ROTEIRO DE AULA PRTICA

METABOLISMO DE CARBOIDRATOS
A demonstrao de Buckner, em 1897, de que extratos de clulas rompidas podem catalisar as
mesmas transformaes qumicas que ocorrem na clula ntegra, abriu amplas perspectivas, permitindo
estudar as reaes, e com isso identificar as diversas vias metablicas.
Com o avano tecnolgico na purificao e identificao das diversas enzimas pode-se, passo a
passo, estabelecer a sequncia e identificao das diversas enzimas metablicas. Em geral, clulas podem
utilizar diversos substratos para fazer a fermentao (degradao oxidativa dos metablitos energticos em
presena de oxignio, liberando energia).
A prtica de hoje permite analisar visualmente, a atividade metablica celular em presena de
oxignio, utilizando-se alguns substratos e inibidores enzimticos, tendo-se como indicador desta atividade
o Azul de Metileno. Esta substncia orgnica apresenta-se azul na forma oxidada e incolor na forma
reduzida, sendo a oxidao-reduo facilmente reversvel.
MATERIAL E MTODO
Utilizaremos o sistema multienzimtico encontrado na levedura Saccharomyces cerevisae
(fermento de panificao) na sua forma intacta, isto , sem rompimento das paredes celulares.
Preparao: Aproximadamente 20g de fermento so suspensos em 100 ml de soluo tampo fosfato 50
mM e pH 7,4. Com o repouso prolongado as clulas sedimentam, sendo necessrio para o
uso que elas sejam suspensas por agitao do frasco.
Suspenso celular, substratos, inibidores e indicadores sero distribudos em tubos de ensaio,
conforme tabela abaixo:
REAGENTES

TUBOS
I
II
III
IV
Suspenso celular
6
0,5
0,5
0,5
Iodoacetato 50 mM
1
Malonato 0,3 M
Etanol absoluto
Agitar os tubos e deixar em repouso por 5 minutos
gua destilada
2
6
5
6
Azul de Metileno 0,05mM
6
3
3
3
Glicose 250 mM
6
0,5
0,5
Succinato 250 mM
0,5
Os nmeros se referem ao volume dos reagentes em ml.

V
0,5
1
-

VI
0,5
3

5
3
0,5

3
3
0,5
-

PROCEDIMENTO:
Inicialmente agita-se a suspenso de clulas de levedura, contidas no frasco, e adiciona-se aos tubos
os volumes indicados. Em seguida distribuem-se os inibidores (iodoacetato, malonato e etanol) agitando
bem os tubos e deixando em repouso por aproximadamente 5 minutos. Adicionar os substratos (glicose,
succinato, gua e azul de metileno) agitando novamente os tubos.
Retirar suspenso do primeiro tubo, encher um tubo menor e invert-lo novamente dentro do
primeiro tubo. Deixar todos os tubos em repouso e observar periodicamente a produo de gs dentro do
pequeno tubo invertido e o descoramento ou no dos demais tubos (onde houver descoramento observar a
colorao azulada na superfcie dos lquidos).
Agitar os tubos onde houver descolorao e registrar os resultados.