reação é catalisada pela forma ativa do fator 2 de iniciação eucariótica (eIF2-
GTP) que liga o iniciador Met-tRNA à subunidade ribossômica 40S. Note que essa
Figura 12.10 ligação ocorre na ausência de mRNA. O mRNA é adicionado em seguida. Primeiro,
Representação esquemática dos eventos da tra- uma proteína cap ligante-eIF4E - liga-se ao “cap” de metil-guanosina no terminal 5’
dução eucariótica. Os passos da iniciação reú- da mensagem. Sem esse “cap”, a ligação do mRNA à subunidade ribossômica
nem as subunidades ribossômicas 40S e 60S,
muitas vezes não é completada (Shatkin, 1976, 1985), e o eIF4E é crítico para o
mRNA e o tRNA iniciador, que está comple-
xado ao aminoácido metionina (Met). Durante prosseguimento da tradução. No entanto, há menos eIF4E do que o número de
o alongamento, aminoácidos são trazidos para mensagens na célula, o que faz pensar que cada mRNA tem que competir por essa
o polissomo, e ligações peptídicas são forma- proteína cap ligante (Thach, 1992). O fator 4A de iniciação se complexa em seguida
das entre os aminoácidos. A seqüência de ami- com o eIF4E e se posiciona numa alça helicoidal fechada na seqüência líder do
noácidos na proteína em crescimento é mRNA. O eIF4A (estimulado por eIF4B e ATP) desenrola a hélice. Esse passo pode
direcionada pela seqüência de códons de áci- ser limitante se a eIF4A da alça helicoidal fechada for ocultada por alguma outra
dos nucléicos no mRNA. Após a última liga- estrutura secundária estável. A subunidade ribossômica 40S viaja em seguida ao
ção peptídica da proteína ter sido feita, um dos longo da mensagem até atingir o códon AUG no contexto adequado. Kozak (1986)
códons UAG, UGA, ou UAA sinaliza o tér-
mostrou que não apenas qualquer um AUG irá servir. Para que a subunidade
mino da tradução. As subunidades ribossômicas
e a mensagem podem ser reutilizadas.
INICIAÇÃO ALONGAMENTO TERMINAÇÃO
Polipeptídeo Polipeptídeo
nascente completado
tRNA
iniciador Ligação
peptídica
Ribossomo
Fator de
Subunidades
liberação
ribossômicas
Subunidades
ribossômicas
recicladas
Unidade Figura 12.11

ribossômica Fase de iniciação da tradução eucariótica. To-
pequena dos os fatores de iniciação estão representados
Ligação do fator de iniciação como círculos. O primeiro complexo é produ-
zido pela união da subunidade ribossômica 40S
com o tRNA iniciador. O tRNA iniciador foi
complexado com a forma ativa (GTP) do fator
tRNA
Iniciador
2 de iniciação. Após a formação desse com-
plexo, o mRNA é posicionado com o auxílio
da proteína cap ligante (eIF4E) e outras subu-
nidades eIF4. Uma vez estando o mRNA co-
locado em seu lugar, o eIF5 media a junção da
subunidade ribossômica 60S e a liberação dos
prévios fatores de iniciação. O eIF2, agora em
sua forma inativa (GDP), é reativado por
eIF2B. (Segundo Hershey, 1989; Thach, 1992;
Cooper, 1996.)
Escaneamento
Reciclagem
de eIF2
Subunidade 60S
ribossômica pare e inicie a tradução, os nucleotídeos ao redor de AUG também são

importantes. Mutando genes clonados e analisando a tradução de seus RNAs,
Kozak achou que a seqüência “ótima” seria ACCAUGG. Mutações nos nucleotí-
deos nos flancos podiam reduzir a tradução em 20 vezes. A importância dos nucle-
otídeos nos flancos também foi vista in vivo. Morle e colaboradores (1985) repor-
taram o caso de um paciente cuja α−talassemia (deficiência da subunidade α−
globina da hemoglobina) era devida à uma alteração nessa seqüência de ACCAUGG
para CCCAUGG. A ligação da subunidade 40S à AUG da mensagem posiciona o
Figura 12.12
Polissomo individual transcrevendo o mRNA
gigante do puff BR2 de Chironomus tentans.
(A) Microscopia eletrônica de um polissomo
contendo 24 ribossomos. As proteínas nas-
centes podem ser vistas se estendendo dos
ribossomos e crescendo à medida que os
ribossomos se movimentam do terminal 5’ da
mensagem para o terminal 3’. Próximo do ter-
minal 3’ estão ribossomos dos quais a prote-
ína se destacou. (B) Um tal polissomo sob
maior aumento; o polissomo foi esticado du-
rante a preparação do espécime. A relação entre
o mRNA e as subunidades ribossômicas e o
polipeptídeo nascente pode ser vista. (de
Francke et al., 1982; fotografias cortesia de J.
E. Edstrom.)
(A) (B)
tRNA iniciador sobre o códon AUG. Somente após o mRNA ter sido posicionado
apropriadamente na subunidade ribossômica pequena, pode a unidade ribossômica
60S (“grande”) se ligar. Isso completa a reação de iniciação. Durante esse proces-
so, o GTP no eIF2 é hidrolisado em GDP. Para o eIF2 captar um novo tRNA inicia-
dor, esse tem que ser regenerado para eIF-GTP pelo eIF2B.
O alongamento envolve a ligação seqüencial de tRNAs do aminoacil ao
ribossomo e a formação de ligações peptídicas entre os aminoácidos à medida que
eles abandonam seqüencialmente seus tRNAs transportadores (veja Figura 12.10).
À medida que aminoácidos são ajuntados, o ribossomo viaja ao longo da mensa-
gem, expondo novos códons para a ligação de tRNA. Isso permite a um outro
ribossomo iniciar sua viajem no terminal 5’ da mensagem. Assim, em geral, qual-
quer mRNA terá vários ribossomos ligados a ele. Essa estrutura é então chamada
poliribossomo- ou mais comumente, polissomo (Figura 12.12). A terminação da
síntese protéica ocorre quando um dos códons mRNA UAG, UAA ou UGA é ex-
posto no ribossomo. Esses tripletes de nucleotídeos (chamados códons de termi-
nação) não são reconhecidos pelos tRNAs e portanto não codificam para quais-
quer aminoácidos. Ao contrário, eles são reconhecidos pelos fatores de liberação,
que hidrolizam o peptídeo do último tRNA, destacando-o do ribossomo. O
ribossomo se separa em duas unidades, e o ciclo da tradução recomeça.
Controle da síntese protéica

pela longevidade diferencial do mRNA
Uma das principais maneiras de regular a expressão gênica ao nível de tradução envol-
ve degradação ou estabilização seletiva do mRNA. Se o mRNA fosse degradado
rapidamente após penetrar no citoplasma, ele somente poderia gerar poucas proteí-
nas. Porém, se a mensagem com uma meia-vida relativamente curta for seletivamente
estabilizada em certas células em certos momentos, então ele poderia produzir grandes
quantidades de uma proteína particular em certos momentos e em certos locais.
Degradação Seletiva de mRNAs
LONGEVIDADE DE UM mRNA E SUA REGIÃO 3’ NÃO TRADUZIDA. Nem todos os

mRNAs têm a mesma estabilidade dentro da célula. Uma mensagem estável como a
β−globina tem uma meia-vida de cerca de 17 horas, enquanto os mRNAs para vários
fatores de crescimento têm meia-vida de menos de 30 minutos. Assim, a quantidade
de proteína produzida de uma única mensagem de globina deve ser muito maior que
aquela de uma mensagem de um único fator de crescimento. Dados recentes, suma-
riados por Decker e Parker (1994), sugerem que as seqüências de RNA dentro da
região 3’ não-traduzida (3’UTR) podem promover a rápida desadenilação da cauda Figura 12.13
do poliadenilato 3’. Isso leva à perda da cobertura do terminal 5’ da mensagem e de Regulação da longevidade do mRNA por uma
sua subseqüente degradação 5’ a 3’. Portanto, os principais determinantes regula- seqüência na região 3’ não traduzida. (A) O
terminal 3’ do gene β-globina do coelho foi
dores da meia-vida da mensagem parecem residir na 3’ UTR. As espécies mais efêmeras
alterado pela inserção de um fragmento de 62
de RNA contêm uma ou mais seqüências ricas em AU nessa região. Shaw e Kamen pares de base derivado do terminal 3’ do gene
(1986) inseriram uma região rica em AT com 51 pares de bases oriundas da 3’UTR do humano GM-CSF ou uma seqüência relacio-
gene para o fator de crescimento GM-CSF na 3’UTR do gene da β−globina do coelho nada, na qual vários pares AT foram substitu-
(Figura 12.13). A mensagem da globina resultante tinha uma meia-vida de menos de ídos por pares GC (indicados em cores). (B)
30 minutos. Uma seqüência semelhante, mas contendo 14 resíduos G e C, foi inserida Os clones foram injetados em culturas de cé-
em um outro gene da β−globina como um controle. Sua mensagem para globina lulas de camundongo, e a presença da mensa-
normalmente tinha a meia-vida longa. gem após 30 horas foi medida incubando-se
A capacidade de degradar seletivamente mRNAs é crítica para a função celular. extratos celulares com DNA marcado com 32P,
complementar ao terminal 5’ da mensagem.
Por exemplo, o gene c-fos codifica um fator de transcrição necessário para a divisão
Se a mensagem β-globina ainda existisse, o
celular normal do fibroblasto (Holt et al., 1986). Tal como a mensagem do fator de cDNA radioativo a ela se ligaria e seria, por-
crescimento GM-CSF, o mRNA para c-fos contém grandes regiões 3’ não-traduzidas tanto, resistente à nuclease S1 (que destrói
ricas em seqüências AU. Se essas regiões forem deletadas (experimentalmente ou somente ácidos nucléicos de fita única). Se a
por mutação natural), a mensagem ganha uma meia-vida mais longa. Conseqüente- mensagem não estivesse presente, a nuclease
mente, mais proteína C-fos é produzida, e a célula recebe sinalização contínua para S1 adicionada iria digerir a sonda até mono-
se dividir. O resultado é um tumor das células que têm o gene c-fos, carente da 3’ nucleotídeos, e nenhum DNA radioativo se-
UTR rica em AU (Meijlink et al., 1985). Wilson e Treisman (1988) descobriram que ria ligado. As soluções resultantes foram cor-
essa região estimula a remoção da cauda poli(A) quando a mensagem é traduzida. ridas em um gel e auto-radiografadas. Pista
1: Extratos de células incorporando o tipo sel-
Quando a região rica em AU foi deletada ou substituída por uma outra seqüência, a
vagem (WT) do gene clonado da β-globina.
cauda poli(A) permanecia, e a mensagem tinha uma meia-vida mais longa. Foram Pista 2: Extrato de células incorporando o gene
encontradas várias proteínas que reconhecem essas regiões 3’UTR ricas em AU, e β-globina do coelho com o terminal 3’ rico
elas podem acelerar a degeneração das mensagens quando ligada à elas (Chen et al, em AT (não mostrando mRNA após 30 ho-
1992, 1994). Reciprocamente, a 3’UTR do RNA de longa vida da α−globina contém ras). Pista 3: Extrato de células incorporando
três regiões ricas em C que ligam proteínas que parecem estabilizar a mensagem o gene da β-globina de coelho com o terminal
(Kiledjian et al., 1995). 3’ substituído por GC (mostrando mRNA
Encurtamento diferencial da cauda poli(A) tem um papel decisivo no ciclo vital do estável após 30 horas). O gene e a sonda
fungo limoso Dictyostelium. Nesse organismo, um novo conjunto de mensagens é para β 2-microglobulina (produzindo um
mRNA longevo) foram usados como con-
transcrito durante a mudança do crescimento vegetativo (ameba) para o desenvolvi-
trole. (Segundo Shaw e Kamen, 1986.)
Terminais 3’ alternativos RNA β−globina
RNA de controle
β2-microglobulina
“CAP” Íntron Íntron
(A) (B)
Porcentagem da marcação
Com prolactina
(pulso) inicial
Sem prolactina
Período após o rastreamento (horas)
Figura 12.14
Degradação de mRNA da caseína na presença e ausência de prolactina. Células mamárias em
cultura foram tratadas com precursores radiativos de RNA (pulso) e após um dado período foram
lavadas e alimentadas com precursores não-radiativos (rastreamento). O mRNA da caseína
sintetizado durante o tempo de pulsação foi em seguida isolado e contado. Na ausência de
prolactina, o mRNA da caseína recém-sintetizado decaiu rapidamente, com uma meia-vida de 1.1
horas. Quando o mesmo experimento foi feito em um meio contendo prolactina, a meia-vida
estendeu-se para 28.5 horas. (Segundo Guyette et al., 1979.)
mento (grex). Ao mesmo tempo, as caudas poli(A) dos mRNAs existentes no estágio
vegetativo são dramaticamente encurtadas. Como resultado, as mensagens recém-
transcritas são traduzidas, enquanto as mensagens pré-existentes não o são (Palatnik
et al., 1984). Esse mecanismo também foi observado em glândulas salivares na larva de
Drosophila (Restifo e Guild, 1986).
ESTABILIZAÇÃO HORMONAL DE RNAs MENSAGEIROS ESPECÍFICOS. Produtos

diferenciados de genes são freqüentemente sintetizados em resposta à indução
hormonal. Em alguns casos, hormônios não aumentam a transcrição de certas mensa-
gens, mas atuam a nível de tradução. Um desses casos envolve a síntese da caseína
por mamíferos em lactação. A caseína é a principal fosfoproteína do leite sendo, por
isso, um produto diferenciado da glândula mamária. Como será discutido mais
detalhadamente no Capítulo 19, a glândula mamária é preparada pela ação seqüencial
de vários hormônios. Prolactina, porém, é o hormônio responsável pela lactação – isto
é, a real produção do leite. A prolactina aumenta a transcrição de mensagens da caseína
somente cerca de duas vezes; seu principal efeito parece ser a estabilização do mRNA
da caseína (Guyette et al., 1979). A prolactina aumenta a longevidade da mensagem da
caseína fazendo com que ela exista por um tempo 25 vezes maior que a maioria das
outras mensagens na célula (Figura 12.14). Conseqüentemente, cada mRNA da caseína
pode ser usado para mais repetições da tradução. Dessa maneira, um número maior do
que o normal pode ser sintetizado de cada mensagem de caseína. A Tabela 12.2 resume
esses dados e mostra que outros hormônios também aumentam a estabilidade de
RNAs mensageiros específicos.
Controle da tradução de mensagens do oócito

Na maioria das espécies animais, o núcleo diplóide não é expresso imediatamente. A
evidência que o desenvolvimento precoce é controlado por fatores armazenados no
ou produzidos pelo oócito veio de diversos experimentos no fim do século XIX (revi-
sados por Davidson, 1976). Esses experimentos demonstraram claramente a dominância
de traços maternos durante o estágio inicial da embriogênese, e uma troca para carac-
terísticas paternas ou híbridas surgindo somente mais tardiamente no desenvolvi-
mento. Tais efeitos maternos de longo alcance já foram mencionados em nossa dis-
Tabela 12.2 Estabilização de RNAs mensageiros específicos pelos hormônios
mRNA Célula ou tecido Efetuador Meia-vida (horas)

Regulatório +Efetuador -Efetuador
Viteologenina Fígado de Xenopus Estrógeno 500 16
Albumina Fígado de Xenopus Estrógeno 10 3
Vitelogenina Fígado de ave Estrógeno 22 ~2.5
Apo VLDL II Fígado de ave Estrógeno 26 3
Caseína Glândula mamária de rato Prolactina 92 5
Hormônio do crescimento Culturas de célula Dexametasona e tiroxina 202
pituitária de rato
Insulina Células de ilhotas Glicose 77 29
pancreáticas de rato
Ovalbumina Oviduto de galinha Estrógeno, progesterona ~24 2-5
Fonte: Segundo Shapiro et. al., 1987.
cussão sobre a orientação da clivagem em embriões de lesmas, nos quais o citoplasma

do oócito contém um fator que direciona as rotações dos planos de clivagem nas
direções à direita ou à esquerda. [cleave1.html]
Caracterização de RNAs Mensageiros Armazenados em Oócitos
TIPOS DE mRNAS ARMAZENADOS EM OÓCITOS. Davidson e seus colegas avali-

aram a complexidade do mRNA do oócito de maneira semelhante àquela empregada em
sua análise da complexidade do RNA nuclear. RNA (em grande excesso) foi hibridizado
com DNA desnaturado, e a metade do valor Cot da hibridização foi encontrada ser
proporcional às quantidades das diferentes seqüências de RNA presentes. Por essa
análise, eles estimaram que cada oócito (em numerosos filos) tinha seqüências
nucelotídicas diferentes em número suficiente para se responsabilizar por aproximada-
mente 1600 cópias cada de 20.000 a 50.000 tipos de RNA (Galau et al., 1976; Hough-
Evans et al., 1977). Essa é a maior complexidade de mensagens de qualquer tipo de
célula conhecida, e isso reflete o enorme potencial do desenvolvimento do oócito.
Relativamente poucas dessas mensagens foram caracterizadas. Além disso, muitos
desses mRNAs não são utilizados no oócito, mas são armazenados e traduzidos após
a fecundação. Isso foi primeiro demonstrado usando inibidores da síntese protéica;
mais recentemente, ensaios de PCR e de proteção de RNase também mostraram a
existência de RNAs armazenados no oócito e primeiro traduzidos durante a maturação
(imediatamente antes e durante a ovulação), fecundação ou clivagem precoce. A Tabe-
la 12.3 apresenta uma lista parcial desses mRNAs armazenados. [RNA4.html]
Alguns desses RNAs são para proteínas que serão necessárias durante a
clivagem, quando o embrião produz quantidades enormes de cromatina, membra-
nas celulares e componentes do citoesqueleto. Uma das situações mais notáveis
é a armazenagem da informação necessária para produzir ribonucleotídeo redutase
para o embrião do molusco. A grande subunidade é armazenada como uma prote-
ína no citoplasma do oócito. A pequena unidade é armazenada como uma mensa-
gem materno não-traduzível. Somente após a fecundação, quando o mRNA para a
pequena subunidade tiver sido traduzida, pode a recém-sintetizada pequena
subunidade combinar-se com a grande subunidade pré-formada para gerar a enzima
funcional (Standart et al., 1986).
Alguns desses mRNAs armazenados regulam o período da divisão celular pre-
coce. Em muitas espécies (incluindo o ouriço-do-mar e a Drosophila) a taxa e o
padrão das divisões celulares precoces não requerem um núcleo. Ao contrário, eles
requerem síntese de proteína contínua a partir do mRNA materno armazenado
(Wagenaar e Mazia, 1978). A razão dessa dependência de mensagens armazenadas
foi mostrada em 1983, quando Evans e colegas acharam uma classe de proteínas que
Tabela 12.3 Alguns mRNAs armazenados no citoplasma do oócito

e traduzidos próximo ou na fecundação
mRNAs codificando Função(ões) Organismo(s)
Ciclinas Regulação da divisão Ouriço-do-mar, molusco,

celular estrela-do-mar, rã
Actina Movimento celular Camundongo, estrela-do-mar
e contração
Tubulina Formação de fusos Molusco, camundongo
mitóticos, cílios, flagelos
Pequena subunidade da Síntese de DNA Ouriço-marinho, molusco,
ribonucleotídeo redutase estrela-do-mar
Hipoxantina fosforil-transferase Síntese de purinas Camundongo
Vg1 Determinação Rã
mesodérmica (?)
Histonas Formação de cromatina Ouriço-do-mar, rã, molusco

Caderinas Adesão de blastômeros Rã
Metaloproteinases Implantação no útero Camundongo
Fatores de crescimento Crescimento celular;
crescimento de células Camundongo
uterinas (?)
Fator FEM-3 de Formação de espermatozóide C. elegans
determinação do sexo
Produtos gênicos PAR Segregam determinantes
morfogênicos C. elegans
Morfógeno SKN-1 Determinação do destino
do blastômero C. elegans
Morfógeno Hunchback Determinação do destino
do anterior Drosophila
Morfógeno Caudal Determinação do destino
do posterior Drosophila
Morfógeno Bicoid Determinação do destino
do anterior Drosophila
Morfógeno Nanos Determinação do destino
do posterior Drosophila
Morfógeno GLP –1 Determinação do destino
do anterior C. elegans
Proteína Germ cell-less Determinação da célula
germinativa Drosophila
Proteína Oskar Localização da

célula germinativa Drosophila
Ornitina transcarbamilase Ciclo da uréia Rã
Fator de alongamento 1α Síntese protéica Rã
Proteínas ribossômicas Síntese protéica Rã, Drosophila
Fontes: Compilado de numerosas fontes, incluindo Raff, 1980; Shiokawa et al., 1983; Rappollee
et al., 1988; Brenner et al., 1989; Standart, 1992.
chamaram ciclinas. Essas proteínas regulam a divisão celular (conforme discutido

no Capítulo 5) e são codificadas por mRNAs materno. O que é surpreendente sobre
as ciclinas é que elas são destruídas na divisão celular e têm que ser resintetizadas
a partir de mensagens armazenadas após o término de cada clivagem. A síntese de
ciclinas oriundas de mensagens estocadas é vista declinar à medida que o embrião
se aproxima do estágio de blástula.
Outras mensagens armazenadas codificam proteínas que determinam o desti-
no celular. As mensagens bicoid e nanos da Drosophila, o mRNA vg1 de Xeno-
pus, e o mRNA glp-1 de C. elegans são todas críticas para a determinação do
destino celular. Como veremos posteriormente neste capítulo, não somente o pe-
ríodo de sua tradução é crítico, como também o é a localização do mRNA quando
ele é traduzido.
(A) Figura 12.15

Demonstração de mensagens localizadas nos pólos animal e vegetal do
oócito de Xenopus. RNA foi obtido do ovo inteiro (T), do hemisfério
pigmentado animal (A) ou do hemisfério pigmentado vegetal (V) e separa-
do eletroforeticamente em gel. O RNA foi transferido para papel pelo
procedimento Northern, e o papel incubado com DNA radioativo de clones
derivados de cDNA complementar à mensagem do oócito. O DNA radioa-
tivo do clone An2 hibridiza para a mensagem presente no pólo animal, mas
não no pólo vegetal. A distribuição oposta é vista para a mensagem
hibridizando para o DNA do clone vg1. (B) Hibridização in situ mostrando
a mensagem vg1 em diferentes estágios de localização no oócito de Xeno-
pus. No oócito maduro, ela reside somente no córtex vegetal. (O RNA vg1
foi recentemente mostrado codificar um fator crítico para a determinação do
eixo dorso-ventral em vertebrados e será discutido mais extensamente no
Capítulo 15.) (A de Rebagliati et al., 1985, cortesia de D. Melton; B de
Melton, 1987.)
(B)
LOCALIZAÇÃO DE mRNAS ARMAZENADOS. Alguns mRNAs armazenados não são

uniformemente distribuídos no oócito (Rodgers e Gross, 1978). Rebagliati e colabora-
dores (1985) mostraram que enquanto a maioria das mensagens maternas é encontra-
da distribuída uniformemente através do ovo não-fecundado de Xenopus, alguns
mRNAS armazenados se localizam no pólo animal ou vegetal do citoplasma. Eles
extraíram RNA contendo poli(A) de oócitos e usaram transcriptase reversa e DNA
polimerase para converter os RNAs em uma população de DNAs de dupla fita. Esses
DNAs foram em seguida inseridos em vetores clonados e cultivados separadamente
em E. coli. Cerca de 2 milhões de clones foram derivados dessa maneira. O DNA
desses clones (a biblioteca do oócito de Xenopus) foi então transferido para dois
pedaços de papel de filtro e desnaturado sob condições de fornecer DNA de fita
simples. Em seguida, os investigadores cortaram o pólo animal ou vegetal do ovo e
extraíram o RNA contendo poli(A) dessas regiões. cDNAs radioativos foram produzi-
dos a partir dos RNAs, e um grupo e filtros contendo DNA foi incubado em cDNAs
das mensagens animal, enquanto o outro foi incubado em cDNAs das mensagens
vegetal. Quando a ligação de cDNAS radioativos foi medida, a maioria dos clones
ligaram quantidades iguais de cDNA dos pólos animal e vegetal, indicando que essas
mensagens estavam igualmente distribuídas. Porém, cerca de 1.2 porcento dos clones
somente ligaram cDNA produzido de mensagens do pólo animal, e cerca de 0.2 porcento
dos clones somente se ligaram ao cDNA derivado do mRNA do pólo vegetal.
O DNA dos clones específico para mensagens animal ou vegetal pôde, então, ser
usado para identificar os mRNAs localizados. RNA foi extraído de ovos inteiros ou
de seus pólos animal e vegetal e corrido em gel. Os RNAs foram separados
eletroforeticamente e foram transferidos para papel de nitrocelulose (transferência
Northern) e examinados com sondas de DNA radioativo para cada um dos clones
específicos para a região. Dois dos resultados estão mostrados na Figura 12.15 e
Prancha 8. A localização desses mRNAs em regiões específicas do ovo é conseguida
através do citoesqueleto e será detalhada nos Capítulos 13 e 20.
& Especulações
Determinando o Destino Celular por Meio do

mRNA Localizado do Oócito
M
UITAS DAS ATIVIDADES do RNA hunchback Figura 12.16
RNA nanos
RNA Controle da polaridade ântero-posterior em
desenvolvimento precoce ocor-
bicoid RNA oskar embriões de Drosophila pelo mRNA materno.
rem sem ativação do núcleo em- (A) As mensagens bicoid, nanos, oskar e
brionário. Já que a especificação dos eixos Anterior Posterior
hunchback são fornecidas ao ovo pelas células
embrionários é em geral um dos primeiros Localização do RNA nutrizes ovarianas. Elas são codificadas pelo
processos da embriogênese, durante mui- Poliadenilação de genoma materno. O mRNA oskar entra pri-
to tempo foi considerado que esses even- caudas de RNA para meiro, é transportado para o pólo posterior e é
bicoid, traduzido na meia oogênese, antes da chegada
tos poderiam ser regulados pelo mRNA
derepressão de nanos de outras mensagens. A mensagem bicoid é
materno. Nos anos recentes, isso foi de- amarrada no anterior do ovo pela sua 3’UTR. A
monstrado ser o caso. Gradiente Gradiente mensagem nanos é direcionada pela sua 3’UTR
O eixo ântero-posterior (cabeça-cauda) de proteína de proteína para ir ao pólo posterior, onde interage com a
da Drosophila é especificado principalmen- bicoide nanos proteína Oskar. O mRNA hunchback é visto
te pelas proteínas codificadas pelos genes (AJ P) (A I P) em todo o oócito. (B) Após fecundação e ativa-
ção do ovo, o mRNA bicoid é poliadenilado e
bicoid, nanos e hunchback (Figura 12.16). Nanos de liga à 3’
se torna ativo para tradução, formando um gra-
Embora suas atuações serão detalhadas de UTR hunchback
diente ântero-posterior da proteína Bicoid. O
maneira mais completa nos próximos capítu- mRNA nanos no pólo posteror torna-se com-
los, discutiremos suas regulações de tradu- petente para tradução e começa a produzir um
ção aqui. Primeiramente, os mRNAs de gradiente posterior-para-anterior da proteína
Nanos. (C) A proteína Nanos liga-se à 3’UTR
bicoid e nanos são transportados das célu- da mensagem hunchback para impedir a tradu-
Gradiente de proteína hunchback
las foliculares do ovário para dentro do ovo. ção. A proteína Bicoid liga-se a região intensifi-
O RNA bicoid permanece na região mais an- a mensagem nanos ligada no citoplasma cadora do gene hunchback para promover a
terior do oócito, enquanto a mensagem nanos posteror é traduzida (Gavis e Lehmann, transcrição de novas mensagens hunchback. O
vai para o pólo posterior do ovo. A mensa- 1994). O posicionamento correto dessa men- resultado é um gradiente íngreme da proteína
Hunchback. Essa proteína irá ativar diferentes
gem bicoid parece ser amarrada pelas suas sagem é também devido as suas 3’UTR e se
genes em diferentes concentrações, com isso
3’UTR aos microtúbulos anteriores pelos outros mRNAs (tal como aquele para a especificando as diferentes regiões do embrião.
produtos dos genes swallow e staufen (Fer- tubulina) tiverem sido dado a 3’UTR de
randon et al., 1994; veja Capítulo 22). A men- nanos, essas mensagens ficarão localizadas duzida em proteína que se mantém no pólo
sagem bicoid colocada no oócito tem uma no posterior do oócito. Quando traduzida, a posterior (Kim-Há et al., 1995). Tal como as
cauda poli(A) relativamente curta, de cerca proteína Nanos se difunde através da parte mensagens bicoid e nanos, sua localização
de 70 resíduos. Porém, dentro do primeiro posterior do embrião e especifica aquelas e momento de tradução dependem de sua
ciclo de divisão, a mensagem é poliadenilada células que a rétem para tornarem-se abdo- 3’UTR. Os mRNAs nanos e oskar têm ex-
de maneira a sua cauda quase dobrar de ta- minais. A mensagem nanos parece ser repri- tensões relativamente curtas de poli(A) que
manho (Sallés et al., 1994; Lieberfarb et al., mida durante a tradução pela ligação da pro- não são significativamente alongadas quan-
1996). Essa poliadenilação coincide com a teína Smaug a dois sítios em sua 3’UTR do as mensagens se tornam traduzíveis. Isso
capacitação da mensagem bicoid ser tradu- (Smibert et al., 1996). Essa repressão é sugere que há ao menos dois mecanismos
zida. A proteína Bicoid se difunde através da abolida uma vez que o mRNA nanos se lo- de ativação das mensagens materna em
porção anterior do embrião precoce, sendo caliza no pólo posterior. A proteína Oskar ovos de Drosophila (Salles et al., 1994). O
responsável pela especificação das regiões pode estar aqui envolvida na ligação da men- primeiro depende da posição, e não envol-
da cabeça e tórax da larva de Drosophila. Os sagem nanos ao citoesqueleto, e a proteína ve o crescimento da cauda poli(A) (p.ex.,
produtos dos genes cortex e grauzone pare- Vasa pode atuar como helicase para desen- oskar e nanos). O segundo independe da
cem ser críticos para a poliadenilação do rolar o RNA (Lian et al., 1994). A proteína posição e requer síntese de poli(A) (bicoid,
mRNA bicoid porque mutações nesse gene Oskar propriamente é regulada por tradu- e também mensagens de Toll e torso).
previnem a poliadenilação e tradução da men- ção. Porém, em contraste com a mensagem As proteínas Bicoid e Nanos realizam
sagem bicoid. nanos, que é traduzida após a fecundação, suas funções regulando a síntese da prote-
O mRNA nanos está localizado no pólo o mRNA oskar é sintetizado e transportado ína Hunchback. Essa irá finalmente especi-
posterior do ovo durante a oogênese, mas para o interior do oócito precocemente na ficar a cabeça e o tórax da mosca de uma
quantidades significativas permanecem dis- oogênese e fica localizado no pólo posteri- maneira dependente da concentração. A pro-
tribuídas através do citoplasma. Durante o or durante os estágios medianos da oogê- teína Bicoid (agora ativa no anterior) age
desenvolvimento precoce, porém, somente nese. Uma vez localizada, a mensagem é tra- como um fator de transcrição para ativar o
gene hunchback, produzindo assim mais (A)

mRNA hunchback
mensagem hunchback e proteína no ante-
rior do embrião. A proteína Nanos, porém, Poly (A)
trabalha ao nível de tradução para inibir a
produção da proteína Hunchback a partir
do mRNA hunchback existente. Isso cria um
gradiente pelo qual a síntese da proteína
Hunchback é aumentada no anterior do
embrião e ativamente reprimida no posteri- mRNA glp-1
or (Wharton e Struhl, 1991; Wang et al., Poly (A)
1994). A 3’ UTR do mRNA contém vários
sítios que ligam dois fatores (Pumilio e uma
proteína de 55-kDa) que por si não bloque- Figura 12.18
iam a tradução. Porém, essas duas proteínas (B) Semelhanças na a regulação de mRNAS
parecem formar uma “sítio de aterrisagem” Hunchback GLP-1 (C. hunchback e glp-1 através de suas 3‘UTRs.
para a proteína Nanos. Quando Nanos se (Drosophila) elegans) (A) A 3’UTR da mensagem hunchback con-
tém várias regiões consideradas essenciais para
liga, a tradução do mRNA hunchback é inibi- a ligação de Nanos e a supressão da tradução.
da (Murata e Wharton, 1995). Esses “elementos de resposta nanos” consis-
A proteína Bicoid também trabalha a tem nos motivos GUUGU e AUUGUA. Os
nível de tradução para bloquear a síntese mesmos elementos podem ser vistos na
3’UTR da mensagem glp-1. (B) Modelo para
Proteína a regulação da tradução de hunchback e glp-1.
mRNA Ambas mensagens estão distribuídas unifor-
glp-1 Proteína
GLP-1 memente através do ovo e embrião precoce.
Anterior Posterior da proteína Caudal. Como Nanos, a prote- Em ambos os casos, a mensagem é reprimida
ína Caudal é crítica para o estabelecimento na parte posterior do embrião. O regulador da
dos segmentos posteriores da mosca, mas tradução hunchback é a proteína Nanos locali-
ao contrário da mensagem nanos, o mRNA zada posteriormente. O regulador da tradução
de glp-1 ainda não é conhecido mas pode ser a
caudal materno é distribuído uniforme- proteína PAL-1. (Segundo Evans et al., 1994.)
mente através do ovo da Drosophila. A
proteína Bicoid liga-se à 3’UTR do mRNA especificar destinos das células anteriores
caudal, impedindo-o de ser traduzido na (veja Capítulo 17). Ela é ativa entre os está-
parte anterior do embrião (Dubnau e Struhl, gios de clivagem de 4 – 28 células. Colora-
1996). Os mecanismos pelos quais a regu- ção por anticorpos mostra que as únicas
lação gênica da tradução determina o eixo células que contêm essa proteína são os
ântero-posterior do embrião de Drosophi- descendentes da célula anterior do estágio
la serão detalhados no Capítulo 14. de 2 células. Porém, hibridização in situ mos-
Isso parece ser uma solução exeqüível trou que a mensagem materna para essa pro-
para a especificação axial quando o embrião teína é encontrada em todas as células do
do estágio precoce de clivagem permanece embrião (Figura 12.17). A célula posterior do
um sincício que permite a formação de tais estágio bicelular e sua progênie parecem ter
gradientes. Porém, experimentos recentes um inibidor da tradução do RNA glp-1. Esse
(Evans et al., 1994) mostraram que tal con- inibidor não foi ainda encontrado, mas o
Figura 12.17 trole da tradução da especificação celular seqüenciamento das 3’UTR mostrou que o
Comparação entre a localização da proteína também pode ocorrer em embriões que for- mRNA gip-1 tem uma 3’UTR com as mes-
GLP-1 e a mensagem glp-1. A mensagem glp- mam células logo após a fecundação. No mas seqüências que reconhecem Pumilio e
1 materna é encontrada através do desenvolvi- nematódeo C. Elegans, muito da embriogê- Nanos (Figura 12.18). Assim, as células an-
mento precoce em cada célula do embrião de C.
elegans. A proteína GLP-1, porém, é vista so- nese precoce depende da proteína GLP-1. teriores de C. Elegans, tal como as de Dro-
mente na progênie da célula anterior formada na Essa é um receptor da superfície da célula sophila, são especificadas pela regulação
primeira divisão. (Segundo Evans et al., 1994.) que recebe sinais de células posteriores para gênica da tradução.
Mecanismos para a regulação

da tradução das mensagens dos oócitos
No Capítulo 4, vimos evidência de que o oócito contém RNAs mensageiros que esta-
vam presentes mas não traduzidos até a fecundação ou ativação do oócito (como na
ativação da progesterona da rã pouco antes da fecundação). Há atualmente ao menos
5 mecanismos que regulam a tradução do mRNA do oócito. Três deles envolvem a
disponibilidade de mRNAs; os outros dois envolvem a eficiência da tradução do

mRNA. A maioria das espécies provavelmente usa mais de um mecanismo para
regular a tradução do mRNA do oócito. A pergunta fundamental é, Como são recru-
tados os mRNAs para os polissomos? Embora o oócito e os blastômeros precoces
contenham a mesma população de mensagens, diferentes subconjuntos estão sen-
do traduzidos no ovo e no embrião (Young e Raff, 1979; Mermod et al., 1980; Rosenthal
et al., 1990; Taylor e Smith, 1985). A pergunta então se torna, Como mRNAS que
estavam dormentes no citoplasma do oócito repentinamente adquirem a competên-
cia de serem traduzidos?
A Hipótese da Mensagem Materna Mascarada
Essa hipótese sustenta que as mensagens do oócito estão mascaradas fisicamente

pelas proteínas, prevenindo os mRNAs se prenderem aos ribossomos. Na matura-
ção ou fecundação, as proteínas mascaradoras se desligariam, permitindo ao mRNA
ser traduzido. RNA mensageiro nunca é encontrado sem proteínas. Porém, o tipo de
proteína associada com o RNA pode variar. Spirin, em 1966, propôs que o mRNA do
oócito é estocado em informossomos (informosomes), complexos de ribonucleo-
proteínas nos quais o mRNA está mascarado. As mensagens mascaradas seriam
incapazes de se ligar aos ribossomos, e assim não seriam traduzidas. Na fecundação,
as proteínas mascaradoras seriam liberadas (possivelmente devido às alterações
iônicas ocorrendo durante a fecundação) e a mensagem estaria livre para iniciar a
tradução. Apoio para essa hipótese apareceu rapidamente. Em 1968, Infante e Nemer
acharam que o ovo não-fecundado do ouriço-do-mar contém partículas de RNP que
sedimentam mais lentamente que os ribossomos, e Gross e colaboradores (1973)
acharam que essas partículas contêm vários mRNAs.
Apoio para a hipótese da mensagem materna mascarada veio de experimentos
mostrando que enquanto o mRNA do ovo não-fecundado estocado em RNPs não
pode ser traduzido, os mesmos RNAs podiam ser traduzidos se seus RNPs fossem
colocados em soluções mimetizando o estado iônico mudado do ovo após a fecunda-
ção (Jenkins et al, 1978; Raff, 1980). Foi proposto que o influxo de sódio durante a
fecundação poderia desestabilizar a partícula de RNP, permitindo assim a tradução de
seu mRNA. Tal desmascaramento poderia estar ocorrendo no molusco bivalve Spisula,
no qual os mRNAs codificando a pequena subunidade de ribonucleotídeo redutase e
ciclina A são severamente reprimidos nos oócitos, e eles não são traduzidos até a
fecundação. Dois procedimentos podem “desmascarar” essas mensagens. Primeiro,
altas concentrações de sal (KCL 0,5 M) permitem a esses mRNAs produzir proteínas;
assim também o faz a remoção de certas seqüências de bases nas regiões 3’ não-
traduzidas dessas mensagens (Figura 12,19; Standart et al., 1990). Há regiões nas
3’UTRs de ambas mensagens que são muito semelhantes, podendo constituir sítios
de ligação para uma proteína de 82-kDA que se liga à 3’UTR desses mRNAs (Standart,
1992). Na fecundação, essa proteína é fosforilada, e parece que a forma fosforilada não
pode mais bloquear a tradução. A fosforilação dessa proteína poderia ser conseguida
pela quinase cdc2 que é ativada na fecundação (Walker et al., 1996).
Outro apoio para a hipótese da mensagem mascarada vem da análise da tradução
da mensagem codificando o receptor-1 do fator de crescimento do fibroblasto de
Xenopus. Essa mensagem está presente, mas não é traduzida em oócitos em cresci-
mento. Ela começa a ser traduzida quando a progesterona inicia a maturação meiótica.
Robbie e colaboradores (1995) mostraram que a nova tradução não depende do
alongamento da cauda poli(A) nem da translocação da mensagem. Ao contrário,
parece haver uma proteína de 43-kDA que está associada com a 3’UTR do mRNA
Xfgfr1 e que possivelmente é removida quando a progesterona estimula a maturação
do oócito. Essa associação estoca o RNA 5S sob uma forma inativa até ser mais
tarde incorporado em novos ribossomos. Oócitos de anfíbios contêm proteínas
específicas que se ligam a alguns mRNAs mas não a outros (Richter e Smith, 1984;
(A) (B)
Extrato RNA KCI
RNA
antisenso (ug/ml)
Figura 12.19
Desmascarando a pequena subunidade da ribonucleo-
Peso molecular (KDa)
tídeo redutase (RR) em oócitos de moluscos. (A) A

mensagem RR do molusco está presente mas não é
traduzida nos oócitos. Extratos de oócitos (pista 1) ou
ovos ativados (pista 2) foram misturados com
ribossomos, fatores de tradução, aminoácidos radioati-
vos e traduzidos in vitro. As proteínas foram corridas
em um gel, e auto-radiografadas. A proteína RR é
produzida no extrato do ovo, mas não no extrato do
oócito. Quando o mRNA dos oócitos (Pista 3) e dos
ovos (pista 4) foram isolados e separados de todas as
proteínas (por extração com fenol), a mensagem RR foi
traduzida em ambos os casos. (B) O grau de
desmascaramento depende da presença de uma alta con-
centração de sal ou da adição de mRNA antisenso, que
bloqueia o sítio ligante de proteína da 3’UTR. (Segun-
do Standart et al., 1990.)
Audet et al., 1987; Swiderski e Richter, 1988), mas não é sabido se essas proteínas
mascaram funcionalmente RNAs endógenos. É possível que essas proteínas facili-
tem a ligação de uma proteína mascaradora de RNA geral que se associaria com o
mRNA fazendo com que ele fique intraduzível. A proteína FGRY2 ativa em oócitos de
Xenopus poderia ser uma tal proteína mascaradora geral (Bouvet e Wolffe, 1994).
Essa proteína se complexa com certos transcritos de oócitos que estão sendo trans-
critos no núcleo e é capaz de silenciar tais mensagens. O “desempacotamento”
global de tais mensagens na fecundação pode envolver alterações iônicas, a fosfo-
rilação de certas proteínas, ou mudanças na composição do RNP.
A Hipótese da Cauda Poli(A)
Estudos recentes demonstraram que a poliadenilação alterada é crítica para esta-

belecer o momento da tradução do mRNA do oócito e que essa poliadenilação alterada
é regulada pela região 3’ não-traduzida.
A 3’UTR pode regular a eficiência da tradução de mensagens do oócito contro-
lando o tamanho da cauda poli(A). Em oócitos, o encurtamento dessa cauda não
condena a mensagem à extinção. Apenas reprime sua capacidade de ser traduzida
(Hyman e Wormington, 1988). Essa repressão muitas vezes é temporária. Em oócitos
de camundongo, aqueles mRNAs que estão sendo usados para o crescimento e
metabolismo do oócito retêm suas longas caudas poli(A) e são imediatamente tradu-
zidos. Entretanto, aqueles mRNAs que deverão ser estocados no oócito para tradu-
ção na maturação meiótica (logo antes da ovulação) ou na fecundação tendem a
perder a maior parte da suas caudas poli(A) quando entram no citoplasma. Esses
Núcleo
Oócito
mRNA nuclear poliadenilado
Remoção da
cauda poli(A)
Mensagem Mensagem Cauda poli(A)
Oócito primário
imaturo e em
crescimento
Dormente Ativamente traduzido
Recomeço da
meiose Adenilação Desadenilação
Cauda poli(A)
Oócito em
maturação
Ativamente traduzido Dormente
Figura 12.20
Modelo para a regulação da tradução dos mRNAs do oócito do camundongo. Os mRNAs a
serem usados no metabolismo do oócito têm seqüências de poliadenilação em suas 3’UTRs e
retêm suas caudas poli(A). Esses mRNAs são traduzidos até a maturação meiótica (logo antes da
ovulação), quando perdem suas caudas poli(A). Aqueles mRNAs que permanecem
traducionalmente dormentes até a maturação meiótica têm elementos de poliadenilação citoplas-
mática (CPEs), assim como suas seqüências de poliadenilação, e eles perdem suas caudas
poli(A) no citoplasma do oócito imaturo. Quando a maturação meiótica começa, as caudas são
restauradas e a tradução dessas mensagens é iniciada.
RNAs somente retêm entre 15 e 90 resíduos de adenilato (Figura 12.20). Na matura-

ção meiótica, uma inversão ocorre. Aqueles mRNAs que haviam sido ativamente
traduzidos perdem suas caudas poli(A) e não mais funcionam, enquanto aqueles
mRNAs pouco adenilados que haviam sido estocados, rapidamente adquirem lon-
gas caudas poli(A) (150 a 600 adenilatos) e são traduzidos em proteínas (Vassalli et
al., 1989; Huarte et al., 1992).
Em mamíferos, as mensagens que são traduzidas no oócito imaturo têm uma se-
qüência padrão AAUAAA de poliadenilação. Essas mensagens retêm suas caudas
poli(A) até o recomeço da maturação meiótica. Nesse momento, suas caudas são
desadeniladas, e se tornam inativas para a tradução. Aqueles mRNAs que irão ser
estocados no citoplasma do oócito imaturo para tradução após a maturação têm suas
caudas poli(A) cortadas imediatamente após abandonarem o núcleo. Essas mensa-
gens tem dois sinais em suas 3’UTR: a seqüência de poliadenilação AAUAAA e uma
seqüência conhecida como o elemento de poliadenilação citoplasmática (CPE), tam-
bém chamado de elemento de controle da adenilação (ACE); sua seqüência consensual
em camundongos e rãs é UUUUUAU (Fox et al., 1989; Bachvarova, 1992; Huarte et al.,
1992). Quando recomeça a maturação do oócito, esses transcritos estocados são
novamente poliadenilados (provavelmente pela mesma enzima de poliadenilação en-
contrada no núcleo) e tornam-se ativos para tradução. A aquisição de uma longa
cauda é crítica para o começo da tradução do mRNA estocado do oócito; o controle
desse alongamento depende da presença ou ausência de um CPE.
Em oócitos de Xenopus, a história é semelhante porém com algumas variações.*

Tal como os mRNAs de oócitos de mamíferos, uma longa cauda poli(A) é necessária
para a tradução da mensagem. Uma troca na tradução de RNA ocorre durante a
maturação. Quando a vesícula germinativa (o núcleo haplóide) se desintegra para
iniciar a divisão meiótica, liberam-se fatores de desadenilação. Os mRNAs sem CPEs
são desadenilados, enquanto as mensagens contendo CPEs são capazes de ser
poliadeniladas (Fox e Wickens, 1990; Varnum e Wormington, 1990; Varnum et al.,
1992). Tanto a seqüência de adenilação como o CPE são necessários para a ativação
da tradução dessas mensagens, mas em alguns casos, a presença per se de uma
cauda poli(A) não é suficiente. Nesses casos o processo de poliadenilação é crítico
para a tradução da mensagem. Isto é, um mRNA injetado com uma cauda poli(A) pré-
existente não será traduzido. É possível que o processo da poliadenilação também
remova um inibidor protéico que mascara a mensagem (Fox et al., 1989; McGrew et
al., 1989). Existem algumas diferenças entre os CPEs, e essas diferenças podem pro-
duzir diferentes padrões de poliadenilação nas mensagens que os contêm (Paris e
Richter, 1990). Por exemplo, um certo CPE com um trecho de 12 bases U inibe a
poliadenilação daqueles mRNAs que os contêm, durante o período de maturação do
oócito. Porém, após a fecundação, os mRNAs contendo esse CPE são poliadenilados
e traduzidos em proteínas (Simon et al., 1992).
Isso sugere que há fatores específicos que se ligam a esses CPEs em diferentes
períodos. Joel Richter e colaboradores (Paris et al., 1991; Hake e Richter, 1994) de-
monstraram que uma proteína do oócito de 58k-Da, CPEB, se liga a um CPE específico
(UUUUUAAU). Essa proteína foi isolada por cromatografia de afinidade de RNA, na
qual proteínas do oócito de Xenopus foram incubadas com partículas de sefarose
ligada a RNAs contendo um CPE com a seqüência UUUUUAAU. A ligação de CPEB
a esse CPB previne a poliadenilação e pode inibir a tradução dessas mensagens até a
maturação do oócito (logo antes da fecundação). Nesse momento, CPEB é fosforilada
por quinase cdc2. (A quinase cdc2 é ativada pela progesterona, que estimula o oócito
a reiniciar a meiose antes da fecundação.) Essa fosforilação parece permitir a CEPB
recrutar uma polimerase poli(A) citoplasmática para a mensagem (Ballantyne et al.,
1995; Gebauer e Richter, 1995). Essas mensagens ficam poliadeniladas e são subse-
qüentemente traduzidas.
A quinase cdc2 (conforme lembramos do Capítulo 5) somente é ativa quando
complexada com uma ciclina. As proteínas ciclinas também estão sob regulação para
tradução, e as 3’UTRs dos mRNAs das ciclinas determinam os momentos que elas
serão traduzidas. Em oócitos de Xenopus, os mRNAs para ciclinas A1, B1 e B2 têm
todos, caudas poli(A) truncadas. Cinco horas após o sinal de progesterona (na
primeira metáfase meiótica), as caudas poli(A) dessas mensagens de ciclina são
alongadas, e começa sua tradução (Sheets et al., 1994). Isso demonstra que avisos
desenvolvimentais podem regular qual conjunto de mRNAs deve tornar-se funcio-
nal. Isso mostra também que existem cascatas de regulação gênica da tradução
durante as horas precedendo a ativação do núcleo.
A ativação de mensagens pela poliadenilação parece ser um processo de im-
portância crítica no desenvolvimento. No entanto, ainda não sabemos porque
caudas poli(A) curtas não são capazes de iniciar a tradução, enquanto caudas
*As funções das seqüências poli(A) e CPEs diferem entre oócitos de camundongo e de rã. Nos
oócitos de rã, a desadenilação que ocorre na maturação é o “estado de ausência”, e desadenilação
e inativação para tradução ocorrem, a não ser que CPE esteja presente. A poliadenilação irá ativar
a mensagem mascarada e manter a tradução dos mRNAs associados aos polissomos. Em oócitos
de camundongo, o CPE controla tanto a poliadenilação como a desadenilação. Em oócitos
imaturos, mensagens sem CPE são imediatamente traduzidas, enquanto mRNAs contendo CPE
são desadenilados e inativados para a tradução. Na maturação, o sistema do camundongo torna-se
semelhante ao de Xenopus, e os RNAs contendo CPE são agora poliadenilados e ativados para
tradução (Huarte et al., 1992).
Figura 12.21
Evidência da ineficiência da síntese protéica em níveis de pH pré-fecundação. O sistema de
[3H] Valina incorporada na proteína (cpm x 10–3)
tradução in vitro feito de ovos não-fecundados é mantido a pH 6.9 ou dializado para pH 7.4.
Mensagens endógenas são traduzidas muito mais eficientemente no pH pós-fecundação. (Se-
gundo Winkler e Steinhardt, 1981.)
maiores o podem. Uma possibilidade (Kuge e Richter, 1995) é que a adição de

3’poli(A) estimula a metilação do “cap” 5’. Eles encontraram que a maturação
meiótica estimulada por progesterona causava a metilação de “caps” de mRNA, e
que essa metilação podia ser inibida prevenindo-se a poliadenilação. Assim, os
terminais 3’ e 5’ da mensagem parecem interagir. Outra possibilidade (Hentze, 1997)
é que a cauda poli(A) se ligue a um fator de inibição na subunidade ribossômica
40S para estimular a tradução.
A Hipótese da Eficiência da Tradução
Tempo (minutos) Os modelos precedentes da regulação da tradução assumem que o aparelho de

tradução é capaz de traduzir eficientemente qualquer mensagem, mas que o mRNA
e os ribossomos são conservados separados por meios físicos ou químicos. Isso
não precisa ser o caso. O baixo pH inicial do oócito é por si mesmo capaz de
impedir a síntese protéica. Conforme discutido no Capítulo 4, há uma dramática
liberação de íons de hidrogênio durante a fecundação do ovo do ouriço-do-mar,
resultando em uma elevação do pH citoplasmático. Quando Winkler e Steinhardt
(1981) aumentaram o pH de um lisado de oócitos (pH 6.9) para aquele do zigoto
(pH 7.4), eles obtiveram um surto de síntese de proteína semelhante aquele obser-
vado durante a fecundação (Figura 12.21).
Hille e colegas (1985; Danilchik et al., 1986) sugeriram que a mudança de pH ativa
o aparelho de tradução do ovo. Ribossomos e fatores de iniciação derivados de
ovos não-fecundados eram menos ativos na tradução que aqueles derivados de
ovos fecundados. Ainda mais, a injeção de mensagem exógena de globina em ovos
não-fecundados não aumentou a quantidade de proteína sendo sintetizada. O mRNA
da globina estava sendo traduzido às custas de outras mensagens, sugerindo que
há uma quantidade limitada de alguma porção do aparelho tradutor. O fator limitante
é, provavelmente, um fator iniciador da tradução. A adição de eIF2B (o fator reciclante
ligante de GTP) ou eIF4F (que contém proteínas cap ligantes) a um lisado preparado
de ovos não fecundados aumentou a eficiência tradutora desse lisado (Colin et al.,
1987; Lopo et al., 1988). A alcalinização do citoplasma do ovo pode servir tanto para
desmascarar o mRNA (fisicamente ou através da poliadenilação) como para ativar
fatores de iniciação. Apoio para essa noção vem de Winkler e colegas (1985; Kelso-
Winemiller e Winkler, 1991), que viram aumentar de três vezes a ligação do mRNA a
ribossomos após elevação do pH.
Outros sistemas de ativação do mRNA:

Mensagens sem “Cap” e Mensagens Seqüestradas
mRNA SEM “cap”. Os terminais 3’ e 5’ modificados do RNA mensageiro são necessá-

rios para a tradução eficiente. Já vimos como diferenças no comprimento da cauda
3’poli(A) pode efetuar tradução diferencial de RNA em oócitos de Xenopus e Spisula.
Certas mariposas usam um mecanismo para controle de tradução envolvendo mu-
danças no “cap” 5’ (Kastern et al., 1982). Para serem traduzidas eficientemente,
quase todas as mensagens eucarióticas necessitam de um “cap” de 7-metilguanosina
em seus terminais 5’ (Shatkin, 1976). As mensagens armazenadas da lagarta chifruda
do tabaco têm um “cap” não-metilado. A guanosina está presente, mas o grupo
metila não foi adicionado. Tais mensagens não são traduzidas em proteínas em um
sistema livre de células. Porém, na fecundação, há um surto de metilação nesses
oócitos, e o “caps” são completados. Os mRNAs com os “cap” completos são então
capazes de se ligar aos ribossomos e iniciar a tradução. Dados sobre mensagens
artificiais sugerem que estruturas secundárias (como alças tipo grampos de cabelo)
na região 5’ não-traduzida, também podem regular o período da tradução do RNA no
oócito (Fu et al., 1991).
mRNA SEQÜESTRADO. Em alguns casos, o aparelho sintetizador de proteínas está

compartimentalizado, impedindo que o mRNA (dentro do RNP) chegue perto dos
ribossomos (Moon et al., 1982). Os mRNAs das histonas do oócito do ouriço-do-
mar parecem ser regulados por esse tipo de restrição. As mensagens de histona do
oócito não são encontradas no citoplasma. Em lugar disso, estão localizadas no
grande pronúcleo do ovo não-fecundado. Somente quando o pronúcleo se desinte-
gra no fim da fecundação, o mRNA da histona entra no citoplasma (Figura 12.22; De
Leon et al., 1983). Isso pode não ser o caso para outras mensagens. Menos de 0.1
porcento do mRNA total do ovo não-fecundado se encontra no pronúcleo (Angerer
e Angerer, 1981; Showman et al., 1982). A observação de que algumas mensagens
maternas assim como ribossomos individuais estão ligadas ao citoesqueleto (Moon
et al., 1983) sugere que o citoesqueleto também pode separar mRNAs dos ribossomos.
É possível que todos esses mecanismos de controle da tradução sejam utilizados no
mesmo oócito. O ovo desenvolveu numerosos meios de regular a tradução do seu
mRNA armazenado, e as espécies estão habilitadas a usar vários desses mecanis-
mos ao mesmo tempo.
70 minutos 80 minutos
80 minutos 90 minutos
Figura 12.22
Seqüestro das mensagens de histona do oócito do ouriço-do-mar. A sonda de cDNA que reco-
nhece a mensagem da histona é hibridizada para ovos de ouriço-do-mar fixados em vários
períodos pós-fecundação. A auto-radiografia mostra a mensagem a ser seqüestrada no pronúcleo
materno até sua degradação 80-90 minutos após a entrada do espermatozóide. (Segundo DeLeon
et al., 1983, cortesia de L. e R. Angerer.)
& Especulações
A Ativação do Genoma Embrionário

O PERÍODO de eventos do desen-
Síntese de RNA (grãos por núcleo) (o)

volvimento difere enormemente
Densidade da banda de tRNA (■)

entre espécies animais. Vinte e
Fração de células móveis (●)

Fração de células
quatro horas após a fecundação, larvas de com membranas
Drosophila eclodiram e estão ocupadas móveis
comendo; embriões de anfíbios estão ou
nos estágios de gástrula tardia, ou nêurula
precoce; e o embrião do ouriço-do-mar é
uma blástula tardia ou gástrula precoce Densidade da banda
com centenas de células. Embriões de ma-
Síntese de RNA
míferos não se apressam. Após 24 horas
de desenvolvimento, um zigoto de camun-
dongo somente se dividiu uma vez, e o ovo
humano ainda tem 6 horas até sua primeira Clivagem
clivagem. Os organismos também diferem Tempo (minuto)
no período e aspereza, da transição do con-
trole citoplasmático para a regulação do Figura 12.23
desenvolvimento pela transcrição nuclear. Ativação da transcrição e motilidade da membrana em Xenopus após a décima segunda divisão.
A transcrição foi avaliada por auto-radiografia, pelo número de grãos de prata sobre os núcleos
Na maioria das espécies estudadas, o em- de embriões imersos em uridina radioativa e pela ativação de um gene de tRNA clonado, cujo
brião precoce é um “mundo de RNA” onde produto radioativo podia ser analisado medindo-se a densidade da banda no gel auto-radiografa-
o genoma nada conta (Wickens, 1992). Em do. A motilidade foi avaliada determinando-se a fração de células mostrando pseudópodos ou
outros embriões, a transcrição nuclear se vesículas em registros de vídeo. (Segundo Davidson, 1986).
inicia logo após a fecundação, e novos pro-
dutos dos genes são vistos durante o pri- sição na blástula intermediária, o desenvol- senvolvimento. Ele liga-se à uma seqüência
meiro ciclo celular (Tabela 12.4). vimento emprega os materiais estocados no de DNA de 14 pares de bases encontrada
Embriões de Xenopus parecem se de- citoplasma do oócito. Finalmente, a trans- nos promotores de vários genes que são
senvolver através do estágio de clivagem crição é iniciada no núcleo do embrião. Após acionados no momento, ou pouco depois
sem necessidade de transcrição nuclear. a transição da blástula intermediária, dife- da transição da blástula intermediária
Conforme mencionado no Capítulo 5, o nú- rentes genes são acionados em momentos (Ovsenek et al., 1992). Se outros genes
cleo é essencialmente inativo até a “transi- diferentes, mas os genes ativados primeiro (como o gene β-globina de Xenopus) esti-
ção da blástula intermediária” ao fim da 12ª podem estar sendo ativados por fatores ma- verem conectados a essa seqüência, eles
divisão celular (Figura 12.23; Newport e ternos no oócito. A proteína OZ1 é um fator ficarão expressos na transição da blástula
Kirschner, 1982). Até o momento dessa tran- de transcrição produzido no oócito em de- intermediária; porém, se a seqüência for
Tabela 12.4 Ativação de genomas embrionários e duração do mRNA materno funcional
Período da primeira transcrição Período da maior Longevidade da

Organismo observável do núcleoa nova transcrição nucleara mensagem materna funcional
Mamífero Estágio tardio de 1-célula (11-17 h) Mórula precoce de 8-16 células Estágio de clivagem
(Mus musculus) (dia 3) de 4 células (dia 2-4)
Anfíbio Clivagem precoce ( 32 células) da 12a clivagem (4000 células) Estágio de nêurula
v
(Xenopus laevis) blástula intermediária (3 h) da blástula intermediária (7 h) (15-30 h)

Equinodermo Zigoto (estágio pronuclear) Blástula intermediária Blástula tardia
(S. purpuratus e ( 0.5 h) (~128 células) (11h) (15 h)
v
outros ouriços-
do-mar)
Inseto Blastoderma sincicial após a Blastoderma celular após a Organogênese intermediária
(Drosophila 10a divisão nuclear (2.5 h) 14a divisão nuclear (3.5 h) (~15 h)
melanogaster)
Fonte: Adaptado de Wilt, 1964; Woodland e Ballantine, 1980; Clegg e Piko, 1983; Gilbert e Solter, 1985; Poccia et al., 1985; Weir e Kornberg,
1985; Davidson, 1986; Edgar e Schubiger, 1986; Shiokawa et al., 1989.
a Períodos indicam incubação nas temperaturas apropriadas.
mutada eles não serão corretamente expres-

sados (Figura 12.24). É possível que essa
Auto-radiograma Sem molde
proteína OZ1 seja por si mesma inativa, até
que algum outro fator (talvez associado com
o alongamento do ciclo celular) a ative.
O conceito de que proteínas maternas
Sem intensificador MBT β−globina
podem ativar o genoma durante a transição
da blástula intermediária é apoiado por in-
vestigações sobre o mutante o da salaman-
dra axolotle. Essa é uma mutação de efeito Intensificador MBT
β−globina
materno no qual fêmeas homozigotas pro- tipo selvagem
duzem ovos que são fecundados com su-
cesso sendo completamente normais até os
estágios de clivagem tardia e blástula pre- Intensificador
MBT mutante β−globina
coce (Briggs e Cassens, 1966). Na blástula
intermediária, ovos descarregados por uma
fêmea o/o têm mitoses mais lentas e conti-
nuam a formar um lábio do blastóporo dor- Outro intensificador
MBT mutante β−globina
sal, mas sempre param na gastrulação.
Malacinski (1971) e Carroll (1974) mostra-
ram que em embriões de fêmeas do tipo sel-
vagem, RNA novo e síntese protéica come- Figura 12.24
çam nesse estágio de blástula intermediária. Efeito do intensificador da transição da blástula intermediária (MBT) ligante de OZ1. A seqüên-
No entanto, as blástulas intermediárias de cia de DNA que ativa a transcrição na MBT para o gene GS17 de Xenopus laevis foi colocada
em um gene da β-globina e injetada em oócitos de Xenopus. Essa construção de globina ficou
ovos de mães o/o não sofrem esse surto de expressa no estágio de blástula intermediária. Genes de globina sem esse intensificador ou com
síntese de proteína e têm um padrão de pro- um intensificador MBT mutado não mostraram expressão significativa nesse estágio. (Segundo
teínas idêntico aquele produzido por zigotos Ovsenek et al., 1992.)
enucleados (Figura 12.25). Briggs e Cassens
dendo-se artificialmente o período G2 de Ouriços-do-mar não apresentam uma
(1966) demonstraram que os embriões de
embriões jovens com cicloheximida. Essa transição da blástula intermediária distin-
mães o/o não tinham um fator que ativa o
ativação pode ser conseguida com embri- ta. Embora seus ovos enucleados possam
genoma nuclear da blástula intermediária. Na
ões tão jovens como os do décimo ciclo, se desenvolver através dos estágios de
ausência de tal fator, o único desenvolvimento
mas não antes. Parece, portanto, que a mai- blástula, e embora certamente há um sur-
que ocorre é aquele que pode ser provido
oria dos genes ficam capacitados para a ati- to de transcrição nuclear a partir dos nú-
pelo mRNA estocado no oócito. Em anfíbi-
vação durante o ciclo 10, mas não iniciam cleos da blástula intermediária, não pare-
os, há material estocado no oócito suficiente
sua transcrição até o ciclo 14. ce haver período no desenvolvimento do
para permitir ao embrião entrar na gastrula-
ção. Porém, sem a síntese de novo RNA, não
pode ocorrer ulterior desenvolvimento.
Em Drosophila também parece haver
uma transição da blástula intermediária dos
mRNAs e proteínas do citoplasma do oócito
para a transcrição nuclear. Essa transição é
primeiro vista após a décima divisão nucle-
ar. Esse é o primeiro ciclo com uma fase G2,
que aumenta de comprimento entre 10 mi-
nutos após o décimo ciclo até 60 minutos
após o décimo quarto. Na fase G2 do déci-
mo quarto ciclo, o genoma está transcre-
vendo no mais alto nível de atividade visto
durante a embriogênese (Anderson e
Lengyel, 1979; Weir e Kornberg, 1985). Ed-
gar e Schubiger (1986) mostraram que nú-
cleos de Drosophila tornam-se competen- Figura 12.25
tes para transcrever no ciclo 10 mas que a Incorporação de [3H]uridina no RNA dos embriões de axolotles tipo selvagem e mutante o/o.
maioria dos genes necessita de fases G2 mais Embriões em estágio de blástula foram incubados no precursor RNA radioativo por 3 horas,
lavados, fixados, corados e observados por auto-radiografia. (A) Células embrionárias normais
longas para ficarem ativados. A alta ativida- mostrando intensa radioatividade, indicando síntese de RNA. (B) Embrião de uma fêmea o/o.
de transcricional de embriões de ciclo 14 Coloração está presente, mas não se vê marcação significativa, indicando que pouca ou nenhuma
pode ser induzida prematuramente, esten- transcrição havia ocorrido. (Segundo Carroll, 1974.)
ouriço-do-mar em que o núcleo embrio- te o estágio de 2 células. Entre os estági- toplasma de embriões tardios de 1 célula
nário não esteja funcionando. Baixos ní- os de 1 e 2 células do embrião, mais de o suporta. Como inibidores da proteína-
veis de transcrição (incluindo novas men- dois terços das proteínas sofrem uma al- quinase (PKA) dependente de cAMP ini-
sagens de histonas) podem ser vistos em teração de cinco vezes em sua síntese bem a competência do citoplasma para
pronúcleos mesmo antes de sua fusão (Latham et al., 1991, 1992). Quando culti- suportar a transcrição, é possível que a
(Poccia et al., 1985). Essas mensagens re- vadas com o inibidor da transcrição a- ativação de PKA seja essencial para a
cém-transcritas entram no “pool” maior aminitina (que bloqueia a RNA polimera- aquisição pelo citoplasma de seu estado
do mRNA materno. A cromatina das quase II), ovos de camundongo são bloquea- transcricionalmente permissivo. Outros
tro primeiras clivagens é feita primaria- dos no estágio bicelular (Flach et al., 1982). mamíferos não seguem necessariamente
mente com histonas estocadas no cito- Em camundongos, os mRNAs maternos o mesmo programa. A síntese do mRNA
plasma do oócito e histonas sintetizadas persistem por cerca de dois dias- a gros- humano é primeiro vista no estágio de 4
de mensagens maternas. Do estágio de so modo, o mesmo tempo que em outros células, e inibidores da transcrição blo-
16 células em diante, porém, a maioria das filos- e em seguida, durante o segundo queiam o desenvolvimento no estágio de
histonas é sintetizada de mensagens dia, os mensageiros maternos são rapida- 4- a 8-células. Em vacas e ovelhas, a ati-
transcritas de núcleos de células embrio- mente degradados (Clegg e Piko, 1983; vidade transcricional é vista nos estági-
nárias (Goustin e Wilt, 1981). Esse padrão Paynton et al., 1988). À medida que os os de 8- a 16-células (Braude et al., 1988;
está em contraste marcado com aquele de produtos gênicos codificados pelas men- Telford et al., 1990).
embriões de Xenopus, nos quais um gran- sagens maternas decaem, eles são subs- Em todas as espécies animais obser-
de “pool” de proteína histona estocada tituídos por novas proteínas produzidas vadas, há um período de tempo em que
pela mãe, e um grande suprimento de men- de mRNA que está sendo recém-transcri- os fenômenos do desenvolvimento pre-
sagem histona estocada no oócito são uti- to do núcleo. Na maioria dos casos, os coce são controlados pelas mensagens
lizados por milhares de células. cromossomos derivados do espermatozói- e proteínas estocadas no citoplasma do
Embriões de mamíferos, ascídios, de são provavelmente ativados simulta- oócito. Na maioria das espécies (os ma-
nematóides e moluscos também parecem neamente com cromossomos derivados do míferos sendo a exceção), o genoma nu-
iniciar a transcrição dentro do primeiro ovo (Gilbert e Solter, 1985). Latham e cole- clear é ativado muito antes das mensa-
ciclo celular (Schauer e Wood, 1990). Po- gas (1992) transplantaram núcleos para di- gens maternas serem degradadas, fazen-
rém, tal como em muitos eventos do deferentes citoplasmas e demonstraram que do com que ambos conjuntos de mRNAs
senvolvimento, não se pode dizer que os o citoplasma muda durante a parte tardia sejam traduzidos simultaneamente. Final-
mamíferos tenham aperfeiçoado uma es- do estágio de 1 célula. O citoplasma da mente, quando as mensagens maternas
tratégia uniforme. No grupo mamífero mais célula precoce do embrião de 1 célula não tiverem sido degradadas nos dias 1 e 2,
estudado, os camundongos, o genoma suporta a transcrição de genes de núcle- os transcritos do genoma embrionário se
embrionário é extremamente ativo duran- os de embriões mais tardios. Porém, o ci- tornarão mais importantes.
Regulação dos genes da tradução em larvas e adultos

O controle da tradução não existe somente para ovos e seus embriões precoces.
Estudos recentes mostraram o uso generalizado da regulação dos genes da tradução
para vários processos críticos do desenvolvimento mais tardio. Tal como em estudos
sobre a embriogênese precoce, as 3’UTR mostraram ter um papel crítico. Essa região
da mensagem “por muito tempo vista como terra perdida de informação genética”
(Wickens, 1992) está começando a se tornar uma das áreas mais interessantes da
regulação gênica do desenvolvimento.
Determinação de Gametas em C. elegans
Um papel particularmente dramático para a 3’UTR no mRNA mascarado é visto em

Caenorhabditis elegans. Esse verme nematóide tem um corpo feminino, mas é herma-
frodita, produzindo tanto espermatozóide como óvulo em períodos diferentes. As
primeiras células germinativas a se diferenciarem no nematóide tornam-se espermato-
zóide, os quais são armazenados no útero para uso posterior. Após a quarta muda (de
larva para adulto), as células germinativas deixam de produzir espermatozóide e come-
çam a produzir óvulos. Esses óvulos irão finalmente ser fecundados pelo espermatozói-
de estocado. O processo determinando qual o caminho a célula germinativa segue –
para espermatozóide ou para óvulo – depende da repressão da tradução de mensagens
diferentes. A iniciação da formação de espermatozóide é conseguida pela repressão da
mensagem tra-2. A proteína TRA-2 é essencial para o desenvolvimento de óvulos e

células do organismo feminino, e a repressão da tradução do mRNA tra-2 em células não-traduzido traduzido
germinativas faz com que elas se tornem espermatozóide. A 3’UTR dessa mensagem óvulos
espermatozóides
contém duas regiões de 28 nucleotídeos, cada uma das quais parece ligar uma proteína
repressora putativa que é sintetizada durante estágios larvais associados à esperma- traduzido não-traduzido
togênese. Se essas regiões forem mutadas, a tradução de mRNA tra-2 não é reprimida,
nenhum espermatozóide é produzido, e o nematóide é fêmea funcional em lugar de
hermafrodita (Evans et al., 1992). Uma proteína que se liga a essas regiões foi isolada; Figura 12.26
e pode mediar a repressão da tradução (Figura 12.26; Goodwin et al., 1993). A transição de espermatogênese para oogêne-
se durante o quarto instar da larva de C. elegans
A história não termina aqui. A mudança de espermatogênese para ovogênese
é regulada pela tradução das mensagens tra-2 e
também requer a supressão da tradução de mRNA fem-3 através de sua 3’UTR. A fem-3. Em ambos os casos, o bloqueio da tra-
proteína FEM-3 é crítica para a especificação de células do organismo masculino e dução ocorre através da ligação de uma prote-
produção de espermatozóide. A transcrição do gene fem-3 é inibida pela proteína ína inibidora à respectiva 3’ UTR.
TRA-2, mas a repressão de mensagens fem-3 existentes também é necessária. A re-
pressão da tradução parece ser afetada pela ligação de um inibidor de tradução pela
3’UTR do mRNA fem-3 (veja Figura 12.26; Ahringer and Kimble, 1991; Evans et al.,
1992). Assim, a iniciação da espermatogênese em nematóides hermafroditas e a transi-
ção de espermatogênese para ovogênese parece ser regulada pela repressão da tradu-
ção através da 3’UTR.
RNA Antisenso Natural
Parece que tudo que as proteínas podem fazer, os RNAs também podem. Se proteínas
podem regular a tradução ligando-se a sítios específicos na 3’UTR de RNAs mensa-
geiros, assim também o podem fazer RNAs pequenos. O “RNA de controle da tradu-
ção” foi originalmente proposto por Bester e colaboradores, em 1975. Desde então, foi
encontrado em C. elegans e pintos.
Caenorhabditis elegans faz jus a seu nome, tendo desenvolvido uma solução par-
ticularmente elegante para o problema do controle da expressão gênica larval (Lee et al.,
1993; Wightman et al., 1993). Altos níveis do fator de transcrição LIN-14 especificam a Figura 12.27
síntese protéica em órgãos larvais precoces. Depois disso, a proteína LIN-4 não é mais Modelo hipotético para a regulação do mRNA
vista, embora mensagens lin-4 sejam detectadas através de todo o desenvolvimento. C. lin-14 pelos mRNAs lin-4. (Isso não foi con-
firmado experimentalmente.) O gene lin-4 não
elegans é capaz de inibir a síntese de LIN-14 de seu mRNA, ativando o gene lin-4. Em
produz um mRNA. Em lugar disso, ele produz
mutações de perda-de-função de lin-4, a proteína LIN-14 é sintetizada continuamente, e RNAs pequenos que não produzem proteínas.
o desenvolvimento precoce do nematóide é interrompido. O gene lin-4 não codifica Esses RNAs são complementares a uma se-
proteína alguma. Em vez disso, ele codifica dois pequenos mRNAs (o mais abundante qüência repetida na 3’UTR do mRNA lin-14.
tendo 25 nucleotídeos de comprimento, o outro continuando por mais 40 nucleotídeos) (Segundo Wickens e Takayama, 1994.)
Seqüência de codificação
Poli(A)
que são complementares a um sítio imperfeitamente repetido na 3’UTR de lin-14. A

Figura 12.27 mostra um esquema hipotético do que pode estar acontecendo. Parece que
a ligação desses transcritos lin-4 para a 3’UTR do mRNA lin-14 não sinaliza a destrui-
ção da mensagem; antes, previne a mensagem de ser traduzida. [RNA5.html]
No embrião do pinto, mRNA antisenso é visto regular a síntese do fator do
crescimento do fibroblasto básico (FGF2). Alguns tecidos (como o mesonefro)
têm mensagens Fgf2 sem o transcrito antisenso, enquanto outros tecidos (como
uma linha não-diferenciada do mesoderma de membros) contêm tanto o mRNA de
Fgf2 como seu complemento antisenso. Acredita-se que o RNA antisenso conduz
a sua própria degradação e a do transcrito Fgf2 (Kimelman e Kirschner, 1989;
Savage e Fallon, 1995).
“Disjuntores” do Controle da Tradução
A regulação oposta e coordenada das duas principais proteínas ligantes de ferro

de mamíferos, ferritina e o receptor de transferrina, foi recentemente elucidada
(veja Klausner e Harford, 1989; Klausner at al., 1993). Os mRNAs tanto da ferritina
como do receptor de transferrina contêm regiões que ligam uma proteína ligante
responsiva ao ferro (IRE-BP). A mensagem da ferritina tem essa seqüência em sua
seqüência líder (5’ para a região codificadora de proteína), enquanto a mensagem
do receptor de transferrina contém duas dessas seqüências na sua região 3’ não-
traduzida. Quando o ferro celular está em baixo suprimento, a proteína ligante de
ferro não pode ligar o ferro e encontra-se em uma conformação para se ligar a
esses mRNAs. Quando se liga à seqüência líder da mensagem da ferritina, ela
bloqueia sua tradução, impedindo assim a síntese dessa proteína de armazenagem
de ferro. Simultaneamente a proteína se liga ao terminal 3’ da mensagem do recep-
tor de transferrina, estabilizando-a contra a degradação e permitindo a produção
de mais receptores de transferrina. Os receptores de transferrina trazem mais ferro
para o interior da célula (Figura 12.28).
mRNA da FERRITINA
IRE-BP ausente IRE-BP presente
Seqüências de reconhecimento para IRE-BP liga-se à seqüência

proteína reguladora ligante de ferro de reconhecimento
(IRE-BP)
Região codificadora Tradução Sem tradução de mRNA

de proteína de mRNA
mRNA DO RECEPTOR DE TRANSFERRINA

IRE-BP ausente IRE-BP presente
Seqüências de
Figura 12.28 reconhecimento para IRE-BP
Regulação da tradução coordenada e oposta
da ferritina e do receptor da transferrina.
Ambas mensagens contêm regiões que são
reconhecidas por uma proteína reguladora
ligante de ferro (IRE-BP). Na ausência de fer-
ro intracelular, essa proteína se liga a essas
Região
mensagens inibindo a tradução do mRNA da
codificadora
ferritina e estabilizando o mRNA para o rede proteína
ceptor de transferrina. (Segundo Klausner e
Harford, 1989.) Degradação de mRNA Sem degradação de mRNA
Editoração do RNA
Um dos mecanismos mais inesperados do controle da tradução foi visto recente-

mente na regulação das proteínas apolipoproteínas-B. Proteínas apo-B são compo-
nentes de proteínas séricas portadoras de lipídios, e são consideradas como tendo
um papel preponderante na gênese da arteriosclerose. Apo-B48 (48-kDA) é sinteti-
zada no intestino e torna-se parte do complexo de quilomícrons necessários para
absorção e transporte do colesterol e triglicerídeos dietéticos. Apo-B100 (100-KDA)
é produzida no fígado e é a principal componente das proteínas portadoras de lipídios
de densidade muito-baixa, baixa e intermediária. Apo-B100 e Apo-B48 são transcri-
tas do mesmo gene e não se nota processamento diferencial algum para gerar mRNAs
diferentes para essas duas proteínas. A análise dos DNAs de Apo-B indica que a
mensagem apo-B no fígado codifica todo o peptídeo Apo-B100. A mensagem intes-
tinal, porém, difere daquela do fígado por apenas uma base. Uma transição C-para-
U ocorreu, mudando um códon normal de glutamina (CAA) para um códon terminador
(UAA) no códon 2153. Essa diferença resulta na formação de uma proteína Apo-B48
mais curta no intestino (Chen et al, 1987; Powell et al., 1987). Essa editoração do RNA
é um exemplo de uma situação em que uma mudança específica de base é feita em um
RNA existente, com isso alterando a mensagem. O transcrito primário do gene apo-
B não parece ser editado, e a editoração C-para-U pode estar sendo conseguida por
um fator contido no núcleo. Por isso, Lau e colegas (1991) concluíram que essa
editoração do RNA é realizada durante os passos de processamento do RNA. A
proteína responsável por essa editoração é a citidina desaminase (Navaratnam et al.,
1995); e pela alteração da estrutura seqüencial do RNA próximo da citosina editada,
Chen e colaboradores (1990) descobriram duas regiões que são críticas para a
editoração. Uma é a região de nucleotídeos conservada por várias espécies de mamí-
feros, e a outra é uma seqüência espécie-específica mais a jusante. Eles postulam
uma enzima que reconhece essas duas regiões e coloca seu sítio catalítico sobre a
citosina em questão. A desaminação dessa citosina converte-a em um resíduo de
uridina (Figura 12.29). Até agora tem sido um axioma da biologia molecular que a
seqüência de nucleotídeos de uma mensagem, uma vez transcrita, não pode ser
alterada. Embora a editoração do RNA seja um evento excepcionalmente raro, é
também visto em certas mensagens de organelas (veja Scott, 1995; Simpson e
Thiemann, 1995), na alteração da permeabilidade do íon de cálcio de certos canais
iônicos com portal de glutamato, durante o desenvolvimento do cérebro de mamífe-
ros (Sommer et al., 1991; Higuchi et al., 1993), e na alteração do fator de transcrição
WT1 (Sharma et al., 1994).
Enzima editora
Figura 12.29
Modelo de um mecanismo enzimático que
poderia permitir a desaminação de uma
citosina específica do mRNA apo-B. Duas
mRNA Apo-B 5’ 3’ regiões são necessárias para a editoração do
RNA: uma região que é conservada em vári-
Não espécie- Espécie-específico os mamíferos e um elemento espécie-espe-
NH 3 U cífico que tem uma estrutura tipo grampo de
específico
cabelo que poderia ser reconhecida pela
Sítio catalítico Sítio de reconhecimento enzima. (Segundo Chan, 1993.)
Subunidades α
Heme
Heme
Heme
Heme
Subunidades β
Figura 12.30
A estrutura da hemoglobina do humano adulto, com quatro cadeias polipeptídicas (duas α, duas
β) e quatro moléculas de heme. (Segundo Dickerson e Geis, 1983.)
Controle da tradução e síntese protéica coordenada:

Produção de Hemoglobina
Um dos principais problemas da regulação gênica é a produção coordenada de vários
produtos de diferentes regiões do genoma. Quando uma célula sangüínea vermelha
em desenvolvimento sintetiza hemoglobina, ela deve garantir que as cadeia de β−
globina, α−globina e moléculas de heme estejam na relação 2:2:4 (Figura 12.30). Qual-
Succinil coenzima
quer desvio maior dessa relação resulta em moléstias severamente debilitantes.
A + glicina A molécula de heme parece regular a síntese proporcional dos componentes da
hemoglobina. Esse feito é conseguido de duas maneiras. Primeiro, um excesso de
sintase DALA heme (i.e., heme não ligado à uma proteína como a globina) desliga sua própria síntese
(Karibian e London, 1965), inativando sintase δ−aminolevulinato (sintase DALA), a
primeira enzima na via de produção de heme (Figura 12.31). Assim, quando existe mais
Ácido δ−aminolevulínico
heme presente do que moléculas para o ligar, ele não será mais produzido. Em segundo
lugar, o excesso de heme estimula a produção da proteína globina (Gribble e Schwartz,
Inibição
Porfobilinógeno 1965; Zucker e Schulman, 1968). Quando heme (ou sua forma oxidada, hemina) é
adicionado a um sistema de tradução isento de células mas que inclui todos os fatores
necessários para traduzir mRNAs (Tabela 12.5), a síntese da globina é muito estimula-
Protoporfirina IX da (Figura 12.32A). Portanto, se não há globina para ligar o heme, o excesso de heme
desliga sua própria síntese e estimula a produção de mais globina.
Heme Vários laboratórios investigaram como uma molécula tão pequena como o heme
pode regular a síntese protéica. Em 1972, Adamson e colegas demonstraram que o
Figura 12.31 efeito estimulador do heme na síntese da globina podia ser imitado pela adição ao
Regulação por retroalimentação (feedback) da sistema de tradução daquelas proteínas que estão frouxamente associadas aos
síntese do heme. (Segundo Harris, 1975.) ribossomos. Como tais soluções são ricas em fatores de iniciação da tradução, cada
Tabela 12.5 Componentes do sistema de tradução in vitro contendo lisato de reticulócitos de coelho
Concentração Concentração
Componente (em 100 µl) Componente (em 100 µl)
Lisato de reticulócitos (1:1) 50 µl KCl 76 mM

Tampão tris-HCl (pH 7.6) 10 mM Mistura proporcional de aminoácidos 6-170 µM
ATP 1 mM [14 C]Leucina 0.8 µCi
GTP 0.2 mM leucina “fria” 26 µM
Fosfato de creatina 5 mM Hemina 10-30 µM
Fosfoquinase de creatina 10 µg H2O para trazer o volume da reação
Acetato de magnésio 2 mM para 100 µl
Fonte: Segundo London et al., 1976.
fator foi testado separadamente. Achou-se que o fator 2 de iniciação eucariótica (eIF2)
restaurava a síntese protéica para lisatos deficientes de heme no sistema de tradução
(Figura 12.32B). Esse fator de iniciação é responsável pela combinação com o tRNA
iniciador e complexá-lo à subunidade ribossômica 40S.
Qual, então, é a relação entre heme e eIF2? Para responder a isso, London e cola-
boradores (Levin et al., 1976; Ranu et al., 1976; Ramaiah et al., 1992) adicionaram
lisatos deficientes de heme a sistemas de tradução suplementados com heme. Eles
acharam que uma porção do lisato deficiente de heme podia realmente deprimir a
síntese da globina no sistema de tradução ao qual ele fora adicionado. Esse achado
indicou que um inibidor estava presente. Essa proteína inibidora responsiva ao heme,
HRI, foi isolada e verificou-se que era uma quinase capaz de fosforilar eIF2. A hemina
liga-se a essa quinase, inativando-a (veja Chen e London, 1995).
O eIF2 finalmente irá parar a tradução. Normalmente, uma vez que as subunida-
des ribossômicas se juntam, o eIF2 é liberado como um complexo com GDP
(Raychaudhury et al., 1985). Para o eIF2 ser novamente usado na iniciação, ele
+Hemina
[14C]Leucina incorporada (cpm x 10-4)
[14C]Leucina incorporada (cpm x 10-3)
+Hemina
Figura 12.32
Sem adições
Regulação da tradução por hemina e pelo fa-
tor 2 de iniciação eucariótica. (A) Tradução do
mRNA da globina no sistema de síntese
protéica in vitro do reticulócito de coelho. A
inclusão de hemina ocasiona uma dramática
elevação da síntese protéica. (B) Efeito da adi-
-Hemina ção do fator 2 de iniciação eucariótica no siste-
ma de tradução in vitro do reticulócito de coe-
lho. O eIF2 elevou o nível da síntese protéica
para perto daquele do sistema estimulado pela
hemina. (A segundo London et al., 1976; B
(A) Tempo (minutos) (B) Tempo (minutos) segundo Clemens et al., 1974.)
Figura 12.33
Subunidade ribossômica 40S Tradução
Esquema para o controle da tradução da síntese
Complexo de iniciação
da globina. Como um resultado da inativação
pela proteína quinase, o eIF2 é depletado a não
ser que o heme inative a proteína quinase.
Proteína Heme Proteína quinase
quinase ativa inativa
eIF2 - P (Seqüestra o
fator de reciclagem)
deverá complexar-se com o eIF2B (fator de reciclagem). Esse eIF2B troca GTP por
GDP (veja Figura 12.11), e o complexo eIF2-GTP resultante é capaz de entrar num
outro ciclo de iniciação. Porém, se a subunidade α do eIF2 for fosforilada, o fator de
reciclagem eIF2B se liga mas não consegue se despregar (Gross et al., 1985; Thomas
et al., 1985). Por fim, todo eIF2B (cuja concentração é 10- a 20-vezes mais baixa que
aquela do eIF2) é ligado a esses complexos, e a tradução cessa. A adição de eIF2B a
lisatos deficientes em heme restitui a síntese protéica aos níveis dos sistemas
suplementados com heme (Grace et al., 1984). Heme em excesso é capaz de se ligar à
proteína quinase, inativando-a (Fagard e London, 1981). Quinase inativada não irá
fosforilar eIF2α, fazendo com que a tradução prossiga. Assim, enquanto heme esti-
ver presente, a síntese da globina continuará (Figura 12.33).
A história do controle da tradução da síntese da globina não termina aqui. Confor-
me discutimos no Capítulo 11, há quatro genes α−globina ativos por célula diplóide e
somente dois genes β−globina ativos. Se cada gene fosse transcrito e traduzido com
a mesma velocidade, esperar-se-ia duas vezes mais moléculas α−globina que β−globina.
Isso claramente não é o caso. Encontra-se uma relação 1.4:1 de mRNA α:β, mas uma
relação 1:1 de proteínas (Lodish, 1971). A igualização das proteínas parece envolver
regulação da tradução.
Kabat e Chappell (1977) sugeriram que a igualização é feita no estágio de inicia-
ção da tradução. Eles mostraram que o mRNA da α−globina compete com a mensa-
gem da β−globina para fatores de iniciação e que a mensagem da β−globina parece
ser o melhor competidor. A mensagem da β−globina é reconhecida mais eficiente-
mente pelos fatores de iniciação sendo por isso traduzida mais freqüentemente.
Quando os dois mRNAs estão presentes em quantidades iguais, mas com um supri-
mento de fatores de iniciação severamente limitante, somente 3% da proteína resul-
tante era α−globina. Porém, quando o mRNA não-fracionado (mensagens α e β
globinas de células lisadas) foi adicionado a um excesso de tais fatores de iniciação,
todos os mRNAs foram traduzidos com igual eficiência e a relação α:β resultante foi
de 1.4:1. A proteína cap ligante foi implicada como sendo o fator responsável pela
discriminação entre os dois tipos de mensagem da globina (Ray et al., 1983; Sarkar et
al., 1984). Enquanto ainda não é conhecido como se dá a discriminação, é conhecido
que a estrutura secundária da seqüência líder 5’ afeta a eficiência da tradução (Pelletier
e Sonenberg, 1985). Como pode ser visto na Figura 12.34, os terminais 5’ das mensa-
gens α e β−globina diferem significativamente. Assim, as razões apropriadas de α−
globina e β−globina, e heme são estabelecidas no passo de iniciação da tradução.
Embora a síntese da hemoglobina envolva regulação nos níveis de transcrição e
processamento de RNA, a molécula final é construída através da coordenação fina
ao nível da tradução.
mRNA da α−globina
mRNA da β−globina
Fator 12.34
Ao mesmo tempo, outro notável exemplo da regulação da tradução está ocorrendo Prováveis estruturas secundárias para os ter-
minais 5’ das cadeias de α-globina e de β-
dentro da célula vermelha do sangue. O mRNA codificando a enzima 15-lipoxigenase
globina do camundongo. Os códons AUG ini-
(15-LOX) é transcrito durante os estágios precoces do desenvolvimento da célula ciadores da tradução estão coloridos. (Segun-
vermelha do sangue na medula óssea, mas ele somente é traduzido quando a célula do Pavlakis et al., 1980.)
vermelha do sangue está a ponto de entrar na circulação periférica. Essa enzima é
responsável pela digestão das mitocôndrias durante os últimos estágios da formação
da célula vermelha sangüínea. A 3’ UTR do mRNA 15-lox tem 10 repetições acopladas
de uma seqüência rica em pirimidina que liga uma proteína de 48-kDA específica para
eritrócitos. Essa proteína reprime a tradução da mensagem 15-lox até o eritrócito estar
pronto para entrar na circulação (Ostarek-Lederer et al., 1994). Não é ainda conhecido
como essa proteína repressora é regulada durante o desenvolvimento da célula ver-
melha sangüínea.
Epílogo: Regulação Pós-tradução

O controle da tradução, portanto, é um mecanismo importante e largamente emprega-
do para regular a expressão gênica durante o desenvolvimento. Ele pode ser usado
para ativar um certo conjunto de mRNAs existente em um certo momento ou para
regular a relação pela qual diferentes mRNAs competitivos podem ser traduzidos. Os
animais desenvolveram vários mecanismos pelos quais mRNAs podem ser armazena-
dos no oócito para posterior uso durante a embriogênese precoce. As bases molecu-
lares desses mecanismos reguladores da tradução estão sendo estudadas.
Porém, a história ainda não acabou quando o peptídeo é sintetizado. Uma vez
que uma proteína tiver sido produzida, ela torna-se parte de um nível mais elevado
de organização. Ela pode tornar-se parte da estrutura de suporte da célula, ou ela
pode se envolver em um dos variados caminhos enzimáticos para a síntese ou degra-
dação de metabólitos celulares. De qualquer maneira, a proteína individual é agora
parte de um complexo “ecossistema” que a integra em um relacionamento com nu-
merosas outras proteínas. Assim, ainda podem ocorrer várias mudanças que deter-
minam se uma proteína está ou não ativa. Em primeiro lugar, algumas proteínas
recém–sintetizadas são inativas sem ulteriores modificações que podem envolver a
remoção por clivagem de certos setores inibitórios da proteína, ou a ligação de um
pequeno composto para intensificar sua atividade. Segundo, algumas proteínas
podem ser inativadas seletivamente. Em alguns casos, a inativação envolve a degra-
dação da própria proteína; em outros, a inativação pode ser causada pela ligação de
um ligante inibidor. Terceiro, algumas proteínas têm que ser “endereçadas” a seus
destinos intracelulares específicos. A célula não é simplesmente um saco de enzimas:
proteínas são muitas vezes seqüestradas em certas regiões, tais como membranas,
lisossomos, núcleos ou mitocôndrias. Em quarto lugar, algumas proteínas têm que
se juntar a outras proteínas para formar uma unidade funcional. A proteína hemoglo-
bina, o microtúbulo e o ribossomo são todos exemplos de numerosas proteínas
juntadas para formar uma unidade funcional. Portanto, a expressão da informação
genética ainda pode ser influenciada no nível pós-tradução. Alguns desses casos
(como a fosforilação do fator promotor da mitose) já foram discutidos, enquanto
outros serão discutidos à medida que aparecerem. Neste ponto, abandonaremos
nossa discussão dos aspetos moleculares da expressão gênica e voltaremos para a
dinâmica do embrião em desenvolvimento. Podemos agora olhar para processos
desenvolvimentais precoces para estudar mecanismos moleculares para a determi-
nação do destino celular e da estrutura tissular.
LITERATURA CITADA
Adamson, S. D., Yau, P. M. P., Herbert, E. and dynamic changes during oocyte maturation and Chan, L. 1993. RNA editing: Exploring one
Zucker, W. V. 1972. Involvement of hemin, a early development. RNA 1: 64-78. mode with apolipoprotein B mRNA. BioEs-
stimulatory fraction from ribo-somes, and a says 15: 33-41.
Belote, J. M., McKeown, M., Boggs, R. T.,
protein synthesis inhibitor in the regulation of
Ohkawa, R. and Sosnowski, B. A. 1989. Molecu- Chen, C.-Y. A., You, Y. and Shyu, A.-B. 1992.
hemoglobin synthesis. J. Mol. Biol. 63: 247-264.
lar genetics of transformer, a genetic switch Two cellular proteins bind specifi-cally to a
Ahringer, J. and Kimble, J. 1991. Control of the controlling sexual differentiation in Drosophi- purine-rich sequence necessary for the destabili-
sperm-oocyte switch in Caenorhabditis elegans la. Dev. Genet. 10: 143-154. zation function of a c-fos protein coding region
by the fem-3 3' untranslated region. Nature 349: determinant of mRNA instability. Mol. Cell. Biol.
Berget, S. M. 1995. Exon recognition in ver- 12: 5748-5757.
346-348.
tebrate splicing. J. Biol. Chem. 270: 2411-2414.
Anderson, K. W. and Lengyel, J. A. 1979. Rates Chen, C.-Y. A., Chen, T.-M. and Shyu, A.-B.
Bester, A. J., Kennedy, D. S. and Heywood, S. M. 1994. Interplay of two functionally and
of synthesis of major classes of RNA in Droso-
1975. Two classes of translational con-trol RNA: structurally distinct domains of the c-fos AU-
phila embryos. Dev. Biol. 70: 217-231.
Their role in the regulation of protein synthesis. rich element specifies its mRNA-desta-bilizing
Angerer, L. M. and Angerer, R. C. 1981. De- Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 1523-1527. function. Mol. Cell. Biol. 14: 416-426.
tection of poly A+ RNA in sea urchin eggs and
Boggs, R. T. Gregor, P., Idriss, S., Belote, J. M. Chen, J.-J. and London, I. M. 1995. Regula-tion
embryos by quantitative in situ hy-bridization.
and McKeown, M. 1987. Regulation of sexual of protein synthesis by heme-regu-lated eIF-2a
Nucleic Acids Res. 9: 2819-2840.
differentiation in D. melanogaster via alternative kinase. Trends Bioch. Sci. 20: 105-108.
Audet, R. G., Goodchild, J. and Richter, J. D. splicing of RNA from the trans-former gene. Cell
1987. Eukaryotic initiation factor 4A stimulates 50: 739-747. Chen, S.-H. and 12 others. 1987. Apolipoprotein
translation in microinjected Xenopus oocytes. B48 is the product of a messenger RNA with an
Bouvet, P. and Wolffe, A. P. 1994. A role for organ-specific in-frame stop codon. Science
Dev. Biol. 121: 58-68.
transcription and FRGY2 in masking ma-ternal 238: 363-366.
Axel, R., Feigleson, P. and Schutz, G. 1976. mRNA within Xenopus oocytes. Cell 77: 931-941.
Chen, S.-H., Li, X., Liao, W. S. L., Wu, J. H. and
Analysis of the complexity and diversity of
Braude, P., Bolton, V. and Moore, S. 1988. Chan, L. 1990. RNA editing of apolipoprotein
mRNA from chicken liver and oviduct. Cell 7:
Human gene expression first occurs be-tween B mRNA: Sequence speci-ficity determined by
247-254.
the four- and eight-cell stages of preimplantation in vitro coupled tran-scription-editing. J. Biol.
Bachvarova, R. F. 1992. A maternal tail of development. Nature 332: 459-461. Chem. 265: 6811-6816.
poly(A): The long and the short of it. Cell 69:
Briggs, R. and Cassens, G. 1966. Accumula-tion Christofori, G. and Keller, W. 1988. 3' cleav-age
895-897.
in the oocyte nucleus of a gene prod-uct essential and polyadenylation of mRNA precur-sors in
Baker, B., Nagoshi, R. N. and Burtin, K. C. 1987. for embryonic development beyond gastrulati- vitro requires a poly(A) polymerase, a cleavage
Molecular genetic aspects of sex de-termination on. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55: 1103-1109. factor, and a snRNP. Cell 54: 875-889.
in Drosophila. BioEssays 6: 66-70. Clegg, K. B. and Piko, L. 1983. Poly(A) length,
Carroll, C. R. 1974. Comparative study of the
Ballantyne, S., Bilger, A. Åstrom, J., Virta-nen, early embryonic cytology and nucleic acid cytoplasmic adenylation, and syn-thesis of
A. and Wickens, M. 1995. Poly(A) polymerases synthesis of Ambystoma mexicanum normal and poly(A)+ RNA in early mouse em-bryos. Deo.
in the nucleus and cytoplasm of frog oocytes: o mutant embryos. J. Exp. Zoo/. 187: 409-422. Biol. 95: 331-341.
Clemens, M. J., Henshaw, E. C., Ra-haminoff, Fagard, R. and London, I. M. 1981. Rela-tionship Goustin, A. S. and Wilt, F. H. 1981. Protein
H. and London, I. M. 1974. Met-tRNAfmet binding between phosphorylation and ac-tivity of heme- synthesis, polyribosomes, and peptide elongation
to 40S ribosomal units: A site for the regulation regulated eukaryotic initia-tion factor 2 kinase. in early development of Strongylocentrotus
of initiation of pro-tein synthesis by hemin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 866-870. purpuratus. Dev. Biol. 82: 32-40.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 2946-2950.
Ferrandon, D., Elphick, L., Nüsslein-Vol-hard Grace, M. and eight others. 1984. Protein
Colin, A. M., Brown, B. D., Dholakia, J. N., C. and St. Johnon, D. 1994. Staufen protein synthesis in rabbit reticulocytes: Character-istics
Woodley, C. L., Wahba, A. J. and Hille, M. B. associates with the 3' UTR of bicoid to form of the protein factor RF that reverses inhibition
1987. Evidence for simultaneous derepres-sion particles that move in a micro-tubule-dependent of protein synthesis in heme-de-ficient
of messenger RNA and the guanine nucleotide manner. Cell 79: 1221-1232. reticulocyte lysates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
exchange factor in fertilized sea urchin eggs. 79: 6517-6521.
ffrench-Constant, C. and Hynes, R. O. 1989.
Deo. Biol. 123: 354-363.
Alternative splicing of fibronectin is tem-porally Gribble, T. J. and Schwartz, H. C. 1965. Ef-fect
Cooper, G. M. 1996. The Cell: A Molecular and spatially regulated in the chicken embryo. of protoporphyrin on hemoglobin syn-thesis.
Approach. Sinauer Associates, Sunderland, MA. Development 106: 375-388. Biochim. Biophys. Acta 103: 333-338.
Coschigano, K. T. and Wensink, P. 1993. Sex- Flach, G., Johnson, M. H., Braude, P. R., Taylor, Gross, K. W., Jacobs-Lorena, M., Baglioni, G.
specific transcriptional regulation by the male R. A. S. and Bolton, V. N. 1982. The transition and Gross, P. R. 1973. Cell-free transla-tion of
and female doublesex proteins of Drosophila. from maternal to embryonic con-trol in the 2- maternal messenger RNA from sea urchin eggs.
Genes Dev. 7: 42-54. cell mouse embryo. EMBO J. 1: 681-686. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2614-2618.
Crossley, P. H. and Martin, G. R.1995. The mouse Fox, C. A. and Wickens, M. 1990. Poly(A) Gross, M., Redman, R. and Kaplansky, D. A.
Fgf8 gene encodes a family of polypeptides and removed during oocyte maturation: A de-fault 1985. Evidence that the primary effects of
is expressed in regions that direct outgrowth and reaction selectively prevented by spe-cific phosphorylation of eukaryotic initiation factor
patterning in the developing embryo. Develop- sequences in the 3' UTR of certain ma-ternal 2a in rabbit reticulocyte lysate is in-hibition of
ment 121: 439-451. mRNAs. Genes Dev. 4: 2287-2298. the release of eukaryotic initia-tion factor 2-
GDP from 60S ribosomal sub-units. J. Biol.
Danilchik, M. V., Yablonka-Reuveniz, Z., Moon, Fox, C. A., Sheets, M. D. and Wickens, M. 1989.
Chem. 260: 9491-9500.
R. T., Reed, S. K. and Hille, M. B. 1986. Separate Poly(A) addition during maturation of frog
ribosomal pools in sea urchin embryos: oocytes: distinct nuclear and cyto-plasmic Guo, W., Mulligan, G. J., Wormsley, S. and
Ammonia activates a movement between pools. activities and regulation by the se-quence Helfman, D. M. 1991. Alternative splicing of
Biochemistry 25: 3696-3702. UUUUUAU. Genes Dev. 3: 2151-2162. (b-tropomyosin pre-mRNA: Cis-acting el-
ements and cellular factors that block the use of
Davidson, E. H. 1976. Gene Activity in Early Francke, C., Edstrom, J. E., McDowell, A. W.
a skeletal muscle exon in nonmuscle cells. Genes
Development. 1st Ed. Academic Press, New York. and Miller, O. L. 1982. Microscopic visu-
Dev. 5: 2096-2107.
alization of a discrete class of giant transla-tion
Davidson, E. H. 1986. Gene Activity in Early
units in salivary gland cells of Chirono-mus Guyette, W. A., Matusik, R. J. and Rosen, J. M.
Development, 3rd Ed. Academic Press, New York.
tentans. EMBO J. 1: 59-62. 1979. Prolactin-mediated transcriptional and
Davidson, E. H. and Britten, R. J. 1979. Reg- post-transcriptional control of casein gene
Fu, L., Ye, R., Browder, L. and Johnston, R.
ulation of gene expression: Possible role of expression. Cell 17:1013-1023.
1991. Translational potentiation of mRNA with
repetitive sequences. Science 204:1052-1059.
secondary structure in Xenopus. Sci-ence 251: Hake, L.E. and Richter, J. D. 1994. CPEB is a
Decker, C. J. and Parker, R. 1994. Mecha-nisms 807-810. specificity factor that mediates cytoplas-mic
of mRNA degradation in eukaryotes. Trends polyadenylation during Xenopus oocyte
Gagnon, M. L., Angerer, L. M. and Angerer, R.
Biochem. 19: 336-340. maturation. Cell 79: 617-627.
C. 1992. Posttranscriptional regulation of
DeLeon, C. V., Cox, K. H., Angerer, L. M. and ectoderm-specific gene expression in early sea Harris, H. 1975. Principles of Human Bio-
Angerer, R. C. 1983. Most early variant histone urchin embryos. Development 114: 457-467. chemical Genetics. Elsevier North-Holland,
mRNA is contained in the pronu-cleus of sea New York.
Galau, G., Kelin, W. H., Davis, M. M., Wold, B.,
urchin eggs. Dev. Biol. 100: 197-206.
Britten, R. J. and Davidson, E. H. 1976. Hentze, M. W. 1997. eIF4G: A multipurpose
Dickerson, R. E. and Geis, I. 1983. Hemoglo- Structural gene sets active in embryos and adult ribosome adapter? Science 275: 500-501.
bin Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA. tissues of the sea urchin. Cell 7: 487-505.
Hershey, J. W. B. 1989. Protein phosphory-
Dubnau, J. and Struhl, G. 1996. RNA recog-nition Gavis, E. R. and Lehmann, R. 1994. Transla- lation controls translation rates. J. Biol. Chem.
and translational regulation by a homeodomain tional regulation of nanos by RNA localiza-tion. 264: 20823-20826.
protein. Nature 379: 694-699. Nature 369: 315-318.
Higuchi, M., Single, F. N., Köhler, M., Som-
Edgar, B. A. and Schubiger, G. 1986. Para-meters Gebauer, F. and Richter, J. D. 1995. Cloning and mer, B., Sprengel, R. and Seeburg, P. H. 1993.
controlling transcriptional activa-tion during early characterization of a Xenopus poly(A) poly- RNA editing of AMPA receptor sub-unit GluR-
Drosophila development. Cell 44: 871-877. merase. Mol. Cell. Biol. 15:1422-1430. B: A base-pair intron-exon struc-ture determi-
nes position and efficiency. Cell 75: 1361-1370.
Evans, T. C., Goodwin, E. B. and Kimble, J. Gilbert, S. F. and Solter, D. 1985. Onset of pa-
1992. Translational regulation of develop-ment ternal and maternal Gpi-2 expression in Hille, M. B., Danilchik, M. V., Colin, A. M. and
and maternal RNAs in Caenorhabditis elegans. preimplantation mouse embryos. Dev. Biol. 109: Moon, R. T. 1985. Translational control in
Semin. Dev. Biol. 3: 381-389. 515-517. echinoid eggs and early embryos. In R. H. Sawyer
and R. M. Showman (eds.), The Cellular and
Evans, T. C., Crittenden, S. L., Kodoyianni, V. Goodwin, E. B., Okkema, P. G., Evans, T. C. and
Molecular Biology of Invertebrate Development.
and Kimble, J. 1994. Translational control of Kimble, J. 1993. Translational regula-tion of
University of South Carolina Press, pp. 91-124.
maternal glp-1 mRNA establishes an asymmetry tra-2 by its 3' untranslated region controls sexu-
in the C. elegans embryo. Cell 77: 183-194. al identity in C. elegans. Cell 75: 329-339. Hodges, P. E. and Beggs. J. D. 1994. U2 ful-fills
a commitment. Curr. Biol. 4: 264-267.
Holt, J. T., Gopal, T. V., Moulton, A. D. and no, a newly discovered RNA-binding protein, is Lieberfarb, M. E., Chu, T., Wreden, C., Theurkauf,
Nienhuis, A. W. 1986. Inducible production of c- essential. Cell 81: 403-412. W., Gergen, J. P. and Strickland, S. 1996.
fos antisense RNA inhibits 3T3 cell pro-liferation. Mutations that perturb poly(A)-de-pendent ma-
Kimelman, D. and Kirschner, M.W. 1989. An
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4794-4798. ternal mRNA activation block the initiation of
antisense messenger RNA directs the covalent
development. Development 122: 579-588.
Horowitz, D. S. and Krainer, A. R. 1994. modification of the transcript en-coding
Mechanisms for selecting 5' splice sites in fibroblast growth factor in Xenopus occytes. Cell Lodish, H. F. 1971. Alpha and beta globin
mammalian pre-mRNA splicing. Trend Genet. 59: 687-696. messenger ribonucleic acid. Different amounts
10: 100-106. and rates of translation. J. Biol. Chem. 246:
Klausner, R. D. and Harford, J. B. 1989. Cis-
7131-7138.
Hough-Evans, B. R., Wold, B. J., Ernst, S. G., trans models for post-transcriptional gene
Britten, R. J. and Davidson, E. H. 1977. regulation. Science 246: 870-872. London, I. M., Clemens, M. J., Ranu, R. S., Levin,
Appearance and persistence of maternal RNA D. H., Cherbas, L. F. and Ernst, V. 1976. The role
Klausner, R. D., Rouault, T. A. and Harford, J. B.
sequences in sea urchin development. Dev. Biol. of hemin in the regulation of protein synthesis in
1993. Regulating the fate of mRNA: The control
260: 258-277. erythroid cells. Fed. Proc. 35: 2218-2222.
of cellular iron metabolism. Cell 72: 19-28.
Huarte, J. and seven others. 1992. Transient Lopo, A. C., MacMillan, S. and Hershey, J. W. B.
Kleene, K. C. and Humphreys, T. 1977. Similarity
translational silencing by reversible mRNA 1988. Translational control in early sea urchin
of hnRNA sequences in blastula and pluteus stage
deadenylation. Cell 69: 1021-1030. embryogenesis: Initiation factor eIF4F stimulates
sea urchin embryos. Cell 12: 143-155.
protein synthesis in lysates from unfertilized eggs
Hyman, L. E. and Wormington, W. M. 1988.
Kleene, K. C. and Humphreys, T. 1985. of S. purpura-tus. Biochemistry 27: 351-357.
Translational inactivation of riboso-mal protein
Transcription of similar sets of rare mater-nal
messenger RNAs during Xeno-pus oocyte MacArthur, C. A., Lawshé, A., Xu, J., San-tos-
RNAs and rare nuclear RNAs in sea urchin
maturation. Genes Dev. 2: 598-605. Ocampo, S., Heikinheimo, M., Chella-iah, C.
blastulae and adult coelomocytes. J. Embryol.
and Ornitz, D. M. 1995. FGF-8 iso-forms
Hynes, R. O. 1987. Fibronectins: A family of Exp. Morphol. 85: 131-149.
activate receptor splice forms that are expressed
complex and versatile adhesive glycopro-teins
Kozak, M. 1986. Point mutations define a in mesenchymal regions of mouse development.
derived from a single gene. Harvey Lect.
sequence flanking the AUG initiator codon that Development 121: 3603-3613.
81:133-152.
modulates translation by eukaryotic ri-bosomes.
MacDougall, C., Harbison, D. and Bownes, M.
Infante, A. and Nemer, M. 1968. Heteroge-neous Cell 44: 283-292.
1995. The developmental consequences of
RNP particles in the cytoplasm of sea urchin
Kuge, H. and Richter, J. D. 1995. Cytoplas-mic 3' alternative splicing in sex determination and
embryos. J. Mol. Biol. 32: 543-565.
poly(A) addition induces 5' cap ri-bose methylation: differentiation in Drosophila. Dev. Biol. 172:
Jenkins, N. A., Kaumeyer, J. R., Young, E. M. Implications for transla-tional control of mater- 353-376.
and Raff, R. A. 1978. A test for masked message: nal mRNA. EMBOJ. 14: 6301-6310.
Malacinski, G. M. 1971. Genetic control of
The template activity of messen-ger ribonucleo-
Latham, K. E., Garrels, J. I., Chang, C. and Solter, qualitative changes in protein synthesis during
protein particles isolated from sea urchin eggs.
D. 1991. Quantitative analysis of protein early amphibian (Mexican axolotl) embryoge-
Dev. Biol. 63: 279-298.
synthesis in mouse embryos. I. Ex-tensive nesis. Dev. Biol. 26: 442-451.
Jurnich, V. A. and Burtis, K. C. 1993. A posi-tive reprogramming at the one- and two-cell stages.
Mayeda, A. and Krainer, A. R. 1992. Regu-lation
role in differentiation of the male dou-blesex Development 112: 821-932.
of alternative pre-mRNA splicing by hnRNP A1
protein of Drosophila. Dev. Biol. 155: 235-249.
Latham, K. E., Solter, D. and Schultz, R. M. and splicing factor SF2. Cell 68: 367-375.
Kabat, D. and Chappell, M. R. 1977. Com- 1992. Acquisition of a transcriptionally
McDevitt, M. A., Imperiale, M. J., Ali, H. and
petition between globin messenger ribonu-cleic permissive state during the 1-cell stage of mouse
Nevins, J. R. 1984. Requirement of a downstream
acids for a discriminating initiation factor. J. embryogenesis. Dev. Biol. 149:457-462.
sequence for the generation of poly(A) addition
Biol. Chem. 252: 2684-2690.
Lau, P. P., Xiong, W., Zhu, H.-J., Chen,S.-H. and site. Cell 37: 329-338.
Karibian, D. and London, I. M. 1965. Con-trol Chan, L. 1991. Apolipoprotein B mRNA editing
McGrew, L., Dworkin-Rastl, E., Dworkin, M. B.
of heme synthesis by feedback inhibi-tion. is an intranuclear event that occurs posttrans-
and Richter, J. D. 1989. Poly(A) elon-gation
Biochem. Biophys. Res. Commun. 18: 243-249. criptionally coincident with splicing and polya-
during Xenopus oocyte maturation is required for
denylation. J. Biol. Chem. 266: 20550-20554.
Kastern, W. H., Swindlehurst, M., Aaron, C., translational recruitment and is mediated by a
Hooper, J. and Berry, S. J. 1982. Control of Lee, R. C., Feinbaum, R. L. and Ambros, V. 1993. short sequence element. Genes Dev. 3: 803-815.
mRNA translation in oocytes and devel-oping The C. elegans heterochromatic gene lin-4
Meijlink, F., Curran, T., Miller, A. D. and Verma,
embryos of giant moths. I. Functions of the 5' encodes small RNAs with antisense complemen-
I. M. 1985. Removal of a 67-base pair sequence
terminal “cap” in the tobacco hornworm tarity to lin-14. Cell 75: 843-854.
in the non-coding region of protooncogene fos
Manduca sexta. Dev. Biol. 89: 437-449.
Levin, D., Ranu, R., Ernst, V. and London, I. M. converts it to a trans-forming gene. Proc. Natl.
Kelso-Winemiller, L. and Winkler, M. M. 1991. 1976. Regulation of protein synthesis in Acad. Sci. USA 82: 4987-4991.
“Unmasking” of stored maternal mRNAs and the reticulocyte lysates: Phosphorylation of
Melton, D. 1987. Translocation of a local-ized
activation of protein syn-thesisat fertilization in methionyl-tRNAf binding factor by protein
maternal mRNA to the vegetal pole of Xenopus
sea urchins. Develop-ment 111: 623-633. kinase activity of translational inhibitor iso-lated
oocytes. Nature 328: 80-82.
from heme-deficient lysates. Proc. Natl. Acad.
Kiledjian, M., Wang, X. and Liebhaber, S. A.
Sci. USA 73: 3112-3116. Mermod, J. J., Schatz, G. and Croppa, M. 1980.
1995. Identification of two KH domain pro-
Specific control of messenger transla-tion in
teins in the a-globin mRNP stability com-plex. Liang, L., Diehl-Jones, W. and Lasko, P. 1994.
Drosophila oocytes and embryos. Dev. Biol. 75:
EMBO J. 14: 4357-4364. Localization of vasa protein to the Drosophi-
177-186.
la pole plasm is dependent on its RNA-binding
Kim-Ha, J., Kerr, K. and Macdonald, P. M. 1995.
and helicase activities. Devel-opment 120: Moon, R. T., Danilchik, M. V. and Hille, M. 1982.
Translational regulation of oskar mRNA by bru-
1201-1211. An assessment of the masked mes-senger
hypothesis: Sea urchin egg messen-ger ribonucleo- Paris, J. and Richter, J. D. 1990. Maturation- Raychaudhury, P., Chaudhuri, A. and Maitra, U.
protein complexes are effi-cient templates for in specific polyadenylation and translational 1985. Formation and release of eukaryotic
vitro protein synthesis. Dev. Biol. 93: 389-03. control: Diversity of polyadenylation ele-ments, initiation factor 2 GDP complex during eukaryotic
influence of poly(A) tail size and the formation ribosomal polypeptide chain initiation complex
Moon, R. T., Nicosia, R. E, Olsen, C, Hille, M.
of stable polyadenylation complexes. Mol. Cell. formation. J. Biol. Chem. 260: 2140-2145.
B. and Jeffery, W. R. 1983. The cytoskele-tal
Biol. 10: 5634-5645.
framework of sea urchin eggs and em-bryos: Rebagliati, M. R., Weeks, D. L., Harvey, R. P.
Developmental changes in the asso-ciation of Paris, J., Swensen, K., Piwnica-Worms, H. and and Melton, D. A. 1985. Identification and
messenger RNA. Dev. Biol. 95: 447-458. Richter, J. D. 1991. Maturation-specific cloning of localized maternal RNAs from Xeno-
polyadenylation: In vitro activation by p34cdc2 pus eggs. Cell 42: 769-777.
Morle, F., Lopez, B., Henni, T. and Godet, J.
and phosphorylation of a 58-kD CPE-binding
1985. a-Thalassaemia associated with the deletion Restifo, L. L. and Guild, G. M. 1986. Poly(A)
protein. Genes Dev. 5: 1697-1708.
of two nucleotides at positions -2 and -3 preceding shortening of coregulated tran-scripts in Droso-
the AUG codon. EMBO J. 4: 1245-1250. Pavlakis, G. N., Lockard, R. E., Vam-vakopo- phila. Dev. Biol. 115: 507-510.
lous, N., Rieser, L., Rajbhandary, U. L. and
Mottes, J. R. and Iverson, L. E. 1995. Tissue- Richter, J. D. and Smith, L. D. 1984. Re-versible
Vournakis, J. N. 1980. Secondary structure of
specific alternative splicing of hybrid shaker/lacZ inhibition of translation by Xeno-pus oocyte-
mouse and rabbit a- and b-globin mRNAs:
genes correlates with kinetic dif-ferences in shaker specific proteins. Nature 309: 378-380.
Differential accessibility of ini-tiator AUG
K+ currents in vivo. Neu-ron 14: 613-623.
codons towards nucleases. Cell 19: 91-102. Robbie, E. P., Peterson, M., Amaya, E. and Musci,
Murata, Y. and Wharton, R. P. 1995. Bind-ing T. J. 1995. Temporal regulation of the Xenopus
Paynton, B. V., Rempel, R. and Bachvarova, R.
of pumillio to maternal hunchback mRNA is FGF receptor in development: A translation
1988. Changes in states of adenylation and time
required for posterior patterning in Drosophila inhibiting element in the 3' untranslated region.
course of degradation of maternal mRNAs during
embryos. Cell 80: 747-756. Development 121: 1775-1785.
oocyte maturation and early embryonic deve-
Nagoshi, R. N., McKeown, M., Burtis, K. C., lopment in the mouse. Dev. Biol. 129: 304-314. Rodgers, W. H. and Gross, P. R. 1978. Inho-
Belote, J. M. and Baker, B. S. 1988. The control mogeneous distribution of egg RNA se-quences
Pelletier, J. and Sonenberg, N. 1985. Inser-tional
of alternative splicing at genes reg-ulating sexu- in the early embryo. Cell 14: 279-288.
mutagenesis to increase secondary structure
al differentiation in D. melanogaster. Cell 53:
within the 5' noncoding region of a eukaryotic Rosenthal, E., Hunt, T. and Ruderman, J. V. 1980.
229-236.
mRNA reduces translational efficiency. Cell 40: Selective translation of mRNA con-trols the
Navaratnam, N., Bhattacharya, S., Fujino, T., 515-526. pattern of protein synthesis dur-ing early deve-
Patel, D., Jarmuz, A. L. and Scott, J. 1995. lopment of the surf clam, Spisula solidissima.
Poccia, D., Wolff, R., Kragh, S. and Williamson, P.
Evolutionary origins of apoB editing: catalysis Cell 20: 487-494.
1985. RNA synthesis in male pronuclei of the sea
by a cytidine deaminase that has acquired a
urchin. Biochim. Bio-phys. Acta 824: 349-356. Ruskin, B., Zamore, P. D. and Green, M. R.
novel RNA-binding motif at its active site. Cell
1988. A factor, U2AF, is required for U2 snRNP
81:187-195. Powell, L. M., Wallis, S. C., Pease, R. J., Ed-wards,
binding and splicing complex as-sembly. Cell
Y. H., Knott, T. J. and Scott, J. 1987. A novel form
Newport, J. and Kirschner, M. 1982. A major 52: 207-219.
of tissue-specific RNA pro-cessing produces
developmental transition in early Xenopus
apolipoprotein-B48 in in-testine. Cell 50: 831-840. Safer, B. 1989. Nomenclature of initiation,
embryos. II. Control of the onset of transcription.
elongation and termination factors for translation
Cell 30: 687-696. Proudfoot, N. J. and Brownlee, G. G. 1976. 3'
in eukaryotes. Eur. J. Biochem. 186: 1-3.
Non-coding region sequences in eukary-otic
Orkin, S. H., Cheng, T.-C., Antonarakis, S. E.
messenger RNA. Nature 263: 211-214. Sallés, F. J., Liebfarb, M. E., Wreden, C., Gergen,
and Kazazian, H. H., Jr. 1985. Tha-lassemia due
J. P. and Strickland, S. 1994. Coor-dinate
to a mutation in the cleavage-polyadenylation Raff, R. A. 1980. Masked messenger RNA and
initiation of Drosophila development by
signal of the human b-globin gene. EMBO J. 4: the regulation of protein synthesis in eggs and
regulated polyadenylation of maternal messenger
453-456. embryos. In D. M. Prescott and L. Goldstein
RNAs. Science 266:1996-1999.
(eds.), Cell Biology: A Comprehen-sive Treatise,
d’Orval, B. C., Carafa, Y. d’A., Sirand-Pugnet,
Vol. 4. Academic Press, New York, pp. 107-136. Sarkar, G., Edery, L, Gallo, R. and Sonen-berg, N.
P., Gallego, M., Brody, E. and Marie, J. 1991.
1984. Preferential stimulation of rabbit a-globin
RNA secondary structure re-pression of a Ramaiah, K. V. A., Dhindsa, R. S., Chen, J. J.,
mRNA translation by a cap-binding protein
muscle-specific exon in HeLa cell nuclear London, I. M. and Levin, D. 1992. Recy-cling
complex. Biochim. Bio-phys. Acta 783: 122-129.
extracts. Science 252: 1823-1828. and phosphorylation of eukaryotic initiation
factor 2 on 60S subunits of 70S initiation Savage, M. P. and Fallen, J. F. 1995. FGF-2
Ostareck-Lederer, A., Ostareck,D. H., Stan-dart,
complexes and polysomes. Proc. Natl. Acad. messenger RNA and its antisense message are
N. and Thiele, B. 1994. Translation of 15-
Sci. USA 89:12063-12067. expressed in a developmentaly specific manner
lipoxygenase mRNA is inhibited by a protein
in the chick limb bud and mesonephros. Dev.
that binds to a repeated sequence in the 3' Ranu, R. S., Levin, D. H., Delaunay, J., Ernst, U.
Dyn. 202: 343-353.
untranslated region. EMBO J. 13: 1476-1481. and London, I. M. 1976. Regula-tion of protein
Characteristics of inhibition of protein synthesis Schauer, I. E. and Wood, W. B. 1990. Early C.
Ovsenek, N., Zorn, A. M. and Krieg, P. A. 1992.
by a translational in-hibitor from heme-deficient elegans embryos are transcriptionally ac-tive.
A maternal factor, OZ-1, activates em-bryonic
lysates and its relationship to the initiation factor Development 110:1303-1317.
transcription of the Xenopus laevis GS17 gene.
which binds Met-tRNAf. Proc. Natl. Acad. Sci.
Development 115: 649-655. Scott, J. 1995. A place in the world for RNA
USA 73: 2720-2726.
editing. Cell 81: 833-836.
Palatnik, C. M., Wilkins, C. and Jacobson, A.
Ray, B. K. and eight others. 1983. Role of mRNA
1984. Translational control during early Sharma, P. M., Bowman, M., Madden, S. L.,
competition in regulating transla-tion: Further
Dictyostelium development: Possible in- Rauscher, F. J. Ill and Sukumar, S. 1994. RNA
characterization of mRNA discriminatory
volvement of poly(A) sequences. Cell 36: editing in the Wilms’ tumor suppres-sor gene,
initiation factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1017-1025. WT-1. Genes Dev. 8: 720-731.
80: 663-667.
Shatkin, A. J. 1976. Capping of eukaryotic Swiderski, R. E. and Richter, J. D. 1988. Wang, C., Dickinson, L. K. and Lehmann, R.
mRNAs. Cell 9: 645-653. Photocrosslinking of proteins to maternal mRNA 1994. Genetics of nanos localization in Droso-
in Xenopus oocytes. Dev. Biol. 128: 349-358. phila. Dev. Dyn. 199: 103-115.
Shatkin, A. J. 1985. mRNA cap binding pro-
teins: Essential factors for initiating transla-tion. Tamkun, J. W., Schwartzbauer, J. E. and Hynes, Weir, M. P. and Kornberg, T. 1985. Patterns of
Cell 40: 223-224. R. O. 1984. A single rat fibronectin gene engrailed and fushi tarazu transcripts re-veal
generates three different mRNAs by alternative novel intermediate stages of Drosophila
Shaw, G. and Kamen, R. 1986. A conserved AU
splicing of a complex exon. Proc. Natl. Acad. segmentation. Nature 318: 433-439.
sequence from the 3' untranslated re-gion of GM-
Sci. USA 81: 5140-5144.
CSF mRNA mediates selective mRNA degradation. Wharton, R. P. and Struhl, G. 1991. RNA
Cell 46: 659-667. Taylor, M. A. and Smith, L. D. 1985. Quan-titative regulatory elements mediate control of Droso-
changes in protein synthesis during oogenesis in phila body pattern by the posterior morphogen,
Sheets, M. D., Fox, C. A., Hunt, T., Vande Woude,
Xenopus laevis. Dev. Biol. 110: 230-237. nanos. Cell 67: 955-967.
G. and Wickens, M. 1994. The 3' untranslated
region of c-mos and cyclin mRNAs stimulate Telford, N. A., Watson, A. J. and Schultz, G. A. Wickens, M. and Stephenson, P. 1984. Role of
translation by regulating cytoplasmic polyade- 1990. Transition from maternal to em-bryonic the conserved AAUAAA sequence: Four
nylation. Genes Dev. 8: 926-938. control in early mammalian devel-opment: A AAUAAA point mutants prevent 3' end
comparison of several species. Mol. Reprod. Dev. formation. Science 226: 1045-1051.
Showman, R. M., Wells, D. E., Anstrom, J.,
26: 90-100.
Hursh, D. A. and Raff, R. A. 1982. Message- Wickens, M. 1992. Introduction: RNA and the
specific sequestration of maternal histone mRNA Thach, R. E. 1992. Cap recap: The involve- early embryo. Semin. Dev. Biol. 3: 363-365.
in the sea urchin egg. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ment of eIF-4F in regulating gene expres-sion.
Wickens, M. and Takayama, K. 1994. De-
79: 5944-5947. Cell 69:177-180.
viants—or emissaries. Nature 367:17-18.
Simon, R., Tassan, J.-P. and Richter, J. D. 1992. Thomas, N. S. B., Matts, R. L., Levin, D. H. and
Wightman, B., Ha, I. and Ruvkun, G. 1993.
Translational control by poly(A) elon-gation London, I. M. 1985. The 60S ribosomal subunit
Posttranslational regulation of the hete-
during Xenopus development: Dif-ferential as a carrier of eukaryotic initiation factor 2 and
rochronic gene lin-14 by lin-4 mediates tempo-
regressions and enhancement by a novel the site of reversing factor ac-tivity during protein
ral pattern formation in C. elegans. Cell 75:
cytoplasmic polyadenylation ele-ment. Genes synthesis. /. Eiol. Chem. 260: 9860-9866.
855-862.
Dev. 6: 2580-2591.
Tian, M. and Maniatis, T. 1993. Positive control
Wilson, T. and Treisman, R. 1988. Removal of
Simpson, L. and Thiemann, O. H. 1995. Sense of pre-mRNA splicing in vitro. Sci-ence 256:
poly(A) and consequent degradation of c-fos
from nonsense: RNA editing in mito-chondria 237-240.
mRNA facilitated by 3' AU-rich se-quences.
of kinetoplastid protozoa and slime molds. Cell
Tian, M. and Maniatis, T. 1993. A splicing Nature 336: 396-399.
81: 837-840.
enhancer complex controls alternative splicing
Winkler, M. M. and Steinhardt, R. A. 1981.
Smibert, C. A., Wilson, J. E., Kerr, K. and of doublesex pre-mRNA. Cell 74: 105-114.
Activation of protein synthesis in a sea urchin
Macdonald, P. M. 1996. Smaug protein re-presses
Varnum, S. M. and Wormington, W. M. 1990. cell-free system. Dev. Biol. 84: 432-439.
translation of unlocalized nanos mRNA in the
Deadenylation of maternal mRNAs during Xe-
Drosophila embryo. Genes Dev. 10: 2600-2609. Winkler, M. M., Nelson, E. M., Lashbrook, C.
nopus oocyte maturation does not require cis
and Hershey, J. W. B. 1985. Multiple lev-els of
Sommer, B., Köhler, M., Sprengel, R. and sequences: A default mechanism for translational
regulation of protein synthesis at fer-tilization
Seeburg, P. H. 1991. RNA editing in brain controls control. Genes Dev. 4: 2278-2286.
in sea urchin eggs. Dev. Eiol. 107: 290-300.
a determinant of ion flow in gluta-mate-gated
Valcárcel, J., Singh, R., Zamore, P. D. and Greene,
channels. Cell 67: 11-19. Wold, B. J., Klein, W. H., Hough-Evans,B. R.,
M. R. 1993. The protein Sex-lethal antagonizes
Britten, R. J. and Davidson, E. H. 1978. Sea
Sosnowski, B. A., Belote, J. M. and McKe-own, the splicing factor U2AF to regulate alternative
urchin embryo mRNA sequences ex-pressed in
M. 1989. Sex-specific alternative splic-ing of splicing of transformer pre-mRNA. Nature 362:
nuclear RNA of adult tissues. Cell 14: 941-950.
RNA from the transformer gene re-sults from 171-175.
sequence-specific splice site blockage. Cell 58: Wu, J. and Maniatis, T. 1993. Specific inter-
Varnum, S., Hurney, C. A. and Worming-ton, W.
449-459. actions between proteins implicated in splice
M. 1992. Maturation-specific dead-enylation in
site selection and regulated alterna-tive splicing.
Spirin, A. S. 1966. On “masked” forms of mes- Xenopus oocytes requires nu-clear and cytoplas-
Cell 75: 1061-1070.
senger RNA in early embryogenesis and in other mic factors. Dev. Biol. 153: 283-290.
differentiating systems. Curr. Top. Dev. Eiol. Young, E. M. and Raff, R. A. 1979. Messen-ger
Vassalli, J. D. and seven others. 1989. Regu-
1: 1-38. ribonucleoprotein particles in develop-ing sea
lated polyadenylation controls mRNA transla-
urchin embryos. Dev. Biol. 72: 24-40.
Standart, N. 1992. Masking and unmasking of tion during meiotic maturation of mouse oocytes.
maternal mRNAs. Semin. Dev. Biol. 3: 367-379. Genes Dev. 3: 2163-2171. Zorn, A. M. and Krieg, P. A. 1992. Develop-
mental regulation of alternative splicing in the
Standart, N., Hunt, T. and Ruderman, J.V. 1986. Wagenaar, E. B. and Mazia, D. 1978. The ef-
mRNA encoding Xenopus laevis neural cell
Differential accumulation of ribonu-cleotide fect of emetine on the first cleavage divi-sion
adhesion molecule (N-CAM). Dev. Biol. 149:
reductase subunits in clam oocytes: The large of the sea urchin, Strongylocentrotus purpuratus.
197-205.
subunit is stored as a polypeptide, the small In E. R. Dirksen, D. M. Prescott and L. F. Fox
subunit as untrans-lated mRNA. J. Cell Biol. 103: (eds.), Cell Reproduction: In Honor of Daniel Zucker, W. V. and Schulman, H. M. 1968.
2129-2136. Mazia. Academic Press, New York, pp. 539-545. Stimulation of globin-chain initiation by hemin
in the reticulocyte cell-free system. Proc. Natl.
Standart, N., Dale, M., Stewart, E. and Hunt, T. Walker, J. Dale, M. and Standart, N. 1996.
Acad. Sci. USA 59: 582-589.
1990. Maternal mRNA from clam oocytes can Unmasking messenger RNA in clam oocytes:
be specifically unmasked in vitro by antisense Role of phosphorylation of a 3’UTR masking
RNA complementary to the 3' untranslated element-binding protein at fertilization. Dev.
region. Genes Dev. 4: 2157-2168. Biol. 173: 292-305.
Especificação do Destino
Celular e os Eixos Embrionários
13 Especificação celular autônoma por determinantes citoplasmáticos

14 A genética da especificação axial em Drosophila 543
IV505
15 Especificação do destino celular por interações célula-célula progressivas 591

16 Estabelecimento dos eixos corporais em mamíferos e aves 635
Especificação celular autônoma
por determinantes citoplasmáticos 13
Considero provável que nas células
germinativas existem tênues diferenças in-
ternas que predeterminam a transformação
subseqüente às substâncias determinantes;
essas diferenças não são meras potências pre-
C ADA ORGANISMO METAZOÁRIO é formado por uma complexa variedade
de células especializadas. Por exemplo, as células vermelhas e brancas do
sangue não só diferem umas das outras mas também diferem das células do
coração, responsáveis pela propulsão dessas células pelo corpo. Também são dife-
rentes dos neurônios alongados que conduzem impulsos neurônicos do cérebro ao
sentes nas células germinativas, mas dife- coração, e de células glandulares que secretam hormônios no sangue. A Tabela 13.1
renças materiais reais tão pequenas que até apresenta uma lista incompleta dos tipos de células especializadas, seus produtos
agora não pudemos demonstrá-las. característicos e suas funções.
R. VIRCHOW (1858)
Estudando a fase de clivagem nos aproxi-

Comprometimento celular e diferenciação
mamos da nascente de onde emergem os rios
progressivamente ramificados da diferenci- O desenvolvimento de tipos especializados de células de um único ovo fertilizado é
ação que deságuam finalmente em plácidas chamado diferenciação. Essa evidente mudança na bioquímica e função celular é
lagoas, as células individuais do complexo precedida por um processo envolvendo um comprometimento dissimulado das célu-
organismo adulto. las a um destino em particular ou a um conjunto de destinos. Nessa fase, a célula não
E. E. JUST (1939) parece ser fenotipicamente diferente do seu estado não comprometido, mas de algu-
ma forma o seu desenvolvimento se tornou restrito. Embora os embriologistas tenham
usado rotineiramente a palavra determinação para descrever esse comprometimento
oculto, um tipo de tecido em particular pode ser classificado como determinado, ou
não determinado, dependendo de qual ensaio foi usado para a determinação (ver
Harrison, 1933). Slack (1991) dividiu esse comprometimento em dois estágios,
especificação e determinação. Uma célula ou tecido pode ser especificado quando é
capaz de diferenciar-se de forma autônoma quando colocado em um ambiente neutro
tal como uma placa de petri. (Esse ambiente é “neutro” em relação à via do desenvol-
vimento.) Uma célula ou tecido pode ser determinado quando é capaz de diferenciar-
se de maneira autônoma quando colocado em outra região do embrião. Se a diferenci-
ação se dá de acordo com o destino original mesmo com a colocação em outra região
do embrião, assume-se que o comprometimento é irreversível.
Nós conhecemos três vias principais pelas quais esse comprometimento pode
acontecer (Tabela 13.2). O primeiro mecanismo de comprometimento, envolve a segre-
gação citoplasmática de moléculas determinativas durante a clivagem embrionária
pelo qual os planos de clivagem separam regiões qualitativamente diferentes do cito-
plasma do zigoto em células-filha diferentes. Cada célula se torna específica pelo tipo
de citoplasma que ela adquire durante a clivagem, de modo que o destino da célula é
determinado sem nenhuma referência às células vizinhas. Esse mecanismo de compro-
meter o destino das células é chamado de especificação autônoma, porque as células
505
506 PARTE III Especificação do Destino Celular e os Eixos Embrionários
Tabela 13.1 Alguns tipos de células diferenciadas e seus principais produtos

Produto da célula
Tipo de célula diferenciada Função especializada
Queratinócito Queratina Proteção contra abrasão
(célula da pele) e dessecação
Eritrócito
(célula vermelha do sangue) Hemoglobina Transporte de oxigênio
Célula do cristalino Cristalinas Transmissão de luz
Linfócito B Imunoglobulinas Síntese de anticorpos
Linfócito T Antígenos da superfície Destruição de células
celular (linfocinas) estranhas; regulação
da resposta imune
Melanócito Melanina Produção de pigmento
Células das Insulina Regulação do
ilhotas pancreáticas metabolismo de
carboidratos
Célula de Leydig () Testosterona Características sexuais
masculinas
Condrócito Sulfato de condroitina; Tendões e ligamentos
(célula da cartilagem) colágeno tipo II
Osteoblasto
(célula formadora de osso) Matriz óssea Suporte do esqueleto
Miócito Actina e miosina Contração
(célula muscular) do músculo
Hepatócito
(célula do fígado) Albumina do soro; Produção de proteínas
numerosas enzimas do soro e numerosas
funções enzimáticas
Neurônios Neurotransmissores Transmissão de
(acetilcolina, impulsos elétricos
epinefrina, etc.)
Célula tubular ( ) Ovalbumina Proteínas do
do oviduto da galinha albúmen do
ovo e proteção
do embrião
Célula folicular ( ) Proteínas coriônicas Proteínas da casca do
do oviduto de inseto ovo para proteção
do embrião
são especificadas pelos seus próprios componentes citoplasmáticos internos

(Davidson, 1991). Dessa maneira, se um determinado blastômero fosse removido pre-
cocemente no desenvolvimento, esse produziria as mesmas células como quando
ainda fazia parte de um embrião maior, e o embrião remanescente não possuiria aquelas
células (e somente aquelas células) que teriam sido formadas pelas células que foram
retiradas (veja Figura 1.29). A especificação autônoma faz surgir um padrão de embrio-
gênese referido como desenvolvimento em mosaico, uma vez que o embrião parece ser
formado por um mosaico de peças autodiferenciadas.
Uma segunda maneira de comprometer o destino das células envolve a interação
com células vizinhas. Aqui, as células originalmente têm a habilidade de seguir mais de
um caminho de diferenciação, e a interação dessas células com outras células ou
tecidos restringe os destinos de um ou ambos os participantes. Esse tipo de determi-
nação do destino celular é muitas vezes chamado de especificação condicional, por-
que o destino de uma célula depende das condições nas quais ela se encontra. Se um
blastômero fosse removido de um embrião precoce de um organismo com especificação
condicional de suas células, as células embrionárias remanescentes poderiam alterar
seus destinos normais para que o papel da célula desaparecida fosse preenchido.
Dessa maneira, a especificação condicional faz surgir um padrão de embriogênese
chamado de desenvolvimento regulador. Como ainda veremos, todos os organismos
CAPÍTULO 13 Especificação celular autônoma por determinantes citoplasmáticos 507
Tabela 13.2 Modelos de especificação do tipo celular e suas características
I. Especificação autônoma
Característica da maioria dos invertebrados.
Especificação pela aquisição de certas moléculas citoplasmáticas presentes no ovo.
Clivagens invariantes produzem as mesmas linhagens em cada embrião da espécie.
Destinos dos blastômeros são geralmente invariantes.
Linhagens de “Células âncoras” são usualmente especificadas de maneira autônoma
nos pólos dos eixos embrionário.
Especificação do tipo celular precede qualquer migração celular embrionária em larga escala.
Produz desenvolvimento em “mosaico” (“determinativo”): células não podem
modificar o destino se um blastômero é perdido.
II. Especificação condicional

Característica de todos vertebrados e poucos invertebrados.
Especificação por interações entre células. Posições relativas são importantes.
Clivagens variáveis não produzem destinações invariantes para as células.
Enormes rearranjos e migrações celulares precedem ou acompanham a especificação.
Capacidade para desenvolvimento “regulativo”: permite que as células adquiram
diferentes funções.
III. Especificação sincicial

Característica da maioria das classes de insetos.
Especificação das regiões do corpo por interações entre regiões citoplasmáticas
antes da celularização do blastoderma.
Clivagem variável não produz destinos celulares rígidos para certos núcleos.
Após a celularização, a especificação condicional é vista com freqüência.
Fonte: De acordo com Davidson, 1991.
usam ambos os meios, autônomo e condicional para especificar diferentes tipos de

células, existindo um espectro de variações entre o desenvolvimento em mosaico e o
desenvolvimento regulativo. No entanto, na maioria dos invertebrados a especifica-
ção do tipo celular é predominantemente autônoma, enquanto os vertebrados são
caracterizados pelo uso extensivo da especificação condicional.
Muitos insetos também usam uma terceira via para a determinação do destino
celular. Nesses casos, interações entre componentes maternos dentro do blastoderma
sincicial ocorrem antes que tenham se formado as membranas celulares que separam
os núcleos. Na especificação sincicial, grande parte das decisões quanto aos desti-
nos das células são feitas antes mesmo que as células tenham sido formadas. Este
capítulo focalizará experimentos que demonstram a especificação autônoma, enquan-
to que os capítulos seguintes irão cobrir os modos condicionais e sinciciais do com-
prometimento celular durante a embriogênese precoce.
Pré-formação e epigênese
Qualquer explicação sobre a diferenciação das diversas células corporais, a partir do
ovo fertilizado tem que explicar (1) a constante morfologia de cada espécie (i.e., que
galinhas somente geram galinhas, e não crocodilos) e (2) a diversidade entre as partes
corporais de cada organismo. Na verdade, uma das principais características do de-
senvolvimento é que cada espécie reproduz seu padrão de desenvolvimento. O de-
senvolvimento envolve a expressão das propriedades herdadas pelas espécies.
No século dezessete, a união de herança e desenvolvimento foi obtida com a
hipótese do pré-formacionismo. De acordo com essa visão, todos os órgãos do adul-
to estariam prefigurados em miniatura dentro do espermatozóide ou (mais usualmente)
no óvulo. Os organismos não eram considerados como “desenvolvidos”, mais sim
“desenrolados”. Essa hipótese encontrava apoio na ciência e na filosofia (Gould,
1977; Roe, 1981). Primeiro, porque todos os órgãos eram prefigurados, o desenvolvi-
mento embrionário meramente requeria o crescimento de estruturas existentes, e não a
formação de novas. Nenhuma força misteriosa extra era necessária para o desenvolvi-
mento embrionário. Segundo, assim como o organismo adulto era prefigurado em
células germinativas, a outra geração já existia em estado prefigurado dentro das
células germinativas da primeira geração prefigurada. Esse corolário, chamado de
embôitment (encapsulação), assegurava que as espécies sempre permaneceriam cons-
tantes. Embora alguns microscopistas alegassem enxergar miniaturas humanas total-
mente desenvolvidas dentro do espermatozóide ou do óvulo, os maiores proponentes
dessa hipótese - Albrecht von Haller e Charles Bonnet- sabiam que o desenvolvimen-
to dos sistemas orgânicos se dava em velocidades diferentes e que as estruturas
embrionárias não precisavam estar no mesmo lugar daquelas do recém-nascido.
Os pré-formacionistas não tinham uma teoria celular para fornecer um limite inferi-
or para o tamanho dos seus organismos pré-formados, e nem tinham uma visão do
domínio do ser humano sobre a Terra como sendo infinito. Pelo contrário, como disse
Bonet (1764) “O trabalho da natureza é tão pequeno quanto ela deseja”, e a espécie
humana existia no finito espaço compreendendo a criação e a ressurreição. Isso esta-
va de acordo com a melhor ciência da época, e de acordo com o princípio do matemá-
tico e filósofo francês René Descartes sobre a divisibilidade infinita de uma natureza
mecânica iniciada, mas não interferida por Deus.
A pré-formação era uma teoria conservadora, enfatizando a falta de mudanças
entre gerações. Sua principal falha era a inabilidade em explicar as variações já conhe-
cidas pela limitada evidência genética da época. Sabia-se, por exemplo, que a união
entre uma pessoa branca e outra negra gerava filhos de uma cor intermediária entre as
duas, uma impossibilidade se a herança e o desenvolvimento ocorressem somente
através do óvulo ou do espermatozóide. Em experimentos com um controle maior, o
botânico alemão, Joseph Kölreuter (1766) produziu plantas híbridas de tabaco conten-
do características de ambas as espécies. Ademais, cruzando o híbrido tanto com o
ascendente masculino ou o feminino, Kölreuter foi capaz de “reverter” as característi-
cas do híbrido de volta àquelas de um ou outro ascendente, após várias gerações.
Dessa maneira, a herança parecia depender de uma mistura de componentes dos pais.
E mais, a pré-formação não podia explicar a geração de “monstruosidades” e determi-
nados desvios, tal como o hexadactilismo (seis dedos em cada mão), quando ambos
os pais eram normais.
Desenvolveu-se, então, uma hipótese alternativa: epigênese. De acordo com essa
hipótese, cada organismo adulto se desenvolveria novamente a partir de uma condi-
ção não diferenciada. Essa visão do desenvolvimento, tendo raízes filosóficas remon-
tando a Aristóteles, foi revivida por Kaspar Friedrich Wolff, um embriologista alemão
que trabalhava em St. Petersburg. Observando cuidadosamente embriões de pinto,
Wolff demonstrou que as partes embrionárias se desenvolvem de tecidos que não têm
contrapartida no organismo adulto. O coração e os vasos sangüíneos (que de acordo
com os pré-formacionistas, tinham que estar presentes desde o começo para assegu-
rar o crescimento embrionário) podiam ser vistos se desenvolvendo de novo em cada
embrião. Similarmente, foi visto que o tubo intestinal se originava das dobras de um
tecido originalmente plano. Essa última observação foi explicitamente detalhada por
Wolff (1767) que declarou: “Quando a formação do intestino por essa maneira for
adequadamente avaliada não existirá nenhuma dúvida, eu acredito, sobre a verdade
da epigênese.” No entanto, para explicar como o organismo é criado novamente a cada
geração, Wolff teve que postular uma força desconhecida, a vis essentialis (“força
essencial”), a qual agindo como a gravidade ou o magnetismo organizaria o desenvol-
vimento embrionário.
O pré-formacionismo explica melhor a continuidade das gerações, enquanto que a
epigênese explica melhor a variação e as observações diretas na formação dos órgãos.
Uma certa reconciliação entre as partes foi tentada pelo filósofo alemão Immanuel
Kant (1724-1804) e seu colega, o biologista Friedrich Blumenbach (1752-1840). Na
tentativa de construir uma teoria científica de descendência racial, Blumenbach postu-

lou uma força mecânica, objetivamente dirigida chamada Bildungstrieb (“força de
desenvolvimento”). Tal força, dizia ele, não era teórica, mas poderia ser demonstrada
através de experimentação. A Hydra, quando cortada, regenera suas partes amputa-
das através de um remanejamento de elementos existentes. Algum tipo de força
organizadora proposital podia ser observada nessa operação, e essa força era uma
propriedade do próprio organismo. Imaginava-se que essa Bildungstrieb fosse uma
herança adquirida através de células germinativas. Dessa maneira, o desenvolvimento
poderia prosseguir epigeneticamente através de uma força predeterminada inerente à
matéria do embrião (Cassirer, 1950; Lenoir, 1980). Ademais, acreditava-se que tal força
era suscetível a mudanças, como demonstrado pela variante da concha do caracol,
com espirais voltadas para o lado esquerdo.
Nessa hipótese, onde o desenvolvimento epigenético é direcionado por instru-
ções pré-formadas, não estamos muito distantes da visão de alguns biologistas mo-
dernos considerando que “A descrição completa do organismo já está escrita no ovo”
(Brenner, 1979). No entanto, até a redescoberta dos trabalhos de Mendel, no começo
do século vinte, não havia uma teoria genética consistente na qual se poderia encaixar
tais idéias sobre variações herdadas, e cada cientista era livre para especular sobre os
mecanismos pelos quais os padrões de desenvolvimento são herdados.
Os Teratologistas F
Teratologistas ranceses
Franceses
As tentativas de encontrar hipóteses que explicassem a constância das espécies e o

desenvolvimento epigenético levaram à criação da moderna embriologia. As buscas
por tais hipóteses foram executadas sob duas tradições intelectuais diferentes. Uma,
centralizada na França, buscava os mecanismos pelos quais erros embriológicos cau-
savam o nascimento de crianças com anormalidades de desenvolvimento. Essa ciên-
cia ficou conhecida como teratologia, ou estudo de malformações congênitas. A se-
gunda busca estava centralizada na Alemanha, e estava voltada para a fisiologia dos
processos do desenvolvimento. Ambas as correntes de pesquisa iniciaram a manipu-
lação de embriões para verificar como um organismo em desenvolvimento iria respon-
der a essas perturbações (Churchill, 1973; Fischer e Smith, 1984).
Os experimentos teratológicos franceses começaram na década de 1820 com os
estudos de Etienne Geoffrey Saint-Hilaire e seu filho, Isadore. Essas investigações
tentaram mostrar que nascimentos anômalos eram produtos de uma falha no desen-
volvimento fetal ao invés de aberrações pré-formadas. Eles buscavam produzir ano-
malias de desenvolvimento artificialmente, alterando as condições de incubação do
ovo de galinha em desenvolvimento. Apesar dos inúmeros fracassos dessas tentati-
vas (suas técnicas rudimentares, ou permitiam a continuação do desenvolvimento
normal ou terminavam por matar os embriões), eles abriram o caminho para as análises
mais refinadas de Dareste em 1877. Dareste realizou milhares de experimentos e acom-
panhou anormalidades no desenvolvimento de aves desde os primeiros estágios do
seu desenvolvimento.
Mas o embrião de pinto foi uma má escolha de organismo para estudar os primei-
ros estágios da embriogênese. Se a intenção era examinar se perturbações nos primei-
ros estágios do desenvolvimento afetavam as estruturas adultas, dever-se-ia usar um
outro organismo. Em 1866, um francês, estudante de medicina, Laurent Chabry, come-
çou a estudar a teratogênese no embrião de tunicado, um organismo mais acessível.
Essa foi uma escolha muito feliz, porque esses embriões desenvolvem-se rapidamente
em larvas, com relativamente poucas variedades de células. Chabry se concentrou em
produzir malformações específicas, lancetando blastômeros específicos de embriões
de tunicados em clivagem. Ele descobriu que cada blastômero era responsável pela
produção de um conjunto particular de tecidos larvares. Na ausência dessas células,
a larva deixava de apresentar justamente as estruturas normalmente formadas por
aquelas células. Além disso, ele observou que quando algumas células em particular
eram isoladas do resto do embrião, elas formavam sua estrutura característica inde-
pendentemente do contexto das outras células. Dessa maneira, cada uma das células
tunicadas aparentavam estar se desenvolvendo de maneira autônoma.* Como discu-
timos anteriormente, essa habilidade de cada célula desenvolver-se independente-
mente de outras células embrionárias é freqüentemente chamada de desenvolvimento
autônomo ou em mosaico, porque o embrião aparenta ser um mosaico de partes
autodiferenciadas.
Especificações autônomas em embriões de tunicados

Estudos mais recentes mostraram que o embrião de tunicado de fato se assemelha a
um “mosaico de partes autodiferenciadas” construído com informações armazenadas
no citoplasma do oócito. Com a divisão do embrião, diferentes células incorporam
diferentes regiões do citoplasma. Acredita-se que essas diferentes regiões
citoplasmáticas contenham determinantes morfogenéticos que controlam o compro-
misso da célula com um determinado tipo de célula. Estudos de determinação em
Figura 13.1
Segregação dos determinantes citoplasmáticos *Essa não foi a resposta pela qual Chabry esperava ou pretendia encontrar. Na França do século
por ocasião da fertilização. (A) Mapa de desti- dezenove, os conservadores favoreciam a visão dos pré-formacionistas, que era interpretada como
no das regiões citoplasmáticas do tunicado apoio às desigualdades hereditárias dos membros de uma comunidade. O que você era, era determi-
Halocynthia roretzi logo após o término dos nado pela sua linhagem. Os liberais, especialmente os socialistas, aprovaram as visões epigenéticas,
movimentos citoplasmáticos da fertilização. as quais foram interpretadas como indicando que todos começavam com a mesma dotação heredi-
Anterior é para a esquerda, posterior para a tária, e que ninguém tinha o “direito” a uma posição mais alta do que a do outro. Chabry, um
socialista que odiava os direitos hereditários dos aristocratas, se esforçou para não extrapolar seus
direita. (B) Os órgãos da larva tunicada. (A de
dados para nada além dos embriões tunicados.
acordo com Nishida, 1987.)
Células pigmentadas
(A) VISTA ANIMAL
VISTA LATERAL Tronco cerebral
Medula espinhal
Medula espinhal Epiderme Músculo
Tronco cerebral Músculo Palpos Notocorda
Células
pigmentadas Cérebro Mesênquima
Tronco cerebral
Medula espinhal Células filamentosas
Cérebro Notocorda endodérmicas
Palpos
Endoderma
Células Células filamentosas endodérmicas
pigmentadas Epiderme
Tronco cerebral
Medula espinhal Músculo Células laterais do tronco
VISTA VEGETAL
Células laterais
Músculo do tronco
Endoderma (B) Manto
Notocorda
Notocorda (Ectoderma)
Mesênquima
Mancha ocelar Cérebro
Músculo Cordão nervoso Notocorda
Boca
Tronco
cerebral Células
filamentosas Palpo
endodérmicas
Estômago Célula
muscular
Medula espinhal
Músculo Mesênquima Faringe Coração
(endoderma) Endóstilo
Células
Notocorda (endoderma)
laterais do tronco
células de tunicados têm sido imensamente auxiliados por ovos de certas espécies
que segregam o seu citoplasma em uma série de regiões coloridas, imediatamente após
a fertilização (Prancha11).
O determinante formador de músculos do crescente amarelo
Em 1905, E. G. Conklin descreveu como esses plasmas coloridos se repartiam em vários

blastômeros. A primeira clivagem separa o ovo em duas partes, imagens espelhares
direita e esquerda. Daí em diante, cada divisão celular em um lado é paralela a uma
divisão celular do outro lado. Observando o destino de cada blastômero do tunicado
Styela partita, Conklin tirou a surpreendente conclusão de que cada região colorida
do citoplasma delineia um destino embrionário específico (Figura 13.1). O citoplasma
do crescente amarelo dá origem às células musculares; o crescente equatorial cinza
produz a notocorda e o tubo neural; o citoplasma claro do pólo animal se torna a
epiderme larval; e a região vegetativa cinza do vitelo dá origem ao intestino larval.
Reverberi e Minganti (1946) analisaram a determinação tunicada em uma série de
experimentos de isolamento, e eles também observaram a autodiferenciação de cada
blastômero isolado e o restante do embrião. O resultado de um desses experimentos é
mostrado na Figura 13.2. Quando o embrião de oito células é separado em seus quatro
pares (os lados direito e esquerdo sendo equivalentes), a determinação em mosaico é
a regra. O par posterior de blastômeros do pólo animal dão origem ao ectoderma; o par
posterior do pólo vegetal produz o endoderma, o mesênquima e o tecido muscular,
como esperado pelo mapa de destino. O desenvolvimento neural é uma exceção. As
células produtoras de nervos são geradas por ambos os quadrantes anteriores, animal e
vegetal, e nenhum deles as produz sozinho. Todavia, quando esses pares anteriores são
reunidos surgem os tecidos do cérebro e do palpo. Mesmo em embriões estritamente
PÓLO ANIMAL
Ectoderma
ANTERIOR
POSTERIOR
Sistema nervoso
Mesênquima
Notocorda
Músculo
Endoderma PÓLO VEGETAL
Separação dos pares

de blastômeros
Ectoderma Ectoderma
Notocorda Figura 13.2

Músculo Determinação em mosaico nos tunicados.
Mesênquima Quando os quatro pares de blastômeros do
embrião de oito células estão dissociados, eles
Endoderma se desenvolvem como indicado, cada um for-
Endoderma mando estruturas separadas. (De acordo com
Reverberi e Minganti, 1946.)
Estágio celular
Horas a 100 C
A6.1 endoderma
A7.3 notocorda
Tronco cerebral
Vegetal A7.5 endoderma Medula espinhal
A7.6 células laterais do tronco
A7.7 notocorda
medula espinhal
músculo
Animal
cérebro Cérebro
palpos
Faringe primordial
Anterior
epiderme palpos
Célula pigmentada
epiderme Cérebro
epiderme
epiderme
endoderma Endoderma
Filamento
mesênquima
Esquerda
endodérmico
notocorda
Posterior
músculo
Músculo
Vegetal
Endoderma
filamento endodérmico
mesênquima Músculo
Medula espinhal
Direita
músculo Filamento
endodérmico
Animal
epiderme
Tronco cerebral
epiderme Medula espinhal
Músculo
epiderme
b5.4 epiderme
Figura 13.3
Linhagem determinativa de blastômeros
tunicados. (A) Mapa de destino de linhagem
determinados como os dos tunicados, algumas interações indutivas acontecem entre
no desenvolvimento embrionário do tunicado os blastômeros. De fato, Ortolani (1959) mostrou que essa região do ectoderma não
H. roretzi. Como as metades direita e esquerda está determinada para originar tecido nervoso até o estágio de 64 células, pouco antes
se desenvolvem da mesma maneira, somente da gastrulação. Dessa maneira, embora a maioria dos tecidos sejam determinados
metade do embrião é aqui representado. (B) imediatamente após a segregação do citoplasma do ovo, certos tecidos nesses em-
Linhagens das células musculares. (A de acor- briões têm uma determinação condicional por interação célula a célula.
do com Nishida, 1987; B de acordo com Pelos estudos de linhagem celular de Conklin e outros (Figuras 13.2 e 13.3), já era
Nishida, 1992a.) conhecido que somente um par de blastômeros (vegetativo posterior; B4.1) no em-
brião de oito células é capaz de produzir o tecido muscular da cauda. Quando o
citoplasma é transferido do blastômero B4.1 (formador de músculo) para o blastômero
b4.2 (formador do ectoderma) de um embrião tunicado de 8 células, o blastômero
▲
Figura 13.4
Localização do citoplasma formador de músculos durante o desenvolvimento precoce de ascídios.
Regiões do citoplasma foram transferidas para o blastômero a4.2 (epiderme presuntiva) e inves-
tigadas para detectar proteínas específicas do músculo produzidas por células derivadas de a4.2.
A região colorida representa o “crescente amarelo”, que deve conter os determinantes da forma-
ção muscular. Porcentagens indicam a fração do espécimen mostrando expressão do gene
muscular. (A) embrião de oito células; (B) ovo não fertilizado; (C) ovo fertilizado na primeira fase
dos movimentos citoplasmáticos. (D) ovo fertilizado na segunda fase dos movimentos citoplas-
máticos. (De acordo com Nishida, 1992b.)
(B)
Estágio de
64 células
Estágio de
32 células
Estágio de
16 células
Estágio de 8 células
Especificação muscular
Especificação muscular autônoma condicionada
formador do ectoderma gera células musculares como também sua progênie ectodérmica
normal (Whittaker, 1982). Além disso, o citoplasma da área de plasma amarelo do ovo
fertilizado pode também fazer com que o blastômero 4.2a expresse proteínas específi-
cas do músculo (Figura 13.4; Nishida, 1992a). Tung e colegas (1977) mostraram o
inverso, que quando os núcleos larvais são transplantados a fragmentos enucleados
de ovos de tunicados, as células recém-formadas mostram uma estrutura típica daque-
las células que fornecem o citoplasma, e não daquelas células que fornecem o núcleo.
(A) 8 células (B) ovo não fertilizado (C) Segregação da (D) Segregação da
primeira fase segunda fase
Crescente
amarelo
Lateral
Podemos concluir, então, que certos determinantes que existem no citoplasma causam
a formação de certos tecidos. Esses determinantes morfogenéticos parecem agir ati-
vando (ou inativando) seletivamente genes específicos. A determinação dos
blastômeros e a ativação de certos genes são controlados pela localização espacial de
determinantes morfogenéticos dentro do citoplasma do ovo. [cyto1.html]
Existe a hipótese de que o determinante miogênico do crescente amarelo regula a
transcrição de genes específicos para o músculo. Imaginava-se que os tunicados
poderiam segregar uma proteína semelhante à MyoD dentro do crescente amarelo. No
entanto, embora essa proteína seja vista nas células musculares do embrião tunicado,
ela só começa a funcionar no estágio de 32 células não sendo então o fator do crescen-
te amarelo (Satoh et al.,1995). Um melhor candidato a determinante miogênico do
crescente amarelo é o RNA materno que parece estar ligado ao citoesqueleto do
oócito e que é segregado junto com o citoplasma formador de músculos. Esse RNA é
encontrado no córtex de oócitos maduros, é segregado juntamente com o citoplasma
amarelo formador de músculos para a coroa do pólo vegetal na primeira fase dos
movimentos citoplasmáticos durante a fertilização, e a partir daí muda para a região
vegetativa posterior do zigoto enquanto se forma o crescente amarelo definitivo (Fi-
gura 13.5; Swalla e Jeffery, 1995). Esse RNA provavelmente não codifica uma proteína,
e não se sabe se pode direcionar o desenvolvimento muscular quando inserido em
uma célula não muscular.
Especificação citoplasmática das linhagens

endodérmicas e epidérmicas e o eixo ântero-posterior
A análise das células endodérmicas e epidérmicas foi feita de maneira semelhante.

Reverberi e Minganti (1946) confirmaram o mapa de destino de Conklin, e Whittaker
(1977) mostrou que enzimas específicas do endoderma eram sintetizadas somente nas
células destinadas a formar o intestino. Mais recentemente, Nishida (1993) fundiu
Figura 13.5 células e fragmentos de células para seguir os determinantes que davam origem às
Localização espacial de um RNA (YC-RNA)
que se segrega com o citoplasma formador de
músculo do crescente amarelo. Hibridizações (A) (B)
in situ foram realizadas em vários estágios do
desenvolvimento de Styela clava. (A) Ovo não
fertilizado. (B) Após a primeira fase dos movi-
mentos de fertilização do citoplasma oogênico.
(C) Seção frontal de um embrião de 4 células
mostrando expressão em ambos os blastômeros
vegetais. (D) Seção frontal de um embrião de
32 células mostrando expressão em seis célu-
las musculares posteriores. (E) Embrião com
broto caudal mostrando expressão de YC-RNA
em células musculares progenitoras em ambos
os lados da notocorda. (de Swalla e Jefferey,
1995; fotografias cortesia dos autores.)
(C) (D) (E)

Primeira fase Segunda fase Embrião de Figura 13.6

da segregação da segregação 8 células Comparação dos movimentos dos determinan-
tes citoplasmáticos em três tipos de tecidos
de tunicados. Estas figuras representam so-
Músculo mente a superfície dos ovos. (De acordo com
Nishida, 1994a.)
Endoderma
Epiderme
linhagens de células epidérmicas e endodérmicas. Após a fusão da célula ou do frag-

mento de célula a uma célula de outra linhagem, Nishida usou um marcador bioquímico
ou antigênico para determinar se aquela célula assumiu o novo destino. Os
determinantes epidérmicos migram para a região apical da célula durante a fertilização
e entram nos blastômeros da coroa do pólo animal (o par a4.2 e o par b4.2) do embrião
de 8 células. Inversamente, foi encontrado que os determinantes endodérmicos mi-
gram para o hemisfério vegetal do zigoto e se distribuem entre os blastômeros
vegetativos (Figura 13.6; Nishida, 1994a).
O eixo ântero-posterior é também determinado durante a migração das regiões
citoplasmáticas do oócito. Pela remoção de aproximadamente 10% do citoplasma da
região vegetativa posterior do ovo, após o segundo movimento ooplásmico, a maioria
dos embriões não formou o eixo ântero-posterior. Em lugar disso, os embriões se
desenvolveram em larvas radialmente simétricas com destinos anteriores. Esse cito-
plasma vegetativo posterior (PVC) era “dominante” em relação a outros citoplasmas,
pois ao se transplantar o PVC para a região vegetativa anterior de zigotos que tiveram
seu próprio PVC removido, o anterior da célula se transformou no novo posterior, e o
eixo foi invertido (Nishida, 1994b). Esses resultados sugerem que o destino posterior
é determinado por um determinante específico do citoplasma, enquanto que o destino
anterior é determinado pela ausência do citoplasma vegetativo posterior. Isso se
correlaciona bem com a observação de que a maioria dos destinos celulares posterio-
res (como o músculo e o endoderma) são especificados pelo citoplasma, mas os des-
tinos celulares anteriores (como o cérebro e a notocorda) são gerados por induções
(Figura 13.7).
No embrião de tunicado, os movimentos ooplásmicos na fertilização criam domíni-
os citoplasmáticos distintamente diferentes, que se distribuem proporcionalmente
nos blastômeros. A identidade desses determinantes e seus mecanismos de ação
ainda não foram esclarecidos.
Localização citoplasmática em embriões de moluscos

O tipo de diferenciação em mosaico é largamente difundido no reino animal, especial-
mente em organismos protostomatas, tais como ctenóforo, anelídeos, nematódeos e
moluscos, os quais, em sua totalidade, iniciam a gastrulação na futura extremidade
anterior, após somente algumas divisões celulares. Moluscos fornecem alguns dos
exemplos mais impressionantes de desenvolvimento em “mosaico” e do fenômeno de
Figura 13.7
Comparação de embriões normais de tunicados e embriões cujo citoplasma vegetativo posterior
(PVC) foi removido. (A) Larva do tipo selvagem. (B) Larva radialmente simétrica de ovo cujo
PVC foi removido. A larva não tem o eixo ântero-posterior. Essas larvas consistem de uma
camada epidérmica externa, uma massa notocordal central e uma camada endodérmica intermedi-
ária. (C) Vista vegetal de um embrião normal com 76 células. (D) Vista vegetal de um embrião
radialmente simétrico cujo PVC foi removido. (De acordo com Nishida, 1994b.)
localização citoplasmática, onde os determinantes morfogenéticos são encontrados

em uma região específica do oócito. Além disso, esses fatores citoplasmáticos são
ativamente transportados para um pólo da célula, de tal modo que um blastômero
tendo esses fatores pode restringir sua transmissão para somente uma de suas célu-
las-filha. O destino das duas células-filha é definido por qual delas recebe o
determinante morfogenético.
E. B. Wilson, o famoso embriologista americano do começo do século XX, isolou
blastômeros precoces de embriões do molusco Patella coerulea e comparou seu
desenvolvimento com o das mesmas células deixadas dentro de outros embriões de
Patella. A Figura 13.8 mostra um grupo de resultados publicados por Wilson em 1904.
Os blastômeros isolados não só seguiram seus destinos normais de desenvolvimento
(nesse caso, para produzir as células trocoblásticas ciliadas), como também completa-
ram o número normal de divisões celulares precisamente ao mesmo tempo que as
Desenvolvimento normal de Patella
Trocoblasto
Figura 13.8 presuntivo
(A-C) Diferenciação de células trocoblásticas
no embrião normal do molusco Patella. (A)
Estágio de 16 células visto de lado; as células
trocoblásticas presuntivas estão sombreadas.
(B) Estágio de 48 células. (C) Estágio de larva
ciliada, visto do pólo animal. São observados
cílios nas células trocoblásticas. (D-G) Dife- (A) (B) (C)
renciação de células trocoblásticas isoladas e
cultivadas in vitro. (D) Célula trocoblástica iso- Desenvolvimento do trocoblasto isolado
lada. (E,F) Resultados da primeira e segunda
divisões em cultura. (G) Produto ciliado de (F).
Mesmo em cultura isolada as células se tornam
ciliadas no momento correto. (De acordo com
Wilson, 1904.) (D) (E) (F) (G)
Citoplasma Figura 13.9

animal claro Clivagem no molusco Dentalium. A extrusão
Citoplasma e a reincorporação do lóbulo polar ocorre duas
equatorial vezes. (De acordo com Wilson, 1904.)
granular
Citoplasma
vegetal claro Lóbulo
polar
Lóbulo polar absorvido Segunda extrusão Lóbulo polar

no blastômero CD do lóbulo polar absorvido no
blastômero D
células permanecendo dentro do embrião. Suas clivagens se deram na orientação

correta, e as células derivadas se tornaram ciliadas na época apropriada. Desses expe-
rimentos, Wilson concluiu que essas células possuíam dentro de si todos os fatores
que determinavam a forma e o ritmo da clivagem e que a diferenciação complexa e
característica que elas sofriam era completamente independente de sua relação com o
resto do embrião. [cyto2.html]
O lóbulo polar
Em seu experimento seguinte, Wilson pôde demonstrar que tal desenvolvimento era
assegurado pela segregação de determinantes morfogenéticos específicos em
blastômeros específicos. Certos embriões clivando espiralmente (principalmente nos
(A)
filos molusco e anelídeo) expelem um bulbo de citoplasma imediatamente antes da
primeira clivagem (veja Figura 13.9). Essa protrusão é chamada lóbulo polar. Em certas
espécies de caracóis, a região unindo o lóbulo polar ao resto do ovo se torna um tubo
delgado. A primeira clivagem divide o zigoto assimetricamente, de tal forma que o
lóbulo polar está ligado somente ao blastômero CD. Em várias espécies, quase um
terço do volume citoplasmático total está presente nesses lóbulos anucleados dando-
lhes a aparência de outra célula. Essa estrutura trilobulada é freqüentemente referida
como o embrião no estágio trifólio (Figura 13.10). O blastômero CD absorve então o
material do lóbulo polar, mas o extruda novamente antes da segunda clivagem (Figura
13.9). Após essa divisão, o lóbulo polar está ligado somente ao blastômero D, que (B)
absorve seu material. A partir daí, não mais se forma o lóbulo polar.
Wilson mostrou que se o lóbulo polar for removido no estágio trifólio, as células Figura 13.10
Lóbulos polares de moluscos. (A) Micro-
remanescentes dividem-se normalmente. Entretanto, em lugar de produzir uma larva
grafia eletrônica de varredura do lóbulo po-
trocófora normal (caracol), elas produzem uma larva incompleta, sem seus órgãos
lar em extensão no ovo não clivado de
mesodérmicos - músculos, boca, glândula da concha e pé.* Ainda mais, Wilson de- Buccinum undatum. As cristas superficiais
monstrou que o mesmo tipo de embrião anormal pode ser produzido removendo o são restritas à região do lóbulo polar. (B)
Seção através da primeira clivagem ou está-
A glândula da concha é um órgão formado por indução pelas células mesodérmicas. Sem o gio trifólio do embrião de Dentalium. A seta
mesoderma, não existem células presentes para induzir o ectoderma competente. Mais uma vez aponta o grande lóbulo polar grande. (Cor-
vemos alguma indução limitada em um embrião em mosaico. tesia de M. R. Dohmen.)
(A)
Figura 13.11
Desenvolvimento do blastômero D. (A) Dia-
gramas esquemáticos da linhagem do blastô-
mero D em embriões de Ilyanassa. (i) Embrião
de 4 células. (ii) Blastômeros 1D e 1d no está-
gio de 8 células. (iii) Estágio de 16 células con-
tendo blastômeros 2D e 2d (derivados de 1D).
As células derivadas do D (coloridas) freqüen-
temente se dividem mais tarde do que as ou-
tras. (iv) Divisão do macrômero 2D para gerar
células 3D e 3d, enquanto a célula 2d se divide
em 2d1 e 2d2. (v) Estágio de 64 células. O
blastômero 3D produz as células 4D e 4d. (vi)
O blastômero 4d divide-se simetricamente para
produzir os dois mesentoblastos ME1 e ME2.
(B) Embrião de 8 células. A pequena célula
PB é o lóbulo polar e não é parte do embrião.
(C) Embrião de 12 células (1a-1d ainda não blastômero D do embrião de 4 células. O pesquisador concluiu que o citoplasma do
dividiram). (D) Embrião de 32 células. (A de lóbulo polar contém os determinantes mesodérmicos e que esses dão ao blastômero
acordo com Clement, 1962; fotografias de Craig sua capacidade formadora do mesoderma. Wilson mostrou também que a localização
e Morrill, 1986, cortesia dos autores.) dos determinantes mesodérmicos é estabelecida logo após a fertilização, demonstran-
do assim que uma região citoplasmática específica do ovo, destinada a ser inclusa no
blastômero D, contém os fatores (quaisquer que sejam) necessários para os ritmos de
clivagem especiais desse blastômero e para a diferenciação do mesoderma.
Os determinantes morfogenéticos seqüestrados dentro do lóbulo polar estão pro-
vavelmente localizados no citoesqueleto ou no córtex e não no citoplasma difusível
do embrião. Isso foi evidenciado a partir de estudos de A. C. Clement (1968). Quando
o hemisfério animal é separado do vegetal no caracol Ilyanassa obsoleta, o hemisfério
animal forma órgãos ectodérmicos que se assemelham a embriões formados de ovos
sem lóbulos. Clement usou aqueles embriões que haviam iniciado a reabsorção do seu
segundo lóbulo polar e os colocou em placas de gelatina. Em seguida, ele centrifugou
os embriões embebidos, forçando o fluido citoplasmático do vitelo da parte vegetativa
da célula para dentro do hemisfério animal. Centrifugando esses embriões em um
segundo meio viscoso, ele causou a separação dos hemisférios animal e vegetal. As
metades animais desses embriões centrifugados não desenvolveram mais estruturas
mesodérmicas e endodérmicas do que aquelas de ovos não centrifugados. Portanto,
os determinantes do lóbulo polar não foram transferidos ao hemisfério animal pelo
conteúdo fluídico do hemisfério vegetal. Van den Biggelaar obteve resultados seme-
lhantes quando removeu o citoplasma do lóbulo polar com uma micropipeta. O cito-
plasma de outras regiões da célula fluíram para o lóbulo polar, repondo a porção que
havia sido removida O desenvolvimento subseqüente desses embriões foi normal.
Além disso, quando o citoplasma solúvel do lóbulo polar foi adicionado ao blastômero
B, não houve duplicações de estruturas (Verdonk e Cather, 1983). Portanto, a parte
difusível do citoplasma não contém esses determinantes morfogenéticos. Eles prova-
velmente se localizam no citoplasma cortical, não fluido, ou no citoesqueleto.
(A) (B) (C)
Clement também analisou o desenvolvimento subseqüente do blastômero D para

observar a futura partição desses determinantes. O desenvolvimento do blastômero D
está ilustrado na Figura 13.11. Esse macrômero, tendo recebido o conteúdo do lóbulo
polar, é maior do que os outros três. Se for removido o blastômero D ou o seu primeiro
ou segundo macrômeros derivados (1D ou 2D), obtém-se uma larva incompleta, sem
coração, intestino, velum (a borda ciliada da larva), glândula da concha, olhos e pé. Se
o blastômero removido é o 3D (após a divisão da célula 2D para formar o blastômero
3d), obtém-se um embrião quase normal, tendo olhos, pé, velum e parte da glândula da
concha, mas sem coração ou intestino (Figura 13.12). Portanto, alguns dos
determinantes morfogenéticos originalmente presentes no blastômero D foram reser-
vados para a célula 3d. Após a produção da célula 4d (pela divisão do blastômero 3D),
a remoção do derivado de D (a célula 4D) não produz diferença qualitativa no desen-
volvimento. Realmente, todos os determinantes essenciais para a formação do cora-
ção e intestinos estão agora no blastômero 4d, e a remoção daquela célula resulta em
uma larva sem coração e intestino (Clement, 1986). O blastômero 4d é responsável pela
formação (na sua próxima divisão) dos dois mesentoblastos, as células que dão ori-
gem a ambos órgãos, mesodérmico (coração) e endodérmico (intestinos).
Figura 13.12
Importância do lóbulo polar no desenvolvimen-
to de Ilyanassa. (A) Larva véliger normal. (B)
Larva anormal, típica para os casos onde o ló-
bulo polar do blastômero D é removido. (E,
olho; F, pé; S, concha; ST, estatocisto, órgão de
equilíbrio; V, velum; VC, cílios velares; Y, vitelo
residual; ES, estomodeu evertido; DV, velum
desorganizado.) (de Newrock e Raff, 1975,
cortesia de K. Newrock.)
(A) Embrião normal (B) Embrião duplo
Figura 13.13
Formação de embriões gêmeos suprimindo a formação do lóbulo polar em Dentalium. (A)
Embrião normal no estágio da sexta clivagem. (B) Embriões gêmeos formados quando
baixas concentrações de citocalasina inibem a formação do lóbulo polar e o material do
lóbulo polar é distribuído para ambos os blastômeros, AB e CD. (De acordo com Guerrier
et al., 1978.)
O material do lóbulo polar é também responsável pela organização da polaridade

dorso-ventral (costas-ventre) do embrião. Quando é permitido que material do lóbulo
polar passe para o blastômero AB, como também para a célula CD, são formadas larvas
gêmeas unidas por suas superfícies ventrais (Figura 13.13; Guerrier et al., 1978; Henry
e Martindale, 1987).
Resumindo, experimentos mostraram que o citoplasma não difusível do lóbulo
polar é extremamente importante para o desenvolvimento normal de moluscos porque:
1. Contém os determinantes para um adequado ritmo e orientação de clivagem do

blastômero D.
2. Contém certos determinantes (aqueles entrando no blastômero 4d e, portanto,
levando à produção dos mesentoblastos) para a diferenciação mesodérmica e
intestinal.
3. Permite interações indutivas (através do material entrando no blastômero 3d)
que levam à formação da glândula da concha e o do olho.
4. Contém determinantes necessários para a especificação do eixo dorso-ventral
do embrião.
Apesar da evidente importância do lóbulo polar no desenvolvimento normal do cara-

col, ainda não se conhece os mecanismos desses efeitos. Parece não haver diferenças
importantes no mRNA ou na síntese de proteínas entre embriões com ou sem o lóbulo
polar (Brandhorst e Newrock, 1981; Collier, 1983, 1984). Um possível indício foi forne-
cido por Atkinson (1987), que observou células diferenciadas no velum, aparelho
digestivo e glândula da concha no embrião sem lóbulo. Embriões sem lóbulo podem
produzir essas células, mas parecem incapazes de organizá-las em tecidos e órgãos
funcionais. Tecidos do trato digestivo podem ser encontrados, mas não são ligados;
miócitos estão espalhados ao redor da larva sem lóbulo, mas não estão organizados
em um tecido muscular funcional. Parece, assim, que as funções do lóbulo polar no
desenvolvimento são muito complexas. [cyto3.html], [evo2.html]
Especificação celular no nematódeo Caenorhabditis elegans

A habilidade em analisar o desenvolvimento exige organismos apropriados. Ouri-
ços-do-mar há muito tempo têm sido o organismo favorito dos embriologistas por-
que pode-se facilmente obter seus gametas em grande número, seus ovos e embri-
ões são transparentes, e a fertilização e o desenvolvimento podem ocorrer em con-
dições de laboratório. Mas, ouriços-do-mar dificilmente podem ser criados no labo-
ratório por mais de uma geração, dificultando o estudo de sua genética. Geneticis-
tas, de outro lado (especialmente aqueles que trabalham com eucariotos
multicelulares), preferem a Drosophila. O rápido ciclo vital, facilidade de reprodu-
ção e os cromossomos politênicos da larva da mosca (que permite a localização de
genes) tornam esse animal soberbamente adequado para análises hereditárias. Mas
o desenvolvimento da Drosophila é muito complexo e difícil de estudar. Um progra-
ma de pesquisa encabeçado por Sidney Brenner (1974) foi organizado para identifi- Figura 13.14
car um organismo onde se pudesse identificar cada gene envolvido no desenvolvi- Caenorhabditis elegans. (A) Vista lateral do
mento, como também seguir a linhagem de cada célula individual. Tal organismo é o adulto hermafrodita. No início do seu desen-
Caenorhabditis elegans, um pequeno nematódeo (1mm de comprimento) de vida volvimento, o espermatozóide é formado. Esse
livre encontrado no solo (Figura 13.14 A). É um organismo com um rápido período de espermatozóide é armazenado durante os está-
embriogênese (aproximadamente 16 horas), que pode ser realizada em placas de gios posteriores, de tal forma que um óvulo
maduro passe através do espermatozóide no
Petri e relativamente poucos tipos de células. Além disso, sua forma predominante é
seu caminho para a vulva. Dessa maneira, o
hermafrodita, cada indivíduo contendo óvulos e espermatozóides. Esses nematódeos hermafrodita une os seus próprios espermato-
podem reproduzir-se ou por autofertilização ou fertilização cruzada com machos que zóide e óvulo. (B) Mapa completo da linhagem
ocorrem com pouca freqüência. O corpo de um C. elegans hermafrodita contém celular para C. elegans. Cada linha vertical
exatamente 959 células somáticas, cuja linhagem total foi identificada através de sua representa uma célula; cada linha horizontal
cutícula transparente (Figura 13.14 B; Sulston e Horvitz, 1977; Kimble e Hirsch,1979; representa uma divisão celular. (De acordo com
Sulston et al.,1983). Além disso, ao contrário das linhagens de células dos vertebrados, Pines, 1992, baseado em Sulston e Horvitz,
1977, e Sulston et al., 1983.)
(A)
Intestino Gônada Faringe
Sistema
nervoso
Ânus
Óvulo Vulva
Reto
Espermatozóide
Óvulo
(B)
Celulas
Células produtoras germinativas
de cutícula Vulva
Sistema nervoso Gônada
Faringe Intestino
Ovo fertilizado
PO (zigoto)
Hipoderme
Neurônios
Músculos faríngeos
Um músculo do corpo
Glândulas Músculos do corpo
(389 células) Músculos faríngeos Intestino
Neurônios (20 células)
Glândulas Hipoderme
(80 células) Músculos do corpo Músculos do corpo
Dois neurônios (20 células)
(47 células)
Linhagem germinativa
Figura 13.15
Mapa resumido da linhagem celular de C.
elegans, enfatizando os precursores da linha-
gem germinativa (células P, P0-P4) que rece-
bem os grânulos P. O número de células (em
parênteses) se refere às células presentes na a linhagem de células do C. elegans é quase inteiramente invariável de um indivíduo
larva recém-eclodida. Algumas dessas conti-
para o outro. Existem poucas possibilidades para o acaso (Sulston et al., 1983). (Essa
nuam a se dividir para produzir as 959 células
somáticas do adulto. (de Strome e Wood, 1983, é uma conseqüência da organização espacial da segregação citoplasmática.)
cortesia de W. Wood.) Caenorhabditis também tem um pequeno número de genes para um organismo
multicelular- aproximadamente 15.000 (Sulston et al., 1992).
A polaridade inicial parece residir no ovo alongado, o eixo ântero-posterior sendo
o eixo longo do ovo. Entretanto, a decisão sobre qual ponta se tornará a anterior e qual
será a posterior parece depender do espermatozóide. A posição de entrada do esper-
matozóide no núcleo define o pólo posterior (Goldstein e Hird, 1996).
O esquema de divisão de C. elegans (Figura 13.15) é semelhante ao da linhagem
de células precursoras, pois durante a clivagem precoce, divisões assimétricas pro-
duzem uma célula-filha “diferenciada” (coletivamente chamadas de células âncoras
e denominadas como AB, MS, E, C e D) e outra célula precursora (a linhagem P1-P4).
A localização das substâncias citoplasmáticas em blastômeros específicos foi ele-
gantemente demonstrada nessas divisões assimétricas. Dentro do ovo está um con-
junto de grânulos da linhagem germinativa, ou grânulos P, que são redistribuídos
no zigoto, pouco depois da fertilização e são restritos às células capazes de formar
gametas. Usando anticorpos fluorescentes contra um dos componentes dos grânu-
los P, Strome e Wood (1983) descobriram que durante a migração pronuclear no
zigoto, os grânulos P aleatoriamente espalhados passam a se localizar na ponta
posterior do zigoto (em direção ao sítio de entrada do espermatozóide), de modo que
somente entram no blastômero (P1) formado do citoplasma posterior (Figura 13.16;
Prancha 10). Após a clivagem, os grânulos P se dispersam através do blastômero P1
até o início da mitose, quando eles novamente migram para a ponta posterior da
célula. Aqui eles ficam reservados para o blastômero P2. Finalmente, os grânulos P
se localizarão na célula P4, cuja descendência se torna os espermatozóides e os
óvulos do adulto. A localização dos grânulos P requer microfilamentos mas pode
ocorrer na ausência de microtúbulos. Tratando os zigotos com citocalasina D (um
inibidor de microfilamentos), se impede a segregação desses grânulos na porção
posterior da célula, enquanto que demicolcina (um inibidor microtubular semelhante
à colchicina) não impede esse movimento (Strome e Wood,1983). Uma vez dentro da
região posterior do zigoto, os grânulos P lá permanecem, mesmo que os
microfilamentos sejam destruídos (Hill e Strome, 1987, 1990). [other.html#cyto4]
Figura 13.16
Localização assimétrica dos grânulos P durante a fertilização e a primeira
clivagem. As figuras à esquerda estão coradas para mostrar o DNA; as
figuras à direita mostram as mesmas células marcadas com anticorpos
fluorescentes contra a proteína do grânulo P. (A) Um zigoto antes da migra-
ção pronuclear mostra uma dispersão aleatória dos grânulos P. (B) Com a
aproximação dos pronúcleos, os grânulos se localizam na periferia posteri-
(A) or do zigoto. (C) Um embrião de duas células no qual P1 está entrando na
prófase mitótica; Os grânulos P estão agora posicionados na periferia
posterior para serem transportados para a célula P2. (de Strome e Wood,
1983, cortesia de S. Strome.)
(B)
(C)
Os mecanismos para o movimento e a ancoragem desses grânulos citoplasmáticos

ainda são desconhecidos, mas eles são regulados pelos genes par que controlam a
partição do citoplasma durante as primeiras clivagens do C. elegans. Mutações em seis
genes par (defectivos na partição) são expressas como mutantes com efeito materno,
onde as distribuições de microfilamentos são aberrantes e os grânulos P são distribuí-
dos anormalmente (Kemphues et al., 1988; Kirby et al., 1990). Clivagens precoces nesses
Figura 13.17
Actina anormal e distribuição de grânulos P
no mutante par-3. Distribuição da actina ci-
toplasmática no embrião do tipo selvagem
(A) e no embrião de uma fêmea deficiente
em par-3 (B). A distribuição dos grânulos P
é assimétrica no embrião do tipo selvagem
(C), mas simétrica no embrião deficiente em
par-3 (D). No embrião mutante de 4 células
(E), os grânulos P podem ser vistos em to-
das as quatro células. (de Kirby, 1992, corte-
(A) (B) sia de C. M. Kirby.)
(C) (D) (E)

embriões mutantes são simétricas e sincronizadas, e os grânulos P são encontrados em

vários blastômeros (Figura 13.17). Os fenótipos dos mutantes par-2 e par-3 se parecem
aos embriões do tipo selvagem quando esses são expostos a um inibidor de
microfilamentos por um período de 10 minutos durante o primeiro ciclo celular (Hill e
Strome, 1990). Além disso, pelo menos três das proteínas (PAR-1, PAR-2 e PAR-3) são
elas mesmas assimetricamente distribuídas no córtex do zigoto (Etemad-Moghadam et
al., 1995; Guo e Kemphues, 1995; Boyd et al., 1996). A proteína PAR-2 é uniformemente
distribuída pelo córtex do oócito, mas se torna localizada no córtex posterior no embrião
de uma célula. Na primeira clivagem, a proteína PAR-2 entra somente na célula-filha
posterior, P1. De forma similar, PAR-2 se torna restrita ao pólo posterior de P1, P2 e P3. A
proteína PAR-2 parece ser crítica para a manutenção da proteína PAR-1 no córtex poste-
rior, e PAR-1 parece estar envolvida em ligação com os grânulos P (Boyd et al., 1996).
Controle maternal da identidade do blastômero: O controle

genético das células progenitoras faríngeas de C. elegans.
A determinação na maior parte do embrião de C. elegans é autônoma, sendo os desti-

nos celulares determinados por fatores citoplasmáticos internos, e não por interações
entre células vizinhas. Considera-se que os fatores protéicos podem determinar o
destino celular entrando no núcleo de blastômeros específicos e ativando ou repri-
mindo certos genes determinantes do destino. Foram encontrados fatores de transcri-
ção em linhagens celulares determinadas de maneira autônoma? Apesar dos grânulos
P de C. elegans estarem localizados de maneira consistente com um papel de
determinante morfogenético, eles não entram no núcleo e sua função no desenvolvi-
mento é ainda desconhecida. Entretanto, a proteína SKN-1 do embrião de C. elegans
é uma candidata muito promissora para um morfógeno de fator de transcrição.
A proteína SKN-1 é um polipeptídeo especificado maternalmente que pode contro-
lar o destino do blastômero EMS, a célula que gera a faringe posterior. Após a primeira
clivagem, somente o blastômero posterior, P1, tem a habilidade de produzir as células
faríngeas de maneira autônoma quando isolado. Depois da divisão de P1, somente o
EMS é capaz de gerar células musculares faríngeas, mesmo quando isolado das outras
células do corpo (Priess e Thomson, 1987). Similarmente, quando a célula EMS se
divide, somente uma de sua progênie, MS, tem a habilidade intrínseca para gerar
tecido faríngeo. Isso sugere que o destino da célula faríngea pode ser determinado
autonomamente por fatores maternos residindo no citoplasma que é destinado parti-
cularmente para essas células. Bowerman e seus colaboradores (1992) procuraram
mutantes de efeito materno que não têm células faríngeas, e eles isolaram uma muta-
ção no gene skn-1. Embriões de mães homozigotas, deficientes em skn-1, não têm
derivativos faríngeos e intestinais de EMS (Figura 13.18). Em lugar de produzir as
estruturas faríngeas e intestinais normais, esses embriões parecem produzir tecido
hipodérmico (pele) extra, onde deveriam estar a faringe e o intestino. Somente aquelas
células destinadas a formar faringe ou intestino são afetadas por essa mutação. Além
disso, a proteína que seria codificada por essa mensagem tem uma seqüência no sítio
de ligação do DNA semelhante aquele visto na família bZIP de fatores de transcrição
(Blackwell et al.,1994).
Bowerman e colegas (1993) mostraram que a proteína SKN-1 está presente no
citoplasma do ovo. Entretanto, após a primeira clivagem muito mais dessa proteína
entra no núcleo P1 do que no núcleo AB (Figura 13.19). Após a segunda divisão,
ambos os derivados P1 recebem a proteína SKN-1 em seus núcleos. Assim, é possível
que a proteína SKN-1 seja um morfógeno que ativa certos genes na célula P1 e seus
descendentes. Entretanto, alguma coisa a mais é necessária para restringir a função de
SKN-1 à célula EMS e para impedir seu funcionamento em P2.
Restringir a identidade de EMS a um único blastômero do embrião de 4 células
requer a atividade de dois outros genes, ambos parecendo regular skn-1. Mutações
dos genes pie-1 (pharyngeal, intestinal excess) e mex-1 (muscle excess) alteram a
Tipo selvagem Mutante skn-1 Figura 13.18

Deficiências de intestino e faringe de mutantes
skn-1. Embriões de fêmeas do tipo selvagem
(A,C) e de fêmeas homozigotas para o mutan-
te skn-1 (B,D) foram testados para verificar a
Antígeno do presença de músculos faríngeos (A,B) e grâ-
músculo nulos específicos do intestino (C,D). O
da faringe anticorpo específico para o músculo faríngeo
marca a musculatura da faringe nos embriões
derivados de fêmeas do tipo selvagem, mas
não se liga a nenhuma estrutura dos embriões
(A) (B) de fêmeas mutantes de skn-1. Analogamente,
os grânulos birrefringentes do intestino estão
ausentes nos embriões derivados das fêmeas
mutantes para skn-1. (de Bowerman et al.,
1992,cortesia de B.Bowerman.)
Grânulos
específicos
do intestino
(C) (D)
determinação de células no embrião de oito células de C. elegans de tal maneira que

várias células adicionais no embrião são determinadas como células MS (Mello et al.,
1992). Em embriões derivados de fêmeas deficientes em pie-1 os blastômeros irmãos
P3 e C são convertidos em blastômeros E e MS, respectivamente, enquanto que embri-
ões derivados de fêmeas deficientes em mex-1, todos os descendentes da célula AB
são redefinidos como células MS. Fêmeas simultaneamente deficientes nos produtos
de mex-1 e pie-1 geram embriões nos quais as seis células anteriores são células MS
e as duas posteriores, células E. Desse modo, as proteínas PIE-1 e MEX-1 agem
independentemente- MEX-1 durante a primeira divisão e a proteína PIE-1 durante a
segunda divisão (Figura 13.20; Bowerman et al., 1993). Em todos os casos o gene do
tipo selvagem SKN-1 é necessário para a formação das células MS extras, e embriões
sem skn-1 não têm faringe. Isso relaciona as proteínas MEX-1 e PIE-1 à ativação (mais
Tipo selvagem mex-1
Figura 13.19
Localização citoplasmática da proteína SKN-
1. Anticorpos à proteína SKN-1 mostram que
ela está presente predominantemente no nú-
cleo da célula P1, após a primeira divisão.
Após a segunda divisão, essa proteína se acu-
mula nas duas células derivadas de P1, mas
não nas células derivadas de AB (compare as
intensidades dos núcleos indicados pelas se-
tas). Em mutantes mex-1 a proteína SKN-1
está distribuída igualmente em todos os
blastômeros. (de Bowerman et al., 1993, cor-
tesia de B. Bowerman.)
Figura 13.20 (A) Ovo

Modelo esquemático da determinação da célu-
la MS em embriões do tipo selvagem e mutan-
tes. (A) O determinante MS (considerado como
o produto do gene skn-1) está presente no esta-
do inativo dentro do ovo. Durante a primeira
divisão nos embriões do tipo selvagem, o de- Tipo selvagem
terminante MS está localizado no blastômero
posterior (P1), e na segunda divisão, ele vai se
localizar na célula EMS. Na terceira divisão, a
célula EMS se divide na célula MS (onde o
fator é ativado) e a célula E. Em embriões deri-
vados de fêmeas deficientes em mex-1, o fator
não se segrega na primeira divisão, mas a se-
gregação a partir de P1 é normal na divisão
seguinte. Em embriões derivados de fêmeas
deficientes em pie-1, a segregação inicial do
determinante de MS para o P1 é normal, mas a
segunda distribuição assimétrica do determi-
nante (para a célula EMS) é defeituosa. No
mutante combinado, os padrões são superpos-
tos, de modo que todas as células do embrião
de 4 células têm o determinante MS inativo.
(B) Sumário das interações envolvendo skn-1,
pie-1 e mex-1. (A de acordo com Mello et al., (B)
1992; B de acordo com McGhee, 1995.)
Em mutantes mex-1, O produto de pie-1
a proteína SKN-1 pode reprimir
é também encontrada atividade de
nos núcleos AB skn-1 no núcleo P2
A proteína SKN-1
é normalmente P2 precisa contactar
encontrada nos EMS para haver
núcleos de EMS e P2 diferenciação do intestino
do que a localização) de SKN-1*. Assim, a proteína SKN-1 localizada no citoplasma do

ovo pode ser um fator de transcrição que ativa genes específicos no blastômero MS,
determinando o seu destino. A proteína PIE-1 impede que SKN-1 especifique a faringe
em P2 e, provavelmente também é um fator de transcrição que antagoniza sua ação
(Mello et al., 1996; Seydoux et al., 1996).
É provável que PIE-1 também tenha um papel positivo. Durante cada divisão, a
proteína PIE-1 é retida pelo centrossomo da célula que se torna o próximo blastômero
da linhagem germinativa. Mutações do gene pie-1 materno resultam em blastômeros
da linhagem germinativa que adotam destinos somáticos, com a célula P2 se com-
portando como um blastômero EMS do tipo selvagem. A localização e as proprieda-
des genéticas de PIE-1 sugerem que esse reprime a determinação celular somática e
preserva a totipotência da linhagem das células germinativas (Mello et al., 1996;
Seydoux et al., 1996).
A localização adequada de SKN-1 parece depender de proteínas PAR, especialmente PAR-3 e

PAR-6 (Watts et al., 1996).
Na terceira divisão, o blastômero EMS dá origem ao E (que forma o intestino) e MS

(que predominantemente forma a faringe e as células da parede muscular). As células
EMS contêm SKN-1, e cada um dos seus descendentes contêm quantidades iguais de
SKN-1. Assim, enquanto SKN-1 é crítica na determinação de qual célula pode dar
origem ao mesoderma faríngeo (ou seja, qual blastômero se torna a célula EMS),
alguma coisa além de SKN-1 especifica MS excluindo E. Estudos de Lin e colegas
(1995) mostraram que a proteína POP-1 é crítica na especificação de MS. Na ausência
de POP-1, a célula MS adota o destino de outro blastômero E do tipo selvagem.
Nesses mutantes de efeito maternal, a célula MS não produz nem células faríngeas
nem musculares, e em lugar disso produz células intestinais. A proteína POP-1 é prova-
velmente um fator de transcrição, e pode interagir com SKN-1 para especificar o de-
senvolvimento de MS. [cyto5.html], [cyto6.html]
Regulação em C. elegans
O desenvolvimento de C. elegans é principalmente autônomo, mas interações

regulatórias entre células também são importantes na especificação do destino celular.
Se o blastômero EMS é separado de todas as outras células no estágio de 4 células
logo após sua formação, ele não formará os grânulos de rabditina (rhabditin), especí-
ficos do intestino. Mas se for recombinado com o blastômero P2 formará esses grânu-
los; mas isso não acontecerá se combinado com ABa, ABp, ou com ambos os deriva-
dos de AB (Figura 13.21; Goldstein,1992). Interações celulares são necessárias para
esse estágio de determinação intestinal.
Como o nematódeo tem linhagens celulares invariantes, tem também interações
célula-célula invariantes. No embrião de 4 células, os blastômeros irmãos Aba (anteri-
or) e ABp (posterior) têm diferentes destinos no desenvolvimento. ABa produz neurô-
nios, células hipodérmicas e células faríngeas anteriores, enquanto ABp produz so-
mente neurônios e células hipodérmicas. Entretanto, se sua posição é invertida expe-
rimentalmente, seus destinos também são invertidos e se forma um embrião normal.
Em outras palavras, ABa e ABp são células equivalentes cujos destinos são determi-
nados por suas posições dentro do embrião (Priess e Thomson, 1987). Entretanto, em
circunstâncias normais, o esquema invariante de clivagem embrionária determina que
os descendentes de ABa, não ABp, produzam 19 células faríngeas. Células-filha de
(A)
Figura 13.21
(B) Intestino se diferencia
Resultados de experimentos de isolamento e
Intestino não se diferencia
recombinação mostrando que são necessárias
interações celulares para que a célula EMS
forme determinantes da linhagem intestinal.
(A) Quando o blastômero EMS é separado
logo após a sua formação, ele não pode pro-
duzir grânulos específicos para o intestino.
(C) Se ele é deixado por períodos mais longos,
então, ele pode produzir. (B) Se a célula EMS
é recombinada com cada um ou ambos deri-
vados do blastômero AB, não formará grânu-
los específicos para o intestino. (C) Se re-
combinado com o blastômero P2, a célula
Tempo de separação EMS dará origem a estruturas específicas do
(minutos antes da clivagem de EMS) intestino.(de Goldstein, 1992.)
ABa se diferenciam nessas células musculares faríngeas devido à sua interação com o
blastômero EMS ou seus descendentes (os quais produzem 18 células musculares da
faringe de maneira autônoma).
Estudos genéticos mostraram que ABp se torna diferente de ABa pela interação
com a célula P2. Além disso, esses estudos mostraram que essa interação é mediada
pela protéina GLP-1 na célula ABp e a proteína APX-1 (anterior pharynx excess) no
blastômero P2. Em um embrião não manipulado, tanto ABa como ABp contactam o
blastômero EMS, mas somente ABp contacta a célula P2. Se a célula P2 é destruída na
fase precoce do estágio de 4 células, a célula ABp não gera as células da válvula
intestinal, o que normalmente faria (Bowerman et al., 1992). O contato entre ABp e P2
é essencial para a especificação do destino das células ABp, e a célula ABa pode ser
mudada em um tipo de célula ABp se for forçado seu contacto com P2 (Hutter e
Schnabel, 1994; Mello et al., 1994). O produto materno do gene glp-1 parece ser crítico
na distinção entre ABa e ABp. Nos embriões de mães com glp-1 mutante, o ABp é
transformado em uma célula ABa (Hutter e Schnabel, 1994; Mello et al., 1994). Usando
alelos de glp-1 sensíveis à temperatura, foi mostrado que o momento para a interação
dependente de GLP-1 é entre os estágios de 4 a 12 células, quando P2 é necessário
para o estabelecimento dos destinos de ABp (Figura 13.22). A proteína é um membro
de uma família amplamente conservada chamada de proteínas Notch, que servem
como receptores de membranas celulares em muitas interações célula-célula e também
é detectada nas células ABa e ABp (Evans et al 1994).*
Um dos ligantes mais importantes para proteínas Notch como GLP-1 é uma outra
proteína de superfície chamada Delta. No C. elegans uma proteína semelhante à Delta
é a APX-1 encontrada na célula P2 (Mango et al., 1994; Mello et al., 1994). Esse sinal
APX-1 parece quebrar a simetria entre ABa e ABp, pois estimula a proteína GLP-1
somente no descendente AB que toca, ou seja, o blastômero ABp. Fazendo assim, a
célula P2 inicia o eixo dorsoventral de C. elegans.
* Como discutido no capítulo anterior, a proteína GLP1 está localizada nos blastômeros ABa e
ABp mas o mRNA do glp-1, maternalmente codificado, é encontrado em todo o embrião. Evans e
colegas (1994) postularam que deve haver algum determinante de tradução no blastômero AB que
permite que a mensagem glp-1 seja traduzida nos seus descendentes. O gene glp-1 é também ativo
na regulação das interações célula-célula pós-embrionárias. Ele é usado mais tarde pela célula da
extremidade distal da gônada para controlar o número de células germinativas entrando em meiose;
daí o nome proliferação da linhagem germinativa (em inglês: germinal line proliferation) (veja
Capítulos 17 e 22; Austin e Kimble, 1987).
faríngea derivada do blastômero AB (%)
Larvas com musculatura
Figura 13.22
Experimento com deslocamento de temperatura para determinar em qual
estágio o produto do gene glp-1 materno está ativo. Neste mutante a
proteína GLP-1 funciona a 15o C, mas não a 25o C. Variando a temperatura
em diferentes estágios embrionários foi determinado que a proteína GLP-
1 era necessária entre os estágios de 4 a 28 células. (De acordo com Priess Número total de células no embrião
et al., 1987.) quando a temperatura variou.
Prancha 2
Unidades de transcrição ativa em
um cromossomo de tritão
Oócitos de anfíbios como Notophtalmus viridescens têm
cromossomos tipo escova-de-lâmpada nos quais os genes
sintetizadores de RNA ativos se projetam para fora. O eixo
do DNA dessas projeções está corado com um corante bran-
co. A mancha vermelha é de um anticorpo que se liga às
proteínas ligantes de RNA. Capítulo 22. (Fotografia cortesia
de M. B. Roth e J. Gall.)
Prancha 1
Um clone de rãs Xenopus
Os núcleos de todos os membros desse clone vieram de um único indivíduo – um
girino fêmea do estágio de broto de membro, cujos antecessores (painel superior
à direita) foram ambos marcados com genes albinos. Os núcleos foram transferi- Prancha 3
dos para ovos não-fecundados, enucleados e ativados de uma fêmea do tipo O fator de crescimento do fibroblasto é
selvagem. As rãs resultantes eram todas fêmeas e albinas (painel inferior). Capí- essencial para produção dos mesodermas
tulo 2. (Fotografia cortesia de J. Gurdon.) lateral e ventral em Xenopus
Quando ovos de Xenopus são injetados com um re-
ceptor mutante negativo e dominante para o fator de
crescimento de fibroblasto (FGF), o embrião é inca-
paz de responder ao FGF. Na ausência do sinal do
FGF, os mesodermas lateral e ventral não se formam,
e o embrião carece de tronco e cauda. Capítulos 3 e
15. (Fotografia cortesia de M. Kirschner.)
Prancha 4
Capacidade do lábio
dorsal do blastóporo
gerar o eixo neural
secundário em anfíbios
O lábio dorsal do blastóporo
de embriões de anfíbios pode
organizar um segundo eixo
embrionário quando trans-
plantado para o lado ventral
de outra gástrula. Esta foto-
grafia foi tirada de uma lâ-
mina real preparada por
Hilde Mangold e mostra que
as estruturas dorsais secun-
dárias contêm tanto tecidos
do hospedeiro (não pigmen- (A)
tados) quanto do doador
(pigmentados). Capítulo 15.
(Fotografia cortesia de P.
Fässler e K. Sander.)
Prancha 5
Salvamento de
estruturas dorsais pela
proteína Noggin
A proteína Noggin pode ser
crítica para a indução do
mesoderma dorsal e do tubo
neural. Quando ovos de Xe- (B)
nopus são expostos à irradia-
ção UV antes da primeira
clivagem, não se formam es-
truturas dorsais (painel supe-
rior). Se uma célula precoce
de tal embrião for injetada com
RNA de noggin, os embriões
formam estruturas dorsais. Se
a mensagem noggin for inje-
tada em demasia, os embriões
produzem muito mais tecido
anterior dorsal (painel inferi-
or). Capítulo 15. (Fotografias
cortesia de R. M. Harland.)
(C)
Prancha 6 (à direita)
O gene noggin é transcrito no mesoderma dorsal e tecido mesodérmico
O RNA de noggin se acumula na região da zona marginal dorsal (A) e é visto no lábio dorsal
do blastóporo (B). Quando essas células involuem, a expressão de noggin é vista na notocorda
e endoderma faríngeo (C), que se estende anteriormente, no centro do embrião (D). Capítulo
15. (Fotografias cortesia de R. M. Harland.) (D)
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
Prancha 7
Rearranjos do citoplasma em Xenopus laevis
O ovo não-fertilizado de Xenopus laevis tem simetria radial. (B) Movimentos citoplasmáticos
são vistos à medida que o ovo começa a clivar, 90 minutos após a fecundação. O citoplasma
do futuro lado dorsal (à direita) difere daquele do futuro lado ventral (à esquerda). Essas
diferenças podem ser vistas durante toda a clivagem embrionária (C,D) e resultam no
posicionamento dos determinantes morfogenéticos dorsais, no lado do embrião oposto ao
ponto de entrada do espermatozóide. (E) Os movimentos citoplasmáticos se correlacionam
com o deslocamento da β-catenina. No estágio bicelular precoce, a β-catenina (cor laranja)
está localizada predominantemente na futura superfície dorsal do embrião. Esse padrão
persiste no estágio de blástula (F). Capítulos 4, 6 e 15. (A-D cortesia de M. V. Danilchik; E
e F cortesia de R. T. Moon.)
Prancha 8 Prancha 9
Localização de um RNA Efeito do ácido retinóico na
específico numa região do ovo regeneração de membros
O RNA de vg1 que codifica um fator O ácido retinóico (RA) faz com que as células
de crescimento da família TGF-β, após em regeneração “esqueçam” sua posição ori-
hibridização in situ, é encontrado resi- ginal. Tecido do pulso da salamandra em re-
dindo exclusivamente na região vege- generação, usualmente formará somente um
tal do ovo de Xenopus. O crescente pulso. Após tratamento com RA, porém, o
branco no fundo do ovo é devido à tecido em regeneração (aqui de uma salaman-
radioatividade da sonda que reconhe- dra pigmentada escura) regenera todo o ante-
ce o RNA; o resto do ovo é verde braço (membro inferior direito) quando en-
devido à coloração com o corante xertado em um membro posterior cortado de
Giemsa. Capítulos 12, 15 e 22. (Foto- um animal com pigmentação diferente. Capí-
grafia cortesia de D. A. Melton.) tulo 18. (Cortesia de K. Crawford.)
Prancha 10
Localização progressiva no citoplasma Prancha 11
A segregação de certos grânulos citoplasmáticos (“grânulos P”) é vista progredin- Localização citoplasmática em
do para dentro das células mais posteriores do embrião de Caenorhabditis elegans. embriões de tunicados
Essas células geram o espermatozóide e o óvulo do nematóide. Quando os A clivagem separa regiões do citoplasma em células
pronúcleos se encontram durante a fecundação, os grânulos P se movem para a particulares. O crescente amarelo do embrião de Styela
porção posterior da célula. Esse movimento prossegue até os grânulos serem fica localizado em um pequeno grupo de células que
encontrados somente na célula P que dá origem aos gametas. A coluna à esquerda irão gerar a musculatura larval. Esta figura mostra os
está corada para mostrar a posição dos núcleos, enquanto a coluna à direita está estágios de 2-, 4-, 16- e 64-células. Capítulo 13. (Foto-
corada para mostrar os grânulos P. Capítulo 13. (Fotografias cortesia de S. Strome.) grafias cortesia de J. R. Whittaker.)
Prancha 12
Onda de íons de cálcio através de ovos do
ouriço-do-mar durante a fertilização
Quando o espermatozóide se funde com o óvulo, uma onda de cálcio se
inicia no local da entrada do espermatozóide e se propaga através do óvulo.
Isso pode ser monitorado pré-carregando o ovo com um corante que fluoresce
quando liga o cálcio. A onda leva 30 segundos para atravessar o ovo.
Capítulo 4. (Fotografia cortesia de G. Schatten.)
(A)
Prancha 13
Regiões responsivas ao ácido
retinóico do embrião de camundongo
Um transgene consistindo de um elemento
responsivo ao ácido retinóico fundido a um
gene da ß-galactosidase foi inserido em um
embrião de camundongo. Coloração para β-
galactosidase deve revelar as células que res-
pondem às concentrações endógenas de ácido
retinóico. (A) O estágio de 3-somitos mos-
trando responsividade ao ácido retinóico na
região mediana do embrião; (B) Embriões de
11,5 dias mostrando coloração região fronto-
nasal e cérebro anterior; (C) Embrião de 14,5
dias mostrando coloração no maxilar, região
óptica, coxim do bigode e regiões interdigitais
(B) (C) do membro. Capítulos 11, 18 e 21. (Fotogra-
fias cortesia de J. Rossant.)
Prancha 14
Formação de padrões em Drosophila
(A) O eixo ântero-posterior é especificado por mRNAs e proteínas
citoplasmáticas. O gradiente da proteína Bicoid é especialmente im-
portante. Altas concentrações dessa proteína (amarelo a vermelho)
causam formação da cabeça e do tórax ativando o gene hunchback.
(B) Os gradientes de proteínas no embrião precoce ativam os genes
gap. Os produtos protéicos dos genes gap (tais como hunchback e
Krüppel) definem grandes domínios no corpo do inseto. Essas pro-
teínas interagem para formar limites específicos no embrião. Aqui,
as proteínas Hunchback (laranja) e Krüppel (verde) se sobrepõem
para formar um limite (amarelo). (C) Os níveis das proteínas gap
promovem a ativação de genes pair-rule específicos (aqui visíveis
pelas bandas escuras) que dividem o embrião em segmentos ao longo
do eixo ântero-posterior. (D) No estágio da banda germinativa esten-
dida, as 14 bandas do gene da polaridade segmentar engrailed podem
ser vistas. Capítulo 14. (Fotografias cortesia de (A) W. Driever e C.
Nüsslein-Volhard; (B) C. Rushlow e M. Levine; (C) T. Karr e (D) S.
Carroll e S. Padock.)
Prancha 15
Compartimentação do disco imaginal da asa de Drosophila
O corante imunofluorescente vermelho marca as células onde a pro-
teína Vestigial é produzida (a futura asa ventral); o corante verde
marca as células que expressam a proteína Apterous (necessária para
a formação da asa dorsal). A área sobreposta é amarela. Capítulo 19.
(Fotografia cortesia de S. Carroll.)
Prancha 16
Localização da RNA polimerase II nos
oócitos do bicho-da-seda gigante
Fotomicrografia de fluorescência (usando lentes
confocais) da câmara do ovo de Hyalophora cecropia.
Fluorescência laranja indica a presença da RNA polimerase
II (corada com amanitina marcada). Fundo verde indica a
localização da actina. (B) Maior aumento da região cortical
do oócito de Antherea polyphemus e células foliculares.
Laranja indica RNA polimerase II. As outras cores são
coloração de fundo de grânulos do vitelo e células
foliculares. Capítulo 22. (Fotografias cortesia de S. Berry.)
Prancha 17 ( acima )
Mariposa ginandromorfa
Um mosaico sexual (ginandromorfo) de uma mariposa lo, dividido bilateralmente
em uma metade feminina rosa-pardacenta e uma metade masculina amarela, de
asa menor. Tais mosaicos sexuais são causados quando um cromossomo X é
perdido de um núcleo durante a divisão mitótica precoce. Capítulo 20. (Fotogra-
fia de T. R. Manley; cortesia do The Journal of Heredity.)
Prancha 18 (esquerda)
Controle do desenvolvimento pelo ambiente
Lagartas de Nemoria arizonaria que eclodem na primavera ingerem flores do
carvalho e desenvolvem uma cutícula que mimetiza as flores. Lagartas da mesma
espécie que eclodem no verão (após o desaparecimento das flores) ingerem fo-
lhas de carvalho; essas lagartas desenvolvem cutículas que se parecem com as
folhas do carvalho. Substâncias químicas nas folhas parecem modificar o desen-
volvimento da cutícula. Capítulo 21. (Fotografias cortesia de E. Greene.)
Prancha 19
Migração das células da crista neural do pinto
Células da crista neural do pinto podem ser seguidas em sua migração corando-as com
um anticorpo monoclonal marcado, fluorescente. As células da crista neural (coradas de
verde) são consideradas migrar através das regiões anteriores (A) mas não das regiões
posteriores (B) do tecido somítico. Esse padrão específico de migração das células da
crista neural tem um papel na determinação da colocação dos neurônios periféricos.
Capítulo 7. (Fotografias cortesia de M. Bronner-Fraser.)
Prancha 20
Vias de migração neural em insetos
Axônios neurais em embriões de insetos migram de acordo
com padrões muito específicos. Neurônios derivados de
um precursor comum (aqui mostrados com a mesma colo-
ração) produzem axônios que migram seletivamente com
outros axônios. O axônio Q1, por exemplo, viaja até en-
contrar o axônio dMP2 e em seguida viaja com esse, en-
quanto o axônio do neurônio G continua a mover-se em
uma linha reta até encontrar o axônio P1. Capítulo 8. (Foto-
grafia cortesia de C. Goodman.)
Prancha 21
Um camundongo com seis pais
O camundongo multicolorido foi formado misturando célu-
las de três embriões do estágio de 4 células: Um embrião
oriundo de dois camundongos pretos; um embrião oriundo
de dois camundongos brancos; e um embrião oriundo de
dois camundongos castanhos. Em lugar de formar um mons-
tro de três cabeças, o embrião regulou-se para formar um
camundongo de tamanho normal com contribuições de cada
um dos três embriões. Cada um dos três embriões também
proveu células da linhagem germinativa, o que foi mostrado
acasalando esse camundongo com um camundongo recessivo
(branco); esse acasalamento produziu descendência de todas
as três cores. Capítulo 5. (Fotografia cortesia de C. Markert
eThe Journal of Heredity.)
O eixo esquerdo-direito é determinado mais tarde, no estágio de 12 células quando

o blastômero MS contacta metade da progênie das células ABa e ABp, convertendo-
as em ABal (anterior esquerda) e ABpl (posterior esquerda), enquanto as outras duas
células se tornam as contrapartidas do lado direito. O sinal da célula MS parece ativar
GLP-1 na progênie de AB (Evans et al., 1994). Entretanto, o ligante dando esse sinal é
diferente de APX-1 e ainda não foi descoberto (Hutter e Schnabel, 1995).
& Especulações
“Ser ou Não Ser: Esse é o Fenótipo”

C ERTAMENTE, estamos sempre
enfrentando decisões de vida ou
morte, mas essa dicotomia exis-
tencial é raramente tão inflexível como
independentemente em cada célula do
embrião; é possível que cada célula do
embrião esteja preparada para morrer, e
aquelas que sobrevivem o fazem porque
que parecem ativar o gene BCL-2. Além
disso, se genes BCL-2 em um promotor
constitutivamente ativo são transferidos
para células que vão morrer logo, a prote-
aquela vista na linhagem celular de C. um gene ced-9 ativo impede a ocorrên- ína BCL-2 é produzida e os intervalos de
elegans. Durante o desenvolvimento nor- cia da morte celular programada.[cyto7.html] vida das células são significativamente
mal de C. elegans, 131 células se suici- Não se sabe como CED-9 impede a aumentados (Nuñez et al., 1990). Isso é
dam. Essa morte celular programada, ou morte das células, nem como a proteína feito naturalmente pelo vírus de Epstein –
apoptose, é um evento ativo iniciado por se torna diferencialmente regulada, ape- Barr (que causa mononucleose). Linfóci-
dois genes, ced-3 e ced-4. Quando esses sar de outros genes produzirem produtos tos infectados com o vírus de Epstein-
genes são expressos, as células que os que a ativam. Genes similares estão sen- Barr não morrem como seria usual porque
expressam morrem. Mutações de perda de do descritos também nos mamíferos. O uma das proteínas virais induz a ativida-
função em qualquer um desses genes per- gene BCL-2 codifica uma proteína da de do gene BCL-2 (Henderson et al., 1991).
mitem a sobrevivência de células que nor- membrana intracelular que previne ou atra- As similaridades entre ced-9 e BCL-2
malmente sofreriam apoptose. Os produ- sa a apoptose normal de neurônios e são tão impressionantes que se o gene
tos de ced-3 ou ced-4 são considerados linfócitos humanos (Hockenbery et al., humano BCL-2 ativo é colocado em em-
tóxicos para a célula ou causam a forma- 1990; Williams et al., 1990; Allsopp et al., briões de C. elegans, ele impede que a
ção de compostos tóxicos a partir de ou- 1993). A maioria dos linfócitos e seus pre- morte celular ocorra normalmente (Vaux
tros metabólitos (Ellis e Horvitz, 1986; cursores morrem durante sua maturação, et al., 1992). Isso sugere que BCL-2 funci-
Yuan e Horvitz, 1990) e aqueles que sobrevivem têm um limita- ona no homem por sua ação nos homólo-
O que determina quais células vive- do tempo de vida. Eles são protegidos da gos humanos de ced-3 e ced-4. Os homó-
rão e quais morrerão? Estudos no labo- morte por certos fatores de crescimento logos humanos de ced-3 foram encontra-
ratório de Robert Horvitz (Hengartner et dos, e constituem uma família de proteases
al., 1992) demonstraram que o gene ced- (A) Inibe ced-3 de cisteína que inclui apopaína (CPP32). A
ced-9 Morte
9 inibe as atividades de ced-3 e ced-4. bcl-2 ced-4 celular apopaína é capaz de inativar, no início da
Mutações que inativam a proteína CED- (apopain) apoptose, a enzima poli(ADP-ribose)
9 fazem com que numerosas células que (B) Sobrevivência polimerase, uma proteína que é necessá-
normalmente sobreviveriam ativem seus ced-9 da célula ria para a estrutura e integridade do geno-
genes ced-3 e ced-4 e morram. Isso leva ma (Nicholson et al., 1995). Considera-se
Morte celular
à morte do embrião. Inversamente, mu- ainda que a apopaína deva ser negativa-
tantes de ganho de função de ced-9 im- Figura 13.23 mente regulada por BCL-2. Certas doen-
pedem a morte de células que normal- Modelo para o funcionamento do gene ced-9 ças degenerativas (como a apoptose
em C. elegans. (A) ced-9 age como em regula-
mente sofrem apoptose. (Essas são as dor negativo de ced-3 e ced-4, os dois genes
linfocítica induzida por vírus na AIDS, ou
mesmas células que sobrevivem nos cujas atividades causam a morte celular. Em doenças neurodegenerativas como apo-
mutantes ced-3 e ced-4.) Portanto, a fun- mamíferos, o homólogo de ced-9 é o Bcl-2 e o plexias) podem se originar da inativação
ção normal de CED-9 é impedir as célu- homólogo de ced-3 é o apopain. Ainda não foi ou do impedimento da ativação de genes
las, que deverão viver, que iniciem o pro- encontrado o homólogo para ced-4. (B) A troca como BCL-2. Se for mostrado que esse é
grama de morte celular (Figura 13.23). O binária efetuada por ced-9. Quando na forma o caso, aqueles genes ativos em impedir a
ligada, as atividades de ced-3 e ced-4 são inibi-
gene ced-9 parece funcionar como um das e a célula sobrevive. Se ced-9 não está liga- morte celular no desenvolvimento podem
comutador binário regulando a escolha do, os produtos dos genes ced-3 e ced-4 matam se situar entre os genes do nosso corpo
entre vida ou morte. Essa decisão é feita a célula. (De acordo com Hengartner et al.,1992.) mais importantes para a medicina.¨
Divisões celulares assimétricas no desenvolvimento tardio

Estudos do desenvolvimento do sistema nervoso da Drosophila forneceram evidên-
cia de que a segregação de determinantes morfogenéticos podem ocorrer no desen-
volvimento tardio, após o estabelecimento do plano principal do corpo. Na formação
do sistema nervoso central da larva da Drosophila, células-tronco neurais (neuro-
blastos) se dividem formando dois tipos distintos de células. Uma célula-filha é outro
neuroblasto (ou seja, outra célula-tronco para manter o crescimento da população),
enquanto a outra célula-filha é uma célula-mãe ganglionar cuja progênie está com-
prometida a se tornar neurônios (Capítulo 8). Essa célula-mãe ganglionar contém um
distinto conjunto de proteínas, incluindo a proteína de membrana Numb e o fator de
transcrição Prospero, que especificam seu comprometimento neuronial. Surpreen-
dentemente, tanto a proteína Numb como a Prospero não são sintetizadas na célula-
mãe ganglionar; elas são sintetizadas no neuroblasto. Esse paradoxo foi resolvido
quando os pesquisadores encontraram que enquanto no neuroblasto, as proteínas
Numb e Prospero permanecem no citoplasma. Entretanto, quando aquela célula come-
ça a se dividir, essas proteínas se associam à membrana que irá formar a célula-mãe
ganglionar. Quando a divisão termina, todas as proteínas Numb e Prospero foram
repartidas para a célula-mãe ganglionar onde elas exercem suas respectivas funções
(Figura 13.24; Hirata et al., 1995; Knoblich et al., 1995; Spana e Doe, 1995). Essas duas
proteínas compartilham uma seqüência de aminoácidos considerada responsável pela
sua segregação assimétrica. Quando esse segmento de aminoácidos é removido des-
sas proteínas, elas se distribuem aleatoriamente em ambas as células-filha. [cyto8.html]
(B) Metáfase
Proteína Prospero se acumula
na membrana polar
Anáfase
(A)
Célula-mãe
ganglionar
Célula-tronco do (C)
neuroblasto
(D)
Telófase
Interfase
Figura 13 24
Distribuição assimétrica da proteína Prospero durante o desenvolvimento da célula-mãe
ganglionar. (A) Célula-tronco do neuroblasto sintetiza a proteína Prospero, a qual permanece
difusamente distribuída no citoplasma. (B) Na metáfase, toda a proteína Prospero está acumu-
lada em um dos pólos do neuroblasto em divisão. (C) Na anáfase e telófase, a proteína Prospe-
ro entra na célula-mãe ganglionar e é excluída do neuroblasto. (D) A proteína Prospero, sendo
um fator de transcrição, entra no núcleo da célula-mãe ganglionar. A proteína Numb se junta
à Prospero ao deixarem o neuroblasto, mas não entra no núcleo do neuroblasto. (De acordo
com Hirata et al., 1995.)
Localização citoplasmática de
determinantes de células germinativas
Determinantes localizados no citoplasma são encontrados em todo o reino animal. Os
determinantes observados mais freqüentemente são os responsáveis pela determina-
ção de precursores de células germinativas, ou seja, as células que dão origem aos
gametas. Mesmo em embriões onde outros aspectos do desenvolvimento precoce
são reguladores, aquelas células contendo determinadas regiões do citoplasma do
ovo são destinadas a se tornarem precursoras de células germinativas.
Determinação de células germinativas em nematódeos
Theodor Boveri (1862-1915) foi o primeiro a observar os cromossomos de um organis-

mo ao longo do seu desenvolvimento. Nesse estudo, ele descobriu um aspecto fasci-
nante do desenvolvimento do nematódeo Parascaris aequorum (antes Ascaris
megalocephala). Esse nematódeo tem somente dois cromossomos por célula haplóide,
permitindo assim observações detalhadas dos cromossomos individuais. O plano de
clivagem da primeira divisão embrionária é pouco usual, porque sendo equatorial
separa a metade animal da metade vegetal do zigoto (Figura 13.25A). Mais estranho,
no entanto, é o comportamento dos cromossomos na divisão subseqüente desses
Figura 13.25
primeiros dois blastômeros. As extremidades dos cromossomos no blastômero deriva-
Distribuição do plasma germinativo (colorido)
do do hemisfério animal se fragmentam em dezenas de pedaços imediatamente antes durante a clivagem de zigotos de Parascaris
da clivagem dessa célula. Esse fenômeno é chamado diminuição cromossômica, por- (A) normais e (B) centrifugados. (A) O plas-
que somente sobrevive uma parte do cromossomo original. Numerosos genes são ma germinativo é conservado normalmente no
perdidos nessas células pela fragmentação dos cromossomos, e esses genes não blastômero mais vegetal, como mostrado pela
estão incluídos nos núcleos recentemente formados (Tobler et al., 1972). Enquanto falta de diminuição cromossômica naquela cé-
isso, no blastômero vegetativo, os cromossomos permanecem normais. Durante a lula específica. Desse modo, no estágio de 4
segunda divisão, a célula animal é cindida meridionalmente, enquanto a célula vegetal células, o embrião tem uma célula-tronco para
novamente se divide equatorialmente. Ambas as células derivadas vegetativamente seus gametas. (B) Quando a primeira clivagem
é deslocada 90o pela centrifugação, ambas as
têm cromossomos normais. Entretanto, os cromossomos de um dos dois blastômeros
células resultantes têm plasma germinativo ve-
vegetativos, o mais próximo do pólo animal, fragmentam-se antes da terceira divisão. getal, e nenhuma delas sofre diminuição de cro-
Desse modo, no estágio de 4 células, somente uma célula- a mais vegetal- contém um mossomos. Após a segunda clivagem, essas
conjunto completo de genes. Em clivagens sucessivas, núcleos somáticos são emitidos duas células dão origem às células-tronco ger-
minativas. (De acordo com Waddington, 1996.)
(A) Diminuição de
cromossomos
Sem diminuição
Plasma germinativo de cromossomos Células-tronco
(B)
Sem diminuição
Plasma germinativo de cromossomos Células-tronco
dessa linhagem, a mais vegetal, até o estágio de 16 células quando existem somente
duas células com cromossomos não diminuídos. Um desses dois blastômeros dá
origem às células germinativas; o outro finalmente sofre diminuição de cromossomos
e forma células somáticas. Os cromossomos só permanecem intactos nas células des-
tinadas a formar a linhagem germinativa. Se esse não fosse o caso, haveria degenera-
ção da informação genética ao se passar de uma geração para a outra. As células que
sofreram diminuição de cromossomos originam as células somáticas.*
Boveri foi considerado o último dos grandes “observadores” da embriologia e o
primeiro dos grandes experimentadores. Não satisfeito em observar a retenção do
completo conjunto cromossômico pela célula germinativa, ele se dispôs a investigar
se uma região específica do citoplasma protege o núcleo nela inserido da diminuição.
Se esse fosse o caso, qualquer núcleo localizado nessa região deveria ser protegido.
Boveri (1910) testou essa possibilidade, centrifugando ovos de Parascaris pouco
antes da primeira clivagem. Esse tratamento modificou a orientação do fuso mitótico.
Quando o fuso se forma perpendicularmente à sua orientação normal, ambos os
blastômeros resultantes devem conter parte do citoplasma vegetativo (veja Figura
13.25). De fato, Boveri encontrou que depois da primeira divisão, nenhum núcleo
sofreu diminuição cromossômica. Entretanto, a próxima divisão foi equatorial ao lon-
go do eixo animal-vegetal. Agora, ambos os blastômeros animais resultantes sofreram
diminuição, mas não as duas células vegetativas. Boveri concluiu que o citoplasma
vegetativo contém um fator (ou fatores) que protege os núcleos da diminuição cro-
mossômica e os determina que sejam células germinativas.
O plasma do pólo dos nematódeos, incluindo o de C. elegans, permanece pouco
caracterizado. A RNA helicase parece se localizar no plasma germinativo tanto de C.
elegans como de Ascaris, e estudos com anticorpos sugerem que essas enzimas
podem ser parte dos grânulos P (Roussell e Bennett, 1993; Kuznicki et al., 1996).
Determinação da célula germinativa em insetos
O citoplasma germinativo de insetos é diferente de qualquer outro citoplasma no ovo.

Hegner (1911) mostrou que quando se removia ou destruía essa região de ovos de
besouro, antes que ocorresse a formação da célula polar, os embriões resultantes não
possuiam células germinativas e eram estéreis. Geigy (1931) mostrou que irradiando o
plasma polar do ovo da Drosophila com luz ultravioleta eram produzidas moscas
estéreis; Okada e colaboradores (1974) estenderam essa linha de experimentação mos-
trando que a adição do plasma polar de embriões doadores não irradiados, podia curar
a esterilidade de ovos irradiados (Figura 13.26). Nenhuma outra parte do citoplasma
podia reverter essa esterilidade. O plasma polar posterior é convenientemente marca-
do com os grânulos polares (Figura 13.27A). Não se conhece o seu papel na determi-
nação das células germinativas, mas sua constante associação com o plasma polar e
as células polares dele derivadas, fazem dos grânulos um marcador conveniente des-
sa região. A região das células polares é identificada facilmente no microscópio eletrô-
nico de varredura (Figura 13.27B). [cyto9.html]
Trabalhos recentes sobre o citoplasma da célula polar estão focalizados principal-
mente em embriões de Drosophila. Os núcleos de embriões de Drosophila no estágio
sincicial são totipotentes e podem dar origem a qualquer tipo celular. Quaisquer dos
núcleos que se encontram no pólo posterior são os primeiros a formar células e incor-
porar o plasma germinativo. Essas células se tornam os precursores dos gametas
(Schbiger e Wood, 1977). A natureza confirmou a importância do plasma polar e de
seus grânulos polares. Fêmeas homozigotas de Drosophila para a mutação grand-
childless produzem descendentes normais mas estéreis: GG x gg UàGg (estéril).
* Enquanto esses casos de diminuição e eliminação de cromossomos são exceções da regra geral
de que células diferenciadas retêm genes não usados, não há evidência que diferentes células somáticas
em Parascaris retêm diferentes partes do genoma.

(A)
Agulha
Agulha
Plasma polar removido Plasma polar injetado (ligeiramente fora

do ovo doador do centro) no ovo hospedeiro irradiado
(B)
Blastoderma
Blastoderma Blastoderma
Células Células
polares polares
Figura 13.26
Habilidade do plasma polar para corrigir a esterilidade induzida por radiação. (A) Técnica de
transplante de plasma polar de um doador não irradiado a um hospedeiro irradiado. (B) Seções
longitudinais da porção posterior do embrião de Drosophila fixado ao se completar a clivagem.
(i) Embrião normal com o blastoderma completo e células polares. (ii) Embrião irradiado durante
a clivagem precoce. O blastoderma se formou, mas as células polares estão ausentes. (iii)
Embrião irradiado durante a clivagem precoce, mas subseqüentemente injetado com plasma polar
de embriões normais. O blastoderma e células polares estão presentes. (De acordo com Okada
et al., 1974, cortesia de M. Okada.)
Mahowald e colegas (1979) mostraram que essas fêmeas cruzadas com machos nor-
mais produzem embriões cujos núcleos nunca migram para o plasma polar no ovo. Não
se formam células polares, e os adultos resultantes não têm células germinativas
primordiais para a produção de gametas. Outra mutação de efeito materno –agametic-
causa a ausência de células germinativas em cerca de metade das gônadas dos des-
cendentes de moscas fêmeas homozigotas. Nesse caso, são formadas células polares
em número normal, mas os grânulos polares degeneram logo após a fertilização
(Engstrom et al., 1982). Experimentos com transplantes demonstram que o defeito está
no citoplasma polar e não no ambiente ovariano. Dessa maneira, temos agora evidên- (A)
cia bastante segura que o plasma polar está diretamente envolvido na determinação
da célula germinativa.
Figura 13. 27
O plasma polar de Drosophila. (A) Micrografia eletrônica de grânulos polares de uma fração
particulada de células polares de Drosophila. (B) Micrografia eletrônica de varredura de células
polares de um embrião de Drosophila pouco antes do término da clivagem. As células polares
podem ser vistas à direita da fotografia. (Fotografias, cortesia de A. P. Mahowald.) (B)
Componentes do plasma polar da Drosophila
O que são os determinantes do plasma polar da Drosophila e como eles se localizam

na parte posterior do embrião? Grânulos polares de Drosophila foram isolados e
parecem ser compostos de proteína e RNA (Mahowald, 1971a,b; Waring et al., 1978),
mas a identidade dessas macromoléculas (e existem ainda algumas de identidade des-
conhecida) não foi estabelecida até que fosse usado um procedimento genético. Um
dos componentes do plasma germinativo é o mRNA do gene germ cell-less (gcl). Esse
gene foi descoberto por Jongens e seus colegas (1992) quando eles mutaram Droso-
phila e fizeram uma varredura procurando as fêmeas que não tinham “netos” (descen-
dentes de segunda geração?). A argumentação era que se uma fêmea não colocasse o
plasma germinativo funcional em seus óvulos, ela ainda podia ter descendentes, mas
esses seriam estéreis (pois não possuíam células germinativas). O gene gcl do tipo
selvagem é transcrito nas células nutrizes do ovário da mosca, e seu mRNA é transpor-
tado para o óvulo através dos canais anelares. Uma vez dentro do óvulo, ele é trans-
portado para a porção mais posterior e permanece dentro do que será o plasma polar
(Figura 13.28AB). Essa mensagem é traduzida em proteína durante os estágios preco-
ces da clivagem (Figura 13.28C,D). A proteína codificada pelo gcl parece entrar no
núcleo e é essencial para a produção de células polares. Moscas mutantes para esse
gene não têm células germinativas, e quando RNA antisenso contra a mensagem de
glc é colocado no embrião, a habilidade em formar células germinativas é também
destruída (Figura 13.29).
O segundo candidato a determinante de plasma germinativo é a proteína Nanos. A
mensagem nanos está localizada no pólo posterior do óvulo e a proteína Nanos dela
traduzida é necessária para a formação do abdômen na Drosophila. Recentemente,
Kobayashi e colegas (1996) mostraram que a proteína também é necessária para a
formação de células germinativas. Células polares sem Nanos não migram para as
gônadas e não se tornam gametas.
Um terceiro candidato à plasma germinativo foi uma grande surpresa: RNA
ribossômico grande das mitocôndrias. Usando o sistema de ensaio com ovos irradia-
dos com luz ultravioleta, Kobayashi e Okada (1989) mostraram que a injeção de RNA
ribossômico grande das mitocôndrias (mtlrRNA) restaura a habilidade de formar célu-
las polares por esses embriões. Além disso, em ovos normais de mosca, o mtlrRNA
está localizado fora das mitocôndrias somente no plasma polar de embriões em estágio
de clivagem, onde aparece como um componente dos grânulos polares (Kobayashi et
al., 1993: Amikura et al., 1996). Apesar do mtlrRNA estar envolvido na formação de
células polares, elas não o contêm.
Tipo selvagem Mutante

Figura 13.28
Localização dos produtos do gene germ cell-
RNA
less na parte posterior do ovo e do embrião. O
gcl
mRNA de gcl pode ser visto no pólo posterior
em embriões produzidos por fêmeas do tipo
selvagem, na fase precoce de clivagem (A), (A) (B)
mas não nos embriões produzidos por fêmeas
mutantes deficientes em gcl (B). Anticorpos
contra a proteína codificada pelo gene gcl po-
dem ser detectados no estágio de blastoderma Proteína
celular de embriões produzidos por fêmeas do Gcl
tipo selvagem (C), mas não em embriões de
fêmeas mutantes (D). (De acordo com Jongens
et al.,1992, cortesia de T. A. Jongens.) (C) (D)
Tipo selvagem Mutante Figura 13.29

Migração de células germinativas em embriões
produzidos por fêmeas do tipo selvagem e em
embriões produzidos por mutantes que não
podem sintetizar a proteína do gene germ cell-
less. A marcação das células germinativas é
obtida por anticorpos dirigidos contra Vasa,
um componente do grânulo polar que não é
mutado em nenhum dos tipos de Drosophila.
Um embrião de fêmea do tipo selvagem no
(A) (B) estágio de blastoderma precoce (A), tem célu-
las polares no pólo posterior. Embriões de fê-
meas mutantes de glc (B) não as têm. Em em-
briões de fêmeas do tipo selvagem, essas célu-
las polares podem ser removidas para o
primórdio do intestino médio posterior (C) de
onde elas migram para as gônadas (E). Essas
células não são vistas em embriões de fêmeas
(C) (D) sem a atividade do gene germ cell-less (D,F).
(De acordo com Jongens et al., 1992, cortesia
de T. A. Jongens.)
(E) (F)
Um quarto componente do plasma polar da Drosophila (e um que se localiza nos

grânulos polares) é um RNA não traduzível chamado componente do grânulo polar
(Pgc). Sua exata função permanece desconhecida, mas as células polares de moscas
transgênicas fêmeas que produzem RNA antisenso contra Pgc não migram para as
gônadas (Nakamura et al., 1996).
O que dirige o mRNA de germ cell-less, a mensagem de nanos, e o mtlrRNA (e
provavelmente outras moléculas do plasma polar) à parte posterior do ovo? Existem
pelo menos outros sete mutantes incapazes de formar células germinativas, e esses
mutantes também têm abdomens malformados. Essas mutações estão nos genes
capuccino, spire, staufen, oskar, vasa, valois e tudor. Cada um desses genes é ativo
no ovário e coloca um de seus produtos no oócito em crescimento. Sondando a
localização do mRNA ou proteína para um gene em um mutante que não possui um
outro gene, pode-se colocar as ações desses genes em uma ordem definida (Figura
13.30). Esses estudos (revisados por Strome, 1992; Ephrussi e Lehmann, 1992) mos-
tram que duas proteínas, aquelas produzidas pelos genes capuccino e spire, são
necessárias para a localização da proteína Staufen no lado posterior. (Ou seja, a proteí-
na Staufen não será colocada no posterior dos óvulos de mães cujos ovários não
podem produzir Capuccino ou Spire.) A proteína Staufen é necessária para a localiza-
ção posterior do mRNA de oskar. A proteína produzida pela mensagem oskar é um
componente dos grânulos polares e é crítica para a localização posterior da proteína
Vasa, outro componente dos grânulos polares. Mutantes de tudor e valois não afetam
o posicionamento de Vasa, mas parecem ser críticos para a manutenção do plasma
polar, uma vez formado (Hay et al., 1990; Lasko e Ashburner, 1990).
A construção do plasma polar é organizada pela mensagem oskar. A quantidade e
posição desse mRNA determina o número de células polares e o lugar onde elas se
Figura 13.30 (A)

(A) Diagrama explicativo da determi-
nação de etapas da via genética que leva
os determinantes da célula germinativa Staufen afeta a posição do
a uma localização posterior. (B) Sumá- mRNA de oskar. oskar não
rio dessas etapas. Sonda oskar no ovo Sonda oskar no ovo afeta a posição do mRNA de
do tipo selvagem deficiente de staufen staufen. Portanto, a função do
gene staufen precede a função
do gene oskar
Sonda staufen no Sonda staufen no ovo

ovo do tipo selvagem deficiente de oskar
(B)
cappucino staufen oskar vasa tudor Determinantes da
spire (localizado posteriormente) célula germinativa
formam.* Embriões derivados de fêmeas com somente uma cópia do gene oskar pro-
duzem de 10 a 15 células polares no estágio de blastoderma celular, enquanto aquelas
que contêm duas cópias do gene produzem aproximadamente 35 células polares. Au-
mentando-se o número de cópias do gene oskar para quatro, serão formadas cerca de
50 células polares. Além disso, Ephrussi e Lehmann (1992) demonstraram que células
germinativas serão formadas onde estiver localizada a mensagem oskar e os estágios
que a precedem são cruciais somente na colocação do mRNA de oskar no pólo poste-
rior do ovo. Se a mensagem oskar se localiza na parte anterior do embrião (o que pode
ser feito experimentalmente), o plasma e as células germinativas se formarão no ante-
rior. A proteína Oskar provavelmente constrói a primeira parte estrutural dos grânulos
polares. As proteínas Vasa e Tudor se ligam à Oskar tornando a estrutura mais comple-
xa e apta a ligar os determinantes da célula germinativa (Breitwieser et al., 1996). A
localização do mRNA de gcl e do mtlrRNA no pólo posterior do ovo é frustrada por
qualquer uma das mutações precedentes. Em mutantes valois e tudor, pequenas quan-
tidades da mensagem de glc podem ser vistas no plasma posterior em embriões em
clivagem precoce, mas essa localização é perdida na clivagem tardia (Jongens et al.,
1992). Assim, os grânulos polares incluem os determinantes das células germinativas
e a estrutura que os mantém no posterior do ovo e do embrião. A estrutura ligará o
mRNA do germ cell-less (e provavelmente produtos gênicos para outros determinantes
de células germinativas). Essas mensagens são traduzidas em proteínas durante a
clivagem precoce, entram no núcleo das células polares, e (de uma forma ainda não
conhecida) determinam que essas células devam ser germinativas.
Determinação de células germinativas em anfíbios
A localização citoplasmática de determinantes de células germinativas foi também

observada em embriões de vertebrados. Bounoure (1934) mostrou que a região
vegetativa de ovos fertilizados de rã contém um material com propriedades de colora-
ção semelhantes às do plasma polar de Drosophila (Figura 13.31). Ele conseguiu
*O nome oskar não vêm de Grouch nem do rei da Noruega, mas do anti-herói anão do romance
de Günter Grass, The Tin Drum. A tradução específica de região do mRNA do oskar em isoformas
específicas é um processo complexo. A mensagem oskar é translocada através do ovo ao pólo
posterior por uma estrutura contendo tropomiosina que é ligada pela proteína repressora Bruno,
para prevenir sua tradução prematura (Erdéyli et al., 1995; Kim-Ha et al., 1995). Com a localização
do mRNA no pólo posterior, a proteína Staufen permite sua tradução. A proteína Oskar é necessária
para reter o mRNA de oskar (e a proteína Oskar) no pólo posterior (Markussen et al., 1995; Rongo
et al., 1995; Capítulo 22).
Plaquetas de vitelo Plasma germinativo
(A) Plasma Pólo vegetativo do zigoto (B) Fuso Plaquetas

germinativo mitótico de vitelo
Figura 13.31
Plasma germinativo de embriões de rã. (A) Plasma germinativo (áreas escuras) perto do pólo Célula Plaquetas
vegetativo de um zigoto recentemente fertilizado. (B) Célula contendo plasma germinativo na somática de vitelo
região endodérmica da blástula na anáfase mitótica. Note o plasma germinativo penetrando em
somente uma das células-filha carregadas com vitelo. (C) Célula germinativa primordial e células
somáticas perto do assoalho da blastocele na gástrula precoce. (Cortesia de A. Blackler.)
seguir esse citoplasma cortical até algumas células no endoderma presuntivo que
normalmente migraria para a crista genital. Transplantando células geneticamente
marcadas de um embrião para outro, Blackler (1962) mostrou que essas células eram
precursoras das células germinativas primordiais. Os movimentos precoces do plasma
germinativo foram analisados em detalhe por Savage e Danilchik (1993), que marcaram
o plasma germinativo com corante fluorescente. Eles encontraram que o plasma
germinativo de ovos não fertilizados consiste de pequenas “ilhas” que parecem estar (C) Célula germinativa
amarradas à massa do vitelo próximo ao córtex vegetativo. Essas ilhas do plasma
germinativo se movem com essa massa de vitelo vegetativo durante a rotação cortical
na fertilização. Após a rotação, as ilhas são liberadas da massa de vitelo e começam a
se fundir e migrar para o pólo vegetal. Essa agregação depende de microtúbulos, e o
movimento desses conjuntos ao pólo vegetal é dependente de uma proteína seme-
lhante à quinesina que pode funcionar como um motor no movimento do plasma
germinativo (Robb et al., 1996). Mais tarde, contrações periódicas da superfície da
célula vegetativa parecem empurrar esse plasma germinativo ao longo dos sulcos nos
blastômeros recém–formados, permitindo-lhe penetrar no embrião.
Quando luz ultravioleta é aplicada à superfície vegetativa (e em nenhum lugar
mais) do embrião da rã, os animais resultantes são normais mas não têm células
germinativas em suas gônadas (Bounoure, 1939; Smith, 1966). Muito poucas células
germinativas primordiais chegam às gônadas, e as que chegam têm cerca de um déci-
mo do volume das células germinativas primordiais normais e têm núcleos com formas
aberrantes (Züst e Dixon, 1977). Savage e Danilchik (1993) mostraram que a luz UV
impede as contrações da superfície vegetativa e inibe a migração do plasma germinativo
ao pólo vegetal. Os homólogos do Xenopus de Nanos (uma proteína da Drosophila
essencial para a migração da célula polar) e Vasa são especificamente localizadas
nessa região (Forristal et al., 1995; Ikenishi et al., 1996; Zhou e King, 1996). Então,
como no plasma polar da Drosophila, o citoplasma da região vegetativa dos zigotos
de rã contém os determinantes para a formação das células germinativas.
Resumo
Temos evidência que em certos organismos a determinação do destino de uma célula é
devida à porção do citoplasma do ovo que ela adquire durante a clivagem. Tal célula
diferencia-se independentemente das outras células, e os organismos que utilizam o
mecanismo tendem a um tipo de desenvolvimento em mosaico ou determinado. Essa
forma de desenvolvimento é exibida por moluscos, tunicados e nematódeos. A localiza-
ção dos determinantes morfogenéticos dentro do citoplasma do ovo, sua redistribuição
durante o desenvolvimento do ovo e a fertilização e os padrões de clivagem celular são
importantes para determinar o destino de cada célula. Cada um desses fenômenos é uma
função do ovo. Apesar da maior parte do desenvolvimento desses organismos seguir o
padrão de mosaico, alguma determinação interativa também existe. Em tunicados, o
sistema nervoso e alguns músculos são formados por interações indutivas entre
blastômeros, e os caracóis e nematódeos também têm certos órgãos formados de manei-
ra interativa. No próximo capítulo nos ocuparemos de certos organismos nos quais as
interações entre moléculas no blastoderma sincicial de ovos de insetos constituem o
mecanismo primário da determinação do destino celular.
LITERATURA CITADA
Allsopp, T. E., Wyatt, S., Paterson, H. F. and Bounoure, L. 1939. L’origine des Cellules Re- Cassirer, E. 1950. Developmental mechan-ics
Davies, A. M. 1993. The proto-oncogene bcl- productries et le Probleme de la Lignée Germi- and the problem of cause in biology. In E. Cassirer
2 can selectively rescue neurotrophic factor- nale. Gauthier-Villars, Paris. (ed.), The Problem of Knowledge. Yale
dependent neurons from apoptosis. Cell 73: University Press, New Haven.
Boveri, T. 1910. Über die Teilung cen-trifugierter
295-307.
Eier von Ascaris megalocephala. Wilhelm Roux Chabry, L. M. 1887. Contribution a 1’em-
Amikura, R., Kobayashi, S., Saito, H. and Okada, Arch. Entwicklungsmech. Org. 30:101-125. bryologie normale tératologique des asci-dies
M. 1996. Changes in subcellular lo-calization of simples. J. Anat. Physiol. Norm. Pathol. 23:
Bowerman, B., Eaton, B. A. and Priess, J. R. 1992.
mtlrRna outside mitochondria in oogenesis and 167-321.
skn-1, a maternally expressed gene re-quired to
early embryogenesis of Drosophila melanogas-
specify the fate of ventral blas-tomeres in the Churchill, F. B. 1973. Chabry, Roux and the ex-
ter. Dev. Growth Differ. 38: 489-498.
early C. elegans embryo. Cell 68:1061-1075. perimental method in nineteenth century
Atkinson, J. W. 1987. An atlas of light mi- embryology. In R. N. Giere and R. S. West-fall
Bowerman, B., Draper, B. W., Mello, C. C. and
crographs of normal and lobeless larvae of the (eds.), Foundations of Scientific Method: The
Priess, J. R. 1993. The maternal gene skn-1
marine gastropod Ilyanassa obsoleta. Int. J. Nineteenth Century. Indiana University Press,
encodes a protein that is distributed unequally in
Invert. Reprod. Dev. 9:169-178. Bloomington, pp. 161-205.
early C. elegans embryos. Cell 74: 443-452.
Austin, J. and Kimble, J. 1987. glp-1 is re-quired Clement, A. C. 1962. Deveopment of Ilyanassa
Boyd, L., Guo, S., Levitan, D., Stinchcomb, D.T.
in the germ line for regulation of the decision following removal of the D macro-mere at
and Kemphues, K.J. 1996. PAR-2 is asymmetri-
between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell successive cleavage stages J. Exp. Zool. 149:
cally distributed and promotes association of P
51: 589-600. 193-215.
granules and PAR-1 with the cortex in C. elegans
Blackler, A. W. 1962. Transfer of primordial embryos. Develop-ment 122: 3075-3084. Clement, A. C. 1968. Development of the vege-
germ cells between two subspecies of Xeno-pus tal half of the Ilyanassa egg after re-moval of
Brandhorst, B. P. and Newrock, K. M. 1981.
laevis. J. Embryol. Exp. Morphol. 10: 641-651. most of the yolk by centrifugal force, compared
Post-transcriptional regulation of protein
with the development of animal halves of similar
Blackler, A. W. 1966. The role of a “germi-nal synthesis in Ilyanassa embryos and isolated po-
visible composi-tion. Dev. Biol. 17: 165-186.
plasm” in the formation of primordial germ cells lar lobes. Dev. Biol. 83: 250-254.
in Rana pipiens. Dev. Biol. 14: 330-347. Clement, A. C. 1986. The embryonic value of
Breitwieser, W., Marhussen, F.-H., Horts-mann,
the micromeres in Ilyanassa obsoleta, as
Blackwell. T. K., Bowerman, B., Priess, J. R. and H. and Eybrussi, A. 1996. Oskar pro-tein
determined by deletion experiments. III. The
Weintraub, H. 1994. Formation of a monomeric interaction with Vasa represents an es-sential
third quartet cells and the mesento-blast cell,
DNA binding domain by SKN bZIP and step in polar granule assembly. Genes Dev. 10:
4d. Int. J. Invert. Reprod. Dev. 9: 155-168.
homeodomain elements. Science 266: 621-628. 2179-2188.
Collier, J. R. 1983. The biochemistry of mol-luscan
Bonnet, C. 1764. Contemplation de la Nature. Brenner, S. 1974. The genetics of Caenorhab-
development. In N. H. Verdonk, J. A. M. van den
Marc-Michel Ray, Amsterdam. ditis elegans. Genetics 77: 71-94.
Biggelaar and A. S. Tompa (eds.), The Mollusca,
Bounoure, L. 1934. Recherches sur la lignée Brenner, S. 1979. Cited in H. F. Judson, The Vol. 3. Academic, New York, pp. 215-252.
germinale chez la grenouille rousse aux premiers Eighth Day of Creation. Simon and Schuster,
Collier, J. R. 1984. Protein synthesis in nor-mal
stades du développement. Ann. Sci. Natl. 10e New York, p. 219.
and lobeless gastrulae of llyanassa obso-leta. Bid.
Wer. 17: 67-248.
Bull 167: 371-377.
Conklin, E. G. 1905a. The organization and cell Goldstein, B. 1992. Induction of gut in Caenor- Hutter, H. and Schnabel, R. 1994. glp-1 and
lineage of the ascidian egg. J. Acad. Nat. Sci. habditis elegans embryos. Nature 357: 255-257. inductions establishing embryonic axes in C.
Phila. 13: 1-119. elegans. Development 120: 2051-2064.
Goldstein, B. and Hird, S. N. 1996. Specifi-cation
Conklin, E. G. 1905b. Organ-forming sub-stances of the anterioposterior axis in Caenorhabditis Hutter, H. and Schnabel, R. 1995. Establish-ment
in the eggs of ascidians. Biol. Bull. 8: 205-230. elegans. Development 122: 1467-1474. of left-right asymmetry in the Caenorhabditis
elegans embryo: A multistep process involving
Conklin, E. G. 1905c. Mosaic development in Gould, S. J. 1977. Ontogeny and Phylogeny.
a series of inductive events. Development 121:
ascidian eggs. J. Exp. Zool. 2: 145-223. Belknap Press, Cambridge, MA.
3417-3424.
Craig, M. M. and Morrill, J. B. 1986. Cellu-lar Guerrier, P., van den Biggelaar, J. A. M., Dongen,
Illmensee, K. 1968. Transplantation of em-
arrangements and surface topology during early C. A. M. and Verdonk, N. H. 1978. Significance
bryonic nuclei into unfertilized eggs of Droso-
development in embryos of llyanassa obsoleta. of the polar lobe for the deter-mination of
phila melanogaster. Nature 219: 1268-1269.
Int. J. Invert. Reprod. Dev. 9: 209-228. dorsoventral polarity in Den-talium vulgare (da
Costa). Dev. Biol. 63: 233-242. Ikenishi, K., Tanaka, T. S. and Komiya, T. 1996.
Dareste, C. 1877. Recherches sur la Produc-
Spatio-temporal distribution of the protein of
tion Artificielle des Monstruosités ou Essais de Guo, S. and Kemphues, K. J. 1995. par-1, a gene
the Xenopus vasa homologue (Xenopus vasa-
Tératogenie Experimental. Reinwald, Paris. required for establishing polarity in C. elegans
like gene-1, XVLG1) in em-bryos. Dev. Growth
embryos, encodes a putative ser/thr kinase that
Davidson, E. H. 1991. Spatial mechanisms of Differ. 38: 527-535.
is asymmetrically distributed. Cell 81: 611-620.
gene regulation in metazoan embryos. Develop-
Jongens, T. A., Hay, B., Jan, L. Y. and Jan, Y. N.
ment 113: 1-26. Harrison, R. G. 1933. Some difficulties of the
1992. The germ cell-less gene product: A
determination problem. Am. Natur.. 67: 306-321.
Ellis, R. E. and Horvitz, H. R. 1986. Genetic posteriorly localized component necessary for
control of programmed cell death in the ne- Hay, B., Jan, L. Y. and Jan, Y. N. 1990. Local- germ cell development in Drosophila. Cell 70:
matode C. elegans. Cell 44: 817-829. ization of vasa, a component of Drosophila polar 569-584.
granules, in maternal effect mutants that alter
Engstrom, L., Caulton, J. H., Underwood, E. M. Kemphues, K. J., Priess, J. R., Morton, D. G. and
embryonic anteroposterior polar-ity. Develop-
and Mahowald, A. P. 1982. Develop-mental Cheng, N. 1988. Identification of genes required
ment 109: 425-433.
lesions in the agametic mutant of Drosophila for cytoplasmic localization in early C. elegans
melanogaster. Dev. Eiol. 91: 163-170. Hegner, R. W. 1911. Experiments with chryso- embryos. Cell 52: 311-320.
melid beetles. III. The effects of killing parts of
Ephrussi, A. and Lehmann, R. 1992. Induc-tion Kim-Ha, J., Kerr, K. and Macdonald, P. M. 1995.
the eggs of Leptinotarsa de-cemlineata. Biol.
of germ cell formation by oskar. Nature 358: Translational regulation of oskar mRNA by Bru-
Bull. 20: 237-251.
387-392. no, an ovarian RNA-binding protein, is essential.
Henderson, S. and seven others. 1991. In-duction Cell 81: 403-412.
Erdélyi, M., Michon, A.-M., Guichet, A., Glotzer,
of bcl-2 expression by Epstein-Barr virus latent
J. B. and Ephrussi, A. 1995. Re-quirement for Kimble, J. and Hirsch, D. 1979. The postem-
membrane protein 1 protects infected B cells
Drosophila cytoplasmic tropomyosin in oskar bryonic cell lineages of the her-maphrodite and
from programmed cell death. Cell 65: 1107-1115.
mRNA localization. Nature 377: 524-527. male gonads in Caenorhab-ditis elegans. Dev.
Hengartner, M. O., Ellis, R. E. and Horvitz, H. Biol. 70: 396-17.
Etemad-Moghadam, B., Guo, S. and Kem-phues,
R. 1992. Caenorhabditis elegans gene ced-9
K. J. 1995. Asymmetrically distrib-uted PAR-3 Kirby, C. M. 1992. Cytoplasmic reorganiza-tion
protects cell from programmed cell death.
protein contributes to cell po-larity and spindle and the generation of asymmetry in Caenorhab-
Nature 356: 494-499.
alignment in early C. elegans embryos. Cell 83: ditis elegans, with an emphasis on par-3, a ma-
743-752. Henry, J. J. and Martindale, M. Q. 1987. The ternal-effect gene essential for both processes.
organizing role of the D quadrant as re-vealed PhD dissertation, Cornell University, Ithaca, NY.
Evans, T. C., Crittenden, S. L., Kodoyianni, V.
through the phenomenon of twin-ning in the
and Kimble, J. 1994. Translational control of Kirby, C. M., Kusch, M. and Kemphues, K.
polychaete Chaetopterus variope-datus. Wilhelm
maternal glp-1 mRNA establishes an asymmetry 1990. Mutations in the par genes of Caenor-
Roux Arch. Dev. Biol. 196: 449-510.
in the C. elegans embryo. Cell 77:183-194. habditis elegans affect cytoplasmic re-
Hill, D. P. and Strome, S. 1987. An analysis of organization during the first cell cycle. Dev.
Fischer, J.-L. 1991. Laurent Chabry and the Biol. 142: 203-215.
the role of microfilaments in the estab-lishment
beginnings of experimental embryology in
and maintainance of asymmetry in Caenorhab-
France. In S. Gilbert (ed.), A Conceptual His- Knoblich, J. A., Jan, L. Y. and Jan, Y. N. 1995.
ditis elegans zygotes. Dev. Biol. 125: 75-84.
tory of Modern Embryology. Plenum, New York, Asymmetric segregation of Numb and Prospero
pp. 31-41. Hill, D. P. and Strome, S. 1990. Brief cy-tochalasin- during cell division. Nature 377: 624-627.
induced disruption of microfila-ments during a
Fischer, J.-L. and Smith, J. 1984. French em- Kobayashi, S. and Okada, M. 1989. Restora-
critical interval in 1-cell C. elegans embryos alters
bryology and the “mechanics of develop-ment” tion of pole-cell forming ability to UV-irra-diated
the positioning of developmental instructions to
from 1887 to 1910: L. Chabry, Y. De-lage and Drosophila embryos by injection of mitochon-
the 2-cell embryo. Development 108:159-172.
E. Bataillon. Hist. Phil. Life Sci. 6: 25-39. drial IrRNA. Development 107: 733-742.
Hirata, J., Nakagoshi, H., Nabeshima, Y-I. and
Forristall, C., Pondel, M., Chen, L. and King, Kobayashi, S., Amikura, R. and Okada, M. 1993.
Matsuzaki, F. 1995. Asymmetric segre-gation
ML. 1995. Patterns of localization and Presence of mitochondrial large ribo-somal RNA
of the homeodomain protein Prospero during
cytoskeletal association of two vege-tally outside mitochondria in germ plasm of Droso-
Drosophila development. Na-ture 377: 627-630.
localized RNAs, Vg1 and Xcat2. Devel-opment phila melanogaster. Science 260: 1521-1524.
121: 201-208. Hockenbery, D. M., Nuñez, G., Milliman, C.,
Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M. and
Schreiber, R. D. and Korsmeyer, S. J. 1990. Bcl-
Geigy, R. 1931. Action de 1’ultra-violet sur le Kitamura, T. 1996. Essential role of the pos-
2 is an inner mitochondrial mem-brane protein
pole germinal dans 1’oeuf de Drosophila mela- terior morphogen nanos for germline de-
that blocks programmed cell death. Nature 348:
nogaster (castration et mutabilité). Rev. Suisse velopment in Drosophila. Nature 380: 708-711.
334-336.
Zool. 38:187-288.
Kölreuter, J. G. 1766. Vorläufige Narchricht von Nakamura,A., Amikura, R., Mukai, M., Kobayashi, Priess, R. A., Schnabel, H. and Schnabel, R. 1987.
einigen das Geschlecht der Pflanzen betef-fenden S. and Lasko, P. F 1996. Re-quirement for a The glp-1 locus and cellular interac-tions in early
Versuchen und Beobachtungen, nebst Fortset- noncoding RNA in Drosophila polar granules for C. elegans embryos. Cell 51: 601-611.
zugen 1, 2 und 3. Leipzig. germ cell es-tablishment. Science 274: 2075-2079.
Reverberi, G. and Minganti, A. 1946. Fenomeni
Kuznicki, K., Gruidl, M., Smith, P., Mc-Crone, Newrock, K. M. and Raff, R. A. 1975. Polar di evocazione nello sviluppo dell’uovo di
S. and Bennett, K. 1996. C. elegans germline lobe specific regulation of translation in embryos Ascidie. Risultati dell’indagine spermentale
RNA helicases: Are they all com-ponents of the of llyanassa obsoleta. Dev. Biol. 42: 242-261. sull’ouvo di Ascidiella aspersa e di Ascidia
P granules? Dev. Biol. 175: 379 malaca allo stadio di 8 blastomeri. Pubbl. Staz.
Nicholson and fifteen others. 1995. Identifi-
Zool. Napoli 20: 199-252. (Quoted in Rever-
Lasko, P. F. and Ashburner, M. 1990. Poste-rior cation and inhibition of the ICE/CED-3 protease
beri, 1971, p. 537.)
localization of vasa protein correlates with, but necessary for mammalian apopto-sis. Nature
is not sufficient for, pole cell de-velopment. 376: 37-43. Robb, D. L., Heasman, J., Raats, J. and Wylie, C.
Genes Dev. 4: 905-921. 1996. A kinesin-like protein is re-quired for germ
Nishida, H. 1987. Cell lineage analysis in ascidian
plasm aggregation in Xenopus. Cell 87: 823-831.
Lenoir, T. 1980. Kant, Blumenbach, and vital embryos by intracellular injection of a tracer
materialism in German biology. Isis 71: 77-108. enzyme. III. Up to the tissue re-stricted stage. Roe, S. 1981. Matter, Life, and Generation:
Dev. Biol. 121: 526-541. Eighteenth-Century Embryology and the Haller-
Lin, R., Thompson, S. and Priess, J. R. 1995.
Wolff Debate. Cambridge University Press,
pop-l encodes an HMG box protein re-quired Nishida, H. 1990. Determinative mecha-nisms
Cambridge.
for the specification of a mesoderm precursor in secondary muscle lineages of as-cidian
in early C. elegans embryos. Cell 83: 599-609. embryos: Development of muscle-specific Rongo, C., Gavis, E. R. and Lehmann, R. 1995.
features in isolated muscle progenitor cells. De- Localization of oskar RNA regulates oskar trans-
Mahowald, A. P. 1971a. Polar granules of Dro-
velopment 108: 559-568. lation and requires Oskar pro-tein. Development
sophila. III. The continuity of polar gran-ules
121: 2737-2746.
during the life cycle of Drosophila. J. Exp. Zool. Nishida, H. 1992a. Determination of devel-
176: 329-343. opmental fates of blastomeres in ascidian Roussell, D. L. and Bennett, K. L. 1993. glh, a
embryos. Dev. Growth Differ. 34: 253-262. germline putative RNA helicase from Caenor-
Mahowald, A. P. 1971b. Polar granules of Dro-
habditis, has four zinc fingers. Proc. Natl. Acad.
sophila. IV. Cytochemical studies show-ing loss Nishida, H. 1992b. Regionality of egg cyto-plasm
Sci. USA 90: 9300-9304.
of RNA from polar granules dur-ing early stages that promotes muscle differentiation in embryo
of embryogenesis. J. Exp. Zool. 176: 329-343. of the ascidian Halocynthia roretzi. Develop- Satoh, Y, Kusakabe, T., Araki, I. and Satoh, N.
ment 116: 521-529. 1995. Timing of initiation of muscle-spe-cific
Mahowald, A. P., Caulton, J. H. and Gehring, W.
gene expression in the ascidian em-bryo prece-
J. 1979. Ultrastructural studies of oocytes and Nishida, H. 1993. Localized regions of egg
des that of developmental fate restriction in
embryos derived from fe-male flies carrying the cytoplasm that promote expression of en-
lineage cells. Dev. Growth Diff. 37: 319-327.
grandchildless muta-tion in Drosophila doderm-specific alkaline phosphatase in embryos
subobscura. Dev. Biol 69: 118-132. of the ascidian Halocynthia roretzi. Develop- Savage, R. M. and Danilchik, M. V. 1993.
ment 118:1-7. Dynamics of germ plasm localization and its
Mango, S. E., Thorpe, C. J., Martin, P. R.,
inhibition by ultraviolet irradiation in early
Chamberlain, S. H. and Bowerman, B. 1994. Two Nishida, H. 1994a. Localization of egg cyto-
cleavage Xenopus eggs. Dev. Biol. 157: 371-382.
maternal genes, apx-1 and pie-1, are required to plasm that promotes differentiation to epi-
distinguish the fates of equivalent blastomeres dermis in embryos of the ascidian Halocyn-thia Schubiger, G. and Wood, W. J. 1977. Deter-
in early C. elegans embryos. Development 120: roretzi. Development 120: 235-243. mination during early embryogenesis in Droso-
2305-2315. phila melanogaster. Am. Zool. 17: 565-576.
Nishida, H. 1994b. Localization of determi-nants
Markussen, F.-H., Michon, A.-M., Bre-itwieser, for formation of the anterior-poste-rior axis in Seydoux, G., Mello, C. C., Pettitt, J., Wood, W.
W. and Eprussi, A. 1995. Transla-tional control eggs of the ascidian Halocynthia roretzi. Deve- B., Priess, J. R. and Fire, A. 1996. Repres-sion
of oskar generates short OSK, the isoform that lopment 120: 3093-3104. of gene expression in the embryonic germ lineage
induces pole plasm assem-bly. Development 121: of C. elegans. Nature 382: 713-716.
Nuñez, G., London, L., Hockenbury, D.,
3723-3732.
Alexander, M., McKearn, J. P. and Ko-rsmeyer, Slack, J. M. W. 1991. From Egg to Embryo:
McGhee, J. D. 1995. Cell fate decisons in the S. J. 1990. Deregulation of blc-2 gene expression Regional Specification in Early Development.
early embryo of the nematode Caenorhabdi-tis selectively prolongs sur-vival of growth factor- Cambridge University Press, New York.
elegans. Dev. Genet. 17: 155-166. deprived hemopoi-etic cells. J. Immunol. 144:
Smith, L. D. 1966. The role of a “germinal
3602-3610.
Mello, G. C., Draper, B. W., Krause, M., plasm” in the formation of primordial germ cells
Weintraub, H. and Priess, J. R. 1992. The pie-1 Okada, M., Kleinman, I. A. and Schneider-man, in Rana pipiens. Dev. Biol, 14: 330-347.
and mex-1 genes and maternal control of H. A. 1974. Restoration of fertility in sterilized
Strome, S. 1992. The germ of the issue. Na-ture
blastomere identity in early C. elegans embryos. Drosophila eggs by transplanta-tion of polar
358: 368-369.
Cell 70: 163-176. cytoplasm. Dev. Biol. 37: 43-54.
Strome, S. and Wood, W. B. 1983. Genera-tion
Mello, C. C, Draper, B. W. and Priess, J. R. Ortolani, G. 1959. Richerche sulla in-duzione
of asymmetry and segregation of germ-like gra-
1994. The maternal genes apx-1 and glp-1 and del sistema nervoso nelle larve delle Ascidie. Boll.
nules in early Caenorhabditis elegans embryos.
establishment of dorsal-ventral polar-ity in the Zool. 26: 341-348.
Cell 35:15-25.
early C. elegans embryo. Cell 77: 95-106.
Pines, M. (ed.). 1992. From Egg to Adult. Howard
Spana, E. P. and Doe, C. Q. 1995. The pros-
Mello, C. C., Schubert, C., Draper, B., Zhang, Hughes Med. Inst., Bethesda, pp. 30-38.
pero transcription factor is asymmetrically
W., Lobel, R. and Priess, J. R. 1996. The PIE-1
Priess, R. A. and Thomson, J. N. 1987. Cel-lular localized to the cell cortex during neurob-last
protein and germline specifica-tion in C. elegans
interactions in early C. elegans em-bryos. Cell mitosis in Drosophila. Development 121:
embryos. Nature 382: 710-712.
48: 241-250. 3187-3195.
Sulston, J. and Horvitz, H. R. 1977. Postem- Waddington, C. H. 1966. Principles of Devel- Wilson, E. B. 1904. Experimental studies on
bryonic cell lineages of the nematode Caenor- opment and Differentiation. Macmillan, New germinal localization. I. The germ regions in
habditis elegans. Dev. Biol. 56:110-156. York. the egg of Dentalium. II. Experiments on the
cleavage-mosaic in Patella and Dental-ium. J.
Sulston, J. E., Schierenberg, J., White, J. and Waring, G. L., Allis, C. D. and Mahowald, A. P.
Exp. Zool. 1: 1-72.
Thomson, N. 1983. The embryonic cell lin- 1978. Isolation of polar granules and the
eage of the nematode Caenorhabditis elegans. identification of polar granule-specific protein. Wolff, K. P. 1767. De formatione intestino-
Dev. Biol. 100: 64-119. Dev. Biol. 66: 197-206. rum praecipue. Novi Commentarii Academ-ine
Scientarum Imperialis Petropolitanae.
Sulston, J. and eighteen others. 1992. The C. Watts, J. L. and seven others. 1996. par-6, a
elegans genome sequencing project: A be-ginning. gene involved in the establishment of asymmetry Yuan, J. Y. and Horvitz, H. R. 1990. The Cae-
Nature 356: 37-42. in early C. elegans embryos, mediates the norhabditis elegans genes ced-3 and ced-4 act
asymmetric localization of PAR-3. Development cell autonomously to cause pro-grammed cell
Swalla, B. J. and Jeffery, W. R. 1995. A ma-
122: 3133-3140. death. Dev. Biol. 138: 33-41.
ternal RNA localized in the yellow crescent is
segregated to the larval muscle cells dur-ing Whittaker, J. R. 1977. Segregation during Zhou, Y. and King, M. L. 1996. Localization of
ascidian development. Dev. Biol. 170: 353-364. cleavage of a factor determining endoder-mal Xcat-2, a putative germ plasm compo-nent, to
alkaline phosphatase development in ascidian the mitochondrial cloud in Xenopus stage I
Tobler, H., Smith, K. D. and Ursprung, H. 1972.
embryos. J. Exp. Zool. 202: 139-153. oocytes. Development. 122: 2947-2953.
Molecular aspects of chromatin elim-ination in
Ascaris lumbricoides. Dev. Biol. 27: 190-203. Whittaker, J. R. 1982. Muscle cell lineage can Züst, B. and Dixon, K. E. 1977. Events in the
change the developmental expression in germ cell lineage after entry of the pri-mordial
Tung, T. C., Wu, S. C., Yel, Y. F., Li, K. S. and
epidermal lineage cells of ascidian em-bryos. Dev. germ cells into the genital ridges in normal and
Hsu, M. C. 1977. Cell differentiation in as-cidians
Biol. 93: 463-70. UV-irradiated Xenopus lae-vis. J. Embryol. Exp.
studied by nuclear transplantation. Scientia
Morphol. 41: 33-46.
Sinica 20: 222-233. Whittaker, J. R., Ortolani, G. and Farinella-Ferruzza,
N. 1977. Autonomy of acetyl-cholinesterase di-
Vaux, D. L., Weissman, I. L. and Kim, S. K.
fferentiation in muscle lin-eage cells in ascidian
1992. Prevention of programmed cell death in
embryos. Dev. Biol. 55: 196-200.
Caenorhabditis elegans by human bcl-2. Science
258:1955-1957. Williams, G. T., Smith, C. A., Spooncer, E.,
Dexter, T. M. and Taylor, D. R. 1990.
Verdonk, N. H. and Gather, J. N. 1983. Mor-
Haemopoietic colony stimulating factors
phogenetic determination and differentia-tion.
promote cell survival by suppressing apop-tosis.
In N. H. Verdonk, J. A. M. van den Biggelaar and
Nature 343: 76-79.
A. S. Tompa (eds.), The Mol-lusca. Academic
A genética da especificação axial
em Drosophila 14
Quando um espermatozóide penetra no óvu-
lo, entra em um sistema celular que já al-
cançou um certo grau de organização.
ERNST HADORN (1955)
N O ÚLTIMO CAPÍTULO, discutimos as especificações de células embrionári-
as precoces, quando adquirem diferentes determinantes citoplasmáticos que
estavam armazenados no oócito. As membranas celulares estabelecem a re-
gião do citoplasma incorporado em cada célula, e acredita-se que determinantes
morfogenéticos direcionam, em seguida, a expressão gênica nesses blastômeros. Du-
Aqueles de nós que estão trabalhando com rante o desenvolvimento de Drosophila, as membranas celulares não se formam antes
Drosophila encontram um aspecto da ques- da décima terceira divisão nuclear. Antes disso, todos os núcleos dividem entre si um
tão. Pois o material disponível é tudo que se citoplasma comum, e o material pode difundir através do embrião. Nesses embriões, a
pode desejar, e mesmo experimentos embrio-
especificação de células ao longo dos eixos ântero-posterior e dorsoventral é
lógicos podem ser realizados... Depende de
conseguida pelas interações de materiais citoplasmáticos dentro de uma única célula
nós utilizarmos essas oportunidades. Temos
multinucleada. Além disso, o início das diferenças entre os eixos é controlada pela
uma história completa a desemaranhar, pois
podemos trabalhar as coisas por ambos tér- posição do óvulo dentro do ovário materno. Embora o local da entrada do espermato-
minos aos mesmo tempo. zóide possa fixar os eixos em ascídios e nematóides, os eixos ântero-posterior e dorso-
JACK SCHULTZ (1935) ventral da mosca são especificados por interações entre o óvulo e suas células folicu-
lares que o circunda.
Inicialmente a principal vantagem da Resumo do desenvolvimento de Drosophila

Drosophila foi uma que escapou à visão
dos historiadores: era um organismo exce- Como discutido no Capítulo 3, os embriões de Drosophila desenvolvem-se muito
lente para projetos de estudantes. rapidamente através de um série de divisões nucleares que formam um blastoderma
ROBERT E. KOHLER (1994) sincicial. Durante o nono ciclo da divisão, cerca de cinco núcleos alcançam a superfí-
cie do pólo posterior do embrião. Esses núcleos ficam envolvidos pelas membranas
celulares e geram as células polares que dão origem aos gametas do adulto. A maioria
dos outros núcleos chegam à periferia do embrião no ciclo dez e em seguida sofrem
mais quatro divisões com velocidades progressivamente menores. Após o ciclo 13,
membranas celulares crescem entre os núcleos para formar o blastoderma celular de
cerca de 6000 células (Turner e Mahowald, 1977; Foe e Alberts, 1983). No ciclo 14, o
nível da transcrição geral, que era muito baixo, aumenta dramaticamente. Ao mesmo
tempo, o embrião de 2 a 3 horas inicia a gastrulação.
Os primeiros movimentos da gastrulação de Drosophila segregam o mesoderma, o
ectoderma e o endoderma presuntivos (Figura 14.1). O mesoderma presuntivo - apro-
ximadamente 1000 células contendo a linha ventral mediana - se dobram para produzir
o sulco ventral. Esse sulco se desprende da superfície para tornar-se o tubo ventral no
543
544 PARTE IV Especificação do Destino Celular e os Eixos Embrionários
(A) (B) (C)
Invaginação
do intestino
anterior
Sulco cefálico
Sulco ventral Sulco ventral
Células polares
na invaginação
do intestino
médio
(D) (E)
Clipeolabro
Região procefálica
Crista
(F) Segmento anterior
óptica
Crista
dorsal
Figura 14.1
Gastrulação em Drosohila. (A) Sulco ventral começando a formar à medida que as células
flanqueando a linha mediana ventral se invaginam. (B) O sulco se fecha, com células mesodérmi-
cas colocadas internamente e ectoderma superficial flanqueando a linha mediana ventral. (C)
Vista dorsal de um embrião um pouco mais velho mostrando as células polares e o endoderma
posterior mergulhando no embrião. (D) Vista lateral mostrando migração completa da banda
germinativa. Sutis reentrâncias marcam o começo da segmentação ao longo da banda germinati-
va: Ma, Mx e Lb correspondem aos segmentos mandibular, maxilar e labial da cabeça. T1-T3,
segmentos torácicos; A1-A8, segmentos abdominais. (E) Banda germinativa revertendo sua
direção. Os segmentos reais são agora visíveis, assim como os outros territórios da cabeça dorsal,
tal como o clipeolabro, a região procefálica, a crista óptica e a crista dorsal. (F) Larva recém-
eclodida do primeiro instar. (Cortesia de F. R. Turner.)
CAPÍTULO 14 Especificação axial em Drosophila 545
interior do embrião. Em seguida, se achata para formar uma camada de tecido mesodér-
mico sob o ectoderma ventral. O endoderma prospectivo invagina em duas bolsas nos
terminais anterior e posterior do sulco ventral. As células polares são internalizadas
juntamente com o endoderma. Nesse momento, o embrião se curva para formar o sulco
cefálico e as dobras transversais anterior e posterior. [other.html#droso1]
As células que permanecem na superfície (o ectoderma) sofrem convergência e
extensão, migrando para a linha ventral mediana para formar a banda germinativa. Essa
se estende posteriormente e talvez devido ao invólucro do ovo, se enrola em volta da
superfície superior (dorsal) do embrião. Assim, ao final da formação da banda
germinativa, as células destinadas a formar as estruturas larvais mais posteriores
estão localizadas logo após a futura região da cabeça. Nesse momento, começam a
aparecer os segmentos corporais, dividindo o ectoderma e o mesoderma. A banda
germinativa se retrai em seguida, colocando os presuntivos segmentos posteriores na
extremidade posterior do embrião.
Enquanto a banda germinativa estiver em sua posição estendida, vários proces-
sos chaves morfogenéticos ocorrem: organogênese, segmentação e segregação dos
discos imaginais.* Além disso, o sistema nervoso forma-se a partir de duas regiões de
células ectodérmicas localizadas ventralmente. Conforme descrito no Capítulo 8, os
neuroblastos se diferenciam desse ectoderma neurogênico dentro de cada segmento
(e também da região não-segmentada do ectoderma da cabeça). Portanto, em insetos
como a Drosophila, o sistema nervoso está localizado ventralmente, em vez de ser
derivado do tubo neural dorsal, como nos vertebrados.
AS ORIGENS DA POLARIDADE ÂNTERO-POSTERIOR

Visão panorâmica
O plano geral do corpo da Drosophila é o mesmo no embrião, na larva e no adulto,
cada qual tendo um terminal da cabeça e um da cauda distintos, entre os quais estão
unidades repetitivas segmentares (Figura 14.2). Três desses segmentos formam o
tórax, enquanto outros oito segmentos formam o abdome. Cada segmento da mosca
*Os detalhes da diferenciação do disco imaginal serão discutidos no Capítulo 19. Para maiores
informações sobre a anatomia do desenvolvimento de Drosophila veja Bate e Martinez-Arias,
1993; Tyler e Schetzer, 1996; e Schwalm, 1997.
Cabeça
Protórax
Mesotórax
Metatórax
Figura 14.2
Comparação entre segmentação larval e adulta
Segmentos em Drosophila. Os três segmentos torácicos
abdominais podem ser distinguidos por seus apêndices: T1
(protorácico) somente tem patas; T2 (mesoto-
rácico) tem asas e patas; T3 (metatorácico) tem
halteres e patas.
Polaridade adulta tem a sua própria identidade. O primeiro segmento torácico por exemplo, somente
citoplasmática
tem patas; o segundo segmento torácico contém patas e asas. O terceiro segmento
(efeito
materno) torácico tem patas e halteres (equilibradores). Os segmentos torácicos e abdominais
também podem ser diferenciados por suas cutículas. Como aparece esse padrão? Duran-
te a última década, a combinação de métodos da biologia molecular, genética e embriologia,
levou a um modelo detalhado descrevendo como é gerado o padrão periódico ao longo
Gradiente de do eixo ântero-posterior, e como cada segmento é diferenciado dos outros.
proteína
Hunchback
A polaridade ântero-posterior no embrião, na larva e no adulto tem sua origem na
polaridade ântero-posterior do ovo(Figura 14.3). Os genes de efeito materno nos
ovários da mosca produzem RNAs mensageiros que são colocados em diferentes
regiões do ovo. Esse codifica proteínas regulatórias transcricional e de tradução que
Genes
gap se difundem através do blastoderma sincicial, e ativam ou reprimem a expressão de
certos genes zigóticos. Um par dessas proteínas, Bicoid e Hunchback, regula a produ-
ção de estruturas anteriores, enquanto outro par de proteínas especificado maternal-
mente, Nanos e Caudal, regulam a formação da parte posterior do embrião. Em segui-
Genes
pair-rule
da, os genes zigóticos regulados por esses fatores maternos são expressos em certos
domínios largos (cerca de três segmentos de largura), parcialmente sobrepostos. Es-
ses genes são chamados genes gap (genes de fenda-porque suas mutações causam
fendas no padrão de segmentação) e estão entre os primeiros genes transcritos no
embrião. As diferentes concentrações das proteínas dos genes gap causam a transcri-
ção dos genes pair-rule que dividem o embrião em unidades periódicas. O padrão de
transcrição desses genes pair-rule fornece um padrão de listas de sete bandas verti-
Genes de Genes cais perpendiculares ao eixo ântero-posterior. As listas das proteínas dos genes pair-
polaridade homeóticos rule ativam a transcrição dos genes de polaridade segmentar (segment polarity genes).
segmentar Seus mRNAs e produtos protéicos dividem o embrião em 14 unidades de largura
segmentar. Isso estabelece a periodicidade do embrião. Ao mesmo tempo, proteínas
Figura 14.3
Modelo generalizado da formação do padrão dos genes gap, pair-rule e de polaridade segmentar interagem para regular outra
de Drosophila. O padrão é estabelecido por classe de genes, os genes homeóticos, cuja transcrição determina o destino desenvol-
genes de efeito materno que formam gradien- vimental de cada um desses segmentos.
tes e regiões de proteínas morfogênicas. Es-
ses determinantes morfogênicos criam um gra- Os genes de efeito materno
diente da proteína Hunchback que ativa dife-
rencialmente os genes gap que definem terri- Evidência Embriológica da Regulação da Polaridade
tórios amplos do embrião. Os genes gap per-
pelo Citoplasma do Oócito
mitem a expressão de genes pair-rule cada qual
dividindo o embrião em regiões de largura
aproximada equivalente a dois segmentos pri- Experimentos embriológicos clássicos demonstraram que existem pelo menos dois
mordiais. Os genes da polaridade segmentar “centros de organização” no ovo do inseto. Um é o centro de organização anterior, o
dividem o embrião em unidades de tamanho outro o centro de organização posterior. Klaus Sander (1975) postulou que essas duas
segmentar ao longo do eixo ântero-posterior. áreas de organização formam dois gradientes, um iniciado no terminal anterior, e o
A combinação desses genes define os domí- outro no terminal posterior. Cada um desses gradientes forma as suas estruturas
nios espaciais dos genes homeóticos que de- próprias nos pólos e interage com o outro gradiente para formar a estrutura central do
finem as identidades de cada segmento. Des- embrião. Sander baseou esse modelo em experimentos envolvendo a ligação do em-
sa maneira, periodicidade é gerada a partir de
brião em vários tempos durante o desenvolvimento, e transplantando regiões do
não-periodicidade, e cada segmento recebe
uma única identidade. citoplasma polar de uma região do ovo para outra (Figura 14.4). Primeiro, quando ele
moveu o citoplasma do pólo posterior para mais anteriormente, obteve um pequeno
embrião anterior ao plasma do pólo posterior, enquanto segmentos extras, não organi-
zados em um embrião, formavam-se atrás dele (veja Figura 14.4D). Em segundo lugar,
ele quando ligava o ovo precocemente durante o desenvolvimento, separando a re-
gião anterior da posterior, metade se desenvolveu em um embrião anterior, enquanto a
outra metade se desenvolveu em um embrião posterior, porém, nenhuma das metades
continha os segmentos medianos do embrião. Quanto mais tardiamente no desenvol-
vimento era feita a ligadura, menos segmentos medianos estavam faltando. Assim,
pareceu que realmente havia gradientes emanando dos dois pólos durante a clivagem
e que esses gradientes interagiam para produzir a informação posicional determinante
da identidade de cada segmento.
Anterior
Prosencéfalo
Segmentos
da cabeça
Segmentos
torácicos
Segmentos
abdominais
Posterior
Figura 14.4
Experimento de ligadura de Sander no embrião do inseto saltador de folhas Euscelis. (A) Em-
brião normal em visão ventral. A bola preta na base representa um agregado de bactérias simbióticas
que marca o pólo posterior. (B) Após ligadura do embrião precoce, forma-se um embrião parcial,
mas a cabeça e os segmentos torácicos estão ausentes em ambos embriões. (C) Quando ligados
mais tarde (no estágio de blastoderma) são formados mais dos segmentos faltantes, mas a maioria
dos embriões ainda não tem os segmentos mais centrais. (D) Quando o citoplasma do pólo
posterior é transplantado para um embrião ligado no estágio de blastoderma, um embrião peque-
no, porém completo, forma-se na metade anterior, enquanto a metade posterior forma um embrião
parcial invertido. Esses resultados podem ser explicados em termos de gradientes nos pólos do
embrião que ativam um conjunto de estruturas e reprimem a formação de outras. (Segundo
Sander, 1960, e French, 1988.)
A possibilidade do mRNA ser responsável pela geração do gradiente anterior foi

sugerida por uma série de experimentos de Kalthoff e Sander (1968). Esses autores
acharam que quando a porção anterior de ovo de Smittia (mosquito pólvora) foi
exposta à luz ultravioleta de comprimentos de onda capazes de inativar RNA (265 e 285
nm), os embriões desenvolviam dois abdomes e telsos (caudas) com simetria de ima-
gem espelhar: telso-abdome-abdome-telso (Figura 14.5). Evidência adicional que o
RNA é importante para a especificação da porção anterior do embrião da mosca foi
obtida por Kandler-Singer e Kalthoff (1976), que submergiram ovos de Smittia em
soluções contendo várias enzimas e em seguida puncionaram os ovos em regiões
específicas. Abdomes duplos resultaram da permissão para a entrada de RNase no
terminal anterior. Outras enzimas não causaram essa anormalidade, nem a RNase cau-
sou esse efeito quando penetrou em outras regiões do ovo. Assim, o laboratório de
Sander postulou a existência de um gradiente em cada terminal do ovo, e pareceu
provável que o ovo seqüestrou um RNA que gerava um gradiente de material ântero-
formador.
O Modelo Molecular: Gradientes Protéicos no Embrião Precoce

Figura 14.5
Em 1988, a hipótese do gradiente foi unida com uma metodologia genética de estudo
Embriões normal e irradiado do mosquito-pól-
da embriogênese de Drosophila. Se houvesse gradientes, quais eram os morfógenos vora (Smittia). O embrião normal (no alto)
cujas concentrações mudavam ao longo do espaço? Quais eram os genes que molda- mostra uma cabeça à esquerda e segmentos
vam esses gradientes? E essas substâncias agiriam ativando ou inibindo certos genes abdominais à direita. O embrião irradiado com
nas áreas onde estavam concentradas? Christiane Nüsslein-Volhard conduziu um pro- luz UV não tem a região da cabeça mas tem
grama de pesquisa que encontrou um conjunto de genes que codificava morfógenos segmentos abdominais em ambos os lados. (De
de gradientes para a parte anterior do embrião, outro conjunto de genes que codificava Kalthoff, 1969, cortesia de K. Kalthoff.)
Tabela 14.1 Genes de efeito materno que afetam a polaridade ântero-posterior do embrião de Drosophila
Gene Fenótipo Funções e estruturas propostas
GRUPO ANTERIOR
bicoid (bcd) Cabeça e tórax deletados, substituídos Morfógeno anterior graduado contém
por telso invertido homeodomínio, reprime caudal
exuperantia (exu) Estruturas anteriores da cabeça deletadas Âncora mRNA bicoid
swallow (swa) Estruturas anteriores da cabeça deletadas Âncora mRNA bicoid
GRUPO POSTERIOR
nanos (nos) Sem abdome Morfógeno posterior; reprime huchback
tudor (tud) Sem abdome, sem células polares Localização de Nanos
oskar (osk) Sem abdome, sem células polares Localização de Nanos
vasa (vas) Sem abdome, sem células polares; Localização de Nanos
oogênese defeituosa
valois (val) Sem abdome, sem células polares; Estabilização da localização do
celularização defeituosa complexo Nanos
pumilio (pum) Sem abdome Ajuda proteína Nanos ligar mensagem
hunchback
caudal (cad) Sem abdome Ativa genes do terminal posterior
GRUPO TERMINAL
torso (tor) Sem terminais Possível morfógeno para terminais
trunk (trk) Sem terminais Transmite sinal torsolike para torso
fs(1)Nasrat[fs(1)N] Sem terminais; ovos em colapso Transmite sinal torsolike para torso
fs(1)polehole[fs(1)ph] Sem terminais; ovos em colapso Transmite sinal torsolike para torso
Fonte: Segundo Anderson, 1989
os morfógenos responsáveis pela organização da região abdominal do embrião e um

terceiro conjunto codificava proteínas que produziam as regiões terminais de ambas
as extremidades do embrião (Figura 14.6; Tabela 14.1). Esse trabalho resultou em um
Prêmio Nobel para a pesquisadora e seu colega Eric Wieschaus, em 1995. [droso1.html]
O eixo ântero-posterior para o embrião de Drosophila parece ser padronizado
antes mesmo do núcleo começar a funcionar (Figura 14.7). As células nutrizes do
ovário depositam mRNAs no oócito em desenvolvimento, e esses mRNAs se tornam
porção de diferentes regiões da célula. Em especial, quatro mRNAs são críticos para a
formação do eixo ântero-posterior:
• mRNAs bicoid e hunchback, cujos produtos protéicos são críticos para a
formação da cabeça e do tórax
• mRNAs nanos e caudal cujos produtos protéicos são críticos para a formação
dos segmentos abdominais
Os mRNAs bicoid são amarrados aos microtúbulos anteriores, enquanto as mensa-
gens nanos são ligadas ao citoesqueleto cortical posterior. Os mRNAs hunchback e
caudal são distribuídos através de todo o oócito. Após a fecundação, os mRNAs
podem ser traduzidos em proteínas. No pólo anterior o RNA bicoid é traduzido em
proteína Bicoid, que forma um gradiente mais alto no anterior. No pólo posterior, a
mensagem nanos é traduzida em proteína Nanos, que forma o gradiente mais alto no
▲
Figura 14.6
Três vias genéticas independentes interagem para formar o eixo ântero-posterior do embrião de
Drosophila. Em cada caso, a assimetria inicial é estabelecida durante a oogênese, e o padrão é
organizado pelos produtos maternos logo após a fertilização. A realização do padrão ocorre
quando os produtos maternos localizados ativam ou reprimem genes zigóticos específicos em
diferentes regiões do embrião. (Segundo St. Johnston e Nüsslein-Volhard, 1992.)
Meia- Conclusão da Blastoderma Blastoderma Expressão Fenótipo
oogênese oogênese sincicial celular gênica
Proteína Tipo selvagem

mRNA bicoid Proteína Bicoid RNA do gene Ácron
gap anterior Hunchback
Cabeça
mRNA Células
bicoid nutrizes Tórax
Abdome
Telso
Deficiente em bicoid
Telso
Proteína Células Células
Oócito
Caudal embrionárias polares
Células nutrizes ovarianas mRNA bicoid mRNA bicoid Proteína Bicoid ativa Abdome
secretam mRNA bicoid localizado no anterior traduzido forma os genes gap anterior,
para o oócito, cujo núcleo por produtos de gradiente protéico; orthodentical
interage com células exuparantia e reprime tradução de buttonhead,
foliculares posteriores swallow mRNA caudal e o gene hunchback
Anterior Bicoid: Telso
Proteína
RNA Hunchback
hunchback
Materno
RNA nanos Deficiente em nanos
Ácron
Cabeça
Tórax
Proteína
Nanos RNA giant Telso
Proteína RNA RNA
Staufen oskar RNA nanos Knirps
Células nutrizes mRNA nanos mRNA nanos traduzido nanos ativa genes
ovarianas secretam secretado por células bloqueia tradução gap posteriores
“forma” posterior para nutrizes ovarianas da mensagem (tais como
ligar mRNA nanos localizadas no hunchback no knirps e giant)
pólo posterior posterior do embrião
Posterior: Nanos
Proteína Proteína mRNA
Proteína Torsolike Torso ativada tailess e
Proteína
Torsolike huckebein
Torso
Deficiente em torso
Cabeça
Tórax
Proteína
Torsolike Abdome
Células
Células foliculares
foliculares
ovarianas produzem mRNA tailess
proteína Torsolike Torsolike ativa e huckebein Torso ativa
nas extremidades Torso nas genes gap
anterior e posterior extremidades terminais
Terminal: Torso
A) Oócito (C)
ANTERIOR
Concentração
mRNA bicoid
Cortex,
Bicoid Hunchback Nanos Grauzone,
caudal
Staufen
mRNA caudal
Anterior Posterior Proteína Bicoid
(B) Embrião de clivagem precoce
Proteína Caudal
PROTEÍNA
POSTERIOR
Hunchback
Concentração
Bicoid mRNA nanos

Caudal
Nanos Smaug Oskar mRNA
hunchback
Proteína
Nanos Pumilio p55
Anterior Embrião de Posterior
Proteína
clivagem precoce
Hunchback
Figura 14.7
Um modelo da geração do padrão ântero-posterior por genes de efeito materno. (A) Os RNA
mensageiros bicoid, nanos, hunchback e caudal são colocados no oócito pelas células nutrizes
ovarianas. A mensagem bicoid é seqüestrada anteriormente. A mensagem nanos é enviada para
o pólo posterior. (B) Na tradução, o gradiente da proteína Bicoid é enviado para o pólo posterior,
e o gradiente da proteína Nanos se estende do posterior para o anterior. Nanos inibe tradução da
mensagem hunchback (no posterior), enquanto Bicoid previne a tradução da mensagem caudal
(no anterior). Isso resulta na oposição dos gradientes Caudal e Hunchback. O gradiente Hunchback
é reforçado secundariamente pela transcrição do gene hunchback dos núcleos anteriores (já que
Bicoid age como um fator de transcrição ativando a transcrição do gene hunchback). (C) Intera-
ções paralelas pelas quais a regulação da tradução gênica estabelece o padrão ântero-posterior do
embrião de Drosophila. No anterior do embrião, o mRNA bicoid é ligado ao citoesqueleto
anterior e impedido de ser traduzido por ter uma pequena cauda poliadenilada. Na fecundação, a
cauda é estendida de maneira dependente das proteínas Cortex, Grauzone e Staufen, e o mRNA
bicoid é traduzido. A proteína Bicoid suprime a tradução do mRNA caudal. Na região posterior
do embrião, o mRNA nanos é suprimido no oócito pela proteína Smaug (que se liga à sua
3’UTR). Na fertilização, Oskar ajuda em sua tradução e a proteína Nanos age como um supressor
da tradução de mRNA hunchback. (C segundo Macdonald e Smibert, 1996.)
posterior. A proteína Bicoid inibe a tradução do RNA caudal, permitindo com isso que
a proteína Caudal seja somente sintetizada na parte posterior da célula. Reciprocamen-
te, a proteína Nanos, em conjunto com a proteína Pumilio, liga-se ao RNA hunchback,
impedindo sua tradução na parte posterior do embrião. Bicoid também eleva o nível da
proteína Hunchback no anterior do embrião ligando-se aos intensificadores do gene
hunchback e estimulando sua transcrição (Figura 12.18). O resultado dessas intera-
ções é a criação de quatro gradientes protéicos no embrião precoce:
• Um gradiente anterior-para-posterior da proteína Bicoid
• Um gradiente anterior-para-posterior da proteína Hunchback
• Um gradiente posterior-para-anterior da proteína Nanos
• Um gradiente posterior-para-anterior da proteína Caudal
O palco está agora preparado para a ativação dos genes zigóticos naqueles núcleos que
tinham sido ocupados dividindo-se enquanto esse gradiente estava sendo estabelecido.
& Especulações
Modelos de Gradientes da Informação Posicional
C OMO PODEM CÉLULAS ser in- sificador que liga o morfógeno fracamen- (A) (C)
formadas de sua posição no te. Somente quando houver uma grande
embrião e em seguida usar tal concentração do morfógeno esse gene
informação para diferenciar-se no tipo estaria ativo. O(s) gene(s) responsáveis
apropriado de célula? Uma explicação pro- pela formação do tórax, por outro lado,
põe gradientes de substâncias morfoge- poderiam apresentar um intensificador que
(B) (D)
néticas (Boveri, 1901; Child, 1941; Wol- ligasse o morfógeno mais eficazmente, o Gradiente Q
Concentração Q
pert, 1971). Nesses modelos, uma subs- que o habilitaria a responder a níveis rela- Gradiente P
tância solúvel (morfógeno) é posicionada tivamente baixos daquele morfógeno. As
de forma a se difundir de uma fonte (onde células da cabeça expressariam ambos os
é produzida) para um ralo (onde é degra- genes, enquanto os genes do tórax ex-
dada), estabelecendo um intervalo contí- pressariam somente aquele gene cujo in-
nuo de concentrações dentro dessa re- tensificador puder ligar baixas quantida- Centro da
Veias alares
pinta ocular
gião. Considerações teóricas (veja Crick, des do morfógeno. As células das por-
1970) sugerem que cada um desses gradi- ções posteriores do corpo não veriam Figura 14.9
entes somente pode atuar ao longo de dis- quantidade alguma desse morfógeno, e Modelo de um gradiente de informação
posicional proposto para explicar pintas em asas
tâncias curtas, menos que 100 células de nenhum desses genes seria ativado. Des- de borboleta. (A) Fotografia de uma pinta ocu-
diâmetros. Em modelos de gradientes, a sa maneira, as células poderiam sentir a lar na asa de Morpho peleides. (B) Diagrama
concentração de morfógenos muda com presença de um morfógeno e responder de um modelo de dois gradientes que pode ex-
a distância, as concentrações mais altas diferentemente. O sensor não precisaria plicar a maneira pela qual a pinta foi gerada. A
estão próximas da fonte do morfógeno. ser um intensificador; poderia bem ser origem do morfógeno está no centro da pinta e
As células teriam que ter “sensores” que um receptor para um fator de crescimen- corresponde ao ápice de um cone, cuja altura
reflete sua concentração. A concentração Q re-
responderiam diferentemente a concentra- to específico na superfície celular (veja presenta o nível de morfógeno necessário para
ções diferentes do gradiente. Se o Capítulo 17). alcançar o limiar de sensibilidade para forma-
morfógeno for um fator de transcrição, A maioria dos modelos de gradiente ção de cor naquelas células alares. (C) Foto-
elementos intensificadores ou promoto- assume que todas as células que podem grafia da asa de Smyrna blomfildia, na qual as
res poderiam ligar o morfógeno com for- responder a um gradiente são equivalen- pintas oculares são elípticas. (D) Orientações
diferentes do gradiente de sensibilidade Q po-
ças diferentes (Figura 14.8). Por exemplo, tes. Todas essas células interpretam o si- dem resultar em tais pintas elípticas. (Segundo
se um morfógeno estiver sendo produzi- nal do morfógeno da mesma maneira e a Nijhout, 1981, cortesia de H. F. Nijhout.)
do no anterior do corpo, os genes res- concentração de morfógeno que recebem
ponsáveis pela organização do desenvol- determina sua identidade. Porém, a inter-
amente linear. Considere por exemplo, uma
vimento da cabeça poderiam ter um inten- pretação dos gradientes não é necessari-
série de notas de um exame que se esten-
de uniformemente de 100 a 60. Em um es-
Ambos Gene A inativo Ambos genes
genes Gene B ativo inativos
quema (uma leitura “linear”), uma nota
ativos Figura 14.8 entre 100 e 90 é A, 89-80 é B, 79-70 é C e
Gene A Modelo hipotético para gradientes estabelecen- 69-60 é D. Em uma outra classe (usando
do informação posicional. A concentração do leitura “curva”), 100-95 é A, 94-85 é B, 84-
Gene B morfógeno diminui a partir da origem. Neste 70 é C e 69-60 é D. Nijhout (1981) usou um
diagrama, os receptores para o morfógeno são modelo de dois gradientes para explicar o
elementos intensificadores para dois genes que desenvolvimento dos padrões “marcas de
Concentração do morfógeno
controlam o destino celular, porém, os recepto- olhos” das asas de borboleta. Um gradi-
res também poderiam ser citoplasmáticos ou ente consiste de uma difusão linear de
de membrana. Um dos receptores (neste caso, morfógeno. O segundo envolve a inter-
Limiar A
Limiar B
o intensificador no gene A) necessita de uma pretação desse morfógeno; ou seja, o li-

alta concentração de morfógeno para atuar. Em miar de sensibilidade das células envolvi-
altas concentrações de morfógeno, ambos ge-
das difere em diferentes regiões das asas.
nes A e B são ativos. Em concentrações mode-
A existência do segundo gradiente dá ori-
radas, somente o gene B é ativo. Onde a con-
centração do morfógeno cai abaixo de outro
gem a uma marca elíptica, não a marca cir-
limiar, nenhum dos genes é ativo. (Segundo cular que resultaria se não existisse o gra-
Distância da fonte Wolpert, 1978.) diente de sensibilidade (Figura 14.9).
Figura 14.10 (A) (B)

Fenótipo de um embrião fortemente
afetado, oriundo de uma fêmea defi-
ciente no gene bicoid. (A) Padrão da
cutícula de um tipo selvagem. (B)
Mutante bicoid. A cabeça e o tórax
foram substituídos por um segundo
conjunto de estruturas do telso pos-
terior. Abreviações: fk, filzkörper;
ap, placas anais (ambas estruturas de telsos);
T1-T3, segmentos torácicos; A1, A8, os dois
segmentos abdominais terminais; mh, cs, es- Evidência que o Gradiente da Proteína Bicoid Constitui o
truturas da cabeça. (de Driever et al. 1990. Centro de Organização Anterior
Cortesia de W. Driever.)
Em Drosophila, o fenótipo do mutante bicoid é muito interessante em ternos de
gradientes. Em lugar de ter estruturas anteriores (ácron, cabeça e tórax) seguidas por
estruturas abdominais e um telso, a estrutura do mutante bicoid é telso-abdome-
abdome-telso (Figura 14.10). Parece que esses embriões carecem de todo morfógeno
necessário para as estruturas anteriores. Além disso, pode-se postular que a substân-
cia da qual esses mutantes carecem é aquela sugerida por Sander e Kalthoff de ativar
os genes para as estruturas anteriores e desligar genes para as estruturas do telso
(Compare as Figuras 14.10 e 14.5).
Outros estudos reforçaram o ponto de vista de que o produto do gene bicoid do
tipo selvagem (bcd) é o morfógeno que controla o desenvolvimento anterior. Em
primeiro lugar, bicoid é um gene de efeito materno. O RNA mensageiro dos genes
(A)
(B)
(C)
Concentração da proteína Bicoid
Figura 14.11
Gradiente da proteína Bicoid no embrião precoce de Drosophila.
(intensidade da mancha)
(A) Localização do mRNA bicoid na extremidade anterior do

embrião. (B) Gradiente da proteína Bicoid logo após a fecunda-
ção. Notar que a concentração é mais alta anteriormente, diminu-
indo posteriormente. Notar também que a proteína Bicoid está
Tipo selvagem
concentrada nos núcleos do embrião. (C) Escaneamento
densidométrico do gradiente da proteína Bicoid. A curva superi-
Mutante bicoid
or representa o gradiente da proteína Bicoid em embriões tipo
selvagem. A curva inferior representa a proteína Bicoid em em-
briões de mães deficientes em bicoid. (A de Kaufman et al.,
1990; B e C de Driever e Nüsslein-Volhard, 1988a; fotografias
cortesia dos autores.) Anterior Posterior
bicoid materno é colocado no embrião pelas células ovarianas maternas (Frigerio et

al., 1986; Berleth et al., 1988; detalhes no Capítulo 22). O RNA bicoid está estritamente
localizado na parte anterior do oócito (Figura 14.11A). Driever e Nüsslein-Volhard
(1988a) mostraram que quando a proteína Bicoid é traduzida desse RNA durante a
clivagem precoce, forma um gradiente com a concentração mais alta no anterior do
ovo e com níveis de fundo na terceira parte posterior do ovo. Além disso, essa prote-
ína logo fica concentrada nos núcleos embrionários da porção anterior do embrião
(Figura 14.11B,C; Prancha 14A).
Mais evidência que a proteína Bicoid é o morfógeno anterior veio de experimentos
que alteraram a inclinação do gradiente. Dois genes, exuperantia e swallow, são
responsáveis pela manutenção da mensagem bicoid no pólo anterior do ovo. Em sua
ausência, a mensagem bicoid difunde mais para o posterior do ovo, e o gradiente da
proteína Bicoid aumenta mais vagorosamente (Driever e Nüsslein-Volhard, 1988b). O
fenótipo produzido por esses dois mutantes é semelhante aquele de embriões defici-
entes em bicoid, porém, menos severo. Esses embriões carecem de suas estruturas
anteriores e têm uma boca e região torácica estendida. Assim, alterando-se o gradiente
da proteína Bicoid, em correspondência altera-se o destino das regiões embrionárias.
A confirmação que a proteína Bicoid é crucial para o início da formação da cabeça
e do tórax veio de experimentos nos quais RNA bicoid purificado foi injetado nos
embriões em clivagem precoce (Figura 14.12; Driever et al., 1990). Quando injetado no
anterior de embriões deficientes de bicoid (cujas mães não tinham genes bicoid), o
RNA bicoid salvou os embriões e fez com que tivessem polaridade ântero-posterior
normal. Além disso, qualquer local no embrião onde as mensagens bicoid haviam sido
injetadas, tornaram-se cabeça. Quando RNA bicoid foi injetado no centro do embrião,
essa região mediana tornou-se a cabeça e as laterais tornaram-se estruturas torácicas.
Se uma grande quantidade de RNA bicoid foi colocada no pólo posterior de um
embrião de tipo selvagem (com sua própria mensagem bicoid no pólo anterior), duas
cabeças emergiram, uma em cada terminal. Portanto, o gene bicoid é atualmente con-
siderado codificar o morfógeno anterior do embrião de Drosophila. Figura 14.12
A próxima questão que emergiu foi: Como foi conseguida essa localização do RNA Representação esquemática do experimento
bicoid? As teorias correntes serão detalhadas no Capítulo 22, mas resumidamente, o demonstrando que o gene bicoid codifica o
citoesqueleto anterior ancora o RNA bicoid através da região 3’ não-traduzida da morfógeno responsável pelas estruturas da ca-
mensagem 3’. O citoesqueleto posterior tem locais específicos de ancoragem que irão beça em Drosophila. Os fenótipos dos embri-
ões deficientes em bicoid e tipo selvagem são
mostrados nos lados. Quando embriões defi-
cientes em bicoid são injetados com mRNA
bicoid, o local da injeção forma as estruturas
da cabeça. Quando o pólo posterior de um
embrião de clivagem precoce do tipo selva-
gem é injetado com mRNA bicoid, estruturas
mRNA bicoid de cabeça se formam em ambos os pólos. (Se-
gundo Driever et al., 1990.)
Tipo selvagem Tipo selvagem
Fenótipo deficiente Fenótipo

em bicoid tipo selvagem
Ácron Cabeça Tórax Abdome Telso

Figura 14.13 (A) Estágio 1-6 (?) (B) Estágio 6-7 (C) Estágio 7-8
A importância das interações oócito-folículo
Células Núcleo do
na formação dos eixos dorsoventral e ântero-
nutrizes Oócito gurken oócito
posterior de Drosophila. (A) O núcleo do
oócito fica localizado no lado posterior do ovo.
Ele localiza um fator (a proteína Gurken) que é
recebido pelas células no terminal posterior da
câmara do ovo. (B,C) Isso faz com que as célu-
las foliculares se diferenciem em células foli-
culares posteriores e secretem algum fator que Células Núcleo do Células Células
motiva o oócito a realinhar seus microtúbulos. foliculares oócito com foliculares foliculares
É possível que esse fator atue ativando a prote- polares não- mRNA gurken anteriores posteriores
ína quinase A (PKA) na membrana celular do comprometidas
oócito (veja Capítulo 22). (D) Essa reorganiza- Mensagem gurken
ção permite o transporte da proteína Oskar e mRNA bcd
(D) Estágio 9 sobre o núcleo
mRNA nanos para o pólo posterior do ovo e Células foliculares dorsais
retém a mensagem bicoid no pólo anterior do
Microtúbulos
ovo. Ao mesmo tempo, o núcleo do oócito vi-
aja ao longo dos microtúbulos repolarizados Células foliculares
em direção à região dorso-anterior do ovo. Aqui, posteriores
o mesmo sinal (a proteína Gurken) inicia o eixo
dorsoventral sinalizando essas células para tor- mRNA osk
narem-se células foliculares dorsais. (Segundo
Gonzáles-Reyes et al., 1995.) Células foliculares ventrais
reconhecer a 3’UTR da mensagem nanos. Assim, a organização global do citoesque-

leto do oócito é crucial para o desenvolvimento. Como ocorre essa organização do
citoesqueleto? No meio da oogênese, o núcleo do oócito está posicionado perto do
pólo posterior do oócito (i.e., longe das células nutrizes). O núcleo do oócito serve
como um “local de coleta” para o RNA gurken, uma mensagem que codifica um
homólogo do fator de crescimento epidérmico e cuja síntese não é bem compreendida.
A mensagem gurken se coleta diretamente sobre o núcleo, entre o núcleo e as células
foliculares dorsais posteriores. Aqui, ele é traduzido em proteína Gurken e é secretado
pelo oócito para aquelas células foliculares mais próximas do núcleo – as células
foliculares posteriores. Isso altera essas células foliculares motivando-as a secretar
um fator que induz a reorganização dos microtúbulos do oócito. Esses microtúbulos
iniciam a reorganização do citoesqueleto do oócito permitindo ao núcleo mover-se de
sua posição posterior para a porção dorso-anterior do oócito em crescimento (Figura
14.13; Gonzáles-Reyes et al., 1995; Roth et al., 1995). Assim, o primeiro sinal para o eixo
ântero-posterior do embrião vem das células foliculares maternas. A distinção entre
células foliculares anteriores e posteriores no ovário causa a distinção entre o eixo
anterior e posterior do embrião.
A próxima questão emergiu em seguida: Como podia um gradiente da proteína
Bicoid controlar a determinação do eixo ântero-posterior? Evidência recente sugere
que Bicoid age de duas maneiras para especificar o anterior do embrião de Drosophi-
la. Primeiro, agindo como um repressor da formação do posterior. Ela faz isso ligando
e suprimindo a tradução do RNA caudal que é encontrado em todo o ovo e no embrião
precoce. O homeodomínio da proteína Bicoid liga-se à uma região específica da região
3’ não-traduzida da mensagem caudal (Dubnau e Struhl, 1996; Rivera-Pomar et al.,
1996). Essa supressão é necessária, pois se a proteína Caudal for produzida no anteri-
or, cabeça e tórax não serão formados de maneira apropriada. O segundo modo de
função de Bicoid é a nível da ativação transcricional. A proteína Bicoid parece pene-
trar nos núcleos dos embriões em clivagem. Aqui, ela ativa o gene hunchback (hb). A
transcrição de hunchback é somente vista na metade anterior do embrião – a região
onde é vista a proteína Bicoid. Mutantes deficientes em proteína Hunchback materna
e zigótica carecem de partes orais e estruturas torácicas. Em fins da década de 1980,
dois laboratórios demonstraram, independentemente, que a proteína Bicoid se liga e

ativa o gene hunchback (Driever e Nüsslein-Volhard, 1989; Struhl et al., 1898). A
proteína Hunchback derivada da síntese do novo mRNA hunchback junta-se à prote-
ína Hunchback sintetizada pela tradução de mensagens materna no anterior do em-
brião. A proteína Hunchback, também um fator de transcrição, é considerada reprimir
genes abominais específicos, permitindo com isso que a região de expressão hunchback
forme a cabeça e o tórax. Usando determinação da “pegada” (“footprinting”) de DNase
(na qual as proteínas são ligadas a um segmento de DNA, DNase adicionada, e o
único DNA que permanece é aquele protegido pela proteína ligante de DNA), os
pesquisadores encontraram que a proteína Bicoid se liga a cinco sítios na região
promotora a montante do gene hunchback. Todos esses sítios têm a seqüência
consensual 5’-TCTAATCCC-3’.
Porém, ligação não significa necessariamente ativação. A ativação desse gene
pela proteína Bicoid foi demonstrada fundindo esses sítios promotores de hunchback
com genes repórteres da acetiltransferase cloroanfenicol (CAT) e injetando esses
genes em embriões precoces de Drosophila. Em todos os casos, a proteína Bicoid
foi necessária para ativar os genes repórteres. Quando injetada em embriões defici-
entes em bicoid não se produziu CAT (Figura 14.14). Também, enquanto alguma
ativação foi vista quando somente uma das cinco seqüências ligantes de Bicoid
estava presente, a expressão total do gene repórter (e presumivelmente de
hunchback) apareceu quando três dos cinco sítios estavam presentes. Assim, o
gradiente da proteína Bicoid provavelmente atua ativando a transcrição do gene
hunchback na porção anterior do embrião.
A proteína Hunchback também trabalha com a Bicoid gerando o padrão anterior do
embrião. Driever e colaboradores (1989) predisseram que ao menos um outro gene
anterior além de hunchback deve ser ativado por Bicoid. Primeiro, deleções de
hunchback produzem somente alguns dos defeitos observados no fenótipo mutante
bicoid. Segundo, conforme vimos nos experimentos com swallow e exuparentia,
somente níveis moderados da proteína Bicoid são necessários para ativar a formação
do tórax (i.e., expressão gênica hunchback), mas a formação da cabeça necessita de
concentrações mais altas. Driever et al. (1989) predisseram que promotores tais como
o gene gap específico da cabeça teriam sítios de ligação de baixa afinidade para a
proteína Bicoid. Esse gene somente seria ativado em concentrações extremamente
altas da proteína Bicoid - isto é, perto da extremidade anterior do embrião. Desde
então, três genes gap da cabeça dependentes de concentrações muito altas da prote-
ína Bicoid para sua expressão foram descobertos (Cohen e Jürgens, 1990; Finkelstein
e Perrimon, 1990; Grossniklaus et al., 1994). Os genes buttonhead (bth), empty spiracles
(sem) e orthodenticle (otd) são necessários para especificar progressivamente as
Sítios ligantes do promotor hunchback Gene transferido para:

para o promotor bicoid Embriões deficientes
em bicoid
Embriões tipo selvagem
Figura 14.14
Influência da proteína Bicoid na ativação do gene hunchback. Dife-
rentes regiões do promotor hunchback foram fundidas com o gene
repórter CAT e injetadas em outros embriões tipo selvagem, ou
embriões de mães deficientes em bicoid. Quanto mais sítios ligantes
de Bicoid havia na região promotora, tanto mais eficaz era sua
expressão nos embriões de tipo selvagem. Em embriões sem prote-
ína Bicoid, nenhuma transcrição resultou de qualquer dos genes
Gene movimentados pelo promotor hunchback. (Segundo Driever e
CAT Atividade CAT Nüsslein-Volhard, 1989.)
regiões anteriores da cabeça. Em adição à sua necessidade por níveis altos de Bicoid
para ativação, esses genes também requerem a presença da proteína Hunchback para
serem transcritos (Simpson-Brose et al., 1994; Reinitz et al., 1995). As proteínas Bicoid
e Hunchback atuam sinergicamente como intensificadores desses “genes da cabeça”
promovendo suas transcrições.
O Centro de Organização Posterior:

Localizando e Ativando o Produto de nanos
O centro de organização posterior é definido pelas atividades do gene nanos (Lehmann

e Nüsslein-Volhard, 1991; Wang e Lehmann, 1991; Wharton e Struhl, 1991). O RNA
nanos é produzido no ovário e transportado para o óvulo, onde se liga na região
posterior (a mais distante das células nutrizes ovarianas). Os produtos de vários
outros genes (oskar, valois, vas, staufen e tudor) – os mesmos produtos gênicos que
colocam o determinante do plasma germinativo no plasma do pólo posterior (veja
Capítulo 13) – são necessários para colocar RNA nanos na parte posterior do ovo.* Se
nanos ou qualquer desses genes de efeito materno estão ausentes na mãe, não há
formação de abdome embrionário (Lehmann e Nüsslein-Volhard, 1986; Schüpbach e
Wieschaus, 1986).
A mensagem nanos é traduzida em proteína logo após a fecundação, tal como
acontece com a mensagem bicoid. Tautz (1988) mostrou que durante a formação nor-
mal do abdome, o produto protéico do gene nanos reprime a tradução do RNA
hunchback (veja Figura 14.7). Esse RNA hunchback está inicialmente presente em
todo o embrião, embora mais dele possa ser produzido a partir de núcleos zigóticos se
forem ativados pela proteína Bicoid. Assim, a combinação das proteínas Nanos e
Bicoid causa um gradiente de proteína Hunchback através do ovo (Figura 14.15). A
proteína Bicoid ativa a transcrição do gene hunchback na parte anterior do embrião,
enquanto a proteína Nanos inibe a tradução do RNA hunchback na parte posterior do
embrião. Se o produto do gene nanos não estivesse presente, a proteína Hunchback
seria fabricada em todo o embrião, e presumivelmente inibiria a expressão de genes
gap geradores do abdome, como knirps (Hülskamp et al., 1989; Irish et al., 1989;
Struhl, 1990). O gene hunchback, portanto, parece ser o ponto focal sob regulação
tanto do centro organizador anterior como do posterior, há muito conhecido existir no
desenvolvimento dos insetos. Esses estudos de funções nanos e bicoid podem agora
explicar experimentos embriológicos. Luz ultravioleta ou tratamento com RNase iria
destruir RNA bicoid, causando a perda de estruturas anteriores e a duplicação do
abdome; procedimentos de ligação podem bloquear o espalhamento de Nanos, permi-
tindo assim o acúmulo de níveis mais altos da proteína Hunchback.
Embora Nanos seja considerado o principal morfógeno posterior, duas outras
proteínas, Pumilio e Caudal, também são importantes para a construção dos segmen-
tos posteriores da Drosophila. A proteína Nanos não se liga diretamente à mensagem
hunchback. Em seu lugar, Pumilio, uma proteína encontrada por todo o embrião, liga-
se a 3’UTR da mensagem hunchback formando um sítio de ligação ao qual Nanos
pode se ligar (Barker et al., 1992; Murata e Wharton, 1995). A ligação de Nanos é crítica
para a repressão da tradução da mensagem hunchback. A proteína Caudal também é
importante para a formação de estruturas posteriores. Embora embriões possam
*Tal como a colocação da mensagem bicoid, a localização da mensagem nanos é determinada

pela sua região 3’ não-traduzida. Se a 3’UTR bicoid for colocada sobre a região codificadora do RNA
nanos, a mensagem nanos será colocada na parte anterior do ovo. Quando o RNA for traduzido, a
proteína Nanos irá inibir a tradução dos mRNAs bicoid e hunchback e o embrião formará dois
abdomens – um no anterior do embrião e um no posterior (Gavis e Lehmann, 1992). A localização
do RNA nanos irá, em última análise, depender das interações entre o oócito e as células foliculares
vizinhas que localizam a mensagem oskar no pólo posterior e localizam o RNA bicoid no pólo
anterior (veja Capítulo 22).
(A) MATERNOS Figura 14.15

Fatores de transcrição
Conversão de gradientes maternos em expressão zigótica do gene gap.
(A) Os gradientes dos fatores de transcrição maternos Bicoid, Caudal
e Hunchback regulam a transcrição dos genes gap. As proteínas
Hunchback e Caudal vêm de ambas mensagens maternas e nova trans-
crição zigótica. (B) A concentração das proteínas Bicoid, Hunchback
e Caudal é crítica na especificação das posições onde os genes gap são
transcritos. Essas proteínas se difundem, e a interação entre elas será
crítica para ativação da transcrição dos genes pair-rule. Nos dois ter-
minais, a interação entre Torso e Torsolike ativa os genes gap tailless
e huckebein. (Segundo Rivera-Pomar e Jäckle, 1996.)
ZIGÓTICOS
Ácron Cabeça Tórax Abdome Telso
formar segmentos abdominais na ausência de Caudal, esses segmentos são freqüen-

temente fundidos uns aos outros ou estão parcialmente ausentes (MacDonald e Struhl,
1986; Mlodzik e Gehring, 1987).
O Grupo Gene Terminal

Terminal
Quando ambos os centros de organização, anterior e posterior, forem não-funcionais,

um embrião pode ainda desenvolver algum padrão ântero-posterior (Nüsslein-Volhard
et al., 1987). Quando fêmeas são tornadas duplamente mutantes tanto para o morfógeno
anterior como para o posterior, seus embriões produzem dois telsos, um em cada
terminal do embrião. Assim, existe um terceiro conjunto de genes de efeito materno
que ajudam a criar os extremos do eixo ântero-posterior. Mutações nesses genes
terminais resultam na perda das extremidades não-segmentadas do organismo: o ácron
anterior e o telso posterior. Na ausência dos produtos desses genes, a porção seg-
mentada do embrião se expande até as extremidades (Degelmann et al., 1986; Klingler
et al., 1988). Portanto, o conjunto de genes terminais define os limites das partes
segmentadas do corpo.
O gene crítico aqui parece ser torso, um gene codificando uma tirosina quinase
receptora (veja Figura 14.6). O RNA torso é sintetizado por células ovarianas, deposi-
tado no oócito e traduzido após a fecundação. A proteína transmembrana Torso não
está restrita espacialmente aos terminais do ovo, mas está distribuída uniformemente
pela membrana plasmática (Casanova e Struhl, 1989). Uma mutação dominante de
torso, que proporciona atividade constitutiva ao receptor, converte toda a metade
anterior do embrião em um ácron e toda a metade posterior em um telso. Assim, Torso
precisa normalmente ser ativada somente nos terminais do ovo. Realmente, Stevens e
seus colegas (1990) mostraram que a proteína Torso é ativada por células foliculares
em cada pólo do embrião. O ativador da proteína Torso é provavelmente Torsolike,
Figura 14.16 Torsolike

Modelo hipotético da sinalização de Torso. A prote-
ína Torsolike, secretada pelas células foliculares an-
teriores e posteriores é ligada pelo receptor Torso RAS
Extracelular
(que é encontrado por toda a membrana do oócito).
Ligação do ligante conduz à ativação de torso e
autofosforilação em resíduos específicos de tirosina. Citoplasma
Os grupos fosfotirosina serão reconhecidos pelo Ativação
domínio da proteína Drk. O domínio SH3 da proteí- de RAS
na Drk liga-se à proteína SOS, com isso ativando a
GTPase da proteína Ras. Isso irá ativar a proteína
Ativação
Raf que é o primeiro membro de uma cascata de serina/ de Torso
treonina. Essa cascata em geral funciona fosforilando
um fator de transcrição permitindo-lhe com isso en- MAP quinase quinase
trar ou funcionar no núcleo. Esse fator não foi ainda
identificado. O resultado final é a estimulação da trans-
crição dos genes gap huckebein e tailless. (Segundo
Duffy e Perrimon, 1994.) MAP quinase
Fator de transcrição
Transcrição dos genes

huckebein e tailless
pois a mutação de perda-de-função do gene torsolike cria um fenótipo quase idêntico

ao produzido por torso. O gene torsolike é expresso nas células foliculares anteriores
e posteriores, e a proteína Torsolike secretada permanece próxima dessas células
(Martin et al., 1994). Stevens e colegas mostraram que quando as células foliculares
nos pólos da câmara do ovo são deficientes no gene torsolike (mesmo quando outras
células foliculares expressam o alelo tipo selvagem desse gene), o embrião resultante
terá o fenótipo semelhante àquele de torso. Parece que a proteína Torsolike é secretada
por células foliculares e que ativa a proteína Torso na membrana do oócito.
A ativação da tirosina quinase do receptor de Torso envolve a autofosforilação de
resíduos de tirosina e a subseqüente ativação das proteínas Ras e Raf (Figuras 14.15
e 14.16; Duffy e Perrimon, 1994). Essas proteínas ativam a cascata da quinase MAP
(veja Capítulo 3), que (de uma maneira ainda desconhecida) estimula a transcrição dos
genes gap, tailless e huckebein. Esses genes em seguida especificam os terminais do
embrião. A distinção entre os terminais anterior e posterior depende da presença de
Bicoid. Se os genes terminais agem sozinhos, células se diferenciam em telsos. Porém,
se Bicoid estiver também presente, as regiões formam um ácron (Pignoni et al., 1992).
O eixo ântero-posterior do embrião é portanto especificado por três conjuntos de
genes: aqueles que definem o centro de organização anterior, aqueles que definem o
centro de organização posterior, e aqueles que definem a região limítrofe terminal. O
centro de organização anterior está localizado no terminal anterior do embrião e age
através de um gradiente da proteína Bicoid que ativa os genes gap específicos do
anterior e suprime genes gap específicos do posterior. O centro de organização
posterior está localizado no pólo posterior e age através da formação da proteína

Nanos, que é transportada para a região abdominal. Aqui, Nanos inibe o inibidor da
expressão gênica específica do abdome e ativa aqueles genes que formam o abdome.
Os limites do ácron e do telso são definidos pelo produto do gene torso, que é ativado
nas extremidades do embrião.
Os genes da segmentação
Uma Visão Panorâmica
O compromisso do destino celular em Drosophila parece ser um processo de duas

etapas: especificação e determinação (Slack, 1983). Precocemente no desenvolvimen-
to, o destino de uma célula depende de sinais ambientais tais como aqueles fornecidos
pelos gradientes já mencionados. Essa especificação do destino celular é flexível e
ainda pode ser alterada em resposta a sinais ambientais. Finalmente, as células irão
sofrer uma transição desse tipo de comunicação frouxa para uma determinação
irreversível. Aqui, o destino da célula tornou-se intrínseco da célula.* A transição de
especificação para determinação em Drosophila é mediada pelos genes de segmentação
(segmentation genes). Esses genes dividem o embrião precoce em uma série repetitiva
de primórdios segmentares ao longo do eixo ântero-posterior. Mutações em genes de
segmentação causam ao embrião tornar-se carente de certos segmentos ou partes de
segmentos; essas mutações demonstram a existência de três classes de genes de
segmentação (Tabela 14.2). Freqüentemente essas mutações afetam parasegmentos,
regiões do embrião separadas por engrossamentos mesodérmicos e sulcos
ectodérmicos e que dividem o embrião em 14 regiões (Martinez-Arias e Lawrence,
1985). Os parasegmentos do embrião não se transformam nos segmentos da larva ou
do adulto. Ao invés disso, incluem a parte posterior do segmento anterior e a porção
anterior do segmento que o sucede (Figura 14.17). Embora os segmentos sejam as
principais divisões anatômicas do plano corporal da larva e do adulto, esses segmen-
tos são construídos de acordo com regras que usam o parasegmento como a unidade
básica da construção.
* Aficionados da teoria da informação irão reconhecer que o processo pelo qual a informação
ântero-posterior em gradientes morfogenéticos é transferida para domínios discretos de genes
seletores homeóticos representa uma transição de especificação analógica para digital. Especifica-
ção é analógica, determinação é digital. Isso permite que a informação transitória dos gradientes no
blastoderma sincicial seja estabilizada de modo a poder ser utilizada muito mais tarde no desenvol-
vimento (Baumgartner e Noll, 1990).
TABELA 14.2 Principais locais afetando o padrão de segmentação em Drosophila
Categoria Locais Categoria Locais
Genes gap Krüppel (Kr) Genes pair-rule fushi tarazu (ftz)

knirps (kni) (secundários) odd-paired (op)
hunchback (hb) odd-skipped (odd)
giant (gt) sloppy-paired (slp)
tailless (tll) paired (prd)
huckebein (hkb)
buttonhead (btd) Genes de polaridade engrailed (en)
empty spiracles (ems) segmentar wingless (wg)
cubitus interruptusD (ciD)
Genes pair-rule orthodenticle (otd) hedgehog (hh)
(primários) hairy (h) fused (fu)
even-skipped (eve) armadillo (arm)
runt (run) patched (ptc)
gooseberry (gsb)
pangolin (pan)
Segmentos
Comportamentos
Parasegmento
Figura 14.17
Segmentos e parasegmentos. A e P representam os compartimentos anterior e posterior
dos segmentos. Os parasegmentos são mudados para um compartimento à frente. Ma, Mx
e Lb representam três dos segmentos da cabeça (mandibular, maxilar e labial), os segmen-
tos T são torácicos, e os segmentos A são abdominais. Os parasegmentos estão numerados
de 1 até 14. Abaixo do mapa estão os limites da expressão gênica observada pela hibridi-
Embrião zação in situ do cDNA radioativo do gene pair-rule fushi tarazu (ftz). (Segundo Martinez-
Embrião mais Larva Arias e Lawrence, 1985.)
precoce tardio Larva (mutante
(normal) (normal) (normal) letal)
Área da Área da Existem três classes de genes de segmentação, cada classe expressa após outra
ação gênica ação gênica Bandas de
dentícula (Figura 14.3). A transição de um embrião caracterizado por gradientes de morfógenos
para um embrião tendo unidades distintas é realizada por produtos dos genes gap. Os
genes gap são ativados ou reprimidos pelos genes de efeito materno, e dividem o
embrião em largas regiões contendo vários primórdios parasegmentares. O gene
krüppel, por exemplo, é expresso primeiramente nos parasegmentos 4-6 no centro do
embrião de Drosophila (Figuras 14.18A e 14.19; Prancha 14A); a ausência de krüppel
faz com que o embrião não apresente essas regiões. Os produtos protéicos dos genes
(A) Gap: Krüppel gap interagem com as suas proteínas vizinhas codificadas por genes gap e ativam a
transcrição de genes pair-rule. A transcrição desses genes subdivide os largos domí-
nios do gene gap em parasegmentos. Mutações dos genes pair-rule (como em fushi
tarazu; Prancha 14C) usualmente deleta porções de cada segmento alternante. As
Figuras 14.18 e 14.20 comparam o morfologia do embrião de tipo selvagem com aquela
do mutante fushi tarazu. Finalmente, os genes de polaridade segmentar são responsá-
veis pela manutenção de certas estruturas repetitivas dentro de cada segmento. Mu-
tações nesse grupo de genes faz com que uma porção de cada segmento seja deletada
e substituída por uma estrutura em imagem espelhar de outra porção do segmento. Por
exemplo, em mutantes engrailed, as porções posteriores de cada segmento são subs-
(B) pair-rule: fushi tarazu tituídas por duplicatas da região anterior do segmento subseqüente (Figura 14.18C;
Prancha 14D). Assim, os genes de segmentação são fatores de transcrição que tomam
os gradientes do embrião de clivagem precoce e transformam o embrião em uma peri-
ódica estrutura parasegmentar.
Figura 14.18
Três tipos mutantes de padrões de segmentação. O painel à esquerda mostra o embrião em estágio
de clivagem, com a região onde um determinado gene é normalmente transcrito no embrião tipo
selvagem mostrado em cores. Nos três painéis à direita, as áreas coloridas foram deletadas à
(C) Polaridade segmentar: engrailed medida que esses mutantes se desenvolvem. (Segundo Mange e Mange, 1990.)
Após os limites parasegmentares terem sido produzidos, os genes pair-rule e gap

interagem para regular os genes homeóticos que determinam a identidade de cada
segmento. No fim do estágio de blastoderma celular, a cada primórdio segmentar foi
atribuída uma identidade individual por sua constelação única de produtos de genes
gap, pair-rule e homeóticos (Levine e Harding, 1989).
Os Genes de gap Figura 14.19

Expressão do gene Krüppel no centro e no
Os genes gap foram originalmente definidos por uma série de mutantes cujos embri- posterior do embrião de Drosophila (setas).
ões não tinham grupos de segmentos consecutivos (Nüsslein-Volhard e Wieschaus, Um embrião de 25 horas foi hibridizado com
1980). Conforme mostra a Figura 14.21, deleções causadas pelos genes hunchback cDNA que reconhecia acumulações de mRNA
(hb), Krüppel (Kr) e knirps (kr) cobrem toda região segmentar do embrião da Krüppel. (de Levine e Harding, 1989, cortesia
de M. Levine.)
Drosophila. O gene gap giant (gt), superpõe-se a esses três genes e os fenótipos
dos mutantes tailless e huckebein deletam porções dos terminais não-segmenta-
dos do embrião.
A expressão desses genes é dinâmica. Em geral, há um baixo nível de atividade
transcricional através de todo o embrião que se define em discretas regiões de alta
atividade à medida que a clivagem continua (Jäckle et al., 1986). O elemento crítico
parece ser a expressão da proteína Hunchback, que ao fim do ciclo 12 da divisão
nuclear, está em níveis altos na parte anterior do embrião e em seguida forma um
gradiente íngreme por 15 núcleos. O último terço do embrião não tem expressão de
detectável Hunchback. Os padrões de transcrição dos genes gap anterior são
iniciados pelas diferentes concentrações das proteínas Hunchback e Bicoid.
(A)
(B)
Pró-cefálico
Maxilar
Figura 14.20
Defeitos constatados no embrião ftz-. (A) Micrografia eletrônica
de varredura de um embrião do tipo selvagem, visto lateralmente.
(B) O mesmo estágio em um embrião ftz-. As linhas brancas
conectam as porções homólogas de uma banda germinativa seg-
mentada. (C) Diagrama da segmentação embrionária do tipo selva-
Clipeolabro
gem. As regiões sombreadas mostram os parasegmentos da banda
Labial
germinativa que estão faltando no embrião ftz-. (Segundo Kaufman
(C) Mandíbula et al., 1990, fotografias cortesia de T. Kaufman.)
hunchback
krüppel
Knirps
tailless
giant
Figura 14.21
Deleções segmentares em mutantes de genes gap. A tabela sob as fotografias indica por
barras brancas regiões segmentares faltantes. Em mutantes hunchback, a região é estendida
(sobreamento mais claro) quando tanto a mãe como o zigoto não têm atividade do gene
hunchback. Os reais domínios da expressão hunchback não foram completamente expres-
sos. (Segundo Gaul e Jäckle, 1990; expressão huckebein segundo Weigel et al., 1990;
fotografias cortesia de E. Wieschaus.)
Altos níveis da proteína Hunchback induzem a expressão de giant, enquanto os

transcritos de Krüppel aparecem sobre a região onde Hunchback começa a decli-
nar (veja Figura 14.15). Também, altos níveis da proteína Hunchback previnem a
transcrição dos genes gap posterior (tal como knirps) na parte anterior do em-
brião (Struhl et al., 1992).
No posterior, a proteína Hunchback encontra-se em níveis baixos ou ausente.
Considera-se que um gradiente da proteína Caudal, mais alto no pólo posterior,
seja responsável pela ativação dos genes gap abdominais knirps e giant. O gene
giant tem dois modos de ativação um para sua banda de expressão anterior, e um
para a banda de expressão posterior (veja Figura 14.15; Rivera-Pomar, 1995; Schultz
e Tautz, 1995).
Após a colocação inicial dessas proteínas pelos genes de efeito materno e
Hunchback, elas se estabilizam e são mantidas por interações entre os diferentes
genes gap*. Por exemplo, a expressão do gene Krüppel é regulada negativamente
no seu limiar anterior pela proteína Hunchback, e no seu limiar posterior pelas
proteínas Knirps e Tailless (Jäckle et al., 1986; Harding e Levine, 1988; Hoch et al.,
1992). Se a atividade de Hunchback está faltando, o domínio da expressão de
Krüppel estende-se anteriormente. Se a atividade Knirps estiver faltando, a ex-
pressão gênica Krüppel estende-se mais posteriormente. Os limites entre as regi-
ões de transcrição dos genes gap são provavelmente criados por repressão mú-
tua. Tal como as proteínas Giant e Hunchback podem controlar o limite anterior da
transcrição de Krüppel, assim também Krüppel pode determinar os limites poste-
riores da transcrição de giant e hunchback. Se um embrião não tiver o gene Krüppel,
a transcrição de hunchback continua para dentro da área usualmente reservada
para Krüppel (Jäckel et al., 1986; Kraut e Levine, 1991). Essas inibições formado-
ras de limites são consideradas ser mediadas diretamente pelos produtos dos
genes gap, porque todos os principais genes gap (hb, gt, Kr e kni) codificam
proteínas ligantes de DNA que podem ativar ou reprimir a transcrição (Kniple et
al., 1985; Gaul e Jäckle, 1990; Capovilla et al., 1992).
Além do mais, essas interações são altamente específicas e o produto de um
gene gap pode se ligar aos promotores de outros genes gap. A determinação da
“pegada” (“footprinting”) de DNase I mostra que a proteína codificada pelo gene
Krüppel tipo selvagem liga-se à região promotora do gene hunchback (que ele
inibe) e à região promotora do gene knirps (que ele estimula). A região promotora de
knirps também é reconhecida pelo produto protéico do gene tailless, que inibe a
transcrição de knirps. A proteína Hunchback (além de reconhecer o promotor de
Krüppel) também reconhece seu próprio promotor, sugerindo que hunchback está
envolvido na regulação de sua própria expressão (Pankratz et al., 1990; Stanojevíc et
al., 1989; Treisman e Desplan, 1989).
Os Genes pair-rule
A primeira indicação de segmentação no embrião da mosca vem quando os genes

pair-rule são expressos durante o décimo-terceiro ciclo da divisão. Os padrões de
transcrição desses genes são marcantes porque cada um divide o embrião em áreas
precursoras do plano do corpo segmentado. Como pode ser visto na Figura 14.22 e
Prancha 14C, uma faixa vertical de núcleos (as células estão apenas começando a se
formar) expressa esse gene, seguida por outra faixa de núcleos que não o expressa, e
em seguida por outra faixa que o faz. O resultado é um padrão de “faixa de zebra” ao
longo do eixo ântero-posterior, dividindo-o em 15 subunidades (Hafen et al., 1984).
Oito genes atualmente são conhecidos como capazes de dividir o embrião precoce
desse modo; eles estão listados na Tabela 14.2. É importante notar que nem todos os
núcleos expressam os mesmos genes pair-rule. Realmente, em cada parasegmento,
cada fila de núcleos provavelmente tem sua própria constelação de genes pair-rule
que a distingue de qualquer outra fila.
Como são instruídos alguns núcleos do embrião de Drosophila a transcrever
um determinado gene, enquanto seus vizinhos são instruídos para não o fazer? A
resposta parece vir da distribuição de produtos protéicos dos genes gap. En-
quanto o RNA de cada um dos genes gap tem uma distribuição muito discreta que
*As interações entre genes e produtos de genes são facilitadas pelo fato de que essas reações
ocorrem dentro de um sincício. As membranas celulares ainda não se formaram.
(A) Figura 14.22

Regiões promotoras específicas do gene even-skipped (eve) controlam bandas de transcrição
específicas no embrião. (A) um gene β-galactosidase repórter foi fundido à região do promotor
even-skipped e inseridos no genoma da mosca. A região promotora completa produz as sete
faixas normais de transcrição. (B) Se somente os 480 pares de bases mais proximais estão
presentes, somente se formam as faixas 2, 3 e 7. (C) Mapa parcial do promotor eve, mostrando as
regiões responsáveis pelas várias faixas e pela auto-regulação. (Fotografias cortesia de S. Carroll
e M. Levine.)
(B)
(C)
Faixa #4, #5, #6 Faixa #1 Auto-regulação Faixa #3 Faixa #2 + #7
define projetando ou ligeiramente superpondo regiões de expressão, os produtos

protéicos desses genes estendem-se mais extensamente. Na realidade, eles se
superpõem por ao menos 8-10 núcleos (que nesse estágio contam com dois a três
segmentos primordiais). Isso foi demonstrado de uma maneira marcante por
Štanojevíc e colaboradores (1989). Esses autores fixaram blastodermas
celularizantes, coraram a proteína Hunchback com um anticorpo contendo um
corante vermelho, e simultaneamente coraram a proteína Krüppel com anticorpo
contendo um corante verde. As regiões celularizantes que continham ambas pro-
teínas ligaram ambos anticorpos e foram coradas de amarelo brilhante (Prancha
14B). De maneira semelhante, a proteína Krüppel superpôs-se à proteína Knirps
na região posterior (Pankratz et al., 1990).
Três genes são conhecidos como os genes pair-rule primários. Esses genes
– hairy, even-skipped e runt–são essenciais para a formação do padrão periódico
e são os genes diretamente controlados pelas proteínas Gap. Os promotores dos
genes pair-rule primários são reconhecidos por proteínas do gene gap, e acredi-
ta-se que as diferentes concentrações dessas proteínas determinam se o gene vai
ser transcrito ou não. Os promotores desses genes são freqüentemente
moduladores: o controle sobre cada faixa está localizado em uma discreta região
do DNA. Por exemplo, uma deleção particular da região promotora do gene even-
skipped previne a formação da terceira faixa even-stripped, enquanto uma deleção
pouco mais abaixo causa a perda da segunda faixa even-skipped (Figura 14.23). A
determinação da “pegada” da DNase I dessa região final mostra que ela contém
seis sítios para a proteína Krüppel, três para Hunchback e cinco para Bicoid.
Evidência genética mostra que se alguns desses sítios são deletados, a posição
da segunda faixa se movimenta. Štanojevíc e colaboradores (1991) mostraram que
a segunda faixa even-skipped é reprimida tanto pelas proteínas Giant como Krüppel
e ativada pela proteína Hunchback, em baixas concentrações de Bicoid. Esse mo-
delo é mostrado na Figura 14.23B,C. A região responsável pela terceira faixa de
transcrição even-skipped contém 20 sítios de ligação Hunchback e nenhum sítio
para a proteína Krüppel (Štanojevíc et al., 1989). Essa situação permitirá ao sítio
responder a níveis muito baixos do produto do gene hunchback. Proteínas Gap
ativam a transcrição de alguns genes pair-rule enquanto reprimem transcrição de
outros. O resultado é o padrão de faixas de transcrição que emergem à medida que
o embrião se desenvolve.
Uma vez iniciado por proteínas Gap, o padrão de transcrição dos genes primários
pair-rule fica estabilizado por suas interações (Levine e Harding, 1989). Os genes
primários pair-rule também formam o contexto que permite ou inibe a expressão dos
(A) hunchback Figura 14.23

Hipótese para a formação da segunda faixa de transcrição do gene
krüppel Knirps giant even-skipped. (A) O gene é ativo onde concentrações da maioria das
proteínas Gap é baixa. (B) Assim, os limites da transcrição de eve
giant são determinados por concentrações altas dessas proteínas. Diferen-
tes elementos intensificadores contêm seqüências de ligação para
diferentes frações. No intensificador para a segunda banda de trans-
crição eve, a ligação da proteína Hunchback estimula a transcrição.
(C) Elementos intensificadores para a regulação da faixa 2, contendo
(B) Faixas eve
seqüências ligantes para proteínas Krüppel, Giant, Bicoid e
Hunchback. Notar que quase cada sítio ativador está intimamente
ligado a um sítio repressor, sugerindo interações competitivas nes-
sas posições. (A e B segundo Reinitz e Sharp, 1995; C segundo
Štanojevíc et al., 1991.)
(C) Bicoid Hunchback

Ativadores
Repressores
Giant Krüppel
genes pair-rule secundários de ação tardia. Um desses genes pair-rule secundários

é o fushi tarazu (ftz, japonês “demasiadamente poucos segmentos”). No começo do
ciclo 14, o RNA ftz e a proteína são vistos através de toda a região segmentada do
embrião. No entanto, à medida que as proteínas dos genes pair-rule primários come-
çam a interagir com o promotor ftz, o gene ftz é reprimido em certas faixas de núcleos
para criar as regiões inter-faixas. Nesse período, a proteína Ftz interage com seu pró-
prio promotor para estimular mais transcrição do gene ftz (Figura 14.24; Edgar et al.,
1986; Karr e Kornberg, 1989; Shier e Gehring, 1992).
Os Genes de Polaridade Segmentar (segmentation genes)

(A)
Até aqui, nossa discussão identificou interações entre moléculas dentro do embrião
sincicial. Porém, uma vez formadas as células, interações passam a acontecer entre
elas. Essas interações intercelulares são mediadas pelos genes da polaridade seg-
mentar e realizam duas tarefas importantes. Primeiro, reforçam a periodicidade (B)
parasegmentar estabelecida por fatores transcricionais anteriores. Em segundo lu-
gar, através dessa sinalização celular, os destinos das células são estabelecidos
dentro de cada parasegmento.
Muitos genes de polaridade segmentar codificam proteínas que são constituin- (C)
tes de trajetos sinalizadores celulares. Por exemplo, Wingless e Hedgehog são pro-
teínas secretadas que agem como ligantes, enquanto Patched é uma proteína
transmembrana que age como receptor (para Hedgehog). Outros genes de polarida-
de segmentar, como disheveled, zeste white-3 e fused, codificam transdutores de (D)
sinais (veja Capítulo 3), e alguns, como engrailed, armadillo e cubitus interruptus,
são considerados fatores de transcrição ativados por essas trajetórias. Mutações
nesses genes de polaridade segmentar levam a defeitos na segmentação e padroni-
zação através do parasegmento.
(E)
Figura 14.24
Transcrição do gene ftz. (A-D) No começo do ciclo 14, há baixa transcrição em cada núcleo da
região segmentada do embrião de Drosophila. Dentro dos próximos 30 minutos, o padrão da
expressão se altera enquanto a transcrição de ftz é intensificada em certas regiões (que formam as
faixas) e reprimida nas regiões entre as faixas. (E) Dupla marcação dos transcritos even-skipped
(bandas mais escuras) e fushi tarazu (bandas mais claras), mostrando que ftz é expresso entre a
bandas. (A-D segundo Karr e Kornberg, 1989; E cortesia de M. Levine.)
O desenvolvimento de padrões normais se baseia no fato de que alguns desses

genes são transcritos em domínios espaciais específicos (Prancha 14D). Por exemplo,
wingless, engrailed e hedgehog são cada um expressos em 14 bandas distintas da
célula. Em particular, wingless é expresso numa faixa de células anteriormente adjacen-
te à uma faixa de células que co-expressam engrailed e hedgehog. A expressão errô-
nea de qualquer desses genes destrói o padrão do parasegmento. O estabelecimento
desses padrões restritos de expressão é determinado pelas proteínas par-rules. A
transcrição do gene wingless é reprimida por proteínas Fushi tarazu e Even-skipped e
estimulada por ativadores gerais encontrados em todo o embrião. Ao mesmo tempo, o
gene engrailed está ativo nas células contendo a proteína Fushi tarazu (que estimula
a transcrição de engrailed) e carente de Odd-skipped (que inibe tal transcrição). Isso
faz com que o wingless seja transcrito somente na célula diretamente anterior às
células onde engrailed é transcrito (Figura 14.25 A).
Uma vez que a expressão de wingless e engrailed estiver estabelecida em células
adjacentes, esse padrão tem que ser mantido para que seja conservada a periodicida-
de parasegmentar do plano corporal, estabelecida pelos genes pair-rule. Deve ser
lembrado que os mRNAs e as proteínas envolvidos na iniciação desses padrões são
de vida curta, mas que esses padrões têm que ser mantidos depois que os iniciadores
de padrão não estiverem mais sendo sintetizados. A manutenção desses padrões é
regulada por interações entre as células expressando wingless e aquelas expressando
engrailed. A proteína Wingless, secretada por células expressando wingless, sinaliza
para células adjacentes, ligando-se à proteína transmembrana D-Frizzled-2 (veja Figu-
ra 3.38; Bhanot et al., 1996). Isso ativa o transdutor de sinais Disheveled, que irá
causar a redução da atividade da quinase Zeste white-3. Acredita-se que a diminuição
da regulação dessa quinase permite a entrada da proteína não-fosforilada Armadillo
(β-catenina) no núcleo, onde age como um fator de transcrição regulando positiva-
mente e, assim, mantendo a expressão do gene engrailed (Siegfried et al., 1994).
A ativação inicia outra porção dessa trajetória recíproca. A proteína Engrailed
ativa a transcrição do gene hedgehog (hh). Esse gene codifica uma proteína secretada
que ativa uma trajetória sinalizadora de transdução nas células que estão respon-
dendo anteriormente, levando à manutenção da transcrição de gene wingless na
célula vizinha. O resultado é um enlace recíproco pelo qual as células sintetizando
Engrailed secretam a proteína Hedgehog, que mantém a expressão do gene wingless
na célula vizinha, enquanto a célula secretora de Wingless conduz à expressão dos
genes engrailed e hedgehog em outra célula (Heemskerk et al., 1991; Ingham et al.,
1991; Mohler e Vani, 1992). Dessa maneira, o padrão de transcrição dessas duas
células permanece estabilizado.
A segunda tarefa realizada pelos genes de polaridade segmentar é estabelecer os
destinos celulares através de cada parasegmento. Isso não está completamente com-
preendido, mas o grupo de células estabilizadas flanqueando o limiar parasegmentar
expressando wingless e hedgehog, respectivamente, é essencial. Isso pode ser obser-
vado na epiderme dorsal, onde as filas de células produzem diferentes estruturas
cuticulares, dependendo de suas posições dentro do segmento. A 1a fila consiste de
grandes dentículos pigmentados. Posteriormente a essas células, a 2a fila produz uma
cutícula epidérmica lisa. As próximas duas filas têm um 3o destino, produzindo peque-
nos pêlos grossos; e são seguidas por várias filas de células que adotam o 4o destino,
que é o de produzir pêlos finos.
As células expressando wingless ficam dentro da região que diferencia os pêlos
finos, enquanto as células expressando hedgehog estão próximas das células da 1a
fila. Os destinos das células podem ser alterados experimentalmente, aumentando ou
diminuindo os níveis das proteínas Hedgehog ou Wingless (Heemskerek e DiNardo,
1994; Bokor e DiNardo, 1996; Porter et al., 1996). Por exemplo, se hedgehog for coloca-
do num promotor de choque térmico e os embriões forem criados numa temperatura
que ativa o gene hh, mais proteína Hh será produzida, e as células normalmente mos-
trando destinos da 3a fila tornar-se-ão células do segundo tipo. As filas de células da
Figura 14.25
Modelo para a transcrição dos genes de po-
laridade segmentar engrailed (en) e wingless
(wg). (A) A expressão de wg e en é iniciada
por genes pair-rule. O gene engrailed é ex-
presso quando as células contêm altas con-
centrações das proteínas Even-skipped ou
Fushi tarazu. O gene wingless é transcrito
Segmento Segmento Segmento Segmento quando nem o gene eve nem ftz estão ativos,
Parasegmento Parasegmento Parasegmento Parasegmento mas um terceiro gene (provavelmente odd-
paired) é expresso. (B) A expressão contí-
(A) Iniciação por produtos de genes pair-rule nua de wg e en é mantida pela interação entre
células expressando engrailed e wingless. A
produtos dos genes
Concentração de
proteína Wingless é secretada e se difunde

para as células circunjacentes. Nas células
Eve Ftz Eve Ftz com competência para expressar engrailed
(tendo proteínas Eve ou Ftz), a proteína
Wingless é ligada pelo receptor Frizzled. Isso
Anterior Posterior permite a ativação do gene engrailed. A pro-
teína Engrailed ativa a transcrição do gene
Células hedgehog e também ativa a transcrição de
seu próprio gene (engrailed). A proteína
(B) Interação entre engrailed e wingless Hedgehog se difunde dessas células e se liga
à proteína Patched. Essa ligação impede a
proteína Patched de inibir a sinalização da
Um segmento proteína Smoothened. O sinal permite a trans-
Anterior Posterior crição do gene wingless e a subseqüente se-
creção da proteína Wingless.
Engrailed competente wingless competente engrailed competente
Difusão da proteína Wingless
Expressão wingless Expressão engrailed
Difusão da proteína
Receptores Patched Hedgehog
Proteína Wingless
Frizzled
Transcrição
de wingless
Armadillo
Transcrição
Cubitus interruptus Receptores de engrailed,
Patched hedgehog
Hedgehog
Proteína smoothened
Gradiente Gradiente
Hedgehog Wingless
Figura 14.26
Especificação celular pelo centro sinalizador Wingless/Hedgehog. (A) Fotografia em campo
iluminado de embrião tipo selvagem de Drosophila, mostrando a posição do terceiro segmento
abdominal. (B) Aproximação da área dorsal do segmento A3, mostrando as diferentes estrutu-
ras cuticulares produzidas pelas 1a, 2 a, 3a e 4a filas de células. (C) Modelo para o papel de
Wingless e Hedgehog. Cada sinal é responsável por aproximadamente metade do padrão. Cada
sinal, ou age de uma maneira gradual (aqui mostrada como gradientes diminuindo a partir de
suas respectivas fontes) para especificar os destinos de células distantes dessas fontes, ou cada
sinal pode agir localmente sobre células vizinhas para iniciar uma cascata de induções (aqui
mostrada como setas em seqüência). (Segundo Heemskerk e DiNardo, 1994; fotografias
cortesia dos autores).
4a mais distante das células secretoras de Wg também podem tornar-se de 3a ou 2a.

Parece que as células mais próximas das secretoras de Wg não podem responder a Hh,
e Hh não pode, por si só, especificar o 1o destino. (Isso pode requerer a expressão dos
produtos do gene pair-rule, especialmente Engrailed.) Assim, Hedgehog e Wingless
parecem necessárias para a elaboração de todo o padrão de tipos celulares do
parasegmento. Porém, o mecanismo pelo qual conseguem tal especificação não está
claro. Ou esses sinais agem de uma forma gradual como morfógenos, ou agem local-
mente iniciando uma cascata de eventos do local de sinalização, onde cada interação
usa um ligante e um receptor diferentes (Figura 14.26). O padrão dos destinos celula-
res também muda o foco da padronização de parasegmento em segmento. Tem-se
agora marcadores externos, as células expressando engrailed tornando-se as células
mais posteriores de cada segmento.
Os genes de seleção homeótica

Padrões de Expressão dos Genes Homeóticos
Após os limites segmentais terem sido estabelecidos, as estruturas características de

cada segmento são especificadas. Essa especificação é conseguida pelos genes
seletores homeóticos (Lewis, 1978). Existem duas regiões do cromossomo 3 da Droso-
phila que contêm a maioria desses genes homeóticos (Figura 14.27). Uma região, o
complexo Antennapedia, contém os genes homeóticos labial (lab), Antennapedia
(Antp), Sex comb reduced (Scr), Deformed (Dfd) e proboscipedia (pb). Os genes
labial e Deformed especificam os segmentos da cabeça, enquanto Sex comb reduced
e Antennapedia contribuem para dar identidade aos segmentos torácicos. O gene
proboscipedia parece atuar somente em adultos, mas em sua ausência, os palpos
labiais da boca são transformados em patas (Wakimoto et al., 1984; Kaufman et al.,
1990). A segunda região de genes homeóticos é o complexo bithorax (Lewis, 1978).
Existem três genes codificadores de proteínas nesse complexo: Ultrabithorax (Ubx),
que é necessário para a identidade do terceiro segmento torácico, e abdominal A
(abdA) e Abdominal B (AbdB), que são responsáveis pelas identidades dos segmen-
tos abdominais (Sánchez-Herrero et al., 1985). O fenótipo letal do mutante de três-
pontos Ubx-, abdA-, AbdB- é idêntico aquele de uma deleção de todo o complexo
bithorax (Casanova et al., 1987). A região do cromossomo contendo tanto o complexo
Antennapedia como o complexo bithorax é freqüentemente referida como o complexo
homeótico (Hom-C).
(A)
Figura 14.27
Os domínios funcionais dos genes dos complexos bithorax e Antenna-
Complexo Antennapedia Complexo Bithorax pedia em Drosophila. (A) O complexo bithorax foi dividido em três
grupos complementares letais identificados por E. B. Lewis. Os genes
(B) do complexo Antennapedia são labial (lab), Deformed (Dfd), Sex comb
reduced (Scr) e Antennapedia (Antp). (B) Sumário do controle dos
genes AbdA e AbdB em Drosophila. Os limites são controlados pelos
genes gap. As séries de mutações infra-abdominal controlam os ele-
mentos reguladores desses genes. (A segundo Dessain et al., 1992; B
segundo Casares e Sánchez-Herrero, 1995.)
Figura 14.28 (A)

(A) Cabeça de uma mosca tipo selvagem. (B)
Cabeça de uma mosca contendo a mutação
Antennapedia que converte antenas em patas.
(Segundo Kaufman et al., 1990, cortesia de T.
C. Kaufman.)
Como esses genes são responsáveis pela especificação das partes corporais da
mosca, suas mutações levam a fenótipos bizarros. Em 1984, William Bateson chamou
esses organismos de “mutantes homeóticos”, que fascinaram biologistas do desen-
volvimento por décadas. O gene Antennapedia, por exemplo, é considerado especifi-
car a identidade do segundo segmento torácico. Na mutação dominante de
Antennapedia, esse gene é expresso na cabeça bem como no tórax, e os discos imaginais
da região da cabeça são especificados como torácicos. Com isso, patas em lugar de
antenas crescem dos soquetes da cabeça (Figura 14.28). No mutante recessivo de
Antennapedia, o gene deixa de ser expresso no segundo segmento torácico, e ante-
nas brotam das posições das patas (Struhl, 1981; Frischer et al., 1986; Schneuwly et al.,
1987). De maneira semelhante, quando o gene Ultrabithorax é deletado, o terceiro
segmento torácico (caracterizado por halteres) se transforma em outro segundo seg-
mento torácico. O resultado (Figura 14.29) é uma mosca com quatro asas - uma situa-
ção embaraçosa para um díptero clássico*.
*Dípteros (insetos com duas asas como as moscas) são considerados ter evoluído de insetos
normais com quatro asas; é possível que essa mudança ocorreu através de alterações no complexo
bithorax. O Capítulo 23 inclui mais especulações sobre a relação entre genes bithorax e a evolução.
Figura 14.29
A mosca das frutas de quatro asas foi construída juntando-se
três mutações em reguladores cis do gene Ultrabithorax.
Essas mutações transformam eficazmente o terceiro segmen-
to torácico em outro segundo segmento torácico (i.e., halteres
em asas). (Cortesia de E. B. Lewis.)
Segmentos:
gene en:
Parasegmentos:
gene ftz:
Complexo Antennapedia
labial Epiderme
(lab)
Sistema
nervoso
central (CNS)
Deformed
(Dfd) Epi
CNS
Sex combs reduced

(Scr)
Epi
CNS
Antennapedia
(Antp)
Epi
CNS
Complexo bithorax
Ultrabithorax
(Ubx)
Epi
CNS
abdominal A
(abdA)
Epi
CNS
Abdominal B
(AbdB)
Epi
CNS
caudal
(cad)
Epi
Figura 14.30
Regiões de expressão gênica homeótica (tanto
mRNA como proteína) no blastoderma e (al-
Esses principais genes seletores homeóticos foram clonados e sua expressão ana- gumas horas mais tarde) no sistema nervoso
lisada por hibridização in situ (Harding et al., 1985; Akam, 1987). Os resultados desses central do embrião de Drosophila. As áreas
experimentos estão sumariados na Figura 14.30. Transcritos de cada loco são detecta- escurecidas são segmentos ou parasegmentos
dos em regiões específicas do embrião sendo especialmente proeminentes no sistema com mais produto. As barras adjacentes à ilus-
nervoso central. Em mutantes homeóticos, essa expressão normal fica alterada. Por tração representam a expressão gênica dentro
exemplo, em alelos dominantes de Antennapedia, o gene Antennapedia foi invertido dos limites parasegmentares. (Segundo
no cromossomo, fazendo com que perdesse seu próprio promotor ficando sob o con- Kaufman et al., 1990.)
trole de um promotor diferente, ativo na cabeça. Isso causa a expressão ectópica de
Antp na cabeça. De maneira semelhante, se o gene Ultrabithorax for colocado em um
novo promotor e expresso na região da cabeça, as antenas começam a produzir estru-
turas específicas de patas e proteínas (Mann e Hogness, 1990).
Iniciando os Padrões da Expressão dos genes Homeóticos
A iniciação dos domínios dos genes homeóticos é influenciada pelos genes gap e
genes pair-rule. Por exemplo, a expressão dos genes abdA e AbdB é reprimida
pelas proteínas Gap Hunchback e Krüppel. Essa inibição impede esses genes que
(A) especificam para o abdome, serem ativos na cabeça e no tórax (Casares e Sánchez-
Herrero, 1995). Reciprocamente, o gene Ultrabithorax é ativado por certos níveis
da proteína Hunchback, fazendo com que seja originalmente transcrito em uma
larga banda no meio do embrião, e a proteína Gap Krüppel ative a transcrição de
Antennapedia (Figura 14.31; Harding e Levine, 1988; Struhl et al., 1992). Os limites
de expressão dos genes homeóticos são logo confinados a parasegmentos defini-
dos pela proteínas Fushi tarazu e Even-skipped (Ingham e Martinez-Arias, 1986;
(B) Müller e Bienz, 1992).
Figura 14.31 Mantendo os Padrões de Expressão dos genes Homeóticos

A expressão inicial do gene homeótico An-
tennapedia (B) está baseada na expressão
anterior de Krüppel (A) na mesma área. Se a
A expressão de genes homeóticos é um processo dinâmico. O gene Antp, por exemplo,
colocação da expressão Krüppel for altera- embora expresso inicialmente no parasegmento 4 presuntivo, logo aparece no
da, assim também a será a expressão de An- parasegmento 5. À medida que a banda germinativa se expande, a expressão do gene
tennapedia. (de Levine e Harding, 1989, cor- Antp é vista no tubo neural presuntivo tão posteriormente quanto o segmento 12.
tesia dos autores.) Durante o desenvolvimento ulterior, o padrão se contrai novamente, e transcritos
Antp estão fortemente localizados nos parasegmentos 4 e 5. Tal como outros genes
homeóticos, a expressão Antp é regulada negativamente por todos os produtos de
genes homeóticos posteriores a ele (Harding e Levine, 1989; González-Reyes e Morata,
1990). Em outras palavras, cada um dos genes do complexo bithorax reprime a expres-
são de Antennapedia. Se Ultrabithorax for deletado, a atividade de Antp se estende
através da região que normalmente teria expresso Ubx e pára onde a região Abd
começa. (Isso permite que o terceiro segmento torácico forme asas tal como o segun-
do segmento torácico, como está na Figura 14.29). Se todo o complexo bithorax for
deletado, a expressão de Antp se estende através de todo abdome. (A larva não
sobrevive, mas o padrão da cutícula através de todo o abdome é aquele do segundo
segmento torácico).
As proteínas Gap e as proteínas Pair-rule são transitórias, mas as identidades dos
parasegmentos têm que ser conservadas para que possa ocorrer a diferenciação espe-
cífica. Assim, uma vez que os padrões de transcrição dos genes homeóticos estiverem
estabilizados, eles são “presos” nos seus lugares por alterações na conformação da
cromatina nesses genes. A repressão dos genes homeóticos parece ser mantida pela
família de proteínas Polycomb, enquanto a estrutura ativa da cromatina parece ser
mantida pela proteína trithorax (Ingham e Whittle, 1980; McKeon e Brock, 1991;
Simon et al., 1992).
GENES REALIZADORES. Foi desencadeada a procura por “genes realizadores”,

genes que são alvos dos genes homeóticos e que funcionam para formar os
primórdios de tecidos específicos ou órgãos. Um método, pioneiro no laboratório
de Walter Gehring, usou “armadilhas de intensificadores” para detectar aqueles
genes regulados por Antennapedia. Aqui, um transpóson contendo um gene re-
pórter da β-galactosidase é acoplado a um promotor fraco e introduzido aleatoria-
mente no genoma de diferentes Drosophila. A expressão da β-galactosidase (que
pode ser facilmente detectada por coloração) fica sob o controle de intensificado-
res na vizinhança do promotor. Se o intensificador for regulado pela proteína
Antennapedia (que está presente na região torácica, mas não na cabeça do em-
brião), então a atividade da β-galactosidase deveria ser diferente quando tecidos
torácico e da cabeça são comparados. Usando essa técnica, Wagner-Bernholz e
colaboradores (1991) encontraram o que pode ser o gene crítico regulado por
Antennapedia. Esse gene, salm, não é ativo em discos imaginais de pata do tórax,
Disco antenal
(A) (B) (C)
Figura 14.32
A “armadilha de intensificador” do transpóson transporta um gene β-galactosidase, ativado
quando colocado perto de um intensificador. Em uma linhagem, o transpóson ficou incorporado
perto de um gene regulado diferencialmente na cabeça e no tórax. (A) Discos imaginais da pata de
larvas do tipo selvagem (no terceiro instar logo antes da transformação em crisálida) não expres-
sam um gene particular salm. (B) Os discos antenais da mesma larva expressam salm. (C) Discos
antenais de um mutante de Antennapedia mostram que esse gene está reprimido nesse mutante.
(Segundo Wagner-Bernholz et al., 1991, cortesia de W. J. Gehring.)
mas é expresso no disco imaginal da antena (Figura 14.32). Assim, salm parece ser
um gene que é reprimido pela proteína Antennapedia. A repressão do gene salm
pode ser crítica para a formação de tecido das patas, em lugar de tecido antenal,
dos discos imaginais torácicos.
Outro método empregado para achar tais genes tem sido o seqüenciamento. O
seqüenciamento de genes mostrou que alguns genes têm elementos intensificadores
que ligam os genes homeóticos, com isso, fazendo com que eles sejam regulados por
padrões de expressão dos genes homeóticos. Um gene alvo, decapentaplegic, tem
um sítio de ligação em seu intensificador para a proteína Ultrabithorax. Isso permite à
proteína Decapentaplegic ser expressa no mesoderma visceral do parasegmento 7,
onde é necessária para o desenvolvimento do intestino médio (Immergluck et al., 1990;
Panganiban et al., 1990).
Outro alvo das proteínas homeóticas, o gene Distal-less (ele próprio um gene
contendo um homeobox) é necessário para o desenvolvimento dos membros e é
ativo somente no tórax. A expressão Distal-less é reprimida no abdome, provavel-
mente por uma combinação de proteínas Ubx e AbdA que podem-se ligar a seu
intensificador e bloquear a transcrição (Vachon et al., 1992; Castelli-Gair e Akam,
1995). Isso apresenta um paradoxo, já que ambos, o parasegmento 5 (inteiramente
torácico e produtor de patas) e o parasegmento 6 (que inclui a maior parte do
primeiro segmento abdominal livre de patas) expressam Ultrabithorax. Como po-
dem dois segmentos tão diferentes ser especificados pelo mesmo gene? Castelli-
Gair e Akam (1995) mostraram que a mera presença da proteína Ubx em um grupo
de células não é suficiente para a especificação. Em vez disso, o momento e o local
de sua expressão dentro do parasegmento podem ser críticos. Antes da expressão
Ubx, os parasegmentos 4-6 têm potenciais semelhantes. No estágio 10, a expres-
são de Ubx nas partes anteriores dos parasegmentos 5 e 6 impede-os de formarem
estruturas (como a espiral anterior), características do parasegmento 4. Além dis-
so, no compartimento posterior do parasegmento 6 (mas não do parasegmento 5),
a proteína Ultrabithorax bloqueia a formação do primórdio dos membros reprimin-
do os genes Distal-less. No estágio 11, quando Ubx tiver alcançado todo
parasegmento 6, o gene Distal-less tornou-se auto-regulatório e não pode ser
reprimido por Ultrabithorax (Figura 14.33).
Figura 14.33 Anterior Posterior

Representação esquemática das diferenças entre a expressão de Ubx Segmentos:
nos parasegmentos 5 e 6. (A) Antes da expressão de Ubx, cada seg- (A)
mento tem competência para produzir espiráculos e patas. (B) No
estágio 10, a expressão precoce de Ubx (sombreada) bloqueia a forma- Primórdio
ção do espiráculo anterior em PS5 e PS6, e previne a formação de do espiráculo
patas no compartimento posterior de PS6. A proteína AbdA provê o
mesmo papel nos outros segmentos abdominais. (C) No estágio 11, o Primórdio da pata
domínio da expressão Ubx se estende ao primórdio das patas de PS5 Para-
e PS6, mas vem “tarde demais” para reprimir a expressão do gene segmentos
Distal-less. (Segundo Castelli-Gair e Akam, 1995.)
Proteína Ubx
(B)
Proteína AbdA
(C)
Os Elementos Cis-Reguladores e o Complexo Bithorax
As diferenças temporais e espaciais na expressão de Ubx entre os parasegmentos

5 e 6 sugerem que Ubx é regulado por diferentes elementos reguladores. Lewis e
seus colegas (Lewis, 1978, 1985; Bender et al., 1983; Karch et al, 1985) identifica-
ram essas regiões cis-reguladoras. No princípio (antes que os três genes do com-
plexo bithorax fossem identificados), essas regiões foram consideradas codificar
proteínas específicas. Hoje, sabe-se que elas regulam a transcrição de um dos três
genes do complexo bithorax em parasegmentos específicos. Por exemplo, os mu-
tantes anterobithorax (abx) e bithorax (bx) faz com que o compartimento anterior
do terceiro segmento torácico (equilibradores anteriores) assuma a identidade do
compartimento anterior do segundo segmento torácico (asas anteriores). De ma-
neira semelhante, os mutantes posterobithorax (pbx) e bithoraxoid (bxd) faz
com que o compartimento posterior do terceiro segmento torácico se pareça aque-
le do segundo segmento torácico. A combinação das mutações abx, pbx e bxd em
um único embrião, causa a transformação total do terceiro segmento torácico em
um outro segundo segmento torácico. (O resultado é a mosca mostrada na Figura
14.29). Embora essas mutações tivessem originalmente sido consideradas estar
em genes separados, parece agora que são mutações de elementos intensificado-
res que possibilitam a expressão específica da posição do gene Ubx (Lewis, 1985;
Peifer et al., 1987).
A relação entre as mutações cis-reguladoras e as três unidades de transcrição do
complexo bithorax é mostrada na Figura 14.34. As regiões codificadoras da proteína
do complexo bithorax ocupam menos que um décimo do DNA nesse complexo. As
mutações reguladoras em geral, colocam-se nas regiões flanqueadoras desses três
genes ou em íntrons no seu interior. Evidência adicional que abx, bx e bxd são
elementos cis-reguladores vem da análise de mutações e deleções específicas. A
deleção do gene Ubx resulta na transformação homeótica do parasegmento 5 (T2
posterior e T3 anterior) e parasegmento 6 (T3 posterior e A1 anterior) em cópias do
Segmentos
Compartimentos
Parasegmentos
Mutações
Ultrabithorax
Mutações
reguladoras
Seqüências reguladoras
Genes estruturais
Unidades de transcrição
Figura 14.34
Mutações reguladores no complexo bithorax. A mosca adulta esquematizada é dividida em
segmentos e compartimentos anterior e posterior. As regiões reguladoras do gene Ultrabithorax
estão mostradas abaixo da mosca. As áreas sombreadas representam a região especificada pelo
domínio regulador particular. A linha contínua abaixo desse representa a região de 300.00 pares
de bases do complexo. As três unidades de transcrição que codificam as três proteínas homeóti-
cas do complexo bithorax estão mostradas em relação aos locais reguladores. Cada um desses
genes é transcrito da direita para a esquerda. Os éxons são mostrados como caixas escuras, os
íntrons por linhas interrompidas. Acima da linha estão as seqüências reguladoras definidas por
mutações genéticas, e a cor das linhas corresponde ao gene que a seqüência regula positivamente.
(Segundo Peifer et al., 1897; Beachy, 1990; Casares e Sánchez-Herrero, 1995.)
parasegmento 4 (T1 posterior e T2 anterior). Tal transformação é letal; o embrião

morre antes de eclodir. Nos mutantes abx e bx, porém, somente o parasegmento 5 é
transformado no parasegmento 4, quando a expressão de Ubx é reduzida no
parasegmento 5 (Casanova et al., 1985; Peifer e Bender, 1986). Daí, a asa anterior
emerge no que, de outra maneira, seria um haltere anterior. De modo semelhante, as
mutações bxd reduzem a expressão Ubx no parasegmento 6 (Peifer et al. 1987). O
elemento regulador bithorax para Ubx, contém um intensificador que liga as proteí-
nas codificadas pelos genes de segmentação: tailless, fushi tarazu e hunchback
(Quian et al, 1991). Na região abdominal, as seqüências cis-reguladoras
intraabdominal (iab) 2-8 direcionam a expressão de abdA ou AbdB nos vários
segmentos (Boulet et al., 1991; Sánchez-Herrero, 1991).
& Especulações
Regulação Molecular do Desenvolvimento:

As Proteínas do Homeodomínio
O Homeodomínio proteína quimérica é construída em maior milares de reconhecimento. Por exemplo, o
Proteínas do homeodomínio são uma famí- parte por Antennapedia, mas com o termi- próximo par de bases é reconhecido pelo ami-
lia de fatores de transcrição caracterizados nal carboxílico (incluindo o homeodomínio) noácido 9 dentro da hélice de reconhecimen-
por um domínio de 60 aminoácidos que se de Ultrabithorax, a proteína pode ser subs- to. Estudos de mutações mostraram que os
ligam a certas regiões do DNA. O homeo- tituída por Ultrabithorax e especificar as homeodomínios das proteínas Bicoid e An-
domínio foi primeiro visto naquelas proteí- células apropriadas como parasegmento 6 tennapedia usam, respectivamente, lisina ou
nas cuja ausência ou má-regulação causa (Mann e Hogness, 1990). O homeodomí- glutamina na posição 9 para distinguir sítios
transformações homeóticas em segmentos nio isolado de Antennapedia irá se ligar de reconhecimento relacionados. A lisina do
da Drosophila. Considera-se que proteínas aos mesmos promotores que a proteína homeodomínio de Bicoid reconhece o G de
do homeodomínio ativem baterias de genes Antennapedia inteira, indicando que a li- pares CG, ao passo que a glutamina do ho-
que especificam as propriedades particula- gação dessa proteína depende de seu ho- meodomínio de Antennapedia reconhece A
res àquele segmento. Tais proteínas con- meodomínio (Müller et al., 1988). de um par AT (Figura 14.35; Hanes e Brent,
tendo homeodomínios incluem os produ- O homeodomínio se dobra em três α-hé- 1991). Se essa lisina for substituída por glu-
tos dos oito genes homeóticos do comple- lices, as últimas duas se dobrando em uma tamina, uma proteína Bicoid irá reconhecer
xo homeótico, assim como outras proteínas, conformação hélice-giro-hélice que é carac- sítios ligantes de Antennapedia (Hanes e
como Fushi tarazu, Caudal e Bicoid. Fatores terística de uma família de fatores de transcri- Brent, 1989, 1991). Outras proteínas com ho-
de transcrição do homeodomínio são impor- ção que ligam DNA ao sulco maior da dupla meodomínios mostram um padrão semelhan-
tantes para a determinação dos eixos ântero- hélice (Otting et al., 1990; Percival-Smith et te, reconhecendo a seqüência comum, en-
posteriores tanto de invertebrados como de al., 1990). A terceira hélice é a hélice de reco- quanto outra porção reconhece uma estru-
vertebrados. Em Drosophila, a presença de nhecimento, e é aqui que os aminoácidos tura específica próxima ao TAAT.
certas proteínas contendo homeodomínios entram em contato com as bases do DNA.
é também necessária para a determinação Uma seqüência de quatro bases, TAAT, é Figura 14.35
de neurônios específicos. Sem esses fato- conservada em quase todos os sítios reco- Interações homeodomínio-DNA. (A) homeo-
domínio hélice-giro-hélice dentro do sulco
res de transcrição, os destinos desses nhecidos pelos homeodomínios; ela prova-
maior do DNA. (B) Pareamento proposto en-
neurônios são alterados (Doe et al., 1988). velmente distingue aqueles sítios aos quais
tre a lisina do homeodomínio Bicoid e o par de
O homeodomínio é codificado por um as proteínas do homeodomínio podem se li-
bases CG da seqüência de reconhecimento, e
homeobox de 190 pares bases (veja Capí- gar. O terminal T 5’ parece ser crítico para entre a glutamina do homeodomínio de Anten-
tulo 10). Os homeodomínios parecem es- esse reconhecimento, pois se mutado ele des- napedia e o par de bases TA de sua seqüência
pecificar os sítios de ligação para essas trói toda ligação do homeodomínio. Os pares de reconhecimento. Em ambos os casos o nono
proteínas e são críticos para a especifica- de bases que seguem a seqüência TAAT são aminoácido da hélice se liga ao par de bases
ção do destino celular. Por exemplo, se uma importantes para distinguir entre os sítios si- imediatamente posterior à seqüência TAAT. (A
(A) (B) segundo Riddihough, 1992; B. segundo Hanes
e Brent, 1991.)
Sítio bicoid, 7 pares de bases
Citosina Guanina Sítio Antp, 7 pares de bases
Timina Adenina
Hélice III
Co-fatores para os Genes Hom-C Extradenticle, ela irá transformar esse fator de transcrição dedo de zinco é ne-
Os genes hoemóticos do complexo ho- segmento em A3. Além disso, as proteí- cessário para o funcionamento do pro-
meótico da Drosophila especificam o des- nas Exd e Ubx são necessárias para a re- duto Scr distinguindo entre os segmen-
tino segmentar, mas podem requerer al- gulação de decapentaplegic, e a estru- tos labial e primeiro torácico. Ele é críti-
guma ajuda para isso. Os sítios ligantes tura do promotor decapentaplegic suco para a especificação da identidade
de DNA reconhecíveis pelos homeodo- gere que a proteína Extradenticle pode do protorácico anterior (parasegmento
mínios das proteínas Hom-C são muito dimerizar com a proteína Ubx no intensi- 3), e pode ser o gene que especifica a
semelhantes, e há alguma superposição ficador desse gene de alvo (Raskolb e “condição basal” do complexo homeó-
em suas especificidades de ligação. Em Wieschaus, 1994; van Dyke e Murre, tico. Se o complexo bithorax e o gene
1990, Peifer e Wieschaus descobriram 1994). A proteína Extradenticle inclui um Antennapedia forem removidos, todos
que o produto do gene Extradenticle homeodomínio, e a proteína humana os segmentos se tornam protórax ante-
(Exd) interage com várias proteínas PBX1 se parece com a proteína Extraden- rior. A função do gene teashirt parece
Hom-C e pode ajudar na especificação ticle e pode ter um papel semelhante ser crítica para o trabalho com a proteí-
de identidades segmentais. Por exemplo, como um co-fator para genes homeóti- na Scr, distinguindo o tórax da cabeça e
a proteína Ubx é responsável pela espe- cos humanos. trabalhando através do tronco para im-
cificação da identidade do primeiro seg- O produto do gene teashirt também pedir a formação de estruturas da cabe-
mento abdominal (A1); sem a proteína pode ser um co-fator importante. Esse ça (Roder et al., 1992). [droso2.html]
A GERAÇÃO DA POLARIDADE DORSOVENTRAL EM DROSOPHILA

Em 1936, o embriologista E. E. Just criticou os geneticistas que achavam que podiam
explicar o desenvolvimento olhando as mutações específicas que afetam a cor dos
olhos, o número de cerdas e a forma das asas. Ele dizia que não estava interessado no
desenvolvimento das cerdas nas costas de uma mosca; ao contrário, ele queria saber
como o embrião da mosca produzia as próprias costas. Cinqüenta anos mais tarde,
embriologistas e geneticistas estão finalmente respondendo essa pergunta*.
A proteína Dorsal:
Morfógeno para a polaridade dorsoventral
A polaridade dorsoventral é estabelecida pelo gradiente de um outro fator protéico de
transcrição, Dorsal. Em contraste com Bicoid, cujo gradiente é estabelecido dentro de
um sincício, o gradiente Dorsal forma-se sobre um campo de células estabelecido
como uma conseqüência de eventos celulares sinalizadores.
A especificação do eixo dorsoventral pode ser dividida em várias etapas. A etapa
crítica é a translocação da proteína Dorsal do citoplasma para os núcleos das células
ventrais durante o ciclo da décima quarta divisão. Anderson e Nüsslein-Volhard (1984)
isolaram 11 genes de efeito materno, cuja ausência de cada um está associada com a
falta de estruturas ventrais (Figura 14.36). Além disso, a ausência de outro gene de
efeito materno, cactus, causa a ventralização de todas as células. As proteínas codifi-
cadas por esses genes maternos são críticas para certificar que a proteína Dorsal entre
somente em núcleos da superfície ventral do embrião. As etapas posteriores à
translocação da proteína Dorsal afetam aquilo que essa proteína faz para especificar
as diferentes regiões do embrião. Aqui, diferentes concentrações da proteína Dorsal
parecem especificar os diferentes destinos dessas células.
Translocação da Proteína Dorsal
A proteína que realmente distingue o dorso do ventre é o produto protéico do gene

dorsal. O RNA dos genes dorsais da mãe é colocado no interior do óvulo pelas células
*De uma maneira que não poderia ter sido predita por Just, revela-se que alguns dos genes (como
o decapentaplegic) envolvidos na regulação do número de cerdas ou forma das asas também têm
funções anteriores na regulação da polaridade dorsoventral.
ovarianas da mosca mãe. Porém, a proteína Dorsal não é sintetizada a partir da mensa-
gem materna antes de decorridos 90 minutos após a fecundação. Quando essa proteí-
na é traduzida, ela é encontrada em todo o embrião, não somente no lado ventral ou
dorsal. Como pode então essa proteína atuar como um morfógeno, se existe por todo
o embrião? Em 1989, a surpreendente resposta foi encontrada (Roth et al., 1989; Rushlow
et al., 1989; Steward, 1989). Enquanto a proteína Dorsal pode ser encontrada em todo
o blastoderma sincicial no embrião precoce de Drosophila, ela somente é transporta-
da para os núcleos celulares na parte ventral do embrião (Figura 14.37A,B). Aqui, a
proteína Dorsal se liga a certos genes nucleares para ativar ou suprimir suas transcri-
ções. Se a proteína Dorsal não penetrar no núcleo, os genes ventralizantes (snail e
twisted) não são transcritos, os genes dorsalizantes (decapentaplegic e zerknüllt)
(A) não são reprimidos, e todas as células do embrião são especificadas como células
dorsais. Essa hipótese de que o eixo dorsoventral da Drosophila é especificado pelo
transporte seletivo da proteína morfogênica Dorsal para o núcleo é reforçada pela
análise de mutações com um fenótipo inteiramente dorsalizado ou ventralizado (Figu-
ra 13.37C,D). Nesses mutantes quando todas a células estiverem dorsalizadas (confor-
me se evidencia pela sua cutícula dorsal), a proteína Dorsal não penetra no núcleo de
nenhuma célula. Reciprocamente, nos mutantes cujas células têm um fenótipo ventral,
(B) a proteína Dorsal é encontrada em todos os núcleos.
Figura 14.36
Salvamento da larva por injeção de mRNA do Provendo o sinal assimétrico para a
tipo selvagem em ovos destinados a ter o translocação da proteína Dorsal
fenótipo snake. (A) Larva deformada consis-
tindo inteiramente de células dorsais. Larvas
como essas se desenvolvem de ovos de uma
Sinal do Núcleo do Oócito para as Células Foliculares
fêmea homozigota para o alelo snake. (B) Apa-
rência tipo selvagem de larvas desenvolvendo- Se a proteína Dorsal for encontrada no todo do embrião, mas se for transladada so-
se de ovos snake que haviam recebido injeções mente para os núcleos das células ventrais, algo mais deve estar provendo os sinais
de mRNA de ovos tipo selvagem. (de Anderson assimétricos (Figura 14.38). Parece que tal sinal é mediado através de uma complexa
e Nüsslein-Volhard, 1984. Cortesia de C. interação entre o oócito e suas células foliculares adjacentes. O epitélio folicular ao
Nüsslein-Volhard.) redor do oócito em desenvolvimento é inicialmente simétrico, mas essa simetria é
Figura 14.37
Inclusão da proteína Dorsal em núcleos ventrais, mas não laterais ou dorsais. (A) Mapa de
destinos através do centro do embrião de Drosophila. A parte mais ventral vira o mesoderma, a
parte superior seguinte vira o ectoderma neurogênico (ventral). O ectoderma lateral e epidérmico
pode ser distinguido na cutícula, e a região mais dorsal torna-se a amnioserosa, a camada extra-
embrionária que envolve o embrião. (B-D) Seção transversal de embriões corados com anticorpo
para mostrar a presença da proteína Dorsal. Em todos os casos, a mancha escura representa a
proteína Dorsal. (B) Um embrião tipo selvagem, mostrando a proteína Dorsal nos núcleos mais
ventrais. (C) Um mutante dorsalizado, mostrando ausência de proteína Dorsal em todos os
núcleos. (D) Um mutante ventralizado; a proteína Dorsal penetrou no núcleo de cada célula. (A
de Rushlow et al., 1989; B-D de Roth et al., 1989, cortesia dos autores.)
(A) Dorsal (B) (C) (D)
Amnioserosa
Ectoderma dorsal
Ectoderma lateral
Ectoderma
neurogênico
Mesoderma
Ventral
Visão lateral Seção transversal
(A) (B) Dorsal (C)
Células nutrizes Oócito

ovarianas Torpedo
Destino da Núcleo
s células do
rsais
Dorsal
Cactus
Proteína
Sinal Toll
Toll
Células
Inibição da
foliculares
síntese das Membrana
proteínas celular
Windbeutel,
Núcleo Nudel, Pipe Spätzle
Spätzle
mRNA ativado
gurken
Nenhum
sinal para o Protease
Easter Easter
lado ventral
ativada
Síntese de Windbeutel,
Nudel, Pipe Snake
Gastrulation
defective
Envoltório
las ventrais Windbeutel Nudel Pipe vitelínico
das célu
Destino
Ventral
1. Núcleo do oócito viaja para o lado dorsal 5. Células foliculares ventrais sintetizam pro-
anterior do oócito. Ele coleta mRNA teínas Windbeutel, Nudel e Pipe
cornichon e gurken
Figura 14.38 6. Proteínas foliculares ventrais absorvem
Representação esquemática de um modelo para 2. Mensagens cornichon e gurken traduzidas. proteínas Snake e Gastrulation-defective
a geração da polaridade dorsoventral em Dro- A proteína Gurken é recebida pelas proteí- para realizar cisão do zimógeno Easter, pro-
sophila. (A) O oócito desenvolve um folículo nas Torpedo durante a meia oogênese duzindo protease Easter ativa, somente no
ovariano consistindo de 15 células nutrizes (que lado ventral
3 a. O sinal Torpedo faz com que as células fo-
suprem proteínas maternas e mensagens ao ovo
liculares se diferenciem para uma morfolo- 7. Easter cinde Spätzle, que se liga à proteína
em desenvolvimento) e células foliculares. (B) gia dorsal receptora Toll
O núcleo do oócito reside no local que irá tor-
nar-se o lado dorsal. Os genes cornichon e 3 b. Síntese de proteínas Windbeutel, Nudel e 8. Sinal Toll causa fosforilação e degradação
gurken do oócito sintetizam um sinal que é re- Pipe inibida nas células foliculares dorsais da proteína Cactus, liberando-a de Dorsal.
cebido pelo receptor produzido pelo gene tor-
pedo das células foliculares. Dada a curta 4. Proteínas Cornichon e Gurken não se di- 9. A proteína Dorsal entra no núcleo e
difusibilidade do sinal, somente as células foli- fundem para o lado ventral ventraliza a célula
culares mais próximas do núcleo do oócito (i.e.,
as células foliculares dorsais) recebem esse si- uma enzima ativa que irá cindir a forma
nal. O sinal do receptor Torpedo faz com que zimogênica da proteína Easter numa protease
as células foliculares se diferenciarem para uma Easter ativa. Essa última, cinde a proteína
morfologia dorsal característica e (de alguma Spätzle para uma forma que pode se ligar ao
maneira) inibir a síntese das proteínas receptor Toll (que é encontrado em toda a mem-
Windbeutel, Nudel e Pipe. Portanto, essas pro- brana celular). Assim, somente o lado ventral
teínas somente são produzidas pelas células recebe o sinal Toll. Esse sinal separa a proteína
foliculares ventrais. (C) As três proteínas foli- Cactus da proteína Dorsal, permitindo essa úl-
culares ventrais são consideradas ser incorpo- tima ser translocada para o núcleo. A proteína
radas na membrana vitelínica, porém, somente Dorsal entra no núcleo e ventraliza as células.
no lado ventral. Elas cindem os produtos dos (Segundo Schüpbach et al., 1991; Roth, 1994;
genes snake e gastrulation defective para criar Hong e Hashimoto, 1995.)
quebrada por um sinal do núcleo do oócito. Conforme já mencionado neste capítulo,

o núcleo do oócito está inicialmente localizado no terminal posterior do oócito, longe
das células nutrizes. Em seguida, ele é transladado anteriormente, abaixo de uma su-
perfície cortical do oócito, para uma posição dorsal anterior, ao longo de uma trilha de
microtúbulos. O núcleo do oócito então sinaliza para as células foliculares a ele sobre-
postas, e as dorsaliza (Montell et al., 1991; Schüpbach et al., 1991). As células foliculares
acima do núcleo assumem uma forma mais colunar que outras células foliculares.
Essas diferenças de forma e empacotamento tornam-se acentuadas à medida que o
óvulo amadurece, terminando por distinguir as células foliculares dorsais das ven-
trais. O sinal dorsalizante do núcleo do oócito parece ser produzido pelos produtos
dos genes gurken e cornichon (Schüpbach, 1987; Forlani et al., 1993). Mutações
desses genes no oócito provocam a ventralização tanto do embrião como de suas
células foliculares circunjacentes. (Se a mutação se der nas células foliculares e não no
óvulo, o embrião é normal.)
O sinal dorsalizante parece ser recebido pelas células foliculares através de um
receptor codificado pelo gene torpedo. A análise molecular mostrou que gurken codi-
fica um homólogo do fator de crescimento epidérmico (EGF), enquanto torpedo codi-
fica um homólogo do receptor EGF de vertebrado (Price et al., 1989; Neuman-Silberberg
e Schüpbach, 1995). Deficiência materna de torpedo causa a ventralização do embrião.
Além disso, o gene torpedo é ativo nas células foliculares ovarianas e não no embrião.
Isso foi descoberto produzindo quimeras da linhagem germinativa/somática. Schüpbach
(1987) transplantou precursores de células germinativas de embriões tipo selvagem
para embriões cujas mães carregavam a mutação torpedo. Reciprocamente, foi feito o
transplante dessas células de embriões torpedo para embriões tipo selvagem (Figura
Figura 14.39 14.39). Os resultados foram surpreendentes pois os ovos do tipo selvagem produzi-
Quimeras de linhagem germinativa produzidas ram embriões ventralizados quando esses ovos se desenvolveram em folículos do
trocando-se células do pólo (precursoras de cé- mutante torpedo. Os ovos desse mutante foram capazes de produzir embriões normais
lulas germinativas) entre embriões de tipo sel- quando se desenvolviam dentro de um ovário do tipo selvagem. Assim, diferentemen-
vagem e embriões de mães homozigotas para o te dos produtos dos genes gurken e cornichon, o gene torpedo do tipo selvagem é
gene torpedo. Esses transplantes produzem
necessário nas células foliculares, não no óvulo propriamente.
fêmeas do tipo selvagem cujos embriões vêm
de ovos das mães mutantes, e embriões defici-
entes em torpedo com ovos do tipo selvagem. Sinalização das Células Foliculares para o Citoplasma do Oócito
Os ovos das mães deficientes em torpedo pro-
duzem embriões normais se os ovos se desen- Os genes nudel (nd), pipe (pip) e windbeutel (wind) também são necessários na
volvem no ovário do tipo selvagem, enquanto célula folicular e não no oócito. Se a mãe não tiver algum desses três genes, o embrião
os ovos do tipo selvagem produzem embriões
ventralizados se os ovos se desenvolvem no
ovário mutante.
Células germinativas
Embrião de mãe deficientes em torpedo em
tipo selvagem uma fêmea tipo selvagem
Eixo
dorsoventral
Oócito deficiente
Células polares
Troca entre em torpedo no
(precursoras das
células polares folículo tipo selvagem
células germinativas)
Células germinativas tipo

selvagem em uma fêmea Não há eixo
Embrião de deficiente em torpedo dorsoventral
mãe deficiente (o todo do
no gene embrião é
torpedo dorsal)
Células germinativas tipo
selvagem em um folículo
deficente em torpedo
forma um fenótipo totalmente dorsalizado. Esses genes são desligados pela ativação
do receptor de Torpedo (Stein et al., 1991). Se forem permitidos ser ativos (como
normalmente ocorre no caso de células foliculares ventrais), suas proteínas são con-
sideradas como incorporadas na porção ventral do envoltório vitelínico que é secretado
ao redor do envoltório adjacente ao ovo pelas células foliculares (Hecht e Anderson,
1992; Stein e Nüsslein-Volhard, 1992). Dessa maneira, um sinal assimétrico está agora
presente no envoltório adjacente ao ovo, e dele separado pelo fluido perivitelínico. No
entanto, essas proteínas não são suficientes para criar o sinal para a translocação da
proteína Dorsal para o núcleo. Mais uma vez, retornamos ao oócito (agora um em-
brião) para suprir componentes essenciais que irão gerar o sinal ventral das células
foliculares para o embrião.
O complexo formado pelas proteínas Nudel, Pipe e Windbeutel é considerado
ativar três proteases serina secretadas pelo embrião para o fluido perivitelínico (veja
Figura 14.38; Hong e Hashimoto, 1995). Essas proteases são os produtos dos genes
gastrulation defective (gd), snake (snk) e easter (ea). Como a maioria das proteases
extracelulares, elas são secretadas em uma forma inativa, tornando-se ativas por
clivagem peptídica. Considera-se que o complexo Nudel-Pipe-Windbeutel primeiro
arrasta e ativa a proteína Gastrulation defective. Essa proteína é uma protease, e cliva
a proteína Snake. Essa clivagem ativa a atividade proteásica da proteína Snake; em
seguida, a proteína Snake ativada cliva a proteína Easter, que cliva a proteína Spätzle
(Chasan et al., 1992; Hong e Hashimoto, 1995).
A proteína Spätzle clivada é agora capaz de se ligar a um receptor na membrana
celular do oócito, o produto do gene Toll. A proteína Toll também é um produto
materno regularmente distribuído na membrana celular do ovo (Hashimoto, 1988,
1991). A mutação recessiva de Toll tem um fenótipo dorsalizado semelhante, e inje-
ções de RNA de ovos do tipo selvagem irão restaurar a polaridade dorsoventral de
ovos postos por mães Toll-/Toll-. No entanto, diferentemente do caso de snake ou
dos outros 10 genes maternos, o local da injeção é importante. Qualquer parte inje-
tada do ovo torna-se a região ventral do embrião resgatado (Anderson et al., 1985).
Isso sugere que ovos Toll-/Toll- não têm um eixo dorsoventral (enquanto em snake,
a região ventral está no seu lugar normal). No desenvolvimento normal, o receptor
Toll está espalhado através de toda a membrana celular do oócito, mas torna-se
somente ativo no local onde se liga à proteína Spätzle, produzida no lado ventral do
ovo. Dessa maneira, os receptores Toll no lado ventral do ovo estão efetuando a
transdução de um sinal para o interior do ovo, ao passo que os receptores Toll do
lado dorsal do ovo não o fazem.
O Estabelecimento do Gradiente da Proteína Dorsal
SEPARAÇÃO DAS PROTEÍNAS DORSAL E CACTUS. O desenlace crucial da sina-

lização através do receptor Toll é o estabelecimento de um gradiente da proteína
Dorsal. Como é estabelecido esse gradiente? Parece que a proteína Cactus está assen-
tada na porção da proteína Dorsal que lhe permite penetrar nos núcleos. Enquanto a
proteína Cactus está ligada à proteína Dorsal, essa permanece no citoplasma. Porém,
esse complexo sistema de sinalização está organizado para cindir a proteína Cactus da
proteína Dorsal na parte ventral do ovo. Quando Spätzle se liga e ativa a proteína Toll,
essa pode ativar a quinase da proteína Pelle. (A proteína Tube é provavelmente
necessária para trazer Pelle até a membrana celular, onde pode ser ativada; Gallindo et
al., 1995). A quinase da proteína Pelle pode então fosforilar a proteína Cactus. Uma vez
fosforilada, Cactus é degradada, e a proteína Dorsal pode entrar no núcleo (Kidd,
1992; Shelton e Wasserman, 1993; Whalen e Steward, 1993; Reach et al., 1996). O
resultado é um gradiente de localização de Dorsal nas células ventrais do embrião,
com as mais elevadas concentrações da proteína dorsal nos núcleos mais ventrais.
O processo descrito para a translocação da proteína Dorsal para os núcleos é
muito parecido com aquele descrito no Capítulo 10 para a translocação do fator de
(A) Embrião de Drosophila (B) Linfócito mamífero
Spätzle IL-1
Membrana Receptor Membrana

Receptor
plasmática IL-1 plasmática
Toll
Citoplasma Citoplasma do
quinase pelle
do oócito Quinase linfócito
Cactus
Dorsal
Dorsal Núcleo Núcleo
Regulação de genes
ventralmente específicos Regulação de genes das imunoglobulinas
Figura 14.40
Modelo de uma trajetória conservada para re-
gular o transporte nuclear de fatores de trans-
crição em Drosophila e mamíferos. (A) Em
Drosophila, a proteína Toll liga o sinal da pro- transcrição NF-κB para o núcleo de linfócitos de mamíferos. De fato, existe uma subs-
teína Spätzle e ativa a região da quinase da tancial homologia entre NF-κB e Dorsal, entre IκB e Cactus, entre a proteína Toll e o
proteína Pelle. A proteína Pelle fosforila receptor da interleucina 1 (IL-1), entre a proteína Pelle e uma proteína quinase associ-
Cactus e Dorsal, fazendo com que as duas ada a IL-1, e entre as seqüências de DNA reconhecidas por Dorsal e NF-κB (Gonzáles-
proteínas se separem uma da outra. A proteí- Crespo e Levine, 1944; Cao et al., 1996). Assim, a via bioquímica usada para especificar
na Dorsal pode então entrar no núcleo e regu- a polaridade dorsoventral em Drosophila parece ser a mesma que aquela usada para
lar a transcrição de genes ventralmente espe- diferenciar linfócitos em mamíferos (Figura 14.40).*
cíficos. (B) Em linfócito de mamíferos, o re-
ceptor IL-1 pode causar a fosforilação de IκB
LEITURA DO GRADIENTE DA PROTEÍNA DORSAL. O que faz a proteína Dorsal
(através de uma proteína quinase ainda não
identificada). Isso permite à proteína NF-κB uma vez localizada nos núcleos das células ventrais? Olhando o mapa de destino do
penetrar no núcleo e efetuar a transcrição de corte transversal pelo meio do embrião de Drosophila no décimo quarto ciclo da
vários genes específicos do linfócito. (Segun- divisão (veja Figura 14.37), torna-se óbvio que as 16 células com a mais alta concentra-
do Shelton e Wasserman, 1993.) ção da proteína Dorsal são as que geram o mesoderma. A próxima célula acima dessa
região gera as células especializadas da glia e as células neurais da linha mediana. As
próximas duas células são aquelas que dão origem à epiderme ventral e cordão nervoso
*Lemaitre e colegas (1996) mostraram que Toll e seu ligante (Spätzle) também estão envolvi-
dos na resposta imune da Drosophila às infecções fúngicas.
Figura 14.41
Gastrulação em Drosophila. Nesta seção trans-
versal, as células mesodérmicas na porção ven-
tral do embrião se dobram para o interior, for-
mando um tubo que em seguida se achata e
forma os órgãos mesodérmicos. Os núcleos
estão corados por anticorpos contra a proteína
Twist. (de Leptin, 1991b, cortesia de M. Leptin.)
ventral, enquanto as nove células acima dessas produzem a epiderme dorsal. O grupo
mais dorsal de seis células não se divide; ele gera a cobertura amnioserosa do embrião
(Ferguson e Anderson, 1991).
Esse mapa de destinos é gerado pelo gradiente da proteína Dorsal nos núcleos.
Grandes quantidades especificam que as células sejam mesoderma, enquanto quanti- Figura 14.42
as menores especificam-nas para ser tecido glial ou ectodérmico (Jiang e Levine, Subdivisão do eixo dorsoventral pelo gradi-
1993). O primeiro evento morfogenético da gastrulação de Drosophila é a invaginação ente de proteína Dorsal nos núcleos. A pro-
das 16 células mais ventrais do embrião (Figura 14.41). Todos os derivados mesodér- teína Dorsal ativa os genes zigóticos
micos dos músculos, corpos gordurosos e gônadas originam-se dessas células (Foe, rhomboid, twist e snail de acordo com sua
1989). A proteína Dorsal especifica essas células para tornarem-se mesoderma de duas concentração nuclear. A proteína Snail, for-
maneiras. Primeiro, a proteína pode ativar genes específicos que criam o fenótipo mada mais ventralmente, inibe a transcrição
da proteína Rhomboid. A proteína Dorsal
mesodérmico. Três dos genes alvo de Dorsal são twist, snail e rhomboid (Figura
inibe a expressão de tolloid, decapentaple-
14.42). Esses genes são transcritos somente nos núcleos da células ventrais que gic e zerknüllt na região ventral. Diferentes
receberam altas concentrações da proteína Dorsal, pois esses intensificadores não se concentrações da proteína Zerknüllt determi-
nam os destinos das células dorsais. (Segun-
do Steward e Govind, 1993.)
zerknüllt Padronização ventral Padronização dorsal

Dorsal Amnioserosa (ativação) (repressão)
dorsal dorsal
Ectoderma dorsal
Ativação Inibição
tolloid
decapentaplegic rhomboid twist snail tolloid dpp zerknüllt
Inibição
Ectoderma lateral
rhomboid
Ectoderma neurogênico
twist Mesectoderma
snail
Ventral
Mesoderma
ligam à proteína Dorsal com alta afinidade (Thisse et al., 1988; Jiang et al., 1991; Pan et
al., 1991). A proteína Twist ativa genes mesodérmicos, enquanto a proteína Snail
reprime genes não-mesodérmicos em particular que poderiam, de outro modo, ser
ativos. O gene rhomboid é interessante porque é ativado por Dorsal mas reprimido
por Snail. Assim, a expressão de rhomboid não é encontrada nas células mais ventrais
(i.e., as precursoras do mesoderma), mas é expressa nas células adjacentes ao
mesoderma que formam o neuroectoderma presuntivo (veja Figura 14.42; Jiang e Levine,
1993). Tanto snail como twist são necessários para produzir o fenótipo mesodérmico
e gastrulação apropriada (Leptin et al., 1991a). A borda aguda entre as células
mesodérmicas e as células à elas adjacentes que geram as células gliais é produzida
pela presença de produtos dos genes snail e twist nas células mais ventrais (Kosman
et al., 1990). Em mutantes de snail, as células mais ventrais ainda têm o gene twist
ativado, e parecem-se com as células mais laterais (Nambu et al., 1990).
A proteína dorsal também determina o mesoderma diretamente. Além de ativar
genes estimuladores do mesoderma (twist e snail), ela inibe diretamente os genes
dorsalizantes zerknüllt (zen) e decapentaplegic (dpp). Assim, nas mesmas células, a
proteína Dorsal pode agir como um ativador de certos genes e um repressor de outros.
A opção se funciona como um ativador ou um repressor, depende da estrutura dos
Figura 14.43
Ativação e repressão pela proteína Dorsal. Um intensificador em um gene ativado pela proteína
Dorsal (como twist ou snail) tem múltiplos sítios de ligação de baixa afinidade para a proteína
Dorsal e nenhum sítio ligante de DSP1. Intensificadores naqueles genes que são reprimidos por
Dorsal contêm tanto sítios ligantes de Dorsal, como um sítio ligante de DSP1. (A) Na ausência
da proteína Dorsal (i.e., naquelas futuras células ectodérmicas nas quais a proteína Dorsal não
penetrou no núcleo) os genes twist e snail não são ativados e genes como zerknüllt não são
reprimidos. (B) Reciprocamente, na presença da proteína Dorsal no núcleo, os genes twist e snail
tornam-se ativos e o gene zerknüllt é desligado. (Segundo Ip, 1995.)
Embrião de Drosophila
Dorsal Co-repressores putativos

(A)
que ligam seqüências ricas
DSP1
em AT de AT1-3
Ectoderma Sem twist

dorsal ou snail
Dorsal Inibição
Neuroectoderma (B)
Mesoderma Ativação
twist,
Gradiente de Snail
Dorsal nuclear Sítios de ligação de Dorsal
Ventral
intensificadores dos genes. O intensificador zen contém um sítio de ligação para uma
proteína chamada DSP1 (“proteína de comutação dorsal 1”). Essa proteína é encontra-
da em todo o embrião. Quando a proteína Dorsal está ausente, não parece ter efeito
algum sobre a transcrição. Porém, quando Dorsal também está presente no sítio do
intensificador, ela converte a função ativadora de Dorsal em função repressora (Figura
14.43; Lehming et al., 1994; Ip, 1995). Mutantes de dorsal expressam genes dpp e zen
através do embrião (Rushlow et al., 1987), e embriões deficientes em dpp e zen deixam
de formar estruturas dorsais (Irish e Gelbart, 1987). Assim, em embriões tipo selvagem,
os precursores mesodérmicos expressam twist e snail (mas não zen e dpp); precurso-
res da epiderme dorsal e da amnioserosa expressam zen e dpp, mas não twist ou snail;
precursores da glia (mesectoderma) expressam somente snail; enquanto os precurso-
res neuroectodérmicos laterais não expressam qualquer um desses quatro genes
(Kosman et al., 1991; Ray et al., 1991). Assim, em conseqüência das respostas ao
gradiente da proteína Dorsal, o eixo fica subdividido em mesoderma, mesectoderma,
ectoderma neurogênico, epiderme e amnioserosa. [droso3.html]
PRIMÓRDIOS DE ÓRGÃOS E EIXOS

O modelo de coordenadas cartesianas e a
especificação dos primórdios dos órgãos
Os eixos ântero-posterior e dorsoventral de embriões de Drosophila formam um siste-
ma coordenado que pode ser empregado para especificar posições no embrião. Teori-
camente, células que inicialmente são equivalentes quanto a seu potencial de desen-
volvimento podem responder às suas coordenadas expressando diferentes conjuntos
de genes. Isso foi visto na formação dos rudimentos da glândula salivar (Panzer et al,
1992). Primeiro, glândulas salivares só se formam na faixa de células definidas pelo
gene Sex combs reduced (Scr) ao longo do eixo ântero-posterior (parasegmento 2).
Glândulas salivares não são formadas em mutantes deficientes em Scr. Além disso, se
Scr é motivado a funcionar através de todo o embrião, os genes das glândulas saliva-
res são expressos em uma faixa ventrolateral ao longo da parte mais longitudinal do
embrião. A posição da glândula salivar ao longo do eixo dorsoventral é reprimida tanto
Scr Ativa
por Decapentaplegic como por Dorsal. Essas proteínas inibem a formação de glându-
las salivares tanto dorsal como ventralmente. Assim, a glândula salivar se forma na
interseção da banda de expressão vertical de Scr (segundo parasegmento) e a região Inibe dpp
horizontal no meio da circunferência do embrião que não apresenta produtos de genes
decapentaplegic nem dorsal (Figura 14.44). As células que formam a glândula salivar
são direcionadas a assim o fazer pela atividade de genes que intersectam os eixos
ântero-posterior e dorsoventral.
Uma situação semelhante é vista em tecidos encontrados em todos os segmentos
da mosca. Neuroblastos se formam de 10 agregados de 4 a 6 células cada um, que se
Inibe grupo
formam duas vezes em cada segmento na faixa do neuroectoderma da linha mediana dl, spitz
do embrião (Skeath e Carroll, 1992). O potencial para formar células neurais é conferido
a essas células pela expressão de genes proneurais do complexo de genes achaete-
scute: achaete (ac), scute (sc) e lethal of scute (l’sc). As células em cada agregado Figura 14.44
interagem (nos modos discutidos nos Capítulos 8 e 17) para gerar uma única célula Sistema de coordenadas cartesianas para ex-
neural do agregado. Skeath e colegas (1993) mostraram que o padrão de transcrição de pressão de genes que originam as glândulas
achaete e de scute é imposto por um sistema de coordenadas. Sua expressão é repri- salivares. Os genes são ativados pelo produto
protéico do gene homeótico Sex combs reduced
mida pelas proteínas Decapentaplegic e Snail ao longo do eixo dorsoventral, enquan-
ao longo do eixo ântero-posterior, e são inibi-
to reforço positivo pelos genes pair-rule ao longo do eixo ântero-posterior causa sua dos nas regiões marcadas por produtos dos
repetição em cada meio-segmento. O intensificador reconhecido por essas proteínas genes decapentaplegic e dorsal ao longo do
especificadoras do eixo fica entre os genes achaete e scute e parece regular ambos. É eixo dorsoventral. Isso permite que as glându-
muito provável, portanto, que as posições dos primórdios dos órgãos são especificadas las salivares se formem na linha mediana do
por toda a mosca através de um sistema de coordenadas bidimensional baseado na segundo parasegmento do embrião. (Segundo
interseção dos eixos ântero-posterior e dorsoventral. Panzer et al., 1992.)
Resumo: Alguns princípios do

desenvolvimento da Drosophila
Estamos começando a aprender como o genoma influencia a construção do organis-
mo. Os genes regulando a formação de padrões em Drosophila operam de acordo com
certos princípios.
• Existem morfógenos - tais como Bicoid e Dorsal – cujos gradientes determinam
a especificação de diferentes tipos celulares. Esses morfógenos podem ser
fatores de transcrição ou atuar como moléculas sinalizadoras.
• Existe uma ordem temporal pela qual diferentes classe de genes são transcri-
tos, e os produtos de um gene freqüentemente regulam a expressão de outro
gene. Em Drosophila, limites de expressão de genes podem ser criados pela
interação entre fatores de transcrição e seus alvos gênicos. Aqui, os fatores de
transcrição transcritos anteriormente regulam a expressão do próximo conjun-
to de genes.
• O controle da tradução é extremamente importante no embrião precoce; mRNAs
localizados são críticos para a padronização do embrião.
• Destinos celulares individuais não são imediatamente definidos. Em seu lugar,
há uma especificação gradativa onde um dado campo é dividido e subdividido,
finalmente regulando os destinos de células individuais.
Estudos genéticos no embrião de Drosophila desvendaram numerosos genes que
são responsáveis pela especificações dos eixos ântero-posterior e dorsoventral.
Estamos longe de entender completamente a formação de padrões formadores em
Drosophila, mas estamos muito mais conscientes de sua complexidade do que está-
vamos há cinco anos atrás. As mutações de Drosophila nos forneceram nossos pri-
meiros vislumbres dos múltiplos níveis de regulação de padrões em um organismo
complexo e permitiram o isolamento desses genes e seus produtos. Além disso, con-
forme veremos nos capítulos subseqüentes, esses genes podem proporcionar pistas
para um mecanismo geral de formação de padrões usado em todo o reino animal.
LITERATURA CITADA
Akam, M. E. 1987. The molecular basis for Bateson, W. 1894. Materials for the Study of Bokor, P. and DiNardo, S. 1996. The roles of
metameric pattern in the Drosophila embryo. Variation. Macmillan, London. Hedgehog and Wingless in patterning the dorsal
Development 101: 1-22. epidermis in Drosophila. Development 122:
Baumgartner, S. and Noll, M. 1990. Networks
1083-1092.
Anderson, K. V. and Nüsslein-Volhard, C. 1984. of interaction among pair-rule genes regulating
Information for the dorsal-ventral pattern of paired expression during primordial segmentation Boulet, A. M., Lloyd, A., Sakonju, S. 1991.
the Drosophila embryo is stored as maternal of Drosophila. Mech. Dev. 1: 1-18. Molecular definition of the morphogenetic and
mRNA. Nature 311: 223-227. regulatory functions and the cis-regu-latory
Beachy, P. A. 1990. A molecular view of the
elements of the Drosophila Abd-B gene. Deve-
Anderson, K., Bokla, L. and Nüsslein-Volhard, Ultrabithorax homeotic gene of Drosophila.
lopment 111: 393-05.
C. 1985. Establishment of dorsal-ventral Trends Genet. 6(2): 46-51.
polarity in the Drosophila embryo: The Boveri, T. 1901. Über die Polarität des
Bender, W. and seven others. 1983. Molecular
induction of polarity by the Toll gene product. Seeigeleiers. Eisverh. Phys. Med. Ges. Würzburg
genetics of the bithorax complex in Drosophila
Cell 42: 791-798. 34: 145-175.
melanogaster. Science 221: 23-29.
Barker, D. D., Wang, C., Moore, J., Dickinson, Cao, Z., Henzel, W. J. and Gao, X. 1996. IRAK:
Berleth, T. and seven others. 1988. The role of
L. K. and Lehmann, R. 1992. Pumillio is A kinase associated with the inter-leukin-1 re-
localization of bicoid RNA in organizing the
essential for function but not for distribution of ceptor. Science 271: 1128-1131.
anterior pattern of the Drosophila embryo.
the Drosophila abdominal determinant, Nanos.
EMBO J. 7: 1749-1756. Capovilla, M., Eldon, E. D. and Pirrotta, V. 1992.
Genes Dev. 6: 2312-2326.
The giant gene of Drosophila encodes a bZIP
Bhanot, P. and eight others. 1996. A new
Bate, M. and Martinez-Arias, A. 1993. The De- DNA-binding protein that regulates the
member of the frizzled family from Drosophi-
velopment of Drosophila melanogaster. Cold expression of other segmentation gap genes.
la functions a s a Wingless receptor. Nature
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Development 114: 99-112.
382: 225-230.
Harbor, NY.
Casanova, J. and Struhl, G. 1989. Localized zygotic gene expression in the Drosophila Gaul, U. and Jäckle, H. 1990. Role of gap genes
surface activity of torso, a receptor tyrosine embryo by the affinity of binding sites for the in early Drosophila development. Annu. Rev.
kinase, specifies body pattern in Drosophila. bicoid morphogen. Nature 340: 363-367. Genet. 27: 239-275.
Genes Dev. 3: 2025-2038.
Driever, W., Siegel, V. and Nüsslein-Volhard, C. Gavis, E. R. and Lehmann, R. 1992. Localization
Casanova, J., Sanchez-Herrero, E. and Morata, 1990. Autonomous determination of anterior of nanos RNA controls embryonic polarity. Cell
G. 1985, Prothoracic transformation and structures in the early Drosophila embryo by the 71: 301-313.
functional structure of the Ultra-bithorax gene bicoid morphogen. Development. 109: 811-820.
González-Crespo, S. and Levine, M. 1994.
of Drosophila. Cell 42: 663-669.
Dubnau, J. and Struhl, G. 1996. RNA recognition Related target enhancers for dorsal and NF-kB
Casanova, J., Sanchez-Herrero, E., Busturia, A. and translational regulation by a homeodomain signalling pathways. Science 264: 255-258.
and Morata, G. 1987. Double and triple mutant protein. Nature 379: 694-699.
González-Reyes, A and Morata, G. 1990. The
combination of the bithorax complex of Dro-
Duffy, J. B. and Perrimon, N. 1994. The torso developmental effect of overexpress-ing a Ubx
sophila. EMBO J. 6: 3103-3109.
pathway in Drosophila: Lessons on receptor product in Drosophila embryos is dependent on
Casares, F. and Sánchez-Herrero, E. 1995. tyrosine kinase signaling and pattern formation. its interactions with other homeotic products.
Regulation of the infraabdominal regions of the Dev. Biol. 166: 380-395. Cell 61: 515-522.
bithorax complex of Drosophila by gap genes.
Edgar, B. A. and Schubiger, G. 1986. Parameters Gonzáles-Reyes, A., Elliot, H. and St. Johnson,
controlling transcriptional activation during early D. 1995. Polarization of both major body axes
Castelli-Gair, J. and Akam, M. 1995. How the Drosophila development. Cell 44: 871-877. in Drosophila by gurken-torpedo signalling.
Hox gene Ultrabithorax specifies two different Nature 375: 654-658.
Edgar, B. A., Weir, M. P., Schubiger, G. and
segments: the significance of spatial and tem-
Kornberg, T. 1986. Repression and turnover Grossniklaus, U., Cadigan, K. M. and Gehring,
poral regulation within metameres. Development
pattern of fushi tarazu RNA in the early Droso- W. J. 1994. Three maternal coordinate systems
121: 2973-2982.
phila embryo. Cell 47: 747-754. cooperate in the patterning of the Drosophila
Chasan, R., Jin, Y. and Anderson, K. V. 1992. head. Development 120: 3155-3171.
Ferguson, E. L and Anderson, K. V. 1991. Dor-
Activation of the easter zymogen is regulated by five
sal-ventral pattern formation in the Drosophi- Hafen, E., Levine, M. and Gehring, W. J. 1984.
other genes to define dorsal-ventral polarity in the
la embryo The role of zygotically active genes. Regulation of Antennapedia transcript distribu-
Drosophila embryo. Development 115: 607-615.
Curr. Top. Dev. Biol. 25: 17-43. tion by the bithorax complex in Drosophila.
Child, C. M. 1941. Patterns and Problems of De- Nature 307: 287-289.
Finkelstein, R. and Perrimon, N. 1990. The
velopment. University of Chicago Press, Chicago.
orthodenticle gene is regulated by bicoid and torso Hanes, S. D. and Brent, R. 1989. DNA
Cohen, S. M. and Jüirgens, G. 1990. Mutations and specifies Drosophila head development. specificity of the bicoid activator protein is
of Drosophila head development by gap-like Nature 346: 485-488. determined by homeodomain recognition helix
segmentation genes. Nature 346: 482-485. residue 9. Cell 57: 1275-1283.
Foe, V. E. 1989. Mitotic domains reveal early
Crick, F. H. C. 1970. Diffusion in embryoge- committment of cells in Drosophila embryos. Hanes, S. D. and Brent, R. 1991. A genetic model
nesis. Nature 225: 420-422. Development 107: 1-22. for interaction of the homeodomain recognition
helix with DNA. Science 251: 426-430.
Degelmann, A., Hardy, P. A., Perrimon, N. and Foe, V. E. and Alberts, B. M. 1983. Studies of
Mahowald, A. P. 1986. Developmental analysis of nuclear and cytoplasmic behavior during the five Harding, K. and Levine, M. 1988. Gap genes
the torso-like phenotype in Drosophila produced by mitotic cycles that precede gas-trulation in Dro- define the limits of Antennapedia and Bithorax
a maternal-effect locus. Dev. Biol. 115: 479-489. sophila embryogenesis. J. Cell Sci. 61: 31-70. gene expression during early development in
Drosophila. EMBO J. 7: 205-214.
Dessain, S., Gross, C. T., Kuziora, M. A. and Forlani, S., Ferrandon, D., Saget, O. and Mohier, E.
McGinnis, W. 1992. Antp-type home-odomains 1993. A regulatory function for K10 in the Harding, K. and Levine, M. 1989. Drosophila:
have distinct DNA-binding specificities that establishhment of dorsoventral polarity in the Dro- The zygotic contribution. In D. M. Glover and
correlate with their different regulatory functions sophila egg and embryo. Mech. Dev. 41: 109-120. B. D. Hames (eds.), Genes and Embryos. IRL,
in embryos. EMBO Journal 11: 991-1002. New York, pp. 38-90.
French, V. 1988. Gradients and insect seg-
Doe, C. Q., Hiromi, Y, Gehring, W. J. and mentation. In V. French, P. Ingham, J. Cooke Harding, K., Wedeen, C., McGinnis, W. and
Goodman, C. S. 1988. Expression and function and J. Smith (eds.), Mechanisms of Segmentation. Levine, M. 1985. Spatially regulated expression
of the segmentation gene fushi tarazu during Company of Biologists, Cambridge, pp. 3-16. of homeotic genes in Drosophila. Science 229:
Drosophila neurogenesis. Science 239: 170-175. 1236-1242.
Frigerio, G., Burri, M., Bopp, D., Baumgart-ner, S.
Driever, W. and Nüsslein-Volhard, C. 1988a. A and Noll, M. 1986. Structure of the segmentation Hashimoto, C., Hudson, K. L. and Anderson, K. V.
gradient of bicoid protein in Drosophila embryos. gene paired and the Drosophila PRD gene set as 1988. The Toll gene of Drosophila, required for
Cell 54: 83-93. part of a gene network. Cell 47: 735-746. dorsal-ventral embryonic polarity, appears to encode
a transmembrane protein. Cell 52: 269-279.
Driever, W. and Nüsslein-Volhard, C. 1988b. The Frischer, L. E., Hagen, F. S. and Garber, R. L.
bicoid protein determines position in the Dro- 1986. An inversion that disrupts the An- Hashimoto, C., Gerttula, S. and Anderson, K. V.
sophila embryo in a concentration-dependent tennapedia gene causes abnormal structure and 1991. Plasma membrane localization of the Toll
manner. Cell 54: 95-104. localization of RNAs. Cell 47: 1017-1023. protein in the syncytial Drosophila embryo:
importance of trans-membrane signalling for
Driever, W. and Nüsslein-Volhard, C. 1989. The Galindo, R. L., Edwards, D. N., Gillespie, S. K.
dorsal-ventral pattern formation. Development
bicoid protein is a positive regulator of H. and Wasserman, S. A. 1995. Interaction of
11: 1021-1028.
hunchback transcription in the early Drosophi- the pelle kinase with the membrane-associated
la embryo. Nature 337: 138-143. protein tube is required for transduction of the Hecht, P. M. and Anderson, K. V. 1992. Ex-
dorsoventral signal in Drosophila embryos. De- tracellular proteases and embryonic pattern
Driever, W., Thoma, G. and Nusslein-Volhard,
velopment 121: 2209-2218. formation. Trends Cell Biol. 2: 197-202.
C. 1989. .Determination of spatial domains of
Heemskerk, J., DiNardo, S., Kostriken, R. and Kalthoff, K. 1969. Der Einfluss ver-shiedener Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Re-
O’Farrell, P. H. 1991. Multiple modes of Versuchparameter auf die Häu-figkeit der ichhart, J.-M. and Hoffmann, J. A. 1996. The
engrailed regulation in the progression towards Missbildung “Doppelabdomen” in UV-bestrahlten dorsoventral regulatory gene casette spätzle/
cell fate determination. Nature 352: 404-410. Eiern von Smittia sp. (Diptera,Chironomidae). Toll/cactus controls the potent an-tifungal
Zool. Anz. Suppl. 33: 59-65. response in Drosophila adults. Cell 86: 973-983.
Heemskerk, J. and DiNardo, S. 1994. Drosophi-
la hedgehog acts as a morphogen in cellular Kalthoff, K. and Sander, K. 1968. Der En- Leptin, M. 1991a. twist and snail as positive and
patterning. Cell 76: 449-460. wicklungsgang der Missbildung “Doppelabdomen” negative regulators during Drosophila mesoderm
im partiell UV-bestrahlten Ei von Smittia development. Genes Dev. 5: 1568-1576.
Hoch, M., Gerwin, N., Taubert, H. and Jäckie,
parthenogenetica (Diptera, Chi-ronomidae).
H. 1992. Competition for overlapping sites in Leptin, M. 1991b. Mechanics and genetics of
Wilhelm Roux Arch. Entwick-lungsmech. Org.
the regulatory region of the Drosophila gene cell shape changes during Drosophila ventral
161: 129-146.
Krüppel. Science 256: 94-97. furrow formation. In R. Keller et al. (eds.), Gas-
Kandler-Singer, I. and Kalthoff, K. 1976. RNase trulation: Movements, Patterns, and Molecules.
Hong, C. C. and Hashimoto, C. 1995. An unusual
sensitivity of an anterior morpho-genetic Plenum, New York, pp. 199-212.
mosaic protein with a protease domain, encoded
determinant in an insect egg (Smittia sp.,
by the nudel gene, is involved in defining Levine, M. S. and Harding, K. W. 1989. Droso-
Chironomidae, Diptera). Proc. Natl. Acad. Sci.
embryonic dorsoventral polarity in Drosophi- phila: The zygotic contribution. In D. M. Glover
USA 73: 3739-3743.
la. Cell 82: 785-794. and B. D. Hames (eds.), Genes and Embryos.
Karch, F. and seven others. 1985. The abdominal IRL, New York, pp. 39-94.
Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle,
region of the bithorax complex. Cell 43: 81-96.
H. and Tautz, D. 1989. Posterior seg-mentation Lewis, E. B. 1978. A gene complex controlling
of the Drosophila embryo in the absence of a Karr, T. L. and Kornberg, T. B. 1989. fushi tarazu segmentation in Drosophila. Nature 276: 565-570.
maternal posterior organizer gene. Nature 338: protein expression in the cellular blastoderm of
Lewis, E. B. 1985. Regulation of the genes of
629-632. Drosophila detected using a novel imaging
the bithorax complex in Drosophila. Cold
technique. Development 105: 95-103.
Immergluck, K., Lawrence, P. A. and Bienz, M. Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 155-164.
1990. Induction across germ layers in Drosophila Kaufman, T. C., Seeger, M. A. and Olsen, G.
Macdonald, P. M. and Smibert, C. A. 1996.
mediated by a genetic cascade. Cell 62: 261-268. 1990. Molecular and genetic organization of the
Translational regulation of maternal mRNAs.
Antennapedia gene complex of Drosophila
Ingham, P. W. and Martinez-Arias, A. 1986. Curr. Opin. Genet. Dev. 6: 403-07.
melanogaster. Adv. Genet. 27: 309-362.
The correct activation of Antennapedia and
Macdonald, P. M. and Struhl, G. 1986. A mole-
bithorax complex genes requires the fushi tarazu Kidd, S. 1992. Characterization of the Drosophila
cular gradient in early Drosophila embryos and
gene. Nature 324: 592-597. cactus locus and analysis of interactions between
its role in specifying the body pattern. Nature
cactus and dorsal proteins. Cell 71: 623-635.
Ingham, P. W. and Whittle, R. 1980. Tritho- 324: 537-545.
rax: A new homeotic mutation of Drosophila Klingler, M., Erdélyi, M., Szabad, J. and Nüsslein-
Mange, A. P. and Mange, E. J. 1990. Genet-
causing transformations of abdominal and Volhard, C. 1988. Function of torso in
ics: Human Aspects. Sinauer Associates,
thoracic imaginal segments. I. Putative role during determining the terminal anlagen of the Droso-
Sunderland, MA.
embryogenesis. Mol. Gen. Genet. 179: 607-614. phila embryo. Nature 335: 275-277.
Mann, R. S. and Hogness, D. S. 1990. Func-
Ingham, P. W., Taylor, A. M. and Nakano, Y. Knipple, D. C., Seifert, E., Rosenberg, U. B.,
tional dissection of Ultrabithorax proteins in D.
1991. Role of Drosophila patched gene in Preiss, A. and Jäckle, H. 1985. Spatial and tem-
melanogaster. Cell 60: 597-610.
positional signalling. Nature 353: 184-187. poral patterns of Krüppel gene expression in
early Drosophila embryos. Nature 317: 40-44. Martin, J. R., Railbaud, A. and Ollo, R. 1994.
Ip. Y. T. 1995. Converting an activator into a
Terminal elements in Drosophila embryo induced
represser. Curr. Biol. 5:1-3. Kosman, D., Ip, Y. T, Levine, M. and Arora, K.
by torso-like protein. Nature 367: 741-745.
1991. Establishment of the mesoderm-
Irish, V. F. and Gelbart, W. M. 1987. The de-
neuroectoderm boundary in the Drosophila Martinez-Arias, A. and Lawrence, P. A. 1985.
capentaplegic gene is required for dorsal-ven-
embryo. Science 254: 118-122. Parasegments and compartments in the Droso-
tral patterning of the Drosophila embryo. Genes
phila embryo. Nature 313: 639-642.
Dev. 1: 868-879. Kraut, R. and Levine, M. 1991. Mutually re-
pressive interactions between the gap genes giant McKeon, J. and Brock, H. W. 1991. Interac-
Irish, V., Lehmann, R. and Akam, M. 1989. The
and Krüppel define middle body regions of the tions of the Polycomb group of genes with
Drosophila posterior-group gene nanos
Drosophila embryo. Development 111: 611-621. homeotic loci of Drosophila. Roux Arch. Dev.
functions by repressing hunchback activity.
Biol. 199: 387-396.
Nature 338: 646-648. Lehmann, R. and Nüsslein-Volhard, C. 1986.
Abdominal segmentation, pole cell formation, Mlodzik, M. and Gehring, W. J. 1987. Expression
Jäckle, H., Tautz, D., Schuh, R., Seifert, E. and
and embryonic polarity require the localized of the caudal gene in the germ line of Drosophi-
Lehmann, R. 1986. Cross-regulatory interactions
activity of oskar, a maternal gene in Drosophi- la: Formation of an RNA and protein gradient
among the gap genes of Drosophila. Nature 324:
la. Cell 47: 141-152 during early embryogenesis. Cell 48: 465-78.
668-670.
Lehmann, R. and Nusslein-Volhard, C. 1991. The Mohler, J. and Vani, K. 1992. Molecular or-
Jiang, J. and Levine, M. 1993. Binding affinities
maternal gene nanos has a central role in poste- ganization and embryonic expression of the
and cooperative interactions with bHLH
rior pattern formation of the Drosophila hedgehog gene involved in cell-cell com-
activators delimit threshold responses to the
embryo. Development 112: 679-691. munication in segmental patterning in Droso-
dorsal gradient morphogen. Cell 72: 741-752.
phila. Development 115: 957-971.
Jiang, J., Kosman, D., Ip, Y. T. and Levine, M.
Lehming, N., Thanos, D., Brickman, J. M., Ma, Montell, D. J., Keshishian, H. and Spradling, A.
1991. The dorsal morphogen gradient regulates
J., Maniatis, T. and Ptashne, M. 1994. An HMG- C. 1991. Laser ablation studies of the role of the
the mesoderm determinant twist in early Droso-
like protein that can switch a transcriptional Drosophila oocyte nucleus in pattern formation.
phila embryos. Genes Dev. 5: 1881-1891.
activator to a represser. Nature 371: 175-179. Science 254: 290-293.
Müller, J. and Bienz, M. 1992. Sharp anterior Peifer, M. and Wieschaus, E. 1990. Mutations Rivera-Pomar, R., Niessling, D., Schmidt-Ott,
boundary of homeotic gene expression in the Drosophila gene extradenticle affect the U., Gehring, W. J. and Häckle, H. 1996. RNA
conferred by the fushi tarazu protein. EMBO way specific homeodomain proteins regulate binding and translational suppression by bicoid.
J.11: 3653-3661. segment identity. Genes Dev. 4: 1209-1223. Nature 379: 746-749.
Müller, M. Affolter, M., Leupin, W., Otting, G., Peifer, M., Karch, F. and Bender, W. 1987. The Roder, L., Vola, C. and Kerridge, S. 1992. The
Wüthrich, K. and Gehring, W. J. 1988. Isolation bithorax complex: Control of segmen-tal role of teashirt in trunk segmental identity in
and sequence-specific DNA binding of the Anten- identity. Genes Dev. 1: 891-898. Drosophila. Development 115: 1017-1033.
napedia homeodomain. EMBO J. 7: 4299-4304.
Percival-Smith, A., Müller, M., Affolter, M. and Roth, S. 1994. Proteolytic generation of a
Murata, Y. and Wharton, R. P. 1995. Binding of Gehring, W. J. 1990. The interaction with DNA morphogen. Curr. Biol. 4: 755-757.
pumilio to maternal hunchback mRNA is required of wild-type and mutant fushi tarazu homeodo-
Roth, S., Stein, D., Nüsslein-Volhard, C. 1989. A
for posterior patterning in Drosophila embryos. mains. EMBO J. 9: 3967-3974.
gradient of nuclear localization of the dorsal
Cell 80: 747-756.
Pignoni, F., Steingrímsson, E. and Lengyel, J. A. protein determines dorsoventral pattern in the
Nambu, J. R., Franks, R. G., Hong, S. and Crews, 1992. bicoid and the terminal system activate Drosophila embryo. Cell 59: 1189-1202.
S. 1990. The single-minded gene of Drosophila tailless expression in the early Drosophila
Roth, S., Neuman-Silberberg, F. S., Barcelo, G.
is required for the expression of genes important embryo. Development 115: 239-251.
and Schüpbach, T. 1995. cornichon and the EGF
for the development of CNS midline cells. Cell
Porter, J. A. and ten others. 1996. Hedgehog receptor signalling process are necessary for both
63: 63-75.
patterning activity. Role of a lipophilic anterior-posterior and dorsal-ventral pattern
Neuman-Silberberg, F. S. and Schiipbach, T. 1993. modification by the carboxy-terminal auto- formation in Drosophila. Cell 81: 967-978.
The Drosophila dorsoventral patterning gene processing domain. Cell 86: 21-34.
Rushlow, C., Frasch, J., Doyle, H. and Levine,
gurken produces a dorsally localized RNA and
Price, J. V., Clifford, R. J. and Sch pbach, T. M. 1987. Maternal regulation of a homeobox
encodes a TGF-a-like protein. Cell 75: 165-174.
1989. The maternal ventralizing gene torpedo gene controlling differentiation of dorsal tissues
Nijhout, H. F. 1981. The color patterns of butterflies is allelic to faint little ball, an embryonic lethal, in Drosophila. Nature 330: 583-586.
and moths. Sci. Am. 245 (5): 140-151. and encodes the Drosophila EGF receptor
Rushlow, C. A., Han, K., Manley, J. L. and Levine,
homolog. Cell 56: 1085-1092.
Nüsslein-Volhard, C. and Wieschaus, E. 1980. M. 1989. The graded distribution of the dorsal
Mutations affecting segment number and Qian, S., Capovilla, M. and Pirrotta, V. 1991. morphogen is initiated by selective nuclear
polarity in Drosophila. Nature 287: 795-801. The bx region enhancer, a distant ciscontrol transport in Drosophila. Cell 59: 1165-1177.
element of the Drosophila Ubx gene and its
Nüsslein-Volhard, C., Fröhnhofer, H. G. and Sánchez-Herrero, E. 1991. Control of the
regulation.by hunchback and other segmentati-
Lehmann, R. 1987. Determination of anterio- expression of the bithorax complex genes ab-
on genes. EMBO J. 10: 1415-1425.
posterior polarity in Drosophila. Science 238: dominal-A and Abdominal-B by cis-regula-tory
1675-1681. Raskolb, C. and Wieschaus, E. 1994. Coordinate regions in Drosophila embryos. Development
regulation of downstream genes by extradenticle 111: 437-449.
Otting, G., Qian, Y. Q., Billeter, M., M ller, M.,
and homeotic selector proteins. EMBO J. 15:
Affolter, M., Gehring, W. J. and Wüthrich, K. Sánchez-Herrero, E., Vernos, I., Marco, R. and
3561-3569.
1990. Protein-DNA contacts in the structure of Morata, G. 1985. Genetic organization of Dro-
a homeodomain-DNA complex determined by Ray, R. Arora, K., Nüsslein-Volhard, C. and sophila bithorax complex. Nature 313: 108-113.
nuclear magnetic resonance spectroscopy in Gelbart, W. M. 1991. The control of cell fate
Sander, K. 1960. Analyse des ooplasmatis-chen
solution. EMBO J. 9: 3085-3092. along the dorsal-ventral axis of the Drosophila
Reaktionssystems von Euscelis pleba-jus Fall
embryo. Development 113: 35-54.
Pan, D., Huang, J.-D. and Courey, A. J. 1991. (Circadina) durch Isolieren und Kombinieren von
Functional analysis of the Drosophila twist Reach, M., Galindo, R. L., Towb, P., Allen, J. L., Keimteilen. II. Die Dif-ferenzierungsleistungen nach
promoter reveals a dorsal-binding ventral Karin, M. and Wasserman, S. A. 1996. A gradient Verlagern von Hinterpolmaterial. Wilhelm Roux
activator region. Genes Dev. 5: 1892-1901. of Cactus protein degredation establishes Arch. Entwicklungsmech. Org. 151: 660-707.
dorsoventral polarity in the Drosophila embryo.
Panganiban, G. E. F., Reuter, R., Scott, M. P. and Sander, K. 1975. Pattern specification in the
Dev. Biol. 180: 353-364.
Hoffmann, F. M. 1990. A Drosophila growth insect embryo. In Cell Patterning. CIBA
factor homolog, Decapentaplegic, regulates Reinitz, J., Mjolsness, E. and Sharp, D. H. 1995. Foundation Symp. 29: 241-263.
homeotic gene expression within and across germ Model for cooperative control of positional
Schier, A. F. and Gehring, A. J. 1992. Direct
layers during midgut morphogenesis. Develop- information in Drosophila by bicoid and mater-
homeodomain-DNA interaction in the au-
ment 110: 1041-1050. nal hunchback. J. Exp. Zool. 271: 47-56.
toregulation of the fushi tarazu gene. Nature
Pankratz, M. J., Seifert, E., Gerwin, N., Billi, B., Reinitz, J. and Sharp, D. H. 1995. Mechanism of 356:804-807.
Nauber, U. and Jäckle, H. 1990. Gradients of eve stripe formation. Mech. Dev. 49: 133-158.
Schneuwly, S., Kuroiwa, A. and Gehring, W. J. 1987.
Krüppel and knirps gene products direct pair-
Riddihough, G. 1992. Homing in on the Molecular analysis of the dominant homeotic
rule gene stripe patterning in the posterior region
homeobox. Nature 357: 643-644. Antennapedia phenotype. EMBO J. 6: 201-206.
of the Drosophila embryo. Cell 61: 309-317.
Rivera-Pomar, R. and Jäckle, H. 1996. From Schulz, C. and Tautz, D. 1995. Zygotic caudal
Panzer, S., Weigel, D. and Beckendorf, S. K.
gradients to stripes in Drosophila embryo- regulation by hunchback and its role in abdomi-
1992. Organogenesis in Drosophila melanogas-
genesis: Filling in the gaps. Trends Genet. 12: nal segment formation of the Drosophila
ter: embryonic salivary gland determination is
478-183. embryo. Development 121: 1023-1028.
controlled by homeotic and dorsoventral
patterning genes. Development 114: 49-57. Rivera-Pomar, R., Lu, X., Perrimon, N., Taubert, Schüpbach, T. 1987. Germ line and soma
H. and Jäckle, H. 1995. Activation of posterior cooperate during oogenesis to establish the
Peifer, M. and Bender, W. 1986. The antero-
gap gene expression in the Drosophila blastoderm. dorsoventral pattern of egg shell and embryo in
bithorax and bithorax mutations of the bithorax
Nature 376: 253-256. Drosophila melanogaster. Cell 49: 699-707.
complex. EMBO J. 5: 2293-2303.
Schüpbach, T. and Wieschaus, E. 1986. Maternal Stein, D. and Nüsslein-Volhard, C. 1992. Multiple Turner, F. R. and Mahowald, A. P. 1977. Scanning
effect mutations altering the anterior-posterior extracellular activities in Drosophila egg electron microscopy of Drosophila melanogas-
pattern of the Drosophila embryo. Roux Arch. perivitelline fluid are required for establishment ter embryogenesis. Dev. Biol. 57: 403-416.
Dev. Biol. 195: 302-317. of embryonic dorsal-ventral polarity. Cell 68:
Tyler, M. S. and Schetzer, J.W. 1996. The Lives
429-440.
Schüpbach, T., Clifford, R. J., Manseau, L. J. and of a Fly. Videocassette. ASAP Media Services,
Price, J. V. 1991. Dorsoventral signaling pro- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein- Orono; Sinauer Associates, Sunderland, MA.
cesses in Drosophila oogenesis. In J. Ger-hart, Volhard, C. 1991. The polarity of the dorsoventral
Vachon, G., Cohen, B., Pfeifle, C., McGuf-fin,
(ed.) Cell-Cell Interactions in Early De- axis in the Drosophila embryo is defined by an
M. E., Botas, J. and Cohen, S. M. 1992.
velopment. Wiley-Liss, New York pp. 163-174. extracellular signal. Cell 65: 725-735.
Homeotic genes of the bithorax complex repress
Schwalm, R 1997. Insects. In S.F. Gilbert and A. Stevens, L. M., Frohnhöfer, H. G., Klingler, M. limb development in the abdomen of the Dro-
M. Raunio, (eds.), Embryology: Constructing the and Nüsslein-Volhard, C. 1990. Localized sophila embryo through the target gene Distal-
Organism. Sinauer Associates, Sunderland, MA. requirement for torso-like expression in follicle less. Cell 71: 437-450.
cells for development of terminal anlagen of
Shelton, C. A. and Wasserman, S. A. 1993. pelle Van Dyke, M. A. and Murre, C. 1994. Ex-
the Drosophila embryo. Nature 346: 660-662.
encodes a protein kinase required to establish tradenticle raises the DNA binding specificity
dorsoventral polarity in the Drosophila embryo. Steward, R. 1989. Relocalization of the dorsal of homeotic selector gene products. Cell 78:
Cell 72: 515-525. protein from the cytoplasm to the nucleus 617-624.
correlates with its function. Cell 59: 1179-1188.
Siegfried, E., Wilder, E. L. and Perrimon, N. Wagner-Bernholz, J. T., Wilson, C., Gibson, G.,
1994. Components of wingless signalling in Steward, R. and Govind, S. 1993. Dorsal-ventral Schuh, R. and Gehring, W. J. 1991. Identification
Drosophila. Nature 367: 76-80. polarity in the Drosophila embryo. Curr. Opin. of target genes of the homeotic gene Antenna-
Genet. Dev. 3: 556-561. pedia by enhancer detection. Genes Dev. 5:
Simon, J., Chiang, A. and Bender, W. 1992. Ten
2467-2480.
different Polycomb genes are required for spatial Struhl, G. 1981. A homeotic mutation trans-
control of the abdA and AbdB homeotic products. forming leg to antenna in Drosophila. Nature Wakimoto, B. T., Turner, F. R. and Kaufman, T.
Development 114: 493-505. 292: 635-638. C. 1984. Defects in embryogenesis in mutants
associated with the Antennapedia gene complex
Simpson-Brose, M., Treisman, J. and Des-plan, Struhl, G. 1989. Differing strategies for or-
of Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 102:
C. 1994. Synergy between the hunchback and ganizing anterior and posterior body pattern in
147-172.
bicoid morphogens is required for anterior Drosophila embryos. Nature 338: 741-744.
patterning in Drosophila. Cell 78: 855-865. Wang, C. and Lehman, R. 1991. Nanos is the
Struhl, G., Struhl, K. and Macdonald, P. M. 1989.
localized posterior determinate in Drosophila.
Skeath, J. B. and Carroll, S. B. 1992. Regulation The gradient morphogen bicoid is a concentra-
Cell 66:637-647.
of proneural gene expression and cell fate during tion-dependent transcriptional activator. Cell 57:
neuroblast segregation in the Drosophila embryo. 1259-1273. Weigel, D., Jüirgens, G., Klingler, M. and Jäckle,
Development 114: 939-946. H. 1990. Two gap genes mediate maternal ter-
Struhl, G., Johnson, P. and Lawrence, P. 1992. Control
minal information in Drosophila. Science 248:
Skeath, J. B., Panganiban, G., Selegue, J. and of a Drosophila body pattern by the hunchback
495-498.
Carroll, S. B. 1993. Gene regulation in two morphogen gradient. Cell 69: 237-249.
dimensions: The proneural achaete and scute Whalen, A. M. and Steward, R. 1993. Disso-
Tautz, D. 1988. Regulation of the Drosophila
genes are controlled by combinations of axis- ciation of the dorsal-cactus complex and
segmentation gene hunchback by two maternal
patterning genes through a common intergenic phosphorylation of the dorsal protein correlate
morphogenetic centers. Nature 332: 281-284.
control region. Genes Dev. 6: 2606-2619. with the nuclear localization of dorsal. J. Cell.
Thisse, B., Stoetzel, C., Gorostiza-Thisse, C. and Biol. 123: 523-534.
Slack, J. M. W. 1983. From Egg to Embryo:
Perrin-Schmidt, F. 1988. Sequence of the twist
Determinative Events in Early Development. Wharton, R. P. and Struhl, G. 1991. RNA
gene and nuclear localization of its protein in
Cambridge University Press, Cambridge. regulatory elements mediate control of Droso-
endomesodermal cells of early Drosophila
phila body pattern by the posterior morphogen
St. Johnston, D. and Nüsslein-Volhard, C. 1992. embryos. EMBO J. 7: 2175-2183.
nanos. Cell 67: 955-967.
The origin of pattern and polarity in the Droso-
Thisse, C, Perrin-Schmidt, F., Stoetzel, C. and
phila embryo. Cell 68: 201-219. Wolpert, L. 1971. Positional information and
Thisse, B. 1991. Sequence-specific trans
pattern formation. Curr. Top. Dev. Biol. 6: 183-
Štanojevic, D., Hoey, T. and Levine, M. 1989. activation of the Drosophila twist gene by the
224.
Sequence-specific DNA-binding activities of the dorsal gene product. Cell 65: 1191-1201.
gap proteins encoded by hunchback and Krüppel Wolpert, L. 1978. Pattern formation in bio-
Treisman, J. and Desplan, C. 1989. The products
in Drosophila. Nature 341: 331-335. logical development. Sci. Am. 239(4): 154-164.
of the Drosophila gap genes hunchback and
Štanojevic, D., Small, S. and Levine, M. 1991. Krüppel bind to the hunchback promoters.
Regulators of a segmentation stripe by overlap- Nature 341: 335-336.
ping activators and repressers in the Drosophila
embryo. Science 254: 1385- 1387.
Especificação do destino celular por
interações célula-célula progressivas 15
O estudo da função dos genes na ontogenia
é um campo da fisiologia do desenvolvimen-
to. Isso não quer dizer que o geneticista será
excluído na resolução desse problema - ele
se tornará um embriologista genético expe-
N O ÚLTIMO CAPÍTULO, observamos que a determinação celular e a especi-
ficação do eixo podem ser causadas por interações de substâncias plasmáticas
específicas dentro de uma célula sincicial. Somente mais tarde ocorrem inte-
rações célula-célula que fixam o destino celular. Mas, a maioria dos tipos de organis-
mos não possui o estágio sincicial na embriogênese precoce. Em muitas espécies,
rimental. Após uma longa jornada onde al- incluindo a maioria dos vertebrados, as células são especificadas pelas suas intera-
gumas vezes ele se distanciou de seus cole- ções com células vizinhas.
gas biologistas, ele volta para casa com al-
guns novos conceitos e instrumentos.
CURT STERN (1936)
Desenvolvimento regulativo
Nos mantemos eretos e andamos com partes Em deuterostomatas, tais como ouriço-do-mar e vertebrados, o destino da célula de-
de nosso corpo que poderiam ser usadas para pende de sua posição no embrião e não da parte do citoplasma que ela adquiriu.
raciocinar se elas tivessem se desenvolvido Sidney Brenner (Citado em Wilkins, 1993) observou que o desenvolvimento animal
em outras partes do embrião. pode se dar de duas maneiras. Alguns organismos são especificados predominante-
HANS SPEMANN (1943) mente no “estilo Europeu”; ou seja, cada célula é determinada por quem eram seus
ancestrais. A linhagem é o fator importante. Inversamente, os blastômeros da maioria
dos vertebrados são especificados predominantemente no “estilo Americano”; existe
uma grande mistura de células e cada célula é determinada pela natureza de suas
vizinhas. Toda célula se inicia com um potencial similar e se desenvolve de acordo com
o que encontra. Nesses embriões, em pelo menos parte da clivagem, cada célula é
capaz de se desenvolver no embrião todo se ela for separada das outras, e as células
remanescentes são capazes de alterar seu destino para produzir o embrião completo
(como na formação de gêmeos). Esse tipo de comprometimento é chamado especificação
condicional (ou dependente), e dá origem ao desenvolvimento regulativo.
Durante o desenvolvimento autônomo, o eixo do embrião é determinado pela dis-
tribuição de materiais em cada um dos blastômeros. Entretanto, no desenvolvimento
regulativo, os eixos se formam a partir de interações das células constituintes. Neste
capítulo acompanharemos os experimentos que se iniciaram há mais de um século para
entender como se dá a especificação do sistema nervoso nos anfíbios.
591
Testando a teoria do plasma germinativo

August Weismann: A teoria do plasma germinativo
A descoberta da determinação regulativa tem suas raízes no insucesso das teorias do

desenvolvimento em mosaico formuladas na Alemanha no fim do século dezenove.
Em 1883, August Weismann começou propondo uma teoria que integrava fenômenos
biológicos diversos como hereditariedade, desenvolvimento, regeneração, reprodu-
ção sexual e evolução por seleção natural. Esse modelo mecânico para a diferenciação
celular foi chamado de teoria do plasma germinativo. Baseado no escasso conheci-
mento sobre fertilização existente na época, Weissmann audaciosamente propôs que
a contribuição cromossômica do espermatozóide e do óvulo ao novo organismo era
igual, não só quantitativa como qualitativamente. Ainda mais, foi postulado que os
cromossomos transportavam os potenciais herdados pelo novo organismo e foram
considerados como a base da continuidade entre gerações.* Entretanto, era conside-
rado que nem todos os determinantes dos cromossomos entravam em cada célula do
embrião; em lugar de dividir-se igualmente, a hipótese era que os cromossomos se
dividiam de tal maneira que diferentes determinantes nucleares entravam em células
diferentes. Enquanto o ovo fertilizado estaria levando a carga completa de determi-
nantes, certas células conteriam os determinantes “formadores do sangue” e outras
os determinantes “formadores dos músculos”. Somente os núcleos daquelas células
destinadas a se tornarem gametas (as células germinativas) reteriam, como se pensa-
va, todos os tipos de determinantes. Os núcleos de todas as outras células teriam
somente uma fração dos tipos determinantes originais.
A hipótese de Weismann propunha a continuidade do plasma germinativo e a
diversidade das linhagens somáticas. A diferenciação era devida à “segregação
de determinantes nucleares” para vários tipos de células. Os cromossomos, ape-
sar de iguais em todas as células, seriam desiguais em suas qualidades. Somente a
linhagem das células germinativas manteria todos os determinantes, e essa linha-
gem seria totalmente independente das células somáticas. Assim, não haveria
herança de características adquiridas pelas células somáticas. Weismann conse-
guiu suporte para esse modelo, cortando a cauda de camundongos recém-nasci-
dos por 19 gerações. Os animais de cada geração subseqüente tinham caudas de
tamanho normal, indicando que a linhagem germinativa estava protegida contra
os insultos ao tecido somático.**
A teoria do plasma germinativo de Weismann está ilustrada na Figura 15.1. A teoria
enfatiza a continuidade e a imortalidade da linhagem germinativa em contraste com a
natureza temporária do organismo adulto, mostrando, como notado pelo fisiologista
Michael Foster, que “o corpo animal é na realidade um veículo para os óvulos”. E. B.
Wilson, que considerava seu extraordinário livro, The Cell in Development and
Inheritance (1896), como oriundo da hipótese de Weismann, também reconheceu as
implicações desse esquema:
* Os embriologistas pensavam nesses termos cerca de 15 anos antes da redescoberta do trabalho

de Mendel. Weismann (1892, 1893) também especulou que esses determinantes nucleares da heran-
ça funcionavam elaborando substâncias que se tornavam ativas no citoplasma.
** Nessa época, o ponto de vista alternativo mais importante era o da pangênese. Essa
hipótese, defendida como uma “hipótese provisória” por Charles Darwin, propunha que cada célula
somática continha partículas (pangenes) que migravam de volta para as células sexuais para permi-
tir a transmissão das características daquelas células. De acordo com essa teoria, Weismann deveria
ter obtido camundongos com caudas mais curtas. Mais recentemente, Thomas Jukes, comentando
os resultados de Weismann citou a intuição de Hamlet que “existe uma divindade que dá forma aos
nossos fins, não importa a crueza com que os fazemos”. Deve ser notado que a independência da
linhagem germinativa em relação à somática não é absoluta em todos os organismos. Em esponjas,
platelmintos, hidrozoários e tunicados coloniais, as células germinativas podem se desenvolver de
tecidos somáticos, e mudanças genéticas feitas nesses tecidos somáticos podem ser herdados (Berrill
e Liu, 1948; Buss, 1987).
CAPÍTULO 15 Especificação Condicional 593
Diferenciação das
Células células somáticas
somáticas
A célula germinativa Continuidade das células germinativas
Figura 15.1
A teoria da herança de Weismann. A célula germinativa dá origem às células somáticas diferenciáveis
do corpo (indicadas em cor), como também às novas células germinativas. (de Wilson, 1986.)
A morte de um indivíduo não envolve solução de continuidade na série de divi-

sões celulares pelas quais a vida da raça continua. O indivíduo morre, é verda-
de, mas as células germinativas continuam, levando com elas as tradições da
raça da qual se originaram e as repassando aos seus descendentes.
Wilhelm Roux: Desenvolvimento em mosaico
Weismann intuiu que os cromossomos são os portadores da informação herdada para

o desenvolvimento. Mais importante que isso, ele propôs uma hipótese de desenvol-
vimento que podia ser testada imediatamente. Weismann dizia que quando a primeira
divisão da clivagem separava a futura metade direita do embrião da futura metade
esquerda, haveria uma separação dos determinantes “direitos” dos determinantes
“esquerdos” nos blastômeros resultantes. Essa afirmação foi testada por Wilhelm
Roux, um jovem embriologista alemão. Em 1888, Roux publicou o resultado de uma
série de experimentos nos quais usou embriões de rã de 2 e 4 células, e destruiu
algumas das células com uma agulha aquecida. A hipótese de Weismann predizia a
formação de embriões pela metade, direita ou esquerda; Roux obteve mórulas incom-
pletas (metades), justamente como havia sido previsto por Weismann (Figura 15.2).
Essas se desenvolveram em nêurulas tendo somente um lado completo, direito ou
esquerdo, com uma dobra medular, uma fossa auditiva e assim por diante. Portanto, ele
concluiu que o embrião da rã era um mosaico de partes autodiferenciáveis e era prová-
vel que cada célula estivesse recebendo um conjunto específico de determinantes e se
diferenciava de acordo com isso. Com essa série de experimentos, Roux inaugurou seu
programa de mecânica do desenvolvimento (Entwicklungsmechanik), um enfoque
fisiológico experimental da embriologia (veja Sander, 1991a,b). Nunca mais, insistia
Roux, será a embriologia submetida por estudos evolucionários. Pelo contrário, a
embriologia assumiria seu papel como uma ciência experimental independente.
Figura 15.2
O desenvolvimento em mosaico, como Roux
tentou mostrar. A destruição de uma célula
de um embrião de rã com 2 células resulta
no desenvolvimento de somente uma meta-
de do embrião.
Tecido Tecido
Agulha quente morto vivo Meio embrião
Clivagem
Metade destruída
(tecido morto)
Ovo fertilizado de rã Estágio de 2 células Estágio de blástula Estágio de nêurula
(A) Larva pluteus normal (B) Plutei desenvolvidas de células isoladas de embrião de 4 células
Figura 15.3
Demonstração do desenvolvimento regulativo por Driesch. (A) Uma larva pluteus normal. (B)
Plutei menores, mas normais, cada uma delas se desenvolveu a partir de um blastômero de um
embrião dissecado de 4 células. (Todas as larvas estão desenhadas na mesma escala.) (De acordo
com Hörstadius e Wolsky, 1936.) Note que as larvas derivadas dessa maneira não são idênticas,
apesar de sua capacidade de gerar todos os tipos celulares necessários. Essas variações também
estão presentes nos ouriços-do-mar adultos formados dessa maneira (Marcus, 1979).
Hans Driesch: Desenvolvimento Regulativo
Ninguém mais do que Hans Driesch apreciava a abordagem experimental à embriologia.

A meta de Driesch era explicar o desenvolvimento em termos das leis da física e da
matemática. Sua investigação inicial era semelhante à de Roux. Os experimentos de
Roux eram, tecnicamente, estudos de defeitos, que respondiam à questão de como os
blastômeros remanescentes de um embrião se desenvolveriam quando uma parte de-
les era destruída. Driesch (1892) procurou estender essa pesquisa realizando experi-
mentos de isolamento. Blastômeros de ouriço-do-mar eram separados uns dos outros
por agitação vigorosa (ou, mais tarde, colocando-os em água do mar sem cálcio). Para
a surpresa de Driesch, cada um dos blastômeros de um embrião de 2 células se desen-
volveu em uma larva completa. Analogamente, quando Driesch separou os blastômeros
de embriões de 4 e 8 células, algumas das células produziram larvas plutei inteiras
(Figura 15.3). Esse era um resultado drasticamente diferente daquele previsto por
Weismann e Roux. Em lugar de se autodiferenciar como sua futura parte embrionária,
cada blastômero podia regular seu desenvolvimento de modo a produzir um organis-
mo completo. Essa era a primeira situação experimentalmente observável do desenvol-
vimento regulativo.
O desenvolvimento regulativo também foi demonstrado em outro experimento de
Driesch. Em ovos de ouriço-do-mar, os primeiros dois planos de clivagem são meridi-
onais passando pelos pólos animal e vegetal, enquanto que a terceira divisão é equa-
torial, dividindo o embrião em quatro células superiores e quatro inferiores (veja Figu-
ra 5.3). Driesch (1893) mudou a direção da terceira clivagem comprimindo suavemente
os embriões precoces entre duas placas de vidro, por conseguinte, fazendo com que
a terceira divisão fosse meridional tal como as duas clivagens precedentes. Após a
diminuição da pressão, a quarta divisão foi equatorial. Esse procedimento relocou os
núcleos, de modo que um núcleo normalmente localizado na região destinada a formar
o endoderma estivesse agora na região ectodérmica presuntiva. Alguns núcleos que
8 células Vista 16 células 8 células Vista 16 células

superior superior
Vista lateral
Placa de vidro
Vista lateral
(A) CLIVAGEM NORMAL (B) CLIVAGEM SOB PRESSÃO
Figura 15.4
Experimento de Driesch com placas de pressão para alterar a distribuição dos núcleos. (A)
Clivagem normal de embriões de ouriço-do-mar com 8 a 16 células, com vistas do pólo animal
(seqüência superior) e lateral (seqüência inferior). (B) Planos de clivagem anormal formados
sob pressão, como observados do pólo animal e lateralmente. (De acordo com Huxley e
deBeer, 1934.)
normalmente produziriam estruturas dorsais agora eram encontrados em células ven-

trais (Figura 15.4). Se a segregação dos determinantes nucleares tivesse ocorrido
(como havia sido proposto por Wiesmann e Roux), o embrião resultante deveria estar
estranhamente desorganizado. Entretanto, Driesch obteve larvas normais desses em-
briões. Ele concluiu que “A posição relativa de um blastômero dentro do conjunto
provavelmente definirá de um modo geral o que com ele originará”.
As conseqüências desses experimentos foram monumentais para a embriologia e
pessoalmente para Driesch. Primeiro, Driesch havia demonstrado que a “potência
prospectiva” de um blastômero isolado (aqueles tipos de células que ele tinha a pos-
sibilidade de formar) é maior do que seu “destino prospectivo” (os tipos de células
que normalmente originaria no curso inalterado do seu desenvolvimento). De acordo
com Weismann e Roux, a potência prospectiva e o destino prospectivo de um blastô-
mero deveriam ser idênticos. Segundo, Driesch concluiu que o embrião do ouriço-do-
mar era um “sistema eqüipotencial harmonioso”, porque todas essas partes potencial-
mente independentes funcionavam juntas para formar um único organismo. Terceiro,
ele concluiu que o destino de um núcleo dependia unicamente da sua localização
dentro do embrião. Driesch (1894) hipotetizou uma série de eventos onde o desenvol-
vimento prosseguia por interações do núcleo e do citoplasma:
Como contém um núcleo, cada célula carrega durante a ontogênese a totalida-

de dos primórdios; como ela contém um corpo celular citoplasmático específico,
está especificamente apta a responder somente a efeitos específicos... Então quan-
do o material nuclear é ativado, sob seu controle, o citoplasma de uma célula
que a princípio havia influenciado o núcleo é por sua vez modificado, e então
está estabelecida a base para um novo processo elementar, o qual não é somente
o resultado mas também a causa.
Esse surpreendente conceito moderno de interação núcleo-citoplasma e equivalência

nuclear, por fim, fez Driesch abandonar a ciência. Ele não podia mais imaginar o em-
brião como uma máquina física, porque esse podia ser subdividido em partes, cada
uma capaz de reformar o organismo todo. Em outras palavras, Driesch passou a acre-
ditar que o desenvolvimento não podia ser explicado por forças físicas. Ele foi levado
Tabela 12.2
151 Procedimentos
Estabilização de
experimentais
RNAs mensageiros
e resultados
específicos
de Roux
por e
hormônios
Driesch
Interpretação em relação
Pesquisador Organismo Tipo de experimento Conclusão à potência e destino
Roux (1888) Rã (Rana fusca) Defeito Desenvolvimento em Potência prospectiva

mosaico (autônomo) igual ao destino prospectivo
Driesch (1892) Ouriço-do-mar Isolamento Desenvolvimento regulativo Potência prospectiva é maior
(Echinus (condicional) que o destino prospectivo
microtuberculatus)
Dreisch (1893) Ouriço-do-mar Recombinação Desenvolvimento Potência prospectiva é maior
(Echinus e regulativo (condicional) que o destino prospectivo
Paracentrotus)
a invocar uma força vital, entelechy (força dirigida por uma meta interna), para explicar
como prosseguia o desenvolvimento. Essencialmente, ele acreditava que o embrião
era imbuído de uma psique interna e sabedoria para conseguir suas metas, apesar dos
obstáculos colocados no seu caminho por embriologistas. Incapaz de explicar seus
resultados pela Física de sua época, Driesch renunciou ao estudo da fisiologia do
desenvolvimento e se tornou um professor de filosofia, proclamando o vitalismo até
sua morte em 1941. Outros, especialmente Oscar Hertwig (1894), puderam incorporar
os experimentos de Driesch em uma embriologia experimental mais sofisticada.*
As diferenças entre os experimentos de Roux e os de Driesch estão resumidas na
Tabela 15.1. A diferença entre experimentos de isolamento e de defeitos e a importância
das interações fornecidas pelos blastômeros destruídos foi enfatizada em 1910, quan-
do J. F. McClendon mostrou que blastômeros isolados de rã se comportam exatamente
como células isoladas de ouriço-do-mar. Portanto, o desenvolvimento em mosaico
dos primeiros dois blastômeros da rã no estudo de Roux foi um artefato do experimen-
to de defeito. Alguma coisa dentro do blastômero morto ou sobre ele ainda informava
às células vivas que ele existia. Nós já vimos que blastômeros precoces de mamíferos
têm um desenvolvimento do tipo regulativo. Como discutimos no Capítulo 5, cada
blastômero isolado de uma massa de células internas do camundongo é capaz de gerar
um animal inteiro e fértil. A habilidade de dois ou mais embriões precoces de camun-
dongo se fundirem em um embrião normal (veja Figura 5.28) e o fenômeno de gêmeos
idênticos (veja Figura 5.27) também atestam a habilidade regulativa dos blastômeros
de mamíferos. Portanto, mesmo que Weismann e Roux tenham sido pioneiros no estu-
do da fisiologia do desenvolvimento, sua proposição que a diferenciação é causada
pela segregação de determinantes nucleares logo se mostrou incorreta.
*Esses experimentos reforçaram dentro da embriologia um tipo de filosofia mecanística cha-

mada organicismo holístico. Essa filosofia se refere aos conceitos que (1) as propriedades do todo
não podem ser previstas unicamente a partir das propriedades das partes componentes, e (2) as
propriedades das partes são informadas pela sua relação ao todo. Como uma analogia, o significado
de uma sentença obviamente depende do significado de suas partes componentes, as palavras.
Entretanto, o significado de cada palavra depende da sentença toda. Na sentença “Os líderes do
partido estavam divididos no palanque”, o significado possível de cada substantivo e verbo é limita-
do pelo significado da sentença toda e pelas relações com outras palavras dentro da sentença.
Similarmente, uma célula no embrião desenvolve seu fenótipo dependendo de suas interações dentro
do embrião inteiro. O conceito materialista oposto é o reducionismo, que mantém que as proprie-
dades do todo podem ser conhecidas se todas as propriedades das partes forem conhecidas. Tradici-
onalmente, a embriologia tem apoiado o organicismo holístico, enquanto que a genética tem se
caracterizado como sendo uma disciplina reducionista (Haraway, 1976; Roll-Hansen, 1978; Allen,
1985; Tauber e Sarkar, 1992; Gilbert e Faber, 1996). Driesch se tornou um conhecido opositor do
Nazismo, e foi um dos primeiros professores não judeus a se aposentar forçadamente quando Hitler
assumiu o poder (Harrington, 1996).
Sven Hörstadius: Potência e gradientes em oócitos
Mas Driesch também não estava totalmente correto. Como vimos no capítulo anterior,
existem numerosos animais que desenvolvem-se principalmente como um mosaico de
partes autodiferenciadas. Mais importante, no entanto, é que mesmo o embrião do
ouriço-do-mar não é uma coleção de células completamente eqüipotenciais. Em uma
série de experimentos realizados entre 1928 e 1935 o biologista sueco Sven Hörstadius
separou, com finas agulhas de vidro, várias camadas de embriões precoces de ouriço-
do-mar, e observou seu desenvolvimento subseqüente (Hörstadius, 1928, 1939). Quan-
do o embrião de 8 células foi dividido meridionalmente através do pólo animal ao
vegetal, as duas metades produziram larvas plutei, exatamente como Driesch havia
previsto. Mas quando embriões no mesmo estágio foram divididos equatorialmente
(separando os pólos animal e vegetal), nenhuma das partes se desenvolveu em uma
larva completa (Figura 15.5). Em lugar disso, a metade animal se tornou uma bola vazia
de células epidérmicas ciliadas (chamada uma dauerblástula), e a metade vegetal se
desenvolveu em um embrião ligeiramente anormal com um intestino expandido.
Hörstadius conseguiu duplicar esses resultados cortando pela metade óvulos não
fertilizados de ouriço-do-mar e fertilizando as metades separadamente. No ouriço-do-
mar, os fragmentos dos ovos (merogônias) podem se dividir e se desenvolver mesmo
tendo somente um núcleo haplóide. Se o espermatozóide penetrar na metade que não
tem o núcleo haplóide do óvulo, a merogônia ainda se desenvolverá (Figura 15.6).
Quando o óvulo foi partido meridionalmente, embriões normais se formaram das duas
metades do óvulo. Entretanto, quando o oócito foi cortado equatorialmente, a fertiliza-
ção produziu uma bola animal ciliada ou um embrião com um intestino expandido a
partir do pólo vegetal. Portanto, mesmo em embriões do ouriço-do-mar parece haver
certo grau de mosaicismo, pelo menos ao longo do eixo animal-vegetal. Isso foi confir-
mado por Maruyama e colaboradores (1985) que, analogamente, dividiram
meridionalmente ou equatorialmente óvulos não fertilizados de ouriço-do-mar. Eles
observaram que ao separar a metade animal da metade vegetal, somente a metade
vegetal fertilizada era capaz de formar micrômeros e gastrular. Portanto, os determinan-
tes que permitem a formação de micrômeros e a gastrulação parecem estar localizados
na porção vegetal do óvulo. [regul1.html]
(A) (B)
Pólo animal Pólo animal
Agulha
de vidro
Pólo vegetal Pólo vegetal
Figura 15.5
Assimetria precoce no embrião de ouriço-do-
mar. (A) Quando os 4 blastômeros do pólo
animal são separados dos quatro blastômeros
Cílios do pólo vegetal e é permitido que cada metade
se desenvolva, as células animais formam uma
dauerblástula ciliada e as células vegetativas
formam uma larva com o intestino expandido.
(B) Quando o embrião de 8 células é dividido
de modo que cada metade contenha células ani-
Dauerblástula Larva Larva Larva (pequena, mais e vegetativas, desenvolvem-se larvas pe-
(blástula permanente) (levemente anormal) (pequena, mas normal) mas normal) quenas com aparência normal.
Figura 15.6 (A) Pólo (B) Pólo

Assimetria no ovo de ouriço-do-mar. (A) Quan- animal animal
do Hörstadius dividiu o ovo do ouriço-do-mar
meridionalmente, de modo que ambas mero-
gônias contivessem citoplasma vegetal e ani-
mal, se desenvolveram pequenas plutei com
aparência normal. (B) Quando o óvulo do ou-
riço-do-mar foi dividido em metades animal e
vegetal (merogônias) e as metades foram ferti- Pólo
Pólo vegetal
lizadas por espermatozóides, a metade animal vegetal
se desenvolveu em uma dauerblástula ciliada, e
a metade vegetal produziu uma pluteus com
um intestino expandido.
Merogônias Merogônias
Fertilização Fertilização
Larva Larva Dauerblástula Larva

(pequena, (pequena, (blástula anormal) (quase normal)
mas normal) mas normal)
REGULAÇÃO DO DESTINO CELULAR EM EMBRIÕES DE CLIVAGEM TARDIA.

Essas observações levaram Hörstadius a realizar algumas das experiências mais exci-
tantes da história da embriologia. Primeiro, Hörstadius (1935) acompanhou o desen-
volvimento normal de cada uma das 6 camadas de células do embrião de ouriço-do-
mar com 64 células. Como mostrado na Figura 15.7A, as células animais e a primeira
camada vegetativa normalmente produzem o ectoderma; a segunda camada vegetativa
dá origem ao endoderma e parte do mesoderma larval; e os micrômeros geram o esque-
leto mesodérmico.
Em seguida, Hörstadius removeu a membrana de fertilização dos embriões de 64
células, separou as camadas com finas agulhas de vidro e as recombinou de várias
maneiras. O hemisfério animal isolado se tornou uma bola de células ectodérmicas
ciliadas (Figura 15.7B). Essa dauerbástula ciliada foi chamada de “animalizada”. Quan-
do Hörstadius recombinou um hemisfério animal isolado com a camada veg1 (Figura
15.7C), a larva resultante estava menos animalizada. O desenvolvimento ciliar foi su-
primido, e foi formada uma porção do intestino. Entretanto, quando o hemisfério ani-
mal foi combinado com a camada veg2 (Figura 15.7D), desenvolveu-se uma larva pluteus
normal. Nessa combinação, as células veg2, que normalmente formam somente o
arquêntero e seus derivados, estão agora formando também as estruturas esqueléticas.
Analogamente, quando a metade animal foi combinada com somente os micrômeros
(Figura 15.7E), uma pequena pluteus normal foi formada, mas nesse caso o endoderma
foi completamente derivado das células animais. Nesse caso, o intestino foi formado
por células que normalmente teriam dado origem ao ectoderma ciliado. Esses experi-
mentos mostraram que as células animais têm potencial genético para se tornarem
células do intestino mesmo no estágio de 64 células.
Formação de um organismo integrado:

Restringindo a potência das células vizinhas
Driesch se referiu ao embrião como um “sistema harmônico eqüipotencial” porque

cada uma das células que o compõem abdica da maior parte de seu potencial para fazer
parte de um único organismo completo. Cada célula poderia sozinha se tornar um
(A) Desenvolvimento normal Figura 15.7

Demonstração da regulação em ouriço-do-mar
Hemisfério por Hörstadius. (A) Destino de cada camada
animal de células do embrião de ouriço-do-mar de 64
células, desde a blástula até o estágio de larva
pluteus. As diferentes camadas de células es-
tão marcadas como na Figura 6.1. (B) Destino
da metade animal isolada. (C) Recombinação
Micrômeros da metade animal com a camada de células veg1.
Larva pluteus (D) Recombinação da metade animal com a
camada de células veg2. (E) Recombinação da
Dauerblástula metade animal mais os micrômeros. Em cada
(B) Somente metade animal caso, o destino original das células foi alterado
pelos novos vizinhos. (De acordo com
Hörstadius, 1939.)
Animalização
completa
(C) Metade animal e veg1
Animalização
(incompleta)
(D) Metade animal e veg2
Larva reconhecível;
mesoderma da
camada veg2
(E) Metade animal e micrômeros
Larva reconhecível;
endoderma das
camadas animais
animal completo, mas não o faz. O que fazia as células cooperarem em lugar de se
tornarem entidades autônomas? No caso dos caracóis e tunicados, a resposta era
simples. O citoplasma materno não permite que cada célula se torne autônoma; cada
célula pode somente se desenvolver em uma porção do embrião. Em ouriço-do-mar e
outros embriões que mostram regulação, a resposta é mais complexa.
Evidência recente sugere que o “sistema harmônico eqüipotencial” é causado por
eventos de indução negativa que restringem mutuamente o destino de células vizi-
Mesômeros nhas. Jon Henry e colegas no laboratório de Rudolf Raff (1989) mostraram que se
forem isolados pares de células do hemisfério animal pigmentado de um embrião de
ouriço-do-mar com 16 células, essas células podem originar componentes tanto
ectodérmicos como mesodérmicos. Entretanto, sua capacidade de formar mesoderma
é severamente restringida se elas são agregadas a outros pares do hemisfério animal
Macrômeros pigmentado. Assim, a presença de células vizinhas, mesmo sendo do mesmo tipo,
restringe a potência de ambos os parceiros. Ettensohn e McClay (1988) mostraram que
a potência é também restringida quando uma célula é combinada com suas vizinhas ao
longo do eixo animal-vegetal. Primeiro, eles demonstraram que o número de células
mesenquimatosas primárias parece ser fixo e pode ser regulado por variações nos
macrômeros. Se todas as 60 células mesenquimatosas primárias de Lytechinus
variegatus são removidas da gástrula precoce, um número igual de células
mesenquimatosas secundárias (do arquêntero que havia sido macrômeros do pólo
vegetal) se convertem em mesênquima primário e começam a formar espículas. Se são
Micrômeros
removidas 20 células mesenquimatosas primárias, cerca de 20 células mesenquimatosas
secundárias se tornam células mesenquimatosas primárias formadoras de espículas. E
Figura 15.8 assim por diante. Portanto, as células mesenquimatosas primárias têm uma influência
Sumário das induções inibitórias na blástula
restritiva, impedindo a formação de novas células mesenquimatosas primárias a partir
do ouriço-do-mar. Setas duplas ilustram as in-
terações mutuamente restritivas entre células
do arquêntero, havendo então a ocorrência de uma indução negativa. Não conhece-
adjacentes. (De acordo com Henry et al., 1989.) mos o mecanismo pelo qual as células mesenquimatosas primárias impedem que o
arquêntero forme o mesênquima primário e estabelecem um limite para o número de
tais células na blastocele.
Recombinando células de várias camadas, Khaner e Wilt (1990, 1991) observaram
que na maioria dos casos, a célula de uma camada restringe a habilidade de uma célula
de outra camada em expressar seus destinos potenciais (Figura 15.8). A exceção mais
importante - como mencionado acima- é a recombinação das células mesoméricas do
pólo animal com certos micrômeros do pólo vegetal para formar tecido intestinal dos
mesômeros. Entretanto, no desenvolvimento normal de ouriço-do-mar, essas células
nunca se associam entre si.
Regulação durante o desenvolvimento de anfíbios

Hans Spemann: Determinação progressiva das células embrionárias
Nas seções anteriores descrevemos a evidência do desenvolvimento regulativo.

Notamos que dois aspectos principais da regulação - primeiro, que um blastômero
isolado tem uma potência maior do que seu destino embrionário normal, e segundo,
que o destino de uma célula é determinado por interações entre células vizinhas-
sendo verdadeiro durante os estágios precoces da clivagem em ouriço-do-mar. Fi-
nalmente, entretanto, os blastômeros se tornam comprometidos a certos destinos.
Em 1918, Hans Spemann, da Universidade de Freiburg, descobriu que existia uma
situação similar no ovo da salamandra. Os experimentos pelos quais ele e seus
colegas analisaram esse fenômeno nos 20 anos seguintes formam a base de boa
parte de nosso conhecimento da fisiologia embrionária e deram o Prêmio Nobel a
Spemann em 1935.
Spemann, assim como Roux e Driesch, pretendia verificar a hipótese de Weismann
e por um método engenhoso, ele demonstrou que os blastômeros precoces da
salamandra aquática têm núcleos idênticos, cada um capaz de produzir uma larva
completa. Logo após a fertilização de um óvulo dessa salamandra, Spemann usou um
fio de cabelo de bebê para laçar o zigoto no plano da primeira clivagem. Ele então
produziu uma constrição parcial do ovo fazendo com que todas as divisões nucleares
acontecessem em um dos lados da constrição. Freqüentemente, até no estágio de 16
células, um núcleo escapava através da constrição para o lado não nucleado. Assim se
iniciava a clivagem também nesse lado, quando o laço foi apertado ainda mais até que
as duas metades estivessem completamente separadas. Larvas gêmeas se desenvol-
Ligadura
Estágio de 8 células Estágio de 16 células 140 dias

Figura 15.9
Demonstração da eqüivalência nuclear na
clivagem da salamandra aquática feita por Spe-
veram, uma ligeiramente mais velha do que a outra (Figura 15.9). Spemann concluiu mann. (A) Quando o ovo fertilizado da sala-
desse resultado que os núcleos precoces de anfíbios são geneticamente idênticos e mandra Triturus taeniatus foi constringido por
que cada célula é capaz de originar um organismo completo. Nesse respeito, os uma ligadura, o núcleo foi restrito a uma meta-
blastômeros de anfíbios eram similares aqueles de ouriço-do-mar. de do embrião. A clivagem daquele lado do
Além do mais, quando Spemann realizou um experimento similar com uma constrição embrião atingiu o estágio de 8 células enquanto
ainda longitudinal, mas perpendicular ao plano da primeira clivagem (separando as o outro lado permaneceu não dividido. (B) No
futuras regiões dorsal e ventral e não os lados direito e esquerdo), ele obteve um estágio de 16 células, um único núcleo pene-
resultado completamente diferente. Os núcleos continuaram a se dividir em ambos os trou na parte não dividida, e a ligadura foi
constringida de modo a completar a separação
lados da constrição, mas somente um lado - o futuro lado dorsal do embrião- dava
das duas metades. (C) Após 140 dias, cada
origem a uma larva normal. O outro lado produzia um massa desorganizada de tecido metade tinha se desenvolvido em um embrião
com células ventrais, que Spemann chamou de Bauchstück - porção ventral. Essa normal. (De acordo com Spemann, 1938.)
massa de tecido era uma bola de células epidérmicas (ectoderma) contendo sangue e
mesênquima (mesoderma) e células de intestino (endoderma), mas nenhuma estrutura
dorsal tal como sistema nervoso, notocorda ou somitos (Figura 15.10).
Porque deveriam esses dois experimentos dar resultados diferentes? Poderia ser
que quando o ovo é dividido perpendicularmente ao plano da primeira clivagem,
algumas substâncias citoplasmáticas não são igualmente divididas entre as duas
(A) (B)
Primeira clivagem
Crescente
Cinzento
Separação dos
blastômeros e
desenvolvimento
Figura 15.10
Assimetria no ovo de anfíbio. (A) Quando o plano da primeira clivagem divide o
ovo em dois blastômeros, de modo que cada um receba uma metade do crescente
cinzento, cada célula separada experimentalmente se desenvolve em um embrião
“Porção
normal. (B) Quando somente um dos dois blastômeros recebe todo o crescente
ventral”
cinzento, ele sozinho forma um embrião normal. O outro pedaço não tem estru-
Desenvolvimento Desenvolvimento Desenvolvimento turas dorsais e permanece como uma massa desorganizada de tecidos. (De
Normal Normal Normal acordo com Spemann, 1938.)
metades? Felizmente, o ovo da salamandra era um bom lugar para procurar respos-
tas. Como foi visto nos Capítulos 4 e 6, existem movimentos dramáticos do citoplas-
ma cortical após a fertilização de ovos de anfíbios, e em alguns deles esses movi-
mentos expõem uma área cinzenta do citoplasma em forma de um crescente na região
diretamente oposta ao ponto de entrada do espermatozóide. Além disso, o primeiro
plano de clivagem normalmente divide essa região em partes iguais, dando origem a
dois blastômeros. Se essas células forem separadas, duas larvas completas se de-
senvolvem. Entretanto, se esse plano de clivagem for anormal (em um raro evento
natural ou em um experimento onde o investigador faz uma constrição com um fio de
cabelo, perpendicularmente ao plano normal de clivagem) o material do crescente
cinzento passa para somente um dos dois blastômeros. Spemann observou que
quando esses dois blastômeros são separados, somente aquele contendo o cres-
cente cinzento se desenvolve normalmente.
Parece, então, que algo contido na região do crescente cinzento é essencial para o
desenvolvimento embrionário adequado. Mas como isso funciona? Qual o seu papel
no desenvolvimento normal? A pista mais importante veio do mapa de destino dessa
área do ovo, ao mostrar que a região do crescente cinzento origina as células que
iniciam a gastrulação. Essas células formam o lábio dorsal do blastóporo. Como visto
no Capítulo 6, as células do lábio dorsal do blastóporo são de certa maneira compro-
metidas a invaginar para dentro da blástula, iniciando assim a gastrulação e a forma-
ção do arquêntero. Porque o desenvolvimento futuro do anfíbio depende da interação
das células rearranjadas durante a gastrulação, Spemann especulou que a importância
do crescente cinzento era devida à sua habilidade em iniciar a gastrulação, onde
ocorriam mudanças cruciais para o desenvolvimento.
Em 1918, Spemann demonstrou que enormes modificações na potência celular de
fato ocorriam durante a gastrulação. Ele verificou que as células da gástrula precoce
não estavam comprometidas com respeito à diferenciação final, mas que o destino das
células da gástrula tardia eram fixos. Spemann trocou os tecidos de gástrulas preco-
ces de duas espécies pigmentadas de salamandra aquática (Figura 15.11). Quando a
região das células epidérmicas prospectivas foi transplantada para uma área de forma-
ção da placa neural, as células transplantadas deram origem ao tecido neural. Quando
células da prospectiva placa neural foram transplantadas à região destinada a se
tornar pele do ventre, as células se tornaram epidérmicas (Tabela 15.2). Portanto, essas
células da gástrula precoce ainda não estavam comprometidas a um tipo específico de
diferenciação. Suas potências prospectivas eram ainda maiores que seus destinos
prospectivos. Essas células exibem desenvolvimento condicional (regulativo ou
Tabela 15.2 Resultados com transplantes de tecidos durante os estágios

de gástrulas precoce e tardia na salamandra aquática
Diferenciação do
Região doadora Região hospedeira tecido doador Conclusão
GÁSTRULA PRECOCE
Neurônios prospectivos Epiderme Epiderme Desenvolvimento
prospectiva dependente (condicional)
Epiderme prospectiva Neurônios Neurônios Desenvolvimento

prospectivos dependente (condicional)
GÁSTRULA TARDIA
Neurônios prospectivos Epiderme Neurônios Desenvolvimento
prospectiva (determinado)
independente (autônomo)
Epiderme prospectiva Neurônios Epiderme Desenvolvimento

(determinada) prospectivos independente (autônomo)
(A) Ectoderma Epiderme Figura 15.11

neural presuntivo presuntiva Determinação do ectoderma durante a gastru-
lação da salamandra aquática. O ectoderma
Placa neural neural presuntivo de um embrião de salaman-
dra é transplantado a uma região de outro
embrião que normalmente se torna epiderme.
(A) Quando a transferência é feita na gástrula
TRANSPLANTE EM precoce, o tecido neural presuntivo se desen-
GÁSTRULA PRECOCE volve em epiderme e se observa somente uma
placa neural. (B) Quando o mesmo experi-
Forma-se
a epiderme mento é feito em tecidos da gástrula tardia, as
Ectoderma células neurais presuntivas formam tecido
(B) neural presuntivo Epiderme neural, causando a formação de duas regiões
presuntiva Placa neurais no hospedeiro. (De acordo com Saxén
neural e Toivonen, 1962.)
TRANSPLANTE EM
GÁSTRULA TARDIA
Forma-se a placa
neural secundária
dependente) porque seu destino final depende da sua localização no embrião. Entre-
tanto, quando os mesmos experimentos de transplantes heteroplásticos (entre espéci-
es) foram feitos entre gástrulas tardias, Spemann obteve resultados completamente
diferentes. Em lugar de regular sua diferenciação de acordo com sua nova localização
as células transplantadas exibiram desenvolvimento autônomo (ou independente, ou
em mosaico). Seus destinos prospectivos estavam determinados e as células se de-
senvolveram independentemente de sua nova localização embrionária. Especifica-
mente, células neurais prospectivas agora se desenvolviam em tecido cerebral mesmo
quando localizadas na região prospectiva da epiderme, e epiderme prospectiva forma-
va epiderme mesmo na região do prospectivo tubo neural. Durante o intervalo de
tempo entre a gastrulação precoce e a tardia, as células ficavam restritas às suas vias
de diferenciação. Essas células são consideradas como determinadas: elas não podem
mais regular sua diferenciação em outros tipos de células. Deve ser notado que os
critérios para a determinação são puramente operacionais. Não ocorrem modificações
óbvias nas células e não se detecta qualquer diferenciação. A base molecular da
determinação permanece como uma das principais incógnitas do desenvolvimento.
Hans Spemann e Hilde Mangold: Indução embrionária primária
Os mais espetaculares experimentos com transplantes foram publicados por Hans

Spemann e Hilde Mangold em 1924*. Eles mostraram que ao se colocar tecidos em
novos locais, o lábio dorsal do blastóporo é a única região autodiferenciável da gástrula.
Quando o tecido do lábio dorsal do blastóporo de uma gástrula precoce foi transplan-
tado para o ectoderma ventral de outra gástrula, ele não só continuou a ser o lábio do
blastóporo, como também iniciou a gastrulação e a embriogênese no tecido vizinho.
Nesses experimentos, Spemann e Mangold usaram embriões de duas espécies de
* Hilde Proescholdt Mangold morreu em um trágico acidente quando seu aquecedor a gasolina
explodiu. Na época, ela tinha 26 anos e seu trabalho estava sendo publicado. Sua tese de doutoramento
foi uma das poucas teses em biologia que resultaram diretamente na concessão do Prêmio Nobel.
Para maiores informações sobre Hilde Mangold e sua época veja Hamburger (1984) e Fässler e
Sander (1996).
(A) Blastocele
Notocorda
presuntiva
Somitos presuntivos
Lábio dorsal Endoderma Epiderme Invaginação

do blastóporo presuntivo presuntiva primária
Estruturas
(B) secundárias induzidas Estruturas primárias
Somito Lúmen do intestino
Tubo neural Notocorda

Notocorda Somito
Lúmen do Endoderma
intestino
Tubo neural
Invaginação Invaginação
secundária primária
(C)
Figura 15.12
Autodiferenciação do tecido do lábio dorsal do blastóporo. (A) O lábio dorsal do blastóporo da
gástrula precoce é transplantado em outra gástrula precoce na região que normalmente se torna
epiderme ventral. (B) O tecido se invagina e forma um segundo arquêntero e depois um segundo
eixo embrionário. Tanto o tecido do doador como o do hospedeiro é visto no tubo neural,
notocorda e somitos. (C) Finalmente, se forma um segundo embrião ligado ao hospedeiro. Esta
ilustração e a Prancha 4 mostram o experimento onde o lábio dorsal do blastóporo pigmentado de
T. taeniatus foi implantado em uma gástrula precoce de um T. cristatus hospedeiro.
salamandra aquática com pigmentação diferente: Triturus taeniatus com pigmentação

escura e Triturus cristatus sem pigmentação. Ao preparar esses transplantes, Spe-
mann e Mangold podiam identificar o tecido hospedeiro e o doador baseados na
coloração. O lábio dorsal do blastóporo (o tecido da região marginal dorsal) de gástrulas
precoces de T. cristatus foram removidos e implantados em regiões da gástrula preco-
ce de T. taeniatus destinadas a se tornar epiderme ventral (Figura 15.12). Diferente-
mente de outros tecidos da gástrula jovem, que se desenvolveram de acordo com sua
nova localização, o lábio do blastóporo doado não se tornou epiderme ventral. Ao
contrário, ele invaginou como o faria normalmente (mostrando autodeterminação) e
desapareceu sob as células vegetativas. O tecido não pigmentado doador continuou
sua autodiferenciação em cordomesoderma e outras estruturas mesodérmicas que
constituíam o destino original do tecido do blastóporo. Com a formação do eixo, as
células do hospedeiro começaram a participar da formação do novo embrião, tornan-
do-se órgãos que normalmente nunca formariam. Assim, podia-se ver somitos conten-
do tanto tecido incolor (doador) como pigmentado (hospedeiro). Mais espetacular
(A) (B) Tubo neural Embrião

Transplante do nódulo induzido hospedeiro
de Hensen do pato
Embrião de pato Embrião de pinto
Figura 15.13
Indução de um novo eixo embrionário pelo nódulo de Hensen. (A) O tecido do nódulo de Hensen
é removido de um embrião de pato e implantado em um embrião de pinto hospedeiro. (B) Um
tubo neural accessório é induzido no local do enxerto. (De acordo com Waddington, 1933.)
ainda, era que as células do lábio dorsal do blastóporo podiam interagir com os teci-
dos do hospedeiro para formar uma placa neural completa a partir do ectoderma do
hospedeiro. Por fim, formou-se um embrião secundário, face a face com o seu hospe-
deiro (veja Figura 15.12; Prancha 4). Essas experiências, tecnicamente difíceis, foram
repetidas recentemente com marcadores nucleares e os resultados de Spemann e
Mangold foram confirmados (Gimlich e Cook, 1983; Smith e Slack, 1983; Jacobson,
1984; Recanzone e Harris, 1985).* [regul2.html]
Spemann (1938) se referiu às células do lábio dorsal do blastóporo como o
organizador porque (1) elas induziam os tecidos ventrais do hospedeiro a mudar seus
destinos para formar um tubo neural e tecido mesodérmico dorsal e (2) elas organiza-
vam esses tecidos do doador e do hospedeiro em um embrião secundário com nítidos
eixos ântero-posterior e dorsoventral. Ele propôs que durante o desenvolvimento
normal, essas células organizariam o ectoderma dorsal em um tubo neural e transfor-
mariam o mesoderma dos flancos no eixo do corpo. Sabe-se agora (graças principal-
mente a Spemann e seus alunos) que a interação entre o cordomesoderma e o ectoder-
ma não é suficiente para “organizar” o embrião completo. Em lugar disso, essa intera-
ção inicia uma série de eventos indutivos seqüenciais. O processo pelo qual uma
região embrionária interage com uma segunda região para influenciar a sua diferenci-
ação ou comportamento (da segunda região) é chamado de indução. Como existem
numerosas induções durante o desenvolvimento embrionário, essa indução principal
onde as células do lábio do blastóporo induzem o eixo dorsal e o tubo neural é tradici-
onalmente chamada de indução embrionária primária.**
Sabemos também que o lábio dorsal do blastóporo é ativo na organização de
embriões secundários em Amphioxus, ciclóstomos e em uma variedade de anfíbios.
Em aves e mamíferos, o organizador se origina na foice de Koller (margem posterior do
embrião), e o nódulo de Hensen age como o lábio dorsal do blastóporo. Células
migrando através do nódulo de Hensen se tornam o endoderma e o cordomesoderma
da cabeça, enquanto que células migrando através de outras partes da linha primitiva
se tornam células mesodérmicas laterais e ventrais. Quando o nódulo de Hensen de
uma gástrula jovem é transplantado em um epiblasto de outra gástrula jovem ele induz
a formação de outro eixo secundário completo (Figura 15.13; Waddington, 1933; Storey
et al., 1992; Khaner, 1995).
*O laboratórios de Spemann e de seus alunos usavam embriões de salamandra para seus

experimentos. Foi demonstrado que o ectoderma de rã é muito mais difícil de ser induzido do que
o desses urodeles.
** Esse termo clássico tem sido uma fonte de confusão, porque a indução do tubo neural pela
notocorda não é mais considerada como o primeiro processo indutivo no embrião. Logo discutire-
mos os eventos indutivos que precedem essa indução “primária”.
O centro de Nieuwkoop
Apesar do considerável volume de pesquisa realizada com embriões de anfíbios,
estamos apenas começando a conhecer os mecanismos básicos da indução embrioná-
ria primária. Na última década, numerosos laboratórios focalizaram seus esforços para
explicar a indução embrionária em um anfíbio –Xenopus laevis– e existe um consenso
em relação às linhas gerais da indução embrionária primária nesse organismo.
Os dados indicam uma orquestração da indução que tem pelo menos quatro
estágios. O primeiro estágio da indução se dá na fertilização. O óvulo não fertiliza-
do é radialmente simétrico ao redor do eixo animal-vegetal. A entrada do esperma-
tozóide quebra essa simetria causando a rotação do citoplasma interno do ovo em
relação ao córtex (veja Capítulo 4). Essa assimetria especifica o eixo dorsoventral
pela mistura dos citoplasmas animal e vegetal nas células vegetativas que se
formam em oposição ao ponto de entrada do espermatozóide. Parece que a mistura
dos citoplasmas ativa determinantes da dorsalização nessas células vegetativas.
Essas células vegetativas dorsalizadas são chamadas centro de Nieuwkoop. No
segundo estágio, os descendentes dessas células vegetativas induzem as células
acima delas a se tornarem o organizador de Spemann-Mangold. As outras células
vegetativas induzem as células marginais acima delas a se tornarem os mesodermas
lateral e ventral. Portanto, existe uma indução antes da “indução primária”. No
terceiro estágio, o organizador converte o mesoderma vizinho em mesoderma dor-
sal, e instrui o ectoderma dorsal a se tornar tecido neural. O quarto estágio envol-
ve a caracterização regional do tecido neural induzido (cérebro anterior, cérebro
posterior, medula espinhal, etc.).
Fragmentos de blástula dissecada dão A formação do centro de Nieuwkoop e a polaridade mesodérmica

origem a diferentes tecidos em cultura:
O endoderma é capaz de instruir as células acima dele a se tornarem o mesoderma.
Células do Além disso, a polaridade do endoderma é transferida às células mesodérmicas. Pieter
hemisfério Nieuwkoop (1969, 1973, 1977) demonstrou a importância das células vegetativas
animal
Ectoderma (endoderma presuntivo) na indução do mesoderma. Ele removeu as células equatori-
pigmentado
ais da blástula e mostrou que nem o hemisfério vegetal nem o animal produziram tecido
Células
equatoriais
Mesoderma mesodérmico. Entretanto, quando os dois hemisférios foram recombinados, as células
do hemisfério animal foram induzidas a formar estruturas mesodérmicas tais como a
Células Endoderma
vegetativas notocorda, músculos, células renais e células do sangue (Figura 15.14). A polaridade
dessa indução (se a região das células animais formava notocorda ou músculos, etc.)
Fragmentos animais e vegetais dão mesoderma
dependia da polaridade dorsoventral do fragmento endodérmico. Esse conjunto de
Hemisfério animal fatores capazes de induzir o mesoderma dorsal tem sido chamado de centro de
pigmentado (ectoderma
presuntivo) é convertido a Nieuwkoop (Gehart et al.,1989), e em Xenopus laevis, ele se localiza nas células
Mesoderma vegetativas mais dorsais da blástula ( Figura 15.15). [regul5.html]
por fatores liberados As células vegetativas ventrais e laterais também têm papéis na especificação
das células vegetativas do mesoderma. Enquanto as células vegetativas ventrais e laterais especificam os
tipos intermediário (músculo e mesênquima) e ventral (mesênquima, sangue, rim
Figura 15.14 pronéfrico) do mesoderma, as células vegetativas mais dorsais especificam os
Sumário dos experimentos de Nieuwkoop e os componentes mesodérmicos axiais (notocorda e somitos; Figura 15.16). Parece
de Nakamura e Takasaki, mostrando indução haver dois sinais: (1) um geral de todas as células vegetativas, “vamos produzir
mesodérmica pelo endoderma vegetativo. Cé- mesoderma” e (2) um sinal mais específico “essas células acima de nós são o
lulas isoladas do hemisfério animal pigmentado mesoderma dorsal (organizador)”, vindo das células vegetativas mais dorsais (D1).
se tornam uma massa de epiderme ciliada; cé- Dale e Slack (1987) forneceram evidência para um terceiro sinal indutivo, vindo
lulas vegetativas isoladas geram tecido seme-
das células organizadoras (aquelas células marginais diretamente acima do centro
lhante a intestino, e células isoladas equatoriais
(zona marginal) se tornam mesoderma. Se as
de Nieukoop) que “dorsalizam” as células mesodérmicas marginais adjacentes a
células do hemisfério animal pigmentado são elas. Quando as células marginais ventrais são isoladas, elas originam principal-
combinadas com células do hemisfério vege- mente os tecidos mesodérmicos ventrais. Entretanto, se elas são cultivadas adja-
tal, muitas das células do hemisfério animal centes às células marginais dorsais (ou seja, o organizador), elas geram tecido
pigmentado geram tecido mesodérmico. mesodérmico intermediário. Um quarto sinal parece vir da região ventral que se
opõe aos sinais do organizador. Assim, existe evidência para uma especificação
do mesoderma em três etapas (Figura 15.17): (1) a indução da atividade do
organizador pelas células vegetativas mais dorsais (o centro de Nieuwkoop), (2) a Organizador
indução do mesoderma ventral pelas outras células vegetativas e (3) a dorsalização
das células marginais laterais adjacentes às células marginais dorsais para produ-
zir o mesoderma intermediário enquanto que outras células marginais seguem des-
tinos ventrais. Na década passada foram feitas tentativas para identificar as
interações moleculares que originam essa modelagem mesodérmica.
Sinais dorsais
A especificação da polaridade dorsoventral na fertilização (Vg1, Noggin,
activina, Wnt)
Sinais ventrais
Como vimos nos Capítulos 4 e 6, a especificação dorsoventral é consumada pela (FGF, BMP-4) Centro de
Nieuwkoop
rotação do citoplasma interno do ovo em relação ao córtex. Se essa rotação é inibida
por luz ultravioleta, o embrião não formará estruturas dorso-anteriores (Vincent e
Gerhart, 1987). Render e Elinson (1986) e Wakahara (1989) cortaram ovos em frag- Figura 15.15
Modelo para indução do mesoderma em Xeno-
mentos antes e depois dessa rotação. Se o ovo fosse cortado antes da rotação,
pus. Um sinal ventral (provavelmente FGF2
ambos os lados desenvolviam estruturas dorso-anteriores: cabeça, notocorda e ou BMP4) é liberado em toda a região vegetal
tubo neural. Se o corte era feito após a rotação, um fragmento desenvolvia a cabeça, do embrião. Isso induz as células marginais a
coração, e algumas estruturas mesodérmicas dorsais, enquanto o outro fragmento se tornarem mesoderma. BMP4 pode especifi-
se desenvolvia essencialmente em um Bauchstück, consistindo quase unicamente car as células marginais a se tornarem meso-
de células ventrais, tendo pouco ou nada de mesoderma dorsal e sem sistema nervo- derma posterior. No lado dorsal (fora do local
so. Sakai (1996) mostrou que se o citoplasma vegetativo do ovo fosse deletado de entrada do espermatozóide), um sinal (pro-
antes da rotação, não se formaria o eixo dorsal, e certos determinantes dorsais se vavelmente iniciado por Vg1 e propagado pe-
movem do córtex vegetativo para a zona marginal no futuro lado dorsal. Parece las proteínas activina, Noggin e Wnt) é libera-
do pelas células vegetativas do centro de
então, que essa rotação citoplasmática movimenta os determinantes que são
Nieuwkoop. Esse sinal dorsal induz a forma-
ativadores dorsais em direção ao futuro lado dorsal do ovo. ção do organizador de Spemann nas células da
zona marginal sobreposta ao centro. (De acor-
do com De Robertis et al., 1992.)
Porcentagem de induções totais

Dorsal Intermediária Ventral
Pólo
animal
Pólo
vegetal
Figura 15.16
Pólo Especificidade regional na indução do meso-
animal derma pela recombinação de células do em-
brião de Xenopus com 32 células. As células
do pólo animal de embriões de 32 células fo-
ram combinadas com blastômeros vegetativos
individuais. As células do pólo animal foram
Camada D marcadas com polímeros fluorescentes para
identificação de seus descendentes. As
induções resultantes dessas recombinações es-
Pólo tão resumidas à direita. (De acordo com Dale e
vegetal Slack, 1987.)
Blastocele Endoderma Blastocele Arquêntero Arquêntero

faríngeo
a
erm
tod
Ec
Mesoderma Mesoderma
ventral dorsal
Animal
Figura 15.17
Mesoderma
intermediária
Interações indutivas durante o desenvolvimento precoce de Xenopus. Durante a oogênese, o eixo
animal-vegetal se eleva. A fertilização causa rearranjos citoplasmáticos que subdividem a região
vegetal nas áreas dorso-vegetal (DV) e ventro-vegetal (VV). Durante a clivagem, a indução
mesodérmica ocorre de tal modo que a região DV induz a atividade do organizador (O) nas
células marginais dorsais acima dela, enquanto a VV induz as células acima para se tornarem
mesoderma ventral (M). Um sinal do organizador converte o mesoderma ventral próximo em
mesoderma lateral (M2, M3, M4). Durante a gastrulação, os mesodermas ventral e lateral vão
para os lados da gástrula (não mostrado), enquanto o mesoderma dorsal se expande e induz a
Gastrulação
polaridade nas células ectodérmicas. Isso faz com que as células ectodérmicas se tornem diferen-
tes regiões do tubo neural (N1, N2, N3, N4). C representa a glândula do cimento, a estrutura mais
anterior do girino. A polaridade do endoderma é assim transferida ao tecido neural. O ectoderma
não induzido se torna epiderme. (De acordo com Smith et al., 1985; Slack e Tannahill, 1992.)
Animal
Mesoderma
ventral
Dorsalização do
mesoderma ventral
Mesoderma Espermatozóide
dorsal (organizador)
Animal Animal
Mesoderma
ventral
Clivagem
Vegetal
Centro de Nieuwkoop
Indução do mesoderma por

células vegetativas
Oogênese
No estágio de 32 células, os determinantes dorso-anteriores estão contidos nos

blastômeros mais dorsais (D1) (Figura 6.20; Gimlich e Gehart, 1984; Gimlich, 1985,
1986). Essa localização foi confirmada por experimentos de recombinação (veja Figu-
ra 15.16). Dale and Slack (1987) recombinaram blastômeros vegetativos isolados de
um embrião de Xenopus de 32 células com a camada animal mais superior de um
embrião no mesmo estágio, marcado por fluorescência. A célula vegetativa mais
dorsal, como esperado, induziu as células do pólo animal a se tornarem mesoderma
dorsal. As células vegetativas remanescentes de modo geral induziam as células
animais a produzirem tecidos mesodérmicos intermediários ou ventrais. Portanto,
células vegetativas dorsais podem induzir células animais a se tornarem tecido
mesodérmico dorsal.
Deve ser notado que em Xenopus (e outros vertebrados), a formação do eixo
ântero-posterior se segue a formação do eixo dorsoventral. Uma vez estabelecida a
porção dorsal do embrião, o movimento do mesoderma involutivo estabelece o eixo
ântero-posterior. O mesoderma que migra inicialmente através do lábio dorsal do
blastóporo dá origem às estruturas anteriores; o mesoderma na margem ventral forma
as estruturas posteriores.
A base molecular da indução mesodérmica

Estabelecendo a regionalização dorsal:
o possível papel da β−catenina
A β−catenina é uma proteína multifuncional que pode funcionar como uma âncora
para as caderinas da membrana celular (Capítulo 3) ou como um fator de transcrição
nuclear. Em embriões de Xenopus, a rotação cortical da fertilização remove as β−
cateninas para a futura parte dorsal do ovo. A β−catenina continua a se acumular
preferencialmente no lado dorsal durante a clivagem precoce, e essa acumulação é
observada nos núcleos das células dorsais (Figura 15.18 A,B; Prancha 7E,F; Schneider
et al., 1996; Larabell et al., 1997). Essa região de acumulação de β−catenina original-
mente parece conter tanto o centro de Nieuwkoop como as regiões do organizador.
Durante as clivagens posteriores, as células com β−catenina podem se localizar espe-
cificamente no centro de Nieuwkoop (Heasman et al., 1994; Guger e Gumbiner, 1995).
A β−catenina é necessária para a formação do eixo dorsal, pois a depleção de
transcritos de β−catenina com oligonucleotídeos antisenso resulta na falta de estrutu-
ras dorsais (Heasman et al., 1994). Além disso, a injeção de β−catenina exógena no
lado ventral do embrião produz um eixo secundário (Funayama et al., 1995; Guger e
Gumbiner, 1995). A β−catenina é parte da via Wnt de transdução sinalizadora e é
negativamente regulada pela quinase 3 da síntese glicogênio (GSK-3; Capítulo 3).
GSK-3 também é crítica para a formação de eixo e GSK-3 ativada bloqueia a formação
de eixo quando adicionada ao ovo (Pierce e Kimelman, 1995; He et al., 1995; Yost et al.,
1996). Se o GSK-3 endógeno é eliminado por uma mutação negativa dominante nas
células ventrais do embrião precoce, um segundo eixo se forma (Figura 15.18C). Expe-
rimentos com marcação (Yost et al., 1996; Larabell et al., 1997) sugerem que a β−
catenina é inicialmente sintetizada (a partir de mensagens maternas) em todo o em-
brião, mas que é degradada pela fosforilação de GSK-3 especificamente nas células
ventrais. Não se conhece a causa dessas variações regionais na atividade de GSK-3.
Experimentalmente a GSK-3 endógena pode ser inibida pela adição de proteínas Wnt
ao ovo, e foi observado que essas Wnts induzem eixos secundários (McMahon e
Moon, 1989; Sokol et al., 1991). Mas Wnts podem não ser as reguladoras naturais de
GSK-3 no lado dorsal do embrião; mutações dominantes negativas de proteínas Wnt
e seus receptores não conseguem bloquear a formação do eixo normal (Hoppler et al.,
1996; Sokol, 1996). Atualmente estão sendo realizados estudos para verificar se a
rotação cortical em ovos de Xenopus de certa maneira regula a atividade de GSK-3 e se
existe um outro agente (além das proteínas Wnt) capaz de inativar GSK-3.
(A) (B) (C)
β-catenina ativada
Figura 15.18
(D) Papel da via das proteínas Wnt na especificação do eixo dorsoventral. (A,B) Translocação
dorsalmente por
rotação cortical diferencial da proteína β-catenina para os núcleos de blastômeros de Xenopus. (A) Lado dorsal
presuntivo de uma blástula de Xenopus corado para β-catenina mostra a localização do núcleo.
(B) Tal localização nuclear não é vista no lado ventral do mesmo embrião. (C) Formação do
eixo dorsal causado pela injeção de ambos os blastômeros de um embrião de Xenopus de 2
células com GSK-3β inativa dominante. O destino dorsal é ativamente suprimido pela GSK-
3β tipo selvagem. (D) Modelo irênico pelo qual o centro de Nieuwkoop (caracterizado pela
expressão do gene Siamois e a habilidade para induzir o mesoderma dorsal) é criado pelo
sinergismo da ativação dorsal da β-catenina e a ativação vegetal de Vg1. (A e B de Schneider
et al., 1996, fotografias cortesia de P. Hausen; C de Pierce e Kimelman, 1995, fotografia
cortesia de D. Kimelman.)
A β−catenina é um fator de transcrição do tipo HMG-box e pode ser uma proteína

de dobramento de DNA. Ela pode tornar células diferentes predispostas a respon-
der de maneiras diferentes após o início da expressão gênica na transição da blástula
intermediária. Uma vez dentro do núcleo das células vegetativas dorsais, ela ativa
Tradução, Expressão máxima
processamento de Siamois: centro determinados genes alvo, um deles sendo o gene Siamois que contém a seqüência
e difusão de Vg1 de Nieuwkoop homeobox. Esse gene é expresso no centro de Nieuwkoop imediatamente após a
transição da blástula intermediária. Se esse gene é expresso ectopicamente nas
células vegetativas ventrais, um eixo secundário emerge no antigo lado ventral do
embrião, e se a rotação cortical é impedida, a expressão de Siamois é eliminada
(Lemare et al., 1995; Brannon e Kimelman, 1996). Estudos recentes (Brannon e
Kimelman, 1996) sugerem que a expressão máxima de Siamois ocorre quando há
sinergismo entre GSK-3/β−catenina e um sinal TGF-β vegetalmente expresso. A ro-
tação cortical pode ativar as β−cateninas e permitir a expressão de Siamois na região
dorsal do embrião. Ao mesmo tempo, a tradução das mensagens localizadas
vegetalmente codificando um fator da família TGF-β pode produzir uma proteína que
permite uma melhor ativação da β−catenina nas células vegetativas do que nas
células animais (Figura 15.18D). Cui e colegas (1996) mostraram que esse membro da
família TGF-β é a proteína Vg1 madura, uma proteína expressa somente nas células
vegetativas. O resultado é que Siamois seria expresso nas células vegetativas mais
dorsais que constituem o centro de Nieuwkoop.
O funcionamento do centro de Nieuwkoop:

funções para Vg1 e Noggin
A PROTEÍNA VG1 ATIVADA. Existem várias maneiras de induzir o mesoderma dorsal.

Primeira, a proteína Vg1 pode induzir a formação do mesoderma dorsal nas células
acima dela. O mRNA para Vg1 é restrito pela massa de vitelo vegetativo durante a
oogênese e permanece no hemisfério vegetal durante a clivagem (Capítulos 4 e 12;
Prancha 8). Após a fertilização, a proteína Vg1 é produzida no hemisfério vegetal da
Controle
Vg madura
EF1α (controle)
Actina cardíaca
(mesoderma dorsolateral)
Xbra
(A) (mesoderma geral)
Gsc (mesoderma
dorsal anterior)
Noggin (mesoderma
dorsal anterior)
Xwnt8 (mesoderma
ventrolateral)
NCAM (neural)
(B) (C)
Figura 15.19
Proteína Vg1 madura induz movimentos
morfogenéticos e expressão gênica mesodér-
mica dorsal em explantes ectodérmicos.
blástula, mas está na forma de um precursor inativo que precisa ser cindido para ser Explantes de hemisfério animal pigmentado no
ativo. A proteína Vg1 ativada é capaz de (1) induzir o mesoderma dorsal nas células do estágio de blástula foram cultivados (A) em
hemisfério animal; (2) induzir um eixo embrionário completo quando microinjetada em meio não tratado ou (B) em meio contendo a
proteína Vg1 madura (clivada). A proteína Vg1
células vegetativas ventrais; e (3) recuperar o eixo dorsal em ovos irradiados com luz
induziu movimentos de extensão convergente
UV quando microinjetada nas células vegetativas dorsais (Dale et al., 1993; Thomsen no hemisfério animal pigmentado. Quando
e Melton, 1993; Kessler e Melton, 1995). deixados no meio tratado por um tempo maior
Kessler e Melton (1995) mostraram que a proteína Vg1 ativada causava a (C) os explantes do hemisfério animal
elongação ativa do mesoderma da notocorda como também a ativação dose-depen- pigmentado formaram estruturas semelhantes
dente dos marcadores mesodérmicos. Quando coroas do pólo animal, no estágio de à larva, incluindo a notocorda, músculos, olhos,
blástula são colocadas em baixa concentração de Vg1 processada, a proteína Vg1 glândula do cimento e eixo ântero-posterior.
induz a expressão de genes como Brachyury, que caracteriza o mesoderma geral. (D) Com o aumento de sua concentração, a
Doses ligeiramente maiores de Vg1 induz a expressão de marcadores mesodérmicos proteína Vg1 induz um conjunto mais dorsal
de marcadores mesodérmicos. A concentra-
laterais (Xwnt8 e actina), e em altas concentrações, a Vg1 induz essas células a
ção mais baixa é 0 (controle), seguida por 1, 3,
expressar os marcadores mesodérmicos dorsais goosecoid e noggin (Figura 15.19). 10 e 30% em sobrenadante de Vg1. (De acor-
Entretanto, Cui e colaboradores (1996) encontraram que a Vg1, sozinha, não é capaz do com Kessler e Melton, 1995; fotografias
de causar diferenciação da notocorda in vivo. Para que isso ocorra, as células ne- cortesia de D. A. Melton.)
cessitam dos produtos de Vg1 e Wnt. (A via Wnt não foi suficiente para induzir
sozinha o mesoderma dorsal.) É possível que a combinação de Vg1 com algum
produto especificado pelo gene Siamois seja capaz de induzir a especificação do
mesoderma dorsal e sua diferenciação na notocorda*.
A proteína Vg1 madura (processada) parece ser crítica para o funcionamento (se
não o estabelecimento) do centro de Nieuwkoop nos anfíbios. Vg1 é também
identificada na região homóloga do embrião de galinha - a zona marginal posterior.
Além disso, quando a proteína Vg1 é introduzida experimentalmente em áreas laterais
* Alternativamente, isso pode ser outro exemplo do conceito de Spemann (1938) chamado de
“dupla certeza”. O embrião poderia especificar o mesoderma dorsal pelo sinergismo de Vg1 e β-
catenina (sem um centro de Nieuwkoop). O mesmo resultado poderia ser obtido a partir de um sinal
iniciado pelo gene Siamois do centro de Nieuwkoop abaixo dele. Spemann considerava dupla
certeza em analogia a usar tanto um cinto como suspensórios.
do blastoderma do pinto, um novo centro de Nieuwkoop é formado e um eixo secun-

dário é induzido (Seleiro et al., 1996).
Indução de especificidade mesodérmica ventral e lateral
Até aqui discutimos a indução do mesoderma dorsal pelas células vegetativas mais
dorsais. Mas, não é só isso. As outras células vegetativas são capazes de induzir as
células acima delas a se tornarem mesoderma ventral. Experimentos de Smith e seus
colegas (1991) mostraram que na blástula intermediária os blastômeros vegetativos
ventrolaterais e dorsais de Xenopus induzem a expressão do gene Brachyury nas
células marginais acima deles. O mRNA de Brachyury codifica um fator de transcri-
ção cuja função é crucial para a formação do mesoderma. Ele é expresso antes da α-
actina e outras proteínas que são produtos das células mesodérmicas, e se o gene
Brachyury é expresso em células onde o fator de transcrição está normalmente
inativo, aquelas células se tornam mesodérmicas (Cunliffe e Smith, 1992). Se o he-
misfério animal contendo as células da zona marginal é removido do hemisfério
vegetal na blástula intermediária não se forma o mesoderma no hemisfério animal.
Entretanto, se células vegetativas são adicionadas de volta aos hemisférios ani-
mais, o gene brachyury é expresso, e as células que o expressam se tornam
mesodérmicas. Desse modo, as células vegetativas induzem a expressão de genes
mesodérmicos em células da zona marginal. Sem essa interação, as células da zona
marginal permanecem ectodérmicas.
FATORES DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO. Existe muito debate sobre a

identidade dos indutores da mesodérmicos gerais encontrados nas células
vegetativas ventrais e laterais. Os fatores de crescimento fibroblástico (e suas
mensagens) foram encontrados no ovo e no embrião de Xenopus, e se considera
que eles permitem às células marginais responderem à Vg1 (ou a outra proteína
semelhante a activina) (Cornell e Kimelman, 1994; LaBonne e Whitman, 1994). O
significado funcional dessas moléculas FGF secretadas foi demonstrado pela des-
truição dos receptores para FGF no embrião por mutações dominantes negativas
(Capítulo 3). Quando esse experimento foi feito, os embriões que não tinham re-
ceptores FGF funcionais tinham reduzido dramaticamente as quantidades de
mesoderma posterior e lateral (Prancha 3). Uma possibilidade é que a quantidade
graduada de Vg1 ativa cria o padrão, com pequena quantidade induzindo o
mesoderma ventral, quantidades maiores induzindo o mesoderma lateral e ainda
maiores concentrações induzindo o mesoderma dorsal. Tais gradientes foram vis-
tos em cultura.
BMP4. Outra molécula considerada importante para a especificação do mesoderma

é a proteína morfogenética 4 do osso (BMP4). Parece haver uma relação antagôni-
ca entre a BMP4 e o mesoderma dorsal. Se o mRNA para a BMP4 é injetado em
ovos de Xenopus com uma célula, todo o mesoderma no embrião se torna
mesoderma ventrolateral, e não ocorre involução no lábio do blastóporo (Dale et
al., 1992; Jones et al., 1992). Experimentos de implantação produziram mais evidên-
cia em relação ao papel da BMP4 na indução do mesoderma ventrolateral. Quando
o hemisfério animal pigmentado de embriões injetados com a mensagem bmp4 foi
Figura 15.20 isolada e implantada na blastocele de blástulas jovens de Xenopus, elas causaram
A importância de BMP4 na produção de estru- a formação de uma cauda extra (Figura 15.20). Inversamente, a super expressão de
turas posteriores pode ser vista quando o
um receptor negativo dominante de bmp4 resultou na formação de dois eixos
mRNA de bmp4 foi injetado em embriões e as
células da coroa animal resultantes foram trans-
dorsais (Graff et al., 1994; Maeno et al., 1994). É possível que a BMP4 esteja
plantadas diretamente abaixo do ectoderma de induzindo um conjunto de fatores de transcrição que especificam o mesoderma
gástrulas jovens. As larvas tratadas, de modo para que seja lateral ou posterior (Stennard et al., 1996; Zhang e King, 1996).
geral, desenvolveram uma cauda extra. (de Jones Assim, a formação do mesoderma posterior (ventrolateral) parece ser originada
et al., 1992, cortesia de B. Hogan.) pelas ações de FGF e BMP4.
A criação da atividade do organizador

Proteínas secretadas do organizador
O organizador é induzido pelo centro de Nieuwkoop. Enquanto as células do centro de

Nieuwkoop permanecem endodérmicas, as células do organizador se tornam o
mesoderma dorsal (mesoderma da cabeça, notocorda, mesoderma paraxial) e se
posicionam abaixo do ectoderma dorsal. Nesse local, induzirão a formação do sistema
nervoso central. As propriedades do tecido organizador podem ser divididas em cinco
funções principais:
1. A habilidade de se tornar mesoderma dorsal (notocorda, etc.)

2. A habilidade de dorsalizar o mesoderma circundante em mesoderma lateral
(que de outra maneira formaria o mesoderma ventral)
3. A habilidade de dorsalizar o ectoderma em ectoderma neural
4. A habilidade de iniciar os movimentos da gastrulação
5. A habilidade de fazer com que a placa neural se torne o tubo neural
As células do organizador, em última análise, contribuem para quatro tipos de

células –endoderma da faringe, mesoderma da cabeça, notocorda e a dobradiça
cordoneural (Keller, 1976; Gont et al., 1993). O endoderma faríngeo lidera a migra-
ção do tecido organizador e parece induzir as estruturas mais anteriores da cabe-
ça. O mesoderma da cabeça induz o cérebro anterior e o intermediário, a notocorda
induz o cérebro posterior e o tronco, e a dobradiça cordoneural induz a extremida-
de da cauda. Recentemente, Vodicka e Gerhart (1995) correlacionaram técnicas de
marcação fluorescente de células e hibridização in situ para obter um mapa da
células que dão origem ao organizador. Foi encontrado que a porção mais animal
(10%) era derivada dos blastômeros A1 da blástula de 32 células; a região central
(70%) era derivada da progênie dos blastômeros B1; e cerca de 20% (as células
vegetativas e as profundas) era derivada do blastômero C1 diretamente acima das
células D1 do centro de Nieuwkoop. Todos os seis blastômeros, A1, B1 e C1
produziram células profundas e superficiais. A progênie do blastômero C1 produz
a parte mais vegetal, líder do organizador, e essas são as células que formam o
mesoderma da cabeça.
Quando o organizador foi inicialmente descrito, iniciou-se o primeiro programa
de pesquisa realmente internacional - a procura das moléculas do organizador.
Pesquisadores da Inglaterra, Alemanha, França, Estados Unidos, Bélgica, Finlân-
dia, Japão e União Soviética, todos tentaram encontrar essas extraordinárias mo-
léculas (veja Gilgert e Saxén, 1993). R. G. Harrison (citado por Twitty, 1966) se
referiu à gástrula dos anfíbios como o “novo Yukon para o qual mineiros ansiosos
estavam se dirigindo rapidamente para escavar ouro ao redor do blastóporo”.
Infelizmente, suas pás e picaretas se mostraram muito rudes para descobrir essas
moléculas. A análise das moléculas do organizador teve que esperar até que a
tecnologia do DNA recombinante permitisse a produção de clones de cDNA do
mRNA do lábio do blastóporo para verificar qual desses clones codificava fatores
que poderiam dorsalizar o embrião. A formação do mesoderma dorsal (organizador)
envolve a ativação de vários genes. Considera-se que as proteínas secretadas no
centro de Nieuwkoop ativam um conjunto de fatores de transcrição nas células
mesodérmicas acima dele. Esses fatores de transcrição ativariam os genes codifi-
cando os produtos secretados pelo organizador. Várias proteínas específicas do
organizador foram encontradas e se acham listadas na Tabela 15.3. Como as pro-
priedades do organizador dependem desses fatores secretados, começaremos com
essas proteínas. [regul3.html]
Várias fontes evidenciaram a presença de sinais difusíveis da notocorda, princi-
palmente a partir dos estudos críticos com transfiltros pelo grupo de pesquisadores
Tabela 15.3 Proteínas expressas somente, ou quase exclusivamente,

no organizador (lista parcial)
Proteínas nucleares Proteínas secretadas
Lim1 Chordin
XANF1 Noggin
Goosecoid Follistatin
Proteínas relacionadas Sonic hedgehog
A HNF3β (p.ex., Forkhead, Pintallavis) Cerberus
Proteínas relacionadas à Nodal (várias)
Filandeses (Saxén, 1961; Toivonen et al., 1975; Toivonen e Wartiovaara, 1976). O lábio
dorsal da salamandra aquática foi colocado em um lado de um filtro suficientemente
fino, de modo que nenhum processo pudesse atravessar os poros, e o ectoderma
competente de gástrula foi colocado no outro lado do filtro. Após várias horas, estru-
turas neurais foram observadas no tecido ectodérmico (Figura 15.21). As identidades
desses fatores difundindo do organizador levaram um quarto de século para serem
definidas. Atualmente, várias dessas moléculas estão sendo estudadas: Chordin,
Noggin, Follistatin, Sonic hedgehog e Cerberus.
(A)
CHORDIN. Um dos papéis iniciais do organizador é se “proteger” contra a
ventralização. A BMP4 é produzida em toda a blástula de Xenopus e ativamente
produz mesoderma ventral (Graff et al., 1994). Em outras palavras, a produção do
mesoderma ventral não é meramente devida à ausência de sinais dorsais; ela é
ativamente construída. Além do mais, como já descrito, a BMP4 pode bloquear os
sinais dorsais. O mesoderma dorsalizado bloqueia o sinal de BMP4 secretando
Chordin e Noggin (Sasai et al., 1994; Holley et al., 1995). Chordin é uma proteína
secretada que é ativada pelos fatores de transcrição Goosecoid e Xnot2 contendo
o homeodomínio. A proteína é originalmente detectada na zona marginal dorsal
cerca de uma hora antes da gastrulação; ao se iniciar a gastrulação, a mensagem
chordin é vista somente no lábio dorsal do blastóporo (Figura 15.22). Daqui em
diante, chordin é expressa na placa precordal (o mesoderma da cabeça que prece-
de anteriormente a notocorda) e na notocorda. Quando estão ocorrendo as últi-
mas induções na cauda, Chordin é encontrada na dobradiça cordoneural, o último
vestígio do organizador. Chordin pode induzir um eixo secundário quando
microinjetada nos lados ventrais da blástula de Xenopus, possivelmente por inter-
(B) ferir com a ação de BMP4.
Figura 15.21 BMP4 é inicialmente expressa nas regiões ectodérmicas e mesodérmicas da
Fatores indutivos solúveis e sua identificação. blástula tardia. Entretanto, durante a gastrulação, transcritos de bmp4 estão res-
(A) Estruturas neurais induzidas no ectoderma tritos à zona marginal ventrolateral (Hemmati-Brivanlou e Thomsen, 1995; Northrop
presuntivo pelo lábio dorsal da salamandra aqu- et al., 1995). A proteína BMP4 induz a expressão de vários fatores de transcrição
ática, separado do ectoderma por um filtro (Xvent-1, Vox, Mix.1, Xom) que são reguladores-chaves no desenvolvimento do
Nucleopore com poros de diâmetro médio de mesoderma ventral. Portanto, a BMP4 ativa a expressão gênica ventral. Os fatores
0.05 µm. Células neurais do tipo anterior são de transcrição induzidos por BMP4 reprimem goosecoid e outros genes dorsais,
evidentes, incluindo alguns olhos induzidos.
enquanto ao mesmo tempo ativam proteínas mesodérmicas ventrolaterais (Gawantka
(B) Tipo similar de indução visto quando o
hemisfério animal pigmentado de Xenopus (ec-
et al., 1995; Hawley et al., 1995; Mead et al., 1996; Schmidt et al., 1996). Dessa
toderma presuntivo) é injetado com mRNA de maneira, a BMP4 ativa o desenvolvimento mesodérmico e suprime o desenvolvi-
chordin e tratado com FGF2 solúvel. (A de mento dorsal. Em Xenopus, chordin e noggin se ligam diretamente e inativam a
Toivonen, 1979; B de Sasai et al., 1996; foto- BMP4, impedindo assim que a proteína aja em células próximas ao organizador
grafias cortesia de L. Saxén e E. De Robertis, (Figura 15.23; De Robertis e Sasai, 1996; Piccolo et al., 1996; Sasai et al., 1996;
respectivamente.) Zimmerman et al., 1996).
(A) (B) (C)
Figura 15.22
Localização do mRNA de chordin. (A) Montagem total da hibridização in situ mostra que
imediatamente antes da gastrulação, a mensagem chordin é expressa na região que se tornará o
lábio dorsal do blastóporo. (B) Quando a gastrulação começa, chordin é expresso no lábio dorsal
do blastóporo, e (C) é visto nos tecidos do organizador. (de Sasai et al., 1994; fotografias cortesia
de E. De Robertis.)
(A)
Animal
Ectoderma
Ectoderma neural
epidérmico
Ventral Dorsal
MOLÉCULAS DO ORGANIZADOR:
Chordin, Noggin, Follistatin, Xnr3
Mesoderma
Endoderma dorsal
Vegetal
(B)
Screw
Genes homeobox
Tolloid Decapentaplegic não neurais
Chordin
Short gastrulation
Cordados
Drosophila
Figura 15.23
Modelo para a ação do organizador. (A) BMP4 (e outras certas moléculas) são poderosos fatores
ventralizantes. Proteínas do organizador como Chordin e Noggin podem bloquear a ação de
BMP4. (Follistatin pode inibir a ação de BMP7, que combina com BMP4 para ativá-lo.) Os
efeitos antagônicos dessas proteínas podem ser vistos em todas as três camadas germinativas. (B)
Vias do desenvolvimento homólogo na formação do sistema nervoso central de um vertebrado
(Xenopus) e de um invertebrado (Drosophila). O fator vertebrado está em preto, a proteína
homóloga da Drosophila em cor. (De acordo com De Robertis e Sasai, 1996; Sasai et al., 1996.)
& Especulações
BMP4 e a lagosta de Geoffroy
R ECENTEMENTE, os laboratóri-
os de De Robertis e Kimelman
mostraram que a reação que
leva à formação do tubo neural dorsal no
Xenopus são as mesmas reações que le-
do short-gastrulation é injetado nas re-
giões ventrais de embriões de Xenopus,
ele induz a notocorda e o tubo neural do
embrião. A injeção do mRNA de chordin
em Drosophila origina tecido nervoso
um dos mais calorosos e críticos con-
frontos em biologia quando ele propôs
que a lagosta era um vertebrado de ca-
beça para baixo. Ele acreditava que o
lado ventral da lagosta (com seu cor-
vam à formação do cordão nervoso ven- ventral. Apesar da Chordin de Xenopus dão nervoso) era homólogo ao lado dor-
tral nos insetos (veja Figura 15.23B; funcionar como um dorsalizador do em- sal dos vertebrados (Appel, 1987). Pa-
Holley et al., 1995; Schmidt et al., 1995). brião, ela ventraliza o embrião de Droso- rece que ele tinha razão ao nível mole-
Em Drosophila, o homólogo do gene phila. Isso é porque na mosca a Dpp é cular, mas não no anatômico. De Robertis
bmp4 é o decapentaplegic (dpp). Como produzida dorsalmente. Em Xenopus, e Sasai (1996) propuseram que todos os
discutido no capítulo anterior, a proteína BMP4 é produzida ventralmente. Em am- filos bilatérios tinham uma origem co-
Dpp é responsável pela modelagem do bos os casos, Sog/Chordin produz teci- mum- uma criatura hipotética (denomi-
eixo dorsoventral na Drosophila, e está do neural bloqueando os efeitos de Dpp/ nada Urbilateria) de cerca de 600 mi-
presente na porção dorsal do embrião e BMP4. Em Drosophila, a Dpp interage lhões de anos atrás que era o ancestral
difunde-se ventralmente. Aqui, ela sofre com o produto do gene screw para seu de ambos os subreinos, protostomatas
a oposição de uma proteína chamada funcionamento. Em Xenopus, o homólogo e deuterostomatas. A interação BMP4
Short-gastrulation (Sog). A Short-gastru- de screw, Bmp7, parece ser essencial para (Dpp)/Chordin(Sog) é um exemplo de
lation é a homóloga de Chordin na Dro- o efeito ventralizante de BMP4 (Hawley “processos homólogos”, sugerindo uma
sophila. Esses homólogos não só se et al., 1995). unidade de princípios de desenvolvi-
parecem como também podem ser subs- Em 1822, o anatomista francês mento em todos os animais (Gilbert et
tituídos um pelo outro. Quando o mRNA Etienne Geoffroy Saint-Hilaire provocou al., 1996).
NOGGIN. Um dos outros agentes do organizador deve ser o produto do gene noggin.
Smith e Harland (1991, 1992) isolaram esse gene construindo uma biblioteca de cDNAs
de gástrulas dorsalizadas (tratadas com lítio). RNAs sintetizados de conjuntos desses
plasmídeos foram injetados em embriões ventralizados produzidos por irradiação com
luz UV. Os conjuntos de plasmídeos cujos RNAs recuperavam o eixo dorsal foram
divididos em conjuntos menores, e assim por diante, até o isolamento de clones úni-
cos cujos mRNAs eram capazes de restaurar o eixo dorsal nesses embriões. Um des-
ses clones continha noggin. Smith e Harland (1992) mostraram que mRNA do noggin,
recentemente transcrito, está localizado inicialmente na região do lábio dorsal do
blastóporo e depois é expresso na notocorda (Prancha 6). Ainda mais, se o embrião
precoce é tratado com cloreto de lítio (LiCl) de modo que o manto mesodérmico inteiro
se torne um tecido organizador semelhante à notocorda, então o mRNA de noggin é
encontrado no manto mesodérmico inteiro. Tratamento do embrião precoce com luz
ultravioleta (que impede a formação do lábio dorsal do blastóporo) inibe a síntese do
mRNA de noggin. Injeção de mRNA de noggin em embriões de uma célula, irradiados
com luz ultravioleta, restaura completamente o eixo dorsal e permite a formação do
embrião completo (Prancha 5). Se muita proteína Noggin é sintetizada nessa ocasião,
o embrião se torna “hiperdorsal”, formando somente a região da cabeça (daí o nome
“noggin”). O mRNA para a proteína Noggin já está presente no ovo fertilizado, e a
seqüência da proteína (como deduzida pelo gene) sugere fortemente que Noggin é
uma proteína secretada. Parece então, que Noggin é um excelente candidato para
mediar algumas das funções do organizador.
Evidência recente sugere que a proteína Noggin pode realizar duas funções impor-
tantes do organizador de Spemann-Mangold: ela induz o tecido neural do ectoderma
dorsal, e dorsaliza as células mesodérmicas que, de outra maneira, contribuem para o
mesoderma ventral. Smith e colaboradores (1993) mostraram que a proteína Noggin
pode dorsalizar as células da zona marginal ventral na gastrulação e reespecificar seu
destino a partir do mesoderma ventral (mesênquima e células do sangue) a destinos
mais intermediários (músculo, coração e rim pronéfrico). Quando Smith e colaborado-
res removeram as zonas marginais ventrais (o mesoderma ventral presuntivo) da gástrula
de Xenopus e as colocaram em um meio contendo a proteína Noggin solúvel, esses
explantes produziram um mRNA específico para músculo que é normalmente reserva-
do para explantes marginais dorsais. Esses explantes também se tornaram alongados
(outra característica do desenvolvimento dorsal). Entretanto, os explantes alongados
não coravam como tecido notocordal. Esses experimentos mostram que a proteína
solúvel Noggin pode induzir células mesodérmicas ventrais da gástrula a se tornarem
músculo (mas não notocorda) e, portanto, ela se assemelha ao sinal do organizador
que dorsaliza o tecido mesodérmico lateral (veja Figura 15.17).
A proteína Noggin também pode induzir tecido neural no ectoderma da gástrula
sem a presença de qualquer mesoderma dorsal (Lamb et al.,1993). Quando Noggin é
adicionada ao ectoderma da gástrula (ou hemisfério animal pigmentado), as células
ectodérmicas são induzidas a expressar marcadores neurais específicos para o cérebro
anterior. Além disso, os produtos gênicos para as células do músculo ou da notocorda
não são induzidos pela proteína Noggin. Como Noggin é uma proteína secretada
sintetizada pelos derivados do organizador (o mesoderma da cabeça e o
cordomesoderma) durante a gastrulação (quando se dá a indução), e desde que ela
inativa a BMP4 (a qual ventraliza o embrião), considera-se que Noggin tem um papel
na dorsalização do mesoderma e na dorsalização do ectoderma dorsal.*
FOLLISTATIN. Hemmati-Brivanhou e Melton (1994) demonstraram que a proteína

Follistatin, ligante de activina, está presente no lábio dorsal do blastóporo e poste-
riormente se torna restrita à notocorda. Embora originalmente se pensasse ligar
somente a activina, agora existe evidência (Yamashida et al., 1995) que a Follistatin
pode inibir as atividades da BMP7. A BMP7 é necessária para a ativação da BMP4,
assim pela inibição da BMP7, a Follistatin pode também prevenir a ventralização do
mesoderma. A Follistatin também tem um papel na dorsalização do ectoderma. Pare-
ce que a activina (ou, provavelmente, uma proteína semelhante à activina, tal como
a BMP7) é necessária para a repressão da indução neural. Ligando essa proteína à
Follistatin a inibição é liberada e permite que o tecido se torne neural (Hemmati-
Brivanlou et al., 1994; Hawley et al., 1995).
É interessante que Noggin, Chordin e Follistatin são todas inibidoras. Aqui vemos
um princípio que é a base de boa parte do desenvolvimento: a ativação é freqüente-
mente realizada inibindo um repressor. Isso pode ser explicado pelo fato de que em
cada núcleo a maioria dos genes estão reprimidos. Para ativar um determinado gene, é
necessário um inibidor dessa repressão. Analogamente, a inibição é freqüentemente
realizada pela supressão do inibidor do repressor. (Biologistas do desenvolvimento se
acostumam a falar com negativas duplas e triplas). Nesse caso, o estado “default“ do
ectoderma é se tornar neural, a não ser que sofra a ação de BMP4. As proteínas do
mesoderma organizador impedem a ação de BMP4 no ectoderma.
*Noggin pode também estar funcionando como parte do centro de Nieuwkoop. Um material do
mRNA de noggin é traduzido na blástula precoce (Smith e Harland, 1992) e uma investigação
recente (Lustig et al., 1996) mostra que Noggin funciona com um co-fator, Xenopus nodal related-
1(Xnr-1), para induzir a gástrula precoce. Xnr-1 pode também estar envolvido na formação do eixo
esquerdo-direito em Xenopus. Durante a neurulação, ele é expresso assimetricamente no mesoderma
da placa lateral, estando presente somente no lado esquerdo do embrião. Esse modelo de expressão
se assemelha aquele dos genes nodal em pintos e camundongos, onde a expressão de nodal é crítica
para o estabelecimento do eixo esquerdo-direito (Capítulo 16).
Placa do assoalho Conjunto de neurônios Placa do assoalho ventral

ventral secundário motores secundários doadora ou outras células
Conjunto de neurônios secretando Hedgehog
motores secundários
Região do
neurônio
Motor Notocorda
doadora
Placa do
assoalho ventral
Notocorda
(A) (B) (C) (D)
Figura 15.24
Cascasta de induções iniciada pela notocorda
no tubo neural recém-formado. (A) Dois tipos SONIC HEDGEHOG. Sonic hedgehog é utilizada após a concretização da maioria
de células no tubo neural recém-formado. As dos eventos indutivos da neurulação. Ela é usada para padronizar o tubo neural
células mais perto da notocorda se tornam as recém-formado. Sonic hedgehog é expressa na notocorda e a porção aminoterminal
células da placa do assoalho ventral. Os neurô- dessa proteína é secretada (veja Figura 7.11). Se fragmentos da notocorda de um
nios motores emergem nos lados ventrolaterais. embrião são transplantados para as laterais de um tubo neural hospedeiro, esse
(B) Se uma segunda notocorda é transplantada formará, nas suas laterais, outro conjunto de células da placa do assoalho. Se um
adjacente ao tubo neural, ela induz um novo pedaço da notocorda é removido de um embrião, o tubo neural adjacente à região
conjunto de células da placa do assoalho e dois deletada não tem células da placa do assoalho (Figura 15.24; Placzek et al., 1990;
novos conjuntos de neurônios motores. (C) Se
Yamada et al.,1991). Essas células da placa do assoalho, uma vez induzidas, induzem
as células da placa do assoalho ventral são trans-
plantadas adjacentes ao tubo neural, novos con- a formação dos neurônios motores em um de seus lados. O mesmo resultado pode
juntos de neurônios motores se diferenciam. ser obtido se os fragmentos de notocorda são substituídos por aglomerados de
(D) As interações indutivas entre essas célu- células secretando Sonic hedgehog (Echelard et al., 1993; Roelink et al., 1994). A
las. As setas vermelhas representam a secreção Sonic hedgehog das células da placa do assoalho é capaz, em seguida, de polarizar
da proteína Sonic hedgehog. (De acordo com o tubo neural. Ela induz os neurônios motores nas regiões ventrolaterais, e impede
Placzek, et al., 1990.) a dorsalização do tubo neural ventral antagonizando os efeitos de BMP4 originada
na epiderme dorsal* (veja Capítulo 7).
CERBERUS. A indução da estruturas mais anteriores da cabeça é realizada por uma

proteína secretada chamada Cerberus. Diferentemente de outras proteínas secretadas,
Cerberus promove a formação da glândula do cimento, olhos e placódios olfatórios.
Entretanto, diferente de Noggin e Chordin, a proteína Cerberus suprime a formação do
mesoderma dorsal, enquanto induz o mesoderma cardíaco e fígado (um derivado
endodérmico do intestino anterior). Quando o mRNA de Cerberus foi injetado no
conjunto de blastômeros vegetativos ventrais (D4) no estágio de 32 células, se forma-
ram estruturas ectópicas da cabeça (Figura 15.25; Bouwmeester et al., 1996). Essas
estruturas da cabeça foram produzidas tanto a partir das células injetadas como das
células circundantes. O gene cerberus é expresso naquelas células que lideram o
movimento anterior das células em gastrulação para dentro do embriäo. Essas são as
células do endoderma involutivo (na camada profunda do organizador) que dão ori-
gem ao intestino anterior e seus derivados, os quais estão sob a cabeça. A mensagem
*BMP4 age como um agente ventralizador na formação do tubo neural (impedindo ativamente
sua formação na parte ventral do embrião), mas uma vez que o tubo neural está produzido, a
proteína pode agir como um agente dorsalizante, sendo secretada da epiderme superior para dorsalizar
o tubo neural (veja Capítulo 7). Um parceiro versátil, ela estimulará o desenvolvimento do músculo
no miótomo, padroniza o desenvolvimento do dente, e até destrói a rede formada entre nossos
dedos da mão e do pé. A BMP4 é freqüentemente pareada com a Sonic hedgehog na formação dos
primórdios dos órgãos.
Figura 15.25
O mRNA de Cerberus injetado em um único blastômero D4 (vegetativo
ventral) de um embrião de Xenopus de 32 células induz estruturas da
cabeça como também um coração e um fígado duplicados. Um olho
secundário (um único olho ciclópico) e um placódio olfatório podem ser
vistos facilmente. (de Bouwmeester et al., 1996; fotografia cortesia de E.
M. De Robertis.)
do cerberus é dependente da atividade do resto do organizador, e a sua transcrição é

ativada por Follistatin, Noggin e Chordin. Isso pode explicar porque a transcrição de
cerberus é limitada à região do endoderma involutivo mais próxima ao organizador,
uma região que se sobrepõe à expressão de chordin.
Fatores de transcrição induzidos no organizador
Considera-se que as atividades do centro de Nieuwkoop ativam um conjunto de genes

codificando fatores de transcrição no mesoderma acima dele. Foram encontrados vá-
rios fatores de transcrição específicos do organizador; ou seja, eles são expressos
somente no lábio dorsal do blastóporo e na notocorda resultante. Duas dessas prote-
ínas são XANF-1 e Goosecoid.
XANF-1 é um fator de transcrição contendo o homeodomínio que pode ser um dos
primeiros a ser expresso. No começo da gastrulação, a XANF-1 está predominante-
mente nas camadas profundas do lábio dorsal do blastóporo, os precursores do
mesoderma da cabeça, e uma injeção de mRNA de XANF-1 nos blastômeros ventrais
induz a formação de um eixo secundário. Essas células injetadas se tornam o mesoderma
anterior do eixo secundário (Zaraisky et al., 1995). Assim, a XANF-1 parece controlar
o comportamento migratório das células profundas do lábio dorsal do blastóporo e a
diferenciação dessas células em tecido do organizador.
Goosecoid parece funcionar de maneira muito semelhante à XANF-1. A mensa-
gem para a Goosecoid foi encontrada fazendo uma varredura das bibliotecas de
cDNA do lábio dorsal do blastóporo com sondas para genes que são ativos na
formação do eixo em Drosophila (Blumberg et al., 1991; Cho et al., 1991a). Os trans-
critos de goosecoid são detectados inicialmente no estágio de blástula tardia, indi-
cando que esse é um gene controlado pelo núcleo, e esses transcritos se acumulam
na área localizada diretamente sobre o lábio dorsal do blastóporo nas células precur-
soras mesodérmicas dorsais (blastômero C1). Em culturas do hemisfério animal
pigmentado, a proteína Vg1 ou a activina, mas não FGF2 ou Noggin, podem induzir
a transcrição do gene goosecoid (Cho et al., 1991a; Thomsen e Melton, 1993). A
expressão do mRNA de goosecoid também se correlaciona com o domínio do
organizador em animais tratados experimentalmente. Quando LiCl é usado para au-
mentar o mesoderma indutor do dorso-anterior da zona marginal, a expressão de
goosecoid da mesma forma é aumentado. Inversamente, quando ovos são tratados
com luz UV antes da primeira clivagem, ambas, a indução dorso-anterior e a expres-
são de goosecoid, são significativamente inibidas. Injeção do comprimento total da
mensagem goosecoid nos dois blastômeros ventrais do embrião de Xenopus com 4
(A) (B) (C) (D)
Figura 15.26
Habilidade do mRNA de goosecoid para induzir um novo eixo. (A) Na gástrula, o embrião
controle (não injetado ou injetado com mRNA semelhante a goosecoid mas sem o homeobox)
tem um lábio dorsal do blastóporo. (B) Um embrião no estágio de 16 células cujos blastômeros
vegetativos ventrais foram injetados com a mensagem goosecoid. Note o lábio dorsal do blastóporo
secundário. (C) Superior, duas nêurulas injetadas com mRNA de goosecoid, mostrando dois
eixos; inferior, duas nêurulas controle. (D) Embrião duplicado produzido pela injeção de goosecoid.
Foram induzidas estruturas completas da cabeça. (De acordo com Cho et al., 1991a; Niehrs et al.,
1993; cortesia de E. De Robertis.)
células faz com que a progênie desses blastômeros involuam, sofram extensão con-
vergente e formem o mesoderma dorsal e o endoderma da cabeça do eixo secundário
(Figura 15.26; Niehrs et al., 1993). Além disso, experimentos com marcação (Niehrs et
(A) al., 1993) mostram que células injetadas com goosecoid são também capazes de
recrutar para o eixo dorsal células vizinhas do hospedeiro. Resumindo, o centro de
Nieuwkoop ativa o gene goosecoid codificando uma proteína ligante de DNA que
(1) ativa as propriedades de migração (involução e extensão convergente) das célu-
las do lábio dorsal do blastóporo, (2) de forma autônoma, determina os destinos
endodérmico da cabeça e mesodérmico dorsal das células que o expressam, e (3)
permite às células que expressam goosecoid recrutarem células vizinhas para dentro
Xbra do eixo dorsal. Foi observado que Goosecoid ativa o gene Xotx2 no mesoderma
Noggin anterior e no ectoderma presuntivo do cérebro (Blitz e Cho, 1995). Xotx2 é o homólogo
Goosecoid do gene orthodenticle em Xenopus que é essencial para o desenvolvimento do
Xnr3
cérebro em moscas e camundongos.
(B) A expressão gênica “específica para o organizador“ pode ser usada para subdi-
vidir o organizador precoce em regiões tendo diferentes combinações dessas men-
sagens (Figura 15.27; Vodicka e Gerhart, 1995). No começo da gastrulação, enquanto
as células do organizador involuem para o embrião, essas configurações mudam.
Dentro das células profundas, o goosecoid agora é visto nas porções mais anterio-
res (na maior parte construída de células C1), especialmente o mesoderma da placa
precordal da cabeça. A sobreposição parcial dos genes noggin e Xbra define a
notocorda, e a região tendo Xbra sem noggin define o domínio destinado a se
tornar o endoderma posterior. Um segundo domínio de expressão de noggin é visto
na placa neural anterior. [regul6.html]
Figura 15.27
Estrutura fina do organizador. (A) No começo da gastrulação, o Xbra está nas células mais
animais do organizador, enquanto o noggin está mais vegetal. As células vegetativas involuem
primeiro e se localizam mais anteriormente. (B) Os mesmos fatores vistos perto do fim da
gastrulação. As zonas de expressão são mais discretas e menos superpostas, e não há correlação
entre a localização original das células e seu padrão de expressão gênica posterior. (De acordo
com Vodicka e Gerhart, 1995.)
& Especulações
Como o Organizador Neuraliza o Ectoderma?
M
ESMO QUE a identidade das da Proteína Quinase C (PKC) nas suas natural foi novamente confirmada quan-
moléculas sinalizadoras este- membranas celulares. Vários estudos do Otte e colaboradores (1991; Otte e
ja sendo estabelecida, o me- (Davids et al., 1987; Davids, 1988; Otte Moon, 1992) demonstraram que a PKC
canismo de suas ações ainda é um enig- et al., 1988, 1989) mostraram que se so- do ectoderma dorsal difere do PKC do
ma. É provável que além de bloquear o mente um desses eventos ocorre, não ectoderma ventral, tanto na sua estru-
sinal ventralizante (BMP4), o organiza- há formação do tecido neural. Entretan- tura como na sua habilidade de ser ati-
dor deve também ativar as células ecto- to, se a Proteína Quinase C e a adenil vada por compostos externos. Somente
dérmicas para se tornarem a placa ciclase forem ativadas artificialmente a PKC encontrada no ectoderma dorsal
neural. Apesar de não se conhecer a(s) nas membranas das células ectodérmi- pode ser correlacionada com a habilida-
molécula(s) responsável(s), é possível cas, o tecido neural é gerado. Nesse de de responder a indutores naturais. É
que a neuralização possa se dar pela modelo, a indução neural é realizada por possível que ninguém ainda tenha con-
combinação de duas reações separadas: duas reações, e cada reação pode ser seguido isolar o fator indutor neural
o aumento do AMP cíclico intracelular iniciada por uma molécula diferente. A natural porque vários fatores estão agin-
nas células ectodérmicas e a ativação participação de PKC na indução neural do simultaneamente.
A especificidade regional da indução

A determinação das diferenças regionais
Um dos mais fascinantes fenômenos na indução neural é a especificidade regional

das estruturas neurais que são produzidas. As regiões do cérebro anterior
(arquencefálica), do cérebro posterior (deuterencefálica) e espinocaudal do tubo
neural devem estar exatamente organizadas em uma direção anterior para posterior.
Dessa maneira, o tecido organizador não somente induz o tubo neural mas também
especifica as regiões do tubo neural. Essa indução específica da região foi demons-
trada por Otto Mangold (1933) em uma série de experimentos onde várias regiões do
teto do arquêntero de Triturus (salamandra-aquática) foram transplantadas para
embriões em gástrula precoce (Figura 15.28). Após a remoção da placa neural
superadjacente, quatro seções sucessivas do teto do arquêntero foram retiradas de
embriões que tinham acabado de completar a gastrulação e colocadas em blastoceles
de gástrulas precoces. A porção mais anterior do teto do arquêntero induziu os
equilibradores e as porções do aparelho oral (Figura 15.28A); a próxima porção mais
anterior induziu a formação de várias estruturas da cabeça, incluindo nariz, olhos,
equilibradores e vesículas óticas (Figura 15. 28B); a terceira seção induziu a estrutu-
ra do cérebro posterior (Figura 15.28C); e o segmento mais posterior induziu a forma-
ção do tronco dorsal e o mesoderma da cauda (Figura 15.28D). A indução do
mesoderma dorsal- e não do ectoderma dorsal do sistema nervoso- pela ponta pos-
terior da notocorda foi confirmada por Bïjtel (1931) e Spofford (1945) que mostraram
que o quinto posterior da placa neural dá origem aos somitos da cauda e às porções
posteriores do ducto pronéfrico do rim.
Além disso, quando lábios dorsais do blastóporo de embriões precoces de
salamandra (gástrulas precoces) foram colocados em outros embriões precoces de
salamandra, eles formaram cabeças secundárias. Quando os lábios dorsais de em-
briões em estágio mais avançado foram transplantados a embriões precoces de
salamandra, eles induziram a formação de caudas secundárias (Figura 15.29; Mangold,
Figura 15.28 (A)

A especificidade regional da indução pode ser
demonstrada implantando diferentes regiões
(coloridas) do teto do arquêntero em gástrulas
precoces de Triturus. Os animais resultantes
Animal
têm partes secundárias. (A) Cabeça com Porção do teto do resultante
equilibradores. (B) Cabeça com equilibradores, arquêntero transplantado
olhos e cérebro anterior. (C) Parte posterior da para gástrula precoce
(B)
cabeça, deuterencéfalo e vesículas óticas. (D)
Segmento tronco-cauda. (De acordo com
Mangold, 1933.)
(C)
(D)
(A) Transplante do lábio dorsal de gástrula jovem
(B) Transplante do lábio dorsal de gástrula avançada
Figura 15.29
Ação indutora específica regionalmente do lábio dorsal do blastóporo. (A) Labios dorsais de
blastóporos jovens (que formarão a porção anterior do mesoderma dorsal) induzem estruturas
anteriores quando colocadas em gástrulas jovens da salamandra aquática. (B) Lábios dorsais de
blastóporos mais velhos colocados em gástrulas de salamandra similares produzem estruturas
mais posteriores. (de Saxén e Toivonen, 1962, fotografias cortesia de L. Saxén.)
1933). Isso significa que as primeiras células do organizador a entrarem no embrião

induzem a formação de cérebros e cabeças, enquanto as células que formam o lábio
dorsal do blastóporo de embriões em estágio mais avançado induzem as células acima
delas a se tornarem medulas espinhais e caudas. Um fenômeno similar ocorre em
embriões de pinto (Storey et al., 1992).
O modelo do duplo gradiente
Nos anos de 1950, P. Nieuwkoop (1952) e Toivonen e Saxén (1955) propuseram mode- Anterior Posterior
los para a especificidade regional que envolviam duas etapas. Na primeira delas, o
tecido neural era induzido pelo organizador. Esse tecido neural era o tecido Figura 15.30
“arquencefálico“ do cérebro anterior. A segunda etapa consistia em um sinal de Evidência para um modelo de indução neural
posteriorização distribuído como um gradiente, com maior concentração caudal. O em dois estágios: ativação e transformação.
sinal de posteriorização agia no ectoderma anterior transformando-o em cérebro pos- Uma dobra do ectoderma de gástrula foi im-
terior e tecido da medula espinhal. A evidência de Nieuwkoop veio de transplantes de plantada em uma região da placa neural. As
estruturas mais anteriores estão no lado esquer-
dobras do ectoderma competente em várias posições ao longo do eixo ântero-poste-
do e 1-4 representam diferentes estruturas
rior da gástrula hospedeira. As porções proximais dessas dobras produziram estrutu-
neurais. Dobras do ectoderma de gástrula não
ras típicas da região de inserção do hospedeiro, enquanto que a parte mais distal da específica tendiam a se diferenciar em estrutu-
dobra se desenvolveu em estruturas neurais de natureza mais anterior do que à da ras neurais anteriores, mas eram posteriorizadas
inserção (Figura 15.30). A evidência de Toivonen e Saxén veio de estudos com indutores por material oriundo do posterior do embrião.
artificiais específicos de tecidos. Foi observado que a medula óssea de cobaia, por (De acordo com Doniach, 1993.)
exemplo, induz somente estruturas mesodérmicas. Fragmentos de fígado de cobaia,
entretanto, podiam induzir estruturas do cérebro anterior. Eles implantaram os dois
indutores juntamente dentro da blastocele da mesma gástrula precoce. Enquanto o
fígado induziria somente o cérebro anterior e a medula óssea induziria somente o
mesoderma, os dois juntos induziram tudo normal; o cérebro anterior, o cérebro poste-
rior, a medula espinhal e o mesoderma do tronco (Toivonen e Saxén, 1955). Portanto, a
especificidade regional da indução neural pode ser devida a gradientes opostos de
substâncias indutoras do cérebro anterior e da medula espinhal (Figura 15.31). Resul-
tados semelhantes vieram de estudos onde o ectoderma neural anterior foi misturado
(A)
Medula Fígado
óssea
Figura 15.31
Evidência para o modelo de indução em
(B) Fígado Fígado + medula Medula óssea gradiente duplo. (A) Implantação simultâ-
113 casos óssea 66 casos 34 casos nea de um indutor neuralizante (fígado de
Cérebro anterior cobaia) e um indutor de mesoderma (me-
Olho dula óssea de cobaia) na blastocele de uma
Nariz gástrula precoce da salamandra aquática.
Equilibrador (B) Resultados dessa implantação. Estru-
Cérebro posterior
turas do cérebro posterior e da medula es-
Vesícula do ouvido pinhal que eram intermediárias entre o cé-
Medula espinhal rebro anterior e o mesoderma no mapa de
destino da placa neural, não foram bem in-
Notocorda duzidas por cada um dos indutores. Quan-
Somitos
do os dois indutores foram implantados
Prônefros
Nadadeira
em conjunto, essas estruturas foram pro-
duzidas. (De acordo com Toivonen e
Saxén, 1955.)
Cérebro anterior
Cérebro posterior
Medula espinhal
Porcentagem
Figura 15.32
Evidência para a indução em gradiente duplo e
dois estágios no embrião de anfíbios. A região com diferentes quantidades de mesoderma dorsal posterior (Figura 15.32; Toivonen e
anterior da placa neural (ou seja, células já in- Saxén, 1968). Assim, o tecido neural foi determinado a ser inicialmente cérebro anterior,
duzidas naturalmente por um indutor do cére- mas em seguida foi posteriorizado de maneira gradativa por substâncias caudais. A
bro anterior, aqui vistas em cor) e células da maioria dos modelos de indução neural convergiram a um esquema que inclui (1) uma
notocorda posterior foram removidas e mistu-
etapa de “ativação” inicial que determina que as células têm capacidade de se conver-
radas em diferentes proporções. A freqüência
de estruturas intermediárias (cérebro posteri- terem em células neurais do cérebro anterior e (2) uma etapa de “transformação” na
or) aumenta à medida que a proporções de cé- qual um gradiente de material do mesoderma posterior causa a posteriorização da
lulas da placa neural anterior e células especificação neural (Figura 15.33). [regul4.html]
mesodérmicas se aproxima de 1:1. Isso sugere
que a especificação regional ocorre após a de- Correlatos moleculares da caudalização neural
terminação das células da placa neural como
neurais. (de Gilbert e Saxén, 1993.) Cada um dos indutores neurais: Chordin, Noggin e Follistatin induz exclusivamente
tecidos neurais anteriores (tipo de cérebro anterior). Então, quais podem ser o(s)
fator(es) que posteriorizam o tubo neural? Vários estudos recentes apontam para o
FGF como sendo o fator que especifica que o ectoderma neural se torne mais caudal
(Cox e Hemmati-Brivanlou, 1995; Lamb e Harland, 1995). Quando o ectoderma de
gástrula precoce (ainda sem a subcamada de mesoderma dorsal) foi isolado e
Formação da cabeça Transformação

anterior (Cerberus) posterior
Ativação neural
(Chordin, Noggin,
Anterior Follistatin) Posterior
Ativação: Transformação posterior

(Chordin FGF, RA, Wnt?
Noggin
Follistatin Posterior
Figura 15.33 Xnr3)
O modelo de ativação–transformação na pa-
dronização neural. De acordo com este mode- Ativação da cabeça
anterior (Cerberus) Mesoderma dorsal
lo, a indução neural original (“ativação”) faz
com que o ectoderma neural seja especificado
como o tipo de células neurais mais anteriores. Anterior
A caudalização (“transformação”) dessas célu- Lábio dorsal do blastóporo
las é realizada por um gradiente de uma outra Endomesoderma
substância, cuja concentração é a mais alta pos- anterior
teriormente. (De acordo com Doniach, 1995.) Ectoderma Endoderma
Concentração de RA Ácido
em contato com a retinóico
nêurula tardia
Não tratada Controle
rRNA
Glândula do cimento
XCG-1
Glândula do
cimento XAG-1
XA-1 Cabeça
XIF-1 Cabeça
XIHbox6 Tronco
Sistema neural N-CAM
Xhox36 Cauda
Figura 15.34
Ácido retinóico (RA) causa a posteriorização de estruturas neurais. (A) Embriões em nêurula
tardia foram expostos continuamente a diferentes concentrações de ácido retinóico e seu
crescimento foi permitido até que os controles atingissem o estágio de girinos. (B) Efeito na
expressão do mRNA do marcador neural quando as blástulas são tratadas com 10-6 M de ácido
retinóico por 2 horas (suficiente para produzir girinos acefálicos). Efeito inibitório pode ser visto
nos genes expressos mais anteriormente. (A de acordo com Ruiz i Altaba e Jessell, 1991; B de
acordo com Sive et al., 1990.)
neuralizado por Noggin, Chordin ou Follistatin foram encontrados marcadores neurais

do tipo anterior. Quando o tecido foi incubado com um indutor neural mais FGF2, o
ectoderma expressou marcadores neurais mais posteriores. Realmente, o FGF2 é capaz
de induzir o cérebro anterior a expressar genes específicos do cérebro posterior. Quan-
do a sinalização de FGF é bloqueada in vivo por um receptor dominante negativo do
FGF, os girinos resultantes não têm seus segmentos posteriores (Amaya et al., 1991).
O FGF2 provavelmente não é o FGF posteriorizador natural em Xenopus, pois não é
secretado e não está localizado em lado nenhum do embrião. Entretanto, uma forma
embrionária de FGF (eFGF, um FGF de Xenopus semelhante ao FGF4 de mamíferos) é
encontrada no mesoderma posterior e do broto da cauda de Xenopus e tem os mesmos
efeitos que FGF2 (Isaacs et al., 1992). A super expressão de eFGF estimula vários
genes expressos posteriormente, incluindo o homólogo de caudal em Xenopus. Isso,
por sua vez, parece ativar a expressão de genes Hox mais posteriores, levando à maior
especificação posterior do sistema nervoso (Pownall et al., 1996).
Além dos FGFs, outros fatores podem estar envolvidos na padronização do siste-
ma nervoso de Xenopus. Quando gástrulas precoces de Xenopus são tratadas com
concentrações nanomolares a micromolares de ácido retinóico (AR), seu desenvolvi-
mento do cérebro anterior e intermediário é prejudicado de forma dependente das
concentrações usadas (Figura 15.34A; Papalopulu et al., 1991; Sharpe, 1991). Quando
são usadas concentrações mais baixas, a indução do tecido neural não parece ser
inibida, mas são produzidas menos mensagens e estruturas do cérebro anterior (Figu-
ra 15.34B; Durston et al., 1989, 1991; Sive et al., 1990). O ácido retinóico parece afetar
tanto o mesoderma como o ectoderma. Ruiz i Altaba e Jessell (1991) verificaram que o
mesoderma dorsal anterior de gástrulas tratadas com ácido retinóico eram incapazes
o
jetad
Figura 15.35
ão
Xwnt3a pode caudalizar o tecido neural anteri-
Embri
a
Não in
Xwnt3
or. Explantes de ectoderma competente liga-
dos ao lábio dorsal do blastóporo foram isola-
dos como na Figura 15.30. Os mRNAs espe-
cíficos expressos foram identificados por PCR XAG1 Glândula do cimento
de transcriptase reversa. Nesta figura, os
marcadores neurais expressos mais anterior-
XANF2 Glândula pituitária
mente estão localizados mais ao alto. A
superexpressão de Wnt3a no embrião com
Xwnt3a anulou os marcadores neurais mais OtxA Cérebro anterior
anteriores. As regiões ectodérmicas de em-
briões não injetados ou aquelas superexpres-
sando uma proteína controle (prolactina) não En2 Cérebro intermediário
foram afetadas. (de McGrew et al., 1995; foto-
grafia cortesia de R. T. Moon.) Krox20 Cérebro posterior
Xlhbox6 Medula espinhal
NCAM Neural (geral)
Actina muscular Mesoderma
de induzir estruturas da cabeça em embriões hospedeiros, e Sive e Cheng (1991)

encontraram que o ectoderma tratado com ácido retinóico não respondia à indução
anterior do mesoderma de gástrulas não tratadas. Outro candidato para fator de
caudalização é o Wnt3a de Xenopus (McGrew et al., 1995). Essa proteína é encontrada
no ectoderma neural da nêurula precoce. Quando o ectoderma é isolado das gástrulas
de Xenopus mas permanece ligada ao lábio dorsal do blastóporo, o ectoderma desen-
volve uma seqüência de marcadores neurais ântero-posteriores. Se o embrião tivesse
sido injetado com RNA de Xwnt3a (causando a super expressão dessa proteína), os
marcadores anteriores seriam perdidos (Figura 15.35).
& Especulações
Sinais verticais e horizontais do organizador
N OSSA DISCUSSÃO se limitou,

até o momento, aos sinais que
vão verticalmente do organiza-
dor ao ectoderma que a ele se sobrepõe.
Sabe-se agora que existe um segundo
volvidos nas atividades neuralizantes do
organizador. É possível que eles forneçam
os sinais que faltam para ativar a neurula-
ção (como oposto aos sinais que bloque-
iam a ventralização). Se sinais planares
movimentando-se do lábio dorsal do
blastóporo através do ectoderma são res-
ponsáveis pela indução neural, então a
fonte original de tais sinais deveria ser o
Sinais
conjunto de sinais que é produzido pelo verticais Sinal
lábio dorsal do blastóporo e enviado planar
horizontalmentre através do plano do
Figura 15.36
ectoderma (Figura 15.36). Dados recentes Duas maneiras de induzir o eixo dorsal. No Arquêntero
sugerem que ambas, a indução vertical mecanismo planar, moléculas são transferidas
através do cordomesoderma e a indução do tecido do lábio dorsal do blastóporo através
horizontal (planar) através do ectoderma, do plano do ectoderma. No mecanismo verti- Lábio dorsal
são necessárias para a indução embrio- cal, moléculas solúveis do cordomesoderma Blastocele do blastóporo
nária completa. E qual seria o papel des- derivado do lábio dorsal do blastóporo indu-
ses sinais? Primeiro, existe alguma evidên- zem as células acima delas para se tornarem
cia que sinais planares podem estar en- tecido neural. (de Doniach, 1993.) Anterior Posterior
epitélio da zona marginal dorsal e não as (A) Pólo (B)

células mesenquimatosas profundas da- animal
Corte
quela zona do organizador. Shih e Keller
(1992) mostraram que isso é correto. Eles
repetiram os experimentos de Spemann e Ventral
Mangold, mas em lugar de usar a zona
marginal dorsal (DMZ) inteira, eles trans-
plantaram as células epiteliais ou as célu- Corte
las profundas da DMZ (as quais marca- Blastóporo
ram com partículas fluorescentes de
dextrano). As células epiteliais tinham to- Dorsal
das as propriedades indutivas do organi-
zador de Spemann e se diferenciaram em
tecido mesodérmico. O epitélio também
recuperou os embriões ventralizados por
irradiação com luz ultravioleta. Essas ati-
vidades do organizador não puderam ser
realizadas nem pelas células profundas da
DMZ nem pelas células marginais ven-
trais. Uma proteína indutora, recentemen-
te descoberta, Xenopus nodal-related-3
(Xnr3), foi encontrada nessa camada su- (C) Embrião controle (D) Tecido do explante
perficial do organizador, e pode converter
hemisférios pigmentados do pólo animal Figura 15.37
em ectoderma neural anterior. Ao contrá- Padrão de expressão dos marcadores neurais induzidos por contato com o lábio dorsal do
rio de outros indutores, ela não dorsaliza blastóporo no plano do ectoderma. (A) Seção sagital de gástrula precoce de Xenopus mostrando
o mesoderma. Ainda não se sabe se essa onde foram feitos os cortes. (B) Explante demonstrando a polaridade ântero-posterior esperada
proteína é parte do sistema sinalizador pelo mapa de destino: a região branca é a epiderme; a região pontilhada é o neuroectoderma
planar (Hansen et al., 1997). presuntivo; a região colorida é o mesoderma dorsal; a região estriada é o teto do arquêntero. Os
Entretanto, os sinais planares não são explantes foram colocados sob lamínulas para impedir a migração do mesoderma. (C) Expressão
considerados suficientes para a indução dos marcadores neurais no embrião controle, estágio 21. Os genes homeobox engrailed-2 e
neural. Nieuwkoop e Koster (1995) impedi- XlHbox6 são expressos na borda do cérebro do posterior–intermediário e na medula espinhal,
ram a ocorrência de indução vertical du- respectivamente; o gene Krox-20 da proteína do dedo de zinco é expresso nos rombômeros 3 e 5
rante a gastrulação de Xenopus, e obser- do cérebro posterior. (D) A mesma ordem de expressão é vista no ectoderma daqueles explantes
varam que não houve diferenciação neural. tendo uma conexão com o lábio dorsal do blastóporo. (De acordo com Doniach et al., 1992.)
Além do mais, se o fragmento ligante de
fibronectina, RGD, for injetado na blasto- precoces de Xenopus de tal forma que o dá através da notoplaca (o ectoderma
cele de gástrulas de Rana pipiens, o ectoderma retém contato com o lábio dor- acima da notocorda).
mesoderma axial não migra em direção ao sal do blastóporo mas não com o meso- No terceiro modelo, os sinais plana-
pólo animal. Em lugar disso, ela se divide derma, não só são induzidos no ectoderma res complementam os sinais verticais na
em dois ramos que involuem horizontal- os marcadores pan-neurais NCAM e NF- criação do tubo neural. Os sinais plana-
mente ao longo do equador do embrião, 3, mas também são expressos quatro res parecem estar envolvidos na indução
formando duas notocordas localizadas la- marcadores neurais específicos para po- da extensão convergente do cérebro pos-
teralmente. Cada notocorda induz uma pla- sição -engrailed-2, Krox-20, XlHbox1 e terior e do ectoderma da medula espinhal
ca neural, mas uma placa neural não se for- XlH-box6- no explante de ectoderma na adjacente a ele (enquanto que o dobra-
ma no ectoderma dorsal, onde os sinais seqüência ântero-posterior apropriada mento da placa neural em um tubo neural
planares se espalhariam (Saint-Jeannet e (Figura 15.37). Parece então que os sinais parece ser induzido pela notocorda) (Keller
Dawid, 1994). Assim, nesse modelo, os si- horizontalmente indutivos do lábio dor- et al., 1992; Nieuwkoop e Koster, 1995).
nais planares são redundantes ou podem sal do blastóporo são suficientes para in- Ainda estamos tentando localizar todos
apoiar os sinais verticais da notocorda. duzir o padrão neural ântero-posterior. os pedaços do quebra-cabeça da indução,
No segundo modelo, os sinais plana- Ruiz i Altaba (1992) também confirmou uma enquanto novos pedaços estão sendo
res podem ser importantes contribuintes extensa padronização neural nessas exo- descobertos. Spemann previu que os ci-
para a especificidade regional da indução. gástrulas, mostrando que o padrão de entistas descobririam que o embrião usa-
Doniach e seus colegas (1992) mostraram marcadores neurais nas exogástrulas re- va mais de um mecanismo (“segurança
que informações instrutivas, posicional- flete os padrões normais, com exceção dupla”) para atingir seus objetivos. O
mente específicas são fornecidas por sido cérebro anterior e regiões ventrais. embrião pode muito bem estar usando
nais planares atravessando o ectoderma. Ele também fornece evidência de que a ambos os sinais planares e verticais para
Quando são usados explantes de gástrulas transmissão desses sinais horizontais se induzir seu sistema nervoso.
Genes homeobox na especificação neural
Uma das mais espetaculares descobertas desta década foi que moscas e camundon-
gos usam os mesmos genes homeobox para especificar regiões ao longo do eixo
ântero-posterior. Entretanto, a análise dos genes homeobox em Xenopus não pro-
grediu tanto devido a impossibilidade de se fazer anulação (“knock out”) de genes
nessas rãs. Como veremos no Capítulo 16, o ácido retinóico é capaz de converter
uma parte do corpo do camundongo em uma parte mais posterior, causando a ex-
pressão de genes homeobox que são característicos da região mais posterior. Isso
também se dá em Xenopus. Tanto o ácido retinóico como o eFGF se mostraram
capazes de alterar a expressão de genes Hox. Pownall e colegas (1996) mostraram
que o eFGF promove a expressão de genes Hox posteriores no ectoderma de Xeno-
pus, e tanto Cho e colegas (1991b) como Sive e Cheng (1991) mostraram que o ácido
retinóico altera a expressão de genes homeobox em uma direção posterior tanto no
ectoderma como no mesoderma. Assim, em uma variação do modelo de dois estági-
os antes proposto, agora propõe-se que a indução neural leva à criação de uma
determinação neural anterior (do tipo cérebro anterior) que é influenciada por um
gradiente posterior de ácido retinóico, eFGF ou Wnt3a para a criação de
especificidades regionais (Otte et al., 1991; Sharpe, 1991). Tal gradiente de ácido
retinóico (dez vezes maior no posterior do que no anterior) foi detectado no meso-
derma dorsal de nêurulas precoces de Xenopus (Chen et al., 1994).
Competência e cascatas indutivas

As interações indutivas primárias, apesar de complexas, não podem construir o em-
brião inteiro. Entretanto, a formação do tubo neural, mesoderma dorsal, endoderma
faríngeo e outros tecidos cria as condições para uma cascata de eventos indutivos
posterior. Interações pelas quais um tecido interage com outro para dirigir especifica-
mente seu destino são chamadas interações secundárias.*
Qualquer sistema de indução embrionária tem pelo menos dois componentes: um
tecido capaz de produzir o estímulo indutor e um tecido capaz de receber e responder
ao estímulo. Até agora, estivemos vendo a especificidade de produção; agora precisa-
mos ver a especificidade das células que respondem ao estímulo. A habilidade para
responder de uma forma específica a um dado estímulo é chamada competência. Nós
vimos que na gástrula precoce, um lábio do blastóporo implantado pode induzir uma
nova placa neural e eixo embrionário em qualquer lugar do embrião onde ele pode
encontrar ectoderma. Entretanto, com o aumento da idade embrionária, o ectoderma
perde sua habilidade de responder, e a implantação de um lábio dorsal do blastóporo
abaixo da epiderme prospectiva de um embrião em estágio de nêurula, não causará a
formação de uma nova placa neural. O embrião perdeu sua competência para respon-
der ao novo lábio do blastóporo.
Apesar do ectoderma da nêurula tardia não ser mais competente para responder
ao lábio do blastóporo, ela se tornou competente para responder a novos indutores.
Essa competência pode ser localizada em áreas determinadas. Durante a gastrulação
e neurulação precoce, o ectoderma da cabeça (mas não o ectoderma do tronco) se
torna competente para formar o cristalino, o nariz e os placódios do ouvido. Essa
competência é adquirida porque a região da placa neural está atuando sobre ele
(Henry e Grainger, 1990). Assim, a região da cabeça na nêurula é agora competente
para responder ao contato da vesícula óptica (derivada do cérebro anterior) para se
tornar cristalino.
*Apesar das induções que se seguem às induções embrionárias “primárias“ terem, freqüente-
mente, sido chamadas de “secundárias”, não existe diferença conceitual entre elas. Retornaremos às
induções secundárias no Capítulo 17.
Mais ainda, uma vez que um tecido foi induzido, ele pode induzir outros tecidos.
Os blastômeros D1 do centro de Nieuwkoop induzem as células acima dele a se torna-
rem o organizador. O organizador então induz o ectoderma acima dele a se tornar o
tubo neural. O tubo neural pode induzir o ectoderma da cabeça a formar o cristalino. E
as induções continuam. Mais ainda, um tecido pode induzir vários outros. O organiza-
dor induz tanto o mesoderma como o ectoderma. A Sonic hedgehog da notocorda não
induz somente a placa do assoalho no tubo neural; originando-se tanto da placa do
assoalho como da notocorda, A Sonic hedgehog induz o somito ventral mediano a se
tornar o esclerótomo formador de cartilagem (veja Figura 9.6; Fan e Tessier-Lavigne,
1994; Johnson et al., 1994). Continuaremos nossa discussão de induções secundárias
no Capítulo 17.
Estamos finalmente dando nomes aos “agentes” e “fatores solúveis” dos embrio-
logistas experimentais. Estamos finalmente delineando as vias intercelulares dos fato-
res parácrinos e fatores de transcrição que constituem os primeiros passos nos pro-
cessos da organogênese. O programa internacional de pesquisa iniciado pelo labora-
tório de Spemann na década de 1920 está chegando a sua conclusão. Mas essa pes-
quisa encontrou níveis de complexidade muito mais profundos que Spemann teria
concebido, e da mesma forma que seus experimentos nos mostraram o quanto não
sabíamos, assim hoje, enfrentamos um novo conjunto de problemas gerados pelas
nossas soluções aos problemas mais velhos: Como é iniciado o centro de Nieuwkoop?
Qual é a atividade de Siamois? Como o mesoderma se torna padronizado? Como são
limitados os sinais da notocorda? Como a notocorda se diferencia? Como o ectoderma
adquire sua competência?
Analisando o campo em 1927, Spemann observou:
Nós ainda estamos em presença de enigmas, mas não sem a esperança de os
resolver. E enigmas com esperança de solução - o que mais um cientista poderia
desejar?
O desafio ainda permanece.
LITERATURA CITADA
Allen, G. E. 1985. Thomas Hunt Morgan: Blumberg, B., Wright, C. V. E., De Robertis, E. Cho, K. W. Y, Morita, A. A., Wright, C. V. E.
Materialism and reductionism in the develop- M. and Cho, K. W. Y. 1991. Organizer-specific and De Robertis, E. M. 1991b. Overex-pression
ment of modern genetics. Trends Genet. 3: 151- homeobox genes in Xenopus laevis embryos. of a homeodomain protein confers axis-forming
154; 186-190. Nature 253: 194-196. activity to uncommitted Xenopus embryonic
cells. Cell 65: 55-64.
Appel, T. A. 1987. The Cuvier-Geoffroy Deba- Bouwmeester, T., Kim, S.-H., Sasai, Y., Lu, B.
te: French Biology in the Decades before and De Robertis, E. M. 1996. Cerberus is a head- Cooke, J. and Webber, J. A. 1985. Dynamics of
Darwin. Oxford University Press, NY. inducing secreted factor expressed in the anteri- the control of body pattern in the development
or endoderm of Spemann’s organizer. Nature 382: of Xenopus laevis. J. Embryol. Exp. Morphol.
Amaya, E., Musci. T. J. and Kirschner, M. W.
595-601. 88: 85-99.
1991. Expression of a dominant negative mutant
of the FGF receptor disrupts mesoderm forma- Brannon, M. and Kimelman, D. 1996. Activation Cornell, R. A. and Kimelman, D. 1994. Ac-tivin-
tion in Xenopus embryos. Cell 66: 257-270. of Siamois by the Wnt pathway. Dev. Biol. 180: mediated mesoderm induction requires FGF. De-
344-347. velopment 120: 453-462.
Berrill, N. J. and Liu, C. K. 1948. Germplasm,
Weismann, and hydrozoa. Q. Rev. Biol. Buss, L. 1987. The Evolution of Individuality. Cornell, R. A., Musci, T. J. and Kimelman, D. 1995.
23:124-132. Princeton University Press, Princeton, NJ. FGF is a prospective competence factor for early
activin-type signals in Xenopus mesoderm
Bïjtel, J. H. 1931. Über die Entwicklung des Chen, Y. P., Huang, L. and Solursh, M. 1994. A
induction. Development 121: 2429-2437.
Schwanzes bei Amphibien. Wilhelm Roux Arch. concentration gradient of retinoidsin the early
Entwicklungsmech. Org. 125: 448-486. Xenopus laevis embryo. Dev. Biol,161: 70-76. Cox, W. G. and Hemmati-Brivanlou, A.
1995. Caudalization of neural fate by tissue
Blitz, I. L. and Cho, K. W. Y. 1995. Anterior Cho, K. W. Y, Blumberg, B., Steinbeisser, H.
recombination and bFGF. Development 121:
neurectoderm is progressively induced during and De Robertis, E. 1991a. Molecular nature
4349-4358.
gastrulation: the role of the Xenopus of Spemann’s organizer: The role of the Xe-
homeobox gene orthodenticle. Development nopus homeobox gene goosecoid. Cell 67:
121: 993-1004. 1111-1120.
Cui, Y., Tian, Q. and Christian, J. L. 1996. Interactions in Early Development. Wiley-Liss, Gimlich, R. L. and Cook, J. 1983. Cell lineage
Synergistic effects of Vgl and Wnt signals in the New York, pp. 109-127. and the induction of nervous systems in
specification of dorsal mesoderm and endoderm. amphibian development. Nature 306: 471-473.
Dev. Biol. 180: 22-34. Durston, A., Timmermans, A., Hage, W. J.,
Hendriks, H. F. J., de Vries, N. J., Heideveld, M. and Gimlich, R. L. and Gerhart, J. C. 1984. Early cellular
Cunliffe, V. and Smith, J. C. 1992. Ectopic Nieuwkoop, P. D. 1989. Retinoic acid causes an interactions promote embryonic axis formation
mesoderm formation in Xenopus embryos caused anteroposterior transformation in the developing in Xenopus laevis. Dev. Biol. 104: 117-130.
by widespread expression of a Brachyury homo- central nervous system. Nature 330: 140-144.
Gont, L. K., Steinbeisser, H., Blumberg, B.
logue. Nature 358: 427-430.
Echelard, Y, Epstein, D. J., St-Jacques, B., Shen, and De Robertis, E. M. 1993. Tail formation
Dale, L. and Slack, J. M. W. 1987. Regional L., Mohler, J., McMahon, J. A. and McMahon, A. as a continuation of gastrulation: the multiple
specificity within the mesoderm of early 1993. Sonic hedgehog, a member of a family of tail populations of the Xenopus tailbud deri-
embryos of Xenopus laevis. Development 100: putative signaling molecules, is implicated in the ve from the late blastopore lip. Development
279-295. regulation of CNS polarity. Cell 75: 1417-1430. 119: 991-1004.
Dale, L. Howes, G., Price, B. M. J. and Smith, J. Ettensohn, C. A. and McClay, D. R. 1988. Cell Graff, J. M., Thies, R. S., Song, J. J., Celeste, A.
C. 1992. Bone morphogenetic protein 4: a lineage conversion in the sea urchin embryo. J. and Melton, D. A. 1994. Studies with a Xeno-
ventralizing factor in early Xenopus develop- Dev. Biol. 125: 396-409. pus BMP receptor suggest that ventral meso-
ment. Development 115: 573-585. derm-inducing signals override dorsal signals in
Fan, C.-M. and Tessier-Lavigne, M. 1994. vivo. Cell 79: 169-179.
Dale, L., Matthew, G. and Coleman, A. 1993. Patterning of mammalian somites by surface
Secretion and mesoderm-inducing activity of the ectoderm and notochord: Evidence for sclero- Guger, K. A. and Gumbiner, B. M. 1995. b-
TGF-b related domain of Xenopus Vg1. EMBO tome induction by sonic hedgehog. Cell 79: catenin has wnt-like activity and mimics the
J. 12: 4471-1480. 1175-1186. Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-
ventral patterning. Dev. Biol. 172: 115-125.
Davids, M. 1988. Protein kinases in amphibian Fässler, P. E. and Sander, K. 1996. Hilde Mangold
ectoderm induced for neural differentiation. (1898-1924) and Spemann’s organizer: Achie- Hamburger, V. 1984. Hilde Mangold, co-discoverer
Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. 197: 339-344. vement and tragedy. Roux Arch. Dev. Biol. 205: of the organizer. J. Hist. Biol. 17: 1-11.
323-332.
Davids, M., Loppnow, B., Tiedemann, H. and Hamburger, V. 1988. The Heritage of Experi-
Tiedemann, H. 1987. Neural differentiation of Funayama, N., Fagotto, F., McCrea, P. and mental Embryology: Hans Spemann and the
amphibian gastrula ectoderm exposed to phorbol Grumbiner, B. M. 1995. Embryonic axis Organizer. Oxford University Press, Oxford.
ester. Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol 106: 137- induction by the armadillo repeat domain of b-
Hansen, C. S., Marion, C. D., Steele, K., George, S.
140. catenin: Evidence for intracellular signalling. J.
and Smith, W. C. 1997. Direct neural induction
Cell Biol. 128: 959-968.
De Robertis, E. M. and Sasai, Y. 1996. A common and selective inhibition of mesoderm and epidermis
plan for dorsoventral patterning in Bilateria. Gawantka, V., Delius, H., Hirschfeld, K., inducers by Xnr3. Development 124: 483-492.
Nature 380: 37-40. Blumenstock, C. and Niehrs, C. 1995. Antagoni-
Haraway, D. J. 1976. Crystals, fabrics and Fields:
zing the Spemann organizer: Role of the homeobox
De Robertis, E. M., Blum, M., Niehrs, C. and Metaphors of Organicism in Twentieth-Century
gene Xvent-1. EMBO J. 14: 6268-6279.
Steinbeisser, H. 1992. Goosecoid and the Biology. Yale University Press, New Haven.
organizer. Development 1992 Suppl.: 167-171. Geoffroy Saint-Hilaire, E. 1822. Considérations
Harrington, A. 1996. Reenchanted Science: Holism
gén’rales sur la vertèbre. Mém. Mus. Hist. Natur.
Doniach, T. 1993. Planar and vertical induction in German Culture from Wilheim II to Hitler.
9: 89-119.
of anteroposterior pattern during the develop- Princeton University Press, Prince-ton, NJ.
ment of the amphibian central nervous system. Gerhart, J. C., Danilchik, M., Doniach, T., Roberts,
Hawley, S. H. B. Wünnenberg,-Stapleton, K.,
J. Neurobiol. 24: 1256-1275. S., Browning, B. and Stewart, R. 1989. Cortical
Hashimoto, C., Laurent, M. N., Watabe, T.,
rotation of the Xenopus egg: Consequences for
Doniach, T. 1995. Basic FGF as an induced Blumberg, B. W. and Cho, K. W. Y. 1995.
the anteroposterior pattern of embryonic dorsal
of anteroposterior neural pattern. Cell 83: Disruption of BMP signals in embryonic Xeno-
development. Development [Suppl.] 107: 37-51.
1067-1070. pus ectoderm leads to direct neural induction.
Gilbert. S. F. and Faber, M. 1996. Looking at Genes Dev. 9: 2923-2935.
Doniach, T., Phillips, C. R. and Gerhart, J. C.
embryos: The visual and conceptual aesthetics
1992. Planar induction of anteroposterior He, X., Saint-Jeannet, J .-P., Woodgett, J. R.,
of embryology. In A. I. Tauber (ed.) The Elusive
pattern in the developing central nervous system Varmus, H. E. and Dawid, I. B. 1995. Glycogen
Synthesis.: Aesthetics and Science. Kluwer Press,
of Xenopus laevis. Science 257: 542-545. synthase kinase-3 and dorsoventral patterning
Dordecht. pp. 125-151.
in Xenopus embryos. Nature 374: 617-622.
Driesch, H. 1892. The potency of the first two
Gilbert, S. F., Opitz, J. and Raff, R. A. 1996.
cleavage cells in echinoderm development. Ex- Heasman, J. M. and eight others. 1994.
Resynthesizing evolutionary and developmen-
perimental production of partial and double Overexpression of cadherins and underex-
tal biology. Dev. Biol. 173: 357-372.
formations. In B. H. Willier and J. M. pression of b-catenin inhibit dorsal mesoderm
Oppenheimer (eds.), Foundations of Experimen- Gilbert, S. F. and Saxén, L. 1993. Spemann’s induction in early Xenopus embryos. Cell 79:
tal Embryology. Hafner, New York. Organizer: Models and molecules. Mech. Dev. 791-803.
41: 73-89.
Driesch, H. 1893. Zur Verlagerung der Blasto- Hemmati-Brivanlou, A. and Melton, D. A. 1992.
meren des Echinideneies. Anat. Anz. 8: 348-357. Gimlich, R. L. 1985. Cytoplasmic localization A truncated activin receptor inhibits mesoderm
and chordamesoderm induction in the frog induction and formation of axial structures in
Driesch, H. 1894. Analytische Theorie de or-
embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 89: 89-111. Xenopus embryos. Nature 359: 609-614.
ganischen Entwicklung. W. Engelmann, Leipzig.
Gimlich, R. L. 1986. Acquisition of develop- Hemmati-Brivanlou, A. and Melton, D. 1994.
Durston, A. and Otte, A. P. 1991. A hierarchy of
mental autonomy in the equatorial region of Inhibition of activin signalling promotes
signals mediates neural induction in Xenopus
the Xenopus embryo. Dev. Biol. 116: 340-352. neuralization in Xenopus. Cell 77: 273-281.
laevis. In J. Gerhart (ed.), Cell-Cell
Hemmati-Brivanlou, A. and Thomsen, G. H. Kageura, H. and Yamana, K. 1983. Pattern Maeno, M., Ong, R. C., Suzuki, A., Ueno, N. and
1995. Ventral mesodermal patterning in Xeno- regulation in isolated halves and blastomeres of Kung, H. F. 1994. A truncated bone morphoge-
pus embryos: Expression patterns and activities early Xenopus laevis. J. Embryol. Exp. Morphol. nesis protein-4 receptor alters the fate of ven-
of BMP-2 and BMP-4. Dev. Genet. 17: 78-89. 74: 221-234. tral mesoderm to dorsal mesoderm—role of ani-
mal pole tissue in the development of ventral
Henry, J. J. and Grainger, R. M. 1990. Early Kageura, H. and Yamana, J. 1986. Pattern for-
mesoderm. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
tissue interactions leading to embryonic lens mation in 8-cell composite embryos of Xenopus
10260-10264.
formation in Xenopus laevis. Dev. Biol. 141: laevis. J. Embryol. Exp. Morphol. 91: 79-100.
149-163. Mangold, O. 1933. Über die Induktions-fahigkeit
Keller, R. E. 1976. Vital dye mapping of the
der verschiedenen Bezirke der Neurula von
Henry, J. J., Amemiya, S., Wray, G. A. and Raff, gastrula and neurula of Xenopus laevis II.
Urodelen. Naturwissenschaften 21: 761-766.
R. A. 1989. Early inductive interac-tions are Prospective areas and morphogenetic move-
involved in restricting cell fates of mesomeres ments of the deep layer. Dev. Biol. 51: 118-137. Marcus, N. H. 1979. Developmental aberrations
in sea urchin embryos. Dev. Biol. 136: 140-153. associated with twinning in laboratory-reared sea
Keller, R., Shih, J., Sater, A. K. and Moreno, C.
urchins. Dev. Biol. 70: 274-277.
Hertwig, O. 1894. Zeit- und Streitfragen der 1992. Planar induction of convergence and
Biologie I. Präformation oder Epigenese? extension of the neural plate by the or-ganizer Maruyama, Y. K., Nakaseko, Y. and Yagi, S.
Grundzüge einer Entwicklungstheorie der of Xenopus. Dev. Dyn. 193: 218-234. 1985. Localization of the cytoplasmic determi-
Organismen. Gustav Fischer, Jena. nants responsible for primary mes-enchyme
Kessler, D. S. and Melton, D. A. 1995. In-duction
formation and gastrulation in the unfertilized
Holley S. A., Jackson, P. D., Sasai, Y., Lu, B., De of dorsal mesoderm by soluble, mature Vg1
eggs of the sea urchin Hemicen-trotus pulcher-
Robertis, E. M., Hoffmann, F. M. and Ferguson, protein. Development 121: 2155-2164.
rimus. J. Exp. Zool. 236: 155-163.
E. L. 1995. A conserved system for dorsal-ven-
Khaner, O. 1995. The rotated hypoblast of the
tral patterning in insects and vertebrates involving McClendon, J. F. 1910. The development of
chicken embryo does not initiate an ectopic axis
sog and chordin. Nature 376: 249-253. isolated blastomeres of the frog’s egg. Am. J.
in the epiblast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
Anat. 10: 425-430.
Hoppler, S, Brown, J. D. and Moon, R. T. 1996. 10733-10737.
Expression of a dominant negative Wnt blocks McGrew, L. L., Lai, C.-J. and Moon, R. T. 1995.
Khaner, O. and Wilt, F. 1990. The influence of
induction of MyoD in Xenopus embryos. Genes Specification of the anteroposterior neural axis
cell interactions and tissue mass on dif-
Dev. 10: 2805-2817. through synergistic interaction of the wnt
ferentiation of sea urchin mesomeres. De-
signaling cascade with noggin and follistatin. Dev.
Hörstadius, S. 1928. Über die Determination des velopment 109: 625-634.
Biol. 172: 337-342.
Keimes bei Echinodermen. Acta Zool. 9:1-191.
Khaner, O. and Wilt, F. 1991. Interactions of
McMahon, A. P. and Moon, R. T. 1989. Ectopic
Hörstadius, S. 1935. Über die Determination im different vegetal cells with mesomeres during
expression of the proto-oncogene int-1 in Xe-
Verlaufe der Eiachse bei Seeigeln. Publ. Staz. early stages of sea urchin development. Deve-
nopus leads to duplication of the embryonic axis.
Zool. Napoli 14: 251-479. lopment 112: 881-890.
Cell 58: 1075-1084.
Hörstadius, S. 1939. The mechanics of sea urchin Ku, M. and Melton, D. A. 1993. Xwnt-11, a
Mead, P. E., Brivanlou, I. H., Kelly, C. M. and
development studied by operative methods. Biol. maternally expressed Xenopus wnt gene. Deve-
Zon, L. I. 1996. BMP-4-responsive regulation
Rev. 14: 132-179. lopment 119: 1161-1173.
of dorsal-ventral patterning by the homeobox
Hörstadius, S. and Wolsky, A. 1936. Studien Über LaBonne, C. and Whitman, M. 1994. Mesoderm protein Mix.l. Nature 382: 357-360.
die Determination der Bilateral-symmetrie des induction by activin requires FGF-mediated
Nakamura, O. and Takasaki, H. 1970. Further
jungen Seeigelkeimes. Wil-helm Roux Arch. intracellular signals. Development 120: 463-472.
studies on the differentiation capacity of the
Entwicklungsmech. Org. 135: 69-113.
Lamb, T. M. and Harland, R. M. 1995. Fi-broblast dorsal marginal zone in the morula of Triturus
Huxley, J. S. and deBeer, G. R. 1934. Elements of growth factor is a direct neural inducer, which pyrrhogaster. Proc. Japan Acad. 46: 700-705.
Experimental Embryology. Cambridge Univer- combined with noggin generates anterior-pos-
Niehrs, C., Keller, R., Cho, K. W. Y. and De
sity Press, Cambridge. terior pattern. Development 121: 3627-3636.
Robertis, E. M. 1993. The homeobox gene
Isaacs, H. V., Tannahill, D. and Slack, J. M. W. Lamb, T. M. and seven others. 1993. Neural goosecoid controls cell migration in Xenopus
1992. Expression of a novel FGF in the Xeno- induction by the secreted polypeptide noggin. embryos. Cell 72: 491-503.
pus embryo. A new candidate inducing factor for Science 262: 713-718.
Nieuwkoop, P. D. 1952. Activation and
mesoderm formation and anteroposterior
Larabell, C. A. and seven others. 1997. organization of the central nervous system in
specificiation. Development 114: 711-720.
Establishment of the dorsal-ventral axis in Xe- amphibians.III. Synthesis of a new working
Jacobson, M. 1984. Cell lineage analysis of neural nopus embryos is presaged by early asymmetries hypothesis. J. Exp. Zool. 120: 83-108.
induction: Origins of cells forming the induced in b-catenin which are modulated by the Wnt
Nieuwkoop, P. D. 1969. The formation of the
nervous system. Dev. Biol. 102: 122-129. signaling pathway. J. Cell Biol. 136: 1123-1136.
mesoderm in urodele amphibians. I. Induction
Johnson, R. L., Laufer, E., Riddle, R. D. and Lemaire, P., Garrett, N. and Gurdon, J. B. 1995. by the endoderm. Wilhelm Roux Arch. Entwi-
Tabin, C. 1994. Ectopic expression of sonic Expression cloning of Siamois, a Xenopus cklungsmech. Org. 162: 341-373.
hedgehog alters dorsal-ventral patterning of homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells
Nieuwkoop, P. D. 1973. The “organisation
somites. Cell 79: 1165-1173. of blastulae and able to induce a complete
center” of the amphibian embryo: Its origin,
secondary axis. Cell 81: 85-94.
Jones, C. M., Lyons, K. M., Lapan, P. M., spatial organisation and morphogenetic action.
Wright, C. V. E. and Hogan, B. L. M. 1992. Lustig, K. D., Kroll, K., Sun, E., Ramos, R., Adv. Morphogen. 10: 1-39.
Elmendorf, H. and Kirschner, M. W. 1996. A Xe-
DVR-4 (bone morphogenetic protein-4) as a Nieuwkoop, P. D. 1977. Origin and esta-
nopus nodal-related gene that acts in synergy with
posterior-ventralizing factor in Xenopus meso- blishment of embryonic polar axes in
noggin to induce complete secondary axis and
derm induction. Development 115: 639-647. amphibian development. Curr. Top. Dev.
notochord formation. Development 122: 3275-3282.
Biol. 11: 115-132.
Nieuwkoop, P. D. and Koster, K. 1995. Vertical Roll-Hansen, N. 1978. Drosophila genetics: A Seleiro, E. A. P., Connolly, D. J. and Cooke, J.
versus planar induction in amphibian early deve- reductionist research program. J. Hist. Biol. 11: 1996. Early developmental expression and ex-
lopment. Develop. Growth Differ. 37: 653-688. 159-210. perimental axis determination by the chick Vg1
gene. Curr. Biol. 6: 1476-1486.
Northrop, J., Woods, A., Seger, R., Suzuki, A., Roux, W. 1888. Contributions to the develop-
Ueno, N., Krebs, E. and Kimelman, D. 1995. mental mechanics of the embryo. On the artificial Sharpe, C. R. 1991. Retinoic acid can mimic
BMP-4 regulates the dorsal-ventral differences production of half-embryos by destruction of one endogenous signals involved in transformation of
in FGF/MAPKK-mediated mesoderm induction of the first two blastomeres and the later develop- the Xenopus nervous system. Neuron 7: 239-247.
in Xenopus. Dev. Biol. 172: 242-252. ment (postgeneration) of the missing half of the
Shih, J. and Keller, R. 1992. The epithelium of
body. In B. H. Willier and J. M. Oppenheimer
Otte, A. P. and Moon, R. T. 1992. Protein kinase the dorsal marginal zone of Xenopus has organizer
(eds.), 1974, Foundations of Experimental
C isozymes have distinct roles in neural induction properties. Development 116: 887-899.
Embryology. Hafner, New York, pp. 2-37.
and competence in Xenopus. Cell 68: 1021-1029.
Sive, H. L. and Cheng, P. F. 1991. Retinoic acid
Ruiz i Altaba, A. 1992. Planar and vertical signals
Otte, A. P., Kramer, I. J. M. and Durston, A. J. perturbs the expression of Xhox.lab genes and
in the induction and patterning of the Xenopus
1991. Protein kinase C and regulation of the alters mesodermal determination in Xenopus
nervous system. Development 115: 67-80.
local competence of Xenopus ectoderm. Science laevis. Genes Dev. 5: 1321-1332.
251: 570-573. Ruiz i Altaba, A. and Jessell, T. 1991. Retinoic
Sive, H. L., Draper, B. W., Harland, R. M. and
acid modifies mesodermal patterning in early
Otte, A. P., Koster, C. H., Snoek, G. T. and Weintraub, H. 1990. Identification of a retinoic
Xenopus embryos. Genes Dev. 5: 175-187.
Durston, A. J. 1988. Protein kinase C mediates acid sensitive period during primary axis formation
neural induction in Xenopus laevis. Nature 334: Saint-Jeannet, J.-P. and Dawid, I. B. 1994. Ver- in Xenopus laevis. Genes and Devel 4: 932-942.
818-620. tical versus planar neural induction in Rana
Slack, J. M. W. and Tannahill, D. 1992.
pipiens embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Otte, A. P., van Run, P., Heideveld, M., van Mechanism of anteroposterior axis specification
91: 3049-3053.
Driel, R. and Durston, A. J. 1989. Neural in vertebrates: Lessons from the amphibians.
induction is mediated by cross-talk between the Sakai, M. 1996. The vegetal determinants Development 114: 285-302.
protein kinase C and cyclic AMP pathways. Cell required for the Spemann organizer move
Smith, J. C. and Slack, J. M. W. 1983. Dor-
58: 641-648. equatorially during the first cell cycle. Develop-
salization and neural induction: Properties of
ment 122: 2207-2214.
Papalopulu, N., Clarke, J. D. W., Bradley, L., the organizer in Xenopus laevis. J. Embryol.
Wilkinson, D., Krumlauf, R. and Holder, N. Sander, K. 1991a. Wilhelm Roux and his Exp. Morphol. 78: 299-317.
1991. Retinoic acid causes abnormal develop- programme for developmental biology. Wilhelm
Smith, J. C., Dale, L. and Slack, J. M. W. 1985.
ment and segmental patterning of the anterior Roux Arch. Dev. Biol. 200: 1-3.
Cell lineage labels and region-specific markers
hindbrain in Xenopus embryos. Development
Sander, K. 1991b. “Mosaic work” and “assimi- in the analysis of inductive interactions. J.
113: 1145-1158.
lating effects” in embryogenesis: Wilhelm Roux’s Embryol. Exp. Morphol. [Suppl.] 89: 317-331.
Piccolo, S., Sasai, Y. Lu, B. and De Robertis, E. conclusions after disabling frog blastomeres.
Smith, J. C., Price, B. M. J., Green, J. B. A.,
M. 1996. Dorsoventral patterning in Xenopus: Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. 200: 237-239.
Weigel, D. and Herrmann, B. G. 1991. Expressi-
Inhibition of ventral signals by direct binding of
Sasai, Y., Lu, B., Steinbeisser, H., Geissert, D., on of a Xenopus homolog of Brachyury (T) is
chordin to BMP-4. Cell 86: 589-598.
Gont, L. K. and De Robertis, E. M. 1994. Xe- an immediate-early response to mesoderm
Pierce, S. B. and Kimelman, D. 1995. Regulation nopus chordin: A novel dorsalizing factor induction. Cell 67: 79-87.
of Spemann organizer formation by the activated by organizer-specific homeobox
Smith, W. C. and Harland, R. M. 1991. Injected
intracellular kinase Xgsk-3. Development 121: genes. Cell 79: 779-790.
wnt-8 RNA acts early in Xenopus embryos to
755-765.
Sasai, Y, Lu, B., Piccolo, S. and De Robertis, E. promote formation of a vegetal dorsalizing
Placzek, M., Tessier-Lavigne, M., Yamada, T., M. 1996. Endoderm induction by the organizer- center. Cell 67: 753-765.
Jessell, T. and Dodd, J. 1990. Mesoder-mal control secreted factors chordin and noggin in Xenopus
Smith, W. C. and Harland, R. M. 1992. Expres-
of neural cell identity: Floor plate induction by animal caps. EMBO J. 15: 4547-555.
sion cloning of noggin, a new dorsalizing factor
the notochord. Science 250: 985-988.
Saxén, L. 1961. Transfilter neural induction of localized to the Spemann orga-nizer in Xenopus
Pownall, M. E., Tucker, A. S., Slack, J. M. W. amphibian ectoderm. Dev. Biol. 3: 140-152. embryos. Cell 70: 829-840.
and Isaacs, H. V. 1996. eFGF, Xcad3 and Hox
Saxén, L. and Toivonen, S. 1962. Embryonic Smith, W. C., Knecht, A. K., Wu, M. and Harland,
genes form a molecular pathway that establishes
Induction. Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ. R. M. 1993. Secreted noggin mim-ics the Spe-
the anteropostior axis in Xenopus. Development
mann organizer in dorsalizing Xenopus
122: 3881-3892. Schmidt, J., Francoise, V, Bier, E. and Kimelman,
mesoderm. Nature 361: 547-549.
D. 1995. Drosophila short gastrulation induces
Recanzone, G. and Harris, W. A. 1985.
an ectopic axis in Xenopus: Evidence for Sokol, S, Y. 1996. Analysis of Dishevelled
Demonstration of neural induction using nucle-
conserved mechanisms of dorso-ventral signalling pathways during Xenopus develop-
ar markers in Xenopus. Wilhelm Roux Arch. Dev.
patterning. Development 121: 4319-4328. ment. Curr. Biol. 6: 1456-1467.
Biol. 194: 344-354.
Schmidt, J. E., Dassow, G. van and Kimel-man, D. Sokol, S., Wong, G. and Melton, D. A. 1990. A
Render, J. and Elinson, R. P. 1986. Axis
1996. Regulation of dorsal-ventral patterning: the mouse macrophage factor induces head structu-
determination in polyspermic Xenopus eggs.
ventralizing effects of the novel Xenopus res and organizes a body axis in Xenopus. Science
Dev. Biol. 115: 425-433.
homobox gene Vox. Development 122: 1711-1721. 249: 561-564.
Roelink, H. and ten others. 1994. Floor plate
Schneider, S., Steinbeisser, H., Warga, R. M. and Sokol, S.. Christian, J. L., Moon, R. T. and Melton,
and motoneuron induction by vhh-1, a vertebrate
Hausen, P. 1996. b-catenin transloca-tion into D. A. 1991. Injected wnt RNA induces a com-
homolog of hedgehog expressed by the
nuclei demarcates the dorsalizing centers in frog plete body axis in Xenopus embryos. Cell 67:
notochord. Cell 76: 761-775.
and fish embryos. Mech. Dev. 57: 191-198. 741-752.
Spemann, H. 1918. Über die Determination der Toivonen, S. and Saxén, L. 1968. Morphogene- Wilkins, A. S. 1993. Genetic Analysis of Animal
ersten Organanlagen des Amphibi-enembryo. tic interaction of presumptive neural and Development, 2nd ed. Wiley-Liss, New York.
Wilhelm Roux Arch. Entwicklungsmech. Org. mesodermal cells mixed in different ratios.
Wilson, E. B. 1896. The Cell in Development
43: 448-555. Science 159: 539-540.
and Inheritance. Macmillan, New York.
Spemann, H. 1927. Neue Arbieten über Organi- Toivonen, S. and Wartiovaara, J. 1976.
Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J.
satoren in der tierischen Entwicklung. Naturwis- Mechanism of cell interaction during primary
and Jessell, T. M. 1991. Control of cell pattern
senschaften 15: 946-951. induction studied in transfilter experiments. Di-
in the developing nervous system: Polarizing
fferentiation 5: 61-66.
Spemann, H. 1938. Embryonic Development activity of floor plate and noto-chord. Cell 64:
and Induction. Yale University Press, New Toivonen, S., Tarin, D., Saxén, L., Tarin, P. J. 635-647.
Haven. and Wartiovaara, J. 1975. Transfilter studies
Yamana, K. and Kageura, H. 1987. Reexamina-
on neural induction in the newt. Differentiati-
Spemann, H. and Mangold, H. 1924. Induction tion of the “regulative development” of
on 4: 1-7.
of embryonic primordia by implantation of amphibian embryos. Cell Differ. 20: 3-10.
organizers from a different species. In B. H. Twitty, V. C. 1966. Of Scientists and Salaman-
Yamashida, H. and seven others. 1995.
Willier and J. M. Oppenheimer (eds.), Founda- ders. Freeman, San Francisco. [p. 39]
Osteogenic protein-1 binds to activin type II
tions of Experimental Embryology. Hafner, New
Vincent, J.-P. and Gerhart, J. C. 1987. Sub-cortical receptors and induces certain activin-like
York, pp. 144-184.
rotation in Xenopus eggs: An early step in effects. J. Cell Biol. 130: 217-226.
Spofford, W. R. 1945. Observations on the pos- embryonic axis specification. Dev. Biol. 123:
Yost, C., Torres, M., Miller, J. R., Brown, CJ.
terior part of the neural plate in Amblystoma. J. 526-539.
D., Lai, C.-J. and Moon, R. T. 1996. The axis-
Exp. Zool. 99: 35-52.
Vodicka, M. A. and Gerhart, J. C. 1995. inducing ability, stability, and subcellular
Stennard, F., Carnac G. and Gurdon, J. B. 1996. Blastomere derivation and domains of gene ex- localization of b-catenin is regulated in Xeno-
The Xenopus T-box gene, Antipodean, encodes pression in the Spemann Organizer of Xenopus pus embryos by glycogen synthase kinase 3.
a vegetally localised maternal mRNA and can laevis. Development 121: 3505-3518. Genes Dev. 10: 1443-1454.
trigger mesoderm formation. Development 122:
Waddington, C. H. 1933. Induction by the Zaraisky, A. G., Ecochard, V., Kazanskaya, O.
4179-4188.
primitive streak and its derivatives in the chick. V., Lukyanov, S. A., Fesenko, I. V. and Duprat-
Storey, K., Crossley, J. M., De Robertis, E., J. Exp. Biol. 10: 38-46. A.-M. 1995. The homeobox-con-tainming gene
Norris, W. E. and Stern, C. D. 1992. Neural XANF-1 may control development of the Spe-
Wakahara, M. 1989. Specification and establish-
induction and regionalisation in the chick mann organizer. Development 121: 3839-3847.
ment of dorsal-ventral polarity in eggs and
embryo. Development 114: 729-741.
embryos of Xenopus laevis, Dev. Growth Diff. Zhang, J. and King, M. L. 1996. Xenopus VegT
Tauber, A. I. and Sarkar, S. 1992. The human 31: 197-207. RNA is localized to the vegetal cortex during
genome project: Has blind reductionism gone oogenesis and encodes a novel T-box transcrip-
Weismann, A. 1892. Essays on Heredity and
too far? Perspec. Biol. Med. 35: 220-235. tion factor involved in mesodermal patterning.
Kindred Biological Problems. Translated by E.
Thomsen, G. H. and Melton, D. A, 1993. B. Poulton, S. Schoenland and A. E. Ship-ley.
Processed Vgl protein is an axial mesoderm Clarendon, Oxford. Zimmerman, L. B., De Jesús-Escobar, J. and
inducer in Xenopus. Cell 74: 433-441. Harland, R. M. 1996. The Spemann organizer
Weismann, A. 1893. The Germ-Plasm: A Theory
signal noggin binds and inactivates bone
Toivonen, S. 1979. Transmission problem in of Heredity. Translated by W. Newton Parker
morphogenetic protein 4. Cell 86: 599-606.
primary induction. Differentiation 15: 177-181. and H. Ronnfeld. Walter Scott Ltd., London.
Toivonen, S. and Saxén, L. 1955. The simul-
taneous inducing action of liver and bone
marrow of the guinea pig in implantation and
explantation experiments with embryos of
Triturus. Exp. Cell Res. [Suppl.] 3: 346-357.
CAPÍTULO 16 Estabelecimento dos eixos corporais em mamíferos e aves 635
Estabelecimento dos eixos corporais

em mamíferos e aves 16
Entre o quinto e o décimo dia, a pequena
massa disforme de células germinativas di-
ferencia-se no plano geral da construção do
embrião [do camundongo] e de seus órgãos.
É um pouco como uma massa de ferro trans-
E STE CAPÍTULO DETALHA parte da pesquisa que forneceu conhecimentos
sobre a maneira como foram estabelecidos os eixos do organismo dos mamí-
feros e aves. Muito deste trabalho utiliza dados fornecidos pela análise de
embriões cujo desenvolvimento ficou malformado através de mutações ou rompido
por determinados produtos químicos.
formando-se numa nave espacial. Realmen- Apesar das tentativas do citado savant Geoffroy Saint-Hilaire (que acreditava que
te, esse é o maior milagre que nós ainda po- todos os animais do mundo compartilhavam de um plano corporal em comum), a
demos imaginar e aceitar, e ao mesmo tempo maioria dos biologistas do desenvolvimento não teria predito que o plano corporal de
tão comum, que temos que nos forçar para
moscas e de mamíferos seria especificado pelo mesmo conjunto de genes. Tendo
nos maravilhar com o caráter maravilhoso
divergido há 500 milhões de anos atrás, o corpo da mosca e o corpo do vertebrado
dessa maravilha.
parecem excepcionalmente diferentes. A maioria dos insetos especifica seus eixos no
MIROSLAV HOLUB (1990)
citoplasma comum do blastoderma sincicial, ao passo que os eixos de vertebrados são
É sabido que a natureza trabalha constan- especificados pelas interações indutivas entre grupos de células. No embrião de
temente com os mesmos materiais. Ela é en- Drosophila, o plano corporal geral é especificado enquanto as células são uma mono-
genhosa em variar apenas as formas. Como camada cilíndrica envolvendo o vitelo; nos mamíferos, as células já sofreram extensa
se ela estivesse restrita às mesmas idéias pri- movimentação quando suas partes corporais são especificadas. A formação dos apên-
mitivas, vemo-la tendendo sempre a fazer dices nos insetos resulta da extensão dos discos imaginais, ectodérmicos enquanto o
com que os mesmos elementos reapareçam, membro do mamífero é gerado por complexas interações indutivas entre as células
com o mesmo número, nas mesmas circuns- mesodérmicas e as ectodérmicas que migraram para essas áreas. Porém, estudos re-
tâncias e com as mesmas conexões. centes mostraram que o eixo ântero-posterior de mamíferos em desenvolvimento é
E. GEOFFROY SAINT-HILAIRE (1807) especificado pelos mesmos genes homeóticos que especificam o eixo do corpo de
Drosophila. Realmente, a seqüência homeobox foi chamada a pedra de Rosetta da
Biologia do desenvolvimento (Riddihough, 1992; Slack e Tannahill, 1993), porque nos
permite transferir nosso conhecimento genético de embriões de Drosophila para a
região menos conhecida do desenvolvimento dos mamíferos.
Iniciando o eixo ântero-posterior

Estabelecendo um Centro de Nieuwkoop
O estabelecimento do organizador parece ser semelhante para todos os vertebrados.

Nos peixes teleósteos, as células do blastoderma permanecem relativamente coeren-
tes até a gastrulação, e os precursores mesodérmicos formam um cinto ao redor da
margem, adjacente às células vitelínicas (Wilson et al., 1995). Existe evidência
635
Figura 16.1 Redistribuição citoplasmática Distribuição de

Uma estratégia comum para estabelecer o cen- ativa localmente os determinantes ativados
tro de Nieuwkoop em vertebrados. Durante a determinantes maternos na blástula tardia
oogênese, determinantes maternos inativos
(círculos abertos) são transportados (talvez com
o vitelo) para um novo ambiente citoplasmático.
Isso resulta em sua conversão para uma forma Anfíbio Dorsal
ativa (círculos cheios). No ovo de anfíbio isso
é conseguido por rotação citoplasmática. Nos
embriões de teleósteos e aves o mecanismo não
é conhecido, mas os determinantes ativados
ficam concentrados perto de um grupo de célu-
las da margem mesodérmica. (Segundo
Grunwald e Wilson, 1996.)
Teleósteo Dorsal
Célula
do vitelo
Ave
Vitelo
(Openheimer, 1936; Tung et al., 1945; Grunwald e Wilson, 1996) que o futuro lado
dorsal da célula vitelínica age como um centro de Nieuwkoop, transferindo fatores
maternos para o blastoderma (Figura 16.1). Nos embriões de aves (e presumivelmente
também em mamíferos) a zona marginal posterior (PMZ) pode ser equivalente ao cen-
tro de Nieuwkoop (Eyal-Giladi e Khaner, 1989; Khaner e Eyal-Giladi, 1989). Experimen-
tos de transplante demonstraram que esse é o local onde as células se reúnem para
formar a linha primitiva. Pensou-se que o hipoblasto tinha habilidade indutora de
eixos, mas estudos recentes (Khaner, 1995) sugerem que essa capacidade reside so-
mente na PMZ. O hipoblasto parece apenas dirigir os movimentos subseqüentes da
linha. A identificação da zona marginal posterior do pinto com o centro de Nieuwkoop
é reforçada pela descoberta de que o homólogo Vg1 do pinto é transcrito nessa
região. Além disso, quando células cultivadas secretando a proteína Vg1 madura
(processada) do pinto são colocadas ao longo das bordas laterais do blastoderma,
elas induzem a formação de novas linhas primitivas (Seleiro et al., 1996). Tal como o
centro Nieuwkoop de anfíbios, a futura posição da PMZ é fixada pouco depois da
fecundação e depende da gravidade e rotação.
Expressão Gênica em Tecidos Organizadores

Tecidos
Conforme mencionado no Capítulo 6, o homólogo mamífero do lábio dorsal do

blastóporo dos anfíbios é o seu nódulo no terminal anterior da linha primitiva. Em
aves, esse é chamado nódulo de Hensen, e em mamíferos (apesar de ter sido primeiro
descrito por Hensen em coelhos), essa estrutura é freqüentemente chamada apenas
de nódulo. A linha primitiva porta-se como os lábios laterais do blastóporo. O nódulo
contém muitas das mesmas proteínas encontradas no organizador da rã, incluindo
Goosecoid, Nodal, Lim-1 e HNF3β. O gene nodal é essencial para a iniciação da linha
primitiva e para sua contínua manutenção. Sua expressão é primeiro vista na margem
ventral (onde começa a gastrulação). Em seguida, a proteína Nodal é vista na região
mais anterior da linha (Figura 16.2; Conlon et al., 1994). Quando esse gene é deletado,
o embrião em desenvolvimento tem uma linha defeituosa e não pode gastrular. Mais
tardiamente na gastrulação (como veremos), a expressão do gene nodal é importante
na formação do eixo esquerdo-direito do embrião.
De maneira semelhante, o mRNA goosecoid é primeiro visto nas células da foice de

Koller, quando as células que formam a linha primitiva aí se agregam. Ele é, em seguida,
detectado no nódulo de Hensen, à medida que a linha se movimenta para frente.
Porém, quando o nódulo regride, as células expressando goosecoid permanecem no
mesoderma da cabeça e no endoderma faríngeo (placa precordal) tal como nos anfíbi-
os; à medida que se forma a região da cabeça, a expressão de goosecoid ocorre nas
células mais anteriores (Izpisúa-Belmonte et al., 1993). Sua expressão nessas células
parece ser crítica para a indução dos genes envolvidos na formação da cabeça. Se os
genes goosecoid forem deletados em embriões de camundongo, os eixos se formam
normalmente, mas a cabeça não se forma adequadamente (Rivera-Pérez et al., 1995).
Outro gene, Lim-1, é também expresso nessas células, e camundongos que têm os
seus genes Lim-1 erradicados não desenvolvem cabeças (veja Figura 7.17).
O gene HNF-3β se parece com genes semelhantes no organizador de Xenopus
(XFH1, XFD1/1 e pintallavis). O HNF-3β é encontrado no mesoderma precordal que
é considerado induzir a especificidade regional no cérebro anterior e no mesencéfalo,
e quando o gene é deletado, não se forma o nódulo. Os embriões têm severas deficiên- Figura 16.2
cias no seu mesoderma da cabeça e na notocorda, deixam de gastrular adequadamen- Expressão do gene organizador em embriões
te, e não apresentam estruturas do prosencéfalo e mesencéfalo (Ang e Rossant, 1994; de camundongo em desenvolvimento. Expres-
Weinstein et al., 1994). são do gene nodal durante a extensão da linha
Enquanto Goosecoid, Lim-1 e HNF-3β parecem ser necessárias para especificar primitiva. (Fotografia cortesia de M. R. Kuehn.)
células do mesoderma dorsal anterior, o eixo dorsal médio e posterior parece ser
especificado pela proteína Brachyury (T) (MacMurray e Shin, 1988; Yanagisawa,
1990; Stott et al., 1993). A formação e a diferenciação da notocorda requerem a
expressão do gene T (Gluecksohn-Schoenheimer, 1938; Herrmann, 1991; Rashbass
et al., 1991), e mutações do gene Brachyury causam malformações do eixo posterior
(Figura 2.25C).
À medida que o nódulo começa a se formar, ele começa a secretar fator de
espalhamento (scatter factor). Essa proteína parece promover a habilidade das célu-
las epiblásticas responderem a sinais de indução do nódulo e/ou da notocorda (Streit
et al., 1995.) Conforme discutido no Capítulo 6, a linha primitiva se alonga, e o tubo
neural é formado ao longo da linha mediana do embrião. O mesoderma precordal é
considerado induzir as estruturas da cabeça, ao passo que a notocorda pode induzir o
cérebro posterior e a medula espinhal. À medida que o tubo neural é depositado,
torna-se especificado para o tipo de tubo neural que virá a ser - prosencéfalo,
mesencéfalo, cérebro posterior ou medula espinhal. O mesoderma e o endoderma são
padronizados de maneira semelhante. Estudos recentes sugerem agora que essa espe-
cificação é conseguida pelos mesmos genes homeobox, que especificam o eixo ântero-
posterior em Drosophila.
Especificando o eixo ântero-posterior de mamífero:

A hipótese do código Hox
Homologia dos Complexos de Genes Homeóticos entre
Drosophila e Mamíferos
O complexo de genes homeóticos de Drosophila (HOM-C) no cromossomo 3, con-
tém as classes Antennapedia e Bithorax de genes homeóticos e pode ser visto como
uma unidade funcional única. (Realmente, em outros insetos, como o caruncho da
farinha Tribolium, ele é uma unidade única.) Os genes HOM-C estão arranjados na
mesma ordem geral que seu padrão de expressão ao longo do eixo ântero-posterior,
os genes mais 3’ (labial) sendo requeridos para produção das estruturas mais ante-
riores, os genes mais 5’ (AbdB) especificando o desenvolvimento do abdome poste-
rior. Genomas humanos e do camundongo contêm quatro cópias de HOM-C por
conjunto haplóide (Hox A a D no camundongo, HOXA a D em humanos; Boncinelli
et al., 1988; McGinnis e Krumlauf, 1992; Scott, 1992). Não somente são encontrados
os mesmos tipos gerais de genes homeóticos em ambos, moscas e mamíferos, mas

a ordem desses genes nos respectivos cromossomos é notavelmente semelhante. E
caso essa semelhança não seja suficiente para argumentar a favor de um esquema
comum de formação axial, foi descoberto que o padrão de expressão desses genes
segue o mesmo modelo: aqueles genes de mamíferos homólogos aos genes de
Drosophila: labial, proboscipedia e Deformed são expressos anteriormente, en-
quanto os genes homólogos aos genes Abdominal-B da Drosophila são expressos
posteriormente. Os genes mamíferos Hox/HOX são numerados de 1 a 13, começan-
do daquele terminal do complexo sendo expressos mais anteriormente. A Figura 16.3
mostra as relações entre os conjuntos de genes homeóticos da Drosophila do ca-
mundongo. Os genes equivalentes em cada complexo do camundongo (como Hoxa-
1, Hoxb-1 e Hoxd-1) são chamados de grupo parálogo. É considerado que os quatro
complexos Hox de mamíferos foram formados de duplicações cromossômicas. Como
não existe uma correspondência um-para-um entre os genes HOM-C de Drosophila
e os genes Hox de mamíferos, é provável que tenham ocorridos duplicações inde-
pendentes depois que esses dois ramos animais divergiram (Hunt e Krumlauf, 1992).
Expressão de Genes Hox no

Sistema Nervoso Central e seus Derivados
A expressão do gene Hox pode ser vista ao longo do eixo dorsal (tubo neural,
crista neural, mesoderma paraxial e mesoderma superficial) do limiar anterior do
cérebro posterior até a cauda. Também é vista nos derivados desses tecidos,
especialmente os derivados das células da crista neural. Por exemplo, a região do
cérebro anterior da cabeça dá origem não só ao cérebro anterior e seus gânglios
cranianos, mas também à cartilagem das orelhas, mandíbula e pescoço, arcos
aórticos, e órgãos como as glândulas tireóide, paratireóide e timo. Conforme dis-
cutido no Capítulo 7, o tubo neural do cérebro posterior divide-se em unidades
segmentais chamadas rombômeros. A migração das células da crista neural craniana
também parece estar organizada no padrão rombomérico fazendo com que um
gânglio craniano específico e o arco branquial por ele inervado se originem da
crista do mesmo rombômero (Lumsden et al., 1991). Essas células da crista neural
também parecem reter informação posicional de seu lugar original ao longo do eixo
ântero-posterior. Quando células pré-migratórias da crista neural de aves que nor-
malmente migrariam para o primeiro arco branquial (para formar a cartilagem da
mandíbula) são colocadas na região da crista cujas células normalmente migram
para o segundo arco branquial (para formar a cartilagem hióide), as células enxer-
tadas da crista neural migram para o segundo arco branquial, mas elas formam as
estruturas (cartilagem da mandíbula) características do primeiro arco. Além disso,
elas irão interagir com o ectoderma superficial e o mesoderma paraxial para formar
a musculatura do primeiro arco (bico e músculos da mandíbula). Isso sugere
marcadamente que antes de migrar, as células da crista neural já estão comprome-
tidas a formar ao menos algumas das estruturas apropriadas para seu nível no eixo
ântero-posterior (Noden, 1988).
Esse compromisso posicional pode ser o resultado dessas células expressarem
combinações particulares de genes Hox. Por exemplo, os genes Hox-B são expres-
sos no presuntivo tubo neural do camundongo antes da formação da crista neural,
e quando as células da crista neural migrarem, irão reter o padrão de expressão do
gene Hox-B característico do seu lugar de origem (Hunt et al., 1991a). Com uma
única exceção conhecida (Hoxb-1), o limite anterior de cada gene Hox pára no
rombômero mais próximo, dois rombômeros à frente do mais anterior do próximo
gene Hox (Wilkinson et al., 1989; Keynes e Lumsden, 1990). Conforme representa-
do na Figura 16.4, os genes homeobox Hoxb-2, -3, e –4 são encontrados através
de toda a medula espinhal, mas o Hoxb-2 pára no limiar dos rombômeros 2 e 3; o
Hoxb-3 pára no limiar 4/5, e o Hoxb-4 pára na fronteira entre o sexto e sétimo
(A) Figura 16.3

Conservação evolucionária da organização
HOM-C de gênica homeótica e expressão transcricional em
Drosophila moscas e camundongos. (A) Conservação en-
tre o agregado homeobox no cromossomo 3 de
Drosophila e os quatro agregados de genes
Hox no genoma murino. As regiões sombrea-
Hox-A das mostram semelhanças estruturais particu-
Camundongo larmente fortes entre as espécies, e pode-se ver
que a ordem nos cromossomos foi conserva-
da. Os genes no terminal 5’ (como todos genes
homeobox murinos são transcritos na mesma
direção) são aqueles que são expressos mais
posteriormente, são expressos mais tarde, e
podem ser induzidos somente por altas doses
de ácido retinóico. Genes tendo estruturas se-
melhantes, as mesmas posições relativas em
cada um dos quatro cromossomos, e padrões
Subgrupos de expressão semelhantes pertencem ao mes-
Parálogos mo grupo parálogo. (B) Comparação entre os
3’ Anterior Cérebro posterior Tronco Posterior padrões de transcrição dos genes HOM-C e
Hox-B de Drosophila (10 horas) e camundon-
Precoce Tardio
gos (12 dias), respectivamente. Outro conjun-
Forte resposta de Fraca resposta de to de genes que controla a formação da cabeça
ácido retinóico ácido retinóico da mosca (orthodenticle e empty spiracles) tem
homólogos no camundongo que se expressam
no cérebro intermediário e anterior. Os genes
(B) homólogos humanos são chamados (em mai-
úsculas) genes HOX. (A segundo Krumlauf,
Drosophila 1993; B segundo McGinnis e Krumlauf, 1992.)
Camundongo
Medula
espinhal
Cervical
Torá
cica
ar
mb
Cérebro
Lo
intermediário
Cérebro Cérebro
anterior posterior
(A) (B)
Arcos viscerais Sistema nervoso
Mesênquima Gânglios Tubo

Ectoderma
do arco craniais neural
superficial
Rombômero 2
Arco
branquial 1
Arco 4 3 2
Branquial 2
Figura 16.4
Arco Transcrição do gene Hox. (A) Diagrama do padrão de transcrição
Branquial 3 do gene Hox no camundongo. Notar que o padrão está distribuído
entre o tubo neural e o mesoderma (de modo que as células da crista
do terceiro rombômero entrem no segundo arco branquial) e os
Medula limites da expressão do gene Hox coincide com os limites
Arco espinhal
rombômeros. (B) Padrões de transcrição de genes homeóticos Hox-
Branquial 4
B no cérebro posterior do camundongo de 9,5 dias. (A de McGinnis
e Krumlauf, 1992; B de Hunt et al., 1991a.)
rombômero. Os genes Hox, mais 5’ são encontrados somente nas regiões poste-
riores do tubo neural, onde formam também um conjunto “aninhado”. Os genes
mais 5’ têm limites de expressão mais posteriores que os genes menos 5’. Quando
as células da crista neural entram em contato com o ectoderma superficial levam as
células ectodérmicas a expressarem o mesmo conjunto de genes Hox (Figura 16.4
A; Hunt et al., 1991b).
Alguns dos genes Hox de mamíferos são tão semelhantes a seus homólogos de
Drosophila, que eles podem substituir um ao outro. O gene do camundongo Hox-6
pode realizar algumas das funções reguladoras do gene Antennapedia da Drosophila
quando o gene murino é transfectado para a Drosophila. O gene humano HOXD-4
também pode executar algumas das funções do seu homólogo da Drosophila,
Deformed (Malicki et al., 1990; McGinnis et al., 1990). Além disso, a região intensifica-
dora do gene Deformed da Drosophila (um gene especificando a expressão gênica
específica da cabeça em Drosophila) pode causar expressão gênica no cérebro poste-
rior do camundongo; e as seqüências reguladoras do homólogo humano de Deformed
fornecem expressão gênica específica da cabeça em embriões de Drosophila
(Awgulewitsch e Jacobs, 1992; Malicki et al., 1992).
Um padrão semelhante da expressão gênica de Hox parece existir também dentro
do tronco. Aqui os padrões da expressão gênica correspondem a limiares somíticos
(em lugar de romboméricos) (Kessel e Gruss, 1991), e alguns genes parálogos são
expressos em limiares somíticos ligeiramente diferentes (Figura 16.5).
Análise Experimental de um Código Hox: Gene Alvo
Os padrões de expressão dos genes Hox murinos sugerem um código pelo qual certas
combinações de genes Hox especificam uma determinada região do eixo ântero-poste-
rior (Hunt e Krumlauf, 1991). Conjuntos particulares de genes parálogos fornecem
identidade segmentária ao longo do eixo ântero-posterior do corpo. A evidência para
tal código vem de três fontes:
Vértebras Vértebras Vértebras Vértebras Vértebras Vértebras

occipitais cervicais torácicas lombares sacrais caudais
Ácido retinóico causa a

expressão de genes em
segmentos mais posteriores
Ácido retinóico causa a

expressão de genes em
segmentos mais anteriores
Figura 16.5
O código do somito Hox no tronco e no pes-
coço do embrião do camundongo. As áreas
principais de expressão estão indicadas em
cor mais escura, enquanto as regiões poste-
riores da expressão não são tão definidas como
• Experimentos de eliminação (“knock-out”) ou de gene alvo (gene targeting) sugere a cor mais clara. O efeito do ácido
(veja Capítulo 2) nos quais são construídos camundongos carentes de ambas retinóico é o de empurrar a expressão gênica
cópias de um ou mais genes Hox particulares. anterior mais posteriormente e a expressão
• Homeose induzida por ácido retinóico, na qual embriões de camundongo gênica posterior mais anteriormente. (Segun-
do Kessel, 1992.)
tratados com o ácido retinóico têm um padrão de expressão diferente do gene
Hox ao longo do eixo ântero-posterior e diferenciação anormal de suas estru-
turas axiais.
• Anatomia comparada, pela qual tipos de vertebrados em diferentes espécies
são correlacionados com a constelação de genes Hox nesses vertebrados.
Quando Chisaka e Capecchi (1991) expulsaram o gene Hox-3 de camundongos
endógamos, os mutantes homozigotos Hoxa-3 morreram logo após o nascimento. Na
autópsia mostrou-se que esses animais tinham a cartilagem do pescoço anormalmente
curta e grossa e as glândulas tireóides, paratireódes e timos severamente deficientes
ou ausentes. Seus corações e vasos sangüíneos estavam também malformados (Figu-
ra 16.6). Esse conjunto de malformações é muito semelhante à desordem congênita
humana, a síndrome de DiGeorge, na qual são encontradas essas mesmas deficiências
em estruturas derivadas da crista neural. Análises ulteriores mostraram que o número
e a migração de células da crista neural que formam essas estruturas são normais.
Assim, parece que os genes Hoxa-3 são responsáveis pela especificação do destino
das células da crista neural craniana e pela permissão para que essas células se dife-
renciem e se proliferem formando a cartilagem do pescoço e os derivados do quarto e
sexto arcos faríngeos (Manley e Capecchi, 1995).
Figura 16.6
Desenvolvimento deficiente de estrutura de arcos faríngeos derivados
da crista neural em camundongos deficientes em Hox-3. À direita, um
embrião de 10,5 dias de um camundongo Hox-3 heterozigoto mostrando
desenvolvimento normal do timo (bolsa 3), paratireóide (bolsa 4) e ou-
tras estruturas. À esquerda, um mutante homozigoto deficiente em Hox-
3 não apresenta desenvolvimento apropriado dessas estruturas. (de
Chisaka e Capecchi, 1991.)
Mutante Tipo selvagem
Outro experimento de alvejar genes eliminou o gene Hoxa-1 (Lufkin et al., 1991). A
expressão de Hoxa-1 se sobrepõe ao gene Hoxa–3, mas é também expressa mais
anteriormente que Hoxa-3. Esses embriões sem genes Hoxa-1 funcionais mostram
uma constelação de anormalidades que indicam especificação deficiente dos
rombômeros 4-7. Esses mutantes freqüentemente deixam de fechar seus tubos neurais,
não têm estruturas do ouvido interno, e não têm os gânglios do cérebro posterior (que
formam os nervos acústico, glossofaríngeo e vago), derivados desses rombômeros.
No entanto, não foram encontradas malformações dos arcos faríngeos, glândulas
tireóide, paratireóide e timo, ou cartilagem do pescoço. Assim, defeitos dos mutantes
Hoxa-1 somente são vistos na região anterior da área de expressão desse gene. (É
possível que suas funções não sejam requeridas ou sejam redundantes na porção
posterior a seu alcance.) Ao contrário dos defeitos (que se limitam à crista neural) de
camundongos Hox3 deficientes, os defeitos de Hox-1 são notados no sistema nervo-
so central e no tecido derivado do placódio, assim como no mesoderma paraxial. A
eliminação de Hoxa-2 também produz camundongos cujas células da crista neural
foram re-especificadas. Elementos cranianos normalmente formados pelas células da
crista neural do segundo arco branquial (estribo, ossos estilóides) estão faltando e
são substituídos pela duplicação de estruturas do primeiro arco branquial (bigorna,
martelo, etc.) (Gendron-Maguire et al., 1993; Rijli et al., 1993). Assim, sem certos genes
Hox, alguns órgãos regionalmente específicos ao longo do eixo ântero-posterior dei-
xam de se formar ou são re-especificados para outras regiões. A evidência inicial apóia
a noção que diferentes conjuntos de genes Hox são necessários para a especificação
completa de toda região do eixo e que um conjunto de genes parálogos pode ser
responsável por diferentes subconjuntos de órgãos nessas regiões.
Transformação Parcial de Segmentos por

Eliminação de Genes Hox Expressos no Tronco
Se os genes Hox realmente formam um código que especifica o eixo ântero-posterior,

poder-se–ia esperar que a alteração da constelação de genes Hox expressos em qual-
quer região particular do embrião poderia alterar uma estrutura em outra ao longo do
eixo ântero-posterior. Isso mostrou ser o caso quando o gene Hoxc-8 é deletado do
embrião por mira ao gene alvo (Le Mouellic et al., 1992). Nesses camundongos, vários
segmentos esqueléticos axiais parecem mais com segmentos anteriores, de tipo muito
semelhante ao que se vê em mutações homeóticas de perda-de-função em Drosophi-
la. Como pode ser visto na Figura 16.7, nesse camundongo a primeira vértebra lombar
formou uma costela – algo caraterístico das vértebras anteriores à ela. A eliminação do
gene Hoxb-4 converte parcialmente a segunda vértebra cervical (a vértebra axial) em
(A) (B) (C)
Figura 16.7.
uma cópia da primeira vértebra cervical (o atlas), e a deleção do gene Hoxa-5 causa a Transformações homeóticas no camundongo
transformação posterior da sétima vértebra cervical (pescoço) em uma vértebra torácica induzidas por eliminação de genes expressos
formadora de costela (Jeannotte et al., 1993; Ramirez-Solis et al., 1993). no tronco. (A) Transformação parcial da pri-
Pode-se conseguir severas transformações axiais eliminando dois ou mais genes do meira vértebra lombar em uma vértebra torácica
conjunto parálogo. Camundongos homozigotos para a deleção de Hoxd-3 têm anorma- pela eliminação de um gene Hox-8. Vértebras
lidades moderadas da junção crânio-cervical (o atlas está reduzido em tamanho), en- torácicas, mas não lombares, apresentam asso-
quanto camundongos homozigotos para a deleção de Hoxa-3 não têm anormalidades ciação com as costelas. (B,C) Transformação
parcial da segunda vértebra cervical em uma
nessa junção (veja a discussão anterior sobre esse mutante). Quando os dois mutantes
segunda cópia da primeira vértebra cervical pela
são criados juntos, ambos conjuntos de problemas ficam mais severos. Os camundon- eliminação do gene Hoxb-4. (B) O camundon-
gos sem conjuntos de genes Hoxa-3 nem Hoxd-3 não têm osso atlas algum, e as cartila- go tipo selvagem tem a primeira vértebra carac-
gens hióide e tireóide são de tamanho tão reduzido que há buracos no esqueleto (Condie terizada por um tubérculo ventral. (C) No ca-
e Capecchi, 1994). Parece que ocorrem interações sinérgicas entre os produtos dos mundongo mutante, a segunda vértebra cervical
genes Hox e que para algumas funções, um dos parálogos pode substituir ao outro. também tem esse tubérculo (seta). (A de Le
A regulação dos genes Hox de vertebrados parece ser controlada por fatores Mouellic et al., 1992; B e C de Ramirez-Solis
semelhantes aqueles que regulam os genes HOM-C em moscas. Em Drosophila, há et al., 1993; Fotografias cortesia dos autores.)
um gene homeobox, caudal, que reside externamente ao complexo HOM-C. Esse gene
de efeito materno em Drosophila funciona para co-direcionar a expressão dos genes
HOM-C mais posteriores (AbdB). Um homólogo mamífero desse gene, Cdx1, tem um
papel semelhante no mesoderma paraxial. Ele torna-se expresso na linha primitiva
durante a gastrulação, quando a especificação do eixo ântero-posterior está sendo
feita; e é desligado pouco depois. Se esse gene for deletado do embrião do camundon-
go, os padrões de expressão dos genes Hox mudam posteriormente para um somito, e
estruturas esqueléticas anteriores são encontradas mais posteriormente (Subramanian
et al., 1995). De maneira semelhante, a repressão de genes Hom-C de Drosophila é
mediada por um conjunto de genes que inclui extra sex combs (esc). Se o homólogo
murino desse gene (embryonic ectoderm development; eed) desempenhar o mesmo
papel, poder-se-ia esperar que mutações em eed resultassem na anti-depressão de
genes Hox e na transformação homeótica de estruturas anteriores em posteriores.
Isso realmente acontece. Genes eed mutantes causam a transformação de estruturas
esqueléticas anteriores em posteriores (Schumacher et al., 1996).
Análise Experimental do Código Hox:

Teratogênese do Ácido R etinóico
Retinóico
Tais alterações homeóticas também podem ser vistas quando a embriões de camun-
dongos são administradas doses teratogênicas de ácido retinóico. O ácido retinóico
exógeno dado a embriões in utero pode fazer com que certos genes Hox sejam expres-
(A) (B) (C) (D)
Figura 16.8
Embriões de camundongos cultivados sob con-
dições controle no dia 8 (A,C), ou em um meio sos em grupos de células que usualmente não os expressam (Conlon e Rossant, 1992;
contendo retinóides teratogênicos (B,D). No Kessel, 1992). Além disso, as anormalidades crânio-faciais de embriões murinos de
dia 2 (A,B), o primeiro arco faríngeo dos em- mães tratadas com doses teratogênicas de ácido retinóico (Figura 16.8) podem ser
briões tratados tem uma aparência encurtada e mimetizadas quando se faz com que o Hoxa-7 se expresse através do embrião (Balling
achatada e aparentemente se fundiu com o se-
et al., 1989). Se doses altas de ácido retinóico podem ativar genes Hox em células
gundo arco faríngeo. No dia 17 (C,D) podem
ser vistas malformações crânio-faciais na carti-
inapropriadas ao longo do eixo ântero-posterior, e se essa constelação de genes hox
lagem derivada da crista neural dos embriões ativos especifica a região do eixo ântero-posterior, então camundongos tratados com
tratados. A cartilagem de Meckel está comple- ácido retinóico no útero devem mostrar transformações homeóticas manifestadas por
tamente deslocada da região mandibular (ma- malformações ocorrendo ao longo desse eixo. Kessel e Gruss (1991) acharam que esse
xilar inferior) para a região maxilar (boca supe- era o caso. Camundongos tipo selvagem têm 7 vértebras cervicais (pescoço), 13 vér-
rior). As cartilagens do martelo e da bigorna tebras torácicas, e 6 vértebras lombares (em adição às vértebras sacrais e caudais).
também não se formaram. (A e B de Goulding Quando expostos ao ácido retinóico no dia 8 da gestação, a primeira ou as duas
e Pratt, 1986; C e D de Morriss-Kay, 1993; primeiras vértebras lombares foram transformadas em vértebras torácicas, enquanto a
Fotografias cortesia dos autores.)
primeira vértebra sacral freqüentemente se tornou uma vértebra lombar (Figura 16.9).
Em alguns casos, a região posterior inteira do embrião de rato deixou de se formar.
Essas alterações estruturais eram correlacionadas com alterações na constelação dos
genes Hox expressos nesses tecidos. Por exemplo, quando o ácido retinóico foi dado
a embriões no dia 8 (durante a gastrulação), a expressão de Hoxa-10 foi deslocada
posteriormente, e um conjunto adicional de costelas se formou onde havia a primeira
(A) (B) (C)
Figura 16.9
Ácido retinóico administrado a ratas grávidas
altera a expressão do gene Hox e o fenótipo
em fetos. A figura mostra mudanças no es-
queleto axial (vértebras e costelas) causadas
por exposição ao ácido retinóico no útero no
dia 8. (A) O tipo selvagem tem 7 vértebras
cervicais, 13 torácicas, 6 lombares, 4 vérte-
bras sacrais fundidas e vértebras caudais.
Esse arranjo é alterado pelo ácido retinóico
dado às mães. Em alguns casos (B,C) o ácido
retinóico causou a perda de vértebras lomba-
res, sacrais e caudais. (A e B segundo Kessel
e Gruss, 1991; C de Kessel, 1992; Fotografi-
as cortesia dos autores.)
Figura 16.10 Dia 8.5

O ácido retinóico media a transformação homeótica em regiões do cérebro posterior. Em em- Controle + Ácido retinóico
briões de camundongo não tratados, no dia 8.5, a expressão de Hoxb-1 se limita ao rombômero
r4. Quando expostos ao ácido retinóico nesse momento, a expressão de Hoxb-1 se expande Cérebro
anteriormente em direção ao cérebro intermediário. Após 2 dias, em embriões normais Hoxb-1 é intermediário
expresso nas células descendentes do rombômero r4 e em células da linha mediana de r5, que
geram o nervo motor facial (mnVII). Em embriões tratados com ácido retinóico, o padrão normal
de r4/5 foi duplicado em r2/3. A expressão da crista neural de Hoxb-2 também está duplicada, e
um segundo nervo motor facial é formado. Isso sugere que o ácido retinóico media a transforma-
ção homeótica de r2/3 em r4/5. (Segundo Krumlauf, 1993.)
Cérebro
Posterior
vértebra lombar. Quando genes Hox posteriores não foram expressos, a parte caudal
do embrião deixou de se formar. *
No sistema nervoso central, o ácido retinóico induz a expressão anterior dos genes
hox que usualmente são somente expressos mais posteriormente, e fazem com que os Medula
rombômeros 2 e 3 assumam a identidade dos rombômeros 4 e 5 (Figura 16.10; Marshall Espinhal
et al., 1992; Kessel, 1993). Nessa situação, o nervo trigêmeo (que se origina do
rombômero 2) é transformado em outro nervo facial (característico do rombômero 4), e Dia 10.5
anormalidades do primeiro arco branquial indicam que as células da crista neural do
segundo e terceiro rombômeros foram transformadas em fenótipos mais posteriores.
O ácido retinóico provavelmente desempenha um papel na especificação axial
durante o desenvolvimento normal, e a fonte desse ácido provavelmente é o nódulo
de Hensen (Hogan, 1992; Maden et al., 1996). Desde que o nódulo precoce parece
conter os precursores tanto de estruturas anteriores como posteriores, é possível
que a especificação dessas células dependa da quantidade de tempo despendido no
meio de alta concentração de ácido retinóico no nódulo. Quanto mais tempo for
despendido no nódulo, mais posterior será a especificação. Isso é visto ocorrer em
cultura, quando células embrionárias de carcinoma expressam mais genes Hox “pos-
teriores” quanto maior for o tempo de sua exposição ao ácido retinóico (Simeone et
al., 1990). Além disso, Hoxa-1, Hoxb-1 e Hoxd-4 tem, cada um, elementos sensíveis
Vesícula
ao ácido retinóico nas regiões reguladoras a montante (veja Capítulo 21). A adminis- ótica
tração de ácido retinóico exógeno iria mimetizar a situação normalmente encontrada
somente pelas células posteriores. Avantaggiato e colegas (1996) mostraram que
quando o ácido retinóico é dado a embriões durante os estágios de meia-linha, as
regiões mais anteriores do tubo neural não se formam e são substituídas por tecido Expressão de hoxb-1
parecendo o cérebro anterior. Isso se correlaciona com uma perda de expressão Expressão de Krox-20
gênica (Emx1, Emx2) do cérebro anterior e médio nessa região, e sua substituição Expressão hoxb-2
por genes Hox específicos para o cérebro posterior como Hoxb-1. A evidência aponta da crista neural
para um código Hox enquanto constelações diferentes de genes Hox especificam as
características regionais ao longo do eixo ântero-posterior. Além disso, como esses
padrões de expressão são semelhantes para mamíferos e insetos, parece que existe
um plano de desenvolvimento comum sobre o qual é construído o eixo ântero-
posterior da maioria dos animais.
Evidência para um Código Hox da Anatomia Comparada
Um novo tipo de embriologia comparada está atualmente emergindo. Gaunt (1994) e

Burke e seus colaboradores (1995) compararam as vértebras do camundongo e do
pinto. Embora ambos tenham um número semelhante de vértebras, elas distribuem-
nas diferentemente. Camundongos (como todos os mamíferos, sejam elas girafas ou
baleias) têm somente 7 vértebras cervicais (pescoço). Essas são seguidas por 13
*Hoxa-10 é também importante para a especificação do padrão axial dos dutos genitais.
Eliminações de Hoxa-10 criam camundongos cuja região uterina superior é transformada em tecido
parecendo o oviduto. Essa região coincide com o limite anterior da expressão de Hoxa-10 no duto
Mülleriano tipo selvagem (Benson et al., 1996).
Figura 16.11
Representação esquemática do padrão verte-
bral do camundongo e do pinto ao longo do Cervical Torácico Lombar Sacral Coccígeas
eixo ântero-posterior. Os limites de certos genes
Hox foram colocados nestes domínios. Pinto
Vértebras
Somitos
Vértebras
Camundongo
Cervical Torácico Lombar Sacral Caudal
Occipital Cervical Torácico Lombar Sacral Caudal Transicional
vértebras torácicas (ligadas às costelas), 6 vértebras lombares, 4 sacrais e um número

variável (20+) de vértebras caudais (Figura 16.11). O pinto, por outro lado, tem 14
vértebras cervicais, sete vértebras torácicas, 12 ou 13 vértebras lombosacrais (depen-
dendo da variedade), e 5 vértebras coccígeas. A pergunta é: A constelação de genes
Hox correlaciona-se com o tipo de vértebra (e.g., cervical ou torácica) ou com a posi-
ção relativa das vértebras (e.g., número 8 ou 9)? A resposta é que a constelação de
genes Hox prediz o tipo de vértebra. No camundongo, a transição entre vértebras
cervicais e torácicas ocorre entre as vértebras 7 e 8; no pinto está entre as vértebras 13
e 14. Em ambos os casos, os parálogos de Hox-5 são vistos nas últimas vértebras
cervicais, enquanto o limite anterior dos parálogos de Hox-6 se estende até a primeira
vértebra torácica. De maneira semelhante, em ambos os casos a transição torácico/
lombar é vista no limite entre os grupos parálogos de Hox-9 e de Hox-10. Parece que
há um código de expressão do gene Hox que determina o tipo de vértebra ao longo do
eixo ântero-posterior.
& Especulações
Animais como Variações sobre o

Mesmo Tema Desenvolvimental
U
M DOS MAIS CELEBRADOS (e única coisa ligando uma pata de inseto, um de uma natureza composta de espécies
cáusticos) debates em biologia foi pé de molusco e uma perna de vertebrado intrinsecamente diferentes, todos os ani-
realizado no apogeu da Revolu- era a sua função locomotora. Anatômica e mais estavam unidos em uma espécie de
ção Francesa em Paris. Aí, na Academie des embriologicamente, elas eram entidades dis- irmandade, reminescente da egalité et
Sciences, E. Geoffroy Saint-Hilaire contes- tintas, não-comparáveis. fraternité revolucionárias (Appe, 1987).
tou Georges Cuvier sobre a natureza do rei- Geoffroy Saint-Hilaire enfatizou as se- Desde aquele tempo, diferentes tradi-
no animal. Cuvier, o eminente anatomista melhanças entre todos os filos. Ele argu- ções biológicas enfatizaram as diferenças,
comparativo que tinha “tornado a zoologia mentou que todos os animais estavam or- ou as semelhanças entre os organismos. A
uma ciência francesa” enfatizou as diferen- ganizados de acordo com os mesmos prin- anatomia comparada (seguindo Cuvier)
ças que separam os filos entre si. Não pode- cípios básicos, e que um inseto não era enfatiza as diferenças, enquanto a morfolo-
ria haver uma “Corrente de Existência” li- mais que um vertebrado virado de cabeça gia (seguindo Geoffroy Saint-Hilaire) cele-
gando todos os organismos, nem poderia para baixo. Uma cabeça era formada em bra as “unidades subjacentes”. A Genética
haver qualquer maneira que partes de um uma extremidade, uma cauda na outra, e e a Biologia celular olham para todos os
inseto poderiam ser vistas como homólogas todos os animais tinham tubos neurais, animais (e plantas) como compostos basi-
daquelas de um molusco ou vertebrado. A fossem eles dorsais ou ventrais. Em lugar camente da mesma maneira, seguindo as
mesmas leis, enquanto a embriologia tradi- Recebendo uma Cabeça: Mais Drosophila Camundongo
cionalmente via cada espécie se desenvol- Homologias Vertebradas e Invertebradas
vendo de uma maneira diferente. Em Drosophila, o cérebro é composto de Cérebro
anterior
Recentemente, porém, a embriologia três neurômeros. Esses são especificados
está fornecendo evidência para a unidade por dois genes contendo homeobox que Cérebro
subjacente da natureza animal. Jonathan não estão ligados à região HOM-C; esses interme-
diário
Slack e seus colegas (1993) definiram um genes são orthodenticle (old), que é ex-
animal como um organismo que exibe um presso predominantemente no neurômero
particular padrão espacial de expressão do mais anterior, e empty spiracle (ems), ex- Cérebro
gene Hox. eles propõem que o plano cor- presso nos dois neurômeros cerebrais posterior
poral de cada filo é tipificado em um parti- posteriores. Mutações de perda-de-fun- r1-r8
cular estágio “filotípico” durante seu de- ção de old eliminam o neurômero mais
senvolvimento. Para vertebrados, isso se- anterior do embrião de Drosophila em
ria o estágio do broto caudal (onde, apesar desenvolvimento, e mutações de perda-
de suas diferentes clivagens e gastrulações, de-função de ems eliminam o segundo e
os embriões de vertebrados convergem e terceiro neurômeros (Hirth et al., 1995). Em
têm brotos caudais e bolsas faríngeas); para rãs e camundongos, os homólogos des-
insetos, a banda germinativa completamen- ses genes (Otx-1, Otx-2, Emx-1, Emx-2)
Medula
te segmentada é o local onde os embriões também são expressos no cérebro (Simeo- espinhal
convergem. Nesse estágio, o padrão de ne et al, 1992), embora os padrões exatos
expressão gênica homeótica dos genes de transcrição não sejam idênticos (Figu-
Hox/HOM-C é visto mais claramente, sen- ra 16.12). O gene Otx-2 foi eliminado como
do notavelmente semelhante em todos ani- gene alvo (Acampora et al., 1995; Matsuo
mais. Os genes parecendo com Deformed et al., 1995; Ang et al., 1996), e os camun-
e labial são expressos no anterior do em- dongos resultantes tinham deficiências
brião; aqueles parecendo com Abdominal neurais e mesodérmicas da cabeça anteri-
B são expressos no posterior. Mesmo ores para o rombômero r3. Em seres hu-
nematóides e hidras têm agregados de manos, mutações de EMX-2 levam à uma
genes homeóticos que parecem ser expres- condição rara conhecida como esquizo-
sos da mesma maneira ântero-posterior encefalia, na qual há sulcos atravessan-
(Schummer et al., 1992; Wang et al., 1993). do todo o córtex cerebral (Brunelli et al., Figura 16.12
Embora fungos e plantas tenham genes 1996). Apesar dos genes old e ems de Expressão dos genes reguladores em Droso-
homeobox, esses não são homólogos com Drosophila serem especificados pelos phila e no camundongo enfatizando os genes
aqueles dos animais, nem estão arranjados gradientes Bicoid e Hunchback, e os trans- expressos na cabeça. A1-9 são segmentos ab-
na mesma ordem cromossômica, nem es- critos Otx e Emx serem induzidos pelo dominais; b1-3 são segmentos neurômeros
tão expressos pelo mesmo padrão ântero- mesoderma dorsal anterior, parece que (“cerebrais”); 1b, md e mx são os segmentos
posterior. Assim, o padrão espacial da ex- esses mesmos genes são usados para es- labial, mandibular e maxilar, respectivamente;
pressão do gene Hox está sendo usado pecificar as regiões cerebrais. r, rombômero; T1-3, segmentos torácicos. (Se-
como a característica subjacente primária gundo Thor, 1995.)
definindo a existência animal. Essa obser-
*Além de expressar os homólogos dos genes contendo homeobox ems e otd, o cérebro de
vação ainda não foi testada em vários filos, mamífero também expressa o homólogo do gene tailess. Esse gene é expresso nas porções mais
e será muito interessante ver se esse pa- anteriores e posteriores do embrião de Drosophila, e é um membro da família dos receptores
drão geral é visto em todo o reino animal. esteróides (Monaghan et al., 1995).
Eixos dorsoventral e esquerdo-direito em mamíferos e aves

Muito pouco é conhecido sobre a maneira pela qual mamíferos formam o eixo
dorsoventral. Em pintos, o eixo é determinado por gravidade que coloca o
hipoblasto no lado ventral (veja Capítulo 5). Em camundongos e humanos, o
hipoblasto se forma no lado da massa celular interna que está exposta ao fluido
blastocístico. À medida que prossegue o desenvolvimento, a notocorda mantém a
polaridade dorsoventral, induzindo padrões dorsoventrais de expressão gênica
no tubo neural (Goulding et al., 1993). [mamaxis1.html]
Também muito pouco sabemos sobre a formação de eixo equerdo-direito. O
corpo do mamífero não é simétrico. O coração é demarcado para o lado esquerdo
(A) da cavidade torácica, embora se forme no centro. O baço é encontrado somente no

lado esquerdo do abdome, enquanto o principal lobo hepático fica no lado direito.
Não é conhecido o que regula essas assimetrias. Porém, achados recentes suge-
rem que dois níveis regulam o eixo esquerdo-direito: um nível global e um nível
específico do órgão.
No camundongo, são conhecidos dois genes cujas mutações destróem a
assimetria esquerda-direita normal. O primeiro gene, situs inversus viscerum (iv),
aleatoriza o eixo esquerdo-direito para cada órgão assimétrico (Hummel e Chapman,
1959; Layton, 1976). Isso significa que o coração pode se voltar para a esquerda
em um animal homozigoto, ou se voltar para a direita em outro. Além disso, a
direção da volta do coração não está coordenada com a colocação do baço ou do
estômago. Isso pode causar sérios problemas, até mesmo a morte. O segundo
gene, inversion of embryonic turning (inv), causa um fenótipo mais global. Ca-
mundongos homozigotos para uma mutação de inserção nesse local, foram encon-
trados tendo todos seus órgão assimétricos no lado errado do corpo (Yokoyama
et al., 1993).* Já que todos os órgão estão invertidos, essa assimetria não tem
conseqüências danosas para os camundongos. Embora não saibamos quais pro-
(B)
teínas são codificadas por iv e inv, alguns dos componentes dessa trajetória fo-
ram recentemente descobertos.
No camundongo, os genes lefty e nodal são expressos somente no mesoderma da
placa lateral esquerda, e sua expressão precede a característica volta à direita do
coração e a rotação à direita do embrião (Figura 16.13; Collignon et al., 1996; Lowe et
al, 1996; Meno et al., 1996). Em camundongos homozigotos para a mutação inversion
of embryonic turning, esses genes são expressos somente no lado direito do meso-
derma da placa lateral, enquanto que em camundongos com a mutação aleatória situs
inversus viscerum, a expressão de nodal e lefty ou é normal, trocada ou está ausente.
(C) Esses genes codificam fatores parácrinos da família TGF-β, e não é conhecido quais
os tecidos eles influenciam. Um possível local da influência é o tubo cardíaco simétri-
co que se forma na linha mediana do embrião. Entre o endocárdio interno e o miocárdio
externo desse tubo de parede dupla está uma matriz extracelular (geléia cardíaca) que
contém a proteína Flectina. No embrião do pinto, essa proteína é expressa
assimetricamente na hora do volteamento cardíaco, acumulando-se predominante-
mente no lado esquerdo da matriz (Prancha 33; Tsuda et al., 1996).
Os mecanismos que dariam transcrição assimétrica de nodal e lefty ainda não
estão claros, mas indícios estão vindo de estudos com o embrião do pinto (Levin
et al., 1995). A observação crítica é que durante a gástrula intermediária, a mensa-
gem sonic hedgehog (shh) é transcrita simetricamente através de todo o nódulo de
Hensen. Algumas horas depois, porém, a transcrição do lado direito cessa, e a
transcrição de shh é vista somente do lado esquerdo do nódulo. Ao mesmo tempo
que se desenvolve essa assimetria, o gene receptor IIa da activin (cActRIIa) é
Figura 16.13
Assimetria da expressão gênica no embrião do expresso somente do lado direito do nódulo (Figura 16.14). Esse receptor pode ser
camundongo. (A) Hibiridização in situ para o induzido pela activina. A expressão de sonic hedgehog no lado esquerdo não
mRNA nodal no embrião murino de 5 somitos. permanece por muito tempo, desaparecendo após aproximadamente 24 horas de
A expressão do gene nodal está restrita ao incubação, e a expressão do gene nodal do pinto fica expressa somente do lado
mesoderma da placa lateral no lado esquerdo esquerdo (Prancha 25). É tentador colocar esses genes em um trajeto em comum
do embrião. (B) Seção transversal através do onde a activina (ou uma molécula semelhante à activina) seria somente produzida
embrião no mesmo estágio que em (A). (C) do lado direito do nódulo de Hensen do embrião do pinto. Isso induziria a síntese
Em camundongos com a mutação inverted (iv), do receptor da activina IIa e funcionaria através desse receptor para bloquear a
a expressão de nodal é vista no mesoderma da
expressão sonic hedgehog onde quer que esse receptor estivesse localizado. Assim,
placa lateral em ambos os lados do embrião. O
coração tem a mesma chance de voltear para o
outro lado. (Segundo Lowe et al., 1996; foto-
grafias cortesia de M.R.Kuehn.)
*Esse gene foi descoberto acidentalmente quando Yokoyama e colegas (1993) produziram
camundongos transgênicos com o transgene (para a enzima tirosinase) inserido aleatoriamente
no genoma. Em um caso, esse gene se inseriu em uma região do cromossomo 4, eliminando o
gene existente.
Figura 16.14 (A) ESQUERDO DIREITO

Caminho para a assimetria esquerda-direita no embrião do pinto. (A) Topo: padrão de expressão
de genes sonic hedgehog, activin receptor IIa e cNR-1, em relação ao nódulo de Hensen. O 12-13 horas
receptor de activina é o primeiro, seguido por sonic hedgehog e por último por cNR-1. Base:
Após um dia, a assimetria é vista no laço do “lado direito” do coração. O caminho hipotético entre
esses genes é mostrado abaixo deles. (B,C) Vistas dorsal e em aproximação da hibridização in
situ do mRNA sonic hedgehog. (D,E) Vistas dorsal e em aproximação da mensagem de activin
receptor IIa. (A segundo Roush, 1995, e Wolpert e Brown, 1995; B-E de Levin,et al., 1995,
cortesia de C. Tabin e C. Stern.)
sonic hedgehog
cNR-1 Notocorda
(nodal)
Receptor IIa
da activina
Nódulo de
Hensen
Linha primitiva
(A) (C) (D) (E)
sonic hedgehog
isso iria bloquear a transcrição no lado direito do nódulo. Sonic hedgehog seria
assim somente expresso no lado esquerdo do nódulo. A proteína Sonic hedgehog
seria então secretada no lado esquerdo do embrião ativando o gene nodal no Sonic
mesoderma da placa lateral que contém os precursores do coração. Aí, poderiam hedgehog Activina
causar acúmulo da proteína flectina no lado esquerdo da matriz extracelular. Expe-
rimentos sugerem que esse caminho é uma boa aproximação. A activina é realmen- cNR-1 no Receptor
te sintetizada no momento apropriado e somente do lado direito do nódulo de mesoderma IIa da
da placa lateral activina
Hensen. Se bloqueada pela adição experimental de Follistatin, a assimetria da
expressão de sonic hedgehog desaparece, e o coração tem uma chance igual de
voltar-se para qualquer dos lados (Levin et al., 1997). Quando gotas impregnadas
com activina foram colocadas no lado esquerdo do nódulo de Hensen, induziram
a síntese de cActRIIa nesse lado, e o gene shh (usualmente expresso somente do Tubo cardíaco
lado esquerdo) foi reprimido. Isso, por sua vez, suprimiu a transcrição de nodal.
Nessa situação, o tubo cardíaco se formou aleatoriamente, tendo uma probabilida-
de igual de ir para a esquerda ou para a direita. Uma condição semelhante foi
produzida quando células secretando Sonic hedgehog foram implantadas no lado
direito do nódulo. Nesse caso, Nodal foi induzida simetricamente no mesoderma
da placa lateral, e o coração teve 50 porcento de chance de ter um tubo à esquerda
(Figura 16.15). A formação do eixo esquerdo-direito no camundongo também pare-
ce usar receptores de activina e proteína nodal, porém não parece ligar os dois
através de Sonic hedgehog (Collignon et al., 1996). O pinto e o camundongo
parecem ter variações sutis sobre como construir seus eixos. [mamaxis2.html] 40-45 horas
Vários caminhos diferentes – teratogênese, eliminação de genes, estudos de genes
organizadores específicos, genética clínica, até mesmo genética da mosca das frutas –
estão nos conduzindo à compreensão de um mistério fundamental: como o embrião
vertebrado começa a saber distinguir o lado de cima do lado de baixo, a boca do ânus,
e a esquerda da direita. Aprendemos mais sobre isso nos últimos cinco anos do que
em todos os anos que os precederam.
(A)
Notocorda
Nódulo de Hensen
(B)
Pastilha de
Sonic hedgehog
Figura 16.15
Expressão ectópica de sonic hedgehog leva à expressão simétrica de cNR-1 (nodal) e aleatorização
do volteamento cardíaco. (A) Expressão tipo selvagem de cNR-1, mostrando expressão no lado
esquerdo. Quase todos os corações desenvolvem voltas do lado direito. Esse padrão também é
visto quando pastilhas contendo substâncias controles são implantadas no lado direito do nódulo
ou quando uma pastilha contendo Sonic-hedgehog é implantada no lado esquerdo (onde shh é em
geral expresso). (B) Quando pastilhas de Sonic hedgehog são implantadas no lado direito do
nódulo, a expressão de cNR-1 se torna bilateralmente simétrica. (de Levin et al., 1995; fotografias
cortesia dos autores.)
LITERATURA CITADA
Acampora, D., Mazan, S., Lallemand, Y., Awgulewitsch, A. and Jacobs, D. 1992. Deformed Burke, A. C., Nelson, A. C., Morgan, B. A. and
Avantaggiato, V., Maury, M., Simeone, A. and autoregulatory element from Drosophila Tabin, C. 1995. Hox genes and the evolution of
Brulet, P. 1995. Forebrain and midbrain regions functions in a conserved manner in transgenic vertebrate axial morphology. Development 121:
are deleted in Otx2-/- mutants due to a defective mice. Nature 358: 341-344. 333-346.
anterior neuroectoderm specification during gas-
Balling, R., Mutter, G., Gruss, P. and Kessel, M. Chisaka, O. and Capecchi, M. 1991. Regionally
trulation. Development 121: 3279-3290.
1989. Craniofacial abnormalities induced by restricted developmental defects resulting from
Ang, S. L. and Rossant, J. 1994. HNF-3Fb is ectopic expression of the homeobox gene Hox- targeted disruption of the mouse homeobox gene
essential for node and notochord formation in 1.1 in transgenic mice. Cell 58: 337-347. Hox-1.5. Nature 350: 473-479.
mouse development. Cell 78: 561-574.
Benson, G. V., Lim, H., Paria, B. C., Satokata, I., Collignon, J., Varlet, I. and Robertson, E. J. 1996.
Ang, S. L., Jin, O., Rhinn, M., Daigle, N., Dey, S. K. and Maas, R. L. 1996. Mechanisms of Relationship between asymmetric nodal
Stevenson, L. and Rossant, J. 1995. A targeted reduced fertility in Hoxa-10 mutant mice: expression and the direction of embryonic
mouse otx2 mutation leads to severe defects in Uterine homeosis and loss of maternal Hoxa-10 turning. Nature 381: 155-158.
gastrulation and formation of axial mesoderm expression. Development 122: 2687-2696.
Condie, B. G. and Capecchi, M. R. 1994. Mice
and to deletion of rostral brain. Development
Boncinelli, E., Somma, R., Acampora, D., with targeted disruptions in the paralogous genes
122: 243-252.
Pannese, M., D’Esposito, M., Faiella, A. and hoxa-3 and hoxd-3 reveal synergistic interac-
Appel, T. A. 1987. The Cuvier-Geoffroy Deba- Simeone, A. 1988. Organization of human tions. Nature 370: 304-307.
te: French Biology in the Decades before Darwin. homeobox genes. Hum. Reprod. 3: 880-886.
Conlon, F. L., Lyons, K. M., Takaesu, N., Barth,
Oxford University Press, New York.
Brunelli, S., Faiella, A., Capra, V., Nigro, V., K. S., Herrmann, B. and Robertson, E. J. 1994.
Avantaggiato, V. Acampora, D., Tuorto, F. and Smeone, A., Cama, A. and Boncinelli, E. 1996. A primary requirement for nodal in the
Simeone, A. 1996. Retinoic acid induces Germline mutations in the homeobox gene Emx2 formation of the primitive streak in the mouse.
stagespecific repatterning of the rostral central in patients with severe schizencephaly. Nat. Development 120: 1919-1928.
nervous system. Dev. Biol. 175: 347-357. Genet. 12: 94-96.
Conlon, R. A. and Rossant, J. 1992. Exogenous gratory and migratory neural crest. Develop- Lumsden, A., Sprawson, N. and Graham, A. 1991.
retinoic acid rapidly induces anterior ectopic ment 112: 43-50. Segmental origin and migration of neural crest
expression of murine Hox-2 genes in vivo. De- cells in the hindbrain region of the chick embryo.
Izpisúa-Belmonte, J. C., De Robertis, E. M., Storey,
velopment 116: 357-368. Development 113: 1281-1291.
K. G. and Stern, C. D. 1993. The homeobox gene
Eyal-Giladi, H. and Khaner, O. 1989. The goosecoid and the origin of organizer cells in the MacMurray, A. and Shin, H.-S. 1988.The
chick’s marginal zone and primitive streak early chick blastoderm. Cell 74: 645-659. antimorphic nature of the Tc allele at the mouse
formation. II. Quantification of marginal zone’s T locus. Genetics 120: 545-550.
Jeannotte, L., Lemieux, M., Cherron, J., Poirier,
potencies—temporal and spatial aspects. Dev.
F. and Robertson, E. J. 1993. Specification of Maden, M., Gale, E., Kostetski, I. and Zile, M.,
Biol. 134: 215-221.
axial identity in the mouse: Role of the Hoxa-5 1996. Vitamin A-deficient quail embryos have
Gaunt, S. J. 1994. Conservation in the Hox code (Hox 1.3) gene. Genes Dev. 7: 2085-2096. half a hindbrain and other neural defects. Curr:
during morphological evolution. Int. J. Dev. Biol. Biol. 6: 417-426.
Kessel, M. 1992. Respecification of vertebral
38: 549-552.
identities by retinoic acid. Development 115: Malicki, J., Schugart, K. and McGinnis, W. 1990.
Gendron-Maguire, M., Mallo, M., Zhang, M. 487-501. Mouse Hox-2.2 specifies thoracic segmental
and Gridley, T. 1993. Hoxa-2 mutant mice identity in Drosophila embryos and larvae. Cell
Kessel, M. 1993. Reversal of axonal pathways
exhibit homeotic transformation of skeletal 63: 961-967.
from rhombomere 3 correlates with extra Hox
elements derived from cranial neural crest. Cell
expression domains. Neuron 10: 379-393. Malicki, J. Cianetti, L. C., Peschle, C. and
75: 1317-1331.
McGinnis, W. 1992. Human HOX4B regulatory
Kessel, M. and Gruss, P. 1991. Homeotic
Gluecksohn-Schoenheimer, S. 1938. The deve- element provides headspecific expression in
transformations of murine vertebrae and
lopment of two tailless mutants in the house Drosophila embryos. Nature 358: 345-347.
concomitant alteration of Hox codes induced by
mouse. Genetics 23: 573-584.
retinoic acid. Cell 67: 89-104. Manley, N. R. and Capecchi, M. R. 1995. The
Goulding, E. H. and Pratt, R. M. 1986. Isotretinoin role of Hoxa-3 in mouse thymus and thyroid
Keynes, R. and Lumsden, A. 1990. Segmentation
teratogenicity in mouse whole embryo culture. J. development. Development 121: 1989-2003.
and the origin of regional diversity in the vertebrate
Craniofac. Genet. Dev. Biol. 6: 99-112.
central nervous system. Neuron 2: 1-9. Marshall, H., Nonchev, S., Sham, M. H.,
Goulding, M. D., Lumsden, A. and Gruss, P. 1993. Muchamore, L, Lumsden, A. and Krumlauf, R.
Khaner, O. 1995. The rotated hypoblast of the
Signals from the notochord and floor plate 1992. Retinoic acid alters hindbrain Hox code
chicken embryo does not initiate an ectopic axis
regulate the regionspecific expression of two and induces transformation of rhombomeres 2/
in the epiblast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
Pax genes in the developing spinal cord. Deve- 3 into a 4/5 identity. Nature 360: 737-741.
10733-10737.
lopment 117: 1001-1016.
Matsuo, I., Kuratani, S., Kimura, C., Takeda, N.
Khaner, O. and Eyal-Giladi, H. 1989. The chick’s
Grunwald, D. J. and Wilson, E. T. 1996. A and Aizawa, S. 1995. Mouse Otx2 functions in
marginal zone and primitive streak formation.
unifying model for the origin of the vertebrate the formation and patterning of the rostral head.
I. Coordinative effects of induction and
organizer. Netherl. J. Zool. 46: 22-46. Genes Dev. 9: 2646-2658.
inhibition. Dev. Biol. 134: 206-214.
Herrmann, B. G. 1991. Expression pattern of McGinnis, W. and Krumlauf, R. 1992. Ho-
Krumlauf, R. 1993. Hox genes and pattern
the Brachyury gene in wholemount Twis/Twis meobox genes and axial patterning. Cell 68:
formation in the branchial region of the
mutant embryos. Development 113: 913-917. 283-302.
vertebrate head. Trends. Genet. 9: 106-112.
Hirth, F., Therianos, S., Loop, T., Gehring, W. McGinnis, N., Kuziora, M. A. and McGinnis,
Layton, W. M. Jr. 1976. Random determination
J., Reichart, H. and Furukubo-Tokunaga, K. W. 1990. Human Hox 4.2 and Drosophila
of a developmental process. J. Hered. 67: 336-
1995. Developmental defects in brain segmen- Deformed encode similar regulatory specifici-
338.
tation caused by mutations of the homeobox ties in Drosophila embryos and larvae. Cell 63:
genes orthodenticle and empty spiracles in Dro- Le Mouellic, H., Lallemand, Y. and Brulet, P. 969-976.
sophila. Neuron 15: 769 -778. 1992. Homeosis in the mouse induced by a null
Meno, C. and seven others. 1996. Leftright
mutation in the Hox-3.1 gene. Cell 69: 251-264.
Hogan, B. L. M., Thaller, C. and Eichele, G. asymmetric expression of the TGFb-family
1992. Evidence that Hensen’s node is a site of Levin, M., Johnson, R. L., Stern, C., Kuehn, M. member lefty in mouse embryos. Nature 381:
retinoic acid synthesis. Nature 359: 237-241. and Tabin, C. 1995. A molecular pathway 151-155.
determining leftright asymmetry in chick em-
Hummel, K. P. and Chapman, D. B. 1959. Monaghan, P. , Grau, E., Bock, D. and Schulz, G.
bryogenesis. Cell 82: 803-814.
Visceral inversion and associated anomalies in 1995. The mouse homolog of the orphan nu-
the mouse. J. Hered. 50: 9-13. Levin, M., Pagan, S., Roberts, D. J., Cooke, J., clear receptor tailless is expressed in the
Kuehn, M. R. and Tabin, C. J. 1997. Different developing brain. Development 121: 839-851.
Hunt, P. and Krumlauf, R. 1991. Deciphering
aspects of laterality are independently controlled
the Hox code: Clues to patterning branchial Morriss-Kay, G. 1993. Retinoic acid and
by an apparently streakautonomous signaling
regions of the head. Cell 66: 1075-1078. craniofacial development: Molecules and
pathway initiating by activin. In press.
morphogenesis. BioEssays 15: 9-15.
Hunt, P. and Krumlauf, R. 1992. Hox codes and
Lowe, L. A. and eight others. 1996. Conserved
positional specification in vertebrate embryonic Nature Genetics (editorial). 1995. Risk assess-
leftright asymmetry of nodal expression and
axes. Annu. Rev. Cell Biol. 8: 227-256. ment and religion. Nat. Genet. 11: 105-106.
alterations in murine situs inversus. Nature 381:
Hunt, P. and seven others. 1991a. A distinct 158-161. Noden, D. 1988. Interactions and fates of avian
Hox code for the branchial region of the head. craniofacial mesenchyme. Development [Suppl.]
Lufkin, T., Dierich, A., LeMeur, M., Mark, M.
Nature 353: 861-864. 103: 121-140.
and Chambon, P. 1991. Disruption of the Hox-
Hunt, P., Wilkinson, D. and Krumlauf, R. 1991b. 1.6 homeobox gene results in defects in a region Oppenheimer, J. M. 1936. The development of
Patterning the vertebrate head: Murine Hox-2 corresponding to its rostral domain of expressi- isolated blastoderms of Fundulus heteroclitus.
genes mark distinct subpopulations of premi- on. Cell 66: 1105-1119. J. Exp. Zool. 72: 247-269.
Ramirez-Solis, R., Zheng, H., Whiting, J., Scott, M. 1992. Vertebrate homeobox gene Tsuda, T., Philp. N., Zile, M. H. and Linask, K.
Krumlauf, R. and Bradley, A. 1993. Hoxb-4 (Hox nomenclature. Cell 71: 551-553. K. 1996. Leftright asymmetric localization of
2.6) mutant mice show homeotic transformation flectin in the extracellular matrix during heart
Seleiro, E. A. P., Connolly, D. J. and Cooke, J.
of a cervical vertebra and defects in the closure looping. Dev. Biol. 173: 39-50.
1996. Early developmental expression and ex-
of the sternal rudiments. Cell 73: 279-294.
perimental axis determination by the chicken Tung, T.-C., Vhang, C.-Y. and Tung, Y.-F.-Y.
Rashbass, P. R., Cook, L. A., Herrmann, B. G. Vg1 gene. Curr. Biol. 6: 1476-1486. 1945. Experiments on the developmental
and Beddington, R. S. P. 1991. A cell autonomous potencies of blastoderms and fragments of
Simeone, A., Acampora, D., Arcioni, L.,
function of Brachiyury in T/T embryonic stem telestean eggs separated latitudinally. Proc. Zool.
Boncinelli, E. and Mavilio, F. 1990. Sequential
cell chimeras. Nature 353: 348-351. Soc. Lond. 115: 175-188.
activation of Hox 2 genes by retinoic acid in
Riddihough, G. 1992. Homing in on the human embryonal carcinoma cells. Nature 34: Wang, B. B., Müller-Immergluck, M. M., Aystin,
homeobox. Nature 357: 643-644. 763-766. J., Robinson, N. T., Chisholm, A. and Kenyon,
C. 1993. A homeotic gene cluster patterns the
Rijli, F. M., Mark, M., Lakkaraju, S., Dierich, Simeone, A., Gulisano, M., Acampora, Stor-
anteroposterior body axis of C. elegans. Cell
A., Dollé, P. and Chambon, P. 1993. A homeotic naiuolo, A., Rambaldi, M. and Boncinelli, E.
74: 29-42.
transformation is generated in the rostral 1992. Two vertebrate homeobox genes related
branchial region of the head by disruption on to Drosophila empty spiracles are expressed in Weinstein, D. C., Ruiz i Altaba, A., Chen, W. S.,
Hoxa-2, which acts as a selector gene. Cell 75: the embryonic cerebral cortex. EMBO J. Hoodless, P., Prezioso, V. R., Jessell, T. M. and
1333-1349. 11:2541-2550. Darnell, J. E. Jr. 1994. The wingedhelix
transcription factor HNF-3b is required for
Rivera-Pérez, J. A., Mallo, M., Gendron- Slack, J. M. W. and Tannahill, D. 1992.
notochord development in the mouse embryo.
Maguire, M., Gridley, T. and Behringer, R. R. Mechanism of anteroposterior axis specification
Cell 78: 575-588.
1995. Goosecoid is not an essential component in vertebrates: Lessons from the amphibians.
of the mouse gastrula organizer but is required Development 114: 285-302. Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Cook, M.,
for craniofacial and rib development. Develop- Boncinelli, E. and Kruflauf, R. 1989. Segmental
Slack, J. M. W., Holland, P. W. H. and Graham,
ment 121: 3005-3012. expression of Hox-2 homeobox-containing
C. F. 1993. The zootype and the phylotypic
genes in the developing mouse hindbrain.
Roush, W. 1995. Embryos travel forking path as stage. Nature 361: 490-492.
Nature 341: 405-409.
they tell left from right. Science 269: 1514-1515.
Stott, D., Kisbert, A. and Herrmann, B. G. 1993.
Wilson, E. T., Cretekos, C. J. and Helde, K. A.
Schumacher, A., Faust, C. and Magnuson, T. Rescue of the tail defect of Brachyuriy mice.
1995. Cell mixing during epiboly in the zebrafish
1996. Positional cloning of a global regulator of Genes Dev. 7: 197-203.
embryo. Dev. Genet. 17: 6-15.
anterior-posterior patterning in mice. Nature
Streit, A., Stern, C. D., Théry, C., Ireland, G. W.,
383: 250-253. Wolpert, L. and Brown, N. A. 1995. hedgehog
Aparacio, S., Sharpe, M. J. and Gherardi, E. 1995.
keeps to the left. Nature 377: 103-104.
Schummer, M., Scheurlen, I., Schaller, C. and A role for HGF/SF in neural induction and its
Galliot, B. 1992. HOM/HOX homeobox genes expression in Hensen’s node during gastrulati- Yanagisawa, K. O. 1990. Does the T gene deter-
are present in hydra (Chlorohydra viridissima) on. Development 121: 813-824. mine the anterior-posterior axis of the mouse
and are differentially expressed during regenera- embryo? Japan. J. Genet. 65: 287-297.
Subramanian, V, Meyer, B. I. and Gruss, P. 1995.
tion. EMBO J. 11: 1815-1825.
Disruption of the murine homeobox gene Cdx1 Yokoyama, T., Copeland, N . G., Jenkins, N. A.,
affects axial skeletal identities by altering the Montgomery, C. A., Elder, F. F. B. and Overbeek,
mesodermal expression domains of Hox genes. P. A. 1993. Reversal of leftright symmetry: A
Cell 83: 641-653. situs inversus mutation. Science 260: 679-682.
Thor, S. 1995. The genetics of brain develop-
ment: Conserved programs in flies and mice.
Neuron 15: 975-977.
Interações Celulares
Durante a Formação do Órgão
17 Interações proximais de tecidos: Indução secundária

18 Desenvolvimento do membro de tetrápode
20 Determinação do sexo 773

701
655 V
19 Interações celulares à distância: Hormônios como mediadores do desenvolvimento 733
21 Regulação ambiental do desenvolvimento animal 805

22 A saga da linhagem germinativa 843
23 Mecanismos desenvolvimentais da mudança evolucionária 883
CAPÍTULO 17 Interações Proximais de Tecidos 655
Interações proximais de tecidos:

Indução secundária 17
Tratando-se de um sistema tão complexo
como o embrião em desenvolvimento é fútil
perguntar se certo rudimento de órgão é “de-
terminado” e se alguma propriedade de sua
vizinhança, com exclusão de outras, o “de-
Ó RGÃOS SÃO ESTRUTURAS COMPLEXAS compostas de numerosos ti-
pos de tecidos. No olho do vertebrado, por exemplo, a luz é transmitida
através do tecido corneano transparente e focalizada pelo tecido do crista-
lino (cujo diâmetro é controlado pelo tecido muscular), para finalmente atingir o
tecido neural da retina. O arranjo preciso dos tecidos nesse órgão não pode ser
termina”. Uma série de diferentes fatores alterado sem lesar a sua função. Tal coordenação na construção dos órgãos é
pode estar envolvida e seus efeitos entrela- conseguida por um grupo de células modificando o comportamento de um conjunto
çados da maneira mais intrincada. Para re- adjacente de células, desse modo, fazendo com que elas mudem sua forma, velocida-
solver esse emaranhado temos que inquirir
de mitótica ou diferenciação. Essa ação à queima-roupa, às vezes chamada intera-
de que maneira o sistema sob consideração
ção proximal ou indução secundária, permite a um grupo de células responder a um
reage com outras partes do embrião durante
segundo grupo de células, em modificação, tornando-se freqüentemente capazes de
os sucessivos estágios do desenvolvimento,
sob uma variedade de condições experimen- alterar um terceiro conjunto de células.
tais tão ampla o quanto for possível impor.
R. G. HARRISON (1933) Interações instrutivas e permissivas
Aspirar a verdade é mais precioso do que Howard Holtzer (1968) distinguiu dois modos principais de interação entre tecidos
assegurar sua posse. proximais. Na interação instrutiva, um sinal da célula indutora é necessário para
G. E. LESSING (1778) iniciar nova expressão gênica na célula responsiva. Sem a célula indutora, a célula
responsiva não seria capaz de se diferenciar de uma maneira particular. Por exemplo,
no Capítulo 15 discutimos a capacidade da notocorda induzir a formação de células
da placa do assoalho no tubo neural. Todas as células do tubo neural são capazes
de responder ao sinal da notocorda, porém, somente aquelas mais próximas da
notocorda são induzidas. As outras células não se tornam células da placa do
assoalho. Ainda mais, se removermos a notocorda do embrião, as células que nor-
malmente se tornariam células da placa do assoalho não se diferenciarão nesse tipo
de célula, e se adicionarmos uma notocorda lateralmente à placa neural, essa nova
notocorda irá induzir um conjunto secundário de células da placa do assoalho. As
células responsivas do tubo neural seriam, de alguma maneira, comandadas a ex-
pressar um conjunto de genes diferentes do conjunto de genes que expressariam, se
não tivessem estado em contato com a notocorda. A notocorda é considerada ser
um tecido indutor que age instrutivamente. Wessell (1977) propôs quatro princípios
gerais característicos da maioria das interações instrutivas:
655
656 PARTE V Interações Celulares Durante a Formação do Órgão
1. Na presença do tecido A, o tecido responsivo B desenvolve-se em uma certa

maneira.
2. Na ausência do tecido A, o tecido responsivo B não se desenvolve dessa
maneira.
3. Na ausência do tecido A, mas em presença de tecido C, o tecido B não se
desenvolve dessa maneira.
4. Na presença da tecido A, um tecido D que normalmente desenvolve-se diferen-
temente, é mudado para desenvolver-se como B.
O segundo tipo de interação tissular proximal é a interação permissiva. Aqui, o

tecido responsivo contém todo o potencial necessário para ser expresso, e somente
requer um ambiente que permita a expressão desses traços. Por exemplo, muitos teci-
dos em desenvolvimento necessitam de um substrato sólido contendo fibronectina
ou laminina para se desenvolver. A fibronectina ou laminina não altera o tipo de célula
que deverá ser produzido, somente permite sua expressão*.
Competência e receptores
Deve-se notar que nos princípios acima, o tecido responsivo deve ser competente
para responder. Competência é a capacidade de responder a um sinal indutivo
(Waddington, 1940). Isso não é um estado passivo, mas uma condição adquirida.
Quando detalhamos a indução do tubo neural, observamos que o ectoderma da
gástrula é capaz de ser induzido pelo lábio dorsal do blastóporo ou seus derivados
mesodérmicos. Assim, o ectoderma da gástrula é dito ser competente para respon-
der a estímulos indutivos. Essa competência para a indução neural é adquirida du-
rante a clivagem tardia e perdida durante os estágios tardios da gástrula. À medida
que essa competência para responder à indução pelo lábio dorsal diminui, algumas
regiões do ectoderma adquirem competência para responder a indutores do cristali-
no. Mais tarde ainda, a competência dos indutores do cristalino é perdida, mas o
ectoderma pode responder a indutores do placódio do ouvido (Serventnick e
Grainger, 1991). Portanto, a própria competência é um fenótipo diferenciado que
distingue células tanto espacial como temporalmente.
Considera-se, em geral, que a competência pode ser adquirida de várias maneiras.
Primeiro, uma célula pode tornar-se competente sintetizando um receptor para a molé-
cula indutora. Como veremos mais adiante neste capítulo, uma célula B não é compe-
tente para responder à indução por células T até que tenha ligado antígenos. Quando
os antígenos são ligados, eles criam um conjunto de receptores que os capacitam a
responder às moléculas indutoras secretadas pelas células T. Esse mecanismo de
competência também é visto na indução da diferenciação de neurônios simpáticos
(Birren e Anderson, 1990; Cattanco e McKay, 1990). Desde o início da década de 1960,
era conhecido que a diferenciação dos neurônios simpáticos depende do fator de
crescimento nervoso (NGF); porém, quando as células progenitoras desses neurônios
foram isoladas, elas não responderam ao NGF. Além disso, não tinham receptores
capazes de ligar NGF. Em vez disso, para se diferenciarem, essas células tinham que ser
primeiro expostas ao fator de crescimento de fibroblasto (FGF). Essa exposição resul-
tava na expressão de NGF nas suas membranas celulares. Tais células tratadas por
FGF podiam responder ao NGF (Figura 17.1). A célula progenitora original não era
competente para ser induzida pelo NGF porque não tinha o receptor NGF. Quando
esse foi induzido pelo FGF, tornou-se competente para responder ao NGF.
* É fácil distinguir as relações permissivas e instrutivas por uma analogia com uma situação mais
familiar. Este livro foi possível ser feito pelas interações permissivas e instrutivas. Os revisores
podem convencer-me a alterar o material no capítulo. Isso é uma interação instrutiva, já que a
informação passará a ser diferente daquela que teria sido. Porém, a informação no livro não poderia
ter sido expressa sem as interações permissivas com o editor e o impressor.
Célula progenitora do nervo

simpático
FGF Responsivo, NGF não responsivo

Receptor FGF
Ligação FGF sinaliza a

síntese do receptor NGF
Neurônio primitivo
Receptor NGF
Ligação de NGF sinaliza a célula

para se diferenciar em um
neurônio simpático maduro
Neurônio
simpático maduro
Neurônio dependente de NGF
Figura 17.1
Indução e competência de uma linhagem precursora de neurônio simpático. A célula germinativa
original é uma célula mitoticamente ativa que não tem receptores NGF, mas que pode responder
a FGF. Isso dá origem a uma célula neural primitiva que tem processos, mas ainda se divide. Esse
neurônio primitivo tem receptores para NGF. A célula responsiva ao NGF pode se diferenciar em
um neurônio simpático maduro que não se divide (caracterizado pelo seu grande soma, nucléolos
proeminentes, extensos processos e dependência de NGF para a sobrevivência). (Segundo Birren
e Anderson, 1990.)
Em segundo lugar, uma célula pode alcançar a competência sintetizando uma mo-
lécula que permite o funcionamento do receptor. Receptores podem ligar o indutor,
mas isso não significa que os receptores sejam funcionais. Freqüentemente, um recep-
tor atua enviando um sinal para o núcleo. Como vimos no Capítulo 3, uma vez que o
receptor tenha fixado um ligante, ele ativa enzimas que fabricam o sinal para divisão ou
diferenciação. Se alguma dessas enzimas não estiver presente, o sinal não é transmiti-
do. Assim, uma célula pode alcançar competência sintetizando um elo faltante na
trajetória da sinalização.
Em terceiro lugar, a competência pode ser adquirida pela repressão de um inibidor.
Se o inibidor estiver presente, uma célula poderá ligar o indutor, enviar o sinal para o
núcleo e, apesar disso, não ser capaz de ser induzida. Por exemplo, os indutores
freqüentemente causam alterações da forma celular (como na indução do tubo neural).
Se a célula estiver inibida de mudar sua forma, ela não será capaz de responder.
Fatores parácrinos
Interações proximais são em geral mediadas por proteínas que podem difundir-se ao
longo de curtas distâncias para induzir mudanças em suas células vizinhas. Essas
proteínas são muitas vezes chamadas de fatores parácrinos ou fatores de diferenciação
e crescimento (GDFs).* Enquanto os fatores endócrinos (hormônios) circulam pelo

sangue para exercer seus efeitos, os fatores parácrinos (como FGF e NGF menciona-
dos anteriormente) são secretados para os espaços imediatamente ao redor da célula
que os produz. Durante a década retrasada, os biologistas do desenvolvimento des-
cobriram que a formação de numerosos órgãos é realmente efetuada por uma popula-
ção relativamente pequena de proteínas. O embrião herda uma “caixa de ferramentas”
relativamente compacta e usa muitas das mesmas proteínas para construir o coração,
os rins, os dentes, os olhos e outros órgãos. Além disso, as mesmas proteínas são
utilizadas através do reino animal, e os fatores ativos na criação do olho ou coração de
Drosophila são muito semelhantes aqueles usados na geração de órgãos de mamífe-
ros. Essas proteínas podem ser agrupadas em quatro famílias principais na base de
suas estruturas. Essas famílias são: a família do fator de crescimento fibroblástico
(FGF), a família Hedgehog, a família Wingless (Wnt) e a superfamília TGF−β.
Os Fatores de Crescimento Fibroblástico
A família FGF tem nove membros relacionados estruturalmente. FGF1 é também

conhecido como FGF acídico, FGF2 é às vezes chamado de FGF básico e FGF7, fator
de crescimento de queratinócitos. Embora existam nove genes FGF distintos, esses
podem gerar uma variedade de isoformas de proteínas variando suas emendas de
RNA ou do códon de iniciação em diferentes tecidos (Lappi, 1995).Os FGFs ativam
um conjunto de tirosina quinases receptoras chamado de receptores do fator de
crescimento fibroblástico As reações iniciadas por esses fatores de crescimento
fibroblástico ativados foram discutidas no Capítulo 3. Os FGFs estão associados
com várias funções desenvolvimentais, incluindo a angiogênese, a formação do
mesoderma e a extensão axônica. Enquanto os FGFs muitas vezes podem substituir
um ao outro, seus padrões de expressão lhes dão funções separadas. O FGF2 é
especialmente importante na angiogênese, e o FGF8 é importante para o desenvolvi-
mento do cérebro intermediário (Crossley et al., 1996). No camundongo, rompimen-
tos de certos genes FGF produzem anormalidades específicas. A ausência de Fgf3
leva à formação desorganizada de somitos, vértebras caudais anormais, e defeitos
do ouvido interno, enquanto a ausência de Fgf4 resulta em morte embrionária preco-
ce causada pela falência do crescimento da massa celular interna. O único problema
de camundongos deficientes em Fgf5 parece ser pêlo anormalmente longo (Figura
17.2; Herbert et al., 1994; Wilkie et al., 1995).
Os FGFs são também ativos na placa de crescimento dos ossos longos e na sutu-
ras dos ossos cranianos (Muenke e Schell, 1995). Mutações levando a ativação pre-
matura de receptores de FGF são a principal causa do nanismo (maturação precoce
das placas de crescimento dos ossos longos) e craniosinostoses (fusão prematura de
ossos cranianos) (Figura 9.19). [cell7.html]
*Os fisiologistas descreveram três maneiras principais pelas quais moléculas solúveis efetuam
mudanças em células. Os fatores parácrinos são moléculas solúveis que efetuam mudanças nas
células adjacentes, ou próximas, à célula secretora. Em embriologia, tais fatores têm também sido
chamados de morfógenos. Os fatores endócrinos (hormônios) são moléculas solúveis que viajam
pelo sangue para realizar mudanças em células distantes da célula secretora. Os fatores autócrinos
são moléculas que efetuam mudanças nas células que os secretaram. Para que os efeitos autócrinos
ocorram, a célula sintetiza uma molécula para qual ela tenha seu receptor próprio. Embora a
estimulação autócrina não seja comum, ela é vista em células citotrofoblásticas placentárias que
sintetizam e secretam o fator de crescimento derivado das plaquetas, cujo receptor está na membra-
na celular daquelas células (Goustin et al., 1985). O resultado é a proliferação explosiva daquele
tecido. Existe apreciável debate sobre até que ponto fatores parácrinos podem operar. A activina,
por exemplo, pode difundir-se por muitos diâmetros celulares e pode induzir diferentes conjuntos de
genes em diferentes concentrações (Gurdon et al., 1994, 1995). As proteínas Vg1, BMP4 e Nodal,
porém, provavelmente somente trabalham sobre seus vizinhos adjacentes (Jones et al., 1996; Reilly
e Melton, 1996). Esses fatores podem induzir a expressão de outros fatores de curto alcance desses
vizinhos, e uma cascata de induções parácrinas pode ser iniciada.
(A) Figura 17.2

Papéis dos fatores de crescimento fibroblásti-
co e seus receptores. Crescimento do pêlo em
um camundongo deficiente em FGF5 (a muta-
ção angorá) (A) torna o pêlo muito mais longo
que o dos companheiros de ninhada no contro-
le (B). (Fotografias cortesia de C. Peterson.)
(B)
A família hedgehog
Em Drosophila, a proteína Hedgehog tem vários papéis críticos na padronização da

mosca em desenvolvimento. No embrião precoce, ela atua de maneira dependente da
concentração na especificação de cada parasegmento embrionário e como veremos
nos próximos capítulos, hedgehog também trabalha mais tardiamemte no desenvolvi-
mento, especificando os eixos da pata e dos discos imaginais alares (Basler e Struhl,
1994; Heemskerk e DiNardo, 1994). Os vertebrados têm pelo menos três homólogos do
gene hedgehog de Drosophila: sonic hedgehog (shh), desert hedgehog (dhh) e
indian hedgehog (ihh). O Desert hedgehog é expresso nas células de Schwann e
Sertoli, e camundongos homozigotos para um alelo zero (“null”) de dhh têm
espermatogênese defeituosa. O indian hedgehog é expresso no intestino e na cartila-
gem (Bitgood e McMahon, 1995; Bitgood et al., 1996).
Entre os três homólogos de vertebrados Sonic hedgehog é a mais empregada.
Confeccionada pela notocorda, é a proteína responsável pela indução de células da
placa de assoalho e neurônios motores no tubo neural (Placzek et al., 1990; Yamada et
al., 1993; veja Capítulo 8). A proteína Hedgehog secretada pela notocorda (na realida-
de, os dois-terços do N-terminal dessa proteína) é também responsável pela indução
do esclerótomo nos somitos (Fan e Tessier-Lavigne, 1994; Johnson et al., 1994). A
Sonic hedgehg foi mostrada mediar a formação do eixo esquerdo-direito em pintos,
iniciar o eixo ântero-posterior nos membros, e induzir o eixo polarizado do intestino
(Riddle et al., 1993; Levin et al., 1995; Roberts et al., 1995). Freqüentemente, a Sonic
hedgehog trabalha com outros fatores parácrinos, como Wnt e FGF. Como veremos
no próximo capítulo, o shh no broto dos membros induz a expressão de FGF4 no
mesoderma posterior, e a combinação de FGF4 e Wnt7a é necessária para manter a
expressão de shh. No dente em desenvolvimento, Sonic hedgehog, FGF4, e outros
fatores parácrinos estão concentrados em regiões onde ocorrem interações celulares
(Figura 17.3; Vaahtokari et al., 1996a).
Bucal
(bochecha)
Mesial Nó de esmalte
(interno)
Nó de esmalte
Figura 17.3
Concentração do fator parácrino de crescimen-
to e fatores de diferenciação na região onde a
A família Wnt
morfogênese e a diferenciação estão ocorrendo
no molar inferior do embrião do camundongo
de 14 dias. (O limite do epitélio dental é mos- Esta família compreende uma família de glicoproteínas ricas em cisteína; existem pelo
trado em branco.) Os fatores parácrinos estão menos 15 membros dessa família em vertebrados. Seu nome advém da fusão do nome
sendo secretados pela células epiteliais não se do gene da polaridade segmentária de Drosophila, wingless, com o nome de um dos
dividindo, o nó de esmalte. (O painel à esquer- seus homólogos vertebrados, integrated. Como vimos no Capítulo 7, a Wnt1 parece
da mostra que as células do nó de esmalte não ser ativa na indução do miótomo nos somitos e no estabelecimento dos limites do
estão replicando DNA.) Acima de cada hibri- cérebro intermediário (McMahon e Bradley, 1990; Ku e Melton, 1993; Stern et al.,
dização in situ está a reconstrução seriada da 1995). Conforme veremos em capítulos subseqüentes, os genes Wnt também são im-
área de expressão. Veja página 682 para deta-
portantes no estabelecimento da polaridade dos membros vertebrados, tal como o
lhes. (de Jernvall, 1995; fotografias cortesia de
A. Vaahtokari, J. Jernvall e I. Thesleff.) wingless estabelece a polaridade durante o desenvolvimento dos membros dos inse-
tos. É interessante que em ambos os casos ocorrem interações com membros da
família hedgehog. Durante a gastrulação do camundongo Wnt3a, Wnt5a e Wnt5b são
todos expressos em regiões sobrepostas mas distintas na linha primitiva. A Wnt3a é a
única proteína Wnt vista nessa região da linha que irá gerar o mesoderma dorsal
(somito), e camundongos homozigotos para o alelo zero do gene Wnt3a não têm
somitos caudais aos membros anteriores (Figura 17.4; Takada et al., 1994).
A trajetória sinalizando Wnt está intimamente conectada à trajetória hedgehog.
Como mostrado na Figura 3.38, hedgehog estimula a expressão de wg e a proteína
Wingless estimula a expressão de hedgehog. Em Drosophila, uma das coisas
feitas por Hedgehog para ativar a expressão gênica de wingless é de contrapor a
repressão da proteína Patched. Uma vez eliminada a repressão do gene patched, o
wingless pode ser expresso. A expressão ectópica do gene patched inibe o cresci-
mento celular. Pensa-se existir uma trajetória semelhante em humanos, e cada uma
das moléculas na trajetória de Drosophila tem um homólogo humano. Em huma-
nos, mutações esporádicas de perda-de–função do gene patched em tecidos
somáticos causam carcinomas de células basais, o tipo mais comum do câncer
(A) (B) Figura 17.4

Ausência de somitos caudais em embriões de
camundongos homozigotos para um alelo zero
de Wnt3a. (A) Embrião de camundongo do
tipo selvagem de 12,5 dias. (B) O mesmo está-
gio em um embrião de um mutante Wnt3a,
mostrando falta de broto caudal e um eixo trun-
cado. (C) Seção transversal através da área do
membro posterior de um embrião tipo selva-
gem de camundongo de 9,5 dias. (D) Seção
transversal no mesmo estágio de um embrião
mutante Wnt3a. Não são vistos somitos (A
massa de células perto da medula espinhal é
mais provavelmente oriunda da crista neural.)
(de Takada et al., 1994; fotografias cortesia de
A. P. McMahon.)
(C) (D)
humano. Mutações herdáveis do gene pathched dão origem à sindrome nevus da

célula basal, uma condição autossômica dominante caraterizada por anomalias
desenvolvimentais (alterações craniofaciais e das costelas, dedos ligados) e tu-
mores malignos (meduloblastomas e carcinomas de células basais) (Hahn et al.,
1996; Johnson et al., 1996).*
A superfamília TGF−β
Existem mais de 30 membros estruturalmente relacionados da superfamília TGF−β, que

regulam algumas das interações mais importantes do desenvolvimento (Figura 17.5).
Os peptídeos codificados pelos genes dessa superfamília são processados de modo
que a região carboxílica terminal contenha o peptídeo maduro. Esses peptídeos são
dimerizados em homodímeros (consigo mesmo) ou heterodímeros (com outros
peptídeos TGF−β) e secretados pela célula. A superfamília TGF−β inclui a família TGF−
β, a família activina, as proteínas da morfogênese óssea (BMPs), a família Vg1, e outras
proteínas, incluindo a Dorsalina (ativa na padronização do tubo neural, veja Capítulo
7), o fator neurotrófico derivado da glia (necessário para a diferenciação dos neurônios
entéricos e renais), e o fator inibidor Mülleriano (que é envolvido na determinação
sexual dos mamíferos, veja Capítulo 20). Em Drosophila, a proteína decapentaplegic é
homóloga à BMP4 de vertebrado.
Os receptores que ligam os membros da superfamília TGF−β transmitem o sinal
para o núcleo pela ativação de proteínas smad específicas. Essas proteínas resi-
dem no citoplasma, mas quando os receptores ligam membros da superfamília
* Carcinomas de células basais, tumores da camada de células basais da epiderme, afligem cerca
de 750.000 pessoas cada ano nos Estados Unidos, a maioria desses cânceres se originando após
exposição à luz solar de pessoas de origem norte-européia. Por outro lado, a síndrome nevus de
células basais (às vezes chamada de síndrome de Gorlin) é extremamente rara.
Família BMP
TGF−β, eles ativam (provavelmente por fosforilação) um desses polipeptídeos de
50-kDa. Isso converte a proteína smad em um fator de transcrição que pode pene-
trar no núcleo e ativar genes específicos (Graff et al., 1996; Hoodless et al., 1996;
osteogenina Liu et al., 1996).
Dorsalina 1 (pinto)
A FAMÍLIA TGF−β −β. Essa família inclui TGF−β1, 2, 3 e 5. TGF−β1 parece ser impor-
tante para a formação de órgão ramificados. TGF−β1 exógeno foi achado inibir o
crescimento de duetos em glândulas mamárias do camundongo (Daniel, 1989;
(braquipodismo) Silberstein et al., 1992), causar malformações de glândulas salivares embrionárias
murinas (Hardman et al, 1994), e prevenir a ramificação dos rins embrionários (Ritvos
(orelha curta) et al.,1995). Assim, TGF−β1 pode ser crítico no processo normal de ramificação,
talvez mediando esse e outros processos, intensificando a produção de componen-
tes da matriz extracelular como a fibronectina, colágenos I e IV (Ignotz e Massagué,
1968; Penttinen et al, 1988), osteonectina (Wrana e al., 1991) e proteoglicanos (Bassols
(camundongo)
e Massagué, 1988; Morales e Roberts, 1988), enquanto inibe a proteólise da matriz
celular (Edwards et al, 1987; Saksela et al., 1987). Isso poderia ter um efeito líquido de
estabilização da estrutura tissular. Os efeitos exatos das proteínas TGF−β depen-
dem, muitas vezes, do tipo celular que encontram, e a mesma TGF−β pode ter efeitos
(Xenopus)
(ouriço-do-mar) opostos (tal como interrompendo ou acelerando a divisão celular) em diferentes
tipos de células.
Screw (Drosophila) Os efeitos de TGF−β são de difícil separação porque componentes da família
Nodal
parecem funcionar de maneira semelhante e podem compensar por perdas dos outros
activina quando expressos conjuntamente. Além disso, deleções apontadas para o gene Tgfb1
activina são difíceis de interpretar, pois a mãe pode suprir esse fator através da placenta e do
leite (Letterio et al., 1994).
A FAMÍLIA BMP. Embora originalmente descoberta devido à sua habilidade em

induzir o crescimento ósseo, as BMPs regulam processos desenvolvimentais tão
diversos como proliferação celular, apoptose, migração celular, diferenciação ce-
Inibina lular e morfogênese (Hogan, 1996). (Revelou-se que a BMP1 não é membro dessa
família.) BMPs se distinguem dos outros grupos da superfamília TGF−β por terem
Figura 17.5
sete, em vez de nove, cisteínas conservadas no peptídeo maduro. Já vimos prote-
Relacionamentos entre membros da superfa- ínas BMP tal como a Nodal (ativa na formação do eixo tanto em Xenopus como em
mília TGF-b. (Segundo Hogan, 1996.) * camundongos), BMP4 (importante na especificação mesodérmica, polaridade do
tubo neural e padronização de somitos), e Decapentaplegic (que determina a pola-
*Infelizmente, laboratórios diferentes usam ridade dorsoventral em Drosophila). A BMP4 também está implicada na indução
letras maiúsculas e/ou hifens para os nomes desde apoptose em células da crista neural migrando de rombômeros de números
ses e de outros fatores de maneiras diferentes. A
nossa ortografia particular não foi planejada para
ímpares (Graham et al., 1993) e membrana entre dedos dos pés dos embriões de
priorizar qualquer desses laboratórios ou con- pintos (veja Capítulo 23). BMP4 e Decapentaplegic são extremamente semelhan-
venções. Porém, lembramos o dito (Cohen, tes, e genes BMP4 humanos podem salvar embriões de moscas carentes de dpp
1982) que “Acadêmicos podem mais facilmente (Padgett et al., 1993). A ausência de algumas BMPs causa anormalidades
compartilhar suas escovas de dentes do que a
nomenclatura um do outro”.
esqueléticas específicas (Kingsley et al., 1994; Storm et al., 1994). Mutações do
gene BMP5 resultam em um esqueleto pequeno e orelhas pequenas devido à
redução de condensações da precartilagem, enquanto mutações de gdf5 causam
membros curtos e um número reduzido de dedos do pé. Como os outros membros
TGF−β, as BMPs funcionam dimerizando receptores nas células-alvo e ativando
suas quinases serina/treonina (Liu et al., 1995).
Sinalização Justácrina (“juxtacrine”)
Embora a maioria dos reguladores da indução conhecidos sejam proteínas difusíveis,

algumas proteínas podem permanecer ligadas à superfície celular. Certas proteínas
Wnt, por exemplo, carecem de um sinal para secreção e podem interagir com recepto-
res de suas vizinhas enquanto ligadas à suas membranas celulares. De maneira seme-
lhante, as proteínas Hedgehog podem existir em forma ligada à membrana antes de seu
Citoplasma Figura 17.6

Sinalização célula-célula entre duas células justapostas. Este mode-
lo especulativo para a sinalização Delta-Notch é baseado em evi-
dência genética de cruzamentos de Drosophila. A proteína receptora
Serrate Delta
Notch pode se ligar às proteínas Serrate ou Delta das células adja-
centes através de seus domínios extracelulares. A proteína Delta
age como um ligante e dimeriza a proteína Notch na membrana
desse último. Essa dimerização é estabilizada por interações entre
Monômero as proteínas, que podem permitir a troca da proteína Suppressor of
Notch
Notch Hairless com Deltex. A proteína Suppressor of Hairless estava
ligada ao lado citoplasmático da molécula Notch, mas uma vez
Extracelular
liberada, torna-se um fator de transcrição. Esse fator pode controlar
o destino da célula, direcionando-a a tornar-se pele em vez de tecido
Citoplasma neural. (Segundo Artavanis-Tsakonas et al., 1995.)
Deltex
Suppressor
of Hairless Suppressor of Hairless
Núcleo Hairless
processamento proteolítico. Nessa sinalização, as células teriam que estar em contato

direto para o sinal ser eficaz. Tal caminho foi visto para o sinal Delta recebido pela
proteína Notch, um sinal cujas funções desenvolvimentais em Drosophila serão dis-
cutidas mais tarde. Notch se estende através da membrana celular, e sua superfície
externa contata proteínas Delta ou Serrate que se estendem de células adjacentes.
Quando as proteínas Delta se conectam à Notch, estabilizam a sua dimerização e
permitem a ocorrência de mudanças conformacionais no lado citoplasmático da prote-
ína Notch. Essas mudanças permitem à proteína Deltex trocar com a proteína chamada
Suppressor of Hairless. Quando se separa da proteína Notch, a proteína Suppressor
of Hairless entra no núcleo para se tornar um fator de transcrição (Figura 17.6; Artavanis-
Tsakonas et al, 1995). Assim, a proteína Notch é capaz de receber o sinal de Delta
somente quando as células estão justapostas. Por isso, esse tipo de sinalização é, às
vezes, chamado de sinalização juxtácrina (“juxtacrine”). [prox1.html]
Interações epitélio-mesênquima
Alguns dos casos melhor estudados de indução secundária são aqueles envolvendo as
interações de lâminas epiteliais com células mesenquimatosas adjacentes. São chama-
das interações epitelio-mesênquima. O epitélio pode originar-se de qualquer camada
germinativa, enquanto o mesênquima é geralmente derivado de tecido mesodérmico
frouxo ou da crista neural. Exemplos dessas interações estão listados na Tabela 17.1.
Especificidade Regional da Indução
Usando como nossos exemplos a indução de estruturas cutâneas, iremos examinar

as propriedades das interações epitélio-mesênquima. O primeiro fenômeno é a
especificidade regional da indução. A pele é composta de dois tecidos principais: a
Tabela 17.1 Algumas interações epitélio-mesênquima
Órgão Componente epitelial Componente

mesenquimatoso
Estruturas cutâneas (pêlo, Epiderme (ectoderma) Derme (mesoderma)

penas, glândulas sudoríparas,
glândulas mamárias)
Membro Epiderme (ectoderma) Mesênquima
(mesoderma)
Órgãos viscerais (fígado, pâncreas, Epitélio (endoderma) Mesênquima
glândulas salivares) (mesoderma)
Órgãos associados faríngeo e Epitélio (endoderma) Mesênquima
respiratório (pulmão, timo, tireóide) (mesoderma)
Rim Epitélio do broto uretérico Mesênquima
(mesoderma) (mesoderma)
Dente Epitélio maxilar (ectoderma) Mesênquima
(crista neural)
epiderme externa, derivada do ectoderma e a derme derivada do mesoderma. A

epiderme do pinto sinaliza as células dérmicas subjacentes a formarem condensações
(provavelmente secretando Sonic hedgehog e TGF−β2); o mesoderma condensado
responde secretando fatores que causam a formação de estruturas cutâneas regio-
nalmente específicas, compostas quase inteiramente de células ectodérmicas (Nohno
et al., 1995; Ting−Βerret e Chuong, 1996; Prancha 23). Essas são as penas largas das
asas, penas estreitas das coxas, e as escamas e garras das patas. Após separar o
epitélio embrionário e o mesênquima um do outro, pode-se recombiná-los de dife-
rentes maneiras (Saunders et al., 1957). Algumas das recombinações estão ilustra-
das na Figura 17.7. Conforme se vê, o mesênquima é responsável pela especificidade
da indução no ectoderma competente. Esse mesmo tipo de ectoderma se desenvol-
ve de acordo com a região de onde foi retirado o mesoderma. Aqui, o mesênquima
tem um papel instrutivo, chamando a participação de diferentes conjuntos de genes
nas células responsivas.
Essa especificidade regional da indução é crítica durante o desenvolvimento
dos sistemas digestivo e respiratório. Na morfogênese dos tubos endodérmicos, o
Fonte do mesoderma Ectoderma alar Indução específica
Asa Pena
da asa
Coxa Pena
Figura 17.7 da coxa
Especificidade regional da indução. Quan-
do células da derme (mesoderma) são re-
combinadas com a epiderme (ectoderma) no
pinto, o tipo de estrutura cutânea produzida Pé Escamas,
pelo ectoderma é determinado pela localiza- garra
ção original do mesoderma. (Adaptado de
Saunders, 1980.)
epitélio endodérmico é capaz de responder diferentemente aos diferentes mesênqui-

mas específicos regionalmente. Isso capacita o tubo digestivo e o tubo respiratório
desenvolverem diferentes estruturas em diferentes regiões do tubo. Assim, à medi-
da que o tubo digestivo encontra novos mesênquimas, se diferencia em esôfago,
estômago, intestino delgado e cólon (Gumpel-Pinot et al., 1978; Fukumachi e
Takayama, 1980). Essa especificidade regional da indução do mesênquima fica dra-
maticamente aparente na formação do sistema respiratório. No mamífero em desen-
volvimento, o tubo respiratório epitelial responde de duas maneiras distintas. Quan-
do na região do pescoço, ele cresce de modo reto, formando a traquéia. Após pene-
trar no tórax, ele se ramifica, formando os dois brônquios e depois o pulmão. O
epitélio respiratório pode ser isolado logo depois de ter se dividido nos dois
brônquios, e os dois lados podem ser tratados de maneira diferente. A Figura 17.8
mostra o resultado de tal experimento. O epitélio bronquial direito manteve seu
mesênquima pulmonar, enquanto o brônquio esquerdo foi rodeado pelo mesênqui-
Figura 17.8
ma traqueal (Wessells, 1970). O brônquio direito se proliferou e se ramificou sob a
Capacidade do epitélio presuntivo pulmonar de
influência do mesênquima pulmonar, enquanto o lado esquerdo continuou a crescer se diferenciar em relação à fonte do mesênqui-
de uma maneira não-ramificada. Assim, o epitélio é extremamente maleável e pode se ma indutor. Após o epitélio pulmonar do ca-
diferenciar de acordo com suas instruções mesenquimatosas. mundongo ter se ramificado em dois brônquios,
A especificidade do mesoderma é considerada ser controlada por suas interações o rudimento inteiro é excisado e cultivado. O
com o tubo endodérmico durante os estágios precoces do desenvolvimento. Roberts brônquio direito é deixado intocado, enquanto
e colegas (1995) implicaram a Sonic hedgehog nessa especificação. No início do de- a extremidade do brônquio esquerdo é coberta
senvolvimento, a expressão de shh é limitada ao endoderma posterior do intestino com mesênquima traqueal. A extremidade do
terminal. Isso parece ser necessário para a indução no mesoderma de um conjunto brônquio direito forma os ramos característi-
cos do pulmão, mas não ocorre ramificação na
aninhado de genes Hox que se parece com o conjunto posterior de genes HOM-C de
extremidade do brônquio esquerdo. (de
Drosophila. Tal como a situação nas vértebras, as margens anteriores do padrão de Wessells, 1970, cortesia de N. Wessells.)
expressão delineiam os limites morfológicos das regiões que irão formar a cloaca, o
intestino grosso, o ceco, ceco médio (na margem intestino médio/intestino terminal), e
a porção posterior do intestino médio (Prancha 22; Figura 17.9). Assim, a expressão
endodérmica de Sonic parece induzir uma expressão aninhada de genes Hox no meso-
derma. Esses genes Hox provavelmente especificam o mesoderma de modo que eles
possam interagir com o tubo endodérmico e especificar suas regiões.
Grupo
paralogo
Hox Intestino delgado
Ceco mediano
Ceco
Neurulação
precoce Intestino
grosso Figura 17.9
Especificação regional do mesoderma visceral
através de interações com o endoderma do in-
testino posterior. A expressão e secreção de
Sonic hedgehog no endoderma gera um con-
junto aninhado de expressão do gene Hox no
mesoderma adjacente. Após o mesoderma ter
Cloaca sido especificado, ele pode atuar sobre o tubo
endodérmico para induzir regiões morfológicas
Estágio do broto mediano específicas. (Segundo Roberts et al., 1995.)
Especificidade Genética da Indução
Enquanto o mesênquima pode instruir o epitélio sobre quais conjuntos de genes

deve ativar, o epitélio responsivo somente pode obedecer a essa informação até o
ponto que seu genoma permitir. Em um experimento clássico, Hans Spemann e Oscar
Schotté (1932) transplantaram ectoderma do flanco de uma gástrula precoce de rã
para região de uma gástrula de salamandra destinada a se tornar parte da boca. De
maneira semelhante, o tecido ectodérmico presuntivo do flanco de uma gástrula de
salamandra foi colocado na presuntiva região oral de embriões de rãs. As estrutu-
ras da região oral diferem muito entre as larvas de salamandras e rãs. A larva da
salamandra Triturus tem equilibradores em forma de clava sob a boca, enquanto os
girinos de rãs produzem glândulas secretoras de muco e sugadores (Figura 17.10).
Os girinos de rãs têm também um maxilar cornificado sem dentes, enquanto a sala-
mandra tem um conjunto de dentes de calcário em sua mandíbula. As larvas resultan-
tes dos transplantes eram quimeras. As larvas da salamandra tinham bocas seme-
lhantes às das rãs, e os girinos de rãs tinham dentes de salamandra e equilibradores.
Em outras palavras, as células mesodérmicas instruíram o ectoderma a produzir uma
boca, mas o ectoderma respondeu produzindo a única boca que “sabía” como pro-
duzir, não importa quão inadequada.*
A mesma especificidade genética é encontrada em combinações de pele de pinto e
pele de camundongo (Coulombre e Coulombre, 1971). Quando ectoderma normalmen-
te destinado a se tornar córnea é isolado de embriões de pinto e combinado com
*Spemann é reportado como tendo descrito dessa maneira: “O ectoderma diz ao indutor, ‘você
me diz como produzir uma boca; está bem, assim o farei, porém, não posso produzir o seu tipo de
boca; só posso produzir a minha e isso farei.” (Citado por Harrison, 1933.)
Doador Hospedeiro Resultado
Área do
presuntivo ectoderma oral
Gástrula Gástrula de
de rã salamandra Sugador
Salamandra com
sugadores de
girino de rã
Figura 17.10
Especificidade genética da indução. O trans-
plante recíproco entre as presuntivas regiões Gástrula Gástrula de Rã
ectodérmicas orais das gástrulas da salaman- de salamandra
dra e da rã conduz a larvas de salamandra com
Equilibradore
sugadores de girino e girino de rã com Girino de rã com
equilibradores de salamandra. (Segundo equilibradores de
Hamburgh, 1970.) salamandra
Figura 17.11
Especificidade genética da indução cutânea. (A)
Seção da região corneana de um embrião de
pinto de 17 dias. Aos 5 dias de incubação, o
cristalino deste olho foi substituído pela derme
do flanco de um embrião precoce de camun-
dongo. Uma condensação de células embrio-
nárias murinas está localizada diretamente sob
o epitélio do pinto. (B) Formação de penas a
partir do epitélio corneano de tal espécimen.
(A) (B) Células de camundongo estão presentes no ru-
dimento das penas. (de Coulombre e Coulom-
bre, 1971, cortesia de A. J. Coulombre.)
mesoderma de pele de pinto, o ectoderma produz botões de penas típicos da pele do

pinto. Além disso, quando o mesmo tecido - ectoderma presuntivo da córnea - é
combinado com ectoderma da pele de camundongo, botões de penas também apare-
cem (Figura 17.11). O mesoderma do camundongo instruiu a córnea do pinto a produ-
zir uma estrutura cutânea. No camundongo, isso normalmente seria pêlo. O ectoderma
competente do pinto, porém, faz o melhor que pode, desenvolvendo suas estruturas
cutâneas – ou seja, penas.
Assim, as instruções enviadas pelo tecido mesenquimatoso podem atravessar
barreiras entre espécies. Salamandras respondem a sinais de rãs, e tecido de pinto
responde a indutores de mamíferos. A resposta do epitélio, porém, é espécie–especí-
fica. Enquanto a especificidade do tipo de órgão (pena ou garra) usualmente é contro-
lada pelo mesênquima dentro de uma espécie, a especificidade da espécie é controlada
pelo epitélio responsivo. [prox2.html]
Cascatas de indução embrionária: Indução do cristalino

Os Fenômenos da Indução do Cristalino
As interações entre células próximas provêem um mecanismo pelo qual o desenvolvi-

mento coordenado pode ocorrer, para um tecido responsivo também poder tornar-se
um tecido indutor. Estudos recentes mostraram que a indução secundária é um pro-
cesso muito complexo. Na verdade, o que tradicionalmente estivemos chamando de
induções “secundárias” usualmente são apenas a última indução em uma cascata que
começou muito antes na embriogênese, e muitos tecidos adquirem sua competência
através de uma indução prévia. Embora esses tecidos possam parecer inalterados ao
microscópio, eles foram induzidos para poder responder a um novo indutor. Isso
provavelmente acontece nas induções epidérmicas mencionadas acima, e certamente
é verdadeiro para a indução secundária mais estudada, a formação do cristalino.
O MODELO DO CÁLICE ÓPTICO NA INDUÇÃO DO CRISTALINO. Conforme

discutido no Capítulo 7, as células que formam o cristalino derivam da região do
ectoderma da cabeça que é contatado pela vesícula óptica do cérebro anterior.
Esse trabalho pioneiro de Hans Spemann e sua revisão desses estudos em 1938,
tornaram a indução do cristalino o paradigma dos eventos indutivos secundários.
Os experimentos básicos foram como segue. Primeiro, quando Spemann (1901)
destruiu o primórdio da vesícula óptica da rã Rana temporaria, não ocorreu o
desenvolvimento do cristalino. Assim, Spemann conclui que o contato da vesícula
óptica com o ectoderma acima dela foi essencial para a formação do cristalino.
Segundo, Warren Lewis (1904, 1907) confirmou e estendeu essa conclusão. Ele
removeu vesículas ópticas de nêurulas de estágio tardio e transplantou-as para o
ectoderma da cabeça de regiões que usualmente não formariam cristalino. Ele achou
que o ectoderma da cabeça dessa região formaria então estruturas semelhantes ao
cristalino, e concluiu que a vesícula óptica era suficiente para induzir a formação
de tecido do cristalino em ectoderma, que de outra maneira não o teria formado.
Pareceu que o contato com a vesícula óptica era tudo o que era necessário para
induzir cristalino no ectoderma sobrejacente.
DESACORDOS COM O MODELO DO CÁLICE ÓPTICO. Houve dissidentes dessa

visão; Mencl (1908) notou que certos peixes tinham defeitos congênitos devido aos
quais não formavam olhos. Apesar disso, esses peixes tinham cristalino no seu
ectoderma da cabeça. Mais importante, quando King (1905) tentou repetir os experi-
mentos de Spemann, ele encontrou ao contrário do esperado que o cristalino ainda se
formava mesmo quando rudimentos da vesícula óptica tinham sido obliterados. Esses
e outros investigadores começaram a achar que os cristalinos podiam se formar sem
contato com a vesícula óptica.*
À medida que mais dados se acumulavam, pareceu que havia um alto grau de
diversidade de espécies. Algumas espécies pareciam formar cristalinos sem a neces-
sidade de vesículas ópticas, ao passo que em outras espécies, os cristalinos pareci-
am depender inteiramente do contato com essa vesícula. Spemann (1938) reconci-
liou esses resultados argumentando que um organismo podia evoluir com uma mar-
gem de segurança, desenvolvendo duas maneiras de formar determinado tecido.
Assim, o cristalino normalmente se originaria pelo contato com a vesícula óptica,
porém, essa falhando, poderia originar-se separadamente se assim ele tivesse que
fazer. Esse conceito foi chamado de hipótese da “dupla segurança”. Em 1966, Jacobson
integrou mais dados nesse modelo. Ele notou que o ectoderma formador do cristali-
no entra seqüencialmente em contato com o endoderma presuntivo do intestino
anterior, o endoderma presuntivo do coração e a vesícula óptica. Ele sugeriu que
cada um desses tecidos atuaria de uma maneira aditiva para induzir a formação do
cristalino nesse tecido. Em algumas espécies, o limiar para a indução do cristalino
seria baixo, e o contato com o ectoderma seria suficiente. Em outras, o limiar seria
alto, e todos os três indutores teriam que estar ativos. Assim, a formação do crista-
lino parecia depender da vesícula óptica, mas na realidade, essa seria somente o
último dos três indutores.
A Base Celular da Indução do Cristalino
Sem descartar o papel do mesoderma e endoderma, estudos recentes em Xenopus

enfatizam a importância da placa neural anterior como um indutor precoce do
ectoderma do cristalino. Esses experimentos indicam que o ectoderma presuntivo
do cristalino recebe sua habilidade de tornar-se cristalino muito cedo durante o
desenvolvimento (durante os estágios de gástrula tardia para meia-nêurula) e que a
vesícula óptica apenas localiza a diferenciação desse tecido já autônomo. Em outras
palavras, o ectoderma da cabeça formará cristalinos sem o contato do cálice óptico,
mas esse é necessário para a completa diferenciação do cristalino e seu
posicionamento adequado em relação ao restante do olho. Este modelo (Figura
17.12; Saha et al., 1989; Grainger, 1992) divide a determinação do ectoderma do
cristalino em quatro estágios: competência, propensão, determinação e diferencia-
ção final. Competência para responder ao sinal indutor inicial é vista como um pro-
cesso autônomo dentro do ectoderma, e a propensão para produzir cristalino é
provida pela placa neural anterior. A especificação do cristalino ocorre ao tempo do
fechamento da placa neural, quando a vesícula óptica se aproxima do ectoderma da
cabeça, e a determinação final é induzida pela vesícula óptica.
*A interpretação desses experimentos foi extremamente difícil devido às diferenças específicas

nos mecanismos de indução, a temperatura na qual ocorre indução máxima, e a dificuldade de
conseguir pedaços de tecidos não contaminados para transplante. Veja Jacobson e Sater (1988) e
Saha et al. (1989, 1991) para revisões sobre esses dissidentes e seus experimentos.
(A) Gástrula precoce Figura 17.12

(competência pré-cristalino) Ectoderma Um modelo corrente da indução do cristalino.
Os sinais indutivos estão indicados por setas.
(A) Na gástrula precoce, o ectoderma ainda
Mesoderma
não alcançou a competência para tornar-se cris-
talino (embora tenha competência para tornar-
(B) Gástrula intermediária tardia se tecido neural). (B) Durante a gástrula inter-
Endoderma
(competência do cristalino) mediária, o ectoderma formador do cristalino
Área da retina
torna-se competente para responder ao sinal
indutor do cristalino da presuntiva placa neural
Área
do cristalino
(possivelmente as presuntivas células da reti-
na). Durante a gástrula tardia, esse sinal do
ectoderma neuralizado (provavelmente a região
presuntiva do olho) induz o presuntivo ecto-
derma formador do cristalino. Um sinal indutivo
Placa adicional pode estar vindo do mesoderma
( C ) Nêurula precoce neural
(viés de formação do cristalino)
presuntivo ou do endoderma do intestino ante-
Área do cristalino
rior. (C) Na nêurula precoce, os sinais da re-
Ectoderma do gião neural anterior causaram o viés de forma-
cristalino ção do cristalino no ectoderma da cabeça. Esse
sinal pode ser reforçado pela indução do meso-
derma lateral anterior. (D) No estágio de nêurula
tardia, a vesícula óptica contata o ectoderma
formador do cristalino, sinalizando a determi-
(D) Nêurula tardia Tubo nação final desse tecido em cristalino. (E) No
(especificação do cristalino) Vesícula estágio de girino, o presuntivo ectoderma do
neural
óptica
cristalino diferencia-se em tecido do cristalino.
Ectoderma (Segundo Saha et al., 1989; Grainger, 1992.)
do cristalino
Cérebro em
desenvolvimento
(E) Girino jovem
(diferenciação do cristalino) Cálice óptico
Cristalino
COMPETÊNCIA ECTODÉRMICA E PROPENSÃO DO CRISTALINO. Em 1987,

Henry e Grainger demonstraram que a determinação da habilidade de formação do
cristalino ocorre muito precocemente no desenvolvimento de Xenopus. Eles trans-
plantaram ectoderma de embriões de Xenopus para a região formadora do cristalino da
nêurula. Seria esse ectoderma capaz de formar um cristalino quando contatado horas
mais tarde pela vesícula óptica? Ectoderma de gástrulas muito jovens não foi compe-
tente. Porém, quando ectoderma de gástrula tardia foi transplantado para nêurulas,
mostrou-se capaz de responder à vesícula óptica com a formação de um cristalino
(Tabela 17.2). Tecido algum respondeu dessa maneira. Outras regiões ectodérmicas de
gástrulas também tinham uma habilidade limitada de formar cristalinos, porém, essa
era perdida durante o prosseguir do desenvolvimento.
Parecia, pois, que o ectoderma formador de cristalino alcançava a competência
muito antes de ser contatado pela vesícula óptica. Quando e como era alcançado
esse estado formador de cristalino? Experimentos por Nieuwkoop (1952) haviam
sugerido que um sinal da placa neural podia viajar através do ectoderma. Poderia a
placa neural induzir a epiderme presuntiva lateral, a se tornar ectoderma formador de
Tabela 17.2 Aumento com a idade da capacidade responsiva do ectoderma prospectivo do cristalino
Operação
Estágio do Doador Nêurula Número Cristalinos Corpo Espessamento Corpo sem Sem Total
Doador hospedeira examinados induzidos semelhante ectodérmico cristalino resposta positivo
(%) ao cristalino (%) (%) (%)
%
Gástrula
intermediária 24 0 4 38 8 50 1 (4%)
Gástrula tardia 21 10 14 42 10 24 5 (24%)
Nêurula precoce 24 75 8 0 4 13 20 (83%)
Nêurula tardia 20 95 5 0 0 0 20 (100%)
Fonte: Segundo Henry e Grainger, 1987.
cristalino? Henry e Grainger (1990) testaram essa hipótese combinando a região

prospectiva anterior da placa neural de embriões em gástrula tardia com ectoderma
da região que iria finalmente tornar-se cristalino. Enquanto o ectoderma isolado de
uma potencial região formadora de cristalino não produzia proteínas do cristalino
quando cultivado sozinho, a mesma região produzia proteínas do cristalino quando
cultivada próxima do tecido prospectivo da placa neural anterior. Embora a diferen-
ciação do cristalino era freqüentemente rudimentar, ela era muito específica. As
proteínas do cristalino não foram produzidas quando o ectoderma da gástrula foi
combinado com outros tecidos, incluindo o endoderma do intestino anterior ou o
mesoderma cardíaco (Figura 17.13A). Esses experimentos mostram que a porção
anterior da prospectiva placa neural (a qual contém a futura região da retina) fornece
um sinal que predispõe esse tecido a se tornar o cristalino.
Porém, todos os tecidos são capazes de responder a um sinal vindo da placa
neural anterior? Servetnick e Grainger (1991) mostraram que somente o ectoderma
de gástrula intermediária à gástrula tardia é competente para responder a esses
sinais. Eles removeram ectodermas do hemisfério animal pigmentado de vários
estágios de gástrula e transplantaram-nos para a região presuntiva do cristalino
de embriões em estágio de placa neural (Figura 17.13B). O ectoderma de gástrulas
precoces mostrou pouca ou nenhuma competência para formar cristalinos (quan-
do testado por meio da produção de proteínas cristalinas), porém, o ectoderma de
estágios um pouco mais tardios foi capaz de formar cristalinos. No fim da gastru-
lação, essa capacidade de responder ao sinal da placa neural tinha se perdido.
Essa competência foi verificada ser inerente ao próprio ectoderma e não ser induzida
por outros tecidos circunjacentes. O ectoderma do hemisfério animal pigmentado
de vários estágios embrionários podia ser removido, cultivado in vitro por certos
períodos, e colocado novamente em embriões no estágio de placa neural. Tal
ectoderma mostrou o mesmo padrão de competência, apesar de ter permanecido
durante parte de seu desenvolvimento em uma placa de Petri. Parece, portanto,
que o ectoderma adquire a competência de responder a sinais indutores da placa
neural anterior nos estágios precoces da gástrula intermediária, e que durante a
gástrula tardia, a placa neural anterior induz um viés na formação do cristalino
nesse tecido. Esse viés pode ser demonstrado transplantando-se o tecido para
outras regiões da cabeça e tornando-o cristalino (enquanto o ectoderma dos está-
gios anteriores não pode fazê-lo).
DETERMINAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DO CRISTALINO. A determinação do cris-

talino pode ser mostrada isolando-se ectoderma e cultivando-o separado do embrião.
No momento do fechamento do tubo neural, o ectoderma das regiões laterais do
(A) FONTE DE ATIVIDADE PRECOCE INDUTIVA DE CRISTALINO Figura 17.13

Indutor Resposta do
Determinação precoce da capacidade formado-
Operação ra do cristalino do ectoderma de Xenopus. (A)
putativo cristalino
A fonte do sinal formador do cristalino foi acha-
da ser a placa neural anterior. O ectoderma
presuntivo do cristalino foi cultivado com ou
sem endoderma lateral/mesoderma, ou com a
Endomesoderma placa neural anterior (os dois principais tecidos
lateral
a ele adjacentes). O ectoderma somente for-
mou proteínas do cristalino quando cultivado
com a placa neural. (B) O período no qual as
Cultura células da placa neural anterior podiam induzir
competência no ectoderma foi determinado
transplantando ectoderma presuntivo de
gástrulas de doadores de estágio diferente para
a região formadora do cristalino da nêurula.
Placa Somente o ectoderma de embriões em gástrula
neural intermediária foi competente para responder aos
sinais. (Segundo Grainger, 1992.)
Cultura
(B) DETERMINAÇÃO DO PERÍODO COMPETENTE DO CRISTALINO

Estágio Operação Resposta
do cristalino
Gástrula
precoce
Gástrula
intermediária
Gástrula
tardia
cérebro anterior irá dar origem à pequenos cristalinos, mesmo sob essas condições. O
cálice óptico não contatou ainda esse tecido, mostrando que não é crítico para a
indução do cristalino em Xenopus. Porém, ele exerce uma função em capacitar o fenótipo
completo do cristalino para ser expresso. Os cristalinos que se formam na ausência da
vesícula óptica são em geral muito rudimentares. Não é conhecido se a influência da
vesícula óptica é diretamente positiva, promovendo a diferenciação do placódio do
cristalino para um cristalino totalmente diferenciado, ou se tal influência se dá remo-
vendo um inibidor da diferenciação do cristalino. Foi proposto (von Woellwarth, 1961;
Henry e Grainger, 1987) que as células da crista neural impedem a diferenciação do
cristalino e que o contato com a vesícula óptica serve como escudo do placódio do
cristalino, frente a esses sinais inibidores.
O fator de transcrição Pax6 participa de várias maneiras nos processos de determi-

nação e diferenciação do tecido ocular. Mutantes homozigotos Pax6 de humanos,
camundongos, ratos e moscas não têm olhos. O ectoderma do embrião de ratos defi-
cientes em Pax6 é incapaz de tornar-se cristalino, mesmo quando cultivado com
vesículas ópticas de embriões de tipo selvagem. O ectoderma da cabeça não foi deter-
minado por sinais anteriores da placa neural ou do mesoderma (Fujiwara et al., 1994).
Pax6 também é crítico para a expressão das cristalinas cristalino. Não somente são
vistos sítios ligantes de Pax6 nas regiões reguladoras de vários genes do cristalino,
mas a expressão específica do cristalino dessas proteínas depende da expressão de
Pax6 (Cvekl et al., 1995; Richardson et al., 1995).
O cristalino está situado entre as câmaras anterior e vítrea do olho, e acredita-
se que sua diferenciação (discutida no Capítulo 7) seja mediada por fatores de
crescimento emanando dessas duas câmaras. A câmara anterior parece concentrar
uma proteína mitogênica (cuja identidade permanece desconhecida) que é especí-
fica para causar mitose e inibir a diferenciação no epitélio formador do cristalino.
Essa proteína é tida como proveniente dos capilares sangüíneos para a câmara
anterior. Na câmara vítrea, FGF1 e 2 estimulam o alongamento e a diferenciação das
células do cristalino e bloqueiam a atividade mitogênica do fator de crescimento
da câmara anterior (Hyatt e Beebe, 1993; Schulz et al., 1993). O resultado é o
alongamento daquelas células do cristalino na superfície dorsal do placódio do
cristalino, e a continuada proliferação de células no lado ventral do placódio do
cristalino (Figura 17.14).
Formação da Córnea
Após ter invaginado, o placódio do cristalino fica coberto por duas camadas
de células do ectoderma adjacente. Agora, o cristalino em desenvolvimento pode
atuar como um indutor. O ectoderma destinado a se tornar córnea, provavelmente
já havia sido determinado durante um estágio anterior do desenvolvimento (Meier,
1977). Agora, a diferenciação da córnea ocorre sob influência do cristalino. O
ectoderma sobrejacente torna-se colunar e se enche de grânulos secretores. Es-
ses grânulos migram para a base das células e secretam um estroma primário con-
tendo cerca de 20 camadas de colágeno dos tipos I e II (veja Figura 17.14). As
células endoteliais vizinhas migram para essa região (no estroma primário) e
secretam ácido hialurônico para essa matriz. O ácido hialurônico faz com que a
matriz se expanda e se torne um bom substrato para a migração de duas ondas de
células mesenquimatosas derivadas da crista neural. Ao penetrar a matriz, a se-
gunda onda dessas células aí permanece, secretando colágeno do tipo I e
hialuronidase. Essa causa o encolhimento do estroma. Sob a influência da tiroxina
da glândula tireóide em desenvolvimento, esse estroma secundário é desidratado,
e a matriz rica em colágeno dos tecidos epitelial e mesênquima, transforma-se na
córnea transparente (veja Hay, 1980; Bard, 1990).
Podemos ver, assim, que “simples” interações indutivas são na realidade dramas
bem coordenados, nos quais os atores têm que vir ao palco e falar seus trechos no
momento e posição corretos. Por adquirir nova informação, elas podem também trans-
mitir informações para outros usarem. Tendo isso em mente, nós podemos agora
passar a estudar alguns dos princípios sobre a indução secundária, obtidos de outros
órgãos em desenvolvimento.
Formação de órgãos parenquimatosos

As interações epitélio-mesênquima são também vistas na formação de órgãos forma-
dores de dutos, como o rim, fígado, pulmão, glândula mamária e pâncreas. Na forma-
ção desses órgãos, notamos a indução recíproca do mesênquima atuando sobre o
epitélio e vice-versa.
Cristalino Figura 17.14

Desenvolvimento corneano e do cristalino. O
Borda do cálice óptico induz a determinação final do cris-
cálice óptico talino. Proteínas mitogênicas (setas pretas) na
câmara anterior mantêm uma linha de células
Mesênquima Cálice óptico induz a formação do
Vítreo em proliferação na superfície ventral do crista-
da cabeça cristalino
lino, enquanto fatores de crescimento fibroblás-
Câmara anterior
tico (setas coloridas) estimulam a diferencia-
Epitélio ção do epitélio dorsal do cristalino. Sob a influ-
Fatores de crescimento das câmaras ência indutiva do cristalino, o epitélio corneano
anterior e vítrea fazem com que as se diferencia e secreta estroma primário con-
células dorsais se diferenciem e as sistindo em camadas de colágeno; células
células ventrais se proliferem endoteliais então secretam ácido hialurônico para
essa região, permitindo a entrada de células
Mesênquima Câmara vítrea mesenquimatosas da crista neural. Em segui-
da, a hialuronidase (secretada pelo mesênqui-
ma ou pelo endotélio) digere o ácido hialurônico,
Endotélio levando o estroma primário a se encolher. (Se-
Epitélio
corneano gundo Hay e Revel, 1969; Hyatt e Beebe, 1993.)
Mesênquima
O cristalino induz o ectoderma
sobrejacente em epitélio colunar e
secretor
Estroma
primário
Mesênquima
Grânulos induzidos secretam estroma

primário contendo colágeno
Endotélio Estroma
primário
Células endoteliais entram e secre-
tam ácido hialurônico, levando o
estroma a engrossar; células me-
Cristalino Mesênquima
senquimatosas entram
Epitélio
Estroma secundário Secreções das células mesenquimato-

sas levam o estroma a encolher; sob
Endotélio a influência de tiroxina o estroma
Cristalino irá finalmente tornar-se córnea
Morfogênese do Rim de Mamífero
A PROGRESSÃO DOS TÚBULOS RENAIS. Como o olho, o rim mamífero é uma

estrutura extraordinariamente intrincada. Sua unidade funcional, o nefro, contém mais
de 10.000 células de no mínimo 12 tipos diferentes, cada tipo localizado em um espaço
particular em relação aos outros ao longo do nefro. O desenvolvimento do rim mamí-
fero progride através de três estágios. No início do desenvolvimento (dia 22 em huma-
nos, dia 8 em camundongos), o duto pronéfrico surge no mesoderma intermediário
imediatamente ventral aos somitos anteriores. As células desse duto migram
caudalmente, e a região anterior do duto induz o mesênquima adjacente a formar os
túbulos pronéfricos do rim (Figura 17.15 A). Embora os túbulos pronéfricos formam
rins funcionais em peixes e em larvas de anfíbios, eles são considerados inativos em
amniotas mamíferos. Em mamíferos, os túbulos pronéfricos e a porção anterior do duto
pronéfrico degeneram, mas as porções mais caudais do duto persistem tornando-se o
(A) (B) (C) (D)
Túbulos
mesonéfricos
Prônefros
Duto néfrico
Gônada
Cordão Gônada
nefrogênico
Mesonefros
Mesonefros
Duto néfrico
(Wolffiano)
Mesênquima
Cordão nefrogênico Mesênquima
metanefrogênico
metanefrogênico
Ureter
Cloaca Broto uretérico
Duto néfrico
Figura 17.15
Esquema geral do desenvolvimento do rim ver-
tebrado. (A) Os túbulos originais, constituin-
do o rim pronéfrico, são induzidos a partir do componente central do sistema excretor através de todo seu desenvolvimento
mesênquima nefrogênico pelo duto pronéfrico (Toivonen, 1945; Saxén, 1987). Esse duto remanescente é freqüentemente referido
migrando caudalmente. (B) À medida que o como duto néfrico ou Wolffiano.
prônefro de degenera, formam-se os túbulos
À medida que os túbulos pronéfricos degeneram, a porção mediana do duto
mesonéfricos. (C) O rim mamífero final, o
metanefro, é induzido pelo broto uretérico. (D) néfrico inicia um novo conjunto de túbulos renais no mesênquima adjacente.
Seção de um rim de camundongo mostrando a Esse conjunto de túbulos constitui o mesonefro, ou rim mesonéfrico. No ser
iniciação do rim mesonéfrico (abaixo) enquan- humano, começando ao redor do dia 25, formam-se cerca de 30 túbulos
to o mesonefro ainda está aparente. O tecido do mesonéfricos. Porém, à medida que mais túbulos são induzidos caudalmente, os
duto está corado com um anticorpo fluorescen- túbulos mesonéfricos anteriores começam a regredir (embora em camundongos,
te para citoqueratina encontrada no duto meso- os túbulos anteriores permanecem, ao passo que os posteriores regridem; Figu-
néfrico e seus derivados. ( A-C segundo Saxén, ra 17.15B). Em fêmeas de mamíferos essa regressão é completa. Porém, como
1987; D cortesia de S. Vainio.) discutiremos no Capítulo 20, alguns desses túbulos mesonéfricos persistem em
machos para se transformar em tubos carreadores de espermatozóide (vasos
deferentes e dutos deferentes) dos testículos.
O rim permanente dos aminotas, o metanefro, é gerado por alguns dos mesmos
componentes dos tipos anteriores transitórios do rim, e acredita-se ser originado
através de uma complexa interação entre componentes mesenquimatosos e epiteliais
do mesoderma intermediário. Nos dois primeiros passos, o mesênquima
metanefrogênico se forma em regiões localizadas posteriormente do mesoderma
intermediário, e induz a formação de um ramo de cada um dos dutos néfricos
pareados. Esses tubos epiteliais são chamados de brotos uretéricos. Esses brotos
finalmente se separam do duto néfrico para tornarem-se os ureteres que levam a
urina para a bexiga. Quando os brotos uretéricos emergem do duto néfrico, entram
no mesênquima metanefrogênico. No terceiro e quarto passos, os brotos uretéricos
induzem esse tecido mesenquimatoso a se condensar ao redor dos brotos e se
diferenciar nos nefros do rim dos mamíferos. O quinto passo da iniciação renal
ocorre quando esse tecido formador do nefro induz a ramificação adicional do
broto uretérico (Figura 15C,D).
Dutos
coletores
Mesênquima
Metanefrogênico
Ureter Ureter
Broto
uretérico
Túbulos
Renais
Túbulo distal
Mesênquima Túbulo
Proximal
Broto Corpo com Cápsula de

Uretérico forma de S Bowman do Células
glomérulo endoteliais
Figura 17.16
Indução recíproca no desenvolvimento do rim
dos mamíferos. À medida que o broto
uretérico penetra no mesênquima metanefro-
INDUÇÃO RECÍPROCA DURANTE O DESENVOLVIMENTO RENAL. Esses dois
gênico, esse o induz a se ramificar. Nas extre-
tecidos mesodérmicos, o broto uretérico e o mesênquima metanefrogênico interagem midades dos ramos, o epitélio induz o mesên-
e induzem um ao outro reciprocamente (Figura 17.16). O mesênquima metanefrogênico quima a se agregar e cavitar para formar os
leva o broto uretérico a se alongar e se ramificar. Na ponta dessas ramificações, o broto túbulos renais. A formação de nefro a partir
uretérico induz as células mesenquimatosas frouxas a formarem um agregado epitelial. das células mesenquimatosas é mostrada na
Cada agregado de cerca de 20 células prolifera-se e se diferencia na intrincada estrutu- inserção. Após se agregar nos ramos, as célu-
ra do nefro renal. Primeiro, cada nódulo se alonga tomando a forma de uma “vírgula”, las mesenquimatosas formam um nódulo
formando em seguida o característico tubo em forma de S. Logo em seguida à forma- epitelial que se estende em um tubo em forma
ção do tubo em forma de S, as células desse epitélio começam a se diferenciar em tipos de S, e se funde com o epitélio do broto
uretérico. (Inserção segundo Romanoff, 1960.)
regionais de células específicas, como as células da cápsula, os podócitos e as células
dos tubos renais distal e proximal. Nesse período, desenvolve-se uma conexão entre o
broto uretérico e o tubo recém-formado que permite a passagem de material de um para
o outro. Os tubos recém-formados derivados do mesênquima formam os nefros
secretores do rim funcional, e o broto uretérico ramificado dá origem aos dutos coleto-
res renais e ao ureter, que drena a urina do rim.
Clifford Grobstein (1955, 1956) documentou essa indução recíproca, in vitro. Ele
separou o broto uretérico do mesênquima e cultivou-os individualmente ou em con-
junto. Na ausência do mesênquima, os brotos uretéricos não se ramificam. Na ausên-
cia do broto uretérico, o mesênquima logo morre. Quando eles são colocados juntos,
porém, o broto uretérico cresce e se ramifica, e túbulos se formam através do
mesênquima (Figura 17.17). Embora certos outros tecidos (em especial o tubo neural)
permitam ao mesênquima metanefrogênico formar túbulos renais, o broto uretérico
somente se ramifica sob instruções do mesênquima metanefrogênico. Mesênquimas
que induzem ramificação em outros epitélios (tais como a glândula salivar) não induzi-
rão a ramificação do broto uretérico (Bishop-Calame, 1996).
Túbulos renais Dutos coletores
(A) (B)
Figura 17.17
Indução de rim estudada in vitro. (A) Um rudimento metanéfrico do
camundongo de 11 dias inclui tanto o broto uretérico como o me-
sênquima metanefrogênico. (B) Após o primeiro dia em cultura,
podem ser vistos túbulos nas extremidades dos ureteres em ramifi-
cação. (C) Os dutos coletores ramificados formados pelo broto
uretérico e os túbulos renais formados pelas condensações mesen- (C)
quimatosas nas extremidades desses brotos podem ser claramente
vistos após 8 dias de cultura. (A e B de Saxén e Sariola, 1987; C de
Grobstein, 1955; todas fotografias cortesia dos autores.)
Os primeiros nefros metanéfricos são, então, imediatamente ligados aos dutos

coletores. À medida que o ureter continua a crescer, esses nefros são levados em
direção externa para o mesênquima metanefrogênico (Figura 17.18A). Os terminais
dos brotos uretéricos, porém, conservam sua capacidade de induzir a formação dos
túbulos nesse mesênquima, e o resultado é a formação de arcadas tubulares (Figura
17.18B). À medida que o ramo uretérico migra através do mesênquima, são formados
novos nefros que se reúnem no mesmo duto coletor (Figura 18.18C; Osathanondh e
Potter, 1963).
Os Mecanismos da Organogênese Renal
Parece haver ao menos seis conjuntos de sinais operando na indução recíproca do

metanefro.
SINAL 1: FORMAÇÃO DO MESÊNQUIMA METANEFROGÊNICO. Uma coisa é

afirmar que o broto uretérico induz o mesênquima metanefrogênico a se tornar o
epitélio dos nefros. Outra é compreender como esse processo ocorre. Tal como o
desenvolvimento do cristalino pela vesícula óptica, considera-se que a indução do
mesênquima metanefrogênico pelo broto uretérico seja apenas a última etapa que
engatilha uma cascata de eventos no mesênquima competente. Somente o mesênqui-
ma metanefrogênico tem a capacidade de responder ao broto uretérico para formar
túbulos renais; se induzido por outros tecidos (tais como a glândula salivar ou o tubo
neural embrionários), o mesênquima metanefrogênico irá responder formando túbulos
renais e nenhuma outra estrutura (Saxén, 1970; Sariola et al., 1982). Assim, o mesênqui-
ma metanefrogênico não pode tornar-se qualquer outro tecido que senão os túbulos
renais. A competência para responder a indutores do broto uretérico é considerada ser
regulada por WT1, um fator de transcrição encontrado no mesênquima metanefrogê-
nico; e se esse mesênquima não tiver esse fator, as células não-induzidas morrem
(Kriedberg et al., 1993). A hibridização in situ mostra que Wt1 normalmente é primeiro
expressa no mesoderma intermediário antes da formação do rim, sendo depois expres-
sa no rim em desenvolvimento, gônadas e mesotélio (Pritchard-Jones et al., 1990; van
Heyningen et al., 1990; Armstrong et al., 1992). Embora esse mesênquima pareça ser
homogêneo, o mesênquima metanefrogênico, pode conter tanto tecido derivado do
Broto uretérico
(A)
Mesênquima
condensando Glomérulo
(B)
Ureter
(C)
mesoderma como algumas células originárias da crista neural (Le Douarin e Tiellet,
1974; Sariola, 1989; Sainio et al., 1994).
SINAL 2: FORMAÇÃO DO BROTO URETÉRICO. O segundo sinal no desenvol-

vimento do rim é um conjunto de moléculas difusivas que causa o crescimento de
dois brotos uretéricos dos dutos néfricos. Pesquisas recentes mostraram que o
fator neurotrófico derivado da glia (GDNF), é um componente crítico desse sinal. O
GDNF é sintetizado no mesênquima metanefrogênico, e camundongos cujos genes
gdnf foram eliminados morrem logo após o nascimento em conseqüência da falta de
rins (Moore et al., 1996; Pichel et al., 1996; Sánchez et al., 1996). O receptor GDNF (a
proteína c-Ret) é sintetizado nos dutos Wolffianos e posteriormente se concentra Figura 17.18
nos brotos uretéricos em crescimento (Figura 17.19: Schuchardt et al., 1996; Trupp Representação esquemática do desenvolvi-
et al., 1996). Camundongos carentes de GDNF também morrem em conseqüência de mento do nefro humano. (A) Formação de
agênese renal. Outra proteína sintetizada pelo mesênquima metanefrogênico é o nefros precoces diretamente ligados ao epitélio
fator de crescimento hepático (HGF; fator de espalhamento); o receptor de HGF é do broto uretérico. (B) Formação de arcadas
produzido pelos brotos uretéricos. Anticorpos contra HGF bloqueiam o crescimento de nefros nas quais vários nefros são ligados
ao mesmo duto coletor. (C) O arranjo geral
expansivo dos brotos uretéricos em rudimentos renais em cultura (Santos et al.,
dos nefros humanos no nascimento. Os nefros
1994; Woolf et al., 1995). A síntese de GDNF e HGF pelo mesênquima é considerada mais profundos constituem uma arcada, en-
ser regulada pelo gene WT1. quanto os nefros mais próximos da superfície
Em outra mutação murina, o mutante Danforth short-tail, o broto uretérico é inici- estão diretamente conectados aos dutos cole-
ado mas não penetra no mesênquima metanefrogênico (Gluecksohn-Schoenheimer, tores do ureter. (Segundo Osathanondh e
1943). Aqui, também, o rim não se forma. A falta de crescimento dos brotos uretéricos Potter, 1963.)
tem sido correlacionada com a ausência da expressão Wnt11 nas extremidade do broto
uretérico. A expressão de Wnt11 é mantida por proteoglicanos produzidos pelo
mesênquima. Parece que uma vez que o broto entra na região mesenquimatosa, os
proteoglicanos mesenquimatosos estimulam seu contínuo crescimento mantendo a
expressão e secreção de Wnt11 (Davies et al., 1995; Kispert et al., 1996).
SINAL 3: PREVENÇÃO DA APOPTOSE MESÊNQUIMA. O terceiro sinal é envia-

do do broto uretérico ao mesênquima, e altera o destino das células mesenquimatosas.
Se deixadas não induzidas pelo broto uretérico, as células mesenquimatosas sofrem
apoptose (Koseki et al., 1992). Porém, se induzidas pelo broto uretérico, as células
Duto
Duto Wolffiano Wolffiano
Broto
uretérico
Broto
Duto uretérico
Wolffiano
(A) (B) (C)
Receptor
Ret Duto
Wolffiano
Broto
Mesênquima Receptor uretérico
metanefrogênico Ret
(D)
Figura 17.19
O crescimento do broto uretérico depende de mesenquimatosas são salvas do precipício da morte e são convertidas em células
GDNF (fator neurotrófico derivado da glia) e germinativas em proliferação (Bard e Ross, 1991; Bard et al., 1996). Os fatores
seu receptor. (A) O broto uretérico do rim de secretados do broto uretérico incluem o fator 2 de crescimento fibroblástico (FGF2)
um embrião murino do tipo selvagem de 11,5 e a proteína morfogenética 7 do osso (BMP7). O FGF2 tem três modos de ação,
dias cultivado durante 72 horas tem padrão de inibindo a apoptose, promovendo a condensação de células mesenquimatosas e
ramificação característico. (B) Em camundon- mantendo a síntese de WT1 (Perantoni et al., 1995). O BMP7 tem efeitos semelhan-
gos embrionários heterozigotos para os genes
tes, e na ausência de BMP7, o mesênquima do rim sofre apoptose (Figura 17.20;
codificando GNDF, o tamanho do broto
uretérico e o número e comprimento de seus
ramos está reduzido. (C) Em camundongos sem
ambas cópias dos genes gdnf, o broto uretérico
não se forma a partir do duto Wolffiano. (D) Rim
Os receptores para GDNF estão concentrados Glândula
na porção posterior do duto Wolffiano. O Supra-renal
GDNF secretado pelo mesênquima metanefro- Rim
gênico estimula o crescimento do broto uretérico
desse duto. Em estágios posteriores, o recep-
tor de GDNF é somente encontrado nas extre-
midades dos brotos uretéricos. Barras de esca-
la iguais a 100µm. (A-C de Pichel et al., 1996;
fotografias cortesia de J. G. Pichel e H. Sariola;
D segundo Schuchardt et al., 1995.)
Figura 17.20
Malformação renal em um embrião de camundongo deficiente em BMP7. No dia embrionário 19,
os rins mutantes são significativamente menores que aqueles dos embriões tipo selvagem. (de
Dudley et al., 1995; fotografia cortesia de E. J. Robinson.)
Figura 17.21
O proteoglicano syndecan da matriz extrace-
lular não é sintetizado ou secretado por célu-
las do mesênquima até após a indução. Essa
molécula provavelmente está envolvida na
estruturação do novo epitélio tubular, e dis-
tingue as células do túbulo, do mesênquima
remanescente. (A) Coloração imunológica de
syndecan mostra sua presença nas células
mesenquimatosas recém-induzidas (T) que es-
tão se tornando epiteliais. Alguma coloração
(U) também é vista no epitélio do broto
epitelial. (B) Coloração intensa de syndecan
é vista na região tubular em desenvolvimento
que irá se tornar o glomérulo renal (G). (de
Vainio et al., 1989, cortesia de L. Saxén.)
(A) (B)
Dudley et al., 1995; Luo et al., 1995). As células mesenquimatoses induzidas também
sintetizam receptores para o fator de crescimento epidérmico e o fator de crescimen-
to neural, e podem responder à essas proteínas com a proliferação.
SINAL 4: CONVERSÃO DE CÉLULAS MESENQUIMATOSAS EM EPITÉLIO. O

broto uretérico causa mudanças dramáticas na matriz extracelular das células do
mesênquima metanefrogênico. O mesênquima não-induzido secreta uma matriz extra-
celular consistindo predominantemente de fibronectina e colágenos dos tipos I e II.
Após a indução, essas proteínas desaparecem e são substituídas por uma lâmina
epitelial basal feita de laminina e colágeno do tipo IV. As alterações na matriz extrace-
lular parecem ser críticas para formação dos túbulos, pois o mesênquima induzido
secreta um receptor para laminina que permite sua participação na formação epitelial
(Ekblom et al., 1994). O citoesqueleto também muda de uma característica de células
mesenquimatosas para um típico de epitélio (Ekblom et al., 1983, Lehtonen et al., 1985).
Dessa maneira, as células mesenquimatosas frouxas são ligadas umas às outras como
um epitélio polarizado sobre uma lâmina basal.
Antes dessas mudanças o mesênquima metanefrogênico récem-induzido sinteti-
za duas proteínas adesivas, E-caderina e Syndecan. A Syndecan é um proteoglicano
primeiro notado ao redor das células mesenquimatosas envolvendo o broto uretérico
quando entra na região do mesênquima. Quando o broto inicia sua primeira ramifica-
ção, toda a região mesênquima ao redor do ramos se cora positivamente para
Syndecan (Figura 17.21). O mRNA de Syndecan está presente no mesênquima renal
não-induzido, mas não é traduzido em proteína a não ser que o mesênquima seja
induzido (Figura 17.22; Vainio et al., 1989a, 1992). Não só pode Syndecan regular a
condensação do mesênquima em um epitélio, como pode também promover a proli-
feração dessas células. Por marcação de células em proliferação com bromodeoxiu-
ridina (que é incorporada em DNA somente em células em divisão) e marcando as
células expressando Syndecan com anticorpos fluorescentes à essa proteína, Vainio
e colegas (1992) demonstraram uma estreita correlação entre as células em divisão e
aquelas expressando Syndecan.
Além disso, o fator de transcrição Pax2 é sintetizado no mesênquima induzido.*
Quando o RNA antisenso ao Pax2 previne a tradução do mRNA de Pax2 que é trans-
crito em resposta à indução, as células do mesênquima de rudimentos de rim em
cultura, deixam de se condensar (Rothenpieler e Dressler, 1993). [prox3.html]
* Pax2 tem vários papéis durante o desenvolvimento renal. Sua função mais crítica ocorre até
mesmo antes da conversão do mesênquima, pois parece que o Pax2 pode ser importante na
especificação do mesoderma intermediário. Em mutantes de Pax2 de camundongo não se forma o
sistema urogenital (Torres et al., 1995).
Figura 17.22
Expressão de syndecan em mesênqui-
mas renais induzidos e não-induzidos.
(A) Hibridização in situ localizando
mRNA de syndecan nos agregados
mesenquimatosas de um rim embrioná-
rio de camundongo de 15 dias. A vi-
sualização da auto-radiografia é feita por
iluminação de campo escuro. (B) Me-
sênquima renal isolado (M) induzido por
medula espinhal (SPC) mostra expres-
são intensa de syndecan após coloração
com anticorpos ao syndecan, fluores-
centes. O mesênquima não-induzido não
(A)
o faz. (C) A quantidade de syndecan
(marcado com enxofre radioativo) iso-
lada de um mesênquima induzido de rim
é dez vezes maior que aquela isolada de
um quantidade semelhante de mesênqui- Induzido
Syndecan isolado (contagem/min)

ma não-induzido. (Segundo Vainio et
al., 1992, cortesia de S. Vainio.)
Não-induzido
(B) (C)
Uma vez induzido e após ter começado a se condensar, o mesênquima começa a

secretar Wnt4, que atua de uma maneira autócrina para completar a transição de massa
do mesenquimatosas para o epitélio (Stark et al., 1994). A expressão de Wnt4 é detec-
tada nas células mesenquimais em condensação e nos agregados em forma de vírgula.
No agregado em forma de S, ele é encontrado na região na qual as células récem-
epitelizadas se fundem com as pontas do broto uretérico. Em camundongos sem os
genes Wnt4, o mesênquima permanece indiferenciado morfologicamente, não se for-
mando agregados pré-tubulares.
SINAL 5: CONVERSÃO DAS CÉLULAS AGREGADAS EM UM NEFRO. No

quinto estágio da formação do rim, o epitélio condensado é especificado em
diferentes tipos celulares do nefro; e os genes responsáveis pela especificação
celular estão ativados. Nos últimos anos foram encontrados três genes cujos
produtos podem ser importantes para essa especificação. O primeiro é o gene
para proteína gap da junção, Conexina 43. Essa proteína é vista no mesênquima
condensado e conecta as células do corpo em forma de S (Sainio et al., 1992). O
segundo gene é o Pax2, que está ativo no mesênquima condensado e é desliga-
do quando as células se diferenciam. Se ele permanecer ativo, os podócitos, os
glomérulos e as células tubulares proximais se formam de maneira anormal
(Dressler et al., 1993). O terceiro gene codifica o receptor de baixa afinidade do
fator de crescimento nervoso, NGFR. Esse fator está ausente no mesênquima
não condensado, mas se apresenta em abundância nas células condensadas que
posteriormente formam os nefros. Quando oligonucleótidos antisenso para o

NGFR foram adicionados a rudimentos renais em cultura, as células condensadas
deixaram de formar túbulos renais (Figura 17.23; Sariola et al., 1991). O sinal que
converte agregados em nefros não é conhecido.
SINAL 6: O CRESCIMENTO CONTÍNUO DO BROTO URETÉRICO E A DIFEREN-

CIAÇÃO DO NEFRO. Após as interações iniciais terem criado os primeiros agrega-
dos, as células do mesênquima metanefrogênico perto da margem renal começam a
proliferar para formar células germinativas. Essas células podem interagir com os ra-
mos do broto uretérico para formar novos nefros, ou podem produzir células do estroma.
Essas células migram para a parte central do rim e produzem fatores (ainda desconhe-
cidos) que (1) permitem o crescimento contínuo do broto uretérico e (2) estimulam a
diferenciação do nefro em túbulos renais convolutos, alça de Henle, glomérulos e
aparelho justaglomerular. O fator de transcrição BF2 é sintetizado nessas células
estromáticas, e quando é eliminado de embriões de camundongo, o rim resultante não
tem a árvore uretérica ramificada (ramifica somente três ou quatro vezes em lugar de
sete ou oito, resultando em uma redução de 8 a 16 vezes no número de ramos), e os
agregados não se diferenciam em nefros (Hatini et al., 1996). Assim, parece que os
fatores necessários para essas duas funções são sintetizados pelas células do estroma
e regulados pelo fator de transcrição BF2.
Existe também evidência que interações recíprocas entre o broto uretérico e o
mesênquima metanefrogênico podem ser críticas para a manutenção dessas células
estromáticas. A combinação de FGF2 e um meio condicionado de linhagens celulares
do broto uretérico do rato é capaz de induzir a completa diferenciação de nefros no
mesênquima metanefrogênico isolado. O FGF2 é necessário para induzir a agregação
de células mesenquimatosas, porém as substâncias secretadas para o meio de cultura
pelas células do broto uretérico são capazes de transformar esses agregados em nefros
(Karavonova et al., 1996). É provável que os fatores do broto uretérico (que permane-
cem não identificados) estimulam as células estromáticas a produzirem seus fatores
(que também permanecem não identificados), de modo que o agregado possa se dife-
renciar em nefro e assim as ramificações podem continuar a crescer. A identificação
desses fatores tornou-se um dos novos focos de importância para a biologia do
desenvolvimento (Bard, 1996).
(A) (B) (C)
Figura 17.23
Papel do receptor NGF de baixa afinidade na morfogênese do rim. (A) Hibridização in situ mostra a localização de
mRNA de NGFR nos mesênquimas condensados de um rim embrionário de rato de 18 dias. (B) Maior aumento do
padrão de ramificação do broto uretérico (corado com anticorpos para uma citoqueratina epitelial específica) em rim de
13 dias cultivado durante 5 dias, in vitro. (C) Broto uretérico de um rim igual aquele em (B) mas cultivado em presença
de oligonucleótidos antisenso ao mRNA de NGFR . (de Sariola et al., 1991, cortesia de H. Sariola.)
& Especulações
Diferenciação Coordenada e Morfogênese no Dente
D URANTE A MORFOGÊNESE de
qualquer órgão ocorrem numero-
sos diálogos entre os tecido em
interação. Nas interações epitélio-mesên-
fatores de transcrição, incluindo proteínas
contendo os homeodomínios Msx1 e Msx2.
A indução da diferenciação do mesênqui-
ma pode ser mimetizada colocando-se BMP4
das a sintetizar a proteína de membrana
syndecan e a proteína da matriz extracelu-
lar tenascina. Essas proteínas (que podem
se ligar uma à outra) aparecem na ocasião
quima, o mesênquima influencia o epitélio; em partículas de agarose e aplicando-as à em que o epitélio induz a agregação do
o tecido epitelial, uma vez modificado pelo massa mesenquimatosa (Vainio et al., 1993). mesênquima; Thesleff e colegas (1990)
mesêquima, pode secretar fatores que al- Assim, a BMP4 parece ser um sinal morfogê- propuseram que essas duas moléculas
teram o mesênquima. Tais interações con- nico crítico do epitélio para o mesênquima. podem interagir para efetivar essa con-
tinuam até que seja formado um órgão com Um evento crítico na análise do de- densação. Como no rim, a expressão de
células mesenquimatosas específicas do senvolvimento dental foi a descoberta que syndecan também se correlaciona com a
orgão e epitélio específico. A identificação o centro de sinalização para o desenvol- proliferação das células mesenquimatosas
das substâncias envolvidas nessas con- vimento dental é um obscuro grupo de agregadas, sugerindo que ela está regu-
versas inter-tissulares está sendo estuda- células epiteliais referidas como o nó do lando a divisão celular assim como a agre-
da em diversos laboratórios. Algumas das esmalte (Jernvall et al., 1994). Esse grupo gação (Vainio et al., 1991).
interações mais investigadas são aquelas de células, primeiro visto no começo do Depois de se agregarem, as células
que formam os dentes dos mamíferos. Aqui, estágio de hemisfério pigmentado, apare- mesenquimatosas começam a secretar
o epitélio da mandíbula se diferencia em ce como uma população de células em não FGF3, BMP3, BMP4, HGH e activina
ameloblastos, enquanto as células mesen- divisão, no centro das cúspides em cres- (Wilkinson et al., 1989, Thesleff e Sahlberg,
quimatosas derivadas da crista neural se tor- cimento (veja Figura 17.3). Além disso, a 1996). Esses sinais, presumivelmente, in-
nam os odontoblastos secretores da dentina. hibridização in situ mostrou que esse nó duzem a formação do nó de esmalte no
Em primeiro lugar, o epitélio faz com de esmalte é a fonte da secreção de Sonic epitélio. O nó em seguida secreta seu po-
que o mesênquima se agregue em locais hedgehog, FGF4, BMP7, BMP4 e de tente coquetel de fatores de crescimento
específicos. Nesse momento, o epitélio BMP2 (Koyoma et al., 1996; Vaahtokari et e diferenciação, os quais promovem o
possui o potencial de gerar estruturas al., 1996a). Sendo uma população que não crescimento e a diferenciação tanto do me-
dentais a partir de vários tipos de células se divide, secretando fatores de cresci- soderma como do epitélio. As células
mesenquimatosas (Mina e Kollar, 1987; mento capazes de serem recebidos tanto mesenquimatosas começam a se diferen-
Lumsden, 1988). Porém, esse potencial pelo epitélio como pelo mesênquima, o nó ciarem em odontoblastos, e a tenascina é
de formação do dente logo é transferido de esmalte é considerado dirigir a morfo- induzida para ser expressa em níveis mui-
para o mesênquima que se agrega abaixo gênese das cúspides do dente e ser críti- to mais elevados e nos mesmos locais que
dele. Essas células mesenquimatosas co no direcionamento das mudanças a fosfatase alcalina. Essas proteínas fo-
formam a papila dental e são agora capa- evolutivas na estrutura dentária nos ma- ram associadas com a diferenciação do
zes de induzir a morfogênese dental em míferos (Jernvall, 1995). osso e da cartilagem, e podem promover a
outros epitélios (Kollar e Baird, 1970). Um resumo de pesquisas recentes mineralização da matriz extracelular
Nesse estágio, o epitélio maxilar perdeu correlacionando indução e diferenciação (Mackie et al., 1987).
sua capacidade de instruir a formação do do mesênquima é mostrado na Figura Por último, à medida que emerge o
dente em outros mesênquimas. Assim, o 17.24. Como se pode ver, o mesênquima fenótipo do odontoblasto, são secreta-
“potencial odontogênico” passou do em um estágio é diferente daquele em ou- dos osteonectina e colágeno de tipo I
epitélio para o mesênquima. Na membra- tros. As células mesenquimatosas são pri- como componentes da matriz extracelu-
na basal que separa o epitélio do mesên- meiro induzidas (pela expressão epitelial lar. O nó de esmalte desaparece por
quima, o epitélio induz o mesênquima a de BMP4, BMP2, BMP7 e provavelmente apoptose (Vaahtokari et al., 1996b). Por
se transformar em odontoblastos, en- FGF8) a expressar um conjunto de fatores esse processo em etapas, as células da
quanto o mesênquima induz o epitélio a de transcrição que incluem Msx1 e Lef1. crista neural craniana da mandíbula po-
se transfornar em células ameloblásticas Se os genes para cada uma dessas prote- dem ser transformadas em odontoblastos
(Figura 17.24; Thesleff et al., 1989). ínas são eliminados, o camundongo em secretores de dentina. Essas interações
Esse deslocamento do potencial odon- desenvolvimento não tem dentes. No ser ocorrem durante períodos específicos do
togênico coincide com o deslocamento da humano, numa condição causada por uma desenvolvimento e são correlacionadas
síntese da proteína morfogenética 4 do osso mutação de MSX1, os pacientes têm fa- com a maturação do epitélio. Em condi-
(BMP4). Durante as fases mais precoces do lhas dentárias (Satokata e Maas, 1994; ções normais, dois fenômenos indepen-
desenvolvimento do dente, a BMP4 é sin- Kratochwil et al., 1996; Vastardis et al., dentes – morfogênese e diferenciação
tetizada no epitélio; e induz a diferenciação 1996). À medida que as células mesenqui- celular - são coordenados na formação
do mesênquima e estimula-o a expressar três matosas condensam-se, elas são induzidos órgãos.
Ectomesênquima Condensação Papila dental Formação da cúspide Odontoblastos
Epitélio
Mesênquima Nó de esmalte Pré-odontoblastos

Osteonectina
Nível de diferenciação
Colágeno tipo I
BMP2, 4, 7 Fosfatase alcalina,

Sonic hedgehog Tenascina
FGF4 do nó de receptor EGF
FGF3 esmalte metaloproteínas
BMP4, 3 BMP4 do
activina-β A mesênquima
do mesênquima
ao epitélio
BMP2, Syndecan, tenascina
4 FGF8 do TGF-β no mesênquima
epitélio ao msx1, 2
mesênquima
Iniciação Agregação Morfogênese Diferenciação terminal
Idade desenvolvimental
Figura 17.24
Diferenciação coordenada e morfogênese no dente do mamífero. À medida que progride o desen-
volvimento, o mesênquima da mandíbula derivado da crista neural sofre diferenciação gradual
interagindo com o epitélio mandibular (Segundo Thesleff et al., 1990; Thesleff e Sahlberg, 1996.)
Mecanismos de ramificação na formação

de órgãos parenquimatosos
A geração dos padrões de ramificação epitelial específica do órgão permanece uma área
largamente inexplorada. Estudos anteriores (para revisões, veja Bard, 1990; Mizuno e
Yasugi, 1990) revelaram três padrões principais pelos quais o mesênquima regula a
especificidade da ramificação. No rim, somente um tipo de mesênquima pode causar
ramificação (Saxén, 1987). Nas glândulas salivares e mamárias, o mesênquima especifica
o padrão de ramificação, mas a diferenciação do epitélio é determinada de modo autôno-
mo pelo epitélio (Lawson, 1974; Sakakura et al., 1976). Nos tubos epiteliais que formam
os tratos contendo diferentes regiões em ramificação (tais como os tratos respiratório,
digestivo e reprodutivo), os mesênquimas regionais especificam tanto o padrão de
ramificação como os tipos de proteína em cada região (Wessells, 1979; Cunha et al.,
1976a,b; Hilfer et al., 1985; Haffen et al., 1987). Por exemplo, na região do tubo endodérmico
que irá se tornar o fígado, o mRNA para a albumina (uma proteína específica do fígado)
é sintetizado na região hepática do epitélio, mesmo antes das células se agregarem para
formar o rudimento do fígado. Tudo que é necessário para a síntese do mRNA da albumina
é que o epitélio esteja em estreito contato com as células mesenquimatosas dessa área.
Tanto no fígado como no pâncreas, essas interações precoces com o mesênquima especí-
fico da região produzem um baixo nível de expressão gênica específica na região do tubo
endodérmico em proliferação (Rutter et al., 1964; Cascio e Zaret, 1991). Esse padrão inicial
será amplificado quando os órgãos formarem suas estruturas morfológicas.
A Matriz Extracelular como um Elemento Crítico na Ramificação
Os mecanismos para essa ramificação podem ter tanto os componentes gerais como
os específicos (Grobstein, 1967), e podem depender da interação entre as forças que
estão promovendo o crescimento celular e as forças que estão promovendo a coesão
intercelular. Os componente gerais são considerados envolver a degradação seletiva
da membrana epitelial basal nos locais da ramificação (Bernfield et al., 1984; Mizuno e
Yasugi, 1990).
Conforme visto no rim e em muitos outros órgãos, o mesênquima pode interagir
com um tubo epitelial levando-o a se ramificar. Isso ocorre quando os crescimentos
epiteliais são divididos por fendas, apresentando lóbulos de cada lado da fenda.
Esses lóbulos crescem criando ramos. A ramificação dos brotos epiteliais depende da
presença do mesênquima. Em alguns casos, tal como na interação do epitélio respira-
tório com mesênquimas diferentes, a interação é instrutiva. Na maioria dos casos,
porém, a interação é meramente permissiva. Os brotos são preparados para ramificar e
formar ácinos, mas necessitam do apoio do mesênquima. É hoje admitido que o
mesênquima promova a formação de fendas e ramificações cindindo o lóbulo e dige-
rindo seletivamente parte da lâmina basal do tecido epitelial.
O controle da formação de fendas parece ser, em parte, uma função das moléculas
de colágeno. Fibras de colágeno III são produzidas por células mesenquimatosas, mas
se acumulam somente dentro das fendas lobulares (Figura 17.25; Grobstein e Cohen,
1965; Nakanishi et al., 1988a). Além disso, a extensão da ramificação pode ser regulada
artificialmente pela preservação ou remoção das moléculas de colágeno (Nakanishi et
al., 1986a). A Figura 17.26 mostra a ramificação de um rudimento de 12 dias de uma
glândula submandibular sob condições que impedem a degradação das fibras de
colágeno (um inibidor de colagenase foi adicionado ao meio). Sem o colágeno, não se
vêem fendas, mas quando a colagenase endógena é incapaz de remover o colágeno
em excesso, aparecem fendas extranumerárias.
Células
mesenquimatosas
Célula
epitelial
Colágeno na
fenda entre
células epiteliais
Figura 17.25
Micrografia eletrônica de varredura da acu-
mulação de fibras de colágeno dentro da fen-
da precoce da glândula salivar de um em-
brião de camundongo de 12 dias. (de Naka-
nishi et al., 1986b, cortesia de Y. Nakanishi.)
1 hr 18 hr 25 hr Figura 17.26
Controle da formação da fenda epitelial pelo
colágeno do mesênquima. Rudimentos da glân-
dula salivar de um rato de 12 dias foram culti-
vados e observados em 1, 18 e 25 horas. (Li-
nha A) Desenvolvimento normal, mostrando
três principais lóbulos. (Linha B) Crescimento
do lóbulo mas sem ramificação quando a
colagenase exógena (5µg/ml) foi adicionada ao
meio. (Linha C) Ramos supranumerários quan-
do o inibidor de colagenase (5µg/ml) foi adici-
(A) Controle onado ao meio para suprimir a atividade da
colagenase endógena. (Segundo Nakanishi et
al., 1986a; cortesia de Y. Nakanishi.)
(B) Adição de colagenase
(C) Adição de inibidor de colagenase
O mecanismo pelo qual o colágeno inicia essa ramificação permanece inexplicado.

Nakanishi e colaboradores (1986b) propuseram que as células mesenquimatosas
alinham as fibras de colágeno por tração para formar cristas que cortam o epitélio
lobular formando fendas. Essas fendas ficam mais claramente definidas à medida
que mais células mesenquimatosas migratórias deformam o lóbulo por tracionamento
(Nakanishi et al., 1987). As fibras de colágeno podem também ser responsáveis pelo
desenvolvimento da fenda em ramos distintos. Bernfield e Banerjee (1982) propuse-
ram que o colágeno pode proteger a lâmina basal das células epiteliais contra a
hialuronidase secretada pelas células mesenquimatosas. Eles mostraram que essas
células realmente digerem o glicosaminoglicano (GAG) do lóbulo (Banerjee e Bernfield,
1979) e que os GAGs nas pontas são mais susceptíveis que aqueles nas fendas.
Quando GAGs de heparan sulfato são removidos de rudimentos de glândula salivar
em cultura, a ramificação cessa (Nakanishi et al., 1993). A degradação da lâmina basal
permitiria a expansão do ramo pelo aumento das mitoses estimuladas nessa área.
Nesse modelo, mostrado na Figura 17.27, o mesênquima promove o crescimento
epitelial, degrada o GAG, e deposita fibras de colágeno na fenda. O epitélio sintetiza
materiais da lâmina basal e estimula a síntese de colágeno do mesênquima. Isso
resulta na degradação diferencial da lâmina basal nas extremidades dos lobos, per-
mitindo assim às células em divisão do lobo formarem ramos. Aqui, a interação de
células mesenquimatosas com a matriz extracelular do epitélio irá determinar o pa-
drão de ramificação do órgão.
(A) Fenda estreita (B) Hialuronidase Degradação da matriz

Colágeno extracelular causada por
hialuronidase
Fibras de
colágeno
Mais
mitose
GAG
Células Células
mesenquimais epiteliais Células Células Colágeno
mesenquimais epiteliais
Figura 17.27
Um modelo para a formação e ramificação em
um rudimento de glândula salivar de camun-
O colágeno também é importante para a estabilização das ramificações formadas.
dongo. (A) Um sulco é produzido no lóbulo Quando se adiciona colagenase a rudimentos de glândula salivar após a ramificação,
pela contração de um feixe de fibras de coláge- o colágeno é removido e os ramos coalescem em um globo (Grobstein e Cohen, 1965;
no (mostrado aqui como uma estrutura torcida, Wessels e Cohen, 1968).
como corda) pela tração das células mesenqui-
matosas. Como mostrado na Figura 17.25, as Fatores Parácrinos Efetuando Padrões de Ramificação
fibras se estendem entre dois grupos de células
mesenquimatosas. (B) Alongamento dos dois Ainda não temos certeza sobre as identidades das moléculas secretadas pelo
lóbulos separados em ramos pode ocorrer, já
mesênquima que são responsáveis pela indução desses padrões de ramificação
que as GAGs nas extremidades dos lóbulos
são mais sensíveis à hialuronidase, pois eles
epitelial. Evidência recente implicou vários fatores parácrinos nesses eventos. O
não têm a proteção das fibras de colágeno. O primeiro candidato é o fator β1 de crescimento transformado (TGF−β1). Essa molé-
talo do lóbulo é estável, enquanto o aumento da cula é abundante em órgãos embrionários. Quando o TGF−β1 exógeno é adicionado
divisão nas extremidades (estimulado pelo a culturas de glândulas mamárias, ou de glândulas salivares embrionárias, pulmão,
mesênquima) empurra o lóbulo para a frente. ou rudimentos de rim, o fator previne o epitélio de se ramificar (Figura 17.28; Silberstein
(A de Nakanishi et al., 1986b; B segundo et al., 1990; Hardman et al., 1994; Serra et al., 1994; Ritvos et al., 1995). O TGF−β1 é
Wessells, 1977.) sabido promover a síntese de proteínas da matriz extracelular e de inibir as
metaloproteinases que podem digerir essas matrizes (Penttinen et al., 1988; Nakamura
et al., 1990). É possível que esse fator tenha um papel na estabilização dos ramos
após seus surgimentos.
Uma segunda molécula que pode ter importância na ramificação epitelial é a activina.
A activina é conhecida por sua importância na especificação do eixo esquerdo/direito
em pintos, e foi detectada em glândulas salivares, pâncreas e rins de embriões de
camundongos. Quando a activina é adicionada exogenamente ao rim, ou rudimentos
salivar ou pancreático do embrião de rato, a activina distorce severamente o padrão de
ramificação normal (Figura 17.29; Ritvos et al., 1995). As células epiteliais não estão
mortas e ainda são capazes de induzir as células mesenquimatosas a formarem nefros,
mas os ramos estão muito desorganizados. As semelhanças entre os rudimento da
glândula salivar tratada com colagenase e aqueles tratados com activina sugerem que
essa última possa desencadear a digestão de matriz extracelular no local de um novo
ramo, e que a sua adição exógena promove a destruição da matriz extracelular através
de todo o epitélio.
Vários fatores parácrinos adicionais parecem ser responsáveis pela indução da
ramificação do epitélio pulmonar. Uma forma de fator de crescimento derivado das
plaquetas pode induzir a ramificação pulmonar, e o RNA antisenso contra sua men-
sagem o inibe (Souza et al., 1995). Epitélio pulmonar em cultura também pode ser
Figura 17.28
O efeito do TGF-β1 na morfogênese do epitélio
renal. (A) Um rim de camundongo de 11 dias
cultivado por 4 dias no meio controle tem rami-
ficação normal. (B) Um rim de um camundon-
go de 11 dias cultivado em TGF-β1 só apre-
senta ramificação na periferia do mesênquima,
e os ramos formados são alongados. (Segundo
Ritvos et al., 1995.)
(A) (B)
estimulado a se ramificar expondo-o à anfiregulina, um fator parácrino semelhante ao

fator de crescimento epidérmico. Anticorpos contra anfiregulina irão inibir a ramifica-
ção nessas culturas (Schugar et al., 1996). O mesênquima do pulmão do embrião do
camundongo secreta FGF7, enquanto o epitélio pulmonar sintetiza o receptor FGF7.
Oligonucleótidos antisenso para FGF7 ou seu receptor bloqueiam a ramificação epitelial
em rudimentos de pulmão em cultura, assim como o fazem as mutações de perda-de-
função desse receptor* (Peters et al., 1994; Post et al., 1996). Além da secreção de
anfiregulina e FGF7 pelo mesênquima, a Sonic hedgehog parece ser secretada pelos
terminais distais dos brotos pulmonares (Bellusci et al., 1996).
Indução ao nível de uma única célula

A indução embrionária ocorre quando interações entre células indutoras e
responsivas trazem mudanças na trajetória desenvolvimental da célula responsiva
(Jacobson e Sater, 1988). Sem a indução, a célula responsiva se tornaria um tipo de
* Em uma notável coincidência, a formação do sistema traqueal de Drosophila também depen-

de de FGF (Glazer e Shilo, 1991; Samakoulis et al., 1996). Os pulmões e as traquéias dos vertebrados
são novidades evolucionárias que não têm semelhanças anatômicas ou embrionárias com as traquéi-
as dos insetos.
Figura 17.29
Os efeitos da activina na morfogênese do epitélio
da glândula salivar. Rudimentos da glândula
salivar embrionária foram cultivados por 4 dias
em meio controle (A), e em meio contendo
activina 7.5 nM (B). Após 4 dias, os órgãos
foram fixados e corados para citoqueratina
(A) (B) epitelial. (de Ritvos et al., 1995.)
célula; com a indução, torna-se um outro. Nossas discussões sobre indução usual-
mente ocuparam-se de tecidos e não de células. Porém, a indução também pode
ocorrer ao nível da única célula. Os primeiros exemplos desse fenômeno vieram de
estudos com o sistema imune. Aqui, a recepção de antígeno (substâncias estranhas)
pela célula B deu-lhe a competência de responder a fatores parácrinos e justácrinos
sintetizados pelas células T auxiliares. Há um diálogo recíproco entre as células B e
as células T pelo qual ambas se diferenciam e se proliferam na presença de antígeno
estranho (Clark e Ledbetter, 1994; Essen et al., 1995). Na verdade, a AIDS é uma
doença de indução, na qual a célula T auxiliar foi destruída e não pode induzir a
diferenciação de células B e macrófagos.* [prox4.html]
Pesquisas recentes sobre o desenvolvimento de Drosophila e Caenorhabditis
mostraram que a indução realmente ocorre no nível célula-para-célula. Alguns dos
exemplos melhor estudados envolvem a formação dos fotorreceptores da retina do
olho da Drosophila. A retina consiste de cerca de 800 unidades chamadas omatídios
(Figura 17.30). Cada omatídio é composto de 20 células organizadas em um padrão
preciso. O olho desenvolve-se na camada epitelial plana do disco imaginal do olho
da larva. Não há células diretamente acima ou abaixo dessa camada, de modo que as
interações são limitadas às células vizinhas em duas dimensões. A diferenciação das
células epiteliais arranjadas de maneira aleatória nos fotorreceptores da retina e seu
tecido do cristalino ao redor ocorre durante o último (terceiro) estágio larval. Uma
Figura 17.30
Microfotografia eletrônica de varredura de um reentrância se forma na margem posterior do disco imaginal, e esse sulco
olho composto de Drosophila. Cada faceta é morfogenético começa a trafegar para frente em direção ao anterior do epitélio (Fi-
um único omatídio. Uma cerda sensorial se gura 17.31). O movimento do sulco depende das proteínas do conjunto marcador,
projeta de cada omatídio. (Cortesia de T. Hedgehog e Decapentaplegic. Hedgehog é expresso por células imediatamente pos-
Venkatesh.) teriores ao sulco (i.e., aquelas que acabaram de se diferenciar) e induz a expressão da
proteína decapentaplegic dentro do sulco (Heberlein et al., 1993; Ma et al., 1993). À
medida que as células da retina começam a se diferenciar atrás do sulco, elas secretam
a proteína Hedgehog, que empurra o sulco anteriormente (Brown et al., 1995). Quan-
do o sulco passa através de uma região de células, essas começam a se diferenciar
em uma ordem específica. A primeira célula a se desenvolver é o fotorreceptor cen-
tral (R8). (Ainda não é sabido como o sulco instruí certas células a se tornarem
fotorreceptores R8, mas é possível que as proteínas DPP e Hedgehog na região do
sulco induzam a determinação de R8). A célula R8 é considerada induzir a célula
anterior e a célula posterior a ela (em relação ao sulco), para se tornarem os fotorre-
ceptores R2 e R5, respectivamente. Os fotorreceptores R2 e R5 são funcionalmente
equivalentes, sendo o sinal de R8 provavelmente o mesmo para ambas (Tomlinson e
Ready, 1987). Sinais dessas células induzem mais quatro células adjacentes a torna-
rem-se os fotorreceptores R3, R4, e depois R1 e R6. Em último lugar aparece o
fotorreceptor R7. As outras células ao redor desses fotorreceptores tornam-se célu-
las do cristalino. A determinação do cristalino é a condição de revelia (“default”) se
as células não forem induzidas. [prox5.html]
Uma série de mutações foram encontradas bloquear alguns dos passos dessa
cascata indutora. A mutação rough (ro), por exemplo, bloqueia a indução dos fotorre-
ceptores R3 e R4. A mutação sevenless (sev) e a mutação bride of sevenless (boss)
pode, cada uma, prevenir as células R7 de se diferenciarem. (Essas células tornam-se
então células do cristalino). A análise dessas mutações mostrou que elas estão envol-
vidas no processo indutivo. O gene sevenless é requerido na própria célula R7. Se
embriões mosaico são produzidos de modo que algumas das células do disco ocular
sejam heterozigotas (normais) e algumas homozigotas para a mutação sevenless, o
fotorreceptor R7 é visto desenvolver-se somente se o precursor R7 tem o alelo sevenless
* Em seres humanos, essas células T são chamadas células T auxiliares / indutoras, um nome que
reconhece seu papel no desenvolvimento. A glicoproteína CD4 normalmente está envolvida na
mediação celular da adesão não-específica entre a célula T auxiliar/indutora e os linfócitos B (Doyle
e Strominger, 1987).
Figura 17.31
Diferenciação de fotorreceptores no disco
imaginal do olho da larva tardia. O sulco
morfogenético (seta) atravessa o disco do
posterior (esquerda) ao anterior (direita).
Atrás do sulco, as células fotorreceptoras se
diferenciam em uma seqüência definida (mos-
trada abaixo). A primeira célula fotorreceptora
a se diferenciar é a R8, que parece induzir a
diferenciação de R2 e R5; a cascata de indução
continua até que o fotorreceptor R7 tenha se
diferenciado. (Segundo Tomlinson, 1988,
fotografia cortesia de T. Venkatesh.)
Porção antenal
do disco
Diferenciação mais Diferenciação precoce

tardia (posterior ao (entrando no sulco
sulco morfogenético) morfogenético)
tipo selvagem (Basler e Hafen, 1989; Bowtell et al., 1989). Anticorpos para essa prote-
ína encontram-na na membrana celular, e a seqüência do gene sevenless sugere que ela
é uma proteína transmembrana com um sítio tirosina quinase em seu domínio
citoplasmático (Banerjee et al., 1987; Hafen et al., 1987). Isso é consistente com a
suposição da proteína ser um receptor para algum sinal.
Esse sinal para o precursor R7 diferenciar-se no fotorreceptor R7, provavelmente
vem diretamente de uma proteína codificada pelo alelo tipo selvagem de bride of
sevenless (boss). Moscas homozigotas para a mutação boss não têm os fotorrecep-
tores R7. Estudos com genes de mosaico onde algumas das células do disco imaginal
são normais e algumas das células são homozigotas para mutação boss mostram que
o gene boss tipo selvagem não é necessário na célula precursora R7. Ao contrário, o
fotorreceptor R7 somente se diferencia se o gene boss tipo selvagem é expresso na
célula R8. Assim, o gene bride of sevenless está codificando alguma proteína cuja
existência na célula R8 é necessária para a diferenciação da célula R7.* O sinal
produzido pela proteína Boss provavelmente trabalha por contato celular. Genes
* Todos os precursores de fotorreceptores sintetizam a proteína Sev, e o sinal Boss dado pelo
fotorreceptor R8 é provavelmente dado e recebido por todas as células circunjacentes. O que,
então, impede as células R1-R6 de também se tornarem células R7? O agente restritivo é prova-
velmente o produto do gene seven-up (sup). Em mutante deficientes em sup, os precursores R1,
R3, R4 e R6 todos desenvolvem o fenótipo R7. O gene sup codifica um fator de transcrição da
família receptora de esteróides (Mlodzik et al., 1990). Isso, porém, não é toda a história. Prova-
velmente existe um caminho paralelo, pelo qual o receptor Sevenless também ativa a proteína
Corkscrew. Corkscrew ativa a proteína Daughter-of-sevenless (dos). A proteína Dos facilita a
ativação de Ras (Herbst et al., 1996).
boss tipo selvagem numa célula R8 em um omatídio não irão corrigir a deficiência de
alelo boss mutante nos omatídios adjacentes, e o domínio extracelular da proteína
Boss é suficiente para ativar a tirosina quinase sevenless em uma célula vizinha
(Reinke e Zipursky, 1988; Hart et al., 1993). Um resumo das induções célula-para-
célula conhecidas na retina de Drosophila (Figura 17.32) mostra que células indivi-
duais são capazes de induzir outras células individuais a criar o arranjo preciso de
células em tecidos particulares.
Figura 17.32 Indução Vulvar no Nematóide Caenorhabditis elegans
Vulvar
Sumário de genes conhecidos por estarem en-
volvidos na indução dos fotorreceptores de
Drosophila. Para que o desenvolvimento con- A vulva de Caenorhabditis elegans é um caso onde um sinal indutor pode gerar
tinue para além da diferenciação dos fotorre- uma variedade de tipos celulares. Esse órgão se forma durante o estágio larval de
ceptores R8, R2 e R5, o gene rough (ro) deve seis células do blasto chamadas células precursoras vulvares (VPCs). A célula que
estar presente tanto nas células R2 como nas conecta a gônada sobrejacente à células precursoras vulvares é chamada célula
R5. Para a diferenciação do fotorreceptor R7, o âncora. Ela secreta a proteína LIN-3, um parente do fator de crescimento epidérmico
gene sevenless (sev) deve estar ativo na célula (Hill e Sternberg, 1992). Se a célula âncora é destruída (ou se o gene lin-3 é mutado),
precursora R7, enquanto o gene bride of as VPCs não formam uma vulva; elas tornam-se parte da hipoderme (pele) (Kimble,
sevenless (boss) deve estar ativo no fotorre- 1981). As seis células precursoras vulvares sob influência da célula âncora formam
ceptor R8. (Segundo Rubin, 1989.)
um grupo de equivalência. Cada membro desse grupo é competente para ser induzi-
do pela célula âncora e pode assumir um de três destinos, dependendo de sua
proximidade à essa célula (Figura 17.33). A célula diretamente abaixo da célula ânco-
ra se divide para formar as células vulvares centrais. As duas células flanqueando a
célula central se dividem para tornarem-se as células vulvares laterais, enquanto as
três células mais distantes da célula âncora geram as células hipoblásticas. Se a
célula âncora é destruída, todas as seis células do grupo de equivalência dividem-se
uma vez e contribuem para o tecido hipodérmico. Se as três células centrais forem
destruídas, as três células externas, que normalmente formam células hipodérmicas,
geram células vulvares em seu lugar. A proteína LIN-3 é recebida pela tirosina quinase
do receptor LET-23 nas VPCs, e o sinal é transferido para o núcleo através da traje-
tória Ras-MAP quinase (veja Capítulo 3).
(A) Gônada Célula âncora
VPCs (células precursoras vulvares)
(B) Membrana basal Célula âncora
Gônada
Cutícula
Figura 17.33
As VPCs e seus descendentes. (A) Localização da gônada, célula
âncora, e VPCs no segundo instar da larva de um C. elegans herma- (C)
frodita. (B,C) Relação da célula âncora com as seis VPCs e suas
linhagens subseqüentes. As primeiras linhagens resultam em células
vulvares centrais; as segundas constituem as células vulvares laterais;
as terceiras geram as células hipodérmicas. O esquema da vulva é
mostrado no quarto instar da larva, os círculos representando as posi-
ções do núcleo. (Segundo Katz e Sternberg, 1996.)
Há três mecanismos pelos quais tais induções podem ocorrer (Katz e Stern-
berg, 1996):
1. A hipótese do sinal graduado. Aqui, a VPC mais próxima da célula âncora

recebe as mais altas concentrações de proteína LIN-3 e gera as células vulvares
centrais. As duas VPCs adjacentes recebem uma baixa quantidade de LIN-3 e
se tornam as células vulvares laterais. As VPCs mais distantes da célula âncora
não recebem LIN-3 suficiente, e se tornam hipoderme (Katz et al., 1995).
2. O modelo da indução seqüencial. Aqui, a proteína LIN-3 trabalha somente
sobre a célula imediatamente abaixo a ela. Essa célula irá gerar a linhagem
vulvar central. Irá também sinalizar lateralmente para as duas células adjacen-
tes e instruí-las para gerar linhagens vulvares laterais. Essas células não irão
instruir as células periféricas de VPCs de fazer algo; por isso, essas tornam-se
hipoderme (Koga e Oshima, 1995; Simske e Kim, 1995).
3. O modelo da não-equivalência. Aqui, as VPCs podem substituir uma a outra,
mas não são idênticas. Elas têm os seus vieses e podem responder até a baixas
concentrações da proteína LIN-3. Porém, os vieses fazem com que a célula
abaixo da célula âncora gere a linhagem vulvar central (Sternberg, 1989;
Sternberg e Horvitz, 1989).
Interessante, existe evidência que todos os três modelos funcionam durante o

desenvolvimento normal (Kenyon, 1995; Katz e Sternberg, 1996). Provavelmente há
um sinal graduado de LIN-3 da célula âncora, que reforça os vieses das VPCs já
existentes. Além disso, uma vez que a VPC abaixo da célula âncora fica determinada a
formar a linhagem vulvar central, ela sinaliza as células a ela adjacentes proibindo-as
de também formar células vulvares centrais. Essa inibição lateral das células precur-
soras vulvares “secundárias” pelas VPC “primária” é conseguida através das proteí-
nas LIN-12 (Figura 17.34; Sternberg, 1988). Se todos esses sistemas estiverem operan-
do durante o desenvolvimento normal, conforme nota Kenyon (1995), “então em con-
junto elas poderiam produzir as tão-perfeitas pequenas vulvas pelas quais C. elegans
é tão famoso.”
LET-3
Sinal ativa genes Vulval
Sinal Sinal
ativa ativa
lin-12 lin-12
Vul ligado Vul ligado Vol ligado Figura 17.34

lin-12 ligado lin-12 ligado Modelo para determinação de linhagens de
células vulvares em C. elegans. O sinal LIN-
3 da célula âncora promove a determinação da
célula P6.p gerar a linhagem vulvar central.
Doses menores de LIN-3 fazem com que as
células P5.p e P7.p formem as linhagens
vulvares laterais. A célula P6.p (linhagem cen-
tral) também secreta um sinal de curto alcance
que induz as células vizinhas a ativarem a pro-
teína LIN-12. Isso também previne as células
P5.p e P7.p de gerarem a linhagem primária
Hipoderme Vulva Hipoderme de células vulvares centrais.
& Especulações
Interações Célula-Célula e Possibilidade na

Determinação de Tipos Celulares
O DESENVOLVIMENTO da vulva Sinal Receptor um neuroblasto. O gene Notch de Droso-

em C. elegans mostra várias si- (A) phila também canaliza uma célula bipo-
tuações de induções ao nível tencial em uma de duas trajetórias alter-
celular. A primeira situação se refere à nativas. Logo após a gastrulação, uma
indução da célula âncora gonadal. A for- região de cerca de 1800 células ectodér-
mação da célula âncora é mediada pelo micas encontra-se ao longo da linha me-
gene lin-12, que codifica uma proteína (B) diana ventral do embrião de Drosophila.
receptora da superfície celular. Em herma- Essas células têm o potencial de formar o
froditas do tipo selvagem, duas células cordão nervoso ventral do inseto, e cerca
adjacentes, Z1.ppp e Z4.aaa, têm o poten- de um-quarto delas se tornam neuroblas-
cial de se tornarem célula âncora gonadal. tos, enquanto o resto se torna precurso-
(C)
Elas interagem de maneira a causar uma ras da hipoderme. As células que dão ori-
delas ser a célula âncora, enquanto a ou- gem aos neuroblastos estão intermistura-
tra se torna o precursor do tecido uterino. das com as células que são destinadas a
Em mutantes recessivos lin-12, ambas dar origem a precursores hipodérmicos.
células se tornam células âncora, enquanto (D) Assim, cada célula ectodérmica nas regiões
em mutantes dominantes, ambas se tor- formadoras de nervos do embrião da mos-
nam precursores uterinos (Greenwald et ca pode dar origem ou a células hipodér-
al., 1983). Estudos usando mosaicos ge- micas ou a células precursoras neurais
néticos e ablações celulares mostraram Célula Âncora Precursor (Hartenstein e Campos-Ortega, 1984), Na
uterino ventral
que essa decisão é feita no segundo está- ausência de transcrição do gene Notch
gio larval e que o gene lin-12 somente Figura 17.35 no embrião, as células se desenvolvem
Modelo para a geração de dois tipos de células
precisa funcionar na célula destinada a se (célula âncora e precursor uterino ventral) de em precursores neurais em lugar de uma
tornar a célula precursora uterina. A duas células equivalentes (Z1.ppp e Z4.aaa). (A) mistura de células precursoras neurais e
presuntiva célula âncora não o necessita. As células começam como equivalentes, com hipodérmicas (Figura 17.36; Artavanis-
Seydoux e Greenwald (1989) especulam quantidades flutuantes de sinal (seta) e receptor Tsakonis et al., 1983; Lehmann et al., 1983).
que essas duas células originalmente sin- (seta invertida). O gene lag-2 é considerado co- Esses embriões morrem, com um grande
dificar o sinal; o gene lin-12 é considerado codi-
tetizam o sinal para a diferenciação uterina excesso de células neurais, às custas da
ficar o receptor. A recepção do sinal diminui a
(a proteína LAG-2) e o receptor para essa produção de LAG-2 e aumenta a de LIN-12. hipoderme ventral e da cabeça (Poulson,
molécula (a proteína LIN-12) (Figura 17.35; (B) Um evento estocástico (aleatório) causa uma 1937; Hoppe e Greenspan, 1986). O gene
Wilkinson et al., 1994). Durante um certo célula a produzir mais substância sinalizadora Notch foi clonado (Kidd et al., 1983;
período no desenvolvimento larval, a cé- que outra em certo período crítico. Isso estimula Yedvobnick et al., 1985) e encontrado ser
lula que por acaso estiver secretando mais mais atividade de LIN-12 na célula vizinha. (C) transcrito durante a metade precoce da
Essa diferença é ampliada, já que a célula com
desse sinal de diferenciação faz com que mais LIN-12 não produz tanto sinal. (D) Final- embriogênese (e mais tarde no estágio
sua vizinha pare de produzir a molécula mente, uma célula envia o sinal, e outra o recebe. pupal precoce). Tanto a proteína Notch
sinalizadora e aumente a produção da pro- A célula sinalizadora torna-se a célula âncora; a como a LIN-12 compartilham notáveis
teína LIN-12. A célula secretando o sinal célula receptora torna-se o precursor uterino ven- homologias seqüenciais entre si. Ambas
se torna a célula âncora gonadal, enquan- tral. (Segundo Greenwald e Rubin, 1992.) são proteínas transmembrana que podem
to a célula recebendo o sinal através de atuar como receptores de sinais de célu-
sua proteína LIN-12 se torna a célula pre- a diferença inicial entre elas é criada pelo las adjacentes (Yochem et al., 1988).
cursora uterina ventral. Assim, as duas acaso. Segundo, essas diferenças iniciais Heitzler e Simpson (1991) propuseram
células são consideradas determinar uma são reforçadas por retroalimentação. Tal que a proteína Notch, tal como a LIN-12, fun-
a outra antes de seus respectivos even- determinação também é vista na determi- ciona como um receptor para sinais interce-
tos de diferenciação. nação de qual das células epidérmicas, lulares envolvendo a distinção entre células
A decisão célula âncora/precursora originalmente equivalentes, do embrião do equivalentes. Além disso, elas provêem evi-
uterina ventral ilustra dois aspectos im- inseto geram os neurônios do sistema dência que outra proteína transmembrana,
portantes da determinação de duas célu- nervoso periférico. Aqui, a escolha é en- produto do gene delta (cuja ausência cria
las originalmente equivalentes. Primeiro, tre tornar-se uma pele (hipodérmica) ou um fenótipo muito semelhante aquele das
Figura 17.36
Representação do efeito da mutação Notch. Em embriões tipo selvagem, as
células ectodérmicas neurogênicas geram tanto neuroblastos como células de
pele (hipodérmicas). Em embriões deficientes em Notch, porém, todo o ecto-
derma neurogênico gera neuroblastos. A proporção de neuroblastos para
células hipodérmicas difere entre as regiões do embrião.
Neuro-
Tipo selvagem
blasto
Dorsal
Hipo-
derme
Células
ectodérmicas
neurogênicas
Ventral
Mutante
notch
deficiências Notch) é o ligante de Notch.
Mosaicos genéticos mostram que enquan-
to Notch é requerido por células que de-
vem se tornar epiderme, o gene delta é ne-
cessário nas células que induzem o
fenótipo epidérmico.
Greenwald e Rubin (1992) propuseram
principalmente pelo número aleatório de bém é determinada pela posição aleató-
um modelo baseado na hipótese LIN-12
receptores hormonais nas células folicu- ria da célula durante a compactação. Tais
para explicar o espaçamento dos neuroblas-
lares. De maneira semelhante, a decisão fatores aleatórios podem ocasionar inte-
tos nos agregados pró-neurais de precur-
sobre se uma célula tornar-se-á ou não rações que são amplificadas, distinguin-
sores epidérmicos e neurais (Figura 17.37).
parte do embrião ou parte do trofoblasto do, finalmente, entre dois tipos celulares
Inicialmente, todas as células têm potenci- – certamente uma decisão fundamental naquilo que havia sido uma população
ais e sinalizações iguais. Porém, quando
no desenvolvimento do mamífero – tam- celular homogênea.
uma das células, por acaso, produz mais
sinal (como o produto delta), ela ativa os
receptores em células adjacentes, reduzin- Figura 17.37
do o nível de sinalização. Como os níveis Modelo para explicar os padrões de espaçamento de neuroblastos entre as células ectodérmicas
de sinalização em células adjacentes são neurogênicas inicialmente equivalentes. Baseando-se no modelo para duas células mostrado na
Figura 17.36, cada célula tanto dá como recebe o mesmo sinal. (A) Um campo de células equivalen-
baixos, as vizinhas das células de baixa si-
tes, todas sinalizando e recebendo igualmente. (B) Um evento aleatório causa uma das células
nalização tenderão ser sinalizadores de alto (sombreamento mais intenso) a produzir mais sinalização. Suas células circunjacentes recebem essa
nível. Dessa maneira, um espaçamento de quantidade aumentada de sinal e reduzem seu próprio nível de sinalização (sombreado mais leve).
neuroblastos é produzido. (C) O restante do padrão está agora constrangido. Aquelas células que reprimiram sua própria
O papel do acaso na determinação sinalização (em resposta aos eventos em B), provavelmente não expressarão mais sinalização que
celular não é tão incomum como se pode suas células vizinhas. As células rodeadas por sinalizadores mais reprimidos terão maior probabi-
lidade de se tornar sinalizadoras. (D,E) Os destinos das células através do campo ficam especificadas
supor. Conforme discutiremos no Capítu- à medida que a amplificação dos sinais cria populações de sinalizadores rodeados por populações de
lo 22, o amadurecimento de somente um receptores. No caso dos genes neurogênicos, o sinal é considerado emanar da proteína Delta, o
óvulo por mês em humanos é determinado receptor sendo a proteína Notch. (Segundo Greenwald e Rubin, 1992.)
(A) (B) (C) (D) (E)
Indução é o processo iniciado quando uma célula ou grupo de células sinaliza

células ou grupos de células vizinhas para mudar seu destino desenvolvimental. Em
organismos tão complexos como os mamíferos, as interações indutivas recíprocas são
essenciais para coordenar as partes em um todo coerente.
LITERATURA CITADA
Armstrong, J. F., Pritchard-Jones, K., Bickmore, Bernfield, M., Banarjee, S. D., Koda, J. E. and uterus and vagina in mice. J. Exp. Zool. 196,
W. A., Hastie, N. D. and Bard, J. B. L. 1992. The Rapraegar, A. C. 1984. Remodeling of basement 361-370.
expression of the Wilms’ tumor gene, WT-1, in membrane as a mechanism of morphogenetic
Cvekl, A., Sax, C. M., Li, X., McDermott, J. B.
the developing mammalian embryo. Mech. Dev. tissue interaction. In R. L. Trelstad (ed.), The
and Piatigorsky, J. 1995. Pax-6 and lensspecific
40: 85-97. Role of Extracellular Matrix in Development.
transcription of the chicken d1-crystallin gene.
Alan R. Liss, New York, pp. 545-547.
Artavanis-Tsakonis, S., Muskavitch, M. A. T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4681-4685.
and Yedvobnick, Y. 1983. Molecular cloning of Birren, S. J. and Anderson, D. J. 1990. A vmyc-
Daniel, C. W. (1989). TGF-Jb1 induced inhibition
Notch, a locus affecting neurogenesis in Droso- immortalized sympathoadrenal progenitor cell
of mouse mammary ductal growth: developmen-
phila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA line in which neuronal differentiation is initiated
tal specificity and characterization. Dev. Biol.
80:1977-1981. by FGF but not NGF. Neuron 4: 189-201.
134: 20-30.
Artavanis-Tsakonas, S., Matsuno, K. and Fortini, M. Bishop-Calame, S. 1966. Étude experimentale
Davies, J. A., Lyon, M., Gallagher, J. and Garrod,
E. 1995. Notch signaling. Science 268: 225-232. de 1’organogenese du systéme urogénital de
D. R. 1995. Sulphated proteoglycan is required
1'embryon de poulet. Arch. Anat. Microsc.
Banerjee, S. and Bernfield, M. 1979. Develop- for collecting duct growth and branching but not
Morphol. Exp. 55: 215-309.
mentally regulated neutral hyaluronidase activity nephron formation during kidney development.
during epithelial mesenchymal interaction. J. Bitgood, M. J. and McMahon, A. P. 1995. Hed- Development. 121: 1507-1517.
Cell Biol. 83: 469a. gehog and BMP genes are coexpressed at many
Deuchar, E. M. 1975. Cellular Interactions in
diverse sites of cell-cell interaction in the mouse
Banerjee, U., Renfranz, P. J., Pollock, J. A. and Animal Development. Chapman and Hall,
embryo. Dev. Biol. 172: 126-158.
Benzer, S. 1987. Molecular characterization and London.
expression of sevenless, a gene involved in neu- Bitgood, M. J., Shen, L. and McMahon, A. P. 1996.
Doyle, C. and Strominger, J. L. 1987. Interaction
ronal pattern formation in the Drosophila eye. Sertoli cell signalling by desert hedgehog regulates
between CD4 and class II MHC molecules
Cell 49: 281-291. the male germline. Curr. Biol. 6: 298-304.
mediates cell adhesion. Nature 330: 256-259.
Bard, J. B. L. 1990. Morphogenesis: The Bowtell, D. D. L., Simon, M. A. and Rubin, G. M.
Dressler, G. R., Wilkinson, J. E., Rothenpieler,
Cellular and Molecular Processes of Develop- 1989. Ommatidia in the developing Drosophila
V. W., Patterson, L. T., Williams-Simons, L.
mental Anatomy. Cambridge University Press, eye require and can respond to sevenless for
and Westphal, H. 1993. Deregulation of Pax-2
Cambridge. only a restricted period. Cell 56: 931-936.
expression in transgenic mice generates severe
Bard, J. B. L. 1996. A new role for the stromal cells Brown, N. L., Sattler, C. A., Paddock, S. W. and kidney abnormalities. Nature 362: 65-67.
in kidney development. BioEssays 18: 705-707. Carroll, S. B. 1995. Hairy and Emc negatively
Dudley, A. T, Lyons, K. M. and Robertson, E. J.
regulate morphogenetic furrow progression in
Bard, J. B. L. and Ross, A. S. A. 1991. LIF, the 1995. A requirement for bone morphogenesis
the Drosophila eye. Cell 80: 879-887.
ES cell inhibition factor, reversibly blocks protein-7 during development of the mammali-
nephrogenesis in cultured mouse kidney Cascio, S. and Zaret, K. S. 1991. Hepatocyte an kidney and eye. Genes Dev. 9: 2795-2807.
rudiments. Development 113: 193-198. differentiation initiates during endodermal-
Edwards, D. R. and seven others. 1987.
mesenchymal interactions prior to liver
Bard, J. B. L., Davies, J. A., Karavanova, I., Transforming growth factor beta modulates the
formation. Development 113: 217-225.
Lehtonen, E., Sariola, H. and Vainio, S. 1996. expression of collagenase and metalloproteinase
Kidney development: the inductive interacti- Cattanco, E. and McKay, R. D. G. 1990. Proli- inhibitor. EMBO J. 6, 1899-1904.
ons. Semin. Cell Dev. Biol. 7: 195-202. feration and differentiation of neuronal stem
Ekblom, P., Thesleff, I., Saxén, L., Miettinen,
cells regulated by nerve growth factor. Nature
Basler, K. and Hafen, E. 1989. Ubiquitous ex- A. and Timpl, R. 1983. Transferrin as a fetal
347: 762-765.
pression of sevenless: Position-dependent growth factor: Acquisition of responsiveness
specification of cell fate. Science 243: 931-934. Clark, E. A. and Ledbetter, J. A. 1994. How B and related to embryonic induction. Proc. Natl. Acad.
T cells talk to each other. Nature 367: 425-428. Sci. USA 80: 2651-2655.
Basler, K. and Struhl, G. 1994. Compartment boun-
daries and the control of Drosophila limb pattern Cohen, M. M. Jr. 1982. The Child with Multiple Ekblom, P. and eight others. 1994. Role of
by hedgehog protein. Nature 368: 208-214. Birth Defects. Raven Press, NY. mesenchymal nidogen for epithelial morphoge-
nesis in vitro. Development 120: 2003-2014.
Bassols, A. and Massagué, J. 1988. Transforming Coulombre, J. L. and Coulombre, A. J. 1971.
growth factor b regulates the expression and Metaplastic induction of scales and feathers in Essen, D. van, Kikutani, H. and Gray, D. 1995.
structure of extracellular matrix chondroitin/ the corneal anterior epithelium of the chick CD40 ligandtransduced costimulation of T cells
dermatan sulfateproteoglycans. J. Biol. Chem. embryo. Dev. Biol. 25: 464-478. in the development of helper function. Nature
263,3039-3045. 378: 620-623.
Crossley, P. H., Martinez, S. and Martin, G. R.
Bellusci, S., Henderson, R., Winnier, G., Oikawa, 1996. Midbrain development induced by FGF8 Fan, C. M. and Tessier-Lavigne, M. 1994.
T. and Hogan, B. L. M. 1996. Evidence from in the chick embryo. Nature 380: 66-68. Patterning of mammalian somites by surface
normal expression and targeted misexpression ectoderm and notochord: Evidence for sclero-
Cunha, G. R. 1976a. Epithelialstromal interac-
that bone morphogenesis protein-4 (BMP-4) tome induction by a hedgehog homolog. Cell
tions in the development of the urogenital tract.
plays a role in mouse embryonic lung morpho- 79: 1175-1186.
Int. Rev. Cytol. 47,137-194.
genesis. Development 122: 1693-1702.
Fujiwara, M., Uchida, T., Osumi-Yamashita, N.
Cunha, G. R. 1976b. Stromal induction and
Bernfield, M. and Banerjee, S. D. 1982. The and Eto, K. 1994. Uchida rat (rSey): a new
specification of morphogenesis and cytodiffe-
turnover of basal lamina glycosaminoglycan mutant rat with craniofacial abnormalities
rentiation of the epithelia of the Müllerian ducts
correlates with epithelia morphogenesis. Dev. resembling those of the mouse Sey mutant. Di-
and urogenital sinus during development of the
Biol. 90: 291-305. fferentiation 57: 31-38.
Fukumachi, H. and Takayama, S. 1980. Epithe- Hafen, E., Basler, K., Edstrom, J. E. and Rubin, G. tion of lensforming potential in embryonic
lial-mesenchymal interaction in differentiation M. 1987. sevenless, a cell-specific homeotic gene ectoderm. Dev. Biol. 124: 200-214.
of duodenal epithelium of fetal rats in organ of Drosophila, encodes a putative transmembrane
Henry, J. J. and Grainger, R. M. 1990. Early tissue
culture. Experientia 36: 335-336. receptor with a tyrosine kinase domain. Science
interactions leading to embryonic lens formation
236: 55-63.
Glazer, L. and Shilo, B. Z. 1991. The Drosophila in Xenopus laevis. Dev. Biol. 141: 149-163.
FGF-R homolog is expressed in the embryonic Haffen, K., Kedinger, M. and Simonassmann, P.
Herbst, R., Carroll, P. M., Allard, J. D., Schilling,
tracheal system and appears to be required for directed 1987. Mesenchyme-dependent differentiation
J., Raabe, T. and Simon, M. A. Daughter of
tracheal cell extension. Genes Dev. 5: 697-705. of epithelial progenitor cells in the gut. J. Pediat.
sevenless is a substrate of the phosphotyrosine
Gastroent. 6: 15-23.
Gluecksohn-Schoenheimer, S. 1943. The phosphatase corkscrew and functions during
morphological manifestations of a dominant Hahn, H. and twenty others. 1996. Mutations sevenless signaling. Cell 85: 899-909.
mutation in mice affecting tail and urogenital of the human homolog of Drosophila patched
Hilfer, S. R., Rayner, R. M. and Brown, J. W.
system. Genetics 28: 341-348. in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.
1985. Mesenchymal control of branching pattern
Cell 85: 841-851.
Goustin, A. S. and nine others. 1985. Coexpressi- in the fetal mouse lung. Tissue Cell 17: 523-538.
on of the sis and myc proto-oncogenes in Hamburgh, M. 1970. Theories of Differentiati-
Hill, R. J. and Sternberg, P. W. 1992. The gene
developing human placenta suggests autocrine on. Elsevier, New York.
lin-3 encodes an inductive signal for vulval de-
control of trophoblast growth. Cell 41: 301-312.
Hardman, P., Landels, E., Woolf, A. S. and velopment in C. elegans. Nature 358: 470-476.
Graff, J. M, Bansal, A. and Melton, D. A. 1996. Spooner, B. S. 1994. TGF-b1 inhibits growth
Hogan, B. L. M. 1996. Bone morphogenesis pro-
Xenopus Mad proteins transduce distinct subsets and branching morphogenesis in embryonic
teins: multifunctional regulators of vertebnrate
of signals for the TGF-b superfamily. Cell 85: mouse submandibular and sublingual glands in
development. Genes Dev. 10: 1580-1594.
479-87. vitro. Devel. Growth Differ. 36: 567-577.
Holtzer, H. 1968. Induction of chondrogenesis:
Graham, A., Heyman, I. and Lumsden, A. 1993. Harrison, R.G. 1933. Some difficulties of the
A concept in terms of mechanisms. In R.
Evennumbered rhombomeres control the determination problem. Am. Nat. 67: 306-321.
Gleischmajer and R. E. Billingham (eds.),
apoptotic elimination of neural crest cells from
Hart, A. C., Krämer, H. and Zipursky, S. L. 1993. Epithelial-Mesenchymal Interactions. Williams
odd-numbered rhombomeres in the chick
Extracellular domain of the boss transmembrane & Wilkins, Baltimore, pp. 152-164.
hindbrain. Development 119: 233-245.
ligand acts as an antagonist of the the sev recep-
Hoodless, P. A., Haerry, T., Abdollah, S.,
Grainger, R. M. 1992. Embryonic lens induction: tor. Nature 361: 732-736.
Stapleton, M., O’Connor, M. B., Attisano, L.
Shedding light on vertebrate tissue determination.
Hartenstein, V. and Campos-Ortega, J. A. 1984. and Wrana, J. L. 1996. MADR1, a MAD-related
Trends Genet. 8: 349-355.
Early neurogenesis in wildtype Drosophila me- protein that functions in BMP2 signaling
Greenwald, I. and Rubin, G. M. 1992. Making a lanogaster. Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. 193: pathways. Cell 85: 489-500.
difference: The role of cell-cell interactions in 308-325.
Hoppe, P. E. and Greenspan, R. J. 1986. Local
establishing separate identities for equivalent
Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Scares, V. C. function of the Notch gene for embryonic
cells. Cell 68: 271-281.
and Lai, E. 1996. Essential role of stromal mor- ectodermal pathway choice in Drosophila. Cell
Greenwald, I., Sternberg, P. W. and Horvitz, H. phogenesis in kidney morphogenesis revealed by 46: 773-783.
R. 1983. The lin-12 locus specifies cell fates in targeted disruption of winged helix transcription
Hyatt, G. A. and Beebe, D. C. 1993. Regulation
Caenorhabditis elegans. Cell 34: 435-444. factor, BF-2. Genes Dev. 10: 1467-1478.
of lens cell growth and polarity by embryonic-
Grobstein, C. 1955. Induction interaction in the Hay, E. D. 1980. Development of the vertebrate specific growth factor and by inhibitors of lens
development of the mouse metanephros. J. Exp. cornea. Int. Rev. Cytol. 63: 263-322. cell proliferation and differentiation. Develop-
Zool. 130: 319-340. ment 117: 701-709.
Hay, E. D. and Revel, J. -P. 1969. Fine structure
Grobstein, C. 1956. Transfilter induction of of the developing avian cornea. In A. Wolsky Ignotz, R. A. and Massague, J. (1986).
tubules in mouse metanephrogenic mesenchyme. and P. S. Chen (eds.), Monographs in Develop- Transforming growth factor beta stimulates the
Exp. Cell Res. 10: 424-440. mental Biology. Karger, Basel. expression of fibronectin and collagen and their
incorporation into the extracellular matrix. J.
Grobstein, C. 1967. Mechanisms of organogene- Heberlein, U., Wolff, T. and Rubin, G. M. 1993.
Biol. Chem. 261, 4337-4345.
tic tissue interaction. Natl. Cancer Inst. Monogr. The TGF-b homolog dpp and the segment
26: 279-299. polarity gene hedgehog are required for Jacobson, A. G. 1966. Inductive processes in
propagation of a morphogenetic wave in the embryonic development. Science 152: 25-34.
Grobstein, C. and Cohen, J. 1965. Collagenase:
Drosophila retina. Cell 75: 913-926.
Effect on the morphogenesis of embryonic salivary Jacobson, A. G. and Sater, A. K. 1988. Features
epithelium in vitro. Science 150: 626-628. Hebert, J., Rosequist, T., Gotz, J. and Martin, G. of embryonic induction. Development 104:
1994. FGF-5 as regulator of hair growth cycle: 341-359.
Gumpel-Pinot, M., Yasugi, S. and Mizuno, T.
Evidence from targeted and spontaneous
1978. Differentiation d’épithéliums endodermi- Jernvall, J. 1995. Mammalian molar cusp
mutations. Cell 78: 1-20.
ques associaes au mésoderme splanchnique. patterns: Developmental mechanisms of
Comp. Rend. Acad. Sci. (Paris) 286: 117-120. Heemskerk, J. and DiNardo, S. 1994. Drosophi- diversity. Acta Zool. Fennica 198: 1-61.
la hedgehog acts as a morphogen in cellular
Gurdon, J. B., Harger, P., Mitchell, A. and Jernvall, J., Kettunen, P., Karavanova, I.,
patterning. Cell 76: 449-460.
Lemaire, P. 1994. Activin signalling and response Martin, L. B. and Theseleff,I. 1994. Evidence
to a morphogen gradient. Nature 371: 487-492. Heitzler, P. and Simpson, P. 1991. The choice for the role of the enamel knot as a control
of cell fate in the epidermis of Drosophila. Cell center in mammalian tooth cusp formation:
Gurdon, J. B., Mitchell, A. and Mahony, D. 1995.
64: 1083-1092. nondividing cells express growth stimulating Fgf-
Direct and continuous assessment by cells of
4 gene. Int. J. Dev. Biol. 38: 463-69.
their position in a morphogen gradient. Nature Henry, J. J. and Grainger, R. M. 1987. Inductive
376: 520-521. interactions in the spatial and temporal restric-
Johnson, R. L., Laufer, E., Riddle, R. D. and Tabin, Koyama, E. and ten others. 1996. Polarizing Liu, F., Hata, A., Baker, J. C., Doody, J., Cárcamo,
C. 1994. Ectopic expression of Sonic hedgehog activity, sonic hedgehog, and tooth develop- J., Harland, R. M. and Massagué, J. 1996. A
alters dorsal-ventral patterning of somites. Cell ment in embryonic and postnatal mouse. Dev. human Mad protein acting as a BMP-regulated
79: 1165-1173. Dyn. 206: 59-72. transcription factor. Nature 381: 620-623.
Johnson, R. L. and ten others. 1996. Human Kratochwil, K., Dull, M., Farinas, I., Galceran, Lumsden, A. G. S. 1988. Spatial organization of
homolog of patched, a candidate gene for the basal J. and Grosschedl, R. 1996. Lef1 expression is the epithelium and the role of neural crest cells
cell nevus syndrome. Science 272: 1668-1671. activated by BMP-4 and regulates inductive in- in the initiation of the mammalian tooth germ.
teractions in tooth and hair development. Genes Development 103 [Suppl.]: 155-169.
Jones, C. M., Armes, N. and Smith, J. C. 1996.
Dev. 10: 1382-1394.
Signalling by TGF-b family members: Shortrange Luo, G., Hofmann, C., Bronckers, A. L. J. J.,
effects of Xnr-2 and BMP4 contrast with the long Kreidberg, J. A., Sariola, H., Loring, J. M., Maeda, Sohocki, M., Bradley and Karsenty, G. 1995.
range effects of activin. Curr. Biol. 6: 1468-1475. M., Pelletier, J., Housman, D. and Jaenisch, R. BMP-7 is an inducer of nephrogenesis and is
1993. WT-1 is required for early kidney develop- also required for eye development and skeletal
Karavanova, I. D., Dove, L. F., Resau, J. H. and
ment. Cell 74: 679-691. patterning. Genes Dev. 9: 2808-2820.
Perantoni, A. O. 1996. Conditioned medium
from a rat ureteric bud cell line in combination Ku, M. and Melton, D. A. 1993. Xwnt-11, a Ma, C., Zhou, Y., Beachy, P. A. and Moses, K. 1993.
with bFGF induces complete differentiation of maternally expressed Xenopus wnt gene. Deve- The segment polarity gene hedgehog is required for
isolated metanephric mesenchyme. Develop- lopment 119: 1161-1173. progression of the morphogenetic furrow in the
ment. 122: 4159-4167. developing Drosophila retina. Cell 75: 927-938.
Lappi, D. A. 1995. Tumor targeting through
Katz, W. S. and Sternberg, P. W. 1996. Inter-cellular fibroblast growth factor receptors. Semin. Cancer Mackie, E. J., Thesleff, I. and Chiquet-
signalling in Caenorhabditis elegans vulval pattern Biol. 6: 279-288. Ehrismann, R. 1987. Tenascin is associated with
formation. Semin. Cell Dev. Biol. 7: 175-183. chondrogenic and osteogenic differentiation in
Lawson, K. A. 1974. Mesenchyme specificity in
vivo and promotes chondrogenesis in vivo. J.
Katz, W., Hill, R. J., Clandenin, T. R. and Stern- rodent salivary gland development: the response
Cell Biol. 105: 2569-2579.
berg, P. W. 1995. Different levels of the C. of salivary epithelium to lung mesenchyme in
elegans growth factor LIN-3 promote distinct vitro. J. Embryol. Exp. Morphol. 32: 469-493. McCormick, F. 1989. ras GTPase activating
vulval precursor fates. Cell 82: 297-307. protein: Signal transmitter and signal terminator.
Le Douarin, N. and Tiellet, M.-A. 1974. Expe-
Cell 56: 5-8.
Kenyon, C. 1995. A perfect vulva every time: rimental analysis of the migration and diffe-
gradients and signaling cascades in C. elegans. rentiation of neuroblasts of the autonomic ner- McMahon, A. P. and Bradley, A. 1990. The Wnt-
Cell 82: 171-174. vous system and of neuroectodermal derivatives, 1 (int-1) protooncogene is required for the de-
using a biological cell marking technique. Dev. velopment of a large region of the mouse brain.
Kidd, S., Lockett, T. J. and Young, M. W. 1983.
Biol. 41: 162-184. Cell 62: 1073-1085.
The Notch locus of Drosophila melanogaster.
Cell 34: 421-433. Lehmann, R., Jimenez, F., Dietrich, U. and Cam- Meier, S. 1977. Initiation of corneal differen-
pos-Ortega, J. A. 1983. On the phenotype and tiation prior to cornealens association. Cell
Kimble, J. 1981. Alterations in cell lineage
development of mutants of early neurogenesis Tissue Res. 184: 255-267.
following laser ablation of cells in the somatic
in Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Arch.
gonad of Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 87: Mencl, E. 1908. Neue Tatsachen zur Selbstdiffe-
Dev. Biol. 192: 62-74.
286-300. renzierung der Augenlinse. Wilhelm Roux Arch.
Lehtonen, E., Virtanen, I. and Saxén, L. 1985. Entwicklungsmech. Org. 25: 431-450.
King, H. D. 1905. Experimental studies on the
Reorganization of the intermediate cytoskeleton
eye of the frog embryo. Wilhelm Roux Arch. Mina, M. and Kollar, E. J. 1987. The induction
in induced mesenchyme cells is independent of
Entwicklungsmech. Org. 19: 85-107. of odontogenesis in nondental mesenchyme
tubule morphogenesis. Dev. Biol. 108: 481-90.
combined with early murine mandibular arch
Kingsley, D. M., Bland, A. E., Grubber, J. M.,
Letterio, J. J., Geiser, A. G., Kulkarni, A. B., epithelium. Arch. Oral Biol. 32: 123-127.
Marker, P. C., Russell, L. B., Copeland, N. G.
Roche, A. B., Sporn, N. S. and Roberts, A. B.
and Jenkins, N. A. 1994. The mouse short ear Mizuno, T. and Yasugi, S. 1990. Susceptibility
1994. Maternal rescue of TGF-b1-null mice.
skeletal morphogenesis locus is associated with of epithelia to directive influences of mesen-
Science 264: 1936-1938.
defects in a bone morpho-genesis protein of the chymes during organogenesis: Uncoupling of
TGF-b superfamily. Cell 71: 399-410. Levin, M., Johnson, R. L., Stern, C., Kuehn, M. morphogenesis and cytodifferentiation. Cell
and Tabin, C. 1995. A molecular pathway Differ. Devel. 31, 151-159.
Kispert, A., Vainio, S., Shen, L., Rowitch, D. R.
determining leftright asymmetry in chick em-
and McMahon, A. P. 1996. Proteoglycans are Mlodzik, M., Hiromi, Y., Weber, U., Goodman,
bryogenesis. Cell 82: 803-814.
required for maintenance of Wnt-11 expression C. S. and Rubin, G. M. 1990. The Drosophila
in the ureter tips. Development 122: 3627-3637. Lewis, W. 1904. Experimental studies on the seven-up gene, a member of the steroid recep-
development of the eye in amphibia. I. On the tor gene superfamily, controls photoreceptor
Koga, M. and Ohshima, Y. 1995. Mosaic analysis
origin of the lens, Rana palustris. Am. J. Anat. cell fates. Cell 60: 211-224.
of the let-23 gene function in vulval induction
3: 505-536.
of Caenorhabditis elegans. Development 121: Morales, T. I. and Roberts, A. B. 1988. Transfor-
2655-2666. Lewis, W. 1907. Experimental studies on the ming growth factor b regulates the metabolism of
development of the eye in amphibia. III. On the proteoglycans in bovine cartilage organ cultures.
Kollar, E. J. and Baird, G. 1970. Tissue interaction
origin and differentiation of the lens. Am. J. J. Biol. Chem. 263, 12828-12831.
in developing mouse tooth germs. II. The
Anat. 6: 473-509.
inductive role of the dental papilla. /. Embryol. Moore, M. W. and nine others. 1996. Renal and
Exp. Morphol. 24: 173-186. Liu, F., Ventura, F., Doody, J. and Maasague, J. neuronal abnormalities in mice lacking GDNF
1995. Human Type II receptor for bone Nature 382: 76-79.
Koseki, C., Herzlinger, D. and Al-Auqati, Q.
morphogenesis proteins (BMPs): Extension of
1992. Apoptosis in metanephric development. Muenke, M and Schell, U. 1995. Fibroblast
the twokinase receptor model to the BMPs. Mol.
J. Cell Biol. 119: 1327-1333. growth factor receptor mutations in human
Cell Biol. 15: 3479-3486.
skeletal disorders. Trends Genet. 11: 308-313.
Nakamura, T. Okuda, S., Miller, D., Ruoslahti, Targeted expression of a dominant negative FGF Rutter, W. J., Wessells, N. K. and Grobstein, C.
E. and Border, W. 1990. Transforming growth receptor blocks branching morphogenesis and 1964. Controls of specific synthesis in the
factorb (TGF-b) regulates production of epithelial differentiation of the mouse lung. developing pancreas. Natl. Cancer Inst. Monogr.
extracellular matrix (ECM) components by EMBO J. 13: 3296-3301. 13: 51-65.
glomerular epithelial cells. Kidney Int. 37, 221.
Pichel, J. G.and eleven others. 1996. Defects in Saha, M. S. 1991. Spemann seen through a lens.
Nakanishi, Y., Sugiura, F., Kishi, J.-I. and Hayakawa, enteric innervation and kidney development in In S. F. Gilbert (ed.), A Conceptual History of
T. 1986a. Collagenase inhibitor stimulates cleft mice lacking GDNF. Nature 382: 73-76. Modern Embryology. Plenum, New York, pp.
formation during early morphogenesis of mouse 91-108.
Placzek, M., Tessier-Lavigne, M., Yamada, T.,
salivary gland. Dev. Biol. 113: 201-206.
Jessell, T. and Dodd, J. 1990. Mesodermal control Saha, M. S., Spann, C. L. and Grainger, R. M.
Nakanishi, Y., Sugiura, F., Kishi, J.-I. and of neural cell identity: Floor plate induction by 1989. Embryonic lens induction: More than
Hayakawa, T. 1986b. Scanning electron micros- the notochord. Science 250: 985-988. meets the optic vesicle. Cell Differ. Dev. 28:
copic observations of mouse embryonic subman- 153-172.
Post, M., Souza, P., Liu, J., Tseu, I., Wang, J.,
dibular glands during initial branching: Preferen-
Kuliszewski, M. and Tanswell, A. K. 1996. Sainio, K., Nonclercq, D., Saarma, M., Palgi, J.,
tial localization of fibrillar structures at the
Keratinocyte growth factor and its receptor are Saxén, L. and Sariola, H. 1994. Neuronal
mesenchymal ridges participating in cleft for-
involved in regulating early lung branching. De- characteristics of embryonic renal stroma. Int.
mation. J. Embryol. Exp. Morphol. 96: 65-77.
velopment 122: 3107-3115. J. Dev. Biol. 38: 77-84.
Nakanishi, Y., Morita, T. and Nogawa, H. 1987.
Poulson, D. F. 1937. Chromosomal deficiencies Sainio, K. and seven others. 1992. Differential
Cell proliferation is not required for the initiation
and the embryonic development of Drosophila expression of gap junction mRNAs and proteins
of early cleft formation in mouse embryonic
melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 23: in the developing murine kidney and in
submandibular epithelium in vitro. Development
133-137. experimentally induced nephric mesenchymes.
99: 429-437.
Pritchard-Jones, K. and eleven others. 1990. The
Nakanishi, Y, Nogawa, H., Hashimoto, Y., Kishi,
candidate Wilms’ tumour gene is involved in Sakakura, T, Nishizuka, Y. and Dawe, C. J. 1976.
J.-I. and Hayakawa, T. 1988. Accumulation of
genitourinary development. Nature 346: 194-197. Mesenchyme-dependent morphogenesis and
collagen III at the cleft points of developing mouse
epithelium-specific cytodifferentiation in mouse
submandibular gland. Development 104: 51-59. Reilly, K. M. and Melton, D. A. 1996. Shortrange
mammary gland. Science 194, 1439-1441.
signaling by candidate morphogens of the TGF-
Nakanishi, Y, Uematsu, J., Takamatsu, H., Fukuda,
b family and evidence for a relay mechanism of Saksela, O., Moscatelli, D. and Rifkin, D. B.
Y. and Yoshida, K. 1993. Removal of heperan
induction. Cell 86: 743-754. 1987. The opposing effects of basic fibroblast
sulfate chains halted epithelial branching mor-
growth factor and transforming growth factor b
phogenesis of developing mouse submandibular Reinke, R. and Zipursky, A. L. 1988. Cell-cell
on the regulation of plasminogen activator
gland in vitro. Dev. Growth Differ. 35: 371-384. interaction in the Drosophila retina: The bride
activity in capillary endothelial cells. J. Cell Biol.
of sevenless gene is required in photoreceptor cell
Nieuwkoop, P. 1952. Activation and organization 105, 957-963.
R8 for R7 cell development. Cell 55: 321-330.
of the central nervous system in amphibians. J.
Samakoulis, C., Hacohen, N., Manning, G.,
Exp. Zool. 120: 1-108. Richardson, J., Cvekl, A and Wistow, G. 1995.
Sutherland, D. C., Guillemin, K. and Krasnow,
Pax-6 is essential for lensspecific expression of
Nohno, T. W. Kawakami, Y, Ohuchi, H., M. A. 1996. Development of the Drosophila
zcrystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4674-
Fujiwara, A., Yoshioka, H. and Noji, S. 1995. tracheal system occurs by a series of morpholo-
4680.
Involvement of the sonic hedgehog gene in gically distinct but genetically coupled branching
chick feather formation. Biochem. Biophys. Res. Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E. and Tabin, events. Development 122: 1395-1407.
Comm. 206: 33-39. C. 1993. Sonic hedgehog mediates the polarizing
Sánchez, M. P., Silos-Santiago, I., Frisén, J., He,
activity of the ZPA. Cell 75: 1401-1416.
Osathanondh, V. and Potter, E. 1963. Develop- B., Lira, S. A. and Barbacid, M. 1996. Renal
ment of human kidney as shown by microdis- Ritvos, O., Tuuri, T, Erämaa, M., Sainio, K., agenesis and the absence of enteric neurons in
section. III. Formation and interrelationships Hilden, K., Saxén, L. and Gilbert, S. R 1995. mice lacking GDNF. Nature 382: 70-73.
of collecting tubules and nephrons. Arch. Pathol. Activin disrupts epithelial branching morpho-
Santos, O. F. P., Baras, E. J. G., Yang, X.-M.,
76: 290-302. genesis in developing murine kidney, pancreas,
Matsumoto, K., Nakamura, T., Park, M. and
and salivary gland. Mech. Dev. 50: 229-245.
Padgett, R. W., Wozney, J. M. and Gelbart, W. Nigam, S. K. 1994. Involvement of hepatocyte
M. 1993. Human BMP sequences can confer Roberts, D. J., Johnson, R.L. Burke, A. C., Nel- growth factor in kidney development. Dev. Biol.
normal dorsalventral patterning in the Droso- son, C. E., Morgan, B. A. and Tabin, C. 1995. 163: 525-529.
phila embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: Sonic hedgehog is an endodermal signal inducing
Sariola, H., Ekblom, P. and Saxén, L. 1982.
2905-2909. Bmp-4 and Hox genes during induction and
Restricted developmental options of the
regionalization of the chick hindgut. Develop-
Penttinen, R. P., Kobayashi, S. and Bornstein, P. metanephric mesenchyme. In M. Burger and R.
ment 121: 3163-3174.
1988. Transforming growth factor-(3 increases Weber (eds.), Embryonic Development, Part B:
mRNA for matrix proteins in the presence and in Romanoff, A. L. 1960. The Avian Embryo. Cellular Aspects. Alan R. Liss, New York, pp.
the absence of the changes in mRNA stability. Macmillan, New York. 425-431.
Rothenpieler, U. W. and Dressier, G. R. 1993. Sariola, H., Holm-Sainio, K. and Henke-Fahle,
Perantoni, A. O., Dove, L. F. and Karavanova, Pax-2 is required for mesenchymeto-epithelium S. 1989. The effect of neuronal cells on kidney
I.1995. Basic fibroblast growth factor can mediate conversion during kidney development. Deve- differentiation. Int. J. Dev. Biol. 33: 149-155.
the early inductive events in renal development. lopment 119: 711-720.
Sariola, H. and seven others. 1991. Depen-
Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 4696-4700.
Rubin, G. M. 1989. Development of the Droso- dence of kidney morphogenesis on the ex-
Peters, K., .Werner, S., Liao, S., Wert, S., phila retina: Inductive events studied at single pression of nerve growth factor receptor.
Whitsett, J. A. and Williams, L. T. 1994. cell resolution. Cell 57: 519-520. Science 254: 571-573.
Satokata, I. and Maas, R. 1994. Msx1 deficient Souza, P., Kuliszewski, M., Wang, J., Tseu, I., Toivonen, S. 1995. Über die Entwicklung der
mice exhibit cleft palate and abnormalities of Tanswell, A. K. and Post, M. 1995. Vor und Uriniere biem Kaninchen. Ann. Acac.
craniofacial and tooth development. Nat. Genet. Sci. Fenn. ser. A 8: 1-27.
PDGF-AA and its receptor influence early lung
6: 348-355.
branching via an epithelial-mesenchymal Tomlinson, A. 1988. Cellular interactions in the
Saunders, J. W., Jr. 1980. Developmental Biolo- interaction. Development 121: 2559-2567. developing Drosophila eye. Development 104:
gy. Macmillan, New York. 183-193.
Spemann, H. 1901. Über Correlationen in der
Saunders, J. W., Jr., Cairns, J. M. and Gasseling, Entwicklung des Auges. Verh. Anat. Ges. 15 Vers. Tomlinson, A. and Ready, D. F. 1987. Cell fate
M. T. 1957. The role of the apical ectodermal Bonn. 61-79. in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 123:
ridge of ectoderm in the differentiation of the 264-275.
Spemann, H. 1938. Embryonic Development and
morphological structure of and inductive
Induction. Yale University Press, New Haven. Torres, M., Gomez-Pardo, E., Dressler, G. R.
specificity of limb parts of the chick. J. Morphol.
and Gruss, P. 1995. Pax2 controls multiple steps
101: 57-88. Spemann, H. and Schotté, O. 1932. Über
of urogenital development. Development 121:
xenoplatische Transplantation als Mittel zur
Saxén, L. 1970. Failure to demonstrate tubule 4057-4065.
Analyse der embryonalen Induction. Naturwis-
induction in heterologous mesenchyme. Dev.
senschaften 20: 463-467. Trupp, M. and twelve others. 1996. Functional
Biol. 23: 511-523.
receptor for GDNF encoded by the c-ret
Stark, K., Vainio, S., Vassileva, G. and McMahon,
Saxén, L. 1987. Organogenesis of the Kidney. protooncogene. Nature 381: 785-789.
A. P. 1994. Epithelial transformation of meta-
Cambridge University Press, Cambridge.
nehric mesenchyme in the developing kidney Vaahtokari, A., Aberg, T, Jernvall, J., Keränen,
Saxén, L. and Sariola, H. 1987. Early organoge- regulated by Wnt-4. Nature 372: 679-683. S. and Thesleff, I. 1996a. The enamel knot as a
nesis of the kidney. Pediat. Nephrol. 1: 385-392. signalling center in the developing mouse tooth.
Stern, H. M., Brown, A. M. C. and Hauschka, S.
Mech. Dev. 54: 39-43.
Schuchardt, A., D-Agati, V., Pachnis, V. and D. 1995. Myogenesis in paraxial mesoderm:
Constantini, F. 1996. Renal agenesis and preferential induction by dorsal neural tube and Vaahtokari, A., Aberg, T. and Thesleff, I. 1996b.
hypodysplasia in ret-k- mutant mice result from by cells expressing Wnt-1. Development 121: Apoptosis in the developing tooth: association
defects in ureteric bud development. Develop- 3675-3686. with an embryonic signaling center and
ment 122: 1919-1929. suppression by EGF and FGF-4. Development
Stern, M. J. and eight others. 1993. The human
122: 121-129.
Schugar, L., Johnson, G. R., Gilbride, K., Plowman, GRB2 and Drosophila drk genes can functionally
D. D. and Mandel, R. 1996. Amphiregulin in lung replace the Caenorhabditis elegans cell signalling Vainio, S., Lehtonen, E., Jalkanen, M., Bernfield,
branching morphogenesis: interaction with gene sem-5. Mol. Biol. Cell. 4: 1175-1188. M. and Saxén, L. 1989. Epithelial-mesenchymal
heparan sulfate proteoglycan modulates cell pro- interactions regulate the stagespecific expressi-
Sternberg, P. W. 1988. Lateral inhibition during
liferation. Development. 122: 1759-1767. on of a cell surface proteoglycan, syndecan, in
vulval induction in Caenorhabditis elegans.
the developing kidney. Dev. Biol. 134: 382-391.
Schulz, M. W., Chamberlain, C. G., de Longh, R. Nature 335: 551-554.
U. and McAvoy, J. W. 1993. Acidic and basic Vainio, S., Jalkanen, M., Vaahtokari, A., Sahlberg,
Sternberg, P. W. and Horvitz, H. R. 1989. The
FGF in ocular media and lens: Implications for C., Mali, M., Bernfield, M. and Thesleff, I. 1991.
combined action of two intercellular signalling
lens polarity and growth patterns. Development Expression of syndecan gene is induced early, is
pathways specifies three cell fates during vulval
118: 117-126. transient, and correlates with changes in
induction in C. elegans. Cell 58: 679-693.
mesenchymal proliferation during tooth
Serra, R., Pelton, R. W. and Moses, H. 1994
Storm, E. E., Huynh, T. V, Copeland, N. G., organogenesis. Dev. Biol. 147: 322-333.
TGFb1 inhibits branching morphogenesis and
Jenkins, N. A., Kingsely, D. M. and Lee, S. J.
N-myc expression in lung bud organ cultures. Vainio, S., Jalkanen, M., Bernfield, M. and Saxén,
1994. Limb alterations of brachyopodism mice
Development 120: 2153-2161. L. 1992. Transient expression of syndecan in
due to mutations in a new member of the TGF-
mesenchymal cell aggregates of the embryonic
Servetnick, M. and Grainger, R. M. 1991. Changes b superfamily. Nature 368: 639-643.
kidney. Dev. Biol. 152: 221-232.
in neural and lens competence in Xenopus
Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva,
ectoderm: Evidence for an autonomous develop- Vainio, S. Karavanova, I., Jowett, A. and Thesleff,
G., McMahon, J. A. and McMahon, A. P. 1994.
mental timer. Development 112: 177-188. I. 1993. Identification of BMP-4 as a signal
Wnt-3a regulates somite and tailbud formation
mediating secondary induction between epithe-
Seydoux, G. and Greenwald, I. 1989. Cell in the mouse embryo. Genes Dev. 8: 174-189.
lial and mesenchymal tissues during early tooth
autonomy of lin-12 function in a cell fate
Thesleff, I. and Sahlberg, C. 1996. Growth factors development. Cell 75: 45-58.
decision in C. elegans. Cell 57: 1237-1245.
as inductive signals regulating tooth morphoge-
van Heyningen, V. and eleven others. 1990. Role
Silberstein, G. B., Flanders, K. C., Roberts, A. B. nesis. Semin. Cell Dev. Biol. 7: 185-193.
for Wilms tumor gene in genital development?
and Daniel, C.W. 1992. Regulation of mammary
Thesleff, I., Vainio, S. and Jalkanen, M. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5383-5386.
morphogenesis: Evidence for extracellular matrix
Cell-matrix interaction in tooth development.
inhibition of ducted budding by transforming Vastardis, H., Karimbux, N., Guthua, S. W.,
Int J. Dev. Biol. 33: 91-97.
growth factor b-1. Dev. Biol. 152: 354-362. Seidman, J. G. and Seidman, C. E. 1996. A human
Thesleff, I., Vaahtokari, A. and Vainio, S. 1990. MSX1 homeodomain missense mutation causes
Silberstein, G. B., Strickland, P., Coleman, S. and
Molecular changes during determination and di- selective tooth agenesis. Nat. Genet. 13: 417-
Daniel, C. W. 1990. Epithelium-de-pendent
fferentiation of the dental mesenchyme cell 421.von Woellwarth, V. 1961. Die Rolle des
extracellular matrix synthesis in transforming
lineage. J. Biol. Bucalle 18: 179-188. neuralleistenmaterials und der Temperatur bei
growth factor-b1-growth-inhibited mouse
der Determination der Augenlinse. Embriologia
mammary gland. J. Cell Biol. 110: 2209-2219. Ting-Berreth, S. A. and Chuong, C.-M. 1996. 6: 219-242.
Local delivery of TGFb2 can substitute for
Simske, J. S. and Kim, S. K. 1995. Sequential
placode epithelium to induce mesenchymal Waddington, C. H. 1940. Organisers and Genes.
signaling during Caenorhabditis elegans vulval
condensation during skin morphogenesis. Dev. Cambridge University Press, Cambridge.
induction. Nature 375: 142-146.
Biol. 179: 347-359.
Wessells, N. K. 1970. Mammalian lung deve- Wilkinson, H. A., Fitzgerald, K. and Greenwald, Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T. and Jessell,
lopment: Interactions in formulation and mor- I. 1994. Reciprocal changes in expression of T. M. 1993. Control of cell pattern in the neural
phogenesis of tracheal buds. J. Exp. Zool. 175: the receptor lin-12 and its ligand lag-2 prior to tube: Motor neuron induction by diffusible
455-466. commitment in a C. elegans cell fate decision. factors from notochord and floor plate. Cell
Cell 79: 1187-1198. 73: 673-686.
Wessells, N. K. 1977. Tissue Interaction and
Development. Benjamin, Menlo Park, CA. Woolf, A. S. and eight others. 1995. Roles of Yedvobnick, B., Muskavitch, M. A. T., Wharton,
hepatocyte growth factor/scatter factor and the K. A., Halpern, M. E., Paul, E., Grimwade, B. G.
Wessells, N. K. and Cohen, J. H. 1968. Effects
Met receptor in the early development of the and Artavanis-Tsakonas, S. 1985. Molecular
of collagenase on developing epithelia in vitro:
metanephros. J. Cell Biol. 128: 171-184. genetics of Drosophila neurogenesis. Cold Spring
lung, ureteric bud and pancreas. Dev. Biol. 18:
Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 841-854.
294-309. Wrana, J. L., Overall, C. M. and Sodek, J. 1991.
Regulation of a secreted acidic protein rich in Yochem, J., Weston, K. and Greenwald, I. 1988.
Wilkie, A. O. M, Morriss-Kay, G. M., Jones, E.
cysteine (SPARC) in human fibroblasts by The Caenorhabditis elegans lin-12 gene encodes
Y. and Heath, J. K. 1995. Functions of fibroblast
transforming growth factor-b. Eur. J. Biochem. a transmembrane protein with overall similarity
growth factors and their receptors. Curr. Biol.
197: 519-528. to Drosophila Notch. Nature 335: 547-550.
5: 500-507.
Yamada, T, Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J.
Wilkinson, D. G., Bhatt, S. and McMahon, A. P.
and Jessell, T. M. 1991. Control of cell pattern
1989. Expression of the FGF-related protoon-
in the developing nervous system: Polarizing
cogene int-2 suggests multiple roles in fetal de-
activity of floor plate and notochord. Cell 64:
velopment. Development 105: 131-136.
635-647.
CAPÍTULO 18 Desenvolvimento do Membro de Tetrápode 701
Desenvolvimento do
membro de tetrápode 18
Meus braços são mais longos do que mi- Padronização no membro
nhas pernas.... Eu sou meu próprio escultor:
estou partindo do meu interior e me mode- PADRONIZAÇÃO é um processo pelo qual as células embrionárias formam arranjos de
lando com materiais vivos, molhados e tecidos diferenciados, espacialmente ordenados. A possibilidade de realização des-
maleáveis: qual outro artista teve à sua disse processo é uma das propriedades mais dramáticas do organismo em desenvolvi-
posição um desenho tão perfeito como esse à mento, provocando um senso de estupefação em cientistas e leigos. Como é que o
disposição de meus martelos e cinzéis: as embrião é capaz não só de produzir os diferentes tipos de células do corpo, mas
células migram para o local exato para cons-
também produzi-las de maneira a formar tecidos e órgãos funcionais? Uma coisa é
truir um braço: é a primeira vez que elas o
diferenciar os condrócitos e osteócitos que sintetizam a cartilagem e as matrizes dos
fizeram, nunca antes e nunca mais, enten-
ossos, respectivamente; outra coisa é produzir essas células em uma orientação
dem vocês “mercies benz” o que eu estou
dizendo? Eu nunca serei repetido. temporal e espacial gerando um osso funcional. E é ainda outra coisa produzir um
CARLOS FUENTES (1989) osso que é um úmero e não uma pelve ou um fêmur. A habilidade das células dos
membros em pressentir suas posições relativas e diferenciar-se de acordo com essas
O que pode ser mais curioso do que a mão de posições tem sido o tema de intensos debate e experimentação. Como é que as
um homem, formada para pegar, a de uma células que se diferenciam em cartilagem do osso embrionário são especificadas de
toupeira para cavar, a perna de um cavalo, a modo a formar dedos em uma ponta e o ombro na outra? (Seria um apêndice quase
nadadeira de um boto e a asa de um morce- desnecessário se a ordem fosse inversa.) Aqui, os tipos de células são os mesmos,
go, todos devem ser construídos no mesmo mas os padrões que os originam são diferentes.
modelo e devem incluir ossos similares na O membro dos vertebrados é um órgão muito complexo com uma distribuição
mesma posição relativa? assimétrica de partes. Os ossos do membro anterior, seja uma asa, uma mão, uma
CHARLES DARWIN (1859) nadadeira ou uma barbatana, consistem de um úmero proximal (adjacente à parede do
corpo), um rádio e um cúbito na região mediana, e os ossos distais do pulso e dos
dedos (Figura 18.1). Originalmente, essas estruturas são cartilaginosas, mas final-
mente a maioria delas é substituída por ossos. A posição de cada um dos ossos e dos
músculos no membro é precisamente determinada. A polaridade também existe em
outras dimensões. No homem, é óbvio que cada mão se desenvolve como a imagem
espelhar da outra. É possível também a existência de outros arranjos- como o polegar
se desenvolver no lado esquerdo de ambas as mãos- mas isso não é comum. Analo-
gamente, a palma (ventral) é facilmente distinta do pulso (dorsal). De alguma manei-
ra, a estrutura tridimensional do membro anterior é produzida rotineiramente. O pro-
blema fundamental da morfogênese- como estruturas específicas se situam em luga-
res determinados- é exemplificado no desenvolvimento dos membros. Como é que o
mesoderma da placa lateral desenvolve capacidades formadoras de membros? Como
é que dedos se formam em uma das extremidades do membro e em nenhum outro
lugar? Como é que o dedo mínimo se desenvolve em uma margem do membro e o
polegar em outra?
701
Figura 18.1
Padrão esquelético da asa de pinto. De acordo com a convenção, os Rádio
dígitos são numerados II,III, IV. Dígitos I e V não são encontrados Úmero
em asas de pinto. (De acordo com Saunders, 1982.)
Dígitos
Metacarpos
Cúbito Anterior
Proximal Distal
Posterior
As “regras morfogenéticas” básicas para a formação dos membros parecem ser as

mesmas para todos tetrápodes (veja Hinchliffe, 1991). Fallon e Crosby (1977) mostra-
ram que enxertos de pedaços de brotos membros de mamíferos ou de répteis podem
dirigir a formação de membros de pinto, e Sessions e colaboradores (1989) demonstra-
ram que regiões dos brotos de membros de salamandra e rã podem, uns aos outros,
dirigir a padronização dos seus membros. Ainda mais, a regeneração dos membros da
salamandra parece seguir as mesmas regras do desenvolvimento (Muneoka e Bryant,
1982). Mas quais são essas regras morfogenéticas?
A informação posicional necessária para construir um membro deve funcionar em
um sistema coordenado tridimensional.* Durante os últimos cinco anos, foram
identificadas certas proteínas que têm um papel na formação de cada um dos eixos do
membro. O crescimento próximo-distal (ombro-dedo; coxa-artelho) parece ser regula-
do pela família de proteínas do fator de crescimento dos fibroblastos (FGF). O eixo
ântero-posterior (polegar-dedo mínimo) deve ser regulado pela proteína Sonic hedge-
hog, e o eixo dorsoventral (nó dos dedos-palma da mão) é regulado, pelo menos em
parte, por Wnt7a. A interação dessas proteínas determina a diferenciação dos tipos de
células, além de se apoiarem mutuamente.
Formação do broto do membro

O campo do membro
Um campo morfogenético pode ser descrito como um grupo de células cuja posição e
destino são especificados em relação ao mesmo conjunto de limites (Weiss, 1939;
Wolpert, 1977). Um campo específico de células dará origem a seu órgão particular
(membro anterior, olho, cauda, etc.) quando transplantado a uma parte diferente do
embrião, e as células do campo podem regular seus destinos, contornando a falta de
células no campo (Huxley e De Beer, 1934; Opitz, 1985; De Robertis et al., 1991). Um
dos primeiros campos a serem identificados foi o campo do membro.
As células mesodérmicas que originam o membro de vertebrados podem ser
identificadas por (1) remoção de certos grupos de células e observando se um membro
se desenvolve em sua ausência (Detwiler, 1918; Harrison, 1918), (2) transplantando
certos grupos de células a novos locais e observando se elas formam um membro
(Hertwig, 1925), e (3) marcando grupos de células com corantes ou precursores radio-
ativos e observando quais descendentes das células marcadas participam no de-
senvolvimento dos membros (Rosenquist, 1971). Com esses procedimentos, a área
prospectiva dos membros foi precisamente localizada em muitos embriões de verte-
* Realmente, é um sistema tetradimensional no qual o tempo é o quarto eixo. Biologistas do

desenvolvimento se acostumam a ver a natureza em quatro dimensões.
brados. A Figura 18.2 mostra a área prospectiva do membro anterior no estágio de Somitos Rim
pronéfrico
broto caudal da salamandra Ambystoma maculatum. O centro desse disco normal-
mente é destinado a originar o próprio membro. Adjacente a ele estão as células que Guelras
formarão o tecido do flanco peribraquial e a cinta do ombro. Essas duas regiões
compreendem o clássico “disco do membro” usado em experimentos citados neste
capítulo. Entretanto, se todas essas células são extirpadas do embrião, ainda se forma-
rá um membro, ainda que mais tarde, a partir de um anel adicional de células que
envolve essa área. Se esse anel de células for incluído no tecido extirpado, não haverá
desenvolvimento do membro. Essa região maior, representando todas as células na Tecido do Membro Cinta do
área capazes de formar um membro, é chamada campo do membro. flanco livre ombro
O campo do membro originalmente tem a habilidade de regular a perda ou a peribraquial
adição de partes. No estágio de broto da cauda em Ambystoma, qualquer das meta- Figura 18.2
des do disco do membro é capaz de regenerar o membro completo quando enxertado Campo prospectivo do membro anterior da sa-
em um novo sítio (Harrison, 1918). Esse potencial também pode ser evidenciado lamandra Ambystoma maculatum. A área cen-
dividindo verticalmente o disco do membro em dois ou mais segmentos e colocando tral contém aquelas células destinadas a formar
delgadas barreiras entre os segmentos para impedir sua reunião. Quando isso é o membro propriamente dito; as células rode-
feito, cada parte se desenvolve em um membro completo. A habilidade reguladora do ando o membro livre são aquelas que dão ori-
broto do membro foi realçada recentemente em um admirável experimento da nature- gem ao tecido do flanco peribraquial e a cinta
do ombro. As células fora dessas regiões ge-
za. Em um pequeno lago em Santa Cruz, Califórnia, foram encontrados numerosas
ralmente não são incluídas nos membros, mas
salamandras e rãs com várias pernas (Figura 18.3). A presença desses apêndices
podem formar um membro se os tecidos mais
extras foi relacionada à infestação do abdômen das larvas por vermes trematóides centrais são extirpados. (De acordo com Stocum
parasíticos. Os ovos desses vermes provavelmente dividiram o broto do membro em e Fallon, 1982.)
vários locais enquanto o girino estava iniciando a formação dessas estruturas
(Sessions e Ruth, 1990). Assim, como um embrião precoce de ouriço-do-mar, o cam-
po do membro representa um “sistema eqüipotencial harmonioso” onde a célula
pode ser instruída a formar qualquer parte do membro.
Especificação dos campos do membro:

Genes Hox e ácido retinóico
Os membros não se formarão simplesmente em qualquer lugar ao longo do eixo corpóreo.

Ao contrário, existem posições muito distintas onde os campos do membro são origi-
nados. Interessantemente, em todos os vertebrados existem somente quatro brotos
de membros por embrião, e eles são sempre opostos entre si em relação à linha medi-
ana. Membros de diferentes vertebrados podem diferir em relação ao nível do somito
de onde se originam, mas sua posição é constante em relação ao nível de expressão do Figura 18.3
gene Hox ao longo do eixo ântero-posterior. Por exemplo, nos peixes (onde as nada- Habilidade reguladora do campo do membro,
deiras peitorais e pélvicas correspondem aos membros anteriores e posteriores, res- vista quando os campos dos membros poste-
pectivamente), anfíbios, aves e mamíferos, os brotos dos membros anteriores são riores precoces de um girino de Hyla regila
encontrados na região mais anterior expressando o gene Hoxc-6, a posição da primei- foram divididos por numerosos ovos de
ra vértebra torácica (Oliver et al., 1988; Molven et al., 1990; Burke et al., 1995). A placa trematóides. (Cortesia de S. Sessions.)
mesodérmica lateral na região dos membros é também especial, pois induz os mioblastos
a sair dos somitos e penetrar no broto do membro. Isso não é feito por nenhuma outra
região da placa mesodérmica lateral (Hyashi e Ozawa, 1995). [limb1.html], [mesend1.html]
O ácido retinóico parece ser crítico para o início do crescimento dos brotos dos
membros, pois bloqueando a síntese de ácido retinóico com certas drogas se impede
a iniciação do broto do membro (Stratford et al., 1996). Bryant e Gardiner (1992) suge-
rem que um gradiente de ácido retinóico ao longo do eixo ântero-posterior pode ativar
certos genes homeóticos em células particulares que são, dessa forma, especificadas
para serem incluídas no campo do membro. A fonte de ácido retinóico seria o nódulo
de Hensen (Hogan et al., 1992). A especificação de um campo de membro pelos genes
Hox, ativados por ácido retinóico, pode explicar uma observação estranha feita por
Mohanty-Hejmadi e colaboradores (1992) e repetida por Maden (1993). Quando cau-
das de girinos foram amputadas e o coto exposto ao ácido retinóico durante os primei-
ros dias de regeneração, esses girinos regeneraram várias pernas do coto de sua
cauda (Figura 18.4). É possível que o ácido retinóico tenha causado uma transforma-
ção homeótica na cauda em regeneração, reespecificando o tecido da cauda em cam-
pos de membros (Müller et al., 1996).
Crescimento do broto de membro precoce: fatores de crescimento

dos fibroblastos como indutores do broto do membro
O desenvolvimento dos membros começa quando as células mesenquimatosas come-

Figura 18.4
çam a proliferar a partir da camada somática do mesoderma da placa lateral do campo do
Regeneração de pernas a partir do blastema da
membro (precursores esqueléticos do membro), e a partir dos somitos (precursores
cauda de um girino de rã balão marmorizado
(marbled balloon). O blastema da cauda foi tra- musculares do membro) (Figura 18.5). As células acumulam-se sob o tecido epidérmico
tado com ácido retinóico após a amputação. (de da nêurula. A protuberância circular na superfície do embrião é chamada broto do mem-
Mohanty-Hejmadi et al., 1992, cortesia de P. bro. As células mesenquimatosas no broto do membro se multiplicam para criar uma
Monhanty-Hejmadi.) protuberância que vai se proliferar para formar um membro. Os estágios iniciais dessa
proliferação podem ser regulados pelo mesoderma intermediário vizinho, tal como os
mesonefros (o rim primitivo). Se nesse estágio, o mesonefro de um dos lados do embrião
é removido, ou se uma delgada membrana impermeável é inserida entre o mesonefro e um
broto de membro, as células mesenquimatosas daquele broto de membro específico
param de se multiplicar (Stephens et al., 1991; Geduspan e Solursh, 1992).
Experimentos recentes (Crossley et al., 1996) sugerem que a molécula proveniente
do mesoderma intermediário é o fator 8 de crescimento do fibroblasto (FGF8). No
mesênquima mesonéfrico do pinto, nos estágios 14 e 15 (quando os prospectivos
brotos do membro começam a aparecer), as regiões de expressão de FGF8 nos
mesonefros coincidem com as regiões onde se formarão os brotos de membro (Figura
18.6). Além disso, os FGFs podem induzir a formação de membros. Uma partícula
embebida em FGF8 (ou FGFs relacionados) pode ser inserida na região “intramembro”
(oposta aos somitos 21-25; veja Figuras 18.6 e 18.7) no estágio 15. Após uma semana
de incubação, um membro ectópico lá se forma. [limb2.html]
Indução da crista ectodérmica apical
A habilidade do FGF8 (ou outros FGFs) em induzir o crescimento mesodérmico do broto

do membro precoce pode ser somente uma atividade permissiva, e não instrutiva. A
formação do broto do membro necessita, além de um indutor mesodérmico ativo, de um
ectoderma competente. O ectoderma competente para formar um broto de membro pare-
ce se localizar somente na borda entre as superfícies dorsal e ventral do embrião.
Miótomo
do somito
Precursor do
Medula músculo
espinhal do membro
Células
Notocorda mesodérmicas Broto do
membro
Prônefro
Figura 18.5
Formação do broto do membro. A proliferação Precursor
das células mesodérmicas da região somática esquelético
do mesoderma da placa lateral causa uma pro- do membro
jeção externa do broto do membro no embrião Endoderma
de anfíbio. Essas células dão origem aos ele-
mentos esqueléticos do membro. (Migração de Mesoderma Mesoderma
células somíticas para o broto do membro gera da placa lateral da placa lateral
a musculatura do membro.)
Enquanto o broto do membro se forma, as células mesodérmicas induzem o ecto- Estágios embrionários
derma sobrejacente a formar uma estrutura chamada crista ectodérmica apical (AER;
Figura 18.8; Kieny, 1960; Saunders e Reuss, 1974). Essa crista corre ao longo da Somitos
margem distal do broto do membro e se tornará o principal centro sinalizador para o
Mesoderma
membro em desenvolvimento. Suas funções incluem (1) manter o mesoderma abaixo
intermediário
Membro anterior
dela em uma fase plástica e proliferativa permitindo o crescimento linear (próximo-
distal) do membro; (2) manter a expressão daquelas moléculas que geram o eixo ântero-
posterior (polegar-dedo mínimo); e (3) interagir com as proteínas especificando os
eixos ântero-posterior e dorsoventral permitindo a cada célula receber instruções de
como se diferenciar.
A AER está localizada na junção entre o ectoderma dorsal e o ventral. No broto
do membro precoce, só o ectoderma nessa junção tem a habilidade de formar uma
AER (Goetinck, 1964; Fraser e Abbott, 1971). Nos mutantes onde o ectoderma do
Membro posterior
Expressão
broto do membro está dorsalizado (como o mutante limbless de pinto), a AER não se de FGF8
forma e o desenvolvimento do membro cessa (Carrington e Fallon, 1988). Ainda
mais, partículas embebidas com FGF não induzirão uma AER quando colocadas Mesoderma
abaixo do ectoderma puramente dorsal ou ventral das costas ou do ventre. A junção segmentário
dorsoventral parece ser crítica. Experimentos recentes (Laufer et al., 1997; Rodriguez
e Izpisúa-Belmonte, 1997; Tanaka et al., 1997) demonstraram que a aposição do Figura 18.6
ectoderma dorsal e ventral do broto do membro do pinto é necessária para causar a Expressão de FGF8 no mesoderma intermedi-
formação de uma AER. Quando o ectoderma dorsal do broto do membro foi enxerta- ário do embrião de pinto nos estágios 13-15.
do no ectoderma ventral de outro broto do membro, uma nova AER se formou em Diagrama esquemático representando a meta-
adição à original (Figura 18.9). Parece que no estágio 15 (justamente antes da forma- de lateral do embrião durante a indução do bro-
ção do broto do membro), o ectoderma dorsal está sintetizando uma proteína secretora to do membro. Os números à esquerda indi-
chamada Radical fringe.* Ao emergir, o broto do membro (no estágio 17) se produz cam níveis de somitos. (Os somitos são repre-
sentados como círculos se desprendendo do
*Assim chamada devido ao gene fringe de Drosophila. A procura dos homólogos do gene fringe mesoderma segmentário, que está representa-
nos vertebrados foi motivada por estudos (a serem discutidos no próximo capítulo) mostrando que do por uma barra colorida). A faixa sombreada
a formação da margem da asa na Drosophila depende da expressão marginal desse gene. Como os
indica a posição do mesoderma intermediário;
genes hedgehog e wingless parecem ter funções na formação de membros tanto nos vertebrados
como nos insetos, vários laboratórios procuraram os genes fringe em vertebrados para verificar se
a expressão de FGF8 nesse mesoderma inter-
haveria a criação do equivalente à margem da asa, ou seja, a AER. Foi previsto que expressões mediário é mostrada pelas regiões mais escu-
limítrofes entre as regiões dorsal e ventral seriam críticas na formação de membros vertebrados e ras na faixa. As posições dos membros
invertebrados (Bryant et al., 1981; Meinhardt, 1984; Javois e Iten, 1986), mas as moléculas prospectivos, anterior e posterior foram
envolvidas só agora estão sendo identificadas. marcadas em cinza. (De acordo com Crossley
et al., 1996.)
Figura 18.7
Membro ectópico formado pela implantação de uma partícula embebida em FGF
no mesoderma entre-membros no estágio 15. Embrião tardio mostrando mem-
bro anterior, membro posterior e membro intermediário induzido pela partícula
embebida em FGF. (Fotografia cortesia de G.R. Martin.)
uma forte demarcação entre as células dorsais que expressam o gene radical fringe
e as células do ectoderma ventral que não o expressam. Durante o crescimento do
broto, a expressão do radical fringe se restringe quase exclusivamente àquelas
células do ectoderma dorsal na margem dorsal/ventral do broto do membro. Essas
células começam a expressar Fgf8 e se tornam a AER. (Como veremos, a FGF8
secretada da AER é considerada crítica por sua capacidade em manter a proliferação
do mesoderma abaixo dela e manter a expressão do gene sonic hedgehog para a
organização do eixo ântero-posterior; veja Figura 18.10.)
A importância da margem expressando ou não o radical fringe é confirmada em
estudos onde esse gene é expresso ectopicamente em retrovírus. Se as células ven-
trais do broto do membro são infectadas com um retrovírus expressando radical
fringe, um novo limite é criado entre as células que expressam o gene e aquelas que
não o expressam, e uma nova AER é nela originada. Inversamente, se a expressão
ectópica de radical fringe destrói a fronteira entre as células que o expressam e as que
não o expressam, aquela região da AER original não se forma.
A formação da AER pode envolver uma interação entre a secreção de FGFs (tal
Crista ectodérmica apical
como FGF8) pelo mesoderma e o limite de expressão de radical fringe ao longo da
Figura 18.8 borda dorsoventral do ectoderma. A secreção limitada de FGFs pode ser crítica na
Micrografia eletrônica de varredura de um bro- identificação de quais células, ao longo do flanco dorsoventral do embrião produzem
to de membro precoce de pinto, com sua crista os brotos do membro. Ainda não se conhece como a borda entre expressão e não
ectodérmica apical em primeiro plano. (Corte- expressão de radical fringe e os FGFs induzem a formação da AER.
sia de K. W. Tosney.)
Produção do eixo próximo-distal dos membros
Figura 18.9
Formação de uma AER ectópica quando tecido A crista ectodérmica apical: O componente ectodérmico
ventral é transplantado para o tecido dorsal do
broto do membro. (A) Procedimento onde ec- O crescimento próximo-distal e a diferenciação do broto do membro é possibilitado
toderma ventral de um broto do membro poste-
por uma série de interações entre o mesênquima do broto do membro e a AER (Figura
rior de pinto é transplantado para a superfície
dorsal de um broto do membro posterior hos- 18.11; Harrison, 1918; Saunders, 1948):
pedeiro, no mesmo estágio. (B) Após 26 horas
de incubação se forma uma AER ectópica (a 1. Quando a AER é removida em qualquer tempo durante o desenvolvimento do
AER original está indicada por uma flecha e a membro, cessa o desenvolvimento posterior de elementos esqueléticos do
AER ectópica por uma cabeça de flecha). (C) membro distal.
Enquanto a AER se forma, a expressão de ra-
dical fringe (cabeça de flecha) no broto do
membro se torna confinada às células dorsais
na junção D/V que formará a AER. (de Laufer
et al., 1997; fotografias cortesia de E. Laufer.) (B) (C)
Estágio 18/19 Estágio 18/19

Broto da perna Jaqueta ectodérmica
do hospedeiro do doador
(A)
Enxerto
ectodérmico AER
Somitos
Estágio 15 Estágio 16 Estágio 17 Estágio 18 Figura 18.10

Um modelo molecular para a iniciação do bro-
to do membro. FGF8 secretado pelo meso-
AER derma intermediário e/ou expressão de radi-
cal fringe na margem ectodérmica induz a ex-
Proliferação
Induzido Proliferação pressão de FGF8 no ectoderma superficial que
Sinal mantida por
por Fgf8 mantida a recobre. A borda ântero-posterior está pre-
dependente FGF8 + FGF4
de Fgf8? por FGF8 sente no estágio 16 (e talvez antes). A secre-
Anterior ção de FGF8 pelo ectoderma induz a prolife-
Posterior ração nas células mesenquimais e induz a ex-
shh shh mantido Fgf4
induzido
pressão de Sonic hedgehog na região posteri-
induzido por FGF8 or do broto do membro. A Sonic hedgehog
por FGF8 +FGF4 por Shh
induz a expressão de FGF4 na porção poste-
Somitos Mesoderma Mesoderma da Ectoderma rior do ectoderma do broto do membro. A
intermediário placa lateral superficial FGF2 também é produzida pelo ectoderma,
Fgf8 (Fator de crescimento dos fibroblastos) apesar de não estar claro se é induzido pelo
FGF8 do mesoderma mesofrênico. (De acor-
shh (sonic hedgehog) do com Crossley et al., 1995.)
Fgf4 +Fgf8
2. Quando uma AER extra é enxertada em um broto de membro existente, são

formadas estruturas supranumerárias, freqüentemente na direção da extremi-
dade distal do membro.
3. Quando mesênquima da perna é colocado diretamente abaixo da AER da asa,
se desenvolvem estruturas distais do membro posterior (artelhos) na ponta do
membro. (Entretanto, se esse mesênquima é colocado mais longe da AER, o
mesênquima do membro posterior se integra às estruturas da asa.)
4. Quando mesoderma não proveniente de membros é enxertado abaixo da AER,
a AER regride e o desenvolvimento do membro cessa.
AER
removida
Cessa
desenvolvimento
do membro
AER
extra
Asa
Mesoderma
do membro
anterior Perna
Asa
Mesoderma
da Perna
AER regride; cessa

desenvolvimento Figura 18.11
do membro Sumário do efeito da crista ectodérmica apical
Mesoderma (AER) sobre o mesênquima subjacente. (Mo-
não de membro dificado de Wessells, 1977.)
Figura 18.12
Corte transversal através da região distal de
um membro de pinto, 3 dias após a retirada de
uma fatia de AER de uma área que formaria
tecido interdigital. Em lugar de degenerar, o
tecido interdigital remanescente formou um
dígito extra. (de Hurle et al., 1989, cortesia
dos autores.)
Portanto, apesar das células mesenquimatosas induzirem e sustentarem a AER, e

determinarem o tipo de membro a ser formado, a AER ainda é a responsável pelo
contínuo crescimento e desenvolvimento do membro (Zwilling, 1955; Saunders et al.,
1957; Saunders, 1972; Krabbenhoft e Fallon, 1989). A AER mantém o mesênquima
diretamente subjacente em um estado de proliferação mitótica e impede a formação de
cartilagem pelas células mesenquimatosas. Hurle e colaboradores (1989) mostraram
que pelo corte de pequena porção da AER de uma região que normalmente cairia entre
os dígitos da perna do pinto, um dígito extra emerge naquele lugar (Figura 18.12).
Parece mesmo que uma função da AER é manter as células mesenquimatosas se pro-
liferando e, portanto, impedindo que formem cartilagem.
A zona progressiva: O componente mesodérmico
O eixo próximo-distal é definido somente após a indução da crista ectodérmica apical

pelo mesoderma subjacente. O broto do membro se alonga pela proliferação das célu-
las mesenquimatosas abaixo da AER. Essa região de divisão celular é chamada zona
progressiva, e se estende cerca de 200 µm para dentro da AER. Considera-se que as
moléculas da AER mantêm as células mesenquimatosas da zona progressiva em divi-
são e que essas moléculas responsáveis são os FGFs (Savage e Fallon, 1995; Crossley
et al., 1996). Quando as células mesenquimatosas deixam a zona progressiva, elas se
diferenciam de maneira regionalmente específica. As primeiras células deixando a zona
progressiva formam as estruturas proximais; aquelas células que sofreram numerosas
divisões na zona progressiva se tornam as estruturas mais distais (Saunders, 1948;
Summerbell, 1974). Portanto, quando a AER é removida de um broto de asa em estágio
precoce, as células da zona progressiva param de se diferenciar e somente um úmero
se forma. Quando a AER é removida um pouco mais tarde, se formam o úmero, o rádio
e o cúbito (Figura 18.13; Rowe et al., 1982).
A polaridade próximo-distal reside no compartimento mesodérmico do membro. Se
a AER fornece a informação posicional- de certa maneira instruindo o mesoderma
subjacente, não diferenciado, sobre quais estruturas produzir- então as AERs mais
velhas combinadas com mesoderma mais jovem deveriam produzir membros com
deleções na sua parte mediana, enquanto as AERs mais jovens combinadas com
mesoderma mais velho deveriam produzir duplicações de estruturas. Mas não foi isso
o que se encontrou (Rubin e Saunders, 1972). Ao contrário, se formaram membros
normais em ambos os experimentos. Mas quando a zona progressiva inteira, incluindo
o mesoderma e a AER de um embrião precoce foi colocada no broto do membro de um
embrião em estágio mais avançado, novas estruturas proximais foram produzidas além
daquelas já presentes. Inversamente, quando zonas progressivas mais velhas são
adicionadas a brotos de membros jovens, imediatamente se desenvolveram estruturas
distais, de tal forma que se viu dígitos emergindo do úmero, sem o rádio e o cúbito
intermediários (Figura 18.14; Summerbell e Lewis, 1975).
(A) (B) (C)
(D) (E)
Figura 18.13
Vista dorsal do padrão esquelético do pinto após remoção total da AER do broto da asa direita de
embriões em vários estágios. A última foto (E) é do esqueleto de uma asa normal. (de Iten, 1982,
cortesia de L. Iten.)
Genes Hox e a especificação do eixo próximo-distal do membro
A análise de mutações naturais ou experimentalmente induzidas deu origem a hipótese

de que os genes Hox 5’ (Abdominal-B) especificam porções individuais do eixo pró- Figura 18.14
Controle da especificação próximo-distal por
ximo-distal do membro. As extremidades 5’ da série de genes parálogos Hoxa e Hoxd
células da zona progressiva (PZ). (A) Con-
(parálogos 9-13) parecem ser ativas no broto do membro anterior do camundongo. junto extra de cúbito e rádio formado quando
Davis e colegas (1995) eliminaram todos os quatro locus para os genes parálogos PZ de broto precoce é transplantada para o
Hoxa-11 e Hoxd-11. (Não existem genes Hoxb-11 em camundongo, e Hocx-11 não é broto tardio da asa que já formou o cúbito e o
bem expresso no membro anterior, apesar de sê-lo no membro posterior.) Os camun- rádio. (B) Falta de estruturas intermediárias
dongos resultantes não tinham o cúbito e o rádio de seus membros anteriores (Figura observada quando a PZ de broto tardio é trans-
18.15A,B). Com base nos padrões de expressão dos genes das séries Hoxa e Hoxd, plantada para broto precoce de membro. A
onde os genes mais 5’ dos conjuntos Hox são expressos mais distalmente, esses posição das dobradiças indica o local dos en-
xertos. (de Summerbell e Lewis, 1975, corte-
sia de D. Summerbell.)
(A) (B)
(A) (C)
Grupos parálogos de Hox cognatos
(B) (D)
Figura 18.15
Deleção de elementos ósseos do membro por deleção dos genes Hox parálogos. (A) Membro
anterior de camundongo tipo selvagem. (B) Membro anterior de camundongo produzido dupla-
mente mutante, com a falta funcional dos genes Hoxa-11 e Hoxd-11. O cúbito e o rádio estão
ausentes. (C) Sinpolidactilia resultante de homozigosidade nos locos HOXD-13. (D) Hipótese
considerando que os parálogos 5’ dos genes Hox poderiam especificar determinadas regiões do
membro anterior. (A, B e D de acordo com Davis et al., 1995; fotografia cortesia de M. Capecchi.
C de Muragaki et al., 1996, cortesia de B. Olsen.)
pesquisadores propuseram um modelo onde os genes parálogos especificam a identi-

dade de uma região do membro (Figura 18.15D). Esse modelo está sendo testado e faz
previsões óbvias em relação ao fenótipo de outros camundongos com dupla ou tripla
eliminação (quando os parálogos 13 ou 12 são deletados).
Esse modelo tem suporte na análise de duas mutações naturais. Camundongos
homozigotos para um alelo de perda-de-função de Hoxa-13 apresentam severa
malformação nas quatro patas, que desenvolvem somente um dígito, uma versão
malformada do dígito 4 (Mortlock et al., 1996). Homozigotos humanos para uma
mutação de perda-de-função de Hoxd-13 mostram anormalidades nos pés e nas
mãos onde ossos metacárpicos e metatársicos são transformados em ossos cárpicos
e társicos curtos. Isso resulta na fusão dos dígitos (Figura 18.15C; Muragaki et al.,
1996). Em ambos os casos, o autópodo (a porção mais distal do membro) é afetado
pela perda-de-função do gene Hox mais 5’. O mecanismo pelo qual os genes Hox
podem especificar o eixo próximo-distal ainda não está esclarecido, mas uma pista
vem da análise do Hoxa-13 de galinha. A expressão ectópica desse gene (que é
usualmente expresso nas extremidades distais dos membros em desenvolvimento
do pinto) parece tornar mais pegajosas as células que o expressam. Isso, por sua
vez, causaria condensação de nódulos cartilaginosos em formas específicas
(Yokouchi et al., 1995; Newman, 1996).
Interações entre a AER e a zona progressiva
Os sinais moleculares da interação entre a AER e o mesênquima da zona progressiva

estão começando a ser identificados. A divisão das células mesenquimatosas na zona
progressiva parece ser regulada pela secreção de membros da família FGF, tais como
FGF2 (Fallon et al., 1994), FGF4 (Niswander et al., 1993) e FGF8 (Mahmood et al., 1995;
Crossley et al., 1996; Vogel et al., 1996). Considera-se que esses fatores de crescimento
do fibroblasto são secretados da AER para o mesênquima adjacente (veja Capa; Figu-
ra 18.16). Ainda mais, se a AER é removida, ela poderá ser substituída pela implantação
de partículas esféricas (contas) cheias de FGF2, FGF8 ou FGF4 (Figura 18.17). Parece,
portanto, que a AER promove o crescimento pela secreção de fatores de crescimento
do fibroblasto (Crossley et al., 1996; Vogel et al., 1996). O FGF8 é uma das primeiras
moléculas identificadas na região do ectoderma que se torna a AER, e sua expressão é
crítica no crescimento do broto do membro (Figura 18.16).
Mutações nas interações entre a zona progressiva e a AER
A relação entre a AER e o mesênquima do broto do membro pode ser melhor apreciada
em mutações no desenvolvimento de membros do pinto. A mutação polydactylous,
como o nome sugere, adiciona dígitos extras em cada membro. Recombinando tecidos
(A) (B) (C) (D)
Figura 18.16
FGF8 e morfogênese de membros. (A) Hibridização in situ mostrando expressão da mensagem
de Fgf8 no ectoderma enquanto o broto do membro começa a se formar. (B) Expressão do RNA
Fgf8 na crista ectodérmica apical, a fonte de sinais mitóticos para o mesoderma subjacente. (C)
Em embriões normais de pinto (estágio 17; cerca de 24 horas), FGF8 é expresso na crista
ectodérmica apical de ambos os brotos do membro, anteriores e posteriores. É também expresso
em vários outros lugares no embrião. (D) No mutante limbless de galinha, FGF8 não é expresso
nos brotos do membro, apesar de não estar perdido em outras regiões do embrião. Aqui, os
brotos do membro se formam mas não se desenvolvem em membros (A e B cortezia de J. C.
Izpisúa Belmonte; C e D cortesia de A. López-Martínez e J. F. Fallon.)
(A)
Remover 20 horas
AER
Forma o úmero
Sem
AER
(B)
Adicionar
Remover partícula com
AER solução salina 20 horas
Forma o
úmero
Partícula
(C)
Remover Adicionar partícula 20 horas Ümero

AER contendo FGF2 Rádio
Cúbito
Partícula
Dígitos
(D)
Úmero
Rádio
Cúbito
Remover Adicionar partícula 24 horas 20 horas
AER contendo FGF2
Implantar
segunda
partícula
contendo
FGF2 Carpos
Segunda
partícula
Figura 18.17
Habilidade de FGF2 para substituir a crista ectodérmica apical no broto do membro anterior em
desenvolvimento do pinto. (A) Quando a AER é removida dos brotos da asa do pinto no estágio
20, somente se forma o úmero. (B) Se uma partícula gelatinosa de lenta liberação embebida em
solução salina é colocada no mesênquima da zona progressiva, o membro ainda fica truncado e
forma somente o úmero. (C) Quando um broto embebido em FGF2 é colocado na zona progres-
siva o crescimento do broto do membro continua, e o cúbito e o rádio são formados. (D) Se uma
segunda partícula contendo FGF2 é colocada na zona progressiva após a dissipação da maioria
do FGF2 da primeira partícula, o broto do membro continua a crescer e a produzir metacarpos e
dígitos. (De acordo com Fallon et al., 1994.)
Tabela 18.1 Mutações que afetam as interações recíprocas entre a AER e seu
mesênquima subjacentea
Mesoderma Epiderme Resultado Conclusão
POLIDÁCTILO
Polidáctilo Tipo selvagem Polidáctilo Mesoderma é afetado
Tipo selvagem Polidáctilo Tipo selvagem pela mutação
EUDIPLOPODIA
Eudiplopodia Tipo selvagem Tipo selvagem Ectoderma é afetado
Tipo selvagem Eudiplopodia Eudiplopodia pela mutação
LIMBLESS
Limbless Tipo selvagem Tipo selvagem Ectoderma é
Tipo selvagem Limbless Limbless afetado pela mutação
aPor transplante recíproco entre o tipo selvagem e AER mutante e mesênquima, o comparti-
mento aberrante da indução pode ser identificado.
mutantes e do tipo selvagem (Tabela 18.1), os defeitos podem ser traçados para as
células mesodérmicas que induzem amplamente uma AER. No mutante eudiplopodia
(Grego, “dois bons pés”), além dos dígitos extras aparecem duas seqüências comple-
tas de dedos em cada membro posterior (Figura 18.18). Experimentos semelhantes com
reconstituição mostram que aqui o defeito está no tecido ectodérmico. Embriões de
pintos homozigotos para a mutação limbless iniciam a formação do broto do membro,
mas a AER não se forma. Experimentos de recombinação mostram que o ectoderma de
limbless é incapaz de formar uma AER, mesmo quando colocado no mesoderma de
membro do tipo selvagem; uma crista normal pode ser formada quando ectoderma
normal é enxertado no campo do membro em lugar do ectoderma mutante (Figura
18.19; Carrington e Fallon, 1988).
Além disso, existem vertebrados naturalmente sem membros, cuja falta de mem-
bros pode ser relacionada às deficiências na interação AER-mesênquima. A praga
contra cobras no Livro do Gênesis parece ter sido dirigida à extremidade distal do
broto do membro, pois a AER desses répteis degenera-se prematuramente e ao mesmo
tempo em que ocorre a morte celular no mesênquima adjacente (Lande, 1978). Não se
sabe se o defeito inicial está no mesênquima ou na AER. [limb3.html]
(A) (B)
Figura 18.18
Secções transversais dos brotos dos mem-
bros posteriores em eudiplopodia de em-
briões de pinto. (A) Duas AERs no broto do
membro posterior; crescimento extra no lado
dorsal formará um conjunto extra de dedos.
(B) Ambas as regiões de crescimento estão
cobertas por uma AER. Recentemente foi
demonstrado (Laufer et al., 1997) que duas
áreas de radical fringe aparecem no broto do
membro desse mutante, e cada uma se asso-
cia com a nova AER. (De Goetinck,1964,
cortesia de P. Goetinck.)
Figura 18.19
O embrião limbless não forma AER, e o defeito parece residir no ectoder-
ma. Se o ectoderma de codorna do tipo selvagem substitui o ectoderma
mutante do pinto na região que forma o membro anterior, a asa se desen-
volverá naquele lado do embrião. Não se forma outro membro. (De acordo
com Carrington e Fallon, 1988; fotografia cortesia de J. Fallon.)
& Especulações
A regeneração dos membros da salamandra e a

retenção do eixo próximo-distal
F REQÜENTEMENTE É ÚTIL en-

contrar modelos adultos de desen-
volvimento embrionário. Durante
dois séculos, a regeneração do membro
ção (veja Chernoff e Stocum, 1995). Duran-
te os próximos 4 dias as células abaixo do
hemisfério em desenvolvimento sofrem uma
dramática desdiferenciação: células ósseas,
de anfíbios foi não somente uma das mais células da cartilagem, fibroblastos, miócitos
extraordinárias demonstrações de regula- e células neurais perdem suas característi-
ção, mas também um modelo para o de- cas diferenciadas e se destacam umas das
senvolvimento do membro tetrápode nos outras. Genes expressos em tecidos dife-
vertebrados. Quando um membro da sa- renciados (como os genes MRF4 e Myf5
lamandra é amputado, as células remanes- expressos em células musculares) são repri-
centes são capazes de reconstruir um midos, enquanto há um dramático aumento
membro completo com todas suas células na expressão de genes, tal como msx1, que
diferenciadas organizadas de maneira cor- são associados com o mesênquima da zona
reta. É extraordinário que não só o mem- progressiva em proliferação (Simon et al.,
bro tenha sido regenerado, mas também 1995). Portanto, a bem estruturada região
que as células que ficaram mantiveram a do membro, na face cortada do toco, forma
informação especificando sua própria uma massa proliferante de células indistin-
posição como também a das células re- tas e desdiferenciadas, logo abaixo do he-
movidas. Em outras palavras, as novas misfério ectodérmico apical. Essa massa de
Figura 18.20
células constroem somente as estruturas células desdiferenciadas é chamada de
Regeneração do membro anterior da salaman-
perdidas e nada mais; por exemplo, quan- dra. Na esquerda, a amputação foi feita abaixo
blastema de regeneração, e essas células
do um punho é amputado, a salamandra do ombro; a amputação mostrada à direita cor- continuarão a se proliferar e se diferenciar
forma um novo punho e não um novo tou através do úmero. Em ambos os casos, a para formar as novas estruturas do mem-
cotovelo (Figura 18.20). De certa maneira, informação posicional correta foi reespecificada. bro. Se as células do blastema forem
o membro da salamandra “sabe” onde o (de Goss, 1969, cortesia de R. J. Goss) destruídas, a regeneração não se dará
eixo próximo–distal foi cortado e pode (Butler, 1935). Ainda mais, uma vez que as
regenerá-lo daquele ponto em diante. Os- migram para cobrir a superfície do ferimento, células se desdiferenciaram para formar um
car Schotté disse que daria seu braço di- formando a epiderme do ferimento. Essa blastema, elas recuperaram sua plasticida-
reito para conhecer o segredo da regene- estrutura em monocamada é necessária para de embrionária.
ração do membro (em Goss, 1991). a regeneração do membro. Ela se prolifera Na maioria dos casos, entretanto, o te-
Ao se amputar um membro, forma-se um para formar o hemisfério ectodérmico apical. cido neural é essencial para a formação do
coágulo de plasma; e dentro de 6-12 horas, A inervação do membro se degenera em uma novo membro pelas outras células. Singer
células epidérmicas do coto remanescente, curta distância a partir do plano de amputa- (1954) demonstrou que um número mínimo
em todas as células em divisão (pois a 1982). Um membro completo (começando

redutase ribonucleotídica, a enzima limitando osso mais proximal) se desenvolve a
te da velocidade na síntese de DNA, repartir do coto do membro, independente-
quer um íon férrico no seu sítio ativo). mente do nível original da amputação. É
Quando são removidos os membros pos- possível que o ácido retinóico cause a re-
teriores, o nervo ciático transporta a especificação das células para a posição
transferrina pelo axônio e libera grandes mais proximal (Figura 18.22; Prancha 9;
quantidades dessa proteína no blastema Crawford e Stocum, 1988b).
(Munaim e Mescher, 1986; Mescher, 1992). O ácido retinóico é sintetizado na
Tanto extratos neurais como transferrina epiderme do ferimento do membro em re-
são capazes de estimular a divisão celular generação, formando um gradiente ao lon-
(A)
em membros enervados, e a quelação dos go do eixo próximo-distal do blastema
íons férricos nos extratos neurais impede (Brockes, 1992; Scadding e Maden, 1994).
sua atividade mitótica (Munaim e Mescher, Esse gradiente de ácido retinóico pode
1986; Albert e Boilly, 1988). Um terceiro ativar os genes diferencialmente em regi-
candidato é o FGF2. Mullen e colaborado- ões diferentes do blastema. Um dos genes
res (1996) mostraram que o hemisfério ec- responsivos ao ácido retinóico é o msx1
todérmico apical transcreve grandes quan- que é associado à proliferação do mesên-
tidades de Dlx3, um homólogo anfíbio de quima (Shen et al., 1994; Viviano et al.,
Distal-less de Drosophila. Durante os es- 1995). Outro conjunto de genes que po-
tágios de regeneração dependentes de dem ser reespecificados pelo ácido reti-
neurônios, a expressão ectodérmica de Dlx3 nóico são os genes HoxA. Gardiner e co-
é dependente da inervação. Existe uma laboradores (1995) mostraram que o pa-
correlação entre a presença de Dlx3 e uma drão da expressão de certos genes HoxA
(B)
epiderme permissiva de crescimento. Nos nas células distais do blastema em rege-
Figura 18.21
estágios tardios da regeneração, a expres- neração é modificado pelo ácido retinói-
Efeitos da vitamina A (um retinóide) em mem-
são de Dlx3 não depende dos neurônios. co exógeno para um padrão de expressão
bros de salamandra em regeneração. (A) Mem-
bro normal regenerado de axolotle (9x) com Se membros amputados são enervados em característico de células mais proximais. É
úmero, rádio e cúbito pareados, carpos e dígi- um estágio dependente de neurônios, a provável que durante a regeneração nor-
tos. A linha pontilhada mostra o plano de am- expressão de Dlx3 e a regeneração podem mal, a epiderme do ferimento/hemisfério
putação. (B) Regeneração após a amputação ser mantidas por partículas contendo FGF2 ectodérmico apical secrete ácido retinói-
através da área do corpo, mas após a colocação (Mullen et al., 1996). co que ativa os genes necessários para a
do blastema do membro em palmitato de retinol O ácido retinóico parece ter uma fun- proliferação celular, reprima os genes es-
por 15 dias. Aparecem um novo úmero, cúbito, ção importante tanto na desdiferenciação pecíficos para células diferenciadas e, fi-
rádio, conjunto de carpos e conjunto de dígitos das células para formar o blastema de re- nalmente, ative um conjunto de genes Hox
(5x). (de Maden et al., 1982; fotografias corte- generação como no processo de reespeci- que orientam as células quanto ao lugar
sia de M. Maden.) ficação quando as células rediferenciam. onde estão e quanto devem crescer. O me-
Se os blastemas de membros de salaman- canismo pelo qual isso é realizado pelos
de fibras nervosas devem estar presentes dra em regeneração são mergulhados em genes Hox não é conhecido, mas foram
para que se dê a regeneração. Considera- soluções com concentrações adequadas verificadas variações tanto na adesão cé-
se que os neurônios liberam um fator esti- de ácido retinóico (ou outros retinóides), lula-célula como em outras qualidades de
mulante de mitose que aumenta a prolife- os membros em regeneração têm duplica- superfície das células (Nardi e Stocum,
ração das células do blastema (Singer e ções ao longo do eixo próximo-distal (Fi- 1983; Stocum e Crawford, 1987; Bryant e
Caston, 1972; Mescher e Tassava, 1975). gura 18.21; Niazi e Saxena, 1978; Maden Gardiner, 1992).
Após uma fase inicial dependente de neu-
Solução Solução de
rônios, a regeneração pode prosseguir sem ácido retinóico
controle
estimulação neural. Um candidato para essa
substância neural crucial é o fator de cres-
cimento da glia (GGF). Sabe-se que esse
peptídeo é produzido pelas células neurais Blastema forma Colocar blastema BLASTEMA Colocar blastema de “Proximalização”
da salamandra aquática, está presente no punho e dígitos de punho doador na de punho punho doador na região do dos destinos
blastema e é perdido na enervação. Quan- região do “ombro” doador “ombro” do membro do blastema
do membro cortado cortado do hospedeiro
do o GGF é adicionado ao blastema do hospedeiro
enervado, as células mitoticamente repri-
Figura 18.22 - Blastemas de punho de membros de axolotle recentemente cortados regeneram
midas são aptas a dividir-se novamente
o punho quando colocados em membros hospedeiros cortados na área do ombro (Veja Capítulo
(Brockes e Kinter, 1986). Outro candidato 3). Entretanto, se forem colocados em solução de ácido retinóico, esses blastemas começarão a se
é a transferrina, uma proteína transporta- regenerar no local onde foram colocados no tecido hospedeiro, e geram estruturas proximais
dora de ferro que é necessária para a mitose àquelas do punho. (Dados de Crawford e Stocum, 1998a,b.)
Assim, estamos frente a uma situação contendo um úmero, que não deve pro-
onde as células adultas de um organismo duzir outro úmero e nem começar imedia-
podem retornar a uma condição “embrio- tamente a produzir dígitos. Não somente
nária” e começam novamente a formação o blastema regenera essas estruturas co-
de um membro. Exatamente como no de- meçando no nível próximo-distal apropri-
senvolvimento embrionário, o blastema ado no membro, como também as polari-
forma sucessivamente estruturas mais dades dos eixos ântero-posterior (pole-
distais (Rose, 1962). Portanto, o blastema gar-dedo mínimo) e dorsoventral (punho-
deve conter alguma informação posicio- palma da mão) também correspondem
nal que informa ao blastema de um coto àquelas do coto.
Especificação do eixo ântero-posterior dos membros

A zona de atividade polarizante
Uma autodiferenciação do eixo ântero-posterior é a primeira modificação da condição

pluripotente. Em pintos, esse eixo é especificado muito antes que o broto do membro
seja reconhecível. Hamburger (1938) mostrou que já no estágio precoce de 16 somitos,
o mesoderma prospectivo da asa transplantada para a área do flanco se desenvolve
em um membro com as polaridades ântero-posterior e dorsoventral do enxerto doado
e não daquelas do tecido hospedeiro (Figura 18.23).
Anterior
Dorsal Ventral Desenvolvimento

normal dos brotos
do membro nas asas
Posterior
Brotos enxertados
diferem do hospedeiro
no eixo dorsoventral
Relacionamento
de eixos entre Brotos enxertados
enxerto diferem do
(sombreado) hospedeiro no eixo
e hospedeiro ântero-posterior
Figura 18.23
Especificação dos eixos ântero-posterior e
dorsoventral na asa do pinto. O broto do mem-
bro enxertado se desenvolve de acordo com
sua própria polaridade e não adota a polarida-
de do seu hospedeiro. As asas que se desen- Brotos enxertados
volvem dos brotos do membro enxertados diferem do
estão coloridas. Para maior clareza, as asas hospedeiro nos
que o hospedeiro normalmente desenvolve eixos ântero-posterior
e dorsoventral
não estão apresentadas. (De acordo com
Hamburger, 1938.)
Estágio 17
Figura 18.24
Dígitos duplicados aparecem como imagem espelhar de dígitos normais quando Estágio 19
ZPA é enxertada no mesoderma do broto do membro anterior. (de Honig e
Smmerbell, 1985, fotografia cortesia de D. Summerbell.)
Considera-se que a diferenciação das estruturas próximo-distais depende do nú-

mero de divisões realizadas pela célula enquanto na zona progressiva, mas a informa-
ção posicional instruindo a célula quanto à sua posição nos eixos ântero-posterior e
dorsoventral deve vir de outras fontes. Vários experimentos (Saunders e Gasseling, Estágio 21
1968; Tickle et al.,1975; Summerbell, 1979) sugerem que o eixo ântero-posterior é espe-
cificado por um pequeno bloco de tecido mesodérmico perto da junção posterior do
jovem broto do membro com a parede do corpo. Quando esse tecido de um jovem
broto de membro é transplantado para uma posição no lado anterior de outro broto de
membro (Figura 18.24), o número de dígitos na asa resultante é duplicado. Além disso
as estruturas do conjunto extra de dígitos é a imagem espelhar daquelas estruturas
normalmente produzidas. A polaridade foi mantida, mas agora a informação vem ao
mesmo tempo das direções anterior e posterior. Essa região do mesoderma é chamada Estágio 23
de zona de atividade polarizante (ZPA).
A distribuição e a força da atividade de sinalização posicional da ZPA na asa do
pinto e brotos da perna foram mapeados (Hinchliffe e Sansom, 1985; Honig e
Summerbell, 1985). Como indicado nos desenhos da Figura 18.25, a atividade polarizante
(medida após o enxerto das células marginais posteriores na margem anterior do broto
do membro) é maior em uma região determinada da margem posterior e de lá vai dimi-
nuindo. A atividade enfraquece enquanto progride o desenvolvimento.
Sonic hedgehog como definidor da ZPA

ZPA Estágio 25
A procura de molécula(s) conferindo atividade polarizante ao broto do membro do

pinto se tornou uma das mais intensas buscas da biologia do desenvolvimento. Os
candidatos atuais a fatores da ZPA foram identificados a partir de estudos que assu-
miram uma homologia evolucionária dos sistemas reguladores do desenvolvimento
entre a Drosophila e os vertebrados. Como deve ser lembrado do Capítulo 16, os Estágio 27
genes homeóticos da Drosophila têm contrapartidas nos vertebrados os quais têm
Figura 18.25
Mapa da atividade sinalizadora de posição enquanto o membro se desenvolve. As cores represen-
tam a intensidade de expressão de sonic hedgehog. Os números representam a porcentagem de
enxertos mostrando duplicações completas quando essas regiões foram transplantadas para a
margem anterior do broto do membro precoce. (Desenhos de acordo com Honig e Summerbell,
1985, dados de expressão de Riddle et al., 1993.) Estágio 29
Transfectar vírus expressando shh e Figura 18.26

permitir que o vírus se espalhe Ensaio para a atividade polarizante de Sonic hedgehog. O gene sonic hedgehog foi inserido no
promotor ativo de um vírus de pinto, e o vírus recombinante colocado em células fibroblásticas
cultivadas de embrião de pinto. As células infectadas pelo vírus foram compactadas e implantadas
na margem anterior do broto do membro de um embrião de pinto resistente à infecção por esse
vírus. O vírus não podia infectar o hospedeiro, mas podia expressar e secretar altos níveis de
Sonic hedgehog. Os membros resultantes mostraram que o material secretado tinha atividade
Cepa infectável de polarizante. (De acordo com Riddle et al., 1993.)
células fibroblásticas
do embrião de pinto
Células compactadas
por centrifugação
funções desenvolvimentais críticas. E como foi mencionado no Capítulo 14, o gene
hedgehog responsável pela polaridade de segmentos parece codificar uma proteína
difusível que interage com as células vizinhas. Seria muito perguntar se existe um
homólogo nos vertebrados que realiza uma função semelhante?
Usando a seqüência conhecida do gene hedgehog em Drosophila, Riddle e
seus colaboradores (1993), usaram a reação da cadeia de polimerase para identifi-
car uma mensagem semelhante a hedgehog em brotos de membros de pinto. Eles
nomearam o gene como sonic hedgehog*. Hibridização in situ mostrou que a
expressão de sonic hedgehog não se dá no broto do membro inteiro, mas é locali-
Implante na porção anterior do broto do zada exatamente na região que, segundo Honig e Summerbell, contém a maior
membro (Embrião no estágio 19-23)
atividade de ZPA (Figura 18.25).
Riddle e colaboradores mostraram que a secreção da proteína Sonic hedgehog
Anterior poderia ser suficiente para a atividade de ZPA. Eles transfectaram fibroblastos embri-
Pélete de onários de pinto (que normalmente nunca sintetizariam essa proteína) com um vetor
Cepa resistente células viral contendo o gene sonic hedgehog (Figura 18.26). O gene foi expresso e traduzido
do embrião secretando nesses fibroblastos, os quais foram inseridos em uma crista anterior de um broto de
hospedeiro Shh membro precoce do pinto. Foi demonstrada também a reversão de polaridade dos
dígitos, de maneira semelhante à ZPA. Mais recentemente, partículas contendo a
Posterior proteína Sonic hedgehog provocaram as mesmas duplicações (López-Martinez et al.,
1995). Portanto, a Sonic hedgehog parece ser o agente ativo da ZPA.
Interações entre a AER e a ZPA para integrar crescimento e padrão

ZPA
Como Sonic hedgehog determina o padrão ântero-posterior do membro? Pesquisas

recentes indicam que a proteína não age sozinha e que a cooperação com sinais da
AER é crítica para sua função. Essas interações podem estabelecer padrões de expres-
são do gene Hox que especificariam o eixo ântero-posterior.
SONIC HEDGEHOG COMO INICIADOR DE SECREÇÃO DE MORFÓGENOS. Ain-

da não se sabe como a ZPA especifica o eixo ântero-posterior. Um modelo sugere que
sinais de curto alcance especificam as células que produzirão os dígitos e que essas
células migram através do broto do membro (Figura 18.27A). Entretanto, essa migra-
ção não foi observada. Isso conduz a dois outros modelos. No modelo da cascata
indutiva (Figura 18.27B), uma progressão de sinais de curto alcance é sucessivamente
propagada da ZPA para os tecidos responsivos. Portanto, Sonic hedgehog não se
difunde através do broto do membro em um gradiente suavemente decrescente. Em
lugar disso, Sonic hedgehog se difunde a uma curta distância e induz as células
*Sim, como o personagem do desenho Sega. O gene hedgehog em Drosophila, como na

maioria dos genes, tem o nome do seu fenótipo mutante. (Isso causa muita confusão. Os genes
“para” falta de olhos ou de membros são na verdade aqueles genes cujos produtos impedem essas
deficiências.) Em Drosophila, a deficiência da expressão do hedgehog resulta em uma cutícula
tendo mais dentículos pontiagudos, portanto, parecendo um hedgehog (porco-espinho).
(A) Sinalização de curto alcance e deslocamento (B) Sinalização seqëncial de curto alcance
Difusão de
curto alcance
(C) Espalhamento progressivo de um sinal graduado e promoção em uma via
Difusão de alcance
mais longo com o
passar do tempo
Figura 18.27
Modelos de atividade da ZPA. (A) Modelo de função da ZPA por sinalização de curto alcance e
subseqüente deslocamento do tecido especificado. (B) Modelo de função da ZPA por sinais
seqüenciais de curto alcance. (C) Modelo de função de ZPA por espalhamento progressivo de um
sinal graduado, onde o tecido responsivo responde a gradiente de concentração. (De acordo com
Tickle, 1995.)
responsivas a secretar outra proteína. Essa segunda proteína se difunde também em

uma curta distância para ativar as células na sua vizinhança e essas células secretam
uma terceira proteína, e assim por diante. Dessa maneira, uma série de sinais é enviada
da fonte de Sonic hedgehog em direção à parte anterior do broto do membro (veja
López-Martínez et al., 1995). O terceiro modelo é chamado de modelo do morfógeno
solúvel (Figura 18.27C; Wolpert, 1969, 1977; Tickle, 1981) onde o tecido responde de
maneira diferente a diferentes concentrações de moléculas solúveis secretadas pela
ZPA. Inicialmente, o tecido mais perto da ZPA recebe baixas concentrações do
morfógeno e é especificado para ser o dígito mais distal. Entretanto, ao continuar a
secreção, aquele tecido é exposto a uma maior concentração e é reespecificado como
um dígito mais proximal (posterior). A próxima região de células, ligeiramente mais
afastada da ZPA, recebe uma baixa concentração do morfógeno e se torna especificada
para estruturas mais distais (anteriores). Isso continua até que todos os dígitos são
especificados através do broto do membro.
Nenhum dos dois últimos modelos foi excluído, mas existe evidência que mesmo
que a Sonic hedgehog defina ou “energiza” a ZPA, a proteína não é o morfógeno
solúvel responsável pela especificação dos dígitos. Deve existir uma cascata de sinais
indutivos. Foi demonstrado que a parte ativa da proteína Sonic hedgehog é a sua
região N-terminal, que é cindida do resto da proteína em membros do pinto. Essa
extremidade ativa pode se difundir da célula, mas essa difusão não vai muito longe de
sua fonte no broto do membro posterior (López-Martínez et al., 1995). Quando ela se
FGF4
Ácido
retinóico Manter proliferação na
zona progressiva; Desenvolvimento
ativar a expressão do esquelético posterior
gene HoxD
Wnt7a
Sonic
hedgehog
Figura 18.28
Algumas interações moleculares pelas quais
o broto do membro é iniciado e mantido. Pa-
drão de expressão dinâmica do gene HoxD difunde, parece ativar proteínas morfogenéticas do osso, especialmente a BMP2 (Francis
durante uma parte da morfogênese da asa do et al., 1994; Laufer et al., 1994). Essas proteínas também não se difundem para muito
pinto. Algumas das principais ligações inclu- longe, e pesquisadores estão a procura de outras moléculas que podem ser ativadas
em (1) a manutenção de Sonic hedgehog (Shh) pelas proteínas morfogenéticas do osso.
pela combinação de Wnt7a e FGF4; (2) a
manutenção de Shh pela combinação de ácido SONIC HEDGEHOG COMO CO-ATIVADOR DE GENES HOX E PROLIFERAÇÃO
retinóico e FGF4; (3) a indução recíproca de CELULAR. Além da ativação dos genes para as proteínas morfogenéticas do osso
FGF4 e Shh para a manutenção de cada um;
(especialmente a BMP2), existem outros dois importantes alvos para Sonic hedgehog.
(4) a interação entre FGF4 e Shh para ativar a
expressão dos genes HoxD e para manter a O primeiro conjunto de alvos podem ser os genes Hoxd 5’ (Figura 18.28; Hoxd-9 a
divisão celular no mesênquima da zona pro- Hoxd-13). Durante o desenvolvimento normal dos membros de pinto ou camundon-
gressiva. (De acordo com Nelson et al., 1996; go, desenvolve-se um padrão característico de expressão de genes Hoxd “concentri-
Niswander et al., 1994.) camente aninhados” e centrados na margem posterior que tinha sido definida como a
ZPA (Dollé et al., 1989; Nelson et al., 1996). A região mais próxima do centro tem todos
esses genes Hoxd 5’ expressos, mas a expressão desses genes cai seqüencialmente à
medida que as células estão progressivamente mais afastadas da ZPA. Além disso, o
transplante de ZPA ou de células secretoras de Sonic hedgehog para a margem ante-
rior leva à formação de padrões de imagens espelhares na expressão dos genes Hoxd
e padrões de imagens espelhares de dígitos (Izpisúa-Belmonte et al., 1991; Nohno et
al., 1991; Riddle et al., 1993).
Originalmente parecia haver um código pelo qual a expressão dos diferentes genes
HoxD especificaria o padrão ântero-posterior dos dígitos, mas estudos recentes mos-
tram que o problema é mais complexo. Sonic hedgehog pode estar agindo em conjun-
ção com sinais da AER na especificação de padrões. Primeiro, a expressão de genes
Hoxd é controlada pela cooperação de AER e ZPA. Na ausência de uma AER, a Sonic
hedgehog é incapaz de induzir a expressão de genes Hoxd (Laufer et al., 1994). Entre-
tanto, a adição de ácido retinóico pode substituir a falta de AER (Helms et al., 1996;
Ogura et al., 1996).* Há muito tempo se sabe que o ácido retinóico induz polarização de
membros. Partículas embebidas em ácido retinóico podem mimetizar o tecido ZPA, e
induzir uma reversão da imagem espelhar na polaridade ântero-posterior (Tickle et al.,
1982, 1985), e uma única partícula embebida com ácido retinóico pode substituir uma
ZPA quando o tecido ZPA normal foi removido (Eichele, 1989). Entretanto, o conteúdo
de ácido retinóico na ZPA não parece suficientemente alto para ativar genes
responsivos ao ácido (Prancha 13; Noji et al., 1991; Rossant et al., 1991), e considera-
ções teóricas (veja Wanek et al., 1991) indicam que é pouco provável que o ácido
retinóico seja o agente ativo da ZPA. De outro lado, estudos recentes sugerem que o
O ácido retinóico morfogeneticamente ativo no broto do membro pode diferir de acordo com
a espécie. No membro do pinto, o ácido retinóico ativo parece ser o ácido didehidroretinóico.
Entretanto, essa forma não é encontrada no broto do membro de camundongo (Stratford et al.,
1996).
ácido retinóico induz um co-fator de Sonic hedgehog. Enquanto Sonic hedgehog

sozinha poderia induzir Hoxd-9 até Hoxd-11, a indução dos genes mais 5’ Hoxd,
Hoxd-12 e Hoxd-13, somente pode ser realizada na presença de ácido retinóico (Ogura
et al., 1996). Experimentos com enxertos mostram que esses fatores induzidos pelo
ácido retinóico são produzidos na AER (Helms et al.,1996).
Um candidato para fator induzido por ácido retinóico é o FGF4. O ácido retinóico
induz a expressão de Fgf4 na AER, e o faz independentemente da Sonic hedgehog
detectável (Niswander et al., 1994). Ainda mais, quando uma partícula contendo FGF4
substitui a AER, a expressão dos genes HoxD é promovida (Laufer et al., 1994). Duprez
e colegas (1996) verificaram que o ácido retinóico induz a BMP2 e essa, por sua vez,
induz tanto o FGF4 na AER como a expressão de Hoxd11 e 13 no mesoderma. Portan-
to, a indução normal dos genes mais 5’ Hox (que não pode ser feita por Shh sozinha)
é feita por uma combinação de BMP2 e FGF4.
Isso cria uma situação interessante porque Sonic hedgehog e FGF4 se ativam
mutuamente. A Sonic hedgehog ativa a expressão do gene Fgf4 na região posterior da
AER (veja Figura 18.9), enquanto a expressão de Fgf4 é necessária para a expressão
normal do gene sonic hedgehog. (Tal relação foi sugerida pelos estudos de Todt e
Fallon, 1987, mostrando que a AER era necessária para a função da ZPA). Existe,
então, uma alça de retroativação positiva onde a Sonic hedgehog do mesoderma
posterior ativa o Fgf4 na AER, e o FGF4 (provavelmente em conjunto com o FGF8) da
AER mantém a expressão de sonic hedgehog (veja Figura 18.28; Laufer et al., 1994;
Niswander et al., 1994).
Especificando a ZPA
ZPA
Ainda não sabemos o que causa a ativação dos genes sonic hedgehog, especifica-
mente nas células do broto do membro posterior e não nas células mais anteriores. É
possível que o gene sonic hedgehog esteja sendo ativado por uma proteína FGF
oriunda da crista ectodérmica apical, recentemente formada, e FGF8 estando presente
na AER é capaz de ativar sonic hedgehog. Mas por que não há ativação de todas as
células mesenquimatosas abaixo da crista? A resposta pode estar na diferente compe-
tência de certas células mesenquimatosas em responder ao sinal de FGF. Charité e
colegas (1994) sugeriram que a proteína Hoxb-8 pode ser crítica no fornecimento
dessa competência restrita. Eles observaram que o gene Hoxb-8 era geralmente ex-
presso na metade posterior do broto do membro anterior do camundongo. Então, eles
produziram camundongos transgênicos nos quais o gene Hoxb-8 estava sob o con-
trole de um novo promotor que causava sua expressão em todos os brotos de mem-
bros anteriores. Isso resultou na expressão de sonic hedgehog na porção anterior dos
brotos dos membros, a criação de uma nova ZPA, uma nova região de expressão de
genes HoxD e duplicações de membros anteriores como imagens espelhares. Essa
evidência sugere que a proteína Hoxb-8 está envolvida na especificação da expressão
de sonic hedgehog e portanto no estabelecimento da ZPA.
A produção do eixo dorsoventral

O terceiro eixo do membro define sua parte dorsal (nós dos dedos, unhas) e sua
parte ventral (palmas e solas). Em 1974, MacCabe e colaboradores demonstraram que
a polaridade dorsoventral do broto do membro é determinada pelo seu envolvimento
pelo ectoderma. Se o ectoderma gira 180o em relação ao mesênquima do broto do
membro, o eixo dorsoventral é parcialmente revertido; os elementos distais (dígitos)
estão de “cabeça para baixo”. Isso sugeriu que a especificação tardia do eixo dorso-
ventral do membro é regulada pelo seu componente ectodérmico. O gene Wnt7a é
expresso no ectoderma dorsal (mas não no ventral) dos brotos de membros do pinto e
do camundongo (Deally, 1993; Parr et al., 1993). In 1995, Parr e MacMahon deletaram
geneticamente o Wnt7a do embrião do camundongo. Os embriões resultantes tinham
(A) (B)
Figura 18.29
Transformações dorsal-para-ventral de regiões do membro em camundongos deficientes de
ambos os genes Wnt7a. (A) Secção histológica (corada com hematoxilina e eosina) da pata do
membro anterior em embrião de camundongo de 15.5 dias. Os tendões ventrais e as almofadas
ventrais dos pés são facilmente vistas. (B) A mesma seção através de um embrião mutante
deficiente em Wnt7a. Tendões e almofadas dos pés estão agora duplicados no que seria a face
dorsal da pata. dt, tendões dorsais; dp almofada dorsal do pé; vp, almofada ventral do pé; vt,
tendão ventral. Os números indicam identidade dos dígitos. (de Parr e McMahon, 1995;
fotografias cortesia dos autores.)
solas em ambas as superfícies de suas patas, mostrando que a Wnt7a era necessária
para a padronização dorsal do membro (Figura 18.29). A Wnt7a induz o gene Lmx1 no
mesênquima dorsal, e esse gene codifica um fator de transcrição que parece ser essen-
cial para a especificação do destino das células dorsais no membro (Riddle et al., 1995;
Vogel et al., 1995). Se esse fator é expresso nas células do mesênquima ventral, elas
desenvolvem um fenótipo dorsal.
Os camundongos deficientes em Wnt7a também não tinham dígitos posteriores,
sugerindo que o Wnt7a também era necessário para o eixo ântero-posterior. Yang e
Niswander (1995) fizeram observações similares no embrião de pinto. Esses pesqui-
sadores removeram o ectoderma dorsal do membro em desenvolvimento e observa-
ram que esse procedimento resultou na perda dos elementos esqueléticos posterio-
res dos membros. Esses membros não tinham dígitos posteriores porque a expres-
são de sonic hedgehog e Fgf4 estavam faltando. A expressão de Wnt7a induzida por
vírus podia substituir o ectoderma dorsal e restaurar a expressão de sonic hedgehog
e o padrão posterior. A síntese de Sonic hedgehog é estimulada pela combinação
das proteínas Wnt7a e FGF4. Os três eixos do embrião de pinto são todos inter-
relacionados e coordenados.
Distinguindo o membro anterior do membro posterior

Até agora, tratamos os membros anteriores e os posteriores como se fossem os mes-
mos. Realmente, ele seguem as mesmas regras da formação do padrão. Mas seus
padrões são diferentes. Um pé não é uma mão, e uma perna de pinto certamente não é
uma asa. Então, como eles se tornam diferentes? Parece que as células da precartilagem
da asa e da perna do pinto respondem de maneira muito diferente aos fatores de
crescimento, e isso faz com que se associem umas as outras e se diferenciem de
diferentes maneiras (Downie e Newman, 1994). Em culturas de células embrionárias, o
ácido retinóico aumenta a condrogênese no mesênquima da asa e inibe a condrogênese
no mesênquima da perna. O TGF-β1 converte nódulos formadores da cartilagem da
perna em camadas, mas não tem efeito nos nódulos cartilaginosos da asa exceto para
promover a condrogênese. As células da precartilagem da asa produzem um padrão
diferente de fibronectina daquele produzido pelas células correspondentes da cartila-
gem da perna (Figura 18.30).
Asa
Perna
Soro TGF−β Ácido retinóico Rede de fibronectina
Figura 18.30
Resposta diferencial de células da precartilagem da asa e da perna (estágio24) a fatores
morfogenéticos específicos. Fotografias das células em soro, TGF-β e ácido retinóico são
fotografias macroscópicas de colônias de células. As fotografias das redes de fibronectina
depositadas pelas células são fotomicrografias fluorescentes em aumento de 40x. (de Downie
e Newman, 1994.)
Essa deposição variada de fibronectina pode ser muito importante consideran-

do as diferenças entre a perna e a asa. A localização, temporalidade e arquitetura
na deposição de cartilagem em culturas de tecido do broto do membro são estrita-
mente paralelas à deposição de fibronectina. Em culturas de asa, as condensações
de cartilagem eram amplas e planas; em culturas de perna, elas eram compactas e
esferoidais. Em ambos os casos, a deposição de cartilagem era paralela à localiza-
ção da fibronectina (Downie e Newman, 1995). Portanto, existem diferenças ine-
rentes entre as células mesenquimatosas precartilaginosas nos membros anterio-
res e posteriores, e que são responsáveis pelas respostas diferentes aos fatores
de crescimento e pela diferente deposição de fibronectina. A disposição de
fibronectina é crítica no direcionamento da colocação e extensão da condrogênese.
O mecanismo pelo qual se dá a formação e bifurcação da cartilagem para formar o
esqueleto do membro é assunto de grande interesse. [limb4.html]
Recentemente foi demonstrada a expressão diferenciada de pares relacionados de
fatores de transcrição em brotos de membros anteriores e posteriores. No pinto, Hoxc-
4 e Hocx-5 são expressos nos brotos das asas, enquanto que Hocx-9, Hocx-10 e
Hocx-11 são expressos exclusivamente nos brotos das pernas (Nelson et al., 1996). O
gene tbx5 semelhante ao Brachyury é transcrito nos membros anteriores do camun-
dongo, enquanto o gene estreitamento relacionado, o tbx4 é expresso nos membros
posteriores (Gibson-Brown et al., 1996). Ainda tem que ser verificado se qualquer um
desses genes é causalmente envolvido ao direcionar a especificação para membros
anteriores ou membros posteriores*. Entretanto, a perda de TBX5 humana resulta na
síndrome de Holt-Oram, caracterizada por anormalidades do coração e membros supe-
riores (Basson et al., 1996; Li et al., 1996). As pernas não são afetadas.
*Quando se refere à mão tem-se um conjunto ordenado de nomes para especificar cada dígito
(Digitus pollicis, d. indicis, d. medius, d. annularis e d. minimus, respectivamente do polegar ao
dedo mínimo). Não existe tal nomenclatura para os dígitos do pé, mas o plano proposto por Phillips
(1991) tem muito mérito. Os dígitos do pé, desde o hálux até o dedinho, seriam chamados porcellus
fori, p. domi, p. carnivorus, p. non voratus e p. plorans domi, respectivamente.
& Especulações
Lições de limbless
C OMO JÁ MENCIONADO, o mu-

tante limbless pode formar bro-
tos de membros, mas esses bro-
tos regridem porque não forma uma
Em primeiro lugar, o broto do membro
limbless não expressa nem FGF4 nem
FGF8, implicando que essas proteínas não
são necessárias para o brotamento nor-
sência da AER. Interessantemente, o mem-
bro formado é bi-dorsal, expressando Wnt7a
em todo o ectoderma. Isso levanta a possi-
bilidade de que a indução da AER necessita
AER. Estudos recentes sobre a expres- mal. Segundo, o mesoderma do limbless de uma interface ectodérmica dorsoventral.
são gênica nesse mutante mostra que o expressa os genes Hoxd-11 a Hoxd-13 de O mutante limbless também sugere a
brotamento do membro é acompanhado forma aninhada posteriormente, junto com possibilidade de que o mesoderma da placa
por padrões “normais” de expressão a expressão assimétrica de BMP4 e Wnt5a. lateral já tem a habilidade para expressar os
gênica que não são estabelecidos pe- Isso se dá na ausência de expressão genes padronizadores ântero-posterior e
los três centros de sinalização. Esses detectável de sonic hedgehog ou de uma próximo-distal, e que esse pré-padrão é sub-
dados sugerem que os padrões de ex- AER (Grieshammer et al., 1996; Noramly seqüentemente estabilizado, mantido ou
pressão gênica, normalmente associa- et al., 1996; Ros et al., 1996). aumentado pela AER e Sonic hedgehog. O
dos ao desenvolvimento do membro A análise experimental do broto do mem- membro é um órgão complicado e pesquisa
tetrápode, teriam se dado de qualquer bro de limbless revela que esse formará atual o faz parecer ainda mais complexo. A
maneira e representam um “pré-padrão” AERs e membros se receber partículas análise do desenvolvimento do membro
que dirige o desenvolvimento desse secretando FGFs. Mais ainda, essas partí- tetrápode deu aos biologistas alguns dos
membro (Ros et al., 1996). Os centros culas induzem Sonic hedgehog na região maiores sucessos no entendimento do de-
sinalizadores somente reforçam e supor- posterior, mostrando que existe uma polari- senvolvimento, mas também tem levantado
tam esse padrão. dade no broto do membro, mesmo em au- alguns dos nossos maiores desafios.
Morte celular e a formação de dígitos

A morte celular também tem uma função na escultura do membro. Na verdade é essen-
cial para a formação de juntas e para a separação dos dedos (Zaleske, 1985). A morte
(ou a falta de morte) em células específicas do membro de vertebrados é geneticamen-
te programada e foi selecionada durante a evolução. Um dos casos envolve a forma-
ção ou não da membrana interdigital nos pés. A diferença entre um pé de galinha e um
de pato envolve a presença ou ausência de morte celular entre os dígitos (Figura
18.31A,B). Saunders e colaboradores (1962; Saunders e Fallon, 1966) mostraram que
na galinha, após certo estágio, as células entre a cartilagem dos dígitos estão destina-
das a morrer e o farão mesmo que transplantadas a outra região do embrião ou coloca-
das em cultura. Entretanto, se antes desse estágio forem transplantadas para um
membro de pato elas serão salvas. Entre a época em que a morte celular é determinada
e quando ela realmente se dá, os níveis de DNA, RNA e síntese de proteínas decres-
cem dramaticamente (Pollack e Fallon, 1976).
Além da zona necrótica interdigital, existem três outras regiões que são “escul-
pidas” pela morte celular. O cúbito e o rádio são separados entre si por uma zona
necrótica interior, e duas outras regiões, as zonas necróticas anterior e posterior,
acabam a modelagem do fim do membro (Figura 18.31B; Saunders e Fallon, 1966).
Apesar dessas zonas serem chamadas “necróticas”, isso é uma herança da época
quando não se distinguia entre morte celular “necrótica” e morte celular “apoptótica”.
Essas células morrem por apoptose, e a morte do tecido interdigital está associada à
fragmentação de DNA (Mori et al., 1995). Em humanos, existem várias síndromes
caracterizadas por dedos ligados (síndromes “sindáctilas”), mas a mutação respon-
sável é conhecida somente em um situação (Vortkamp et al., 1991; Hui e Joyner,
1993), na qual o gene codifica um fator de transcrição que é expresso no mesênqui-
ma interdigital. O sinal para apoptose em membros de pinto pode ser a proteína
BMP4. A expressão de BMP4 é observada nos espaços interdigitais em membros de
(A) PRIMÓRDIO DA PERNA DO PATO

Morte celular mínima
Zona
necrótica
interior
(B) PRIMÓRDIO DA PERNA DO PINTO

Morte celular extensa
Zona necrótica
interdigital
Zona Zona
necrótica necrótica
anterior posterior
Zona
necrótica
interior
(C) Expressão gênica em regiões da perna do

embrião de pinto antes da morte celular
Receptor β de CRBP msx-1

ácido retinóico
Figura 18.31
Padrões de morte celular em primórdios de pernas de embriões de (A) pato e (B,C) de pinto.
Sombreamento indica áreas de morte celular. No pato, a morte celular é mínima, enquanto que
existem regiões de extensa morte celular no tecido interdigital da perna do pinto (De acordo com
Saunders e Fallon, 1966.)
pinto, e a inibição da sinalização de BMP4 impede a apoptose em células interdigitais.

É interessante considerar que essa expressão de BMP não é vista nessa fase no
mesênquima interdigital embrionário do pato (Gañan et al., 1996; Zou e Niswander,
1996; veja Capítulo 23).
Os membros têm sido uma pedra fundamental no estudo da produção de padrões
em vertebrados. Isso se origina de numerosos processos inter-relacionados que en-
volvem a disposição e crescimento do broto do membro, a indução da AER, a manu-
tenção do mesênquima da zona progressiva, a formação e manutenção mútua de ZPA
e AER, a formação do eixo dorsoventral, a geração de condensações precartilaginosas
do mesênquima que formarão os tecidos cartilaginoso e ósseo, e a imposição de
assimetria ao broto do membro pela ZPA. Ainda existem animados debates em relação
aos mecanismos desses processos e considerável controvérsia sobre as moléculas
que poderiam regular tais fenômenos.
& Especulações
Evolução do membro tetrápode

Sobre nadadeiras e membros (A) Perna do pinto (B) Peixe (Danio) (como previamente se acreditava) através
Macroevolução, a produção de novidades do quarto dígito (produzindo os raios da
morfológicas na evolução de novas espé- nadadeira homólogos aos outros dígitos),
cies e grupos taxonômicos mais altos, re- mas através de um arco de condensações
sulta de alterações do desenvolvimento. distais de punho (metapterígio) que co-
Algumas das mais importantes modifica- Estágio 21 meçam posteriormente e se dirigem ante-
ções macroevolucionárias resultaram da Mesên- riormente através do mesênquima distal
quima
transição de animais aquáticos para terres- Mesên- (Figura 18.33). Portanto, a borda de ex-
tres. Uma das mudanças mais óbvias foi a quima pressão do gene 5’ HoxD segue o eixo
da nadadeira do peixe para a perna do anfí- Dobra ectodérmica metapterígio que Shubin e Alberch
apical da nadadeira
bio. Como apontado por Richard Owen hipotetizaram como sendo a origem dos
(1849) existe uma considerável homologia dígitos. Sordino e colegas propuseram
entre os ossos da nadadeira e do membro que a localização proximal dos transcritos
tetrápode, sendo as nadadeiras peitorais e do gene HoxD representa o padrão origi-
pélvicas do peixe homólogas aos membros nal e é comum a todos os vertebrados. A
anterior e posterior, respectivamente. Foi fase reorientada, distal, da expressão do
possível fazer homologias específicas en- Estágio 26 gene HoxD representa uma condição nova
tre os elementos proximais da nadadeira e e “derivada”. Isso, por sua vez, pode ter
do membro (zeugópode; tíbia e fíbula), mas Figura 18.32 evoluído em resposta às modificações na
as homologias entre o autópode do mem- Diferenças na expressão de Hoxd-11 em apên- regulação dos genes 5’ HoxD. O padrão
bro (a mão ou o pé na ponta distal) e os dices embrionários nos peixes e no pinto. (A) precoce de HoxD é formado independen-
raios da nadadeira não se consolidaram. Regiões de expressão de Hoxd-11 no membro temente de Sonic hedgehog, mas o pa-
posterior do camundongo desde o estágio de
Isso era verdade mesmo ao se comparar o broto precoce até um estágio mais tardio. Du- drão de expressão distalizado pode ser
membro tetrápode às nadadeiras dos pei- rante os estágios mais tardios, o padrão de ex-
xes crossopterígios (nadadeiras lobulares), pressão de Hoxd-11 atravessa a borda ântero-
considerados como estreitamente relacio- posterior da zona progressiva. (B) Na nadadei-
nados aos ancestrais dos anfíbios (veja ra peitoral do peixe zebra, Hoxd-11 continua a
ser expresso posteriormente, mas não se esten-
Coates, 1994; Hinchliffe, 1994). O proble- de anteriormente. hpf, horas após a fertilização
ma fica mais vexatório quando se observa (De acordo com Sordino et al., 1995.)
os membros dos primeiros tetrápodes co-
nhecidos. Em lugar de ter cinco dígitos restritos à extremidade posterior do broto
canônicos, esses anfíbios primitivos tido membro. Algo semelhante ocorre no
nham seis (Turlepedon), sete (Ichthyoste- broto da nadadeira do peixe zebra (Figura
(A) (B) (C)
ga), ou mesmo oito (Acanthostega) dígi- 18.32). Entretanto, nos tetrápodes, existe
tos em seus membros. Esses membros não uma segunda fase onde muda a expres- Figura 18.33 Origem dos dígitos (autópodos)
possuem raios semelhantes às nadadeiras são dos genes HoxD semelhantes a Abd. como uma novidade evolucionária dependente
associadas a eles, e considera-se que fun- Em lugar de ficar restrita ao posterior do da expressão 5’ do gene HoxD (semelhante a
AbdB). (A) Representação de uma nadadeira
cionavam mais como remos em poças ra- broto do membro, a expressão dos genes primitiva de peixe, mostrando um eixo central
sas de água do que como suporte do peso 5’ HoxD perpassa o mesênquima distal, (preto) com raios irradiando anteriormente (cin-
do corpo em terra. Novamente, apesar da logo abaixo da AER. Essa banda de ex- za claro) e posteriormente (cinza escuro). (B)
homologia para os elementos proximais do pressão é coincidente como o “arco digi- Representação da hipótese mais antiga do de-
membro, o autópode parece algo novo- o tal” do qual se formam os dígitos (Morgan senvolvimento do membro tetrápode. O eixo
central está curvado através do quarto dígito. O
que os biologistas evolucionários chamam e Tabin, 1994; Sordino et al., 1995; Nelson quinto dígito era considerado homólogo a um
de estrutura “neomórfica”. et al., 1996). Esses estudos mostram que raio posterior; o primeiro, segundo e terceiro
Estudos recentes fortemente sugeri- enquanto o padrão de expressão do gene dígitos eram considerados homólogos aos raios
ram que a localização do terminal 5’ (se- HoxD é homólogo nas regiões proximais, anteriores. (C) Visão atual da formação autópode.
melhante a Abd) dos genes Hox do grupo a expressão no mesênquima distal do bro- O eixo originalmente se estende posteriormente,
HoxD pode ser crucial na troca de nada- e em seguida se dobra anteriormente através da
to tardio é nova. Isso também confirma os
cartilagem metapterígia. Considera-se que a tí-
deiras para membros. Nos brotos de mem- estudos paleonto-desenvolvimentais de bia se ramifica anteriormente mas os dígitos não
bros precoces de pintos e de camundon- Shubin e Alberch (1986), que propuseram são homólogos aos raios. (De acordo com Nel-
go, os genes 5’ (Hoxd-11, 12, 13) estão que a via de formação dos dígitos não era son e Tabin,1995.)
governado pela expressão de Sonic hed- Expressão experimental de hedgehog

gehog. O pé e a mão parecem ser novas Desenvolvimento normal
no primórdio do membro anterior
estruturas na evolução, e é provável que
tenham sido formados por um reposicio-
Pinto Broto do
namento da expressão do gene HoxD du- membro
rante o desenvolvimento da nadadeira. É
desnecessário enfatizar que essa não é a Membro
única modificação que ocorreu na cria- Expressão embrionário
ção dos dígitos. Outros genes Hox e de shh
provavelmente sonic hedgehog muda- Expressão de hh
ram também seu padrão de expressão. Drosophila
Estamos chegando a um ponto na biolo-
gia onde mudanças na expressão gênica
podem ser relacionadas às grandes vari-
ações evolucionárias.
Disco Asa
Sobre pernas de moscas e imaginal da asa adulta
pernas de galinha
Evolução envolve modificação com des- Figura 18.34

cendência. Isso foi freqüentemente do- Homologia de processos de formação dos eixos ântero-posterior em Drosophila e apêndices em
pinto. (A) Um broto de membro do pinto expressa sonic hedgehog na sua região posterior. Se
cumentado com homologias. A nadadei-
sonic hedehog também for expresso em uma região anterior, o membro em desenvolvimento
ra de uma foca, a asa de um morcego, o
desenvolve uma duplicação que é a imagem espelhar do eixo ântero-posterior. (B) Um disco da
braço de um esquilo e o braço de um ho- asa da Drosophila expressa hedgehog no seu compartimento posterior. Se hedgehog também for
mem são todos baseados em um mesmo expresso em um compartimento anterior, a asa desenvolve uma duplicação que é a imagem
“plano” homólogo, mas com modifica- especular do eixo ântero-posterior. (De acordo com Ingham, 1994.)
ções. Cada um é uma modificação dife-
rente do plano de membros reptilianos,
que é por sua vez homólogo ao dos ver-
tebrados. Uma das mais importantes des- consideradas como derivadas de uma durante a metamorfose), a proteína Hed-
cobertas da moderna biologia do desen- mesma estrutura. gehog é usualmente expressa na porção
volvimento está relacionada à homologia Membros de moscas e membros de posterior do disco. Se for expressa anteri-
de processos e estruturas. Como vere- vertebrados têm pouco em comum a não ormente surgirão duplicações que são
mos no Capítulo 23, certas vias de de- ser sua função. Entretanto, ambos os imagens espelhares da asa (Figura 18.34;
senvolvimento e interações foram con- membros do vertebrado e da mosca pare- Basler e Struhl, 1993; Ingham, 1994).
servadas durante o tempo da evolução e cem ser formados através da mesma via Além disso, certos genes regulados por
foram modificadas por diferentes grupos de desenvolvimento. (Parece haver uma Hedgehog também foram conservados
animais. Isso pode ser visto com o de- homologia de processos subjacente à (Marigo et al., 1996), e os compartimentos
senvolvimento do membro. Membros de analogia de estruturas). Como vimos, ventrais dos membros de insetos e verte-
mosca e membros de vertebrados são sonic hedgehog é usualmente expresso brados parecem ser regulados pela expres-
exemplos familiares de analogia (como o na parte posterior do broto do membro. são do gene engrailed (Davis et al., 1991;
oposto da homologia). Onde estruturas Se for expresso na parte anterior do bro- Loomis et al., 1996). Assim, parece que a
homólogas são vistas como modificações to, aparecem duplicações que são imagens natureza descobriu como produzir um mem-
de uma estrutura original e podem agora espelhares (Riddle et al., 1993). bro somente uma vez, e ambos artrópodos
ter diferentes funções, as estruturas aná- No disco da asa da Drosophila (o (Drosophila) e vertebrados (galinhas e ca-
logas têm a mesma função mas não são campo de células que dá origem a asa mundongos) usam esse processo até hoje.
LITERATURA CITADA
Albert, P. and Boilly, B. 1988. Effect of FGF8 in the induction, initiation, and mainte- Francis, P. H., Richardson, M. K., Brickell, P.
transferrin on amphibian limb regeneration: A nance of chick Development of the tetrapod M. and Tickle, C. 1994. Bone morphogenesis
blastema cell culture study. Roux Arch. Dev. Biol. limb. Cell 84: 127-136. proteins and a signalling pathway that controls
197: 193-196. patterning in developing chick limb. Develop-
Davis, A. P., Witte, D. P., Hsieh-Li, H. M.,
ment 120: 209-218.
Basler, K. and Struhl. G. 1993. Compartment boun- Potter, S. and Capecchi, M. R. 1995. Absence of
daries and the control of Drosophila limb pattern radius and ulna in mice lacking hoxa-11 and hoxd- Fraser, R. A. and Abbott, U. K. 1971. Studies on
by hedgehog protein. Nature 368: 208-214. 11. Nature 375-791-795. limb morphogenesis VI. Experiments with early
stages of the polydactylous mutant Eudiplopo-
Basson, C. T., and thirteen others. 1996. Davis, C. A., Holmyard, D. P., Millen, K. J. and
dia. J. Exp. Zool. 176: 237-248.
Mutations in human TBX5 cause limb and Joyner, A. L. 1991. Examining pattern formation
cardiac malformation in Holt-Oram syndrome. in mouse, chicken and frog embryos with an En- Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquil-laud, M.,
Nat. Genet. 15: 30-35. specific antiserum. Development 111: 287-298. Ros, M. A. and Hurle, J. M. 1996. Role of TGF-
bs and BMPs as signals controlling the position
Brockes, J. P. 1992. Introduction of a retinoid Dealy, C. N., Roth, A., Ferrari, D., Brown, A. M.
of the digits and the areas of interdigital cell
reporter gene into the urodele limb blastema. C. and Kosher, R. A. 1993. Wnt-5a and Wnt-7a
death in the developing chick autopod. Deve-
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11386-11390. are expressed in the developing chick limb bud
lopment 122: 2349-2357.
in a manner that suggests roles in pattern for-
Brockes, J. P. and Kinter, C. R. 1986. Glial growth
mation along the proximodistal and dorsoven- Gardiner, D. M., Blumberg, B., Konine, Y. and
factor and nerve-dependent proliferation in the
tral axes. Mech. Dev. 43: 175-186. Bryant, S. V. 1995. Regulation of HoxA expres-
regeneration blastema of urodele amphibians.
sion in developing and regenerating axolotl limbs.
Cell 45: 301-306. De Robertis, E. M., Morita, E. A. and Cho, K.
W. Y. 1991. Gradient fields and homeobox genes.
Bryant, S. V. and Gardiner, D. M. 1992. Retinoic
Development 112: 669-678. Geduspan, J. S. and Solursh, M. 1992. A growth-
acid, local cell-cell interactions, and pattern for-
promoting influence from the mesonephros
mation in vertebrate limbs. Dev. Biol. 152: 1-25. Detwiler, S. R. 1918. Experiments on the deve-
during limb outgrowth. Dev. Biol. 151: 242-250.
lopment of the shoulder girdle and the anterior
Bryant, S. V., French V. and Bryant, P. J. 1981.
limb of Amblystoma punctatum. J. Exp. Zool. Gibson-Brown, J. J., Agulnik, S. I., Chapman, D.
Distal regeneration and symmetry. Science 21:
25: 499-538. L., Alexiou, M., Garvey, N., Silver, L. M. and
993-1002.
Papaioannou, V. E. 1996. Evi-dence of a role
Dollé, P., Izpisúa-Belmonte, J.-C., Falkenstein,
Burke, A. C., Nelson, C. E., Morgan, B. A. and for T-box genes in the evo-lution of limb mor-
H., Renucci, A. and Duboule, D. 1989. Coordinate
Tabin, C. 1995. Hox genes and the evolution of phogenesis and the spec-ification of forelimb/
expression of the murine Hox-5 complex
vertebrate axial morphology. Development 121: hindlimb identity. Mech. Dev. 56: 93-101.
homeobox-containing genes during limb pattern
333-346.
formation. Nature 342: 767-772. Goetinck, P. 1964. Studies on limb morphoge-
Butler, E. G. 1935. Studies on limb regeneration nesis. III. Experiments with the polydactylous
Downie, S. A. and Newman, S. A. 1994. Mor-
in X-rayed Ambystoma larvae. Anat. Rec. 62: mutant Eudiplopodia. Dev. Biol. 10: 71-91.
phogenetic differences between fore and hind
295-307.
limb precartilage mesenchyme: Relation to Goss, R. J. 1969. Principles of Regeneration.
Carrington, J. L. and Fallon, J. F. 1988. Initial mechanisms of skeletal pattern formation. Dev. Academic Press, New York.
limb budding is independent of apical ectodermal Biol. 162: 195-208.
Goss, R. J. 1991. The natural history (and mystery)
ridge activity: Evidence from a limbless mutant.
Downie, S. A. and Newman, S.A. 1995. Different of regeneration. In C. E. Dinsmore (ed.), A History
roles for fibronectin in the generation of fore of Regeneration Research. Cambridge Universi-
Charité, J., Graaff, W. de, Shen, S. and Duchamps, and hind limb precartilage condensations. Dev. ty Press, New York, pp. 7-23.
J. 1994. Ectopic expression of Hoxb-8 causes Biol. 172: 519-530.
Grieshammer, U., Minowada, G., Pisenti, J. M.,
duplications of the ZPA in the forelimb and
Duprez, D. M., Kostakopoulou, K., Francis- Abbott, U. and Martin, G. R. 1996. The limbless
homeotic transformation of axial structures. Cell
West, P. H., Tickle, C. and Brickell, P. M. 1996. mutation causes abnormalities in limb dorsal
78: 559-601.
Activation of Fgf-4 and HoxD gene expression ventral patterning implication for the mecha-
Chernoff, E. A. G. and Stocum, D. 1995. Deve- by BMP-2 expressing cells in the developing nism of apical ridge formation. Development
lopmental aspects of spinal cord and limb rege- chick limb. Development 122: 1821-1828. 122: 3851-3861.
neration. Dev. Growth Diff. 37: 133-147.
Eichele, G. 1989. Retinoic acid induces a pattern Hamburger, V. 1938. Morphogenetic and axial
Coates, M. I. 1994. The origin of vertebrate of digits in anterior half wing buds that lack the self-differentiation of transplanted limb
limbs. Development 1994 Suppl. 169-180. zone of polarizing activity. Development 107: primordia of 2-day chick embryos. J. Exp. Zool
863-867. 77: 379-400.
Crawford, K. and Stocum, D. L. 1988a. Retinoic
acid coordinately proximalizes regenerate pattern Fallon, J. F. and Crosby, G. M. 1977. Polarizing Hayashi, K. and Ozawa, E. 1995. Myogenic cell
and blastema differential affinity in axolotl limbs. zone activity in limb buds of amniotes. In D. A. migration from somites is induced by tissue
Development 102: 687-698. Ede, J. R. Hinchliffe and M. Balls (eds.), Vertebrate contact with medial region of the presumptive
Limb and Somite Morphogenesis. Cambridge limb mesoderm in chick embryos. Development
Crawford, K. and Stocum, D. L. 1988b. Retinoic University Press, Cambridge. 121: 661-669.
acid proximalizes level-specific properties
responsible for intercalary regeneration in Fallon, J. F., Lopez, A., Ros, M. A., Savage, M. Harrison, R. G. 1918. Experiments on the deve-
axolotl limbs. Development 104: 703-712. P., Olwin, B. B. and Simandl, B. K. 1994. FGF-2: lopment of the forelimb of Amblystoma, a self-
Apical ectodermal ridge growth signal for chick differentiating equipotential system. J. Exp. Zool
Crossley, P. H., Monowada, G., MacArthur, C. Development of the tetrapod limb. Science 264: 25: 413-461.
A. and Martin, G. R. 1996. Roles for 104-107.
Helms, J. A., Kim, C. H., Eichele, G. and Thaller, Krabbenhoft, K. M. and Fallon, J F. 1989. The Molven, A., Wright, C. V. E., Bremiller, R., De
C. 1996. Retinoic acid signaling is required during formation of leg or wing specific structures by Robertis, E. M. and Kimmel, C. B. 1990. Ex-
early chick Development of the tetrapod limb. leg bud cells grafted to the wing bud is influenced pression of a homeobox gene product in normal
Development 122: 1385-1394. by proximity to the apical ridge. Dev. Biol. 131: and mutant zebrafish embryos: Evolution of the
373-382. tetrapod body plan. Development 109: 279-288.
Hertwig, O. 1925. Haploidkernige Transplante
als Organisatoran diploidkeniger Extremitaten Lande, R. 1978. Evolutionary mechanisms of Morgan, B. A. and Tabin, C. 1994. Develop-
be Triton. Anat. Anz. [Suppl.] 60: 112-118. limb loss in tetrapods. Evolution 32: 73-92. ment 1994 Suppl., p. 181-186.
Hinchliffe, J. R. 1991. Developmental approa- Laufer, E., Nelson, C. E., Johnson, R. L., Morgan, Mori, C., Nakamura, N., Kimura, S., Irie, H.,
ches to the problem of transformation of limb B. A. and Tabin, C. 1994. Sonic hedgehog and Takigawa, T. and Shiota, K. 1995. Programmed
structure in evolution. In J. R. Hinchliffe (ed.), Fgf-4 act through a signalling cascade and cell death in the interdigital tissue of the fetal
Developmental Patterning of the Vertebrate feedback loop to integrate growth and patterning mouse limb is apoptosis with DNA fragmentati-
Limb. Plenum, New York, pp. 313-323, of the developing limb bud. Cell 79: 993-1003. on. Anat. Rec. 242: 103-110.
Hinchliffe, J. R. 1994. Evolutionary biology of Laufer, E. and seven others. 1997. The Radical Mortlock, D. P., Post, L. C. and Innis, J. W.
the tetrapod limb. Development 1994 Suppl. fringe expression boundary in the limb bud ectoderm 1996. The molecular basis of hypodactyly (Hd):
163-168. regulates AER formation. Nature. 386: 366-367. a deletion in Hoxa13 leads to arrest of digital
arch formation. Nat. Genet. 13: 284-289.
Hinchliffe, J. R. and Sansom, A. 1985. The dis- Li, Q. Y. and sixteen others. 1996. Holt-Oram
tribution of the polarizing zone (ZPA) in the syndrome is casued by mutations in TBX5, a Mullen, L. M., Bryant, S.V., Torok, M. A.,
legbud of the chick embryo. J. Embryol. Exp. member of the Brachyury (T) gene family. Nat. Blumberg, B. and Gardiner, D. M. 1996. Nerve
Morphol. 86: 169-175. Genet. 15: 21-29. dependency of regeneration: the role of Distal-
less and FGF signaling in amphibian limb rege-
Hogan, B. L. M., Thaller, Thaller, C. and Eichele, Loomis, C. A., Harris, E., Michaud, J. Wurst, J.,
neration. Development. 122: 3487-3497.
G. 1992. Evidence that Hensen’s node is a source Hanks, W. and Joyner, A. L. 1996. The mouse
of retinoic acid synthesis. Nature 359: 237-241. Engrailed-1 gene and ventral limb patterning. Müller, G., Streicher, J. and Müller, R. 1996.
Nature 382: 360-363. Homeotic duplicate of the pelvic body segment
Honig, L. S. and Summerbell, D. 1985. Maps of
in regenerating tadpole tails induced by retinoic
strength of positional signaling activity in the López-Martínez, A. and seven others. 1995.
acid. Dev. Genes Evol. 206: 344-348.
developing chick wing bud. J. Embryol. Exp. Limb-patterning activity and restricted posteri-
Morphol. 87: 163-174. or localization of the amino-terminal product of Munaim, S. I. and Mescher, A. L. 1986.
sonic hedgehog cleavage. Curr. Biol. 5: 791-796. Transferrin and the trophic effect of neural tissue
Hui, C.-C. and Joyner, A. L. 1993. A mouse
on amphibian limb reneration blastemas. Dev.
model of Grieg cephalopolysyndactyly MacCabe, J. A., Errick, J. and Saunders, J. W. Jr.
Biol. 116: 138-142.
syndrome: the extra-toes mutation contains an 1974. Ectodermal control of dorso-ventral axis
intragenic deletion of the Gli3 gene. Nat. Genet. in leg bud of chick embryo. Dev. Biol. 39: 69-82. Muneoka, K. and Bryant, S. V. 1982. Evidence
3: 241-246. that patterning mechanisms in developing and
Maden, M. 1982. Vitamin A and pattern formati-
regenerating limbs are the same. Nature 298:
Hurle, J. M., Gañan, Y. and Macias, D. 1989. on of the regenerating limb. Nature 295: 672-675.
369-371.
Experimental analysis of the in vivo chondro-
Maden, M. 1993. The homeotic transformation
genic potential of the interdigital mesenchyme Muragaki, Y., Mundlos, S., Upton, J. and Olsen,
of tails into limbs in Rana temporaria by
of the chick limb bud subjected to local B. 1996. Altered growth and branching patterns
retinoids. Dev. Biol. 159: 379-391.
ectodermal removal. Dev. Biol. 132: 368-374. in synpolydactyly caused by mutations in
Mahmood, R. and nine others. 1995. A role for HOXD13. Science 272: 548-551.
Huxley, J. S. and De Beer, G. R. 1934. The
FGF-8 in the initiation and maintenance of
Elements of Experimental Embryology. Cam- Nardi, J. B. and Stocum, D. L. 1983. Surface
vertebrate limb outgrowth. Curr. Biol. 5: 797-806.
bridge University Press, Cambridge. properties of regenerating limb cell: Evidence
Marigo, V., Johnson, R. L., Vortkamp, A., and for gradation along the proximodis-tal axis. Di-
Ingham, P. W. 1994. Hedgehog points the way.
Tabin, C. J. 1996. Sonic hedgehog differentially fferentiation 25: 27-31.
Curr. Biol. 4: 345-350.
regulates expression of GLI and GLI3 during
Nelson, C. E. and Tabin, C. 1995. Footnote on
Iten, L. E. 1982. Pattern specification and Development of the tetrapod limb. Develop-
limb evolution. Nature 375: 630-631.
pattern regulation in the embryonic chick limb ment 180: 273-283.
bud. Am. Zool. 22:117-129. Nelson, C. E. and nine others. 1996. Analysis of
Meinhardt, H. 1984. Models for positioning
Hox gene expression in the chick limb bud. De-
Izpisúa-Belmonte, J.-C, Tickle, C., Dollé, P., signaling, the threefold subdivision of segments
velopment 122: 1449-1466.
Wolpert, L. and Duboule, D. 1991. Expression and the pigmentation pattern of molluscs. J
of the homeobox Hox-4 genes and the Embryol. Exp. Morphol. 83 Suppl.: 289-311. Newman, S. A. 1996. Sticky fingers: Hox genes
specification of position in chick wing develop- and cell adhesion in vertebrate Development of
Mescher, A. L. 1992. Trophic activity of
ment. Nature 350: 585-589. the tetrapod limb. BioEssays 18:171-174.
regenerating peripheral nerves. Comments Dev.
Javois, L. C. and Iten, L. E. 1986. The hand- Neurobiol. 1: 373-390. Niazi, I. A. and Saxena, S. 1978. Abnormal
edness and origin of supernumerary limb struc- hindlimb regeneration in tadpoles of the toad
Mescher, A. L. and Tassava, R. A. 1975.
tures following 180° rotation of the chick limb Bufo andersonii exposed to excess vitamin A.
Denervation effects on DNA replication and
bud on its stump. J. Embryol. Exper. Morphol. Folia Biol. (Krakow) 26: 3-8.
mitosis during the initiation of limb regenerati-
91: 135-152.
on in adult newts. Dev. Biol. 44: 187-197. Niswander, L. and Martin, G. M. 1993. FGF-4
Kieny, M. 1960. Rôle inducteur du mésoderme and BMP-2 have opposite effects on limb
Mohanty-Hejmadi, P., Dutta, S. K. and
dans la différenciation précoce du bourgeon de growth. Nature 361: 68-71.
Mahapatra, P. 1992. Limbs generated at the site
membre chez 1’embryon de poulet. J. Embryol.
of tail amputation in marbled balloon frog after Niswander, L., Tickle, C., Vogel, A., Booth, I.
Exp. Morphol. 8: 457-467.
vitamin A treatment. Nature 355: 352-353. and Martin, G. R. 1993. FGF-4 replaces the
apical ectodermal ridge and directs outgrowth the apical ectodermal ridge at the dorsoventral logical structure and inductive specificity of limb
and patterning of the limb. Cell 75: 579-587. boundary of the vertebrate limb. Nature 386: parts of the chick. J. Morphol. 101: 57-88.
360-366.
Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R. and Saunders, J. W., Jr., Gasseling, M. T. and Saunders,
Tickle, C. 1994. A positive feedback loop Ros, M. A., Lopez-Martinez, A., Simandl, B. K., L.C. 1962. Cellular death in morphogenesis of
coordinates growth and patterning in the Rodriguez, C., Belmonte, J. C. I., Dahn, R. and the avian wing. Dev. Biol. 5: 147-178.
vertebrate limb. Nature 371: 609-612. Fallon, J. F. 1996. The limb field mesoderm de-
Savage, M. P. and Fallon, J. F. 1995. FGF-2 mRNA
termines initial limb bud anteroposterior
Nohno, T. and seven others. 1991. Involve- and its antisense message are expressed in a
asymmetry and budding independent of sonic
ment of the Chox-4 chicken homeobox genes developmentally specific manner in the chick limb
hedgehog or apical ectodermal gene expressions.
in determination of anteroposterior axial bud and mesonephros. Dev. Dyn. 202: 343-353.
polarity during Development of the tetrapod
Scadding, S. R. and Maden, M. 1994. Retinoic
limb. Cell 64: 1197-1205. Rose, S. M. 1962. Tissue-arc control of regene-
acid gradients during limb regeneration. Dev. Biol.
ration in the amphibian limb. In D. Rudnick (ed.),
Noji, S. and ten others. 1991. Retinoic acid 162: 608-617.
Regeneration. Ronald, New York, pp. 153-176.
induces polarizing activity but is unlikely to be
Sessions, S. and Ruth, S. B. 1990. Explanation
a morphogen in the chick limb bud. Nature Rosenquist, G. C. 1971. The origin and
for naturally occurring supernumary limbs in
350: 83-86. movement of the limb-bud epithelium and
amphibians. J. Exp. Zool. 254: 38-47.
mesenchyme in the chick embryo as determined
Noramly, S., Pisenti, J., Abbott, U. and Morgan,
by radioautographic mapping. J. Embryol. Exp. Sessions, S. K., Gardiner, D. M. and Bryant, S. V.
B. 1996. Gene expression in the limbless mutant:
Morphol. 25: 85-96. 1989. Compatible limb patterning mechanisms
Polarized gene expression in the absence of Shh
in urodeles and anurans. Dev. Biol. 131: 294-301.
and AER. Dev. Biol. 179: 339-346. Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M.
and Giguère, V. 1991. Expression of a retinoic Shen, R. Q., Chen, Y. P., Huang, L., Vitale, E.
Ogura, T., Alvarez, I. S., Vogel, A., Rodrigez, C.,
acid response element-hsplacZ transgene defi- and Solursh, M. 1994. Characterization of the
Evans, R. M. and Belmonte, J. C. I. 1996.
nes specific domains of transcriptional activity human msx-1 promoter and an enhancer
Evidence that Shh cooperates with a retinoic
during mouse embryo-genesis. Genes Dev. 5: responsible for retinoic acid induction. Cell. Mol.
acid inducible co-factor to establish ZPA-like
1333-1344. Biol. Res. 40: 297-312.
activity. Development 122: 537-542.
Rowe, D. A., Cairnes, J. M. and Fallon, J. F. Shubin, N. H. and Alberch, P. 1986. A mor-
Oliver, G., Wright, C. V. E., Hardwicke, J. and De
1982. Spatial and temporal patterns of cell death phogenetic approach to the origin and basic
Robertis, E. M. 1988. A gradient of homeodomain
in limb bud mesoderm after apical ectodermal organization of the tetrapod limb. Evol. Biol.
protein in developing forelimbs of Xenopus and
ridge removal. Dev. Biol. 93: 83-91. 20: 319-387.
mouse embryos. Cell 55: 1017-1024.
Rubin, L. and Saunders, J. W., Jr. 1972. Ec- Simon, H. G., Nelson, C., Goff, D., Laufer, E.,
Opitz, J. M. 1985. The developmental field
todermal-mesodermal interactions in the growth Morgan, B. A. and Tabin, C. 1995. The differential
concept. Am. J. Med. Genet. 21: 1-11.
of limbs in the chick embryo: Constancy and expression of myogenic regulatory genes and
Owen, R. 1849. On the Nature of Limbs. J. Van temporal limits of the ectodermal induction. Dev. msx-1 during dedifferentiation and redifferen-
Voor, London. Biol. 28: 94-112. tiation of regenerating amphibian limbs. Dev.
Dyn. 202: 1-12.
Parr, B. A. and McMahon, A. P. 1995. Saunders, J. W., Jr. 1948. The proximal-distal
Dorsalizing signal wnt-7a required for normal sequence of origin of the parts of the chick wing Singer, M. 1954. Induction of regeneration of
polarity of D-V and A-P axes of the mouse limb. and the role of the ectoderm. J. Exp. Zool. 108: the forelimb of the postmetamorphic frog by
Nature 374: 350-353. 363-404. augmentation of the nerve supply. J. Exp. Zool.
126: 419-472.
Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G. and Saunders, J. W., Jr. 1972. Developmental control
McMahon, A. P. 1993. Mouse Wnt genes exhibit of three-dimensional polarity in the avian limb. Singer, M. and Caston, J. D. 1972. Neurotrophic
discrete domains of expression in early Ann. N.Y. Acad. Sci. 193: 29-42. dependence of macromolecular synthesis in the
embryonic CNS and limb buds. Development 119: early limb regenerate of the newt, Triturus. J.
Saunders, J. W., Jr. 1982. Developmental Biolo-
247-261. Embryol. Exp. Morphol. 28: 1-11.
gy. Macmillan, New York.
Phillips, J. 1991. Higgledy, piggledy. N. Engl. J. Sordino, P., Hoeven, F. van der and Duboule,
Saunders, J. W., Jr. and Fallon, J. F. 1966. Cell
Med. 324: 497. D. 1995. Hox gene expression in teleost fins
death in morphogenesis. In M. Locke (ed.),
and the origin of the vertebrate digits. Nature
Pollak, R. D. and Fallon, J. F. 1976. Autora- Major Problems of Developmental Biology.
375: 678-681.
diographic analysis of macromolecular synthesis Academic Press, New York, pp. 289-314.
in prospectively necrotic cells of the chick limb Stephens, T. D. and seven others. 1991. Axial
Saunders, J. W., Jr. and Gasseling, M. T. 1968.
bud. II. Nucleic acids. Exp. Cell Res. 100: 15-22. and paraxial influences on limb morphogenesis.
Ectodermal-mesodermal interactions in the
J. Morphol. 208: 367-379.
Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E. and Tabin, origin of limb symmetry. In R. Fleis-chmajer
C. 1993. Sonic hedgehog mediates the polarizing and R. E. Billingham (eds.), Epithelial-Mesen- Stocum, D. L. and Crawford, K. 1987. Use of
activity of the ZPA. Cell 75: 1401-1416. chymal Interactions. Williams & Wilkins, retinoids to analyse the cellular basis of memory
Baltimore, pp. 78-97. in regenerating amphibian limbs. Biochem. Cell
Riddle, R. D., Ensini, M., Nelson, C., Tsuchida,
Biol. 65: 750-761.
T., Jessell, T. M. and Tabin, C. 1995. Induction Saunders, J., Jr. and Reuss, C. 1974. Inductive
of the LIM homeobox gene Lmx1 by WNT7a and axial properties of prospective wing-bud Stocum, D. L. and Fallon, J. F. 1982. Control of
establishes dorsoventral patter in the vertebrate mesoderm in the chick embryo. Dev. Biol. 38: pattern formation in urodele limb on-togeny: A
limb. Cell 83: 631-640. 4150. review and a hypothesis. J. Embryol. Exp.
Morphol. 69: 7-36.
Rodriguez-Esteban, C., Schwabe, J. W. R., De La Saunders, J. W., Jr., Cairns, J. M. and Gas-seling,
Pena, J., Foys, B., Eshelman, B. and Izpisúa- M. T. 1957. The role of the apical ridge of Stratford, T., Horton, C. and Maden, M. 1996.
Belmonte, J. C. 1997. Radical fringe positions ectoderm in the differentiation of the morpho- Retinoic acid is required for the initiation of
outgrowth in the chick limb bud. Curr Biol. 6: Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L. and Lee, J. Wanek, N., Gardiner, D. M., Mueoka, K. and
1124-1133. 1982. Local application of retinoic acid to the Bryant, S. V. 1991. Conversion by retinoic acid
limb bud mimics the action of the polarizing of anterior cells into ZPA cells in the chick wing
Summerbell, D. 1974. A quantitative analysis
region. Nature 296: 564-566. bud. Nature 350: 81-83.
of the effect of excision of the AER from the
chick limb bud. J. Embryol. Exp. Morphol. 32: Tickle, C., Lee, J. and Eichele, G. 1985. A Weiss, P. 1939. Principles of Development. Holt,
651-660. quantitative analysis of the effect of alltrans- Rinehart & Winston, New York.
retinoic acid on the pattern of chick wing deve-
Summerbell, D. 1979. The zone of polarizing Wessells, N. K. 1977. Tissue Interaction and
lopment. Dev. Biol. 109: 82-95.
activity: Evidence for a role in abnormal chick Development. Benjamin, Menlo Park, CA.
limb morphogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. Todt, W. L. and Fallon, J. F. 1987. Posterior
Wolpert, L. 1969. Positional information and
50: 217-233. apical ectodermal ridge removal in chick wing
the spatial pattern of cellular formation. J.
bud triggers a series of events resulting in
Summerbell, D. and Lewis, J. H. 1975. Time, Theoret. Biol. 25:1-47.
defective anterior pattern. Development 101:
place and positional value in the chick limb bud.
505-515. Wolpert, L. 1977. The Development of Pattern
J. Embryol. Exp. Morphol. 33: 621-643.
and Form in Animals. Carolina Biological,
Tosney, K. W. and Landmesser, L. T. 1985.
Tabin, C. J. 1991. Retinoids, homeoboxes, and Burlington, NC.
Development of the major pathways for neurite
growth factors: Toward molecular models for De-
outgrowth in the chick hindlimb. Dev. Biol. 109: Yang, Y. Z. and Niswander, L. 1995. Interaction
velopment of the tetrapod limb. Cell 66: 99-217.
193-214. between signaling molecules Wnt7a and Shh
Tabin, C. J. 1992. Why we have (only) five during vertebrate limb development: Dorsal
Viviano, C. M., Horton, C. E., Maden, M. and
fingers per hand: Hox genes and the evolution signals regulate anteroposte-rior patterning. Cell
Brockes, J. P. 1995. Synthesis and release of 9-
of paired limbs. Development 116: 289-296. 80: 939-947.
cis retinoic acid by the urodele wound epidermis.
Tanaka, M., Tamura, K., Noji, S., Nohno, T. Development 121: 3753-3762. Yokouchi, Y, Nakazato, S., Yamamoto, M.,
and Ide, H. 1997. Induction of additional limb at Goto, Y, Kameda, T., Iba, H. and Kuroiwa, A.
Vogel, A., Rodriguez, C., Warnken, W. and Izpisúa-
the dorsal-ventral boundary of a chick embryo. 1995. Misexpression of Hoxa-13 induces
Belmonte, J.-C. 1995. Dorsal cell fate specified
Dev. Biol. 182:191-203. cartilage homeotic transformation and changes
by chick Lmx1 during vertebrate Development
in adhesiveness in chick limb buds. Genes Dev.
Tickle, C. 1981. The number of polarizing region of the tetrapod limb. Nature 378: 716-720.
9: 2509-2522.
cells required to specify additional digits in the
Vogel, A., Rodriguez, C. and Izpisúa-Belmonte,
developing chick wing. Nature 289: 295-298. Zaleske, D. J. 1985. Development of the upper
J.-C. 1996. Involvement of FGF-8 in initiation,
limb. Hand Clin. 1985(3): 383-390.
Tickle, C. 1995. Vertebrate Development of the outgrowth, and patterning of the vertebrate limb.
tetrapod limb. Curr. Biol. 5: 478-484. Development 122: 1737-1750. Zou, H. and Niswander, L. 1996. Requirement
for BMP signaling in interdigital apoptosis and
Tickle, C., Summerbell, D. and Wolpert, L. 1975. Vortkamp, A., Gessler, M. and Grzeschik, K.-
scale formation. Science 272: 738-741.
Positional signaling and specification of digits in H. GLI3 zinc-finger gene interrupted by trans-
chick limb morphogenesis. Nature 254: 199-202. locations in Grieg syndrome family. Nature 352: Zwilling, E. 1955. Ectoderm-mesoderm
539-540. relationship in the development of the chick
embryo limb bud. J. Exp. Zool. 128: 423-441.
Interações celulares à distância:
Hormônios como mediadores
do desenvolvimento
19
Mudou a velha ordem cedendo seu espaço
para a nova.
ALFRED LORD TENNYSON (1886)
As fases iniciais presas na terra construíram

A FORMAÇÃO DE ÓRGÃOS NOS ANIMAIS é consumada por interações de
numerosos tipos de células. Nos dois capítulos precedentes discutimos
como as interações no desenvolvimento podem ser mediadas por popula-
ções celulares adjacentes. Neste capítulo discutiremos a regulação do desenvolvi-
mento pelas moléculas difusíveis que se deslocam em longas distâncias, de um tipo de
aparelhos digestivos enormes e os movimen- célula a outro. Reguladores difusíveis do desenvolvimento que se deslocam pelo
tou sobre pés de lagartas. Mais tarde na his-
sangue para promover modificações na diferenciação ou morfogênese de outros teci-
tória da vida, esses recursos puderam ser li-
dos são chamados hormônios.
quidados e reinvestidos na construção de um
organismo inteiramente novo- uma máqui-
na voadora dedicada ao sexo.
CARROLL M. WILLIAMS (1958) Metamorfose: o direcionamento
hormonal do desenvolvimento
É extremamente difícil isolar hormônios de embriões pois quantidades muito pequenas
desses são suficientes para concretizar sua ação. Portanto, algumas das análises mais
detalhadas do controle hormonal do desenvolvimento foram centralizadas na dramá-
tica “reprogramação” do desenvolvimento conhecida como metamorfose.
Em muitas espécies de animais, o desenvolvimento embrionário leva a um estágio
larval com caraterísticas muito diferentes daquelas do organismo adulto. Muito freqüen-
temente, as formas larvais são especializadas para algumas funções tais como cresci-
mento ou dispersão. A larva pluteus do ouriço-do-mar, por exemplo, pode se deslocar em
correntes oceânicas, enquanto o ouriço adulto leva uma existência sedentária. As lar-
vas, em forma de lagarta, das borboletas e mariposas são especializadas para a alimenta-
ção, ao passo que suas formas adultas são especializadas para o vôo e a reprodução e
freqüentemente não possuem as partes da boca necessárias para a alimentação. A divi-
são de funções entre a larva e o adulto é freqüentemente bastante distinta (Wald, 1981).
As efeméridas eclodem de ovos e se desenvolvem durante vários meses. Todo esse
desenvolvimento lhes permite passar um dia como insetos alados completamente de-
senvolvidos, acasalando rapidamente antes de morrer. Como seria de se esperar dessa
discussão, a forma larval e o adulto com freqüência vivem em ambientes diferentes. Mais
ainda, como primeiro observado por Weismann (1875), as larvas devem ter sua própria
adaptação para lhes ajudar a sobreviver. A borboleta viceroy adulta (limenitis archippus)
mimetiza a menos apetitosa borboleta monarca, mas a lagarta viceroy não se parece com
a bonita lagarta da monarca. Ao contrário, a larva viceroy escapa da detecção parecendo
excremento de pássaros (Begon et al., 1986).
733
734 PARTE V Interações Durante a Formação do Órgão
Durante a metamorfose, hormônios específicos reativam processos do desenvol-

vimento, e o organismo inteiro se modifica preparando-se para sua nova existência.
Essas modificações não são somente na forma. Em girinos de anfíbios, a metamorfose
causa não só a maturação desenvolvimental de enzimas do fígado, da hemoglobina e
de pigmentos do olho, como também remodela os sistemas nervoso, digestivo e
reprodutor. Portanto, a metamorfose é uma fase de mudanças dramática no desenvol-
vimento, afetando o organismo todo.
Este capítulo focaliza três casos nos quais os hormônios reativam os processos de
desenvolvimento após o nascimento: metamorfose em anfíbios, metamorfose em inse-
tos e desenvolvimento das mamas do camundongo.
Metamorfose anfíbia
Em anfíbios, a metamorfose é geralmente associada com as mudanças que preparam
um organismo aquático para uma existência terrestre. Em urodelos (salamandras), as
modificações incluem a reabsorção das nadadeiras da cauda, a destruição das guel-
ras externas e a mudança da estrutura da pele. Nos anuros (rãs e sapos), as mudan-
ças metamórficas são mais surpreendentes, e quase todos os órgãos são modifica-
dos (Tabela 19.1). As modificações na forma são muito óbvias (Figura 19.1). Mudan-
ças regressivas incluem a perda dos dentes córneos e das guelras internas do girino,
como também a destruição de sua cauda. Ao mesmo tempo, são evidentes os pro-
Tabela 19.1 Resumo de algumas modificações metamórficas em anuros
Sistema Larva Adulto
Locomotivo Aquática; nadadeiras de cauda Terrestre; tetrápode sem cauda
Respiratório Guelras, pele, pulmões; Pele, pulmões; hemoglobinas adultas

hemoglobinas larval
Circulatório Arcos aórticos; aorta; Arco carótido; arco sistêmico;

veias cardinais anteriores, veias jugulares
posteriores e comuns
Nutricional Herbívoros: longo intestino em Carnívoros: intestino curto- proteases;

espiral- simbiontes intestinais; boca grande- língua longa
boca pequena- mandíbulas
corneadas, dentes labiais
Nervoso Falta da membrana nictitante; Desenvolvimento de músculos

porfiropsina, sistema de linha oculares, membrana nictitante,
lateral- Neurônios de Mauthner rodopsina, perda do sistema de linha
lateral- degeneração dos neurônios de
Mauthner; membrana timpânica
Excretório Principalmente amônia, Principalmente uréia, alta atividade das

pouca uréia (amonotélico) enzimas do ciclo ornitina-uréia
(ureotélico)
Integumentário Epiderme fina com bicamada e Epiderme escamosa estratificada com

derme fina; sem glândulas queratinas adultas; derme bem
mucosas ou granulares desenvolvida contém glândulas
mucosas e granulares secretando
peptídeos antimicrobianos
Fonte: Dados de Turner e Bagnara, 1976; Reilly et al., 1994.
CAPÍTULO 19 Hormônios e metamorfose 735
cessos construtivos como o desenvolvimento dos membros e a construção da glân-

dula dermóide. Para a locomoção, a cauda tipo remo retrocede enquanto os membros
anteriores e posteriores se diferenciam. O crânio cartilaginoso do girino é substitu-
ído pelo crânio predominantemente ósseo da pequena rã. Os dentes córneos,
construídos para dilacerar plantas das lagoas, desaparecem enquanto a boca e a
mandíbula assumem novas formas e se desenvolve o músculo da língua. Enquanto
isso, o amplo intestino característico dos herbívoros se encurta para se adaptar à
dieta mais carnívora da rã adulta. As guelras regridem e os arcos das guelras dege-
neram. Os pulmões aumentam, e músculos e cartilagem se desenvolvem para bom-
bear ar para dentro e para fora dos pulmões. O sistema sensorial muda, também,
assim como o sistema da linha lateral do girino degenera e o olho e o ouvido sofrem
mais diferenciações. No ouvido se desenvolve o ouvido médio e a membrana do
tímpano, tão característica de rãs e sapos. No olho, aparecem as membranas nictitantes
e as pálpebras; o pigmento do olho também muda. Nos girinos, como nos peixes de
água doce, o fotopigmento mais importante da retina é a porfiropsina, um complexo
entre a proteína opsina e o aldeído da vitamina A2. Em rãs adultas, o pigmento muda
para rodopsina, o fotopigmento característico dos vertebrados terrestres e maríti-
mos. A Rodopsina é um conjugado de opsina e o aldeído da vitamina A1 (Wald, 1945,
1981; Smith-Gill e Carver, 1981; Hanken e Hall, 1988).
Outros eventos bioquímicos também estão associados à metamorfose. A hemo-
globina do girino liga o oxigênio mais rapidamente e o libera mais lentamente do que
a hemoglobina do adulto (McCutcheon, 1936). Além disso, Riggs (1951) mostrou
que a ligação do oxigênio pela hemoglobina do girino é independente do pH, ao
passo que a hemoglobina da rã (como a maioria das outras hemoglobinas de verte-
brados) mostra um aumento na ligação de oxigênio com o aumento do pH (efeito de
Bohr). Outra mudança bioquímica na metamorfose de certas rãs é a indução daque-
las enzimas necessárias para a produção de uréia. Girinos, como a maioria dos peixes
de água doce são amonotélicos; ou seja, eles excretam amônia. Muitas rãs adultas
(tal como o espécie Rana mas não o Xenopus) são ureotélicos, excretando uréia,
como a maioria dos vertebrados terrestres. Durante a metamorfose, o fígado desen-
volve enzimas necessárias para produzir uréia de dióxido de carbono e amônia. Figura 19.1
Seqüência da metamorfose na rã Rana pipiens.
Essas enzimas constituem o ciclo da uréia, e cada uma delas aparece durante a
(A) Girino premetamórfico. (B) Girino
metamorfose (Figura 19.2).
prometamórfico mostrando crescimento do
membro posterior. (C) Início do clímax
Controle hormonal da metamorfose de anfíbios metamórfico ao emergirem os membros anteri-
ores. (D,E) Estágios do clímax.
Todas essas variadas modificações são induzidas pela secreção dos hormônios da
tireóide tiroxina (T4) e triiodotironina (T3), durante a metamorfose (Figura 19.3). Atu-
almente se acredita que T3 é o hormônio ativo, pois ele causa mudanças metamórficas
em girinos tireoidectomizados em concentrações muito menores do que o faria o T4
(Kistler et al., 1977; Robinson et al., 1977). O controle da metamorfose pelos hormônios
da tireóide foi demonstrado por Gudernatsch (1912), observando que girinos sofriam
uma metamorfose prematura ao serem alimentados com a glândula tireóide de carneiro
pulverizada. Allen (1916) e Hoskins e Hoskins (1917) mostraram que pela retirada do
rudimento da tireóide de girinos precoces, a larva não sofria metamorfose tornando-
se, em lugar disso, um girino gigante.
MODIFICAÇÕES REGIONALMENTE ESPECÍFICAS. Os vários órgãos do corpo

respondem de maneira diferente à estimulação hormonal. O mesmo estímulo causa a
degeneração de certos tecidos enquanto outros se desenvolvem e se diferenciam. Por
exemplo, a degeneração das estruturas da cauda são claramente associadas a níveis
crescentes de hormônios da tireóide. A degeneração das estruturas da cauda é relati-
vamente rápida, pois o esqueleto ósseo não se estende até a cauda, que é somente
suportada pela notocorda (Wassersug, 1989). Essa degeneração pode ser mostrada in
vitro (Weber, 1967) quando pedaços isolados de cauda são colocados em recipientes
Figura 19.2 (A) Carbamoilfosfato

Desenvolvimento do ciclo da uréia durante a sintase
metamorfose de anuros. (A) Os principais as- Carbamoilfosfato
pectos do ciclo da uréia, pelo qual resíduos
Ornitina
nitrogenados podem ser detoxificados e
carbamoiltransferase
excretados. (B) Emergência de atividades
enzimáticas do ciclo da uréia correlacionada
com mudanças metamórficas na rã Rana
Ornitina Citrulina
catesbeiana. (De acordo com Cohen, 1970.)
Aspartato
Argininosuccinato
Uréia sintetase
Arginase Argininosuccinato
Arginina
Argininosuccinato
liase
Fumarato
(B)
Carbamoilfosfato sintase
Porcentagem de níveis de enzimas
Ornitina carbamoiltransferase
Argininosuccinato sintetase
pós-metamórficas
Argininosuccinato liase
Excreção de uréia
Estágio do desenvolvimento
com ágar e submetidos a tratamentos químicos. As caudas cultivadas em meio não

tratado permanecem sadias, enquanto aquelas colocadas em meio contendo hormôni-
os da tireóide sofrem uma regressão característica. Além disso, a prolactina inibe a
degeneração da cauda induzida pelos hormônios da tireóide (Brown e Frye, 1969).
Considera-se que a regressão da cauda se dá em quatro estágios. Primeiro, a síntese
de proteína diminui nas células do músculo estriado da cauda (Little et al., 1973). Em
seguida, há um aumento das enzimas do lisossoma. As concentrações de proteases,
RNase, DNase, colagenase, fosfatase e glicosidases aumentam na epiderme, notocor-
da e células do cordão nervoso (Fox, 1973). Provavelmente a morte celular é causada
pela liberação dessas enzimas no citoplasma. A epiderme ajuda a digestão do tecido
muscular, possivelmente pela liberação dessas enzimas digestivas. Se a epiderme é
cirurgicamente removida das extremidades da cauda, essas não sofrerão regressão
quando cultivadas em tiroxina (Eisen e Gross, 1965; Niki et al., 1982). Após essa morte
celular, macrófagos se acumulam na região da cauda, digerindo os detritos com suas
próprias enzimas proteolíticas (Kaltenbach et al., 1979). O resultado é que a cauda se
Tiroxina (T 4 )
Triiodotironina (T 3 )
Figura 19.3
Fórmulas da tiroxina (T4) e da triiodotironina (T3).
torna uma grande sacola de enzimas proteolíticas (Figura 19.4). As principais enzimas
proteolíticas parecem ser as colagenases e outras metaloproteínases cuja síntese de-
pende dos hormônios da tireóide. Se um inibidor de metaloproteínases (TIMP) é adi-
cionado às caudas, ele impede a regressão da cauda induzida pelo hormônio da tireóide
(Oofusa e Yoshizato, 1991; Patterson et al., 1995).
A resposta aos hormônios da tireóide é intrínseca ao próprio órgão e não depen-
de dos tecidos vizinhos. Na epiderme, a resposta aos hormônios tireoidianos de-
pende de qual parte do corpo a epiderme está cobrindo. As células epidérmicas da
cabeça e do corpo do girino sofrem uma lenta renovação (como esperado na pele), e
T3 não modifica essa velocidade. Na cauda, entretanto, T3 causa um rápido aumento
na queratinização e morte dessas células. Também se dá uma supressão, específica
para a cauda, das divisões das células precursoras que poderiam originar mais célu-
las epidérmicas. O resultado é a morte das células epidérmicas da cauda enquanto
Concentração da protease catepsina lisossômica
(unidades/µg nitrogênio)
Figura 19.4
Aumento da atividade proteásica lisossômica
durante a regressão da cauda em Xenopus
laevis. As enzimas lisossômicas são conside-
radas responsáveis pela digestão das células da
Comprimento relativo da cauda (%) cauda. (De acordo com Karp e Berrill, 1981.)
(A) (B)
Extremidade da
cauda transplantada
no tronco
Figura 19.5
Especificidade de órgãos durante a metamor-
fose da rã. (A) Extremidades da cauda regridem Cauda
mesmo quando transplantadas no tronco, en-
quanto (B) os cálices oculares permanecem
intactos mesmo quando transplantados para a
cauda em regressão. (De acordo com Schwind,
1933; fotografias de Geigy, 1941, cortesia do
Journal of Experimental Zoology.)
que a epiderme da cabeça e do corpo continua a funcionar (Nishikawa et al., 1989).

Essas respostas epidérmicas locais parecem ser controladas pela especificidade
regional do mesoderma dérmico. Se as células do dermátomo da cauda (que dão
origem a derme da cauda) são transplantadas para o tronco, a epiderme que elas
contactam sofrerá degeneração na metamorfose. Inversamente, quando o dermáto-
mo do tronco é transplantado para a cauda, aquelas regiões da pele persistem.
Modificando o ectoderma não se altera a resposta regional aos hormônios da tireóide
(Kinoshita et al., 1989).
Essa resposta específica dos órgãos é dramaticamente demonstrada quando extre-
midades da cauda são transplantadas para a região do tronco ou quando cálices
oculares são colocadas na cauda (Schwind, 1933; Geigy, 1941). A extremidade da
cauda extra colocada no tronco não é protegida da degeneração, mas o olho retém sua
integridade apesar de estar colocado dentro da cauda em degeneração (Figura 19.5).
Portanto, a degeneração da cauda representa uma morte celular autônoma programa-
da. Somente tecidos específicos morrem quando é dado o sinal. Essas mortes celula-
res programadas são importantes na modelagem do corpo. Em humanos, a degenera-
ção programada ocorre nos tecidos entre os dedos e os artelhos, e a degeneração da
cauda humana durante a semana 4 do desenvolvimento se parece à regressão da
cauda do girino (Fallon e Simandl, 1978).
COORDENAÇÃO DAS MUDANÇAS NO DESENVOLVIMENTO. Um dos princi-

pais problemas da metamorfose é a coordenação dos eventos desenvolvimentais. A
cauda não deve degenerar até que outro meio de locomoção- os membros- estejam
desenvolvidos, e as guelras não devem regredir até que o animal possa utilizar os seus
músculos pulmonares recém-desenvolvidos. A maneira de coordenar os eventos
metamórficos parece ser através de diferentes quantidades de hormônio que produ-
zem diferentes efeitos específicos (Kollros, 1961). Esse modelo é chamado de conceito
do limite. Com o crescimento gradual da concentração de hormônios da tireóide,
diferentes eventos ocorrem dependendo do nível de concentração do hormônio. Quan-
do girinos privados de suas tireóides são colocados em uma solução diluída de hor-
mônios da tireóide, os únicos efeitos morfológicos são o encurtamento dos intestinos
e o crescimento acelerado dos membros posteriores. Entretanto, em concentrações
mais altas do hormônio, a regressão da cauda é observada antes da formação dos
membros posteriores. Esses experimentos sugerem que ao se elevarem os níveis de
hormônio da tireóide, os membros posteriores se desenvolvem primeiro e depois regride
a cauda. Analogamente, quando girinos recebem T3 induz-se a formação dos ossos
precoces nas dosagens mais baixas e os mais tardios em dosagens mais altas,
mimetizando a situação natural (Hanken e Hall, 1988). Portanto, o planejamento na
metamorfose é regulado pela competência dos diferentes tecidos em responder aos
hormônios da tireóide.
MUDANÇAS NEURONIAIS. Mas o que acontece com o sistema nervoso quando o

animal está construindo um novo organismo a partir do velho? A anatomia adaptiva
de uma rã certamente difere daquela de seu girino. Uma conseqüência imediata da
metamorfose nos anuros é observada na transferência dos olhos para frente, a partir
de sua posição lateral original (Figura 19.6).* Os olhos laterais do girino são típicos
de herbívoros como presa, ao passo que os olhos frontais da rã são mais adequados
*Um dos movimentos mais espetaculares de olhos durante a metamorfose ocorre nos peixes
chatos como o linguado. Originalmente, os olhos estão em lados opostos da face. Todavia, durante
a metamorfose, um dos olhos migra dorsalmente para encontrar o outro no topo da cabeça,
permitindo ao peixe permanecer no fundo, olhando para cima (Martin e Drewry, 1978).
Figura 19.6
A migração do olho e mudanças neuroniais
associadas durante a metamorfose do girino de
Xenopus laevis. Os olhos do girino são locali-
zados lateralmente, por isso, existe um plano
binocular relativamente pequeno. Os olhos
migram dorsalmente e rostralmente durante a
metamorfose, criando um amplo campo
binocular para a rã adulta. Abaixo do girino em
metamorfose está uma representação da região
óptica de seu cérebro. Quando se injeta
peroxidase de rabanete (horseradish) na retina,
os neurônios ópticos a transportam para o lado
contralateral (oposto) do cérebro (flecha pe-
quena), mas não para o lado ipsilateral. Com a
continuação da metamorfose, as projeções
ipsilaterais (envolvidas na visão binocular) co-
meçam a ser vistas (flecha grande). (de Hoskins
e Grobstein, 1984, cortesia de P. Grobstein.)
ao seu estilo predatório de vida. Para alcançar sua presa, a rã deve enxergar em três
dimensões. Ou seja, ela deve adquirir um campo de visão binocular onde os sinais
de ambos os olhos convergem no cérebro. No girino, o olho direito inerva o lado
esquerdo do cérebro e vice-versa. Não existem projeções ipsilaterais (do mesmo
lado) dos neurônios da retina. Entretanto, durante a metamorfose essas vias
ipsilaterais adicionais emergem, permitindo que sinais de ambos os olhos atinjam a
mesma área do cérebro (Currie e Cowan, 1974; Hoskins e Grobstein, 1985a). Em
Xenopus, essas novas vias neuroniais não resultam da remodelação de neurônios
existentes, mas da formação de novos neurônios que se diferenciam em resposta
aos hormônios da tireóide (Hoskins e Grobstein, 1985a,b). Tanto o movimento dos
olhos para sua nova posição como a diferenciação de novos neurônios que esten-
dem processos ipsilaterais para o cérebro são modificações dependentes de hormô-
nios da tireóide.
Outros neurônios também sofrem mudanças profundas. Algumas células nervo-
sas morrem, como aquelas que inervam os músculos da cauda de girinos (Forehand e
Farel, 1982). Essa morte neuronial parece ser uma outra resposta ao hormônio da
tireóide, e não causada pela morte do tecido alvo. Outros neurônios, como certos
neurônios motores na mandíbula do girino trocam sua fidelidade do músculo larval
para o músculo adulto recém-formado (Alley e Barnes, 1983). E ainda outros neurôni-
os, como aqueles inervando a língua (um músculo recém-formado, não presente na
larva) estiveram dormentes durante o estágio de girino e só iniciam a formação de
conexões durante a metamorfose (Grobstein, 1987). O cérebro também sofre mudanças
em sua estrutura durante a metamorfose. Portanto, o sistema nervoso dos anuros
sofre enorme reestruturação durante a metamorfose. Alguns neurônios morrem, ou-
tros nascem, e outros mudam sua especificidade.
MUDANÇAS DE COMPORTAMENTO. A metamorfose também traz mudanças de

comportamento; obviamente, o comportamento de uma rã é diferente do seu girino.
Recentemente, o estudo de rãs tropicais demonstrou comportamentos surpreen-
dentes envolvendo inter-relações rã-girino. A rã flecha de veneno, Dendrobates, é
encontrada nas florestas tropicais da América Central. A maior parte do tempo,
essas rãs altamente tóxicas vivem nos detritos foliares do solo da floresta. Após a
postura dos ovos sobre uma folha úmida, um dos pais (às vezes o macho, outras a
fêmea) serve de guardião dos ovos. Quando os ovos se transformam em girinos, o
guardião permite que eles se aboletem em suas costas (veja Prancha 34). A rã sobe
então para a copa das árvores até encontrar bromélias com poças de água em suas
folhas da base, onde deposita um de seus girinos. Em seguida, vai buscar outro, e
assim por diante até que a ninhada toda tenha sido depositada em numerosas pe-
quenas poças de água. Em seguida, a fêmea retorna todos os dias a essas poças
onde deposita ovos não fertilizados, e reabastece o suprimento de alimento para os
girinos, quando esse escasseia, até que se complete a metamorfose (Mitchell, 1988;
vanWijngaarden e Bolanos, 1992; Brust, 1993). Não se sabe como a fêmea se lembra-
ou é informada- onde foram depositados os girinos.
Repostas Moleculares aos Hormônios

da Tireóide Durante a Metamorfose
Evidência de experimentos com inibidores sugeriram que os hormônios da tireóide

controlam a metamorfose ao nível da transcrição. Weber (1967) demonstrou que a
injeção de actinomicina D em girinos prometamórficos normais inibiu a regressão da
cauda e a remodelação da cabeça. No fígado (que é remodelado na metamorfose e não
destruído ou substituído) as mudanças metamórficas são acompanhadas por aumen-
tos dramáticos da síntese de RNA ribossômico e mensageiro, com a velocidade de
síntese de proteínas aumentada quase 100 vezes dentro de 4 horas após a estimulação
pelos hormônios da tireóide (Cohen et al., 1978). Muitos desses novos mRNAs estão
codificando as novas enzimas do fígado adulto. Mori e colaboradores (1979) mostra-

ram que muito do aumento de carbamoilfosfato sintase pode ser atribuído ao aumento
da transcrição do seu gene.
O método de transferência de manchas, onde mRNA radioativo de girinos da rã boi
(bullfrog) na fase premetamórfica e em metamorfose é hibridizado com genes clonados,
demonstrou três tipos de resposta aos hormônios da tireóide. A transcrição de um
conjunto de genes aumenta em resposta a uma metamorfose induzida natural ou ex-
perimentalmente; a transcrição de um outro conjunto de genes é dramaticamente redu-
zida; e um terceiro conjunto de genes permanece inalterado pelos hormônios da tireóide
(Lyman e White, 1987; Mathison e Miller, 1987). A transcrição dos mRNAs para
albumina, globina adulta, queratina da pele adulta e o homólogo de Sonic hedgehog
em Xenopus é controlada por T3. A transcrição do gene sonic hedgehog é interessan-
te, pois sugere que o padrão regional de formação de órgãos durante a metamorfose
pode ser conseqüência do reaparecimento de algumas das mesmas moléculas que
haviam estruturado o embrião (Stolow e Shi, 1995).
Mas essas são respostas ao T3 relativamente tardias. A resposta a T3 mais precoce
é a ativação transcricional dos genes do receptor do hormônio da tireóide (TR) (Yaoita
e Brown, 1990; Kawahara et al., 1991). Os receptores de hormônios da tireóide são
membros de uma superfamília de receptores de hormônios esteróides dos fatores de
transcrição. Existem dois tipos principais de TR, TRα e TRβ, e os mRNAs de ambos
estão presentes em níveis relativamente baixos antes do início da metamorfose (Tabe-
la 19.2; Kawahara et al., 1991; Baker e Tata, 1992). Entretanto, a síntese desses mRNAs
é acelerada dramaticamente ao se iniciar a metamorfose. A injeção de T3 exógeno causa
um aumento de 2 a 5 vezes na mensagem de TRα e um aumento de 20 a 50 vezes no
mRNA para TRβ. Essa auto-indução da mensagem do receptor de T3 pelo próprio T3
pode ter um papel significativo na aceleração da metamorfose (Figura 19.7). Quanto
mais receptores de T3 tiver um tecido, mais competente ele será para responder à
pequenas quantidades de T3. Portanto, o clímax metamórfico, quando as mudanças
visíveis da metamorfose ocorrem rapidamente, pode ser conseqüência de um aumento
na produção e indução de mais receptores de T3. O mecanismo dessa indução não é
conhecido, mas Kanamori e Brown (1992) mostraram que a aceleração na formação do
mRNA de TRβ é significativamente bloqueada por inibidores da síntese de proteínas.
Assim, outras proteínas estão provavelmente envolvidas na responsividade de genes
de TR ao T3. O TR não funciona sozinho, mas forma um dímero com o receptor retinóide,
RX. Esse dímero liga hormônios da tireóide e pode entrar no núcleo para efetuar a
transcrição (Wong e Shi, 1995).
Tabela 19.2 Acumulação relativa de

mRNA TRα α e β em
girinos de Xenopus
após tratamento com
T3 e prolactina
Unidades relativas
Tratamento α
TRα β
TRβ
Nenhum 505 24
T3 1290 368
Prolactina + T3 799 <10
Prolactina 405 43
Fonte: De acordo com Baker e Tata, 1992.

(A) PREMETAMORFOSE (B) METAMORFOSE PRECOCE (C) CLÍMAX METAMÓRFICO

(PROMETAMORFOSE)
Concentração baixa de tirotropina Concentração de tirotropina aumenta Alta concentração de tirotropina
Alta Alta
Concentração de Concentração concentração do
Concentração Concentração baixa concentração
T 3 e T4 aumenta do receptor receptor de T3
baixa de T3 e T4 do receptor de T3 de T3 e T4
de T3 aumenta
Gene do receptor de T3
Transcrição Transcrição
(Nenhuma transcrição) Ligação ao receptor

de T3 estimula a
Outros genes responsivos a T3 produção de mais
receptores de T3
Aumenta transcrição
dos genes induzidos
por T 3
Transcrição
Ligação ao receptor de T3 estimula

a transcrição de outros genes Transcrição
Algumas proteínas induzidas por T3

estimulam mais mensagem de T3
Figura 19.7
Modelo hipotético para a aceleração da metamorfose em Xenopus pela auto-indução de receptores
de T3 por T3. (A) No girino, a premetamorfose é caracterizada por baixos níveis de tirotropina
(fator de liberação do hormônio da tireóide), hormônios da tireóide e receptores de T3. (B) No
início da metamorfose, os níveis de tirotropina aumentam (provavelmente devido à maturação
desenvolvimental da glândula pituitária). Isso aumenta a quantidade de T3 que se liga à pequena
quantidade de seu receptor estimulando a transcrição de mais mRNA do receptor de T3. Algumas
outras proteínas induzidas por T3 também são necessárias para a transcrição de mais mensagem
de T3. (C) No clímax metamórfico, as grandes concentrações de T3 induzem, ainda mais, a síntese
de seus receptores, o que causa uma resposta mais rápida ao T3.
Foi observado que o hormônio prolactina também inibe o aumento de mRNAs de

TRα e TRβ. Ainda mais, se a aceleração dos receptores da tireóide é bloqueada pela
prolactina, a cauda não é reabsorvida, e o gene de queratina específico para o adulto
não é ativado (Tata et al., 1991; Baker e Tata, 1992). Injeções de prolactina estimulam
o crescimento larval e inibem a metamorfose (Bern et al., 1967; Etkin e Gona, 1967),
mas é controverso se isso reflete o papel natural da prolactina (Taka hashi et al.,
1990; Buckbinder e Brown, 1993). Ainda não conhecemos o mecanismo de regulação
dos níveis de hormônios da tireóide no girino, nem como a recepção do hormônio
desencadeia respostas diferentes (proliferação, diferenciação, morte celular) em te-
cidos diferentes.
& Especulações
Heterocronia
A MAIORIA DAS ESPÉCIES animais

se desenvolve através de uma fase
larval. Entretanto, algumas espé-
cies modificaram seus ciclos de vida alon-
gando ou encurtando seu período larval. O
fenômeno pelo qual os animais modificam o
período de aparecimento e a velocidade de
desenvolvimento de caracteres já presen-
tes em seus ancestrais é chamado hetero-
cronia. Aqui discutiremos três tipos extre-
mos de heterocronia. Neotenia, se refere à
retenção da forma juvenil devido a um atra-
so no desenvolvimento do corpo, em rela-
ção às células germinativas e às gônadas,
cuja maturidade é alcançada em tempo nor-
mal. Progênese também se refere à reten-
ção da forma juvenil, mas nesse caso as
gônadas e a linhagem germinativa se de-
senvolvem mais rapidamente do que o nor- (A) (B)
mal e elas se tornam sexualmente maduras,
Figura 19.8
enquanto o resto do corpo está ainda na
Metamorfose induzida no axolotle. (A) Condição normal do axolotle. (B) Espécimen tratado com
fase juvenil. No desenvolvimento direto, os tiroxina para induzir a metamorfose. (Cortesia de G. Malacinski.)
embriões abandonam completamente os es-
tágios de desenvolvimento larval e passam larvas, acasalamentos bem sucedidos. Em De Beer (1940) e Gould (1977) especu-
a construir um pequeno adulto. parte do seu habitat, A. tigrinum é uma laram que a neotenia é um dos fatores im-
salamandra neotênica, se deslocando atra- portantes na evolução de grupos taxonô-
Neotenia vés dos frios lençóis de água das Monta- micos mais complexos. Retardando o de-
Em certas salamandras, a maturidade se- nhas Rochosas. Entretando, na parte mais senvolvimento de tecidos somáticos, se dá
xual ocorre em uma fase que é considera- quente do seu habitat, a forma larval de A. à seleção natural um substrato mais flexí-
da larval. O sistema reprodutivo e as célu- tigrinum é transitória, originando-se a sa- vel. De acordo com Gould, a neotenia esta-
las germinativas amadurecem, enquanto lamandra tigre terrestre. Populações ria fornecendo “um escape da especializa-
o resto do corpo retém a forma juvenil ao neotênicas das Rochosas podem ser indu- ção. Os animais podem abandonar suas
longo de sua vida. Na maioria dos casos, zidas a sofrer metamorfose quando colo- formas adultas especializadas, retornar à
a metamorfose não se concretiza, e a ma- cadas em águas mais quentes. Parece que labilidade da juventude e se preparar para
turidade sexual se dá em um corpo “larval”. o hipotálamo dessas espécies não pode novas direções evolucionárias”.
A axolotle Mexicana, Ambystoma me- produzir o fator liberador de TSH em bai-
xicanum, não sofre metamorfose na natu- xas temperaturas. Progênese
reza porque sua glândula pituitária não li- Algumas salamandras, entretanto, são Na progênese, a maturação das gônadas
bera a forma ativa do hormônio estimulan- permanentemente neotênicas, mesmo no é acelerada enquanto o resto do corpo se
te da tireóide (TSH) para que seja estimula- laboratório. Enquanto a tiroxina é capaz de desenvolve normalmente a um certo está-
da a síntese de T3 em sua glândula tireóide produzir a antiga forma adulta perdida de A. gio. A progênese permitiu que certas es-
(Prahlad e De-Lanney, 1965; Norris et al., mexicanum (Figura 19.8), as espécies pécies de salamandra encontrassem novos
1973; Taurog et al., 1974). Assim, quando neotênicas Necturus e Siren não respon- nichos ecológicos. Bolitoglossa occiden-
os pesquisadores forneceram à A. mexica- dem a hormônios da tireóide (Frieden, 1981); talis é uma salamandra tropical diferente
num o hormônio da tireóide ou TSH, eles sua neotenia é permanente. Yaoita e Brown de outros membros do seu gênero, por vi-
observavam uma metamorfose em um adul- (1990) notaram que o mRNA para o receptor ver em árvores. Essa salamandra é palmí-
to não encontrado na natureza (Huxley, β do hormônio da tireóide está ausente em pedes e tem um corpo pequeno, condições
1920). Outras espécies como a A. tigrinum, Necturus e, portanto, não pode ser induzi- adequadas para uma vida arbórea; os pés
só sofrem metamorfose se receberem sido por T3. As lesões genéticas considera- produzem a sucção para a subida e o cor-
nais do ambiente. Isso não acontecendo, das responsáveis pela neotenia em várias po pequeno torna a tração eficiente.
elas se tornam neotênicas e realizam, como espécies estão mostradas na Figura 19.9. Alberch e Alberch (1981) mostraram que
Estímulos externos mento direto, é típico em espécies de rãs emerge do ovo gelatinoso, três semanas
que não têm girinos e ouriços-do-mar que após a fertilização, não é um girino, mas
não têm larvas pluteus. Elinson e seus uma pequena rã (Figura 19.10D). A peque-
Hipotálamo colegas (del Pino e Elinson, 1983; Elinson, na rã tem uma cauda durante a primeira
1987) estudaram uma pequena rã, Eleu- parte de sua vida, mas ela é usada para
Ambystoma tigrinum therodactylus coqui, que é um dos ani- respiração e não para a locomoção. Tais
Ambystoma gracilus mais mais abundantes na ilha de Porto rãs com desenvolvimento direto não ne-
Rico. Diversamente dos ovos de Rana e cessitam de água para seus estágios
Hormônio liberador de Xenopus, os ovos de E. coqui são fertili- larvais e podem, portanto, colonizar no-
tirotropina (TSH-RF) zados enquanto estão no corpo da fêmea. vas regiões inacessíveis a outras rãs.
Cada ovo tem 3.5mm de diâmetro (cerca Raff (1987) estudou o desenvolvimen-
Pituitária
de 20 vezes o volume dos ovos de Xeno- to direto em ouriços-do-mar. Em ouriços-
pus). Após a postura, o macho permane- do-mar “típicos”, as células mesenquima-
ce levemente apoiado sobre os embriões, tosas primárias invaginam e secretam o
Ambystoma mexicanum
protegendo-os de predadores e da des- esqueleto de carbonato de cálcio da larva
secação (Taigen et al., 1984). O desenvol- pluteus. Essas larvas se alimentam e cres-
Hormônio
vimento precoce é semelhante à maioria cem até que se formem as vesículas
estimulante da tireóide
das rãs. A clivagem é holoblástica, a gas- celômicas (também derivadas dos micrô-
trulação é iniciada na posição subequa- meros) nos lados do intestino (Pehrson e
torial (Figura 19.10A), e as dobras neurais Cohen, 1986). O celoma esquerdo conti-
Tireóide
se elevam a partir da superfície (Figura nua a crescer produzindo uma hidrocele
19.10B). Entretanto, logo após o fecha- que induz o ectoderma sobrejacente a
Tiroxina,
Triiodotironina
mento do tubo neural, os brotos dos mem- invaginar formando um vestíbulo. A
bros aparecem na superfície (Figura hidrocele e o vestíbulo formam um rudi-
Eurycea neotenes
19.10C). Essa emergência precoce de bro- mento que cresce dentro da larva até ser
Espécies de Necturus tos de membros é a primeira indicação de liberado na metamorfose para se tornar
e Siren
que o desenvolvimento é direto e que não um ouriço-do-mar juvenil (Figura 19.11).
passará pelo estágio de girino sem mem- Várias espécies de ouriço-do-mar têm
Tecidos alvo capazes
bros. Mais ainda, a emergência dos mem- estágios suprimidos da larva pluteus en-
de sofrer metamorfose bros não depende de hormônios da quanto aceleram o desenvolvimento do ru-
tireóide (Lynn e Peadon, 1955). O que dimento adulto. Como no desenvolvimento
Figura 19.9
Estágios ao longo do eixo hipotálamo-pituitária- (A) (B)
tireóide da salamandra onde se considera que
várias espécies têm bloqueio da metamorfose.
Eurycea, Necturus e Siren parecem ter um de-
feito no receptor dos tecidos responsivos.
Eurycea terá metamorfose ao ser exposta à con-
centrações extremamente altas de tiroxina, en-
quanto que Necturus e Siren não respondem a
qualquer dose. (De acordo com Frieden, 1981.)
B. accidentalis se assemelha aos juvenis

(C) (D)
das espécies relacionadas B. subpalmata
e B. rostrata (cujos jovens são peque-
nos, com dígitos que ainda não ultrapas-
saram a interligação). Considera-se que
B. occidentalis se tornou um adulto se-
xualmente maduro com um tamanho mui-
to menor do que seus predecessores. Isso
deu-lhe um fenótipo que possibilitou a
vida em árvores.
Figura 19.10
Desenvolvimento direto Desenvolvimento direto da rã Eleutherodactylus coqui. (A) Gástrula precoce mostrando o lábio
Enquanto alguns animais estenderam o do blastóporo. (B) Vista dorsal da nêurula mostrando a elevação das dobras neurais. (C) Um dia
período larval de sua vida, outros “acele- após o fechamento das dobras neurais, pode se ver os brotos dos membros. (D) Três semanas
raram” seu desenvolvimento abandonan- após a fertilização eclode uma pequena rã, aqui vista ao lado de uma moeda de um penny
do suas formas larvais “normais”. Esse Canadense (a inflação da cauda é um artefato causado pelos fixadores químicos usados para
último fenômeno, chamado desenvolvi- preparar o espécimen). (de Elinson, 1987, cortesia de R. P. Elinson.)
(A) (B) A natureza forneceu uma excelente

comparação em duas espécies australia-
nas de ouriço-do-mar do gênero Helioci-
daris. Heliocidaris erythrogramma e H.
tuberculata são espécies comuns, que de
acordo com dados morfológicos e de se-
qüenciamento de DNA, são estreitamen-
te relacionadas. Eles vivem lado a lado e
desovam ao mesmo tempo no verão. En-
Rudimento do Estômago tretanto, H. erythrogramma tem um ovo
ouriço-do-mar com o diâmetro de 425µm e é de desen-
(C) (D) volvimento direto; H. tuberculata produz
um ovo com 95µm de diâmetro e se de-
senvolve através de uma larva pluteus tí-
pica. Uma comparação entre as duas es-
pécies revela que o desenvolvimento di-
reto eliminou os estágios larvais e há um
prosseguimento direto para a formação do
celoma e a construção do ouriço-do-mar
juvenil (Figura 19.12). A larva pluteus é
destinada à natação e alimentação (Strath-
mann, 1971, 1975), usando seus braços
como suporte de faixas de cílios que var-
rem partículas de alimento para dentro da
boca. As células nos organismos de de-
Rudimento do Apêndices senvolvimento direto mudaram seus des-
ouriço-do-mar adultos
tinos de modo a não se formar o esquele-
Figura 19.11
to larval ou a boca. Também, na gastrula-
Metamorfose normal da larva pluteus para adulto no ouriço-do-mar Lytechinus pictus. (A) Larva
pluteus, 8 dias após a fertilização. (B) Larva pluteus de 11 dias com rudimento do ouriço-do-mar ção desses ouriços-do-mar de desenvol-
e bolsa celômica esquerda. (C) Uma pluteus de 19 dias com o rudimento do ouriço-do-mar em vimento direto não se observa descen-
desenvolvimento. (D) Cerca de 11 minutos após a fixação ao substrato, os braços da larva dentes das células do micrômero que
começam a ser reabsorvidos. (De Hinegardner, 1969, cortesia de R. T. Hinegardner.) invaginam para formar o esqueleto larval.
Pelo contrário, essas células são imedia-
direto na rã, esse desenvolvimento em ou- (portanto, não se alimentam). Essas espé- tamente envolvidas na formação da espi-
riço-do-mar depende de um ovo grande cies mostram um crescimento acelerado nha calcária do jovem adulto. Também, a
com vitelo. De fato, Raff encontrou uma do rudimento adulto, de modo que um ou- extremidade do arquêntero nas formas de
correlação entre o volume do ovo e a ex- riço-do-mar juvenil, capaz de se alimentar, ouriço-do-mar com desenvolvimento di-
tensão do desenvolvimento direto (Tabela é produzido rapidamente. Existem alguns reto forma uma extensa hidrocele que
19.3). Ouriços-do-mar na América do Nor- ovos com vitelo alcançando um diâmetro interage com o vestíbulo ectodérmico para
te e na Europa têm ovos cujo diâmetro va- de 2mm (próximo do volume de ovos de formar o rudimento de ouriço-do-mar na
ria de 60 a 200 µm. Essas espécies têm um Xenopus). Esses embriões desenvolvem- gastrulação. No desenvolvimento indire-
desenvolvimento indireto através da larva se diretamente sem qualquer estágio to, somente duas células iniciam a forma-
pluteus. Ovos no intervalo de 300-350 µm pluteus. O estágio de alimentação não é ção do vestíbulo, e essas interagem com
produzem larvas pluteus parciais que pos- necessário porque a nutrição é garantida a hidrocele depois do estabelecimento da
suem o esqueleto larval mas não o intestino pelo vitelo. estrutura de pluteus (Wray e Raff, 1990,
1991). Dessa forma, temos um interessan-
te paradoxo. De um lado, o desenvolvi-
Tabela 19.3 Relação entre o tipo de desenvolvimento e o tamanho do mento dos estágios larvais parecem estar
ovo em ouriços-do-mar fortemente contidos. Larvas de diferen-
Número de Espécies Intervalos de tamanho Tipo de desenvolvimento tes classes de equinodermos são muito
µm)
de ovo (µ parecidas, e os girinos de diferentes gru-
pos de rãs são também muito semelhan-
83 60 - 345 Larva pluteus com alimentação
tes. Entretanto, essas contenções podem
1 280 Pluteus com alimentação facultativa ser eliminadas se for abandonada a ne-
2 300 - 350 Pluteus abreviada, sem alimentação cessidade de um estágio larval para ali-
mentação. O aumento da quantidade de
19 400 - 2000 Pluteus perdida; desenvolvimento direto vitelo à disposição do embrião parece tor-
Fonte: De acordo com Raff, 1987. nar isso possível.
Figura 19.12 DESENVOLVIMENTO INDIRETO

Modificações no destino celular e gastrulação
S. purpuratus, H. tuberculata
no ouriço-do-mar em desenvolvimento direto
e indireto. Os mapas de destino no estágio de
32 células mostram as diferenças de destino
celular. Os destinos vegetais (indicados por
sombreamento) incluem o celoma (C), intesti-
no (G), células pigmentadas (P) e mesênquima
esqueletogênico (S). As células dando origem Seqüestro do adulto
aos tecidos neurais são denotadas como N. para o primórdio
Note que o desenvolvimento direto não produ- da bolsa celômica
ziu micrômeros e macrômeros separados. No
desenvolvimento indireto forma-se uma pluteus, Destinos em 32 células Pluteus
e dentro dessa estrutura larval as interações 4 semanas
formam o rudimento do ouriço-do-mar juvenil
(colorido). No desenvolvimento direto, tais in-
terações entre o celoma e as células do vestíbu-
lo ocorrem imediatamente na gastrulação, e o DESENVOLVIMENTO DIRETO
rudimento juvenil (colorido) é formado sem o Ouriço-do-mar
estágio larval de alimentação. Ambos os tipos juvenil
de desenvolvimento geram as mesmas estrutu-
ras adultas. (De acordo com Raff, 1994.) H. erythtogramma 4 dias
Sem alongamento do
arquêntero, iniciação
do esqueleto larval,
formação do intestino
larval ou seqüestro
Destinos em
do primórdio embrionário
32 células
Metamorfose em insetos
Eversão e Diferenciação dos Discos Imaginais
Enquanto a metamorfose em anfíbios é caracterizada pela remodelação de tecidos

existentes, a metamorfose nos insetos freqüentemente envolve a destruição de teci-
dos larvais e sua substituição por uma população de células totalmente diferente.
Existem três padrões principais de desenvolvimento dos insetos. Alguns poucos
insetos, como os poduras (subordem dos colêmbolos) não têm o estágio larval e se
desenvolvem diretamente. Outros insetos, notavelmente gafanhotos e insetos
rastejantes, sofrem uma metamorfose gradual hemimetabólica (Figura 19.13A). Ór-
gãos adultos são formados sem uma descontinuidade intensa. Os rudimentos da asa,
órgãos genitais e outras estruturas adultas estão presentes na eclosão, e se tornam
mais maduros em cada muda. Na última muda, o inseto emergente é um adulto alado e
sexualmente maduro. A forma larval do inseto hemimetabólico é chamada de ninfa.
Nos insetos holometabólicos (moscas, besouros, mariposas e borboletas) existe
uma transformação dramática e súbita entre os estágios de larva e adulto (Figura
19.13B). A larva juvenil (lagarta, verme, larva de inseto) sofre uma série de mudas
enquanto se torna maior. Uma larva de inseto recém-eclodida é coberta com uma dura
cutícula. Para crescer, o inseto precisa produzir uma cutícula nova e maior, como
também descartar a cutícula velha. Portanto, o desenvolvimento pós-embrionário
(A) DESENVOLVIMENTO (B) DESENVOLVIMENTO

HEMIMETABÓLICO HOLOMETABÓLICO
Muda Muda
Muda Muda
Muda
Muda
Muda
Muda Muda e metamorfose à pupa
Muda e metamorfose Metamorfose
Adulto Adulto
Figura 19.13
(A) Metamorfose hemimetabólica (incompleta). (B) Metamorfose holometabólica (completa).
desses insetos consiste em uma sucessão de mudas. O número de mudas antes da

fase adulta é característico das espécies, apesar de fatores ambientais poderem au-
mentar ou diminuir esse número. Os estágios entre essas mudas são chamados insta-
res. Os estágios instar crescem em degraus, cada um sendo qualitativamente maior do
que o anterior. Após o último estágio instar, a larva sofre uma muda metamórfica para
se tornar uma pupa. A pupa não se alimenta, e sua energia deve se originar daqueles
alimentos ingeridos enquanto larva. Durante a pupação, as estruturas adultas são
formadas e substituem as estruturas larvais. Finalmente, uma muda imaginal permite
ao adulto descartar o invólucro pupal e emergir.
A Drosophila sofre quatro mudas no seu ciclo vital. O embrião se desenvolve no
primeiro instar da larva e muda, em seguida, para se tornar a larva do segundo instar.
Mudas subseqüentes separam o segundo instar do terceiro, do terceiro para a pupa e
da pupa para o adulto. Em cada muda, as células epidérmicas se separam da cutícula e
secretam um “fluido de muda” nos espaços intervenientes. Após a secreção da nova
cutícula, as células epidérmicas degradam a velha pela ativação de enzimas no fluido
de muda (Hepburn, 1985). A transformação de juvenil para adulto ocorre dentro da
cutícula pupal. A maior parte do corpo antigo da larva é sistematicamente destruído ao
se desenvolverem novos órgãos adultos a partir de ninhos de células não diferenciadas,
Figura 19.14 Discos para:

As localizações e os destinos desenvolvi-
mentais dos discos imaginais de Drosophi- Parte da boca
la melanogaster. (De acordo com Fristrom
et al., 1969.) Placa frontal e
Discos imaginais
lábio superior
Antena
Cabeça
Olho
Tórax
Perna
Haltere
Asa Abdômen
Genitália
Larva de Metamorfose Adulto de

Drosophila Drosophila
os discos imaginais (e, em alguns insetos, os histoblastos). Quando o organismo

adulto (imago) está desenvolvido, a muda imaginal resulta no descarte da cutícula e
na emergência do inseto adulto. Em larvas holometabólicas, então, existem dois tipos
de populações celulares: as células larvais, usadas para as funções do juvenis, e as
milhares de células imaginais, as quais esperam em aglomerados o sinal para diferen-
ciar. A Figura 19.14 mostra a localização dos discos imaginais na Drosophila e as
estruturas nas quais eles se desenvolvem.
Na Drosophila existem 10 pares principais de discos imaginais, que reconstroem o
adulto inteiro (com exceção do abdômen), e um disco genital que forma as estruturas
reprodutivas. A epiderme abdominal se forma de um pequeno grupo de células imagi-
nais chamadas histoblastos, que se situam na região do intestino larval, e outros
ninhos de histoblastos localizados em toda a larva formam os órgãos internos do
adulto. Os discos imaginais podem ser vistos na larva recém eclodida como
espessamentos locais da epiderme. Na Drosophila esses discos recém-eclodidos do
olho-antena, asa, halteres, pernas e genitais contêm 70, 38, 20, 36-45 e 64 células,
respectivamente (Madhavan e Schneiderman, 1977). Enquanto que a maioria das célu-
las larvais tem uma capacidade mitótica limitada, os discos imaginais dividem-se rapi-
damente em tempos caracteristicamente específicos. Ao se proliferarem, as células
formam um epitélio tubular que se dobra sobre si mesmo em uma espiral compacta
(Figura 19.15A). O disco maior, o da asa, contém cerca de 60.000 células, ao passo que
os discos da perna e do haltere contêm 10.000 (Fristrom, 1972). Na metamorfose, essas
células se diferenciam e se alongam (Figura 19.15B).
O mapa do destino e a seqüência de alongamento do disco da perna estão ilustra-
dos na Figura 19.16. No fim do desenvolvimento larval, o disco da perna é um saco
epitelial conectado à epiderme larval por um delgado pedúnculo. Em um lado do saco,
o epitélio está dobrado em uma série de dobras concêntricas, “reminescentes da rosca
Dinamarquesa” (Kalm et al., 1995). No fim do período larval, as células do centro do
disco se projetam para fora para se tornarem as porções mais distais da perna- a garra
e o tarso. As células de fora se tornam as estruturas proximais- a coxa e a epiderme
(A) (B)
Figura 19.15
Alongamento do disco imaginal. Eletromicrografia de varredura do disco da perna de Drosophila
no terceiro instar antes (A) e após (B) o alongamento. (De Fristrom et al., 1977, cortesia de D.
Fristrom.)
adjacente. Após a diferenciação, as células dos apêndices e epiderme secretam uma

cutícula apropriada para a região específica. Apesar dos discos serem compostos
primariamente de células epidérmicas, um pequeno número de células adepiteliais
migram para o disco no início do desenvolvimento. Durante o período pupal, essas
células dão origem aos músculos e nervos que servem essa estrutura.
O processo de alongamento pode ser iniciado em cultura colocando-se discos
imaginais em solução contendo o hormônio de muda, 20-hidroxiecdisona. Ainda mais,
tal eversão pode ser inibida adicionando um de três conjuntos de drogas. (1) Inibidores
de síntese de RNA e de proteínas inibem a eversão quando adicionados a discos
imaginais cultivados, ao mesmo tempo que o 20-hidroxiecdisona. Sabe-se que a sínte-
se de RNA e de proteína ocorrem antes do alongamento e que algumas dessas proteínas
são necessárias para que isso ocorra. (2) Citocalasina B, um inibidor da função de
microfilamentos, também inibe o alongamento, indicando assim a necessidade de
microfilamentos de actina. (3) Inibidores de proteases também inibem o alongamento
(Pino-Heiss e Schubiger, 1989), pois proteases da superfície das células são necessá-
rias para a liberação de constritores da forma celular. Em conjunto, esses dados suge-
rem que a eversão de discos imaginais requer síntese de novas proteínas, um sistema
bem desenvolvido de microfilamentos de actina e alguma comunicação celular através
da superfície da célula (Fristrom et al., 1977; Kalm, 1995).
Estudos de Condic e seus colegas (1990) demonstraram que o alongamento do
disco imaginal é devido primariamente às mudanças da forma celular dentro do epitélio
Coxa
Trocanter Membrana
peripodial T2-5
Tórax Fêmur
Fêmur T1 T1 Trocanter
presuntivo Tíbia Tíbia Tíbia Fêmur Tíbia T1 T2-5 Fêmur
Coxa
Garra
Trocanter Fêmur Coxa Tíbia
Tórax Fêmur Tórax Tórax
Coxa presuntivo Trocanter presuntivo (D)
Trocanter presuntivo
T2-5 T1
(A) Garras (B) (C)
Tarso
Figura 19.16
Seqüência de alongamento do disco da perna de Drosophila. (A) Vista da superfície do disco não Garras
invertido. (B,C) Secção longitudinal através do disco da perna em alongamento e completamente
invertido. t1, basitarso; t2-5, segmentos tarsais 2-5. (D) Perna adulta. (de Fristrom e Fristrom,
1975, cortesia de D. Fristrom.)
Figura 19.17 (A) (B) (C)

Modificações na forma da célula durante o alon-
gamento do disco imaginal da perna da Droso-
phila. Superior: Seções ópticas através do se-
gundo disco da perna em alongamento. As fle-
chas marcam os segmentos basitarsais, e a bar-
ra de calibração representa 100µm. Inferior:
Aumento maior (barra de calibração representa
10µm) dos ápices celulares através da área
basitarsal. Os limites celulares estão marcados
com faloidina marcada por fluorescência. (A)
Início do estágio prepupal. (B) Prepupa com 6
horas. (C) Disco da perna de uma prepupa em
fase inicial tratada com tripsina. As células
basitarsais estão inicialmente comprimidas ao
longo do eixo próximo-distal. Por tratamento
com hidroxiecdisona ou tripsinização, a com-
pressão é liberada, e as células se expandem
para alongar o tecido. (de Condic et al., 1990,
cortesia dos autores.)
do disco. Usando faloidina marcada por fluorescência para corar os microfilamentos

periféricos das células do disco da perna, eles mostraram que as células dos discos
precoces do terceiro instar estão fortemente comprimidas ao longo do eixo próximo-
distal. Essa compressão é mantida por várias rodadas de divisão celular. Então, ao se
iniciar o alongamento do tecido, a compressão é removida e as células “saltam” para
sua forma mais arredondada (Figura 19.17). Essa conversão de um epitélio de células
comprimidas em um epitélio mais longo de células não comprimidas representa um
novo mecanismo para a extensão de um órgão durante o desenvolvimento.
& Especulações
A determinação dos discos imaginais da perna e da asa

Determinação dos discos do ectoderma or da expressão da proteína Wingless (Wg) haltere. Portanto, os discos da perna e da
A biologia molecular da metamorfose de e a banda horizontal de células expressan- asa têm uma origem comum (Figura 19.18).
insetos começa com a especificação de do a proteína Decapentaplegic (Dpp).
certas células epidérmicas para se torna- Ambas as proteínas são solúveis e têm um Determinação da identidade do disco
rem precursoras do disco imaginal. Como alcance limitado. No embrião precoce de Apesar de sua origem comum, é óbvio que
foi discutido no Capítulo 14, os rudimen- Drosophila (em uma extensão da banda os discos da perna e da asa são determi-
tos de órgãos na Drosophila são especifi- germinativa cerca de 4.5 horas após a ferti- nados para se tornarem estruturas dife-
cados em uma grade ortogonal pela lização), um único grupo de células na rentes. Como detalhado anteriormente, a
intersecção dos sinais ântero-posterior e intersecção desses domínios forma os pre- especificação desses discos para seus
dorsoventral. Na maioria dos segmentos, cursores do disco imaginal no abdômen. destinos particulares é provavelmente re-
os produtos do gene homeobox impedem Essas células (e somente elas) expressam alizada pelas interações dos genes homeó-
a expressão do gene Distal-less e o esta- a proteína Distal-less. Enquanto as células ticos. Mesmo assim, ainda não conhece-
belecimento de primórdios dos membros; expressando dpp são movidas dorsalmen- mos as moléculas que especificam que os
mas naqueles segmentos especificados te, essas células expressando Distal-less discos da perna sejam diferentes dos dis-
para serem torácicos é permitida a forma- se movem para estabelecer um agrupamen- cos da asa, ou que os discos do olho se-
ção de membros (veja Figura 14.33). Cohen to secundário de células imaginais (deri- jam diferentes dos discos da antena. Sa-
e colegas (1993) demonstraram que a per- vadas do agrupamento ventral original). Os bemos sim que quando certos genes ho-
na e a asa se originam do mesmo conjunto agrupamentos iniciais formam os discos meóticos são expressos nos lugares erra-
de precursores imaginais, especificados na imaginais da perna, enquanto que os se- dos (como a expressão de Antennapedia
intersecção entre as faixas ântero-posteri- cundários formam os discos da asa e do no disco do olho-antena), os discos se
Célula expressando Distal-less
Alcance do sinal Wg
Alcance do sinal Dpp
Célula expressando dpp
Célula expressando wg
4.5 horas 10 horas Embrião maduro

Figura 19.18
Modelo esquemático para a alocação e separação do disco perna-asa no tórax da Drosophila. O
embrião é dividido em uma grade ortogonal com faixas verticais de Wingless (Wg) e uma banda
horizontal de síntese e secreção de Decapentaplegic (Dpp). O disco inicial se forma na intersecção engrailed está ausente, todas as células
desses domínios secretores. As células secretoras de Dpp migram dorsalmente, trazendo com do disco se tornam anteriorizadas. O limite
elas algumas células do disco imaginal. Essas células do disco dorsal geram o disco da asa, entre os compartimentos anterior e poste-
enquanto as células remanescentes formam o disco da perna. (De acordo com Cohen et al., 1993.) rior é estritamente observado. Células de
um lado não podem produzir descenden-
reespecificam (de modo que pernas nas- ciais, um sistema polar coordenado (se- tes que cruzam o limite para o outro lado.
cem do disco da antena). A determinação melhante aquele discutido no capítulo No disco da asa, as células posteriores
do disco da asa parece ser regulada pelo anterior, para o desenvolvimento do mem- expressam a proteína Hedgehog que age
gene vestigial, que regula a sua (do disco bro de vertebrados) pode subdividir mais como um sinal de curto alcance para indu-
da asa) identidade. Usando um sistema precisamente as regiões (Held, 1995). zir a expressão de Dpp nas células anterio-
de endereçamento da expressão gênica, res adjacentes, enquanto a expressão de
Kim e colegas (1996) fizeram com que o O eixo ântero-posterior engrailed nas células posteriores as torna
gene vestigial fosse expresso nos discos Durante o primeiro instar larval, os discos não responsivas à Hedgehog que elas se-
do olho, antena e perna (Figura 19.19). imaginais da perna e da asa adquirem seu cretam. A proteína Dpp age como um sinal
Quando isso acontece, regiões da estru- eixo ântero-posterior (A/P). Os discos se de longo alcance para estabelecer o eixo
tura normal são convertidas em asa. tornam divididos em dois compartimentos ântero-posterior da asa (Guillen et al., 1995;
representando as futuras regiões anterior Tabata et al., 1995; Nellen et al., 1996).
Determinação da polaridade do disco e posterior dos apêndices (ou seja, da fren- No disco da perna, o compartimento
Evidência recente sugere que os eixos da te para trás da asa). O compartimento pos- posterior também secreta a proteína Hed-
perna e da asa são especificados por inte- terior é definido pela expressão do gene gehog. Aqui, entretanto, Hedgehog induz
rações nos limites de seus compartimen- engrailed nas células posteriores do dis- as células dorsais do compartimento ante-
tos (Meinhardt, 1980; Causo, 1993; co (Figura 19.20; Garcia-Bellido et al., 1973; rior a secretar Dpp enquanto essa induz as
Tabata, 1995). Após essas interações ini- Lawrence e Morata, 1976). Se a função células ventrais do mesmo compartimento
a secretar Wingless (Jiang e Struhl, 1996).
(A)
Gene vestigial O eixo dorsoventral
Proteína No segundo instar da larva, um segundo
GAL4
eixo, o dorsoventral é determinado no disco
Intensificador GAL4 Elemento da asa. O limite D/V se situa na futura mar-
do olho ligante de gem da lâmina da asa, assim separando as
GAL4 (USP)
Vestigial expresso superfícies superior e inferior da asa (Bryant,
(B) ectopicamente nas 1970; Garcia-Bellido et al., 1973). O gene
células do olho envolvido nesse evento de compartimenta-
Vista ventral da cabeça da Drosophila
ção é o apterous. Células expressando o
Crescimento semelhante à
asa a partir do olho ventral
gene apterous se tornam as células dorsais
Olho
Figura 19.19 O gene vestigial determina a identidade do disco da asa. (A) Kim e colegas
construíram linhagens de Drosophila que possuem a proteína ativadora transcricional do levedo
GAL4 acoplada a um intensificador, tal como o intensificador do olho mostrado nesta figura. Apesar
de GAL4 ser expressa nos olhos dessas moscas, não há ligação a qualquer DNA da Drosophila.
Entretanto, se a mosca é cruzada com outra espécie que contém o gene vestigial a vazante do elemento
ligante de GAL4 (a seqüência ativadora a montante - UAS), a proteína GAL4 ativa esse gene.
Portanto, nessas moscas, a proteína GAL4 é produzida no disco do olho e ativa a expressão do gene
vestigial. (B) O olho resultante contém regiões do tecido da asa. (De acordo com Kim et al., 1996.)
Primeiro instar Figura 19.20 membro (ou seja, a garra). Essa região
Anterior
Compartimentação e expressão gênica no dis- começa a expressar os genes Distal-less
Posterior
co da asa. (A) No primeiro instar da larva foi e arista-less que caracterizam a região da
formado o eixo ântero-posterior e é manifesta-
extremidade distal e estimulam o cresci-
do pela expressão do gene engrailed no com-
partimento posterior. No segundo instar, for- mento e a diferenciação das células (Fi-
Segundo instar gura 19.21A; Campbell et al., 1993; Basler
Ventral
ma-se o eixo dorsoventral, e é visto pela ex-
Dorsal A pressão do gene apterous na futura superfície e Struhl, 1994; Diaz-Nenjumea et al., 1994).
dorsal. No terceiro instar da larva, as bordas da Se a proteína Dpp é produzida por um
expressão de engrailed se estendem ligeiramen- aglomerado de células no compartimento
te além do limite de A/P. Onde há interação das anterior ventral ou se a proteína Wingless
proteínas secretadas e da membrana na junção
é expressa por um pequeno grupo de cé-
dos eixos D/V e A/P, as células são determina-
das a se tornar a extremidade distal da asa (X). lulas no compartimento anterior dorsal
Fim do terceiro instar Margem (ativando genes), um eixo próximo-distal
(De acordo com Blair, 1995.)
Ventral inteiramente novo será formado no local
perna é realizada por interações nos limi- da expressão (Figura 19.21B; Prancha 27).
Dorsal tes entre os eixos D/V e A/P. A situação na asa é um pouco mais difí-
Na perna, a proteína Hedgehog do cil de compreender. A proteína Hedgehog
compartimento posterior induz as células do compartimento posterior induz as célu-
mais próximas do compartimento anterior las adjacentes dos compartimentos anterior
Lâmina da asa dorsal, a secretar a proteína Decapenta- dorsal e anterior ventral a secretar Dpp. Isso
Adulto plegic e induz a proteína Wingless das estabelece as condições de crescimento
células mais próximas do compartimento celular e padronização ao longo do eixo A/
Dorsal Ventral anterior ventral. Ambas as proteínas, De- P. Nas células que dão origem à margem, as
Margem capentaplegic e Wingless ativam o gene células da superfície dorsal que expressam
optomotorblind, cujo produto protéico
promove o crescimento dos apêndices do
(A)
membro (Wilder e Perrimon, 1995; Grimm
e Pflugfelder, 1996). Ainda mais, onde es-
sas três proteínas difusíveis se encontram Distalless
se define a extremidade mais distal do
engrailed
apterous
ambos
(B) Anterior Posterior
(Prancha 15; Frontispício; Blair, 1993; Diaz-

Benjumea et al., 1993). Quando o apterus é
deletado, todas as células no disco adqui- (C)
rem destinos ventrais. Tanto engrailed
como apterous são considerados genes
seletores pois eles regulam o destino de um
compartimento. Da mesma maneira que os
genes homeóticos seletores discutidos no
Capítulo 14, esses genes contêm homeobo-
xes que parecem codificar fatores de trans-
crição. Na asa, não há crescimento ao longo
do eixo D/V, pois o ectoderma permanece
com a espessura de uma camada de células
em cada lado da margem da asa. Não se Figura 19.21 Modelo da formação do eixo na perna da Drosophila em desenvolvimento.
sabe o que causa a polaridade inicial do D/ (A) A proteína Hedgehog é somente sintetizada e secretada pela células sintetizadoras de Engrailed
no lado posterior do disco. A proteína Hedgehog se difunde em uma distância de alguns diâme-
V no disco da perna.
tros celulares e induz a faixa de células posteriores adjacentes na região dorsal do disco a
expressarem os genes decapentaplegic. A proteína Dpp então se difunde e padroniza o lado
O eixo próximo-distal dorsal anterior do disco. A secreção de Hedgehog pelas células posteriores instrui as células
A interação entre os eixos D/V e A/P nos anteriores ventrais, adjacentes às células posteriores, a sintetizarem e secretarem a proteína Wingless.
seus limites é crítica para o crescimento Isso ajudará a padronizar a asa anterior ventral. (B) Quando um clone de células expressando
ao longo do eixo próximo-distal. Durante Wingless é produzido na região dorsal do disco (pela manipulação de um transgene wingless),
esse organiza a formação de um novo eixo do membro. Aqui, esse eixo pode ser visto quando
a metamorfose, a “distalização” do eixo corado para a presença de expressão do gene Distalless. (C) Novo eixo de membro formado
próximo-distal da base do tórax para fora quando um clone de células expressando Dpp é expresso ectopicamente. (B e C de Diaz-
em direção à extremidade da asa ou da Benjumea et al., 1994; fotografias cortesia dos autores.)
Prancha 22
Expressão de sonic hedgehog no
embrião do pinto de três dias. Prancha 23
O sonic hedgehog está envolvido em numerosas inte- Expressão de sonic hedgehog no embrião
rações indutivas nas quais um tecido influencia a dife- do pinto de dez dias.
renciação de outro tecido. Hibridização in situ da Depois de mediar várias interações importantes durante a formação de
montagem total encontra mRNA de sonic hedgehog órgãos, sonic hedgehog torna-se expresso no ectoderma dos germes das
na notocorda, células da placa do assoalho neural, penas em desenvolvimento e escamas dos pés. Essa hibridização in situ
intestino anterior e mediano e no mesoderma do broto da montagem total mostra o arranjo hexagonal do padrão das penas.
do membro posterior. Capítulos 7, 8 , 15 e 18. (Foto- Capítulo 17. (Fotografia cortesia de Won-Sun Kim e John F. Fallon.)
grafia cortesia de C. Tabin.)
Prancha 24
A proteína Myf-5 é expressa em precursores da célula muscular
expressa muscular..
Os elementos genéticos regulando a expressão temporal e espacial do gene Myf-5
podem ser discernidos fundindo-se o gene da β-galactosidase com as seqüências
envolvendo o loco Myf-5. Aqui, uma seqüência particular a montante do gene Myf-
5 causa a expressão do gene (cor preta) nos músculos do pescoço, arcos faríngeos,
músculos oculares, músculos dos membros anteriores, e miótomos segmentados do
embrião de camundongo de 13.5 dias. Capítulos 2 e 9. (Fotografia cortesia de A.
Patapoutian, G. Lyons, J. Miner e B. Wold.)
Prancha 25
Expressão assimétrica do gene nodal no
embrião do pinto de 24 horas.
Hibridização in situ da montagem total usando sondas para o gene nodal do
pinto encontra-o expresso no mesoderma da placa lateral somente do lado
esquerdo. Pode aqui ser visto como a região de cor púrpura. Esse gene é
importante para o estabelecimento do eixo esquerdo-direito do pinto. Capí-
tulo 16. (Cortesia de C. Stern.)
Prancha 26
Regulação da expressão
homeótica dos genes na
formação das patas dos insetos.
Ao contrário das lagartas das borboletas, as
larvas das moscas não têm pró-pernas. Aqui,
os produtos dos genes homeóticos Ultrabi-
thorax e abdominal-A estão corados de ver-
de e a proteína Distal-less (necessária para o
desenvolvimento dos membros) está cora-
da de laranja. Na larva precoce da borboleta
do castanheiro Precis, os membros torácicos
(de T1-3) são facilmente vistos. Alguns seg-
mentos abdominais (A3-6) começam a pro-
duzir “buracos” em seu domínio de expres-
são das proteínas homeóticas. Abaixo, quan-
do a lagarta cresceu, a expressão de Distal-
less pode ser vista nessas regiões. (O ama-
relo indica sobreposição de domínios de
expressão.) Capítulos 14, 19 e 23. (Foto-
grafias cortesia de B. Warren, S. Paddock e
S. Carroll.)
Prancha 27
A proteína Wingless tem um papel crítico na orga-
nização do disco alar imaginal de Drosophila
Drosophila..
Células na junção entre os compartimentos dorsal e ven- Prancha 28
tral do disco alar induzem a expressão da proteína Wingless Expressão ectópica do gene eyeless de Drosophila causa a
em uma estreita faixa de células abarcando esse limite. A formação de novos olhos em outras regiões do adulto.
proteína Wingless induz então a expressão de outras pro- Aqui, o gene eyeless foi ativado experimentalmente nas regiões da larva
teínas tal como a Vestigial (aqui corada de vermelho) a da mosca que formam a cutícula da cabeça. Na metamorfose, olhos
vários diâmetros de distância. Capítulo 19. (Fotografia compostos pigmentados emergiram desse tecido. Capítulo 23. (Foto-
cortesia de K. Basler.) grafia cortesia de W. Gehring e Science.)
Prancha 30
Expressão do fator de transcrição Oct4
no blastocisto do camundongo.
O fator de transcrição Oct4 é encontrado nas células que
irão formar o embrião, ao passo que está ausente naquelas
células que irão formar a placenta. A cromatina está corada
com iodeto de propídio (vermelho) enquanto a proteína
Prancha 29 Oct4 está corada de verde. A sobreposição é indicada pela
Polifenismo sazonal de Araschina levana
levana,, cor amarela que mostra a presença de Oct4 somente nas
a borboleta mapeada européia. células da massa celular interna. Capítulos 5 e 22. (Foto-
Várias espécies de borboletas desenvolvem-se de maneira diferente nas dife- grafia cortesia de H. R. Schöler.)
rentes estações do ano. Em A. levana, a forma de verão é representada no alto;
a forma de primavera é representada abaixo. Neste caso, as diferenças
desenvolvimentais são produzidas pelo ambiente, especificamente as diferen-
ças na duração do dia. Capítulo 21. (Fotografia cortesia de H. F. Nijhout.)
Prancha 31
Isoladores da expressão gênica.
A proteína BEAF-32 liga-se a centenas de sítios nos
cromossomos politênicos de Drosophila, dividindo
os cromossomos em domínios funcionais. Suspeita-
se que sinais regulatórios de um domínio não atra-
vessem o limite para o próximo. O DNA foi corado
de vermelho com iodeto de propídio. O anticorpo da
proteína BEAF-32 está corado de verde e a
sobreposição aparece em amarelo. Capítulo 11. (Fo-
tografia cortesa de U. K Laemmli.)
Prancha 33
Expressão assimétrica da proteína Flectina no
coração em desenvolvimento do pinto.
Essa proteína da matriz extracelular (corada de ama-
Prancha 32 relo) acumula-se predominantemente no lado esquer-
Polaridade dorsoventral do tubo neural do pinto. do do embrião do pinto no estágio 10. Capítulos 9 e
Sinais difusíveis da notocorda (tubo verde em baixo) induzem a forma- 16. (Fotografia confocal laser de varredura cortesia
ção da placa do assoalho no lado ventral do tubo neural (verde). As de K. Linask.)
células da placa do assoalho induzem a formação de duas regiões de
neurônios motor (dourado) nos lados ventrolaterais. A notocorda tam-
bém restringe a expressão da proteína Dorsalin (necessária para o de-
senvolvimento das células da crista neural) para a região mais dorsal do
tubo neural (azul). Capítulos 7 e 17. (Fotografia cortesia de T. M. Jessell.)
Prancha 35
Localização das células mesenquimatosas
ouriço--do
primárias no embrião do ouriço -mar
-mar..
do-mar
Prancha 34 Nesta micrografia confocal imunofluorescente somente é mos-
Cuidado parental de girinos de rã. trada parte da blástula mesenquimatosa. As células mesenqui-
Girinos da rã de jato-venenoso reticulada (‘poison-dart frog”) são matosas primárias estão coradas de verde e a β-catenina está
carregados no dorso de seus pais para pequenas poças de água na base corada de vermelho. β-catenina é vista nas junções aderentes das
de folhas de bromélia no dossel da floresta tropical. A fêmea das membranas celulares embrionárias, e também é encontrada no
espécies amazônicas do Peru, em seguida, supre ovos não-fertilizados citoplasma e núcleos das células que servem de alvos para a
como alimento aos girinos em desenvolvimento. Capítulo 9. (Foto- migração das células mesenquimatosas primárias. Capítulo 6.
grafia por M. Fogden/DRK Foto.) (Fotografia cortesia de J. R. Miller e D. McClay.)
Segmentos da antena ANTENA usadas pelos discos imaginais para espe-

cificar informação posicional podem ser
Arista as mesmas na mosca inteira. Ou seja, os
discos podem especificar os destinos res-
pectivos de suas células pelos mesmos
mecanismos. Isso é chamado de especifi-
cação homóloga. Portanto, células no dis-
Garras PERNA
co do olho podem responder às mesmas
“deixas” posicionais que as células no
Coxa disco da perna. Especificação homóloga
pode ser vista com certos mutantes ho-
Segmentos tarsais meóticos como Antennapedia, na qual
Trocanter
estruturas antenais são transformadas em
pernas (Postlethwait e Schneiderman,
1971). Ocasionalmente, a antena inteira se
Tíbia torna uma perna inteira, mas é mais co-
Fêmur
mum que somente uma porção da antena
seje parecida com a perna. No último caso,
a troca é absolutamente específica da po-
sição. As células do disco da antena que
normalmente formariam a extremidade
Figura 19.22 distal da antena (arista) são transforma-
Correspondência entre porções da antena e porções da perna. No mutante Antennapedia, regiões das na porção mais distal da perna (gar-
da antena são transformadas em estruturas da perna. As flechas mostram as porções da antena ra); células especificadas para dar origem
que formam porções correspondentes específicas da perna. Essa correspondência foi também à segunda porção da antena são transfor-
observada nos padrões de transcrição de genes tais como salm. (De acordo com Postlethwait e madas na segunda porção (trocanter) da
Schneiderman, 1971.) perna. As partes correspondentes das
duas estruturas estão ilustradas na Figu-
apterous se encontram com as células superfícies dorsal e ventral da asa são coor- ra 19.22. Então, é aparente que os dois
ventrais que não expressam apterous. O denados. As superfícies dorsal e ventral da discos determinados diferentemente usam
fator de transcrição de Apterous ativa a ex- asa são grudadas pelas integrinas em am- um mecanismo comum para a especifica-
pressão dos genes fringe e serrate nas cé- bos epitélios (Brower e Jaffe, 1989; Kim et ção dos destinos das células dentro dos
lulas dorsais (Irvine e Wieschaus, 1994; al., 1996). [meta1.html] respectivos discos.*
Williams et al., 1994; Kim et al., 1995). As A hipótese do limite aqui discutida, Sim, é muito complexo e é provável que
proteínas Fringe e Serrate agem promoven- não explica certas observações envolven- fique ainda mais complexo. Mas não há falta de
humor. Sidney Brenner (1996) relembra a frus-
do a transcrição dos genes vestigial e do a polaridade D/V da perna ou a
tração do Prêmio Nobel Francis Crick com essa
wingless nas células que revestem a fron- distalização dos apêndices. Held (1995) complexidade dizendo “Deus sabe como esses
teira D/V (Frontispício). O fator de transcri- sugere que existe um gradiente da proteí- discos imaginais funcionam”. Brenner fantasiou
ção Vestigial ativa os genes específicos da na Dpp que estimula a síntese de molécu- uma reunião onde Crick pergunta a Deus como
asa ventral, enquanto que a proteína las (ainda não identificadas) necessárias ele construiu essas entidades e fazendo com que
o próprio Deus também se supreendesse com
Wingless se difunde da célula para sinalizar para estender o apêndice e estabelecer a
essa complexidade. Finalmente tudo o que Deus
a célula dorsal adjacente que expresse seus polaridade nas três dimensões. pôde fazer foi assegurar a Crick que “estamos
genes específicos da asa dorsal. Dessa ma- construindo moscas aqui por 200 milhões de anos
neira, o crescimento e a diferenciação das Especificação homóloga. As moléculas e não tivemos nenhuma reclamação”.
Remodelação do sistema nervoso
Como na metamorfose de anuros, a metamorfose de insetos causa uma grande

reestruturação do sistema nervoso do organismo. Alguns nervos morrem, outros as-
sumem novas funções. No Capítulo 17, vimos o desenvolvimento de fotorreceptores
a partir das células epiteliais do disco do olho. Aqui, um novo conjunto de neurônios
é gerado para assumir uma nova função. Os neurônios que se conectaram para matar
tecidos, ou morrem com o tecido ou são reespecificados para novas funções. O nervo
do músculo proleg da lagarta da mariposa Manduca é independentemente sensível à
ecdisona e morre simultaneamente com o tecido alvo larval. Entretanto, o neurônio
motor inervando o segundo músculo oblíquo da larva sobrevive a morte de seu alvo,
para inervar um músculo adulto recém-formado (o quarto músculo externo dorsal) que
se diferencia durante a metamorfose (Truman et al., 1985).
Em alguns casos, as funções larvais são assumidas por diferentes regiões no
adulto. O vaga-lume larval tem suas lanternas pareadas no oitavo (último) segmento
abdominal; os neurônios desse segmento controlam a luminescência da larva. Duran-
te a pupação, o sexto e o sétimo segmentos também desenvolvem os fotocitos produ-
tores de luz e os nervos para controlar a regulagem do flash. No fim da pupação,
somente o sexto e o sétimo segmentos têm lanternas funcionais. Ainda mais, se as
lanternas larvais forem removidas, as lanternas adultas ainda se formarão (Strause et
al., 1979). Portanto, o que havia sido uma função neural dos gânglios do oitavo seg-
mento se tornou uma função dos gânglios do sexto e sétimo segmentos.
Controle Hormonal da Metamorfose de Insetos
O controle hormonal da metamorfose de insetos foi mostrado nos experimentos

dramáticos de Wigglesworth (1934), que estudou o Rodnius prolixus, um inseto
sugador de sangue que tem cinco instares antes de sofrer uma surpreendente meta-
morfose. Quando uma larva de Rodnius do primeiro instar foi decapitada e fundida
a uma larva em muda do quinto instar, o diminuto primeiro instar desenvolveu a
cutícula, a estrutura do corpo e a genitália do adulto. Isso mostrou que os hormôni-
os carreados pelo sangue são responsáveis pela indução da metamorfose.
Wigglesworth também mostrou que a corpora allata, perto do cérebro do inseto,
produz um hormônio que contra ataca essa tendência para sofrer metamorfose. Se a
corpora allata fosse removida de uma larva do terceiro instar, a próxima muda trans-
formaria a larva em um adulto precoce. Inversamente, se a corpora allata de uma
larva do quarto instar fosse implantada em uma larva do quinto instar, essas larvas
se tornariam larvas enormes do “sexto instar” e não adultos. Sabemos atualmente
que a corpora allata secreta o hormônio juvenil, um inibidor natural da metamorfose
(que será discutido em breve).
Transplante de tecidos em insetos, realizados em vários laboratórios, permitiram
o estabelecimento de uma visão integrada de como se dá a metamorfose. Ainda que
o mecanismo detalhado da metamorfose seja diferente entre as espécies, o padrão
geral da ação hormonal é usualmente bastante similar (Figura 19.23). Como na meta-
morfose dos anfíbios, a metamorfose nos insetos parece ser regulada por hormônios
efetores controlados por hormônios peptídicos neurosecretores no cérebro (para
revisões, veja Gilbert e Goodman,1981; Granger e Bollenbacher, 1981). O processo
de muda é iniciado no cérebro, onde células neurosecretoras liberam o hormônio
protoracicotrópico (PTTH) em resposta a fatores neurais, hormonais ou ambientais.
PTTH é uma família de hormônios peptídicos com um peso molecular de aproximada-
mente 40.000, que estimulam a produção de ecdisona pela glândula protorácica
(Figura 19.24). A ecdisona, entretanto, não é um hormônio ativo, mas um pré-hormô-
nio que precisa ser convertido para a forma ativa. Essa conversão é realizada por
uma oxidase contendo heme nas mitocôndrias e microssomos de tecidos periféricos
como o corpo gorduroso. Aqui a ecdisona é transformada no hormônio ativo 20-
hidroxiecdisona (Figura 19.25).*
Cada muda é ocasionada por um ou mais pulsos de 20-hidroxiecdisona. Para uma
muda de uma larva, o primeiro pulso produz um pequeno aumento na concentração de
hidroxiecdisona na hemolinfa da larva (sangue) e produz uma mudança no comprome-
timento celular. O segundo, grande pulso de hidroxiecdisona inicia os eventos de
Desde sua descoberta em 1954, quando Butenandt e Karlson isolaram 25mg de ecdisona a partir
de 500kg de pupas da mariposa do bicho-da-seda, a 20-hidroxiecdisona teve vários nomes, incluindo
β-ecdisona, ecdisterona e crustecdisona.
Hormônio protora- PTTH

cicotrópico (PTTH)
Ecdisona
Glândula
protorácica
Células
neurossecretoras Corpus
Cérebro cardiacum Hidroxiecdisona
20-hidroxiecdisona
Regulação
Corpus
allatum Epiderme L/P L/P Epiderme
Disco
imaginal
P,L/A
Proteína ligante Hormônio juvenil P/A Epiderme
(JHBP) discos P/A
imaginais
Hormônio
juvenil (JH)
JH-JHBP
Dia do quarto Dia do quinto instar Pupa

instar
Figura 19.23
Diagrama esquemático ilustrando o controle da muda e da metamorfose na mariposa do
verme chifrudo do tabaco. Parecem haver períodos criticamente sensíveis quando a presença
ou ausência de JH determina se um tecido é retido no mesmo estágio ou se muda a um estado
de maior maturidade. Diferentes tecidos têm diferentes períodos sensíveis. (De acordo com
Nijhout, 1994.)
diferenciação associados com a muda. A hidroxiecdisona produzida por esses pulsos

compromete e estimula as células epidérmicas a sintetizar enzimas que digerem e reciclam
os componentes da cutícula. Em alguns casos, condições ambientais podem controlar
a muda, como no caso da mariposa do bicho-da-seda Hyalophora cecropia. Aqui, a
secreção de PTTH cessa após a formação da pupa. A pupa permanece nesse estado de
suspensão chamado diapausa, durante todo o inverno. Se não for exposta ao frio, a
diapausa pode durar indefinidamente. Mas se for exposta ao frio por duas semanas, a
pupa pode sofrer uma muda quando retornada a uma temperatura mais quente (Williams,
1952,1956; veja Capítulo 21).
O segundo importante hormônio efetor no desenvolvimento de insetos é o hor-
mônio juvenil (JH). A estrutura de um ativo hormônio juvenil comum em borboletas
e lagartas de mariposas está ilustrada na Figura 19.25A. O JH é secretado pela Figura 19.24
corpora allata. As células secretoras da corpora allata são ativas durante as mudas Localização celular do mRNA de PTTH na
larvais mas inativas na muda metamórfica. Esse hormônio é responsável pela pre- larva de Bombyx mori (mariposa do bicho-
venção da metamorfose. Enquanto o JH está presente, as mudas estimuladas por da-seda). Hibridização in situ de um gene
hidroxiecdisona resultam em um novo instar larval. No último instar larval, o nervo radioativo clonado para o peptídeo de 224
mediano do cérebro à corpora allata inibe a produção do hormônio juvenil pela aminoácidos localiza o mRNA do PTTH em
duas células neurossecretoras no hemisfério
glândula, e há um aumento simultâneo na habilidade do corpo em degradar o JH
esquerdo do cérebro e duas células neuros-
existente (Safranek e Williams, 1989). Ambos os mecanismos causam uma queda dos secretoras no hemisfério direito. Nesta se-
níveis de JH a um valor abaixo do limite crítico. Isso desencadeia a liberação de ção, uma célula secretora de PTTH pode ser
PTTH do cérebro (Nijhout e Williams, 1974; Rountree e Bollenbacher, 1986). PTTH, vista em cada lado. A barra representa
por sua vez, estimula as glândulas protorácicas a secretar uma pequena quantidade 100µm. (de Kawakami et al., 1990, cortesia
de ecdisona. A hidroxiecdisona resultante, na ausência de JH, compromete as células de H. Ishizaki e A. Kawakami.)
para o desenvolvimento pupal. Os mRNAs específicos para as larvas não são subs-
tituídos e novos mRNAs são sintetizados, cujos produtos protéicos inibem a trans-
crição das mensagens larvais. Após o segundo pulso de ecdisona, são sintetizados
Hormônio juvenil novos produtos de genes específicos de pupas (Riddiford, 1982), e a muda subse-
qüente transforma o organismo de larva para pupa. Parece, portanto, que o primeiro
pulso de ecdisona durante o último instar larval desencadeia o processo que inativa
os genes específicos da larva e prepara para transcrição os genes específicos de
pupa. O segundo pulso de ecdisona transcreve os genes específicos para a pupa e
inicia a muda (Nijhout, 1994).
Até recentemente e desde a década de 1950, acreditava-se que o tipo de muda era
determinado pela concentração de hormônio juvenil no momento dos pulsos de
ecdisona. Altos níveis de JH induziam as larvas, níveis intermediários produziam pupas
e baixos níveis de JH produziam adultos (veja Piepho,1951; veja também o Capítulo 20
da Quarta Edição deste livro). Entretanto, quando o título de JH pôde efetivamente ser
Ecdisona determinado, encontrou-se que ele flutuava durante o período do último instar, tendo
picos e vales específicos. A metamorfose não está correlacionada a um declínio pro-
gressivo na atividade de JH e nem é causada por ele. O controle da metamorfose deve
ser mais complexo.
Na mariposa chifruda do tabaco Manduca sexta, existem momentos quando
diferentes células são sensíveis a hormônios juvenis (veja Figura 19.23). Como regra
geral, se o JH está presente em um período sensível ao hormônio, o estado corrente
do desenvolvimento é mantido, mas se o JH estiver ausente nesse período esse
tecido progredirá a um estágio de desenvolvimento mais maduro. O início e a dura-
ção do período sensível ao JH parece ser um estado autônomo da célula e não é
20-hidroxiecdisona controlado por hormônios (Nijhout, 1994). (Foi considerado que esse deve ser um
momento quando receptores de JH estão à disposição nesses tecidos.) Em cada
Figura 19.25 instar larval existe um período quando a presença de JH impede a transformação da
Estruturas de um hormônio juvenil de ocorrên- epiderme larval em epiderme pupal. Se o JH está presente, a epiderme continua a ser
cia comum, ecdisona, e do hormônio ativo da larval; se o JH está ausente, ela se torna pupal. Em larvas no penúltimo instar, os
muda, 20-hidroxiecdisona. títulos de JH conseguem reter a epiderme no seu estado larval. Durante o último
instar existem duas janelas de sensibilidade ao JH. A primeira é para a epiderme;
nesse momento, entretanto, os níveis de JH já baixaram significativamente e a
epiderme será transformada de larval a pupal. O segundo período sensível ao JH diz
respeito ao tecido do disco imaginal. Nesse momento, todavia, o título de JH aumen-
tou novamente, de modo que os discos imaginais não são instruídos para inverter
ou diferenciar. A muda transforma a larva em pupa (Nijhout e Wheeler, 1982). No
momento seguinte, ocorrem pulsos de ecdisona, e não se identifica JH nos períodos
críticos. A epiderme se transforma de pupal à adulta, e os discos imaginais podem
inverter e se diferenciar. A injeção de JH na pupa nesse momento pode fazer com que
ele mude para uma segunda pupa (Williams, 1959).
Como na metamorfose da rã, a regulagem da ecdise deve ser meticulosamente
coordenada. Muitos dos comportamentos vistos durante a metamorfose são caracte-
rísticos daquele estágio, e o fracasso em realizá-los deixa o inseto fatalmente enredado
na sua velha cutícula. A coordenação dos movimentos e trocas de cutícula é provavel-
mente regulada por uma cascata de hormônios, onde o hormônio da eclosão do cére-
bro ativa a secreção de hormônios desencadeadores de ecdise pelas células na base
de cada espiráculo. Os hormônios desencadeadores de ecdise sinalizariam os gânglios
abdominais de cada segmento para iniciar os movimentos que permitem que a larva
descarte sua velha casca (Žitòan et al., 1996).
Na Drosophila, existe uma variação desse tema geral (Riddiford, 1993). A ecdisona
é liberada pela glândula em anel (uma estrutura tendo regiões similares tanto ao
corpus allatum como a glândula protorácica). Um pulso de ecdisona com título alto
no fim do terceiro instar sinaliza o início da metamorfose. A larva cessa o movimento,
inverte seus espiráculos e permite que a cutícula larval endureça em um puparium
(casulo pupal) que envolve o organismo durante sua metamorfose. Nesse estágio,
os discos imaginais se invertem para formar o esquema básico do corpo adulto, mas
ainda com a cabeça presa dentro da cavidade do corpo. Após 12 horas (a 25°C), um
breve pulso de ecdisona desencadeia a emergência da cabeça a partir do tórax e a
transição de “prepupa” à pupa. A cabeça é empurrada para fora pela contração de
músculos abdominais, que empurram uma bolha de ar para o interior, produzindo um
espaço para a cabeça everter (Fristrom e Fristrom, 1993). Um surto subseqüente de
ecdisona completa a diferenciação final da pupa de Drosophila para a forma adulta,
imediatamente antes da eclosão, a “produção” do adulto a partir do casulo pupal.
Como em outros insetos, a Drosophila tem um hormônio de eclosão que inicia os
movimentos e comportamentos que permitem ao adulto se desvencilhar de seu ca-
sulo pupal para um mundo maior.
A biologia Molecular da Atividade da Hidroxiecdisona
A LIGAÇÃO DE HIDROXIECSIDONA AO DNA. Durante a muda e a metamorfose,

certas regiões dos cromossomos politênicos da Drosophila formam tufos em certas
células (Veja Figura 2.13; Clever, 1966; Ashburner, 1972; Ashburner e Berondes,
1978). Esses tufos cromossômicos representam áreas onde o DNA está sendo ativa-
mente transcrito. Mais ainda, o padrão específico de órgãos de formação de tufos
pode ser reproduzido cultivando o tecido larval e adicionando hormônios ao meio
ou fornecendo hidroxiecdisona à larva em um estágio precoce. Quando a hidroxi-
ecdisona é adicionada às glândulas salivares da larva, certos tufos são produzidos e
Figura 19.26
Tufos induzidos por ecdisona em células cultivadas da glândula salivar de
D. melanogaster. Aqui, a região do cromossomo é a mesma da Figura
2.13. A formação de tufos é induzida pela ecdisona. (i) Controle não
induzido. (ii-v) Cromossomos estimulados por hidroxiecdisona após 25
minutos, 1, 2 e 4 horas. (Cortesia de M. Ashburner.)
outros regridem (Figura 19.26). A formação de tufos é mediada pela ligação de hidro-
xiecdisona a locais específicos nos cromossomos; anticorpos fluorescentes contra
a hidroxiecdisona encontram esse hormônio localizado nas regiões sensíveis a ele
(Gronemeyer e Pongs, 1980).
DIFERENTES RECEPTORES DE HIDROXIECDISONA EM DIFERENTES TECI-

DOS. Os tecidos de larvas em instares tardios podem ser grosseiramente divididos
em três tipos com base em suas respostas à hidroxiecdisona: (1) os tecidos estrita-
mente larvais (tais como, glândulas salivares, músculo e intestino) que sofrem morte
celular em resposta à hidroxiecdisona; (2) os tecidos imaginais que se dividem e se
diferenciam para produzir estruturas adultas quando expostos à hidroxiecdisona; e
(3) tecidos que sofrem extensas modificações ou remodelagem, tais como o corpo
gorduroso ou o sistema nervoso central. Não se sabe como um grupo de células
prolifera enquanto outro degenera recebendo o mesmo sinal, mas estudos recentes
(Talbot et al., 1993; Truman et al., 1994) sugerem que nem todos os receptores de
ecdisona são os mesmos em cada tecido. O gene para o receptor de ecdisona (EcR)
pode ser alternativamente emendado dentro de três mRNAs que fornecerão três
proteínas diferentes, mas relacionadas: EcR-A, EcR-B1 e EcR-B2 (Figura 19.27). To-
das as células parecem ter um pouco de cada uma, mas os tecidos estritamente
larvais e os neurônios regressivos são caracterizados por sua abundância em EcR-
B1 em comparação com EcR-A. Discos imaginais e neurônios diferenciados, de ou-
tro lado, mostram uma preponderância da isoforma EcR-A sobre EcR-B1. É possível,
portanto, que os diferentes receptores ativem diferentes conjuntos de genes quan-
do ligam hidroxiecdisona.
O BROAD-COMPLEX. Outra razão para a resposta específica de tecidos à ecdisona

pode ser a presença de outros fatores de transcrição nesses tecidos. Um dos genes
precoces estimulados pela ecdisona é o gene Broad-Complex (Br-C). Esse é um
gene complexo, composto de unidades de transcrição parcialmente superpostas
que criam várias proteínas de fatores de transcrição através de mensagens diferen-
cialmente emendadas. Em alguns mutantes de BR-C, as glândulas salivares não
morrem como normalmente o fazem na metamorfose. Em outros mutantes, a cabeça
Figura 19.27 não emerge ou o SNC não sofre remodelação. A marcação com anticorpos específi-
Formação dos receptores de ecdisona. Emen- cos para as isoformas mostra uma fascinante correlação entre o tipo de proteína BR-
das alternativas no mRNA de transcritos do C no núcleo e o tipo de resposta à ecdisona. Órgãos como as glândulas salivares,
receptor de ecdisona (EcR) cria três tipos de destinadas à histólise durante a metamorfose, expressam a isoforma Z1; os discos
mRNAs de EcR. Esses geram proteínas com imaginais destinados à diferenciação celular expressam a isoforma Z2; e o sistema
os mesmos sítios de ligação tanto para o DNA
nervoso central (que sofre intensa remodelação na metamorfose) expressa todas as
como para a hidroxiecdisona, mas com amino-
terminais muito diferentes. (De acordo com
isoformas, com Z3 predominando (Figura 19.28; Emery et al., 1994). Moscas
Talbot et al., 1993.)
A1 A2 A3
Síntese de mRNA Proteína EcR
Seqüências lider ou
seguidora (não traduzidas)
Éxons traduzidos
Íntrons
Sítio de Sítio de ligação

ligação de ecdisona
de DNA
(A) (B) Figura 19.28

Anti Z3 Coloração de DNA Especificidade das isoformas do Broad-
Complex. Anticorpos fluorescentes localizam
Corpo gorduroso Glândula salivar Corpo gorduroso Glândula salivar a isoforma Z3 nos núcleos do corpo gorduroso
mas não nos núcleos das glândulas salivares.
(A) Preparações de cromossomos do corpo
gorduroso (esquerda) e da glândula salivar (di-
reita) marcados com anticorpos específicos à
isoforma Z3 do Broad-Complex. (B) As mes-
mas preparações coradas para DNA. (Foto-
grafias cortesia de I. Emery.)
transgênicas demonstraram que essas diferenças são funcionalmente importantes.

Transcrição de genes dependente de ecdisona nas glândulas salivares (finalmente
levando à sua destruição) envolve a expressão precoce, dependente de ecdisona,
da isoforma Z1 do Broad-Complex. As proteínas Z2, Z3, ou Z4 não serão suficientes Complexo receptor
(Crossgrove et al., 1996). Essas isoformas também têm correlação com os tipos de de ecdisona (EcR)
mutação gerados pelos alelos mutantes nesse loco. Portanto, a especificidade de
resposta pode ser controlada por uma isoforma específica do Broad-Complex que é
estimulada pela ecdisona. Entretanto, algum outro fator no tecido larval deve interagir Hidroxiecdisona
com o mecanismo de emenda na célula produzindo a estrutura específica do éxon na EcR
mensagem BR-C.
DIFERENTES RECEPTORES DE ECDISONA DENTRO DE UMA ÚNICA CÉLULA.

As respostas à hidroxiecdisona devem ser coordenadas tanto temporal quanto espa-
cialmente. Assim, em adição à heterogeneidade de respostas à hidroxiecdisona entre
tecidos, existe também uma heterogeneidade de respostas dentro de uma célula indi-
Tufo precoce Tufo tardio
vidual. Os tufos sensíveis à hidroxiecdisona ocorrendo nos estágios tardios da larva
no terceiro instar (ao se preparar para formar a pupa) podem ser divididos grosseira-
mente em três categorias: tufos que regridem devido à hidroxiecdisona; tufos que a Síntese de
proteína
hidroxiecdisona induz rapidamente; e tufos vistos inicialmente algumas horas após a
estimulação. Por exemplo, nas glândulas salivares da larva, cerca de seis tufos emer-
gem dentro de poucos minutos após o tratamento com hidroxiecdisona. Esses genes
não necessitam de síntese de proteína para serem ativos. Um conjunto muito maior de
genes é induzido mais tarde no desenvolvimento, e esses necessitam de síntese protéica Figura 19.29
para serem transcritos. Ashburner (1974, 1990) predisse que os genes “precoces” Modelo de Ashburner da regulação de hidro-
produzem uma proteína que é essencial para a ativação dos genes “tardios”. Ainda xiecdisona da transcrição. A hidroxiecdisona
se liga ao seu receptor e esse composto se liga
mais, essa própria proteína desligaria a transcrição do gene precoce (Figura 19.29).
a um gene de tufo precoce e a um gene de tufo
Pesquisas recentes suportam essa idéia e sugere que os genes precoces represen- tardio. O gene do tufo precoce é ativado, e seu
tam fatores de transcrição que podem mediar o efeito da ecdisona. Os receptores de produto protéico (1) reprime a transcrição de
ecdisona (EcRs) constituem uma família de fatores de transcrição derivados de um seu próprio gene e (2) ativa o gene do tufo
único gene, e eles ligam esse hormônio esteróide e o trazem à região específica do tardio, talvez por deslocar o receptor de
DNA. Como nos receptores ligantes de esteróides dos vertebrados, os EcRs formam ecdisona. (De acordo com Richards, 1992.)
Figura 19.30 (A) Formação do puparium

Padrões de expressão gênica regulada por
ecdisona na metamorfose de Drosophila. (A)
Padrão temporal da expressão gênica. Os pul-
sos de ecdisona são as barras verticais na parte
superior, a altura corresponde à intensidade dos
pulsos. O desenvolvimento progride da esquer-
da para a direita, começando com o terceiro
instar, as mudas são representadas por linhas Pupa
pontilhadas. (B) Interações subjacentes aos Larva do terceiro instar Prepupa
Picos de ecdisona
padrões de transcrição temporal. Flechas re-
presentam ativação, enquanto as linhas bloque-
adas representam os efeitos repressivos. (De
acordo com Thummel, 1996.) mRNAs precoces
mRNA precoce-tardio
mRNA prepupal intermediário
Genes de adesão Genes de resposta

Genes tardios L71 secundária
(B) Larva
precoce do Larva tardia Prepupa Prepupa
terceiro do terceiro intermediária tardia
instar instar
Baixa Alta Baixa Alta
concentra- concentra- concentra- concentra-
ção de ção de ção de ção de
ecdisona ecdisona ecdisona ecdisona
Genes Genes Genes

Genes ng tardios tardios
Pig-1 de adesão
L71
heterodímeros. Os receptores de ecdisona não ligam ecdisona ou suas respectivas

seqüências de DNA sem antes formar um heterodímero com o produto do gene
ultraspiracle (USP) (o análogo do receptor retinóide em Drosophila; Yao et al., 1992;
Thomas et al., 1993). Quando o heterodímero EcR/USP está formado, ele liga a hidro-
xiecdisona e ativa os genes responsivos à ecdisona mais precoces.
Algumas dessas interações estão sendo elucidadas. Como ilustrado na Figura
19.30, os genes EcR, BR-C e E74B são expressos em baixas concentrações de ecdisona,
tais como aquelas encontradas no final do período do terceiro instar. As proteínas BR-
C são necessárias para manter a transcrição dos genes das proteínas de aderência (as
proteínas de aderência permitem à pupa da Drosophila aderir ao seu substrato) e a
reprimir genes larvais anteriores. E74B é necessária tanto para manter a ativação dos
genes de aderência como para reprimir genes como o L71 cujas proteínas formam o
puparium. No fim do período do terceiro instar, existe um pulso alto e característico de
ecdisona. Essas concentrações mais altas de ecdisona reprimem os genes da aderência
e substituem a transcrição do gene E74 que em lugar de sintetizar E74B passa a

transcrever a proteína E74A relacionada.* Enquanto E74B inibia a expressão do gene
L71, E74A a estimula (Urness e Thummel, 1995). Nesse e em outros casos, está ocor-
rendo a transição de larva para pupa.
Além disso, a cascata de ativações e repressões transcricionais pode gerar novos
receptores de ecdisona. Quando o gene EcR é desacelerado na formação do puparium,
os produtos dos genes E75 ou E78 podem assumir suas funções (Koelle et al 1991;
Stone e Thummel, 1993). Dessa maneira, a ecdisona induz uma cascata de fatores de
transcrição que podem ativar ou reprimir diferentes conjuntos de genes.
Assim, é possível que a ecdisona inicie “ondas” de ativação transcricional, e que
diferentes níveis do hormônio possam ativar diferentes conjuntos de genes. Dessa
maneira, o desenvolvimento da Drosophila parece ser semelhante ao dos anfíbios, a
coordenação das mudanças sendo orquestradas por diferentes concentrações de
hormônios. Os “alvos” desses fatores de transcrição estão começando a ser identifi-
cados. Alguns desses alvos parecem ser “fatores de competência” que dão a outros
genes a possibilidade de serem induzidos mais tarde no desenvolvimento. Por exem-
plo, na metade do estágio prepupal o título de ecdisona é diminuído. Isso torna possí-
vel a transcrição de outro fator, βFTZ-F1. O gene codificando βFTZ-F1 necessita ter
um pulso anterior de ecdisona para se tornar potencialmente ativo, mas ele inicia a
transcrição somente quando o título do hormônio é diminuído. Outros alvos podem
incluir os genes reaper e hid, que se tornam ativados naqueles tecidos (como as
glândulas salivares) que sofrem morte celular dependente de ecdisona.
A biologia molecular está começando a interpretar uma das mais fascinantes redes
de interações conhecidas da biologia do desenvolvimento e certamente um dos pri-
meiros exemplos de desenvolvimento animal que conhecemos- a metamorfose da lar-
va para um inseto adulto.
* As proteínas E74A e E74B se originam do mesmo gene pela ativação de diferentes promoto-
res. Ambas partilham a mesma ponta carboxi-terminal com sua região de ligação a DNA. Entretan-
to, a proteína E74A tem um amino terminal mais longo. Os mRNAs de E74B são transcritos em
concentrações de ecdisona dez vezes menores do que aquelas necessárias para ativar a transcrição
das mensagens de E74A (Karim e Thummel, 1991).
& Especulações
Controle ambiental sobre a

forma e a função da larva
A MAIORIA DAS DISCUSSÕES

no desenvolvimento se limitam
ao interior do corpo do organis-
mo. Entretanto, o desenvolvimento de um
organismo algumas vezes pode ser regu-
Carroll Williams em Harvard, ele trouxe
consigo seu principal animal experimen-
tal, o inseto de plantas Europeu Pyrrho-
coris apterus. Para a consternação geral
as larvas. Os resultados foram tanto con-
clusivos como surpreendentes: larvas
cultivadas sobre papel Europeu (incluin-
do páginas da revista Nature) sofriam
do laboratório, os insetos não sofreram metamorfose como sempre, mas as larvas
lado por fatores ambientais, fora do cor- metamorfose no fim do quinto instar, mas criadas em papel Americano (tais como
po. Existem vários tipos de fenômenos se tornaram grandes larvas do sexto ins- cópias descartadas da revista Science)
desenvolvimentais onde substâncias pro- tar- o que nunca havia sido observado no não sofreram metamorfose. Finalmente, foi
duzidas por um organismo (freqüentemen- laboratório ou na natureza- e no fim mor- verificado que a fonte do papel America-
te de outra espécie) induz modificações reram antes de se tornarem adultos. Após no era um abeto balsâmico, uma árvore
no desenvolvimento de outro organismo. o teste de muitas variáveis, foram testa- indígena do Norte dos Estados Unidos e
Quando Karel Sláma veio da Checos- das as toalhas de papel que forravam os Canadá. Essa árvore sintetiza um compos-
lováquia para trabalhar no laboratório de recipientes para verificar seu efeito sobre to muito semelhante ao hormônio juvenil
Adulto
Segundo Terceiro Quarto Quinto
estágio estágio estágio estágio
Primeiro da ninfa da ninfa da ninfa da ninfa
estágio
da ninfa
Precoceno 1
Após tratamento
com precocenos
no estágio 2 Figura 19.31
Metamorfose precoce no inseto Dysdercus causada por precocenos. (A) Es-
trutura de dois precocenos ativos encontrados em plantas. (B) Desenvolvi-
Adulto precoce mento inibido no Dysdercus. Quando ninfas no segundo estágio são tratadas
Precoceno 2
com precocenos, elas se metamorfoseiam em adultos precoces estéreis em
lugar de continuar sua seqüência de mudas do desenvolvimento normal. (De
(A) (B) acordo com Bowers et al., 1976.)
(Bowers et al., 1966; Sláma e Williams, cenos e suas estruturas químicas estão hormônio juvenil é também responsável
1966; Williams, 1970), e provavelmente usa representadas na Figura 19.31A. Quando pela maturação do ovo do inseto (Capítu-
esse análogo do hormônio juvenil para se as larvas ou ninfas desses insetos são lo 21). Sem esse hormônio, as fêmeas são
livrar de certos predadores de insetos. pulverizadas com qualquer um dos com- estéreis. Assim, os precocenos podem
Outras plantas têm compostos que postos, elas sofrem mais uma muda e se proteger as plantas causando uma meta-
produzem o mesmo efeito- a morte de pre- metamorfoseia à forma adulta (Figura morfose prematura de certas larvas de in-
dadores de insetos- mas o fazem induzin- 19.31B). Precocenos causam a morte sele- setos a adultos estéreis.*
do a metamorfose muito cedo. Dois com- tiva das células do corpus allatum no in-
postos que foram isolados de ervas com- seto imaturo (Schooneveld, 1979; Pratt et
postas causam metamorfose precoce em al., 1980). Essas células são responsáveis
larvas de certos insetos transformando- pela síntese do hormônio juvenil. Sem esse Muitas mais dessas mudanças induzidas pelo
os em adultos estéreis (Bowers et al., 1976). hormônio, a larva começa suas mudas ambiente no desenvolvimento das larvas serão
Esses compostos são chamados preco- metamórficas e imaginais. Mais ainda, o discutidas no Capítulo 21.
Interações hormonais múltiplas no

desenvolvimento da glândula mamária
O desenvolvimento das mamas é iniciado durante o desenvolvimento embrionário,
mas somente é completado no mamífero lactante no fim da gravidez. Durante o desen-
volvimento da mama, diferentes hormônios fornecem informação variada ao tecido
rudimentar. O desenvolvimento da mama pode ser dividido em quatro estágios: o
estágio embrionário; o estágio adolescente, a gravidez e a lactação. Os produtos
diferenciados das glândulas mamárias, caseína e outras poteínas do leite, são produ-
zidos somente durante o estágio final (Topper e Freeman, 1980).
Estágio embrionário
No desenvolvimento normal da fêmea do camundongo, duas bandas elevadas de

tecido epidérmico aparecem em ambos os lados da linha mediana ventral no dia 11
da gestação. Esse tecido é chamado de crista mamária. Dentro de cada crista, as
células se reúnem em centros de concentração e lá permanecem formando os brotos
mamários (Figura 19.32). No camundongo existem cinco desses brotos em cada
lado; nos humanos, somente um por lado. Nos dias imediatamente antes do nasci-
mento, as células epiteliais nesses lugares proliferam-se rapidamente, dando origem
(A) Figura 19.32

Seqüência do desenvolvimento precoce da glândula mamária no camun-
dongo fêmea. (A) Broto mamário no feto de 12 dias. Células ectodérmicas
epiteliais invadem o mesênquima. (B) Corda mamária de um feto de 15
dias. Uma pequena fenda no fundo sinaliza o início da ramificação. (C)
Cavidade da corda se estendendo para formar um lúmen oco no feto de 20
dias. (de Hogg et al., 1983, cortesia de C. Tickle.)
(B) (C)
à corda mamária. Essa corda abre na pele, em uma extremidade, formando um mamilo
enquanto a outra extremidade começa a se ramificar em dutos. Aqui o desenvolvi-
mento cessa até a puberdade.
O desenvolvimento do tecido mamário no camundongo macho é idêntico ao da
fêmea até 13-15 dias de gestação. Nessa época, o mesênquima se condensa ao redor
do centro do broto mamário, e as células da corda morrem. Portanto, uma pequena
corda de células epiteliais é destacada da pele (Figura 19.33), e a glândula mamária não
se estende até a superfície. Não ocorre desenvolvimento adicional.
Essa morte celular na corda mamária dos machos tem sido estudada cultivando
os brotos mamários in vitro. Tais brotos de camundongos fêmeas normalmente
desenvolvem lóbulos conectados à superfície (Figura 19.34). Entretanto, se testos-
terona é adicionada ao meio de cultura, os brotos se degeneram. Os brotos mamários
de camundongos machos também desenvolvem lóbulos quando cultivados em au-
sência de testosterona; portanto, o hormônio testosterona impede o desenvolvi-
mento mamário no macho. A testosterona motiva essa morte celular específica ins-
truindo as células mesenquimatosas a destruir a corda epitelial. Isso foi mostrado
por uma série de experimentos de recombinação. Existe em camundongos (e também
em humanos) uma mutação chamada síndrome de insensibilidade androgênica, na
qual indivíduos cromossomicamente machos (XY) não produzem um receptor funci-
onal de testosterona. Assim, apesar desses indivíduos possuírem testículos que
estão secretando testosterona ativamente, eles são incapazes de responder a ela.
Um dos resultados é que esses indivíduos têm um desenvolvimento mamário do
tipo feminino (veja Figura 19.9). Kratochwil e Schwartz (1976) isolaram células epiteliais
e mesenquimatosas a partir de brotos mamários normais e mutantes e os cultivaram Figura 19.33
em várias combinações. Algumas culturas tiveram a adição de testoterona e outras Rudimento mamário em um feto de camun-
não. Os resultados estão mostrados na Figura 19.35. Quando ambos, o mesênquima dongo macho. O rudimento (flecha) se sepa-
e o epitélio, eram do tipo selvagem, o rudimento se desenvolvia em tecido mamário. rou da epiderme. (de Raynaud, 1961.)
Figura 19.34 Epiderme

Papel da testosterona como mediador do desli-
gamento da corda mamária. (A) O tecido ma-
mário do camundongo fêmea, in vivo ou em
cultura, crescerá para baixo a partir da epiderme
e se ramifica. (B) Quando o tecido mamário do
camundongo fêmea é cultivado na presença de
Broto Derme
testosterona, o broto se alonga, mas as células
mesenquimatosas se agregam ao redor da has-
te e a porção inferior é separada, exatamente
como no desenvolvimento normal do macho.
(C) Quando o tecido mamário do camundongo
macho é cultivado em ausência de testosterona,
o desenvolvimento é o mesmo que o da fêmea.
(De acordo com Kratochwil, 1971.)
Haste
Lóbulos
(A) TECIDO NORMAL (B) TECIDO DE FÊMEA (C) TECIDO DE MACHO
DE FÊMEA MAIS TESTOSTERONA SEM TESTOSTERONA
Quando testosterona foi adicionada, o mesênquima se condensou ao redor do broto

e a corda foi separada. Quando epitélio normal foi cultivado com mesênquima mu-
tante (que não podia responder à testosterona), o desenvolvimento normal da mama
ocorreu na presença de testosterona. Entretanto, quando o mesênquima era normal
e o epitélio mutante, a testosterona era capaz de causar a degeneração da corda
Figuras 19.35
Evidência de que a célula mesenquimatosa é o
alvo da testosterona na interrupção do desen-
volvimento mamário. (A) Cultivo de um rudi- (A) (B)
mento mamário de um embrião de fêmea de 14
dias. (B) Rudimento mamário de um embrião
de macho de 14 dias começando sua resposta à
testosterona. (C) Broto mamário recombinado
contendo células epiteliais do tipo selvagem e
mesênquima insensível a andrógenos, cultiva-
do com testosterona. Não se verifica resposta a
andrógenos. (D) Broto mamário recombinado
contendo células epiteliais insensíveis a
andrógenos e mesênquima do tipo selvagem,
cultivado com testosterona. As células mesen-
quimatosas estão condensando na constrição
do broto. (de Kratochwil e Schwartz, 1976,
cortesia de K. Kratochwil.) (C) (D)
mamária. Assim, o alvo da testosterona é o mesênquima e não o epitélio. O mesên-

quima deve ser responsivo à testosterona para que sua ação ocorra. Nos machos, a
testosterona induz o mesênquima mamário a destruir seu epitélio adjacente. O efeito
é específico para o órgão visto que nenhum outro mesênquima destruirá o epitélio
mamário, e nenhum outro epitélio pode ser destruído pelo mesênquima mamário
(Dürnberger e Kratochwil, 1980).
Adolescência
Durante a adolescência (que no camundongo ocorre da semana 4 à semana 6), o

sistema de dutos da glândula mamária prolifera extensivamente. As células alveolares
secretoras de leite nas extremidades dos dutos ainda não se diferenciaram e o leite não
é produzido. A extensa divisão celular está sob o controle de hormônios estrogênio e
de crescimento e parece estar concentrada nas extremidades dos dutos. Estudos da
pesquisadora Coleman e seus colegas (1988) implicaram o fator de crescimento
epidérmico (EGF) como o fator responsável pelo crescimento dos dutos nesse perío-
do. Eles implantaram péletes plásticos de lenta liberação contendo EGF em glândulas
mamárias de camundongos de 5 semanas. Os ovários desses camundongos haviam
sido removidos e, portanto, seu desenvolvimento mamário foi interrompido. Os dutos
adjacentes ao implante de EGF reiniciaram seu crescimento e desenvolvimento
morfológico, ao passo que os dutos mais distantes não o fizeram (Figura 19.36). Ainda
mais, quando secções da glândula mamária foram incubadas com EGF radioativo, o
EGF foi detectado na extremidade dos dutos e associado com as células sofrendo
mitose. Provavelmente o EGF age diretamente causando o crescimento das glândulas
mamárias durante a adolescência.*
Gravidez e lactação Figura 19.36

Crescimento da glândula mamária dependente
Entre a adolescência e a gravidez, as células da mama no camundongo estão mitotica- de EGF em ausência de estrogênio. (A) Não se
mente dormentes e indiferenciadas. Esse estado se modifica durante a segunda meta- observa crescimento de dutos ou diferenciação
de da gravidez. Sob a influência dos hormônios estrogênio e progesterona (o último em camundongos deficientes em estrogênio
da placenta), novos dutos são formados, e suas células distais começam a desenvol- quando um pélete de albumina de soro bovino
ver as características de um tecido secretor. (*) é implantado na glândula mamária. (B)
Quando um pélete contendo EGF é implantada
O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) pode ser um elemento chave na na glândula mamária deficiente em estrogênio,
etiologia dos cânceres de mama (que afetam uma em cada oito mulheres nos Estados Unidos). dutos vizinhos aumentam de tamanho e desen-
Considera-se que alguns cânceres de mama podem se desenvolver se o estrogênio induz TGF-α, um volvem tecido lobular em suas extremidades
ligante alternativo para o EGFR. A ativação de EGFR causaria a contínua proliferação do tecido (flechas). (C) Desenvolvimento normal dos
mamário (Sainsbury et al., 1985; Klijn et al., 1992; McIntyre et al., 1995). dutos mamários em um camundongo controle
de 5 semanas virgem. (de Coleman et al., 1988,
cortesia de S. Coleman.)
(A) (B) (C)

Célula precursora Célula secretora

secretando caseína
Insulina e hidrocortisona
(divisão celular e Prolactina
diferenciação) (sem divisão celular)
Insulina (divisão celular)
Retículo
endoplasmático
rugoso
(A)
(B)
Figura 19.37
Diferenciação da glândula mamária dependen-
te de hormônios. (A) Diagrama esquemático
do desenvolvimento dependente de hormônio
da glândula mamária in vitro. (B) Auto-radio-
grafia da glândula mamária de um camundon-
go virgem com uma sonda de cDNA radioati-
vo para o mRNA da caseína. (C) Auto-radio-
grafia da glândula mamária de um camundon-
go em lactação, com uma sonda de cDNA re-
conhecendo a mensagem da caseína. (D) Auto-
radiografia da glândula mamária de um camun-
dongo virgem incubada com insulina, hidro-
cortisona e prolactina, 72 horas antes de ser
submetida a uma sonda de cDNA para a men-
sagem da caseína. (A de acordo com Turkington,
1968; B-D de Liscia et al., 1988; fotografias
cortesia de G. Smith.)
(C) (D)
Quando glândulas mamárias da metade da gravidez são cultivadas in vitro, a maior

parte das células tem pouco retículo endoplasmático rugoso e aparelho de Golgi e não
tem grânulos de caseína. Quando insulina ou outro promotor de síntese de DNA é
adicionado a essas culturas, as células se tornam responsivas a outros hormônios
(Turkington et al., 1965). (É provável que a insulina esteja apenas mimetizando os
efeitos dos lactogênios placentários, hormônios que têm uma estrutura semelhante e
são produzidos durante a gravidez). Glucocorticóides então induzem a formação do
retículo endoplasmático rugoso, onde a caseína e outras proteínas são sintetizadas.
Quando o camundongo dá à luz, a prolactina é secretada. A prolactina causa a trans-
crição do gene da caseína e estabiliza a mensagem da caseína uma vez formada (Figura
19.37). Durante o período de lactação (quando os filhotes estão mamando), um camun-
dongo fêmea pode produzir cerca de 10% do seu peso corporal em leite por dia. Quase
80% das proteínas daquele leite são caseínas, e destas, a β-caseína é a mais abundante.
O promotor do gene da β-caseína no camundongo está localizado imediatamente a
montante do gene de β-caseína e é ligado por um fator de transcrição, o fator da
glândula mamária (MGF). Altos níveis desse fator de transcrição se acumulam perto
do fim da gravidez e na lactação, mas o fator é inativo a não ser que seja fosforilado. A
fosforilação de MGF ocorre quando a prolactina reúne seus dois receptores na super-
fície da célula. Isso ativa seus domínios de tirosina quinase, que fosforilam uma tirosina
Insulina + hidrocortisona
Figura 19.38 (A)
Insulina, hidrocortisona
Níveis de mRNA de β-caséina em culturas de células da glândula mamária de camundongo em
Insulina + prolactina
diferentes condições de cultura. (A) mRNA endógeno de β-caseína quando as células foram
Somente Insulina
cultivadas durante 6 dias em matriz extracelular ou plástico em meio contendo hormônios como
insulina, hidrocortisona ou prolactina. A matriz extracelular e a prolactina foram essenciais. (B)
+ prolactina
Expressão do gene repórter CAT quando fundido a uma construção contendo o intensificador e Hormônios
o promotor de β-caseína. O gene fundido foi transfectado para células mamárias do camundongo
cultivadas durante 6 dias sob várias condições de substrato e hormônios. O gene fundido foi
expresso somente em presença de prolactina e matriz extracelular. Sem o intensificador (tendo
somente o promotor), não houve transcrição em nenhuma das condições. (De acordo com
Matriz extracelular
Matriz extracelular
Matriz extracelular
Matriz extracelular
Schmidhauser et al., 1992.)
Substratos
Plástico
Plástico
Plástico
Plástico
específica na molécula de MGF. O MGF fosforilado pode entrar no núcleo e se ligar à
região do promotor nos genes das proteínas do leite (Groner e Gouilleux, 1995). A Auto-radiograma
separação dos filhotes da mãe durante a lactação resulta em um rápido decréscimo da
atividade de MGF. A volta à amamentação dos filhotes faz com que a atividade volte ao β-caseína
seu máximo dentro de 4 horas. O efeito pode ser mediado pelos hormônios pituitários
ou hipotalâmicos que são responsivos à sucção (Schmitt-Ney et al., 1992).
A caseína é sintetizada nas células mamárias competentes em resposta à prolactina
somente quando as células estão ancoradas a uma matriz extracelular (Figura 19.38). O (B)
intensificador de β-caseína é responsivo a ambos, a prolactina e a matriz extracelular.
Usando um gene repórter (CAT) ligado a diferentes regiões da seqüência flanqueando
Síntese de CAT
a ponta 5’, Schmidhauser e colegas (1992) encontraram uma seqüência com 160 pares
de bases, a 1517 pares de bases do sítio de início da transcrição (Figura 19.39). Esse
sítio intensificador só funciona em células mamárias, e é responsivo à prolactina e à
matriz extracelular (veja Figura 19.38B).
Portanto, o desenvolvimento da glândula mamária envolve uma complexa interação
de vários hormônios, proteínas parácrinas e fatores ambientais em quatro diferentes
estágios da vida: embrionário, adolescência, gravidez e lactação. A glândula mamária
nunca se desenvolve em machos normais e não se torna um órgão completamente Intensificador Promotor Gene
de β-caseína de β-caseína CAT
diferenciado nas fêmeas até a metade da gravidez no organismo adulto. Estudos desse
órgão nos deu uma visão da complexidade do controle local e hormonal no desenvol-
vimento de mamíferos.
Atividade de CAT
CAT (cpm convertidas/min/µg)
Deleções no 5’ da β-caseína
Figura 19.39
Construções importantes na identificação do intensificador do gene da β-caseína no camundon-
go. O gene CAT foi usado como um repórter e foi fundido à ponta 5’ do gene da β-caseína no
camundongo. A exonuclease removeu pedaços sucessivamente maiores da região do gene
flanqueando a ponta 5’. Enquanto o gene contendo 1677 pares de bases na seqüência flanqueando
a ponta 5’ foi totalmente ativo, a seqüência contendo somente 1517 pares de bases apresentou
pouca atividade. Portanto, foi postulado que o intensificador estava dentro dos 160 pares de
bases. (De acordo com Schmidhauser et al., 1992.)
Vimos que a regulação difusível nas interações célula-célula são também importan-
tes na regulação do desenvolvimento. Estudando a reativação do desenvolvimento
que ocorre durante a metamorfose e o desenvolvimento da mama, podemos identificar
o papel dos hormônios na elicitação de novos padrões de diferenciação e morfogêne-
se. Podemos também ver as interações entre o desenvolvimento do organismo e o
ecossistema do qual ele faz parte. No próximo capítulo, estudaremos os papéis de
fatores difusíveis e autônomos da célula nos processos responsáveis pelo desenvol-
vimento das gônadas e pela determinação do sexo.
LITERATURA CITADA
Alberch, P. and Alberch, J. 1981. Hete-rochronic Blair, S. S. 1995. Compartments and appendage Cohen, B., Simcox, A. A. and Cohen, S. M. 1993.
mechanisms of morphological diversification development in Drosophila. Bio. Essays 17: Allocation of the thoracic imaginal primordia
and evolutionary change in the neotropical 299-309. in the Drosophila embryo. Development 117:
salamander Bolitoglossa occidentalis (Amphibia: 597-608.
Bowers, W. S., Fales, H. M., Thompson, M. J.
Plethodontidae). J. Morphol. 167: 249-264.
and Uebel, E. C. 1966. Identification of an Cohen, P. P. 1970. Biochemical differentiation
Allen, B. M. 1916. Extirpation experiments in active compound from balsam fir. Science 154: during amphibian metamorphosis. Science 168:
Rana pipiens larva. Science 44: 755-757. 1020-1021. 533-543.
Alley, K. E. and Barnes, M. D. 1983. Birth-dates Bowers, W. S., Ohta, T., Cleere, J. S. and Marsella, Cohen, P. P., Brucker, R. F. and Morris, S. M.
of trigeminal motor neurons and metamorphic P. A. 1976. Discovery of insect anti-juvenile 1978. Cellular and molecular aspects of thyroid-
reorganization of the jaw myoneural system in hormones in plants. Science 193: 542-547. hormone action during amphibian metamorpho-
frogs. J. Comp. Neurol. 218: 395-405. sis. Harm. Prot. Peptides 6: 273-381.
Brenner, S. 1996. Francisco Crick in Paradiso.
Ashburner, M. 1972. Patterns of puffing activity Curr. Biol. 6:1202. Coleman, S., Silberstein, G. B. and Daniel, C.
in the salivary glands of Drosophila. VI. W. 1988. Ductal morphogenesis in the mouse
Brower, D. L. and Jaffe, S. M. 1989. Requirements
Induction by ecdysone in salivary glands of D. mammary gland: Evidence supporting a role
for integrins during Drosophila wing develop-
melanogaster cultured in vitro. Chromosoma for epidermal growth factor. Dev. Biol. 127:
ment. Nature 342: 285-287.
38: 255-281. 304-315.
Brown, P. S. and Frye, B. E. 1969. Effect of
Ashburner, M. 1974. Sequential gene activation Condic, M. L., Fristrom, D. and Fristrom, J. W.
prolactin and growth hormone on growth and
by ecdysone in polytene chromosomes of Dro- 1990. Apical cell shape changes during Drosophila
metamorphosis of tadpoles of the frog Rana
sophila melanogaster. II. Effects of inhibitors imaginal leg disc elongation: A novel morphogenetic
pipiens. Gen. Comp. Endocrinol. 13: 139-145.
of protein synthesis. Dev. Biol. 39: 141-157. mechanism. Development 111: 23-33.
Brust, D. G. 1993. Maternal brood care by
Ashburner, M. 1990. Puffs, genes, and hormones Crossgrove, K., Bayer, C. A., Fristrom, J. W.
Dendrobates pumilio: A frog that feeds its young.
revisited. Cell 61: 1-3. and Guild, G. M. 1996. The Drosophila Broad
J. Herpatol. 26: 102-105.
Complex early gene directly regulates late gene
Ashburner, M. and Berondes, H. D. 1978. Puffing
Bryant, P. J. 1970. Cell lineage relationships in transcription during the ecdysone-in-duced
of polytene chromosomes. In The Genetics and
the imaginal wing disc of Drosophila melano- puffing cascade. Dev. Biol. 180: 745-758.
Biology of Drosophila, Vol. 2B. Academic Press,
gaster. Dev. Biol. 22: 389-411.
New York, pp. 316-395. Currie, J. and Cowan, W. M. 1974. Evidence for
Buckbinder, L. and Brown, D. D. 1993. Expres- the late development of the uncrossed retino-
Baker, B. S. and Tata, J. R. 1992. Prolactin
sion of the Xenopus prolactin and thyrotropin thalamic projections in the frog Rana pipiens.
prevents the autoinduction of thyroid hormone
genes during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Brain Res. 71: 133-139.
receptor mRNAs during amphibian metamor-
Sci. USA 90: 3820-3824.
phosis. Dev. Biol. 149: 463-467. De Beer, G, 1940. Embryos and Ancestors.
Butenandt, A. and Karlson, P. 1954. Über die Clarendon Press, Oxford.
Basler, K. and Struhl, G. 1994. Compartment
Isolierung eines Metamorphosen-Hormons der
boundaries and the control of Drosophila limb del Pino, E. M. and Elinson, R. P. 1983. A
Insekten in kristallisierter Form. Z. Naturforsch.,
pattern by hedgehog pro-tein. Nature 368: novel development pattern for frogs: Gastru-
Teil B 9: 389-391.
208-214. lation produces an embryonic disk. Nature 306:
Campbell, G., Weaver, T. and Tomlinson, A. 589-591.
Begon, M., Harper, J. L. and Townsend, C. R.
1993. Axis specification in the developing Dro-
1986. Ecology: Individuals, Populations, and Diaz-Benjumea, F. J. and Cohen, S. M. 1993.
sophila appendage: The role of wingless, deca-
Communities. Blackwell Scientific, Oxford. Interaction between dorsal and ventral cells in
pentaplegic, and the homeobox gene aristaless.
the imaginal disc directs wing development in
Bern, H. A., Nicoll, C. S. and Strohman, R. C. Cell 74: 1113-1123.
Drosophila. Cell 75: 741-752.
1967. Prolactin and tadpole growth. Proc. Soc.
Causo, J. P., Bate, M. and Martánez-Arias, A.
Exp. Biol. Med. 126: 518-521. Diaz-Benjumea, F. J., Cohen, B and Cohen, S,
1993. A wingless-dependent polar coordinate
M. 1994. Cell interaction between compart-
Blair, S. S. 1993. Mechanisms of compartment system in Drosophila imaginal discs. Science
ments establishes the proximal-distal axis of
formation: Evidence that non-proliferating cells 259: 484-489.
Drosophila wings. Nature 372: 175-179.
do not play a role in defining the D/V lineage
Clever, U. 1966. Induction and repression of
restriction in the develop ing wing of Drosophi- Dürnberger, H. and Kratochwil, K. 1980.
a puff in Chironomus tentans. Dev. Biol. 14:
la. Development 119: 339-351. Specificity of tissue interaction and origin of
421-438.
mesenchymal cells in the androgen response Garcia-Bellido, A., Ripoll, P. and Morata, G. 1973. Hinegardner, R. T. 1969. Growth and develop-
of the embryonic mammary gland. Cell 19: Developmental compartmentalization of the ment of the laboratory cultured sea urchin. Biol
465-471. wing disc of Drosophila. Nat. New Biol. 245: Bull. 137: 465-475.
251-253.
Eisen, A. Z. and Gross, J. 1965. The role of Hogg, N. A. S., Harrison, D. J. and Tickle, C.
epithelium and mesenchyme in the production Geigy, R. 1941. Die metamorphose als Folge 1983. Lumen formation in the mammary gland.
of a collagenolytic enzyme and a hyaluronidase gewebsspezifischer determination. Rev. Suisse J. Embryol. Exp. Morphol. 73: 39-57.
in the anuran tadpole. Dev. Biol. 12: 408-418. Zoo/. 48: 483-494.
Hoskins, E. R. and Hoskins, M. M. 1917. On
Elinson, R. P. 1987. Change in developmental Gilbert, L. I. and Goodman, W. 1981. Chemistry, thyroidectomy in amphibia. Proc. Soc. Exp. Biol.
patterns: Embryos of amphibians with large eggs. metabolism, and transport of hormones con- Med. 14: 74-75.
In R. A. Raff and E. C. Raff (eds.), Development trolling insect metamorphosis. In L. I. Gilbert
Hoskins, S. G. and Grobstein, P. 1984. Thy-roxine
as an Evolutionary Process. Alan R. Liss, New and E. Frieden (eds.), Metamorphosis: A Pro-
induces the ipsilateral retinothala-mic projection
York, pp. 1-21. blem in Developmental Biology. Plenum, New
in Xenopus laevis. Nature 307: 730-733.
York, pp. 139-176.
Emery, I. F., Bedian, V. and Guild, G. M. 1994.
Hoskins, S. G. and Grobstein, P. 1985a. Develop-
Differential expression of Broad-Complex trans- Gould, S. J. 1977. Ontogeny and Phylogeny.
ment of the ipsilateral retinothalamic projection
cription factors may forecast tissue-specific de- Harvard University Press, Cambridge, MA, p. 283.
in the frog Xenopus laevis. II. Ingrowth of optic
velopmental fates during Drosophila metamor-
Granger, N. A. and Bollenbacher, W. E. 1981. nerve fibers and production of ipsilaterally
phosis. Development 120: 3275-3287.
Hormonal control of insect metamorphosis. In projecting cells. J. Neurosci. 5: 920-929.
Etkin, W. and Gona, A. G. 1967. Antagonism L. I. Gilbert and E. Frieden (eds.), Metamorpho-
Hoskins, S. G. and Grobstein, P. 1985b. Deve-
between prolactin and thyroid hormone in sis: A Problem in Developmental Biology.
lopment of the ipsilateral retinothalamic
amphibian development. J. Exp. Zool. 165: Plenum, New York, pp. 105-138.
projection in the frog Xenopus laevis. III. The
249-258.
Grimm, S. and Pflugfelder, G. O. 1996. Control role of thyroxine. J. Neurosci. 5: 930-940.
Fallon, J. F. and Simandl, B. K. 1978. Evidence of a of the gene optomotor-blind in Drosophila wing
Huxley, J. 1920. Metamorphosis of axolotl
role for cell death in the disappearance of the development by decapentaplegic and wingless.
caused by thyroid feeding. Nature 104: 436.
embryonic human tail. Am. J. Anal. 152: 111-130. Science 271: 1601-1604.
Irvine, K. D.and Wieschaus, E. 1994. fringe, a
Forehand, C. J. and Farel, P. B. 1982. Spinal cord Grobstein, P. 1987. On beyond neuronal specificity:
boundary-specific signaling molecule, mediates
development in anuran larvae. I. Primary and Problems in going from cells to networks and from
interactions between dorsal and ventral cells
secondary neurons. J. Comp. Neurol. 209: 386-394. networks to behavior. In P. Shinkman (ed.),
during Drosophila wing development. Cell 79:
Advances in Neural and Behavioral Development,
Fox, H. 1973. Ultrastructure of tail degeneration 595-606.
Vol. 3, Ablex, Nor-wood, NJ, pp. 1-58.
in Rana temporaria larva. Folia Morphol. 21:
Jiang, J. and Struhl, G. 1996. Complementary
103-112. Gronemeyer, H. and Pongs, O. 1980. Localiza-
and mutually exclusive activities of decapenta-
tion of ecdysterone on polytene chromosomes
Frieden, E. 1981. The dual role of thyroid plegic and wingless organize axial patterning
of Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad.
hormones in vertebrate development and during Drosophila leg develop-ment. Cell 86:
Sci. USA 77: 2108-2112.
calorigenesis. In L. I. Gilbert and E. Frieden (eds.), 401-409.
Metamorphosis: A Problem in Developmental Groner, B. and Gouilleux F. 1995. Prolactin-
Kalm, L., von, Fristrom, D. and Fristrom, J. 1995.
Biology. Plenum, New York, pp. 545-564. mediated gene activation in mammary ep-ithelial
The making of a fly leg: a model for epithelial
cells. Curr. Opin. Genes Dev. 5: 587-594.
Fristrom, D. and Fristrom, J. W. 1975. The morphogenesis. BioEssays 17: 693-702.
mechanisms of evagination of imaginal disks of Gudernatsch, J. F. 1912. Feeding experiments
Kaltenbach, J. C., Fry, A. E. and Leius, V. K.
Drosophila melanogaster. I. General considera- on tadpoles. I. The influence of specific organs
1979. Histochemical patterns in the tadpole tail
tions. Dev. Biol. 43: 1-23. given as food on growth and differentiation. A
during normal and thyroxine-induced metamor-
contribution to the knowledge of organs with
Fristrom, D. and Fristrom, J. W. 1993. The phosis. II. Succinic dehydrogenase, Mg- and Ca-
internal secretion. Wilhelm Roux Arch. Entwi-
metamorphic development of the adult adenosine triphosphatases, thiamine pyrophos-
cklungsmech. Org. 35: 457-483.
epidermis. In M. Bate and A. Martinez-Arias, phatase, and 5' nucleotidase. Gen. Comp.
(eds.) The Development of Drosophila melano- Guillen, I., Mullor, J. L., Capdevilla, J., Sanchez- Endocrinol. 38: 111-126.
gaster. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Herrero, E., Morata, G. and Guerrero, I. 1995.
Kanamori, A. and Brown, D. D. 1992. The
Cold Spring Harbor, pp. 843-897. The function of engrailed and the specification
regulation of thyroid hormone receptor b genes
of Drosophila wing pattern. Development 121:
Fristrom, J. W. 1972. The biochemistry of by thyroid hormone in Xenopus lae-vis. J. Biol.
3447-3456.
imaginal disc development. In H. Ursprung and Chem. 267: 739-745.
R. Nothiger (eds.), The Biology of Imaginal Hanken, J. and Hall, B. K. 1988. Skull develop-
Karim, F. D. and Thummel, C. S. 1991. Ecdysone
Discs. Springer-Verlag, Berlin, pp. 109-154. ment during anuran metamorphosis II. Role of
coordinates the timing and amounts of E74A
thyroid hormones in osteogenesis. Anat.
Fristrom, J. W., Raikow, R., Petri, W. and and E74B transcription in Drosophila. Genes
Embryol. 178: 219-227.
Stewart, D. 1969. In vitro evagination and RNA Dev. 5: 1067-1079.
synthesis in imaginal discs of Drosophila mela- Held, L. I. Jr. 1995. Axes, boundaries and
Karp, G. and Berrill, N. J. 1981. Development.
nogaster. In E. W. Hanley, Problems in Biolo- coordinates: the ABCs of fly leg development.
McGraw-Hill, New York.
gy: RNA in Development. University of Utah BioEssays 18: 721-732.
Press, Salt Lake City. Kawahara, A., Baker, B. S. and Tata, J. R.
Hepburn, H. R. 1985. Structure of the integu-
1991. Developmental and regional expressi-
Fristrom, J. W., Fristrom, D., Fekete, E. and ment. In G. A. Kerkut and L. I. Gilbert (eds.),
on of thyroid hormone receptor genes during
Kuniyuki, A. H. 1977. The mechanism of Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry,
Xenopus metamorphosis. Development 112:
evagination of imaginal discs of Drosophila and Pharmacology, Vol 3. Perga-mon Press,
933-943.
melanogaster. Am. Zool. 17: 671-684. Oxford, pp. 1-58.
Kawakami, A. and 9 others 1990. Molecular Lynn, W. G. and Peadon, A. M. 1955. The role Norris, D. O., Jones, R. E. and Criley, B. B.
cloning of the Bombyx mori prothoraci-cotropic of the thyroid gland in direct development of 1973. Pituitary prolactin levels in larval,
hormone. Science 247: 1333-1335. the anuran Eleutherodactylus martinicenis. neotenic, and metamorphosed salamanders
Growth 19: 263-286. (Ambystoma tigrinum). Gen. Comp. Endocrinol.
Kim, J., Irvine, K. D. and Carroll, S. B. 1995.
20: 437-42.
Cell recognition, signal induction, and symme- Madhavan, M. M. and Schneiderman, H. A.
trical gene activation at the dorsal-ventral 1977. Histological analysis of the dynamics of Oofusa, K. and Yoshizato, K. 1991. Biochemical
boundary of the developing Drosophila wing. growth of imaginal disc and histioblast nests and immunological characterization of collage-
Cell 82: 795-802. during the larval development of Drosophila nase in tissues of metamorphosing bullfrog
melanogaster. Wilhelm Roux Arch. Dev. Biol. tadpoles. Dev. Growth Differ. 33: 329-339.
Kim, J., Sebring, A., Esch, J. J., Kraus, M. E.,
183: 269-305.
Vorwrk, K., Magee, J. and Carroll, S. B. 1996. Patterson, D., Hayes, W. P. and Shi, Y. B. 1995.
Integration of positional information and Martin, F. D. and Drewry, G. E. 1978. Develop- Transcriptional activation of the metallopro-
identity by Drosophila vestigial gene. Nature ment of Fishes of the Mid-Atlantic Bight, Vol. 6. U. teinase gene stromelysin-3 coincides with thyroid
382: 133-138. S. Department of the Interior, Washington, D.C. hormone-induced cell death during frog
metamorphosis. Dev. Biol. 167: 252-262.
Kinoshita, T., Takahama, H., Sasaki, F. and Mathison, P. M. and Miller, L. 1987. Thyroid
Watanabe, K. 1989. Determination of cell death hormone induction of keratin genes: A two-step Pehrson, J. R. and Cohen, L. H. 1986. The fate
in the developmental process of anu-ran larval activation of gene expression dur-ing develop- of the small micromeres in sea urchin develop-
skin. J. Exp. Zool. 251: 37-46. ment. Genes Dev. 1: 1107-1117. ment. Dev. Biol. 113: 522-526.
Klijn, I. G. M., Berns, P. M. J. J., Schmitz, P. I. McCutcheon, F. H. 1936. Hemoglobin function Piepho, H. 1951. Über die Lenkung der In-
M. and Foekens, J. A. 1992. The clinical during the life history of the bullfrog. J. Cell. sektenmetamorphose durch Hormone. Verh.
significance of EGF-R in human breast cancer: A Comp. Physiol. 8: 63-81. dtsch. Zool. Gessel. 62-76.
review of 5232 patients. Endocr. Rev. 13: 3-17.
McIntyre, B. S., Birkenfeld, H. P. and Sylvester, Pino-Heiss, S. and Schubiger, G. 1989. Extrace-
Kistler, A., Yoshizato, K. and Frieden, E. 1977. P. W. 1995. Relationship between EGFR levels, llular protease production by Drosophila
Preferential binding of tri-substituted thyronine autophosphorylation, and mitogenic resposive- imaginal discs. Dev. Biol. 132: 282-291.
analogs by bullfrog tadpole tail fin cytosol. ness in normal mouse mammary epithelial cells
Postlethwait, J. H. and Schneiderman, H. A.
Endocrinology 100: 134-137. in vitro. Cell Pro-lif. 28: 45-56.
1971. Pattern formation and determination in
Koelle, M. R., Talbot, W. S., Segraves, W. A., Meinhardt, H. 1980. Cooperation of compart- the antenna of the homeotic mutant Antenna-
Bender, M. T., Cherbas, P. and Hogness, D. S. ments for the generation of positional informa- pedia of Drosophila melanogaster. Dev. Biol.
1991. The Drosophila EcR gene encodes an tion. Z. Naturforsch. 35c: 1086-1091. 25: 606-640.
ecdysone receptor, a new member of the steroid
Mitchell, A. W. 1988. The Enchanted Canopy. Prahlad, K. V. and DeLanney, L. E. 1965. A
receptor superfamily. Cell 67: 59-77.
Macmillan, New York. study of induced metamorphosis in the ax-olotl.
Kollros, J. J. 1961. Mechanisms of amphibian J. Exp. Zool. 160:137-146.
Mori, M., Morris, S. M., Jr. and Cohen, P. P.
metamorphosis: Hormones. Am. Zool. 1: 107-114.
1979. Cell-free translation and thyroxine Pratt, G. E., Jennings, R. C., Hammett, A. F. and
Kratochwil, K. 1971. In vitro analysis of the induction of carbamylphosphate synthetase I Brooks, G. T. 1980. Lethal metabolism of
hormonal basis for sexual dimorphism in the messenger RNA in tadpole liver. Proc. Natl. precocene-I to a reactive epoxide by locust
embryonic development of the mouse mammary Acad. Sci. USA 76: 3179-3183. corpora allata. Nature 284: 320-323.
gland. /. Embryol. Exp. Morphol. 25:141-153.
Nellen, D., Burke, R., Struhl, G. and Basler, K. Raff, R. A. 1987. Constraint, flexibility, and
Kratochwil, K. and Schwartz, P. 1976. Tissue 1996. Direct and long-range action of a Dpp phylogenetic history in the evolution of direct
interaction in androgen response of embryonic morphogen gradient. Cell 85: 357-368. development in sea urchins. Dev. Biol. 119: 6-19.
mammary rudiment of mouse: Identification of
Nijhout, H. F. 1994. Insect Hormones. Princeton Raff, R. A. 1994. Developmental mechanisms
target tissue for testosterone. Proc. Natl. Acad.
University Press, Princeton, NJ. in the evolution of animal form: Origins and
Sci. USA 73: 4041-4044.
evolvability of body plans. In S. Bengtson, (ed.),
Nijhout, H. F. and Wheeler, D. E. 1982. Juvenile
Lawrence, P. A. and Morata, G. 1976. Compart- Early Life on Earth, Columbia University Press,
hormone and the physiological basis of insect
ments of the wing of Drosophila: a study of the New York, pp. 489-500.
polymorphisms. Quart. Rev. Biol. 57: 109-133.
engrailed gene. Dev. Biol. 50: 321-337.
Raynaud, A. 1961. Morphogenesis of the mammary
Nijhout, H. F. and Williams, C. M. 1974. Control
Liscia, D. S., Doherty, P. J. and Smith, G. H. gland. In S. K. Kon and A. T. Cowrie (eds.), Milk:
of moulting and metamorphosis in the tobacco
1988. Localization of a-casein gene transcripti- The Mammary Gland and Its Secretion, Vol. 1.
hornworm, Manduca sexta: Cessation of
on in sections of epoxy resin-embedded mouse Academic Press, New York, pp. 3-46.
juvenile hormone secretion as a trigger for
mammary tissues by in situ hybridization. J.
pupation. J. Exp. Biol. 61: 493-501. Reilly, D. S., Tomassini, N. and Zasloff, M. 1994.
Histochem. Cytochem. 36: 1503-1510.
Expression of magainin antimicrobial peptide
Niki, K., Namiki, H., Kikuyama, S. and
Little, G., Atkinson, B. G. and Frieden, E. 1973. genes in the developing granular glands of Xe-
Yoshizato, K. 1982. Epidermal tissue require-
Changes in the rates of protein synthesis and nopus skin and induction by the thyroid
ment for tadpole tail regression induced by
degradation in the tail of Rana catesbeiana hormone. Dev. Biol. 162: 123-133.
thyroid hormone. Dev. Biol. 94: 116-120.
tadpoles during normal metamorphosis. Dev. Biol.
Richards, G. 1992. Switching partners? Curr. Biol.
30: 366-373. Nishikawa, A., Kaiho, M. and Yoshizato, K. 1989.
2: 657-658.
Cell death in the anuran tadpole tail:
Lyman, D. F. and White, B. A. 1987. Molecular
Riddiford, L. M. 1982. Changes in translatable
cloning of hepatic mRNAs in Rana catesbeiana Thyroid hormone induces keratinization and
mRNAs during the larval-pupal transformation
response to thyroid hormone during induced and tail-specific growth inhibition of epidermal cells.
of the epidermis of the tobacco hornworm. Dev.
spontaneous metamorphosis. J. Biol. Chem. 262: Dev. Biol. 131: 337-344.
Biol. 92: 330-342.
5233-5237.
Riddiford, L. M. 1993. Hormones and Droso- Stone, B. L. and Thummel, C. S. 1993. Droso- Cohen and F. Strumwasser (eds.), Comparative
phila development. In M. Bate and A. Martinez- phila 78C early-late puff contains E78, an Neurobiology. Wiley, New York, pp. 25-14.
Arias (eds.), The Development of Drosophila ecdysone-inducible gene that encodes a novel
Truman, J. W., Talbot, W. S., Fahrbach, S. E. and
melanogaster, Cold Spring Harbor Laboratory member of the nuclear hormone superfamily.
Hogness, D. S. 1994. Ecdysone receptor expression
Press, Cold Spring Harbor, pp. 899-939 Cell 75: 1-20.
in the CNS correlates with stage-specific responses
Riggs, A. F. 1951. The metamorphosis of Strathmann, R. R. 1971. The feeding behavior to ecdysteroids during Drosophila and Manduca
hemoglobin in the bullfrog. J. Gen. Physiol. of planktotrophic echinoderm larvae: Mecha- development. Development 120: 219-234.
35: 23-40. nisms, regulation and rates of suspension feeding.
Turkington, R. W. 1968. Hormone-dependent
Exp. Mar. Biol. Ecol. 6: 109-160.
Robinson, H., Chaffee, S. and Galton, V. A. 1977. differentiation of mammary gland in vitro. Curr.
Sensitivity of Xenopus laevis tadpole tail tissue Strathmann, R. R. 1975. Larval feeding in Top. Dev. Biol. 3: 199-218.
to the action of thyroid hormones. Gen. Comp. echinoderms. Am. Zool. 15: 717-730.
Turkington, R. W., Juergens, W. G. and Topper,
Endocrinol. 32: 179-186.
Strause, L. G., DeLuca, M. and Case, J. F. 1979. Y. J. 1965. Hormone-dependent synthesis of
Rountree, D. B. and Bollenbacher, W. E. 1986. Biochemical and morphological change accom- casein in vitro. Biochem. Biophys. Acta 111:
The release of the prothoracicotropic hormone panying light organ development in the firefly, 573-576.
in the tobacco hornworm, Manduca sexta, is Photuris pennsylvanica. J. Insect Physiol. 125:
Turner, C. D. and Bagnara, J. T. 1976. General
controlled intrinsically by juvenile hormone. J. 339-347.
Endocrinology, 6th ed. Saunders, Philadelphia.
Exp. Biol. 120: 41-58.
Tabata, T, Schwartz, E., Gustavson, E., Ali, Z.
Urness, L.D. and Thummel, C. D. 1995. Mole-
Safranek, L. and Williams, C. M. 1989. and Kornberg, T. B. 1995. Creating a Drosophi-
cular analysis of a steroid-induced regulatory
Inactivation of the corpora allata in the final la wing de novo, the role of engrailed, and the
hierarchy: The Drosophila E74A protein directly
instar of the tobacco hornworm, Manduca sex- compartment border hypothesis. Development
regulates L71-6 transcription. EMBO J. 14:
ta, requires integrity of certain neural pathways 121: 3359-3369.
6239-6246.
from the brain. Biol. Bull. 177: 396-400.
Taigen, T. L., Plough, F. H. and Stewart, M. M.
van Wijngaarden, R. and Bolanos, F. 1992.
Sainsbury, J. R. C., Malcolm, A. J., Appleton, D. 1984. Water balance of terrestrial anuran (Eleu-
Parental care in Dendrobates granuliferus
R., Farndon, J. R. and Harris, A. L. 1985. Presence therodactylus coqui) eggs: Importance of pa-
(Anura, Dendrobatidae) with a description of
of epidermal growth factor receptor as an indicator ternal care. Ecology 65: 248-255.
the tadpole. J. Herpetol. 26: 102-105.
of poor prognosis in patients with breast cancer.
Takahashi. N., Yoshihama, K., Kikuyama, S.,
J. clin. Pathol. 38: 1225-1228. Wald, G. 1945. The chemical evolution of vision.
Yamamoto, K., Wakabayashi, K. and Kato, Y.
Harvey Lect. 41: 117-160.
Schmidhauser, C., Casperson, G. F., Myers, C. 1990. Molecular cloning and nucleotide sequence
A., Sanzo, K. T., Bolten, S. and Bissell, M. J. of complementary DNA for bullfrog prolactin. Wald, G. 1981. Metamorphosis: An overview.
1992. A novel transcriptional enhancer is J. Mol. Endocrinol. 5: 281-287. In L. I. Gilbert and E. Frieden (eds.), Metamor-
involved in the prolactin- and extracellular phosis: A Problem in Developmental Biology.
Talbot, W. S., Swyryd, E. A. and Hogness, D. S.
matrix-dependent regulation of b-casein gene Plenum, New York, pp. 1-39.
1993. Drosophila tissues with different
expression. Mol Biol. Cell 3: 699-709.
metamorphic responses to ecdysone express Wassersug, R. J. 1989. Locomotion in amphibian
Schmitt-Ney, M., Happ, B., Ball, R. K. and different ecdysone receptor isoforms. Cell 73: larvae (or why aren’t tadpoles built like fish).
Groner, B. 1992. Developmental and environ- 1323-1337. Am. Zool. 29: 65-84.
mental regulation of a mammary gland-specific
Tata, J. R., Kawahara, A. and Baker, B. S. 1991. Weber, R. 1967. Biochemistry of amphibian
nuclear factor essential for the transcription of
Prolactin inhibits both thyroid hormone-induced metamorphosis. In R. Weber (ed.), The
the gene encoding b-casein. Proc. Natl. Acad.
morphogenesis and cell death in cultured Biochemistry of Animal Development, Vol. 3.
Sci. USA 89: 3130-3134.
amphibian larval tissues. Dev. Biol 146: 72-80. Academic Press, New York, pp. 227-301.
Schooneveld, H. 1979. Precocene-induced
Taurog, A., Oliver, C., Porter, R. L., McKen- Weismann, A. 1875. Über den Saison-Dimor-
collapse and resorption of corpora allata in
zie, J. C. and McKenzie, J. M. 1974. The role of phismus der Schmetterlinge. In Studien Zur
nymphs of Locusta migratoria. Experientia 35:
TRH in the neoteny of the Mexican axolotl Descendenz-Theorie. Engelmann, Leipzig.
363-364.
(Ambystoma mexicanum). Gen. Comp. Endo-
Schwind, J. L. 1933. Tissue specificity at the crinol. 24: 267-279. Wigglesworth, V. B. 1934. The physiology of
time of metamorphosis in frog larvae. J. Exp. ecdysis in Rhodnius prolixus (Hemiptera). II.
Thomas, H. E., Stunnenberg, H. G. and Stewart, Factors controlling moulting and metamorpho-
Zool. 66: 1-14.
A. F. 1993. Heterodimerization of the Droso- sis. Q. J. Microsc. Sci. 77: 121-222.
Slama, K. and Williams, C. M. 1966. The juvenile phila ecdysone receptor with retinoid X recep-
hormone. V. The sensitivity of the bug, Pyrrho- tor and ultraspiracle. Nature 362: 471-475. Wilder, E. L. and Perrimon, N. 1995. Dual
coris apterus, to a hormonally active factor in function of wingless in the Drosophila leg
Thummel, C. S. 1996. Flies on steroids: Droso- imaginal disc. Development 121: 477-488.
American paper-pulp. Biol. Bull. 130: 235-246.
phila metamorphosis and the mechanisms of
Smith-Gill, S. J. and Carver, V. 1981. Biochemical steroid hormone action. Trends Genet. 12: 306- Williams, C. M. 1952. Physiology of insect
characterization of organ differentiation and 310. diapause. IV. The brain and prothoracic glands
maturation. In L. I. Gilbert and E. Frieden (eds.), as an endocrine system in the Cecropia
Topper, Y. J. and Freeman, C. S. 1980. Multiple silkworm. Biol. Bull. 103: 120-138.
Metamorphosis: A Problem in Developmental
hormone interactions in the develop mental
Biology. Plenum, New York, pp. 491-544. Williams, C. M. 1956. The juvenile hormone of
biology of the mammary gland. Physiol. Rev.
Stolow, M. A. and Shi, Y. B. 1995. Xenopus sonic 60: 1049-1106. insects. Nature 178: 212-213.
hedgehog as a potential morphogen during embryo- Williams, C. M. 1959. The juvenile hormone. I.
Truman, J. W., Weeks, J. and Levine, R. B. 1985.
genesis and thyroid hormone dependent metamor- Endocrine activity of the corpora allata of the adult
Developmental plasticity during the metamor-
phosis. Nucleic Acids Res. 23: 2555-2562. Cecropia silkworm. Biol. Bull. 116: 323-338.
phosis of an insect nervous system. In M. J.
Williams, C. M. 1970. Hormonal interactions Wray, G. A. and Raff, R. A. 1990. Novel origins Yaoita, Y. and Brown, D. D. 1990. A correlation
between plants and insects. In E. Sondheimer of lineage founder cells in the direct-developing of thyroid hormone receptor gene expression
and J. B. Simeone (eds.), Chemical Ecology. sea urchin, Heliocidaris erythro-gramma. Dev. with amphibian metamorphosis. Genes Dev. 4:
Academic Press, New York, pp. 103-132. Biol. 141: 41-54. 1917-1924.
Williams, J. A., Paddock, S. W, Vorwek, K. and Wray, G. A. and Raff, R. A. 1991. Rapid evolution Ž itòan, D., Kingan, T. G., Hermesman, J. L. and
Carroll, S. B. 1994. Organization of wing for- of gastrulation mechanisms in a sea urchin with Adams, M. E. 1996. Identification of ecdysis-
mation and induction of a wing patterning gene lecithotrophic larvae. Evolution 45: 1741-1750. triggering hormone from an epitracheal
at the dorsal/ventral compartment boundary. endocrine system. Science 271: 88-91.
Yao, T.-P, Segraves, W. A., Oro, A. E., McK-
Nature 368: 299-305.
eown, M. and Evans, R. M. 1992. Drosophi-
Wong, J. M. and Shi, Y. B. 1995. Coordinated la ultraspiracles modulates ecdysone recep-
regulation and transcriptional activation of Xe- tor function via heterodimer formation. Cell
nopus thyroid hormone and retinoid-X recep- 71: 63-72.
tors. J. Biol. Chem. 270: 18479-18483.
Determinação do sexo
20
A reprodução sexual é... a obra-prima da
Natureza.
ERASMUS DARWIN (1791)
É curioso notar que o número de especula-

O S MECANISMOS pelos quais é determinado o sexo de um indivíduo é uma
das grandes perguntas da embriologia desde a antigüidade. Aristóteles, que
colecionava e dissecava embriões, afirmava que o sexo era determinado pelo
calor do parceiro masculino durante a relação sexual. Quanto mais calorosa a paixão,
maior era a probabilidade de uma progênie masculina. (Aristóteles aconselhava ho-
ções conectadas com a natureza do sexo pra- mens idosos a conceber no verão se quisessem ter herdeiros masculinos.) Aristóteles
ticamente dobraram desde que Drelincourt, (ca. de 335 A.C.) promulgou uma hipótese muito direta para determinação sexual: as
no século dezoito, reuniu duzentas e ses-
mulheres eram homens cujo desenvolvimento havia parado porque o frio do ventre
senta e duas “hipóteses sem fundamento”,
materno suplantara o calor do sêmen masculino. Mulheres eram mais frias e mais
e desde que Blumenbach causticamente ob-
passivas que os homens, e os órgãos sexuais femininos não haviam amadurecido até
servou que nada era mais certo do que a
teoria do próprio Drelincourt constituir a
o ponto em que poderiam prover sementes ativas. Essa visão foi aceita pela igreja
ducentésima sexagésima terceira hipótese. cristã e por Galeno (cujos textos de anatomia foram o padrão durante mais de 1000
J. A. THOMSON (1926) anos). Ao redor do ano 200 D.C., Galeno escreveu:
Assim como a espécie humana é a mais perfeita de todos os animais, assim

dentro da humanidade, o homem é mais perfeito que a mulher, e a razão para
essa perfeição é seu excesso de calor, pois o calor é o instrumento primário da
Natureza... a mulher é menos perfeita que o homem em relação às suas partes
geradoras. Porque as partes foram formadas em seu interior enquanto ela
ainda era um feto, mas devido ao defeito do calor, não podiam emergir e se
projetar para o exterior.
O ponto de vista que as mulheres eram apenas homens subdesenvolvidos e que seus
órgãos genitais eram iguais aos dos homens, somente virados de dentro para fora, foi
muito popular durante mais de mil anos. Mesmo em 1543, Andreas Vesalius, o anatomista
paduano que derrubou muito da anatomia de Galeno (e que se arriscou à censura pela
igreja por reiterar que homens e mulheres têm o mesmo número de costelas), manteve
esse conceito. As ilustrações de seus dois principais trabalhos, De Humanis Corporis
Fabrica e Tabulae Sex, mostram que ele via a genitália feminina como uma represen-
tação interna da genitália masculina (Figura 20.1). Apesar disso, o livro de Vesalius
iniciou uma revolução na anatomia, e ao fim do século XVI, os anatomistas descarta-
ram as representações galênicas da anatomia feminina. Durante os séculos XVII e
XVIII, seres femininos foram reconhecidos como produtores de ovos que podiam
773
(A) transmitir traços parentais, e a fisiologia dos órgãos sexuais começou a ser estudada.
Ainda assim, não havia consenso sobre como os sexos eram determinados (veja
Horowitz, 1976; Tuana, 1988; Schiebinger, 1989).
Naquele tempo o ambiente – em especial, calor e nutrição - eram acreditados ser
de importância para a determinação do sexo. Em 1890, Geddes e Thomson resumiram
todos os dados disponíveis sobre a determinação sexual, e chegaram à conclusão que
“constituição, idade, nutrição e ambiente dos pais deveriam ser especialmente consi-
derados” em qualquer dessas análises. Eles argumentavam que fatores favorecendo a
armazenagem de energia e nutrientes influenciavam a favor de progênie feminina,
enquanto que fatores favorecendo a utilização da energia e nutrientes influenciavam
a favor de progênie masculina.
Essa visão ambiental da determinação sexual permaneceu a única teoria científica
importante até a descoberta do trabalho de Mendel em 1900 e da redescoberta do
cromossomo sexual por McClung em 1902. Baseado em seu conhecimento do
Mendelismo, Correns especulou que a relação sexual 1:1 da maioria das espécies,
podia ser conseguida se o macho fosse heterozigoto e a fêmea homozigota para algum
fator determinante do sexo. Porém, somente em 1905 a correlação (em insetos) do sexo
(B) feminino com os cromossomos sexuais XX e do sexo masculino com os cromossomos
XY ou XO foi estabelecida (Stevens, 1905; Wilson, 1905). Isso sugeriu fortemente que
um componente nuclear específico era responsável pelo direcionamento do desenvol-
vimento do fenótipo sexual. Assim, acumulou-se evidência que a determinação sexual
ocorria por herança nuclear em vez de por circunstâncias ambientais.
Hoje, achamos que tanto os mecanismos ambientais como os internos da determi-
nação sexual podem atuar em diferentes espécies. Iremos primeiro discutir os mecanis-
mos cromossômicos da determinação do sexo, e em seguida considerar os meios pelos
quais o ambiente regula o fenótipo sexual.
Determinação cromossômica do sexo em mamíferos

Determinação Sexual Primária
A determinação sexual primária se refere à determinação das gônadas. Nos mamífe-

ros, a determinação do sexo é estritamente cromossômica e não é usualmente influen-
ciada pelo ambiente. Na maioria dos casos, a fêmea é XX e o macho é XY. Cada
indivíduo tem que ter ao menos um cromossomo X. Como a fêmea é XX, cada um de
Figura 20.1 seus óvulos tem um único cromossomo X. O macho, sendo XY, pode gerar dois tipos
Representações de Vesalius (1538, 1543) dos de espermatozóide: metade contém o cromossomo X, metade o Y. Se o óvulo receber
órgãos reprodutivos femininos. (A) Interpre- outro cromossomo X do espermatozóide, o indivíduo resultante é XX, forma ovários,
tação de Vesalius à concepção de Galeno do e é feminino; se o óvulo recebe um cromossomo Y do espermatozóide, o indivíduo é
trato feminino da vagina ao útero. (B) Interpre- XY, forma testículos, e é masculino. O cromossomo Y carrega um gene que codifica um
tação de Vesalius do sistema reprodutivo femi- fator determinador de testículos. Esse fator organiza a gônada em um testículo em vez
nino. (Reproduzido em Schiebinger, 1989.) de um ovário. Diferentemente do caso da Drosophila (a ser discutido adiante), o
cromossomo Y do mamífero é um fator crucial para determinação do sexo nessa espé-
cie. Uma pessoa com cinco cromossomos X e um cromossomo Y (XXXXXY) seria
macho. Além disso, um indivíduo com somente um único cromossomo X e nenhum
segundo X ou Y (i.e., XO) se desenvolve como fêmea e começa a formar ovários, mas
é incapaz de manter os folículos ovarianos.
Determinação Secundária do Sexo
A determinação secundária do sexo se refere ao fenótipo corporal externo às gô-

nadas. Um mamífero masculino tem um pênis, vesículas seminais, uma glândula
próstata, e freqüentemente tamanho, cartilagem vocal e musculatura específicos
do sexo. Um mamífero feminino tem a vagina, cérvix, útero, ovidutos, glândulas
mamárias, e freqüentemente tamanho, cartilagem vocal e musculatura específicos
CAPÍTULO 20 Determinação do Sexo 775
Células Genitália interna

Foliculares feminina (útero,
OVÁRIO Folículos oviduto, cérvix,
Células vagina superior)
tecais
Gônada
Sulco Genital
bipotencial Duto Mülleriano
Células
de Sertoli Regressão
TESTÍ-
CULOS Seio urogenital do
Células tubérculo genital
Testosterona
de Leydig
Pênis,
próstata
Duto
Genitália interna
Wolffiano
masculina
(epidídimo, vasos
deferentes, vesícula
seminal)
Figura 20.2
do sexo. As características sexuais secundárias são geralmente determinadas pelos Cascatas postuladas levar à formação de
hormônios secretados pelas gônadas. Porém, na ausência das gônadas, é gerado o fenótipos sexuais em mamíferos. A conversão
fenótipo feminino. Quando Jost (1953) removeu as gônadas de fetos de coelhos antes do sulco genital na gônada bipotencial necessi-
da sua diferenciação, os coelhos resultantes eram fêmeas, independentemente de ta dos genes SF1 e WT1, pois camundongos
serem XX ou XY. Cada um tinha ovidutos, um útero e uma vagina, mas não tinha um carentes de um ou de outro desses genes não
pênis ou estruturas acessórias masculinas. têm gônadas. A gônada bipotencial parece ser
O esquema da determinação do sexo de mamíferos está mostrado na Figura 20.2. Se conduzida para a via feminina pelos genes
WNT4 e DAX1, e para a via masculina pelo
o cromossomo Y estiver ausente, os primórdios gonadais desenvolvem-se em ovári-
gene SRY (do cromossomo Y), em conjunto
os. Os hormônios estrogênicos produzidos pelo ovário permitem o desenvolvimento com genes autossômicos como SOX9. O ová-
do duto Mülleriano em útero, ovidutos e terminal superior da vagina. Se o cromosso- rio produz células tecais e células granulosas,
mo Y estiver presente, formam-se testículos que secretam dois hormônios principais. que juntas são capazes de sintetizar estrógeno.
O primeiro -hormônio anti-duto Mülleriano (AMH; também chamado de substância Sob estrógeno (primeiro provindo da mãe, em
inibidora Mülleriano, (MIS) -destrói o duto Mülleriano. O segundo hormônio -testos- seguida das gônadas), o duto Mülleriano se
terona- masculiniza o feto estimulando a formação do pênis, escroto e outras porções diferencia em genitália feminina e a prole de-
da anatomia masculina, inibindo também o desenvolvimento dos primórdios do seio. senvolve características sexuais secundárias
Assim, o corpo tem o fenótipo feminino a não ser que seja mudado pelos dois hormô- femininas. Os testículos produzem dois hor-
mônios principais, o fator anti-duto Mülleriano
nios elaborados pelos testículos fetais. Olharemos agora mais detalhadamente para
(AMH), que causa regressão do duto, e a tes-
esses eventos. tosterona, que causa a diferenciação do duto
Wolffiano em genitália interna masculina. Na
As Gônadas em Desenvolvimento região urogenital, a testosterona é convertida
em diidrotestosterona (DHT) que causa a mor-
O desenvolvimento das gônadas é uma situação embriológica única. Todos os outros fogênese do pênis e da próstata. (Segundo
rudimentos de órgãos normalmente se diferenciam em um único tipo de órgão. Um Marx, 1995).
rudimento de pulmão somente pode tornar-se pulmão e um rudimento de fígado so-
mente se desenvolve em fígado. O rudimento da gônada, porém, tem duas opções
normais. Quando se diferencia, pode desenvolver-se em um ovário ou em um testícu-
lo. O tipo de diferenciação seguido por esse rudimento determina o desenvolvimento
sexual futuro do organismo. Porém, antes dessa decisão ser tomada, a gônada do
mamífero se desenvolve primeiro através de um estágio indiferente (bipotencial) du-
rante o qual não tem características femininas nem masculinas. Em humanos, o rudi-
mento da gônada aparece no mesoderma intermediário durante a quarta semana e
permanece sexualmente indiferente até a sétima semana. Durante esse estágio, o epitélio
do sulco genital se prolifera para dentro do tecido mesenquimatoso conjuntivo frouxo
acima dele (Figura 20.3A,B). Essas camadas epiteliais formam as cordas sexuais, que
irão envolver as células germinativas que migram para a gônada humana durante a
GÔNADAS INDIFERENTES
Duto Duto
Wolffiano Glomérulo Aorta Wolffiano
Duto
Sulco Túbulo Epitélio Cordas sexuais
Sulco Mesentério Mülleriano
mesonéfrico mesonéfrico celômico em primitivas
Genital Dorsal
excretório proliferação
(A) 4 SEMANAS (B) 6 SEMANAS
DESENVOLVIMENTO TESTICULAR DESENVOLVIMENTO OVARIANO
Túbulo mesonéfrico Túbulo

Duto Wolffiano
em degeneração mesonéfrico em Mesênquima
(vasos deferentes)
degeneração urogenital
Cordas da Duto Wolffiano
rede testicular Cordas
sexuais corticais
Cordas
testiculares
Duto Mülleriano
Epitélio
Túnica albugínea
Duto Mülleriano superficial
(C) 8 SEMANAS (E) 8 SEMANAS
Cordas da
rede testicular Cordas sexuais
em degeneração
Dutos eferentes Epitélio
(vasos eferentes) Túnica
Superficial
albugínea
Duto Wolffiano Cordas

(vasos deferentes) testiculares Oogônia
Duto Wolffiano
Folículos
Duto Mülleriano Duto Mülleriano ovarianos
(D) 16 SEMANAS (F) 20 SEMANAS
Figura 20.3
Diferenciação das gônadas humanas mostrada em seção transversal. (A) Sulco genital de um embrião de
4 semanas. (B) Sulco genital de uma gônada indiferente de 6 semanas mostrando cordas sexuais primiti-
vas. (C) Desenvolvimento testicular na oitava semana. As cordas sexuais perdem contato com o epitélio
cortical e desenvolvem a rede testicular. (D) Na décima-sexta semana de desenvolvimento, as cordas
testiculares são contínuas com a rede testicular e se conectam com o duto Woffiano. (E) O desenvolvimen-
to ovariano em um embrião humano de 8 semanas, quando as cordas sexuais primitivas degeneram. (F)
O ovário humano de 20 semanas não se conecta ao duto Wolffiano, e novas cordas sexuais corticais
rodeiam as células germinativas que migaram para o sulco genital. (Segundo Langman, 1981.)
sexta semana. Tanto em gônadas XY como XX, as cordas sexuais permanecem

conectadas ao epitélio superficial.
Se o feto for XY, as cordas sexuais continuam a proliferar durante a oitava sema-
na, estendendo-se profundamente no tecido conjuntivo.* Essas cordas fundem-se
uma com a outra, formando uma rede de cordas sexuais internas (medulares) e, em
seu terminal mais distal, a rede testicular (rete testis) mais fina (Figura 20.3C,D). No
fim, as cordas testiculares perdem o contato com o epitélio superficial e dele ficam
separadas pela grossa matriz extracelular, a túnica albugínea. Assim, as células ger-
minativas são encontradas nas cordas dentro dos testículos. Durante a vida fetal e
a infância, essas cordas permanecem sólidas. Na puberdade, porém, ficam ocas para
formar os túbulos seminíferos, e as células germinativas começam a produção de
espermatozóide. O espermatozóide é transportado do interior dos testículos através
da rede testicular, que se junta com os dutos eferentes. Esses túbulos eferentes são
os remanescentes da rim mesonéfrico, e ligam os testículos ao duto Wolffiano. Esse
duto tinha sido o tubo coletor do rim mesonéfrico. Em machos, o duto Wolffiano se
diferencia em vasos deferentes, o tubo através do qual o espermatozóide passa para
uretra e para fora do corpo. No intervalo, durante o desenvolvimento fetal as células
mesenquimatosas intersticiais dos testículos se diferenciaram em células de Leydig,
que produzem a testosterona. As células das cordas testiculares se diferenciam em
células de Sertoli, que criam o espermatozóide e secretam o hormônio anti-duto
Mülleriano.
Em fêmeas, as células germinativas irão residir perto da superfície externa da gônada.
Ao contrário das cordas sexuais nos machos, que continuam sua proliferação, as
cordas sexuais iniciais de gônadas XX degeneram. Porém, o epitélio logo passa a
produzir um novo conjunto de cordas sexuais, que não penetram profundamente no
mesênquima, mas permanecem perto da superfície externa (córtex) do órgão. Por isso,
são chamadas cordas sexuais corticais. Essas cordas são divididas em agregados,
cada qual envolvendo uma célula germinativa (Figura 20.2E,F). A célula germinativa se
transformará em óvulo, e as cordas sexuais epiteliais que a rodeiam irão se diferenciar
em células granulosas. As células mesenquimatosas do ovário diferenciam-se em
células tecais. Juntas, as células tecais e granulosas formam os folículos que envol-
vem as células germinativas e secretam hormônios esteróides. Cada folículo irá conter
uma única célula germinativa. Em fêmeas, o duto Mülleriano permanece intacto, e se
diferencia em ovidutos, útero, cérvix e vagina superior; o duto Wolffiano, privado de
testosterona, degenera. Um resumo do desenvolvimento dos sistemas reprodutivos
dos mamíferos encontra-se na Figura 20.4. [sex1.html]
Determinação sexual primária dos mamíferos:

Genes cromossômicos Y para a determinação dos testículos
Vários genes cuja função é necessária para a diferenciação sexual normal foram en-
contrados. Ao contrário do que ocorre em outros órgãos em desenvolvimento, os
genes envolvidos na determinação do sexo diferem extensamente entre os filos, fazen-
do com que não se possa olhar para genes determinantes de sexo em Drosophila
esperando ver seus homólogos direcionando a determinação sexual de mamíferos.
Todavia, desde que o fenótipo de mutações em genes determinantes do sexo muitas
vezes é a esterilidade, estudos clínicos foram empregados para identificar aqueles
genes ativos na determinação do sexo em humanos femininos ou masculinos. As
manipulações experimentais visando confirmar as funções desses genes puderam ser
realizadas em camundongos.
* Em camundongos e coelhos, algumas células do mesonefro (o rim primitivo) migram para o

sulco genital e tornam-se parte da população celular intersticial. Essas parecem ser necessárias para
estabelecer a estrutura normal da corda (Buehr et al., 1993).
Figura 20.4 (A) SEXUALMENTE INDIFERENTES

Sumário do desenvolvimento das gônadas e
Gônadas
seus dutos em mamíferos. Notar que tanto os
dutos Wolffiano como o Mülleriano estão pre-
sentes no estágio da gônada indiferenciada.
O desenvolvimento dos dutos Wolffianos de- Rim metanéfrico
pende do mesênquima que eles encontram. Mesonefro
As partes inferiores do duto Wolffiano que
normalmente formariam o epidídimo forma- Ureter
Duto Wolffiano
rão o tecido da vesícula seminal se cultivados
com mesênquima associado com porções su- Duto
periores (vesícula seminal) do duto. (Higgins Mülleriano
Cloaca
et al, 1989.)
Epidídimo Rins
Testículos metanéfricos Ovários Oviduto
Ureteres
Duto Mülleriano Duto Wolffiano

degenerado degenerado
Bexiga Bexiga Duto Mülleriano
urinária urinária (oviduto)
Duto Wolffiano
(vasos deferentes) Uretra Uretra Útero
Vagina
(B) MASCULINO (C) FEMININO
GÔNADAS
Tipo gonadal Testículos Ovário
Cordas sexuais Medular (interno) Cortical (externo)
DUTOS
Dutos remanescentes para Wolffiano Mülleriano
células germinativas
Diferenciação do duto Vasos deferentes Oviduto, útero, cérvix,
Epidídimo, vesícula seminal parte superior da vagina
SRY:: O Determinante Se
SRY xual do Cromossomo Y
Sexual
Em seres humanos, o principal gene para o fator determinante dos testículos reside no
braço curto do cromossomo Y. Indivíduos que nascem com o braço curto, porém, sem
o braço longo do cromossomo Y são machos enquanto que indivíduos que nascem
com o braço longo do cromossomo Y, mas não o braço curto, são fêmeas. Analisando
o DNA de homens XX e fêmeas XY, a posição do gene determinador dos testículos foi
restringida à uma região de 35.000 pares de bases do cromossomo Y, localizada perto
da extremidade do braço curto [sex2.html]. Nessa região, Sinclair e colaboradores
(1990) encontraram uma seqüência de DNA específica de macho que podia codifi-
car um peptídio de 223 aminoácidos. Tal peptídio provavelmente seria um fator de
transcrição, já que contém um domínio ligante de DNA chamado de seqüência (box)

HMG. Esse domínio HMG (grupo de alta mobilidade) é encontrado em vários fatores
de transcrição e proteínas de cromatina não-histônicas; ele induz curvatura na região
de DNA à qual ele se liga (Figura 20.5: Giese et al., 1992). O gene foi chamado SRY
(região determinante do sexo do Y) e existe evidência que realmente ele codifica o fator
determinante dos testículos humanos. O SRY é encontrado em machos XY e nos raros
machos XX, estando ausente em fêmeas normais XX e em muitas fêmeas XY. Outro
grupo de fêmeas XY foi achado ter mutações de ponta ou de mudança de moldura no
gene SRY, e essas mutações impedem a proteína SRY de se ligar ao DNA ou curvá-lo
(Pontiggia et al., 1994; Werner et al., 1995). Pelo menos dois genes envolvidos na
determinação sexual secundária (os genes para AMH e a aromatase P450 envolvida na
síntese de esteróides) contêm sítios ligantes de SRY em seus promotores (Haqq et al.,
1993), a ligação específica de sequência de SRY a um outro gene específico de testícu-
lo leva à ativação daquele gene (Cohen et al., 1994).
Se SRY realmente codifica o principal fator determinante dos testículos, poder-
se-ia esperar que ele atuasse no sulco genital imediatamente antes, ou durante, a
diferenciação dos testículos. Essa previsão foi confirmada por estudos do gene
homólogo encontrado em camundongos. O gene do rato (Sry) também se correla-
ciona com a presença de testículos; ele está presente em machos XX e ausente de
Figura 20.5
fêmeas XY (Gubbay et al., 1990; Koopman et al., 1990). O gene Sry é expresso nas
Associação de DNA com a proteína SRY pode
células somáticas da gônada indiferenciada do camundongo, imediatamente antes levar o DNA a se curvar de 70o - 80o. As partes
ou durante sua diferenciação em um testículo; sua expressão desaparece em se- escuras representam a seqüência (box) HMG
guida (Hacker et al, 1995). da proteína SRY. A espiral vermelha é a dupla
A evidência mais convincente de que o Sry é o gene para o fator determinante dos hélice do DNA ligado especificamente por
testículos vem de camundongos transgênicos. Se Sry induz os testículos, a inserção SRY. Nesse caso, é uma região do promotor
de seu DNA no genoma de um zigoto de camundongo XX normal deve levá-lo a formar do gene do hormônio anti-Mülleriano. (Segun-
testículos. Koopman e colaboradores (1991) tomaram a região de 14 kilobases do DNA do Haqq et al., 1994; Werner et al., 1995.)
que inclui o gene Sry (e presumivelmente seus elementos regulatórios) e microinjetaram
essa seqüência em pronúcleos de zigotos de camundongos recém-fertilizados. Em
vários casos, os embriões XX assim injetados, desenvolveram testículos, órgãos aces-
sórios masculinos e pênis (Figura 20.6). (Não se formou espermatozóide funcional;
porém, isso era esperado porque a presença de dois cromossomos X previne a formação
Controle
(A) (B)
Figura 20.6
Um camundongo XX transgênico para Sry é macho. (A) A reação da cadeia de polimerase
seguida por eletroforese mostra a presença do gene Sry em machos XX normais, e em um
camundongo Sry XX transgênico. O gene está ausente na fêmea XX da ninhada. (B) A genitália
externa do camundongo transgênico é masculina (direita) e essencialmente a mesma como a de
um macho XY (esquerda). (Segundo Koopman et al., 1991; fotografia cortesia dos autores.)
de espermatozóide em camundongos e homens XXY.) Há, por isso, boas razões para
se pensar que Sry/SRY é o gene principal no cromossomo Y para a determinação de
testículos em mamíferos.
O gene determinante de testículos do cromossomo Y é necessário mas não sufici-
ente para o desenvolvimento dos testículos em mamíferos. Estudos em camundongos
(Eicher e Washburn, 1983; Washburn e Eicher, 1989) haviam mostrado que a SRY de
algumas variedades de ratos deixam de produzir testículos quando colocados em meio
autossômico diferente. Quando a proteína SRY se liga a seus sítios no DNA, provavel-
mente cria grandes alterações conformacionais. Desenrola a dupla hélice em sua vizi-
nhança e curva o DNA em até 80o (Pontiggia et al., 1994; Werner et al., 1995). Essa
curvatura pode levar proteínas ligadas à distância do aparelho de transcrição a um
maior contato, permitindo-lhes interagir e influenciar a transcrição. A identidade des-
sas proteínas ainda não é conhecida. [sex3.html]

Genes autossômicos na determinação de testículos
SOX9: Reversão Autossômica na Displasia Campomélica
Se SRY for um fator de transcrição, deveria ser esperado ativar ou reprimir uma bateria
de genes no sulco genital. Um candidato para tal gene é o SOX9 em seres humanos. O
SOX9 codifica um fator de transcrição putativo que também contém uma seqüência
HMG. Indivíduos sem uma cópia funcional desse gene têm uma síndrome chamada de
displasia campomélica, uma doença envolvendo numerosos sistemas do esqueleto e
órgãos; eles morrem logo após o nascimento em conseqüência de dificuldades respi-
ratórias decorrentes de brônquios e traquéias defeituosos (Foster et al., 1994; Wagner
et al., 1994; Mansour et al., 1995). Cerca de 75 porcento dos pacientes XY com essa
síndrome desenvolvem-se como fenótipos femininos ou hermafroditas. Parece que
SOX9 é essencial para a formação de testículos. Além disso, o homólogo murino desse
gene, Sox9, é expresso somente nos sulcos genitais masculinos (XY), mas não nos
femininos (XX), e nas mesmas células do sulco genital que Sry. Sox9 é expresso
somente pouco após a expressão de Sry (Wright et al., 1995; Kent et al., 1996).
Masculinass
SF1: A Ligação Entre SRY e as Trajetórias Desenvolvimentais Masculina
Uma outra proteína que poderia ser ativada por SRY e ser um cofator com SRY é o fator
de transcrição SF1. O SF1(fator 1 esteroidogênico) é uma proteína que ativa vários
genes envolvidos na síntese de esteróides. Na verdade, ele atua nas células de Leydig
dos testículos, ativando genes que codificam as enzimas da via da testosterona. Toda-
via, o SF1 foi recentemente mostrado ter duas outras funções críticas (Figura 20.7).
Primeiro, deletando os genes Sf1 dos camundongos, esses se desenvolvem sem as
glándulas supra-renais ou as gônadas (Luo et al., 1994). (As gônadas se desenvolvem
mas degeneram em seguida, e os camundongos morrem por falta de corticosterona.)
Segundo, o SF1 parece estar relacionado ao desenvolvimento dos testículos. À medi-
da que os níveis de SF1 declinam no sulco genital dos embriões XX, o SF1 permanece
nos testículos em desenvolvimento. Acredita-se que a SRY ative o gene Sf1, e que a
proteína SF1, em seguida, ative ambos componentes da diferenciação sexual masculi-
na (o AMH de Sertoli e a via Leydig da testosterona) (Shen et al., 1994). Tanto SRY
como SF1 podem ser necessárias para ativar o gene AMH, sugerindo que interações
entre essas proteínas sejam importantes (Haqq et al. 1994, Shen et al., 1994).
A pesquisa de reversão de sexo em camundongos mostrou que o cromossomo Y
de um tipo não necessariamente produz testículos em outra linhagem de camundon-
gos. Parece que as proteínas SRY divergiram tanto que elas podem, não muito dis-
tante, interagir com outra proteínas do aparelho de transcrição (Coward et al., 1994;
Eicher, 1994).
Rim
Rim
Epidídimo
Testículo
Oviduto
(A) (B) (C)
Figura 20.7
Funções de SF1 durante a gonadogênese. (A). Eliminação do gene SF1 do embrião do camun-
dongo leva à perda tanto das supra-renais como dos testículos. (O duto Mülleriano persiste e
torna-se o oviduto.) (B) Um controle mostrando epidídimo e testículos. (C) Hibridização in situ
mostrando a ativação do gene Sf1 através do desenvolvimento testicular de um embrião de
camundongo de 12.5 dias. (A de Luo et al., 1994; C de Shen et al., 1994.)

Desenvolvimento ovariano
DAX1: Um Potencial Gene Determinante de Ovário no Cromossomo X
Em 1980, Bernstein e colaboradores descreveram o caso de duas irmãs geneticamente

XY. Seus cromossomos Y eram normais, mas tinham duplicado uma pequena porção
do braço curto do cromossomo X (Xp21). Subseqüentes casos foram encontrados;
concluiu-se que quando houvesse duas cópias dessa região no cromossomo X ativo,
o sinal SRY seria revertido (Figura 20.8). Uma dose dupla dessa região interromperia a
formação dos testículos, mas a ausência dessa região foi compatível com a formação
de testículos. Bardoni e colegas (1994) propuseram que essa região continha um gene
que compete com o fator SRY e que foi importante para o direcionamento do desenvol-
vimento do ovário. No desenvolvimento testicular, esse gene seria suprimido, mas a
presença de duas cópias ativas do gene se sobreporia a essa repressão. Esse gene,
DAX1, foi clonado e mostrou codificar um membro da família do receptor do hormônio
nuclear (Muscatelli et al., 1994; Zanaria, 1994). Dados preliminares (Zanaria, 1994)
sugerem que o DAX1 é expresso nos sulcos genitais do embrião de camundongo.
Wnt4a: Um potencial Gene Determinante de Ovário em um Autossomo
O gene WNT4a é outro gene que pode ser crítico para a determinação ovariana. Esse
gene é expresso no sulco genital do camundongo quando ele ainda está no seu
estágio indiferenciado. Depois, se torna indetectável nas gônadas XY (que se tornam
Genótipo
DAX1
inativo
2 cópias
de DAX1
Gônadas Testículos Ovário Disgênese gonadal

Fenótipo Macho Fêmea Fêmea
Figura 20.8
Reversão sexual fenotípica em seres humanos tendo duas cópias do loco DAX1. DAX1 (no cromos-
somo X) mais SRY no Y produzem testículos. DAX1 sem SRY (pois o outro loco DAX1 está no
cromossomo X inativo) produz ovários. Duas cópias ativas de DAX1 (no cromossomo X ativo)
mais um SRY (do cromossomo Y) levam a uma gônada mal-formada. Como a gônada não produz
AMH nem testosterona, o fenótipo é feminino. (Segundo Genetics Review Group, 1995.)
testículos), enquanto que a expressão de WNT4a é mantida nas gônadas XX quando

elas começam formar ovários. Se forem criados camundongos sem os genes WNT4a,
o ovário não se forma de maneira adequada, e suas células expressam marcadores
específicos do testículo, incluindo AMH e testosterona produzindo enzimas (Vainio e
McMahon, 1996).
É possível que SRY forme testículos reprimindo a expressão de WNT4a no sulco
genital, como também promovendo SF1. Deve-se compreender que tanto o desenvol-
vimento dos testículos como o do ovário são processos ativos. Em mamíferos, a
determinação sexual primária em caso algum é um estado à revelia (Eicher e Washburn,
1986). Embora os últimos anos tenham presenciado notável progresso, nós ainda não
sabemos o que fazem os genes determinantes do testículo ou do ovário, e o problema
da determinação sexual primária permanece (como desde a pré-história), uma das gran-
des questões não resolvidas da biologia. [sex4.html]
Determinação sexual secundária em mamíferos

Regulação Hormonal do Fenótipo Sexual
A determinação sexual primária envolve a formação de um ovário ou de um testículo de

uma gônada indiferenciada. Isso, porém, não fornece o fenótipo sexual completo. A
determinação sexual secundária se refere ao desenvolvimento dos fenótipos masculi-
no e feminino por hormônios secretados pelos ovários e testículos. A determinação
sexual secundária, tanto masculina como feminina, tem dois componentes temporais
principais. O primeiro ocorre dentro do embrião durante a organogênese; o segundo
ocorre durante a adolescência.
Conforme mencionado anteriormente, se gônadas indiferentes são removidas de
um animal embrionário é concebido o fenótipo feminino. Os dutos Müllerianos se
desenvolvem enquanto o duto Wolffiano se degenera. Isso também é visto em certos
seres humanos que nascem sem gônadas funcionais. Indivíduos cujas células têm
somente um cromossomo X (e nenhum cromossomo Y) originalmente desenvolvem
ovários; porém, esses ovários se atrofiam antes do nascimento, e as células germina-

tivas morrem antes da puberdade. Porém, sob a influência de estrógeno primeiramente
derivado do ovário, mas depois da mãe e da placenta, essas crianças nascem com um
trato genital feminino (Langman e Wilson, 1982).*
A formação do fenótipo masculino envolve a secreção de hormônios testiculares
que promovem o desenvolvimento do duto Wolffiano e promovem atrofia do duto
Mülleriano. O primeiro desses hormônios é o hormônio anti-duto Mülleriano, o hor-
mônio da célula de Sertoli que causa a degeneração do duto Mülleriano. O segundo
desses hormônios é a testosterona esteróide, que é secretado pelas células de Leydig
testiculares fetais. Esse hormônio causa a diferenciação do duto Wolffiano em
epidídimo, vasos deferentes e vesículas seminais, e causa o desenvolvimento de
tumefações urogenitais e seios no interior do escroto e pênis. A existência desses dois
sistemas independentes de masculinização é demonstrada em pessoas tendo síndrome
da insensibilidade andrógena. Esses indivíduos XY têm o gene do fator determinante
testicular e, por isso, têm testículos que produzem testosterona e AMH. Porém, essas
pessoas não têm a proteína receptora de testosterona e portanto não podem respon-
der à testosterona produzida em seus testículos (Meyer et al., 1975). Porque elas são
capazes de responder ao estrógeno produzido em suas glândulas supra-renais, elas
são de aparência distintamente feminina (Figura 20.9). Porém, apesar dessa aparência
feminina, esses indivíduos têm testículos, e embora não possam responder à testoste-
rona, eles respondem ao AMH. Assim, seus dutos Müllerianos degeneram. Essas Figura 20.9
pessoas se desenvolvem como mulheres normais mas são estéreis, não tendo um Um indivíduo XY com a síndrome da in-
sensibilidade andrógena. Apesar do cariótipo
útero ou ovidutos e tendo testículos em seu abdome.**
XY e da presença de testículos, o indivíduo
desenvolve características sexuais secun-
Testosterona e Diidrotestosterona dárias femininas. Internamente, porém, a
mulher não tem os derivados do duto
Existem dois diferentes hormônios masculinizantes, testosterona e AMH. Existe evidên- Mülleriano e tem testículos não descidos.
cia que a testosterona, em certos tecidos, pode não ser o hormônio ativo. A testosterona (Cortesia de C. B. Hammond.)
parece ser responsável pela promoção da formação de estruturas reprodutivas masculi-
nas (o epidídimo, vesículas seminais e vasos deferentes) do primórdio do duto Wolffiano.
No entanto, a testosterona não masculiniza diretamente a uretra masculina, próstata,
α-diidrotestosterona.
pênis ou escroto. Essas funções posteriores são controladas pela 5α
Siiteri e Wilson (1974) mostraram que a testosterona é convertida em 5α-
diidrotestosterona nos seios urogenitais e tumefações, mas não no duto Wolffiano.
Imperato - McGinley e colegas (1974) acharam uma pequena comunidade na Repú-
blica Dominicana na qual vários habitantes tinham uma deficiência genética da enzima
5α-cetoesteróide redutase 2, que converte testosterona em diidrotestosterona. Indiví-
*Os mecanismos pelos quais o estrógeno poderia promover a diferenciação dos dutos Müllerianos
não são bem compreendidos. Durante o desenvolvimento embrionário, o duto é extremamente
sensível a compostos estrogênicos, conforme é conhecido pelos efeitos teratogênicos da
dietilstilbesterol (DES). Esse composto é um estrógeno sintético que foi dado às mulheres nas
décadas de 1940 até 1960 para manutenção da gravidez. As filhas nascidas dessas mulheres que
usaram essa droga apresentaram alta incidência de anomalias do duto Mülleriano, incluindo malfor-
mações dos epitélios vaginal e cervical, anomalias estruturais dos ovidutos e útero, e uma incidência
acima do normal de câncer vaginal (Robboy et al., 1982; Bell, 1986).
**A síndrome da insensibilidade andrógena é uma de várias condições chamadas pseudo-
hermafroditismo. Os hermafroditas verdadeiros (raros em humanos e na maioria dos mamíferos,
mas normal em certos invertebrados) contêm tecidos gonadais tanto masculino como feminino.
Hermafroditas mamíferos verdadeiros têm anormalidades na determinação sexual primária e po-
dem ocorrer quando o cromossomo Y é translocado para o cromossomo X. Se o X translocado for
inativado, o Y será desligado. Algumas das células gonadais serão XX e outras XY (Berkovitz et al.,
1992). Na condição pseudo-hermafrodita, existe somente um tipo de gônada, mas as características
sexuais secundárias diferem daquilo que é esperado do sexo gonadal. Em humanos, pseudo-herma-
froditas masculinos podem resultar da síndrome da insensibilidade andrógena, ou da incapacidade de
produzir testosterona devido a um defeito gênico em uma das enzimas levando à sua síntese (Geissler
et al., 1994). Pseudo-hermafroditas femininos ocorrem quando o organismo tem uma superprodu-
ção de testosterona.
Bexiga urinária
Reto
Púbis Vesícula
seminal
Próstata
Pênis
Uretra
Vaso deferente
Epidídimo
Testículo
Dependente de diidrotestosterona
Dependente de testosterona
Figura 20.10
Regiões dependentes de testosterona e diidrotestosterona no sistema genital do feto humano
masculino. (Segundo Imperato-McGinley et al., 1974.)
duos afetados não tinham um gene funcional para essa enzima (Andersson et al.,
1991; Thigpen et al, 1992). Embora esses indivíduos XY tenham testículos funcionantes,
eles têm uma bolsa vaginal cega e um clitóris aumentado. Pareciam meninas e são
criadas como tais. Suas anatomia interna, porém, é masculina: testículos, desenvolvi-
mento de duto Wolffiano e degeneração do duto Mülleriano. Assim, parece que a
formação da genitália externa está sob o controle da diidrotestosterona, enquanto que
a diferenciação do duto Wolffiano é controlada pela própria testosterona (Figura
20.10). É interessante que a genitália externa torna-se responsiva à testosterona na
puberdade, causando óbvia masculinização em uma pessoa originalmente considera-
da como sendo uma menina.
Hormônio Anti-Mülleriano
O hormônio anti-duto Mülleriano (AMH) é uma glicoproteína com 560 aminoácidos

(Cate et al., 1986) produzido nas células de Sertoli (Tran et al., 1977). Quando fragmen-
tos de testículos fetais ou células de Sertoli isolados são colocados ao lado de seg-
mentos em cultura, contendo porções dos dutos Wolffiano e Mülleriano, o duto
Mülleriano se atrofia apesar de nenhuma alteração ocorrer no duto Wolffiano (Figura
20.11). Essa atrofia é causada tanto pela morte celular como pela transformação em
mesênquima e migração de células epiteliais do duto (Trelstad et al., 1982). O gene
AMH de camundongo tem uma seqüência promotora que é ligada tanto pela proteína
SF1 como por SRY (Haqq et al., 1994; Shen et al., 1994). [sex5.html]
Vemos assim, que uma vez formados, os testículos secretam dois hormônios que
causam a masculinização do feto. Um desses hormônios - testosterona - pode ser
convertido em uma forma mais ativa pelos tecidos que criam a genitália externa. Em
fêmeas, o estrógeno secretado pelos ovários fetal parece ser suficiente para induzir a
diferenciação do duto Mülleriano em útero, ovidutos e cérvix. Dessa maneira, os
cromossomos sexuais controlam o fenótipo sexual de um indivíduo.
Figura 20.11
Exame da atividade do hormônio anti-duto
Mülleriano no segmento anterior do trato
reprodutivo de um feto de rato de 15.5 dias,
após 3 dias em cultura. (A) Tanto o duto
Mülleriano (seta à esquerda) quanto o duto
Wolffiano (seta à direita) estão abertos. (B) O
duto Wolffiano (seta) está aberto, mas o duto
Mülleriano se degenerou e se fechou. (Corte-
sia de N. Josso.)
(A) (B)
O Sistema Nervoso Central
Uma das áreas mais controversas da determinação sexual secundária envolve o de-
senvolvimento de comportamentos específicos do sexo. Em aves canoras, a testoste-
rona é vista regular o crescimento de agregados neuroniais específicos do macho no
cérebro. Machos de canários e tentilhões-zebra cantam eloqüentemente, enquanto as
fêmeas cantam pouco ou nunca. Esses cantos servem para marcar territórios e atrair
consortes. A habilidade de cantar é controlada por seis diferentes agregados de neu-
rônios (núcleos) no cérebro da ave (Figura 20.12). Neurônios conectam cada uma
dessas regiões entre si. Em canários machos, esses núcleos são várias vezes maiores
que agregados correspondentes de neurônios em canários-fêmea; em fêmeas de
tentilhões-zebra, uma dessas regiões pode até estar inteiramente ausente (Arnold,
1980; Konishi e Akutagawa, 1985).
A testosterona tem um papel importante na produção do canto. Em machos adul-
tos de tentilhões-zebra, Pröve (1978) demonstrou uma correlação linear entre a quan-
tidade de canto e a concentração de testosterona sérica. Foi mostrado que mudanças
sazonais nos níveis de testosterona estão correlacionadas com os padrões canoros
desses pássaros. Quando os níveis de testosterona estão baixos, não somente ocorre
um decréscimo de canto do pássaro mas também uma diminuição do tamanho dos
núcleos cerebrais específicos de machos (Nottebohm, 1981). Em tentilhões adultos, a
castração elimina o canto, mas a injeção de testosterona induz tais pássaros a cantar
mesmo em Novembro, o que normalmente não fazem (Thorpe, 1958). Em várias espéci-
es de pássaros, as fêmeas podem ser induzidas a cantar pela injeção de testosterona
(Nottebohm, 1980). Quatro regiões controladoras do canto no cérebro dessas aves
crescem 50-69 porcento em tais pássaros, enquanto outras regiões cerebrais não o Tentilhão-zebra macho
fazem. Estudos auto-radiográficos (Arnold et al., 1976) mostraram que os neurônios
dos núcleos controladores do canto incorporam testosterona radioativa, enquanto
outras regiões do cérebro não o fazem. Parece, portanto, que os hormônios das gôna-
das têm um papel importante no desenvolvimento das regiões do sistema nervoso que
geram comportamentos específicos do sexo.
Syrinx
Figura 20.12
Dimorfismo sexual no cérebro avicular. O diagrama esquemático indica as principiais área neurais Tentilhão-zebra fêmea
acreditadas estar envolvidas na produção do canto no tentilhão-zebra. Os círculos representam
áreas cerebrais específicas; o tamanho de cada círculo é proporcional ao volume ocupado por
essa região. Círculos com linhas hachuriadas são volumes estimados. Os números dentro de
cada círculo representam a porcentagem de células que incorporam testosterona radioativa. As
diferenças de volume entre três dessas regiões (HVc, RA e NXIIts) são significantes entre os
sexos, e a área X não foi observada nos cérebros de tentilhões fêmeas. As diferenças na ligação
de testosterona nas regiões HVc e MAN são significativas, e não foram observadas diferenças
sexuais relativas à ligação de hormônio esteróide em outras regiões do cérebro. As setas indicam
as vias axônicas conectando as regiões no tentilhão macho. (Segundo Arnold, 1980.)
A situação é menos clara em mamíferos, porque aí há menos comportamentos que

caracterizam exclusivamente um sexo. A penetração peniana em ratos é um desses
comportamentos, e é controlado por neurônios motores dos músculos levator ani e
bulbocavernoso. Ambos neurônios se originam de um núcleo espinhal que especifi-
camente concentra testosterona. Em ratas, esses músculos são vestigiais, e o volume
dos seus neurônios controladores é muito reduzido (Breedlove e Arnold, 1980; Tobin
e Joubert, 1992). A testosterona parece promover dois tipos de mudanças nesses
neurônios responsivos. Em fetos e ratos recém-nascidos, a testosterona impede a
morte “normal” de neurônios nessa região. Ratas perdem até 70 porcento dos neurô-
nios desse núcleo espinhal, enquanto ratos machos perdem somente 25 porcento. Em
ratos adultos, a testosterona atua nesse núcleo para manter o tamanho das células
nevosas e seus dendritos. A área do soma e o comprimento dos dendritos desse
núcleo espinhal são reduzidos à metade quando um rato adulto é castrado. Essa
redução é revertida pela injeção de testosterona (Nordeen et al., 1985; Kurz et al.,
1986). Em seres humanos, as diferentes taxas de crescimento entre os sexos produzem
aspectos anatômicos ligeiramente diferentes. Embora os cérebros humanos femininos
sejam 10 porcento menores que os masculinos, a camada granular de algumas regiões
corticais contém neurônios empacotados mais densamente em comparação com regi-
ões semelhantes de cérebros masculinos (Witelson et al., 1995).
A testosterona não é o único esteróide capaz de mediar o comportamento. No
cérebro do mamífero, tambérm são vistos neurônios sensíveis ao estrógeno. Esses
neurônios estão colocados em posições dos circuitos neurais conhecidas por mediar
o comportamento reprodutivo: o hipotálamo, a hipófise e a amígdala (Figura 20.13;
McEwen, 1981). Pfaff e McEwen (1983) demonstraram que o estrógeno altera as pro-
priedades elétricas e químicas dos neurônios hipotalâmicos capazes de ligar estrógeno
em sua cromatina. Terasawa e Sawyer (1969) já tinham encontrado que a atividade
elétrica desses neurônios varia durante o ciclo estrogênico sazonal do rato, aumen-
tando no período da ovulação. Além disso, o estrógeno parece estimular aqueles
neurônios nas regiões que induzem o comportamento reprodutivo feminino. Ratas
ovariectomizadas injetadas com estrógeno diretamente no hipotálamo exibem lordose,
uma posição que estimula o comportamento de monta em camundongos machos,
enquanto que ratas ovariectomizadas controles não mostraram tal comportamento
(Barfield e Chen, 1977; Rubin e Barfield, 1980). O mecanismo pelo qual o estrógeno
promove atividade neuronial específica nesses períodos é considerado envolver au-
mento da permeabilidade ao potássio desses neurônios (Nabekura et al., 1986).
Telencéfalo Diencéfalo Mesen- Rom- Medula

céfalo bencé- espinhal
falo
Cerebelo
Te t o
Córtex óptico
Bulbo
olfativo
Figura 20.13
Representação das regiões ligantes de estróge-
Septo Área Hipotálamo Hipófise
no no cérebro de uma rata. (Segundo Kandel e Medula
pre-óptica
Schwartz, 1985.) espinhal
& Especulações
O Desenvolvimento de Comportamentos Sexuais

A Hipótese da Organização/Ativação o principal componente do sangue fetal e podem levar pessoas semelhantes bi-
A exposição pré-natal (ou neonatal) a cer- fluido cérebro-espinhal. Ela se ligará ao ologicamente a divergirem extensa-
tos hormônios impõe mudanças específi- estrógeno, mas não à testosterona. mente em suas atividade sexuais.
cas do sexo no sistema nervoso central? Tentativas de estender a hipótese da
Tais mudanças neurais específicas do organização/ativação aos comportamentos Homossexualidade Masculina
sexo foram demonstradas nas regiões do sexuais “voluntários” são mais controver- Certos comportamentos são freqüentemen-
cérebro que regulam a fisiologia sexual sos porque não há um comportamento verte citados como sendo parte do fenótipo
“involuntária”. A secreção cíclica de hor- dadeiramente específico do sexo que dis- “completo” masculino ou feminino. Tem-
mônio luteinizante pela hipófise da rata tinga os dois sexos de muitos mamíferos e se dito que o cérebro do homem maduro é
adulta depende da falta de testosterona porque existem múltiplos efeitos do trata- formado de forma que ele tenha o desejo
durante a sua primeira semana de vida. A mento hormonal no mamífero em desen- de copular com uma mulher madura, e o
secreção do hormônio luteinizante das volvimento. Por exemplo, a injeção de tes- cérebro da mulher madura faz com que ela
ratas pode ser tornada não-cíclica dando- tosterona em uma rata de uma semana irá deseje copular com um homem maduro.
lhes testosterona 4 dias após o nascimen- aumentar seus impulsos pélvicos e dimi- Porém, por mais importantes que sejam os
to; inversamente, as secreções do hormô- nuir sua quantidade de lordose (Phoenix desejos em nossas vidas, eles não podem
nio luteinizante em machos podem ser tor- et al., 1959; Kandel et al., 1995). Essas mu- ser detectados por hibridização in situ nem
nadas cíclicas removendo seus testícu- danças podem ser atribuídas às alterações isolados por anticorpos monoclonais. Não
los dentro de um dia após o nascimento mediadas por testosterona no sistema ner- sabemos ainda se os desejos sexuais são
(Barraclough e Gorski. 1962). Acredita-se voso central, mas também podem ser devi- instilados em nós pela nossa educação
que os hormônios sexuais podem atuar das a efeitos hormonais em outros tecidos. social ou se são “armados” em nossos cé-
durante o estágio fetal ou neonatal da vida A testosterona possibilita o crescimento rebros por genes ou hormônios durante
dos mamíferos para organizar o sistema dos músculos que permitem o impulsiona- nosso desenvolvimento intra-uterino ou
nervoso e que durante a vida adulta, os mento pélvico. Visto que a testosterona espor outros meios.
mesmos hormônios podem ter efeitos timula o amplo crescimento das fêmeas e o Em 1991, Simon LeVay propôs que par-
ativadores transitórios. Isso é chamado fechamento de seus orifícios vaginais, não te do hipotálamo anterior de homens ho-
hipótese da organização/ativação. se pode concluir que a ausência de lordose mossexuais tinha a forma anatômica típica
Interessantemente, o principal hormô- seja somente devida às mudanças mediada mulher em lugar daquela de homens
nimo responsável pelo padrão do cérebro das pela testosterona no circuito nervoso heterossexuais. O hipotálamo é considera-
masculino é o estradiol.* A testosterona (Harris e Levine, 1965; De Jonge et al., 1988; do ser a fonte de nossas necessidades se-
do sangue fetal ou neonatal pode ser con- Moore, 1990; Moore et al., 1992; Fausto- xuais, e ratos têm uma área sexualmente
vertida em estradiol pela aromatase P450; Sterling, 1995). dimórfica no hipotálamo anterior que pare-
e essa conversão ocorre no hipotálamo e A extrapolação de ratos para huma- ce regular o comportamento sexual. Esse
no sistema límbico -duas áreas do cérebro nos é um empreendimento muito arrisca- estudo gerou muita publicidade e discus-
conhecidas por regular os comportamen- do, já que nenhum comportamento espe- são. Os principais resultados estão mos-
tos reprodutivos e hormonais (Reddy et cífico do sexo foi identificado em huma- trados na Figura 20.14. Os núcleos
al., 1974; MdEwen et al., 1977). Assim, a nos, e o que é “masculino” em uma cultu- intersticiais do hipotálamo anterior (INAH)
testosterona é capaz de causar seus efei- ra pode ser considerado “feminino” em foram divididos em quatro regiões. Três
tos através da conversão em estradiol. Mas outra (veja Jacklin, 1981; Bleier, 1984; delas não mostraram sinais de dimorfismo
o ambiente fetal é rico em estrógenos oriun- Fausto-Starling, 1992). Conforme conclui sexual. Uma delas, INAH3, mostrou uma
dos das gônadas e da placenta. O que im- uma revisão (Kandel et al., 1995): diferença estatística significativa entre
pede os estrógenos de masculinizar o sis- machos e fêmeas; foi apregoado que o
tema nervoso de um feto feminino? O Existe ampla evidência que a organi- INAH3 masculino é, em média, mais de
estrógeno fetal (tanto masculino como fe- zação neural dos comportamentos duas vezes maior que o INAH3 feminino.
minino) é ligado à α-fetoproteína. Essa pro- reprodutivos, enquanto influenciada Além disso, os dados de LeVay sugeriram
teína é produzida no fígado fetal e torna-se de maneira importante por eventos que o INAH3 de homens homossexuais
Os termos estrógeno e estradiol são freqüen- hormonais durante um período pré- era semelhante ao das mulheres e tinha
temente usados indistintamente. Todavia, o natal crítico, não exerce uma influên- menos da metade do tamanho do INAH3
estrógeno refere-se à uma classe de hormônios cia imutável sobre o comportamento de homens heterossexuais. Esse achado,
esteróides responsáveis pela estabilização e ma- sexual do adulto, ou mesmo sobre uma proclamou LeVay, “sugere que a orienta-
nutenção das características femininas específi-
cas. O estradiol é um desses hormônios, e na
orientação sexual individual. Ao lon- ção sexual tem um substrato biológico.”
maioria dos mamíferos (incluindo os humanos) go da vida de um indivíduo, motivos Houve várias críticas à essa interpre-
ele é o mais potente dos estrógenos. religiosos, sociais ou psicológicos tação dos dados por LeVay. Em primeiro
Figura 20.14 xuais masculinos (homens homossexuais

Uma parte dos dados que podem sugerir uma que tinham um irmão homossexual). Entre
base biológica para o homossexualismo.
40 pares de irmãos homossexuais dos quais
INAH4 e INAH3 são dois grupos de neurôni-
os hipotalâmicos. O INAH4 não mostra di- um havia herdado uma região particular no
morfismo sexual no volume, enquanto o cromossomo X de sua mãe, 33 deles tinham
INAH3 mostra agregação estatisticamente sig- irmãos que também haviam herdado essa
nificativa, embora o intervalo seja semelhante. região (Hamer et al., 1993). Era de se espe-
O INAH3 de autópsias de cérebros masculi- rar que isso tivesse ocorrido, em média, em
nos “homossexuais” mostra agregação em di-
reção da distribuição feminina. Porém, não se somente 20 deles. Novamente, isso é so-
pode posicionar uma relação causa e efeito. mente uma concordância estatística, que
(Segundo LeVay, 1991.) poderia ser coincidente. Além disso, o con-
trole (a observação se o mesmo marcador
Mulheres Homens Homens tanto, não é um fenótipo no sentido usual existia nos homens “não-homossexuais”
heterosse- homosse- da palavra. Em terceiro lugar, os cérebros dessas famílias) não foi apresentado, e o
xuais xuais viés estatístico das observações foi ques-
dos “homens homossexuais” eram de paci-
presumidos presumidos
entes que tinham falecido de AIDS. A AIDS tionado, especialmente porque outros la-
afeta o cérebro, e seu efeito sobre os neurô- boratórios não foram capazes de repetir o
nios hipotalâmicos não é conhecido. Em resultado (Risch et al., 1993; Marshall,
quarto lugar, como o estudo foi feito em cé- 1995). Em um estudo mais recente do mes-
rebros de sujeitos mortos, não se pode infe- mo laboratório, Hu e colegas (1995) encon-
rir causa e efeito. Conforme mencionado no tram pouco ou nenhum aumento nessa re-
Capítulo 1, tais dados mostram apenas cor- gião quando homens homossexuais foram
relações, não causas. comparados com seus irmãos não-homos-
É tão provável comportamentos pode- sexuais. Os autores concluíram que essa
rem afetar o tamanho da densidade neu- região era “nem necessária nem suficiente
ronial regional como a densidade neuroni- para uma orientação homossexual.” Assim,
al regional poder afetar comportamentos. apesar de relatos desses estudos na média
Se os dados forem interpretados como in- pública, não foi encontrado o “gene gay”.
Mulheres Homens Homens
heterosse- homosse- dicando que o INAH3 de homossexuais Merece ser lembrado que genes codi-
xuais xuais masculinos é menor que aquele de hete- ficam RNAs e proteínas, não comporta-
presumidos presumidos rossexuais masculinos, ainda não se sabe mentos. Enquanto os genes podem cau-
se isso é um resultado da homossexuali- sar viés em resultados comportamentais,
lugar, os dados provinham de populações, dade ou uma causa. Em quinto lugar, mes- não temos evidência para sua ação “con-
não de indivíduos. Pode-se também dizer mo se a diferença existe, não há evidência troladora” sobre eles. A existência de pes-
que há um intervalo estatístico e que ho- que a diferença tenha algo a ver com sexu- soas com a “síndrome da personalidade
mens e mulheres têm o mesmo intervalo geral. alidade. Em sexto lugar, esses estudos não múltipla” indica que um genótipo pode
Na realidade, o INAH3 de um “homem ho- indicam quando tais diferenças (se existi- apoiar um grande intervalo de personali-
mossexual” era maior do que de todos, rem) emergem. A questão se diferenças de dades. Isso é certamente um problema
exceto de um dos 16 “homens heterossexu- INAH3 entre homens, mulheres e homens para qualquer definição de um “fenótipo
ais”. Em segundo lugar, os “homens hete- homossexuais ocorrem durante o desen- homossexual”, já que muitas pessoas al-
rossexuais” não eram necessariamente he- volvimento embrionário, logo após o nas- ternam entre comportamentos homosse-
terossexuais, nem os “homens homossexu- cimento, durante os primeiros anos de vida, xual e heterossexual. Assim, a pergunta
ais” eram necessariamente homossexuais; durante a adolescência, ou em um outro se desejos homossexuais são formados
os cérebros vieram de cadáveres de pesso- momento, não foi estudada. por genes dentro do núcleo, por hormô-
as cujas preferências sexuais não eram co- Em 1993, foi feita um correlação entre nios sexuais durante o desenvolvimento
nhecidas. Isso levanta um outro aspecto: o uma certa seqüência de DNA no cromos- fetal, ou por experiências pós-nascimen-
homossexualismo tem muitas formas e, por- somo X e um certo subgrupo de homosse- to ainda permanece uma questão aberta.
Determinação sexual cromossômica em Drosophila

A Via do Desenvolvimento Sexual
Os mecanismos determinantes do sexo em mamíferos e insetos como Drosophila são

muito diferentes. Nos mamíferos, o cromossomo Y tem papel de pivô na determinação
do sexo masculino. Assim, mamíferos XO são fêmeas, com ovários, útero, ovidutos
(em geral, porém, com pouquíssimos, se tanto, óvulos). Em Drosophila, a determinação
Tabela 20.1 Razões de cromossomos X para autossomos em diferentes

fenótipos sexuais de Drosophila melanogaster
Cromossomos X Conjuntos de Relação X:A Sexo
Autossomos (A)
3 2 1.50 Metafêmea
4 3 1.33 Metafêmea
4 4 1.00 Fêmea normal
2 3 0.66 Intersexo
1 2 0.50 Macho normal
1 3 0.33 Metamacho
Fonte: Segundo Strickberger, 1968.
sexual é conseguida por um equilíbrio entre determinantes femininos no cromossomo

X e determinantes masculinos nos autossomos (cromossomos não-sexuais). Se hou-
ver ao menos um cromossomo X em uma célula diplóide (1X:2A), a mosca será macho.
Se houver dois cromossomos X em um célula diplóide (2X:2A) a mosca será fêmea
(Bridges, 1921,1935). Assim, Drosophila XO são machos estéreis. A Tabela 20.1 mos-
tra as diferentes relações X-para-autossomos e o sexo resultante.
Em Drosophila, e insetos em geral, podem-se observar ginandromorfos – ani-
mais nos quais certas regiões são masculinas e outras femininas (Figura 20.15;
Prancha 17). Isso pode acontecer quando um cromossomo X é perdido de um núcleo
embrionário. As células descendentes daquela célula, em vez de serem XX (fêmeas)
são XO (masculinas). Como não há hormônios sexuais para modular tais eventos em
insetos, cada célula produz a sua própria “decisão” sexual. As células XO exibem
características masculinas, enquanto as células XX exibem traços femininos. Essa
situação fornece um belo exemplo da associação entre cromossomos X e sexo. Con-
forme pode ser visto nesse exemplo, o cromossomo Y não tem qualquer papel na
determinação do sexo em Drosophila. Ele é somente necessário para garantir fertili-
dade em machos. O cromossomo Y somente é ativo tardiamente no desenvolvimen-
to, durante a formação de espermatozóide.
Qualquer teoria de determinação sexual em Drosophila precisa explicar como é lida
a razão X-para-autossomo, e como essa informação é transmitida aos genes que con-
trolam os fenótipos masculinos ou femininos. Embora nós ainda não conheçamos os
mecanismos íntimos pelo qual a razão X:A é tornada conhecida para as células, a
pesquisa durante a última década revolucionou nossa visão da determinação sexual
em Drosophila. Muito dessa pesquisa se ocupou da identificação e análise dos genes
que são necessários para a diferenciação sexual e a colocação desses genes em uma
seqüência desenvolvimental. Mutações de perda-de-função na maioria desses genes-
Sex-lethal (Sxl), transformer (tra) e transformer-2 (tra2)- transformam indivíduos
Crista sexual masculina
Figura 20.15
eosin eye
Ginandromorfo de D. melanogaster no qual o
Tipo eosin eye
selvagem lado esquerdo é feminino (XX) e o lado direito
miniature wing miniature wing é masculino (XO). O lado masculino perdeu
um cromossomo portando os alelos tipo selva-
gem da cor dos olhos e forma das asas, permi-
tindo com isso a expressão dos alelos recessi-
vos eosin eye e miniature wing no cromosso-
mo X remanescente. (Segundo Morgan, 1919.)
Razão X:A
Não-ativado (sem
proteína funcional)
Não-ativado (sem
proteína tra funcional)
Reprime
genes Proteínas Dsx Proteínas Dsx Genes
msl específicas específicas msl
da fêmea da macho
ix Reprime Reprime
Genes de Genes de Genes de Genes de
Genes Genes
diferenciação diferenciação diferenciação diferenciação
ligados ao X ligados ao X
feminina masculina masculina feminina
Taxa de Fenótipo Fenótipo Taxa de

transcrição feminino masculino transcrição
feminina masculina
Figura 20.16
Cascata da regulação proposta para a deter-
minação sexual somática em Drosophila. XX em machos. Tais mutações não têm efeito sobre a determinação sexual em machos
Setas representam ativação, enquanto um blo- XY. A homozigozidade do gene intersex (ix) leva moscas XX a desenvolver um fenótipo
co no fim de uma linha indica supressão. Os intersexual que tem porções de tecido masculino e feminino no mesmo órgão. O gene
locos msl, sob o controle do gene Sxl, regu- doublesex (dsx) é importante para a diferenciação sexual dos dois sexos. Se dsx esti-
lam a transcrição compensatória de dosagem ver ausente, tanto moscas XX como XY se transformam em intersexuais (Baker e
do cromossomo X masculino. (Segundo
Ridge, 1980; Belote et al., 1985a).
Baker et al., 1987.)
A posição desses genes numa trajetória desenvolvimental está baseada (1) nas
interpretações de cruzamentos genéticos resultando em moscas tendo duas ou mais
dessas mutações e (2) na determinação do que acontece quando ocorre ausência total
dos produtos de um desses genes. Tais estudos geraram o modelo da cascata regulatória
visto na Figura 20.16.
O Gene Sex-lethal como o Pivô para a Determinação do Sexo
INTERPRETANDO A RAZÃO X:A. A primeira fase da determinação sexual em

Drosophila requer a leitura da razão X:A. Quais elementos no cromossomo X são
“contados” e como é usada essa informação? Parece que valores altos da razão
X:A são responsáveis pela ativação do gene comutador feminilizante Sex-lethal
(Sxl). Em valores baixos (machos), Sxl permanece inativo durante os estágios
precoces do desenvolvimento (Cline, 1983; Salz et al., 1987). Em Drosophila XX,

Sxl é ativado durante as primeiras duas horas após a fecundação, e esse gene
transcreve um particular tipo embrionário de mRNA Sxl que é somente encontrado
durante mais duas horas (Salz et al., 1989). Uma vez ativado, esse gene permanece
ativo apesar de ulteriores mudanças na razão X:A (Sánchez e Nöthiger, 1983).
Função precoce de Sxl é necessária para que embriões XX iniciem a via desenvol-
vimental feminina e mantenham um nível apropriado de transcrição de dois cro-
mossomos X.
Essa ativação específica da fêmea de Sxl é considerada ser estimulada pelos
“elementos numeradores” no cromossomo X que constituem a parte X da razão
X:A. Cline (1988) demonstrou que dois desses elementos numeradores são os genes
sisterless-a e sisterless-b. O gene Sxl não parece sentir esses elementos numerado-
res sem a presença de produtos dos genes runt e daughterless (da). A falta da
proteína Daughterless previne a ativação de Sxl. Isso não afeta os embriões XY (já
que de qualquer maneira eles não ativam Sxl), mas é letal em embriões femininos, já
que o mecanismo para a compensação de dosagem faz com que os dois cromosso-
mos X sejam transcritos com uma taxa maior (masculina) (Cline, 1986; Cronmiller e
Cline, 1987; Duffy e Gergen, 1991) – daí o nome da mutação. Assim, pouco após a
fecundação, os genes sis-a, sis-b, runt e da permitem o Sxl ser somente transcricio-
nalmente ativo em embriões femininos.
Os “elementos denominadores” são aqueles genes que são contados dos
autossomos. Um dos principais elementos denominadores parece ser o gene
deadpan (Younger–Shepherd et al., 1992). Machos com uma razão demasiadamen-
te alta de sis-b para deadpan ativam Sxl e morrem, enquanto que fêmeas com essa
razão demasiadamente baixa não ativam o Sxl e morrem. Outro gene denominador
codifica Extramachrochaetae, uma proteína que compete com a ligação de
Daughterless ao promotor Sxl (Van Doren et al., 1991). Os genes daughterless, sis-
a, sis-b e deadpan são todos fatores de transcrição Hélice-laço-hélice (HLH), e é
possível que as proteínas denominadora e numeradora formem heterodímeros uma
com a outra. Presumivelmente, as proteínas denominadoras são capazes de formar
heterodímeros que bloqueiam aqueles das proteínas ativadoras (Sis e Daughterless)
(Figura 20.17). Parece, portanto, que a razão X:Autossomo é medida pela competi-
ção da ativação codificada pelo X e repressores codificados autossomicamente
no promotor do gene Sxl. [sex6.html]
MANUTENÇÃO DA FUNÇÃO SXL. Pouco após a transcrição de Sxl, um segundo

promotor no gene Sex-lethal é ativado, e esse gene é transcrito tanto em machos
como em fêmeas. Porém, a análise de cDNA do mRNA Sxl mostra que o mRNA Sxl
dos machos difere daquele das fêmeas (Bell et al., 1988). Isso é o resultado do
processamento diferencial do RNA. Além disso, a proteína Sxl parece ligar-se a seu
próprio precursor de mRNA emendando-o da maneira feminina. Como machos não
têm proteína Sxl disponível, os seus novos transcritos são processados da maneira
masculina (Keyes et al., 1992). O mRNA Sxl masculino não é funcional. Enquanto a
mensagem Sxl específica de fêmea codifica uma proteína de 354 aminoácidos, o
transcrito Sxl específico de macho contém um códon de terminação tradutora (UGA)
posterior ao aminoácido 48. O processamento diferencial do RNA que coloca esse
códon de terminação no mRNA específico para machos está mostrado nas Figuras
20.17B e 20.18. Em machos, o transcrito nuclear é emendado de uma maneira que
fornece três éxons, e o códon de terminação está no interior do éxon central. Em
fêmeas, o processamento de RNA fornece somente dois éxons, e o éxon central
específico de macho está agora externalizado como um grande íntron. Assim, o
mRNA específico de fêmea carece do códon de terminação.
A proteína produzida pelo transcrito Sxl específico de fêmea pode ser predita a
partir de sua seqüência nucleotídica. Essa proteína conteria duas regiões que são
importantes para ligação ao RNA compartilhadas com proteínas nucleares ligantes de
(A) 2X:2A feminino (B) 1X:2A masculino
TRANSCRIÇÃO PROMOTORA PRECOCE Fatores de transcrição de heterodímeros não iniciam a transcrição de Sxl
dos promotores precoces
Gene Sxl Gene Sxl
Transcrição
Não há transcrição de Sxl,

tradução ou subseqüente atividade
Proteína Sxl do fator de emenda da proteína Sxl
Códon Emenda e
Iniciador tradução
TRANSCRIÇÃO PROMOTORA TARDIA TRANSCRIÇÃO PROMOTORA TARDIA
Sem
M Proteína
Códon Códon
Proteína Sxl age como fator iniciador Terminação
de emenda para remover
o éxon do transcrito Emenda masculina à revelia inclui
códon de parada no transcrito de
RNA; proteína não é traduzida
Figura 20.17
Ativação diferencial do gene Slx em machos e fêmeas. (A) em Drosophila tipo selvagem com
dois cromossomos X e dois conjuntos de autossomos (XX; AA), as subunidades do fator
de transcrição numerador (sis-a, sis-b, etc.) não estão totalmente complexadas pelas
subunidades inibidoras derivadas dos genes (como deadpan) nos autossomos. Esses fatores
numeradores ativam o promotor precoce do gene Sxl, que produz um transcrito que é auto-
maticamente emendado no mRNA específico de fêmea que codifica a proteína Sxl funcional.
Por fim, a transcrição constitutiva de Sxl começa a partir do promotor tardio. Se Sxl já estiver
disponível (i.e., de uma transcrição precoce), o mRNA de Sxl será emendado para formar a
mensagem funcional específica de fêmea. (B) Em Drosophila de tipo selvagem com um
cromossomo X e dois conjuntos de autossomos (XO; AA), os fatores de transcrição nume-
radores são ligados pelas subunidades denominadoras e não podem ativar o promotor preco-
ce. Quando o gene Sxl for transcrito do promotor tardio, a emenda de RNA não irá excluir
o éxon específico de macho no mRNA. A mensagem resultante codifica um peptídio trunca-
do e não-funcional, visto que o éxon específico de macho contém um códon de terminação
da tradução. (Segundo Keyes et al. 1992.)
RNA tais como àquelas em snRNPs. Bell e colegas (1988) propuseram que existem dois
alvos para a proteína ligante de RNA codificada pelo Sxl. Um desses alvos é o pré-
mRNA do próprio Sxl. Isso seria o mecanismo que manteria o estado feminino da
trajetória após a ocorrência do evento ativador inicial. O segundo alvo seria o pré-
mRNA do próximo gene da trajetória, transformer.
Os Genes transformer
O gene Sxl regula a determinação sexual somática controlando o processamento do

transcrito do gene transformer. Como vimos no Capítulo 12, o gene transformer (tra)
é emendado alternadamente em machos e fêmeas. Existe um mRNA específico de
fêmea e também um mRNA não-específico encontrado tanto em fêmeas como em
machos. Tal como a mensagem Sxl masculina, o mRNA tra contém um códon de
terminação precoce na mensagem, tornando a proteína não-funcional (Boggs et al.,
1987). Em tra, o segundo éxon do mRNA não-específico tem um códon de terminação.
Esse éxon não é utilizado na mensagem específica de fêmea (veja Figura 20.18). Como
fêmeas produzem um transcrito diferente dos machos? Acredita-se que a proteína
específica de fêmea do gene Sxl ative um local de emenda 3’ específico de fêmea no
pré-mRNA do transformer fazendo com que ele seja processado de uma maneira que
expele o segundo éxon. Para isso, a proteína Sxl bloqueia a ligação do fator de emenda
U2AF ao sítio de emenda não-específico, ligando-se especificamente ao trato de
polipirimidina adjacente. Isso leva o U2AF a se ligar ao local de emenda 3’ de menor
afinidade (específico de fêmea) e gerar um mRNA específico de fêmea (Valcárcel et al.,
1993). A proteína codificada por essa mensagem é crítica para a determinação do sexo
feminino. Se o transcrito específico de fêmea for produzido artificialmente em moscas
XY, essas moscas se tornam fêmeas. O transcrito não-específico não tem efeito quer
em machos quer em fêmeas (McKeown et al., 1988).
O produto de tra específico de fêmea age em conjunto com o gene transformer-2
(tra2) para ajudar a gerar o fenótipo feminino. (O gene tra2 não é necessário para a
determinação do sexo masculino, embora seja necessário mais tarde para a espermato-
gênese.) O gene tra2 é constitutivamente ativo e produz o mesmo produto protéico
em machos e fêmeas. Essa proteína TRA-2, tal como a proteína específica de fêmea Sxl,
contém um domínio ligante de RNA (Amrein et al., 1988; Goralski et al., 1988). Propõe-
se que o gene tra2 pode se ligar ao transcrito do gene doublesex, mas somente na
presença da proteína Tra específica de fêmea (Baker, 1989).
Figura 20.18
doublesex
doublesex:: O Gene Comutador da Determinação Sexual O padrão de emenda do RNA específico do
sexo em três principais genes determinantes
O gene doublesex é ativo tanto em machos como fêmeas, mas seu transcrito primá- do sexo em Drosophila. Os pré-mRNAs es-
rio é processado de uma maneira específica do sexo (veja Figura 12.9; Baker et al., tão localizados no centro do diagrama e são
1987). Os transcritos masculino e feminino são idênticos através dos três primeiros idênticos nos núcleos masculinos e femini-
éxons. Os éxons 3’ diferem marcadamente. O que é um éxon para os transcritos espe- nos. Em cada caso, o transcrito específico de
cíficos de fêmea é parte do terminal 3’ não-traduzido da mensagem específica de ma- fêmea é mostrado à esquerda, enquanto o
transcrito à revelia (seja masculino ou não-
cho. Além disso, análises moleculares das mutações dsx dominantes revelam que elas
específico) é mostrado à direita. Éxons estão
numerados, e as posições dos códons termi-
nais e sítios poli(A) estão marcados. (Se-
gundo Baker, 1989.)
mRNA feminino Emenda Pré-mRNA Emenda mRNA masculino

específica “à revelia” ou não-específico
de fêmea Sex-lethal
AAA
Códon de parada
Transformer
AAA
Códon de parada
Doublesex
AAA
contêm inserções no éxon específico de fêmea. Se existir um alelo dsx dominante em

um indivíduo XX, a mosca se torna um macho.
O processamento alternativo de RNA parece ser o resultado dos genes transformer
(veja Figura 20.18). As proteínas Tra2 e as proteínas específicas de fêmea Tra1
ligam-se especificamente à uma seqüência de DNA adjacente ao local de emenda 3’
específica de fêmea do pré-RNA dsx, e recruta fatores de emenda não-específicos
para esse sítio (Tian e Maniatis, 1993). Se tra não for produzido, o transcrito doublesex
é emendado de uma maneira específica de macho. O sítio de emenda 3’ a jusante é
usado para produzir um transcrito específico de macho. Esse codifica uma proteína
ativa que inibe traços femininos e promove traços masculinos. Por outro lado, se o
gene trasnformer estiver produzindo sua proteína ativa específica de fêmea dá-se
um tipo diferente de processamento (Ryner e Bruce, 1991). As proteínas Transformer
se ligam à seqüência no interior do éxon específico de fêmea e ativam o sítio de
emenda 3’ específico de fêmea. (A alternativa seria elas bloquearem o sítio 3’ especí-
fico de macho). Essa ativação, de um outro modo não usada do sítio de emenda 3’
específico de fêmea, produz um mRNA codificando uma proteína específica de fê-
mea que ativa genes específicos de fêmea (como aqueles das proteínas do vitelo) e
inibe o desenvolvimento masculino.
As funções das proteínas Doublesex podem ser observadas na formação da
genitália de Drosophila. Aqui, tanto genitália masculina como feminina derivam de
populações celulares diferentes. Em moscas masculinas (XY), o primórdio feminino
é reprimido e o masculino se diferencia em estruturas genitais adultas. Em moscas
femininas (XX), o primórdio masculino é reprimido, e o feminino se diferencia. Se o
gene doublesex estiver ausente (e aí nenhum transcrito será produzido), ambos
primórdios, masculino e feminino, se desenvolvem e serão produzidas genitálias
intersexuais. Assim, um dos papéis dos transcritos doublesex específicos do sexo é
o de inibir ativamente o crescimento da genitália inapropriada. Transcritos dsx mas-
culinos inibem o desenvolvimento da fêmea; transcritos dsx específicos de fêmea
inibem o desenvolvimento masculino (Nöthiger et al., 1977; Schüpbach et al., 1978).
De acordo com esse modelo (Baker, 1989), a cascata da determinação sexual se reduz
a qual tipo de mRNA será processado do transcrito doublesex. Se a razão X:A for 1,
então Sxl produz um fator de emenda específico de fêmea que faz com que o trans-
crito do gene tra seja emendado de uma maneira específica de fêmea. Essa proteína
específica de fêmea interage com o fator de emenda Tra2 para levar o pré-mRNA
doublesex a ser emendado de uma maneira específica de fêmea. Se o transcrito
doublesex não sofre tal atuação, ele será processado à revelia para produzir a men-
sagem específica de macho.
Genes-alvo para a Cascata de Determinação Sexual
Muitas proteínas estão presentes em um sexo de Drosophila e não no outro. Em

fêmeas, essas incluem as proteínas do vitelo e as da casca do ovo (cório). Em ma-
chos, as cristas sexuais das patas são estruturas específicas do sexo. Coschigano e
Wensink (1993) mostraram que tanto os transcritos doublesex masculinos como os
femininos se ligam a três sítios no interior do intensificador de 127 pares de bases
dos genes yolk protein (proteínas do vitelo). Seus estudos de ligação e mutagênese
demonstram que o produto Doublesex específico de macho inibe a transcrição ligan-
do-se a esses sítios, enquanto a proteína Doublesex específica de fêmea ativa a
transcrição gênica a partir dos mesmos sítios. Além disso, a proteína Doublesex
masculina pode também exercer um papel positivo na promoção da diferenciação
das cristas sexuais masculinas (Jursnich e Burtis, 1993).
Mutações termosensíveis dos genes determinantes do sexo podem capacitar pes-
quisadores a determinarem os momentos críticos em que certos genes-alvo estão
sensíveis a uma comutação determinante do sexo. Quando alelos sensíveis à tempera-
tura (ts) do gene tra2 foram usados, as vias de desenvolvimento sexual em Drosophila
mostraram-se ativas desde os estágios larvais tardios até o período adulto. O gene
tra2ts é um alelo sensível à temperatura no qual o fenótipo feminino é expresso em
temperaturas permissivas (mais frias) e o fenótipo masculino em temperaturas não-
permissivas (mais quentes). Durante estágios tardio larval e de pupa, o aumento da
temperatura de níveis permissivos para não-permissivos faz com que uma larva ou
pupa XX se desenvolva em macho. Além disso, quando mutantes adultos são conser-
vados a temperaturas baixas, o corpo gorduroso adulto produz proteínas do vitelo
(yolk proteins) que irão penetrar no oócito. Quando movidos para temperatura mais
altas, não-permissivas, a transcrição dos genes yolk protein cessa (Belote et al.,
1985b). Um achado notável foi que se moscas adultas XX tra2ts são conservadas em
temperatura não-permissiva durante vários dias, elas começam a exibir comportamen-
to de cortejar masculino (Belote e Baker, 1987).
Hermafroditismo
Hermafroditismo no Nematóide C. elegans
O nematóide Caenorhabditis elegans tem usualmente dois tipos sexuais: hermafrodi-

ta e macho. A maioria dos indivíduos dessa espécie são hermafrodíticos,* tendo
tanto testículos como ovários. Quando larvas, esses hermafroditas produzem esper-
matozóide, que é armazenado no trato genital do nematóide (Figura 20.19). O ovário
adulto produz óvulos que são fertilizados quando migram para o útero. (O espermato-
zóide já está presente no hermafrodita adulto.) A autofertilização quase sempre produz
mais hermafroditas. Somente 0.2 porcento da progênie são machos. Esses, porém,
podem copular com hermafroditas; como seu espermatozóide tem uma vantagem com-
petitiva sobre o espermatozóide hermafrodita endógeno, a razão sexual resultante de
tais uniões é de cerca 50% hermafroditas e 50% machos (Hodgkin, 1985).
Em C. elegans, o hermafrodita é XX, e o macho é XO. Como em Drosophila, o sexo
é determinado pela razão de cromossomos X para autossomos. Em espécies estreita-
mente relacionadas de nematóides são encontradas fêmeas XX, sugerindo que os
hermafroditas evoluíram de fêmeas. Somaticamente, as fêmeas e os hermafroditas são
idênticos, a única diferença sendo a produção de espermatozóide durante o desenvol-
vimento precoce antes dos hermafroditas mudarem para a produção de óvulos. Em C.
elegans existe uma mutação dominante (tra-1D) que transforma indivíduos XX ou XO
*Hermafroditas receberam o nome em homenagem ao filho de Hermes (Mercúrio) e Afrodite

(Vênus). Tendo herdado a beleza de ambos os pais, excitou o amor da ninfa da fonte de Salmacis.
Enquanto ele se banhava nessa fonte, ela o abraçou, pedindo aos deuses que eles ficassem unidos para
sempre. Ela conseguiu seu desejo da forma mais literal possível.
Hermafrodita: XX
Espermatozóide Ovário
Ovário na espermateca
Óvulos no
útero
Boca Ânus
Oócitos
Órgão
copulatório
Macho: XO Vulva
Figura 20.19
Esperma- Cloaca Diagramas esquemáticos do macho e do her-
tozóide Vasos mafrodita de Caenorhabditis elegans, enfati-
deferentes zando seus sistemas reprodutivos. (de
Testículos Hodgkin, 1985.)
1.0 Baixo Alto Baixo Alto Baixo Alto
Hermafrodita
Ratio
X:A
Alto Baixo Alto Baixo Alto Baixo
Macho
Figura 20.20
Modelo esquemático da determinação sexual
somática em C. elegans. O gene sdc-1 é postu-
lado estar envolvido na transmissão da razão
X/A. Ele controla compensação de dosagem em fêmeas férteis. Em colônias com tal alelo, três sexos são possíveis e funcionais
do cromossomo X assim como a supressão do (Hodgkin, 1980).
gene her-1 se a razão for 1. A designação alto/ Como em Drosophila, a determinação do sexo em C. elegans envolve vários genes
baixo reflete a atividade funcional do gene. A autossômicos que lêem e respondem à razão X:A. O gene que integra os numeradores
atividade dos genes sdc, ao final, leva à ativi- e denominadores do desenvolvimento de C. elegans é o xol-1 (XO-lethal). Níveis
dade do gene tra-1, cuja atividade promove o
altos de XOL-1 durante a gastrulação desligam a trajetória para o desenvolvimento
fenótipo hermafrodita. Os genes scd podem
ser inibidos pelo gene xol, que é somente ativo hermafrodítico, transformando com isso o animal em um macho (Rhind et al., 1995).
em XO (machos). (Segundo Hodgkin, 1985; XOL-1 parece conseguir isso reprimindo os genes sdc (controle da determinação do
Miller et al., 1988.) sexo), cujas atividade tornam o animal hermafrodita (Miller et al., 1988).
A trajetória para determinação do sexo em C. elegans foi decifrada encontrando-se
mutações em genes necessários para o desenvolvimento hermafrodita (os genes tra),
bem como outros necessários para a expressão do fenótipo masculino (os genes her
e fem). Criando genótipos carreando diferentes combinações dessas mutações Hodgkin
(1980) e outros foram capazes de construir um modelo para essa via desenvolvimental
(Figura 20.20). Por exemplo, mutações tra-2 suprimiram a mutação her-1, indicando
que her-1 é mais tardio na trajetória.
O gene crucial na trajetória para a determinação sexual parece ser o tra-1. Se o
tipo selvagem tra-1 for ativo, o indivíduo é um hermafrodita. Se esse gene não for
funcional, o indivíduo é um macho. Os outros genes parecem regular esse gene
singular de troca.
Porém, o que tem essa via genética linear a ver com os reais eventos celulares
levando à determinação sexual? Estudos recentes indicam que alguns desses genes
codificam proteínas de uma via sinalizadora entre células. A análise de mosaicos
genéticos sugere que sdc-1 e her-1 não são necessariamente ativos nas células
que os produzem. Ao contrário, esses genes parecem produzir produtos secreta-
dos. Em contraste, tra-1 age de um modo celular autônomo e, portanto, provavel-
mente é parte de um aparelho receptor de sinais. A seqüência do gene tra-1 sugere
que esse codifica um fator de transcrição dedo de zinco (Hunter e Wood, 1990;
Zarkower e Hodgkin, 1992; Perry et al., 1993). Kuwabara e Kimble (1992) propuse-
ram recentemente um modelo que integra essa via genética com a biologia celular
da determinação do sexo. A proteína HER-1 é considerada promover o desenvolvi-
mento masculino em nematóides XO inibindo a TRA-2. A proteína codificada por
tra-2, porém, não é um fator de transcrição ou um fator de emenda, mas sim uma
proteína integral de membrana com múltiplos domínios transmembrana. Além dis-
so, seu mRNA é encontrado (em quantidade diferentes) tanto em machos como em
fêmeas. De acordo com esse modelo especulativo (Figura 20.21), as proteínas
FEM se combinam para criar um grande complexo de proteína FEM, e esse comple-
xo está ligado pela proteína TRA-2 da membrana. Em indivíduos XX, esse comple-
xo é ligado à membrana, e a proteína TRA-1 pode entrar no núcleo. Em nematóides
XO, porém, a proteína HER-1 se liga à região extracelular da proteína TRA-2,
causando a liberação do complexo FEM. Esse complexo, uma vez livre no citoplas-
ma, pode ligar a proteína TRA-1 e impedir sua entrada no núcleo. Desde que a
Hermafroditas XX Machos XO Figura 20.21

Esquema hipotético para as ações dos genes
determinantes do sexo em C. elegans. Em indi-
víduos XX, as proteínas FEM estão seqüestra-
das próximo da membrana celular pelos pro-
dutos dos genes tra-2. Na ausência das prote-
ínas FEM, a proteína TRA-1 penetra no núcleo
para transcrever os genes necessários para o
desenvolvimento hermafrodítico. Em indiví-
duos XO, a proteína HER-1 se liga ao produto
de TRA-2, levando-o a liberar as proteínas
FEM. Uma vez livres no citoplasma, essas pro-
teínas podem se ligar ao produto de TRA-1,
Citoplasma impedindo-o de penetrar no núcleo. (Segundo
Kuwabara e Kimble, 1992.)
Núcleo
proteína TRA-1 (um fator de transcrição putativo) não pode entrar no núcleo, ela
não poderá ativar os genes específicos do hermafrodita. Mais estudos terão que
ser realizados para confirmar ou desaprovar esse modelo que, no entanto, é útil
por sugerir novas pesquisas e por visualizar como os genes poderiam gerar vias
para a determinação sexual em C. elegans.
Um dos problemas mais interessantes desse nematóide é seu hermafroditismo.
Como se originou essa condição em um organismo que provavelmente tinha um siste-
ma sexual macho/fêmea? Quais mudanças genéticas apareceram, e haveria outras
soluções que poderiam ter prevalecido? Os genes determinantes do sexo de uma
espécie estreitamente relacionada, a C. ramanei (com indivíduos macho e fêmea)
estão sendo agora identificados para se poder responder a essas perguntas. [sex7.html]
Hermafroditismo em Peixes
Embora o hermafroditismo não seja incomum em vermes e insetos, só é visto raramen-

te em vertebrados. Em aves e mamíferos, o hermafroditismo é geralmente uma condi-
ção patológica causando infertilidade. Os hermafroditas vertebrados mais comuns
são peixes, que exibem vários tipos de hermafroditismo (Yamamoto, 1969). Alguns
peixes, porém, são gonocorísticos; isso é, eles têm um sexo determinado cromossomi-
camente como macho ou fêmea. Peixes hermafroditas podem ser divididos em três
grupos. Os primeiros são os hermafroditas sincrônicos, nos quais ovários e tecidos
testiculares existem ao mesmo tempo e nos quais tanto espermatozóide como óvulos
são produzidos. Uma dessas espécies é Servanus scriba. Na natureza e em aquários,
esses peixes formam pares procriadores. Assim que um dos peixes põe seus ovos, o
outro peixe os fertiliza. Em seguida os peixes invertem seus papéis, e o peixe que havia
sido macho põe seus ovos para que possam ser fertilizados pelo espermatozóide de
seu parceiro (Clark, 1959).
Em outras espécies hermafroditas, um indivíduo passa por uma mudança sexual
geneticamente programada durante seu desenvolvimento. Nesses caso, as gônadas
são dimórficas, tendo tanto áreas femininas como masculinas. Uma ou outra predo-
mina durante certa fase da vida. Em hermafroditas protóginos (“fêmea primeiro”), o
animal começa sua vida como uma fêmea para mais tarde tornar-se um macho. O
reverso acontece em espécies protândreas (“machos primeiro”). A Figura 20.22
Figura 20.22 (A) FASE MASCULINA (B) FASE TRANSITÓRIA (C) FASE FEMININA
Alterações nas gônadas no peixe hermafrodita
Sparus auratus, mostradas em seção através Ovário
da gônada de (A) a fase masculina, (B) a fase
transitória e (C) a fase feminina final. (Cortesia Ovário
da família de T. Yamamoto.) Ovário
Testículo
Testículo
Testículo
mostra as mudanças gonádicas no peixe hermafrodita protândreo Sparus auratus. A

princípio predomina o tecido testicular, mas após um período de transição no qual são
vistos tanto tecidos testiculares como ovarianos, as células ovarianas predominam.
Determinação ambiental do sexo

Determinação Sexual Dependente de T
Sexual emperatura em Répteis
Temperatura
Enquanto o sexo da maioria das serpentes e lagartos é determinado pelos cromosso-

mos sexuais no momento da fecundação, o sexo da maioria das tartarugas e todas as
espécies de crocodilos é determinado pelo ambiente após a fecundação. Nesses rép-
teis, a temperatura dos ovos durante um certo período do desenvolvimento é o fator
decisivo na determinação do sexo (Bull, 1980), e pequenas alterações na temperatura
podem causar mudanças dramáticas na razão sexual. Em geral, ovos incubados à baixa
temperatura (22o – 27oC ) produzem um sexo, enquanto ovos incubados a temperaturas
mais altas (30oC e acima) produzem o outro. Há somente um pequeno intervalo de
temperatura que permite tanto machos como fêmeas emergir de um mesmo choco de
ovos. A Figura 20.23 mostra mudança abrupta causada por mudança de temperatura
nas razões sexuais para certas espécies de tartarugas. Se os ovos forem incubados
abaixo de 28oC, todas as tartarugas serão machos. Acima de 32oC cada ovo origina uma
fêmea. Em temperaturas intermediárias darão origem a indivíduos de ambos os sexos.
Existem variações disso. Os ovos das tartarugas mordedoras (snapping turtles), por
exemplo, serão fêmeas no frio (20oC ou abaixo) ou no calor (30oC ou acima). Entre esses
extremos, predominam os machos.
Um dos répteis melhor estudados é a tartaruga européia de lagoas, Emys obicularis.
No laboratório, a incubação de ovos de Emys à temperaturas acima de 30oC produz
fêmeas, enquanto abaixo de 25oC as crias serão todas masculinas. A temperatura limite
(na qual a razão sexual é 1) é de 28.5oC (Pieau et al., 1994). O período desenvolvimental
durante o qual ocorre a determinação sexual, pode ser estudado incubando ovos na
temperatura produtora de machos por um certo período, e em seguida mudando os
ovos para uma incubadora à temperatura produtora de fêmeas (e vice-versa). Em
Emys, a última terça parte do desenvolvimento parece ser o período mais crítico para a
determinação sexual. Não se acredita que as tartarugas possam reverter seu sexo após
esse período.
Os caminhos para a masculinidade e feminilidade estão apenas sendo delineados.
O estrógeno induz a diferenciação ovariana à temperaturas masculinizantes, e o perí-
odo sensível para os efeitos do estrógeno coincide com àquele em que a determinação
(A) Lagartos (B) Tartarugas Graptemys (3 espécies)

Chrysemys picta
Todos machos Todos machos
Porcentagem de nascimentos masculinos
Porcentagem de nascimentos masculinos

Agama Testudo
agama Emys obicularis graeca
Eublepharis
macularius
Caretta
caretta
Todas fêmeas Todas fêmeas
Figura 20.23
Relação entre a razão sexual e a temperatura de incubação em répteis. (A) Duas espécies de
lagartos nas quais temperaturas mais altas resultam na geração de prole masculina. (B) Sete
espécies de tartarugas nas quais temperaturas mais altas resultam em prole feminina. (Segundo
Bull, 1980.)
do sexo normalmente ocorre (Bull et al., 1988; Gutzke e Chymiy, 1988). Parece que a
enzima aromatase (que pode converter testosterona em estrógeno) é importante. A
atividade da aromatase de Emys é muito baixa à temperatura “masculina” de 25oC. À
temperatura “feminina” de 30oC, a atividade da aromatase aumenta dramaticamente
durante o período crítico para a determinação do sexo (Desvages et al., 1993; Pieau et
al., 1994). Atividade dependente de temperatura de aromatase também é vista em
terrapíneos (tartarugas-“diamondback terrapins”), e sua inibição masculiniza suas
gônadas (Jeyasuria et al., 1994). É possível que o regulador da atividade da aromatase
seja o hormônio anti-Mülleriano. AMH é conhecido por diminuir a atividade da aroma-
tase em gônadas de Emys (Desvages e Pieau, 1992).
Ferguson e Joanen (1982) estudaram a determinação sexual no jacaré do Mississipi, Probóscide
tanto no laboratório como no campo; eles concluíram que o sexo é determinado entre
7 e 21 dias de incubação. Ovos criados a 30oC ou abaixo produzem fêmeas, enquanto
aqueles incubados a 34oC ou acima produzem somente machos. Além disso, ninhos
construídos sobre barragens (perto de 34oC) produzem machos, enquanto aqueles
construídos em pântanos úmidos (perto de 300C) produzem fêmeas. As vantagens e
desvantagens da determinação sexual dependente de temperatura são discutidas no
Capítulo 21.
Determinação Sexual Dependente da Localização (A)

em Bonellia viridis e Crepidula fornicata (B)
O sexo do verme equiuróide Bonellia depende de onde a larva se aloja. Bonellia

fêmea é marinha, habita rochas, tem um corpo de cerca de 10 cm (Figura 20.24), Tem,
porém, uma probóscide que pode se estender por mais de um metro. Essa probóscide
tem duas funções. Em primeiro lugar, varrer comida das rochas para o trato digestivo
da fêmea. Em segundo lugar, se uma larva aterrissar na probóscide, essa entra na boca
do animal, migra até o útero, e se diferencia em macho simbiótico de 1-3 mm de compri-
Figura 20.24
mento. Assim, quando uma larva se aloja numa superfície rochosa, torna-se uma fê-
Dimorfismo sexual extremo em Bonellia viridis.
mea, mas se a mesma larva se aloja sobre a probóscide de uma fêmea, se torna um (A) Fêmea, de cerca de 10 cm, com uma
macho. O macho de Bonellia passa sua vida no interior do corpo da fêmea, fecundan- probóscide capaz de se estender por mais de
do seus ovos. um metro. (B) Macho simbiótico (muito au-
Baltzer (1914) demonstrou que quando larvas eram cultivadas na ausência de mentado comparado com a fêmea), 1-3 mm de
fêmeas adultas, cerca de 90 porcento se tornavam fêmeas. Porém, quando essas larvas comprimento. (Segundo Barnes, 1968.)
Água do mar pura

Água do mar
e fragmentos de probóscide
Porcentagem
Indiferentes
Figura 20.25
Análise in vitro da diferenciação de Bonellia. Larvas foram colocadas em água do mar normal ou
em água do mar contendo fragmentos de probóscide feminina. A maioria dos animais cultivados
na presença dos fragmentos de probóscide tornaram-se machos, enquanto normalmente se torna-
riam fêmeas. (Segundo Leutert, 1974.)
eram cultivadas na presença de uma fêmea adulta ou de sua probóscide isolada, 70

porcento aderiam à probóscide e desenvolviam estruturas masculinas. Esses resulta-
dos foram mais recentemente confirmados por Leutert (1974; Figura 20.25).
A(s) molécula(s) responsável pela masculinização das larvas podem ser extraídas
da probóscide de fêmeas adultas. Quando larvas são cultivadas em água do mar
normal, na ausência de fêmeas adultas, a maioria se torna fêmea. Quando cultivadas
em água do mar contendo extratos aquosos de tecido da probóscide, a maioria adquire
forma de macho ou intermediária, nem totalmente masculina nem feminina (Nowinski,
1934; Agius, 1979). O composto ou compostos que atraem a larva para a probóscide e
causam sua masculinização estão sendo purificados.
Outro exemplo em que a determinação sexual é afetada pela posição do organismo
é o caso do caramujo escorregador Crepidula fornicata. Aqui, indivíduos se empilham
uns em cima dos outros para formar um montículo (Figura 20.25). Indivíduos jovens
são sempre machos. Essa fase é seguida pela degeneração do sistema reprodutivo
masculino e um período de labilidade. A próxima fase pode ser masculina ou feminina,
dependendo da posição do animal no montículo. Se a lesma está fixada à uma fêmea,
torna-se macho. Se tal lesma for removida da fixação, torna-se fêmea. Da mesma manei-
ra, a presença de um grande número de machos irá fazer com que alguns dos machos
se tornem fêmeas. Porém, uma vez que o indivíduo se torna fêmea, não irá reverter para
macho (Coe, 1936).
Resumo
A Natureza forneceu muitas variações em sua obra prima. Em algumas espécies, o sexo
é determinado somente por cromossomos, enquanto em outras, sexo é uma questão
de condições ambientais. Entre essas grandes categorias, existem numerosas varia-
ções. Um catálogo completo dos mecanismos de determinação sexual conhecidos iria
requerer um volume em separado (e muito interessante).
Figura 20.26
Agregados de lesmas Crepidula. Dois indivíduos estão mudando de machos para fêmeas.
Morto
Após esses moluscos se tornarem fêmeas, serão fecundados pelo macho acima deles. (Segun-
do Coe, 1936.)
LITERATURA CITADA
Agius, L. 1979. Larval settlement in the Belote, J. M. and Baker, B. S. 1987. Sexual sex-transforming maternal effect linking sex
echiuran worm Bonellia vividis: Settlement on behavior: Its genetic control during devel opment determination and dosage com pensation in Dro-
both the adult proboscis and body trunk. Mar. and adulthood in Drosophila melanogaster. Proc. sophila melanogaster. Dev. Biol. 95: 260-274.
Biol. 53: 125-129. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8026-8030.
Cline, T. W. 1986. A female-specific lethal lesion
Amrein, H., Gorman, M. and Nöthiger, R. 1988. Belote, J. M., McKeown, M. B., Andrew, D. J., in an X-linked positive regulator of the Droso-
The sex-determining gene tra-2 of Drosophila Scott, T. N., Wolfner, M. F. and Baker, B. S. phila sex determination gene, Sexlethal.
encodes a putative RNA binding protein. Cell 1985a. Control of sexual differentiation in Dro- Genetics 113: 641-663.
55: 1025-1035. sophila melanogaster. Cold Spring Harbor
Cline, T. W. 1988. Evidence that sisterless-a
Symp. Quant. Biol. 50: 605-614.
Andersson, S., Berman, D. M., Jenkins, E. P. and sisterless-b are two of several discrete
and Russell, D. W. 1991. Deletion of steroid 5a- Belote, J. M., Handler, A. M., Wolfner, M. F, “numerator elements” of the X/A sex determi-
reductase 2 gene in male pseudoher-maphrodi- Livak, K. L. and Baker, B. S. 1985b. Sex-specific nation signal in Drosophila that switch Sxl
tism. Nature 354: 159-161. regulation of yolk protein gene expression in between two alternative stable expression states.
Drosophila. Cell 40: 339-348. Genetics 119: 829-862.
Aristotle. The generation of animals. Translated
by A. Platt. In J. Barnes (ed.), 1984, The Com- Berkovitz, G. D. and seven others. 1992. The Coe, W. R. 1936. Sexual phases in Crepidula. J.
plete Works of Aristotle, Vol. 8. Princeton Uni- role of the sex-determining region of the Y chro- Exp. Zool. 72: 455-477.
versity Press, Princeton, NJ. mosome (SRY) in the etiology of 46, XX true
Cohen, D. R., Sinclair, A. H. and McGovern, J.
hermaphrodites. Hum. Genet. 88: 411-416.
Arnold, A. P. 1980. Sexual differences in the D. 1994. SRY protein enhances transcription of
brain. Am. Sci. 68: 165-173. Bernstein, R., Jenkins, T, Dawson, B., Wagner, Fos-related antigen 1 promoter constructs. Proc.
J., Devald, G., Koo, G. C. and Wachtel, S. S. 1980. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4372-4376.
Arnold, A. P., Nottebohm, F. and Pfaff, D. W. 1976.
Female phenotype and multiple abnormalities in
Hormone concentrating cells in vocal control and Coschigano, K. T. and Wensink, P. C. 1993.
sibs with a Y chromosome and partial X-chro-
other brain regions of the zebra finch (Poephila Sex-specific transcriptional regulation of the
mosome duplication: H-Y antigen and Xg blood
guttata). J. Comp. Neurol. 165: 487-512. male and female doublesex proteins of Droso-
group findiungs. J. Med. Genet. 17: 291-300.
phila. Genes Dev. 7: 42-54.
Baker, B. S. 1989. Sex in flies: The splice of life.
Bleier, R. 1984. Science and Gender. Pergamon,
Nature 340: 521-524. Coward, P., Nagai, K., Chen, D., Thomas, H. D.,
Nagamine, C. M. and Lau, Y-F. C. 1994.
Baker, B. S. and Ridge, K. A. 1980. Sex and the
Boggs, R. T, Gregor, P., Idriss, S., Belote, J. M. Polymorphism of a CAG trinucleo-tide repeat
single cell. I. On the action of major loci
and McKeown, M. 1987. Regulation of sexual within Sry correlates with B6YDom sex reversal.
affecting sex determination in Drosophila me-
differentiation in D. melanogaster via alterna- Nat. Genet. 6: 245-250.
lanogaster. Genetics 94: 383-423.
tive splicing of RNA from the transformer gene.
Cronmiller, C. and Cline, T. W. 1987. The Dro-
Baker, B. S., Nagoshi, R. N. and Burtis, K. C. 1987. Cell 50: 739-747.
sophila sex determination gene daughterless has
Molecular genetic aspects of sex determination in
Breedlove, S. M. and Arnold, A. P. 1980. different functions in the germ line versus the
Drosophila. BioEssays 6: 66-70.
Hormone accumulation in a sexually dimorphic soma. Cell 48: 479-87.
Baltzer, F. 1914. Die Bestimmung und der Di- motor nucleus of the rat spinal cord. Science
De Jonge, F. H., Muntjewerff, J.-W., Louw-erse,
morphismus des Geschlechtes bei Bonellia. Sber. 210: 565-566.
A. L. and Van de Poll, N. E. 1988. Sex-ual behavior
Phys.-Med. Ges. Würzb. 43: 1-4.
Bridges, C. B. 1921. Triploid intersexes in Dro- and sexual orientation of the female rat after
Bardoni, B. and eleven others. 1994.A dosage sensitive sophila melanogaster. Science 54: 252-254. hormonal treatment during various stages of de-
locus at chromosome Xp21 is involved in male to velopment. Horm. Behav. 22:100-115.
Bridges, C. B. 1925. Sex in relation to
female sex reversal. Nat. Genet. 7: 497-501.
chromosomes and genes. Am. Nat. 59: 127-137. Desvages, G. and Pieau, C. 1992. Time required
Barfield, R. J. and Chen, J. J. 1977. Activation for temperature-induced changes in gonadal aro-
Buehr, M., Gu, S. and McLaren, A. 1993.
of estrous behavior in ovariectomized rats by matase activity and related go-nadal structure in
Mesonephric contribution to testis differentiation
intracerebral implants of estradiol benzoate. turtle embryos. Differentiation 52: 13-18.
in the fetal mouse. Development 117: 273-281.
Endocrinology 101: 1716-1725.
Desvages, G., Girondot, M. and Pieau, C. 1993.
Bull, J. J. 1980. Sex determination in reptiles.
Barnes, R. D. 1968. Invertebrate Zoology. Sensitive stages for the effects of temperature
Q. Rev. Biol. 55: 3-21.
Saunders, Philadelphia. on gonadal aromatase activity in embryos ofthe
Bull, J. J., Gutzke, W, H. N. and Crews, D. 1988. marine turtle Dermochelys coriacea. Gen.
Barraclough, C. A. and Gorski, R. A. 1962. Studies Comp. Endocrinol. 92: 54-61.
Sex reversal by estradiol in three reptilian orders.
on mating behavior in the androgen-sterilized fe-
Gen. Comp. Endocrinol. 70: 425-428.
male rat in relation to the hypothalamic regulati- Duffy, J. B. and Gergen, J. P. 1991. The Droso-
on of sexual behavior.J. Endocrinol. 25: 175-182. Cate, R. L. and eighteen others. 1986. Isolation phila segmentation gene runt acts as a position-
of the bovine and human genes for Müllerian specific numerator element necessary for the
Bell, S. E. 1986. A new model of medical uniform expression of the sex determining gene
inhibiting substance and expression of the gene
technology development: A case study of DES. sex-lethal. Genes Dev. 5: 2176-2187.
in animal cells. Cell 45: 685-698.
Sociol. Health Care 4: 1-32.
Clark, E. 1959. Functional hermaphro-ditism Eicher, E. M. 1994. Sex and trinucleotide repeats.
Bell, L. R., Maine, E. M., Schedl, P. and Cline, Nat. Genet. 6: 221-223.
and self-fertilization in a serranid fish. Science
T. W. 1988. Sex-lethal, a Drosophila sex
129: 215-216.
determination switch gene, exhibits sex-specific Eicher, E. M. and Washburn, L. L. 1983. Inherited
RNA splicing and sequence similarity to RNA Cline, T. W. 1983. The interaction between sex reversal in mice: Identification of a new sex-
binding proteins. Cell 55: 1037-1046. daughterless and Sex-lethal in triploids: A novel determining gene. J. Exp. Zool. 228: 297-304.
Fausto-Sterling, A. 1992. Myths of Gender. Basic Harris, G. W. and Levine, S. 1965. Sexual Konishi, M. and Akutagawa, E. 1985. Neuronal
Books, New York. physiology of the brain and its experimental growth, atrophy, and death in a sexually
control. J. Physiol. 181: 379-400. dimorphic song nucleus in the zebra finch brain.
Fausto-Sterling, A. 1995. Animal models for the
Nature 315: 145-147.
development of human sexuality: A critical Higgins, S. J., Young, P. and Cunha, G. R. 1989.
evaluation. J. Homosexuality 28: 217-236. Induction of functional cytodifferentiation in Koopman, P., Miinsterberg, A., Capel, B., Vivian,
the epithelium of tissue recombinants II. N. and Lovell-Badge, A. 1990. Expression of a
Ferguson, M. W. J. and Joanen, T. 1982.
Instructive induction of Wolffian duct epithelia candidate sex-determining gene during mouse
Temperature of egg incubation determines sex in
by neonatal seminal vesicle mesenchyme. De- testis differentiation. Nature 348: 450-452.
Alligator mississippiensis. Nature 296: 850-853.
velopment 106: 235-250.
Koopman, P., Gubbay, J., Vivian, N., Good-fellow,
Foster, J. W. and eleven others. 1994. Cam-
Hodgkin, J. 1980. More sex-determination P. and Lovell-Badge, R. 1991. Male develop-
pomelic dysplasia and autosomal sex reversal
mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics 96: ment of chromosomally female mice transgenic
caused by mutations in an SRY-re-lated gene.
649-664. for Sry. Nature 351: 117-121.
Nature 372: 525-530.
Hodgkin, J. 1985. Males, hermaphrodites, and Kurz, E. M., Sengelaub, D. R. and Arnold, A. P.
Galen, C. On the Usefulness of the Parts of the
females: Sex determination in Caenorhabditis 1986. Androgens regulate the dendritic length
Body. Translated by M. May, 1968. Cornell
elegans. Trends Genet. 1: 85-88. of mammalian motoneurons in adulthood.
University Press, Ithaca, NY.
Science 232: 395-397.
Horowitz, M. C. 1976. Aristotle and women. J.
Geddes, P. and Thomson, J. A. 1890. The
Hist. Biol. 9: 183-213. Kuwabara, P. E. and Kimble, J. 1992. Molecular
Evolution of Sex. Walter Scott, London.
genetics of sex determination in C. elegans.
Hu, S., Pattatucci, A. M. L., Patterson, C., Li,
Genetics Review Group. 1995. One for a boy, Trends Genet. 8: 164-168.
L., Fulker, D. W., Cherny, S. S., Kruglyak, L.
two for a girl? Curr. Biol. 5: 37-39.
and Hamer, D. H. 1995. Linkage betwen sequal Langman, J. 1981. Medical Embryology, 4th
Giese, K., Cox, J. and Grosschedl, R. 1992. The orientation and chromosome Xq28 in males but Ed. Williams & Wilkins, Baltimore.
HMG domain of lymphoid enhancer factor 1 bends not in females. Nat. Genet. 11: 248-256.
Langman, J. and Wilson, D. B. 1982. Embryo-
DNA and facilitates the assembly of functional
Hunter, C. P. and Wood, W. B. 1990. The tra-1 logy and congenital malformations of the fe-
nucleoprotein structures. Cell 69:185-195.
gene determines sexual phenotype cell-autono- male genital tract. In A. Blaustein (ed.),
Geissler, W. M. and nine others. 1994. Male mously in C. elegans. Cell 63: 1193-1204. Pathology of the Female Genital Tract, 2nd Ed.
pseudohermaphroditism caused by muta-tions of Springer-Verlag, New York, pp. 1-20.
Imperato-McGinley, J., Guerrero, L., Gau-tier, T.
testicular 17b-hydroxysteroid de-hydrogenase 3.
and Peterson, R. E. 1974. Steroid 5a-reductase Leutert, T. R. 1974. Zur Geschlechtsbestim-mung
Nat. Genet. 7: 34-39.
deficiency in man: An inherited form of male und Gametogenese von Bonellia vividis Rolan-
Goralski, T. J., Edström, J.-E. and Baker, B. S. pseudohermaphroditism. Science 186: 1213- 1215. do. J. Embryol. Exp. Morphol. 32: 169-193.
1988. The sex determination locus transformer-2
Jacklin, D. 1981. Methodological issues in the study LeVay, S. 1991. A difference in hypothalamic
of Drosophila encodes a polypeptide with similarity
of sex-related differences. Dev. Rev. 1: 266-273. structure between heterosexual and homosexual
to RNA binding proteins. Cell 56: 1011-1018.
men. Science 253: 1034-1037.
Jeyasuria, P., Roosenburg, W. M. and Place, A. R.
Gubbay, J. and eight others. 1990. A gene
1994. Role of P-450 aromatase in sex determi- Luo, X., Ikeda, Y. and Parker, K. L. 1994. A
mapping to the sex-determining region of the
nation of the diamondback terrapin, Malademys cell-specific nuclear receptor is essential for
mouse Y chromosome is a member of a novel
terrapin. J. Exper. Zool. 270: 95-111. adrenal and gonadal development and sexual di-
family of embryonically expressed genes. Nature
fferentiation. Cell 77: 481-490.
346: 245-250. Josso, N., Picard, J.-Y and Tran, D. 1977. The
anti-Müllerian hormone. Recent Prog. Horm. Mansour, S., Hall, C. M., Pembrey, M. E. and Young,
Gutzke, W. H. N. and Chymiy, D. B. 1988.
Res. 33:117-167. I. D. 1995. A clinical and genetic study of campo-
Sensitive periods during embryology for
melic dysplasia. J. Med. Genet. 32: 415-420.
hormonally induced sex determination in turtles. Jost, A. 1953. Problems of fetal endocrinology:
Gen. Comp. Endocrinol. 71: 265-267. The gonadal and hypophyseal hormones. Recent Marshall, E. 1995. NIH’s “gay gene” study
Prog. Harm. Res. 8: 379-418. questioned. Science 268: 1841.
Hacker, A., Capel, B., Goodfellow, P. and Lovell-
Badge, R. 1995. Expression of Sry, the mouse sex Jursnich, V. A. and Burtis, K. C. 1993. A positive Marx, J. 1995. Mammalian sex determination:
determining gene. Development 121: 1603-1614. role in differentiation for the male doublesex Snaring the genes that divide sexes for mammals.
protein of Drosophila. Dev. Biol. 155: 235-249. Science 269: 1824-1825.
Hamer, D. H., Hu, S., Magnuson, V. L., Hu, N.
and Pattatucci, A. M. L. 1993. A linkage between Kandel, E. R. and Schwartz, J. H. 1985. Principles McClung, C. E. 1902. The accessory chromo-
DNA markers on the X chromosome and male of Neural Science. Elsevier, NY. somesex determinant? Biol. Bull. 3: 72-77.
sexual orientation. Science 261: 321-327.
Kandel, E. R., Schwartz, J. H. and Jessell, T. M. McEwen, B. S. 1981. Neural gonadal steroid
Haqq, C. M., King, C. Y, Donahoe, P. K. and 1995. Essentials of Neural Science and Behavior. actions. Science 211: 1303-1311.
Weiss, M. A. 1993. Sry recognizes conserved Appleton and Lange, Norwalk, CT.
McEwen, B. S., Leiberburg, I., Chaptal, C. and
DNA sites in sex-specific promoters. Proc. Natl.
Kent, J.,Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, Krey, L. C. 1977. Aromatization: Important for
Acad. Sci. USA 90: 1097-1101.
A. H. and Koopman, P. 1996. A male-specific sexual differentiation of the neonatal rat brain.
Haqq, C., King, C.-Y, Ukiyama, E., Falsafi, S., role for SOX9 in vertebrate sex determination. Horm. Behav. 9: 249-263.
Haqq, N., Donahoe, P. K. and Weiss, M. A. 1994. Development 122: 2813-2822.
McKeown, M., Belote, J. M. and Boggs, R. T.
Molecular basis of mammalian sexual determi-
Keyes, L. N., Cline, T. W. and Schedl, P. 1992. 1988. Ectopic expression of the female trans-
nation: Activation of Müller-ian inhibiting
The primary sex determination signal of Dro- former gene product leads to female differentia-
substance gene expression by SRY. Science 266:
sophila acts at the level of transcription. Cell tion of chromosomally male Drosophila. Cell
1494-1500.
68: 933-943. 53: 887-895.
Meyer, W. J., Migeon, B. R. and Migeon, C. J. mediating mat-ing behavior in the female guinea Shen, W-H., Moore, C. C. D., Ikeda, Y., Parker,
1975. Locus on human X chromosome for dihy- pig. En-docrinology 65: 369-382. K.L. and Ingraham, H. A. 1994. Nu-clear recep-
drotestosterone receptor and androgen insensiti- tor steroidogenic factor 1 regu-lates the Müllerian
Pieau, C., Girondot, N., Richard-Mercier, G,
vity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 1469-1472. inhibiting substance gene: a link to the sex de-
Desvages, M., Dorizzi, P and Zaborski, P. 1994.
termination cas-cade. Cell 77: 651-661.
Miller, L. M., Plenefisch, J. D., Casson, L. P. Temperature sensitivity of sexual dif-ferentia-
and Meyer, B. 1988. xol-1: A gene that controls tion of gonads in the European pond turtle. J. Siiteri, P. K. and Wilson, J. D. 1974. Testos-
the male mode of both sex determination and X Exper. Zool. 270: 86-93. terone formation and metabolism during male
chromosome dosage compensation in C. elegans. sexual differentiation in the human embryo. J.
Pontiggia, A., Rimini, R., Goodfellow, P. N.,
Cell 55: 167-183. Clin. Endocrinol. Metab. 38: 113-125.
Lovell-Badge, R. and Bianchi, M. E. 1994. Sex-
Moore, C. L. 1990. Comparative development reversing mutations affect the architec-ture of Sinclair, A. H. and nine others. 1990. A gene
of vertebrate sexual behavior: Levels, cascades, Sry/DNA complexes. EMBO J. 13: 6115-6124. from the human sex-determining region encodes
and webs. In D. A. Dewsbury (ed.), Issues in a protein with homology to a con-served DNA-
Pröve, E. 1978. Courtship and testosterone in
Comparative Psychology. Sin-auer Associates, binding motif. Nature 346: 240-244.
male zebra finches. Z. Tierpsychol. 48: 47-67.
Sunderland, MA, pp. 278-299.
Stevens, N. M. 1905. Studies in spermato-genesis
Reddy, V. R., Naftolin, F. and Ryan, K. J. 1974.
Moore, C. L., Dou, H. and Juraska, J. M. 1992. with especial reference to the “ac-cessory chro-
Conversion of androstenedione to es-trone by
Maternal stimulation affects the number of mo- mosome.” Carnegie Inst. Wash-ington Rep. 36.
neural tissues from fetal and neonatal rats.
tor neurons in a sexually dimorphic nucleus of
Endocrinology 94: 117-121. Terasawa, E. and Sawyer, C. H. 1969. Changes
the lumbar spinal cord. Brain Res. 572: 52-56.
in electrical activity in rat hypo-thalamus related
Rhind, N. B., Miller, L. M., Kopczynski, J. B.
Morgan, T. H. 1919. The Physical Basis of to electrochemical stimu-lation of adenohypo-
and Meyer, B. J. 1995. xol-1 acts as an early
Heredity. Lippincott, Philadelphia. physeal function. En-docrinology 85: 143-149.
switch in the C. elegans male/her-maphrodite
Muscatelli, F. and fourteen others. 1994. Mutations decision. Cell 80: 71-82. Thigpen, A. E., Davis, D. L., Imperato-
in the DAX-1 gene give rise to both X-linked McGinley, J. and Russell, D. W 1992. The mole-
Risch, N., Squires-Wheeler, E. and Keats, B. J.
adrenal hypoplasia con-genita and hypogonado- cular basis of steroid 5a-reductase de-ficiency in
B. 1993. Male sexual orientation and ge-netic
tropic hypogo-nadism. Nature 372: 672-634. a large Dominican kindred. N. Engl. J. Med.
evidence. Science 262: 2063-2065.
327: 1216-1219.
Nabekura, J., Oomura, Y, Minami, T, Mizuno,
Robboy, S. J., Young, R. H. and Herbst, A. L. 1982.
Y. and Fukuda, A. 1986. Mechanism of the rapid Thorpe, W. H. 1958. The learning of song
Female genital tract changes re-lated to prenatal
effect of 17b-estradiol on medial amygdala patterns by birds with especial reference to the
diethylstilbesterol expo-sure. In A. Blaustein (ed.),
neurons. Science 233: 226-228. song of the chaffinch, Fringilla coelebs. Ibis
Pathology of the Female Genital Tract, 2nd Ed.
100: 535-570.
Nordeen, E. J., Nordeen, K. W., Sengelaub, D. R. Springer-Ver-lag, New York, pp. 99-118.
and Arnold, A. P. 1985. Androgens prevent Tian, M. and Maniatis, T. 1993. A splicing
Rubin, B. S. and Barfield, R. J. 1980. Prim-ing of
normally occurring cell death in a sexually enhancer complex controls alternative splicing
estrus responsiveness by implants of 17b-estradiol
dimorphic spinal nucleus. Science 229: 671-673. of doublesex pre-mRNA. Cell 74: 105-114.
in the ventromedial hypothal-amic nuclei of fe-
Nöthiger, R., Dübendorfer, A. and Epper, F. 1977. male rats. Endocrinology 106: 504-509. Tobin, C. and Joubert, Y. 1992. Testos-terone-
Gynandromorphs reveal two separate primordia induced development of the rat lev-ator ani
Ryner, L. C. and Bruce, B. S. 1991. Regula-tion
for male and female geni-talia in Drosophila muscle. Dev. Biol. 146: 131-138.
of doublesex pre-mRNA processing oc-curs by
melanogaster. Wilhelm Roux Arch. 181:367-373.
3'-splice site activation. Genes Dev. 5: 2071-2085. Tran, D., Meusy-Dessolle, N. and Josso, N. 1977.
Nottebohm, F. 1980. Testosterone triggers Anti-Müllerian hormone is a func-tional marker
Salz, H. K., Cline, T. W. and Schedl, P. 1987.
growth of brain vocal control nuclei in adult of foetal Sertoli cells. Nature 269: 411-412.
Functional changes associated with struc-tural
female canaries. Brain Res. 189: 429-436.
alterations induced by mobilization of a P Trelstad, R. L., Hayashi, A., Hayashi, K. and
Nottebohm, F. 1981. A brain for all seasons: element inserted into the Sex-lethal gene of Donahoe, P. K. 1982. The epithelial-mesen-
Cyclical anatomical changes in song con-trol nuclei Drosophila. Genetics 117: 221-231. chymal interface of the male rate Mtillerian
of the canary brain. Science 214: 1368-1370. duct: Loss of basement mem-brane integrity and
Salz, H. K., Maine, E. M., Keyes, L. N., Samuels,
ductal regression. Dev. Biol. 92: 27-40.
Nowinski, W. 1934. Die vermännlichende M. E., Cline, T. W. and Schedl, P. 1989. The
Wirkung fraktionierter Darmextrakte des Drosophila female-specific sex-de-termination Tuana, N. 1988. The weaker seed. Hypatia 3:
Weibchens auf die Larven der Bonellia viridis. gene, Sex-lethal, has stage-, tis-sue-, and sex- 35-59.
Pubbl. Staz. Zool. Napoli 14: 110-145. specific RNAs suggesting multiple modes of re-
Vainio, S. and McMahon, A. 1996. Wnt-4a as a
gulation. Genes Dev. 3: 708-719.
Perry, M. D., Li, W., Trent, C., Robertson, B., signal regulating sex organogenesis. WNT
Fire, A., Hageman, J. M. and Wood, W. B. 1993. Sánchez, L. and Nöthiger, R. 1983. Sex de- Meeting Abstracts, Stanford, CA.
Molecular characterization of the her-1 gene termination and dosage compensation in Dro-
Valcárcel, J., Singh, R., Zamore, P. and Greene,
suggests a direct role in cell signal-ing during sophila melanogaster: Production of male clones
M. R. 1993. The protein Sex-lethal antagonizes
Caenorhabditis elegans sex deter-mination. in XX females. EMBO J. 1: 485-491.
the splicing factor U2AF to regulate alternati-
Genes Dev. 7: 216-228.
Schiebinger, L. 1989. The Mind Has No Sex? ve splicing of transformer pre-mRNA. Nature
Pfaff, D. W. and McEwen, B. S. 1983. The Harvard University Press, Cambridge, MA. 362: 171-175.
actions of estrogens and progestins on nerve
Schüpbach, T, Wieschaus, E. and Nöthiger, R. Van Doren, Ellis, H. M. and Posakony, J. W.
cells. Science 219: 808-814.
1978. The embryonic organization of the 1991. The Drosophila extramacrochaetae
Phoenix, C. H., Goy, R. W., Gerall, A. A. and Young, genital disc studied in genetic mosaics of Dro- protein antagonizes sequence-specific DNA
W. C. 1959. Organizing action of prenatally sophila melanogaster. Wilhelm Roux Arch. 185: binding by daughterless/achaete-scute protein
administered testosterone proprionate on the tissues 249-270. complexes. Development 113: 245-255.
Wagner, T. and thirteen others. 1994. Auto- Wilson, E. B. 1905. The chromosomes in re- Younger-Shepherd, S., Vaessin, H., Bier, E., Jan,
somal sex reversal and campomelic dyspla-sia lation to the determination of sex in insects. L. Y. and Jan, Y. N. 1992. deadpan, an es-sential
are caused by mutations in and around the SRY- Science 22: 500-502. pan-neural gene encoding an HLH protein, acts
related gene SOX9. Cell 79: 1111-1120. as a denominator in Drosophila sex determina-
Witelson, S. F., Glezer, I. I. and Kigar, D. L.
tion. Cell 70: 911-922.
Washburn. L. L. and Eicher, E. M. 1989. Nor- 1995. Women have greater density of neu-rons
mal testis determination in the mouse depends in posterior temporal cortex. J. Neu-rosci. 15: Zanaria, E. and thirteen others. 1994. An unusual
on genetic interaction of a locus on chromoso- 3418-3428. member of the nuclear hormone receptor
me 17 and the Y chromosome. Genetics 123: superfamily responsible for X-linked adrenal
Wright, E. and eight others. 1995. The Sry-
173-179. hypoplasia congenita. Na-ture 372: 635-641.
related gene Sox9 is expressed during chondro-
Werner, M. H., Huth, J. R., Groneborn, A. M. genesis in mouse embryos. Nat. Genet. 9: 15-20. Zarkower, D. and Hodgkin, J. 1992. Molec-ular
and Clore, G. M. 1995. Molecular basis of human analysis of the C. elegans sex-determin-ing gene
Yamamoto, T.-O. 1969. Sex differentiation. In
46X,Y sex reversal revealed from the three- tra-1: A gene encoding two zinc finger proteins.
W. S. Hoar and D. J. Randall (eds.), Fish
dimensional solution structure of the human SRY- Cell 70: 237-249.
Physiology, Vol. 3. Academic Press, New York,
DNA complex. Cell 81: 705-714.
pp. 117-175.
Regulação ambiental do
desenvolvimento animal 21
Podemos agora passar a considerar adapta-
ções para o ambiente externo; e inicialmente
as adaptações diretas.... nas quais um ani-
mal, durante seu desenvolvimento, é modi-
ficado por fatores externos de tal maneira
N A PRIMEIRA METADE do século 19, “biologia” era o estudo do “organis-
mo em relação às suas condições de existência”, e a investigação do orga-
nismo vivo era geralmente realizada em seu habitat original. Somente ao
redor de 1850, é que a “fisiologia” emergiu como uma tentativa de quantificar o fenô-
meno biológico no laboratório. A embriologia permaneceu dentro do reino da biologia,
que há um aumento da eficiência com que enquanto a fisiologia investigava as estruturas e funções dos organismos adultos
esses fatores são tratados. independentemente dos seus ambientes originais (Nyhart, 1995).
C. H. WADDINGTON (1957)
Dentro desse contexto biológico, a embriologia foi vista como o motor da mu-
dança evolucionária, e o desenvolvimento como sendo condicionado pelo ambiente.
Por exemplo, Augusto Weismann (1875) verificou que borboletas da mesma espécie
eclodindo em estações diferentes podiam apresentar cores diferentes, e ele podia
transformar a forma do verão na forma da primavera, resfriando as pupas. Carl Siebold
mostrou que alguns afídios partenogenéticos podiam dar origem a machos e fêmeas
sexuadas tardiamente na época de reprodução para produzir um ovo que hibernava (e
que invariavelmente eclodia como uma fêmea partenogenética), e vários pesquisado-
res estudaram a determinação sexual pelo ambiente na Bonellia e em colméias de
insetos (veja Hertwig, 1894). A primeira geração de embriologistas experimentais
estudou os efeitos do ambiente sobre o desenvolvimento, incluindo o efeito de falta
de íons ou de nutrientes na determinação do sexo e na morfogênese (Selenka 1876;
Born, 1881; Herbst, 1893). (Os estudos de Born mostrando que o sexo de embriões de
rãs podia ser alterado por fatores ambientais foi mostrado com proeminência no filme
Jurassic Park.)
Mas a maré estava mudando. Nas décadas de 1870 e de 1880, jovens zoologistas
se afastavam dessas “questões biológicas” em direção às questões de fisiologia
interna e anatomia. Embriologistas mais velhos, como Carl Siebold e Ernst Haecke,
que desenvolveram seus trabalhos em um contexto evolucionário ou ambiental, se
desesperavam porque a “próxima geração de ‘zoologistas científicos’ somente co-
nheceria cortes seccionais e tecidos corados, mas nem o animal inteiro e nem seu
modo de vida” (Haeckel, 1881). Eles estavam atônitos pela falta de interesse dos
805
jovens pesquisadores em estudar o embrião vivo no seu habitat natural.* Siebold

justificou esses excessos observando que a pressão para publicar exercida sobre os
jovens cientistas os forçava a realizar pesquisa que podia ser feita em poucos me-
ses, em lugar das que ele realizava e que levavam anos para serem completadas
(Nyhart, 1995). Quando Wilhelm Roux tentou unir a embriologia experimental
com a fisiologia, ele postulou que o desenvolvimento era causado por fatores inter-
nos, especialmente aqueles dentro do núcleo. A embriologia experimental se afas-
tou das explicações ambientais e se concentrou naquelas forças dentro do ovo fer-
tilizado que permitem o desenvolvimento do embrião. Essa tem sido a direção ge-
ral da biologia do desenvolvimento.
Agora, com o novo interesse na relação entre desenvolvimento e evolução, com a
surpreendente perda de diversidade nos organismos e os efeitos dos poluentes
ambientais, existe uma renovada preocupação com a regulação do desenvolvimento
pelo ambiente (veja Weele, 1995). Algumas pessoas estão convencidas de que o
“DNA fornece o programa que controla o desenvolvimento do embrião” (Wolpert,
1991) ou que tudo que é necessário para formar o embrião está dentro do ovo fertiliza-
do. Entretanto, existem numerosos exemplos (e o Homo sapiens fornece os melhores)
onde o ambiente tem um papel crítico na determinação do fenótipo do organismo. Nós
já discutimos a regulação ambiental do desenvolvimento quando estudamos a deter-
minação do sexo em Bonellia, Crepidula e muitos répteis (veja Capítulo 20). Natural-
mente, a habilidade genética para responder a tais fatores ambientais deve ser herda-
da, mas nesses casos é o ambiente que pode dar os diferentes fenótipos a partir do
mesmo genótipo nuclear.
Q REGULAÇÃO AMBIENTAL DO
DESENVOLVIMENTO NORMAL
Sugestões ambientais usadas pelos organismos

para completar seus desenvolvimentos
Certas sugestões ambientais, tais como um campo gravitacional de 1G ou um oceano
salino a 0.85%, podem ser utilizados durante o desenvolvimento. Portanto, não é
surpreendente que muitos ovos usam a gravidade como a força que assegura a pola-
ridade de seus oócitos, e a perturbação da gravidade pode desregular o desenvolvi-
mento em rãs e aves (Pflüger, 1883; Born, 1884). Analogamente, vimos no Capítulo
4 que oócitos de ouriço-do-mar (e sem dúvida os oócitos de muitas outras espécies)
usam íons de sódio da água do mar para substituir os íons de hidrogênio e ajudar a
ativar o ovo (Jaffe, 1980). Embriões de mamíferos estão intimamente ligados ao seu
alimento, oxigênio e fontes iônicas durante seu inteiro desenvolvimento pré-natal.
Nesses casos, as sugestões para o desenvolvimento normal não estão no oócito, mas
assume-se que estão presentes no ambiente onde o ovo se desenvolve.
A colonização larval
A inclusão de sugestões ambientais no desenvolvimento normal ocorrem durante a

colonização de larvas marinhas. Aqui, as sugestões podem não ser universais, mas
devem ser parte do ambiente se o desenvolvimento deve prosseguir. Uma larva
planctônica freqüentemente necessita se estabelecer próximo a uma fonte de alimen-
to ou a um substrato firme no qual sofre a metamorfose. Se a presa ou as âncoras
fornecem moléculas solúveis, essas moléculas podem ser usadas pelas larvas como
* Essas preocupações e a retórica que as expressa são extraordinariamente similares àquelas dos
embriologistas mais velhos de hoje que se desesperam porque os pesquisadores mais jovens são somente
clonadores de genes sem conhecimentos sobre a estrutura total dos embriões (veja Nyhart, 1995).
CAPÍTULO 21 Regulação Ambiental do Desenvolvimento Animal 807
Tabela 21.1 Substratos específicos para a colonização de larvas de moluscos
Espécies de moluscos Substrato
GASTROPODA (caracóis, nudibrânquios)

Nassarius obsoletus Lama do habitat do adulto
Philippia radiata Porites lobata (um cnidário)
Adalaria proxima Electra pilosa (um briozoário)
Doridella obscura Electra crustulenta (um briozoário)
Phestila sibogae Porites compressa (um cnidário)
Rostanga pulchra Ophlitaspongia pennata (uma esponja)
Trinchesia aurantia Tubularia indivisa (um cnidário)
Elysia chlorotica Filme primário de microorganismos do habitat do adulto
Haminoea solitaria Filme primário de microorganismos do habitat do adulto
Aplysia californica Laurencia pacifica (uma alga vermelha)
Aplysia juliana Ulva spp. (algas verdes).
Aplysia parvula Chondrococcus hornemanni (uma alga vermelha)
Stylocheilus longicauda Lyngbya majuscula (uma cianobactéria)
Onchidoris bilamellata Crustáceos vivos
AMPHINEURA (CHITONS)
Tonicella lineata Lithophyllum sp. e Lithothamnion sp. (algas vermelhas)
LAMELLIBRANCHIA (Bivalvos)
Teredo sp. Madeira
Bankia gouldi Madeira
Mercenaria mercenaria Líquidos de moluscos; areia
Placopecten magellanicus Concha adulta; areia; etc.
Mytilus edulis Algas filamentosas; outro material não biológico de seda
Crassostrea virginica Líquido da concha; extrato do corpo; “glicogênio de crustáceo”
sugestões para iniciar sua colonização. Nos moluscos, freqüentemente existem su-
gestões muito específicas para a colonização (Tabela 21.1). A maioria das larvas dos
nudibrânquios (lesma do mar) sofrem metamorfose somente se induzida por uma
presa adulta viva (que é diferente de espécie a espécie). Em alguns casos, foi identi-
ficado o produto solúvel da presa que dispara a metamorfose (Hadfield, 1977). A
larva do teredo (shipworm) Teredo navalis é induzida a se estabelecer por compostos
liberados pela madeira, e material solúvel eluído de conchas de ostras induzem a
colonização das larvas de ostras.*
O haliote vermelho (abalone) Haliotis rufescens tem larvas que somente coloni-
zam quando entram em contacto físico com algas vermelhas coralinas. Somente um
contacto breve é necessário para que a larva competente pare de nadar e comece a
metamorfose. Ainda não foi isolado o agente químico responsável por essa modifica-
ção, mas o reconhecimento de um peptídeo de algas induz a metamorfose em larvas
competentes. As larvas que não são competentes para a indução da metamorfose
parecem não ter esse receptor. Considera-se que esse receptor esteja ligado a uma
* Em 1880, William Keith Brooks, um embriologista na Universidade de Johns Hopkins (e supervisor

da tese de T. H. Morgan, E. B. Wilson, R.G. Harrison e E. G. Conklin), foi solicitado a ajudar a
problemática indústria de ostras de Chesapeake Bay. Durante décadas, as ostras foram dragadas da baía,
e sempre havia uma nova colheita em seu lugar. Mas, recentemente, a produção estava caindo ano a ano.
O que seria responsável por esse declínio? Realizando experimentos com larvas de ostras, Brooks
descobriu que a ostra Americana (diferentemente de sua prima Européia- melhor conhecida) necessitava
de um substrato rígido no qual sofriam metamorfose. Durante anos, os pescadores de ostras jogavam as
conchas de volta para o mar, mas com o advento das calçadas suburbanas, os pescadores estavam
vendendo as conchas para as fábricas de cimento. A solução de Brooks: jogar as conchas de volta na baía.
A população de ostras respondeu: o cais de Baltimore até hoje vende seus descendentes.
proteína G semelhante àquelas encontradas em vertebrados, e a ativação dessa prote-

ína G pode ser necessária para a indução da colonização larval e a metamorfose
(Morse et al., 1984; Baxter e Morse, 1992; Degnan e Morse, 1995).
O alimento não é a única sugestão usada na colonização larval. A larva da mosca
preta, por exemplo, se adere a superfícies duras nos rios e se alimenta passivamente
das partículas suspensas no fluxo. Essas larvas procuram ativamente áreas com cor-
rentes de alta velocidade. Nessa zona de alta velocidade as larvas são relativamente
imunes aos ataques dos platelmintos. Em experimentos de laboratório (Hansen et al.,
1991), platelmintos não podiam capturar larvas da mosca preta em fluxos mais rápidos
que 35 cm/segundo. A razão disso é que os platelmintos ingerem sua presa elevando
a cabeça para fora da superfície. Isso expõe sua superfície frontal ao fluxo e reduz a
área da superfície de aderência ao substrato. Portanto, em correnteza de alta veloci-
dade, os platelmintos correm o risco de serem levados rio abaixo se eles tentam se
alimentar. Dessa maneira, as moscas pretas sobrevivem, sofrem metamorfose e difi-
cultam a vida dos próximos acampados.
Refeições de sangue
Em muitos mosquitos, a produção de ovos é induzida por uma refeição sangüínea.

(Na Drosophila a sugestão ambiental para a produção de ovos parece ser o
fotoperíodo.) Nos mosquitos, só a fêmea pica e ela não produz vitelogenina antes
dessa refeição. No Aedes aegypti, os produtos digeridos do alimento sangüíneo
estimulam o cérebro a secretar o hormônio neurosecretor para o desenvolvimento
do ovo (EDNH, também conhecido como hormônio ecdisteroidogênico ovariano,
OEH). Esse estimula o ovário a produzir ecdisteróides, os quais instruem as célu-
las do corpo gorduroso a produzir vitelogenina para os oócitos (Fallon et al., 1974;
Hagedorn, 1983; Borovsk et al., 1990). A vitelogenina é crítica para a produção de
ovos. Portanto, sem uma refeição sangüínea, não há vitelogenina e nem ovos
(Figura 21.1).
No inseto sugador de sangue, Rhodinus prolixus, as fêmeas adultas produzem
uma nova carga de ovos toda vez que sugam sangue. Esse alimento sangüíneo serve
a dois propósitos. As proteínas do sangue fornecem os aminoácidos necessários para
a síntese de vitelogenina, e o estiramento físico do abdômen pelo sangue inicia o
estímulo endócrino que ativa a secreção do hormônio juvenil pela corpora allata. O
hormônio juvenil estimula a síntese de vitelogenina no ovário e no corpo gorduroso
(veja Nijhout, 1994). Além disso, o estiramento causado por uma única refeição
sangüínea induz a muda larval. Se esse inseto se alimentar com várias pequenas
refeições, ele sobreviverá, mas não sofrerá muda e nem crescerá. Nessa situação,
mamíferos são usados em parte do desenvolvimento de insetos.
Simbiose no desenvolvimento
Em alguns dos exemplos acima, o desenvolvimento de um indivíduo é possível

pela presença de outro indivíduo de uma espécie diferente. Em alguns organismos,
essa relação se tornou simbiótica (Sapp, 1994). Aqui, os simbiontes estão forte-
mente integrados ao organismo hospedeiro, e esse não pode se desenvolver sem
eles. A lula adulta Euprymna scolopes está equipada com um órgão de luz compos-
to de sacos contendo a bactéria luminosa Vibrio fischeri. A lula juvenil não tem
esses simbiontes emitentes de luz e nem as estruturas para abrigá-los. Na verdade,
a lula adquire a bactéria através da água do mar bombeada através da cavidade de
sua cobertura. As bactérias se ligam a um epitélio ciliado que se estende nessa
cavidade. As bactérias induzem a morte dessas células, sua substituição por um
epitélio não ciliado e a diferenciação das células epiteliais vizinhas para se tornar
receptáculos de armazenagem das bactérias (Figura 21.2; McFall-Ngai e Ruby,
1991; Montgomery e McFall-Ngai, 1995).
Emergência Refeição de sangue Figura 21.1

Diagrama de fluxo mostrando as interações
que permitem a produção de ovos no mosqui-
Cérebro to Aedes aegypti. (De acordo com Hagedorn,
Cérebro
1983; Nijhout, 1994.)
Corpora allata
EDNH
Acasalamento e
JH comportamento alimentar
Ovário Competência Ovário no

imaturo crescimento estágio de repouso
Corpo
gorduroso Vitelogenina Ovário vitelogênico Ovos e ovário
pós-vitelogênico
Competência Corpo gorduroso Ecdisteróides

competente
A simbiose entre massas de ovos e algas fotossintéticas é crítica para o desenvol-

vimento de certas espécies. O suprimento de oxigênio limita a taxa de desenvolvimen-
to quando os ovos estão agrupados em massas compactas, e o desenvolvimento dos
embriões na parte interna do aglomerado é retardado em comparação com aqueles
mais próximos da superfície (Strathmann e Strathmann, 1995). Apesar do forte gradien-
te de oxigênio partindo de fora do aglomerado para seu interior, os embriões parecem
ter resolvido o problema envolvendo-se com uma fina camada de algas fotossintéticas.
Em ninhadas de ovos de anfíbios e caracóis, fotossíntese “infratora“ das algas permi-
te produção líquida de oxigênio na luz, enquanto a respiração excede a fotossíntese no
escuro (Bachmann et al., 1986; Pinder e Friet, 1994; Cohen e Strathmann, 1996). Portan-
to, as algas salvam os ovos pela fotossíntese.
Uma ligação ainda mais intensa entre morfogênese e simbiose é verificada na
cigarrinha Euscelis incisus. Aqui, a simbiose ocorre dentro do ovo. Existem bactérias
simbióticas nessas espécies que estão dentro do citoplasma do ovo e que são
transferidas através de gerações, exatamente como as mitocôndrias. Essas bactérias
se tornaram tão especializadas que só podem se multiplicar dentro do citoplasma do
organismo, e o embrião do hospedeiro se tornou tão dependente da bactéria que lhe é
Figura 21.2
Micrografia eletrônica de varredura do primórdio do órgão
de luz de uma lula juvenil E. scolopes de 3 dias. (A) Órgão
de luz em um juvenil não infectado. (B) Órgão de luz de um
juvenil infectado com a bactéria simbiótica V. fischeri. Re-
gressão do epitélio é óbvia em (B). (De acordo com
Montgomery e McFall-Ngai, 1995; fotografias cortesia de
(A) (B) M. McFall-Ngai.)
Figura 21.3
Simbiontes microbianos são necessários para Tórax
a formação do intestino da cigarrinha Euscelis Cabeça Abdômen
incisus. (A) Embrião controle com simbion-
tes tem formação normal do intestino. (B)
Embrião anormal com formação deficiente
do intestino quando antibióticos eliminaram
a maioria das bactérias do ovo. (De acordo
com Schwemmler, 1974; fotografias corte-
sia de W. Schwemmler.)
0.1 mm
(A)
Cabeça Tórax Abdômen
0.1 mm
(B)
impossível completar a embriogênese sem ela. De fato, considera-se que os simbiontes

bacterianos são essenciais para a formação do intestino embrionário. Se as bactérias
são removidas cirurgicamente ou metabolicamente (alimentando as larvas ou os adul-
tos com antibióticos), elas podem ser eliminadas dos ovos em desenvolvimento. Es-
ses oócitos livres de simbiontes se desenvolvem em embriões que não têm o abdômen
(Figura 21.3; Sander, 1968; Schwemmler, 1974, 1989). O endossimbionte pode estar
secretando um fator que penetra no citoplasma do ovo.
Existe até uma simbiose desenvolvimental no intestino de mamíferos. As bacté-
rias colonizam o intestino desde o momento do nascimento, e a sucessão ecológica
no intestino humano progride através de uma série de colonizações envolvendo
cerca de 400 espécies bacterianas. As células epiteliais do intestino de camundon-
gos mantidos livres de germens, não sintetizam certos mRNAs que codificam deter-
minadas enzimas de glicosilação (Bry et al., 1996). Entretanto, se uma determinada
cepa de bactérias começa a colonizar seus intestinos, esses micróbios induzem o
mRNA a se tornar expresso. [env1.html]
Diferenças ambientais previsíveis

como sugestões para o desenvolvimento
Sazonalidade e sexo: Afídios e V
sex olvox
olvox
Volvo
Como já mencionado, várias espécies de afídios partenogenéticos têm um fascinan-

te estilo de vida onde os ovos eclodidos dão origem à várias gerações de fêmeas
reproduzindo-se assexualmente. Entretanto, durante o outono é produzido um de-
terminado tipo de fêmea, cujos ovos podem dar origem a machos e fêmeas sexuadas.
Essas formas sexuadas se acasalam, e o ovo que se forma está apto a sobreviver o
inverno. Quando esse eclode, uma nova geração de fêmeas assexuadas é produzida.
Um dos grandes mistérios desse tipo de partenogênese foi resolvido em 1909 por
Número de
cromossomos Oogênese completa
Ovo com 12 Ovo haplóide

Fêmea
cromossomos
sexuada
Ovo Ovo Espermatogênese Cruzamento

“Mãe precursora” Femêa
hibernal partenogênico completa Fertilização
assexuada capaz de
produzir
geração Ovo com 10 Macho
sexuada cromossomos sexuado Degeneração
Figura 21.4
Mudanças cromossômicas durante o ciclo vital do afídio da família Phylloxeridal. O clima
do outono induz a produção de machos e fêmeas, que se cruzam para produzir o ovo
hibernal.
Thomas Hunt Morgan (antes dele começar a trabalhar com a mosca da fruta). Morgan
analisou os cromossomos do afídio da nogueira (hickory) durante várias gerações
(Figura 21.4). Ele encontrou que o número diplóide das fêmeas de afídios é 12.
Durante a oogênese, somente um corpo polar é expelido do óvulo em desenvolvi-
mento, de modo que o número diplóide de 12 é retido. Esse ovo desenvolve-se
partenogeneticamente sem ser fertilizado. Nas fêmeas que podem dar origem a ovos
que se tornam macho ou fêmea, ocorre uma modificação dessa oogênese. Nos ovos
produtores de fêmeas, seis pares de cromossomos penetram no único corpo polar.
Portanto, o número diplóide de 12 é retido. Nos ovos produtores de machos, entre-
tanto, um par extra de cromossomos entra no corpo polar. O número diplóide do
macho é 10. Esses machos e fêmeas são sexuados e têm divisões meióticas comple-
tas. A fêmea produz oócitos com um conjunto haplóide de 6 cromossomos. Os
machos, entretanto, dividem os seus 10 cromossomos para produzir uma parte do
espermatozóide com o número haplóide de 4 cromossomos e a outra parte com o
número haplóide de 6 cromossomos. O espermatozóide com 4 cromossomos se
degenera. O espermatozóide com 6 cromossomos fertiliza o ovo com esses para
restaurar o número diplóide de cromossomos a 12. Quando o ovo eclode, após o
inverno, é uma fêmea.
Isso resolveu uma charada. A outra, de como o clima do outono regula se a
fêmea é sexuada ou partenogênica ou se o organismo é alado ou áptero permanece
sem solução. Da mesma maneira, não sabemos o que regula o oócito diplóide a
produzir ovos dando machos ou fêmeas. Além disso, fatores ambientais são usa-
dos de maneiras diferentes pelas várias espécies. A Figura 21.5 mostra um tipo de
ciclo vital encontrado em afídios. Nos afídios da nogueira e na Megoura viciae,
existe uma alternância de gerações sexuadas e assexuadas. Em Megoura, a tempe-
ratura determina o sexo precocemente no desenvolvimento (temperaturas extre-
mas favorecendo a produção de fêmeas). No desenvolvimento da fêmea, o
fotoperíodo e a temperatura determinam se a fêmea se reproduzirá sexualmente ou
partenogeneticamente, e uma combinação de temperatura e densidade populacional
determinará se a fêmea é alada ou sem asas (Beck, 1980). É possível que o hormô-
nio juvenil controle a troca partenogenética/sexual (adição de hormônio juvenil a
adultos produzindo descendentes sexuados os leva a ter descendentes parteno-
genéticos) e inibe a formação de asas (Hardie, 1981; Hardie e Lees, 1985). Mas não
se sabe como as mudanças ambientais se transformam em títulos de hormônio
juvenil ou como o clima de outono ou a luz solar causam o movimento diferencial
dos cromossomos para o corpo polar.
Figura 21.5 (A)

Efeitos ambientais no ciclo vital do afídio
Megoura viciae. (A) Alternância de gerações Primavera Verão
sexuadas e assexuadas, onde a geração
sexuada é produzida no outono. (B) Alterna-
tivas de desenvolvimento fornecidas por fa-
tores ambientais no ciclo vital de Megoura.
(A de acordo com Nijhout, 1994; B de acor- Fêmea Fêmea
do com Beck, 1980.) assexuada alada assexuada
sem asas
Ovo hibernal Macho
Inverno Outono
Fêmea sexual
Fêmeas
(B) assexuadas
aladas
Aglomeração,
baixa temperatura
Dia longo, Isolamento,

alta temperatura alta temperatura Fêmeas
assexuadas
Temperatura Dia curto, sem asas
alta ou baixa temperatura média
Fêmea
sexuada
Temperatura
média
Macho
No Capítulo 1, discutimos o ciclo vital do volvox e sua dependência da temperatu-

ra. Aqui, também, a temperatura é responsável pela troca das formas assexuadas do
organismo pelas formas sexuadas. A fêmea reproduzindo-se assexualmente dá origem
a descendentes que produzem espermatozóides ou óvulos. O resultado dessa fertili-
zação é o zigoto cuja camada externa pode protegê-lo da dessecação e do frio ao secar
a lagoa e à chegada do inverno.
Diapausa
Muitas espécies de insetos desenvolveram uma estratégia chamada diapausa.

Diapausa é a suspensão do desenvolvimento que pode ocorrer no estágio embrio-
nário, larval, pupal ou adulto, dependendo das espécies. Em algumas espécies, a
diapausa é facultativa e ocorre somente quando induzida por condições ambientais;
em outras espécies, a diapausa se tornou uma parte obrigatória do ciclo vital. Essa
última é freqüentemente encontrada em insetos da zona temperada, onde a diapausa
é induzida por mudanças no fotoperíodo (a duração relativa dos dias e das noites).
O comprimento do dia onde 50% da população entrou em diapausa é chamado de
comprimento crítico do dia, e geralmente é bastante repentino (Figura 21.6). Insetos
entrando na diapausa quando o comprimento do dia cai abaixo desse limite são
chamados de insetos de dia longo. Os insetos que se desenvolvem normalmente
quando existem somente algumas horas de luz solar e que entram em diapausa
quando expostos a dias mais longos são chamados de insetos de dia curto. O com-
primento crítico do dia é uma propriedade geneticamente determinada (Danilevskii,
1965; Tauber et al., 1986).
A diapausa não é uma resposta fisiológica desencadeada por condições drásticas.
porcentagem de indivíduos entrando na diapausa

Laspeyresia
Sem dúvida, ela é induzida por estímulos sinalizadores que são um presságio de molesta
mudança no ambiente, antes que as condições adversas realmente se instalem. A
Pieris
diapausa é especialmente importante para os insetos da zona temperada, permitindo- brassicae
lhes sobreviver o inverno. Embriões do bicho-da-seda Bombyx mori passam o inver-
no como embriões, entrando na diapausa pouco antes da segmentação. A mariposa Acronycta
rumicis
cigana Lymantia dispar inicia sua diapausa como uma larva completamente formada,
pronta a eclodir assim que a diapausa termine. Outros insetos experimentam a diapausa Leptinotarsa
decemlineata
como ovos, pupas ou mesmo como adultos.
No bicho-da-seda Bombyx, a diapausa embrionária parece ser regulada pelo
hormônio da diapausa, um peptídeo de 24 aminoácidos que é produzido no gânglio
subesofagiano (Fukuda, 1952; Hasegawa, 1952). Esse hormônio age nos oócitos
em maturação no estágio pupal e leva à interrupção do desenvolvimento, uma vez
que o embrião alcance 12.000 células (Kitazawa et al., 1963). A diapausa larval,
entretanto, parece ser controlada pela inibição de produção do PTTH (veja Capí-
Comprimento do dia (horas)
tulo 19). Isso impede que a larva sofra uma muda e se transforme em pupa. Em
muitas borboletas, a inibição de PTTH é devida a um título elevado contínuo do Figura 21.6
hormônio juvenil. Analogamente, a falta de secreção de PTTH e ecdisona uma A resposta fotoperiódica de insetos de dia lon-
vez ocorrida a pupação, originará a diapausa nessa etapa do desenvolvimento. go, que são induzidos a entrar em diapausa
Pupas em diapausa podem ser reativadas pela adição de 20-hidroxiecdisona. quando as horas de luz natural caem abaixo de
certo nível. Cada uma das quatro espécies
Entretanto, em condições normais, o cérebro de uma pupa em diapausa (tal como
aqui mostradas, (Laspeyresia molesta, Pieris
a mariposa Hyalophora) é ativado pela exposição ao clima frio durante certo brassicae, Acronycta rumicis e Leptinotarsa
tempo. Pupas de mariposas conservadas em condições aquecidas permanecerão decemlineata) deixam a diapausa com luz
em diapausa até a morte (veja Nijhout, 1994). Os mecanismos pelo quais essas solar de 14-17 horas. (De acordo com
modificações na temperatura e no comprimento do dia regulam a produção Danilevskii, 1965.)
hormonal devem ainda ser elucidados. [env2.html]
Plasticidade fenotípica: Polifenismo e regras de reação

A habilidade de um indivíduo em expressar um fenótipo sob um conjunto de circuns-
tâncias e outro fenótipo sob outro conjunto de condições ambientais é chamada
plasticidade fenotípica. Existem dois tipos principais de plasticidade fenotípica:
polifenismo e regras de reação. Polifenismo se refere a fenótipos descontínuos (“um
ou outro”) elicitados pelo ambiente. Gafanhotos migratórios, por exemplo, existem
em duas formas mutuamente exclusivas: a fase solitária de asas curtas e coloração
uniforme e a fase gregária de asas longas e cores brilhantes. O ambiente (principal-
mente a densidade populacional) determina qual morfologia assumirá o jovem gafa-
nhoto (veja Pener, 1991). Analogamente, as ninfas de gafanhotos de plantas podem
se desenvolver de duas maneiras, dependendo do seu ambiente. Alta densidade
populacional e certas comunidades de plantas levam a produção de insetos migrató-
rios, onde o terceiro segmento torácico produz uma grande asa posterior. Densidade
populacional baixa e outras plantas alimentícias levam ao desenvolvimento de suga-
dores de plantas, não voadores, onde o terceiro segmento torácico se desenvolve em
uma asa vestigial semelhante a um haltere (Figura 21.7; Raatikainen, 1967; Denno et
al., 1985). A mudança sazonal da coloração do pêlo de animais árticos é um outro
exemplo de polifenismo.*
Em certos casos, o genoma codifica uma variedade potencial de fenótipos, e o
ambiente seleciona aquele fenótipo que usualmente é o mais adaptativo. Por exem-
plo, o trabalho intenso e constante pode fazer com que os músculos aumentem de
tamanho; mas existe um limite geneticamente definido que determina o quanto a
* Apesar do polifenismo sazonal ser geralmente considerado como adaptativo, existem certas
ocasiões que não há aumento da aptidão do organismo. Por exemplo, o fotoperíodo pode fazer com
que o pêlo da lebre mude de marrom para branco, mas se não houver neve, a lebre ficara conspícua
em um segundo plano escuro.
Figura 21.7 Forma estacionária Forma migratória

Diagrama composto mostrando as formas de asa curta (esquerda)
e de asa longa (direita) do gafanhoto de plantas Prokelisia marginata.
A forma de asa longa é um excelente voador; a forma de asa curta
não é voadora. (De acordo com Denno et al., 1985.)
hipertrofia é possível. Analogamente, o micro-habitat de uma salamandra jovem

pode causar sua mudança de cor (novamente, dentro de limites geneticamente
definidos). Essa variação contínua de fenótipos expressos por um único genótipo
através de uma série de condições ambientais é chamada de regra de reação
(Woltereck, 1909; Schmalhausen, 1949; Stearns et al., 1991). A regra de reação é,
portanto, uma propriedade do genoma e pode também ser selecionada. É de se
esperar que diferentes genótipos sejam diferentes na direção e quantidade de
plasticidade que serão capazes de expressar (Gotthard e Nylin, 1995; Via et al.,
1995). A extensão pela qual regras de reação podem ser herdadas fornece a base
para a evolução da plasticidade fenotípica.
Polifenismo sazonal em borboletas
Um exemplo dramático de polifenismo ocorre na mariposa Nemoria arizonaria. Essa

mariposa tem um ciclo vital bastante típico. Os ovos eclodem na primavera, e as
lagartas se alimentam das flores jovens do carvalho (amentos). Essas larvas sofrem
metamorfose no final da primavera, se acasalam no verão, e produzem outra prole de
lagartas nos carvalhos. Essas lagartas comem as folhas do carvalho, sofrem meta-
morfose e se acasalam. Seus ovos hibernam para novamente começar o ciclo na
próxima primavera. O que é surpreendente é que as lagartas que eclodem na prima-
vera em nada se parecem com seus descendentes que eclodem no verão (Prancha18).
As lagartas que eclodem na primavera e se alimentam de amentos são castanho-
amareladas, rugosas e pontilhadas parecendo um amento. Elas estão magnificamente
camufladas contra predadores. E as lagartas que eclodem no verão, quando os amentos
já não existem? Elas também estão bem camufladas parecendo ramos de carvalhos
de um ano de idade. Como isso é controlado? Fazendo experimentos de alimentação
recíproca, Greene (1989) conseguiu transformar as formas de primavera em formas
de verão, alimentando-as com folhas de carvalho. O experimento recíproco não trans-
formou as formas de verão em lagartas semelhantes aos amentos. Parece, portanto,
que a forma do amento é o estado normal (“default state”) e alguma coisa induz a
morfologia semelhante aos ramos do carvalho. Essa substância é provavelmente um
tanino que é concentrado nas folhas de carvalho durante sua maturação.
Outro exemplo de polifenismo sazonal é a borboleta do mapa Europeu, Araschnia
levana, que tem dois fenótipos tão diferentes que foram classificados por Linnaeus
como duas espécies diferentes (Weele, 1995). A forma da primavera é cor de laran-
ja brilhante com manchas pretas, enquanto a forma do verão é quase toda preta
com uma banda branca (Figura 21.8; Prancha 29). A mudança das formas da pri-
mavera para as do verão é controlada tanto por mudanças no comprimento do dia
como da temperatura durante o período larval. Esses fatores regulam a liberação de
ecdisona, que inicia as últimas mudas metamórficas (Shapiro, 1976; Koch e
Buchmann, 1987). Quando pupas em diapausa são injetadas com 20-hidroxiecdi-
sona de modo a recomeçar o desenvolvimento dentro de 3 dias após a pupação, a
forma que emerge é a do verão. Se a injeção for feita 10 dias após a pupação, são
produzidas as formas da primavera.
Figura 21.8
Polifenismo sazonal na borboleta Araschnia
laevana. (A) A forma do verão que emerge
da pupa em não diapausa. (B) A forma
alaranjada e marrom da primavera, que emer-
ge da pupa em diapausa. (Veja Prancha 29
para fotografias coloridas.) (Fotografias cor-
tesia de H. F. Nijhout.)
(A) (B)
Em quase toda a área do Hemisfério Norte, pode-se verificar o polifenismo nas

borboletas Colias e Pieris (repolhos brancos e sulfurosas) entre aquelas que eclodem
durante os longos dias do verão e aquelas que eclodem no fim da estação, nos dias
curtos do outono. O pigmento da asa posterior nas formas de dia curto é mais escuro
do que nas borboletas de dia longo. Isso tem uma vantagem funcional durante os
meses mais frios do outono; as borboletas mais escuras de dia curto usam seus pig-
mentos para se aquecer entre os vôos. Os pigmentos mais escuros absorvem a luz
mais eficientemente, aumentando a temperatura do corpo mais depressa do que os
pigmentos mais claros (Shapiro, 1968; 1978; Watt, 1968, 1969; Hoffmann, 1973;
veja Nijhout, 1991). [env3.html]
Nas zonas tropicais do mundo, freqüentemente existem estações secas e chuvo-
sas. Na África, a borboleta do Malawi Bicyclus anynana tem um polifenismo que é
adaptivo às mudanças sazonais. A forma da estação fria e seca é crítica, parecendo as
folhas mortas de cor castanha do seu habitat. A forma da estação quente e chuvosa é
mais ativa, e ela tem manchas em forma de olhos (ocelos) nas asas posteriores ven-
trais que desviam ataques de aves predadoras e lagartos (Figura 21.9). O fator deter-
minante parece ser a temperatura durante a pupação. Baixas temperaturas produzem
a forma da estação seca; altas temperaturas, a forma da estação chuvosa (Brakefield
e Reitsma, 1991). O desenvolvimento das manchas em forma de ocelos nas borbole-
tas começa nos estágios larvais tardios, quando a transcrição do gene Distal-less está
restrita a um pequeno foco que se tornará o centro de cada ocelo. Durante a fase
precoce do estágio pupal, a expressão de Distal-less é vista em uma área maior, e
considera-se que esse é o sinal ativador que determina o tamanho da mancha. Final-
mente, as células recebendo o sinal determinam a cor que elas terão. As formas sazo-
nais de Bicyclus parecem divergir nos estágios mais adiantados da ativação de sinais
e diferenciação de cor (Figura 21.10; Brakefield et al., 1996).
(A) (B)
Figura 21.9
As duas formas sazonais da borboleta de Malawi, Bicyclus anynana. (A) A forma da estação
seca que se mistura a restos de folhas mortas, secas e escuras. (B) Forma da estação chuvosa com
visíveis manchas em forma de ocelos das asas posteriores ventrais. A forma da estação chuvosa
pode ser mimetizada pelo cultivo da larva em temperaturas mais altas (23oC); larvas cultivadas em
temperaturas mais baixas (17oC, se aproximando das temperaturas na transição para a estação
seca) se desenvolvem na forma da estação seca. (De acordo com Brakefield et al., 1996; fotogra-
fias cortesia de S. Carroll e P. Brakefield.)
Figura 21.10 (A) (B) (C) (D)

Estágios do desenvolvimento levando à for- Divisão Expressão de
mação das manchas em forma de ocelos. (A) A da asa Distal-less
expressão do gene Distal-less nas regiões do
disco imaginal da asa onde há potencial para a T alta
formação das manchas em forma de ocelos.
(B) Focos de expressão de Distal-less são
estabilizados em regiões específicas da asa. (C)
Na pupa, os focos de Distal-less se expandem.
(D) As células vizinhas respondem ao sinal T baixa
produzindo pigmentos específicos, dependen-
do de suas distâncias do foco e de suas posi-
ções na asa. No Bicyclus, as duas formas são Prepadronização Determinação Sinalização Diferenciação
indistinguíveis até o estágio de sinalização (C). Focal
(De acordo com Brakefield et al., 1996.)
Polifenismo nutricional
Nem todo polifenismo é controlado pelas estações. Nas abelhas, o tamanho da larva
fêmea na muda pupal determina se o indivíduo será uma operária ou uma rainha. A
larva que é alimentada com “geléia real”, rica em nutrientes, retém a atividade da sua
corpora allata durante o estágio do último instar. O hormônio juvenil secretado por
esses órgãos atrasa a pupação, fazendo com que a abelha emergente seja maior e (em
algumas espécies) mais especializada em sua anatomia (Figura 21.11A; Brian, 1974,
1980; Plowright e Pendrel, 1977). Os níveis de hormônio juvenil em larvas destina-
das a se tornar rainha é 25 vezes maior que o título das destinadas a serem operárias,
e a aplicação desse hormônio em larvas operárias pode transformá-las em rainhas
(Wirtz, 1973; Rachinsky e Hartfelder, 1990).
Analogamente, colônias de formigas são predominantemente fêmeas, e essas
podem ser extremamente polimórficas (Figura 21.11A). Os dois tipos principais de
fêmeas são a operária e a gine. A gine é uma rainha em potencial. Em espécies mais
especializadas, também se observa uma operária maior, o soldado. Na Pheidole
bicarinata, essas castas são determinadas pelos níveis de hormônio juvenil nas lar-
vas em desenvolvimento. Larvas recebendo alimento rico em proteínas têm um título
elevado de hormônio juvenil que causa uma abrupta mudança no desenvolvimento
(A) (B) (C)

Nascimento Nascimento
Operários
secundários
Operários
Operárias principais
Gines Gines (soldados)
Figura 21.11
(A) Fotografia do notável dimorfismo da formiga operária (esquerda) e a rainha (direita) na
espécie Pheidologeton diversus. As duas são irmãs, mas uma foi alimentada de tal maneira
que sua larva continua a crescer e finalmente se metamorfoseia em uma “rainha” fértil. (B,C)
Formação da gine (rainha) e da operária nas formigas. Áreas levemente coloridas representam
bipotencialidade para se tornarem operárias ou gines. O N no círculo representa uma troca
nutricional controlada pelo ambiente da larva. (B) Myrmica rubra, onde somente as larvas que
hibernam (OW) permanecem bipotenciais. No último instar, a troca nutricional determina a casta.
(C) Pheidole pallidula, onde a rainha controla a determinação das gines, através dos hormônios
que agem durante a embriogênese. (Fotografia com copirraite, cortesia de Mark W. Moffett na
National Geographic Society; B e C de acordo com Wheeler, 1986.)
que “reprograma” o tamanho no qual as larvas iniciarão a metamorfose. Isso causa

uma grande e descontínua diferença de tamanho entre as castas de soldados e operá-
rias, com a cabeça e as mandíbulas crescendo mais rapidamente do que o resto do
corpo. Essa reprogramação também envolve mudanças na atividade gênica, pois as
proteínas cuticulares das operárias e dos soldados são diferentes (Passera, 1985;
Wheeler, 1991).
Em espécies diferentes, a determinação de casta pode ser ambiental, hormonal ou
a combinação de ambos. Os padrões do desenvolvimento na determinação de castas
foram analisados por Diana Wheeler (1986, 1991) e estão resumidos na Figura
21.11B,C. Na maioria das espécies, larvas de formigas são bipotenciais até perto da
pupação. Na Myrmica rubra, somente larvas que hibernam permanecem bipotenciais.
Após o inverno, a rainha estimula os operários a subalimentar as larvas do último
instar. Isso significa que enquanto houver uma rainha, não poderão resultar outras.
Se as larvas são alimentadas, elas podem se tornar gines. Portanto, as larvas perma-
necem bipotenciais até bem tarde no seu último instar. Em outras espécies como a
Pheidole pallidula, a rainha controla a formação de gines através de substâncias quí-
micas que agem durante a embriogênese, de modo a não se formarem novas rainhas.
Entretanto, as operárias permanecem bipotenciais e podem se tornar majoritárias ou
minoritárias, dependendo da nutrição.
Determinação sexual dependente do ambiente

sexual
Existem muitas espécies onde o ambiente determina se o indivíduo será macho ou

fêmea. A determinação sexual em peixes e répteis, dependente da temperatura, repre-
senta o caso melhor estudado. A Figura 21.12 demonstra os principais padrões de
determinação sexual dependente da temperatura em répteis. Esse tipo de determina-
ção sexual ambiental tem vantagens e desvantagens. Uma das vantagens é que dá às
espécies o benefício da reprodução sexual sem limitá-las a uma relação de sexos 1:1.
Nos crocodilos, onde extremos de temperatura produzem fêmeas e temperaturas
moderadas produzem machos, a relação de sexos pode ser de até 10 fêmeas para um
macho (Woodward e Murray, 1993). A maior desvantagem na determinação sexual
dependente da temperatura pode estar no estreitamento dos limites de temperatura
dentro dos quais uma espécie pode existir. Isso significaria que poluição térmica (ou
localmente ou por “aquecimento global”) pode realmente eliminar uma espécie em
uma determinada área (Janzen e Paukstis, 1991). Ferguson e Joanen (1982) especu-
laram que os dinossauros podem ter tido uma determinação sexual dependente da
temperatura e que seu súbito desaparecimento pode ter sido causado por uma peque-
na mudança da temperatura criando condições onde somente machos ou fêmeas
eclodiam de seus ovos.
Charnov e Bull (1977) argumentaram que a determinação sexual ambiental seria Figura 21.12
adaptativa em certos habitats caracterizados por retalhamento, havendo certas regi- Padrões da determinação sexual dependente da
ões onde é mais vantajoso ser macho e outras onde é mais vantajoso ser fêmea. temperatura. Nos primeiros três painéis, dife-
Conover e Heins (1987) forneceram evidência que em certos peixes, as fêmeas se rentes temperaturas dão a predominância de
machos ou fêmeas. No último painel, a tempera-
tura não tem efeito. De acordo com Bull, 1980.)
Tartarugas mordedoras Alguns lagartos,
Lagartos, crocodilos Muitas tartarugas (e outras), crocodilos cobras e tartarugas
Porcentagem de fêmeas
Temperatura (oC)
Figura 21.13
Relacionamento entre temperatura e razão sexual F:(F+M)
durante o período da determinação sexual em Menidia
menidia. Nos peixes coletados na porção mais norte da área
(Nova Scotia), a temperatura teve pouco efeito na determina-
ção sexual. Quando foram coletados embriões de peixes em
locais mais ao sul (especialmente da Virginia para a South
Carolina), o ambiente teve um grande efeito. (De acordo com
Razão sexual: F/(F+M)

Conover e Heins, 1987.)
Norte
Nova Scotia
Prince Edward Island
New York
Virginia
North Carolina
South Carolina
Sul
beneficiam por serem maiores, pois tamanho se traduz em maior fecundidade. É uma
vantagem nascer cedo na época da reprodução para uma fêmea Menidia, que teria um
período mais longo de alimentação e um tamanho maior. Nos machos, o tamanho não
tem importância. Conover e Heins mostraram que na parte sul da área da Menidia, as
fêmeas realmente nascem cedo na estação de reprodução. A temperatura parece ter um
papel importante. Entretanto, na parte norte de sua região, a mesma espécie não mos-
tra determinação sexual ambiental. Na verdade, uma relação 1:1 é gerada em todas as
temperaturas (Figura 21.13). Os autores especulam que as populações mais ao norte
têm uma estação de alimentação muito curta, de modo que não há vantagem para uma
fêmea nascer antes. Portanto, essa espécie de peixes tem uma determinação sexual
ambiental nas regiões onde é adaptiva e uma determinação sexual genotípica nas
regiões onde não é adaptiva. Aqui, novamente, observa-se que o ambiente pode
induzir um fenótipo sexual, ou o fenótipo sexual pode ser uma propriedade do genoma,
como é o caso na maioria dos mamíferos.
Fatores ambientais imprevisíveis

controlando o desenvolvimento animal
A maioria dos estudos de adaptação se preocupa com o papel assumido pelas estrutu-
ras adultas, permitindo que o indivíduo sobreviva em ambientes precários e hostis.
Entretanto, o embrião também deve sobreviver no seu habitat, e ele tem que fazê-lo
antes que essas adaptações adultas sejam feitas. Como já mencionado, a coloração
protetora da larva é um dos exemplos, e a habilidade da larva em ingerir alimentos
tóxicos para seus predadores é outro exemplo. Essas duas estratégias são
exemplificadas pelas lagartas das borboletas viceroy e monarca, respectivamente (veja
página 733). A temperatura não é o único fator ambiental que pode efetuar a determi-
nação sexual no peixe. O sexo do peixe limpador (“wrasse”) de cabeça azul, um
peixe Panamenho, depende da população que ele encontra. Se o embrião atinge um
recife onde um macho vive com muitas fêmeas, o peixe limpador cresce e se acasala
como fêmea. Quando o macho morre, uma das fêmeas (usualmente a maior) se torna
macho. Dentro de um dia, seus ovários regridem e seus testículos crescem. Se o

mesmo embrião tivesse chegado a um recife que não tivesse machos ou a um territó-
rio não defendido por um macho, o embrião se desenvolveria como um peixe limpa-
dor macho (Warner, 1993).
Defesas induzíveis contra a predação
Alguns embriões são protegidos das condições ambientais por materiais secretados
dentro do ovo ou ao seu redor. Em outros casos, o ambiente induz uma via específica
de desenvolvimento em lugar da via normal. Na lagarta Nemoria, a dieta altera o
fenótipo e protege o indivíduo da predação. Alguns animais levaram isso um passo a
frente: O desenvolvimento de um jovem é modificado por substâncias liberadas pelo
próprio predador, permitindo aos jovens escapar desses mesmos predadores. Isso é
algumas vezes chamado de defesa induzida pelo predador (ou polifenismo indu-
zido pelo predador).
Para demonstrar defesa induzida pelo predador, deve-se demonstrar que a mu-
dança fenotípica é causada pelo predador (geralmente por substâncias solúveis libe-
radas pelo predador) e que a modificação fenotípica aumenta a aptidão de seus porta-
dores quando o predador está presente (Adler e Harvell, 1990).* Por exemplo, várias
espécies de Daphnia e rotíferos alterarão sua morfologia quando desenvolvidos em
águas onde seus predadores foram cultivados (Figura 21.14; Dodson, 1989; Adler e
Harvell, 1990). O rotífero predatório Asplanchna libera na água um composto solú-
vel que induz os ovos de uma espécie de presa, Keratella slacki, a se desenvolver em
indivíduos com um corpo ligeiramente maior, mas com espinhas anteriores 130%
mais longas do que seria o normal. Essas modificações as torna mais difíceis de
serem devoradas. O caracol Thais lamellosa desenvolve uma concha mais grossa e
um “dente” na sua abertura quando exposto ao efluente das espécies de caranguejo
que são seus predadores. Em uma população mista, os caranguejos não atacam os
caracóis mais espessos até que mais de 50% dos normais tenham sido devorados
(Palmer, 1985). Figura 21.14
Polifenismo envolvendo predadores não se limita aos invertebrados. McCollum Polifenismo induzido por predadores. Formas
e Van Buskirk (1996) mostraram que na presença de seus predadores, a nadadeira da típicas (linha superior) e induzidas por preda-
cauda da rã de árvore Hyla chrysoscelis cresce mais e se torna vermelho brilhante. dores (linha inferior) em vários organismos.
Os números abaixo de cada coluna represen-
tam a porcentagem de organismos sobreviven-
*O fenômeno da ciclomorfose, no qual há uma variação cíclica da morfologia em certas espécies de
do à predação, quando indivíduos induzidos e
Daphnia (Woltereck, 1909), não foi correlacionado com um predador específico. O fenômeno pode ser
devido a outros fatores (Dodson, 1989).
não induzidos foram submetidos a predadores
(em vários ensaios). (Dados de Adler e Harvell,
1980 e referências neles citados.)
Forma
típica
Abertura Inflado e
grossa com dente com corcova
Forma
induzida
por
predador
Cladocera Rotífero Cirrípede Bryozoa Molusco (Thais) Carpa (Carassius)

(Daphnia) (Keratella) (Chthalamus) (Membranipora)
Sem predação até que
50% das formas típicas
Sobrevivência (típica/induzida) sejam devoradas
Isso permite que o girino se afaste nadando rapidamente e desvie golpes na região da
cauda. A carpa Carassius carassius reponde à presença do lúcio (pike) predatório
somente se esse já se alimentou com peixe. A carpa cresce adquirindo uma forma
entumecida e com uma corcova que não mais se ajusta às mandíbulas do lúcio. Como
na maioria das defesas induzidas pelo predador, existe uma contrapartida (ou então
seria de se esperar que a forma induzida se tornasse o fenótipo normal). Nesse caso, a
morfologia induzida produz um retardamento nas condições de natação, e o peixe mais
gordo não pode nadar tão eficientemente (Brönmark e Pettersson, 1994). A Figura
21.14 mostra as formas típicas e as induzidas pelo predador para várias espécies. Em
cada caso, filtrados solúveis da água envolvendo o predador são capazes de induzir
essas modificações. Como mostra a Figura 21.14, a forma induzida é mais susceptível
a sobreviver ao seu predador. [env4.html]
Plasticidade fenotípica e mudanças no ambiente
O sapo pé de espada (spadefoot toad), Scaphiopus couchii, tem um ciclo de vida

extraordinário. Os sapos terminam a hibernação com o barulho do trovão que acom-
panha as primeiras tempestades da primavera no deserto de Sonoran. (Infelizmente,
motocicletas produzem o mesmo som, fazendo com que esses sapos saiam da hiber-
nação e morram no escaldante sol do Arizona.) Os sapos se reproduzem nas lagoas
temporárias formadas pelas chuvas, e os embriões se desenvolvem rapidamente em
larvas. Após a metamorfose das larvas, os novos sapos retornam ao deserto, se afun-
dando na areia até que as tempestades do ano seguinte os tragam para fora.
As lagoas do deserto são poças efêmeras e tanto podem secar rapidamente como
persistir por algum tempo, dependendo da profundidade inicial e a freqüência das
chuvas. Poderia se considerar que existem somente dois cenários alternativos con-
frontando o embrião do sapo: ou (1) a lagoa persiste até que ele sofra a metamorfose
e ele vive, ou (2) a lagoa seca antes da metamorfose e ele morre. Esses sapos (e
numerosos outros anfíbios), entretanto, desenvolveram uma terceira alternativa. A
época da metamorfose é controlada pela lagoa. Se essa não seca, o desenvolvimento
continua em uma velocidade normal, e os girinos se alimentando de algas finalmente
se transformam em sapos pé de espada juvenis. Entretanto, se a lagoa está secando,
se cria uma superpopulação e alguns dos girinos embarcam em uma via alternativa
de desenvolvimento. Eles desenvolvem uma boca mais larga e necessitam de múscu-
los mais fortes nas mandíbulas que os permita comer, entre outras coisas, outros
girinos de Scaphiopus. Esses girinos carnívoros sofrem uma rápida metamorfose,
ainda que em uma versão menor do sapo pé de espada juvenil. Mas eles sobrevivem,
enquanto que os outros girinos Scaphiopus morrem ou por dessecação ou ingeridos
por seus companheiros de lagoa (Figura 21.15; Newman, 1989, 1992).
Grupo de músculo Grupo de músculo

hióideos da mandíbula hióideos da mandíbula
Figura 21.15
Polifenismo nos girinos do sapo pé de espada, Músculo Musculo
interhióideo interhióideo
Scaphiopus couchii. A forma típica é a onívo-
ra, usualmente se alimentando de insetos e al-
gas. Quando as lagoas estão secando é forma- Alças Alças
da a forma carnívora (canibalística). A boca é intestinais intestinais
mais larga, os músculos das mandíbulas são
maiores, e o intestino modificado para uma di- CARNÍVORO
eta carnívora. (Fotografia e desenho cortesia (outros girinos) ONÍVORO (camarão do mar,
de R. Ruibel.) Superfície ventral algas) Superfície ventral
Essa plasticidade fenotípica é vista também em larvas de equinodermos. Quando o

alimento está escasso, os membros ciliados da larva pluteus crescem mais longos e
aumenta a habilidade da larva em obter alimento. Mas isso é feito com um custo para
o rudimento do adulto que cresce dentro da larva, e leva mais tempo para essas plutei
de membros longos (mesmo que elas possam adquirir alimento) sofrerem metamorfose
(Hart e Strathmann, 1994).
A plasticidade fenotípica dá ao indivíduo a habilidade para responder às diferen-
tes condições ambientais. Diferentes fenótipos se adaptam melhor em diferentes
ambientes. No sapo pé de espada, a forma de rápido desenvolvimento é mais adequa-
da para lagoas que secam rapidamente, mas os sapos de desenvolvimento lento (os
quais se desenvolvem em sapos maiores, e mais robustos) são mais adequados para
condições com mais água. Existe um custo nessa plasticidade fenotípica, mas é asse-
gurado que sempre alguns animais sobreviverão em cada condição.
& Especulações
Assimilação Genética
a discussão sobre a relação custo/ Presumivelmente sua pele, como a de
N benefício entre formas induzidas

e não induzidas, foi mencionado
que se a forma induzida não tivesse um cus-
to significativo, seria de se esperar que essa
outros animais, reagiria diretamente à
pressão externa e à fricção tornando-se
mais espessa... Essa capacidade para
reagir deve ser dependente de genes...
se tornasse a forma predominante da espé- Não deve ser difícil que ocorra uma
cie. Isso foi previsto independentemente por mutação gênica que modificará alguma
C. H. Waddington e I. I. Schmalhausen para outra área no embrião, de tal maneira
explicar como algumas espécies podiam que ela passa a assumir a função da pres-
evoluir rapidamente em determinadas dire- são externa, interagindo com a pele, de
ções (veja Gilbert, 1994). Ambos estavam modo a ”puxar o gatilho” e desencade-
impressionados com os calos encontrados ar o desenvolvimento de calosidades.
nos pés de avestruzes. Na maioria dos ma-
míferos, a pele é capaz de formar calos nas Por essa transferência de indução, de um
áreas que se desgastam em contacto com o indutor externo para um interno, um cará-
solo ou outra superfície.* ter induzido pelo ambiente se tornou parte
Aqui, as células da pele respondem à do genoma do organismo e pode ser seleci-
fricção proliferando-se. Apesar dos exem- onado. Waddington chamou esse fenôme-
plos de calos induzidos pelo ambiente se- no de “assimilação genética” enquanto
rem muito difundidos, o avestruz nasce com Schmalhausen (1949) chamou-o de “sele-
calos onde tocará o solo (Figura 21.16). ção estabilizada”. Ambos os cientistas usa-
Waddington e Schmalhausen propuseram ram a embriologia e a genética ortodoxas
que as células da pele já são competentes para explicar exemplos que haviam sido
para serem induzidas pela fricção, elas po- considerados casos Lamarckianos de “he-
Figura 21.16
deriam ser induzidas por outras coisas tam- rança de características adquiridas”.
Lado ventral de um avestruz; a flecha marca os
bém. Com a evolução dos avestruzes, uma A transferência de estímulos ambientais
calos. (de Waddington, 1942.)
mutação permitiu que as células da pele res- para estímulos genéticos pode ser vista na
pondessem a uma substância dentro do determinação sexual em Menidia e na de- truturas larval e juvenil é paralela àquela
embrião. Waddington (1942) escreveu: terminação de casta em formigas. Analo- vista onde as reservas de alimento são esto-
gamente, a plasticidade de desenvolvimen- cadas no ovo. Portanto, as trocas já presen-
to preexistindo nas larvas alimentares nos tes como adaptações às fontes externas de
* E até este século, escritores eram reconheci-
equinodermos pode ter sido a ponte na tran- recursos alimentares poderiam ter se torna-
dos pelos calos em seus dedos. (Portanto, da obser-
vação dos seus dedos, Sherlock Holmes corretamen- sição da larva pluteus (alimentar) para a lar- do geneticamente fixas naquelas espécies
te deduziu que o homem ruivo havia sido contrata- va que não tem os membros ciliados. A tro- cujas larvas não precisam procurar seu ali-
do como um escriba.) ca na distribuição de recursos entre as es- mento (Strathmann et al., 1992).
Se a assimilação genética indica a fixa- adaptivo ao dia curto (clima frio) de várias A assimilação genética pode ter um
ção de um dos fenótipos adaptivamente ex- borboletas é o mesmo que o único fenótipo, papel importante fornecendo um viés
pressos, então as borboletas seriam uma boa geneticamente produzido, de espécies re- para mudanças evolucionárias. Se um or-
fonte onde encontrar mais exemplos. Bra- lacionadas ou subespécies vivendo em al- ganismo herda uma norma de reação, as
kefield e colegas (1996) mostraram que po- tas altitudes ou latitudes. Pode-se também vias de desenvolvimento levando a um
diam fixar geneticamente as diferentes for- produzir o fenótipo de clima frio incuban- fenótipo particular já estão colocadas, e
mas do polifenismo adaptivo de Bicyclus, do no refrigerador as larvas ou pupas das tudo o que a evolução deve fazer é suprir
e Shapiro (1976) mostrou que o fenótipo borboletas da estação quente. [env5.html] um iniciador constante dessas vias.
A contínua plasticidade do desenvolvimento

A habilidade de um organismo em monitorar e responder à mudança ambiental é
crítica para a sobrevivência em habitats complexos. Nossos dois principais sistemas
sensoriais, os sistemas nervoso e imune, nos permite regular desenvolvimentalmente
nosso corpo em resposta aos estímulos ambientais.
O sistema imune: Desenvolvimento no adulto
Se o polifenismo induzido por predadores é uma resposta adaptativa às ameaças

potenciais, o sistema imune dos mamíferos é seu maior feito. O sistema imune dos
mamíferos é um mecanismo incrivelmente elaborado para detectar e destruir materi-
ais estranhos ao corpo. Quando somos expostos a uma molécula estranha (chamada
antígeno), nós produzimos anticorpos e os secretamos no soro sangüíneo (veja Capí-
tulos 10 e 17 para detalhes). Os anticorpos combinam com os antígenos inativando-os
ou eliminando-os. A base da resposta imune é resumida na hipótese da seleção clonal
(Burnett, 1959). Ela contém cinco postulados principais:
1. Cada linfócito B (célula B) pode produzir um e somente um tipo de anticorpo.

Ou seja, uma célula B pode estar produzindo um anticorpo que se liga ao
poliovírus, enquanto uma célula vizinha pode estar produzindo um anticorpo
que se liga à toxina diftérica.
2. Cada célula B colocará o anticorpo que produz na sua membrana celular com
o lado portador da especificidade voltado para fora.
3. Os antígenos são apresentados às células B (geralmente na superfície dos
macrófagos).
4. Somente aquelas células B que se ligam ao antígeno podem completar seu
desenvolvimento em células plasmáticas secretoras de anticorpo. As células
B dividem-se repetidamente, produzem um extenso retículo endoplasmático
rugoso, e sintetizam enormes quantidades de moléculas de anticorpos. Esses
anticorpos são secretados no sangue.
5. A especificidade do anticorpo é exatamente a mesma daquela na superfície
celular das células B.
O tipo de molécula de anticorpo na superfície celular da célula B é determinado

por acaso. De dez milhões de tipos de anticorpos protéicos que a célula pode sinteti-
zar, cada célula B produz somente um tipo. Essas células B são continuamente cria-
das e destruídas. Entretanto, quando um antígeno se liga a um conjunto de células B,
essas células são estimuladas a se dividir e se diferenciar em células plasmáticas (que
secretam o anticorpo) e células de memória (que populam os nódulos linfáticos e
respondem rapidamente quando expostas mais tarde ao mesmo antígeno) (Figura
21.17). Portanto, a constelação de células plasmáticas e de memória de cada pessoa
difere dependendo de quais antígenos ela encontrou. Gêmeos idênticos têm diferen-
tes populações de descendentes de células B em seus baços e nódulos linfáticos.
Anticorpo na superfície Anticorpo na superfície

Linfócito celular reconhecendo o celular reconhecendo o
Célula B em repouso antígeno A antígeno B
Dia 1 Núcleo
Citoplasma Antígeno A
Sem divisão ou diferenciação
Clones de dos linfócitos cujos anticorpos
linfócito da superfície celular não
em repouso reconhecem o antígeno A
Ribossomos
Dia 2 Figura 21.17
Modelo de seleção clonal na formação de
Moléculas de
anticorpo são
anticorpos. Cada célula B produz um tipo par-
sintetizadas no ticular de proteína de anticorpo (imunoglobuli-
retículo na) e a expõe na sua superfície celular. Quando
endoplasmático um antígeno (estranho ao corpo) se liga às pro-
teínas do anticorpo na membrana da célula B, a
Dia 3 célula B está apta a se dividir e se diferenciar
Proliferação em uma célula plasmática secretora de
anticorpos. A célula plasmática secreta somente
Retículo aquele tipo específico de anticorpo que foi ori-
endoplasmático
ginalmente produzido pela célula B.
Dia 4
Diferenciação
Célula de
Anticorpo anti-A secretado memória
Célula
plasmática
Dia 5
Anticorpo secretado
Aprendizado: Um sistema nervoso adaptável ao ambiente
No Capítulo 8, discutimos como a atividade pode ser um fator crítico na decisão de

quais sinapses neuroniais são retidas pelo organismo adulto. Aqui, estenderemos
aquela discussão para realçar aquelas situações extraordinárias onde novas experiên-
cias modificam o conjunto original de conexões neuroniais, causando a criação de
novos neurônios ou a formação de novas sinapses entre neurônios existentes. Como
neurônios após formados não se dividem, o seu “aniversário” pode ser identificado
tratando o organismo com timidina radioativa. Normalmente, muito pouca timidina
radioativa é incorporada no DNA de um neurônio que já se formou. Entretanto, se um
novo neurônio se diferencia por divisão celular durante o tratamento, ele incorporará
a timidina radioativa no seu DNA. A produção de tais novos neurônios pode ser
observada em machos de aves canoras quando esses aprendem suas canções. Os
tentilhões-zebra juvenis memorizam uma música modelo e em seguida aprendem o
padrão de contrações musculares necessárias para cantar uma frase específica. Nesse
processo de aprendizado e repetição, são gerados novos neurônios no corpo
hiperestriado do cérebro do tentilhão. Muitos desses novos neurônios enviam axônios
ao arquistriado que é responsável pelo controle da musculatura vocal (Nordeen e
Nordeen, 1988). Essas modificações não são observadas em machos que são muito
velhos para aprender a música, e nem em fêmeas juvenis (que não cantam essas
frases); isso é discutido mais completamente no Capítulo 20.
Os córtices cerebrais de ratos jovens criados em ambiente estimulante têm mais

neurônios, sinapses e dendritos do que são encontrados em animais criados isolados
(Turner e Greenough, 1983). Mesmo o cérebro adulto está se desenvolvendo em
resposta às novas experiências. Quando canários adultos aprendem uma nova músi-
ca, eles geram novos neurônios cujos axônios se projetam de uma região vocal do
cérebro a outra (Alvarez-Buylla et al., 1990). Analogamente, quando ratos adultos
aprendem a se equilibrar sobre cilindros de madeira, seus neurônios das células de
Purkinje do cerebelo desenvolvem novas sinapses (Black et al., 1990). Portanto, o
sistema nervoso continua a se desenvolver na vida adulta, e o padrão das conexões
neuroniais é o produto do padrão herdado e do padrão produzido pelas experiências.
Essa interação entre o desenvolvimento inato e o experimental foi detalhada o mais
dramaticamente em estudos da visão em mamíferos.
MUDANÇAS EXPERIMENTAIS NAS VIAS VISUAIS INERENTES NOS MAMÍ-

FEROS. Algumas das pesquisas mais interessantes sobre padronização neuronial
em mamíferos se concentram nos efeitos da privação sensorial no desenvolvimen-
to do sistema visual em gatinhos e macacos. As vias pelas quais os impulsos
elétricos passam da retina ao cérebro nos mamíferos estão ilustradas na Figura
21.18. Os axônios das células ganglionares da retina formam os dois nervos ópticos,
que se encontram no quiasma óptico. Como nos girinos de Xenopus, algumas
fibras vão para o lado oposto (contralateral) do cérebro, mas diferentemente da
maioria dos outros vertebrados, as células retinianas dos mamíferos também envi-
am sinais para o mesmo lado (ipsilateral) do cérebro. Esses nervos terminam nos
dois núcleos geniculados laterais. Aqui, a entrada de cada olho é mantida separa-
da, as camadas mais superiores e anteriores recebendo os axônios do olho contra-
lateral, e o meio dos corpos recebendo a entrada do olho ipsilateral. A situação se
torna mais complicada quando os neurônios do núcleo geniculado lateral se
conectam com os neurônios do córtex visual. Mais de 80% das células neurais no
córtex recebem entradas de ambos os olhos. O resultado é visão binocular e per-
cepção de profundidade. Outro conhecimento importante é que a projeção
retinocortical é a mesma para os dois olhos. Se um neurônio cortical é estimulado
por luz reluzindo através de uma região do olho esquerdo, 5o acima e 1o à esquerda
da fóvea,* ele também será estimulado por uma luz reluzindo através de uma re-
gião do olho direito, 5o acima e 1o à esquerda da fóvea. Além disso, a resposta
evocada na célula cortical quando ambos os olhos são estimulados é maior do que
a resposta quando cada retina é estimulada sozinha.
Hubel, Wiesel e seus colaboradores (veja Hubel, 1967) demonstraram que o
desenvolvimento do sistema nervoso depende até certo ponto da experiência do
indivíduo durante um período crítico do desenvolvimento. Em outras palavras, nem
todo o desenvolvimento neuronial está codificado no genoma: uma parte é aprendi-
da. A experiência parece reforçar ou estabilizar algumas conexões neuroniais que já
estão presentes no nascimento e enfraquecer ou eliminar outras conexões. Essas
conclusões vêm de estudos de privação sensorial parcial. Hubel e Wiesel (1962,
1963) fecharam com costura as pálpebras direitas de gatos recém–nascidos e as
deixaram fechadas durante três meses. Após esse tempo, eles descosturaram as
pálpebras direitas. As células corticais desses gatos não puderam ser estimuladas
por luz brilhante no olho direito. Quase todas as entradas no córtex visual vinham
somente do olho esquerdo. O comportamento dos gatinhos revelava a ineficiência
do olho direito: quando o olho esquerdo desses animais foi vedado, eles se torna-
ram funcionalmente cegos. Como os neurônios geniculados laterais pareciam ser
estimulados pelos dois olhos, direito e esquerdo dos gatinhos, o defeito fisiológico
parecia ser entre os núcleos geniculados laterais e o córtex visual. Nos macacos
*A fóvea é uma depressão no centro da retina onde somente os cones estão presentes e os bastonetes
e vasos sangüíneos estão ausentes. Aqui ela se torna um marco conveniente.
(A) Olho direito Olho esquerdo
Retina
Nervo
óptico
Quiasma
óptico
Núcleo
geniculado
lateral
Radiações ópticas
Córtex visual
Vias visuais do olho direito (vista da Vias visuais do olho esquerdo Vias visuais combinadas,
superfície ventral do cérebro) esquerda e direita
Figura 21.18
Vias principais do sistema visual de mamífe-
ros. (A) Em mamíferos, o nervo óptico de cada
olho se ramifica, enviando fibras nervosas a
um núcleo geniculado lateral em cada lado do
cérebro. No lado ipsilateral, uma parte especí-
fica da retina vai a uma parte específica do nú-
cleo geniculado lateral. No lado contralateral,
o núcleo geniculado lateral recebe entradas de
todas as partes da retina. Neurônios de cada
núcleo geniculado lateral inervam o córtex vi-
sual no mesmo lado. (B,C) Retinas isoladas (e
filetadas) mostrando projeções ipsilaterais (B)
(B) (C)
e contralaterais (C), das células ganglionárias
da retina de um embrião de camundongo de 16
dias. O corante fluorescente carbocianina DiI
foi inserido atrás do quiasma óptico, e foi per-
mitido que o corante penetrasse nos axônios
rhesus, onde fenômenos semelhantes são observados, o defeito foi relacionado à
retinianos. O corante se difunde ao longo dos
falta de síntese de proteínas nos neurônios geniculados laterais inervados pelo axônios, assim demarcando a sua origem. Pro-
olho coberto (Kennedy et al., 1981). jeções ipsilaterais na sua maioria vêm de uma
Seria tentador concluir que a cegueira resultante foi devida à não formação de única parte da retina (neste caso, da região
conexões visuais apropriadas, mas esse não é o caso. Realmente, quando um gato ventro-temporal). Projeções contralaterais para
nasce, axônios dos neurônios geniculados laterais recebendo entradas de cada olho o mesmo sítio vêm de toda a retina. (B e C de
se superpõe extensivamente no córtex visual (Hubel e Wiesel, 1963). Entretanto, Colello e Guillery, 1990, cortesia dos autores.)
quando um olho é coberto muito cedo na vida do filhote, suas conexões com o córtex
visual são assumidas por aquelas do outro olho (Figura 21.19). Existe competição, e
a experiência tem um papel na fortificação e estabilização das conexões de cada
núcleo geniculado lateral ao córtex visual. Portanto, quando ambos os olhos do gati-
nho são costurados durante 3 meses, a maioria das células corticais pode ser estimu-
lada pela iluminação apropriada de um ou outro olho. O tempo crítico no desenvolvi-
mento do gato para essa validação das conexões neuroniais começa entre a quarta e a
sexta semana na vida do animal. A privação monocular até a quarta semana produz
pouca ou nenhuma deficiência fisiológica, mas após 6 semanas ela produz todas as
mudanças neuroniais características. Se um gatinho teve uma experiência visual du-
rante os primeiros 3 meses, qualquer privação monocular posterior (mesmo por um
ano ou mais) não tem efeito. As sinapses se estabilizaram.
(B)
(A)
(C) (D) Camada cortical 3
Camada cortical 4
Figura 21.19
Auto-radiografia de fundo escuro do córtex
estriado de macaco, 2 semanas após injeção de
[3H]prolina no humor vítreo de um olho. Cada
neurônio retiniano absorve a marcação radioa-
tiva e a transfere para as células com as quais
forma sinapses. (A) Padrão normal de marca-
ção. As listas brancas indicam que cerca da
Portanto, dois princípios podem ser visualizados na padronização do sistema
metade das colunas absorveram a marcação,
enquanto a outra metade não a obsorveu; esse visual nos mamíferos. Primeiro, conexões neuroniais envolvidas na visão estão
padrão indica que metade das células estavam presentes mesmo antes que o animal enxergue; e segundo, a experiência tem um
inervadas pelo olho marcado e metade pelo olho papel importante na determinação de quais conexões permanecem.* Da mesma
não marcado. (B) Padrão de marcação quando maneira que a experiência refina as conexões neuromusculares originais, ela tam-
o olho não marcado permaneceu fechado por bém tem um papel no refinamento e melhora das conexões visuais. É também
suturas durante 18 meses. As projeções possível, que funções adultas como aprendizado e memória se originam no esta-
axônicas do olho normal (marcado) assumem belecimento e/ou reforço de diferentes sinapses pela experiência. Purves e
as regiões que normalmente seriam inervadas
Lichtman (1985) observaram:
pelo olho suturado. (C,D) Desenhos de axônios
dos núcleos geniculados de gatinhos que tive-
ram um olho ocluído por 33 dias. A ramifica- A interação entre animais individuais e seu mundo continua a moldar o sistema
ção terminal dos axônios no olho ocluído (C) nervoso através da vida de uma maneira impossível de ter sido programada.
foi muito menos extensa do que aquela do Modificação do sistema nervoso pela experiência é, portanto, a última e mais
olho não ocluído (D). (A e B de Wiesel, 1982, sutil estratégia desenvolvimental.
cortesia de T. Wiesel; C e D de acordo com
Antonini e Stryker, 1993.)
*Estudos recentes (Colman et al., 1997) mostraram que a divergência na liberação de
neurotransmissores resulta em modificação da adesividade sináptica e causa a remoção do axônio
fornecendo a estimulação mais fraca. Os que estudaram neurobiologia se lembrarão (se potenciados
adequadamente) que o conceito da sinapse de Hebbian se baseia na premissa que a experiência
influencia vias neuroniais. Se um axônio do neurônio A ativa o neurônio B, de tal maneira que o
disparo de B está sempre associado ao de A, então a sinapse entre os neurônios A e B é reforçada.
Existem várias maneiras pelas quais esse reforço poderia ocorrer, mas a maioria das hipóteses
focalizam as modificações que permitiriam a entrada mais rápida de íons de cálcio no neurônio B.
Esse tipo de sinapse poderia explicar o fenômeno de potenciação de longo prazo, a qual é conside-
rada como a base da memória correlativa (onde uma sensação relembra outras). Tais mecanismos
Hebbianos podem mediar a competição entre os axônios dos núcleos geniculados laterais por células
no córtex visual (Stent, 1973; Reite e Stryker, 1988).
Q DISTÚRBIOS AMBIENTAIS DO
DESENVOLVIMENTO NORMAL
Malformações e distúrbios
Da primeira parte deste capítulo, ficou claro que as instruções para o desenvolvimen-
to não residem completamente nos genes ou mesmo no zigoto. O organismo é sensí-
vel às sugestões do ambiente. Entretanto, isso torna o organismo vulnerável às mu-
danças ambientais que podem provocar distúrbios no desenvolvimento.
Se parece surpreendente que qualquer um de nós sobrevive para nascer, isso é
real; estima-se que da metade a dois terços de todas as concepções humanas não se
desenvolvem a termo com sucesso (Figura 21.20). Muitos desses embriões expres-
sam sua anormalidade tão cedo que não há implantação no útero. Outros se implan-
tam mas não conseguem estabelecer uma gravidez de sucesso. Portanto, a maioria
dos embriões anormais são espontaneamente abortados antes mesmo que a mulher
saiba que está grávida (Boué et al., 1985). Edmonds e colaboradores (1982) usando
um teste imunológico muito sensível que pode detectar a presença de gonadotropina
coriônica humana (hCG) 8 ou 9 dias após a fertilização, monitoraram 112 gestações
em mulheres normais. Dessas gestações determinadas por hCG, 67 não foram mantidas.
Parece, então, que muitos embriões humanos são prejudicados cedo no desenvol-
vimento e não sobrevivem por muito tempo no útero. Os defeitos nos pulmões, mem-
bros, face ou boca não seriam deletérios para o feto (que não depende desses órgãos
enquanto dentro da mãe), mas podem ameaçar seriamente a vida após o nascimento.
Cerca de 5% de todos os nascimentos humanos têm uma malformação reconhecível,
algumas leves, outras muito severas (McKeown, 1976).
Anormalidades congênitas (“no nascimento”) e a eliminação de embriões e fetos
antes do nascimento são causadas tanto intrinsecamente como extrinsecamente. As
anormalidades causadas por eventos genéticos (mutações, aneuploidia, translocações)
são chamadas malformações. Por exemplo, aniridia (ausência da íris) causada pela
Figura 21.20
mutação do gene PAX6, é uma malformação. A síndrome de Down, causada pela Os destinos hipotéticos de 20 ovos que são
trissomia do cromossomo 21, é também uma malformação. A maior parte da elimina- fertilizados naturalmente nos Estados Unidos
ção precoce de embriões e fetos é provavelmente devida às anormalidades e Europa ocidental. Em condições normais,
cromossômicas que interferem com o processo normal do desenvolvimento. somente 6.2 ovos dos 20 originais teriam
possibilidade de se desenvolver a termo com
sucesso. (De acordo com Volpe, 1987.)
Óvulos em contacto com

o espermatozóide
Fertilização bem sucedida
Implantação bem sucedida
Desenvolvimento bem
sucedido, 4 semanas
Desenvolvimento bem Número de

sucedido, 8 semanas sobreviventes
dos 20 originais
Fetos levados a termo
Porcento
Tabela 21.2 Alguns agentes conside- Anormalidades devidas a agentes exógenos (certos agentes químicos ou vírus,
rados causadores de distúrbios no de- radiação ou hipertermia) são chamados distúrbios. Os agentes responsáveis pelos
senvolvimento fetal humanoa distúrbios são chamados teratogênicos (do Grego, formadores de monstros), e o
DROGAS E SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS estudo de como agentes ambientais rompem o desenvolvimento normal é chamado
Ácido retinóico (Isotretinoina, Accutane) teratologia.* Teratogênicos funcionam durante certos períodos críticos no desenvol-
Ácido valpróico vimento. O período mais crítico para qualquer órgão é quando ele está crescendo e
Agentes antitiróideos (PTU) formando suas estruturas. Diferentes órgãos têm diferentes períodos críticos, apesar
Álcool
Aminoglicosídeos (Gentamicina) do espaço de tempo entre 15 e 60 dias ser crítico para muitos órgãos. O coração se
Aminopterina forma primariamente durante as semanas 3 e 4, enquanto a genitália externa é mais
Bromo sensível nas semanas 8 e 9. O cérebro e o esqueleto são sempre sensíveis, do começo
Chumbo da semana 3 até o fim da gravidez e além.
Cocaína
Cortisona
Dietilestilbesterol (DES) Agentes teratogênicos
Difenilhidantoína
Estreptomicina Agentes diferentes são teratogênicos em diferentes organismos. Uma lista parcial de
Fumaça de cigarro
Heroína agentes teratogênicos no homem está apresentada na Tabela 21.2.
Metilmercúrio A principal classe de teratogênicos inclui drogas e compostos químicos
Penicilamina ambientais. Alguns compostos químicos que são encontrados naturalmente no
Talidomida ambiente podem causar defeitos de nascimento. Mesmo nos puros campos alpi-
Tetraciclina
Trimetadiona nos intocados das Montanhas Rochosas são encontrados teratogênicos. Aqui nasce
Warfarina o repolho de gambá Veratrum californicum, que algumas vezes serve de alimento
para os carneiros. Se ovelhas grávidas se alimentam dessa planta, seus fetos ten-
RADIAÇÃO IONIZANTE (RAIOS-X) dem a desenvolver graves danos neurológicos, incluindo ciclopia, a fusão dos
HIPERTERMIA dois olhos no centro da face (Figura 21.21). Essa condição também ocorre no
homem, porco e muitos outros mamíferos; o organismo afetado morre logo após
MICROORGANISMOS INFECCIOSOS o nascimento (como resultado do grave defeito no cérebro, incluindo a falta da
Cytomegalovírus glândula pituitária).
Herpes simplex
Parvovírus Quinina e álcool, duas substâncias derivadas de plantas, podem também causar
Rubéola (Sarampo Alemão) malformações. A quinina pode causar surdez, e o álcool (quando mais de 60-90 g por
Toxoplasma gondii (toxoplasmose) dia são ingeridas pela mãe) pode causar retardamento físico e mental na criança. Não
Treponema pallidum (sífilis) foi provado que a nicotina e a cafeína causam anomalias congênitas, mas mulheres
Vírus Coxsackie
que fumam muito (20 cigarros ou mais por dia) podem ter crianças menores que
CONDIÇOES METABÓLICAS NA MÃE aquelas nascidas de mães que não fumam. Fumar também diminui significativamente o
Doença auto-imune número e a motilidade de espermatozóides em homens que fumam pelo menos quatro
(incluindo incompatibilidade de Rh) cigarros por dia (Kulikauskas et al., 1985).
Diabetes
Deficiências dietéticas, malnutrição Além disso, nossa sociedade industrial produz anualmente centenas de novos
Fenilcetonúria compostos artificiais que passam para o uso geral. Pesticidas e compostos orgânicos
de mercúrio têm causado anormalidades neurológicas e de comportamento em bebês
Fonte: Adaptado de Opitz, 1991. cujas mães os ingeriram durante a gravidez. Uma trágica demonstração disso ocorreu
a
Esta lista inclui agentes teratogênicos conheci-
dos e possíveis e não é exaustiva.
em 1965, quando uma firma japonesa despejou mercúrio em um lago, onde foi inge-
rido pelos peixes que foram comidos por mulheres grávidas da aldeia de Minamata.
O dano cerebral congênito e a cegueira nas crianças nascidas se tornou conhecido
como a doença de Minamata.
Em alguns casos, as mesmas condições podem ser causadas por um distúrbio (causado por um agente
exógeno) ou uma malformação (do núcleo). Por exemplo, certas malformações axiais em camundongos
podem ser produzidas pela administração de ácido retinóico ou por mutações em certos genes Hox. Consi-
dera-se que, em alguns casos, a mutação e o teratogênico estão afetando a mesma enzima. A
condroplasia puntacta é um defeito congênito do osso e da cartilagem, caracterizada por uma
mineralização anormal do osso, subdesenvolvimento da cartilagem nasal e dedos encurtados; esse
defeito é causado por um gene defeituoso no cromossomo X. Um fenótipo idêntico é produzido pela
ingestão de warfarina, o composto que mata ratos. Parece que o gene defeituoso é normalmente
responsável pela produção de uma proteína, a arilsulfatase, necessária para o crescimento da carti-
lagem. O composto warfarina inibe essa mesma enzima (Franco et al., 1995).
Ácido retinóico como um teratógeno
Em alguns casos, um composto usado para o desenvolvimento no corpo pode ter

efeitos deletérios se fornecido em grandes quantidades em tempos determinados.
O ácido retinóico é importante na formação do eixo ântero-posterior do embrião de
mamíferos e também na formação de membros. Nesse caso, o ácido retinóico é
produzido de células discretas e funciona em uma pequena área. Entretanto, se
ácido retinóico é fornecido pela mãe em grandes quantidades, as células respon-
dem a isso, pois normalmente não receberiam concentrações tão altas dessa molé-
cula. No Capítulo 16, discutimos o efeito do ácido retinóico no desenvolvimento
do camundongo. No corpo, vitamina A e ácido 13-cis-retinóico são isomerizados
às formas ativas de ácido retinóico no desenvolvimento, ácido retinóico todo- Figura 21.21
trans- e ácido retinóico 9-cis (Creech Kraft, 1992). O ácido retinóico não pode Cabeça de carneiro ciclope nascido de uma ca-
bra que havia ingerido Veratrum californicum
ligar-se diretamente aos genes. Para a função de regular os genes, o ácido retinói-
no início da gestação. Os hemisférios cere-
co deve se ligar a um grupo de fatores de transcrição chamado de receptores de brais se fundiram, formando um único olho e
ácido retinóico (RARs). Essas proteínas têm a mesma estrutura geral que os recep- sem glândula pituitária. (de Binns et al. 1964,
tores de esteróides e de hormônios da tireóide, e são ativos somente quando cortesia de J. F. James e o USDA-ARS
ligados ao ácido retinóico (Linney, 1992). Os receptores de ácido retinóico se Poisonous Plant Laboratories.)
ligam a elementos intensificadores específicos no DNA que são denominados
elementos de resposta ao ácido retinóico. Os elementos de resposta ao ácido
retinóico contêm pelo menos duas cópias da seqüência GGTCA (Ruberte et al.,
1990, 1991a). Alguns genes Hox têm elementos de resposta a ácido retinóico nos
seus promotores (Yu et al., 1991; Pöpperl e Featherstone, 1993; Studer et al., 1994).
Existem três tipos principais de receptores de ácido retinóico: RAR-α, RAR-β e
RAR-γ. Cada um deles liga ambas as formas de ácido retinóico e cada um deles se
liga ao mesmo elemento de resposta a ácido retinóico.
O ácido retinóico tem sido útil no tratamento da acne cística grave e está dispo-
nível (sob o nome de Accutane; no Brasil um dos produtos farmacêuticos contendo
ácido retinóico é Retin-A) desde 1982. Os efeitos deletérios resultantes da adminis-
tração de grandes doses de vitamina A ou seus análogos para várias espécies de
animais em gestação são conhecidos desde a década de 1950 (Cohlan, 1953; Giroud
e Martinet, 1959; Kochhar et al., 1984), e por essa razão a droga contém uma etiqueta
de alerta indicando que não pode ser usada por mulheres grávidas. Apesar disso,
cerca de 160.000 mulheres em idade fértil (15 a 45 anos) tomaram essa droga desde
que foi introduzida, e algumas a usaram durante a gravidez. Lammer e colaboradores
(1985) estudaram um grupo de mulheres que se expuseram inadvertidamente ao
ácido retinóico e que decidiram permanecer grávidas. Dos 59 fetos, 26 nasceram sem
anomalias observáveis, 12 abortaram espontaneamente e 21 nasceram com anomali-
as óbvias. Os bebês malformados tinham um padrão característico de anomalias,
incluindo orelhas ausentes ou defeituosas, queixos ausentes ou pequenos, lábio
leporino, anormalidades do arco aórtico, deficiências do timo e anormalidades do
sistema nervoso central.*
Esse padrão de múltiplas anomalias congênitas é semelhante aquele visto em
embriões de rato e de camundongo cujas mães quando grávidas receberam essas
drogas. Goulding e Pratt (1986) colocaram embriões de camundongo de 8 dias em uma
solução contendo ácido retinóico 13-cis em concentrações muito baixas (2x10-6M).
Mesmo nessa concentração, aproximadamente um terço dos embriões desenvolveram
*Saúde Pública é um fator crítico, pois existe uma significante sobreposição entre a população
que usa medicamentos para a acne e a população de mulheres em idade fértil. Além disso, considera-
se que metade das gestações na América do Norte não são planejadas (Nulman et al., 1997). A
própria vitamina A é teratogênica quando injetada em mega doses. Rothman e colegas (1995)
encontraram que mulheres grávidas que tomaram mais de 10.000 unidades internacionais de vitami-
na A pré-formada/dia (na forma de suplementos vitamínicos) tinham cerca de 2 por cento de chance
de terem uma criança nascida com distúrbios semelhantes aqueles produzidos pelo ácido retinóico.
Figura 21.22
Embrião de camundongo normal com 17 dias
(A) e um embrião de camundongo de 17 dias
cuja mãe recebeu ácido retinóico no dia 8 da
gestação (B). Podem ser vistas malformações
craniofaciais na cartilagem derivada da crista
neural dos embriões tratados. A cartilagem de
Meckel está completamente deslocada da re-
gião mandibular (queixo inferior) para a região
maxilar (parte superior da boca). As cartila-
gens do martelo e bigorna também não são for-
madas. (de Morriss-Kay, 1993; fotografia cor-
tesia de G. Morriss-Kay.)
(A) (B)
um padrão de anomalias muito específico, incluindo uma dramática redução no tama-

nho do primeiro e segundo arcos faríngeos (Figura 21.22). Em camundongos normais,
o primeiro arco forma o maxilar e a mandíbula do queixo e dois ossículos do ouvido
médio, enquanto o segundo arco forma o terceiro ossículo do ouvido médio como
também outros ossos faciais.
A base para esse distúrbio do desenvolvimento parece residir na habilidade da
droga em alterar a expressão dos genes Hox e, portanto, reespecificar porções do
eixo ântero-posterior e inibir a migração das células da crista neural da região craniana
do tubo neural (Moroni et al., 1994; Studer et al., 1994). O ácido retinóico marcado
radioativamente se liga às células da crista neural craniana e impede não só sua
proliferação como sua migração (Johnston et al., 1985; Goulding e Pratt, 1986). A
ligação parece ser específica às células derivadas da crista neural craniana, e o
efeito teratogênico da droga é confinado a um período específico do desenvolvi-
mento (dias 8-10 no camundongo; dias 20-35 em humanos). A teratogênese do ácido
retinóico em modelos animais tem sido extremamente bem sucedida em elucidar seus
mecanismos a nível celular. [env6.html]
Talidomida como um teratógeno
Antes de 1961, havia pouca evidência sobre malformações induzidas por drogas
em humanos. Mas, naquele ano, Lenz e McBride independentemente acumula-
ram evidência de que um sedativo leve, talidomida, causava um enorme aumento
em uma síndrome previamente rara de anomalias congênitas. A mais evidente des-
sas anomalias era a focomelia, uma condição na qual os ossos longos dos mem-
bros estão ausentes (amelia) ou severamente deficientes (peromelia), fazendo com
que os apêndices resultantes pareçam membros de foca (Figura 21.23). Mais de
7000 crianças afetadas nasceram de mães que haviam tomado a droga, e uma
mulher necessitava ingerir apenas um comprimido para produzir crianças com os
quatro membros deformados (Lenz, 1962, 1966; Toms,1962). Outras anormalidades
induzidas pela ingestão de talidomida incluem defeitos no coração, ausência de
ouvidos externos e intestinos malformados. A droga foi retirada do mercado em
Novembro de 1961.
Nowack (1965) documentou o período de susceptibilidade durante o qual a
talidomida causava essas anormalidades. Foi encontrado que a droga era teratogênica
somente durante os dias 34-50 após a última menstruação (cerca de 20 a 36 dias
pós-concepção). A especificidade da ação da talidomida é mostrada na Figura
21.23C. Do dia 34 ao dia 38, não se observa anormalidades nos membros. Durante
esse período, a talidomida pode causar a ausência ou deficiência dos componentes
do ouvido. Malformações dos membros superiores são vistas antes daquelas dos
membros inferiores, pois durante o desenvolvimento os braços se formam pouco
antes do que as pernas.
(A) (B) Figura 21.23

Estrutura e efeito da talidomida. (A) Estrutura química da
talidomida. (B) Focomelia em uma criança cuja mãe tomou
talidomida durante os primeiros dois meses de gestação. (C)
Período de suceptibilidade aos efeitos teratogênicos da
talidomida. (De acordo com Nowack, 1965.)
(C)
Ausência de ouvido
Dedos ausentes ou mal formados
Ausência de braços
Severo encurtamento dos braços
Deslocamento da bacia
Malformação do ouvido
Ausência de pernas
Severo encurtamento das pernas
Dedos malformados
Dias após a última menstruação
A tragédia da talidomida mostrou os limites de modelos animais como testes do

potencial efeito teratogênico de drogas. Diferentes espécies (e linhagens dentro das
espécies) metabolizam talidomida de maneira diferente. Ratas e camundongos fême-
as grávidas - os animais usados normalmente para testar tais compostos-não produ-
zem filhotes malformados quando recebem talidomida. O coelho produz alguns des-
cendentes malformados, mas os defeitos são diferentes daqueles vistos em crianças
humanas afetadas. Primatas, tais como o sagüi parecem ter uma susceptibilidade
semelhante à do homem, e fetos de sagüi afetados têm sido estudados como uma
tentativa de descobrir como a talidomida causa esses distúrbios. McCredie (1976a,b)
propôs que a talidomida pode afetar a diferenciação das células derivadas da crista
neural, e McBride e Vardy (1983) mostraram que a diferença mais notável vista antes
das malformações dos membros se referia ao tamanho da raiz dorsal dos gânglios e
seus neurônios. O número de neurônios nesses gânglios é marcadamente reduzido
(Figura 21.24). Esses autores especulam que os neurônios desses gânglios são neces-
sários para a manutenção do desenvolvimento dos membros e que a talidomida inter-
fere com os neurônios ou os destroem.
Outra hipótese (Neubert et al., 1995; Geitz et al., 1996) propõe que o alvo inicial da
talidomida são as moléculas de adesão do broto do membro e seus capilares. A adição
de pequenas doses de talidomida a sagüis ou a células endoteliais cultivadas resulta
em uma desaceleração de várias moléculas de adesão célula-célula ou célula-substrato.
Figura 21.24
Efeitos da talidomida no feto de sagüi. As figuras superiores mostram fenótipos de fetos de sagüis tardiamen-
te na gestação. As figuras inferiores mostram seções da medula espinhal ao nível dos membros anteriores.
(A) Feto de um sagüi controle. (B) Feto de um sagüi tratado com 25mg de talidomida por quilograma de peso
coporal entre os dias 38 e 46 da gestação. (de McBride e Vardy, 1983, cortesia de W. G. McBride.)
Um terceiro mecanismo para explicar a teratogenicidade da talidomida foi proposto

por Lash e Saxén (1972). Lash (1963) observou que o rim primitivo, o mesonefro,
induzia o crescimento da cartilagem em tecido de membro cultivado. Lash e Saxén
observaram que a talidomida inibia esse crescimento de cartilagem induzido por
mesonefros em culturas de órgãos humanos obtidos de embriões abortados
eletivamente. Além disso, a talidomida radioativa parecia se ligar especificamente ao
mesonefro humano. O mecanismo molecular dessa teratogenicidade seletiva da
talidomida ainda não é conhecido, e isso será um problema difícil de ser estudado
enquanto nossos únicos modelos animais forem outros primatas.
A tragédia da talidomida acentua outro princípio importante: o metabolismo em
embriões é diferente do que nos adultos, e a construção de um órgão pode ser
afetado por substâncias químicas que não têm efeito deletério sobre o funciona-
mento daquele órgão. Vários medicamentos para adultos são teratogênicos para
embriões. Esses incluem metotrexato (uma droga usada para deter o crescimento de
células tumorais), anticonvulsivantes como trimetadiona e fenitoína, e anticoagulantes

como warfarina. Fumar cigarros durante a gravidez foi associado com o retardamen-
to do crescimento fetal, mas nem a ingestão de café ou de antidepressivos triocíclicos
produziu anormalidades significativas de desenvolvimento (veja Friedman, 1992:
Nulman et al., 1997).
Álcool como um teratogênico
Em termos de freqüência e custo à sociedade, o teratogênico mais devastador é indu-

bitavelmente o etanol. Em 1968, Lemoine e colegas verificaram uma síndrome
de defeitos de nascimento em crianças de mães alcoólatras. Jones e Smith (1973)
também observaram a síndrome alcoólica fetal (FAS). Bebês com FAS eram caracteri-
zados como tendo uma cabeça pequena, um filtro indistinto (o par de cristas que
correm entre o nariz e a boca acima do centro do lábio superior), um lábio superior
estreito, e uma baixa fossa nasal. O cérebro dessa criança pode ser dramaticamente
menor do que o normal e freqüentemente mostra defeitos na migração neuronial e glial
(Figura 21.25; Clarren, 1986). Existe também uma proeminente morte celular extra no
processo frontonasal e nos gânglios do nervo craniano (Sulik et al., 1988). A síndrome
alcoólica fetal é o terceiro tipo mais prevalente de retardamento mental (atrás da sín-
drome do X frágil e da síndrome de Down) e afeta uma entre 500 a 750 crianças
nascidas nos Estados Unidos (Abel e Sokol, 1987).
Crianças com síndrome alcoólica fetal são retardadas no desenvolvimento e men-
talmente, com um QI médio ao redor de 68 (Streissguth e LaDue, 1987). Foi determi-
nado que pacientes com uma idade cronológica média de 16.5 anos tinham um voca-
bulário funcional de crianças de 6.5 anos e habilidades matemáticas de alunos da
quarta-série. A maioria dos adultos e adolescentes com FAS não podem gerenciar
dinheiro ou suas próprias vidas, e eles têm dificuldades em aprender com experiências
passadas. Entretanto, em muitos exemplos de FAS, as anormalidades de comporta-
mento existem sem grandes mudanças físicas no tamanho da cabeça ou no QI (J.
Opitz, comunicação pessoal, 1996). Existe uma grande variação na habilidade de
mães e fetos para metabolizar o etanol, e se considera que 30-40% das crianças nas-
cidas de mães alcoólicas que bebem durante a gravidez terão FAS. A ingestão de
menores quantidades de etanol pela mãe pode levar ao efeito alcoólico fetal, uma
forma menos severa de FAS, mas uma condição que diminui as habilidades funcio-
nais e intelectuais do paciente.*
* Para uma notável descrição da criação de uma criança com síndrome alcoólica fetal bem como uma
análise de FAS na cultura dos Índios Americanos nos Estados Unidos, veja Dorris (1989). Os efeitos
pessoais e sociológicos de FAS estão bem integrados aos dados científicos e econômicos.
Figura 21.25
Comparação de um cérebro de uma criança com síndrome alcoólica
fetal (esquerda) com o cérebro de uma criança normal da mesma
idade (direita). O cérebro de uma criança com FAS é significativa-
mente menor, e o padrão de convoluções está obscurecido pelas
células gliais que migraram sobre o topo do cérebro. (Fotografia
cortesia de S. Clarren.)
Figura 21.26
Possíveis mecanismos que produzem a
síndrome alcoólica fetal. (A-C) Morte celular
pelos radicais de superóxido induzidos pelo
etanol. Coloração com sulfato de Azul do
Nilo revela áreas de morte celular. (A) Região
da cabeça de um embrião controle de camun-
dongo de 9 dias. (B) Região da cabeça de um
embrião tratado com etanol, mostrando áreas
de morte celular. (C) Região da cabeça de um
embrião de 9 dias tratado com etanol e
superóxido dismutase, um inibidor de radicais
superóxido. O inibidor do superóxido impede
a morte celular induzida pelo álcool. (D) Gráfi-
co representando a inibição da adesão celular
mediada por L1 pelo etanol. (A-C de Kotch et
al., 1995; fotografias cortesia de K. Sulik; D de
acordo com Ramanathan et al., 1996.)
Porcentagem de células aderentes
Células
aderindo
pelo L1
Células controle não
expressando L1
Concentração de etanol, mM
Um sistema modelo no camundongo foi usado para explicar os efeitos do

álcool na face e no sistema nervoso. Quando camundongos recebem etanol na
época da gastrulação, é induzido o mesmo espectro de defeitos do desenvolvi-
mento como em humanos. Após 12 horas da ingestão de álcool pela mãe, já são
observadas anormalidades do desenvolvimento. As estruturas da linha mediana
não se formam, permitindo a proximidade anormal dos processos medianos da
face. São vistas também anomalias no cérebro anterior, e os fetos afetados mais
severamente não têm um cérebro anterior completo (Sulik et al., 1988). Nos em-
briões tratados com etanol, a morte celular pode ser vista com proeminência no
processo frontonasal (facial), como também nos gânglios do nervo craniano e
no mesoderma do arco visceral. Estudos recentes sugerem que etanol pode in-
duzir seus efeitos teratogênicos por mais de um mecanismo. Primeiro, evidência
anatômica sugere que a migração da crista neural é severamente prejudicada.
Segundo, a morte celular pode ser causada pela produção de radicais de
superóxido que oxidam membranas celulares e levam à citólise (Figura 21.26A-C;
Davis et al., 1990; Kotch et al., 1995). Terceiro, o álcool pode impedir diretamente
que a molécula L1 de adesão celular funcione mantendo as células agregadas.
Ramanathan e colegas (1996) mostraram que o etanol pode bloquear as funções
adesivas das proteínas L1 in vitro a níveis tão baixos como 7mM, uma concen-
tração de etanol produzida no sangue ou cérebro com um única dose (Figura
21.26D). Além disso, mutações nos genes L1 humanos causam uma síndrome de
retardamento mental e malformações semelhantes àquelas vistas em casos seve-
ros da síndrome alcoólica fetal. [env7.html]
Outros agentes teratogênicos
Drogas e substâncias químicas não são os únicos agentes capazes de causar distúr-
bios no desenvolvimento. Outra classe de teratogênicos inclui os vírus. Gregg (1941)
foi o primeiro a documentar o fato que mulheres com rubéola (sarampo Alemão)
durante o primeiro terço da gravidez tinham uma chance em seis de dar à luz uma
criança com catarata ocular, malformações cardíacas ou surdez. Essa foi a primeira
evidência de que a mãe não podia proteger totalmente seu feto contra o meio ambi-
ente externo. Quanto mais cedo na gravidez ocorria a infecção por rubéola, maior era
o risco de que o embrião seria malformado. As primeiras cinco semanas parecem ser
as mais críticas, porque é nesse período que estão sendo formados o coração, os
olhos e os ouvidos. A epidemia de rubéola entre 1963 e 1965 nos Estados Unidos
provavelmente resultou em 20.000 mortes fetais e 30.000 crianças com defeitos de
nascença. Dois outros vírus, Cytomegalovirus e Herpes simplex, são também
teratogênicos. Infecção por Cytomegalovirus em embriões precoces é quase sem-
pre fatal, mas infecção mais tardia pode levar à cegueira, surdez, paralisia cerebral e
retardamento mental.
Bactérias e protistas são raramente teratogênicos, mas dois deles podem prejudi-
car embriões humanos. Toxoplasma gondii, um protozoário carreado por coelhos e
gatos (e por suas fezes), pode atravessar a placenta e causar defeitos no cérebro e
olhos do feto. Treponema pallidum, a causa da sífilis, pode matar fetos precoces e
produzir surdez em outros mais velhos.
A radiação ionizante pode quebrar cromossomos e alterar a estrutura do DNA.
Por essa razão, mulheres grávidas são alertadas para evitar Raios–X desnecessá-
rios, mesmo que não exista evidência para anomalias congênitas resultantes de
radiação diagnóstica (Holmes, 1979). O calor em febres altas é também um
teratogênico possível. [env8.html], [env11.html]
Apesar de conhecermos as causas de certas malformações, a maioria das anorma-
lidades congênitas ainda não estão explicadas. Por exemplo, anomalias cardíacas con-
gênitas ocorrem 1 em 200 nascimentos vivos. As causas genéticas são responsáveis
por cerca de 8% dessas anomalias cardíacas, e cerca de 2% podem ser explicadas por
teratogênicos conhecidos. Isso deixa 90% das anomalias sem explicação (O’Rahilly e
Müller, 1992). Ainda existe muita pesquisa a ser realizada e ainda não foram feitas
análises da maioria das substâncias químicas para avaliar seus efeitos teratogênicos.
Atualmente, existem mais de 50.000 substâncias químicas artificiais em uso na nossa
sociedade e entre 200 e 500 novos materiais sendo produzidos a cada ano (Johnson,
1980). O problema de analisar esses produtos químicos é de grande importância, e
protocolos padrão são caros, longos, e sujeitos a diferenças metabólicas entre espé-
cies. Ainda não existe consenso em como testar a teratogenicidade de uma substância
em embriões humanos.
Na antiga União Soviética, a prática não regulada de “uma produção industrial a
qualquer custo”, deixa uma herança de defeitos de nascimentos em elevação. Em
algumas regiões do Kazakhstan, teratogênicos como o chumbo, o mercúrio e o zinco
são encontrados em altas concentrações na água potável, nos vegetais e no ar. Nesses
lugares, quase metade das pessoas testadas apresentaram extensa quebra cromossô-
mica. Em algumas áreas, a incidência de defeitos de nascimento dobrou desde 1980
(Edwards, 1994). Apesar da constante presença de teratogênicos entre nós, os fetos
estão expostos a riscos cada vez maiores com o aparecimento anual de muitos com-
postos não testados em nosso ambiente.
& Especulações
Estrogénos Ambientais
U ma das maiores controvérsias na

toxicologia ambiental é, prova-
velmente, a questão se pestici-
das são os responsáveis pelo câncer de
cos. Críticos de pesticidas, entretanto,
alegam que ainda que esses componen-
tes se liguem fracamente ao receptor de
estrógenos, eles estão presentes no soro
do plástico polistireno e os pesquisado-
res tiveram que fazê-lo eles mesmo. Des-
cobriu-se que o composto era o p-
nonilfenol, usado para endurecer o plás-
mama, pelo declínio da contagem de es- sangüíneo 100 vezes mais do que a con- tico PVC dos encanamentos que trazem
permatozóides no homem e por malfun- centração dos estrógenos normais. Eles água e para estabilizar o plástico polisti-
ções congênitas em animais selvagens. Os também argumentam que pequenas quan- reno que contém água, leite, suco de la-
Americanos usam quase 2 bilhões de li- tidades de outros compostos ativos po- ranja e outros líquidos (Soto et al., 1991;
bras de pesticidas cada ano. Além disso, dem agir sinergisticamente para estimu- Colburn et al., 1996). Esse composto é
alguns resíduos de pesticidas permanecem lar a atividade estrogênica normalmente também o produto de degradação de de-
na cadeia alimentar durante décadas. O fraca dessas moléculas (veja Hansen e tergentes e produtos de limpeza caseira.
DDT foi banido nos Estados Unidos em Jansen, 1994; Stone, 1994). Arnold e co- Um composto relacionado, 4-tert-pentil-
1972 mas sua meia-vida ambiental é de legas (1996), por exemplo, mostraram que fenol, tem um potente efeito estrogênico
100 anos (Nature, 1995). Evidência recente a combinação de dois fracos estrógenos em células humanas cultivadas e pode
mostrou que o DDT [dicloro-difenil- ambientais produz um efeito 1000 vezes fazer com que carpas machos (Cyprinus
tricloroetano] e seu principal produto me- mais forte do que cada composto sozi- carpis) desenvolvam ovidutos, tecido
tabólico, DDE (que não tem um dos áto- nho. Um trabalho recente de Kelce e co- ovariano e oócitos (Gimeno et al., 1996).
mos de cloro), podem agir como compos- legas (1995) sugere que o modo de ope- Alguns outros estrógenos ambientais
tos estrogênicos, mimetizando o hormô- ração crítico pode não ser o efeito fraca- são os bifenis policlorinados (PCBs). Es-
nio sexual feminino estrogéno, ou inibin- mente estrogênico do DDT, mas o poten- ses compostos eram muito usados como
do a eficiência de androgênios (Davis et te efeito antitestosterona de seu metabó- refrigeradores até serem banidos, na dé-
al., 1993; Kelce et al., 1995). Esses com- lito, DDE. O DDE é capaz de inibir a trans- cada de 1970, como causadores de cân-
postos foram associados a problemas am- crição responsiva a androgênios em do- cer em ratos. Entretanto, eles permane-
bientais como o decréscimo na popula- ses comparáveis àquelas encontradas em cem na cadeia alimentar e têm sido res-
ção de crocodilos na Flórida, a feminiza- solos contaminados nos Estados Unidos ponsabilizados pelo declínio generali-
ção de peixes no Lago Superior, o aumen- e outros países. zado da capacidade reprodutiva de lon-
to de câncer de mama, e o declínio mundi- Alguns compostos estrogênicos po- tras, focas, visões e peixes. Os PCBs se
al nas contagens de espermatozóide hu- dem estar no nosso alimento ou na sua assemelham ao dietil-estilbesterol (DES)
mano (Carlsen et al., 1992; Keiding e embalagem, pois compostos químicos na forma, e eles podem afetar o receptor
Skakkebaek, 1993; Stone, 1994). Guillette usados para estabilizar plásticos foram, de estrógenos como o faz o DES, talvez
e colaboradores (1994) associaram uma em alguns casos, demonstrados como esse ligando a outro sítio do receptor es-
contaminação de DDT no lago Apopka na trogênicos. A descoberta desse efeito dos trogênico. A estrutura desses compos-
Flórida a um declínio em 90% no índice de estabilizadores de plásticos foi feita de tos se parece com a estrutura dos hormô-
nascimentos de crocodilos e ao tamanho maneira preocupante. Pesquisadores da nios da tireóide (Figura 21.27). Hormô-
reduzido do pênis em machos jovens. Tufts University Medical School estuda- nios da tireóide são críticos para o cres-
Dioxina, outro ingrediente de pesticidas, vam células tumorais responsivas a cimento da cóclea do ouvido interno, e
foi relacionado com câncer; e os descen- estrógenos. Essas células requerem o ratos cujas mães foram expostas a PCBs
dentes machos de ratas prenhes expostas à estrógeno para proliferar. Os experimen- mostravam cócleas mal desenvolvidas e
dioxina têm contagem de espermatozóide tos foram bem até 1987 quando algo defeitos de audição (Goldey e Crofton
mais baixa, testículos menores e menos aconteceu. As células controle estavam em Stone, 1995). [env9.html]
comportamentos específicos de machos. crescendo tão bem como as tratadas com No norte dos Estados Unidos e sul do
Alguns cientistas, entretanto, consi- estrógenos. Parecia que o meio havia sido Canadá está havendo um dramático au-
deram exageradas essas afirmações. Ape- contaminado por estrógenos. Qual seria mento no número de rãs com deforma-
sar de pesticidas poderem mimetizar os a fonte de contaminação? Após quatro ções desenvolvimentais no que parecem
estrógenos, só o fazem em grandes quan- meses de testes com todos os componen- ser puras lagoas de florestas. As princi-
tidades e se ligam ao receptor de estróge- tes de seu sistema experimental, os pes- pais anormalidades são membros extras
no 1000 vezes mais fracamente do que quisadores descobriram que a fonte de e malformados. Não se conhece a causa
os estrógenos normais. Outro argumento estrógeno era os tubos plásticos que con- desses distúrbios, mas a especulação (veja
é que alguns componentes de pesticidas tinham a água e o soro. A companhia que Hilleman, 1996) é que pesticidas (pulve-
têm fracos efeitos anti-estrogênicos, que produziu os tubos se recusou a identifi- rizados para o controle de mosquitos e
cancelariam os fracos efeitos estrogêni- car seu novo processo de estabilização carrapatos) estejam ativando os recepto-
Estradiol-17β Dietilestilbesterol Figura 21.27

Estruturas de hormônios e compostos que pro-
vocam distúrbios em hormônios.
res de ácido retinóico e reespecificando

tecidos como membros.
É difícil documentar os efeitos dos
Bisfenol-A o,p’-DDT
compostos ambientais no homem, e ain-
da mais difícil determinar os efeitos de
“cocktails” consistindo de diferentes
compostos ingeridos em tempos diferen-
tes. Ainda é necessário um grande volu-
me de pesquisa na bioquímica desses
compostos, seus efeitos no desenvolvi-
mento e a epidemiologia das anormali-
dades do desenvolvimento. No momen-
Tiroxina Estrutura PCB to, a evidência proveniente de estudos
com animais sugere que o homem e as
populações de animais silvestres estão
ameaçados por esses moduladores hor-
monais, mas não estão disponíveis todos
os dados necessários. [env10.html]
Interações genética-ambiental
A observação de que uma substância pode ser teratogênica em uma espécie mas não
em outra, sugere fortemente que existe um componente genético para que uma subs-
tância possa ou não produzir modificações no desenvolvimento normal. Evidência
recente sugere que diferentes alelos na população humana podem influenciar se uma
substância é benigna ou perigosa para o feto. Por exemplo, existe na população em
geral, um pequeno risco de que o fumo intenso pela mãe cause malformações faciais
no seu feto. Entretanto, se o feto possui um determinado alelo (A2) do gene para o
fator de crescimento TGF-α, a fumaça absorvida através da placenta pode aumentar
de dez vezes o risco de lábio e pálato fissurados (Shaw et al., 1996). Analogamente,
diferentes alelos codificando a enzima álcool desidrogenase-2 têm diferentes habilida-
des de degradar o etanol. Se o alto consumo de álcool pela mãe leva à uma síndrome
alcoólica fetal ou a um efeito alcoólico fetal dependerá do tipo de isozimas de álcool
desidrogenase presentes na mãe e no feto (McCarver-May, 1996). Portanto, se um
composto é “teratogênico” depende de muitos fatores, incluindo os genes do indiví-
duo a ele exposto.
Resumo
Freqüentemente, o desenvolvimento ocorre em um meio ambiente rico, e a maio-
ria dos animais é sensível às sugestões do ambiente. O ambiente pode determinar o
fenótipo sexual, pode induzir incríveis adaptações químicas e estruturais de acordo
com a estação, pode induzir determinadas modificações morfológicas que permitem
que o indivíduo escape à predação e pode induzir a determinação de castas nos insetos.
O ambiente também pode alterar a estrutura de nossos neurônios e a especificidade de
nossas células imunocompetentes. Infelizmente, o ambiente também pode ser a fonte de
compostos químicos que prejudicam processos normais de desenvolvimento.
Enquanto o desenvolvimento ocorre normalmente em um ambiente natural com-
plexo, ele pode ser facilmente estudado no laboratório. Na verdade, nossos “sistemas
modelo” são animais facilmente domesticados, cujo desenvolvimento é pouco afeta-
do por fatores ambientais (Bolker, 1995). Entretanto, ao conhecermos a complexida-
de do desenvolvimento, compreendemos que esse é criticamente ligado ao ambiente.
É necessária uma comunidade para desenvolver um embrião. A exploração de como
o ambiente regula o desenvolvimento está apenas começando.
LITERATURA CITADA
Abel, E. L. and Sokol, R. J. 1987. Incidence of Bolker, J. A. 1995. Model systems in develop- Carlsen, E., Giwercman, A., Keiding, N. and
fetal alcohol syndrome and economic impact of mental biology. BioEssays 17: 451-455. Skakkeback, N. E. 1992. Evidence for decreasing
FAS-related anomalies. Drug AIcohol Depend. quality of semen during past 50 years. Brit. Med.
Born, C. 1881. Experimentelle Untersuchungen
19: 51-70. J. 305: 609-613.
über die Entstehung der Geschlechtsunterschiede,
Adler, F. R. and HarvelI, C. D. 1990. Inclucible Jahres-Bericht d. SchIeischen Gesell f. väterländ, Charnov, E. L. and Bull, J. J. 1977. When is sex
defenses, phenotypic variability, and biotic Culture 21 jan. pp. 2-23. environmentally determined? Nature 266: 828-830.
environments. Trends Ecol. Evol. 5: 407-410.
Born, G. 1884. Über die Einflussder Schwere uaf Clarren, S. K. 1986. Neuropathology in the fetal
Alvarez-Buylla, A., Kirn, J. R. and Nottebohm, die Froschie. Verh. Med Sect Schles. Gessell. . alcohol syndrome. In J. R. West (ed.), Alcohol
F. 1990. Birth of projection neurons in adult väterländ. Culture 4 April 1884. and Brain Development. Oxford University
avian brain may be related to perceptual or Press, New York.
Borovsk, D., Carlson, D. A., Griffin, P. R.,
motor learning. Science 249: 1444-1446.
Shabanowitz, J. and Hunt, D. F. 1990. Mosquito Cohen, C. S. and Strathmann, R. R. 1996. Em-
Antonini, A. and Stryker, M. P. 1993. Rapid oostatic factor: A novel decapeptide modulating bryos at the edge of tolerance: Effects of envi-
remodeling of axonal arbors in the visual cortex. trypsin-like enzyme biosynthesis in the midgut. ronment and structure of egg masses on supply
Science 260: 1818-1821. FASEB J. 4: 3015-3020. of oxygen to embryos. Biol. Bull. 190: 8-15.
Arnold, S. F., Klotz, D. M. Collins, B. M., Vonier, Boué, A., Boué, J. and Cropp, A. 1985. Cohlan, S. Q. 1953. Excessive intake of vitamin
P. M., Guilllete, L. J. Jr. and McLachlan, J. A. Cytogenetics of pregnancy wastage. Adv. Hum. A as a cause of congenital anomalies in the rat.
1996. Synergistic activation of estrogen recep- Genet. 14:1-57. Science 117: 535-537.
tor with combinations of environmental
Brakefield, P. M. and Reitsma, N. 1991. Phenotypic Colburn, T., Dumanoski, D., and Myers, J. P.
chemicals. Science 272: 1489-1492.
plasticity, seasonal climate, and the population 1996. Our Stolen Future. Dutton, New York.
Bachmann, M. D., Carlton, R. G., Burkholder, J. biology of Bicyclus butterflies (Satyridae) in
Colello, R. J. and Guillery, R. W. 1990. The
M. and Wetzel, R. G. 1986. Symbiosis between Malawi. Ecol. Entomol. 16:291-303.
early development of retinal ganglion cells with
salamander eggs and green algae: Microelectrode
measurements inside eggs demonstrate effects Brakefield, P. M. and seven others. 1996. Deve- uncrossed axons in the mouse: retinal position
lopment, plasticity, and evolution of butterfly and axon course. Development 108: 515-523.
of photosynthesis on oxygen concentrations.
eyespot patterns. Nature 384: 236-242.
Can. Zool. 64: 1586-1588. Colman, H., Nabekura, J. and Lichtman, J. W.
Baxter, G. T. and Morse, D. E. 1992. Cilia from Brian, M. V. 1974. Caste differentiation in 1997. Alterations in synaptic strength preceding
Myrmica rubra: The role of hormones. J. Insect axon withdrawal. Science 275: 356-361
abalone larvae contain a receptor-dependent G-
Physiol. 20: 1351-1365.
protein transduction system similar to that in Conover, D. O. and Heins, S. W. 1987. Adaptive
mammals. Biol. Bull. 183: 147-154. Brian, M. V. 1980. Social control over sex and variation in environmental and genetic sex de-
caste in bees, wasps and ants. Biol. Rev. 55: termination in a fish. Nature 326: 496-498.
Beck, S. D. 1980. Insect Photoperiodism. 2nd
379-415.
ed. Academic Press, NY. Creech Kraft, J, 1992. Pharmacokinetics,
Brönmark, C. and Pettersson, L. 1994. Chemical placental transfer, and teratogencity of 13cis
Begon, M., Harper, J. L. and Townsend, C. R.
cues from piscivores induce a change in retinoic acid, its isomer and metabolites. In G.
1986. Ecology: Individuals, Populations, and
morphology in crucian carp. Oikos 70: 396-402. M. Morriss-Kay (ed.), Retinoids in Normal De-
Communities. Blackwell Scientific, Oxford.
velopment and Teratogenesis. Oxford Universi-
Bry, L., Falk, P. G., Midtvedt, T. and Gordon, J.
Binns, W., James, L. F. and Shupe, J. L. 1964. ty Press, Oxford, pp. 267-280.
I, 1996. A model of host-microbial interactions
Toxicosis of Veratrum californicum in ewes and
its relationship to a congenital deformity in in an open mammalian ecosystem. Science 273: Danilevskii, A. S. 1965. Photoperiodism and
1380-1383. Seasonal Development of Insects. Oliver and
lambs. Ann. N.Y. Acad. Sci. 111: 571-576.
Boyd, Edinburgh.
Bull, J. J. 1980. Sex determination in reptiles.
Black, J. E., Issacs, K. R. anderson, B. J. Alcantara,
A. A. and Greenough, W. T. 1990. Learning cau- Q. Rev. Biol. 55: 3-21. Davis, D. L., Bradlow, H. L., Wolff, M., Woodruff,
T., Hoel, D. G. and Anton-Culver, H. 1993.
ses synaptogenesis, whereas motor activity cau- Burnett, F. M. 1959. The Clonal Selection Theory
Xenoestrogens as preventable causes of breast
ses angiogenesis, in cerebellar cortex of adult rats. of Immunity. Vanderbilt University Press,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5568-5572. cancer. Environ. Health Perspect. 101: 372-377.
Nashville.
Davis, W. L., Crawford, L. A., Cooper, O. J., Giroud, A. and Martinet, M. 1959. Teratogenese reference to the organs controlling determina-
Farmer, G. R., Thomas, D. and Freeman, B. L. pur hypervitaminose A chez le rat, la souris, le tion of voltinism. J. Fac. Agric. Tottori Univ. 1:
1990. Ethanol induces the generation of reactive cobaye, et le lapin. Arch. Fr. Pediatr. 16: 971-980. 83-124.
free radicaIs by neural crest celIs in culture. J.
Gotthard, K. and Nylin, S. 1995. Adaptive Herbst, C. 1893. Experimentelle Untersuchun-
Craniofac. Genet. Dev. Biol. 10: 277-293.
plasticity and plasticity as an adaptation: A gen über den Einfluss der veränderten chemischen
Degnan, B. M. and Morse, D. E. 1995. Deve- selective review of plasticity in animal Zusammensetzung des umgebenden Mediums auf
lopmental and morphogenetic gene regulation morphology and life history. Oikos 74: 3-17. die Entwicklung der Thiere. II. Wierteres über
in Haliotis rufescens larvae at metamorphosis. die morphologische Wirkung der Lithiumasalze
Goulding, E. H. and Pratt, R. M. 1986.
Amer. Zool. 35: 391-398. und ihre theoretische Bedeutung. Mitt. d. zool.
Isotretinoin teratogenicity in mouse whole
Station Neapel. 11: 136-220.
Denno, R. F., Douglass, L. W. and Jacobs, D. embryo culture. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol.
1985. Crowding and host plant nutrition: envi- 6: 99-112. Hertwig, O. 1894. The Biological Problem of
ronmental determinants of wing form in To-day: Preformed or Epigenesis (P. C. Mitchell,
Greene, E. 1989. A diet-induced developmen-
Prokelisia marginata. Ecology 66: 1588-1596. translator). Macmillan, New York.
tal polymorphism in a caterpillar. Science 243:
Dodson, S. 1989. Predator-induced reaction 643-646. Hilleman, B. 1996. Frog deformities pose a
norms. BioScience 39: 447-452. mystery. Chem. Engin. News 74:24.
Gregg, N. M. 1941. Congenital cataract following
Dorris, M. 1989. The Broken Cord. Harper and German measles in the mother. Trans. Opthalmol. Hoffmann, R. J. 1973. Environmental control
Row, New York. Soc. Aust. 3: 35. of seasonal variation in the butterfly Colias
eurytheme I. Adaptive aspects of a photoperio-
Edmonds, D. K., Lindsay, K. S., Miller, J. F., Guillette, L. J., Gross, T. S., Masson, G. R.,
dic response. Evolution 27: 387-397.
Williamson, E. and Wood, P. J. 1982. Early Matter, J. M., Percival, H. F. and Woodward,
embryonic mortality in wornen. Fertil. Steril. A. R. 1994. Developrnental abnormalities of Holmes, L. B. 1979. Radiation. In V. C. Vaughan,
38: 447-453. the gonad and abnormal sex hormone concen- R. J. McKay and R. D. Behrman (eds.), Nelson
trations in juvenile alligators from contamina- Textbook of Pediatrics, 11th Ed. Saunders,
Edwards, M. 1994. Pollution in the former
ted and control lakes in Florida. Environ. Health Philadelphia.
Soviet Union: Lethal legacy. Natl. Geog. 186
Perspect. 102: 680-688.
(2): 70-115. Hubel, D. H. 1967. Effects of distortion of
Hadfield, M. G. 1977. Metamorphosis in marine sensory input on the visual system of kittens.
Fallon, A. M., Hagedorn, H. H., Wyatt, G. R. and
molluscan larvae: An analysis of stimulus and Physiologist 10: 17-45.
Laufer, H. 1974. Activation of vitellogenin
response. In R.-S. Chia and M. E. Rice (eds.),
synthesis in the mosquito Aedes aegypti by Hubel, D. H. and Wiesel, T. N. 1962. Receptive
Settlement and Metamorphosis of Marine
ecdysone. J. Insect Physiol. 26: 829-1823. fieIds, binocular interaction and functional
Invertebrate Larvae. Elsevier, New York, pp.
architecture in the cat’s visual cortex. J. Physiol.
Ferguson, M. W. J. and Joanen, T. 1982. 165-175.
160:106-154.
Temperature of egg incubation determines sex
Haeckel, E. 1891. Quoted in Nyhart, L., 1995.
in Alligator mississippiensis. Nature 296: Hubel, D. H. and Wiesel, T. N. 1963. Receptive
850-853 Hagedorn, H. H. 1983. The role of ecdysteroids fields of celIs in striate cortex of very young,
in the adult insect. In G. Downer and H. Laufer visually inexperienced kittens. J. Neurophysiol.
Franco, B. and twelve others, 1995. A cluster of
(eds.), Endocrinology of Insects. Alan R. Liss, 26: 944-1002.
sulfatase genes on Xp22.3 mutations in chon-
drodysplasia punctata (CDPX) and implications Jaffe, L. A. 1980. Electrical polyspermy block
for warfarin embryopathy. Cell 81: 15-21. Hansen, L. G. and Jansen, H. T. 1994. Environ- in sea urchins: Nicotine and low sodium
mental estrogens (Letter to editor in response experiments. Dev. Crowth Differ. 22: 503-507.
Friedman, J. M. 1992. Effects of drugs and other
to Stone, 1994). Science 266: 526.
chemicaIs on fetal growth. Crowth Genet. Horm. Janzen, F. J. and Paukstis, G. L. 1991. Environ-
8(4): 1-5. Hansen, R. A., Hart, D. D. and Merz, R. A. 1991. mental sex determination in reptiles: Ecology,
Flow mediates predator-prey interaction between evolution, and experimental design. Q. Rev. Biol.
Fukuda, S. 1952. Function of the pupal brain
triclad flatworms and larval blackflies. Oikos 60: 66:149-179.
and subesophageal ganglion in the production of
187-196.
non-diapause and diapause eggs in the silkworm. Johnson, E. M. 1980. Screening for teratogenic
Annot. Zool. Japan 25: 149-155. Hardie, J. 1981. Juvenile hormone and photo- potential: Are we asking the proper questions?
periodically controlled polymorphism in Aphis Teratology 21: 259.
Geitz, H., Handt, S. and Zwingenberger, K. 1996.
fabae: Postnatal effects on presumptive
Thalidornide selectively modulates Johnston, M. C., Sulik, K. K., Webster, W. S.
gynoparae. J. Insect Physiol. 27: 347-355.
and Jarvis, B. L. 1985. Isotretinoin embryopa-
the density of cell surface molecules involved in
Hardie, J. and Lees, A. D. 1985. Endocrine thy in a mouse model: Cranial neural crest in-
the adhesion cascade. Immunopharmacology
control of polymorphism and poly volvement. Teratology 31: 26A.
31: 213-221.
phenism. In G. A. Kerkut and L. I. Gilbert (eds.), Jones, K. L. and Smith, D. W. 1973. Recognition
Gilbert, S. F. 1994. Dobzhansky, Waddington
Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry, of the fetal alcohol syndrome. Lancet 2:999-1001
and Schmalhausen: Embryology and the Modern
and Pharmacology. Vol. 8, pp. 441-490.
Synthesis. In M. B. Adams (ed.), The Evolution Keiding, N and Skakkebaek, N. E. 1993. Are
of Theodosius Dobzhansky: Essays on His Life Hart, M. W. and Strathmann, R. R. 1994. estrogens involved in falling sperm counts and
and Thought in Russia and America. Princeton Functional consequences of phenotypic disorders of the male reproductive tract? Lancet
University Press, Princeton, pp. 143-154. plasticity in echinoid larvae. Biol. Bull. 186: 341: 1392-1395.
291-299.
Gimeno, S., Gerritsen, A., Bowmer, T. and Kelce, W. R., Stone, C. R., Laws, S. C., Gray, L. E.,
Komen, H. 1996. Feminization of male carp. Hasegawa, K. 1952. Studies on voltinism of the Kemppainen, J. A. and Wilson, E. M. 1995. Persis-
Nature 384: 221-222. silkworm, Bombyx mori L., with special tent DDT metabolite p,p’-DDE is a potent androgen
receptor antagonist. Nature 375: 581-585.
Kennedy, C., Suda, S., Smith, C. B., Miyaoka, Abstracts of the Ninth International Congress of born during song learning in zebra finches. Nature
M., Ito, M. and SokoIoff, L. 1981. Changes in Human Genetics Brazil J. Genet. 19: 73. 334: 149-151.
protein synthesis underlying functional plasticity
McCollum, S. A. and Van Buskirk, J. 1996. Costs Nowack, E. 1965. Die sensible Phase bei der
in immature monkey visual system. Proc. Natl.
and benefits of a predator induced polyphenism Thalidomide-Embryopathie. Humangenetik 1:
Acad. Sci USA 78: 3950-3953.
on the gray treefrog Hyla chrysoscelis. Evolution 516-536.
Kitazawa, T., Kanda, T. and Takami, T. 1963. 50: 583-593.
Nulman, I. and eight others. 1997. Neurodeve-
Changes of mitotic activity in the silkworm egg
McCredie, J. 1976a. Neural crest defects: A lopment of children exposed in utero to antide-
in relation to diapause. BuIl. Seric. Exp. Sta.
neuroanatomic basis for classification of multiple pressant drugs. N. Engl. J. Med. 336: 258-262.
18:283-295.
malformations related to phocomelia. J. Neurol.
Nyhart, L. K. 1995. Biology Takes Form: Animal
Koch, P. B. anel Buchmann, D. 1987. Hormonal Sci. 28: 373-387.
Morphology and the German Universities, 1800-
control of seasonal morphs by the timing of
McCredie, J. 1976b. The pathogenesis of 1900. University of Chicago Press, Chicago.
ecdysteroid release in Araschnia levana
congenital malformations. Australas. Radiol.
(Nymphalidae: Lepidoptera). J. Insect Physiol. O’Rahilly, R. and MüIler, F. 1992. Human Em-
19:348-355.
36: 159-164. bryology and Teratology. Wiley-Liss, New York.
McKeown, T. 1976. Human malforrriations: An
Kochhar, D. M., Penner, J. D. and Tellone, C. I. Opitz, J. M. and Paul, N. W. (eds.) 1993. Blasto-
introduction. Br. Med. BuIl. 32:1-3.
1984. Comparative teratogenic activities of two genesis: Normal and Abnormal, March of Dimes
retinoids: Effects on palate and limb development. McFall-Ngai, M. J. and Ruby, E. G. 1991. Birth Defects Foundation Original Article Series.
Teratogen. Carcinogen. Mutagen. 4:377-387. Symbiont recognition anel subsequent morpho- Wiley-Liss, New York.
genesis as early events in an animalbacterial
Kotch, L. E., Chen, S-Y. and Sulik, K. K. 1995. Palmer, A. R. 1985. Adaptive value of shell
mutualism. Science 254: 1491-1494.
Ethanol-induced teratogenesis: free radical variation in Thais lamellosa: Effect of thick
damage as a possible mechanism. Teratology 52: Montgomery, M. K. and McFaIl-Ngai, M. J. shells on vulnerability to and preference by crabs.
128-136. 1995. The inductive role of bacterial symbionts Veliger 27: 349-356.
in the morphogenesis of a squid light organ. Amer.
Kulikauskas, V., Blaustein, A. B. anel Ablin, R. J. Passera, L. 1985. Soldier determination in ants of
Zool. 35: 372-380.
1985. Cigarette smoking and its possible effects the genus Pheidole. In J. A. L. Watson B. M Okot-
on sperm. Fertil. Steril. 44: 526-528. Morgan, T. H. 1909. Sex determination and Kotber and C. Noirot, (eds.) Caste Determination
parthenogenesis in phylloxerans and aphids. in Social Insects. Pergmon, Oxford, pp. 331-346.
Lammer, E. J. and eleven others. 1985. Retinoic
Science 29: 234-237,
acid embryopathy. N. Engl. J. Med. 313: 837- Pener, M. P. 1991. Locust phase polymorphism
841. Moroni, M. C., Vigano, M. A. and Mavilio, F. and its endocrine relations. Adv. Insect Physiol.
1994. Regulation of human Hoxd-4 gene by 3: 1-79.
Lash, J. W. 1963. Studies on the ability of
retinoids. Mech. Dev. 44: 139-154.
embryonic mesonephros explants to form Pflüger, E. 1883. Über den Einfluss der
cartilage. Dev. Biol. 6: 219-232. Morriss-Kay, G. 1993. Retinoic acid and Schwerkraft auf die Theilung der Zellen. I, II III.
craniofacial development: Molecules and mor- Pflüger’s Arch. 32.
Lash, J. W. and Saxén, L. 1972. Human
phogenesis. BioEssays 15: 9-15.
teratogenesis: In vitro studies of thalidomidei- Pinder, A. W. and Friet, S. C. 1994. Oxygen
nhibited chondrogenesis. Dev. Biol. 28: 61-70. Morse, A. N. C., Froyd, C. A. and Morse, D. E. transport in egg masses of the amphibians Rana
1984. Molecules trem cyanobacteria and red sylvatica and Anibystoma maculatum: Convec-
Lemoine, E. M., Harousseau, J. P., Borteyru, J.
algae that induce larval settlement and meta- tion, diffusion, and oxygen production by algae.
P. and Menuet, J. C. 1968. Les enfants de parents
morphosis in the mollusc Haliotis rufescens. J. Exp. Biol. 197: 17-30.
alcoholiques: Anomalies observées Oest. Med.
Marine Biol. 81: 293-298.
21: 476-482. Plowright, R. C. and Pendrel, B. A. 1977. Larval
Nature Genetics (editorial). 1995. Risk assess- growth in bumble-bees. Can. Entomol. 109:
Lenz, W. 1962. Thalidomide and congenital
ment and religion. Nat. Genet. 11: 105-106. 967-973.
abnormalities. Lancet 1: 45. (First reported at a
1961 symposium.) Neubert, R., Hinz, N., Thiel, R. and Neubert, D. Purves, D. and Lichtman, J. W. 1985. Principles
1995. Down-regulation of adhesion receptors of Neural Development. Sinauer Associates,
Lenz, W. 1966. Malformations caused by drugs
on cells of primate embryos as a probable me- Sunderland, MA.
in pregnancy. Am. J. Dis. Child. 112: 99-106.
chanism of the teratogenic action of thalidomi-
Pöpperl, H. and Featherstone, M. S. 1993.
Linney, E. 1992. Retinoic acid receptors: trans- de. Life Sci. 58: 295-316.
Identification of retinoic acid response element
cription factors modulating gene expression,
Newman, R. A. 1989. Developmental plasticity upstream from the mouse Hox-4.2 gene. Mol.
developrnent, and differentiation. Curr. Top. Dev.
of Scaphiopus couchii tadpoles in an unpredic- Cell. Biol. 13: 257-265.
Biol. 27:309-350.
table environment. Ecology 70: 1775-1787.
Raatikainen, M. 1967. Bionomics, enemies, and
McBride, W. G. 1961. Thalidomide and
Newman, R. A. 1992. Adaptive plasticity in am- population dynamics of Javesella pellucida (F.)
congenital abnormalities. Lancet 2: 1358.
phibian metamorphosis. BioScience 42: 671-678. (Homoptera, Delphaidae). Annales Agric.
McBride, W. G. and Vardy, P. H. 1983. Fenniae 6: 1-49.
Nijhout, H. F. 1991. The Development and
Pathogenesis of thalidomide teratogenesis in the
Evolution of Butterfly Wing Patterns. Smith Rachinsky, A. and Hartfelder, K. 1990. Corpora
marmot (Callithrix jacchus): Evidence sugges-
allata activity, a prime regulating element for
ting a possible trophic influence of cholinergic sonian Institution Press, Washington, D. C.
caste-specific juvenile hormone titre in honey
nerves in limb morphogenesis. Dev. Growth
Nijhout, H. F. 1994. Insect Hormones. Princeton bee larvae (Apis mellifera carnica). J. Insect
Differ. 25: 361-373.
University Press, Princeton. Physiol. 36: 329-349.
McCarver-May, D. G. 1996. Genetic differences
Nordeen, K. W. and Nordeen, E. J. 1988. Ramanathan, R., Wilkemeyer, M. F., Mittel, B.,
in alcohol dehydrogenase and fetal alcohol effects.
Projection neurons within a vocal pathway are Perides, G. and Charness, M. E. 1996. Alcohol
inhibits cell-cell adhesion mediated by human Stearns, S. C., de Jong, G. and Newman, R. A. 1991. Sherman and J. Alcock, (eds), Exploring Animal
L1. J. Cell Biol. 133: 381-390. The effects of phenotypic plasticity on genetic Behavior. Sinauer Associates, Sunderland, MA,
correlations. Trends Ecol. Evol. 6: 122-126. pp. 188-196.
Reiter, H. O. and Stryker, M. P. 1988. Neural
plasticity without postsynaptic action potentials: Stent, G. S, 1973. A physiologícal mechanism Watt, W. B. 1968. Adaptive significance of
Less-active inputs become dominant when kitten for Hebb’s postulate of learning. Proc. Natl. pigment polymorphism in Colias butterflies, I.
visual cortical cells are phamacologically inhibited. Acad. Sci. USA 70: 997-1001. Variation of melanin in relation to thermoregu-
Proc. Natl. Acad, Sci. USA 85: 3623-3627. lation. Evolution 22: 437-458.
Stone, R. 1994. Environmenta1 estrogens stir
Rothman, K. J., Moore, L. L., Singer, M. R., debate. Scíence 265: 308-310. Watt, W. B. 1969. Adaptive significance of
Nguyen, U. -S. D. T., Mannino, S. and Milunsky, pigment polymorphism in Colias butterflies, II.
Stone, R. 1995. Environmental toxicants under
A. 1995. Teratogenicity of high vitamin A Thermoregulation and periodically controlled
scrutiny at Baltimore meeting. Science 267:
intake. N. Engl. J. Med. 333: 1369-1373. melanin production in Colias eurytheme. Proc.
1770-1771.
Natl. Acad. Sci. LISA 63: 767-774.
Ruberte, E., Dollé, P., Krust, A., Zalent, A.,
Strathmann, R. R. and Strathmann, M. F. 1995.
Morriss-Kay, G. and Chambon, P. 1990. Specific Weele, C. van der, 1995. Images of Develop-
Oxygen supply and limits on aggregation of
spatia1 and temporal distribution of retinoic acid ment: Environmental Causes in Outogeny.
embryos. J. Mar. Biol. Assoc. U. K. 75: 413-428.
receptor g transcripts during mouse embryoge- Elinkwijk, Utrecht.
nesis. Development 108:213-222. Strathmann, R. R., Fenaux, L. and Strathmann,
Weismann, A. 1875. “Über den Saison-Dimor-
M. F. 1992. Heterochronic developmental
Ruberte, E. and seven others. 1991. Retinoic phismus der Schmetterlinge. In Studien zur
plasticity in larval sea urchins and its implication
acid receptors in the embryo. Semin. Dev. Biol. Descendenz-Theorie. Engelmann, Leipzig.
for evolution on nonfeeding larvae. Evolution
2:153-159.
46: 972-986. Wheeler, D. 1986. Developmental and physio-
Sander, K. 1968. Entwick1ungsphysiologische logical determinants of caste in social hyme-
Streissguth, A. P. and LaDue, R. A. 1987. Fetal
Untersuchungen am embryonalen Mycetom von noptera: Evolutionary implications. Am. Nat.
alcohol: Teratogenic causes of developmental
Euscelis plebejus F. (Hornoptera, Ciciadina). I. 128: 13-34.
disabilities. In S. R. Schroeder (ed.), Toxic
Dev. Biol. 17:16-38.
Substances and Mental Retardation, American Wheeler, D. 1991. The developmental basis of
Sapp, J. 1994. Evolution by Association: A History Association of Mental Deficiency, Washington, worker caste polymorphism in ants. Amer. Nat.
of Symbiosis. Oxford University PTess, NY. DC, pp. 1-32. 138: 1218-1238.
Schmalhausen, I. I. 1949. Factors of Evolution: Studer M., Popperl, H., Marshall, H., Kuroiwa, Wiesel, T. N. 1992. Postnatal developrnent of
The Theory of Stabilizing Selection. University A. and Krumlauf, R. 1994. Role of a conserved the visual cortex and the influence of environr-
of Chicago Press, Chicago. retinoic acid response element in rhombomere nent. Nature 299: 583-591.
restriction of Hoxb-1. Science 265: 1728-1732.
SchwernmIer, W. 1974. Endosymbionts: factors of Wirtz, P. 1973. Differentiation in the honeybee
egg patterning. J. Insect Physiol. 20: 1467-1474. Sulik, K, K., Cook, C. S. and Webster, W. S. larva. Meded. Landb. Hogesch. Wagningen. 73-
1988. Teratogens and craniofacial malformati- 75, 1-66.
Schwemmler, W. 1989. Insect symbiosis as a model
ons: relationships to cell death. Development
system for egg cell differentiation. In W. Wolpert, L. 1991. The Triuniph of the Embryo.
103 (Suppl.): 213-231.
Schwemmler and G. Gassner, eds. Insect Endosym- Oxford University Press. Oxford.
biosis, CRC Press, Boca Raton, pp. 37-53. Tauber, M. J., Tauber, C. A. and Masaki, S. 1986.
Woltereck, R. 1909. Weitere experimentelle
Seasonal Adaptations of Insects. Oxford Uni-
Selenka, E. 1876. Zur Entwick1ung der Untersuchungen über Artveränderung, speziell
versity Press, Oxford.
Holothurien: Ein Beitrage zur Keimblättertheo- über das Wesen quantitativer Artunderscheide bei
rie. Zeitschr. wissensch. Zool. 27: 155-178. Toms, D. A. 1962. Thalidomide and congenital Daphniden. Versuch. Deutsch. Zool. Ges. 1909:
abnormalities. Lancet 2: 400. 110-172.
Shapiro, A. M. 1968. Photoperiodic induetion
of vernal phenotype in Pieris protodice Boisdu- Turner, A. M. and Greenough, W. T. 1983. Woodward, D. E. and Murray, J. D. 1993. On the
val and Le Conta (Lepidoptera: Pieridae). Synapses per neuron and synaptic dimensions in effect of temperature-dependent sex determina-
Wasmann J. Biol. 26: 137-149. occipital cortex of rats reared in complex, soci- tion on sex ratio and survivorship in crocodilians.
al, or isolation housing. Acta Stereolegica 2 Proc. R. Soc. Loud. [B] 252: 149-155.
Shapiro, A. M. 1976. Seasonal polyphenism.
(Supp1. 1): 239-244.
Evol. Biol. 9: 259-333. Yu, V. C. and nine others. 1991. RXRb: A
Via, S., Comulkiewicz, R., De Jong, G., Scheiner, coregulator that enhances binding of retinoic
Shapiro, A. M. 1978. The evolutionary
S. M., Schlichting, C. D. and Van Tienderen, P. acid, thyroid hormone, and vitamin D receptors
significance of redundancy and variability in
H. 1995. Adaptive phenotypic plasticity: to their cognate response elements. Cell 67:
phenotypic induction mechanisms of pierid
Consensus and controversy. Trends Ecol. Evol. 1251-1266.
butterflies (Lepídoptera). Psyche 85: 275-283.
10: 212-217.
Shaw, G. M., Wasserman, C. R., Lammer, E. J.,
Voet, D. and Voet, J. G. 1995. Biochemistry I,
O’Malley, C. D., Murray, J. C., Basart, A. M. and
2nd ed. John Wiley, NY.
Tolarova, M. M. 1996. Orofacial clefts, parental
cígarette smoking, and Volpe, E. P. 1987. Developmental biology and
human concerns. Am. Zool. 27: 697-714.
transforming growth factor-alpha gene variants.
Am. J. Hum. Genet. 58: 551-561. Waddington, C. H. 1942. Canalization of deve-
lopment and the inheritance of acquired
Soto, A., Justicia, H., Wray, J. and Sonnenschein,
characteristics. Nature 150: 563-565.
C. 1991. p-nony1phenol: an estrogenic xenobi-
otic released from “modified” polystyrene. Warner, R. R. 1993. Mating behavior and
Environ. Health Perspect. 92: 167-173. hermaphrodítism in coral reef fishes. In P. W.
A saga da linhagem germinativa
22
E o fim de todo nosso explorar
Será o retorno para de onde partimos
E pela primeira vez o conhecimento do lugar.
T. S. ELIOT (1942)
C OMEÇAMOS NOSSA ANÁLISE do desenvolvimento animal discutindo a
fecundação, e iremos terminar nosso estudo sobre o desenvolvimento indi-
vidual investigando a gametogênese, os processos pelos quais são forma-
dos o espermatozóide e o óvulo. Células germinativas proporcionam a continuidade
da vida entre as gerações, e os ancestrais mitóticos de nossas próprias células
germinativas residiram uma vez nas gônadas de répteis, anfíbios, peixes e inverte-
brados. Em muitos animais, como insetos, nematelmintos e vertebrados existe uma
clara e precoce separação das células germinativas de tipos celulares somáticos. Em
vários filos animais (e no todo do reino vegetal), essa divisão não está tão bem esta-
belecida. Nessas espécies (que incluem cnidários, platelmintos e tunicados), as célu-
las somáticas podem facilmente se tornarem células germinativas mesmo em orga-
nismos adultos. Os zoóides, brotos e pólipos de muitos filos de invertebrados atestam
a capacidade das células somáticas dar origem a novos indivíduos.
Naqueles organismos nos quais existe uma linhagem germinativa estabelecida, se-
parando-se precocemente no desenvolvimento, as células germinativas não se origi-
nam de dentro da gônada propriamente. Ao contrário, seus precursores – as células
germinativas primordiais (PGCs) – migram para o interior das gônadas em desen-
volvimento. O primeiro passo na gametogênese, portanto, envolve a formação das PGCs
e sua condução para o sulco genital à medida que a gônada está se formando. A inicia-
ção da linhagem da célula germinativa (a linhagem germinativa) em anfíbios, insetos e
nematelmintos foi discutida no Capítulo 13. Reiniciamos nossa história da linhagem
germinativa com a migração das PGCs de seu local de origem para as gônadas.
Migração das células germinativas

Migração das Células Germinativas em Anfíbios
Conforme discutido no Capítulo 13, o plasma germinativo de anfíbios anuros – sapos

e rãs – se agrupa ao redor do pólo vegetal do embrião de 1 célula. Durante a clivagem,
esse material é levado para cima através do citoplasma vitelínico, e os grânulos ricos
em RNA se associam com as células endodérmicas revestindo o assoalho da blasto-
cele (Figura 22.1; Bounoure, 1934; Ressom e Dixon, 1988; Kloc et al., 1993). As
PGCs ficam concentradas na região posterior do intestino larval, e à medida que se
forma a cavidade abdominal, as PGCs do anuro emigram ao longo do lado dorsal do
843
Figura 22.1 Pólo animal

Sulco de clivagem
Alterações na posição do plasma germinativo (colorido) no
embrião precoce da rã. Originalmente localizado perto do pólo (A) (B) (C)
vegetal do ovo não-clivado (A), o plasma germinativo avança
ao longo dos sulcos de clivagem (B) até se localizar no assoalho
da blastocele (C). (Segundo Bounoure, 1934.)
Plasma
germinativo Blastocele
Pólo vegetal
intestino, primeiramente ao longo do mesentério dorsal (que conecta o intestino com

a região onde os órgãos mesodérmicos estão se formando) e em seguida ao longo da
parede abdominal e para dentro dos sulcos genitais. Elas migram para cima nesse
tecido até atingirem as gônadas em desenvolvimento (Figura 22.2). As PGCs de Xe-
nopus se movimentam extruindo um único filopódio e em seguida escorrendo seu
citoplasma vitelínico para o filopódio enquanto retraem sua cauda. Condução por
contato dessa migração parece provável pois ambas as células e a matriz extracelular
sobre a qual elas migram estão orientadas na direção dessa migração (Wylie et al.,
1979). Além disso, a adesão e a migração de PGC pode ser inibida se o mesentério
for tratado com anticorpos contra a fibronectina de Xenopus (Heasman et al., 1981).
Assim, o caminho para a migração das células germinativas nessas rãs parece ser
constituído por uma matriz extracelular contendo fibronectina orientada. As fibrilas
sobre as quais as PGCs viajam perdem essa polaridade logo após o término da migra-
ção.* Enquanto elas migram, as PGCs de Xenopus se dividem cerca de três vezes, e
aproximadamente 30 PGCs colonizam as gônadas (Whitngton e Dixon, 1975; Wylie
e Heasman, 1993). Essas irão se dividir para formar as células germinativas.
As células germinativas primordiais dos anfíbios urodelos (salamandras) têm uma
origem aparentemente diferente, que foi tracejada por experimentos de transplantes
recíprocos para as regiões do mesoderma que involuem através dos lábios ventrolaterais
do blastóporo. Além disso, não parece existir qualquer “plasma germinativo” em ovos
de salamandra. Em vez disso, a interação das células endodérmicas dorsais e as célu-
las do hemisfério animal cria as condições necessárias para formar células germinati-
vas nas áreas particulares que involuem através dos lábios ventrolaterais (Sutasurya
e Nieuwkoop, 1974). Assim em salamandras, as PGCs são formadas por indução den-
tro da região mesodérmica e presumivelmente seguem um caminho diferente para o
interior da gônada.
Migração das Células Germinativas em Mamíferos
Não existe plasma germinativo óbvio em mamíferos, e as células germinativas de

mamíferos não são morfologicamente distintas durante o desenvolvimento inicial.
Porém, usando anticorpos monoclonais que reconhecem diferenças na superfície ce-
lular entre as PGCs e suas células circunjacentes, Hahnel e Eddy (1986) mostraram que
as PGCs de camundongos residem originalmente no epiblasto do embrião em gastru-
lação. Ginsburg e seus colegas (1990) localizaram essa região no mesoderma extra-
embrionário imediatamente posterior à estria primitiva do embrião de camundongo de
Figura 22.2 sete dias. Aqui são vistas cerca de oito grandes células coradas pela fosfatase alcali-
Migração das células germinativas primordiais na. Se essa área for removida, o embrião remanescente torna-se livre de células
em uma rã. Esta fotomicrografia de contraste germinativas, enquanto o segmento isolado desenvolve um grande número de células
de fase de uma seção através da parede corpo-
primordiais. Em embriões de camundongos normais, os precursores das células
ral e mesentério dorsal de um embrião de Xe-
nopus mostra a migração de duas grandes cé-
lulas germinativas primordiais (setas) ao longo *Isso não parece necessariamente ser verdade para todos os anuros. Na rã Rana pipiens, as células
do mesentério dorsal. (de Heasman et al., 1977, germinativas seguem um caminho semelhante mas podem ser viajantes passivos ao longo do mesentério
cortesia dos autores.) em vez de células ativamente móveis (Subtelny e Penkala, 1984).
CAPÍTULO 22 A Saga da Linhagem Germinativa 845
Figura 22.3
Trajetória para a migração de células germina-
tivas primordiais de mamífero. (A) células ger-
minativas primordiais vistas no saco vitelínico
Intestino
próximas da junção do intestino posterior e da
posterior Alantóide alantóide. (B) Migração através do intestino e,
Intestino dorsalmente, acima do mesentério dorsal para
anterior Sulcos
o interior do sulco genital. (C) Quatro grandes
genitais
PGCs no intestino posterior de um embrião de
camundongo (perto da alantóide e do saco
vitelínico) se coram positivamente para altos
níveis de fosfatase alcalina. (D) Tais células
Coração podem ser vistas migrando subindo o mesen-
Células
tério dorsal e entrando nos sulcos genitais. (A
germinativas Mesonefros e B de Langman, 1981; C de Heath, 1879; D de
primordiais Mintz, 1957; fotografias cortesia dos autores.)
Mesentério
dorsal
Saco vitelínico Intestino
(A) (B) Cloaca posterior
Células germinativas
primordiais
(C) Células germinativas primordiais (D) Mesentério Sulcos

dorsal genitais
germinativas no mesoderma extra-embrionário migram em seguida de volta para o

embrião, primeiramente para o mesoderma da linha primitiva e em seguida para o
endoderma através da alantóide. O caminho dessa migração (Figura 22.3) assemelha-
se à migração de PGCs em anuros. Após juntarem-se na alantóide no dia 7.5 (Chiquoine,
1954; Mintz, 1957), as PGCs de mamíferos migram para o saco vitelínico adjacente
(Figura 22.3A,C). Nesse tempo, elas já se separaram em duas populações que irão
migrar para o sulco genital direito ou esquerdo. Em seguida, as PGCs irão se mover
caudalmente no saco vitelínico através do intestino posterior recém-formado subindo
pelo mesentério dorsal para dentro do sulco genital (Figura 22.3B,D.) A maioria das
PGCs alcançam a gônada em desenvolvimento no décimo primeiro dia após a fecunda-
ção. Durante esse trajeto, elas terão se proliferado de uma população inicial de 10 a 100
células para as 2500 a 5000 PGCs presentes nas gônadas no dia 12. Tal como as PGCs
de Xenopus, as PGCs de mamíferos parecem estar estreitamente associadas com a
células sobre as quais elas migram, movimentando-se por extensão de filopódios
sobre as superfícies celulares subjacentes. Essas células também são capazes de
penetrar monocamadas celulares e migram através de camadas celulares (Stott e Wylie,

1986). O mecanismo pelo qual as células germinativas primordiais têm conhecimento
da rota dessa jornada permanece ainda desconhecido. A fibronectina é provavelmente
um substrato importante sobre as quais as PGCs migram (ffrench-Constant et al.,
1991), e evidência in vitro sugere que os sulcos genitais dos embriões de camundon-
go de 10.5 dias secretam uma proteína semelhante à TGF-β1 difusível que é capaz de
atrair as células germinativas primordiais do camundongo (Godin et al., 1990; Godin e
Wylie, 1991). Permanece por ser testado se o sulco genital pode prover tais sinais.
Embora nenhum plasma germinativo tenha sido encontrado, a retenção da potên-
cia total foi correlacionada com a expressão de um fator de transcrição nuclear, o Oct4.
Esse fator é expresso em núcleos do blastômero de clivagem precoce sendo em segui-
da expresso na massa celular interna. Durante a gastrulação, ele é expresso somente
naquelas células epiblásticas posteriores consideradas dar origem às células
germinativas primordiais. Depois, essa proteína somente é vista nas células
germinativas primordiais e em oócitos (Figura 22.4; Yeom et al., 1996; Prancha 30).
A proliferação das PGCs parece ser provida pelo fator da célula-tronco, o mes-
mo fator de crescimento necessário para a proliferação dos melanoblastos derivados
da crista neural e de células-tronco hematopoiéticas (veja Capítulo 7). O fator da
célula-tronco é produzido pelas células ao longo do seu trajeto de migração e perma-
nece ligado às suas membranas celulares. Parece que a apresentação dessa proteína
nas membranas é importante para sua atividade. Camundongos homozigotos para a
mutação White (W) são deficientes em células germinativas (e em melanócitos e
células sangüíneas), já que suas células-tronco carecem do receptor para o fator de
crescimento da célula-tronco. Camundongos homozigotos para a mutação Steel têm
um fenótipo semelhante, pois também carecem da capacidade de produzir esse fator
de crescimento. Camundongos homozigotos para o alelo Steel-Dickie (Sld) têm um
número reduzido de células germinativas, pois embora esses camundongos possam
produzir o fator de crescimento da célula-tronco, esse não permanece ligado às suas
membranas (Dolci et al., 1991; Matsui et al., 1991). A adição do fator da célula-
tronco precursor às PGCs retiradas de camundongos de 11 dias irá estimular sua
proliferação por cerca de 24 horas e parece prevenir a morte programada de células
que de outra maneira iria ocorrer (Pesce et al., 1993).
(A) (B) (C)

Figura 22.4
Expressão de mRNA Oct4 se correlaciona com a totipotência e a capacidade de formar células
germinativas. Um transgene Oct4/lacZ impulsionado pela região promotora Oct4 mostra sua
expressão na (A) massa celular interna, (B) epiblasto posterior de um embrião de 8.5 dias, e (C)
em PGCs migrando em um embrião de 10.5 dias. (Segundo Yeom et al., 1996; permissão cortesia
de H. R. Schöler.)
& Especulações
Teratocarcinomas e Células-Tronco Embrionárias
O FATOR DA CÉLULA-TRONCO
aumenta a proliferação de células
germinativas primordiais de ca-
mundongo em cultura, e essa prolifera-
Epitélio
Eritrócitos
Células
queratinizadas
ção pode ainda ser aumentada pela adição

de outro fator de crescimento, o fator de ini-
bição de leucemia (LIF). Porém, o tempo
de vida dessas células é curto e elas mor-
rem logo. Se um regulador mitótico adici-
onal- o fator de crescimento de fibrobalsto
básico – for adicionado, acontece uma mu-
dança notável. As células continuam a pro-
liferar, produzindo uma célula-tronco em-
Matriz óssea Cartilagem Tecido Epitélio
brionária pluripotente com característi- conjuntivo queratinizante
cas semelhantes às das células da massa
celular interna (Matsui et al., 1992). Dis- Figura 22.5
cutimos essas células-tronco embrioná- tumor, as células germinativas tornam-se cé- Fotomicrografia de uma seção através de um
rias anteriormente, pois são as células que lulas-tronco embrionárias, tal como nos ex- teratocarcinoma mostrando numerosos tipos de
perimentos já referidos. Esse tipo de tumor é células diferenciadas. (de Gardner, 1982, foto-
podem ser transfectadas com genes re-
grafia de C. Graham, cortesia de R. L. Gardner.)
combinantes e inseridas no blastocisto chamado teratocarcinoma. Seja espontâ-
para criar camundongos transgênicos. neo ou produzido experimentalmente, um
Tal célula germinativa ou célula-tronco teratocarcinoma contém uma população de 1977). Além disso, essas células-tronco não
de mamífero contém em seu interior toda a células-tronco não diferenciadas que tem somente se dividem, como também podem
informação necessária para o subseqüente propriedades bioquímicas e desenvolvimen- se diferenciar em uma grande variedade de
desenvolvimento. O que aconteceria se tal tais notavelmente semelhantes àquelas das tecidos, incluindo epitélios intestinal e res-
célula se tornasse maligna? Em um tipo de células da massa celular interna (Graham, piratório, músculos, nervos, cartilagem e osso
Inserção no
blastocisto
Incorporação
Transferência cirúrgica na massa
para a mãe de criação celular interna Isolamento da linhagem de Teratocarcinoma
células-tronco maligno
Figura 22.6
Protocolo para a criação de camundongos cujos genes são pre-
dominantemente derivados de células tumorais. Células-tronco
foram isoladas de um teratocarcinoma de camundongo e inseridas
em blastocistos de uma variedade diferente de camundongo. Os
Mosaico
Tipo selvagem blastocistos quiméricos foram colocados em uma mãe de cria-
ção. Se as células tumorais estiverem integradas no blastocisto,
o camundongo que se desenvolve terá muitas de suas células
derivadas do tumor. Se o tumor tiver dado origem às células
germinativas, os camundongos mosaicos podem ser cruzados
com camundongos normais para produzir uma geração F1. Os
animais F1 devem ser heterozigotos para todos os cromossomos
das células tumorais. Cruzamentos entre animais F1 produzem
F1 onde as células germinativas “Nova linhagem” formada quando camundongos F2 tendo alguns genes homozigotos derivados
foram derivadas do tumor foram cruzados dois camundongos F1 das células tumorais. (Segundo Stewart e Mintz, 1981.)
(Figura 22.5). Uma vez diferenciadas, essas riedade agouti (ponta-amarela) de camun- portando um marcador apropriado, o ca-
células não podem mais se dividir e, portan- dongo foram cultivadas por várias gera- mundongo quimérico foi capaz de gerar
to, não são malignas. Tais tumores podem ções e foram vistas manter o complemen- camundongos tendo parte do fenótipo do
dar origem à maioria dos tipos de tecidos no to cromossômico característico do ca- tumor “paterno”. A célula do carcinoma
organismo. Assim, as células-tronco do tera- mundongo ancestral. Células-tronco in- embrionário maligno tinha produzido
tocarcinoma copiam o desenvolvimento ma- dividuais desse tipo foram injetadas em muitos, senão todos, tipos de células
mífero precoce, mas o tumor que formam é blastocistos de camundongos negros. Os somáticas normais, e tinham mesmo pro-
caracterizado por desenvolvimento rando- blastocistos foram em seguida transferi- duzido células germinativas normais,
mizado, descontrolado. dos para o útero de uma mãe de criação, funcionais! Quando camundongos ten-
Em 1981, Stewart e Mintz formaram nascendo camundongos vivos. Alguns do uma célula tumoral para um pai foram
um camundongo de células derivadas em desses tinham pelagem de duas cores, in- cruzados entre si, a prole resultante con-
parte de uma célula-tronco de teratocar- dicando que as células tumorais haviam tinha camundongos homozigotos para
cinoma. Células-tronco que haviam sur- se integrado no embrião. Além disso, um grande número de genes da célula
gido em um teratocarcinoma de uma va- quando cruzado com um camundongo tumoral (Figura 22.6).
Migração de Células Germinativas em Aves e Répteis
Em aves e répteis, as células germinativas primordiais são derivadas de células epi-

blásticas que migram da região central da área pelúcida para uma zona em forma de
crescente no hipoblasto na borda anterior da área pelúcida (Figura 22.7; Eyal-Giladi et
al., 1981; Ginsburg e Eyal-Giladi, 1987). Essa região extra-embrionária é chamada de
crescente germinativo, e as células germinativas primordiais aí se multiplicam. Ao
contrário das PGCs em anfíbios e mamíferos, as células germinativas em aves e répteis
migram primariamente por meio da corrente circulatória (Figura 22.8). Quando os va-
sos sangüíneos se formam no crescente germinativo, as PGCs penetram nos vasos e
são carreadas pela circulação para a região onde está se formado o intestino posterior.
Aqui, elas saem da circulação, associam-se ao mesentério, e migram para os sulcos
genitais (Swift, 1914; Kuwana, 1993). As PGCs do crescente germinativo parecem
entrar nos vasos sangüíneos por diapedese, um tipo de movimento em comum de
linfócitos e macrófagos que permite às células se espremerem entre as células
endoteliais dos vasos sangüíneos menores.
Crescente
germinativo
Área pelúcida
Área opaca
Nódulo de Hensen
Figura 22.7
Vista dorsal de um embrião em estágio de linha primitiva, mostrando a região, chamada crescente
germinativo, na qual se originam as células germinativas. (Segundo Swift, 1914.)
Vaso sangüíneo
Células sangüíneas
Epitélio gonadal
Célula
germinativa
primordial
(A) (B)
Figura 22.8
Células germinativas primordiais no embrião
Dessa forma, as PGCs entram no embrião sendo transportadas pelo sangue (Pasteels, do pinto. (A) Micrografia eletrônica de varre-
1953, Dubois, 1969). As PGCs têm também que “saber” como sair do sangue quando dura de PGC de pinto em um capilar de um
encontram a gônada em desenvolvimento (veja Figura 22.8B). Quando o crescente embrião em gastrulação. A PGC pode ser
germinativo de um embrião de pinto é removido, e a circulação desse embrião é junta- identificada pelo seu grande tamanho e as
da àquela de um embrião normal, as células germinativas primordiais do embrião nor- microvilosidades em sua superfície. (B) Se-
mal irão migrar para ambos conjuntos de gônadas (Simon, 1960). Não é conhecido o ção transversal próxima à prospectiva região
que causa a atração para os sulcos genitais. Uma possibilidade é que a gônada em gonadal do embrião. Várias PGCs dentro do
desenvolvimento produz uma substância quimiotática que atrai as PGCs e as retêm vaso sangüíneo se agregam próximo ao
epitélio. Uma PGC está atravessando o
nos capilares limitando a gônada (Regulska, 1969). (Tais substâncias são conhecidas
endotélio da parede vascular, e outra já está
como secretadas pelos linfócitos nos locais de infecção para atrair os macrófagos localizada no interior do epitélio. (A de
permitindo que esses passem através da parede capilar por diapedese.) A evidência Kuwana, 1993, cortesia de T. Kuwana; B se-
para essa quimiotaxia veio de estudos (Kuwana, et al., 1986) nos quais as PGCs gundo Romanoff, 1960.)
circulantes do pinto foram isoladas do sangue e cultivadas entre rudimentos gonadais
e outros tecidos embrionários. As PGCs migraram para o interior dos rudimentos
gonadais durante 3 horas de incubação.
Outra possibilidade é que as células endoteliais dos capilares gonadais têm um
composto na superfície celular que promove as PGCs aderirem especificamente a esse
local. Usando anticorpos monoclonais que reconhecem diferentes moléculas da su-
perfície celular, Auerbach e Joseph (1984) mostraram que as células endoteliais de
várias redes capilares têm diferentes componentes da membrana celular, e que as
células endoteliais de capilares ovarianos diferem de todas as outras testadas.* Tanto
a quimiotaxia como os mecanismos diferenciais de adesão celular podem estar atu-
ando. Seja como for, esses fatores não são espécie-específicos. A gônada do pinto
atrai as PGCs circulantes do peru e até mesmo do camundongo (Reynaud, 1969;
Regulska et al., 1971).
Migração de Células Germinativas Primordiais em Drosophila

Primordiais
Durante a embriogênese de Drosophila, as células germinativas passam do pólo

posterior para as gônadas. O primeiro passo é uma fase passiva, na qual as células
germinativas são deslocadas pelos movimentos das células embrionárias durante
a gastrulação. A diferenciação do endoderma aciona o movimento amebóide ativo
*Uma situação semelhante parece ocorrer quando linfócitos migram através da corrente sangüínea
e abandonam a circulação quando entram no leito capilar de um determinado órgão linfóide. O mecanis-
mo para esse “alojamento” e especificidade para o órgão envolvem a capacidade do linfócito de
aderir especificamente às células endoteliais dos vasos sangüíneos nesses órgãos. Células endoteliais
dos nódulos linfáticos periféricos contêm uma glicoproteína, uma selectina, em suas membranas
celulares que é essencial para a ligação e saída daqueles linfócitos que podem reconhecê-la. Para
cada selectina nessas células endoteliais, existe uma molécula complementar no linfócito que
pode reconhecê-la (Gallatin et al., 1983, 1986).
(A) (B) (C)
Figura 22.9
Migração de células germinativas em Droso-
phila. (A) Células germinativas coradas com
anticorpos contra a proteína Vasa mostram cé-
lulas germinativas originando do pólo poste-
rior. (B) Durante a extensão da banda
germinativa, as células são movidas para o
intestino intermediário posterior. (C) Células
germinativas migram através da parede do in- (D) (E)
testino (o embrião está contracorado para a Células germinativas
proteína Engrailed) e (D) migram em duas
filas únicas através do mesoderma, onde (E)
elas se agregam nas gônadas em desenvolvi-
mento. (F) Processo de migração através da
parede intestinal, iniciado pela diferenciação
endodérmica. (A-F de Warrior 1994, permis-
são cortesia de R. Warrior; F segundo Jaglarz
e Howard, 1995.)
(F)
nas células germinativas promordiais, e elas viajam através do endotélio intesti-

nal, migrando em direção ao mesoderma. Aí se dividem em dois grupos, cada qual
ficando associado com um primórdio da gônada em desenvolvimento (Figura 22.9;
Warrior et al., 1994).
O produto do gene wuwen parece ser responsável pelo direcionamento da migração
das PGCs do endoderma para dentro do mesoderma. Essa proteína é expressa no
endoderma imediatamente antes da migração da PGC, e ele repele as PGCs. Nos mutan-
tes de perda de função desse gene, as PGCs viajam ao acaso (Zhang et al., 1997).
Meiose
Uma vez na gônada, as células germinativas primordiais continuam a dividir-se mi-
toticamente, produzindo milhões de gametas potenciais. As PGCs de gônadas tanto
masculinas como femininas enfrentam então a necessidade de reduzir seu número de
cromossomos da condição diplóide para a haplóide. Nessa última, cada cromossomo
está representado somente uma vez, enquanto as células diplóides têm duas cópias de
cada cromossomo. Para conseguir essa redução, as células germinativas masculina e
feminina passam por meiose.
Após a última divisão meiótica, ocorre um período de síntese de DNA, fazendo
com que as células iniciando a meiose tenham o dobro da quantidade normal de
DNA em seus núcleos. Nesse estado, cada cromossomo consiste de duas cromátides
irmãs fixadas a um centrômero comum. (Em outras palavras, o núcleo diplóide
contém quatro cópias de cada cromossomo, mas os cromossomos são vistos como
duas cromátides ligadas.) A meiose (mostrada na Figura 1.13) envolve duas divisões
celulares. Na primeira divisão, cromossomos homólogos (p.e., o par cromossômico 3
na célula diplóide) se juntam e são então separados em células diferentes. Assim,

a primeira divisão meiótica separa cromossomos homólogos em duas células-fi-
lhas de modo que cada célula tenha somente uma cópia de cada cromossomo.
Porém, cada um dos cromossomos já se replicou. A segunda divisão meiótica em
seguida separa as duas cromátides irmãs uma da outra. Em conseqüência, cada
uma das quatro células produzidas pela meiose tem uma única cópia (haplóide) de
cada cromossomo.
A primeira divisão meiótica se inicia com uma longa prófase, que é subdividida
em cinco partes. Durante o estágio leptóteno (do grego, “fio fino”), a cromatina
das cromátides é muito finamente esticada, e não é possível identificar os cro-
mossomos individuais. Porém, a replicação do DNA já ocorreu, e cada cromosso-
mo consiste de duas cromátides paralelas. No estágio zigoteno (do grego, “fios
juntados”), os cromossomos homólogos formam pares lado a lado. Esse empare-
lhamento é chamado sinapse sendo característico da meiose, e não ocorre durante
as divisões mitóticas. Embora o mecanismo pelo qual cada cromossomo reconhe-
ce seu homólogo não seja conhecido, o emparelhamento parece requerer a presen-
ça da membrana nuclear e a formação de uma fita protéica chamada complexo
sináptico. Esse complexo é uma estrutura tipo escada com um elemento central e
duas barras laterais (von Wettstein, 1984; Schmekel e Daneholt, 1995). A cromati-
na está associada com as duas barras laterais e as cromátides estão assim ligadas
uma a outra (Figura 22.10). O exame do núcleo da célula meiótica pelo microscópio
eletrônico (Moses, 1968; Moens, 1969) sugere que os pares de cromossomos
estão ligados à membrana nuclear, e Comings (1968) sugeriu que o envoltório
nuclear favorece o encontro dos cromossomos homólogos. A configuração forma-
da pelas quatro cromátides e do complexo sináptico é referida como uma tétrade
ou uma bivalente.
Durante o próximo estágio da prófase meiótica, as cromátides engrossam e se
encurtam. Esse estágio foi por isso chamado de paquiteno (do grego, “fio gros-
so”). As cromátides individuais podem agora ser distinguidas sob o microscópio
Cromatina
Elementos laterais
(A) (B)
Filamentos
transversos
Figura 22.10
O complexo sináptico. (A) cromossomos homólogos conserva- Elementos centrais
dos juntos na primeira prófase meiótica no oócito de Neottiella. Pilar
(B) Diagrama interpretativo da estrutura do complexo sináptico.
Elementos laterais
(A de von Wettstein, 1971, cortesia de D. von Wettstein; B segun-
do Schmekel e Daneholt, 1995.) Cromatina
Figura 22.11
Quiasmas em cromossomos bivalentes diplótenos de oócitos de salamandra. Centrômeros são
visíveis como círculos intensamente corados; as setas apontam para os dois quiasmas. (Corte-
sia de J. Kezer.)
de luz, e pode ocorrer crossing-over. Esse crossing-over representa trocas de

material genético através do qual genes de uma cromátide são trocados por genes
homólogos de outra cromátide. Esse crossing-over continua no próximo estágio,
o diplóteno (do grego, “duplos fios”). Aqui, o complexo sináptico se decompõe, e
os dois cromossomos homólogos começam a se separar. Em geral, porém, eles
ficam fixados em vários lugares chamados quiasmas, os quais são considerados
representar regiões onde ocorre o crossing-over (Figura 22.11). O estágio diplóteno
se caracteriza por um alto nível de transcrição gênica. Em algumas espécies, os
cromossomos tanto de células germinativas masculinas como femininas assu-
mem a aparência de “escova” característica de cromossomos que estão ativamen-
te fabricando RNA. Durante o próximo estágio, diacinese (do grego “se afastan-
do”), os centrômeros se afastam um do outro, e os cromossomos permanecem
ligados somente nas pontas das cromátides. Esse último estágio da prófase meiótica
termina com a desintegração da membrana nuclear e a migração dos cromosso-
mos para a placa da metáfase.
Durante a anáfase I, os cromossomos homólogos são separados um do outro de
uma maneira independente. Esse estágio conduz à telófase I, durante a qual são for-
madas duas células-filhas, cada uma contendo um dos parceiros do par de cromosso-
mos homólogos. Após uma breve intercinese, ocorre a segunda divisão da meiose,
durante a qual o centrômero de cada cromossomo se divide durante a anáfase fazendo
com que cada uma das novas células obtenha uma das duas cromátides, o resultado
final sendo a criação de quatro células haplóides. Notar que a meiose também reagrupou
os cromossomos em novos grupamentos. Cada uma das células haplóides tem agora
um sortimento diferente de cromossomos. Em humanos, nos quais há 23 diferentes
pares de cromossomos, pode haver 223 (perto de 10 milhões) de diferentes tipos de
células haplóides formados do genoma de uma única pessoa. Além disso, os cruza-
mentos (crossing-over) que ocorrem durante os estágios paquiteno e diplóteno da
prófase I aumentam ainda mais a diversidade genética tornando incalculável o número
de gametas diferentes.
O mecanismo do emparelhamento homólogo é desconhecido. Pensa-se que
os primeiros eventos envolvam a procura por regiões homólogas de cromatina e
que esse processo possa utilizar enzimas reparadoras de DNA (Baker et al., 1996).
Mutantes de camundongo carentes de tais enzimas de reparo têm sinapses anor-
mais. Após o alinhamento das regiões homólogas, a sinapse é iniciada em regiões
localizadas. Em Drosophila, evidência recente sugere que as sinapses são inicia-
das em regiões de heterocromatina (Dernburg et al., 1996). Além disso, intera-
ções entre a proteína Mei-S332 e a heterocromatina rodeando o cinetocentro são
críticas para manter as cromátides irmãs juntas (Karpen et al, 1995, 1996; Kerrebrock
et al. 1995). O gene para a proteína Mei-S332 foi encontrado selecionando-se
mutações para incapacidade de completar a meiose. Nesses mutantes, as
cromátides irmãs separam-se precocemente durante 90 porcento do tempo. Em
vertebrados, a proteína Rad51 corresponde aos elementos laterais do complexo
sináptico e parece mediar o emparelhamento dos homólogos (Ashley et al., 1995).
Ao fim da meiose, essa proteína está localizada somente em sítios onde ainda
estão fixados os homólogos. Seria importante saber como essas e outras proteínas
interagem durante a gametogênese humana, já que a maioria dos eventos não
disjuncionais (como aqueles levando à trissomias) são considerados defeitos do
pareamento meiótico (veja Yoon et al., 1996).
& Especulações
Grandes Decisões: Mitose ou Meiose?

Espermatozóide ou Óvulo?
E M MUITAS ESPÉCIES, as células (A) Gônada intacta
germinativas migrando para o in-
Região de Zona de Região de
terior das gônadas são bipotenci-
meiose transição mitose
ais e podem diferenciar-se em espermato-
zóides ou óvulos, conforme seu ambiente
gonadal. Quando ovários de salamandras
são transformados experimentalmente em
testículos, as células germinativas residen-
Célula da
tes cessam sua diferenciação oogênica e extremidade distal
começam a desenvolver-se em espermato-
zóide (Burns, 1930; Humphrey, 1931). Da (B) Célula da extremidade distal removida
mesma maneira, na mosca doméstica e no
Todas células sofrem meiose
camundongo, a gônada pode direcionar a
diferenciação da célula germinativa
(McLaren, 1983; Inoue e Hiroyoshi,
1986). Assim, na maioria dos organismos,
o sexo das gônadas e de suas células ger-
minativas é o mesmo.
Figura 22.12
Porém, o que se passa em animais her-
Regulação da decisão meiose-mitose pela célula
mafroditas, nos quais a mudança de produ- (C) MITOSE da extremidade distal do ovo-teste de C. elegans.
ção de espermatozóide para produção de (A) Gônada intacta no início do desenvolvimen-
óvulos é um evento fisiológico que ocorre to com regiões de mitose (células sombreadas) e
naturalmente? Como pode o mesmo animal Regulador
terminal meiose. (B) Gônadas após ablação por laser da
ser capaz de produzir espermatozóide du- para mitose célula da extremidade distal. Todas as células
Trajetória da
rante parte de sua vida e oócitos durante determinação germinativas entram em meiose. (C) Modelo para
outra? Usando Caenorhabditis elegans, sexual as interações pelas quais células germinativas
Kimble e seus colegas identificaram duas adotam um destino único. O gene gld-1 está
“decisões” que células germinativas presu- ativo (e ocorre oogênese) a não ser que seja
míveis têm que fazer. A primeira envolve a inibido ou pelo sinal mitótico (se a célula for
decisão de entrar em meiose ou permanecer ativada por GLP-1) ou pelo sinal espermatogê-
uma célula-tronco dividindo-se mitotica- OOGÊNESE ESPERMATOGÊNESE nico (se os genes da determinação sexual como
mente. A segunda é se a célula meiótica irá tra-1 e fem-3 estiverem ativos). O sinal mitótico
se converter em um óvulo ou um espermato- tronco da linhagem germinativa serão pro- pode inibir tanto o sinal oogênico (GLD-1) como
zóide. Evidência recente mostra que essas duzidas perto dessa nova posição (Figura o sinal espermatogênico (FOG-1, FOG-3).
Ambos sinais inibem o sinal mitótico, e o sinal
decisões estão intimamente ligadas. A deci- 22.12; Kimble, 1981; Kimble e White,
espermatogênico pode inibir o sinal oogênico.
são mitótica/meiótica é controlada por uma 1981). Parece que as células da extremidade
A mitose é promovida pela ativação de GLP-1
única célula que não se divide, no terminal distal secretam alguma substância que man-
da célula germinativa, enquanto a trajetória da
de cada gônada, a célula da extremidade tém essas células em mitose e inibe sua dife- determinação sexual pode ativar os genes fog-1
distal. Os precursores das células germinati- renciação meiótica. Austin e Kimble (1987) e fog-3. (C segundo Ellis e Kimble, 1995.)
vas próximos dessa célula dividem-se mito- isolaram uma mutação que mimetiza o
ticamente formando o reservatório de célu- fenótipo obtido quando as células da extre- produzem somente de 5 a 9 células esper-
las germinativas, mas à medida que essas midade distal são removidas. Todos os pre- máticas. Quando são produzidas quimeras
células se afastam da célula da extremidade cursores das células germinativas de genéticas nas quais são encontrados precur-
distal, elas entram em meiose. Se as células nematóides homozigotos para a mutação sores de células germinativas do tipo selva-
da extremidade distal forem destruídas por recessiva glp-1 iniciam a meiose, não dei- gem em larvas mutantes, as células do tipo
um feixe focalizado de raio laser, todas as xando população mitótica. Em lugar das selvagem são capazes de responder às célu-
células germinativas entram em meiose, e se 1500 células germinativas geralmente en- las da extremidade distal e sofrer mitose.
a célula da extremidade distal for colocada contradas no quarto estágio larval do desen- Porém, quando precursores de células ger-
em um local diferente na gônada, células- volvimento hermafrodito, esses mutantes minativas mutantes são encontrados em
(A) Tipo selvagem: Espermatozóides e oócitos de. Por exemplo, mutantes homozigotos
mog (masculinização da linhagem germi-
nativa) se desenvolvem como machos pro-
dutores de espermatozóide, e mutantes ho-
mozigotos fem-1 desenvolvem-se como fê-
meas produtoras de óvulos (Figura 22.13).
Os mutantes duplos homozigotos tanto
para tra-1 como para fem-1 têm um único
fenótipo. Eles são somaticamente machos,
Espermateca
(região de mas são fêmeas na linhagem germinativa
armazenagem de (Doniach e Hodgkin, 1984). Isso sugere que
Espermatozóides Primeiro oócito
espermatozóide)
maduros tra-1 é o gene chave na determinação se-
Estágios precoces da espermatogênese
xual dos tecidos somáticos, mas que os
genes fem são responsáveis pela decisão es-
permatozóide/oócito (Figura 22.14).
(B) Feminilizado: Somente oócitos
Os laboratórios de Hodgkin (1985) e
Kimble (1986) isolaram vários genes ne-
cessários para a seleção do caminho da cé-
lula germinativa. A Figura 22.14 apresenta
um esquema de como esses genes podiam
funcionar na mudança de formação de es-
permatozóide para a formação de oócito.
Durante o desenvolvimento precoce, os
genes fem, em especial fem-3, são críticos
Espermateca (vazia) Primeiro oócito para a especificação das células espermáti-
cas. Mutações de perda-de-função desses
(C) Masculinizado: Somente espermatozóides genes convertem nematóides XX em fême-
as (i.e., hermafroditas sem espermatozóide).
Enquanto são produzidas proteínas FEM
nas células germinativas, são produzidos
espermatozóides. Os genes fem ativos são
considerados ativar os genes fog (cujas mu-
tações de perda-de-função causam a femi-
nização da linhagem germinativa e elimi-
nam a espermatogênese). Os produtos do
gene fog ativam os genes envolvidos na
Espermatozóide maduro Estágios precoces transformação da célula germinativa em es-
Espermateca
da espermatogênese permatozóide e também inibem aqueles
Figura 22.13 genes que iriam de outra maneira dirigir as
Gônadas de C. elegans tipo selvagem e mutante. (A) Hermafrodita tipo selvagem produzindo células germinativas para iniciar a oogêne-
primeiro espermatozóides e em seguida óvulos. (B) Animal fêmea produzido por mutação fem-
se. A oogênese pode começar somente
1 produz somente óvulos. (C) Hermafrodita masculinizado produzido por mutações de perda-de-
quando a atividade fem é suprimida. Essa
função de genes mog (ou mutações do 3’UTR de fem-3) produz somente espermatozóides.
(Fotografia cortesia de J. Kimble.)
supressão parece atuar ao nível da tradu-
ção do RNA. A região 3’ não-traduzida
larvas do tipo selvagem, essas entram em te, em cada ovário/testículo, as células ger- (3’UTR) do mRNA de fem-3 contém uma
meiose. Assim, o gene glp-1 parece ser res- minativas mais próximas produzem esper- seqüência que liga um repressor durante o
ponsável pela capacitação de células ger- matozóide, enquanto as mais distantes (per- desenvolvimento normal. Se essa região é
minativas responderem ao sinal das células to da extremidade) tornam-se óvulos mudada de maneira que a proteína repres-
da extremidade distal.* (Hirsch et al., 1976). A genética dessa mu- sora não pode se ligar, o mRNA de fem-3
Após as células começarem suas divi- dança está atualmente sendo analisada. permanece traduzível, e a oogênese nunca
sões meióticas, ainda precisam transformar- Conforme discutido no Capítulo 20, os ocorre. O resultado é um corpo de herma-
se em espermatozóide ou óvulo. Geralmen- genes para a determinação sexual geram frodita que somente produz espermatozói-
ou um corpo feminino funcionalmente her- de (Ahringer e Kimble, 1991; Ahringer et
* O gene glp-1 parece estar envolvido em vári- mafrodita ou um corpo masculino. Na lial., 1992). O fator de repressão que age no
as interações indutivas em C. elegans. Deve ser
nhagem germinativa, o caminho da deter- trans ainda não foi identificado, mas pro-
relembrado que glp-1 é também necessitado pelo
blastômero AB para receber os sinais indutivos do minação sexual ativa ou reprime certos vavelmente é o produto de um dos genes
blastômero EMS para formar os músculos faríngeos genes que são críticos para as células se mog (Graham e Kimble, 1993). Pensa-se que
(veja Capítulo 13). transformarem em óvulo ou espermatozói- proteínas ou mensagens estocadas no
(A) Determinação sexual somática Figura 22.14

Modelo da determinação sexual na linhagem
germinativa de hermafroditas de C elegans,
baseado na análise de mutações. (A) Deter-
minação sexual em tecidos somáticos, mos-
trando uma hierarquia de regulação negativa.
baixo ALTO baixo ALTO baixo ALTO (B) Controle da determinação sexual na linha-
gem germinativa. Os genes fog-2 e mog-1 re-
ALTO baixo ALTO baixo ALTO baixo gulam a determinação sexual na linhagem
germinativa. Os genes fog-1 e fog-3 agem a
jusante para iniciar a espermatogênese. (Se-
(B) Determinação sexual da linhagem germinativa gundo Ellis e Kimble, 1995.)
Em mutantes de perda-de-função para gld-

1, a oogênese está ausente e as células da
linhagem germinativa continuam a proli-
ferar formando tumores (Francis et al., 1995;
Jones et al., 1996).
ESPERMA- Em Drosophila, as células germinati-
baixo ALTO ALTO baixo ALTO TOZÓIDES vas são instruídas pelas células gonadais,
precoce
para se diferenciarem em espermatozóide
baixo ALTO baixo ALTO baixo OÓCITOS
tardio ou óvulo. As células gonadais femininas
ALTO baixo ALTO baixo ALTO ESPERMA- produzem um produto que é recebido pela
TOZÓIDES célula geminativa e que ativa uma série
de proteínas cuja atividade é essencial para
oócito podem controlar o momento desse mudando a gametogênese de espermato- a transcrição precoce do gene Sxl da célu-
processo, fazendo com que a espermatogê- zóide para óvulos. Um outro gene gld-1 la germinativa. Uma razão apropriada X:
nese ocorra enquanto há repressores da ex- (defeituoso no desenvolvimento da linha- autossomo é também necessária. Por esse
pressão de mog. Quando esses inibidores gem germinativa) é essencial para que a mecanismo, as moscas XX acabam produ-
maternos da expressão de mog decaem, as oogênese ocorra. A entrada de oócitos zindo óvulos, enquanto as moscas XY pro-
proteínas MOG tornam-se capazes de ini- presuntivos na via meiótica correlaciona- duzem espermatozóide (Burtis, 1993,
bir a síntese das proteínas FEM, com isso se com um dramático aumento de GLD-1. Oliver et al., 1993).
Espermatogênese
A espermatogênese é a produção de espermatozóide pelas células germinativas pri-
mordiais. Uma vez que as células germinativas primordiais de mamíferos chegam no
sulco genital dos embriões masculinos, elas se incorporam às cordas sexuais. Aí per-
manecem até a maturidade quando as cordas sexuais tornam-se ocas para formar os
túbulos seminíferos, e o epitélio dos túbulos se diferencia em células de Sertoli. Du-
rante sua vida, um homem pode produzir de 1012 a 1013 gametas (Reijo et al., 1995). As
células espermáticas são ligadas às células de Sertoli por moléculas de N-caderina em
suas respectivas superfícies celulares, e por moléculas de galactosil-transferase nas
células espermatogênicas que ligam um receptor nas células de Sertoli (Newton et al.,
1993; Pratt et al., 1993.) As células de Sertoli alimentam e protegem as células espermá-
ticas em desenvolvimento, e espermatogênese - a via de desenvolvimento da célula-
tronco espermatogônia até o espermatozóide maduro – ocorre nos recessos das célu-
las de Sertoli (Figura 22.15). Os processos pelos quais as PGCs produzem espermato-
zóide foram estudados em detalhe em vários organismos, mas enfocaremos aqui a
espermatogênese em mamíferos. Após atingir a gônada, as PGCs se dividem para
formar espermatogônias tipo A1. Essas células são menores que as PGCs e são carac-
terizadas por um núcleo ovóide que contém cromatina associada com a membrana
nuclear. As espermatogônias A1 são encontradas adjacentes à membrana basal exter-
na das cordas sexuais. Na maturidade, essas espermatogônias são consideradas divi-
dir-se para produzir uma outra espermatogônia tipo A1, assim como um tipo de célula
mais pálida, a espermatogônia tipo A2. Assim, cada espermatogônia tipo A1 é uma
célula-tronco capaz de se regenerar assim como produzir um novo tipo de célula. A
espermatogônia tipo A2 se divide para produzir a espermatogônia tipo A3, que produz
Lúmem do túbulo
Espermátides
Corpo residual
Espermatócito secundário
Espermatócito primário
Espermatogônia Tipo A1
Célula de Espermatogônia
Espermatogônia
Sertoli Tipo B
Tipo A2
Figura 22.15
Desenho de uma seção do túbulo seminífero, a espermatogônia tipo A4. É possível que cada tipo de espermatogônia A seja uma
mostrando a relação entre células de Sertoli e o célula-tronco capaz de auto-renovação. A espermatogônia A4 tem três opções. Ela
espermatozóide em desenvolvimento. À medi-
pode formar outra A4 (auto-renovação); pode apresentar morte celular (apoptose), ou
da que as células amadurecem, elas progridem
em direção ao lúmen do túbulo seminífero. (Se- pode diferenciar-se na primeira célula-tronco comprometida, a espermatogônia inter-
gundo Dym, 1977.) mediária. Essas estão comprometidas a se tornarem espermatozóide e se dividem uma
vez para formar as espermatogônias tipo B. Essas células são os precursores dos
espermatócitos e são as últimas células a sofrerem mitose. Essas células dividem uma
vez, gerando os espermatócitos primários - as células que entram em meiose. Não é
conhecido o que faz com que as espermatogônias tomem o caminho da diferenciação
em lugar da auto-renovação; também não é conhecido o que estimula as células a
entrar em divisão meiótica em vez de mitótica (Dym, 1994).
Examinando a Figura 22.16, vemos que durante as divisões espermatogônicas, a
citocinese não é completa. Antes, as células formam um sincício pelo qual cada célula
se comunica com a outra através de pontes citoplamáticas de cerca de 1 µm de diâme-
tro (Dym e Fawcett, 1971). As sucessivas divisões produzem clones de células
interconectadas, e como íons e moléculas passam facilmente por essas pontes interce-
lulares, cada grupo amadurece sincronicamente.
Cada espermatócito primário sofre a primeira divisão meiótica para fornecer um par
de espermatócitos secundários, que completam a segunda divisão da meiose. As
células haplóides formadas são chamadas espermátides e ainda estão conectadas
uma a outra por pontes citoplasmáticas. Essas espermátides têm núcleos haplóides
mas são funcionalmente diplóides, já que o produto gênico formado em uma célula
pode facilmente se difundir para o citoplasma de suas vizinhas (Braun et al., 1989).
Durante as divisões de espermatogônias tipo A1 até a espermátide, as células se
distanciam mais e mais da membrana basal do túbulo seminífero e se aproximam de seu
lúmen (veja Figura 22.15). Assim, cada tipo de célula pode ser encontrado em uma
camada particular do túbulo. As espermátides estão localizadas na margem do lúmen,
Espermatogônia tipo A1 Mais espermatogônia tipo A1 Figura 22.16

ou Formação de clones sinciciais de células ger-
minativas masculinas humanas. (Segundo
Bloom e Fawcett, 1975.)
Espermatogônias tipo A2
Espermatogônias tipo A 3
Espermatogônias tipo A 4
Espermatogônias intermediárias
Espermatogônias
tipo B
Pontes citoplasmáticas
Espermatócitos primários
(1a divisão meiótica)
Espermatócitos secundários
(2a divisão meiótica)
Espermátides
Corpos residuais
Células espermáticas
aqui perdendo duas conexões citoplasmáticas e diferenciando-se em células espermá-

ticas. Em humanos, a progressão da célula-tronco espermatogônica até o espermato-
zóide maduro demora 65 dias (Dym, 1994).
Espermiogênese
A espermátide haplóide é uma célula redonda não-flagelada que não se parece em

absoluto com o espermatozóide maduro dos vertebrados. O próximo passo na
maturação do espermatozóide, portanto, é a espermiogênese (ou espermateliose), a
diferenciação da célula espermática. Para que a fecundação possa ocorrer, o esper-
matozóide terá que encontrar e ligar-se ao óvulo; a espermiogênese diferencia o es-
permatozóide para essas funções de motilidade e interação. Os processos da diferen-
ciação do espermatozóide mamífero podem ser vistos na Figura 4.2. O primeiro pas-
so envolve a construção da vesícula acrossômica a partir do aparelho de Golgi. O
acrossomo forma uma coroa que cobre o núcleo espermático. À medida que a coroa é
formada, o núcleo gira fazendo com que a coroa acrossômica fique de frente para a
membrana basal do túbulo seminífero. Essa rotação é necessária porque o flagelo está
começando a se formar do centríolo do outro lado do núcleo, e esse flagelo irá se
estender para o interior do lúmen. Durante o último estágio da espermiogênese, o
núcleo se achata e se condensa, o citoplasma remanescente (a “gotícula citoplasmática”)
é descartado, e as mitocôndrias formam um anel em volta da base do flagelo. O
espermatozóide resultante penetra em seguida no lúmen do túbulo.
No camundongo, o integral desenvolvimento da célula-tronco até o espermato-
zóide leva 34.5 dias. Os estágios espermatogônicos duram 8 dias, a meiose 13 dias, e a
espermiogênese gasta mais 13.5 dias. Em seres humanos, o desenvolvimento
espermático é perto de duas vezes mais longo. Como as espermatogônias do tipo A1
são células-tronco, a espermatogênese pode ocorrer continuamente. Cada dia, perto
de 100 milhões de espermatozóides são produzidos em cada testículo humano, e
cada ejaculação liberta cerca de 200 milhões de espermatozóides. Quando não usa-
do, esses são reabsorvidos ou eliminados do organismo pela urina.
& Especulações
Expressão Gênica
Durante o Desenvolvimento do Espermatozóide
Expressão Gênica Antes da nas ligantes de RNA são críticas na esper- dos genes específicos do espermatozóide
Meiose Masculina matogênese porque muitos dos genes ex- transcrito é aquele para a β2-tubulina. Essa
A expressão gênica no espermatozóide é es- pressos no espermatozóide são regulados no isoforma da β−tubulina é vista somente du-
tágio-específica, e mesmo as células haplói- nível da tradução (Schäfer et al., 1995). Re- rante a espermatogênese, e é responsável
des são aptas a sintetizar certos produtos. A almente, em alguns animais, muito da es- pela formação de fusos meióticos, do
iniciação da espermatogênese na puberda- permatogênese ocorre na ausência de trans- axonema e dos microtúbulos associados
de é provavelmente regulada pela síntese crição de novos genes. A síntese de com as mitocôndrias em processo de ex-
de BMP8B pelas espermatogônias. Quan- protamina, a proteína básica que substitui tensão.* Hoyle e Raff (1990) mostraram que
do BMP8B atinge uma concentração críti- as histonas no núcleo espermático haplóide uma outra isoforma da tubulina, a β3-
ca, as espermatogônias podem se diferenci- do espermatozóide, é regulada pela fosfori- tubulina (que normalmente é expressa em
ar em espermátides redondas. Essas células lação de uma proteína ligante de 18-kDa células mesodérmicas e na epiderme), não
produzem altos níveis de BMP8B, que po- que reconhece a região 3’ não-traduzida da pode substituir a β2-tubulina.. Quando os
dem estimular as espermatogônias a se dife- mensagem protamina do camundongo autores fundiram a região regulatória 5’ do
renciarem. Camundongos carentes de (Kwon e Hecht, 1993). gene da β2-tubulina com a seqüência
BMP8B não iniciam a espermatogênese na Em Drosophila, o gene roughex trans- codificadora do gene da β3-tubulina, esse
puberdade (Zhao et al., 1996). Em huma- crito por espermatogônias de Drosophila gene pôde ser expresso no espermatozóide
nos, o gene DAZ localizado no braço longo pré-meiótica controla o número de divi- em desenvolvimento. Quando esse gene foi
do cromossomo Y está deletado em muitos sões meióticas. Machos carentes de có- expresso na ausência do gene da β2-
homens inférteis, muitos dos quais não pro- pias funcionais do gene roughex sofrem tubulina, as células germinativas resultan-
duzem espermatozóide algum. O gene DAZ uma metáfase meiótica extra em adição às tes não sofreram meiose, reunião de
é expresso exclusivamente em células ger- duas normais. O aumento da concentra- axonemas, ou conformação nuclear. So-
minativas masculinas, especialmente nas es- ção de Roughex resulta na incapacidade mente ocorreu a extensão mitocondrial. Isso
permatogônias, e parece codificar uma pro- de executar meiose II (Gönczy et al., 1994). indica que a formação dos fusos meióticos
teína ligante de RNA (Reijo et al., 1995; e do axonema de células espermáticas não
Menke et al., 1997). DAZ é homólogo de Expressão Gênica durante a
* A confecção do axonema espermático em
dois genes da Drosophila, Rb97D e boule, Meiose Masculina
Drosophila é uma tarefa de monta. A cauda do es-
os quais também codificam proteínas Muito da transcrição gênica durante a es- permatozóide tem 2 mm de extensão – tão compri-
ligantes de RNA, e ambos são essenciais para permatogênese ocorre durante o estágio da quanto a mosca masculina inteira. O espermato-
a espermatogênese. Espermatogônias se de- diplóteno da prófase meiótica. Os genes que zóide da espécie relacionada D. bifurca, de 58.3 mm
generam em moscas masculinas deficientes são transcritos especificamente durante a de comprimento, é aproximadamente 20 vezes
mais longo que as moscas que o produzem. É
em Rb97D, enquanto as células germinati- espermatogênese são freqüentemente aque-
notável que o ovo de D. melanogaster incorpo-
vas de moscas carentes do gene boule não les cujos produtos são necessários para mo- ra todo o espermatozóide (Karr, 1991). Somen-
entram em meiose (Karsch-Mizrachi e tilidade do espermatozóide ou sua fixação te cerca de 3 mm do espermatozóide de D. bifur-
Haynes, 1993; Eberhart et al., 1996). Proteí- ao óvulo. Em Drosophila melanogaster, um ca é incorporado pelo ovo (Pitnick et al., 1995).
é conseguida por qualquer β−tubulina e que para o alelo mutante, leva a embriões nor-
a transcrição de suas isoformas específicas mais. Um desses genes de efeito paterno é o
do espermatozóide é importante. spe-11 em C. elegans. Os espermatozóides
Os genes cujos produtos são necessá- contendo alelos mutantes nesse loco são in-
rios para ligação do espermatozóide e das capazes de direcionar movimentos cromos-
matrizes extracelulares do óvulo são tam- sômicos que orientam o fuso mitótico do em-
bém transcritos durante a espermatogê- brião, sugerindo que a mutação afeta as regi-
nese. O gene da bindina do ouriço-do- ões organizadoras dos microtúbulos, tais
mar é transcrito relativamente tarde na como os centríolos (Figura 22.18; Hill et al.,
espermatogênese e seu mRNA é traduzi- 1989). Mutações de efeito paterno foram
do em bindina logo após ser produzido identificadas em Drosophila e essas podem
(Nishioka et al., 1990). A bindina se acu- também envolver a estrutura do fuso mitótico
mula em vesículas que se fundem para do zigoto (Karr, 1996). [fert10.html]
formar a vesícula acrossômica única no
espermatozóide maduro do ouriço-do- Expressão Gênica Terminal
mar. A Figura 22.17 mostra a localização Por fim, o genoma haplóide é condensado
da proteína bindina na vesícula acrossô- à medida que as histonas são substituídas
mica do espermatozóide enquanto esse por protaminas ou histonas especificamen-
ainda está nos testículos. te modificadas. Muitas histonas do esper-
matozóide são modificadas no estágio de
Expressão Gênica Haplóide espermátide tardia da espermiogênese. Es-
em Espermatócitos. sas modificações (tal como a desfosforila-
Além da transcrição de genes em células ção das regiões N-terminais de certas
diplóides durante a prófase meiótica, cer- histonas causam a condensação da cro-
tos genes são transcritos na espermátide matina), que resulta em severa redução da
(revisado por Palmiter et al., 1984). Essa transcrição. Assim, a transcrição do geno-
evidência para expressão gênica haplói- ma masculino não é detectada novamente
de vem de estudos envolvendo camun- até ser reativada algum tempo durante o
Figura 22.17
dongos heterozogotos nos quais são vis- desenvolvimento (Poccia,1986; Green e
Localização de bindina no acrossomo do es-
tas duas populações diferentes de esper- permatozóide, por meio de anticorpos antibin- Poccia, 1988).
matozóide – uma expressando o fenótipo dina marcados com ouro. Os átomos de ouro
mutante, e outra expressando a caracterís- permitem aos anticorpos aparecerem como
tica tipo selvagem. Se a síntese do RNA pontos negros na micrografia eletrônica. Es-
ou da proteína ocorresse enquanto as cé- ses espermatozóides ainda estão no interior
dos testículos do ouriço-do-mar. (Cortesia de
lulas ainda fossem diplóides, todo o es- D. Nishioka.)
permatozóide apresentaria o mesmo
fenótipo. Transcrições do gene para a Genes de Efeito Paterno
protamina são vistas nas células haplói- Em algumas espécies, o espermatozóide for-
des precoces (espermátides redondas) em- nece importante informação desenvolvimen- (A)
bora sua tradução seja retardada por vári- tal que não pode ser compensada pelo óvulo.
os dias (Peschon et al., 1987). O gene para Já discutimos a impressão (“imprinting”) de
a β1, 4-galactosiltransferase que liga o es- cromossomos de mamíferos no qual o DNA
permatozóide à zona pelúcida somente é do espermatozóide e do óvulo diferem nos
transcrito durante a fase haplóide da ma- seus padrões de metilação (veja Capítulos 4 e
turação do espermatozóide do camundon- 11). Existem também casos de genes de efei-
go (Hardvin-Lepers et al., 1993). Esses to paternos. Aqui, alelos homozigotos reces-
genes expressos no estágio haplóide po- sivos no macho causam desenvolvimento
dem ser regulados pelo hormônio estimu- anormal no embrião, mesmo se a fêmea for
lador de folículos da glândula pituitária homozigota para o alelo de tipo selvagem, (B)
(Foulkes et al. 1993; Blendy et al.,1996; enquanto o cruzamento recíproco, no qual o Figura 22.18
Nantel et al., 1996).* pai é do tipo selvagem e a mãe é homozigota Fotomicrografias imunofluorescentes de fusos
mitóticos no embrião de primeira clivagem de
* Esse mecanismo parece indevidamente complexo. Os genes pós-meióticos parecem ser regulados C. elegans quando o espermatozóide é (A) de
pelo fator de transcrição CREM. Esse gene para o fator de transcrição, o modulador do elemento responsivo um macho tipo selvagem e (B) de um macho
ao AMP-cíclico é transcrito durante a espermatogênese precoce, mas a mensagem decai rapidamente. A homozigoto para o gene spe-11 de efeito pater-
proteína que produz, inibe a transcrição de dois genes pós-meióticos. Porém, a recepção de FSH pelas células no. Em (B), três centríolos organizadores de
meióticas causa a emenda alternativa do precursor do mRNA de CREM, fazendo com que ele se torne uma microtúbulos podem ser vistos em lugar dos
mensagem estável para uma isoforma ativadora da molécula. O direcionamento para o alvo do gene CREM dois pólos mitóticos usuais. (De Hill et al., 1989,
de camundongo resulta na ausência da expressão gênica pós-meiótica e na morte dos espermatócitos. cortesia de S. Strome.)
Oogênese
Meiose oogênica
Oogênese - a diferenciação do óvulo- difere de várias maneiras da espermatogênese.

Enquanto o gameta formado pela espermatogênese é essencialmente um núcleo móvel,
o gameta formado pela oogênese contém todos os fatores necessários para iniciar e
manter o metabolismo e o desenvolvimento. Portanto, além de formar um núcleo
haplóide, a oogênese também constrói um reservatório de enzimas citoplasmáticas,
mRNAs, organelas e substratos metabólicos. Enquanto o espermatozóide torna-se dife-
renciado para motilidade, o oócito desenvolve um citoplasma notavelmente complexo.
Os mecanismos da oogênese variam mais que os da espermatogênese. Essa dife-
rença não deve surpreender, já que os padrões de reprodução variam extremamente
entre espécies. Em algumas espécies, tais como os ouriços-do-mar e as rãs, a fêmea
rotineiramente produz centenas ou milhares de óvulos de uma vez, enquanto em outras
espécies, como nos seres humanos e na maioria dos mamíferos, somente são produzi-
dos alguns óvulos durante a vida de um indivíduo. Nas espécies que produzem milha-
res de óvulos, as oogônias são células-tronco auto-renováveis que perduram durante a
vida do organismo. Nas espécies que produzem menos óvulos, as oogônias se dividem
para formar um número limitado de células precursoras de óvulos. Em humanos, as
mil, ou coisa assim, oogônias dividem-se rapidamente do segundo ao sétimo mês da
gestação para formar cerca de 7 milhões de células germinativas (Figura 22.19). Após o
sétimo mês do desenvolvimento, porém, o número de células germinativas decresce
abruptamente. A maioria das oogônias morre durante esse período, enquanto as oogônias
remanescentes entram na prófase da primeira divisão meiótica (Pinkerton et al., 1961).
Essas células tardias, chamadas de oócitos primários, progridem através da primeira
prófase meiótica até o estágio diplóteno, no qual são mantidas até a puberdade. Com o
advento da adolescência, grupos de oócitos periodicamente reiniciam a meiose. Assim,
na fêmea humana, a primeira parte da meiose é iniciada no embrião, e o sinal para
reiniciar a meiose não é dado antes de decorridos cerca de 12 anos. Na realidade, al-
guns oócitos são mantidos em prófase meiótica por perto de 50 anos. Como indicado
na Figura 12.19, oócitos primários continuam a morrer mesmo após o nascimento. Dos
milhões de oócitos primários presentes na ocasião do nascimento, somente cerca de
400 amadurecem durante a vida da mulher.
Número de células germinativas x 106
Nascimento
Meses antes Anos após o nascimento

da concepção
Figura 22.19
Mudanças no número de células germinativas no ovário humano. (Segundo Baker, 1970.)
Figura 22.20
Formação do corpo polar no oócito do peixe branco Coregonus. (A) Anáfase da primeira divisão
meiótica, mostrando o primeiro corpo polar comprimindo-se com seus cromossomos. (B) Metáfase
(no interior do oócito, seta) da segunda divisão meiótica, com o primeiro corpo polar ainda no seu
lugar. O primeiro corpo polar pode ou não dividir-se novamente. (de Swanson et al., 1981,
cortesia de C. P. Swanson.)
A meiose oogênica também difere da espermatogênese na sua colocação na placa

metafásica. Quando o oócito primário se divide, o seu núcleo, chamado de vesícula
germinativa, se desintegra e o fuso metafásico migra para a periferia da célula. Na
telófase, uma das duas células-filhas contém praticamente nada de citoplasma, en-
quanto a outra tem quase a totalidade do volume dos constituintes celulares (Figura
22.20). A célula menor é chamada de primeiro corpo polar, e a célula maior é referida
como o oócito secundário. Durante a segunda divisão da meiose, ocorre uma citocinese (A)
semelhante. A maior parte do citoplasma é retida pelo óvulo maduro e o segundo
corpo polar recebe pouco mais que um núcleo haplóide. Assim, a meiose oogênica
serve para conservar o volume do citoplasma do oócito em uma única célula em lugar
de dividi-lo igualmente entre quatro progênies.
Em algumas espécies de animais, a meiose é severamente modificada fazendo
com que o gameta resultante seja diplóide e não necessite ser fertilizado para se
desenvolver. Tais animais são ditos ser partenogenéticos. Na mosca Drosophila
mangabeirai, um dos corpos polares atua como espermatozóide e “fecunda” o oócito
após a segunda divisão meiótica. Em outros insetos (como a Moraba virgo) e o
lagarto Cnemidophorus uniparens, a oogônia duplica seu número de cromossomos
antes da meiose, a fim de que a divisão dos cromossomos restaure o número diplóide.
As células germinativas do gafanhoto Pycnoscelus surinamensis dispensam a meiose
por completo, formando óvulos diplóides através de duas divisões mitóticas (Swanson
et al., 1981). Nos exemplos precedentes, as espécies consistem inteiramente de fême- (B)
as. Em outras espécies, a partenogênese haplóide é largamente empregada não so-
mente como um meio de reprodução, mas também como um meio de determinação
sexual. Nos Himenópteros (abelhas, vespas e formigas), ovos não-fertilizados desen-
volvem-se em machos, enquanto ovos fertilizados, sendo diplóides, desenvolvem-se
em fêmeas. Os machos haplóides são capazes de produzir espermatozóide abando-
nando a primeira divisão meiótica, com isso formando duas células espermáticas atra-
vés da segunda meiose.
Maturação do Oócito em Anfíbios
O ovo é responsável pela iniciação e direcionamento do desenvolvimento, e em algu-

mas espécies (conforme visto anteriormente), a fecundação nem é necessária. O
material acumulado no citoplasma do oócito inclui fontes de energia e organelas (o
vitelo e as mitocôndrias); as enzimas e precursores para síntese de DNA, RNA e Tabela 22.1 Componentes celulares
armazenados no oócito maduro de
proteínas; RNAs mensageiros armazenados; proteínas estruturais; e fatores regula- Xenopus laevis
dores morfogenéticos que controlam a embriogênese precoce. Um catálogo parcial
Excesso aproximado em
dos materiais armazenados no citoplasma do oócito é mostrado na Tabela 22.1. A relação à quantidade
maior parte dessa acumulação ocorre durante a prófase meiótica I, e esse estágio é Componente existente em células larvais
freqüentemente subdividido em fases pré-vitelogênica (do grego, “antes da formação
do vitelo”) e vitelogênica (formadora de vitelo). Mitocôndria 100.000
RNA polimerases 60.000 – 100.000
Ovos de peixes e anfíbios são derivados de uma população de células-tronco DNA polimerases 100.000
oogônias que pode gerar um novo grupo de oócitos cada ano. Na rã Rana pipiens, a Ribossomos 200.000
oogênese dura três anos. Durante os dois primeiros anos, o oócito aumenta de tama- tRNA 10.000
nho gradualmente. Durante o terceiro ano, porém, o rápido acúmulo de vitelo no Histonas 15.000
Deoxirribonucleosídeo 2.500
oócito faz com que o óvulo inche, atingindo seu característico tamanho grande (Fi- trifosfatos
gura 22.21). Os óvulos amadurecem em grupos anualmente, o primeiro grupo ama-
durece pouco após a metamorfose; o próximo grupo amadurece um ano depois. Fonte: Segundo Laskey, 1979.
Figura 22.21
Crescimento de oócitos na rã. Durante os três
primeiros anos de vida são produzidos três gru-
pos de oócitos. Os desenhos seguem o cresci-
mento dos oócitos da primeira geração. (Se-
gundo Grant, 1953.)
Primeiro grupo
Fase vitelogênica
Diâmetro (mm)
Fase pré-vitelogênica
Segundo grupo
Terceiro grupo
Primavera
Primavera
Primavera
Inverno
Inverno
Inverno
Outono
Outono
Outono
Verão
Verão
Verão
Primeiro ano Segundo ano Terceiro ano
A vitelogênese ocorre quando o oócito alcança o estágio diplotênico da prófase

meiótica. O vitelo não é uma substância única, mas uma mistura de materiais usados
para a nutrição do embrião. O principal componente do vitelo é uma proteína de 470-
kDa, chamada vitelogenina. Essa não é produzida no oócito da rã (como são as
principais proteínas do vitelo de organismos tais como os anelídeos e o lagostim),
mas é sintetizada no fígado e levada pela corrente sangüínea até o ovário (Flickinger
e Rounds, 1956). Essa grande proteína passa entre as células foliculares do ovário e
é incorporada ao oócito por micropinocitose, o desligamento de vesículas envoltas
pela membrana na base das vilosidades (Dumont, 1978). No oócito maduro, a
vitelogenina é cindida em duas proteínas menores: a altamente fosforilada fosvitina
e lipoproteína lipovitelina. Essas duas proteínas estão acondicionadas juntas em
plaquetas do vitelo envoltas pela membrana (Figura 22.22A). Grânulos de glicogênio
e inclusões lipocondriais armazenam o carboidrato e os componentes lipídicos do
vitelo, respectivamente.
A maioria dos óvulos são altamente assimétricos, e é durante a oogênese que
o eixo animal-vegetal do óvulo é especificado. Danilchik e Gerhart (1987) mostra-
ram que embora a concentração de vitelo em oócitos de Xenopus aumente cerca de
10 vezes à medida que vai do pólo animal para o pólo vegetal do ovo maduro, a
captação de vitelogenina é uniforme na superfície do oócito. O que difere é seu
movimento dentro do oócito, que depende do local onde se deu a entrada das
proteínas vitelínicas. Quando as plaquetas do vitelo são formadas no futuro he-
misfério animal, movimentam-se em direção ao centro da célula. As plaquetas do
vitelo vegetal, porém, não se movem ativamente, permanecendo na periferia por
muito tempo, aí aumentando de tamanho. Elas são depois deslocadas lentamente
do córtex à medida que novas plaquetas entram da superfície. Como um resultado
desse transporte intracelular diferenciado, a quantidade de vitelo aumenta regu-
larmente no hemisfério vegetal, até que a metade vegetal do oócito maduro de
Xenopus contenha perto de 75% do vitelo (Figura 22.22B-E). O mecanismo dessa
translocação permanece desconhecido.
(A) (B) (C) (D) (E)
Figura 22.22
Distribuição do vitelo em Xenopus. (A) Uma plaqueta de vitelo anfíbio. (B-E) Estabelecimento
da polaridade animal-vegetal das plaquetas de vitelo em oócitos de Xenopus. (B) No oócito no
final do estágio III (600 µm), plaquetas de vitelo penetram na célula igualmente por todos os
pontos da superfície. (C,D) À medida que o oócito cresce, as plaquetas do futuro pólo animal
são deslocadas para o pólo vegetal, enquanto aquelas no pólo vegetal aí permanecem. Continua
a entrada de vitelo por todos os lados. (E) Ao fim da vitelogênese, as plaquetas mais precoces
(III) estão todas no hemisfério vegetal, que concentrou agora 75% do vitelo do oócito. O
momento de entrada do vitelo nas plaquetas do oócito está indicado pelo grau de sombreamento
e números romanos: III, plaquetas de estágio III; IV-e, plaquetas do estágio precoce IV; IV-
l:plaquetas de estágio tardio IV; V, plaquetas do estágio V; gv, vesícula germinativa. (Segundo
Danilchik e Gerhart, 1987; fotografia cortesia de L. K. Opresko.)
À medida que o vitelo está sendo depositado, as organelas também se arran-

jam assimetricamente. Os grânulos corticais começam a se formar a partir do apa-
relho de Golgi, estando originalmente espalhados aleatoriamente através do cito-
plasma do oócito. Posteriormente, migram para a periferia da célula. As mitocôndrias
se replicam nesse período, dividindo-se para formar milhões de organelas que
serão distribuídas para as diferentes células durante a clivagem. (Em Xenopus não
são formadas novas mitocôndrias antes do início da gastrulação.) Quando a
vitelogênese se aproxima de seu final, o citoplasma do oócito se estratifica. Os
grânulos corticais, mitocôndrias e grânulos pigmentados são encontrados na pe-
riferia da célula, dentro do córtex do oócito rico em actina. No interior do citoplas-
ma interior, emergem gradientes distintos. Enquanto as plaquetas do vitelo se
concentram mais no pólo vegetal, os grânulos de glicogênio, ribossomos, vesículas
lipídicas e retículo endoplasmático são encontrados mais em direção do pólo ani-
mal. Mesmo os mRNAs específicos armazenados no citoplasma se localizam em
determinadas regiões do oócito. [germ1.html]
Enquanto os mecanismos precisos para o estabelecimento desses gradientes
permanecem desconhecidos, estudos usando inibidores mostraram que o citoes-
queleto é criticamente importante para a localização de RNAs específicos e de
fatores morfogenéticos. Parece haver dois caminhos para conseguir a localização
no córtex vegetal (Foristall et al., 1995; Kloc e Etkin, 1995). Mensagens tais como
as que codificam a proteína Vg1 estão inicialmente presentes em todo o oócito,
sendo trasladadas para o córtex vegetal em dois passos (Yisraeli et al., 1990). Na
primeira fase, são necessários microtúbulos para trazer o mRNA Vg1 para o hemis-
fério vegetal. Na segunda fase, os microfilamentos são responsáveis pelo
ancoramento da mensagem de Vg1 no córtex. A porção do mRNA Vg1 que se liga
a esses elementos citoesqueléticos reside na região 3’ não-traduzida. Quando uma
seqüência específica de 340 bases é colocada sobre uma mensagem de β-globina, o
mRNA β-globina é colocado de maneira semelhante no córtex vegetal (veja Capítu-
lo 12; Mowry e Melton, 1992). Outros mRNAs, como Xlsirt (uma família de RNAs
RNAs que não codificam proteínas mas podem ser necessários para a manutenção de Vg1
maternos
no córtex), Xwnt11 e Xcat2 (que codifica uma proteína ligante de RNA relacionada
a Nanos), deixam a vesícula germinativa para se localizarem na “nuvem” mitocondri-
al no pólo vegetal do núcleo. Essas mensagens ficam compartimentalizadas em
agregados associados com o plasma germinativo e são transportadas para o córtex
vegetal de uma maneira que parece ser independente do citoesqueleto (Figura 22.23;
Estágio 1-2 Kloc et al., 1996).
Conclusão da meiose: Progesterona e Fecundação

Progesterona
Estágio 2-3 Oócitos de anfíbios podem permanecer anos no estágio diplóteno da prófase meiótica.
O recomeço da meiose no oócito primário dos anfíbios requer progesterona. Esse
hormônio é secretado pelas células foliculares em resposta ao hormônio
gonadotrófico secretado pela hipófise. Seis horas após a estimulação por
progesterona, ocorre a desintegração da vesícula germinativa (GVBD), as
microvilosidades se retraem, os nucléolos se desintegram e os cromossomos em
Estágio 4
forma de escova se contraem e migram para o pólo animal para iniciar a divisão.
Pouco depois, ocorre a primeira divisão meiótica, e o óvulo maduro é liberado pelo
ovário pelo processo da ovulação. Quando liberado, esse óvulo se encontra na
segunda metáfase meiótica.
Como pode a progesterona capacitar o óvulo a interromper sua dormência e reiniciar
a meiose? Para compreender esse mecanismo de ativação, é necessário revisar rapida-
mente o modelo para divisão precoce do blastômero apresentado no Capítulo 5. O
Trajetória Vg1 Trajetória metro fator promotor da maturação (MPF) é responsável pelo reinício da meiose. Sua ativida-
(Xwnt11, Xcat2)
de é cíclica, sendo alta durante a divisão celular e indetectável durante a interfase. O
Figura 22.23 MPF é uma proteína quinase que contém uma subunidade enzimática (ciclina). Como
Representações esquemáticas de duas trajetó- todos os componentes do MPF estão presentes no oócito do anfíbio, considera-se
rias para a localização de mRNAs na região que a progesterona de alguma maneira converte um complexo pré-MPF em MPF ativo,
vegetal do oócito de Xenopus. A trajetória talvez pela ativação da fosfatase cdc25 (veja Capítulo 5; Minishull, 1993).
METRO (organizadora do transporte de men- O mediador do sinal de progesterona é provavelmente a proteína c-mos. A
sagens – message transport organizer) acumu-
progesterona reinicia a meiose, fazendo o ovo poliadenilar o mRNA c-mos mater-
la mensagens na nuvem mitocondrial, e suas
ilhas são transportadas para o córtex do pólo nal que havia sido armazenado em seu citoplasma (Sagata et al., 1988, 1989; Sheets
vegetal. Na trajetória Vg1 são vistas mensa- et al., 1995). Essa mensagem é traduzida em uma fosfoproteína de 39-kDa, pp39mos,
gens por todo o ovo, porém, essas são trasla- detectável somente durante a maturação do oócito, sendo rapidamente destruída
dadas por um sistema movido pelos microtú- após a fecundação. No entanto, durante sua breve vida, essa proteína exerce um
bulos para os microfilamentos do córtex vege- papel principal na liberação do óvulo da sua dormência. Se a tradução de pp39mos
tal. (Segundo Kloc e Etkin, 1995.) for inibida (injetando-se mRNA mos-antisenso no oócito), esse não aparece e a
desintegração da vesícula germinativa e a renovação da maturação do oócito não
acontecem. Após ter estimulado o reinício da meiose, pp39mos capacita o oócito a
passar por uma divisão meiótica, mas congela o segundo ciclo meiótico na metáfase.
Esse bloqueio é causado pelas ações combinadas de pp39mos e outra proteína, a
quinase 2 dependente de ciclina (cdk2; Gabrielli et al., 1993). Essas duas proteínas
são consideradas constituir o fator citoestático (CSF) encontrado nos ovos ma-
duros da rã, que pode bloquear os ciclos celulares na metáfase (Masui, 1974).
Acredita-se que o CSF previne a degradação da ciclina.
A próxima pergunta envolve os mecanismos pelos quais a fecundação capacita
o oócito que está na segunda metáfase a completar a divisão para formar um gameta
haplóide. Evidência recente sugere que o fluxo de íons de cálcio ocorrendo durante
a fecundação capacita a proteína ligante de cálcio calmodulina a tornar-se ativa. A
calmodulina, por sua vez, pode ativar a proteína quinase II dependente de calmodulina.
Essa é necessária e suficiente para inativar a quinase cdc2 e estimular a degradação
de c-mos (Lorca et al., 1993). A calpaina II, uma protease dependente de cálcio,
degrada pp39mos (Watanabe et al., 1989). Assim, os dois componentes do CSF são
inativados ou destruídos. Sem CSF, a ciclina pode ser degradada, e a divisão meiótica
pode ser completada (Figura 22.24).
Progesterona secretada Liberação da

pelas células foliculares parada da metáfase
libera a parada da interfase pela fertilização
Metáfase: meiose II
Parada em Meiose I parada de metáfase Mitose I
Estágio do
interfase em metáfase mediada por CSF Primeira fase-S em metáfase
ciclo celular
Alta
Atividade de MPF
Baixa
Síntese protéica Calpaina II Ciclina B

Cam-PK II
Estágio
desenvolvimental Esperma-
tozóide
Oócito Imaturo GVBD Oócito ou Fertilização Primeira Primeira

(Parada G2) (primeira meiose) óvulo maduro mitose clivagem
(segunda meiose)
Figura 22.24
Representação esquemática da maturação do oócito de Xenopus, mostrando a regulação da divi-
são meiótica da célula por pp39mos, cdk2 e calpaina II. A linha sólida no gráfico representa os
níveis relativos de MPF ativo. As barras sob o traçado mostram os períodos quando as sínteses
de determinadas proteínas são necessárias para a entrada na próxima fase M. GVBD é o ponto da
desintegração da vesícula germinativa. A morfologia do oócito está representada embaixo. (Se-
gundo Minishull, 1993.)
Transcrição Gênica em Oócitos
Na maioria dos animais (insetos sendo uma exceção importante), o oócito em cresci-
mento é ativo na transcrição de genes onde os produtos são ou (1) necessários para
o metabolismo celular, (2) necessários para processos específicos do oócito, ou (3)
requeridos para o desenvolvimento precoce antes do núcleo começar a funcionar. Em
camundongos, por exemplo, o oócito diplóteno em crescimento está ativamente trans-
crevendo os genes para as proteínas da zona pelúcida ZP1, ZP2 e ZP3. Esses genes
são transcritos somente no oócito e não em qualquer outra célula (Epifano et al., 1995;
veja Capítulo 2).
O oócito anfíbio tem certos períodos em que a síntese de RNA é muito ativa.
Durante o estágio diplóteno, certos cromossomos estendem grandes laços de DNA,
fazendo com que o cromossomo se assemelhe a uma escova (um útil instrumento para
limpeza de tubos de ensaio em tempos anteriores ao uso de materiais descartáveis).
Esses cromossomos em forma de escova (Prancha 2) podem ser vistos nos locais da
síntese de RNA por hibridização in situ. Cromossomos de oócitos podem ser prepara-
dos, desnaturados e incubados com RNA radiativo que codifica uma proteína especí-
fica. Após o RNA não-ligado ter sido removido por lavagem, a auto-radiografia visualiza
a localização precisa do gene. A Figura 22.25 mostra o cromossomo diplóteno I da
salamandra Triturus cristatus após incubação com mRNA da histona radiativo. Fica
Figura 22.25
óbvio que o gene (ou conjunto de genes) da histona está localizado em uma das Localização (ponta da seta) dos genes histona
dobras do cromossomo em forma de escova (Old et al., 1977). Micrografias eletrônicas em um cromossomo em forma de escova em um
de transcritos de genes dos cromossomos em forma de escova também permitem que oócito de anfíbio. Os genes foram visualizados
se veja cadeias de mRNA destacando-se de cada gene à medida que esse estiver por hibridização in situ e auto-radiografia. (de
sendo transcrito (Hill e MacGregor, 1980). Old et al., 1977, cortesia de H. G. Callan.)
Figura 22.26 Alta RNAs ribossômicos

Produção de RNA ribossômico em oócitos de tRNA
Taxa relativa de síntese

Xenopus. (A) Taxas relativas da síntese de
DNA, tRNA e rRNA na oogênese de anfíbios
durante os últimos três meses antes da ovula- DNA
ção. (B) A transcrição do precursor do RNA
dos RNAs ribossômicos 28S, 18S e 5.8S. Es-
sas unidades estão ligadas em série, aproxima-
damente 450 por genoma haplóide. (A de RNA 5S
Gurdon, 1976; B cortesia de O. L. Miller Jr.) Baixa
Amplificações de rDNA
Hormônio
Oócito pituitário
Começa o totalmente
acúmulo de vitelo crescido Fertilização
3 meses crescimento do oócito Maturação

16 horas
Transcrição por
gravidade do RNA Fim da
(B) Começa a transcrição ribossômico transcrição DNA de espaçamento não-transcrito
Em adição à síntese de mRNA, os padrões de transcrição de rRNA e tRNA são

também regulados durante a oogênese. A Figura 22.26 A mostra a síntese de
ribossomos e RNA de transferência durante a oogênese de Xenopus. A transcrição
parece começar em oócitos precoces (estágio I, 25-40 µm), durante o estágio diplóteno
da meiose. Nesse ponto, todos os RNAs ribossômico e de transferência necessários
para a síntese protéica até o estágio de blástula intermediária são produzidos, e
todos os mRNAs maternos para o desenvolvimento precoce são transcritos. Esse
estágio dura meses em Xenopus. A taxa de produção de RNA ribossômico é espan-
tosa. O genoma do oócito de Xenopus tem mais de 1800 genes codificando o rRNA
18S e 28S, e esses genes são amplificados seletivamente até que existam mais de
500.000 genes produzindo esses RNAs ribossômicos (Figura 22.26B; Brown e Dawid,
1968). Após atingir certo tamanho, os cromossomos do oócito maduro (estágio VI)
se condensam, e os genes não estão transcrevendo ativamente. Essa condição de
“oócito maduro” também pode perdurar por meses. Após estimulação hormonal, o
oócito completa sua primeira divisão meiótica e é ovulado. Os mRNAs armazenados
pelo oócito agora se juntam aos ribossomos para iniciar a síntese protéica. Dentro
de horas, a segunda divisão meiótica começou, e o oócito secundário foi fertilizado.
Os genes do embrião não começam a transcrição ativa antes da transição da blástula
intermediária (Davidson, 1986). [germ2.html]
Conforme vimos no Capítulo 12, os oócitos de várias espécies produzem duas
classes de mRNAs – aqueles de uso imediato no oócito e aqueles que são armazena-
dos para uso durante o desenvolvimento precoce. Em ouriços-do-mar, a tradução
das mensagens maternas armazenadas é iniciada pela fecundação, enquanto em rãs o
sinal para tal tradução é iniciado pela progesterona quando o ovo está prestes a ser
ovulado. Uma das ações da atividade da quinase MPF induzida pela progesterona pode
ser a fosforilação das proteínas ligantes de CPE nos mRNAs do oócito armazenados.
A fosforilação desses fatores está associada com o prolongamento das caudas

poli(A) nas mensagens armazenadas e com a tradução dos mRNAs armazenados
(Paris et al., 1991).
Oogênese Meroística em Insetos
Existem vários tipos de oogênese em insetos, mas a maioria dos estudos focalizaram
os insetos, tais como Drosophila e mariposas, que sofrem oogênese meroística.
Nesse processo as conexões citoplasmáticas permanecem entre as células produzidas
pelo oogônio. Em Drosophila, cada oogônio se divide quatro vezes para produzir um
clone de 16 células conectadas uma à outra através de canais anelares. A produção
dessas células interconectadas (chamadas cistócitos) envolve uma seqüência alta-
mente organizada de divisões celulares (Figura 22.27). Somente as duas células apre-
sentando quatro interconexões são capazes de se desenvolver em oócitos, e dessas
duas, somente uma torna-se um óvulo. A outra inicia a meiose mas não a termina.
Figura 22.27
Assim, somente um de 16 cistócitos pode tornar-se um óvulo. Todas as outras células A formação de 16 cistócitos interconectados
se tornam células nutrizes. Mostra-se que a célula destinada a ser o oócito é aquela em Drosophila. (A) Diagrama de um ovaríolo
residindo na extremidade mais posterior da câmara do ovo que contém o clone de 16 adulto mostrando a seqüência da oogênese com
células. Porém, já que as células nutrizes estão conectadas ao oócito através de suas cistos germinativos mais jovens, amadurecen-
pontes citoplasmáticas, o complexo inteiro pode ser visto como uma unidade produ- do dentro do ovaríolo. (B) Divisão das células
tora de um óvulo. formadoras de cistócitos (cistoblastos). As
O ovário meroístico nos confronta com alguns problemas interessantes. Se todas células estão representadas esquematicamente
as células estão conectadas de modo que as proteínas e os RNAs podem transitar dividindo-se em um único plano. Uma célula-
tronco se divide para produzir outra célula-tron-
livremente entre elas, porque teriam destinos desenvolvimentais diferentes? Porque
co mais uma célula comprometida a formar os
uma célula se torna o oócito enquanto as outras se tornam “fábricas sintetizadoras de cistócitos. Somente um dos 16 cistócitos tor-
RNA”, enviando mRNAs, ribossomos e mesmo centríolos para o interior do oócito? na-se um oócito; os outros tornam-se células
Porque o fluxo de proteína e RNA vai somente em uma direção? À medida que os nutrizes, conectadas ao oócito por canais ane-
cistócitos se dividem, se forma uma grande estrutura rica em espectrina chamada lares (pontes citoplasmáticas). O centríolo do
fussomo, cobrindo as pontes citoplasmáticas entre as células (Figura 22.27). Esse é cistócito 1 retém o fussomo (em vermelho),
construído assimetricamente, pois sempre cresce do pólo do fuso que permaneceu que cresce através do canal anelar em direção à
em uma das células (Lin e Spradling, 1995). A célula que reteve o fussomo durante a sua irmã mitótica. A seta mostra a polaridade,
primeira divisão se torna o oócito. Não é ainda conhecido se o fussomo contém de- apontando para a célula da qual cresceu o
fussomo. Após mais três divisões mitóticas é
terminantes oogênicos, ou se ele dirige o tráfego de materiais para o interior dessa
formado o cisto de 16 células. Se o transporte
célula em particular. intracelular for coordenado pelo fussomo, o
Uma vez estabelecidos os padrões de transporte, o citoesqueleto fica ativamente transporte de mRNAs e proteínas iria para o
envolvido no transporte de mRNAs das células nutrizes para o citoplasma do oócito cistócito 1, que assim se tornaria o oócito. (A
(Cooley e Theurkauf, 1994). O arranjo microtubular é crítico para a determinação do segundo Ruohola et al., 1991; B segundo Lin e
oócito. Se essa grade for rompida (quimicamente ou por mutações tais como bicaudal-D Spradling, 1995.)
(A) Anterior Célula nutriz Oócito Posterior
Células
foliculares
posteriores
(B)
Mais 2
divisões
Cistoblasto Cisto de 2 células
em divisão
Fussomo
ou egalitarian), os produtos dos genes são transmitidos em todas as direções e

todas as 16 células se diferenciam em células nutrizes (Gutzeit, 1986; Theurkauf et
al., 1992, 1993; Spradling, 1993). É possível que alguns compostos transportados
das células nutrizes para o oócito fiquem associados com proteínas transportadoras
como a cinesina, o que poderia capacitá-las a viajar na esteira de microtúbulos
estendendo-se através do canal anelar (Theurkauf et al., 1992; Sun e Wyman, 1993).
A actina pode tornar-se importante na manutenção dessa distinção durante os está-
gios mais tardios da oogênese. Mutações que impedem microfilamentos de actina
forrarem os canais anelares previnem o transporte de mRNAs da célula nutriz para o
oócito, e a ruptura dos filamentos de actina faz com que a distribuição de mRNA seja
ao acaso (Cooley et al., 1993; Watson et al., 1993). Assim, o citoesqueleto microtubular
e microfilamentoso parece controlar o movimento de organelas e RNAs entre células
nutrizes e oócito fazendo com que os sinais desenvolvimentais sejam trocados
Figura 22.28
somente na direção apropriada.
Transporte de mRNA de células nutrizes para
oócitos da mosca. (A,B) Auto-radiografias da
célula folicular da mosca doméstica, Musca TRANSPORTE DE RNA DAS CÉLULAS NUTRIZES PARA O OÓCITO. Os oócitos
domestica, após incubação com citidina [3H]. de insetos meroísticos não passam pelo estágio transcricional ativo, nem apresentam
(A) Câmara do ovo fixada imediatamente após cromossomos em forma de escova. Ao contrário, evidência auto-radiográfica mostra
introdução da marca. Os núcleos das células que a síntese de RNA é, em grande parte, confinada às células nutrizes e que o RNA
nutrizes estão fortemente marcados, indican- produzido por essas células é ativamente transportado para o citoplasma do oócito.
do que estão sintetizando novo RNA. O oócito Isso pode ser visto na Figura 22.28. Quando as câmaras de ovo da mosca doméstica
permanece não-marcado exceto onde algum são incubadas em citidina radioativa, os núcleos das células nutrizes mostram intensa
RNA esteja escapando para o oócito através
marcação. Quando a marcação é interrompida, e as células são incubadas por mais 5
da conexão citplasmática entre esse e a célula
nutriz (seta). (B) Uma câmara do ovo seme- horas em meios não-radioativos, o RNA marcado é visto entrar no oócito a partir das
lhante fixada 5 horas mais tarde. A marca células nutrizes (Bier, 1963). A oogênese ocorre em somente 12 dias, sendo as célu-
desapareceu dos núcleos da célula nutriz, las nutrizes metabolicamente muito ativas durante esse tempo. Elas são ajudadas na
movendo-se para o citoplasma. Além disso, o sua eficiência transcricional tornando-se politênicas. Em lugar de ter duas cópias de
RNA radiativo pode ser visto passando para cada cromossomo, elas replicam seus cromossomos até terem produzido 512 cópias.
o citoplasma do oócito através dos dois canais As 15 células nutrizes são conhecidas por passar RNAs ribossômicos e mensageiros
entre as células nutrizes e o oócito. (C) Auto- assim como proteínas para o citoplasma do oócito; e ribossomos inteiros podem ser
radiografia da câmara do ovo de Drosophila também transportados (Prancha 16). Os mRNAs não se associam com polissomos,
corada por uma sonda radioativa para o mRNA
sugerindo que eles não são imediatamente ativos na síntese protéica (Paglia et al.,
bicoid. Essa mensagem é transportada das cé-
lulas nutrizes e permanece na porção mais an- 1976; Telfer et al., 1981).
terior do oócito. (A e B de Bier, 1963, corte-
sia de D. Ribbert; C de Stephanson et al.,
1988, cortesia de E. C. Stephanson.)
(A) (B) (C)
Núcleo da
célula nutriz
Citoplasma da
célula nutriz
Citoplasma
do oócito
Epitélio
folicular
& Especulações
A Origem dos Eixos Embrionários de

Drosophila Durante a Oogênese
gurken
O S EIXOS ÂNTERO-POSTERIOR e A reorientação dos microtúbulos é um (A)

dorsoventral são estabelecidos evento crítico. Os mRNAs nanos e oskar WT
Núcleo
durante a metade da oogênese são sintetizados pelas células nutrizes e são oskar
(González-Rayes et al., 1995; Roth et al., inicialmente vistos na futura zona anterior
1995). O mRNA para o determinante ante- do óvulo. Esses mRNAs podem ser trans-
rior, bicoid, é colocado na região anterior portados para o pólo posterior ao longo dos
do óvulo; os mRNAs para os determinan- microtúbulos para o teminal positivo (mas bicoid
tes posteriores, oskar e nanos, são envia- não para o terminal negativo). Assim, essas
dos para o pólo posterior; a mensagem mensagens podem agora ser transportadas gurken
gurken fica concentrada em uma região do para o pólo posterior. A mensagem oskar é
oskar
óvulo, aí iniciando as reações que estabe- crítica para a organização do plasma polar, (B)
lecem esse lado como a superfície dorsal e se for traduzida antes de atingir o pólo PKA - bicoid
do embrião. Os mecanismos para a cons- posterior, pode estabelecer abdomens e cé-
trução desses eixos envolvem complexas lulas germinativas em outros lugares. Du-
interações entre as células nutrizes, o oócito rante sua jornada para o posterior, a mensa-
e as células foliculares (veja Figura 14.13). gem oskar é reprimida pela proteína Bru-
Primeiro, a mensagem gurken é produzida no (que se liga à 3’UTR da mensagem
pelas células nutrizes, e se aglutina ao re- oskar). Uma vez na posição posterior, essa
dor do núcleo do oócito, posicionando-se repressão é abolida e a proteína Oskar pode Figura 22.29
ser produzida (Kim-Ha et al., 1995; Rongo Localização do RNA nos oócitos de Drosophi-
entre o núcleo e a membrana plasmática. O
la tipo selvagem e mutantes deficientes em PKA.
núcleo está na região posterior do óvulo, e et al., 1995). Reciprocamente, a mensagem
(A) No oócito do tipo selvagem (estágio 9), o
a proteína Gurken recém-transcrita ativa seu bicoid é conservada no anterior pelos ter-
mRNA oskar está no pólo posterior, o mRNA
receptor nas células foliculares no pólo pos- minais negativos dos microtúbulos. Se es- bicoid está nas margens anteriores, e o mRNA
terior. (A proteína Gurken se parece com o ses forem desagregados, a mensagem se gurken está localizado no canto anterior dorsal.
fator de crescimento epidérmico.) Essas cé- difunde para o citoplasma, e se a polarida- (B) Nos oócitos deficientes em PKA, a distri-
lulas foliculares do pólo posterior responde dos microtúbulos for retida em sua con- buição da mensagem gurken não é afetada, mas
dem enviando um sinal (talvez AMP formação original (como nas moscas caren- o mRNA oskar deixa de se localizar no pólo
cíclico) que ativa a proteína quinase A tes em PKA), a mensagem bicoid será trans- posterior e se acumula centralmente, enquanto o
(PKA) na membrana celular do oócito. portada para o pólo posterior (Figura 22.29; mRNA bicoid é transportado para o pólo poste-
Como um resultado da ativação de PKA, Macdonald et al., 1991; Marcey et al., 1991; rior. (Segundo Lasko, 1995.)
os microtúbulos do oócito são reorienta- Pokrywka e Stephenson, 1991.) Esse posi-
dos (Lane e Kalderon, 1994).* Em lugar cionamento do mRNA bicoid na futura as células foliculares adjacentes se conver-
de ter seus terminais positivos apontados posição anterior a das mensagens oskar e tam em células dorsais. (As células folicula-
para as células nutrizes (i.e., anteriormen- nanos na futura posição posterior estabele- res polares e laterais produzem proteínas di-
te), elas revertem seus terminais positivos ce as condições para a organização do eixo ferentes e respondem de maneira diferente
de modo que fiquem posteriores (onde ântero-posterior (veja Capítulo 15). ao sinal Gurken. As células foliculares pola-
havia estado o núcleo). O realinhamento dos microtúbulos faci- res ativam a PKA do oócito; as células foli-
lita o movimento do núcleo com seu sinal culares laterais se tornam dorsalizadas e re-
*PKA é também conhecida por organizar mi- Gurken, ao longo da membrana plasmática primem a síntese de proteínas ventralizan-
crotúbulos no crescimento axônico (Shea et al.,
1992), e como vimos no Capítulo 1, isso pode do óvulo em direção ao canto dorsal anteri- tes). Assim, os eixos ântero-posterior e dor-
mediar a diferenciação da célula peduncular em or (Roth et al., 1995; González–Reyes et al., soventral em Drosophila são iniciados an-
Dictyostelium (Williams et al., 1993). 1995). Aqui, a proteína Gurken faz com que tes mesmo de ocorrer a fertilização.
TRANSPORTE DAS PROTEÍNAS DO VITELO PARA O OVO. As três principais

proteínas do vitelo em Drosophila são produzidas no corpo gorduroso e ovário,
mas não no oócito propriamente dito (Bownes, 1982; Brennen et al., 1982). A síntese
do vitelo é controlada por vários agentes interativos, incluindo sexo, níveis de
Cérebro hormônio juvenil, ecdisona e nutrição. Esses agentes fisiológicos são “integra-
dos” pela região intensificadora entre os dois genes da proteína do vitelo de
Drosophila (veja Figura 10.13; Bownes et al, 1988). Esses genes são somente
Hormônio cerebral
ativos em moscas fêmeas, e isso é regulado pela ligação da proteína Doublesex
específica de fêmea a essa região do intensificador. Acredita-se que um hormônio
cerebral, respondendo a sinais ambientais*, estimule o corpora allata a secretar
Corpora allata hormônio juvenil (Figura 22.30). O hormônio juvenil (1) regula a captação de
peptídeos vitelínicos na superfície do oócito, (2) estimula a síntese de proteínas
vitelínicas do ovário (que são idênticas àquelas produzidas pelo corpo gorduro-
Hormônio juvenil so), e (3) faz com que os folículos ovarianos e outras células abdominais secretem
ecdisona. Essa é metabolizada para sua forma ativa - 20-hidroxiecdisona - e esti-
Células Ovário
mula o corpo gorduroso a produzir proteínas do vitelo, tal como o estradiol esti-
abdominais
produtoras de mula o fígado anfíbio a fazê-lo. Da mesma maneira, a administração de ecdisona a
ecdisona machos adultos faz com que seus corpos gordurosos secretem proteínas vitelínicas
(Postlethwait et al., 1980) e que a proteína vitelínica seja levada para os oócitos de
Proteínas
Ecdisteróides vitelínicas insetos através de endocitose mediada por receptores (Raikhel e Dhadialla, 1992).
Os receptores para a vitelogenina estão localizados em regiões da membrana do
oócito na base das microvilosidades e entre as mesmas. Os complexos receptor-
Corpo Proteínas
vitelínicas vitelogenina são internalizados e a vitelogenina é liberada do receptor dentro do
gorduroso
vacúolo endocítico. Esse se funde com outros endossomos para formar o grânulo
repleto de vitelogenina armazenado pelo vitelo.
Figura 22.30
Modelo para a regulação hormonal da síntese Oogênese em Mamíferos
de peptídio vitelínico em D. melanogaster. Em
resposta a um hormônio cerebral, o corpora A ovulação do óvulo dos mamíferos segue um de dois padrões básicos, dependendo
allata produz hormônio juvenil, que faz com da espécie. Um tipo de ovulação é estimulado pelo ato físico da copulação. A
que o ovário produza proteínas vitelínicas e estimulação física do cérvix desencadeia a liberação de gonadotrofinas da hipófise.
ecdisteróides. O hormônio juvenil também in- Essas gonadotrofinas sinalizam o ovo para recomeçar a meiose e iniciar os eventos
duz a síntese de ecdisteróides nas células abdo-
que expelem o óvulo do ovário. Esse método assegura que a maior parte das copulações
minais. Esses ecdisteróides motivam o corpo
gorduroso a produzir proteínas vitelínicas que
conduz a óvulos fertilizados; e animais que utilizam esse método de ovulação – coe-
são transportadas para o ovário. (Segundo lhos e visões – têm a reputação de procriações bem sucedidas.
Bownes, 1982.) A maioria dos animais, porém, tem um tipo periódico de ovulação. A fêmea
apenas ovula em épocas específicas do ano, chamadas de estro (ou seu equiva-
lente português “cio”). Nesses casos, sinais ambientais, mais notavelmente a
quantidade e o tipo de iluminação diurnos, estimulam o hipotálamo a liberar o fator
liberador de gonadotrofina. Esse estimula a hipófise para liberar suas
gonadotrofinas – o hormônio estimulante de folículos (FSH) e o hormônio luteini-
zante (LH) – que faz com que as células foliculares se proliferem e secretem
estrógeno. O estrógeno subseqüentemente penetra em certos neurônios e evoca
o padrão de comportamento copulatório característico da espécie. As
gonadotrofinas também estimulam o crescimento folicular e a iniciação da ovula-
ção. Assim, estro e ovulação ocorrem em épocas próximas.
Os seres humanos apresentam variação sobre o tema da ovulação periódica.
Embora fêmeas humanas tenham ovulação cíclica (em média de cerca de 29.5
dias), sem estro anual definido, a maior parte da fisiologia reprodutiva humana é
compartilhada com outros primatas. A característica periodicidade dos primatas
na maturação e liberação de óvulos é chamada ciclo menstrual porque envolve o
* Em Drosophila, o sinal ambiental parece ser o fotoperíodo. No mosquito comum, o sinal é a refeição
sangüínea. Somente mosquitos fêmeas picam, e elas não produzem vitelogenina antes da refeição.
Algum fator sangüíneo estimula o cérebro do mosquito para liberar o hormônio juvenil e o fator estimulador
do corpocardíaco. Esse último fator causa a liberação do hormônio neurosecretório do desenvolvi-
mento do ovo (EDNH). Esse estimula o ovário a secretar vitelogenina (Hagedorn, 1983; Borovsk
et al., 1990). (Veja Capítulo 21.)
(A)
Células
Granulosas Células
Granulosas
Células
Células
tecais
tecais
FOLÍCULOS
PRIMORDIAIS
(B) Células tecais

Zona pelúcida
Coroa radiata
Antro
Células granulosas
Membrana
granulosa Oócito
FOLÍCULO GRAAFIANO
Figura 22.31
O folículo ovariano dos mamíferos. (A) Maturação do folículo ovariano. Quando maduro, ele é
freqüentemente chamado folículo Graafiano. (B) Microfotografia eletrônica de varredura de um
foliculo maduro no rato. O oócito (centro) está rodeado pelas menores células granulosas que irão
constituir a coroa. (A segundo Carlson, 1981; B cortesia de P. Bagavandoss.)
periódico sangramento e descarte de detritos celulares do útero em intervalos

mensais.* O ciclo menstrual representa a integração de três atividades muito dife-
rentes: (1) o ciclo ovariano, cuja função é amadurecer e liberar um oócito, (2) o
ciclo uterino, cuja função é prover o ambiente apropriado para o blastocisto de-
senvolvido se implantar, e (3) o ciclo cervical, cuja função é de somente permitir a
entrada do espermatozóide no trato reprodutivo feminino no momento apropria-
do. Essas três funções estão integradas através dos hormônios da hipófise,
hipotálamo e ovário.
A maioria dos oócitos são mantidos no interior do ovário humano adulto no está-
gio diplóteno prolongado da primeira prófase meiótica (freqüentemente referida como
o estado dictíado). Cada oócito está envolvido por um folículo primordial consistindo
de uma camada única de células granulosas epiteliais e uma camada menos organizada
de células tecais mesenquimatosas (Figura 22.31). Periodicamente um grupo de folículos
primordiais entra em estágio de crescimento. Nesse período, o oócito sofre um aumen-
to de volume de 500 vezes (correspondendo a um aumento do diâmetro de 10 µm em
um folículo primordial, para 80 µm em um folículo totalmente desenvolvido).
* O descarte periódico do revestimento uterino é um processo ativo observado em todos os mamíferos.

O útero tem intrincadas adaptações circulatórias (como as artérias espirais) que permitem ao sangue fluir
livremente por algum tempo sem coagular e em seguida cessar seu fluxo (para evitar uma hemorragia).
Profet (1993) propôs que a menstruação trata-se de uma crucial função imunológica, protegendo o útero
contra infecções pelo sêmen ou outros agentes ambientais.
Concomitantemente com o crescimento do oócito ocorre um aumento no número de

células granulosas foliculares, que forma camadas concêntricas ao redor do oócito.
Essa proliferação das granulosas é mediada pelo fator parácrino, GDF-9, um membro
da família TGF-β (Dong et al., 1996). Através de todo esse período de crescimento, o
oócito permanece no estágio dictíaco. O folículo completamente crescido contém
um grande oócito rodeado por várias camada de células granulosas. Muitas dessas
células permanecerão com o óvulo liberado, formando o “cumulus”, que envolve o
óvulo no oviduto. Além disso, durante o crescimento do folículo se forma um antro
(cavidade), que se enche com uma complexa mistura de proteínas, hormônios, cAMP
e outras moléculas. A qualquer momento, um pequeno grupo de folículos está
madurecendo. Porém, após progredir para um estágio mais maduro, a maioria dos
oócitos e seus folículos morrem. Para sobreviver, um folículo tem que encontrar uma
fonte de hormônios gonadotróficos e “pegando a onda” no momento apropriado,
ele tem que cavalgá-la até que atinja o cume. Assim, para que ocorra a maturação do
oócito, o folículo terá que estar em um certo estágio de desenvolvimento quando
nascem as ondas de gonadotrofina.
O dia 1 do ciclo menstrual é considerado ser o primeiro dia do “sangramento”
(Figura 22.32). Esse sangramento da vagina representa o desbastamento de teci-
do extra-uterino e vasos sangüíneos que teriam ajudado na implantação do
blastocisto. Na primeira fase do ciclo (chamada fase proliferativa ou folicular),
a glândula pituitária começa a secretar quantidades cada vez maiores de FSH. O
grupo de folículos em maturação que já sofreram algum desenvolvimento, res-
pondem a esse hormônio com mais crescimento e proliferação celular. O FSH
induz também a formação de receptores de LH nas células granulosas. Pouco
após esse período de crescimento folicular inicial, a pituitária começa a secretar
LH. Em resposta ao LH, o bloqueio meiótico é quebrado. A membrana nuclear de
oócitos competente se desintegra e os cromossomos se reúnem para sofrer a pri-
meira divisão meiótica. Um conjunto de cromossomos é conservado no interior do
oócito, e o outro é fornecido ao pequeno corpo polar. Ambos estão revestidos
pela zona pelúcida, que foi sintetizada pelo oócito em crescimento. É nesse está-
gio que o ovo será ovulado.
As duas gonadotrofinas, atuando em conjunto, fazem com que as células folicula-
res produzam quantidades crescentes de estrógeno, que tem ao menos cinco princi-
pais atividades na regulação do progresso do ciclo menstrual:
1. Faz com que a mucosa uterina inicie sua proliferação e se enriqueça em vasos
sangüíneos.
2. Faz com que o muco cervical se afine, permitindo o espermatozóide entrar nas
porções internas do trato reprodutivo.
3. Causa um aumento do número de receptores de FSH nas células granulosas
(Kammerman e Ross, 1975) e simultânea diminuição da produção de FSH
pela hipófise. Estimula também as células granulosas a secretarem o hormônio
peptídico inibina, que também suprime a secreção hipofisária de FSH (Rivier et
al., 1986; Woodruff et al., 1988).
4. Em baixas concentrações, inibe a produção de LH, mas em altas concentra-
ções a estimula.
5. Em concentrações muito altas e longos períodos, o estrógeno interage com o
hipotálamo, fazendo com que ele secrete o fator liberador de gonadotrofina.
À medida que os níveis de estrógeno aumentam como um resultado da produ-

ção folicular, os níveis de FSH declinam. Todavia os níveis de LH continuam a
aumentar à medida que mais estrógeno é secretado. À medida que o estrógeno é
produzido (dias 7-10), as células granulosas continuam a crescer. Começando no
dia 10, a secreção de estrógeno aumenta pronunciadamente. Esse aumento é se-
guido no meio do ciclo por uma enorme onda de LH e uma menor explosão de FSH.
Figura 22.32
O ciclo menstrual humano. A coordenação de
ciclos (B) ovarianos e (D) uterinos é contro-
Gonadotrofinas lada pelos (A) hormônios hipofisário e (C)
Hormônio luteinizante (LH)
(da hipófise anterior) ovariano. Durante a fase folicular, o ovo ama-
durece dentro do folículo, e o revestimento
uterino é preparado para receber o embrião.
(A) O ovo maduro é liberado ao redor do dia 14.
Se um embrião não for implantado no útero, a
parede uterina começa a se desintegrar, levan-
do à menstruação.
Hormônio estimulante de folículos (FSH)
Eventos no ovário Ovulação Corpo lúteo

(B) Folículo em desenvolvimento
Ovo
Hormônios ovarianos Progesterona

(C)
Estrógeno
Revestimento uterino
(D)
Menstruação Fase folicular Fase lútea
Dia do ciclo menstrual
Experimentos com macacas mostraram que a exposição do hipotálamo a mais de

200pg de estrógeno por ml de sangue por mais que 50 horas resulta na secreção
hipotalâmica do fator libertador de gonadotrofina. Esse fator subseqüentemente
causa a liberação de FSH e LH da hipófise. Dez a 12 horas após o pico de
gonadotrofina, o óvulo é ovulado (Figura 22.33; Garcia et al., 1981). Embora o
mecanismo detalhado da ovulação não seja ainda conhecido, a expulsão física do
oócito maduro do folículo parece ser devida a um aumento induzido de LH na
colagenase, ativador de plasminogênio e prostaglandina no interior do folículo
(Lemaire et al., 1973). O mRNA para o ativador de plasminogênio encontrava-se
dormente no citoplasma do oócito. O LH faz com que essa mensagem seja
poliadenilada e traduzida nessa poderosa protease (Huarte et al., 1987). As
prostaglandinas podem causar contrações localizadas nos músculos lisos do ová-
rio e pode também aumentar o fluxo de água dos capilares ovarianos (Diaz-Infante
et al., 1974; Koos e Clark, 1982). Se a síntese de prostaglandina ovariana for inibi-
da, a ovulação não ocorre. Além da pressão induzida pela prostaglandina, as
colagenases e a protease ativadora de plasminogênio se afrouxam e digerem a
matriz extracelular do folículo (Beers et al., 1975; Downs e Longo, 1983). O resulta-
do do efeito do LH seria, então, um aumento da pressão folicular acoplada com a
degradação da parede folicular. Um orifício seria formado e digerido, através do
qual o óvulo irromperia.
Figura 22.33
Ovulação no coelho. O ovário de um coelho vivo anestesiado foi
exposto e observado. Quando o folículo começou a ovular, o ovário
Cumulus
foi removido, fixado e corado. (Cortersia de R. J. Blandau.)
Oócito
Ovário
Folículo imaturo
Células foliculares
remanescentes
Após a ovulação, começa a fase lútea do ciclo menstrual. As células restantes do

folículo rompido sob a influência do LH tornam-se o corpo lúteo. (Elas são capazes de
responder a esse LH porque o surto de FSH as estimula a desenvolver mais receptores
de LH.) O corpo lúteo secreta algum estrógeno, mas a sua secreção predominante é a
progesterona. Esse hormônio esteróide circula até o útero, onde completa a tarefa de
preparar o tecido uterino para a implantação do blastocisto, estimulando o crescimen-
to da parede uterina e seus vasos sangüíneos. O bloqueio do receptor da progesterona
com o esteróide sintético mifepristona (RU486) impede a parede uterina de engrossar
e previne a implantação do blastocisto no útero (Couzinet et al., 1986).* A progesterona
também inibe a produção de FSH, com isso prevenindo a maturação de mais folículos
e óvulos. (Por essa razão, tal combinação de estrógeno e progesterona tem sido usada
em pílulas de controle da natalidade. O crescimento e a maturação de novos óvulos
são prevenidos enquanto o FSH estiver inibido).
Se o óvulo não for fecundado, o corpo lúteo se degenera, a secreção de progesterona
cessa e a parede uterina é descartada. Com o declínio dos níveis de progesterona
sérica, a hipófise volta a secretar FSH e o ciclo é recomeçado. Porém, se ocorrer
fertilização, o trofoblasto secreta um novo hormônio, luteotropina, que faz com que
o corpo lúteo permaneça ativo e os níveis de progesterona sérica se mantenham altos.
Assim, o ciclo menstrual permite a maturação periódica e a ovulação dos óvulos
humanos permitindo ao útero desenvolver-se periodicamente em um órgão capaz de
nutrir durante nove meses um organismo em desenvolvimento.
O óvulo e o espermatozóide irão ambos morrer se não se encontrarem. Voltamos
assim para onde começamos. O palco está preparado para a fecundação. Como reco-
nhecido por F. R. Lillie em 1919, “Os elementos que se unem são células únicas, cada
qual a ponto de morrer; mas pela sua união é formado um indivíduo rejuvenescido,
que constitui um elo no eterno processo da Vida.
* RU486 é considerado competir pelo receptor de progesterona no interior do núcleo. RU486
pode se ligar ao sítio de progesterona no receptor, e o complexo receptor-RU486 parece formar
heterodímeros com o receptor normal de progesterona a essa ligado. Quando esse complexo RU486-
progesterona se liga aos elementos intensificadores responsivos à progesterona no DNA, a transcri-
ção desse sítio é inibida (Vegeto et al., 1992; Spitz e Bardin, 1993). Na Europa o RU486 tornou-se
uma alternativa largamente empregada ao aborto cirúrgico (Palka, 1989; Maurice, 1991).
& Especulações
O Reinício da Meiose nos Oócitos de Mamíferos
S E NUMEROSOS FOLÍCULOS são

capazes de maturar quando é
secretado o hormônio estimulan-
te de folículos, por que em geral somente
folículo produz, mais receptores de FSH
ele tem, e menos FSH permanece na circu-
lação. À medida que a concentração de
FSH diminui progressivamente, somente
um folículo e seu oócito prevalecem? Pa- um folículo pode ligar o FSH disponível.
rece que o folículo capaz de produzir a Somente esse folículo pode crescer; os
maior quantidade de estrógeno em respos- outros folículos morrem.
ta ao FSH é aquele que amadurece, en- O que faz o LH causar o reinício da
quanto todos os outros morrem. Aqueles meiose? Para responder a essa pergunta, a
conjuntos de folículos que inicialmente natureza do bloqueio meiótico foi inten-
receberam FSH não somente começam a samente estudada. Como em oócitos de
proliferar, mas também produzir novos re- anfíbios, o estágio dictíado é extremamen-
ceptores de hormônio luteinizante nas suas te importante porque é durante esse perío-
células tecais (Figura 22.34). A recepção do que os oócitos crescem, diferenciam as
de LH faz com que essas células iniciem a estruturas específicas para oócitos, e ad-
produção de estrógeno. Como vimos, o quirem a capacidade de recomeçar a
estrógeno tem dois efeitos diferentes en- meiose (Sorensen e Wassarman, 1976).
volvendo a futura recepção de FSH. Em Experimentos iniciais demonstraram que
um nível, deprime a secreção hipofisária oócitos envoltos em folículos não sofrem (A)
de FSH, enquanto em outro nível aumen- maturação in vivo ou in vitro a não ser
Processo da
ta os receptores de FSH nas células folicu- quando expostos a gonadotrofinas, en- célula folicular
lares. Assim, quanto mais estrógeno um quanto oócitos removidos dos folículos
reiniciam espontaneamente a meiose mes-
mo na ausência de estimulação hormonal
Recepção de FSH (Pincus e Enzmann, 1935).
Parece, portanto, que a meiose normal-
Mais mente é inibida pelas células foliculares e
receptores pode ser reiniciada pelas gonadotrofinas.
de LH
Essa hipótese – que as células foliculares
Diminuição dos
níveis de FSH são importantes reguladores da meiose –
LH (B) Oócito
é fortalecida por observações que células
granulares se comunicam com o oócito Figura 22.35
Mais estrógeno por processos que se estendem através da Comunicação entre oócito e células granulo-
Mais secretado zona. Esses processos têm junções de fen- sas. (A) Oócito de carneiro rodeado pela zona
receptores pelo folículo da que permitem pequenas moléculas pas- pelúcida e células foliculares. As células gra-
de FSH nulosas do folículo estão estendendo proces-
sarem entre o oócito e as células granulo-
sos através da zona pelúcida, tocando o oócito.
sas do folículo (Figura 22.35; Anderson e
(B) Micrografia eletrônica de processos de cé-
Albertini, 1976; Gilula et al., 1978).
lulas foliculares estabelecendo conexões de jun-
Figura 22.34 Porque a elevação dos níveis de cAMP ção de fenda com um oócito de macaco rhesus.
Ciclo de retroalimentação positiva em células inibe a maturação do oócito (Cho et al., Junções de fenda (setas) estão coradas com
foliculares de mamíferos. A recepção do hor- 1974), foi proposto que a parada meiótica lantanio ionizado. (A de Moor e Cran, 1980,
mônio estimulante de folículos (FSH) leva à é mantida pela transferência de cAMP atra- cortesia dos autores; B de Anderson e Albertini,
produção de mais receptores do hormônio lu- vés das junções de fenda da células granu-
teinizante (LH). As células foliculares secre- 1976, cortesia de D. Albertini.)
tam estrógeno quando estimuladas pelo LH; o losas foliculares para o oócito (Dekel e
estrógeno ocasiona tanto um aumento no nú- Beers, 1978, 1980). O surto de hormônio ser crítico para o reinício da meiose. A de-
mero de receptores de FSH como um decrésci- luteinizante poderia desencadear a matu- sintegração da vesícula germinativa pode
mo na produção de FSH pela hipófise. Por ração terminando a comunicação pela jun- ser prevenida inibindo-se a degradação de
fim, muito poucos folículos permanecem ca- ção de fenda, com isso inibindo a transfe- cAMP em ovos livres de folículos ou dire-
pazes de receber as pequenas quantidades de
FSH produzidas, com isso amplificando sua rência da cAMP para o oócito. Várias li- tamente provendo tais ovos com cAMP
capacidade de receber LH. Esses poucos nhas de evidência apoiam essa hipótese. (Bornslaeger et al., 1986). O declínio da
folículos são capazes de amadurecer. Primeiramente, o declínio de cAMP parece concentração de cAMP do oócito ocorre
imediatamente antes do reinício da meiose Baixa atividade de adenil ciclase Alta atividade de adenil ciclase ou
(Figura 22.36; Schultz et al., 1983). ou alta atividade da fosfodiesterase baixa atividade de fosfodiesterase
Em segundo lugar, as gonadotrofinas
podem causar a perda de comunicação entre
as células foliculares e o oócito. As células Alta concentração de cAMP Baixa concentração de cAMP
foliculares parecem ser fontes importantes
de cAMP do oócito, e mudanças da concen-
tração de cAMP nessas células se refletem
nos níveis de cAMP no oócito (Bornslaeger Alta atividade da quinase Baixa atividade da quinase
dependente de cAMP dependente de cAMP
e Schultz, 1985; Racowsky, 1985). Essa ob-
servação explica porque os oócitos perma-
necem em parada meiótica quando rodea-
dos por células foliculares, mas reiniciam a Fosforilação de certas Certas proteínas do
meiose quando essas são removidas. proteínas do oócito oócito não são fosforiladas
O surto de gonadotrofinas pode elevar
a concentração de cAMP da célula folicular
para novos níveis. Em resposta a essa ele- Desintegração da vesícula
Manutenção da
vação, as células foliculares maduras sinte- parada meiótica germinativa; liberação
tizam ácido hialurônico, que causa ruptura da parada meiótica
física do contato entre os processos das cé-
lulas foliculares e o oócito (Eppig, 1979; Figura 22.36
Larsen et al., 1986). As pontes pela quais o Sumário do mecanismo proposto por meio do qual o nível de cAMP do oócito regula o recomeço
cAMP flui da célula granulosa folicular da meiose pelo oócito. Os níveis de cAMP no oócito são providos, ao menos em parte, pelo
cAMP das células foliculares. O AMP cíclico não pode atravessar membranas celulares, mas
para o oócito, com isso, foram removidas,
pode penetrar no oócito através das junções de fenda conectando o oócito com suas células
permitindo o oócito mamífero reiniciar a
foliculares. Quando as conexões são liberadas, os níveis de cAMP do oócito declinam, conduzin-
meiose (Dekel e Sherizly, 1985; Racowsky do à liberação da parada meiótica.
e Satterlie, 1985).
Tal como oócitos de anfíbios, o oócito
ovulado do camundongo está suspenso o fator citostático pp39mos responsável pela volver-se partenogeneticamente (Colled-
na segunda metáfase meiótica e é fecun- parada de meiose na metáfase II. Camun- ge et al., 1994: Hashimoto et al., 1994). É
dado nesse estado. Paules e colaborado- dongos fêmeas deficientes no gene mos evidente que eventos semelhantes têm que
res (1989) mostraram que oócitos de ca- não param sua divisão na metáfase II, e ocorrer para a maturação dos oócitos de
mundongo em maturação também contêm seus ovos freqüentemente tentam desen- anfíbios e mamíferos.
LITERATURA CITADA
Ahringer, J. and Kimble, J. 1991. Control of the Auerbach, R. and Joseph, J. 1984. Cell surface Beers, W. H., Strick1and, S. and Reich, E. 1975.
sperm-oocyte switch in Caenorhabditis elegans markers on endothelial cells: A developmen- Ovarian plasminogen activator: Relationship
hermaphrodites by the fem-3 3’untranslated tal perspective. In E. A. Jaffe (ed.), The Bio- to ovulation and hormonal regulation. Cell 6:
region. Nature 349: 346-348. logy of Endothelial Cells. Nijhoff, The Hague, 387-394.
pp. 393-400.
Ahringer, J., Rosequist, T. A., Lawson, D. N. Bier, K. 1963. Autoradiographische Untersu-
and Kimble, J. 1992. The C. elegans sex Austin, J. and Kimble, J. 1987. glp-1 is required chungen über die Leistungen des Follikelepithels
determining gene, fem-3, is regulated posttrans- in the germ line for regulation of the decision und der Nahrzellen bei der Dottbildung und
criptionally EMBO J. 11: 2303-2310. between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell Eiweissynthese im Fliegenova. Wilhelm Roux
51: 589-599. Arch Entwick1ungsmech. Org. 154: 552-575.
Anderson, E. and Albertini, D. F. 1976. Gap
junctions between the oocyte and companion Baker, S. M. and eleven others. 1996. Involvement Blendy, J. A., Kaestner, K. H., Weinbauer, G. F.,
follicle cells in the mammalian ovary. J. Cell of the mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and Nieschlag, E. and Schütz, G. 1996. Severe
Biol. 71: 680-686. meiotic crossing over. Nat. Genet. 13: 336-342. impairment of spermatogenesis in mice lacking
the CREM gene. Nature 380: 162-165.
Ashley, T., Plug, A. W., Xu, J. H., Solari, AJ., Baker, T. G. 1970. Primordial germ cells. In
Reddy, G., Golub, E. I. and Ward, D. C. 1995. C. R. Austin and R. V. Short (eds.), Repro- Bloom, W. and Fawcett, D. W. 1975. Textbook
Dynamic changes in Rad51 distribution on chro- duction in Mammals, Vol. 1: Germ Cells and of Histology, 10th Ed. Saunders, Philadelphia.
matin during meiosis in male and female Fertilization. Cambridge University Press,
Bornslaeger, E. A. and Schultz, R. M. 1985. Re-
vertebrates. Chromosoma 104: 19-28. Cambridge, pp. 1-13.
gulation of mouse oocyte maturation: Effect of
elevating cumulus cell cAMP on oocyte cAMP Cooley, L. and Theurkauf, W. E. 1994. Dumont, J. N. 1978. Oogenesis in Xenopus
levels. Biol. Reprod. 33: 698-704. Cytoskeletal functions during Drosophila laevis. VI. Route of injected tracer transport in
oogenesis. Science 266: 590-596. follicle and developing oocyte. J. Exp. Zool.
Bornslaeger, E. A., Mattei, P. and Schultz, R. M.
204:193-200.
1986. Involvement of cAMP-dependent protein Cooley, L., Verheyen, E. and Ayers, K. 1992.
kinase and protein phosphorylation in regulati- chickadee encodes a profilin required for Dym, M. 1977. The male reproductive system.
on of mouse oocyte maturation. Dev Biol. 114: intercellular cytoplasm transport during Droso- In L. Weiss and R. O. Greep (eds.), Histology,
453-462. phila oognesis. Cell 69: 173-184. 4th Ed. McGraw-Hill, New York, pp. 979-1038.
Borovsk, D., Carlson, D. A., Griffin, P. R., Couzinet, B., Le Strat, N., Ulmann, A., Baulieu, Dym, M. 1994. Spermatogonial stem celIs of
Shabanowitz, J. and Hunt, D. F. 1990. Mosquito E. E. and Schaison, G. 1986. Termination of the testis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11287-
oostatic factor: A novel decapeptide modulating early pregnancy by the progesterone antagonist 11289.
trypsin-like enzyme biosythesis in the midgut. RU486 (Mifepristone). N. Engl. J. Med. 315:
Dym, M. and Fawcett, D. W. 1971. Further
FASEB J. 4: 3015-3020. 1565-1570.
observations on the number of spermatogonia,
Bounoure, L. 1934. Recherches sur lignée Danilchik, M. V. and Gerhart, J. C. 1987. Diffe- spermatocytes, and spermatids connected by
germinale chez la grenouille rousse aux premiers rentiation of the animal-vegetal axis in Xeno- intercellular bridges in the mammalian testis.
stades au développement. Ann. Sci. Zool. Ser. pus laevis oocytes: Polarized intracellular Biol. Reprod. 4: 195-215.
17,10: 67-248. translocation of platelets establishes the yolk
Eberhart, C. G., Maines, J. Z. and Wasserman, S.
gradient. Dev. Biol. 122: 101-112.
Bownes, M. 1982. Hormonal and genetic regu- A. 1996. Meiotic cell cycle requirement for a
lation of vitellogenesis in Drosophila. Q. Rev. Davidson, E. 1986. Gene Activity in Early fly homologue of human Deleted in Azoosper-
Biol. 57:247-274. Development, 3rd Ed. Academic Press, mia. Nature 381: 783-785.
Orlando, FL.
Bownes, M., Scott, A. and Shirras, A. 1988. Ellis, R. E. and Kimble, J. 1995. The Jog-3 gene
Dietary components modulate yolk protein Dekel, N and Beers, W H. 1978. Rat oocyte and regulation of cell fate in the germ line of
transcription in Drosophila melanogaster. De- maturation in vitro: Relief of cyclic cAMP Caenorhabditis elegans. Genetics 139: 561-677.
velopment 103: 119-128. inhibition by gonadotropins. Proc. Natl. Acad.
Epifano, O., Liang, L-f., Familari, M., Moos,
Sci. USA 75: 4369-4373.
Braun, R. E., Behringer, R. R., Peschon, J. J., M. C. Jr. and Dean, J. 1995. Coordinate expres-
Brinster, R. L. and Palmiter, R. D. 1989. Dekel, N. and Beers, W H. 1980. Development sion of the three zona pellucida genes during
Genetically haploid spermatids are phenotypi- of the rat oocyte in vitro: Inhibition and mouse oogenesis. Development 121:1947-1956.
cally diploid. Nature 337: 373-376. induction of maturation in the presence or
Eppig, J. J. 1979. FSH stimulates hyaluronic acid
absence of the cumulus oophorus. Dev. Biol. 75:
Brennen, M. D., Weiner, A. J., Goralski, T. J. synthesis by oocyte-cumulus cell complexes
247-254.
and Mahowald, A. P. 1982. The follicle cells are from mouse preovulatory follicles. Nature 281:
a major site of vitellogenin synthesis in Droso- Dekel, N. and Sherizly, I. 1985. Epidermal 483-4,84.
phila melanogaster. Dev. Biol. 89: 225-236. growth factor induces maturation of rat follicle-
Eyal-Giladi, H., Ginsburg, M. and Farbarou, A.
enclosd oocytes. Endocrinology 116: 406-409.
Brown, D. D. and Dawid, I. B. 1968. Specific 1981. Avian primordial germ cells are of
gene amplification in oocytes. Science 160: Dernburg, A. F., Sedat, J. W and Hawley, R. S. epiblastic origin. J. Embryo1. Exp. Morphol.
272-280. 1996. Direct evidence of a role for heterochro- 65: 139-147.
matin in meiotic chromosome segregation. Cell
Burns, R. K., Jr. 1930. The process of sex- Ffrench-Constant, C., Hollingsworth, A.,
86:135-146.
transformation parabiotic Amb1ystoma. I. Heasman, J. and Wylie, C. 1991. Response to
Transformation from female to male. J. Exp. Diaz-Infante, A., Wright, K. H. and Wallach, E. fibronectin of mouse primordial germ cells
Zool. 55: 123-169. E. 1974. Effects of indomethacin and PGF2a before, during, and after migration. Develop-
on ovulation and ovarian contraction in the ment 113: 1365-1373.
Burtis, K. C. 1993. The regulation of sex deter-
rabbit. Prostaglandins 5: 567-581.
mination and sexually dimorphic differentiati- Flickinger, R. A. and Rounds, D. E. 1956. The
on in Drosophila. Curr. Opin. Cell Biol. 5:1006- Dolci, S. and eight others. 1991. Requirement maternal synthesis of egg yolk proteins as
1014. for mast cell growth factor for primordial germ demonstrated by isotopic and serological means.
cell survival in culture. Nature 352: 809-811. Biochem. Biophys. Acta 22: 38-72.
Carlson, B. M. 1981. Patten’s Foundations of
Embryology. McGraw-Hill, New York. Dong, J., Albertini, D. F., Nishimori, K., Kumar, Forristall, C., Pondel, M., Chen, L. and King,
T. R., Lu, N., amd Matzuk, M. 1996. Growth M. L. 1995. Patterns of localization and
Chiquoine, A. D. 1954. The identification, origin,
differentiation factor-9 is required during early cytoskeletal association of two vegetally
and migration of the primordial germ celIs in
ovarian folliculogenesis. Nature 383: 531-534. localized RNAs, Vg1 and Xcat-2. Development
the mouse embryo. Anat. Rec. 118: 135-146.
121: 201-208. Foulkes, N., Schlotter, F., Pévet,
Cho, W K., Stern, S. and Biggers, J. D. 1974. Doniach, T. and Hodgkin, J. 1984. A sex-
P. and Sassone-Corsi, P. 1993. Pituitary FSH
Inhibitory effect of dibutyryl cAMP on mouse determining gene, fem-1, required for both male
directs the CREM functional switch during
oocyte maturation in vitro. J. Exp. Zool. 187: and hermaphroditic development in C. elcgans.
spermatogenesis. Natujre 362: 264-267.
383-386. Dev. Biol. 106:223-235.
Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J. and Schedl,
Colledge, W H., Carleton, M. B. L., Udy, G. B. Downs, S. and Longo, F. J. 1983. Prostaglandins
T. 1995. gld-1, a tumor suppressor gene required
and Evans, M. J. 1994. Disruption of cmos cau- and preovulatory follicular maturation in mice.
for oocyte development in Caenorhabditis
ses parthenogenetic development of unfertilized J. Exp. Zool. 228: 99-108.
elegans. Genetics 139: 579-606.
mouse eggs. Nature 370: 65-68.
Dubois, R. 1969. Le mécanisme d’entrée des
Gabrielli, B., Roy, L. M. and Maller, J. L. 1993.
Comings, D. E. 1968. The rationale for an ordered cellules germinales primordiales dans le réseau
Requirement for cdk2 in cytostatic factor-
arrangement of chromatin in the interphase vasculaire, chez l’ embryon de poulet. J.
mediated metaphase II arrest. Science 259:
nucleus. Am. J. Hum. Genet. 20: 440-460. Embryol. Exp. Morphol. 21: 255-270.
1766-1769.
Gallatin, W. M., Weissman, I. L. and Butcher, E. Gurdon, J. B. 1976. The Control of Gene Ex- Humphrey, R. R. 1931. Studies of sex reversal in
C. 1983. A cell surface molecule involved in pression in Animal Development. Harvard Uni- Amblystoma. III. Transformation of the ovary
organ-specific homing of lymphocytes. Nature versity Press, Cambridge, MA. of A. tigrinum into a functional testis through
304: 30-35. the influence of a testis resident in the same
Gutzeit, H. O. 1986. The role of microfilaments
animal. J. Exp. Zool. 58: 333-365.
Gallatin, W. M., St. John, T. P., Siegelman, M., in cytoplasmic streaming in Drosophila follicles.
Reichert, R., Butcher, E. C. and Weissman, I. L. J. Cell Sci. 80: 159-169. lnoue, H. and Hiroyoshi, T. 1986. A maternal-
1986. Lymphocyte homing receptors. Cell 44: effect sex-transformation mutant of the housefly,
Hagedorn, H. H. 1983. The role of ecdysteroids
673-680. Musca domestica L. Genetics 112: 469-481.
in the adult insect. In G. Downer and H. Laufer
Garcia, J. E., Jones, G. S. and Wright, G. L. 1981. (eds.), Endocrinology of Insects. Alan R. Liss, Jaglarz, M. K. and Howard, K. R. 1995. The
Prediction of the time of ovulation. Fert. Steril. New York, pp. 241-304. active migration of Drosophila primordial germ
36: 308-315. cells. Development 121: 3495-3503.
Hahnel, A. C. and Eddy, E. M. 1986. Cell surface
Gardner, R. L. 1982. Manipulation of develop- markers of mouse primordial germ cells defined Jones, A. R., Francis, R. and Schedl, T 1996. GLD-
ment. In C. R. Austin and R. V. Short (eds.), by two monoclonal antibodies. Gamete Res. 1, a cytoplasmic protein essential for oocyte di-
Embryonic and Fetal Development, Cambridge 15: 25-34. fferentiation, shows stage- and sex-specific ex-
University Press, Cambridge, pp. 159-180. pression during Caenorhabditis elegans germlime
Hardvin-Lepers, A., Shaper, J. and Shaper, N. L.
developrnent. Dev. Biol. 180: 165-183.
Gilula, N. B., Epstein, M. L. and Beers, W. H. 1993. Characterization of two cis-regulatory
1978. CeIl-to-cell communication and ovulati- regions in the murine b1,4-galactosyltrarisferase Kammerman, S. and Ross, J. 1975. Increase in
on. A study of the cumulus-oocyte complex. J. gene. J. Biol. Chem. 268: 14348-14359. numbers of gonadotropin receptors on granulosa
Cell Biol. 78: 58-75. cells during follicle maturation. J. Clin. Endo-
Hashimoto, N. and ten others. 1994. Partheno-
crinol. 41: 546-550.
Ginsburg, M. and Eyal-Giladi, H. 1987. Primor- genetic activation of oocytes in cmos-deficient
dial germ cells of the young chick blastoderm mice. Nature 370: 68-71. Karpen, G. H., Le, M.-H. anel Le, H. 1996.
originate from the central zone of the area Centric heterochromatin and the efficieney of
Heasman, J., Mohun, T. and Wylie, C. C. 1977.
pellucida irrespective of the embryo-forming achiasmatic disjunction in Drosophila female
Studies on the locomotion of primordial germ
process. Development 101: 209-219. meiosis. Science 273: 118-121.
cells from Xenopus laevis in vitro. J. Embryol.
Ginsburg, M., Snow, M. H. L. and McLaren, A. Exp. Morphol. 42: 149-162. Karr, T. L. 1991. lntracellular sperm-egg
1990. Primordial germ cells in the mouse embryo interaction in Drosophila: A three-dimensional
Heasman, J., Hynes, R. D., Swan, A. P.,
during gastrulation. Development 110: 521-528. structural analysis of a paternal product in the
Thomas, V. and Wyle, C. C. 1981. Primordial
developing egg. Mech. Dev. 34: 101-111.
Godin, I. and Wylie, C. C. 1991. TGFb1 inhibits germ cells of Xenopus embryos: The role of
proliferation and has a chemotactic effect on fibronectin in their adhesion during migration. Karr, T. L. 1996. Paternal investment and
mouse primordial germ cells in culture. Deve- Cell 27: 437-447. intracellular sperm-egg interaction during and
lopment 113: 1451-1457. following fertilization in Drosophila. Curr. Top.
Heath, J. K. 1978. Mammalian primordial germ
Dev. Biol. 34: 89-115.
Godin, I., Wylie, C. and Heasman, J. 1990. Genital cells. Dev. Mammals 3: 272-298.
ridges exert long-range effects on primordial Karsch-Mizrachi, I. and Haynes, S. R. 1993. The
Hill, D. P., Shakes, D. C., Wards, S. and Strome, S.
germ cell numbers and direction of migration in Rb97D gene encodes a potential RNA-binding
1989. A sperm-supplied product essential for initiation
culture. Development 108: 357-363. protein required for spermatogenesis in Droso-
of normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans
phila. Nucl. Acids Res. 21: 2229-2235.
Gönczy, P., Thomas, B. J. and DiNardo, S. 1994. is encoded by the paternal effect embryonic-lethal
roughex is a dose-dependent regulator of the gene, spe-11. Dev. Biol. 136: 154-166. Kerrebrock, A. W., Moore, D. P., Wu, J. S. and Orr-
second meiotic division during Drosophila Weaver, T. L. 1995. Mei-S332, a Drosophila protein
HilI, R. S. and MacGregor, H. C. 1980. The
spermatogenesis. Cell 77: 1015-1025. required for sister-chromatid cohesion, can localize
developrnent of lampbrush chromosometype
to meiotic centromere regions. Cell 83: 247-256.
González-Reyes, A., Elliot, H. and St. Johnson, transcription in the early diplotene oocytes of
D. 1995. Polarization of both major body axes Xenopus laevis: An electron microscope Kim-Ha, J., Kerr, K. and Macdonald, P. M. 1995.
in Drosophila by gurken-torpedo signalling. analysis. J. Cell Sci. 44: 87-101. Translational regulation of oskar mRNA by bru-
Nature 375: 654-658. no, an ovarian RNA-binding protein, is essential.
Hirsh, D., Oppenheim, D. and Klass, M. 1976.
Cell 81: 403-412.
Graham, C. E. 1977. Teratocarcinoma cells and Development of the reproductive system of
normal mouse embryogenesis. In M. I. Sherman Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 49: 200-219. Kimble, J. E. 1981. Strategies for control of
(ed.), Concepts of Mammalian Embryogenesis. pattern formation in Caenorhabditis elegans.
Hodgkin, J., Doniach, T. and Shen, M. 1985.
M.I.T. Press, Cambridge, MA, pp. 315-394. Philos. Trans. R. Soc. Lond. [B] 295: 539-551.
The sex determination pathway in the nema-
Graham, P. L. and Kimble, J. 1993. The mog1 tode Caenorhabditis elegans: Variations on a Kimble, J. E. and White, J. G. 1981. Control of
gene is required for the switch from spermato- theme. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. germ cell development in Caenorhabditis
genesis to oogenesis in C. elegans. Genetics 50: 585-593. elegans. Dev. Biol. 81: 208-219.
133:919-931.
Hoyle, H. D. and Raff, E. C. 1990. Two Droso- Kimble, J., Barton, M. K., Schecil, T. B.,
Grant, P. 1953. Phosphate metabolism during phila b-tubulin isoforms are not functionally Rosenquist, T. A. and Austin, J. 1986. Controls
oogenesis in Rana temporaria. J. Exp. Zool. equivalent. J. Cell Biol. 111: 1009-1026. of postembryonic: germ line development in
124: 513-543. Caenorhabditis elegans. In J. Gall (ed.),
Huarte, J., Belin, D., Vassalli, A., Strickland, S.
Gametogenesis and the Early Embryo. Alan R.
Green, G. R. and Poccia, D. L. 1988. Interaction and Vassalli, J. -D. 1987. Meiotic maturation of
Liss, New York, pp. 97-110.
of sperm histone variants and linker DNA during mouse oocytes triggers the translatio and polya-
spermiogenesis in the sea urchin. Biochemistry denylation of dormant tissue-type plasminogen Kloc, M. and Etkin, L. 1995. Two distinct
27: 619-625. activator mRNA. Cenes Dev. 1: 1201-1211. pathways for the localization of RNAs at the
vegetal cortex in Xenopus oocytes. Develop- Manseau, L. J. and Schüpbach, T. 1989. expression during sea urchin spermatogenesis.
ment 121: 287-297. cappuccino and spire: two unique maternal- Mol. Reprod. Dev. 27: 181-190.
effect loci required for both the anteroposterior
Kloc, M., Larabell, C. and Etkin, L. 1996. Old, R. W., Callan, H. G. and Gross, K. W. 1977.
and dorsoventral patterns of the Drosophila
Elaboration of the messenger transport Localization of histone gene transcripts in newt
embryo. Genes Dev. 3: 1437-1452.
organizer pathway for localization of RNA to lampbrush chromosomes by in situ hybridization.
the vegetal cortex of Xenopus oocytes. Dev. Marcey, D., Watkins, W. S. and Hazelrigg, T. 1991. J. Cell Sci. 27: 57-80.
Biol. 180: 119-130. The temporal and spatiaI distribution pattern of
Oliver, B., Kim, Y.-J. and Baker, B. S. 1993.
maternal exuparentia protein: Evidence for a role
Kloc, M., Spohr, G. and Etkin, L. 1993. Trans- Sex-1ethal, master and slave: A hierarchy of
in establishment but not maintainance of bicoid
location of repetitive RNA sequences with the germ-line sex determination in Drosophila.
mRNSA localization. EMBO J. 10: 4259-4266.
germ plasm in Xenopus oocytes. Science 262: Development 119: 897-908.
1712-1714. Masui, Y. 1974. A cytostatic factor in amphibi-
Paglia, L. M., Berry, J. and Kastern, W. H.
an: Its extraction and partial characterization.
Koos, R. D. and Clark, M. R. 1982. Production 1976. Messenger RNA synthesis, transport, and
J. Exp. Zool. 187: 141-147.
of 6-keto-prostaglandin F1a by rat granulosa cells storage in silkmoth ovarian follicles. Dev. Biol.
in vitro. Endocrinology 111: 1513-1518. Matsui, Y., Toksoz, D., Nishikawa, S., Nishikawa, 51: 173-181.
S.-I., Williams, D., Zsebo, K. and Hogan, B. L.
Kuwana, T. 1993. Migration of avian primordi- PaIka, J. 1989. The pill of choice? Science 245:
M. 1991. Effect of Steel factor and leukemia
al germ cells toward the gonadal anlage. Dev. 1319-1323.
inhibitory factor on murine primordial germ cells
Growth Differ. 35: 237-243.
in culture. Nature 353: 750-752. Palmiter, R. D., Wilkie, T. M., Chen, H. Y. and
Kuwana, T., Maeda-Suga, H. and Fujimoto T. 1986. Brinster, R. L. 1984. Transmission distortion
Matsui, Y., Zsebo, K. and Hogan, B. L. M. 1992.
Attraction of chick primordiaí germ cells; by and mosaicism in an unusual transgenic mouse
Derivation of pluripotential embryonic stem
gonadal anlage in vitro. Anat. Rec. 215: 403-406. pedigree. Cell 36: 869-877.
cells from murine primordial germ cells in culture.
Kwon, Y. K. and Hecht, N. B. 1993. Binding of Cell 70: 841-847. Paris, J., Swenson, K., Piwnice-Worms, H. and
a phosphoprotein to the 3’ untranslated region Richter, J. D. 1991. Maturation-specifie polya-
Maurice, J. 1991. Improvements seen for RU-
of the mouse protamine 2 mRNA temporally denylation: In vitro activation by p34cdc2 and
486 abortions. Science 254: 198-200.
represses its translation. Mol. Cell Biol. 13: phosphorylation of a 58-kD CPE-binding
6547-6557. McLaren, A. 1983. Does the chromosomal sex protein. Genes Dev. 5: 1697-1708.
of a mouse cell affect its developrnent? Symp.
Lane, M. E. and Kalderon, D. 1994. RNA Pasteels, J. 1953. Contributions à I’étude du
Br. Soc. Dev. Biol. 7: 225-227.
localization along the anteroposterior axis of developpement des reptiles. I. Origine et
the Drosophila oocyte requires PKA-mediated Menke, D. B., Mutter, G. I. and Page, D. C. migration des gonocytes chez deux Lacertiens.
signal transduction to direct normal microtubule 1997. Expression of DAZ, an azoospermia Arch. Biol. 64: 227-245.
organization. Genes Dev. 8: 2986-2995. factor candidate, in human spermatogonia. Am.
Paules, R. S., Buccione, R., Moscel, R. C., Vande
J. Hum. Genet. 60:237-241.
Langman, J. 1981. Medical Embryology, 4th Woude, G. F. and Eppig, J. J. 1989. Mouse mos
Ed. Williams & Wilkins, Baltimore. Minishull, J. 1993. Cyclin synthesis: Who needs protoncogene product is present and functions
it? BioEssays 15: 149-155. during oogenesis. Proc. Nafl. Acad. Sci. USA
Larsen, W J., Wert, S. E. and Brurmer, G. D.
86: 5395-5399.
1986. A dramatic loss of cumulus cell gap junctions Mintz, B. 1957. Embryological development of
is correlated with germinal vesicle breakdown in primordial germ cells in the mouse: Influence of Pesce, M., Farrace, M. G., Piacentini, M., Dolci, S.
rat oocytes. Dev. Biol. 113: 517-521. a new mutation. J. Embryol. Exp. Morphol. 5: and De Felici, M. 1993. Stem cell factor and
396-403. leukemia inhibitory factor promote primordial
Laskey, R. A. 1979. Biochemical processes in
germ cell survival by suppressing programmed cell
early development. In A. T. Bull, J. R. Lagnado, Moens, P. B. 1969. The fine structure of rneiotic
death (apoptosis). Development 118: 1089-1094.
J. O. Thomsen and K. F. Tipton, (eds.), chromosome polarization and pairing in Locusta
Companion to Biochemistry, Vol. 2. Longman, migratoria. Chromosoma 28: 1-25. Peschon, J. J., Behringer, R. R., Brinster, R. L.
London, pp. 137-160. and Palmiter, R. D. 1987. Spermatid-specific
Moor, R. M. and Cran, D. G. 1980. Intercellular
expression of protamine-1 in transgenic mice.
Lasko, P. 1995. Cell-cell signalling, microtubule coupling of mammalian oocytes. Dev. Mammals
organization and RNA localization: Is PKA a 4:3-38.
link? BioEssays 17: 105-107. Pincus, G. and Enzmann, E.V. 1935. The
Moses, M. J. 1968. Synaptonemal complex.
comparative behavior of mammalian eggs in
Lin, H. and Spradling, A. C. 1995. Fusosome Annu. Rev. Genet. 2: 363-412
vivo and in vitro. I. The activation of ovarian
asymmetry and oocyte determination in Dro-
Mowry, K. L. and Melton, D. A. 1992. Vegetal eggs. J. Exp. Med. 62: 665-675.
sophila. Dev. Genet. 16: 6-12.
messenger RNA localization directed by a 340-
Pinkerton, J. H. M., McKay, D. G., Adams, E. C.
Lemaire, W. J., Yang, N. S. T., Behram, H. H. nt RNA sequence element in Xeiiopus oocytes.
and Hertig, A. T. 1961. Development of the
and Marsh, J. M. 1973. Preovulatory changes in Science 255: 991-994.
human ovary: A study using histochemical
concentration of prostaglandin in rabbit graafian
Nantel, F. and eight others. 1996. Spermio-enesis techniques. Obstet. Gynecol. 18: 152-181.
follicles. Prostaglandins 3: 367-376.
deficiency and germ-cell apoptosis in CREM-
Pitnick, S., Spicer, G. S. and Markow, T. A. 1995.
Lillie, F. R. 1919. Problems of Fertilization. mutant mice. Nature 380: 159-162
How long is a giant sperm? Nature 375: 109
University of Chicago Press, Chicago.
Newton, S. C., Blaschuk, O. W. and Millette, C. F.
Poccia, D. 1986. Remodeling of nueleoproteins
Lorca, T., Cruzalegui, F. H., Fesquet, D., Cavadore, 1993. N-cadherin mediates Sertoli cell-spermato-
during gametogenesis, fertilization, and early
J.-C., Méry, J., Means, A. and Dorée, M. 1993. genic cell adhesion. Dev. Dyn. 197:1-13.
development. Int. Rev. Cytol. 105: 1-65.
Calmodulin-depcndent protein kinase II mediates
Nishioka, D., Ward, D., Poccia, D., Costacos, C.
inactivation of MPF and CSF upon fertilization Pokrywka, N. J and Stephenson, E. C. 1991,
and Minor, J. E. 1990. Localization of bindin
of Xenopus eggs. Nature 366: 270-273. Microtubules mediate the localization of bicoid
RNA during Drosophila oogenesis. Development receptor signalling process are necessary for both Stewart, T. A. and Mintz, B. 1981. Successful
113: 55-66. anterior-posterior and dorsal-ventral pattern generations of mice produced from an established
formation in Drosophila. Cell 81: 967-978. culture line of euploid teratocarcinoma cells.
Postlethwait, J. H., Brownes, M. and Jowett, T.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6314-6318.
1980. Sexual phenotype and vitellogenin Ruohola, H., Bremer, K. A., Baker, D., Swedlow,
synthesis in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. J. R., Jan, L. Y. and Jan, Y. N. 1991. Role of Stott, D. and Wylie, C. C. 1986. Invasive
79: 379-387. neurogenic genes in establishment of follicle cell behaviour of mouse primordial germ cells in
fate and oocyte polarity during oogenesis in vitro. J. Cell Sci. 86: 133-144.
Pratt, S. A., Scully, N. F. and Shur, B. D 1993.
Drosophila. Cell 66: 433-449.
Cell surface b1,4-galactosyltransferase on SubteIny, S. and Penkala, J. E. 1984. Experimen-
primary spermatocytes facilitates their initial Sagata, N., Watanabe, N., Vande Woude, G. F. tal evidence for a morphogenetic role in the emer-
adhesion to Sertoli celIs in vitro. Biol. Reprod. and lkawa, Y. 1989. The c-mos proto-oncogene gence of primordial germ celIs from the endoderm
49: 470-482. product is a cytostatic factor responsible for of Rana pipiens. Differentiation 26: 211-219.
meiotic arrest in vertebrate eggs. Nature 342:
Profet, M. 1993. Menstruation as a defense Sun, Y.-A. and Wyman, R. J. 1993. Reevaluation
512-518.
against pathogens transported by sperm. Q, Rev. of electrophoresis in the Drosophila egg
Biol. 68: 335-385. Sagata, N., Oskarsson, M., Copeland, T., chamber. Dev. Biol. 155: 206-215.
Brumbaugh, J. and Vande Woude, G. F. 1988.
Racowsky, C. 1985. Effect of forskolin on the Sutasurya, L. A. and Nieuwkoop, P. D. 1974.
Function of c-mos proto-oncogene product in
spontaneous maturation and cyclic AMP content The induction of primordial germ celIs in the
meiotic maturation in Xenopus oocytes. Nature
of hamster and oocyte-cumulus complexes. J. urodeles. Wilhelm Roux Arch. Entwicklungsmech.
335: 519-525.
Exp. Zool. 234: 87-96. Org. 175:199-220.
Schäfer, M., Nayernia, K., Engel, W. and Schäfer,
Racowsky, C. and Satterlie, R. A. 1985. Swanson, C. P., Merz, T. and Young, W. J. 1981.
U. 1995. Translational control of spermatoge-
Metabolic, fluorescent dye and electrical coupling Cytogenetics: The Chromosome in Division,
nesis. Dev. Biol. 172: 344-352.
between hamster oocytes and cumulus cells Inheritance and Evolution. Prentice-Hall,
during meiotic maturation in vivo and in vitro. Schmekel, K. and Daneholt, B. 1995. The cen- Englewood Cliffs, NJ.
Dev. Biol. 108: 191-202. tral region of the synaptonemal complex
Swift, C. H. 1914. Origin and early history of
revealed in three dimensions. Trends Cell Biol.
Raikhel, A. S. and Dhadialia, T. S. 1992. the primordial germ-celIs iri the chick. Am. J.
5: 239-242.
Accumulation of yolk proteiris in insect oocytes. Anat. 15: 483-516.
Annu. Rev. Entomol. 37: 217-251. Schultz, R. M., Montgomery, R. R. and Belanoff,
Telfer, W. H., Woodruff, R. I. and Huebner, E.
J. R. 1983. Regulation of mouse oocyte
Reijo, R. and twelve others. 1995 Diverse sper- 1981. Electrical polarity and cellular differentiati-
maturation: Implications of a decrease in oocyte
matogenic defects in hurnas caused by Y chro- on in meroistic ovaries. Am. Zool. 21: 675-686.
cAMP and protein dephosphorylation in
mosome deletions encompassing a novel RNA-
commitment to resume meiosis. Dev. Biol. 97: Theurkauf, W. E., Smiley, S., Wong, M. L. and
binding protein gene. Nat. Genet. 10: 383-393.
264-273. Alberts, B. M. 1992. Reorganization of the
Reynaud, G. 1969. Transfert de cellules cytoskeleton during Drosophila oogenesis: Im-
Sheets, M. D., Wu, M. and Wickens, M. 1995.
germinales primordiales de dindon à l’embryon plications for axis specification and intercellular
Polyadenylation of c-mos mRNA as a control
de poulet par injection intravasculaire. J. transport. Development 115: 923-936.
point in Xenopus meiotic maturation. Nature
Embryol. Exp. Morphol. 21: 485-507.
374: 511-516. Theurkauf, W. E., Alberts, B. M., Jan, Y. N. and
Ressom, R. E. and Dixon, K. E. 1988. Relocation Jongens, T. A. 1993. A control code for
Shea, T. B., Beermann, M. L., Leli, U. and Nixon,
and reorganization of germ plasm in Xenopus microtubules in the differentiation of Droso-
R. A. 1992. Opposing influences of protein
embryos after fertilization. Development 103: phila oocytes. Development 118: 1169-1180.
kinase activities on neurite out-growth in human
507-518.
neuroblastoma cells: Initiation by kinase A and Vegeto, E., Allan, G. F., Schrader, W. T., Tsai,
Rivier, C., Rivier, J. and Vale, W. 1986. Inhibin- restriction by kinase C. J. Neurosci. Res. 33: M.-J., McDonnell, D. P. and O’Malley, B. W.
mediated feedback control of follicle-stimulating 398-407. 1992. The mechanism of RU486 antagonism is
hormone secetion in the female rat. Science dependent on the conformation of the carboxy-
Simon, D. 1960. Contribution à l’étude de la
234: 205-208. terminal tail of the human progesterone recep-
circulation et du transport des gonocytes
tor. Cell 69: 703-713.
Rogulska, T. 1969. Migration of chick primor- primaires dans les blastodermes d’oiseau cultivé
dial germ cells from the intracoelomically in vitro. Arch. Anat. Microsc. Morphol. Exp. von Wettstein, D. 1971. The synaptonemal
transplanted germinal crescent into the genital 49: 93-176. complex and four-strand crossing over. Proc.
ridge. Experientia 25: 631-632. Natl. Acad. Sci. USA 68: 851-855.
Sorensen, R. and Wassarman, P. M. 1976.
Rogulska, T. Ozdzenski, W. and Komer, A. 1971. Relationship between growth and meiotic von Wettstein, D. 1984. The synaptonemal
Behavior of mouse primordial germ cells in chick maturation of the mouse oocyte. Dev. Biol. 50: complex and genetic segregation. In C. W. Evans
embryo. J. Embryol. Exp. Morphol, 25: 155-164. 531-536. and H. G. Dickinson (eds.), Controlling Events
in Meiosis. Cambridge University Press, Cam-
Romanoff, A. L. 1960. The Avian Embryo. Spitz, I. M. and Bardin, C. W. 1993. Mifeprisone
bridge, pp. 195-231.
Macmillan, New York. (RU486): A modulator of progestin and gluco-
corticoid action. N. Engl. J. Med.329: 404-412. Warrior, R. 1994. Primordial germ cell migration
Rongo, C., Gavis, E. R. and Lehmann, R. 1995.
and the assembly of the Drosophila embryonic
Localization of oskar RNA regulates oskar trans- Spradling, A. C. 1993. Germine cysts: Communes
gonad. Dev. Biol. 166: 180-194.
lation and requires Oskar protein. Development that work. Cell 72: 649-651.
121: 2737-2746. Watanabe, N., Vande Woude, G. F., Ikawa, Y. and
Stephanson, E. C., Chao, Y.-C. and Fackenthal,
Sagata, N. 1989. Specific proteolysis of the c-mos
Roth, S., Neuman-Silbergerg, F. S., Barcelo, G. J. D. 1988. Molecular analysis of the swallow
proto-oncogene product by calpain on fertilization
and Schüpbach, T. 1995. cornichon and the EGF- gene of Drosophila melanogaster. Gmes Dev. 2:
of Xenopus eggs. Nature 342: 505-517.
1655-1665.
Watson, C. A., Sauman, I. and Berry, S. J. 1993. Wylie, C. C. and Heasman, J. 1993. Migration, Yoon, P. W. and eight others. 1996. Advanced
Actin is a major structural and functional element proliferation, and potency of primordial germ maternal age and risk of Down syndrome
of the egg cortex of giant silkmoths during cells. Semin. Dev. Biol. 4: 161-170. characterized by the meiotic stage of the
oogenesis. Dev. Biol. 155: 315-323. chromosomal error: A population-based study.
Wylie, C. C., Heasman, J, Swan, A. P. and
Amer. J. Hum. Genet. 58: 628-633.
Whitington, P. M. and Dixon, K. E. 1975. Anderton, B. H. 1979. Evidence for substrate
Quantitative stuidies of germ plasm and germ guidance of primordial germ cells. Exp. Cell Res. Zhang, N., Zhang, J, Purcell, K. J, Cheng, Y. and
cells during early embryogenesis of Xenopus 121: 315-324. Howard, K. 1997. The Drosophila protein
laevis. J. Embryol. Exp. Morphol. 33: 57-74. Wuwen repels migratory germ cells. Nature 385:
Yeom Y. I. and seven others. 1996. Germline
64-67.
Williams, J. and seven others. 1993. Interacting regulatory element of Oct-4 specific for the
signalling pathways regulating prestalk cell di- totipotent cycle of embryonal cells. Develop- Zhao, G.-Q., Deng, K, Labosky, P. A., Liaw, L.
fferentiation and movement during the ment 122: 881-894. and Hogan, B. L. M. 1996. The gene encoding
rnorphogenesis of Dictyostelium. Development bone morphogenetic protein 8B is required for
Yisraeli, J. K, Sokol, S. and Melton, D. A. 1990.
Suppl.: 1-7. the initiation and maintenance of spermatoge-
A two-step model for the localization of a ma-
nesis in the mouse. Genes Dev. 10: 1657-1669.
Woodruff, T. K, D’Agostino, J, Schwartz, N. ternal mRNA in Xenopus oocytes: Involvement
B. and Mayo, K. E. 1988. Dynamic changes in of microtubules and microfilaments in translo-
inhibin messenger RNAs in rat ovarian follicles cation and anchoring of Vg1 mRNA. Develop-
during the reproductive cycle. Science 239: ment 108: 289-298.
1296-1299.
Mecanismos desenvolvimentais
da mudança evolucionária 23
Como a acontece a novidade no mundo?
Como nasce? De que fusões, traduções,
junções, é realizada? Como ela sobrevive
extrema e perigosa como é?
Que compromissos, que acordos, que
C harles Darwin foi herdeiro de séculos de especulação relacionada com as
origens da diversidade da vida animal. A própria educação de Darwin foi
baseada na tradição Britânica da teologia natural que sustentava que a oni-
potência e benevolência de Deus podiam ser observadas nos trabalhos de Sua cria-
ção. A parte dominante dessa tradição foi o relato da Criação proclamando que as
traições de sua natureza secreta deverá espécies foram trabalhos planejados intrincadamente do Criador. Os dedos da mão
fazer para afastar os tripulantes humana eram encarados como um requinte (alguns diziam ser perfeito) de inventos
destruidores, o anjo exterminador, a
planejados que permitiu aos humanos dominarem o seu meio ambiente. As garras em
guilhotina?
forma de pá da toupeira estavam, novamente, perfeitamente adaptadas no seu “traba-
SALMAN RUSHDIE (1988)
lho de existência”, tal como as asas de um pássaro ou as barbatanas de um peixe.
O primeiro Pássaro nasceu do ovo
Uma forma mais sofisticada da teologia natural, definida na Grã Bretanha pelo
de um Réptil. anatomista e embriologista Richard Owen, que afirmou que as adaptações eram ape-
WALTER GARSTANG (1922) nas de importância secundária. Pelo contrário, as homologias eram críticas. Estrutu-
ras homólogas eram aqueles órgãos que tinham as mesmas partes básicas arranjadas
da mesma forma, fazendo das diferenças a sua modificação secundária. O que era
realmente importante era que a mão humana, as garras da toupeira, as asas do pássaro
e as barbatanas do peixe foram cada uma baseada no mesmo plano. Resumindo o
plano dos membros, nós podiamos determinar o grandioso desenho pelo qual Deus
construiu todos os apêndices dos vertebrados. Para Owen (1848), as homologias
baseadas na diversidade animal eram o que contava, e não as adaptações secundárias
dessas unidades básicas.
“Unidade de Tipo” e “Condições de Existência”

A Síntese de Charles Darwin
Darwin reconheceu sua dívida com esses debates primários quando escreveu em
(1859), “É amplamente reconhecido que todos os seres orgânicos foram formados
segundo duas grandes leis - Unidade de Tipo e Condições de Existência.” Darwin
continuou a explicar que sua teoria poderia explicar a unidade de tipo através da
descendência. As mudanças criando esses tipos e causando adaptações maravilhosas
para as condições de existência, além disso, eram explicadas através da seleção natural.
Darwin chamou isso de “Linhagem com modificação”. Após a leitura do sumário de
Johannes Müller sobre a lei de von Baer em 1842, Darwin acreditou que semelhanças
883
embrionárias seriam um argumento muito forte em favor da conexão genética em gru-

pos de animais diferentes. “Uma comunidade de estruturas embrionárias revela uma
comunidade de linhagem,” ele concluiria na Origens das espécies.
Formas larvais foram usadas para a classificação taxonômica mesmo antes de
Darwin. J. V. Thompson, por exemplo, demonstrou que a larva da craca (cirrípede) era
quase idêntica às larvas do caranguejo e portanto contou as cracas como artrópodes
e não como moluscos (Figura 23.1; Winsor, 1969). Darwin, um perito em taxinomia da
craca comemorou esse achado: “Mesmo o ilustre Cuvier não se apercebeu de que a
craca tratava-se de um crustáceo, mas num relance a larva mostra isso de maneira
indubitável”. A interpretação evolucionária de Darwin sobre a lei de von Baer criou
um paradigma que foi seguido por muitas décadas, especificamente, que relações
entre grupos podem ser descobertas observando-se formas larvais em comum.
Kowalevsky (1871) faria em breve uma descoberta similar (publicada em Descent of
Man por Darwin) que a larva tunicada tem notocordas e forma o seu tubo neural e
outros órgãos de uma maneira muito similar ao cordado anfioxo primitivo. Os
(A) Tetraclita tunicados, outro enigma dos esquemas de classificação (normalmente colocados,
juntamente com as cracas, como um molusco), desse modo encontraram um lar entre
os cordados. Darwin também notou que organismos embrionários, às vezes, produ-
zem estruturas que são inapropriadas para sua forma adulta, mas que mostram sua
relação com outros animais. Ele mostrou a existência de olhos em toupeiras embrio-
nárias, rudimentos pélvicos em cobras embrionárias, e dentes nas barbatanas em
embriões de baleia. Neste livro, notamos que os embriões mamíferos formam um
saco vitelínico rudimentar, enviam vasos sangüíneos para esse saco, e sofrem gas-
trulação de uma maneira semelhante às aves e répteis, cujo desenvolvimento é
confinado pelo vitelo.
Darwin também argumentou que as adaptações que partem do “tipo” e permitem
que o organismo sobreviva em ambiente próprio, se desenvolvem mais tarde no
embrião. Ele notou que diferenças entre espécie e gêneros são, como as previstas
pela lei de von Baer, somente produzidas mais tarde no desenvolvimento; ele até
mesmo colocou pombos em clorofórmio (com grande relutância) para provar a si
próprio de que esse era realmente o caso. Dessa maneira, Darwin reconheceu duas
maneiras de encarar a “linhagem com modificação.” Poderíamos enfatizar a linha-
gem comum, assinalando homologias embrionárias entre dois ou mais grupos de
(B) Penaeus animais, ou poderíamos enfatizar as modificações mostrando como o desenvolvi-
mento foi alterado para produzir estruturas que permitem aos animais se adaptarem
Figura 23.1 às condições particulares.
Larvas nauplius de (A) crustáceo (Tetraclita, Darwin não procurou construir filogenias completas a partir de dados embriológi-
vista pela face ventral) e (B) um camarão cos, mas o seu trabalho influenciou muitos dos seus contemporâneos a fazê-lo. Um dos
(Penaeus, vista pela face dorsal). O camarão e primeiros cientistas a perceber a importância evolucionária dos estudos de von Baer foi
a craca têm um estágio larval similar apesar da Elie Metchnikoff. Metchnikoff reconheceu que a evolução consiste na modificação de
radical divergência no desenvolvimento poste- organismos embrionários, e não de adultos. Assim ele escreveu (1891):
rior. (De acordo com F. Müller, 1864.)
O homem parece ser um resultado unilateral, mas não total, de um organismo

melhorado, não só pela junção de macacos adultos, mas preferivelmente por ter
seus fetos desenvolvidos desigualmente. Do ponto de vista puramente histórico
natural, seria possível reconhecer o homem como um “monstro” de macaco, com
um cérebro, face e mãos enormemente desenvolvidos.
Dessa maneira, os organismos eram vistos através das mudanças no seu desenvolvi-
mento embrionário. No início do século 20, essa fusão de evolução e embriologia foi
mal interpretada apoiando o modelo linear de evolução (oposto ao ramificado). A
interpretação de Ernst Haeckel foi de que muitos organismos evoluíram pela adição
terminal de um estágio novo ao fim do anterior. Dessa maneira, ele interpretou todo
o reino animal como representações de etapas encurtadas do desenvolvimento huma-
no (veja Gasman,1971; Gould, 1977). [evo1.html]
CAPÍTULO 23 Mecanismos Desenvolvimentais da Mudança Evolucionária 885
E. B. Wilson e F R.. Lillie

F.. R
Se mudanças no desenvolvimento embrionário afetaram mudanças evolucionárias,

como acontecem essas mudanças de desenvolvimento? No final do século 19, mui-
tos investigadores tentaram ligar o desenvolvimento à filogenia através de análises
das linhagens celulares. Eles observaram meticulosamente cada célula nos embriões
em desenvolvimento e compararam os caminhos pelos quais organismos diferentes
formaram seus tecidos. Em 1898, dois embriologistas eminentes realizaram palestras
sobre linhagem celular no Marine Biology Laboratories em Woods Hole,
Massachusetts, e suas palestras serviram para enfatizar os dois caminhos da embrio-
logia que estavam sendo usados para apoiar a biologia evolucionária. A primeira
palestra, apresentada por E. B. Wilson, foi um marco no uso de homologias embrio-
nárias para estabelecer relações filogenéticas. Wilson havia observado que os pa-
drões de clivagem espiral de platelmintos, moluscos e anelídeos e ele havia desco-
berto que em cada caso, os mesmos órgãos provinham do mesmo grupo de células.
Para ele, isso significou que esses filos tinham um antepassado comum. Os vários
grupos de células em estágio de clivagem em platelmintos, moluscos e anelídeos
Mostram uma correspondência tão próxima tanto em relação à origem como ao

destino, que parece impossível explicar a similaridade obtida a não ser como um
resultado da comunidade de linhagem. As muitas diferenças, como veremos, dão
algumas das mais interessantes e convincentes evidências da afinidade genética;
para processos nos quais nas formas inferiores desempenham um papel impor-
tante no desenvolvimento estão nas formas superiores tão reduzidos a ponto de
não ser mais que vestígios ou reminiscências do que eram, e em alguns casos
parecem ter desaparecidos tão completamente como os dentes de pássaros ou os
membros de serpentes.
O próximo palestrante foi F. R. Lillie, que também havia realizado pesquisas

sobre o desenvolvimento de embriões de moluscos e em modificações de linhagens
celulares. Ele enfatizou as modificações, não as similaridades, da clivagem. Suas
pesquisas no Unio, um mexilhão cuja clivagem foi alterada para produzir uma larva
com forma de “armadilha de urso” permitindo-lhe sobreviver em água corrente, fo-
ram descritas no Capítulo 5. Lillie argumentou que os estudos evolucionários “mo-
dernos” estavam melhor concentrados nas mudanças do desenvolvimento embrioná-
rio que permitiram a sobrevivência em ambientes particulares em vez de enfocar
homologias ancestrais que uniam os animais em linhas de descendência.
Em 1898, portanto, as duas principais vias de aproximação para a evolução e o desen-
volvimento estavam claramente definidas: encontrar unidades básicas que unem grupos
de animais distintos, e detectar diferenças no desenvolvimento que permitem espécies se
adaptarem a ambientes particulares. (Certamente, essas mesmas linhas de pensamento
caracterizaram os dois tipos de teologia natural antes de Darwin.) Darwin pensou serem
apenas distinções temporárias, isto é, seriam encontradas unidades básicas nos primeiros
estágios, enquanto os últimos estágios se divergiriam para permitir adaptações específi-
cas (veja Ospovat, 1981). No entanto, Wilson e Lillie estavam ambos discutindo o está-
gio da clivagem da embriogênese. Essas duas maneiras de caracterizar o desenvolvimen-
to e a evolução ainda são as principais correntes de pensamento hoje.
A evolução do desenvolvimento precoce: E. Pluribis Unum

A emergência dos embriões
Na evolução e desenvolvimento de organismos vivos, podemos observar a emergência

de multicelularidade a partir de organismos unicelulares. Uma nova totalidade é forma-
da de componentes celulares. Isso é um passo fundamental na emergência de um novo
patamar de complexidade. As volvocaceas e os dictiostelídeos mencionados no Capítu-

lo 1 representam somente 2 de 17 tipos de protistas nos quais a multicelularidade foi
conseguida (Buss, 1987). No entanto, somente três grupos (aqueles que geraram fun-
gos, plantas e animais) desenvolveram a capacidade de formar agregados multicelulares
que poderiam se diferenciar em tipos de células particulares, i. e., um embrião.
Os primeiros embriões tiveram que resolver um problema fundamental. Uma vez
que cada um dos componentes celulares tinha o aparelho genético e a arquitetura
citoplasmática necessária para a divisão, porque cada célula não haveria de continuar
a sua própria proliferação? O que causaria essas células sacrificarem sua capacidade
proliferativa para formar um indivíduo coletivo? Pode ter havido mais de uma solu-
ção. Buss sugere que nesses embriões precoces houve uma dicotomia abrupta entre a
proliferação e a diferenciação e que nosso ancestral protista nunca aprendeu o truque
da divisão após a diferenciação dos cílios. Enquanto outros grupos de protistas (es-
pecialmente os ciliados) podiam produzir mais centros organizadores de microtúbu-
los, nossos ancestrais não o podiam. Até os dias atuais, nenhuma célula metazoária
ciliada se divide (embora células metazoárias ciliadas podem perder os seus cílios e
depois se dividir). Buss especula que os ancestrais dos metazoários de hoje pararam
sua proliferação celular se diferenciando em uma blástula de células ciliadas. (Os
embriões precoces dos primeiros filos metazoários- esponjas e cnidários- são carac-
terizados como bolas de células ciliadas, como os embriões de ouriço-do-mar discu-
tidos no Capítulo 5.) Essas blástulas ciliadas podiam se mover, mas parecia que todo
o seu desenvolvimento havia parado, para as células ciliadas não se dividirem, nem
se tornarem outro tipo diferenciado de célula. Para se desenvolver em um organismo,
esse dilema tinha que ser resolvido.
Esse problema foi resolvido pela retenção ou produção de uma população de célu-
las não-ciliadas. Essas células podiam se proliferar em novas células, enquanto as célu-
las ciliadas permitiam ao embrião se mover. Mas essas células divididas não podiam
simplesmente ir para qualquer lugar. Não podiam crescer em cima das células ciliadas ou
seu movimento cessaria. Elas não podiam crescer na água ou seriam sugadas pelos
movimentos do embrião. Ao contrário, teriam que migrar para dentro da blastocele (Figu-
ra 23.2). Acredita-se que esse movimento e proliferação de células seja a origem da
gastrulação. Dessa maneira, a blástula surge como uma maneira de juntar células autô-
nomas em uma federação. A gástrula surgiu como um acordo com essa federação permi-
tindo ao embrião se desenvolver enquanto se move (Buss, 1987).*
Os primeiros embriões provavelmente se desenvolveram sob essa forma de mo-
saico. No entanto, a indução proporcionou um segundo mecanismo para assegurar
que blastômeros totipotentes permanecessem juntos para formar um único indiví-
duo. Aqui, cada célula sacrificou sua autonomia para criar uma comunidade coeren-
te. Henry e seus colaboradores (1989) descobriram que enquanto os blastômeros
individuais do ouriço-do-mar podem ser totipotentes, os agregados produzidos des-
sas mesmas células não o são. Ao contrário, cada célula restringe a potência da sua
vizinha (veja Capítulo 15). Essa regulação restritiva também é vista em camundongos
quiméricos (veja Capítulo 5), onde blastômeros de mamíferos se combinam para formar
um único camundongo quimérico ao invés de dois camundongos individuais. Parece
haver restrições muito importantes na potência celular, uma vez que as células se
juntam. Ademais, uma vez que a população interna pode interagir com a população
*Essa é uma modificação da teoria originalmente proposta por Metchnikoff (1886) para explicar a
origem dos organismos multicelulares. Usando embriões de hidróides e de esponjas, Metchnikoff assina-
lou que certas células da parede da blástula “arrastadas por seu flagelo, se tornam amebóides e móveis, se
multiplicam por divisão, preenchem a cavidade da blástula, e se tornam capazes de fazer digestão.” Esse
estado embrionário, ele sentiu, como “com o direito de ser considerado o protótipo dos seres multicelulares.”
Metchnikoff tentou fazer uma filogenia de todos os organismos baseada nas suas camadas germinativas,
e ele acreditava que todas as células mesodérmicas poderiam ser caracterizadas por sua habilidade de
fagocitar substâncias estranhas. As suas descobertas em embriologia comparativa finalmente lhe permitiu
formular fundações conceituais de uma nova ciência, a imunologia. (Para maiores detalhes sobre a teoria
de origens multicelulares de Metchnikoff, veja Chernyak e Tauber, 1988, 1991.)
Figura 23.2
Gastrulação em dois cnidários hidróides. (A-
E) Gastrulação em Aequoria foskalea, onde é
formada uma blástula ciliada. As células do
pólo vegetal perdem seus cílios e migram para
dentro da blastocele para formar uma popula-
ção em divisão mitótica. (F-I) Gastrulação em
Clava squamata, onde uma estereoblástula re-
pleta de células é formada e em seguida a ca-
mada externa se torna ciliada. Ambos os pla-
nos convergem para a larva plânula ciliada
(A) (B) (C) (D) (E) característica dos cnidários. (A epíbole de um
Aequoria foskalea ectoderma não-ciliado não está presente em
embriões livres para nadar.) (De acordo com
Buss, 1987.)
(F) (G) (H) (I)

Clava squamata
celular externa e com outras partes da população interna, eventos indutivos podem
dar origem ao surgimento de novos órgãos.
Independentemente da maneira pela qual essa comunidade de células foi forma-
da, a integração delas em um embrião unificado é realizada pela contribuição mater-
na ao citoplasma do ovo. É esse conjunto de instruções que causa a clivagem das
células de um modo específico, aderir uma a outra, e se diferenciar em períodos
particulares. Como foi observado no Capítulo 12, o embrião do ouriço-do-mar se torna
uma blástula ciliada mesmo na ausência de transcrição nuclear. Somente na gastrula-
ção o núcleo começa a regular o desenvolvimento. Dessa maneira, seleção a nível de
propagação celular (que tem sido a regra da sobrevivência entre os protistas) foi
suplantada pela seleção ao nível de organismos multicelulares individuais.
Formação de um Novo F ilo: Modificando os

Filo:
(A)
Caminhos do Desenvolvimento
Somente três dúzias de modelos de corpos animais estão sendo usados atualmente
neste planeta (Margulis e Schwartz, 1988; Brusca e Brusca, 1990). Esses constituem
o filos animais. Isso não quer dizer que esses modelos são os únicos possíveis. O
Burgess Shale, um depósito de fósseis de corpos moles do período Cambriano inici-
al, é conhecido por conter representantes de 20 filos ou mais que nunca desenvolve-
ram descendentes nas camadas superiores (Figura 23.3). Além disso, essa pequena
banda de sedimento, aproximadamente do tamanho de um quarteirão, contém cerca (B)
de uma dúzia de classe de artrópodes previamente desconhecida. Esses animais não
são membros “primitivos” de uma classe ou filo existente, mas são exemplos Figura 23.3
especializados do seus próprios grupos. (Whittington, 1985; Gould, 1989). Existem Dois organismos fósseis do Burgess Shale da
também duas espécies no Burgess Shale que podem estar relacionadas às formas metade do período Cambriano. (A) Opabina,
um organismo com cinco olhos na cabeça, um
ancestrais do filo existente. Uma é um animal parecido com um peripato, que deve
apêndice frontal com uma garra terminal, seg-
ser próximo à uma forma ancestral de inseto; e outro aparenta ser um cordado bem mentos corpóreos com guelras dorsais e um
preservado chamado Pikaia gracilens que pode estar relacionado aos cordados an- pedaço de cauda de três segmentos. (B) Pikaia
cestrais (veja Figura 23.3B). Esse último fóssil apresenta muitos traços que recomen- gracilens, possivelmente um cordato. (de
dam que seja classificado em nosso filo: ele parece ter uma notocorda, e as bandas Gould, 1989.)
Boca Medusas reprodutivas

sexualmente com
Tentáculo Colônias jovens
células mutantes
compostas de
Pólipo células mutantes
reprodutivo
Pólipos de Ovo Zigoto Larva

Broto de
nutrição medusa
Espermatozóide
Brotamento
Mutação somática
dá origem a uma
nova linhagem
Figura 23.4
Aparecimento rápido de novas variantes em invertebrados com alternação de gerações. Aqui,
uma mutação somática ocorre nas células de uma colônia hidróide. Algumas dessas células
Colônia madura
mutantes se tornam parte do pólipo reprodutivo, dando origem às medusas (água-viva) que
contêm os alelos mutantes. Essas medusas se reproduzem para formar uma nova colônia que
pode ser produzida de células mutantes.
em zigue-zague ao longo de sua lateral se parecem muito com a musculatura derivada

de somito encontrada nos Amphioxus (Conway Morris e Whittington, 1979).* Dessa
maneira, todos os filos metazoários conhecidos (e muitos até agora desconhecidos)
parecem ter se formado pela radiação Cambriana há cerca de 540 milhões de anos atrás
(Bowring et al., 1993; Wray et al., 1996).
Como é que nenhum filo novo surgiu nos últimos 500 milhões de anos? Kauffman
(1993) propõe um modelo matemático que prevê que qualquer sistema evolutivo
(sendo ele filo, espécie, automóvel ou religião) mostra esse padrão de divergência
seguido pela clausura dentro de um subconjunto particular da diversidade original.
Kauffman usa uma metáfora de um terreno acidentado onde existem picos e vales de
aptidão, e todos os organismos começam com o mesmo valor de aptidão médio igual
(na metade do pico). Se eles dão saltos grandes, eles têm uma chance de 50% de se
tornarem organismos fisicamente aptos. Por fim, a chance de encontrar um plano
corporal fisicamente apto diminui se um organismo dá um salto para longe de onde
está situado. Saltos longos se tornam arriscados, e as chances desses picos mais
altos já estarem ocupados aumenta. Ao invés disso, saltos pequenos (sobre o mes-
mo pico) podem tornar um organismo fisicamente mais apto do que a população ao
seu redor. Portanto, o que vemos é uma diversificação em torno de poucos modelos
de sucesso. Geralmente, o intervalo entre saltos longos com sucesso duplica a cada
tentativa. No começo do período Cambriano, é possível que o genoma não tivesse
se estabilizado nos conjuntos de interações que vemos hoje. Além do mais, em
muitos grupos invertebrados existe uma alternação de gerações onde uma forma
sexuada gera uma forma assexuada (zoóide, pólipo, broto) que então dá origem
novamente à uma forma sexuada. Em tais casos, mutações somáticas na forma
assexuada podem entrar no corpo da forma sexuada e serem propagadas de uma
forma muito rápida (Figura 23.4; Buss, 1987).
*Um fóssil ainda mais antigo, Yunnanazoon lividum, do começo do período Cambriano, em torno de
525 milhões de anos atrás, foi primeiramente reportado como sendo um cordado (Chen et al., 1995). No
entanto, a interpretação da notocorda fóssil foi questionada por Shu e colegas (1996), que interpretaram o
Yunnanazoon como sendo o hemicordado mais antigo conhecido.
Como, então, podemos modificar um Bauplan para criar um outro Bauplan? O

primeiro passo seria modificar os primeiros estágios do desenvolvimento. De acordo
com von Baer (veja Capítulo 7), animais de diferentes espécies mas do mesmo gênero,
divergem muito tardiamente no desenvolvimento. Quanto mais divergente for uma
espécie da outra, mais cedo poderemos distinguir os seus embriões. Dessa maneira,
embriões de gansos da neve são indistinguíveis dos gansos azuis até quase os últi-
mos estágios. No entanto, o desenvolvimento do ganso da neve diverge do desenvol-
vimento do pinto um pouco antes, e os embriões do ganso podem também serem
distinguidos de embriões de lagarto em estágios ainda mais precoces. Parece então
que mutações que criaram Baupläne novos poderiam fazê-lo alterando os primeiros
estágios do seu desenvolvimento. Figura 23.5
Essas mudanças precoces do desenvolvimento podem ser afetadas pela mudança Comparação do desenvolvimento de duas clas-
de localização dos determinantes citoplasmáticos, mudando a razão da divisão celu- ses de vermes anelídeos, (A) o poliqueto
lar de uma célula ou grupo de células relativa a outras, ou mudando as posições das Podarke e (B) o oligoqueto Tubifex. Estão mos-
trados seus embriões em clivagem, mapas de
células enquanto elas se dividem. No Capítulo 5, vimos que a modificação da clivagem
destino da blástula e produtos da gastrulação.
do molusco pode dar a massa de citoplasma para as células ectodérmicas que for- No Podarke, a gastrulação leva à formação de
mam a concha larval. Isso é devido à mudança na maneira pelo qual os blastômeros uma larva trocófora. No Tubifex, não há um
dividem e partilham o citoplasma. Nos vermes anelídeos, as diferenças entre poliquetas estágio larval, e o embrião se desenvolve dire-
e oligoquetas, derivam de diferenças na localização citoplasmática de morfógenos tamente em um corpo segmentado. (De acordo
dentro do ovo (Figura 23.5). Embora ambos sofram clivagem espiral, eles partilham com Anderson, 1973.)
(A) Podarke Mapa de destino Larva trocófora
Tufo apical
Tufo apical presuntivo Prototroco

Ectoderma
anterior presuntivo Estomodeu
Prototroco
presuntivo
Ectoderma
presuntivo
posterior
Intestino
Estomodeu Banda médio
Mesoderma mesodérmica
presuntivo presuntivo
Embrião de 40 células
Intestino
médio
Ectomesoderma Ectoderma dorsal
presuntivo
presuntivo temporário do
saco vitelínico
Ectoderma do Somitos
(B) Tubifex Estomodeu
saco vitelínico mesodérmicos
presuntivo Banda
presuntivo ectoteloblástica Ectoteloblasto
Ectoderma do
ectoteloblasto
presuntivo
Intestino Mesoderma Ectoteloblasto

médio presuntivo Ectoderma ventral Intestino
presuntivo temporário do médio
saco vitelínico
Embrião em clivagem Mapa de destino Gastrulação

Vestimentiferano
Polygordius
Patella
(A) (B) (C) (D) (E) (F)
Figura 23.6
Divergência no desenvolvimento após o está- seus morfógenos em células diferentes. Poliquetas sofrem uma clivagem espiral relati-
gio larval de trocófora. (A-C) A metamorfose vamente padronizada, dando origem à larva trocófora. Oligoquetas, no entanto, colo-
do anelídeo poliqueto Polygordius a partir de cam a maior parte de seu citoplasma nas células destinadas à formação de estruturas
sua forma larval trocófera de nado livre mostra adultas, ao invés de larvais. Esse grupo passa depois para o estágio larval. Se uma
a formação de um tronco segmentado. Por fim, mutação colocasse um certo morfógeno citoplasmático em uma única região do ovo
as estruturas larvais se encurtam na extremida- ao invés de uma outra, ou se a mutação originasse uma mudança no eixo da divisão
de anterior à medida que a cabeça se forma. (D- celular para que conjuntos diferentes de células adquirissem esses determinantes,
E) Metamorfose do molusco prosobrânquio então um fenótipo radicalmente diferente poderia ser produzido. Como E. G. Conklin
(mexilhão) Patella. Após o estágio trocóforo,
escreveu em 1915, “Nós somos vertebrados porque nossas mães eram vertebrados e
ele desenvolve um pé de molusco, uma glân-
dula da concha e uma corcova visceral. (F) produziram ovos de padrão vertebrado.”
Micrografia eletrônica de varredura de uma lar- Uma outra maneira de evolução de um novo filo pode envolver uma modifica-
va trocófora de um vestimentiferano. (A-E de ção da larva. Darwin e outros pensavam que similaridades na forma larval signifi-
acordo com Grant, 1978; F de Jones e Gardiner, cavam origem em comum. No entanto, isso pode ser reinterpretado para significar
1989; cortesia dos autores.) que as mudanças que originam filos diferentes podem ocorrer na larva. Caramujos,
equiuróides e poliquetos têm padrões de divisão muito semelhantes e formam lar-
vas trocóforas (Figura 23.6). De fato a colocação do filo recém-descoberto
Vestimentífera (invertebrados vermelho brilhante, sem tubo digestivo, encontra-
dos nas valas profundas do oceano) próximo aos anelídeos foi feita em parte base-
ada nas larvas trocóforas das vestimentíferas (Jones e Gardiner, 1989; Young et al.,
1996). Assim, um dos principais mecanismos para estabelecer novos filos e classes
pode ser a relocação do desenvolvimento durante o estágio larval para que a meta-
morfose surja com novos tipos de organização. Garstang (1928) mostrou como a
larva véliger de alguns caramujos pode ter surgido através de mutação e depois ter
sido selecionada porque a nova disposição da cabeça e concha permitiam que a
cabeça se retraísse, por segurança, abaixo da concha. Ele também inventou a hipó-
tese de que cordados se desenvolveram das larvas tunicadas ancestrais que se
tornaram neotênicas. Infelizmente, larvas de corpo mole raramente se fossilizam,
portanto sabemos muito pouco dos mecanismos pelos quais cordados e outros filos
surgiram de larvas* Cambrianas precoces.
* Formas larvais freqüentemente preenchem a lacuna entre as diferentes formas adultas. A forma
larval é vista ou como sendo ancestral a dois grupos ou como um “separador” por neotenia e formando um
diferente tipo de organismo. Isso vem freqüentemente sendo hipotetizado como um mecanismo pelo qual
os cordados emergiram de invertebrados e vertebrados surgiram de cordados. A larva tornaria dos
hemicordados é formada de uma maneira deuteróstoma, similar às larvas equinodermos e se mostra muito
parecida com uma larva equinodermo tendo sido originalmente confundida com elas. Isso ligaria os
equinodermos e cordados. Garstang (1928) e Berril (1955) hipotetizaram que as larvas de certos tunicados
podiam ter evoluído em cordados tais como os anfioxos pelo desenvolvimento neotênico. Desse modo, os
tunicados manteriam a notocorda, musculatura larval e o aparelho alimentar da larva tunicada enquanto se
tornam sexualmente maduras. Existem, na verdade, tunicados nadadores neotênicos (como as Larvacea).
Modificações dessa interpretação (usando linhagens de protocordados diferentes) foram sugeridas por
Jefferies (1986). A origem dos cordados permanece um problema difícil.
Modularidade: O pré-requisito para mudança

evolutiva através do desenvolvimento
Existem somente cerca de 35 Baupläne, mas existem milhões de diferentes espécies,
cada uma com o seu padrão de desenvolvimento. Portanto, a maior parte da evolução
ocorreu nos moldes de um Bauplan existente. Como isso é feito? Como o desenvolvi-
mento de um embrião pode ser modificado já que é um processo tão precisamente
afinado e complexo? Costumava-se pensar que o único caminho para promover a
evolução era adicionar um degrau no fim do desenvolvimento embrionário, mas ago-
ra sabemos que mesmo os estágios mais iniciais podem ser alterados para produzir
novidades evolucionárias. A razão pela qual mudanças podem ser produzidas duran-
te o desenvolvimento é que o embrião, como o organismo adulto, é composto por
uma série de módulos que se interagem (Riedl, 1978; Bonner, 1988).
Modularidade
O desenvolvimento ocorre através de módulos discretos e interativos (Riedl, 1978;
Gilbert et al., 1996; Raff, 1996; Wagner, 1996). Os organismos são construídos de
unidades que são coerentes em si e ainda parte de uma unidade maior. Dessa manei-
ra, células fazem parte dos tecidos, que fazem parte dos órgãos, que fazem parte de
um sistema, e assim por diante. Tal sistema tão hierarquicamente entrelaçado foi
chamado de arranjo modular interagindo em níveis (Dyke, 1988). No desenvolvi-
mento, esses módulos incluem campos morfogenéticos (por exemplo, aqueles des-
critos para o membro ou o olho) discos imaginais, linhagens celulares (tais como a
massa celular interna ou trofoblasto), parasegmentos de insetos e rudimentos de
órgãos de vertebrados. Unidades modulares permitem que diferentes partes do corpo
mudem sem a interferência de outras funções.
O princípio fundamental da modularidade permite três processos de alteração do de-
senvolvimento: dissociação, duplicação e divergência, e co-opção (Raff, 1996). Uma vez
que os módulos estão em todos os níveis, do molecular ao orgânico, não é surpreendente
que esses princípios sejam vistos operando em todos os níveis do desenvolvimento.
Dissociação: Heterocronia e Alometria
Nem todas as partes do embrião são conectadas umas às outras. Podemos dissecar
um campo do membro de uma nêurula de salamandra sem afetar os olhos. Por mutação
ou perturbação ambiental, uma parte do embrião pode mudar sem a outra parte. Essa
modularidade do desenvolvimento pode permitir mudanças que são tanto espaciais
quanto temporais. Heterocronia é uma mudança no ajustamento relativo de dois pro-
cessos do desenvolvimento durante a embriogênese, de uma geração para outra. Em
outras palavras, um módulo pode mudar sua expressão temporal relativa para outros
módulos do embrião. Chegamos a esse conceito em nossas discussões de neotenia e
progênese em salamandras (veja Capítulo 19). A heterocronia pode ser causada de
diferentes maneiras. Em heterocronias de salamandra onde o estágio larval é retido, a
heterocronia é causada por mutações gênicas no sistema de competência da indução.
Outros fenótipos heterocrônicos, entretanto, são causados pela expressão
heterocrônica de certos genes. O desenvolvimento direto do rudimento do ouriço-do-
mar adulto (veja Capítulo 19) envolve a ativação precoce de genes adultos e a supres-
são da expressão do gene larval (Raff e Wray, 1989). A heterocronia pode “retornar”
um organismo para o seu estado larval, livre das adaptações especializadas do adulto.
A heterocronia também pode dar características larvais a um organismo adulto, como
nos pequenos e enredados pés da salamandra arbórea ou na taxa de crescimento fetal
do tecido cerebral do recém nascido humano. [evo2.html]
Outra conseqüência da modularidade é a alometria. Alometria ocorre quando dife-
rentes partes do organismo crescem com taxas diferentes. Alometria pode ser muito
Figura 23.7 Nasal

Crescimento alométrico na cabeça da baleia. A mandíbula se estendeu Parietal
Pré-maxilar
para frente, fazendo com que o nariz se deslocasse para o topo do crânio.
(O pré-maxilar está presente no feto humano precoce, mas ele se funde ao Occipital
maxilar já no fim do terceiro mês de gestação. O pré-maxilar humano foi
descoberto por Wolfgang Goethe, entre outros, em 1786.) (De acordo Maxilar
Frontal
com Slijper, 1962.)
Parietal
Nasal
Zigomático Occipital
Maxila
Mandíbula Escamoso (temporal)
importante na formação de variantes de planos corporais dentro do Bauplan. Tais

mudanças no crescimento diferencial podem envolver uma alteração da sensibilidade
das células alvo a fatores de crescimento ou alteração da quantidade de fatores de
crescimento produzidos. Novamente, o membro vertebrado pode fornecer uma ilustra-
ção útil. Diferenças locais nos condrócitos fazem com que o crescimento do dígito
central do cavalo seja 1.4 vezes maior se comparado aos dígitos laterais (Wolpert,
1983). Isso significa que à medida que o cavalo aumentava de tamanho durante a
evolução, essa diferença regional transformou o cavalo de 5 dígitos em um cavalo de
um só dígito. Um exemplo particularmente dramático de alometria na evolução vem do
desenvolvimento do crânio. No embrião muito jovem da baleia (4-5 mm), o nariz se
encontra na posição usual dos mamíferos. No entanto, o enorme crescimento do
maxilar e do pré-maxilar (parte superior da mandíbula) empurra o osso frontal e força o
nariz para o topo do crânio (Figura 23.7). Essa nova posição do nariz (orifício do sopro)
permite que a baleia tenha uma mandíbula grande e altamente especializada que permi-
te a respiração enquanto paralela à superfície da água (Slijper,1962).
Alometria pode também gerar novidades evolucionárias através de pequenas
mudanças incrementais que finalmente cruzam algum limite do desenvolvimento
(algumas vezes chamado de ponto de bifurcação). Finalmente, uma mudança na
quantidade se torna uma mudança na qualidade quando esses limites são ultrapas-
sados. Foi postulado que esse tipo de mecanismo produziu as bolsas externas,
revestidas de pêlos, do “pescoço” das toupeiras com bolso e dos ratos cangurus
que moram no deserto. As bolsas externas diferem das internas (1) por apresentar
pêlos e (2) não apresentar conexão interna com a boca. Elas são muito úteis pois
permitem a esses animais armazenarem sementes sem correrem o risco de desidrata-
ção. Brylski e Hall (1988) dissecaram a cabeça de embriões de toupeiras com bolso e
ratos cangurus com bolsa, e observaram como a bolsa bucal externa é construída.
Quando os dados desses animais foram comparados com dados de animais que
formam bolsas bucais internas (como os hamsters), os investigadores descobriram
que as bolsas são formadas de maneiras muito semelhantes. Em ambos os casos, as
Figura 23.8 bolsas são formadas dentro das bochechas embrionárias através de uma
Secção transversal através da região anterior protuberância em forma de bolsa no epitélio da bochecha (bucal) para dentro do
do embrião da toupeira com bolso (Tho- mesênquima facial (Figura 23.8). Em animais com bolsa bucal interna, essas
momys) mostrando a abertura anterior da bol- evaginações ficam dentro da bochecha. No entanto, nos animais que formam bolsas
sa (AP) e a continuidade entre a bolsa neste
externas, o alongamento do focinho leva essas bolsas a se elevarem para a região do
estágio e a cavidade bucal (BC) através da
área de desenvolvimento do lábio. (EP, célu- lábio. À medida que o epitélio labial rola para fora da cavidade oral, também o fazem
las epiteliais; MC, cartilagem de Meckel; T, as bolsas externas. O que antes era interno agora é externo. O revestimento de pele
língua.) (De acordo com Brylski e Hall, 1988, é provavelmente derivado de bolsas externas que entram em contato com o mesên-
cortesia dos autores.) quima dermal, que pode induzir o epitélio à formação de cabelo (veja Capítulo 17).
Essa bolsa não possui abertura interna para a boca. Certamente, a transição de bolsa
interna para externa é uma questão de limiares. A localização das evaginações, ante-
rior ou posteriormente, determina se a bolsa é interna ou não. Não existe “estágio de
transição” com duas aberturas, uma interna e outra externa. Poderia-se imaginar
essa externalização como uma ocorrência de mutação por acaso deslocando a posi-
ção da bolsa externa para uma posição um pouco mais anterior. Esse traço seria
selecionado no deserto. Como Van Valen refletiu em 1976, a evolução pode ser
definida como “o controle do desenvolvimento pela ecologia”.
Duplicação e Divergência
Modularidade também permite a ocorrência de duplicação e divergência. A parte da

duplicação nesse processo permite a formação de estruturas redundantes, e a parte
divergente do processo permite que essas estruturas assumam novos papéis. Uma
das cópias pode manter o papel original enquanto as outras estão livres para mutar e
divergir funcionalmente. Isso pode acontecer em vários níveis. A família TGF-β, a
família MyoD e as globinas, cada uma provavelmente começou como um único gene
que se duplicou diversas vezes. Após a duplicação, mutações causaram as divergên- Figura 23.9
cias que deram aos membros de cada família novas funções. Em nível de tecido, As inter-relações nas induções epidérmicas-
mesenquimatosas. Durante a morfogênese, o
podemos observar duplicação e divergência nos somitos que dão origem aos esque-
mesênquima pode causar a invaginação (A-C)
letos cervicais, lombares e torácicos. ou a evaginação (D-H) da epiderme adjacente.
Também existem duplicações e divergências de padrões particulares do desenvolvi- Em alguns casos, como na formação dos mem-
mento. Interações epitélio-mesênquima parecem ser variações de um único tema (Figura bros ou da carapaça da tartaruga, o mesênqui-
23.9; Maderson, 1975; Burke, 1989a). As glândulas de secreção da epiderme são modifi- ma causa a formação de uma crista ectodérmica
cações do mesmo tipo de indução - glândulas mamárias são glândulas sudoríparas apical (G,H). (De acordo com Burke, 1989a.)
INDUÇÃO INDUÇÕES
INICIAL SECUNDÁRIAS (A) Cabelo (na pele)
(B) Glândula sudorípora ou

mamária (na pele)
Epitélio (C) Dente (na gengiva)

ectodérmico
Morfogênese
(D) Pena (na pele de aves)
Mesênquima (E) Escama (na pele do réptil)
(F) Escama (na pele do peixe)
(G) Membro (em vertebrados)
(H) Carapaça (em tartaruga)

Figura 23.10
Secção através do meio do tronco do embrião
da tartaruga Chelydra serpentina. (A) A crista
da carapaça (seta) se forma no limite entre o
mesoderma da placa somítica e o mesoderma
da placa lateral e agora representa o limite dor-
soventral. As bandas mesodérmicas engrossa-
das se estendendo do centro para a área da ca-
rapaça são as condensações da costela. (B)
Aumento maior da crista da carapaça. (De acor-
do com Burke, 1989b, cortesia do autor.)
(A) (B)
modificadas embriologicamente. Da mesma maneira, a temida fileira de dentes do tuba-
rão são modificações das escamas do corpo. Mudanças na indução podem transformar
escamas em penas (como no caso das galinhas garnizé) e são responsáveis por adapta-
ções tão extraordinárias quanto o pulmão das aves, o estômago dos ruminantes, as
presas dos elefantes (incisivos modificados), e as presas das morsas (dentes caninos
superiores modificados). A carapaça (casco) da tartaruga é uma novidade evolucionária
que parece se formar de maneira reminiscente aos membros. Existe até mesmo uma crista
da carapaça que organiza o mesênquima de maneira semelhante à crista ectodérmica
apical do broto do membro (Figura 23.10; Burke, 1989b).
Co
Co--opção
Nenhuma estrutura é destinada a um propósito particular. Um lápis pode ser usado para
escrita, mas ele também pode ser usado como um palito, uma adaga, um instrumento
perfurante ou uma baqueta. Ao nível molecular, sabemos que o gene engrailed, usado
para segmentação nos embriões de Drosophila, é usado posteriormente também para
especificar seus neurônios e é usado nos estágios larvais para fornecer um eixo ântero-
posterior aos discos imaginais. Similarmente, uma proteína que funciona como uma
enzima no fígado pode funcionar como uma proteína cristalina estrutural no cristalino
(Piatigorsky and Wistow, 1991). Em outras palavras, unidades préexistentes podem ser
recrutadas para novas funções. Essa co-opção também é vista a nível morfológico. As
asas evoluíram três vezes durante a evolução dos vertebrados, e em cada caso, diferen-
tes estruturas de antebraços foram modificados para uma função inteiramente nova.
Um dos casos mais celebrados de co-opção é o uso de partes da mandíbula embri-
onária para a criação do ouvido médio dos mamíferos (revisado por Gould, 1990).
Células da crista neural distinguem vertebrados dos protocordados e invertebrados.
Os protocordados têm um tubo neural dorsal e notocorda, mas não uma “cabeça”
verdadeira. As células da crista neural craniana são as grandes responsáveis pela
criação da face, crânio e arcos branquiais. Considera-se que o desenvolvimento da
cabeça originalmente permitia uma predação mais eficiente, pela colocação das es-
truturas sensoriais adjacentes às mandíbulas que capturam as presas (Gans e Northcutt,
1983; Langille e Hall, 1989; Hall, 1992). Duas transições notáveis ocorreram na
evolução da mandíbula do vertebrado. A primeira é a criação de mandíbulas a partir
dos arcos das guelras de peixes sem mandíbulas. A segunda é o uso de ossos que (A)
articulavam as mandíbulas superiores e inferiores nos répteis para a formação dos Suportes
Mandíbula Caixa das guelras
ossos martelo e bigorna do ouvido médio. Nos primeiros vertebrados, uma série de superior craniana
guelras se abriu atrás de uma boca sem mandíbula. Quando as fendas das guelras
foram sustentadas por elementos cartilaginosos, o primeiro conjunto desses suportes
de guelras circundou a boca para formar a mandíbula. Existem amplas evidências de
que as mandíbulas são suportes de guelras modificadas. Primeiro, esses dois conjun-
tos de ossos são produzidos de células da crista neural. (A maioria dos outros ossos
procedem de tecidos mesodérmicos.) Segundo, ambas estruturas se formam de bar-
ras superiores e inferiores que se curvam para a frente e são dobradas no meio. Ter- Mandíbula Hiomandibular
ceiro, a musculatura da mandíbula parece ser homóloga à musculatura dos suportes inferior
de guelras originais. Dessa maneira, a primeira transformação da cartilagem do pri-
meiro arco branquial foi aquela do aparelho da guelra para o aparelho da mandíbula.
Escamoso
Mas a história não termina aqui. (B)
A parte superior do segundo arco branquial que suporta a guelra se transforma Quadrado
no osso hiomandibular de peixes com mandíbula. Esse elemento segura o crânio e Pré-maxilar Maxilar
junta a mandíbula ao crânio (Figura 23.11A). Como vimos no Capítulo 7, essa função
Nasal
do osso hiomandibular nos mamíferos é realizada pelo estribo, um dos ossos do
ouvido médio. Mas os peixes não usam esse osso para escutar; então, como um
osso usado para suporte de guelras e depois como suporte para o crânio se torna
parte do aparelho auditivo dos mamíferos? Quando o peixe chegou à terra depa-
rou-se com um novo problema: como conseguir escutar em um meio tão pouco Articular
denso como o ar? Acontece que o osso hiomandibular está próximo da cápsula Dentário
auditiva, e a matéria óssea é um excelente transmissor do som. Dessa maneira,
enquanto ainda funcionava como um suporte para o crânio, o osso hiomandibular
dos primeiros anfíbios também começou a funcionar como um transdutor de som (C) Escamoso
(Clark, 1989). À medida que os vertebrados terrestres alteraram sua locomoção, (temporal)
estrutura mandibular e postura, o crânio prendeu-se firmemente em seu lugar sem
necessitar de apoios hiomandibulares. Parece ter se especializado em seguida como
o osso estribo do ouvido médio. O que havia sido a segunda função desse osso Nasal
acabou se tornando sua função primária.
Os ossos originais da mandíbula também mudaram. O primeiro arco branquial
gera o aparelho da mandíbula. Nos anfíbios, répteis e pássaros, a porção posterior
dessa cartilagem forma o osso quadrado da mandíbula superior e o osso articular da
mandíbula inferior. Esses ossos se conectam e são responsáveis pela articulação na
mandíbula superior e inferior. No entanto, nos mamíferos, essa articulação ocorre em Auditivo
outra região (os ossos dentários e escamosos), com isso “liberando” esses elementos Zigomático
ósseos para adquirirem novas funções. Os osso quadrado da mandíbula superior dos
Maxila Mandíbula
répteis evoluiu nos mamíferos transformando-se no osso bigorna e o osso articular
da mandíbula inferior dos répteis se tornou nosso osso martelo. Esse segundo pro-
cesso foi primeiramente descrito por Reichert em 1837, que observou no embrião do
Figura 23.11
porco que a mandíbula se ossifica pelo lado da cartilagem de Meckel, enquanto a Evolução da mandíbula no peixe (A), no réptil
região posterior dessa cartilagem se ossifica, se destaca do resto da cartilagem, e (B) e no mamífero (C). (A) Homologias da
entra na região do ouvido médio para se tornar o osso martelo (Figura 23.11B,C)* mandíbula e dos arcos das guelras como vistas
no crânio do tubarão paleozóico Cobeledus
* A falta de formas de transição é freqüentemente citada pelos Criacionistas como uma crítica aculentes. (B) Vista lateral do crânio de um
da evolução. Por exemplo, na transição de répteis para mamíferos, três ossos da mandíbula dos crocodilo. A porção articular da mandíbula in-
répteis se tornaram martelo e bigorna, deixando somente um osso (dentário) na mandíbula inferior. ferior se articula com o osso quadrado do crâ-
Gish (1973), um Criacionista, disse que isso é uma situação impossível, pois nenhum fóssil com dois nio. Nos mamíferos, o quadrado se internaliza
ou mais ossos da mandíbula e dois ou três ossículos do ouvido fora encontrado. Ele considerou que tal para formar a bigorna do ouvido médio. O osso
animal teria arrastado suas mandíbulas pelo chão. Entretanto, tal forma de transição específica não articular mantém seu contato com o quadrado,
precisaria ter existido (há mais de dúzia de formas de transição documentadas entre crânios de
tornando-se o martelo do ouvido médio. Vista
répteis e mamíferos). Hopson (1966) mostrou com bases embriológicas como os ossos da mandíbula
poderiam ter se dividido e usados para diversas funções, e Romer (1970) encontrou fósseis de répteis lateral do crânio humano, mostrando a junção
onde as novas articulações da mandíbula já eram funcionais enquanto ossos mais antigos se tornada mandíbula inferior com a região escamosa
vam inúteis. Existem várias espécies de répteis terapsídeos com duas articulações de mandíbula, com (temporal) do crânio. (De acordo com Zangerl
a bigorna junto a parte superior do osso quadrado (que virá se tornar o osso bigorna). [evo3.html] e Williams, 1975.)
A existência de discretos módulos de desenvolvimento permitiu que os princípi-

os de dissociação, duplicação e divergência e co-opção formassem novos tipos de
organismos.
Progressão correlacionada
Uma conseqüência evolucionária da natureza modular do desenvolvimento é a pro-

gressão correlacionada. Aqui, mudanças em uma parte do embrião induzem mu-
danças em outras. A cartilagem esquelética informa a colocação dos músculos, e os
músculos induzem a colocação dos axônios dos nervos. Nesses casos, se uma estru-
tura muda, isso irá induzir que outras estruturas também o façam (Thomson, 1988).
As mudanças dramáticas na organização dos ossos, desde os ágnatos até os peixes
(A) Cérebro médio com mandíbulas, dos peixes com mandíbulas até os anfíbios, e dos répteis até os
Cérebro mamíferos foram todas coordenadas através de mudanças nas estruturas da mandí-
posterior bula, musculatura da mandíbula, deposição e formato dos dentes e modificações da
abóboda cranial e ouvido (Kemp, 1982; Thomson, 1988). Em 1995, Rowe formulou
a tese de que a migração da cartilagem da mandíbula dos répteis para formar a carti-
lagem do ouvido médio é por si só um caso de progressão correlacionada, ou seja, uma
conseqüência do aumento da caixa craniana pelo qual os precursores da cartilagem
foram liberados para migrar caudalmente.
Podemos observar também a progressão correlacionada ao longo de um curto
período em animais domésticos. Humanos têm um grande talento para selecionar
variantes hereditárias em animais domésticos que envolvem aquelas células da crista
(B) Estribo neural formadoras dos processos mandibular e frontonasal. Em tais casos, como o do
bulldog, a raça é selecionada para se obter uma face larga com um ângulo muito
pequeno entre a mandíbula e a cabeça. Outras raças como o collie são selecionadas
visando obter um focinho estreito com uma mandíbula alongada distanciando-se da
cabeça. Todas as raças podem mover suas mandíbulas, sacudir suas cabeças e latir,
apesar das diferenças na via que seus ossos são formados ou posicionados. Cada
variação é geneticamente determinada; e é importante notar que cada uma representa
uma reordenação harmoniosa dos diferentes ossos que interagem entre si e com suas
ligações musculares. Com a seleção dos elementos esqueléticos, também foram sele-
cionados os músculos que os movem, os nervos que controlam os movimentos, e os
Parte da
vasos sangüíneos que os alimentam.*
caixa craniana
O mecanismo pelo qual o aparelho da mandíbula manteve sua integridade desde
Esqueleto Processo
da língua retroarticular
as lampréias até os amniotas é um extraordinário exemplo de módulos embrionários.
As estruturas da cabeça de vertebrados derivadas da crista neural, incluem os arcos
Figura 23.12 faríngeos (os precursores da mandíbula, ouvido médio, esqueleto da língua, etc.) tão
Células da crista neural de rombômeros do bem quanto os ossos dérmicos da face e a musculatura facial (veja Capítulo 7). A
embrião de pinto e seus “pacotes” músculo- caixa craniana é um produto de tecidos mesodérmicos. Substituindo rombômeros
esqueléticos. (A) Embrião de pinto de dois dias individuais de pinto pelos de codornas, Köntges e Lumsden (1996) foram capazes de
mostrando a contribuição das células da crista
mapear os destinos das células da crista neural associadas com os rombômeros da
rombomérica aos arcos faríngeos. (A maioria
das células da crista neural de r3 e r5 sofrem
codorna (Figura 23.12). Os anticorpos marcando as células da crista neural das co-
apoptose, enquanto que o resto dessas células dornas mostraram que cada rombômero dá origem a um elemento esquelético em
contribuem para a população maior de células particular e aos músculos a eles atados. Ademais, se descobriu que os módulos mús-
da crista neural de r4.) (B) Embrião de 10 dias culo-e-esqueleto de cada rombômero foram enervados por um nervo cranial especí-
mostrando os ossos das mandíbulas superior e fico. Por exemplo, as células da crista neural do rombômero 4 geraram quatro tecidos
inferior, o esqueleto da língua e o ouvido mé- esqueléticos - o processo retroarticular da mandíbula inferior (encontrado nas aves
dio derivados das células da crista rombomérica. mas não nos mamíferos), uma porção do esqueleto da língua, o osso bigorna do
Os músculos derivados de r4 são ligados aos ouvido médio, e supreendentemente, a pequena porção da caixa craniana onde os
ossos do mesmo rombômero, e a parte da caixa
músculos de abertura da mandíbula se ligam ao crânio, principalmente derivado do
craniana ligada ao músculo da abertura da man-
díbula derivado de r4 é também derivada do
mesoderma. Os músculos que conectam esses quatro elementos esqueléticos também
mesmo rombômero. (Para maior clareza ou- *Entretanto essa coordenação não é totalmente universal. Em cães com faces muito acentuadas (como
tros músculos foram omitidos.) (De acordo com os bulldogs), a pele não coordenou o seu desenvolvimento com os ossos e, portanto, fica pendente em
Ahlberg, 1997.) dobras desde a cabeça (Stockard, 1941).
(A) Padrões esqueléticos embrionários (B) Padrões esqueléticos finais (C) Padrões musculares finais
Archaeopteryx
Ave moderna Músculo

poplíteo
Ave
experimental
Réptil
(Crocodylus)
(D) Figura 23.13

“Atavismos” experimentais produzidos pela
alteração de campos embrionários no membro.
(A-C) Resultados dos experimentos de Müller
onde lâminas folheadas de ouro dividem o cam-
po do membro posterior do pinto. (A,B) O
padrão embrionário e final do osso, indicando
que a estrutura fibular foi retida pelo membro
experimental do pinto, como o é em répteis
existentes e como se considera que foi no
Archaeopteryx. (C) Algumas das mudanças
musculares correlacionadas nos embriões ex-
perimentais de pinto. O músculo poplíteo está
presente no pinto, mas ausente nos membros
de répteis e nos membros experimentais. O
músculo fibular brevis, que normalmente se
vieram das células da crista neural do rombômero 4. Todos esses músculos são origina da tíbia e da fíbula no pinto, assume o
inervados pelo nervo cranial VII. Os rombômeros formam uma unidade modular, cons- padrão reptiliano originando somente da fíbula
tituindo dos elementos esqueléticos do arco faríngeo, os músculos que os movem, o nos membros operados. (D) Archaeopteryx
local de ligação dos músculos à caixa craniana, e os nervos que inervam os músculos. fóssil em calcário. A impressão das penas pode
ser vista claramente. Se não fossem as penas,
Como esses músculos e ossos são formados das mesmas células, suas relações po-
esse organismo dentado seria provavelmente
dem ser mantidas apesar das mudanças dramáticas nas posições e funções que esses classificado como um réptil. (A-C de acordo
elementos poderiam sofrer ao longo do tempo. com Müller, 1989; fotografia cortesia de B. A.
A progressão correlacionada também foi mostrada experimentalmente. Repetin- Müller/Biological Photo Service.)
do experimentos anteriores de Hampé (1959), Gerd Muller (1989) inseriu barreiras
folheadas de ouro dentro de brotos precondrogênicos de membros posteriores de um
embrião de pinto de três dias e meio. A barreira separava as regiões da formação da
tíbia e da formação fíbula. Os resultados desse experimento são duplos. Primeiro, a
tíbia é encurtada e a fíbula se dobra e retém sua conexão ao fibular. Tais relacionamen-
tos entre a tíbia e a fíbula não são muito comuns em pássaros, mas são característicos
de répteis (Figura 23.13). Segundo, a musculatura do membro posterior sofre mudan-
ças paralelas com os ossos. Três dos músculos que se ligam a esses ossos agora
mostram padrões de inserção característicos de répteis. Nos parece, portanto, que
manipulações experimentais que alteram o desenvolvimento de uma parte do campo
mesodérmico formador de membros também altera o desenvolvimento de outros com-
ponentes mesodérmicos. Como na progressão correlacionada observada no desen-
volvimento da face, essas mudanças parecem ser todas devidas às interações dentro
de um campo, nesse caso, o campo dos membros posteriores do pinto. Esses não são
efeitos globais e podem ocorrer independente de outras partes do corpo.
Restrições ao desenvolvimento
Embora discretamente, os módulos de desenvolvimento podem interagir uns com os
outros. Essas interações limitam os fenótipos possíveis que podem ser criados, e
também permitem a ocorrência de mudanças em certas direções com maior eficiên-
cia do que em outras.* Coletivamente, essas restrições na produção de fenótipos são
chamadas de restrições do desenvolvimento.
Restrições Físicas
Fizemos alusão ao fato de que existem relativamente poucos Baupläne, e podemos

facilmente imaginar tipos de animais que não existem dentro de um filo existente. Por
que não existem mais tipos principais de corpos entre os animais? Para responder a
isso, temos que considerar as restrições impostas na evolução. Existem três classes
principais de restrições na evolução morfogenética. Primeiro, existem as restrições
físicas na construção de um organismo. Essas restrições de difusão, hidráulica e
sustentação física permitem que somente certos mecanismos do desenvolvimento
ocorram. Podemos observar que não existe um vertebrado com apêndices virados
(parecido com que Dorothy viu em o Mágico de Oz) porque o sangue não circula em
órgãos que giram; toda essa possibilidade da evolução foi abandonada. Similarmente,
parâmetros estruturais e a dinâmica de fluidos impossibilitam a existência de um
pernilongo de um metro e meio de altura. [evo4.html]
Restrições Morfogenéticas
Existem também restrições envolvendo regras de construção morfogenética (Oster et al.,

1988). Bateson (1894) ressaltou que quando organismos se afastam do seu desenvolvi-
mento normal, eles o fazem em somente um número limitado de maneiras. Pesquisas nessa
área tentam encontrar parâmetros arquitetônicos pelos quais os organismos são construídos
e procuram mostrar como esses parâmetros podem ser modificados durante a evolução.
Alguns dos melhores exemplos desses tipos de restrições vêm da análise da formação de
membros em vertebrados. Holder (1983) afirma que embora possam ter havido muitas
modificações do membro vertebrado nestes 300 milhões de anos, algumas modificações
(tais como o dedo indicador ser mais curto que os dedos vizinhos) não foram encontradas.
Além do mais, análises de populações naturais sugerem que existe um número relativa-
mente pequeno de caminhos pelos quais a mudança nos membros pode ocorrer (Wake e
Larson, 1987). Se um membro mais longo é favorável em determinado ambiente, o úmero
pode se tornar alongado. Jamais veremos dois úmeros pequenos unidos juntos em dois
lugares, embora possamos imaginar as vantagens seletivas que essa distribuição poderia
ter. Isso indica um esquema de construção que tem certas regras.
As regras principais para a formação de um membro vertebrado foi resumida por
Oster e seus colegas (1988). Eles descobriram que o mecanismo de reação-difusão
pode explicar as morfologias conhecidas do membro e também pode explicar porque
outras morfologias são proibidas. Esse modelo postula que as agregações da cartila-
gem recrutam ativamente mais células da área em volta e inibem lateralmente a forma-
ção de outros focos de condensação. O número de focos depende da geometria do
tecido e a força da inibição lateral. Se a inibição permanece a mesma, o tamanho do
volume do tecido deve aumentar para permitir a formação de dois focos onde inicial-
mente só havia um. Num dado limite (chamado de limite de bifurcação), esse tamanho
é alcançado, e o membro pode se ramificar em dois focos.
*Leibniz, provavelmente o filósofo que mais influenciou Darwin, notou que a existência deve ser limitada
não somente pelo possível, mas também pelo mutuamente compatível. Isto é, enquanto diversas coisas podem
vir a existir, somente aquelas que são mutualmente compatíveis irão realmente existir (veja Lovejoy, 1964).
Assim, embora muitas mudanças do desenvolvimento sejam possíveis, somente aquelas que podem se integrar
ao resto do organismo (ou que podem causar mudanças compensatórias no resto do organismo) serão vistas.
Progênese natural
(D) Hemidactylium scutatum (E) Proteus anguinus
Tíbia Tíbia
VARIAÇÃO
(A) Ambystoma mexicanum NATURAL
Fíbula
Fíbula
Tíbia
Fíbula Tíbia
Tíbia
VARIAÇÃO
EXPERIMENTAL
Fíbula Fíbula
Decréscimo experimental no número de células

Figura 23.14
Relação entre o número de células e o número
de dígitos na salamandra. (A) O membro pos-
Evidências para esse modelo matemático vêm de manipulações experimentais e da terior de um axolotle (Ambystoma mexicanum)
anatomia comparativa. Quando um broto do membro de axolotle é tratado com a droga com seus cinco dígitos simétricos. (B,C) Dígi-
antimitótica colchicina, as dimensões dos membros são reduzidas. Nesses membros tos no membro posterior do axolotle após in-
não ocorre somente a redução dos dedos, mas a redução de certos dedos em uma certa cubação do broto do membro posterior em col-
ordem, como esperado pelo modelo matemático e pelas morfologias “proibidas”. Ade- chicina para reduzir o número de células. (D,E)
mais, essas reduções de dedos específicos são muito similares aqueles membros de Duas salamandras selvagens formadas por
salamandras progenéticas, aquelas espécies que alcançam a maturidade em um está- progênese, cada uma possuindo um broto de
gio menor do que seus ancestrais e cujos membros se desenvolvem a partir de brotos membro menor. (D) Hemidactylium scutatum.
(E) Proteus anguinus. Os paralelos entre as
de membros menores (Figura 23.14; Alberch e Gale, 1983, 1985). Dessa maneira, o uso
variações experimental e natural podem ser vis-
de mecanismos de reação-difusão para construir membros pode restringir as possibi- tos, e o denominador comum é o número redu-
lidades que podem ser geradas durante o desenvolvimento, porque somente certos zido de células nos brotos do membro. (De
tipos de membros são possíveis usando essas regras. acordo com Oster et al., 1988.)
Restrições Filéticas
Filéticas
Restrições filéticas compreendem o terceiro conjunto de restrições na evolução de

novos tipos de estruturas (Gould e Lewontin, 1979). Essas são as restrições históri-
cas baseadas na genética do desenvolvimento do organismo. Por exemplo, uma vez
gerada uma estrutura por interações indutivas, é difícil recomeçar novamente. A
notocorda, que ainda é funcional em protocordados adultos (Berril, 1987), é consi-
derada vestigial em mamíferos e aves adultos. No entanto, ela pode ser momentane-
amente necessária no embrião para especificar o tubo neural. Similarmente,
Waddington (1938) notou que embora o rim pronéfrico do embrião de pinto seja
considerado vestigial (uma vez que não tem habilidade para concentrar urina), ele é
a fonte do broto uretérico que induz a formação de um rim funcional durante o
desenvolvimento do pinto.
Esse tipo de restrição filética foi recentemente revisto por Raff e colegas (1991).
Até recentemente, acreditava-se que os primeiros estágios do desenvolvimento seri-
am os mais difíceis para mudar, porque a sua alteração iria destruir o embrião ou gerar
um fenótipo radicalmente novo. Mas trabalho recente (e reavaliação do antigo) mos-
trou que alterações podem ser feitas nas primeiras clivagens sem alterações no resul-
tado final. Modificações de morfógenos em embriões de moluscos podem dar origem
a novos tipos de larvas que ainda sofrem metamorfose em moluscos, e mudanças nos
morfógenos citoplasmáticos do ouriço-do-mar podem gerar ouriços-do-mar que se
desenvolvem sem larvas mas ainda são ouriços-do-mar. Na realidade, ao olharmos
para os vertebrados, podemos observar que existe uma história completa que nos leva
até o famoso diagrama da lei de von Baer mostrado no Capítulo 7. Todos os vertebra-
dos chegam a esse estágio particular do desenvolvimento (chamado de faríngula),
mas o fazem por meios diferentes (Figura 23.15). Aves, répteis e peixes chegam a esse
ponto após clivagens meroblásticas de tipos diversos; os anfíbios chegam a esse
estágio por meio de clivagem holoblástica radial; e os mamíferos alcançam o mesmo
ponto após construírem um blastocisto, córion e âmnio. Portanto, os primeiros estági-
os do desenvolvimento parecem ser extremamente plásticos. Similarmente, os últimos
SALAMANDRA PINTO HOMEM
Ovo
(em escala)
Blástula
(secção)
Gástrula
Figura 23.15
O gargalo no estágio “faringular” do desenvolvimento dos verte-
brados. A parte inferior deste esquema é a ilustração padrão da lei
de von Baer (como mostrado no Capítulo 7), demonstrando a di-
vergência das classes de vertebrados após um estágio embrionário
comum. A parte superior deste esquema representa os inícios di-
vergentes do desenvolvimento. O próprio von Baer (1886) estava
consciente desse gargalo. (De acordo com Elinson, 1987.)
estágios são muito diferentes, como as diferenças nos fenótipos de camundongos, (A)
peixes-lua, cobras e salamandras demonstram amplamente. Existe algo no meio do
desenvolvimento que aparenta ser invariante.
Raff argumenta que a formação de novos Baupläne é inibida pela necessidade de
seqüências globais de indução durante o estágio de nêurula (Figura 23.16). Antes
desse estágio, existem poucos eventos indutivos. Após aquele período, existem mui-
tos efeitos indutivos, mas quase todos eles feitos em módulos discretos. Durante a
(B)
organogênese precoce, no entanto, existem diversos eventos indutivos ocorrendo
simultaneamente que são globais na natureza. Nesse estágio, os módulos se sobre-
põem e interagem uns com os outros. Nos vertebrados, usando o exemplo de von
Baer, nos primeiros estágios se dá a especificação dos eixos e a gastrulação. A indução
não aconteceu em larga escala. Ademais, como Raff e seus colegas mostraram (Henry
et al.,1989), existe aqui uma grande habilidade regulativa, assim, pequenas mudan-
ças na distribuição dos morfógenos, ou na posição das clivagens planas podem ser (C)
acomodadas. Após a fixação do principal plano corporal, ocorrem induções por todo
o corpo, mas essas são compartimentalizadas em discretos sistemas de formação de
órgãos. O cristalino induz a formação da córnea, e se essa falhar, somente o olho é
afetado. Similarmente, existem induções na pele que formam penas, escamas ou pêlo.
Se essas não ocorrerem, a pele ou parte dela pode não ter essas estruturas. Mas du-
rante a organogênese precoce, as interações são mais globais (Slack, 1983). Uma
falha na colocação do coração em determinado lugar pode afetar a indução dos olhos
(veja Capítulo 17). Uma falha na indução do mesoderma em uma certa região leva a
má formação dos rins, membros e cauda. É esse estágio que restringe a evolução e
que tipifica o filo vertebrado. Dessa maneira, uma vez vertebrado, é muito difícil se
desenvolver em outra coisa.
Figura 23.16
Evolução Conjunta do Ligante e Receptor: Isolamento Reprodutivo Mecanismo do gargalo no estágio “faringular”
do desenvolvimento em vertebrados. (A) No
Outra restrição do desenvolvimento envolve a habilidade de um tecido de interagir embrião em clivagem existem interações glo-
com outro. No desenvolvimento, as coisas têm de se ajustar perfeitamente se o bais, mas elas são muito poucas (principalmente
organismo irá sobreviver. Os ligantes têm que se ajustar aos receptores, e devem ser para especificar os eixos do organismo). (B)
expressos no lugar certo e na hora certa. Mudanças no ligante têm que ser acomoda- Entre os estágios de nêurula e faríngula exis-
tem muitas interações globais. (C) Após o es-
das por mudanças complementares no receptor para que esse possa funcionar. No
tágio “faringular” existem ainda mais intera-
entanto, se a mudança na estrutura do ligante (ou receptor) produzir uma mudança ções indutivas, mas essas são principalmente
muito grande, esse não se ligará ao seu receptor (ou ligante), e o desenvolvimento de efeito local, confinadas aos seus próprios
irá cessar. Essas mudanças complementares podem levar a uma separação de fun- campos. (De acordo com Raff, 1994.)
ções, como pode ser observada na evolução das famílias de hormônios e seus
receptores (Moyle et al.,1994).
Tal separação de funções pode causar isolamento reprodutivo e a separação
de espécies quando o receptor e o ligante são proteínas no espermatozóide e no
óvulo. Enquanto a maioria das proteínas de espécies marinhas relacionadas são
muito similares, as proteínas responsáveis pela fertilização são muitas vezes extre-
mamente diferentes (Metz et al., 1994). Nos ouriços-do-mar, a bindina do esperma-
tozóide e os receptores complementares do óvulo co-evoluíram em conjunto de
modo que a bindina de uma espécie freqüentemente não reconhece os receptores
bindina no oócito de outra. Hofmann e Glabe (1994) propuseram um modelo onde
existiriam diversos sítios de reconhecimento distintos entre a bindina e seus re-
ceptores. As mutações poderiam causar alguma alteração nesses sítios e, dessa
forma, selecionando alterações complementares no gameta oposto. Existiria um
estágio no qual alguns espermatozóides poderiam se unir, embora precariamente
aos óvulos, mas finalmente, esse processo de alteração e acomodação produziria
dois grupos reprodutivos isolados dentro das espécies (Figura 23.17). Nos haliotes,
as mutações de uma pequena região da proteína lisina e seus receptores corres-
pondentes parecem ser as responsáveis pela especificidade de fertilização da es-
pécie. Ademais, a evolução dessas mudanças nas proteínas lisina e bindina parece
Figura 23.17 Proteína bindina do

Modelo hipotético para o sistema de reconhecimento entre o esper- Cruzamento espermatozóide
matozóide e o óvulo em duas espécies relacionadas de ouriço-do- homólogo Bindina S.p. Bindina S.f.
mar. O espermatozóide de Strongylocentrotus purpuratus pode
ligar o receptor no óvulo. Analogamente, o espermatozóide de S. Receptor S.p. Receptor S.f.
franciscanus pode se ligar com seu receptor do óvulo. O
espematozóide de S. purpuratus não se ligará a óvulos de S. Proteína do
franciscanus, mas o espermatozóide desse se ligará fracamente a receptor no óvulo
óvulos de S. purpuratus. Postula-se que cada um dos elementos Cruzamento
repetidos na proteína bindina interage com sítios complementares heterólogo Bindina S.p. Bindina S.f.
nos seus respectivos receptores de bindina. A co-evolução entre a
bindina e seu receptor pode ter separado as duas espécies. (De Receptor S.p.
acordo com Shaw et al., 1994.) Receptor S.f.
Sem ligação Ligação fraca
ser rápida e se correlaciona com a especiação (Shaw et al.,1994; Lee et al., 1995;
Metz e Palumbi, 1996).*
O mecanismo genético do desenvolvimento da mudança

evolucionária: Genes reguladores homólogos
Descendência com modificação pode ser demonstrada agora a nível molecular.
Ademais, pode se mostrar que as modificações envolvem genes reguladores. Roth
(1984) definiu homologia como “o compartilhamento de vias do desenvolvimento,
as quais são controladas por genes relacionados genealogicamente.” Mas quando
Roth fez essa definição influente, os caminhos do desenvolvimento ainda não havi-
am sido elucidados. Podemos dizer agora muito mais sobre evolução e desenvolvi-
mento e podemos dar sustentação ao conceito de que herdamos vias de desenvolvi-
mento e que a evolução pode ocorrer quando os elementos dessas vias são mudados.
Pax6 e o desenvolvimento do olho
Na genética populacional, a principal suposição relacionada à evolução foi que “a

busca de genes homólogos é completamente inútil a não ser em parentes muito pró-
ximos” (Dobzhansky, 1955; Mayr, 1966). No entanto, a biologia molecular e a gené-
tica do desenvolvimento mostraram que essa suposição é totalmente inválida. A ex-
traordinária conclusão é que os genes responsáveis por determinadas funções no
desenvolvimento foram conservados por mais de 100 milhões de anos. Ademais, mo-
dificações nesses genes e seus alvos podem causar a maior parte da diversidade dos
organismos vivos. Uma das descobertas mais eletrizantes foi que o gene Pax6 rege o
desenvolvimento do olho em espécies tão distantes quanto moscas e humanos.
O desenvolvimento do olho do mamífero, do inseto e do molusco, são muito
diferentes um do outro. O olho das moscas contém numerosos omatídios e se de-
senvolvem a partir de um sulco morfogenético que se estende ao longo de um disco
imaginal. O olho do cefalópode se desenvolve através da separação das regiões
formadoras do cristalino e da retina a partir de um placódio comum. O olho de
*Um outro exemplo de mutação do desenvolvimento que causa isolamento reprodutivo envolve uma
função mais mecânica. As mutações no espiralamento da concha do caramujo discutidas no Capítulo 5 são
mutações que agem durante o desenvolvimento precoce para mudar a posição dos órgãos mesodérmicos. O
acasalamento entre caramujos de conchas com espiralamento para a esquerda e com caramujos de conchas
com espiralamento à direita é mecanicamente muito difícil, para não dizer impossível, em algumas espécies.
(Clark e Murray, 1969). Como essa mutação é herdada como um gene de efeito materno, seria produzido
um grupo de caramujos relacionados podendo se acasalar um com o outro, mas não com outros membros
da população original. Esses caramujos reprodutivamente isolados poderiam expandir seu alcance, e por
acumulação de novas mutações, formar uma nova espécie (Alexandrov Sergievski, 1984).
mamífero se desenvolve através de uma série de interações indutivas envolvendo

uma protuberância do diencéfalo em contato com o ectoderma da superfície (veja
Capítulo 17). Considerava-se que os três tipos de olhos mostravam evolução con-
vergente e que o olho tinha evoluído independentemente em cada um desses três
grupos. Porém, pesquisas recentes mostram que os olhos de insetos e de vertebra-
dos não têm origens distintas, mas se originaram em um passado distante de um
antepassado em comum.
Alelos mutantes do gene humano PAX6 são responsáveis por malformações do
olho (Hanson et al., 1994). Heterozigotos são notáveis pois carecem de íris. Um feto
humano que se acreditava ter mutações homozigotas do PAX6 foi descrito como
não tendo olhos e com várias anormalidades craniofaciais (Hodgson e Saunders,
1980). No camundongo e no rato, esse gene é chamado Small eyes, devido ao fenótipo
do heterozigoto. Fetos homozigotos de camundongo e rato morrem logo após o
nascimento e não têm nariz nem olhos (Hogan et al., 1986; Grindley et al., 1995). A
grande semelhança entre a estrutura e função dos genes Pax6 em camundongos e
humanos era esperada. Porém, em 1994, a pesquisadora Quiring e seus colegas no
laboratório de Walter Gehring mostraram que o genoma da Drosophila continha um
homólogo de Pax6 que codificava uma proteína cuja seqüência mostrava 94% de
identidade com a proteína Pax6 humana. Mutações de perda-de-função no Pax6 da
Drosophila apontam para o gene eyless, um gene caracterizado por olhos pequenos
em heterozigotos e falta de olhos em homozigotos. Parece, portanto, que existe um
gene em comum - Pax6 - que é necessário para o desenvolvimento dos olhos tanto
em insetos como vertebrados.*
Como evidência positiva é mais forte do que evidência negativa, o laboratório de
Gehring expressou o Pax6 de Drosophila (i.e., o gene eyeless tipo selvagem) em
discos imaginais que normalmente não o expressam. Halder e seus colegas (1995)
colocaram genes codificando a proteína ativadora de transcrição, GAL4, do levedo
a jusante de um intensificador que iria funcionar em uma porção não-neural da
mosca, tal como um disco imaginal de uma perna ou asa. Em seguida, eles construí-
ram um transposon, colocando o cDNA para o gene eyless a jusante de uma seqüên-
cia composta de cinco sítios de ligação de GAL4. A proteína GAL4 só podia ser
produzida em um determinado disco imaginal, e quando essa proteína fosse produ-
zida, causaria a transcrição do cDNA de eyeless nessas células em particular (Figura
23.18A). Em moscas nas quais o cDNA eyeless era expresso nos discos antenais, as
antenas tornaram-se os omatídios pigmentados e com cerdas, características dos
olhos de Drosophila (Prancha 28). Quando o cDNA de eyeless foi expresso no disco
alar, parte da cutícula alar deu origem a olhos (Figura 23.18B). Mais notável ainda,
quando o cDNA do eyeless de Drosophila foi substituído por cDNA de Pax6 de
camundongo e colocado sob controle do sistema de expressão GAL4, a proteína
Pax6 murina causou a formação de olhos ectópicos de Drosophila (Figura 23.18C)!
O gene Pax6 parece ser um regulador da via formadora do olho tanto de vertebrados
como de insetos. Mas os olhos não são os mesmos. Permanece para ser entendido
como esses caminhos divergiram durante a evolução para produzir os diferentes
tipos de olhos atualmente vistos.
Parece que o gene Pax6 é conservado em todo o do reino animal e que codifica um
fator de transcrição que se liga a genes formadores de olhos em todo esse reino. O
gene Pax6 não é o único regulador do desenvolvimento que parece ser homólogo em
insetos e mamíferos. Outro tal gene é o tinman que contém a seqüência homebox. Esse
gene é expresso no mesoderma esplâncnico de Drosophila, finalizando por residir na
*O modelo antes dessa pesquisa era que os olhos haviam se desenvolvido independentemente
pelo menos 40 vezes. O laboratório de Gehring mencionou a clonagem de homólogos de Pax6 de
platelmintos e cefalópodes. Um segundo gene de Drosophila, dachshund (dac), também pode dar
origem a olhos ectópicos quando expresso no disco imaginal errado. Como parece que eyeless pode
ativar a expressão de dachshund, e vice-versa, os dois genes podem ter desenvolvido uma alça de
retroalimentação (feedback) positiva autoreforçante (Shen e Mardon, 1997).
Figura 23.18
Pax-6 como um gene homólogo para o desen- Proteína
volvimento do olho em insetos e vertebrados. ativadora
(A) A expressão dirigida do cDNA de Pax6 GAL4 de GAL4 Sítios ligantes cDNA
Seqüência
em um disco imaginal não de olho em Droso- intensificadora de GAL4 de Pax6
phila. Uma espécie de Drosophila é construída específica do
onde o gene para a proteína GAL4 do levedo é disco imaginal
colocado a jusante de uma seqüência intensifi-
cadora que estimula a expressão no disco Expressão GAL4 específica de tecido Expressão do cDNA de Pax6
específica de tecido
imaginal da asa, perna ou antena. Normalmen-
te, a proteína do levedo não encontra uma se-
qüência para ativar. Entretanto, se é adicionado
ao embrião um transposon que leva um cDNA
para Pax6 a jusante dos sítios de ligação de
GAL 4, aquele cDNA será expresso em quais-
quer dos discos imaginais onde é produzida a
proteína GAL4. (B) Omatídios de Drosophila
emergindo da asa de uma mosca da fruta quan-
do o cDNA de eyeless foi expresso no disco da
asa de Drosophila. (C) Omatídios de Droso-
phila emergindo na perna de uma mosca da
fruta quando o cDNA de Pax6 de camundongo
foi expresso no disco da perna de Drosophila.
(de Halder et al., 1995; fotografias cortesia de
W. J. Gehring.)
região do mesoderma cardíaco. Mutantes de perda-de-função de tinman não têm o

coração (daí seu nome segundo o personagem do Mágico de Oz) (Bodmer, 1993). Em
camundongos, o gene homólogo é chamado Cardiac-specific homebox (Csx), e é
também expresso originalmente no mesoderma esplâncnico e em seguida continua a
ser expresso nas células que irão formar os tubos cardíacos (Manak e Scott, 1994).
Assim, embora o coração dos vertebrados e o coração dos insetos praticamente nada
têm em comum, exceto sua capacidade de bombear fluidos, ambos parecem ser predi-
tos pela expressão do mesmo gene Csx/tinman. A diferença entre os corações deve
residir nos genes regulados pela proteína CSX/Tinman.
BMP4 e a Morfogênese dos Membros
Em alguns casos, um gene homólogo pode assumir uma nova função quando expres-
so em um novo local. A expressão de Bmp4 no membro do pinto é um bom exemplo de
como uma pequena mudança desenvolvimental pode criar uma importante alteração
morfológica, do ponto de vista evolucionário. A maioria das pessoas concordaria que
o pato e o pinto não são iguais, embora sua embriogênese seja extremamente seme-
lhante até os últimos dias. Nesse momento, o bico do pato torna-se distinguível do
bico do pinto, e os pés interdigitados do pato são retidos, mas a interdigitação é
perdida nos pés posteriores do pinto.
BMP4 é conhecida como indutora de apoptose em células na crista neural craniana,
no mesênquima pulmonar e nos brotos dentais. Ela também causa apoptose no tecido
interdigital frouxo do membro do pinto. Não só o Bmp4 é expresso no tecido interdigital,
mas se os membros do pinto forem infectados com um vírus expressando uma forma
negativa dominante do receptor de BMP, o tecido interdigital não sofrerá apoptose
quando receber o sinal BMP4 (Figura 23.19; Yokouchi et al., 1996; Zou e Niswander,
1996). O pinto e o pato mostram padrões muito similares na expressão de BMP. Porém,
embriões de pato não expressam Bmp4 (ou BMP2 ou 7, relacionados) em seus tecidos
(B)
(A)
Figura 23.19
Expressão de BMP necessária para a indução
de apoptose no enredamento interdigital em
embriões de pinto. (A) A BMP4 é vista no
interdigitais. Portanto, mudando ligeiramente a regulação de Bmp4 é produzida uma enredamento interdigital do membro posteri-
nova morfologia que pode ser selecionada ou rejeitada pela seleção natural. Altera- or do pinto (esquerda) mas não no do pato
ções no desenvolvimento podem produzir a chegada do mais apto. Sua sobrevivên- (direita) no mesmo estágio do desenvolvimen-
cia depende do seu ambiente. to. (B) Quando o sinal de BMP é bloqueado
por um receptor negativo dominante infectado
no membro posterior, a apoptose interdigital
Genes Hox e a Evolução dos V
Hox ertebrados
Vertebrados não ocorre e os dígitos são mais curtos. (de
Zou e Niswander, 1996; fotografias cortesia
Uma das mais notáveis peças de evidência da profunda homologia entre todos ani- de L. Niswander.)
mais do mundo é fornecida pelos genes Hox. Conforme mencionado no Capítulo 16,
os genes Hom-C da mosca da fruta são homólogos aos do mamífero. Não somente
são os genes homólogos, como também estão na mesma ordem em seus respectivos
cromossomos. Os padrões de expressão são também notavelmente semelhantes; a
expressão dos genes do terminal 3’ ocorre anteriormente, enquanto aqueles do termi-
nal 5’ são expressos mais posteriormente. Como se essa evidência de homologia não
fosse o suficiente, Malicki e colegas (1992) demonstraram que o gene humano HOX4B
podia imitar a função de seu homólogo na Drosophila, Deformed, quando introduzi-
do em embriões de Drosophila deficientes em Dfd. Slack e colegas (1993) postula-
ram que o padrão de expressão do gene Hox define o desenvolvimento de todos os
animais e que é constante para todos os filos, o gene Hox tipo labial sendo expresso
anteriormente, o gene Hox tipo Ubx no centro, e o gene Hox tipo AbdB posteriormen-
te. A regulação global desses genes Hox é também semelhante de espécies para espé-
cies. A proteína Caudal é usada para induzir os domínios posteriores da Drosophila, e
parece fazer o mesmo em camundongos e nematóides (Subramanian et al., 1995). Se a
expressão subjacente do gene Hox for uniforme, considera-se que diferenças nos filos
emergem de diferenças em como esses genes são regulados e quais genes são regula-
dos pelas proteínas derivadas de Hox.*
Em vertebrados, existem quatro complexos Hox. Em anfioxus, um cordado não-
vertebrado que carece de uma cabeça verdadeira, cérebro, tecidos da crista neural, e
medula espinhal, há somente um complexo Hox muito parecido com aquele dos inse-
tos (Figura 23.20; Holland e Garcia-Fernández, 1996). Quando da evolução dos peixes,
haviam quatro complexos Hox. Os genes Hox parecem interpretar a informação
posicional ao longo do eixo ântero-posterior do corpo, e a importância desses genes
relacionando evolução e desenvolvimento foi sugerida por certas estruturas
“atavisticas” que resultaram da perda de determinados genes Hox. A ruptura de genes
* Considera-se que a razão dessa notável conservação de estrutura do complexo do gene Hox é o
compartilhamento de regimes cis-reguladores pelos genes vizinhos. Se um gene Hox é movido para uma
região diferente dentro do complexo, sua regulação é alterada. Os regimes reguladores críticos podem ser os
sítios ligantes para as proteínas Polycomb. Essas proteínas são também conservadas através da evolução,
e silenciam os genes Hox em determinados momentos e locais. Aqui, portanto, vemos uma “restrição
filética” a nível molecular (Chiang et al., 1995; Müller et al., 1995; van der Hoeven et al., 1996).
Figura 23.20
Ascendência postulada de genes homeóticos a
partir de um ancestral hipotético tanto de HOM-C de
deuterostomatas como protostomatas. Anfio- Drosophila
xos têm somente um aglomerado, semelhante
aos insetos. Vertebrados têm quatro aglomera- HOM-C de
dos, nenhum dos quais é completo. (De acordo inseto em geral
com Holland e Garcia-Fernández, 1996.)
Ancestral
comum
hipotético
Aglomerado
Hox de
Anfioxo
Hox-Α de
Camundongo
Hox-Β de
Camundongo
Hox-C de
Camundongo
Hox-D de
Camundongo
Hoxa-2 resulta numa transformação parcial do segundo arco faríngeo em uma cópia
do primeiro arco. Os fetos mutantes carecem dos ossos estribo e estilóide formados
do segundo arco, mas têm extra os ossos martelo, bigorna, timpânico e escamoso. Eles
têm também uma cartilagem filamentosa que está fundida ao elemento alisfenóide e
cujo terminal caudal está em contato com a bigorna supranumerária. Essa cartilagem
não tem contrapartida em camundongos normais, mas suas relações anatômicas suge-
rem que seja homóloga com a cartilagem pterigoquadrática vista em répteis. O comple-
xo formado por essa cartilagem e a bigorna é considerado ter estado presente em
terapsídeos, o grupo de répteis que deu origem aos mamíferos (Rijli et al., 1993; Mark
et al., 1995). Quando o gene Hoxa-2 é desregulado pela eliminação de receptores de
ácido retinóico, uma distinta cartilagem pteroquadrada se desenvolve ligando os os-
sos bigorna e alisfenóide (Figura 23.21; Lohnes et al., 1994).
Porém, permanecia a pergunta se os genes Hox especificam o eixo de acordo
com um sistema de contagem ou por um código pelo qual diferentes genes Hox
especificam vértebras diferentes. Essa é uma pergunta importante porque dá a
visão de como os mesmos genes Hox podem especificar corpos diferentes. Com-
parando os padrões de expressão do gene Hox com o tipo de vértebras mostrou-
se que esse era especificado pela constelação de genes Hox expressos nos somitos
(Gaunt, 1994; Burke et al., 1995). Por exemplo, o camundongo tem 5 vértebras
occipitais, 7 cervicais, 13 torácicas, 6 lombares e 4 sacrais. O pinto, por outro lado,
tem 5 vértebras occipitais, 14 cervicais, 7 torácicas, 9 lombares e 4 sacrais. Embora
o número total de vértebras pré-sacrais difira somente por uma (34 versus 35),
existem óbvias transposições entre as espécies (Goodrich, 1930). Em ambos os
animais, Hoxc-5 é expresso no fim das vértebras cervicais, enquanto Hoxc-6 apa-
rece no começo da série torácica. No camundongo isso ocorre no limiar entre a
décima segunda e décima terceira vértebra e em pintos entre a décima nona e a
vigésima. Assim em vertebrados, alterações da morfologia podem se concretizar
mudando-se os domínios da expressão gênica de Hox.
Figura 23. 21
Representação de elementos do esqueleto derivados do primeiro arco faríngeo (em cinzento) e do
segundo arco faríngeo (em preto). (AS, alisfenóide; I, bigorna; I2 bigorna duplicado; P e P2,
cartilagem pteróide normal e duplicada; PQ, cartilagem pterigoquadrada; SQ, escamoso; SQ2
escamoso duplicado.) (De acordo com Mark et al., 1995.)
Camundongo selvagem/mamífero
Genes Hox e a Evolução dos Artrópodes
A mesma pergunta produziu uma resposta diferente quando feita a respeito dos
artrópodes. Borboletas (Lepidópteros) diferem de Drosophila (Dípteros) de duas
óbvias maneiras. Primeiro, borboletas têm quatro asas, ao passo que os dípteros
têm duas. Segundo, larvas de borboletas têm membros abdominais chamados pró-
pernas que não existem em larvas de moscas. A maneira mais provável de criar
essas diferenças seria alterar o padrão da expressão do gene homeótico (Lewis, Réptil
1978). Em Drosophila, o Ultrabithorax (Ubx) é expresso nos halteres, mas não nas
asas. Mutações de perda-de-função de Ubx convertem os halteres em asas
mesotorácicas, enquanto que a expressão ectópica de Ubx nos discos alares faz
com que eles formem halteres (veja Capítulo 14). Poder-se-ia esperar, por isso, que
o Ubx seria inativo nos discos das asas posteriores da borboleta. Esse não é o caso.
Warren e colaboradores (1994) mostraram níveis altos de expressão de Ubx nos
discos das asas posteriores da borboleta “buckeye”, Precis coenia. Na realidade, o
padrão de expressão do gene Hom-C em Precis foi essencialmente o mesmo que o
padrão em Drosophila. Na borboleta, o Ubx modifica a morfologia alar para pro-
duzir uma asa posterior (em lugar de uma anterior). Na mosca, ele modifica a asa
em um haltere. A hipótese atual é que os genes alvo de Ubx podem ter mudado, Mutante com Hoxa-2 anulado
mas não o padrão da expressão de Ubx.
A EVOLUÇÃO DO NÚMERO DE ASAS. As asas dos insetos são consideradas ter

evoluído de apêndices multiramificados de guelras de crustáceos ancestrais. Especi-
ficamente, o padrão de expressão áptero das abas osmorreguladoras dorsais (epípodos)
dos crustáceos se parece com sua expressão em asas de insetos em desenvolvimento
(Kukalova-Peck, 1978; Averof e Cohen, 1997). Carroll e seus colegas (1995) suge-
rem que o inseto original tinha asas saindo de todos os segmentos (como as guelras
dos crustáceos). Em insetos modernos, diferentes genes homeóticos suprimem esse
potencial na maioria dos segmentos. Em outras palavras, a formação das asas origi-
nou-se independentemente dos genes homeóticos em um organismo que estava usando
os genes homeóticos para identidade segmentar ou padronização neural. Somente
mais tarde o programa formador de asas ficou sob o controle dos genes homeóticos.
Há várias observações apontando para essa conclusão. Primeiro, embora o Antenna-
pedia seja expresso em dois segmentos (segundo e terceiro torácico), capazes de
produzir asas, ele não é necessário para formação das asas. O segmento mesotoráci-
co alar (T2) pode, portanto, representar o “estado fundamental” presente em todos os
segmentos antes dos genes homeóticos começarem a regular a formação das asas.
Segundo, em vez do Antennaedia estar regulando positivamente o desenvolvimento
alar em T2 e T3 parece que outros genes Hom-C reprimem o desenvolvimento alar
em outros primórdios. Mutações de perda-de-função dos genes Hom-C causam a
formação de primórdios alares ectópicos nos segmentos em que são expressos (veja
Figura 14.29 mostrando uma mosca cujo Ubx foi removido). Portanto, com a possí-
vel exceção dos segmentos abdominais inferiores controlados por Abd-b, o potencial
para o desenvolvimento de asas existe em todos os segmentos e é reprimido pelos
genes homeóticos. Terceiro, se a expressão de Scr é induzida em discos alares (usan-
do o sistema GAL4 mencionado anteriormente), o desenvolvimento alar é abortado
em seus estágios precoces.
(A) Apterigoto Figura 23.22

Esquema evolucionário do desenvolvimento da asa. Apterigotos (A) já tinha o esquema
padrão Hom-C dos insetos. Quando emergiram as asas (B,C), todos os segmentos as possu-
íam, independente dos genes Hom-C neles expressos. (D,E) Na maioria dos insetos, AbdB,
Scr e abdA impediram a formação da asa. (F) Em dípteros tais como a Drosophila, Ubx
também adquiriu a habilidade para reprimir o desenvolvimento da asa. (De acordo com
Carroll et al., 1995.)
(B) Ninfa Paleodictióptera
Combinando genética do desenvolvimento e registro fóssil (Kukalova-Peck, 1978),

Carroll e colegas propuseram o seguinte cenário (Figura 23.22): quando as asas se
originaram, elas foram encontradas em todos os segmentos, e não havia regulação
homeótica de seu número ou caráter. Admitindo que o padrão de expressão gênica de
Hom-C tenha permanecido o mesmo, as proteínas HOM-C adquiriram a capacidade de
regular a formação de asas através da evolução de sítios sensíveis a Scr, AbdA e Ubx
nas regiões reguladoras dos genes formadores de asas. A evolução de elementos
(C) Ninfa de efemérida paleozóica
responsivos a Scr levaria à modificação ou redução das asas protorácicas (T1), en-
quanto os elementos responsivos a AbdA levariam à redução das asas abdominais.
Em insetos de quatro asas, o Ubx reprime a formação de asas no primeiro segmento
abdominal (A1) e, em insetos de duas asas, ele controla o desenvolvimento de asas em
ambos, A1 e T3. Assim, diferentemente da situação em mamíferos, a evolução da
identidade de segmentos de insetos não parece corresponder com mudanças nos
genes Hom-C. Ao contrário, as proteínas codificadas por esses genes homeóticos
adquiriram novos “alvos” reguladores.
EVOLUÇÃO DO NÚMERO DE PATAS DE INSETOS. Outra importante lição

evolucionária é que os genes Hom-C não são reguladores todo-poderosos. Ao con-
(D) Adulto neóptero primitivo trário, eles podem ser regulados localmente pelos produtos de outros genes. Em
artrópodes, muitos grupos são distinguidos pelo número de membros. Os insetos têm
seis patas quando adultos, três pares se originando de cada um dos três segmentos
torácicos. Em Drosophila, o gene Distal-less (Dll) é crítico para prover o eixo próxi-
mo-distal dos apêndices (veja Figuras 14.33 e 19.21). A expressão de Distal-less ocorre
nos discos formadores de membros cefálicos e torácicos (tanto para patas, mandíbu-
las e asas), mas é excluída no abdômen pelas proteínas AbdA e Ubx. Assim, os apên-
dices crescem como patas e asas no tórax e como mandíbulas na cabeça. A larva de
Drosophila nunca desenvolve membros no seu abdômen.
Não obstante, larvas de borboletas e mariposas são caracterizadas por patas ab-
(E) Endopterigoto moderno (Lepidóptero) dominais rudimentares chamadas pró-patas. A pesquisadora Panganiban e seus cole-
gas (1994) clonaram o homólogo do Distal-less da borboleta “buckeye” e mapearam
sua expressão durante o desenvolvimento da borboleta. Durante a porção precoce da
embriogênese de Precis a expressão de Dll é a mesma que em Drosophila. Primeiro é
vista nas regiões da cabeça durante a gastrulação (segmentos antenais, maxilares, e
labiais) e nas regiões torácicas que irão dar origem aos discos imaginais das patas
(Figura 23.23A). No entanto, com o progresso do desenvolvimento, o gene Dll de
Precis torna-se expresso do terceiro até o sexto segmento abdominal (Figura 23.22B).
Enquanto a expressão de Dll é vista tanto no anel proximal como em “soquetes” das
(F) Endopterigoto moderno (Díptero) patas torácicas verdadeiras, a expressão de Distal less no abdômen está restrita ao
anel proximal.
Assim, as pró-pernas dos lepidópteros parecem ser homólogas à porção proximal
das patas torácicas. A expressão nos segmentos maxilar e labial tanto em Drosophila
como em Precis é interessante por ser consistente com recente evidência paleontológica
(Kukalova-Peck et al., 1992) de que embora essas estruturas da mandíbula se origina-
ram de primórdios de membros, elementos de membros distais estão perdidos de todas
as mandíbulas de artrópodes.
Figura 23.23
Expressão do gene Distal-less em Precis. (A)
Aos 12% da embriogênese, transcritos de Dll
aparecem em três segmentos torácicos (T1,
T2, T3) como também nos segmentos antenal
(an), maxilar (mx),o embrionário, a expres-
são de Dll em Precis divergiu significativa-
mente daquela da Drosophila mostrando tam-
bém expressão Dll nos segmentos abdomi-
nais 3-6. (A e B de acordo com Panganiban et
al., 1994, cortesia dos autores.)
(A)
(B)
A presença de pró-pernas larvais e a expressão de Distal-less nos segmentos

abdominais de Precis sugere que Distal-less é regulado de maneira diferentemente em
dípteros e lepidópteros. Duas possibilidades chegam à frente. (1) Os genes Distal-less
de Precis não são reprimidos pelas proteínas AbdA e Ubx do homeodomínio, ou (2) a
expressão dos genes repressores do homeodomínio é de alguma maneira abolida nas
regiões abdominais de Precis. Warren e colaboradores. (1994), mostraram que os
embriões de Drosophila e Precis têm o mesmo padrão inicial da expressão gênica de
Hom-C. Porém, a cerca de 20% do caminho da embriogênese de Precis, a expressão
do gene Hom-C é perdida em pequenos pedaços dos segmentos A3-A6. Nem Ubx
nem AbdA são expressos na região dos segmentos abdominais que dão origem às
pró-pernas (Prancha 26). Pouco tempo depois, os genes Distal-less e Antennapedia
são expressos nesses “furos”. Não é conhecido quais moléculas são empregadas para
reprimir a expressão dos genes abdA e Ubx nas regiões de expressão do Distal-less.
Os genes do grupo Polycomb são os suspeitos mais prováveis por serem capazes de
reprimir ambos genes em Drosophila.
Caminhos homólogos do desenvolvimento

Uma das descobertas mais emocionantes da década passada não foi somente os
genes reguladores homólogos, mas também as vias homólogas do desenvolvimento
(Zuckerkandl, 1994; Gilbert, 1996; Gilbert et al., 1996). Duas dessas vias já foram
discutidas em capítulos anteriores. Primeiro, como foi visto no Capítulo 15, a via
chordin/BMP4 demonstra que em ambos, vertebrados e invertebrados, a chordin/
short-gastrulation inibe os efeitos de lateralização de BMP4/decapentaplegic, portan-
to, permitindo ao ectoderma protegido por chordin/short-gastrulation se tornar ecto-
derma neurogênico. As reações são tão parecidas que a proteína decapentaplegic da
Drosphila pode induzir destinos ventrais em Xenopus e pode substituir para a proteí-
na short-gastrulation (Holley et al., 1995). Em segundo lugar, vimos no Capítulo 18,
que as interações entre Hedgehog e Wingless foram conservadas entre insetos e
Figura 23.24 Drosophila melanogaster (corpo gorduroso)

Regulação semelhante do gene da álcool desidrogenase em Droso-
phila e humanos. CREB/ATF e C/EBP são reguladores positivos do
gene da álcool desidrogenase. AEF é um regulador negativo. (De
acordo com Abel et al., 1992; Zuckerkandl, 1994.)
Seqüência reguladora
a montante
Homo sapiens (fígado)
Seqüência reguladora
Figura 23.25 a montante
A via RTK-RAS amplamente usada. O esque-
ma da via está mostrado no lado esquerdo jun-
to com os nomes em diferentes espécies. O
ligante, que pode ser solúvel (como no EGF) vertebrados na formação dos membros. Na verdade, as mesmas interações são usadas
ou uma proteína ligada à membrana em outra
para estabelecer o padrão de segmentação em embriões precoces de Drosophila (veja
célula (como na proteína Boss [“Bride of
sevenless”] associada ao sevenless do RTK).
Capítulo 14) e para estabelecer compartimentos no cérebro dos mamíferos (veja Capí-
Os domínios citoplasmáticos das RTKs são tulo 7). Também foi mostrado que numerosas interações DNA-proteína regulando
autofosforilados ao se dimerizarem, e isso lhes genes específicos são conservadas através de espécies divergentes. Dessa maneira,
permite se ligar à proteína adaptadora e estimu- o gene da álcool desidrogenase é controlado no corpo gorduroso da Drosophila pelo
lar a proteína Ras G. A proteína Ras G transloca mesmo conjunto de proteínas que governa sua expressão no fígado humano (Figura
a proteína Raf para a membrana celular, dessa 23.24; Abel et al.,1992).
maneira ativando-a. Isso pode ser inibido pelas Entre as primeiras vias homólogas conhecidas está a via de transdução do sinal
proteínas gap, as quais podem inativar Ras. A RTK-Ras que foi recentemente identificada em todo o reino animal, embora usada
proteína Raf ativada inicia a cascata de fosfori-
estritamente em diferentes funções (veja Capítulo 3; Figura 23.25). Na Drosophi-
lação que termina em um fator de transcrição
fosforilado (ativado) que entrando no núcleo
la, a determinação do fotorreceptor sete é cumprida quando a proteína Sevenless
efetua a transcrição do RNA.
Ligante Receptor
Proteína G Fora da célula
Membrana plasmática
Citoplasma
Domínio
da tirosina
quinase
Organismo e tecido Ligante Tirosina Proteína Proteína G Ativador de GTPase Efeito
quinase do SH2-SH3 e proteínas
receptor de troca GDP/GTP
Vulva de C. elegans Proteína Proteína SEM-5 Proteína ?/LET-341 (?) Diferenciação e divisão
LIN-3 LET-23 LET-60 da célula vulvar
Pele de mamífero EGF Receptor GRB2 Proteína Ras GAP/GNRP Divisão da célula epidérmica
de EGF
Olho de Drosophila Bride of Sevenless Drk Ras1 Gap1/ Son of sevenless Diferenciação do fotorreceptor
sevenless sete em cada omatídio
(no suposto fotorreceptor 7) se junta à proteína Bride Sevenless (Boss) no fotorre-

ceptor 8. Essa interação ativa a tirosina quinase da proteína Sevenless a se
autofosforilar. A proteína DRK se liga então a essas novas tirosinas fosforiladas
através da sua região de homologia-2 de Src (SH2) e ativa a proteína Son of Sevenless
(SOS). Essa proteína é uma trocadora de nucleotídeos de guanosina e troca GDP por
GTP na proteína Ras1 G. Isso ativa a proteína G, permitindo que ela transmita seu
sinal ao núcleo através da cascata da quinase MAP. Esse mesmo sistema foi encon-
trado na determinação da vulva do nematóide, da epiderme do mamífero, e dos
segmentos terminais da Drosophila. A similaridade nesses sistemas é tão impressi-
onante que muito dos componentes são intercambiáveis entre as espécies. O gene
para o GRB2 humano pode corrigir os defeitos fenotípicos dos nematóides deficien-
tes em Sem-5 e a proteína do nematóide SEM-5 pode se juntar à forma fosforilada do
receptor EGF humano (Stern et al.,1993).
Caminhos homólogos formam a infra-estrutura básica do desenvolvimento. Os
alvos desse caminho podem mudar, dependendo do organismo. No ectoderma de um
organismo, o caminho RTK-Ras pode ativar os genes responsáveis pela proliferação.
Em outro organismo, o mesmo caminho pode ativar os genes responsáveis pela pro-
dução de um fotorreceptor. E num terceiro organismo, o caminho ativa os genes ne-
cessários para a construção de uma vulva.
Criando novos tipos de células:

O mistério evolucionário básico
Uma das principais questões não resolvidas na biologia evolucionária e do desenvol-
vimento é, Como os organismos desenvolvem um novo tipo de célula? Essa é uma
questão importante, uma vez que mudanças no filo estão associadas com a evolução
de novos tipos de células. Hipoteticamente, novas combinações de genes também
podem criar novos tipos de células. No entanto, isso permanece uma hipótese ainda
não provada. Kauffman (1993) modelou matematicamente a geração de novos tipos
de células a partir de um genoma aleatório consistindo de 10.000 genes, cada um
regulado por 2 outros genes. Em tais casos, ele encontra somente 100 estados está-
veis de interação (de aproximadamente 210.000 estados possíveis). Cada um desses
estados possíveis representa um tipo celular diferenciado. Em alguns casos, a muta-
ção de um gene regulador é suficiente para a restruturação das interações, e é quando
uma nova célula é criada. A maioria dos genes, no entanto, permanecem inalterados
por esse novo arranjo.
A criação de novos tipos de célula é um evento raro na natureza, e freqüentemen-
te pode mudar a natureza do animal. Como mostra a Figura 23.26, os vertebrados são
conhecidos por terem surgido de invertebrados nas diversas etapas que envolveram a
formação e modificação de novos tipos de células.
Como mencionado anteriormente neste capítulo, as células da crista neural fo-
ram importantes na origem dos cordados. Enquanto não sabemos como surgiram
as células da crista neural, Holland e colegas (1996) forneceram uma fascinante
especulação que envolve dissociação, duplicação e divergência, e co-opção. Tam-
bém envolve os homólogos vertebrados do gene da Drosophila discutidos anteri-
ormente, Distal-less. Anfioxo é um protocordado que tem notocorda, somitos, e um
tubo neural oco. Falta-lhe um cérebro e estruturas faciais e, o mais importante, não
possui células da crista neural. Como a Drosophila, o anfioxo tem somente uma
cópia do gene Distal-less por genoma haplóide, e como na Drosophila, esse gene é
expresso na epiderme e no sistema nervoso central. No entanto, enquanto o anfioxo
tem somente uma cópia desse gene, os vertebrados têm de quatro a seis cópias bem
parecidas do Distal-less, cada uma provavelmente originária de um único gene an-
cestral que se assemelha ao do anfioxo (Price, 1993; Boncinelli, 1994). Esses
homólogos Distal-less encontraram novas funções. Algumas estão no mesoderma,
CORDADOS
VERTEBRADOS
Cefalocordados
Gnatostomatas
Hemicordados
Equinodermos
Calcicordados
Urocordados
(Amphioxus)
(ascidianos)
Conodontes
Agnatos
Modificação do
arco mandibular
em mandíbulas
Crista neural, placódios
epidérmicos (formação da cabeça)
Podócitos renais
Simetria radial Mesoderma forma a notocorda

Sistema vascular aquoso Cordão nervoso dorsal oco
Fendas faríngeas pareadas

Arcos aórticos
Simetria bilateral em adultos

Sistema circulatório fechado
Larva ciliada bilateralmente simétrica

Formação de deutorostomatas
Mesoderma enterocélico
Figura 23.26
Mudanças de desenvolvimento na evolução de invertebrados para vertebrados. Os invertebrados
deuterostomatas originais foram capazes de formar os equinodermos e outros organismos que
finalmente deram origem à linhagem vertebrada. A habilidade do mesoderma para formar a
notocorda e seu ectoderma sobrejacente para se tornar um tubo neural, separou os cordatos dos
invertebrados remanescentes. O desenvolvimento das células da crista neural e os placódios
epidérmicos que dão origem aos nervos sensoriais da face distinguem os vertebrados dos
protocordatos. (De acordo com Gans, 1989; Langille e Hall, 1989.)
um lugar onde o Distal-less não é expresso em anfioxos. Outros homólogos verte-

brados de Distal-less são expressos no cérebro anterior, imitando um padrão de
expressão visto no anterior do tubo neural do anfioxo. Isso sugere que o cérebro
anterior vertebrado é homólogo ao tubo neural anterior do anfioxo. Um outro
homólogo vertebrado de Distal-less é expresso nas células da crista neural. Embora
não esteja comprovado, é possível que um novo tipo do gene Distal-less possa
fazer com que as células ectodérmicas migratórias dos anfioxos evoluam em célu-
las da crista neural.
Uma nova síntese evolucionária

Em 1922, Walter Garstang declarou que a ontogenia (desenvolvimento individu-
al) não recapitula a filogenia (evolução); ela cria a filogenia. Os animais que surgi-
ram mais tarde na história evolucionária, não surgiram através de uma adição termi-
nal em um embrião existente. Ao contrário, surgiram através de mutações que afeta-
ram a interação de módulos já existentes no Bauplan do organismo:
Uma casa não é um chalé com um andar extra em cima. Uma casa representa um
grau maior na evolução de uma residência, mas o prédio todo é alterado- funda-
ções, madeiramento e telhado- mesmo que os tijolos permaneçam os mesmos.
Dessa maneira, quando dizemos que o cavalo moderno de um só dedo evoluiu

de um ancestral com cinco dedos, nós queremos dizer que ocorreram mudanças
hereditárias na diferenciação do mesoderma do membro para condrócitos du-
rante a embriogênese na linhagem do cavalo. Nessa perspectiva, a evolução é o
resultado de mudanças hereditárias afetando o desenvolvimento.* Esse é o caso
se a mutação muda o embrião do réptil em um pássaro ou muda a cor dos olhos
da Drosophila.
Essa perspectiva do desenvolvimento, no entanto, esteve perdida durante a dé-
cada de 1940. Um dos maiores eventos na teoria evolucionária foi a “síntese mo-
derna” da biologia evolucionária e genética Mendeliana (Mayr e Provine, 1980).
Um resultado dessa fusão duramente obtida é que a evolução foi redefinida para
significar mudanças nas freqüências gênicas de uma população através do tempo.
“Uma vez que a evolução é uma mudança na composição genética das popula-
ções,” escreveu Dobzhansky (1937), “os mecanismos da evolução constituem pro-
blemas da genética de populações.” A abordagem desenvolvimental da evolução foi
excluída da síntese (Hamburger, 1980; Gottlieb, 1992; Dietrich, 1995; Gilbert et
al., 1996). Pensava-se que a genética de populações poderia explicar a
macroevolução, de modo que a morfologia e o desenvolvimento foram considera-
dos como tendo papéis de menor importância na teoria evolucionária moderna
(Adams, 1991). Em outras palavras, a macroevolução (as grandes mudanças
morfológicas vistas entre espécies, classes e filos) poderia ser explicada pelos me-
canismos da microevolução, os “valores adaptativos diferenciais de genótipos ou
desvios no acasalamento aleatório ou ambos fatores agindo juntos” (Torrey e
Feduccia, 1979).
No entanto, essa visão tinha seus críticos (seus hereges, alguns diriam). Tal-
vez o mais importante desses tenha sido Richard Goldschmidt. Goldschmidt co-
meçou o seu livro The Material Basis of Evolution (1940) com um desafio à sínte-
se moderna.
Eu podia desafiar os devotos da visão estritamente Darwiniana, a qual estamos

discutindo aqui, para tentar explicar a evolução das seguintes características
pela acumulação e seleção de pequenos mutantes: pêlo nos mamíferos, penas
nos pássaros, segmentação nos artrópodes e vertebrados, a transformação dos
arcos de guelras em filogenia incluindo os arcos aórticos, músculos, nervos,
etc.; mais adiante, dentes, conchas dos moluscos, ectoesqueletos, olhos compos-
tos, circulação sangüínea, alternação de gerações, estatocistos, sistemas
ambulacrários de equinodermos, pedicelária dos mesmos, cnidocistos, aparelho
de veneno das cobras, osso da baleia, e finalmente, diferenças químicas como
hemoglobina versus hemocianina.
Goldschimidt afirmou que as novas espécies não surgiram do mecanismo da

microevolução e que a genética de populações era incapaz de explicar novos tipos de
estrutura que envolvem diversos componentes mudando simultaneamente. Tais mu-
danças macroevolucionárias “requerem outros métodos evolucionários do que sim-
plesmente acumulação de micromutações.’’ Goldschmidt viu mutantes homeóticos
como “macromutações’’ que poderiam mudar uma estrutura em outra e possivelmente
criar novas estruturas ou novas combinações de estruturas. Essas mutações não
seriam nos genes estruturais, mas nos genes reguladores. Uma nova espécie, afirma
ele, começaria como um “esperançoso monstro” (uma frase um tanto infeliz tendo
como antecedentes a prosa de Metchnikoff).
*Uma maneira de visualizar isso é usar uma analogia matemática (Gilbert et al., 1996):
Biologia funcional = anatomia, fisiologia, biologia celular, expressão gênica
Biologia do desenvolvimento = δ [biologia funcional]/ δt
Biologia evolucionária = δ [biologia do desenvolvimento]/ δt
Ao mesmo tempo, Conrad H. Waddington estava tentando descobrir mecanis-

mos de desenvolvimento para a produção dessas novas espécies. Ele também con-
siderou mutações homeóticas em moscas como modelos de fenótipos drasticamen-
te novos, formulando a noção de transferência de competência (“assimilação gené-
tica,’’ veja Capítulo 21) para explicar certos aspectos da evolução morfológica. Pou-
cos cientistas prestavam atenção a Goldschmidt ou Waddington porque eles não
estavam escrevendo no paradigma da genética de populações da síntese moderna e
seus programas científicos eram suspeitos. (Goldschmidt não acreditava na opinião
de Morgan sobre o gene como uma entidade particular, e o trabalho de Waddington
foi mal interpretado como apoiando a herança de traços adquiridos.) No entanto, na
década de 1970, eventos na paleontologia (teoria do equilíbrio pontuado), eventos
na sociedade (os Criacionistas dando a disputa microevolucionária para os biolo-
gistas mas contestando a macroevolução), e eventos em biologia molecular
(Notadamente o trabalho de King e Wilson em 1975 mostrando que os DNAs, huma-
no e do chimpanzé, eram mais do que 99% idênticos) levaram os cientistas a consi-
derar seriamente que mutações em genes reguladores podem criar grandes mudan-
ças na morfologia.
Na década de 1990, as técnicas de biologia molecular permitiram aos biologistas
descobrirem (1) genes reguladores homólogos como o Pax6, que controlam o de-
senvolvimento dos mesmos órgãos em todo reino animal, (2) caminhos homólogos
para o desenvolvimento, cujas funções podem mudar entre organismos ou entre
células do mesmo organismo, e (3) os padrões de mudança da expressão dos genes
homeóticos, permitindo que diversas partes do corpo tenham estruturas e funções
diferentes. Tais descobertas convergiram para a formação de uma síntese evolucio-
nária do desenvolvimento que incorpora a abordagem da genética de populações
mas que expande a teoria evolucionária para explicar também o fenômeno
macroevolucionário. A síntese evolucionária do desenvolvimento também retém
uma multiplicidade de paradigmas. Em alguns momentos (tais como a criação das
células da crista neural), uma mudança qualitativa ocorre, enquanto em outros ca-
sos (como a formação da bolsa do toupeira com bolso), quantidade se torna qualida-
de quando um limite é ultrapassado. Sinalizando a união dessa síntese, “Biologia
Evolucionária do Desenvolvimento’’ se tornou um tópico separado em uma enciclo-
pédia da ciência (Hall, 1996), e o Roux’s Archives of Developmental Biology, uma
das mais antigas publicações da embriologia experimental, mudou o nome para De-
velopment, Genes, and Evolution.
Nós estamos em um extraordinário momento de nosso entendimento da nature-
za, pois a síntese da genética do desenvolvimento com a biologia evolucionária
pode transformar nossa apreciação dos mecanismos fundamentais da mudança
evolucionária e diversidade animal. Tal síntese é na realidade um retorno a uma
teoria evolucionária mais ampla que se fragmentou na virada do último século (Figu-
ra 23.27). Nos últimos anos do século 19, a biologia evolucionária continha as ciên-
cias que nós chamamos hoje de biologia evolucionária, sistemática, ecologia, gené-
tica e desenvolvimento. Quando Wilhelm Roux (1894) anunciou a criação da ‘’mecâ-
nica do desenvolvimento’’, ele não rompeu totalmente com a biologia evolucionária.
Ao contrário, ele afirmou que “uma mecânica do desenvolvimento ontogenético e
filogenético deve ser aperfeiçoada.’’ Ele citou que a mecânica do desenvolvimento
dos embriões (o ramo ontogenético) iria crescer mais rápido do que os estudos em
filogenética, mas afirmou que “em conseqüência das conexões causais íntimas entre
os dois, muitas das conclusões surgidas da investigação sobre ontogenia [iriam]
esclarece os processos filogenéticos.’’
Cem anos mais tarde, estamos em um ponto onde podemos nos ater à segunda
mecânica do desenvolvimento de Roux e criar uma teoria unificada da evolução.
Figura 23.27
EVOLUÇÃO Roteiro disciplinar do lado evolucionário da
biologia, desde 1880 até o presente. Para maior
Roux, Wilson, clareza, outras vias (tais como a da genética
outros geral à genética humana ou da evolução à
imunologia) não foram mostradas.
“Questão geracional”
Mecânica desenvolvimental
Biologia evolucionária Morgan

Sistemática
Ecologia
Anatomia comparada Genética
Genética de
populações
Embriologia experimental
Regeneração
Fertilização
“Síntese moderna” Grupo
Imunologia
NeoDarwinismo do fago
Biologia celular
Biologia do
desenvolvimento
Genética molecular
Genética do
desenvolvimento
Sob Construção
SÍNTESE
DESENVOLVIMENTAL
LITERATURA CITADA
Abel, T., Bhatt, R, and Maniatis, T. 1992. A Alberch, P. and Gale, E. 1983. Size dependency Averoff, M. and Cohen, S. M. 1997. Evolutio-
Drosophila CREB/ATF transcriptional activator during the development of the amphibian foot. nary origin of insect wings from ancestral gills.
binds to both fat body- and liver-specific Colchicine induced digital loss and reduction. J. Nature 385: 627-630.
regulatory elements. Genes Dev. 6: 466-480. Embyol. Exp. Morphol. 76:177-197.
Bateson, W. 1894. Materials for the Study of
Adams, M. 1991. Soviet perspectives on Alberch, P. and Gale, E. 1985. A developmental Variation. Cambridge University Press, Cambridge.
evolutionary theory. In L. Warren and M. analysis of an evolutionary trend. Digit reduction
Berrill, N. J. 1955. The Origins of the Vertebrates.
Meselson (eds.), New Perspectives iri Evolution. in amphibians. Evolution 39: 8-23.
Oxford University Press, New York.
Liss/Wiley, New York.
Alexandrov, D. A. and Sergievsky, S. O. 1984. A
Berrill, N. J. 1987. Early chordate evolution. I.
Averoff, M. and Cohen, S. M. 1997. Evolutio- variant of sympatric speciation in snails.
Amphioxus, the riddle of the sands. Int. J. Invert.
nary origin of insect wings from ancestral gills. Malacol. Rev. 17: 147.
Repr. Dev. 11: 1-27.
Nature 385: 627-630.
Anderson, D. T. 1973. Embryology and Phylo-
Bodmer, R. The gene tinman is required for
AhIberg, P. E. 1997. How to keep a head in geny of Annelids and Arthropods. Pergamon
specification of the heart and visceral muscles
order. Nature 385: 489-490. Press, Oxford.
in Drosophila. Development 118: 719-729.
Boncinelli, E. 1994. Early CNS development: Conway Morris, S. and Whittington, H. B. 1979. Cottlieb, G. 1992. Individual Development and
Distal-less related genes and forebrain developr- The animals of the Burgess Shale. Sci. Am. Evolution: The Genesis of Novel Behavior.
nent. Curr. Opin. Neurobiol. 4: 29-36. 240(1): 122-133. Oxford University Press, New York.
Bonner, J. T. 1988. The Evolution of Complexity. Darwin, C. 1859. The Origin of Species. John Gould, S. J. 1977. Ever Since Darwin. Norton,
Princeton University Press, Princeton. Murray, London. New York.
Bowring, S. A., Grotzinger, J. P. Isachsen, C. E., Dietrich, M. (1995). Richard Goldschmidt’s Gould S. J. 1989. Wonderful Life. Norton,
Knoll, A. H., Pelechaty, S. M. and Kolosov, P. “heresies” and the evolutionary synthesis. J. Hist. New York.
1993. Calibrating rates of early Cambrian Biol. 28: 431-461.
Gould, S. J. 1990. An earful of jaw. Natural
evolution. Science 261: 1293-1298.
Dobzhansky, T. G. 1937. Genetics and the Origin History 1990(3): 12-23.
Brusca, R. C. and Brusca, G. J. 1990. Invertebrates. of Species. Columbia University Press, New York.

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FOTOGRAFIA DA CONTRACAPA: Fotografia de um embrião de pinto

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento

Afinidade celular diferencial 79 3 Moléculas de receptores e vias de transdução

PARTE II Padrões de Desenvolvimento

novo organismo 121 4 Q Informações adicionais & Especulações

Estrutura dos gametas 121 Respostas precoces 149

Q Informações adicionais & Especulações Mecanismos de gastrulação em aves 238

células embrionárias 209 6 Tipos de neurônios 276

A crista neural cardíaca 296 Início do desenvolvimento

PARTE III Mecanismo da Diferenciação Celular

específicos 391 10 Regiões de controle de loco: transcrição do gene da

cromatina 431 11 Mecanismos da tradução eucariótica 472

Caracterização de RNAs Mensageiros Q Informações adicionais & Especulações

PARTE IV Especificação do Destino Celular e os

Q Informações adicionais & Especulações Indução de especificidade mesodérmica ventral e

Especificação do destino celular Estabelecimento dos eixos

PARTE V Interações Celulares Durante a

Indução secundária 655 17 indutores do broto do membro 704

Controle Hormonal da Metamorfose de Insetos 754 Hermafroditismo 795

A saga da linhagem Mecanismos desenvolvimentais

O s últimos anos do século 20 encontram a biologia do desenvolvi-

Como usar o website

Mais localizações estão sendo adicionadas no website, e essas podem

Introdução ao desenvolvimento animal

Os problemas da biologia do desenvolvimento

mento da cartilagem e dos músculos ocorreram ao longo de muitas gerações de

Os estágios do desenvolvimento animal

1. Ocorrência de clivagem imediatamente após a fertilização. Clivagem é uma

Nossa herança eucariótica

Figura 1.2 (A) CÉLULA PROCARIÓTICA (B) CÉLULA EUCARIÓTICA

Procariotos e eucariotos têm mecanismos diferentes de regulação do gene. Em

Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares

Controle da Morfogênese no Desenvolvimento em Acetabulária

DNA Ribossomos RNA

Diferenciação em Ameboflagelados Naegleria

(A) (B) (C) (D)

Porcentagem da população com flagelo

Células de corpo com

As Origens da Reprodução Sexual

Micronúcleo restante se Micronúcleos migratórios Núcleo diplóide se forma e

A união desses dois processos distintos, sexo e reprodução, em reprodução

Figura 1.12 Reprodução assexual (mitótica)

Dois parceiros tipo mais e tipo menos

Envoltório Cromossomos Cromatídeos

Interfase Prófase I precoce Meia prófase I Prófase I tardia Metáfase I

O envoltório nuclear se rompe e cromossomos homólogos (cada cromossomo

(A) (B) Figura 1.14

Anáfase I Telófase I Metáfase II Anáfase II Telófase II

Os dois cromossomos O centrômero se divide Cada nova célula tem

Eucariotos coloniais: A evolução da diferenciação

células do lado posterior podem se reproduzir. Em P. californica, a colônia normalmen-

Sexo e Individulidade em Volvox

Expansão Morte de células

(A) (F) Figura 1.18

das células que as produzem (Pommerville

(D) (I) * Esse gene (regA) foi clonado e mostrou

células em forma de garrafa abre um bura- O que acontece às células somáticas

(A) assexuadamente e se tornam potencialmen- advento da inevitável morte natural

Macho assexuado Desenvolvimento embrionário Macho sexuado

Fêmea assexuada Fêmea sexuada

Diferenciação e Morfogênese em Dictyostelium