TCNICAS BSICAS DA

MICROBIOLOGIA
Tcnicas bsicas da Microbiologia
DUAS OPERAES BSICAS EM MICROBIOLOGIA
CULTURA DE MICRORGANISMOS
Crescimento de populaes de microrganismos em meios de cultura laboratoriais
(usualmente, em cultura pura)
ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
Separao de estirpes microbianas especficas a partir de populaes mistas
(ex. amostras ambientais, amostras clnicas)
Tcnicas de asspsia e de esterilizao
Preparao de meios de cultura
Isolamento de culturas puras
Microscopia
Manuteno de clulas viveis no laboratrio
Preparao de meios de cultura
A composio de um dado meio de cultura est
dependente da espcie que se pretende cultivar.
O conhecimento do habitat natural de um dado microrganismo
muitas vezes til na seleco do meio de cultura adequado, j
que as suas necessidades nutricionais reflectem esse mesmo
habitat.
ELEMENTOS ESSENCIAIS
Enxofre (S)
(~ 1% do peso seco da clula)
Protenas, coenzimas
Carbono (C)
(Elemento comum a todos os
constituintes celulares
~ 50% do peso seco da clula)
Protenas, cidos nucleicos, polissacridos, lipidos
Azoto (N)
(~ 14% do peso seco da clula)
Protenas, cidos nucleicos, coenzimas
Fsforo (P)
(~ 3% do peso seco da clula)
Fosfolpidos, cidos nucleicos, ATP
Hidrognio (H)
(~ 8% do peso seco da clula)
Protenas, cidos nucleicos, polissacridos, lipidos
Oxignio (O)
Protenas, cidos nucleicos, polissacridos, lipidos
(~ 20% do peso seco da clula)
Fontes de energia
Fontes de Carbono
- CO
2
- Compostos orgnicos
CATEGORIAS
NUTRICIONAIS
DOS
MICRORGANISMOS
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Chlorophyll or
bacteriochlorophyll
Maior parte dos microrganismos
usam um de trs tipos de
fontes de energia
Fig. 9.1
Macronutrientes ()
Macronutrientes Fontes de elementos principais
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
(g/l)
(mg/l)
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Micronutrientes ou elementos trao (g/l)
Vitaminas factores de crescimento essenciais.
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Meios de cultura sintticos ou definidos meios
de cultura cuja composio qumica perfeitamente conhecida.
Meios de cultura complexos - meios de cultura cuja
composio exacta desconhecida. Podem ter como componentes
diversos ingredientes, tais como Peptonas, Extracto de Levedura,
Extracto de Carne, etc.
PEPTONAS
Hidrolizados de
protenas preparados
por digesto
proteolitica parcial
de fontes proteicas
(p.ex. extracto de
carne, casena, soja,
gelatina, etc.). Os
aminocidos e
pequenos pptidos
resultantes servem
como fonte de
carbono (C), de
energia e de azoto
(N), para os
microrganismos.
EXTRACTO DE
LEVEDURA
(Yeast extract)
Obtido a partir da lise
de clulas de levedura
da cerveja e hidrlise
dos seusconstituintes.
Fonte de vitaminas,
compostos de
Carbono (C), de azoto
(N) e sais minerais.
Meios selectivos
suprimem o crescimento de
determinados
microrganismos em
benefcio de outros.
(ver aula sobre cultura de
enriquecimento)
Meios de cultura liquidos e slidos
Agar
agente solidificante
(polissacrido de alga marinha vermelha)
Os meios de cultura podem ser usados na seleco e crescimento de um
determinado microrganismo ou na identificao de uma espcie em particular.
Meios diferenciais
permitem a distino entre diferentes
grupos de microrganismos com base na
capacidade de metabolizar componentes
especficos presentes no meio de cultura
e/ou
na morfologia (aparncia) das colnias.
Permitem, por vezes, a identificao de
microrganismos com base nas suas
caractersticas fisiolgicas.
Meios selectivos e meios diferenciais
(In J. Black, Microbiology, principles and exploration, 6th ed, J Wiley & Sons)
Microrganismos so ubquos
(gua, ar, solo, corpo, etc.)
Solo
ar
lngua
Figura mostra colnias de microrganismos (na superfcie de meio slido)
Pasteur Sec. XIX
. Refutao final da teoria da gerao expontnea
. Desenvolvimento de tcnicas de esterilizao
eficientes
(pasteurizao)
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Crescimento microbiano em meio lquido turbidez
Esterilizao no Laboratrio
CALOR
CALOR SECO - em estufa (160C/2horas; 180C/1 hora)
- pouco eficiente
- em desuso; s aplicvel a material de vidro
ou outro resistente a temperaturas altas
CALOR HMIDO na AUTOCLAVE
FILTRAO
RADIAO Ultra- Violeta ( = 260 nm)
Limitada a superficies (p.ex. salas, pequenos compartimentos, superficie de utenslios
(No penetra vidro, filmes sujos, gua, etc.)
ESTERILIZAO Morte ou remoo de todos os organismos vivos, estruturas
biolgicas e virus de um material, meio de cultura, etc. (in Brock Biology of Microorganisms)
na AUTOCLAVE
por aco do calor hmido*
Esterilizao
CONDIES DE
ESTERILIZAO
NA AUTOCLAVE
121C (presso: 1 bar)
Durao depende de:
Volume de material
dentro da autoclave;
Grau de contaminao do
material a esterilizar
(usual 15 min)
* Vapor de gua saturado,
sob presso (1 bar)
APLICADA A:
- Meios de cultura sem
componentes termolbeis
(p.ex. muitos aucares, aminocidos,
vitaminas, no so estveis a 121C)
- Materiais de plstico ou vidro
- Descontaminao de materiais
contaminados com clulas viveis
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
ENDSPOROS:
- Presentes na gua, solo, etc
- Podem permanecer viveis durante muito tempo
(dcadas; milhares/milhes(?) de anos encontrados em locais arqueolgicos, no intestino de
abelha extinta preservada em ambar)
- Algumas bactrias que os produzem so agentes de doenas graves (ex. Ttano, Botulismo)
Esterilizao na autoclave
Porqu 121C,
durante pelo menos 15 minutos?
Condies que causam a MORTE CELULAR:
Levedura
Bolor
Bactria
Vrus
Clulas vegetativas
5 min a 50-60C
30 min a 62C
10 min a 60-70C
30 min a 60C
Esporos
5 min a 70-80C
30 min a 80C
2-800 min a 100C
ou 0,5-12 min a
121C
-
Esporos bacterianos (endsporos) so as estruturas biolgicas
mais resistentes ao calor
( a sua extrema resistncia que determina quais as condies de
funcionamento da autoclave que asseguram uma esterilizao eficiente dos materiais)
Bacillus sp.
Endsporo
Clula
vegetativa
(Perry, Staley, Lorry, Microbial Life, Sinauer ed.)
TESTE QUE PODE SER USADO
PARA VERIFICAR O FUNCIONAMENTO EFICIENTE DA AUTOCLAVE
Spore strip = Tira de papel esterilizada contendo sobre a superfcie endsporos de uma
bactria (p.ex. do gnero Bacillus)
(1)
(2)
Esterilizao
por filtrao
(In J. Black, Microbiology Fundamentals and Applications,
J. Wiley and sons)
APLICADA A:
Lquidos
- Solues de compostos sensveis a temperaturas altas
(p.ex. antibiticos, vitaminas, aminocidos, aucares
podem sofrer alteraes, incluindo degradao, a 121C)
- Meios de cultura liquidos com componentes termossensveis
Gases
Esterilizao do AR por filtrao
Mscaras cirurgicas
Rolhas de algodo nos frascos
onde so cultivados
microrganismos
. Sistemas usados para filtrar ar
que entra em bioreactor
Filtros HEPA
(high-efficiency particulate air
filters)
(eficcia de reteno de 99,99% para
particulas de 0,3 g)
usados em:
- cmaras de fluxo laminar
de segurana biolgica
- salas limpas
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Cmaras de Fluxo Laminar de Segurana Biolgica
(vrios graus de conteno biolgica)
Segurana Biolgica
(nvel de conteno 4)
( In Microbiology today, vol 33, pag 18)
Transferncia de culturas de microrganismos - Tcnicas de asspsia
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Chama do bico de Bunsen
(Vizinhana da chama do bico de Bunsen oferece condies asspticas)
Ansa de repicagem
(filamento metlico)
A imobilizao das clulas num meio slido torna possvel a visualizao do
crescimento em massas celulares homogneas e isoladas denominadas colnias.
Isolamento de
colnias pela tcnica
de RISCADO EM
MEIO SLIDO
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Isolamento de colnias em meio slido
Colnia cultura pura de um microrganismo
A cultura pura de um dado microrganismo uma cultura de clulas gentica e
morfologicamente idnticas.
(Inculo inicial
num ponto da superfcie
de meio de cultura slido)
1 gerao
2 gerao
3 gerao
...
...
CRESCIMENTO MICROBIANO exponencial
Isolamento de colnias de microrganismos
Tcnica de ESPALHAMENTO em meio slido
Aps incubao T ambiente durante 24 h
Exemplo:
Suspenso de solo em gua
(Populao mista de microrganismos)
COLNIAS COM MORFOLOGIAS DIFERENTES
MICRORGANISMOS DIVERSOS
(Noo de estirpe)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Morfologia de colnias
forma e tamanho dependem do microrganismo
mas, tambm podem depender das condies ambientais,
tais como, quantidade de oxignio e
nutrientes disponveis no meio de cultura, pH,etc..
Robert KOCH (1876) primeiro cientista a definir CULTURA PURA e
a isolar COLNIAS de bactrias em meios de cultura slidos.
R. Koch
Microfotografia de bactrias
provenientes de uma colnia
isolada (confirmao de ser
um nico tipo morfolgico)
Bacillus anthracis
(desenhos de R. Koch, sec XIX)
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Passo1. Diluies sucessivas da
suspenso de solo
(10
-1
ou 1: 10;
10
-2
ou 1: 100;
10
-3
ou 1: 1000;
10
-4
ou 1: 10000;
...)
Solo populao mista
- vrios trilies de clulas
de microrganismos
diversos
Suspenso de solo em gua
(10g / 100 ml)
Passo 1.
Passo 2.
(In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)
Passo 3a
Passo 3b
Passo 4.
Isolamento de colnias e
enumerao de Unidades Formadoras de Colnias (UFC) clulas viveis
(p.ex. numa amostra de solo)
0,1 ml
N de colnias em cada placa de Petri est
relacionado com o tamanho da POPULAO
CULTIVVEL presente na amostra original de solo
Tipos morfolgicos diferentes das colnias
em cada placa relacionado com a diversidade
de microrganismos cultivveis presentes
no solo.
Bactrias Fungos miceliais (bolores)
Diluio 10
-2
10
-3
10
-4
50 colnias (diluio 10
-3
)
50 x 10 x 10
3
UFC / ml suspenso de solo (A)
50 x 10
6
UFC / 100 ml de suspenso de solo
/10 g de solo
(In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)
CULTURA DE
ENRIQUECIMENTO
Isolamento de
microrganismos
pouco abundantes e
com requerimentos
nutricionais especficos,
a partir de populaes
mistas
(p.ex. bactrias que so capazes
de degradar benzoato, i.e.
usam benzoato
como fonte de C e
energia).
Outros exemplos:
- Isolamento de bactrias que
degradam um certo
pesticida ou
hidrocarbonetos do
petrleo ou
outros poluentes orgnicos
do Ambiente.
Crescimento em
meios de cultura selectivos
1) enriquecimento em meio liquido
(nas bactrias em causa)
2) isolamento de colnias
em meio slido
(adaptado de Perry, Staley, Lory,
Microbial Life, Sinauer ed.)
PRESSO SELECTIVA
presena de fonte de C e energia
nica (neste caso, benzoato)
versus
Bactrias observveis numa amostra de solo
(observao directa atravs de microscpio
de fluorescncia)
4.2 x 10
10
Clulas totais / g solo
4.2 x 10 UFC de bactrias / g solo
UFC=CFU
Unidades Formadoras de Colnias
(Colony Forming Units)
6
vs
Diversidade microbiana no solo uma fonte
importante para explorao biotecnolgica de
NOVOS microrganismos, produtos e processos
LIMITAO DAS TCNICAS DE ISOLAMENTO DE COLNIAS
Estima-se que que somente 1-10% dos microrganismos funcionais presentes nos ambientes naturais
(p.ex solo, gua, amostras clnicas) so cultivveis em meios de cultura laboratoriais conhecidos
Clulas viveis, mas no cultivveis
Explorao das potencialidades dos microrganismos no-cultivveis
nos meios de cultura laboratoriais conhecidos
- Desenvolvimento de mtodos moleculares (no dependentes do cultivo)
para pesquisa e identificao ( ex. Anlise de DNA, RNA, protenas)
-Procura de novas frmulas para cultivo de microrganismos
(Prescott, Harley e Klein, Microbiology, 5th edition)
Procura de microrganismos adequados para um processo industrial:
- a partir da Natureza / Ambiente (solo, gua, etc.)
Estirpes adequadas (estirpes selvagens, mutantes ou geneticamente
manipuladas) so conservadas em colecces de culturas nacionais
e internacionais
(por ex. Micoteca da Universidade do Minho, American Type Culture Collection ATCC,
National Collection of Industrial Cultures - UK)
Maximizar o rendimento do processo
Novos produtos
- so frequentemente sujeitos a processos de melhoramento
(Engenharia Gentica; mutao)
Manuteno de microrganismos viveis no Laboratrio e em Coleces de Culturas
. Em rampas ou placas de Petri contendo meio slido
(viabilidade das clulas: dias ou semanas)
. Congelao
(clulas suspensas em meio de cultura + glicerol (anti-criognico)
(viabilidade das clulas: anos)
- em Azoto lquido (-196C)
- em Arcas congeladoras (-70C)
. Liofilizao
(liofilizao - desidratao das cluas por
sublimao de gua congelada, sob vcuo)
(viabilidade das clulas: anos; dcadas)
Vrias metodologias permitem a manuteno de culturas viveis, no contaminadas e
inalteradas nas suas propriedades durante perodos de tempo mais ou menos longos,
nomeadamente: