PROTOCOLO

CITOMETRO DE FLUXO

Prof. Enrique R. Argaaraz

Lab Virologia Molecular
Faculdade de Cincias da Sade
Universidade de Braslia

FLUXOGRAMA
Iniciar
Sistema

Controle de
Qualidade

Ajustar
Parmetros

Gravar
Dados

Analisar
Dados

Desligar
Sistema

I. Iniciar Sistema
1. Ligar o aparelho na seguinte ordem: Ligar o aparelho na seguinte
ordem:
Ligar estabilizador.
Ligar o Citmetro de Fluxo.
Ligar o Computador; deixar 5 a 10 (para atingir mxima potncia)

2. Checagem de Reservatrios
Vasilhame de Descarte gaveta esquerda (descartar o liquido e
acrescentar 50-100 ml hipoclorito concentrado)
- Observar se est em Standby (S assim o equipamento est pronto para uso).
Vasilhame FACS FLOW
Verificar presso ( puxar alavanca em direo ao operador)
1. Apertar bem a tampa
2. Encaixe do tubo
Nota: No esquecer de desligar a presso ante de abrir o vasilhame
Apertar RUN e HIGH
Objetivo: para que o sistema se complete com o FACS flow novo.
Nota: monitorar ate ausncia de bolhas na mangueira (tirar a mangueira do
filtro e tirar as bolhas)
Se as bolhas no desaparecerem, apertar HIGH e PRIME esperar voltar a
Stanby.
Objetivo: tirar bolhas e a soluo velha.

3. Abrir o programa Cell Quest Pro.

Fechar a folha em branco Untitle (Dont Save).
Abrir a planilha, pode estar pronta :
File Open Document Abrir a Planilha de Aquisio Open.
File Document Size Criar uma Folha.

4. Conectar o computador ao aparelho:

Acquire Connect to Cytometer (ma + B) Ao conectar, a janela do
Browser aparece automaticamente (Parameter Description).

Figura 1
Ao conectar o computador ao FACS aparecer o menu aquisio Aquisio control

Figura 2
5. Nmero e Tipos de Eventos que sero Adquiridos)
Clicar em Acquire mais uma vez;
Clicar em Aquisio and Storage aparecer menu abaixo

Figura 3

Neste menu se podem escolher os critrios para salvar e exibir os eventos.

Aquisio Gate: quais eventos sero salvos ou rejeitados, os eventos
podem compor uma dada populao (morfologica ou fenotpica)
Nota: em geral se deixa como All para ter salvos todos os eventos e excluir
apenas na anlise
Collection Criteria: se define com que nmeros de eventos a aquisio
ser encerrada ( seja de eventos totais ou uma dada populao);
Storage Gate: os eventos que sero salvos se aconselha deixar em All ;
Resolution: selecionar o valor 256;
Parameters saved: quais parmetros sero salvos. Devem ser
selecionados FSC, SSC ( morfologia, tamanho) e as fluorescncias

Figura 4
6. Identificao das Amostras ( nome e destino dos arquivos)
Ao conectar o citmetro aparecera automaticamente o menu abaixo

Figura 5

Folder: em que pasta sero gravados os dados, ex iniciais do operador.

custom prefixmudar para simple ID
File name prefix: nome do experimento
File name suffix: se mantido enumerar de forma
crescente

Figura 6
Ainda no parametr description se repete no item Sample ID: o nome do tubo ex.
Mock;
Se deve colocar dos eixos dos grficos: P1-FSC; P2-SSC; P3-FL1; P4-FL2;
P5-FL3. Pode-se ainda se escolher outros eixos ex anti-CD3 FITC ao invez
de FL1, como nome do eixo P1.
Nota: possvel s se existe um tipo de Ac conjugado a FITC. Fechar, no tem ok

7. Abrir as 4 janelas (maa 1,2,3,4) ou Cytometer abrir as seguintes

janelas:
i.
ii.
iii.
iv.
v.

Detectors/Amp (ma + 1) (mudar para log FL1,2 e3)

Threshold (ma + 2).
Compensation (ma + 3).
Status (ma + 4)
Instrument Settings Open Procurar uma Compensao
(Feita com as Beads ou CD3-CD4-CD8) Set Done.

Figura 7

Detectors/ Amp:
FSC e SSC devem ser mantidos em Linear e as fluorescncias em Log;
Pode-se ligar o seh]gundo laser four color (635 nm-vermelho)

Compensation usado se houver 2 ou mais marcaes

Threshold: usado para tirar debris

8. Na pagina principal abrir Plot

Figura 8

Em Plot Source: selecionar Axquisition e em seguida parecero X e Y

parameters que foram previamente selecionados parameters saved;

Escolher os eixos desejados: ex para 3 fluorescencias FSC x SSC; FL1 x FL2,

FL1 x FL3 e FL2 x FL3.

Pode-se escolher No Gate ou apenas os eventos que interessam,

selecionando uma regio de interesse.
Nota: Mesmo que selecione um gate todos os eventos estaro sendo salvos
como determinado em Aquisio & Store

Para abrir Histogramas selcioanr plots e depois Histogram

Neste ponto poder ser adquiridas as amostras controles para ajustar os

parmetros. Sempre com o item Setup selecionado Figura 2

II. Ajuste de Parmetros ( Settings)

Deve ser seguido o roteiro abaixo

Passos da otimizao
A.
B.
C.
D.

Amostras para otimizao

Ajustar as voltagens de FSC e SSC.

Ajustar threshold.
Seleo de populao de interesse gate.
Ajustar as voltagens dos PMT.

Controle No Marcado

Controle com FITC

Controle com PE
Controle com PerCP

E. Compensao.

A. Ajuste de morfologia
- Passar a amostra Mock e no plot de Foward / Side- Sacatter;
- Mexer no Detector / Amp para distribuir a populao e distinguir as diferentes
populaes, vide exemplo

Figura 9
- Em A a voltagem SSc esta muito alta e B a de FSC esta alta, permitindo a aquisio de
debris o que diminuir os eventos plauciveis de serem analizados.
- A voltagem de FSC deve ser mantida em E00 e como em B tem muito debris o valor
de FSc deve ser diminudo ou mesmo para SSC, at ficarem satisfatrios como figura
abaixo
1
0
0
8
0

0
6
0
0
4
0
0
2
0
0
0
0
.

Figura 10

Neutr
filos

0 2
0
0

4
0
0

6
0
0

8
0
0

10
00

Moncit
os
Linfcito
s

B. Ajustar o Threshold -Excluso do Debris

Existem duas formas de excluir o debris:
a) Baixar a voltagem do FSC
b) Aumentando o Threshold, at que o debris deixe de ser visualizada
Em qual parmetro
usa-se o treshold?
100
0

80
0
60
0

SSC-H
40
0
20
0
0

20

DEBRIS 0

40
0

60
0

FSC-H

80
0

10
00
Figura 11

C. Seleo de populao de interesse gate.

D. Ajuste de voltagens (FSC e SSC)
Fazer gate na populao de interesse e ajustar as voltagens dos PMT.
Objetivo: evitar falso positivo e falso negativo clulas no marcadas como controle

Sem ajuste

Com ajuste

E.

Compensao- Vazamento
Muitas fluorescncias apresentam superposio-vazamento para outros canais,
pelo que tem que ser realizada a compensao
Sobreposio de Espectros

a) Passar os controles (+) para cada fluorescncia e compensar, ou seja aumentar as

diferencias entre as fluorescencias para tirar o vazamentoi-sobreposio das
fluorescencias.

Compensao do FITC ( +FITC/-PEC)

Com ajuste

Sem ajuste
FITC
530/3
0

PE
585/42

PERCP
670nm

Relative

0.0

Intensity

Aumente o
valor

500n
m

550n
600n
650n
Wavelength
m
m (nm) m

700n
m

 Compensao PEC (- FITC/+ PEC)

Sem ajuste
FITC PE
530/3 585/42
0

PERCP
670nm

Com ajuste

PE-Cy7
780/60

Relative
Intensity

1.2

Aumente o
valor

Compensao (-FITC / - PEC)

Ajustar as populaes para que a populao fique no quadrante duplo
negativo.
Wavelength
(nm)

Salvar
Aquire ---- Adquisio store: - definir R1 e o nmero de eventos
Parmeter description--- Sample ID---nome de cada tubo
passar os controles novamente clicando no settting para que grave
Onde os valores de parmetros ficam armazenados?

II. Aquisio das Amostras

c) Salvar Aquire ---- Adquisio store: - definir R1 e o nmero de eventosParmeter
description--- Sample ID---nome de cada tubo

Apndice
I. Calibrao automtica por beads - FACS comp.
1. Preparar os seguintes tubos
a) 1 ml de FACS Flow + 1 gota de beads no marcados
b) 3 ml de FACS Flow + 1 gota de cada fluorescncia
2. Abrir o FACS Comp
a) defenir o tipode clula: se lavada ou no
b) Cdigos: colocar os cdigos de cada beads
c) Se vai se gravar ou no

II. Para puxar uma calibrao anterior

a) Uma calibrao anterior
Abrir Citometer---- Instrument setting---Open----Puxar a calibrao anterior
b) Calibrao do FACS Comp
Abrir FACS station-----BD files---- Instrument setting----Calibration files------ Open--- set----Done

III. Imprimir relatrio

Abrir FACS station-----BD files ---FACS comp files--- Pasta do dia---- cliques

OBSERVAOES IMPORTANTES

Limpeza do filtro de ar.

Lavar periodicamente com detergente neutro, deixando ele secar e recolocando
na grade do filtro, sempre lembrando com a proteo metlica para baixo.

Limpeza do tanque de isoton

Para a retirada da sonda tomar cuidado para no rodar toda a sonda, rodar
somente a parte branca que envolve a sonda, pois pode levar a quebrar o fio
que leva a informao para o aparelho se o isoton esta cheio ou vazio

Nvel dos tanques

A importncia de verificar o nvel dos tanques: se o isoton estiver abaixo do nvel
mnimo a coluna de ar ser maior que a de lquido, levando a adquirir muito ar
podendo prejudicar as amostras.

Enchendo o tanque de isoton

No momento em que for encher o tanque de isoton tomar cuidado com a limpeza
do funil e do Becker, que poder a levar a cair partculas de sujeira que

acarretara no mal uso do citmetro podendo levar ate o entupimento do

aparelho.

Tanque de waste
O tanque de waste quando estive cheio descartar na pia, e depois colocar 100ml
de hipoclorito concentrado e levar de volta ao citmetro.

Kit bsico
importante ter um kit bsico na sala de citometria, que composto por um
esguicho de gua bi destilada,de hipoclorito a 1% e outro de isoton, com uma
observao importante, o hipoclorito no pode ficar em um frasco transparente
por que s ira durar 1 dia e a gua tem que ser trocada diariamente por que
pode criar alga.

Entupimento do citmetro
Caso ocorra o entupimento do citmetro, temos 3 procedimentos que
poderamos fazer para resolver.
O 1 dando o prime no prprio aparelho com a gua no SIP, este
procedimento ira provocar uma presso para o lado de fora do SIP tentando
limpar o sugador.
2 passo usando uma seringa com um cano de plstico que ira ligar ao SIP
que atravs da presso exercida que ser maior que a do prime para o
desentupimento do SIP.
3 passo utilizando um fio muito fino que colocaremos dentro do SIP e
empurrando de um lado e puxando do outro para desobstruir o SIP.