Microbiologia

MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O
CONTROLE DE INFECO RELACIONADA

ASSISTNCIA SADE
Mdulo 6: Deteco e Identificao de Bactrias de
Importncia Mdica
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria | Anvisa
AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA ANVISA
MICROBIOLOGIA CLNICA PARA

O CONTROLE DE INFECO
RELACIONADA ASSISTNCIA SADE
Mdulo 6: Deteco e Identificao e
Bactrias de Importncia Mdica
Copyright 2013 Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.

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1 edio 2010
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Ficha Catalogrfica
Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade. Mdulo 6 : Deteco
e identificao de bactrias de importncia mdica /Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Braslia: Anvisa, 2013.
150p..: il.9 volumes
ISBN
1. Infeco Relacionada Assistncia Sade Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiologia Clnica. 4. Vigilncia Sanitria em Servios de Sade. 5. Resistncia microbiana. I. Ttulo.
Sumrio
Captulo 1: Estafilococos, Estreptococos, Enterococos e outros. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2 Identificao de estafilococos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.3 Identificao dos Staphylococcus aureus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Captulo 2: Neisserias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2 Isolamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.3 Transporte e semeadura do material. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.4 Bacterioscopia e identificao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Captulo 3: Enterobactrias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.1 Introduo: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.2 Tipos de testes utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3 Etapas da identificao de enterobactrias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.4 Identificao das enterobactrias de importncia clnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.5 Identificao sorolgica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Captulo 4: Bastonetes Gram-Negativos No Fermentadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.2 Semeadura, leitura e interpretao das provas de identificao utilizadas na
triagem inicial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4.3 Testes necessrios para a identificao bioqumica dos BNFs aps a triagem
inicial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
4.4 Procedimentos para a identificao bioqumica dos BNFs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Captulo 5: Bacilos Curvos ou Espiralados e outros Relacionados de Importncia
Clnica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
5.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
5.2 Campylobacter. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
5.3 Vibrios, aeromonas e plesiomonas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
Captulo 6: Bacilos Gram Positivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
6.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
6.2 Orientao geral para a identificao de BGPs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
6.3 Corineformes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
6.4 Bacilos gram-positivos regulares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
6.6 Bacilos gram-positivos anaerbios que devem ser diferenciados. . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
6.7 Bacilos esporulados aerbios e anaerbios facultativos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Captulo 7: Fastidiosos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

7.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
7.2 Bartonella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
7.3 Bordetella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
7.4 Brucella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
7.5 Francisella tularensis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
7.6 Haemophilus sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
7.7 Legionella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
7.8 Pasteurella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
7.9 Actinobacillus sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
7.10 Capnocytophaga sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
7.11 Eikenella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
7.12 Kingella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
7.13 Cardiobacterium hominis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
7.14 Chromobacterium violaceum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
7.15 Streptobacillus moniliformis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
Captulo 8: Bactrias Anaerbias Estritas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
8.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
8.2 Coleta de material. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
8.4 Processamento do material. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
8.5 Identificao bacteriana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
8.6 Provas de sensibilidade a antimicrobianos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica
Apresentao
A resistncia microbiana um grave problema mundial, estando associada ao aumento do
tempo de internao, dos custos do tratamento e das taxas de morbidade e mortalidade dos
pacientes. O uso indiscriminado e incorreto dos antimicrobianos na comunidade e no ambiente hospitalar reconhecidamente um importante fator de risco para o aparecimento e a
disseminao da resistncia microbiana.
Nesse contexto, insere-se o Laboratrio de Microbiologia, que tem como objetivo no apenas apontar o responsvel por um determinado estado infeccioso, mas tambm indicar,
atravs do monitoramento de populaes microbianas, qual o perfil dos micro-organismos
que esto interagindo com o organismo humano, possibilitando a indicao de tratamentos mais adequados. Para o desempenho satisfatrio dessa funo, fundamental que os
laboratrios de microbiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informaes sobre
a melhor amostra biolgica, reconhecer a microbiota e os contaminantes, identificar micro-organismos associados infeco ou com propsitos epidemiolgicos, obter resultados
rpidos em casos de emergncia, realizar o transporte rpido das amostras e manter uma
educao contnua em relao aos aspectos da infeco relacionada assistncia sade.
Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia um campo muito dinmico, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa, em cooperao com a Organizao Pan-Americana da Sade OPAS, prope a terceira reviso do Manual de Procedimentos
Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia
Sade, buscando atualizar informaes nos temas considerados essenciais e contando com
um seleto e conceituado corpo editorial. O manual composto por nove mdulos, a saber:
Mdulo 1 Biossegurana e manuteno de equipamentos em laboratrio de microbiologia clnica; Mdulo 2 Controle externo da qualidade; Mdulo 3 Principais Sndromes Infecciosas; Mdulo 4 Procedimentos laboratoriais: da requisio do exame anlise microbiolgica e laudo final; Mdulo 5 Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios
de cultura empregados nos exames microbiolgicos; Mdulo 6 Deteco e identificao
de bactrias de importncia mdica; Mdulo 7 Deteco e identificao de micobactrias
de importncia mdica; Mdulo 8 Deteco e identificao de fungos de importncia mdica e Mdulo 9 Infeces virais.
A Anvisa e a OPAS esperam com essa publicao contribuir para que os laboratrios de microbiologia possam assimilar e alcanar novos nveis de complexidade laboratorial, atendendo s
exigncias e caractersticas prprias de cada unidade hospitalar, alm de subsidiar a adoo
de procedimentos bsicos padronizados nesses servios.
Captulo 1:
Estafilococos, Estreptococos, Enterococos e outros
ngela Von Nowakonski
Elsa Masae Mamizuka
1.1 Introduo
1.1.1
Staphylococcus aureus
Os Estafilococos so cocos Gram-positivos no esporulados que mais resistem
no meio ambiente. Podem sobreviver por meses em amostras clnicas secas,
so relativamente resistentes ao calor e podem tolerar uma concentrao aumentada de sal. No entanto, apesar dos antimicrobianos existentes, da melhora das condies sanitrias e das medidas de controle de infeco relacionada assistncia sade, esse micro-organismo continua a ser um dos mais
importantes patgenos para o homem. Indivduos sadios so colonizados
intermitentemente por Staphylococcus aureus desde a amamentao, e podem albergar o micro-organismo na nasofaringe, ocasionalmente na pele e
raramente na vagina. A partir desses stios, o S. aureus pode contaminar a pele
e membranas mucosas do paciente, objetos inanimados ou outros pacientes
por contato direto ou por aerossol, ocasionando infeces letais por conta dos
fatores de virulncia ou atravs de resistncia aos antimicrobianos atualmente
utilizados. J foram descritos no Brasil casos de infeces causadas por Staphylococcus aureus com sensibilidade reduzida aos antibiticos mais potentes
como a Vancomicina, e relatos da capacidade que os Staphylococcus coagulase negativa tm de desenvolver resistncia. Recentemente tem sido relatada
a emergncia de Staphylococcus aureus associado a infeces na comunidade
com resistncia a oxacilina, (ORSA-AC), porm sensvel maioria das classes de
antibiticos, exceto a beta-lactmicos, representados por penicilinas e cefalosporinas, contrapondo ao ORSA hospitalar que multirresistente. Tal emergncia vem preocupando, pois essas linhagens so conhecidas por apresentarem
fatores de virulncia como a citotoxina, denominada leucocidina de Panton
Valentine, associados principalmente a leses de pele e mucosas e s pneumo-
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa
nias necrotizantes graves. Esse tipo de pneumonia caracteriza-se por quadros

clnicos graves com infiltrado alveolar multilobar, diferente de pneumonias
hospitalares que evoluem para empiema. A mortalidade muito mais elevada
nos casos de pneumonia necrotizante e o achado de acometimento bilateral
do parnquima, associado hemorragia necrotizante comum nesses casos.
Alguns autores tm notado uma substituio das linhagens hospitalares tradicionais por essa linhagem ORSA-AC. A emergncia de ORSA-AC foi observada
em vrios pases por mtodos moleculares que possibilitou a identificao do
ORSA-AC, por meio da caracterizao do gene mecA, como cassete cromossmico tipo IV ou SCCmec tipo IV, devido ao seu baixo peso molecular com
taxa de replicao mais rpida, conferindo vantagens de disseminao dessas
linhagens. Recente estudo realizado em nosso meio mostrou que os fatores
de risco relacionados com a aquisio de ORSA-AC foram crianas menores
de um ano, menor nmero de doenas de base e menor frequncia de uso de
antibiticos e realizao de procedimentos cirrgicos (Marques 2007).
1.1.2
Estafilococos coagulase negativos

Os estafilococos coagulase-negativa (ECN) so habitantes normais da pele
e membranas mucosas de humanos e geralmente possuem um relacionamento benigno ou simbitico com seu hospedeiro. No entanto, adquirem
potencial patognico se tiverem acesso ao tecido do hospedeiro atravs de
trauma da barreira cutnea, inoculao por agulhas ou implante de materiais mdicos (prteses, cateteres, vlvulas cardacas, marcapassos, etc.) (HEIKENS, 2005). Um dos maiores problemas enfrentados pelo laboratrio de microbiologia clnica e pelos mdicos envolvendo os ECN est na dificuldade
em distinguir isolados significantes (patognicos) de isolados contaminantes, j que o principal contaminante dos frascos de hemocultura tambm
o principal patgeno em infeces envolvendo cateter e outros materiais
mdicos implantados (EIFF, 1998).
Vrios critrios tm sido utilizados na tentativa de diferenciar bacteremia clnicamente significativa causada por ECN e contaminao de hemoculturas.
Esses critrios incluem, entre outros, combinaes de achados clnicos, fonte
da amostra de sangue (amostras de sangue perifrico x amostras obtidas
de cateter), e, principalmente, o nmero de culturas positivas. No entanto,
investigaes recentes utilizando tcnicas de tipagem molecular revelaram
que 33% de aparentes infeces da corrente circulatria causadas por ECN
diagnosticadas tendo como base o nmero de hemoculturas positivas revelaram isolados no relacionados (OUD, 1999). Outra alternativa utilizada
para avaliar a importncia clnica dos ECN a identificao das espcies
desses isolados, a qual deve ser rpida e confivel a fim de predizer o mais
precocemente possvel o potencial patognico e a sensibilidade aos antimi-
crobianos de cada isolado e esclarecer o significado clnico de cada espcie

(COUTO, 2001). No entanto, essa identificao continua problemtica para os
laboratrios de microbiologia clnica pela necessidade de uma grande variedade de provas bioqumicas, as quais muitas vezes fornecem resultados no
confiveis para os ECN (CARRETO, 2005).
1.1.3
Estreptococos e Enterococos
Os estreptococos foram os maiores causadores de infeco relacionada assistncia sade na era pr-antibitica, causando surtos de infeco e morte
de purperas. Apesar de no serem atualmente uma importante causa de
infeco relacionada assistncia sade, provocam, no entanto, doenas
muito graves e muitas vezes letais, mesmo em pacientes imunocompetentes, sendo importante o rpido diagnstico desse agente. J os enterococos
apresentam importncia crescente como causadores de infeco relacionada assistncia sade, pelo aparecimento de resistncia quase total aos
antibiticos tradicionalmente utilizados para tratamento dessas infeces.
Os Enterococos mais comumente isolados so: Enterococcus faecalis (90%
dos casos) e Enterococcus faecium, com grande capacidade de colonizao
de pacientes e de contaminarem superfcies ou equipamentos utilizados em
hospitais. Possuem sensibilidade ou resistncia varivel aos antibiticos chamados glicopeptdios como a vancomicina e teicoplanina. O emprego de
muitos antibiticos ou classes de antibiticos tem sido associado infeco
ou colonizao por enterococos resistentes a vancomicina ERV em estudos clnicos, incluindo cefalosporinas de espectro ampliado e agentes com
potente atividade contra bactrias anaerbias. Enterococcus resistentes
vancomicina (ERV) so um problema global e tm sido isolados com alta frequncia nos hospitais brasileiros. A maioria dos ERV so E. faecium fentipo
VanA (EVRFM), porm existe um clone especfico de E. faecalis fentipo VanA
(EVRFS) que tem se disseminado rapidamente em vrios hospitais do pas.
Fatores de virulncia de E. faecalis e E. faecium que influenciam na relao
parasita/hospedeiro tm sido descritos.
Existem, atualmente, cepas comensais naturalmente resistentes a vancomicina e que podem ser isoladas de pacientes internados, porm excepcionalmente capazes de causar surtos, mas que devem ser corretamente identificadas.
1.1.4
Identificao preliminar
A identificao dos estreptococos e estafilococos baseada na morfologia
que apresentam em meios lquidos, sendo o estreptococo uma cadeia normalmente longa e os estafilococos mostrando-se em forma de cocos aos pares, em cachos de uva ou agrupados.
9
A identificao presuntiva comea com a inoculao primria na placa de

gar sangue de carneiro que deve ser incubada em 5% de tenso de CO2 (mtodo da vela ou estufa de CO2). As colnias de estafilococos so geralmente
maiores, convexas, de colorao variando do branco-porcelana a amarelo
podendo apresentar hemlise ou no. Note-se que o desenvolvimento da
cor amarelada no S.aureus ocorre somente aps incubao prolongada (72
horas), temperatura ambiente. As colnias de estreptococos tendem a ser
menores (puntiformes), e com halos de hemlise total ou parcial (beta e alfa
hemlise). A diferenciao entre os estreptococos e os estafilococos se d,
seguramente, pela prova da catalase.
A) Prova da catalase
Com a ala bacteriolgica ou com um palito coleta-se o centro de uma
colnia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Colocar sobre esse
esfregao uma gota de gua oxigenada a 3% e observar a formao de
bolhas. Para a famlia Staphylococcaceae (estafilococos) a prova geralmente positiva, enquanto que para a famlia Streptococcaceae (estreptococos) negativa.
10
Esquema simplificado para identificao das espcies do gnero Staphylococcus

spp. (Adaptado de Terasawa 2006)
+ S.aureus
+Trealose
maltose
- S.schleiferi subsp. coagulans
Coagulase
xylose e/ou
- arabinose
+ S.caprae
sacarose
+,
S. xylosus
+
trealose
maltose
+
manitol
+
ornitina
uria
S.lugdunensis
+ S.cohnii subsp.
urealyticum
+ S.capitis
- uria
+manitol
hemlise
- S.shleiferi subsp.
urealyticum
nitrato
S. simulans
+
maltose
S. simulans
+ uria
- S.cohnii subsp.
cohnii
+
uria
Crescimento
anaerbio em
thioglicolato
+ S.epidermidis
Crescimento
- anaerbio em
thioglicolato
+
resistncia
novobiocina
S.warneri
S. haemolyticus
+
S.saprophyticus
- resistncia
novobiocina
S.hominis subs.
hominis
+
S.hominis subs.
novobiosepticus
+ S.saprophyticus
S.hominis
subsp. hominis
resistncia
novobiocina
- S.warneri
+
S.warneri
S.haemolyticus
11
1.1.5
Diviso dos cocos Gram-positivos pela prova da catalase

Catalase positivos
Catalase negativos
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
Micrococcus spp.
Streptococcus spp.
Planococcus spp.
Aerococcus spp.
Stomatococcus spp.
Gemella spp., Leuconostoc spp.
Lactococcus spp.
Stomatococcus spp.
Ao coletar a colnia, no carregar meio de cultura (gar sangue), que pode

acarretar resultados falso-positivos porque o sangue do meio contm catalase. Algumas cepas de enterococos podem dar falsa reao positiva (fazer
Gram e ver disposio em cadeias curtas ou aos pares).
Identificao simplificada dos cocos Gram-positivos de importncia clnica
Gnero
Catalase
Motilidade
NaCl 5%
Oxidase
Aerbio estrito
Ttrade
Staphylococcus
neg
neg
no
varivel
Planococcus
neg
varivel
Micrococcus
neg
varivel
varivel
Enterococcus
neg
varivel
neg
no
no
Streptococcus
neg
neg
varivel
neg
no
no
Aerococcus
neg
neg
neg
no
Stomatococcus
varivel
neg
neg
neg
no
varivel
Kocuria
neg
varivel
* aderente ao meio
Cocos Gram-positivos, Catalase negativa, Motilidade Negativa 1
Gnero
NaCl 5%
PYR
Bile Esculina
Ttrade
Enterococcus
varivel
no
Streptococcus
neg
sensvel
neg2
neg3
no
Aerococcus
sensvel
varivel
varivel
varivel
Leuconostoc
varivel
resistente
neg
varivel
no
Pediococcus
varivel
resistente
neg
varivel
neg
sensvel
neg
no
neg
sensvel
varivel
Gemella
Rothia mucilaginosa
1 E. casseliflavus e E. gallinarum so positivos

2 S. pyogenes positivo
3 alguns S. viridans podem ser positivos
4 catalase fracamente positiva
12
Vancomicina
1.2 Identificao de estafilococos

Os Staphylococcus pertencem famlia Staphylococcaceae. O gnero Staphylococcus
apresenta 32 espcies, 14 subespcies, sendo que somente 15 espcies so encontradas em amostras humanas, e, de uma maneira prtica, os estafilococos so divididos
em duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos de acordo com a resposta ao teste da plasmo coagulase.
O teste mais importante na identificao da famlia Staphylococcaceae a prova da
catalase, mas tambem compartilhada por gneros de cocos Gram-positivos relacionados: Micrococcus, Planococcus, Alloiococcus (catalase varivel), Rothia mucilaginosa
(catalase variavel) e Kocuria cristinae, pouco isolados e de pouca importncia clnica,
mas que podem ser diferenciados dos Staphylococcus pelo teste da bacitracina com
disco de 0,04 UI: Micrococcus=sensvel e Staphylococcus=resistente.
1.2.1
Provas diferenciais dos Gneros Catalase positivos ou variveis
Gnero
Motilidade
NaCl 6,5%
Oxidase
Catalase
Staphylococcus
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Macrococcus
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Planococcus
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Alloiococcus
Negativo
Positivo
Negativo
Varivel
Rothia mucilaginosa
Negativo
Negativo
Negativo
Varivel
Micrococcus
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Kocuria kristinae
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
* OBs. Apenas S. aureus subsp. anaerobius e S. saccharolyticus so catalase negativos, os demais so positivos
Identificao das espcies de Staphylococcus de maior importncia clnica
Espcie
DNAse
PYR
Novobiocina
Ureia
Polimixina
Outras
S. aureus
neg
sensvel
varivel
resistente
pig.amarelo
S. epidermidis
neg
neg
sensvel
resistente
S. lugdunensis
neg
sensvel
varivel
varivel
Ornitina +
S. haemolyticus
neg
sensvel
neg
sensvel
Ornitina neg
S. saprophyticus
neg
neg
resistente
sensvel
isolado em
urina
S. schleiferi
neg
sensvel
neg
sensvel
Sacarose neg
S. intermedius
sensvel
sensvel
S. hyicus
neg
sensvel
varivel
resistente
S. hominis
neg
neg
sensvel
varivel
S. capitis
neg
neg
sensvel
neg
neg
S. cohnii
neg
neg
sensvel
neg
neg
Obs. Veja esquema completo em Iorio et al 2007
13
Existem cerca de 31 espcies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, das quais as mais frequentes so:
Staphylococcus epidermidis causador de infeces de cateteres e prteses e o mais frequente micro-organismo encontrado em hemoculturas.
Staphylococcus saprophyticus causador de infeco urinria em mulheres jovens.
Staphylococcus haemolyticus importante devido resistncia aumentada aos antimicrobianos, e por ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemlise na placa de gar sangue de carneiro.
1.2.2
Teste da resistncia a novobiocina

A cepa semeada de maneira semelhante ao antibiograma em placa de
Muller Hinton acrescida de um disco teste de novobiocina contendo 5 g. As
amostras resistentes mostram zonas de inibio de 6 a 12 mm, enquanto as
susceptveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus saprophyticus so resistentes.
1.2.3
Testes da Trealose, Urease e Novobiocina
Espcies
Trealose
Urease
Novobiocina
S. epidermidis
Negativo
Positivo
Sensvel
S. haemolyticus
Positivo
Negativo
Sensvel
S. saprophyticus
Positivo
Positivo
Resistente
1.3 Identificao dos Staphylococcus aureus

A forma mais simples de identificar o Staphylococcus aureus a prova da coagulase
que pode ser efetuada em tubo ou em lamina.
1.3.1
Teste da coagulase em lmina

A maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada (ou fator aglutinante) clumping factor na superfcie da parede celular, que reage
com o fibrinognio do plasma causando a coagulao do mesmo.
14
Colocar 2 gotas de salina em uma lmina.

Emulsionar uma colnia isolada a ser testada.
Colocar uma gota de plasma e misturar com um palito de plstico ou de
madeira.
Observar se h aglutinao em 10 segundos.
No se pode executar esse teste a partir de um gar com grande concentrao de sal como gar manitol.
1.3.2
Teste da coagulase em tubo

Esse teste baseia-se na presena da coagulase livre que reage com um fator
plasmtico formando um complexo que atua sobre o fibrinognio formando
a fibrina. O teste melhor efetuado se:
Adicionar 0,1 mL de caldo BHI, incubado por uma noite, com colnia suspeita a um tubo de ensaio com 0,5 mL de plasma.
Incubar por 4 horas 35C em estufa ou banho maria.
A formao do cogulo observada pela inclinao suave do tubo de ensaio
a 90 graus da vertical.
Um mtodo alternativo a emulsificao dessa mesma colnia suspeita em
um 0,5 plasma e incubado da mesma forma. Qualquer cogulo indica uma
prova positiva, porm no confundir com precipitados ou floculao. O melhor plasma a ser usado o de coelho com EDTA, no devendo ser usado o
plasma humano vindo do banco de sangue.
1.3.3
Teste da DNAse
Esse teste consiste na inoculao de colnias em meio contendo DNA, (DNAse test gar) obtido comercialmente.
Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentrao de 0,1%.

o meio adquire uma colorao azul intensa.
Incubar a 35C por 24 horas.
Uma colorao rsea caracterstica ao redor das colnias produtoras de
DNAse indica a positividade da prova.
O meio adicionado com corante demonstra uma melhor facilidade na leitura, e permite o repique da amostra positiva para o teste de sensibilidade aos
antimicrobianos, evitando que se retorne placa original onde nem sempre
as colnias esto bem isoladas.
1.3.4
Teste da endonuclease
Teste da endonuclease termoestvel efetuado no mesmo meio de DNA.
Ferver o caldo de cultura com a bactria suspeita por 15 minutos.
Fazer pequenos orifcios no meio (em placa) utilizando canudos de refrigerante.
Colocar ao meio de DNA gotas de caldo de cultura turvo com a colnia
suspeita.
A leitura do teste semelhante ao da DNAse.
15
Note que esse mtodo pode ser efetuado a partir de caldo de hemocultura
em que foi observado o crescimento de cocos Gram-positivos agrupados.
1.3.5
Outras provas que diferenciam o Staphylococcus aureus

Aglutinao em ltex ou em hemcias de carneiro (sorologia). Esses testes
geralmente detectam a coagulase livre e alguns apresentam tambm uma
imunoglobulina antiprotena A presente da parede do Staphylococcus aureus. Como so disponveis comercialmente, deve-se seguir as instrues do
fabricante.
1.3.6
Teste do crescimento em gar manitol

O Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio
contendo 7,5 % de cloreto de sdio, denominado gar manitol salgado ou
Meio de Chapman. O indicador de pH o vermelho de fenol, que indica uma
reao positiva quando o meio ao redor das colnias se torna amarelo, e negativa quando permanece avermelhado.
1.3.7
Identificao de outros gneros

A diferenciao entre Micrococcus sp. e os Staphylococcus sp. se d pela colorao de Gram, em que os Micrococcus aparecem em ttrades, ou pela
pigmentao de suas colnias (amarelas, rseas ou alaranjadas). Alguns no
apresentam pigmentos e podem ser diferenciados pela sensibilidade a Bacitracina 0,004 UI, a mesma utilizada na identificao de Streptococcus pyogenes, mas utilizando-se a inoculao em gar Mueller Hinton.
1.3.8
Identificao dos estreptococos

Os estreptococos podem ser diferenciados de acordo com sua aparncia na
placa de gar sangue aps incubao a 35C em presena de 5% de CO2,
podendo apresentar: hemlise total (beta), parcial (alfa, de cor esverdeada)
ou nenhuma (gama).
A identificao de espcie de estreptococos beta hemolticos feita atravs
de aglutinao com soros especficos contra os antgenos de Lancefield (A,
B, C, D, F e G), que constitui uma prova rpida, porm no acessvel a todos
os laboratrios em virtude do elevado custo.
1.3.9
16
Teste da bacitracina
importante notar que as identificaes devem ser feitas em gar sangue
sem tenso de CO2 ou os resultados podem ser conflitantes.
Semear meia placa de gar sangue com o estreptococo a ser identificado,
como para um antibiograma.
Colocar o disco de bacitracina 0,004 UI como indicado.
Incubar por uma noite a 35C sem CO2.

Observar qualquer zona de inibio como resultado de sensibilidade.
O Streptococcus pyogenes (grupo A) assim rapidamente identificado.
1.3.10 Teste do Sulfametoxazol Trimetoprim (SXT)

Adicionar na mesma placa de gar sangue o disco de SXT.
Incubar por uma noite a 35C sem CO2.
A sensibilidade a essa droga significa, em conjunto com as outras leituras,
que o estreptococo no pertence ao grupo A, B ou D de Lancefield.
Colocar um disco de Bacitracina 0,004 UI direita e um de Sulfametoxazol-trimetoprim esquerda.
Havendo necessidade, pode ser feito o teste de CAMP na mesma placa, conforme desenho abaixo.
A) Teste de CAMP (NA MESMA PLACA)
Inocular uma estria nica de uma amostra de Staphylococcus aureus
produtor de beta lisina (ATCC 25923) no centro de uma placa de gar
sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro. (Essa linhagem de S. aureus deve ser mantida continuadamente em estoque).
Inocular as amostras a serem testadas em estrias formando um ngulo
reto com a linha de inoculao da amostra teste de estafilococo. As
estrias no devem se tocar, ficando a 1 mm de distncia, e desse modo
vrias amostras podem ser testadas em uma mesma placa de gar sangue. A maneira de inocular fundamental para a observao do efeito
esperado.
Incubar a placa a 35-37C durante um perodo de 18-24 horas.
A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), evidenciada pelo alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta
de flecha caracterstica, na rea de interseco entre as duas estrias.
Se o teste de CAMP no resultar em uma flecha, mas numa figura semelhante a uma cabea de fsforo, refazer o teste de catalase e em caso positivo verificar as provas para identificao de Listeria sp.
B) Teste do PYR
Esse teste determina a atividade do PYR tambm chamado pyrrolidonyl-aminopeptidase, uma enzima produzida pelo Streptococcus
pyogenes e tambm pelo Enterococcus sp. Utilizar somente colnias
puras para o teste, pois podem surgir resultados errneos. Seguir as
instrues do fabricante, uma vez que se encontra disponvel comercialmente.
Esse teste tecnicamente equivalente prova da hidrlise da bile esculina e crescimento em 6,5% de NaCl, usados na identificao clssica
17
dos enterococos, e mais especfico que o teste da Bacitracina na caracterizao presuntiva dos estreptococos beta hemolticos do grupo A,
tendo a vantagem de ser mais rpido.
Em qualquer dos dois casos, o PYR constitui uma alternativa importante para esclarecer testes duvidosos. Na impossibilidade da realizao
de testes sorolgicos de confirmao, reforar o valor dos testes presuntivos clssicos de identificao do Streptococcus pyogenes.
C) Teste da bile esculina e do NACL 6,5%

Semear as provas de Bile Esculina e do caldo de NaCl a 6,5%.
Incubar da mesma forma.
Teste da bile esculina positiva apresenta cor marrom escuro e o do caldo de NaCl a 6,5 % deve mostrar turvao para ser considerado positivo.
1- Disco de bacitracina
2- Disco de sulfametoxazol trimetoprim
3- Camp Test
Linhas verticais
cepas teste
Linha horizontal
estria com cepa beta hemol
Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile

esculina positiva, seja Enterococcus sp. ou Streptococcus do grupo D
no enterococo (Streptococcus bovis). Quanto ao teste da tolerncia ao
NaCl a 6,5%, somente os enterococos so positivos.
1.3.11 Teste da hidrlise do hipurato

Os Streptococcus agalactiae (grupo B) so tambm capazes de hidrolisar o
hipurato em seus componentes: glicina e cido benzico.
Identificao de estreptococos beta hemolticos dos grupos A, B e D
Espcies
18
Sensibilidade
Bacitracina
CAMP teste.
Hidrlise do Hipurato
SXT
Bile esculina.
Tolerncia
NaCl 6,5%
S. pyogenes
sensvel
negativo
negativo (R)
negativo
S. agalactiae
resistente
positivos
negativo (R)
negativo
Enterococcus sp.
resistente
negativo
negativo (R)
positivos
Estreptococo No
A, B ou D.
resistente
negativo
positivos (S)
negativo
1.3.12 Identificao dos estreptococos no beta hemolticos

Somente os estreptococos do grupo B (Streptococcus agalactiae) e os do
grupo D Enterococcus spp. e Streptococcus bovis podem no apresentar nenhuma hemlise, a denominada gama hemlise.
1.3.13 Identificao de estreptococos gama hemolticos ou sem hemlise
A) Identificao CAMP/Hidrlise de hipurato Bile Esculina Tolerncia a
NaCl 6,5%
Streptococcus agalactiae positivo negativo negativo
Enterococo negativo positivo positivo
S. bovis negativo positivo negativo
1.3.14 Identificao dos estreptococos alfa hemolticos
A identificao desse grupo no deve ser feita por mtodos sorolgicos,
pois a maioria no possui os antgenos de Lancefield.
Identificao dos estreptococos alfa hemolticos
Identificao
Optoquina e Bile solubilidade
Bile esculina
Tolerncia 6,5% a NaCl
Pneumococo
positivo
negativo
negativo
Enterococos
negativo
negativo
positivo
Grupo viridans
negativo
negativo
negativo
Streptococcus
negativo
positivo
negativo
1.3.15 Teste da optoquina

Semear um quarto de uma placa de gar sangue com a cepa alfa hemoltica a ser testada.
Aplicar um disco de optoquina.
Incubar a 35oC em tenso aumentada de CO2 mtodo da vela.
Uma zona de inibio de 14 mm ou mais volta de um disco de 6 mm
significa sensibilidade e identifica o Streptococcus pneumoniae.
1.3.16 Teste da bile solubilidade
O teste da bile solubilidade tambm identifica o Streptococcus pneumoniae.
Pode ser executado em placa ou em caldo.
B) Caldo:
Tomar um caldo turvo aps 3 horas de incubao a 35C.
Inocular uma suspenso de desoxicolato a 10%.
Clareamento da turbidez reflete a lise bacteriana e confere um resultado positivo prova.
19
C) Placa:
Inocular gotas de desoxicolato de sdio a 2% sobre as colnias suspeitas.
Incubar a 35C por 30 minutos.
As colnias positivas iro desaparecer por lise bacteriana.
Suspeitar da presena de variante nutricional de Streptococcus desses
micro-organismos quando o Gram de amostras positivas de hemocultura
obtidas em meios comerciais mostram cocos em cadeias que no crescem no subcultivo em gar sangue, ento deve-se proceder dessa forma:
Semear o repique em gar sangue.
Fazer estrias perpendiculares ao sentido da semeadura com Staphylococcus aureus, como para a identificao presuntiva de Haemophilus
influenzae.
Incubar a 35C em atmosfera com CO2.
Identificao dos enterococos mais importantes clnicamente
Espcie
20
Arabinose
Sorbitol
Crescimento
Telurito 0,04%
Motilidade
Pigmento
Vancomicina
E. faecalis
negativo
positivo
positivo
negativo
negativo
varivel
E. faecium
positivo
varivel
negativo
negativo
negativo
varivel
E. casseliflavus
positivo
varivel
negativo
positivo
positivo
resistente
E. gallinarum
positivo
negativo
negativo
positivo
negativo
resistente
Referncias Bibliogrficas
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portador de SCC mec tipo IV. Dissertao de mestrado-FMUSP. 2007, 66p. Ref.
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21
Captulo 2:
Neisserias
Ana Carolina Ramos Moreno
Carlos Emlio Levy
Marina Baquerizo Martinez
2.1 Introduo
O gnero Neisseria formado por bactrias aerbias, imveis e no esporuladas. As
neisserias so diplococos Gram-negativos, cuja caracterstica peculiar a unio de
seus lados adjacentes. Na rotina do laboratrio clnico, costuma-se comparar essa
morfologia a dois gros de feijo ou rins unidos
. Apenas a espcie N. elongata
difere dessa morfologia, sendo diplobacilos ou diplococo-bacilo. A maioria das espcies de Neisseria pode habitar as mucosas de animais e seres humanos de forma
comensal. O crescimento timo se d em ambientes midos com temperatura entre
35 a 37C (temperatura do corpo humano).
Todas as Neisserias so micro-organismos fastidiosos, oxidase positiva e a maioria so
catalase positiva (com exceo de Neisseria elongata e Kingella denitrificans). Elas utilizam os carboidratos por via oxidativa, com pouca produo de cido. O meio de
cultura mais utilizado para verificar a oxidao dos carboidratos o Cistyne Tripticase
gar (CTA), com o indicador de pH vermelho de fenol. Para evitar reaes duvidosas
na hora da identificao de Neisseria, recomenda-se utilizar uma grande quantidade
de inculo para que, assim, haja uma maior produo de cidos. As diferentes espcies de Neisseria, incluindo N. meningitidis e N. gonorrhoeae, so analisadas junto com
as espcies Moraxella catarrhalis, Moraxella spp. e Kingella spp. por suas caractersticas morfolgicas, cocos ou cocides Gram-negativos, e pela possibilidade de haver
confuso durante a identificao.
Embora as doenas causadas por N. meningitidis e N. gonorrhoeae sejam as mais conhecidas, as outras espcies de Neisseria podem causar doenas em pessoas com a
imunidade comprometida.
23
Neisseria
meningitidis
Neisseria
gonorrhoeae
Neisseria spp.
MOT
AS
DNAse
CTA Gli
OF Gli
OXI
CAT
Diagnstico diferencial entre Neisserias e outros cocobacilos Gramnegativos

Morfol
Bactria
2.1.1
diplococo
no cresce
neg
neg
diplococo
no cresce
neg
neg
neg
diplococo/
bacilo
diplococo
varivel
varivel
(oxidativo)
inerte
varivel
neg
neg
Moraxella
+
+
neg
+
+
neg
catarrhalis
Kingella spp.
cocobacilo +
neg
fermentador
+
neg
+
varivel
Moraxella spp. cocobacilo +
+
inerte
neg
neg
+
neg
OXI = oxidase CAT=catalase AS = crescimento em
OFGli=OF Glicose CTAGli= utilizao da glicose em
gar Sangue
base gar cistina tripticase MOT = motilidade
Caractersticas de algumas espcies de importncia clnica

2.1.2
24
Neisseria gonorrhoeae
O ser humano o hospedeiro natural de Neisseria gonorrhoeae e a doena causada por esse micro-organismo denomina-se gonorria. A gonorria,
considerada uma doena sexualmente transmissvel, transmitida entre
os seres humanos atravs do contato ntimo das mucosas. N. gonorrhoeae
pode infectar a uretra, a vagina e o nus e pode se propagar para as articulaes. As mulheres so as principais portadoras assintomticas; no homem
encontra-se apenas uma taxa de 1 a 5% de portadores. N. gonorrhoeae
sempre considerada patognica, o que indica a necessidade de tratamento. A transmisso para o recm-nascido pode ocorrer durante o parto. No
homem, N. gonorrhoeae causa uretrite e est relacionada a complicaes
como epididimite, prostatite e estenose uretral. O perodo de incubao da
bactria pode ser de um a sete dias. Na mulher, esse micro-organismo causa
corrimento vaginal, endocervicite, uretrite, abscesso vestibular, salpingooforite e doena inflamatria plvica. A mudana do microambiente vaginal
inibe o crescimento de bactrias produtoras de cido, como Lactobacillus,
que fazem parte da microbiota feminina. O pH vaginal torna-se menos cido
e uma variedade de organismos , ento, capaz de proliferar, o que acarreta
infeces secundrias. N. gonorrhoeae pode ser isolada tambm na mucosa
oral e anal. Em recm-nascidos pode causar uma conjuntivite denominada
oftalmia neonatorum. A doena sistmica disseminada pode ocorrer em 1 a
3% dos pacientes infectados, principalmente em assintomticos, e caracterizada por febre, tremores, leses cutneas e artrite de extremidades. As
leses cutneas so do tipo mculo-pustulares ou hemorrgicas, com centro
de necrose. Ocorre artrite sptica, com 50% de positividade de isolamento.
Pode ocorrer meningite e endocardite.
2.1.3
Neisseria meningitidis
N. meningitidis o agente etiolgico da enfermidade meningoccica, mais
comumente chamada de bacteremia e meningite meningoccica. Essas
duas sndromes clnicas podem aparecer simultaneamente, entretanto, a
presena apenas da meningite mais frequente. N. meningitidis tambm
pode causar infeco sistmica grave, com coagulao intravascular disseminada (CIVD) e elevada mortalidade, conjuntivite, artrite sptica, pericardite purulenta, sinusite, otite e pneumonia. Esse micro-organismo pode ser
isolado das mucosas de 5 a 15% de indivduos sos por perodos de semanas
a meses. A transmisso se faz por vias areas (aerossis) ou contato com secrees respiratrias de portadores assintomticos.
A meningite um processo infeccioso que acomete as meninges, sendo que
nessa entidade clnica esto comprometidas a piamater, aracnide e espao
subaracnideo. Esse espao contnuo e o lquor que nele circula envolve a
convexidade cerebral, preenche as cisternas, passa pela emergncia dos nervos cranianos e pela medula espinal. Logo, um agente infeccioso que atinge
esse compartimento, espalha-se rapidamente por todo o Sistema Nervoso
Central (SCN).
N. meningitidis uma bactria encapsulada, sendo esse um importante fator de virulncia. Os meningococos so tradicionalmente classificados pelo
sistema de tipagem sorolgica baseada na diferena da estrutura da cpsula (sorogrupo), protenas de membrana externa e lipooligossacardeo. De
acordo, com a classificao baseada nos antgenos capsulares, existem 12
sorogrupos conhecidos: A, B, C, 29-E, H, I, K, L, W-135, X, Y, Z. So conhecidos
20 sorotipos (antgenos Protena de Membrana Externa (OMP) classe 2/3) e
10 subtipos (antgenos OMP classe 1).
2.1.4
Moraxella (Branhamella catarrhalis)

M. catarrhalis est frequentemente associada a infeces do trato respiratrio e ocorre principalmente em crianas e adultos jovens. Esse micro-organismo pode causar otite mdia, sinusite, bronquite e pneumonia. Mais raramente pode causar endocardite, meningite ou infeces sistmicas. Em idosos, aps o Haemophylus influenzae e pneumococo, M. catarrhalis constitui a
terceira causa de pneumonia em pacientes com doena pulmonar obstrutiva crnica. M. catarrhalis raramente isolada em indivduos assintomticos.
Cerca de 80% das cepas so produtoras de beta-lactamase e so detectadas
atravs do teste do Nitrocefin (cefalosporina cromognica). Os agentes antimicrobianos geralmente utilizados no tratamento de M. catarrhalis so amoxicilina-cido clavulnico, trimetoprim-sulfametoxazol, cefalosporinas orais,
25
macroldeos, tetraciclinas e fluoroquinolonas. Outras espcies de Neisseria

raramente so isoladas em casos de endocardite.
2.2 Isolamento
2.2.1
Para o diagnstico de N. gonorrhoeae, o stio apropriado para a coleta do
material clnico depende da idade, sexo e prticas sexuais do indivduo, alm
dos sintomas clnicos da infeco. O instrumento que ser utilizado para fazer a coleta pode ser lubrificado apenas com gua morna. Outros tipos de
lubrificantes podem ser txicos para a bactria. O material pode ser coletado
com swab ou ala bacteriolgica, o que depende do material. Sempre que
possvel coletar o material em swabs separados, um para cultura e outro para
bacterioscopia.
A) Tipos de materiais clnicos:
Uretral
Endocervical (sexualmente ativas/vaginal em meninas)
Retal (colher secreo mucosa e no fezes, utilizando meio seletivo
tipo Thayer Martin)
Orofaringe
Conjuntiva
Glndula de Bartholin
Trompas
Endomtrio
Lquido sinovial
Leses de pele
Sangue
B) Recomenda-se:
Utilizar swab com algodo atxico ou swab de Rayon ou Dacron.
Semear o material clnico nos meios slidos o mais rpido possvel.
Sempre utilizar as placas previamente aquecidas em estufa.
Urina pode ser utilizada aps centrifugao rpida e semeadura do sedimento.
Utilizar meio seletivo no caso de materiais clnicos no estreis, para
aumentar a probabilidade de isolamento do patgeno.
Usar frascos de hemocultura sem o anticoagulante SPS, que inibidor para as N. gonorrhoeae (Ex: Caldo BHI com 1% de gelatina) ou fazer
repiques cegos em 24 horas de incubao no caso de hemoculturas
automatizadas.
26
2.2.2
Em leses de pele, preferir a bipsia ao swab.

Incubar em cmara mida em atmosfera de CO2 a 5% ou em jarra de
vela.
Sempre realizar bacterioscopia pelo Gram.
A temperatura de incubao crtica, no deve ultrapassar os 37C.
O meningococo isolado mais prontamente quando o material clnico obtido antes do incio da antibioticoterapia e quando rapidamente transportado ao laboratrio, protegido de ambientes secos e temperaturas extremas,
especialmente frias. O stio apropriado para a coleta do material clnico depende do indivduo e dos sintomas clnicos da infeco. Sempre que possvel
coletar material para cultura e bacterioscopia.
A) Materiais clnicos para isolamento, de acordo com aspectos clnicos:
Sangue (usar frascos de hemocultura sem SPS como anticoagulante)
LCR
Aspirado de petquias
Sufuses hemorrgicas ou bipsias
Lquido sinovial
Swab de conjuntiva
Aspirado traqueal ou transtraqueal ou escarro
Leses de pele
Swab de nasofaringe (prefervel ao swab de orofaringe)
2.2.3
Moraxella (branhamella) catarrhalis

A escolha do material clnico em pacientes com otite aguda mdia e sinusite
maxilar o fluido de timpanocentese e o aspirado sinusal, respectivamente.
Sempre que possvel coletar material para cultura e bacterioscopia.
2.2.4
Material clnico adequado para isolamento de acordo com o quadro

clnico:
Otite mdia: Timpanocentese (miringotomia) quando indicado. Secreo colhida com swab em geral revela flora contaminante, exceto se rompimento espontneo muito recente e sem uso prvio de antimicrobianos.
Sinusite: Aspirado de seios da face comprometidos, quando indicado.
Infeces do trato respiratrio inferior/pneumonia: Escarro, aspirado traqueal e transtraqueal podem ser teis ou BAL, quando indicado, e
comparados com bacterioscopia.
27
2.3 Transporte e semeadura do material

O material clnico coletado deve ser representativo do processo infeccioso investigado, evitando contaminao com as reas adjacentes. A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiolgico e favorecer o
crescimento da flora contaminante.
Aps a coleta do material clnico, o ideal seme-lo imediatamente em meio slido
e incub-lo em estufa bacteriolgica a 35-37C em jarra de vela com umidade. O uso
de meios de transporte como Stuart ou Amies deve ser considerado uma alternativa
de risco. Para M. catarrhalis, os meios de transporte habituais so adequados.
IMPORTANTE: Todo resultado liberado pelo laboratrio de microbiologia consequncia da qualidade da amostra recebida.
2.3.1
O gonococo muito sensvel a temperatura e atmosfera de CO2 e, frequentemente, um pequeno nmero de organismos est presente no material clnico. Quando a amostra enviada ao laboratrio, ela precisa ser transportada
de maneira a preservar a viabilidade do micro-organismo.
Recomendaes:
28
N. gonorrhoreae sensvel a variaes de temperatura acima de 37C ou

abaixo de 35C, de modo que a amostra no pode ser refrigerada ou mantida acima dos 37C.
Para cultura do micro-organismo, recomenda-se gar chocolate enriquecido com suplemento de l-cistena, NAD e vitaminas (Isovitalex ou similar).
Incubar em jarra com umidade (bola de algodo e gua estril) e CO2 a 5%
(jarra com vela ou estufa de CO2).
Para secreo retal, swab de orofaringe ou outros materiais com microbiota contaminante abundante ou menor expectativa de isolamento, semear, alm do meio rico, em meio seletivo como Thayer Martin modificado
(TMM) ou meio New York City (NYC).
Meios seletivos como TMM inibem crescimento de enterobactrias, a
maioria das espcies saprfitas de Neisserias (7,5 g/mL de colistina),
Gram-positivos (Vancomicina 3 g/mL) e fungos (13,5 g/mL de nistatina)
e contm suplementos para suportar crescimento das Neisseria meningitidis e N. gonorrhoeae.
2.3.2
N. meningitidis no to fastidiosa quanto a N. gonorrhoeae. O material clnico, aps coletado, deve ser transportado ao laboratrio clnico rapidamente,
protegido de ambientes secos e variaes de temperatura, especialmente
frias.
Recomendaes:
2.3.3
Transportar em ambientes midos, com CO2, evitando variaes de temperatura.

N. meningitidis cresce bem em gar sangue, mas por precauo, deve-se
semear tambm em gar chocolate.
Incubar em jarra com umidade (bola de algodo e agua estril) e CO2 (jarra com vela ou gerador de CO2).
Para materiais com microbiota contaminante ou menor expectativa de isolamento, semear, alm do meio rico, em meio seletivo como Thayer Martin
modificado (TMM) ou meio New York City (NYC).
Moraxella catarrhalis
A) Recomenda-se:
M. catarrhalis tolera a temperatura ambiente, ou seja, no to sensvel a variaes de temperatura como as Neisserias.
Possui um bom crescimento em gar sangue de carneiro 5% e gar
chocolate. Uma boa porcentagem de M. catarrhalis cresce em gar seletivo.
Incubar as placas a 35C em ambiente aerbio ou em atmosfera de 5 a
7% CO2.
Material estril ou com pouca microbiota (LCR, sinovial, sangue, bipsia, conjuntiva, nasofaringe) pode ser semeado em meio no seletivo.
2.4 Bacterioscopia e identificao

O exame bacterioscpico muito importante na microbiologia clnica e consiste na
observao direta, atravs de microscpio, do material obtido de qualquer tipo de
leso (feridas, lquor, urina, entre outros). Isto , o material recolhido e ento observado por microscopia, aps colorao. Em muitos casos, pode ser utilizado para
identificao presuntiva dos micro-organismos, como o gnero Neisseria.
Recomendaes:
29
No momento da coleta, recomenda-se colher dois swabs da amostra clnica, ou

material suficiente para a semeadura e bacterioscopia. O esfregao na lmina deve
ser feito logo aps a coleta.
Quando o swab nico, no caso de Neisseria, d-se preferncia semeadura imediata do material e posteriormente:
Ressuspender o swab em 1 mL de salina.
Agitar no Vortex.
Centrifugar.
Fazer um esfregao do sedimento.
O laudo da bacterioscopia deve relatar de forma quantitativa o material analisado,
salientando a presena ou ausncia de diplococos Gram-negativos com caractersticas de Neisseria em:
raros (+)
poucos (++)
moderados (+++)
muitos (++++)
Descrever se os micro-organismos so extracelulares ou intracelulares e quantificar os polimorfonucleares e as clulas epiteliais.
importante correlacionar a bacterioscopia com achados de cultura e dados do
paciente, como quadro agudo, portador, etc. Em casos de abuso sexual, fundamental o isolamento e identificao completa do micro-organismo, considerando
que neisserias saprfitas ou mesmo Acinetobacter spp. podem ser diagnosticados
erroneamente como N. gonorrhoeae.
2.4.1
Identificao
A anlise macroscpica das colnias bacterianas revela informaes que so
importantes no processo de identificao do micro-organismo. Cada espcie possui caractersticas que, muitas vezes, lhe peculiar, tais com tamanho,
forma, cor, aspecto, entre outros.
N. gonorrhoeae produz em gar chocolate vrios tipos de colnias. A colnia
tpica pequena, brilhante e convexa. So menores do que as de neisserias
saprfitas cuja cor pode variar de cinza a amarelo. A colnia de M. catarrhalis
de cor cinza rseo-acinzentado, comumente frivel, saindo inteira quando
removida com a ala bacteriolgica. As colnias de N. meningitidis so maiores que as colnias de gonococos, brilhantes e convexas. Os subtipos A e C
capsuladas podem apresentar-se mucides.
Para o diagnstico da gonorria, existem no comrcio recursos como ELISA,
sondas genticas de acido nuclico, PCR e suas variantes, que possuem elevado custo e so indicados em caso de levantamentos epidemiolgicos ou
30
quando no se dispe dos recursos tradicionais de identificao. Os testes

imunolgicos no substituem a cultura bacteriana e a bacterioscopia.
Para LCR, outros fludos estreis e at mesmo a urina, a caracterizao de
Neisseria meningitidis pode ser feita pela tcnica de aglutinao com partculas de ltex. Esse mtodo rpido, possui boa sensibilidade, especificidade e permite a tipagem dos sorogrupos de N. meningitidis mais prevalentes
em meningites. Uma vantagem do mtodo imunolgico sua positividade
nos casos de cultura negativa por uso prvio de antimicrobianos, sendo, no
entanto, de custo elevado. Para o tipo B, alguns produtos oferecem testes
para afastar reao cruzada com E. coli. A reao negativa no exclui o diagnstico, que deve ser sempre avaliado juntamente com a bacterioscopia e a
cultura.
2.4.2
Bacteriologia
A identificao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae pode ser realizada de
duas formas: presuntiva e confirmatria.
A identificao presuntiva baseia-se na realizao das provas de oxidase,
bacterioscopia e colorao de Gram das colnias crescidas. Em servios de
Sade Pblica (relacionados a doenas sexualmente transmitidas DST), a
prevalncia da gonorria bem significativa. Desta forma, para fins prticos de tratamento, pode-se fazer o diagnstico atravs de aspectos clnicos
associados bacterioscopia positiva (Diplococos Gram-negativos intracelulares) em pacientes de risco. Deve-se, no entanto, sempre colher material
para cultura, possibilitando a confirmao e o monitoramento da resistncia
dessas bactrias.
Na ocorrncia de surtos de meningite meningoccica, o diagnstico presuntivo para fins de tratamento tambm pode ser baseado na clnica e na bacterioscopia positiva do LCR ou de leses (petquias e prpuras). Deve-se realizar a cultura do material clnico para confirmao, identificao de sorotipo
e sensibilidade aos antimicrobianos atravs dos seguintes procedimentos:
Fazer a colorao de Gram das colnias isoladas para confirmar a presena de diplococos Gram-negativos.
Fazer o teste de oxidase das colnias sugestivas.
Deve-se procurar afastar outros gneros de bactrias como Acinetobacter
spp., Kingella spp. e Moraxella spp. que so morfologicamente parecidos.
Um recurso prtico para evitar erros de identificao de Acinetobacter
spp. e Kingella spp. com Neisseria :
Semear a colnia suspeita em gar chocolate.
31
Colocar um disco de penicilina de 10 UI.

Aps 24 horas fazer um Gram das colnias que crescerem prximas
zona de inibio.
Se permanecerem cocides, com aspecto de neisserias, confirma-se o isolamento; caso tenham adquirido a forma de bacilos longos, o isolado no
de Neisseria.
Outro passo importante verificar a capacidade de crescimento em meios
pobres como o gar nutriente ou a necessidade de crescimento em meio
rico (gar chocolate suplementado).
A diferenciao entre as espcies de Neisseria baseia-se na sua capacidade

de oxidao de carboidratos especficos (glicose, maltose, lactose, sacarose
e frutose) e nas exigncias nutricionais e de meio ambiente para seu crescimento. As neisserias utilizam os carboidratos por via oxidativa e o meio utilizado para verificar a bioqumica bacteriana a base gar Cistina Tripticase
(CTA), adicionada de 1% de cada um dos aucares. Essa base possui como
indicador de pH o vermelho de fenol, que a partir do pH 6,8 adquire a cor
amarela. No entanto, reaes duvidosas podem ocorrer devido a falhas na
deteco da acidez produzida pela bactria, o que pode dificultar a identificao. Recomenda-se enviar a cepa isolada rapidamente ao Laboratrio de
Referncia para confirmao.
2.4.3
Provas de rotina para diferenciar Neisserias patognicas

AC
22C
NA
35C
DNAse
GLI
MAL
LAC
SAC
FRU
N. gonorrhoeae
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
N. meningitidis
neg
neg
neg
neg
neg
N. lactamica
neg
neg
nen
N. siccca
neg
neg
N. mucosa
neg
neg
N. flavescens
neg
neg
neg
neg
neg
neg
M. catarrhalis
neg
neg
neg
neg
neg
Kingella spp.
neg
neg
neg
neg
neg
Bactria
AC crescimento em gar chocolate 22C; NA crescimento em gar nutriente 35C; GLI glicose; MAL maltose;
LAC lactose; SAC sacarose; FRU frutose; NEG negativo; V varivel.
32
FORBES, B.A.; SAHM, D.F.; WEISSFELD, A.S. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology. 12th ed.
St. Louis. Mosby Elsevier, 2007, 1031p.
WINN, J.Jr; ALLEN, S.; JANDA, W.M.; KONEMAN, E.; PROCOP, G.; SCHRENKENBERGER, P.C.;
WOODS, G.K. Color Atlas and Textbook OF Diagnostic Microbiology. 6th Ed. Lippincott
Williams & Wilkins, 2006, 1535p.
MC FADDIN, J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria. Baltimore. Ed.
William & Wilkins Co., 2000.
MURRAY, P.R. et al. Manual of Clnical Microbiology. 9th ed. Washington DC. American Society
for Microbiology ASM Press 2007, 2256p
http://www.cdc.gov/ Center for Disease Control and Prevention.
33
Captulo 3:
Enterobactrias
Carlos Emlio Levy
Tnia Mara Ibelli Vaz
3.1 Introduo:
A famlia Enterobacteriaceae constituda por um grande grupo de bacilos Gram-negativos, classificados atualmente em 44 gneros, 176 espcies e quatro grupos
entricos ainda no nomeados. As enterobactrias esto amplamente distribudas
na natureza e so encontradas no solo, gua, frutas, vegetais e produtos de origem
animal, como a carne e ovos. Sua ecologia varivel, bem como seu potencial patognico para o homem, animais e vegetais.
A) Caracterizao da famlia Enterobacteriaceae:
So bacilos Gram-negativos, no esporulados, com motilidade varivel. Crescem na presena ou ausncia de oxignio. Crescem bem nos meios comuns de
cultura e nos meios seletivos para enterobactrias como o gar Mac Conkey.
Fermentam a glicose com ou sem a formao de gs. A maioria catalase positiva, exceto a Shigella dysenteriae. A maioria oxidase negativa, exceto Plesiomonas, gnero recentemente incorporado na classificao da famlia Enterobacteriaceae e Aeromonas sp. (muito semelhante a E. coli). A maioria reduz o
nitrato a nitrito.
B) Importncia clnica:
As enterobactrias representam 80% ou mais de todos os Gram-negativos de
importncia clnica isolados na rotina microbiolgica. Muitas espcies de enterobactrias so patognicas para o homem causando vrios tipos de doenas.
Essas incluem doenas diarreicas, infeces em feridas e queimaduras, infeco
no trato urinrio e respiratrio, septicemia e meningite, sendo responsveis por
cerca de 70% das infeces urinrias e 50% das septicemias.
35
Algumas espcies so consideradas enteropatognicas, por causarem preferencialmente infeces gastrointestinais, normalmente transmitidas por gua
ou alimentos contaminados. So considerados enteropatgenos clssicos os
diferentes sorotipos de Salmonella, Shigella spp., categorias diarreiognicas de
E. coli e Yersinia enterocolitica. Alguns desses podem, ainda, estar associados a
infeces extraintestinais.
C) Infeces Relacionadas Assistncia Sade e na comunidade:

Infeces relacionadas assistncia sade: Nas infeces relacionadas assistncia sade, os gneros e espcies predominantemente isolados, representando 99% das enterobactrias de importncia clnica, so: Escherichia coli,
Salmonella spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens, Proteus
spp., Morganella morgannii, Citrobacter spp., e Providencia spp.
Infeces na comunidade: As infeces na comunidade so frequentemente
causadas pelos enteropatgenos clssicos, associados s doenas transmitidas
por alimentos. Tambm so comuns as infeces urinrias causadas por E. coli,
Proteus spp. e Klebsiella spp.
Baseado em dados de prevalncia e importncia clnica, considera-se necessrio que
os laboratrios de microbiologia utilizem metodologia que permita discriminar com
80% de acerto os gneros e espcies considerados a seguir:
Escherichia coli
Citrobacter koseri
Enterobacter aerogenes
Shigella spp.
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter cloacae
Salmonella typhi
Klebsiella oxytoca
Enterobacter sakazaki
Salmonella spp.
Providencia spp.
Pantoea agglomerans
Citrobacter freundii
Serratia spp.
Yersinia enterocolitica
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Morganella morganii
Tabela 1 Principais provas para a identificao das enterobactrias de importncia clnica
36
fermentao da glicose
produo de gs (CO2)
fermentao da lactose
utilizao de citrato
motilidade
produo de indol
oxidase
produo de urease
descarboxilao da lisina
produo de fenilalanina desaminase ou opo triptofanase
produo de sulfeto de hidrognio (H2S)
produo de gelatinase e/ou DNAse
Tabela 2 Provas complementares de Identificao

Teste da ornitina descarboxilase e arginina dehidrolase
Reao de vermelho de metila (VM) e Voges-Proskauer (VP)
Fermentao de outros carboidratos: glicerol, sacarose, maltose, arabinose, salicina, dulcitol, manitol, etc.
ONPG teste da Beta galactosidase
Utilizao do malonato de sdio
Hidrlise da Esculina, etc.
Os esquemas de identificao baseiam-se na determinao dos gneros e espcies

mais isolados na clnica, e nas provas mais caractersticas de cada gnero e espcie,
segundo alguns critrios como: facilidade de execuo, facilidade de interpretao,
custo, rapidez para leitura, etc.
3.2 Tipos de testes utilizados

Na maioria dos laboratrios de microbiologia clnica, a identificao de enterobactrias se baseia em caractersticas fenotpicas. Para a identificao das espcies so
utilizados testes convencionais, kits comerciais, mtodos automatizados ou mtodos
rpidos utilizando substratos cromognicos.
Testes convencionais preparados no laboratrio devem ser submetidos a um rigoroso controle de qualidade. Aqueles adquiridos no comrcio em testes isolados ou em
kits devem ser acompanhados dos respectivos esquemas de identificao, previamente validados com cepas padro e desempenho documentado.
Mtodos automatizados, em geral, utilizam essas mesmas provas e ampliam o nmero de testes podendo caracterizar com maior segurana e melhor poder de discriminao gneros e espcies no comuns.
Mtodos rpidos em geral utilizam substratos cromognicos para deteco de enzimas produzidas pelas bactrias e que se revelam aps 4 a 6 horas de incubao.
Na rotina bacteriolgica, existem vrias alternativas e, com base em conjuntos ou
sistemas simplificados de provas bioqumicas, possvel realizar a triagem e identificao presuntiva dos principais gneros de interesse clnico. Desse modo, das enterobactrias isoladas de amostras clnicas, cerca de 90% podem ser perfeitamente
identificadas atravs desses esquemas, podendo o resultado ser entregue dentro de
um espao de tempo relativamente curto, geralmente, entre 48 a 72 horas a partir do
isolamento.
37
3.2.1
Principais Meios Bioqumicos Utilizados na Rotina

A identificao presuntiva das enterobactrias pode ser facilitada pela utilizao de meios que renem em um s tubo vrias reaes bioqumicas.
Assim, possvel realizar a identificao presuntiva dos principais gneros
de interesse clnico, minimizando o tempo de sada do resultado.
No Brasil, os meios presuntivos de identificao mais utilizados so: Meio de
Rugai, modificado por Pessoa e Silva (Meio de IAL), EPM MILI e TSI.
As facilidades, dificuldades ou limitaes na utilizao de cada um desses
meios dependem do treinamento e conhecimento do analista que est executando o exame.
Meio IAL (Instituto Adolfo Lutz) O meio de IAL extremamente prtico por
se tratar de um nico tubo reunindo nove reaes: Na fase superior do tubo
pode ser verificada a fermentao da glicose, produo de gs, fermentao
da sacarose, produo de urease, H2S e triptofano desaminase. Na fase inferior, separada da superior por uma camada de cera de carnaba, verifica-se
a descarboxilao da lisina e motilidade. No tampo observa-se a produo
de indol. O meio deve ser inoculado com uma picada profunda, at o final do
tubo, e posteriormente, aps a picada, estria-se a superfcie, na fase superior.
Baseado nestas provas possvel identificar as seguintes bactrias: E. coli,
Shigella (indol positiva), Shigella (indol negativa), Enterobacter aerogenes,
Klebsiella pneumoniae, Klebsiella spp. (sacarose negativa), Enterobacter cloacae, Providencia spp. (ureia positiva) ou Morganella morganii, Providencia
spp. (ureia negativa), Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Salmonella spp., Salmonella typhi, Citrobacter freundii, Serratia marcescens (necessita provas complementares), Vibrio cholerae, Vibrio spp. (oxidase positiva) e alguns bacilos
no fermentadores.
Por se tratar de um meio presuntivo, provas complementares devem ser realizadas sempre que necessrio, especialmente a utilizao do citrato em
meio Citrato de Simmons, a DNAse, oxidase e a fermentao da lactose.
A) Variantes do meio IAL:
Tubo 1 meio de Rugai sem sacarose provas: fenilalanina, fermentao da
glicose, gs, H 2 S, ureia
Tubo 2 MIO (Motilidade Indol Ornitina)
Tubo 3 lisina
Tubo 4 citrato
Tubo 5 rhamnose
38
Conjunto EPM/MiLi/Citrato Trata-se praticamente da mesma combinao

de reaes do meio IAL ou Rugai & Arajo (modificado por Pessoa & Silva),
separados em 2 tubos, passando a verificao do indol da tampa do IAL, para
o meio MILi aps adio do reativo de Kovacs.
B) Tubo EPM:
Fermentao da glicose, produo de gs, H2S, ureia, fenilalanina; inocular picando at o fundo e semear na superfcie, incubar com a tampa
frouxa 24 horas/35oC.
Tabela 3 Interpretao do Meio EPM
Base
Superfcie
Produo de gs
Formao de bolhas ou rachaduras no meio
Produo de H2S
Presena de pigmento negro de qualquer intensidade
Hidrlise da Ureia
Colorao azul esverdeada (fraca) na base indica prova

positiva
Desaminao do Triptofano
Reao positiva verde escuro ou acastanhado

Reao negativa superfcie inalterada
C) Tubo MILi:
Fazer picada central apenas incubar 24hs/35oC.
Motilidade bactrias mveis crescem alm da picada turvando o
meio, enquanto as imveis crescem apenas na linha de picada.
descarboxilao da lisina lisina positivo o meio torna-se roxo, na prova negativa o meio permanece amarelado nos 2/3 inferiores.
Aps a leitura da lisina adicionar 3 gotas de reativo de Kovacs para o
teste de indol a formao de um anel rosa na superfcie do meio indica positividade para o indol.
D) Citrato:
Inocular a superfcie e incubar 24hs/35oC.
A prova positiva evidenciada pelo aparecimento de colorao azul
na superfcie.
Meio Trplice Acar Ferro (TSI) Considerado o mais clssico dos sistemas de identificao, necessita de provas adicionais, mas tem a vantagem
de ser de mais fcil interpretao. Abaixo ser descrito em detalhes e ser
a base da identificao de enterobactrias.
Acurcia da identificao Qualquer sistema de testes existentes no comrcio, com leitura manual ou automatizada tem limitaes no nmero
de provas e de discriminao dos diferentes gneros e espcies de enterobactrias, de modo que a maioria dos esquemas trabalha com um
mximo de 80% de acerto.
39
Os esquemas de identificao de enterobactrias podem utilizar uma ampla

gama de recursos, variando desde nove reaes como meio IAL ou Rugai &
Arajo modificado por Pessoa & Silva, at dez testes propostos nesse manual, ou sistemas como API 32E que pode identificar enterobactrias e alguns
no fermentadores, utilizando 32 testes. importante destacar que nenhum
sistema oferece 100% de acerto para a caracterizao das espcies de enterobactrias, mas analisam o principal comportamento descrito na literatura.
A fonte de informao mais utilizada baseia-se na tabela organizada por Farmer (1999) contando com 47 provas, e os respectivos percentuais de positividade para os diferentes gneros e espcies de enterobactrias. Alguns dos
principais gneros e espcies de importncia clnica podem ser caracterizados com >95% de acerto com poucas provas. Entretanto para as espcies
dos gneros Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella e Serratia os testes mais utilizados apresentam baixo poder de discriminao, sendo a identificao feita
pelo maior percentual de probabilidade.
necessrio destacar que padres no usuais podem ocorrer e que o microbiologista deve estar atento para analisar cepas que possam ter importncia
clnica e epidemiolgica ou encaminh-las a Laboratrios de Referncia. Antes, no entanto, deve certificar-se da pureza da cultura e que o padro no
usual no se deve a cultura mista de bactrias.
O meio de TSI inclinado em bico de flauta, de cor vermelho cereja e deve ser
inoculado por picada central at o fundo, seguido de espalhamento na superfcie e incubao durante 18-24h a 35oC.
Tabela 4 Provas do Meio de TSI
Prpura/amarelo (pice prpura e base amarela) =fermentao apenas da glicose (lactose e sacarose
negativos)
Amarelo/amarelo (pice e base amarelas) = fermentao da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3
acares)
Presena de gs (CO2) = bolhas ou meio fragmentado
H2S positivo= presena de precipitado negro
40
Tabela 5 Interpretao do resultado das reaes encontradas no TSI

pice
Base
H2S
Gs
Interpretao mais provvel
Vermelho
Vermelho
Neg
Neg
Sem crescimento = bactria exigente ou no semeado
Vermelho
Vermelho
Neg
Neg
Crescimento na superfcie = No Fermentador ou Gram (+)
Amarelo
Vermelho
Neg
Neg
Crescimento na superfcie = Gram (+)
Vermelho
Amarelo
Neg
Enterobactria ou Aeromonas lactose e sacarose negativas
Amarelo
Amarelo
Neg
Enterobactria
Amarelo
Amarelo
Pos
Salmonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter
Neg. = negativo
v. = varivel
Obs.: A presena de H2S em bactrias lactose e sacarose negativas pode ser

menos evidente pois a precipitao de sais de ferro pelo sulfeto de hidrognio depende de meio cido (Ex: Salmonella typhi)
3.3 Etapas da identificao de enterobactrias

3.3.1
Anlise do crescimento nos meios ricos e seletivos

A identificao de uma enterobactria comea com a anlise da morfologia
da colnia obtida a partir do material semeado. Em geral temos os seguintes
meios para interpretar:
Secrees: gar sangue e Mac Conkey
Lquidos nobres e bipsias: gar chocolate e Mac Conkey
Fezes: Mac Conkey e SS.
Urina: CLED ou gar sangue e Mac Conkey, etc.
Devemos considerar que:
A enterobactria sempre cresce nos meios ricos (gar sangue, chocolate e
CLED), bem como nos meios seletivos: gar Mac Conkey e SS.
Os Gram-positivos como regra no crescem em gar Mac Conkey e SS, exceto os enterococos que podem crescer, porm as colnias so menores.
No gar Mac Conkey e SS, alm das enterobactrias e dos enterococos,
podem crescer bactrias no fermentadoras e Candida.
Portanto caracteriza-se uma enterobactria quando ela est presente em
todos os meios semeados, mas ainda necessrio diferenciar de outros
micro-organismos no muito exigentes como no fermentadores, enterococos e Candida spp.
Recomenda-se a seguir realizar:
41
A) Gram da colnia isolada

Recomenda-se sempre fazer o Gram para evitar enganos de interpretao (diferenciar cocos de bacilos, Gram-positivos de Gram-negativos
e leveduras).
B) Prova da oxidase
Indicada para detectar e/ou diferenciar o grupo Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio que tambm so fermentadores. A prova de oxidase no deve
ser realizada a partir de meios que contm corantes ou indicadores.
C) Prova do metabolismo fermentador
Triagem utilizando os meios de OF-glicose (quando suspeitar de no
fermentador) ou meio presuntivo (IAL, EPM-MILI,TSI)
D) Srie bioqumica complementar
Sempre necessria para caracterizar gnero e espcie. O nmero de
provas permitir maior ou menor discriminao (vide a seguir nvel de
complexidade de provas).
As Enterobactrias caracterizam-se por se apresentarem como: bacilos
Gram-negativos, fermentadores da glicose, com ou sem produo de gs,
oxidase negativas, reduzem nitrato a nitrito e que crescem bem no meio de
gar Mc Conkey ou gar EMB (Eosin Metilene Blue gar).
Como modelo de triagem na identificao bacteriana tem sido utilizado o
meio de TSI (Trplice acar ferro), que permite avaliar a fermentao da glicose, produo de gs, fermentao de lactose e/ou sacarose e produo de H2S.
O TSI constitui o meio de identificao preliminar mais utilizado no mundo,
sendo necessrio, no entanto, adicionar algumas provas para completar a
identificao, que podem ser utilizadas em dois nveis de complexidade, dependendo da disponibilidade de testes, interesse ou necessidade de uma
melhor qualidade de identificao:
42
Nvel de complexidade 1 TSI mais:

Motilidade, indol, lisina, ureia, citrato, lactose observada no gar Mc
Conkey, fenilalanina, DNAse e oxidase.
Nvel de complexidade 2 realizar as provas do nvel 1 mais:
Ornitina, arginina, sacarose, arabinose, malonato, esculina e PYR.
3.3.2
Descrio das Principais Provas Bioqumicas

A) Motilidade/H2S/Indol
Semear por picada at o fundo, e incubar 24hs/35oC.
Motilidade Para testar motilidade pode-se utilizar os meios de Motilidade/
indol (pode-se adicionar resazurina para melhor observao do crescimento); SIM (motilidade, indol e H2S) e Mili (Motilidade, Indol e Lisina):
Crescimento apenas na linha de picada = motilidade negativa
Crescimento difuso em todo o meio = motilidade positiva
H2S Produo de gs sulfdrico, verificado no TSI ou SIM
H2S positivo = meio enegrecido
H2S negativo = cor inalterada do meio
Indol Aps 24h de incubao, pingar 3-4 gotas de Kovacs na superfcie do
meio:
presena de cor prpura = indol positivo
cor do reagente = indol negativo
B) Ureia de Christensen
Inoculado apenas na superfcie e incubar 24h/35oC
Urease positivo = cor vermelha (Proteus apresenta reao mais intensa)
Urease negativo = mantm cor amarelada do meio
C) Citrato de Simmons
Inocular na superfcie (inculo fraco) e incubar 24h/35oC
Citrato positivo = azul e/ou crescimento no meio
Citrato negativo = cor verde (inalterado)
D) Fenilalanina
Inocular a superfcie do meio (inclinado) e incubar 24h/35oC, aps crescimento pingar na superfcie 5 gotas do reagente cloreto frrico a 10%
FA positivo = cor verde escuro na superfcie
FA negativo = mantm a cor do meio inalterada
Maiores detalhes e outras provas consultar o fascculo de meio de cultura.
3.4 Identificao das enterobactrias de importncia clnica

3.4.1
Consideraes
a) Valores positivos ou negativos referem-se a 80% ou mais de definio;
para saber o real percentual de provas positivas ou negativas consultar a
tabela geral.
43
b) PB (padro bioqumico) = probabilidade terica da bactria em questo

apresentar o padro bioqumico analisado (os testes considerados so indicados pelo sinal). Exemplo: PB para Proteus vulgaris em relao s provas, H2S +(98%) FA +(95%) Indol + (98%) (multiplicar os percentuais de
ocorrncia) = 92%.
c) Quando o PB baixo significa ter outro padro mais frequente.
d) Os padres bioqumicos pouco frequentes tero menor probabilidade de
isolamento.
e) No aplicado quando se considera gnero pois envolve vrias espcies
com diferentes padres de testes (ex: Salmonella spp.).
f ) Valores seguidos do sinal positivo (+) ou negativo (-) significa o percentual de cepas com resultado do teste positivo ou negativo. Ex: Lisina 75%+
= 75% das cepas so lisina positivas.
g) V = valores >20% e <80% de reaes positivas ou negativas; essas provas
podem ser teis para diferenciar duas espcies ou dois gneros quando
a reao s ocorre para uma delas. Ex.: ureia em relao a E. coli e Citrobacter. E. coli negativa e Citrobacter varivel. Se a reao encontrada for
positiva, exclui-se E. coli. Pela importncia clnica e epidemiolgica, padres no comuns de Yersinia e Salmonella spp. foram considerados, pois
na prtica a motilidade pode ser duvidosa e o H2S pode ser falso negativo.
h) As provas destacadas com fundo cinza tm a finalidade de facilitar a busca de provas-chave na diferenciao bacteriana.
i) Recomenda-se de rotina utilizar as provas do nvel 1 que, para a maioria
das bactrias da rotina, permite uma caracterizao adequada. Quando
houver necessidade (provas no conclusivas, fins epidemiolgicos, etc)
usar as provas de nvel 2.
Lac MC= lactose em Mc Conkey
Tabela 6 Identificao Bioqumica Simplificada das Principais Enterobactrias
Nvel de Complexidade 1
H2S
44
fenilalanina
indol
motilidade
Citrato
DNAse
Tabela
6.1
6.2
6.3a
6.3b
6.4
6.5
6.6
6.8a
6.8b
6.7
Tabela 6.1 H2S (gs sulfdrico) positivo, Fenilalanina positivo

Indol +
Proteus vulgaris
PB 92%
Indol neg
Proteus mirabilis
PB 94%
Tabela 6.2 H2S negativo, Fenilalanina positivo

Indol +
Indol neg
Citrato +
Ureia v
Providencia spp.
PB 88%
Citrato neg
Ureia +
Morganella morganii
PB72%
Citrato neg
Ureia +
P. penneri
PB 69%
Citrato v
Ureia neg
Enterobacter spp.
PB <16%
Tabela 6.3 H2S positivo, Fenilalanina negativo

a) Indol positivo
Bactrias/Provas
Citrato
Motilidade
urease
lisina
lac (MC)
PB
78%
89%
neg
25%
Edwarsiella tarda
neg
neg
neg
99%
b) Indol negativo
Bactria/Provas
urease
citrato
lisina
Motilidade
gs
sorotipagem
Salmonella spp.
neg
S. typhi
neg
neg
neg
97%
S. gallinarum/S. pullorum
neg
neg
neg
90%
neg
neg
52%
C. freundii
PB
Tabela 6.4 H2S negativo, FA negativo, Indol positivo, motilidade negativa

Bactria/Provas
citrato
urease
lisina
lactose
gs
sorotipagem
PB
Y. enterocolitica
neg
75%+
neg
neg
neg
+Yersinia
50%
Shigella spp.
neg
neg
neg
neg
neg
+Shigella
50%
Klebsiella oxytoca
No
99%
E. coli inativa (rara)
neg
neg
75%neg
neg
Invasora2
80%
1 motilidade positiva temperatura ambiente e negativa a 37C

2 em coprocultura testar p/E. coli invasora
Tabela 6.5 H2S negativo, FA negativo, Indol positivo, Motilidade positiva

Bactria/Provas
E. coli
Citrobacter spp.
Aeromonas spp.
citrato
urease
lisina
lactose
gs
PB
neg
neg
97%
neg
neg
neg
1 oxidase positiva (verificar Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio)

2 Aeromonas Dnase positiva e Plesiomonas Dnase negativa
45
Tabela 6.6 H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade negativa

Bactria/Provas
urease
citrato
lisina
gs
lactose
Shigella spp.
(colnia pequena)
neg
neg
neg
neg
neg
sorotipagem
50%
Klebsiella pneumoniae 1
pos
pos
pos
pos
pos
colonia mucide
100%
Yersinia enterocolitica 2
75%+
neg
neg
neg
neg
sorotipagem
50%
neg
neg
neg
15% mot neg
9,6%
P. agglomerans 3
comentrio
PB
1 cepas isoladas do trato respiratrio superior, especialmente nariz podem ser ureia negativas e bioquimicamente pouco ativas (citrato V, lisina V), denominadas K.ozaenae e K.rhinoscleromatis
2 motilidade(+) temperatura ambiente
3 pode ocorrer falsa motilidade negativa em meio semi-slido e positiva em caldo
Tabela 6.7 H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato negativo
Bact/Provas
lisina
lactose
sorotipagem
PB
Hafnia alvei
neg
negativa
7%6
Salmonella choleraesuis
neg
37%
Salmonella paratyphi A
neg
neg
90%
P. agglomerans
neg
negativa
25%
Salmonella typhi
pos
neg
pos
12%
Tabela 6.8 H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato positivo
DNAse/gelatinase negativos
Bactria/Provas
lisina
urease
lactose
gs
Sorotipo
PB
pos
neg
pos
++
neg
95%
neg
pos
++
neg
95%
DNAse/gelatinase positivos
Bactria/Provas
lisina
urease
lactose
gs
pig. verm.
PB
Serratia marcescens
pos
85% neg
neg
55% pos
95%
Serratia liquefaciens
pos
neg
90% neg
75% pos
neg
76%
55% pos
neg
pos
70% neg
85%
Serratia rubidae1
1 raramente isolada
46
Tabela 7 Identificao Bioqumica Simplificada das Principais enterobactrias

Nvel de Complexidade 2
H2S
fenilalanina
indol
motilidade
citrato
DNAse
tabela
7.1a
7.1b
7.2a
7.2b
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.9
7.10
7.8
Tabela 7.1 H2S positivo, Fenilalanina positivo

a) Indol positivos
Bactria/Provas
ornitina
sacarose
PB
neg
92%
neg
20%
ornitina
citrato
PB
Proteus mirabilis
V (65%+)
94%
Proteus penneri
neg
neg
30%
Proteus vulgaris
Morganella morganii
b) Indol negativos
Tabela 7.2 H2S negativo, Fenilalanina positivo

a) Indol negativo
Bactria/Provas
urease
citrato
sacarose
ornitina
Proteus penneri
neg
neg
Morganella morganii
neg
neg
P. agglomerans
neg
75%+
neg
Enterobacter sakazaki
neg
b) Indol positivo
Bactria/Provas
Citrato
Morganella morganii
neg
Providencia spp.
47
Tabela 7.3 H2S positivo, Fenilalanina negativo e indol positivo

Bactria/Provas
citrato
urease
lisina
ornitina
lactose
sacarose
78% +
44% +
neg
neg
78 %+
89%+
neg
neg
neg
neg
Edwarsiella tarda
Tabela 7.4 H2S positivo, Fenilalanina negativo e indol negativo

Bactria/Provas
Lisina
citrato
Ureia
ornitina
Motilidade
arabinose
Gs
Sorotip
S. paratyphi A
neg
neg
neg
C. freundii
neg
78%+
44+
neg
89%+
89%+
neg
Salmonella spp.
neg
S. typhi
neg
neg
neg
neg
neg
S. choleraesuis
25%+
neg
neg
S. gallinarum
neg
neg
neg
neg
neg
S. pullorum
neg
neg
neg
Outras Salmonellas
neg
Triagem rpida para principais bactrias H2S+

Bactria/prova
PYR
Glicerol
Fenilalanina
Salmonella spp.
neg
neg
neg
Citrobacter spp.
neg
neg
Proteus spp.
Tabela 7.5 H2S negativo, Fenilalanina negativo, Indol positivo, Motilidade negativa
Bactria/Provas
citrato
ureia
lisina
ornitina
lactose
gs
sorotip
PB
Y. enterocolitica1
neg
75%
+
neg
neg
neg
50%
Shigella spp.
neg
neg
neg
neg
neg
neg
50%
Klebsiella oxytoca
neg
++
NI
99%
E. coli inativa (rara)
neg
neg
40%+
20%+
25%+
neg
Invasora2
80%
1 motilidade positiva temperatura ambiente e negativa a 35-37 C

2 em coprocultura testar p/E. coli invasora
o
48
Tabela 7.6 H2S negativo, Fenilalanina negativo, Indol positivo, motilidade positiva
Bactria/Provas
citrato
ureia
lisina
ornitina
lactose
gs
PB
neg
neg
90%+
65 +
97%
C. diversus (koseri) 1
75%+
neg
50%+
97%
Citrobacter amalonaticus1
85%+
neg
35%+
97%
Yersinia enterocolitica2
neg
75%+
neg
neg
neg
vide 2
Pantoea agglomerans
50%+
20%+
neg
neg
40%+
20%+
16%
neg
+4
neg
E. coli
Aeromonas spp3
1 C. koseri = malonato+, C. amalonaticus= malonato negativo

2 motilidade negativa a 35-37oC e positiva a temperatura ambiente
3 oxidase positiva: Aeromonas Dnase positiva e Plesiomonas shigelloides Dnase negativa
4 Aeromonas caviae lisina negativa e lactose positiva
Tabela 7.7 H2S negativo, Fenilalanina negativo, Indol negativo, Motilidade negativa
Bactria/Provas
Ureia
citrato
Lisina
gs
lactose
neg
nega
neg
neg
neg
neg
78%+
Yersinia enterocoltica 2
75%+
Pantoea agglomerans 3
neg
Shigella spp.
(colnia pequena)
Klebsiella spp. 1
comentrio
PB
Sorotipagem
positiva
50%
Colnia
Mucide
100%
Mucide
neg
78%+
neg
neg
neg
neg
neg
neg
11% motilidade
negativa
16%
Sorotipagem
positiva
50%
15% motilidade
negativa
9,6%
1 cepas isoladas do trato respiratrio superior, especialmente nariz podem ser ureia negativas e bioquimicamente pouco ativas (citrato V, lisina V), denominadas K.ozaenae e K.rhinoscleromatis
2 motilidade(+) temperatura ambiente
3 pode ocorrer falsa motilidade (negativa em meio semi-slido e positiva em caldo)
Tabela 7.8 H2S negativo, Fenilalanina neg, Indol negativo, Motilidade +, Citrato neg
Bactria/Provas
Lisina
Ornitina
Lactose
Urease
Arabinose
Sorologia
PB
Hafnia alvei
neg
neg
neg
76%
Salmonella typhi 1
neg
neg
neg
neg
S. choleraesuis
neg
neg
neg
Y. enterocolitica 2
neg
neg
75%+
S. paratyphi A
neg
neg
neg
Pantoea agglomerans
neg
neg
40%+
20%+
neg
vide 2
25%
1 H2S pode ser positivo no TSI com 48h

2 motilidade negativa a 35oC e positiva a 25oC
49
Tabela 7.9 Tabela fracionada H2S negativo, FA varivel, Indol negativo, Motilidade
Positiva, Citrato positivo
Dnase e Gelatina negativos
a) Lisina negativa, Ornitina negativa e fenil negativo
Bactria/Provas
E. agglomerans
Arginina
Gs
Esculina
67%+
neg
neg
neg
60%+
b) Lisina negativa e Ornitina positiva

Bactria/Provas
Ureia
Fenil
Malonato
Esculina
ocorrncia
Enterobacter
cloacae
65%+
neg
75%+
30%+
comum
Enterobacter
sakazaki
neg
50%+
18%+
raro
c) Lisina positiva, ornitina positiva e fenil negativo

Bactria/Provas
Ureia
Lactose
E. aerogenes
neg
Enterobacter gergoviae
55%+
Fenil
Lisina
Arginina
Ornitina
Malonato
Gs
Lactose
Esculina
C. freundii
44%+
67%+
11%+
89%+
78%+
E. aerogenes
2%+
98%+
98%+
95%+
100%+
95%+
98%+
E. cloacae
65%+
97%+
96%+
75%+
100%+
93%+
30%+
E. agglomerans
20%+
20%+
65%+
20%+
40%+
60%+
E. gergoviae
93%+
90%+
100%+
96%+
98%+
55%+
97%+
E. sakazakii
1%+
50%+
99%+
91%+
18%+
98%+
99%+
100%+
Bactria/
Provas
Ureia
Tabela 7.10 Tabela completa H2S negativo, FA varivel, Indol neg., Motilidade positiva,
Citrato positivo, Dnase e Gelatina negativos
Tabela 7.11 H2S neg., Fenilalanina neg., Indol neg., Motilidade positivo, Citrato positivo,
Dnase e Gelatina (positivas)
Bactria/Provas
50
Lisina
Ornitina
L-arabinose
Malonato
Motilidade
Lactose
Serratia marcescens
99% +
99% +
Neg
Neg
Pos
Neg
S. marcescens biog 1
55% +
65% +
Neg
Neg
Neg
Neg
95% +
95% +
Pos
Neg
Pos
Neg
Serratia rubidae
55% +
neg
Pos
Pos
Pos
Pos
Tabela 7.12 Caracterizao geral das principais enterobactrias de importncia

clnica (%)
Bactria/Provas
Indol Citrato H2S
Ureia Fenilala Lisina Arginina Ornitina Motil.
33
78
78
44
67
89
Citrobacter diversus (koseri)
99
99
75
80
99
95
100
95
85
85
95
95
99
100
100
100
98
95
98
98
97
100
65
97
96
95
99
93
90
100
90
Enterobacter sakazakii
11
99
50
99
91
96
Escherichia coli
98
90
17
65
95
Escherichia coli inativa
80
40
20
Shigella dysenteriae
45
Shigella flexneri
50
Shigella boydii
25
10
Shigella sonnei
98
Hafnia alvei
10
100
98
85
98
95
98
Klebsiella oxytoca
99
95
90
99
Klebsiella ozaenae
30
10
40
Klebsiella rhinoscleromatis
Morganella morganii grupo
95
20
95
95
95
Pantoea agglomerans
20
50
20
20
85
Proteus mirabilis
65
98
98
98
99
95
Proteus vulgaris
98
15
95
95
99
95
Proteus penneri
30
100
99
85
Providencia rettgeri
99
95
90
98
94
Providencia stuartii
98
93
30
95
85
Providencia alcalifaciens
99
90
90
96
Salmonella spp.
95
95
98
70
97
95
Salmonell typhi
97
98
97
Salmonella cholerasuis
25
50
95
55
100
95
10
15
95
95
Salmonella gallinarum
100
90
10
95
Salmonella pullorum
90
100
10
95
Salmonella outras
90
100
99
70
99
99
Serratia marcescens
98
15
99
99
97
Serratia marcescens bio 1
30
55
65
14
90
95
95
95
Serratia rubidae
95
55
85
50
75
95
Citrobacter amalonaticus
Edwarsiella tarda
51
Bactria/Provas
Malonato
Gs glicose
lactose
sacarose
esculina
DNAse
11
89
78
89
Citrobacter diversus (koseri)
95
98
50
40
Citrobacter amalonaticus
97
35
Edwarsiella tarda
100
95
100
95
100
98
75
100
93
97
30
96
98
55
98
97
Enterobacter sakazakii
18
98
99
100
100
Escherichia coli
95
95
50
35
Escherichia coli inativa
25
15
Shigella flexneri
Shigella boydii
Shigella sonnei
Hafnia alvei
50
98
10
93
97
98
99
99
Klebsiella oxytoca
95
97
100
100
100
Klebsiella ozaenae
50
30
20
80
Klebsiella rhinoscleromatis
95
75
60
Morganella morganii grupo
99
Pantoea agglomerans
65
20
40
75
60
Proteus mirabilis
90
90
15
50
Proteus vulgaris
91
85
97
50
80
Proteus penneri
50
45
100
40
Providencia rettgeri
10
15
35
Providencia stuartii
50
10
Providencia alcalifaciens
85
15
Salmonella spp.
90
Salmonell typhi
Salmonella cholerasuis
95
99
Salmonella gallinarum
10
Salmonella pullorum
90
Salmonella outras
100
0 ou 15
Serratia marcescens
90
55
99
95
98
Serratia marcescens bio 1
30
100
90
82
90
75
10
98
97
85
Serratia rubidae
90
94
30
100
99
94
99
95
25
52
gelatina
3.5 Identificao sorolgica

Dentro da famlia Enterobacteriaceae, encontram-se conjuntos de amostras bacterianas bioquimicamente homogneas e sorologicamente relacionadas, que constituem
os gneros e, segundo alguns critrios, podem dividir-se em espcies.
As amostras relacionadas bioquimicamente so divididas em subgrupos ou tipos, por
critrio sorolgico, de acordo com a presena dos antgenos somtico (O), flagelar (H)
e de envoltrio ou cpsula (K). Desse modo, os sorotipos so divises baseadas no
relacionamento antignico, enquanto os biotipos so amostras do mesmo sorotipo
que diferem em caractersticas bioqumicas.
Em atividades de rotina de Bacteriologia Clnica, a identificao ou confirmao sorolgica feita apenas com germes comprovadamente patognicos e de importncia
epidemiolgica como Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Yersinia enterocolitica e mesmo assim utilizando-se esquemas simplificados, atravs do seguinte procedimento tcnico:
a) Preparar uma suspenso bastante densa (aspecto leitoso) da bactria a ser testada, utilizando-se soluo salina a 0,85%. A massa bacteriana proveniente do gar
TSI usado na identificao bioqumica ou, de preferncia, em gar nutriente inclinado aps repique para obteno de massa de germes. Coloca-se a salina sobre
o crescimento bacteriano ocorrido na superfcie inclinada do meio e, aps alguns
minutos, agitar o tubo de modo a obter a suspenso bacteriana. Bactrias em fase
rugosa tendem a se autoaglutinar, e no devem ser utilizadas na classificao sorolgica.
b) Sobre uma lmina limpa misturar uma gota do anti-soro conhecido e da suspenso
bacteriana a ser testada, e, com movimentos circulares, tornar a mistura bastante
homognea continuando o movimento durante um ou no mximo dois minutos.
O aparecimento de aglutinao, nesse intervalo de tempo, indica positividade da
reao.
c) Algumas vezes, necessrio o aquecimento da suspenso bacteriana em banhomaria fervente, durante 15 minutos, com finalidade de eliminar estruturas mais
externas da clula que tm ao interferente na reao. Aps resfriamento da suspenso repete-se o teste. Caso ocorra a aglutinao, confirma-se a prova.
3.5.1
Identificao de Salmonella:
No gnero Salmonella existe uma grande quantidade de sorotipos, que no
so mais considerados como espcies, e sua identificao sorolgica completa e detalhada uma tarefa restrita aos denominados Laboratrios de
Referncia. Para identificao rotineira no laboratrio clnico, utiliza-se basicamente trs antisoros:
53
a) Anti-Salmonella polivalente somtico (Grupos A,B,C,D,E)

b) Anti-Salmonella somtico, Grupo D (S. typhi)
c) Anti-Salmonella, anti Vi
Quando o denominado antgeno de virulncia (Vi) est presente, poder
bloquear a aglutinao do antgeno somtico do grupo D (Salmonella typhi).
Desse modo, a suspenso dever ser aquecida em banho-maria fervente e
testada novamente com os trs anti-soros citados, dando o resultado abaixo
no caso de Salmonella typhi.
A partir de uma reao positiva feita apenas com o antgeno somtico polivalente, existe condio de confirmar a amostra como sendo do gnero Salmonella, sem especificar o sorotipo ou sorovar.
Anti-soros
Antgeno vivo
Antgeno aquecido
Anti-soro poli somtico
Grupo D somtico
Anti Vi
Aps a identificao bioqumica e aglutinao com soro polivalente, as

amostras podero ser testadas com os soros A, B, C, D, E monovalentes. A
bactria pertencer ao sorogrupo em cujo soro houver aglutinao. Se a reao for negativa deve-se aquecer a metade da suspenso em banho-maria
fervente e repetir o teste. A metade no aquecida dever ser utilizada para
determinao de antgenos flagelares.
A identificao at sorotipos poder ser feita com auxlio dos soros flagelares
(a, b, c, d, i, 1, 2, 5), e atravs de sua utilizao possvel identificar as seguintes amostras:
Grupo Sorolgico
Grupo O2 (A)
Salmonella Paratyphi A
Grupo O4 (B)
Salmonella Paratyphi B e S. Typhimurium
Grupo O7 (C1)
Salmonella Paratyphi C e S. Cholerae suis
Grupo O5 (D1)
Salmonella Typhi
3.5.2
54
Sorotipos
Identificao de Shigella:
O gnero Shigella est constitudo de apenas quatro sorogrupos, que so identificados sorologicamente, de maneira simplificada, com a utilizao de anti-soros polivalentes. Excepcionalmente, utiliza-se apenas o antisoro monovalente de Shigella dysenteriae tipo 1 (bacilo de Shiga), por ser o mais patognico.
Grupo Sorolgico
Espcie Bacteriana
Sorotipos
- Grupo A
15 sorotipos
- Grupo B
Shigella flexneri
8 sorotipos
- Grupo C
Shigella boydii
19 sorotipos
- Grupo D
Shigella sonnei
1 sorotipo
As culturas suspeitas devero ser testadas, primeiro com os soros contra Shigella flexneri e Shigella sonnei, que representam mais de 95% das amostras
de Shigella isoladas em nosso meio. Caso no haja aglutinao, prosseguir
com os outros soros.
No ocorrendo aglutinao, possvel que a cultura seja rica em antgenos
de superfcie que geralmente impedem o contato do soro com o antgeno
somtico O. Esses antgenos devem ser destrudos pelo aquecimento da suspenso bacteriana por 15 minutos em banho-maria fervente, procedimento
que pode ser adotado como de rotina na sorologia desse gnero.
3.5.3
Identificao de Escherichia coli

As amostras de Escherichia coli que causam diarreia pertencem a cinco grupos principais: E. coli Enteropatognica (EPEC), E. coli Enterotoxignica (ETEC),
E. coli Enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora da toxina Shiga (STEC), a qual
inclui o subgrupo referido como E. coli enterohemorrgica (EHEC) e E. coli
enteroagregativa (EAEC). No existe nenhuma prova bioqumica que possa,
seguramente, distingui-las entre si ou de outros tipos de E. coli pertencentes
flora normal do intestino. As cepas diarreiognicas de E. coli so identificadas atravs de mtodos moleculares, tais como PCR utilizando iniciadores
especficos, ou mtodos para verificao da produo de toxinas, realizadas
somente em laboratrios de referncia ou de pesquisa. As cepas de EPEC e
EIEC podem ser identificadas presuntivamente por provas de sorotipificao
rotineira. Considerando que um mesmo sorogrupo pode pertencer a uma
ou mais categorias diarriognica, as amostras devem ser encaminhadas a
laboratrios de referncia para confirmao.
Soro Anti E. coli Enteropatognica Clssica (EPEC):
Polivalente A: anti 026, 055, 0111, 0119
Polivalente B: anti 0114, 0125, 0142,0158
Polivalente C: anti 086, 0126, 0127, 0128
Para os laboratrios que ainda utilizam a sorotipificao, recomenda-se que
essa tcnica seja feita utilizando-se a mesma tcnica descrita para outras
enterobactrias. Um melhor resultado obtido, repicando-se cerca de cinco colnias caractersticas a partir do gar EMB (Eosin Metilen Blue) ou Mc
55
Conkey, para um tubo contendo gar Nutriente Inclinado, com finalidade de

obter massa de germes. feita ento uma suspenso bacteriana em soluo
salina, a qual ser testada utilizando-se anti-soros polivalentes, abrangendo
os sorotipos mais prevalentes na populao.
Soro Anti E. coli Enteroinvasora (EIEC):
Polivalente A: anti 028ac, 029, 0136, 0144, 0152
Polivalente B: anti 0112ac, 0124, 0143, 0164, 0167
Soro Anti E. coli O 157 (EHEC):
utilizar o soro para O157:H7.
A) Observaes importantes:
Bactrias isoladas com o mesmo padro de provas de materiais nobres
em surtos de infeco relacionada assistncia sade ou isoladas de
infeces da comunidade que possam suspeitar de um surto, ou pela
gravidade da doena, ou por um padro no esperado de resistncia,
devem ser remetidas ao Laboratrio de Referncia para melhor caracterizao.
No caso de bactrias que no se enquadram nos padres definidos acima, recorrer a testes suplementares como os descritos abaixo ou usar
kits com maior nmero de provas ou em caso de importncia clnica
(descritos acima) enviar a Laboratrio de Referncia.
56
BARON, E.J., FINEGOLD, S.M. Bailey and Scotts. Diagnostic Microbiology. 8th Ed. St. Louis,
Mosby,1990.
CHRISTENSEN, W.B. Ureia decomposition as means of differentiating Proteus and paracolon
cultures from each other and from Salmonella and Shigella types. J. Bacteriol, 52: 461-466, 1946.
FARMER III, J.J., KELLY, M.T. Enterobacteriaceae. IN: Balows A.; Hausler, W.J.Jr.; Herrmann, K.L.;
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GARRITY, GMB; DAVID, R; CASTENHOLZ, RW. Bergeys manual of Systematic Bacteriology
Garrity, (Eds.) Second edition Springer 721p.
57
Captulo 4:
Bastonetes Gram-Negativos No Fermentadores
Carlos Emlio Levy
Doroti de Oliveira Garcia
4.1 Introduo
Os bacilos Gram-negativos classificados como no fermentadores (BNFs) so micro-organismos aerbios, no esporulados, que se caracterizam por serem incapazes de
utilizar carboidratos como fonte de energia atravs de fermentao, degradando-os
pela via oxidativa.
A identificao dos BNFs sempre foi um desafio para os laboratrios de rotina em microbiologia, considerando que a maioria deles no realiza esse tipo de identificao,
ou o faz de maneira elementar em virtude da pouca incidncia em amostras ambulatoriais, assim como pela complexidade e elevado custo dos esquemas completos de
identificao.
A caracterizao desse grupo de bactrias de grande importncia nos casos de infeco relacionada assistncia sade. Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter
baumannii na atualidade esto entre as bactrias mais isoladas em hemoculturas e
amostras do trato respiratrio de grandes hospitais. No entanto, os demais BNFs representam um percentual pequeno de isolamentos, quando comparados com outros agentes etiolgicos, mas alguns deles apresentam resistncia elevada a vrios
antibiticos (complexo B. cepacia e S. maltophilia) e so capazes de causar infeces
graves. Essas bactrias colonizam e causam infeces oportunistas, em especial em
pacientes graves oriundos de CTI e submetidos a procedimentos invasivos. Muito h
por se conhecer sobre a importncia clinica, caracterizao laboratorial, taxonomia,
sensibilidade a drogas e patogenicidade desse grupo de micro-organismos, sendo
importante classific-los em nvel de gnero e espcie.
59
O nmero de bactrias no fermentadoras conhecidas muito grande. Foram selecionadas aquelas atualmente consideradas de maior importncia clnica (*) e as demais para diagnstico diferencial entre si.
4.1.1
BNFs de importncia clnica consideradas nesse captulo*:
Acinetobacter spp.*
Alcaligenes spp.*
Achromobacter spp.
Bordetella bronchyseptica
Complexo Burkholderia cepacia*
Elizabethkingia e Chryseobacterium spp.*
Methylobacterium spp.
Moraxella spp.*
Pseudomonas aeruginosa*
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas luteola
Pseudomonas oryzihabitans
Pseudomanas putida
Pseudomonas stutzeri
Burkholderia pseudomallei*
Roseomonas spp.
Stenotrophomonas spp.*
Shewanella spp.
Sphingobacterium spp.
Sphingomonas paucimobilis
4.1.2
Triagem inicial para identificao de rotina dos BNFs

A partir de colnias isoladas em cultura pura com 24-72 horas de crescimento, nos meios de cultura e isolamento primrio, deve-se proceder a realizao das tcnicas de identificao e diferenciao dos BNFs.
Observar se h pigmento da colnia isolada (amarelo, rseo, cor metlica)
4.1.3
Testes necessrios para triagem inicial para identificao de rotina dos BNFs
Tubo com TSI (trplice aucar ferro)
Tubo de TSA (tripticase soja agar)*1 inclinado
Disco de oxidase ou reativo de oxidase
Caldo TSB (tripticase soja caldo) para motilidade em lmina
Colorao de Gram
Semeadura em placa de gar MacConkey
*1 ou outro meio similar, sem adio de corantes para verificar pigmento e manter
o inculo.
Semear uma nica colnia nos meios TSI, TSA e TSB e incubar a 30C por 1624 horas. Realizar colorao de Gram, oxidase, motilidade em lmina a fresco, semear em placa de gar MacConkey*2 e observar o crescimento a 30C
por 24-72 horas, pois alguns BNFs crescem lentamente.
*2 ou considerar o crescimento no primo isolamento, quando utilizado o
gar MacConkey.
60
4.2 Semeadura, leitura e interpretao das provas de identificao

utilizadas na triagem inicial
TSI
Semear com agulha picando at o fundo do tubo e na superfcie do gar inclinado.
Leitura TSI
No fermentador: o meio permanece inalterado, vermelho (alcalino) no pice e na
base.
Verificar a produo de H2S.
Disco de oxidase
Retirar uma alada da massa bacteriana (a partir do TSA), utilizando ala de platina
ou descartvel.
Esfregar sobre a fita ou disco teste; pode umedecer o papel com 1 gota de salina estril.
A leitura feita em 15 a 30 segundos.
A cor violeta forte aparece rapidamente. Complexo Burkholderia cepacia e Stenotrophomonas maltophilia podem dar reao fraca ou lenta, em alguns casos aps 30 segundos.
Reativo de Oxidase
Umedecer um papel de filtro, colocado no interior de uma placa de Petri, com soluo de oxalato de p-aminodimetilanilina a 1%*.
Esfregar uma alada da massa bacteriana (a partir do TSA) no papel de filtro umedecido, utilizando ala de platina ou descartvel.
A leitura feita em 15 a 30 segundos.
A cor prpura forte aparece rapidamente nas amostras oxidase positiva. Complexo
Burkholderia cepacia e Stenotrophomonas maltophilia podem dar reao fraca ou lenta, em alguns casos aps 30 segundos.
*Preparar a soluo e aliquotar em pequenas fraes. Conservar a -20C. Descongelar
apenas no momento do uso.
Caldo TSB Motilidade
Colocar uma gota do caldo com crescimento bacteriano (16-24 horas a 30C) sobre
uma lmina nova.
Cobrir a gota com uma lamnula e levar ao microscpio. Observar com aumento de 400 x.
Motilidade Positiva: presena de bactrias cruzando o campo em diferentes direes
ou girando em torno dela mesma.
Motilidade Negativa: movimentos vibratrios fracos.
Movimento Browniano: Quando o movimento de todas as bactrias numa mesma
direo, provavelmente o movimento do lquido entre a lmina e a lamnula.
Obs: Verificar a motilidade em temperaturas de 37C e 20C (ambiente).
61
Gram
Observar a colorao, morfologia e a disposio das clulas bacterianas.
Grupamento inicial para a identificao dos bacilos gram-negativos no fermentadores mais
frequentemente isolados e de importncia clnica
GNERO
MORFOLOGIA CELULAR
OXIDASE
MOTILIDADE/TIPO
Cresc. em gar
MacConkey
OF GLICOSE
Pseudomonas
Bacilar
+a
+/polar
O/I
Alcaligenes/
Achromobacter
Burkholderia
Stenotrophomonas
Acinetobacter
Bacilar
+/peritrqueo
O/I ou A
Bacilar
Bacilar
Coco bacilarCocide
aos pares
Cocobacilar
+ lento
+ lento
neg
+/polar
+/polar
neg
+
+
+
O
O/I
O/I
neg
Bacilar (pleomrfico)
neg
Moraxella
Elizabethkingia/
Chryseobacterium
exceto P. luteola e P. oryzihabitans que so oxidase negativa

O = oxidativo | I = inerte | A = alcalino | V = varivel | neg = negativo
Observaes:
Produo de H2S em TSI se positivo: suspeita de Shevanella spp.
Colnias bem rugosas, amarelas, oxidase negativa, mveis suspeita de Pseudomonas oryzihabitans e P. luteola
Para visualizao de flagelos vide colorao especfica no final desse captulo.
No caso de identificaes duvidosas, rever:
Motilidade: comum falso negativo; repetir com caldo incubando 6 horas.
Oxidase: reaes duvidosas repetir com repique novo.
4.3 Testes necessrios para a identificao bioqumica dos BNFs aps a

triagem inicial
Tubo de OF* glicose (com vaselina)
Tubo de OF* glicose (sem vaselina)
Tubo com lisina
Tubo com arginina
Tubo com ornitina (complementar em alguns casos)
Tubo controle de aminocidos
Disco de PYR
Caldo TSB crescimento 42C
Tubo gar citrato
Tubo gar ureia
Tubo de caldo indol
Disco de Polimixina
Tubo com gar esculina
Disco de Imipenem
Tubo com gelatina
Placa de DNAse
Tubo com caldo NaCl 6%

* pode ser utilizado o MEVAG (Milieau pour letude de la voie dattaque des glucides) como base para a oxidao-fermentao um meio mais sensvel para a deteco da oxidao de acares, mesmo em quantidades mnimas. Pode ser utilizado com maior eficcia que o OF (vide fascculo de meios de cultura).
62
Semeadura, leitura e interpretao das provas de identificao bioqumica

A partir do crescimento no tubo de TSA (ou similar) utilizado para a realizao da
prova de oxidase, deve-se proceder a realizao de provas de identificao e diferenciao dos BNFs. Se necessrio, semear em mais de um tubo de TSA (ou similar) para a obteno de maior quantidade de massa bacteriana. Preparar uma
suspenso bacteriana em soluo salina a 0,85%, correspondente escala 0,5-1,0
de McFarland.
PROVAS
SEMEADURAS
LEITURA E INTERPRETAO
Tubo de OF
glicose (com e sem
vaselina)
Picar com agulha at o fundo

do tubo
Fermentador: os dois tubos ficam amarelos (cido)

Oxidativo:
tubo sem vaselina amarelo
tubo com vaselina verde
Inerte ou alcalino: dois tubos no mudam de
cor (inerte) ou o tubo sem vaselina fica azulado
(alcalino). Aguardar, no mnimo, 72h para definir
como inerte, pois pode ocorre a oxidao tardia ou
lenta.
Tubo com pedao

de filme com
gelatina
Utilizar um volume da
suspenso bacteriana
suficiente para deixar o
fragmento imerso.
Incubar a 30C. Se negativo, aguardar no mnimo

72h. Se positivo, ocorre precipitado cinza no fundo
do tubo
Placa de DNAse
Semear com ala em spot

(crculo de 1 cm de dimetro)
Adicionar HCl 1N e aguardar 5 minutos

Observar a presena de halo transparente em volta
do inculo positivo enquanto o restante do meio
fica leitoso
Se negativo, repetir o teste com leitura em 72h
Tubo com lisina,

arginina, ornitina,
controle de
aminocidos
Usar inculo denso ou 3 gotas "Comparar os tubos testes dos aminocidos com o
controle negativo
da suspenso bacteriana;
Tubo controle negativo deve ficar azul esverdeado
pode adicionar 2 mL de
plido e as provas positivas ficam de cor prpura
vaselina lquida no tubo com
Se negativo, aguardar at 05 dias
lisina
Ureia
Semear com agulha inculo

denso na superfcie do meio
A cor rosa forte aparece em todo o meio aps 24

a 72 h de incubao. Uma ligeira mudana de cor,
rsea no pice, que no progride aps um tempo
de incubao mais longo, considerada negativa
Bordetella bronchiseptica: reao positiva em 4 h
Citrato de Simmons Semear com agulha na

A cor azul forte aparece no pico, e aps um tempo
superfcie do meio ou uma
de incubao mais longo estende-se a todo o meio
gota da suspenso bacteriana
Caldo TSB
Semear 1-2 gotas da
crescimento a 42C
suspenso bacteriana no
e 44C
caldo
Ocorre turbidez no meio ou ntido o aumento da

densidade bacteriana
Ideal comparar com controle com mesmo inculo
mantido a temperatura ambiente
Tubo com caldo

NaCl 6,5%
A presena de turbidez e mudana de cor indicam

crescimento
Semear 1-2 gotas da

suspenso bacteriana no
caldo
63
PROVAS
Tubo com gar
esculina
SEMEADURAS
LEITURA E INTERPRETAO
Semear com agulha, em estria Ocorre um precipitado negro intenso nas provas
na superfcie do meio
positivas a partir de 6 horas de incubao at 48h
Cor castanho-escuro considerada prova negativa;
a cor deve-se produo de pigmentos por alguns
BNFs
Tubo de caldo indol Inocular 3 gotas da suspenso Colocar 5 gotas de xilol e agitar bem o tubo.
bacteriana no caldo
Adicionar 5 gotas do reagente de Erlich ou Kovacs.
Observar a presena de anel prpura-plido ou
intenso que revelam prova positiva
Discos de
polimixina e
imipenem
Semear com swab (como

para antibiograma) em gar
Mueller Hinton
Colocar os discos
Incubar a 35 2C por 16-24
hs
Polimixina: Qualquer halo em torno do disco

significa sensibilidade. Gnero Burkholderia
intrinsecamente R
Imipenem: S. maltophilia intrinsecamente R
Disco de PYR
Colocar o disco sobre colnias

de crescimento recentes ou
fazer suspenso densa
Depositar 3 a 4 gotas sobre o
disco de PYR
Incubar durante 4 horas numa
placa vazia com umidade
Colocar o disco teste em contato com o

crescimento bacteriano
Coloc-lo sobre uma lmina
Depositar uma gota do reagente que acompanha
o teste
A presena de cor alaranjada prova positiva;
mantendo a cor amarela a prova considerada
negativa
Recomenda-se testar controles positivo e negativo
4.4 Procedimentos para a identificao bioqumica dos BNFs

4.4.1
Resultado do OF-Glicose (OF-G)
Bacilo (cocobacilo) Gram-negativo oxidase negativa: OF-G oxidativo/inerte:

motilidade negativa:
Cocobacilos ou cocos Gram-negativos aos pares
Tabela 1
motilidade positiva:
Bacilos Gram-negativos
Tabela 3 ou 4
Cocos Gram-negativo, oxidase positiva, motilidade negativa, OF-G inerte
Tabela 2
Bacilo Gram-negativo oxidase positiva lenta OF-G oxidativo/inerte, Mveis
Tabela 4
Se pigmento rosa: Tabela 8

Bacilo Gram-negativo oxidase positiva; OF-G oxidativo/inerte/alcalino:
motilidade negativa e pigmento amarelo: Tabela 5
motilidade positiva:
se OF-G Oxidativo seguir
Tabela 6
se TSI com H2S seguir Tabela 7
64
se OF-G Inerte/alcalino, seguir
Tabela8
se pigmento rosa, seguir
Tabela 9
Observaes:
Lisina e ornitina podem ser negativas em 24h e positivar com 48-72h. Rever quando
houver duas reaes positivas, pois raramente ocorrem.
Caldo NaCl 6,5% pode turvar mas no virar o indicador no caso de Alcaligenes (OF glicose
alcalino).
4.4.2
Tabelas de identificao dos BNFs
Tabela 1 Coco-bacilos ou cocos Gram-negativo aos pares, NF, Oxidase negativa e Motilidade negativa
Micro-organismosa
Cresc.
44C
OF-G
Citrato
Gelatina
Hemliseb
A. baumannii/A.
genoespcie 13TU
neg
neg
A. calcoaceticus/A.
genoespcie 3
neg
neg
neg
A. haemolyticus
I/O
neg
A. lwoffii
neg
neg
neg
neg
Complexo
A.baumannii A.
calcoaceticus
colnias lisas, no pigmentadas, semelhantes s de enterobactrias

em gar sangue (prova opcional)
neg= negativo | O= oxidativo | I= inerte
a
Tabela 2 Cocos Gram-negativo (NF), Oxidase positivo, Motilidade negativa, OF-G inerte
Micro-organismos
Urease
Gelatina
Cresc em gar Mac

Conkey
DNAse
Moraxella catarrhalis
neg
neg
neg
Moraxella canis
neg
neg
Psychrobacter phenylpyruvicus/
Oligella ureolytica
positivo
neg
neg
Moraxella lacunata
neg
pos
neg
neg
Moraxella spp.*
neg
neg
neg
* Moraxella spp.: nonliquefaciens, lincolnii, osloensis, atlantae e Oligella urethralis

neg= negativo
V = varivel
Tabela 3 Bacilos Gram-negativo (BNF), Oxidase negativa, Motilidade positiva, OF-G oxidativo, Lisina negativa
Micro-organismos
Lisina
Arginina
DNAse
Pol
Pseudomonas luteola
Neg
Neg
Bem rugosa, pigmento

amarelo, aderente
Pseudomonas
oryzihabitans
Neg
neg
Neg
Bem rugosa, pigmento

amarelo, aderente
neg negativo
Pol polimixina
IPM imipenem
S sensvel
IPM
Caractersticas da colnia
R resistente
65
Tabela 4 Bacilos Gram-negativo (BNF), Oxidase negativa ou positiva lenta, Motilidade positivaa, OF-G oxidativo ou inerte, Lisina positiva
Micro-organismos
Caractersticas da
colnia
Oxidase
Lisina
Arginina
DNAse
Pol
IPM
Complexo
Burkholderia
cepacia
+ lenta
maioria
+
neg
neg
Cremosa, lisa,
algumas com
pigmento bem
amarelo em TSI b
Stenotrophomonas
maltophilia
neg/
+ lenta
93% +
neg
Lisas, amarelo plido

em meio claro
neg= negativo | S= sensvel | Pol= polimixina | R= resistente | V= varivel

a
Complexo B. cepacia pode apresentar fraca motilidade, confundindo com cepas imveis
b
em gar MacConkey tornam-se frequentemente rosa escuro a vermelho devido oxidao da lactose aps incubao
mais longa (4 a 7 dias)
Provas opcionais para as tabelas 3 e 4

Micro-organismos
Esculina
PYR
neg
neg
neg
Complexo B. cepacia
S. maltophilia
Pseudomonas luteola
Pseudomonas oryzihabitans
neg= negativo
V = varivel
Tabela 5 Oxidase positiva, motilidade negativa e OF-G oxidativo, bacilos (BNF) com pigmento amarelo e crescimento em gar MacConkey varivel
Micro-organismos
Indol
DNAse
Pol
Ureia
Elizabethkingia meningoseptica
neg
Chryseobacterium indologenes
neg
neg
Sphingomonas sppa
neg
neg
neg
Sphingobacterium sppb
neg
motilidade ocorre a 18-22C, mas no a 37C; a reao de oxidase geralmente lenta, raramente negativa
S. multivorum, S. spiritivorum e S. thalpophilum
neg negativo V varivel S sensvel R resistente
66
Tabela 6 Bacilos Gram-negativo (BNF), Oxidase positiva, Motilidade positiva, OF-Glicose

oxidativo vide fluxograma para facilitar a interpretao
Pol
Lisina
Arginina
NaCl
6%
Gelatina
Cresc.
a 42C
Caractersticas
da colnia
A. xylosoxidans
neg
13% +
69% +
neg
84% +
No pigmentadas,
lisas, semelhantes
ao Acinetobacter
P. aeruginosa
neg
82% +
Pigmentos
P. fluorescens
neg
neg
Pigmentos
P. putida
neg
neg
neg
Pigmentos
P. stutzeri
neg
neg
neg
Burkholderia
pseudomallei
neg
Complexo B. cepacia
80% +
neg
83% +
pigmento amarelo
(V)
Sphingomonas sppa
neg
neg
neg
neg
pigmento amarelo
Micro-organismos
neg
Seca
mveis em temperatura ambiente b crescimento leve

neg= negativo | S= sensvel | Pol= polimixina | R= resistente | V= varivel
a
Provas complementares para a Tabela 6

Micro-organismos
Esculina
PYR
piocianina
(P)
pioverdina ou
fluorescena(F)
Colorao flagelos*
A. xilosoxidans
subsp. xylosoxidans
neg
neg
neg
Peritrqueo
P. aeruginosa
neg
65% +
Polar (1)
P. fluorescens
neg
neg
96% +
Polar (>1)
P. putida
neg
neg
neg
93% +
Polar (>1)
P. stutzeri
neg
neg
neg
neg
Polar (1)
neg
neg
neg
Polar ( 2)
Complexo B. cepacia
neg
neg
neg
Polar ( 2)
Sphingomonas spp
25% +
neg
neg
Polar (1-2)
B. pseudomallei
a
neg= negativo
V = varivel
* vide consideraes no final do captulo
Tabela 7 BNF, Oxidase, Motilidade e DNAse positivas, com H2S no TSI, OF-G varivel
Micro-organismos
Shewanella putrefaciens
Shewanella algae
Ornitina
NaCl 6,5%
NaCl 0%
43% +
neg
neg
67
Fluxograma Auxiliar para as Tabelas 4, 5 e 6

S. maltophilia
Imipenem R
Lisina
positiva
Complexo B. cepacia
Polimixina R
Negativa
arginina
positiva
negativa
polimixina
polimixina
crescimento 42C
B. pseudomallei
esculina
Complexo
B. cepacia
positiva
negativa
positiva
negativa
PYR
S. paucimobilis
negativa
DNAse
positiva
positiva
negativa
A. xyl subsp xylosoxidans
negativa
P. stutzeri
(colnia seca)
positiva
P. fluorescens
negativa
Colorao de flagelos
Peritrqueo
A. xyl subsp xylosoxidans
68
positiva
P. putida
P. aeruginosa
S.putrefaciens
TSI= H2S +
Gelatina
Produo de
pigmentos
Polar
P. aeruginosa
Tabela 8 BNF Oxidase positiva, Motilidade positivo, OF-G inerte/alcalino
Micro-organismos
Ureia
NaCl
6,5%
DNAse
Gelatina
PYR
Colorao de
flagelosa
Achromobacter denitrificans
neg
75% neg
neg
neg
Peritriqueo
Alcaligenes faecalis
neg
neg
78%neg
neg
Peritrqueo
Bordetella bronchiseptica
++
+b
neg
neg
neg
Peritrqueo
S. maltophilia c
neg
78% neg
93% +
neg
Polar (> 2)
provas complementares | turva o meio, mas no muda a cor do indicador | raramente pode ser oxidase positiva
b
Tabela 9 Bacilos e coco-bacilos Gram-negativos no fermentadores (NF), Oxidase positiva

ou positiva fraca, OF-G varivel, com pigmento rseo
Motilidade
Morfologia
Urease
Cresc em
gar Mac
Conkey
Cresc.
a 42C
Caractersticas
das colnias
Methylobacterium
spp.
Bacilos
23% +
neg
neg
Colnia seca coral
Roseomonas spp.*
Cocobacilos
Colnias
mucides rosadas
Microorganismos
* oxidase positiva fraca (geralmente aps 30s) ou oxidase negativa
4.5 Tabelas complementares de consulta para identificao de BNFs

contendo mais provas e Gneros e espcies menos frequentes
Cocobacilos Gram-negativos, Oxidase e motilidade negativos
OF-G
Cresc. a
44C
Citrato
Malonato
Gelatina
Hemlise em
gar sangue
A. baumannii/A.
genoespcie 13TU
neg
neg
A. calcoaceticus/A.
genoespcie 3
neg
neg
neg
I/O
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
I/O
neg
Micro-organismos
Complexo A.
baumannii
A. calcoaceticus
A. haemolyticus
A. lwoffii
Acinetobacter spp.
O= oxidativo | I= inerte | neg= negativo | V= varivel
69
Bacilos Gram-negativos (BNFs), Oxidase negativa ou positiva lenta,

Motilidade positiva, crescimento em gar MacConkey positivo
Micro-organismos
Oxidase
OF-G
IPM
POL
Esculina
DNAse
Lisina
Arginina
Cr 42C
P. luteola
neg
neg
neg
94% +
P.oryzihabitans
neg
neg
neg
neg
14% +
33% +
S. maltophilia
neg/+ lenta
85% o
39% +
93% +
neg
48% +
Complexo B. cepacia
neg/+ lenta
63% +
neg
80% +
neg
83% +
IPM = imipenem | POL = polimixina | neg = negativo | O = oxidativo | S = sensvel | R = resistente | V = varivel
Bacilos Gram-negativos (BNF), Oxidase positiva, Motilidade negativa,

OF-G oxidativo, crescimento em gar MacConkey varivel
Micro-organismos
Motilidade
OF-G
Ureia
Indol
DNAse
POL
Elizabethkingia. meningoseptica
neg
O lento
neg
C. indologenes
neg
O lento
neg
neg
Sphingomonas spp.
neg*
neg
neg
neg
Sphingobacterium spp.
neg
neg
* pode ser positiva a 20C

POL polimixina | neg negativo | O oxidativo | S sensvel | R resistente | V varivel
Oxidase positiva, Motilidade negativa, OF-G inerte e cocoide

Ureia
Gelatina
DNase
Cresc em gar
MacConkey
M. catarrhalis
neg
O lento
neg
M. canis
neg
O lento
neg
neg
M. lacunata
neg
neg
neg
Moraxella spp. * raras
neg
neg
neg
Micro-organismos
Psychrobacter phenylpyruvica/
Oligella ureolytica
neg = negativo | V = varivel
Bacilos Gram-negativos (BNFs), Oxidase positiva, Motilidade positiva e

OF-G inerte ou alcalino, crescimento em gar MacConkey positivo
Micro-organismos
Morfologia
Ureia
Citrato
Reduo
Nitrato
Nitrato/
gs
Cresc a
42C
Colorao de
flagelos
Achromobacter denitrificansa
Bacilo
neg
Peritriqueo
Achromobacter piechaudiia
Bacilo
neg
neg
Peritriqueo
Bacilo
neg
neg
neg
Peritriqueo
cocobacilo
++
neg
Peritriqueo
Bacilo
neg
neg
Polar (> 2)
P. pseudoalcaligenes
Bacilo
neg
neg
neg
Polar (1)
P. alcaligenesb
Bacilo
neg
54% +
neg
neg
Polar (1)
Alcaligenes faecalis
a
B. bronchiseptica
Comamonas sppb
b
a
b
70
OF-G alcalino
OF-G inerte
Bacilos Gram-negativos (BNFs), Oxidase positiva, Motilidade positiva e OF-G oxidativo

Cresc em
MC
Cresc a
42C
Gelatina
Esculina
POL
Lisina
Arginina
Colorao de
flagelos
A. xilosoxidans subsp
xylosoxidans
84% +
neg
neg
neg
Peritrqueo
P. aeruginosa
82% +
neg
neg
Polar (1)
P. fluorescens
neg
neg
neg
Polar (>1)
P. mendocina (rara)
neg
neg
neg
Polar (1)
P. putida
neg
neg
neg
neg
Polar (>1)
P. stutzeri
69 %
+
neg
neg
neg
neg
Polar (1)
Sphingomonas spp.
neg
neg
neg
NT
NT
Polar (1-2)
Complexo B. cepacia
neg
Polar
B. pseudomallei
neg
Polar (2)
S. putrefaciens
neg
neg
neg
Polar (1-2)
Micro-organismos
NT= no testado (no citado na literatura) | V= varivel | neg= negativo | MC= gar MacConkey | POL= polimixina
Bacilos Gram-negativos (BNFs), oxidase positiva, OF-G varivel, ureia positiva, com pigmento rosa
Motilidade
Morfologia
Cresc em gar
MacConkey
Cresc a
42C
Methylobacterium
spp.
Bacilo
neg
neg
Colnia seca, coral,

bacilos com vacolos
Roseomonas spp.
Cocobacilo
Colnias mucides,
rosadas, cocobacilos
Micro-organismos
Caractersticas das colnias
neg= negativo | V= varivel
4.6 Colorao de flagelos (Clark, 1976)

A colorao de flagelos pelo mtodo de Leifson pode ser uma prova complementar
muito til em casos de identificao de P. aeruginosa no produtora de pigmentos,
que pode ser confundida com A. xylosoxidans subsp. xylosoxidans e tambm nos casos de bactrias OF-inerte ou alcalino.
Componentes do corante:
NaCl
0,5 g
cido tnico
1,0 g
Acetato p-rosanilina ou acetato de sdio
P-rosanilina HCl
0,1 g
o
lcool etlico 95 33 mL
H2O destilada
67 mL
0,3 g
71
Os corantes so colocados em um becker e dissolvidos aos poucos no lcool com a

ajuda de um basto. Em outro becker, dissolver o NaCl e o cido tnico na gua. Misturar as duas solues e deixar na geladeira em frasco bem fechado. Agitar durante
4-5 dias para dissolver bem o corante. Aps esse perodo est pronto para uso. Aliquotar em pequenas fraes e armazenar a 5o C (semanas) ou a -10o C/-20o C (meses).
Agitar antes de usar.
Tcnica:
As lminas devem estar bem limpas, livres de gordura. Lavar as lminas com sabo
neutro, enxaguar muito bem, sem toc-las com as mos, e deix-las imersas em lcool por pelo menos 3 dias, trocando o lcool diariamente.
Preparo do inculo:
Semear a cepa a ser testada em um tubo grande de TSA inclinado, de preferncia
com gua de condensao (pode ser adicionado em torno de 1 mL de soluo salina
fisiolgica a 0,85% no fundo do tubo). Incubar a 30C por 16-24 hs.
Com o auxlio de uma pipeta Pasteur, cuidadosamente, retirar a suspenso bacteriana que se formou no fundo do tubo atravs de capilaridade (no aspirar, pois pode
haver quebra dos flagelos). Introduzir cuidadosamente essa suspenso em um tubo
grande inclinado, com 10 mL de gua destilada estril. Deixar descansando por 10
minutos, mantendo o tubo inclinado, sem moviment-lo.
Segurar a lmina inclinada e colocar uma gota da suspenso na parte superior da
lmina. Deixar que a gota escorra lentamente at o fim da lmina para que no arrebente os flagelos.
Deixar a lmina secar naturalmente e corar.
Cobrir a lmina com o corante por 10-15 minutos. Cobrir com gua destilada at retirar o excesso do corante.
Deixar a lmina secar naturalmente e observar ao microscpio tico no aumento de
1.000 x.
Obs: os flagelos geralmente encontram-se no final da lmina.
72
CLARK, W.A. A simplified Leifson flagella stain. J Clin Microbiol. 3: 632-634, 1976.
HUGH, R. & LEIFSON, E. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative
metabolism of carbohydrates by various gram negative bacteria. J Bacteriol 66: 24-26, 1953.
KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; JANDA, W.M.; SCRECKENBERGER, P.C.; WINN, W.C. Diagnostic
Microbiology 6a ed., 2006.
LAFFINEUR, K.; JANSSENS, M.; CHARLIER, J.; AVESANI, V.; WAUTERS, G.; DELME. Biochemical
ans susceptibility tets useful for identification of nonfermenting Gram-negative rods. J. Clin.
Microbiol., 40(3):1085-1087, 2002.
MACFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of medical Bacteria. Third ed. Lippincott
Williams& Williams PA USA, 912 p, 2000.
MURRAY, P. R. et al. Manual of Clnical Microbiology. American Society for Microbiology. 9th
ed., 2007.
73
Captulo 5:
Bacilos Curvos ou Espiralados e outros Relacionados de
Importncia Clnica
Carla Taddei de Castro Neves
Carlos Emlio Levy
5.1 Introduo
Esse captulo apresenta os principais bacilos curvos ou espiralados de importncia
clnica, relacionados s principais patologias, fontes de infeco e recursos diagnsticos para sua caracterizao. Por se tratar de agentes raros, com exceo dos Campylobacter spp., no sero abordados em profundidade, devendo o microbiologista encaminhar a cepa isolada para Laboratrio de Referncia ou consult-lo sobre recursos
disponveis para tentativa de isolamento.
5.1.1
Principais bactrias curvas ou espiraladas
Agente
Arcobacter spp.
Borrelia burgdorferi
Borrelia recurrentis
Campylobacter coli/
jejuni
Campylobacter fetus
Helicobacter pylori
Helicobacter spp.
Leptospira spp.
Treponema
pallidum
Vibrio spp.
Doena
Bacteremia, gastroenterite,
endocardite e peritonite
Doena de Lime
Febre recorrente
epidmica
Reservatrio
Gado, humanos, animais
domsticos
Roedores
Humanos
Transmisso
Alimentos 1, fecal-oral.
Gastroenterite
Carnes contaminadas
(frango), leite e gua
Humanos
Fecal-oral
Carrapatos
Sarna (P.humanus)
Alimentos 1, fecal-oral
Bacteremia, infeco
extraintestinal
Gastrite, lcera pptica,
cncer gstrico
Gastroenterite,
bacteremia, etc.
Leptospirose
Sfilis
Humanos, macacos, gatos
Alimentos 1, Fecal-oral
Animais domsticos,
humanos.
Ces, gatos, porcos, ratos
Humanos
Fecal-oral, alimentos
Clera, gastroenterite
Alimentos, gua
Alimentos-gua 2
Sexual,
transplacentria
Alimentos 1, fecal-oral
1 Ingesto de alimentos e gua contaminados

2 Ingesto ou exposio a alimentos ou gua contaminados com urina de animal infectado
75
5.1.2
Recursos diagnsticos
Agente
Testes *
Arcobacter spp.
Microscopia: bacilos Gram-negativos curvos ou helicoidais.

Cultura: cresce entre 15 a 30oC, em ambiente de microaerofilia, em meio seletivo,
como CAMPY-CVA.
Sorologia: No disponvel.
Ensaio Molecular: PCR utilizando iniciadores especficos.
Microscopia: espiroquetas visualizadas por colorao de prata de Warthinneg Starry ou
complexadas com anticorpos marcados por fluorescena, em bipsia de leses de pele
ou tecidos.
Cultura: meio BSK II em ambiente de microaerofilia, entre 30-37oC por 6 semanas.
Sorologia, Imunofluorescncia e ELISA.
Ensaio Molecular: uso de sondas especficas ou PCR.
Microscopia: espiroquetas coradas por Giemsa ou Wright, em amostras de sangue
colhidas em picos febris.
Cultura: igual de B. burgdorferi.
Microscopia: bacilos finos e curvos, fracamente corados por Gram (Gram-negativo).
Cultura: cresce a 37 e 42C em ambiente de microaerofilia, em meio
seletivo como Campy-CVA.
Microscopia: bacilos finos e curvos, fracamente corados por Gram (Gram
negativo).
Cultura: cresce a 37 e 42C em ambiente de microaerofilia, em meio
seletivo como Campy-CVA.
Microscopia: bacilos curvos ou espiralados, detectados em bipsia gstrica corada por
H&E, Giemsa, colorao pela prata de Warthin-Starry ou Gram (Gram-negativo).
Recurso rpido: teste da urease em bipsia gstrica (sensibilidade>90%).
Cultura: cresce em meios seletivos ou no em microaerofilia a 37oC por 5-7dias.
Sorologia: til para determinar doena ativa por Enzima-Imunoensaio.
Microscopia: Bactrias estreitas, flexveis, enroladas em espiral, com as extremidades
em forma de gancho, detectadas no sangue, LCR e urina, por microscopia em campo
escuro (baixa sensibilidade), por imunofluorescncia direta ou colorao pela tcnica
de impregnao pela prata (Fontana).
Cultura: primeiros 10 dias de doena LCR e sangue colhido com heparina em meio de
Fletcher incubado temperatura ambiente por 2 a 16 semanas. Cultura do sedimento
urinrio alcalinizado aps a 1 semana da doena.
Sorologia: aglutinao ou ELISA so sensveis e especficos.
Ensaio Molecular: PCR.
Microscopia: espiroquetas longas e finas, com espiras rgidas e regulares, observadas
em microscopia de campo escuro ou colorao pela prata (Fontana) de esfregaos de
linfa de leses. Testes de imunofluorescncia direta so mais sensveis.
Sorologia: testes no treponmicos (VDRL) ou testes treponmicos (FTA-abs) so
muito teis para diagnstico.
Microscopia: Bacilos Curvos Gram Negativos, em forma de vrgula
Cultura: enriquecimento em gua Peptonada. Crescimento em gar TCBS diferencia
as espcies V. cholerae e V. fluvialis (colnias amarelas) de V. parahaemolyticus e V.
mimicus (colnias verdes).
Sorologia: aglutinao
Ensaio Molecular: PCR utilizando iniciadores especficos
B. burgdorferi
(doena de
Lyme)
Borrelia spp.
Campylobacter
coli e C. jejuni
C. fetus
Helicobacter
pylori
Leptospira spp.
Treponema
pallidum
Vibrio spp.
* Recursos no citados: no teis ou no disponveis

BSK II = meio de Barbour Stoenner-Kelly
Campy-CVA= Meio seletivo para Campylobacter com cefoperazona, vancomicina e anfotericina.
PCR: Reao da Polimerase em Cadeia
76
5.2 Campylobacter
Em caso de gastroenterite, as fezes so preferencialmente coletadas para isolamento
de espcies de Campylobacter, porm, swabs retais tambm so aceitveis para cultura.
As amostras devem ser enviadas rapidamente ao laboratrio ou em meio de transporte
de Cary-Blair semi-slido. Em amostras de sangue colhidas em meios convencionais,
essas podem suportar o crescimento do C. fetus que a espcie que causa com maior
frequncia infeces extraintestinais.
A colorao de Gram deve usar no lugar da safranina a carbol-fucsina ou fucsina bsica a 0,1% durante 2 minutos. Exame de fezes costuma revelar presena de leuccitos,
mas a ausncia no contraindica a cultura ou a suspeita diagnstica. O Gram das fezes tem sensibilidade entre 70 a 90% e elevada especificidade.
A maioria das espcies de Campylobacter exige microaerofilia contendo cerca de 5%
de O2, 10% de CO2 e 85% de N2, obtidos com geradores especficos e no apenas com
vela. Para aumentar a chance de isolamento em fezes recomenda-se a filtrao das
fezes em filtro de acetato de celulose >0,45 m. Vrios so os meios de cultura especficos para coprocultura por serem seletivos, sendo na atualidade os mais recomendados o gar Carvo Desoxicolato Cefoperazona, o meio Campy CVA (Cefoperazona,
Vancomicina e Anfotericina) e o meio de Karmali (base de Columbia gar, carvo ativado e suplemento de antibiticos).
Amostras de hemocultura devem ser repicadas em meios no seletivos com geradores para microaerofilia. Fazer o teste de crescimento a 25, 37 e 42oC (todos
crescem a 37oC). No exame direto em gota direto no microscpio entre lmina e
lamnula pode-se observar a motilidade tipo hlice em movimento.
As provas de crescimento devem ser feitas em gar Mueller Hinton com 5% de sangue de carneiro em microaerofilia. O teste de sensibilidade ao cido nalidxico e cefalotina pode ser feito em qualquer meio no seletivo e ser considerado sensvel
presena de qualquer tamanho de halo.
77
Principais espcies de Campylobacter e Arcobacter

Bactria
Catalase
H2S-TSI
Cresc.
15oC
Cresc.
25oC
Cresc.
42oC
Mac
Conkey
cido
Nalidixico
Cefalotina
C. jejuni
neg
neg
neg
neg
sensvel
ou
resistente
resistente
C. coli
neg
neg
neg
neg
sensvel
resistente
C. fetus
neg
neg
neg
neg
sensvel
ou
resistente
sensvel
Campylobacter
spp.
varivel
neg
neg
neg
sensvel
ou
resistente
sensvel
Arcobacter
neg
varivel
varivel
sensvel
varivel
* C. lari = resistente
5.3 Vibrios, aeromonas e plesiomonas

A suspeita da presena de Vibrio, Aeromonas e Plesiomonas evidenciada pelo:

Isolamento de bactria Gram negativa fermentadora da glicose (TSI fermentador) e oxidase positiva.
Materiais clnicos que podem, eventualmente, ser associados com maior frequncia de isolamentos de Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas.
Principais bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva e sua associao com diferentes
quadros clnicos:
Bactria
Diarreia
Infeces partes Moles
Sepse
Outros
V. cholerae
V. parahaemolyticus
frequente
pouco comum
Raro
Raro
P. shigeloides
frequente
Raro
frequente
Raro
A. hydrophila
frequente
frequente
frequente
frequente
A. caviae
frequente
Raro
frequente
frequente
A. veronii
frequente
Raro
frequente
frequente
5.3.1
78
Vibrio
As espcies do Gnero Vibrio so bacilos curvos ou s vezes retos, longos,
anaerbios facultativos, mveis, fermentadores da glicose, em geral sem
produzir gs, e oxidase positivas. Alm do Vibrio cholerae, existem mais de 10
espcies patognicas para o ser humano. Algumas espcies podem causar
gastroenterite, outras infeces cutneas e bacteremias.
A clera causada pelo V. cholerae produtor da toxina CT (toxina colrica),

responsvel por diarreia secretria intensa. O bacilo disseminado por via
fecal-oral (gua e alimentos contaminados) em surtos e epidemias associadas falta de condies sanitrias adequadas. O quadro clnico pode variar
de assintomtico diarreia aguda com morte em 5 horas por desidratao
e distrbio eletroltico. Casos espordicos podem ocorrer por ingesto de
ostras e outros pescados crus ou mal cozidos.
O material utilizado para identificao do agente deve ser preferencialmente, fezes, porm, amostras de swab retal ou de vmitos podem ser utilizadas.
A coleta do material quando for fecal dever ser feita utilizando o meio de
transporte de Cary Blair, e as cepas suspeitas ou confirmadas de Vibrio devero ser encaminhadas a Laboratrio de Referncia, para registro epidemiolgico.
Algumas outras espcies de Vibrios alm do V. cholerae necessitam de NaCl
para crescimento. gar sangue e Mac Conkey permitem o crescimento da
maioria das espcies, e nesse ltimo meio as colnias so semelhantes s de
bastonetes no fermentadores. A diferena que no TSI, EPM ou IAL h fermentao da glicose, como ocorre tambm com Aeromonas e Plesiomonas.
So oxidase positivas, a maioria esculina negativa, DNAse positivo e quase
todos crescem em caldo com NaCl 6%.
Em casos de surtos ou em regies onde a clera endmica, a triagem das
amostras e confirmao do gnero pode ser realizada utilizando um meio
seletivo para Vibrio, como o gar TCBS (tiossulfato-citrato-sais biliares-sacarose). Cepas de V. cholerae fermentam a sacarose e aparecem como colnias
amarelas e cepas de V. parahemolyticus no fermentam a sacarose e aparecem como colnias verdes.
5.3.2
Aeromonas e plesiomonas
Vivem em ambientes aquticos em todas as partes do mundo. Podem ser encontradas em gua de fonte, gua de lagos, guas poludas, etc. Plesiomonas
preferem guas tropicais e no marinhas, sendo a Aeromonas mais tolerante
s diferentes condies ambientais. Aeromonas tm sido isoladas em carnes,
meio ambiente aqutico e produtos do mar, e suas diferentes espcies causam doenas no s no homem como em animais, peixes, rpteis, cobras e
pssaros.
Em nossa experincia comum o isolamento de Aeromonas em abscesso
ps-picada de cobra, lquido biliar em pacientes com colicistite, diarreia, sepse (em pacientes com doena heptica crnica) e abscessos cutneos ps79
-acidentes (corto-contusos) em lagos, tanques, etc. A chance de detectar Aeromonas e Plesiomonas depende da adoo do procedimento em se fazer o
teste da oxidase em bactrias com caractersticas de Escherichia coli lactose
negativa.
As principais caractersticas das Aeromonas so: lactose negativa, H2S negativo, fenilalanina negativa, indol positivo, motilidade positiva, e crescem
bem em meios ricos e seletivos, como gar Mac Conkey e gar Salmonella-Shigella.
Principais provas diferenciais entre Aeromonas spp., E. coli e Citrobacter spp.
Citrato
Ureia
Lisina
H2S
Lactose
Gs
Neg
Neg
Neg
Varivel
Citrobacter spp.
Varivel
Neg
Varivel
Varivel
Aeromonas spp.
Varivel
Neg
Neg
Neg
Varivel
Bactria
E. coli
1 Aeromonas caviae: lisina negativa e lactose positiva
Provas diferenciais para bactrias fermentadoras da glicose,

oxidase positiva: Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio
V. cholerae
Outros vibrios
Aeromonas spp.
Plesiomonas spp.
Cresce sem NaCl1
Neg
Cresce com 6% NaCl1
Neg
Neg
Oxidase
DNAse
Neg
Provas
1 crescimento em caldo nutriente

2 exceto V. mimicus
Provas para diferenciar as principais espcies de Aeromonas e Plesiomonas

Bactrias
Indol
LIS
ARG
ORN
ARA
LAC
ESC
HEM
A. hydrophila
Positivo Positivo Positivo
Neg
Positivo Varivel Positivo Positivo Positivo
A. caviae
Varivel
Positivo
Neg
Positivo Varivel Positivo Positivo
A. sobria
Neg
Neg
Neg
Positivo
A. veronii
Positivo Positivo
Positivo
Neg
Neg
A. jandaei
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Positivo
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Varivel
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
A. schubertii
P. shigelloides
Neg
Neg
Neg
Positivo Positivo
Positivo Positivo Positivo Positivo
LIS = lisina ARG = arginina ORN = orninina ARA = arabinose LAC = lactose SAC = sacarose
ESC = esculina HEM * = hemlise/sangue carneiro
80
SAC
Neg
Neg
Positivo
WINN,J.Jr.; ALLEN, S.; JANDA, W.M.; KONEMAN, E.; PROCOP, G.; SCHRENKENBERGER, P.C.
MURRAY, P. R. et al. Manual of Clinical Microbiology. 9th ed. Washington DC. American
Society for Microbiology ASM Press 2007., 2256p
MURRAY, P. R. et al. Manual of Clinical Microbiology. 10th ed. Washington DC. American
Society for Microbiology ASM Press 2010., 2252p
81
Captulo 6:
Bacilos Gram Positivos
Ana Luza de Mattos Guaraldi
Carlos Emlio Levy
6.1 Introduo
Esse captulo aborda diversos aspectos prticos para identificao dos seguintes gneros de Bacilos Gram-positivos (BGPs) de importncia clnica:
Irregulares (Corineformes)
Arcanobacterium, Corynebacterium, Cellulosimicrobium, Gardnerella,

Oerskovia, Rothia
Regulares
Erysipelothrix, Listeria
Esporulados
Bacillus
Ramificados (Actinomicetos)
Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces
Alguns BGPs que so citados no texto para fins de diagnstico diferencial e foram
abordados detalhadamente em outros captulos incluem as micobactrias e os anaerbios estritos e/ou facultativos pertencentes aos gneros Actinomyces, Bifidobacterium, Clostridium, Eubacterium, Lactobacillus, Mobilluncus, Propionibacterium.
6.2 Orientao geral para a identificao de BGPs

O significado clnico do isolamento de BGPs altamente dependente do contexto do
isolamento da amostra. Assim como para os demais patgenos humanos, mais do que
um retrato do crescimento nas placas de Petri de BGPs, o laudo microbiolgico deve ser
o resultado de uma leitura interpretativa e crtica. O microbiologista na sua rotina diria
para decidir a importncia dos BGPs isolados deve considerar o potencial patognico
do agente e os dados clnicos do paciente. A comunicao e interao entre o laboratrio de microbiologia e o mdico bastante til.
83
84
Materiais clnicos oriundos de stios estreis (sangue, LCR, lquido pericrdico,

urina) assim como de regies anatmicas contaminadas, bipsias, escarro, LBA,
abscessos ou feridas devem ser valorizados, desde que os quadros clnicos sejam
compatveis.
Valorizar o achado em pacientes imunocomprometidos, incluindo idosos, portadores de neoplasias ou do vrus HIV. Valorizar tambm os achados em pacientes
imunocompetentes uma vez que diversas espcies de BGPs tambm podem causar infeces graves, e por vezes fatais, em indivduos previamente sadios.
O material deve ser colhido a partir do stio da infeco e com anti-sepsia
rigorosa para evitar contaminao.
Mesmo em lquidos estreis h risco de contaminao, por isso solicita-se a coleta
de no mnimo duas hemoculturas.
Realizar exame microscpico pela colorao de Gram diretamente do material clnico descrevendo aspectos qualitativos e quantitativos possibilitar verificar se h
predomnio do agente em questo e presena de clulas inflamatrias e de micro-organismos no interior de macrfagos/neutrfilos.
No LCR o resultado do Gram do sedimento e a presena de neutrofilia reforam a
hiptese de ser agente infeccioso.
Fazer colorao de Ziehl-Neelsen ou de Kinyoun, uma vez que o laboratrio deve
ficar atento para o isolamento de BGPs como Rhodococcus e Nocardia que exibem
graus variados de lcool-cido resistncia.
Utilizar meios de cultura ricos alm de meios seletivos que permitam o crescimento e isolamento do BGP em questo. As condies de incubao devem ser observadas atentamente, uma vez que a maioria dos BGPs requer um mnimo de 48
horas de incubao para o crescimento em meios ricos tais como o gar sangue
de carneiro.
Observar caractersticas da colnia: pigmento, tamanho, cheiro, consistncia, hemlise. Para observar esporos e hifas areas algumas vezes necessrio deixar a
colnia envelhecer ou crescer em meios pobres.
Lembrar que esse grupo de micro-organismos pode variar muito quanto s caractersticas morfolgicas, de acordo com o material clnico, culturas jovens ou
velhas, meios slidos ou lquidos, meios ricos ou pobres, sem que represente contaminao ou cultura mista.
sempre interessante fazer repiques em meios slidos e lquidos para observar
variaes na morfologia celular, particularmente quando frente a amostras de cocobacilos e BGPs ramificados.
Considerar o nmero de espcimes clnicos de que foram isolados BGPs.
Alguns desses BGPs so habitantes de pele e mucosas e podem causar infeco
mista associada ou no com anaerbios estritos.
Nos casos de isolamento de mais de um tipo de micro-organismo, considerar se
ocorre predominncia ou co-predominncia de BGPs alm do tipo, nmero relativo e patogenicidade dos outros micro-organismos associados.
Em casos de abscessos interessante fazer semeadura quantitativa (com ala calibrada), sendo sugestivo o isolamento em cultura pura ou >104 UFC/mL.
Em urina, sugestivo quando isolado como nico agente, bacterioscopia concordante, leucocitria, sintomas de infeco urinria e contagem > 102-4 UFC/mL,
dependendo da idade e das condies imunolgicas do paciente. Em casos de
infeces mistas sugestivo quando isolado como agente predominante e/ou
contagem > 105 CFU/mL.
Quadros clnicos relevantes associados aos bacilos gram-positivos

Bactria
Quadros clnicos
Arcanobacterium
Faringite, pneumonia, infeco de partes moles, pielonefrite, artrite sptica,

septicemia, endocardite e meningite
Bacillus
Antraz, intoxio alimentar, septicemia e pneumonia
Cellulosimicrobium
Septicemia neonatal, artrite sptica, tenossinovite e endoftalmite ps-trauma
Corynebacterium
Difteria, pneumonia, infeco urinria, infeco por cateter e de ferida cirrgica,

septicemia, endocardite, peritonite, osteomielite e meningite
Erysipelothrix
Celulite, septicemia e endocardite
Gardnerella
Vaginose, endometrite ps-parto e infeco urinria
Lactobacillus
Septicemia, endocardite, peritonite, meningite e abscessos
Leifsonia
Septicemia, peritonite, infeco urinria e meningite
Listeria
Meningite, septicemia e aborto
Nocardia
Infeco invasiva pulmonar, septicemia, abscesso cerebral, infeco

linfocutnea e cutnea superficial (micetoma, abscesso, celulite) e endocardite
Oerskovia
Endocardite, bacteriemia, meningite, peritonite, nefrose e endoftalmite
Rhodococcus
Infeco pulmonar (pneumonia piogranulomatosa e cavitao, abscesso

e malacoplaquia), septicemia, abscesso cerebral e heptico, osteomielite e
pericardite
Rothia
Endocardite, septicemia, pneumonia, aneurisma mictico, peritonite e

osteomielite
Turicella
Otite mdia, mastoidite e bacteriemia
Streptomyces
Micetoma, pneumonia, bacteremia, pericardite e endocardite
85
6.2.1
Triagem inicial para bacilos gram-positivos
Bactria
Actinomyces
Arcanobacterium
Bacillus
Cellulosimicrobium
Corynebacterium
Esporo
+
-
AAR*
-
Ramif.
v
v
-
Hemlise*
beta
v
v
Catalase
v
+
+
+
Observaes
Alguns aerotolerantes
Pleomrfico
Mobilidade V
Penetrao no gar
Pleomrfico; imvel
Crescimento de 5 a 42oC;
Erysipelothrix
alfa
pH 6,7 a 9,2; H2S positivo
Gardnerella
beta**
Gram-lbil
Listeria
beta
+
Mobilidade a 25-28 oC
Hifas; crescimento em
Nocardia
+
+
+
lisozima
Oerskovia
v
+
Penetrao no gar
Propionibacterium
+
v
Alguns aerotolerantes
Formas cocoides;
Rhodococcus
+
v
+
pigmento coral
Rothia
+
v
Pleomrfico
Streptomyces
+
+
Hifas
V, varivel; AAR, lcool-acido resistncia fraca ou parcial; Ramif., clulas ramificadas; *, sangue carneiro; **,
sangue de coelho ou humano a 3%
6.3 Corineformes
Os bastonetes gram-positivos irregulares (BGPIs) ou corineformes formam um grupo
bastante heterogneo morfologicamente e com poucas caractersticas bioqumicas
em comum.
Arcanobacterium
Microbacterium
Exiguobacterium
Corynebacterium
Brevibacterium
Rothia
Leifsonia
Dermabacter
Cellulosmicrobium
Arthrobacter
Oerskovia
Gardnerella
Curtobacterium
Cellulomonas
Turicella
A) Dentre os corineformes esto os seguintes gneros:

A reclassificao taxonmica desse grupo de micro-organismos frequente conforme aumenta o grau de conhecimento relativo a suas caractersticas fenotpicas e genotpicas, portanto, dificultando a valorizao microbiolgica e clnica do isolamento,
a escolha do esquema de identificao para o diagnstico laboratorial, a identificao de gnero e espcies alm da antibioticoterapia.
86
Nitrato
Ureia
Esculina
Glicose
Maltose
Sacarose
Manitol
Xilose
Arcanobacterium
Arthrobacter
Brevibacterium
Cellulomonas
Cellulosmicrobium
+
+
+
+
F
O
O
F
F
v
v
-
v
v
+
+
v
-
v
v
+
+
+
v
v
+
+
v
v
v
+
+
v
v
v
+
+
v
v
-
v
+
+
Corynebacterium
Dermabacter
Gardnerella
Leifsonia
+
+
+
+
F/O
F
F
O
v
v
v
-
v
+
v
v
+
+
+
v
+
+
v
v
+
v
v
v
+
v
v
+
Microbacterium
Oerskovia
v
+
F/O
F
v
v
v
+
v
-
v
+
+
+
+
+
v
+
v
-
v
+
Rothia
v F
- + - + + + +
F, fermentao; O, oxidao; +, positivo; -, negativo; v, varivel
Catalase
Mobilidade
Metabolismo
Oxidativo/
fermentativo
Em virtude da relevncia clnica, recomendvel caracterizao e provas diferenciais

para os seguintes gneros:
Gnero
6.3.1
Outras
Odor de corpo ou queijo

Penetrao em gar;
xantina positiva
Bacilos curtos
Gram-lbil
Pigmento amarelo;
DNAse-positiva;
Crescimento em 6,5% NaCl V
Penetrao em gar;
xantina negativa
Aderncia ao gar V
Corynebacterium
Atualmente, o gnero Corynebacterium composto de 110 espcies, sendo
aproximadamente 40 dessas consideradas de relevncia mdica. Alm das
corinebactrias produtoras de toxina, que so patgenos obrigatrios para
humanos e/ou animais (C. diphtheriae, C. ulcerans e C. pseudotuberculosis), diversas outras espcies podem fazer parte da microbiota anfibintica normal
humana e/ou atuar como patgenos oportunistas.
As infeces humanas causadas pelas corinebactrias vm adquirindo crescente importncia tanto em pases industrializados quanto em desenvolvimento, e podem levar ao bito tanto pacientes imunocomprometidos quanto imunocompetentes.
O aparecimento de amostras multirresistentes aos antimicrobianos utilizados no tratamento e o aumento do nmero de casos de infeces de origens
diversas, por vezes culminando em bito, tm contribudo para aumentar o
interesse pelas corinebactrias.
Dentre os fatores predisponentes s infeces pelas corinebactrias oportunistas destacam-se os estados de malignidade, idade avanada, transplantes,
87
Aids, diabetes, neutropenia, hospitalizao e/ou antibioticoterapia por perodo prolongado alm de procedimentos invasivos (cateterismo, implantes e
vlvulas). Em alguns casos, difcil a distino entre colonizao e infeco.
Embora a maioria das infeces graves por corinebactrias multiresistentes
seja atribuda ao C. jeikeium, tm sido descritos quadros de infeces por
amostras multiresistentes de outras espcies, incluindo C. urealyticum, C.
striatum, C. amycolatum, C afermentans e C. pseudodiphtheriticum, particularmente em hospitais.
Alm dos mtodos bioqumicos convencionais encontram-se comercialmente disponveis sistemas semiautomatizados de identificao. Mtodos
moleculares geralmente so utilizados em Laboratrios de Referncia.
As principais espcies de corinebactrias estabelecidas como patgenos humanos esto apresentadas no quadro a seguir.
Micro-organismos
Quadros clnicos principais
C. diphtheriae*
Difteria, lceras cutneas, endocardite, septicemia, pneumonia e osteomielite
C. ulcerans
Difteria, faringite, pneumonia, ndulos pulmonares

granulomatosos e lceras cutneas
C. jeikeiumMR
Infeco de ferida cirrgica e prtese, septicemia, pneumonia,

endocardite, peritonite e meningite
C. urealyticumMR*
Infeco urinria (cistite encrustada), ferida cirrgica, septicemia, pneumonia,

endocardite, peritonite, osteomielite
C. striatumMR*
Pneumonia, septicemia, endocardite, osteomielite, peritonite e meningite
C. amycolatum
MR
Septicemia, peritonite, endocardite e mastite
C. afermentans
Septicemia, endocardite, empiema, abscesso pulmonar,

heptico e cerebral, otite
C. minutissimum*
Eritrasma, abscesso mamrio, septicemia e endocardite
C. pseudodiphtheriticum*
Pneumonia, endocardite, farigite e conjuntivite
C. xerosis*
Infeco de ferida cirrgica, endoftalmite, septicemia,

endocardite e osteomielite
* Espcies que podem ser encontradas colonizando superfcies cutneo-mucosas de portadores

assintomticos; MR, maioria das amostras so multiresistentes aos agentes antimicrobianos
88
Catalase
Metabolismo
Oxidativo/
fermentativo
Lipofilia
Reduo
Nitrato
Hidrlise
Ureia
Hidrlise Esculina
PYZ
Glicose
Maltose
Sacarose
CAMP
Esquema simplificado de caracterizao bioqumica das

principais espcies de corinebactrias de importncia clnica
C. afermentans
C. amycolatum
+
+
O
F
v
-
+
+
v
-
C. diphtheriae
C. jeikeium
C. minutissimum
C. propinquum
C. pseudodiphtheriticum
+
+
O
O
+
+
v
+
C. pseudotuberculosis
C striatum
C. ulcerans
C. urealyticum
C. xerosis
+
+
O
F
+
-
+
-
+
+
Espcies
Testes
Outros
DNAse
DNAse
Hemlise*;
- DNAse +;
Glicognio V
DNAse
- GFrutose ;
alactose +
Frutose +;
Tirosina +
- Tirosina +
- DNAse
DNAse
Rev hemlise*;
Glicognio
v Tirosina +
Hemlise*;
DNAse +;
Rev
Glicognio +;
Gelatina +;
- DNAse
- DNAse
PYZ, Atividade pirazinamidsica; +, positivo; -, negativo; V, varivel; Rev, reao reversa; *, hemcias carneiro
6.3.1.1 Corynebacterium diphtheriae

Apesar da vacinao compulsria, a espcie tipo do gnero, o C. diphtheriae,
permanece constante motivo de preocupao da Sade Pblica dos pases
nos diferentes continentes. No Brasil, a difteria incide de forma endmica,
com o aparecimento de surtos epidmicos nas diversas regies. A prevalncia do bacilo diftrico fermentador de sacarose difere da maioria dos pases
onde so isoladas apenas amostras sacarose-negativas.
A difteria um processo infeccioso agudo, muitas vezes fatal, caracterizado
por uma inflamao local, com formao de pseudomembrana na orofaringe e linfadenopatia cervical. A produo da toxina diftrica e sua liberao
na corrente sanguinea levam morte celular, principalmente nos orgos de
alta perfuso, como fgado, rins, glndulas adrenais, corao e nervos. A imunidade contra a difteria medida da por anticorpos primariamente contra a
toxina, portanto, pessoas imunizadas podem ser portadoras do micro-organismo.
89
Na era da vacinao, o ressurgimento da difteria na populao adulta pode ser

parcialmente justificado pela maior prevalncia de baixos nveis de IgG antitoxina diftrica entre esses indivduos. Quadros clnicos atpicos, com ausncia
de formao de pseudomembrana, podem ocorrer em indivduos parcialmente imunizados e infectados por amostras toxinognicas. C. diphtheriae, independentemente de sua capacidade de produo de toxina, tambm tem sido
observado como agente etiolgico de endocardites, alm de outras infeces
invasivas em indivduos previamente submetidos vacinao.
90
Quadro clnico de
difteria clssica
A faringite produz sintomas como dor de garganta, febre baixa, tosse, fadiga,
dificuldade em deglutir e nuseas. As crianas podem ter febre alta. Os ganglios
linfticos regionais (no pescoo) ficam muito inchados. Sintomas da intoxicao
sistmica podem incluir miocardite, hipotenso, paralisia de msculos e de
nervos sensitivos.
Outros quadros clnicos
Difteria cutnea, endocardite, pneumonia, septicemia, osteomielite e infeces

relacionadas ao uso de cateter.
Coleta de material
O material de orofaringe, nasofaringe e/ou de leso cutnea deve ser colhido

das bordas da pseudomembrana. Durante a coleta, no deve ser removida
a pseudomembrana dos stios de infeco de modo a evitar um aumento da
liberao de toxina diftrica na corrente sangunea.
Isolamento
No diagnstico bacteriolgico da difteria, a cultura bacteriana deve ser feita

atravs de semeadura da secreo em meio de gar sangue utilizado na
pesquisa de Streptococcus pyogenes e outros patgenos eventuais. Dentre os
meios especficos para a pesquisa de C. diphtheriae, podem ser utilizados meios
de enriquecimento como o meio de Leffler, alm de meios seletivos contendo
telurito de potssio (gar chocolate-telurito ou gar sangue-cistina-telurito).
Nos meios contendo telurito, o bacilo diftrico apresenta maior resistncia
quando comparado a outras bactrias e forma colnias de colorao cinza ao
negro, cujo tamanho e outras caractersticas dependem da subespcie. O meio
de Leffler bastante rico em soro que propicia um crescimento bacteriano
mais rpido (4 a 16 horas) alm de permitir o desenvolvimento de morfologia
celular caracterstica das corinebactrias, o que favorece o exame microscpico
a partir do cultivo primrio.
Bacterioscopia
A bacterioscopia direta do material clnico aps colorao pelo mtodo de Gram

pode ser sugestiva quando vizualizados bastonetes ou coco-bacilos dispostos
em formato de letras chinesas ou paliadas. Granulaes metacromticas,
quando presentes, podem tambm ser visualizadas pela colorao de Albert
Laybourn.
Identificao
As peculiaridades de superfcie celular bacteriana e as propriedades bioqumicas

permitiram a distribuio das amostras de C. diphtheriae em quatro subespcies
denominadas gravis, intermedius, mitis e belfanti. O C. diphtheriae subsp. gravis
apresenta colnias grandes, achatadas e rugosas, raramente apresentando
granulaes metacromticas. So capazes de fermentar glicognio e amido.
O C. diphtheriae subsp. intermedius apresenta colnias diminutas, achatadas e
umbilicadas, no hemolticas. O C. diphtheriae subsp. mitis apresenta colnias
lisas, convexas, negras e brilhosas; hemolticas e frequentemente com
granulaes metacromticas. O C. diphtheriae subsp. belfanti se diferencia da
subespcie mitis pela incapacidade de reduo do nitrato.
Identificao
Os bacteriologistas devem tomar cuidado ao descartar os micro-organismos

classificados como difterides, j que h relatos de amostras de bacilo diftrico
isoladas de locais inusitados como sangue e/ou que exibem comportamentos
atpicos, como as amostras fermentadoras de sacarose.
A pesquisa de produo de toxina pelo teste de Elek ainda realizada pela maioria
dos laboratrios em todo o mundo apesar de j ter sido descrita uma tcnica
de PCR multiplex usando iniciadores para os genes dtxR e tox que permitem
simultaneamente a identificao da espcie C. diphtheriae e a capacidade de
produo de toxina diftrica.
Em casos de dificuldades na identificao bioqumica e na pesquisa de produo
de toxina de amostras clnicas potencialmente toxinognicas, recomenda-se
encaminhar o material ou contactar Laboratrios de Referncia em Difteria para
orientao.
6.3.1.2 Corynebacterium ulcerans
Importncia clnica
Isolamento e Identificao
Recentemente passou a ser considerada como uma espcie distinta do C.

diphtheriae. O micro-organismo capaz de causar processos infecciosos em
humanos e animais (mastite bovina), por vezes fatais. Em humanos, tem sido
crescente o nmero de casos de quadros infecciosos diversos que no tiveram
contatos prvios com animais de fazendas ou derivados alimentares, inclusive
no Brasil. Alm dos quadros de difteria, o micro-organismo pode causar faringite,
pneumonia, ndulos pulmonares granulomatosos e lceras cutneas.
Alm de produzir toxina antigenicamente homloga toxina diftrica, o C.
ulcerans tambm produz fosfolipase D.
Os micro-organismos produzem colnias fracamente hemolticas e so diferenciados do C. diphtheriae atravs dos resultados positivos nos testes de hidrlise
da ureia e de CAMP reverso (inibe a beta-hemlise do Staphylococcus aureus em
gar-sangue de carneiro), semelhana de C. pseudotuberculosis. Produzem resultados positivos nos testes de glicognio de hidrlise da gelatina e negativo
no teste PYZ.
6.3.1.3 Corynebacterium pseudotuberculosis
Importncia clnica
Deve ser lembrado nos casos infeces em veterinrios ou trabalhadores de

zona rural com quadros de linfadenite ulcerativa ou abscessos relacionados a
procedimentos de aborto de gado.
Alm de fosfolipase D, essa espcie tambm pode ser produtora de toxina
diftrica.
As colnias so pequenas, branco-amareladas; PYZ-negativas; urease e CAMreverso positivas.
6.3.1.4 Corynebacterium jeikeium
Importncia clnica
Os micro-organismos podem ser encontrados colonizando a superfcies cutneo-mucosas dos indivduos hospitalizados e de integrantes do corpo clnico.
O isolamento de amostras pode ocorrer a partir de diversos materiais clnicos,
principalmente de feridas cirrgicas, sangue e fluido cerebrospinal.
Frequentemente ocorre transmisso nosocomial inclusive de amostras multirresistentes que apresentam sensibilidade apenas a vancomicina.
As colnias so puntiformes, branco-acinzentadas e lipoflicas (crescem em
caldo BHI apenas na presena de 1% de Tween 80); metabolismo oxidativo
glicose em base CTA (cystine trypticase gar) semi-slido; urease e esculina
negativas e PYZ-positivas.
91
6.3.1.5 Corynebacterium pseudodiphtheriticum
Importncia clnica
Micro-organismo frequentemente encontrado na microbiota de naso e orofaringe de humanos, tem sido relacionado principalmente com quadros de infeces do trato respiratrio inferior em pacientes imunocomprometidos incluindo
portadores do vrus HIV, diabetes, transplantados ou portadores de tumores
malignos, alm de doenas coronarianas, inclusive em ambiente hospitalar. O
micro-organismo tambm foi relacionado com processos infecciosos do trato
respiratrio inferior em indivduos imunocompetentes.
O estabelecimento do potencial patognico do C. pseudodiphtheriticum baseado
em critrios adotados para outros patgenos do trato respiratrio inferior.
Exibem colnias esbranquiadas e ligeiramente secas; hidrolisam a ureia e
reduzem o nitrato, mas so incapazes de produzir cidos a partir de carboidratos
comumente testados.
6.3.1.6 Corynebacterium urealyticum
Importncia clnica
C. urealyticum comumente encontrado em animais e na pele e mucosas de

humanos predominantemente em reas perigenitais femininas. Est entre as espcies de corinebactrias de significado clnico mais frequentemente isoladas.
fundamentalmente um patgeno oportunista do trato urinrio e pode estar
relacionado com quadros de cistite (cistite incrustante), pielouretrite e pielonefrite. Adicionalmente, a espcie tem sido relacionada com quadros de infeco
de ferida cirrgica, septicemia, pneumonia, endocardite, peritonite e osteomielite.
Na maioria das oportunidades, os isolados clnicos de C. urealyticum so multirresistentes, inclusive para a penicilina.
Como as demais espcies lipoflicas, exibem colnias puntiformes, convexas,

lisas, esbranquiadas; aerbio estrito e no fermentador com elevada atividade
uresica.
6.3.1.7 Corynebacterium amycolatum
92
Importncia clnica
Micro-organismos no lipoflicos, que apresentam parede celular desprovida de

cidos miclicos.
Em humanos, casos de endocardite foram associados ao uso de dispositivos intravasculares. A multirresistncia aos agentes antimicrobianos frequentemente observada entre as amostras clnicas.
a espcie de corinebactria no lipoflica mais encontrada em quadros de mastite bovina.
As colnias so acinzentadas, secas e cerosas com bordos irregulares aps 24 h

de incubao. Exibem comportamento bioqumico semelhante ao das espcies
pertencentes ao complexo C. minutissimum/C. xerosis/C. striatum apresentado
abaixo.
6.3.1.8 Complexo C. minutissimum/C. xerosis/C. striatum
Importncia clnica
O C. minutissimum tem sido relacionado com quadros de eritrasma, abscessos, infeco

oftalmolgica, pielonefrite e infeces endovenosas associados ao uso de dispositivos
intravasculares em pacientes portadores de neoplasias. Quadros de bacteremia
tambm foram observados em pacientes imunocompetentes.
O C. xerosis uma corinebactria no lipoflica cujas colnias podem apresentar
aspecto ressecado, da o nome (xeros = seco), e tem sido isolado em casos de
endocardite e feridas cirrgicas.
A semelhana de C. minutissimum e C. xerosis, o C. striatum tambm est includo
entre os micro-organismos da microbiota de pele que podem ser transmitidos
para outros indivduos no ambiente hospitalar. Alm de outros processos
infecciosos, o C. striatum tambm foi relacionado com quadros de endocardite.
As espcies C. amycolatum/C. minutissimum/C. xerosis/C. striatum podem ser

diferenciadas atravs das seguintes reaes: C. amycolatum e C. minutissimum
no crescem a 20oC ao contrrio de C. xerosis e C. striatum; C. xerosis no fermenta
glicose a 42oC; a maioria das amostras de C. amycolatum resistente ao composto
vibriocida 0/129; amostras de C. striatum podem expressar discreta reatividade
ao teste de CAMP.
Uma vez que apresentam caractersticas bioqumicas similares, muitas vezes, as
espcies s podem ser diferenciadas atravs de anlise genotpica.
6.3.1.9 C. Afermentans
Importncia clnica
C. afermentans subsp. afermentans, no lipoflico, componente da microbiota

humana de pele e tem sido isolado principalmente de hemoculturas.
Amostras C. afermentans subsp. afermentans so frequentemente susceptveis
aos antibiticos -lactmicos. Entretanto, j foram observadas amostras multirresistentes.
Amostras de C. afermentans subsp. lipophilum isoladas de sangue e de feridas
cutneas superficiais foram susceptveis aos antibiticos -lactmicos semelhana de C. afermentans subsp. afermentans.
Aproximadamente 60% das amostras C. afermentans subsp. afermentans so

CAMP-positivas.
C. afermentans subsp. lipophilum a nica espcie lipoflica que pode apresentar
reao positiva no teste de CAMP.
6.3.2
Arcanobacterium haemolyticum
Importncia clnica
Juntamente com S. pyogenes tem sido considerado como agente etiolgico

de faringites, identificados e relatados com a finalidade de tratamento. Est
associado tambm com quadros de infeces de partes moles, septicemia,
endocardite e osteomielite.
So bacilos delicados e curvos e alguns apresentam dilatao terminal e

ramificaes ru dimentares. Crescem em 24-48h como colnias pequenas e
beta-hemolticas. A hemlise melhor visualizada em sangue de coelho, e cresce
melhor em ambiente de CO2. Pode se apresentar como dois tipos de colnias no
mesmo cultivo: lisas, mucides e brancas ou secas e cinza. Produz a prova de
CAMP reverso (inibio da hemlise). Colnias mais velhas tendem a adquirir a
forma de coco-bacilo, que pode ser confundido com estreptococos. Em caldo
tendem a formar ramificaes e em anaerobiose filamentos.
93
6.3.3
Caractersticas gerais
G. vaginalis apresenta classificao taxonmica incerta e portanto, para fins

didticos, estudada no grupo dos corineformes. Coram-se irregularmente pelo
cristal violeta em virtude da parede celular ser muito mais delgada do que os
demais micro-organismos gram-positivos.
Importncia clnica
Faz parte da microbiota vaginal de cerca de 70% das mulheres em idade

reprodutiva, mas est associada vaginose bacteriana, quando predomina na
flora vaginal em substituio ao Lactobacillus (bacilos de Doderlein). A vaginose
bacteriana e a presena de G. vaginalis esto associadas tambm ao parto
prematuro, ruptura prematura de membranas e corioamnionite. Essa bactria
comumente isolada em hemoculturas de pacientes com febre puerperal e psaborto. Pode causar sepse em recm-nascidos e raramente infeco urinria em
adultos ou em outros stios anatmicos.
Crescem no gar sangue humano e de coelho produzindo hemlise beta. So

incapazes de produzir hemlise quando cultivadas em gar sangue de carneiro.
So visualizadas e caracterizadas no exame citolgico e/ou na colorao de Gram
pela presena das clue cells, que so clulas epiteliais abarrotadas de pequenos
bacilos Gram lbeis, de modo a perder sua definio morfolgica. Pequenos
bacilos ou coco-bacilos irregulares, Gram-lbeis (por vezes Gram-negativa e por
outras vezes parcialmente e fracamente Gram-positiva), imveis, sem cpsula;
anaerbio facultativo, fermentador lento, catalase e esculina negativos
6.3.4
Rothia dentocariosa
Importncia clnica
Pertence microbiota da cavidade oral, e pode estar associada a quadros

de endocardite, septicemia, pneumonia, aneurisma mictico, peritonite e
osteomielite.
Bacilos ou coco-bacilos, retos ou ramificados. As colnias so brancas salientes

e s vezes rugosas (em forma de rodas de carroa); catalase-varivel, imvel,
fermentador de glicose, maltose e sacarose; esculina positiva.
6.3.5
94
Gardnerella vaginalis
Oerskovia turbata
Importncia clnica
Oerskovia turbata so bactrias do meio ambiente ou solo, relacionadas com

raros casos de bacteremia e infeces em implantes de prteses.
So micro-organismos cocides ou na forma de bacilos resultantes da

quebra de miclios; ramificados e com hifas vegetativas com capacidade
de penetrao no gar.
Crescimento em gar sangue de carneiro e gar chocolate; colnias com
pigmento amarelo aps 24-48h em anaerobiose ou em atmosfera de 5% CO2;
catalase positiva e mobilidade varivel; fermentao rpida da glicose, maltose
e sacarose, hidrlise da esculina, gelatina e amido; xantina e hipoxantinanegativas.
6.3.6
Cellulosimicrobium cellulans
Importncia clnica
Anteriormente caracterizados como Oerskovia xanthineolytica, so bactrias

encontradas no meio ambiente ou solo e raramente relacionados com quadros
clnicos humanos como bacteremia, meningite, endocardite, peritonite, nefrose,
implante de prteses, e endoftalmite. A maioria das infeces foi observada em
pacientes hospitalizados e associada quebra de cadeia assptica.
Micro-organismos morfologicamente e bioquimicamente similares a O. turbata.

Apresentam colnias amareladas, com penetrao no gar aps 24-48h; ao
contrario de O. turbata, so imveis, xantina e hipoxantina-positivas.
6.4 Bacilos gram-positivos regulares

6.4.1
Listeria monocytogenes
Dentre as sete espcies do gnero Listeria, a nica importante para o homem a

L. monocytogenes, encontrada no solo, em matria orgnica em decomposio,
gua, leite e derivados, carne alm de ser componente da microbiota de diversos
mamferos, aves, peixes e insetos.
Importncia clnica
Importncia clnica particularmente para idosos e indivduos imunocomprometidos causando meningite, encefalite ou septicemia. Em pacientes grvidas, a
infeco pode causar amnionite, infeco do feto com aborto, parto prematuro,
meningite neonatal e sepse neonatal. Surtos epidmicos podem ocorrer e esto
geralmente relacionados com a contaminao de alimentos.
Bacilos anaerbios facultativos, uniformes, no ramificados, apresentando-se

isolados ou dispostos em cadeias pequenas. Crescem em gar sangue, gar
chocolate, CLED, gar nutriente, TSA e gar Mueller Hinton, mas no em Mac
Conkey. As colnias so pequenas, crescendo melhor entre 30oC e 37oC, e crescem
tambm temperatura ambiente e a 4oC em 3 a 4 dias.
A partir de hemoculturas, LCR, placenta, alimentos e gua, semear em gar sangue de carneiro, coelho ou cavalo, com base TSA, embora cresa tambm com
outras bases (Mueller Hinton, Columbia, Brucella, BHIA, etc). Existem meios seletivos indicados em investigaes epidemiolgicas.
Os micro-organismos produzem reao positiva no teste da catalase e negativa
nos testes da oxidase, ureia, gelatina, indol e H2S; cido a partir de glicose; hemlise beta em gar sangue de carneiro e CAMP-positivo. A mobilidade observada em temperaturas de 25oC a 28oC, porm negativa a 37oC. Alm dos
resultados positivos nos testes de hidrlise da esculina e crescimento em 6,5%
NaCl observada reao rpida na prova da esculina.
Sistemas semi-automatizados de identificao desses micro-organismos so
encontrados disponveis comercialmente.
95
6.4.2
Erysipelothrix rhusiopathiae
Importncia clnica
Presentes na natureza, em matria orgnica, urina, fezes e carcaa de animais.

Alm disso podem ser encontrados em animais, peixes, pssaros e causar
erisipela em sunos.
No homem, esto relacionados com quadros de doena ocupacional de veterinrios
e manuseadores de carne e animais caracterizada por celulite que aparece no
local da inoculao aps 2 a 7 dias. A leso costuma ser violcea e com muita dor,
acompanhada de edema endurado, sem supurao e bem delineado nas bordas.
Ocorre linfangite regional e artrite adjacente. Disseminao da doena e endocardite
podem ocorrer, particularmente em imunossuprimidos, cujo prognstico grave.
Cicatrizao pode ocorrer em 2 a 4 semanas ou meses, com possibilidade de recada.
Material ideal para isolamento a bipsia colhida de maneira assptica. Swabs

de leso em geral fornecem resultado negativo, pois o agente encontra-se na
profundidade da borda endurecida.
Bacilos curtos de extremidades arredondadas, anaerbios facultativos, no
esporulado, no lcool-cido resistente, ocorrem s em cadeias curtas ou longas,
sem ramificar. Crescem em gar sangue, gar chocolate, caldo tripticase soja, a
35oC aerobiose ou 5% CO2. Crescem entre 5oC a 42oC e em caldo 6,5% NaCl.
No gar sangue crescem em 24 a 72h, como colnias minsculas, lisas e
transparentes, mas o outro tipo de colnia, maior, rugosa e chata pode aparecer,
bem como uma hemlise esverdeada em baixo da colnia no gar sangue. As
colnias lisas so bacilos ou coco-bacilos Gram-positivos; s vezes corando-se
mal pelo Gram.
Os micro-organismos fermentam lentamente a glicose sem produzir gs, so
catalase negativa, imveis, esculina, ureia e indol negativos; lactose positiva e
sacarose negativa. Caracterizam-se por crescerem em meio TSI produzindo H2S.
6.5 Principais diferenas entre BGPS e cocos gram-positivos

Bactria
Gram
Catalase
Mobilidade
25C
Hemlise
CAMP
NaCl 6,5%/
Esculina
Corynebacterium
bacilos e coco-bacilos
pleomrficos
v/v
Enterococcus
cocos ou coco-bacilos em
cadeias
+/+
Erysipelothrix
rhusiopathiae1
coco-bacilos ou
filamentos longos
alfa
-/-
Kurthia2
bacilos grandes, cadeias,

cocoide em cultura velha
-/-
Lactobacillus
coco-bacilos e cadeias
longas
-/-
Listeria
monocytogenes
bacilos curtos ou cocobacilos regulares e largos
beta
+/+
Streptococcus
beta hemolticos
cocos em cadeias
beta
-/+
-/-
1, H2S positivo; 2, glicose negativo; 3, S. agalactiae; -, negativo; +, positivo; V, varivel; Rev, reao reversa; *,
sangue de coelho ou humano a 3%
96
6.6 Bacilos gram-positivos anaerbios que devem ser diferenciados

6.6.1
Lactobacillus
Os lactobacilos fazem parte da microbiota da boca, intestino e flora vaginal
(bacilo de Doderlein) humana. So catalase negativos, imveis e apresentam capacidade de crescer em gar sangue e gar chocolate como colnias
puntiformes. Esses micro-organismos tm sido associados frequentemente
a quadros de endocardite e bacteremia, levando a bito aproximadamente 30% dos pacientes. Casos de peritonite, abscessos e meningites tambm
tm sido relatados.
6.6.2
Mobilluncus
Anaerbios estritos, curvos, mveis encontrados no trato genital e reto de
humanos. Os micro-organismos podem ser encontrados juntamente com G.
vaginalis em pacientes com quadros de vaginose.
6.6.3
Propionibacterium, Eubacterium e Bifidobacterium

Anaerbios estritos que so analisados juntamente com os demais anaerbios.
6.7 Bacilos esporulados aerbios e anaerbios facultativos

6.7.1
Bacillus
O gnero Bacillus compreende cerca de 259 espcies de bacilos aerbios ou
anaerbios facultativos, formadores de endosporos, gram-lbeis; a maioria
catalase positiva. Todos exibem mobilidade, exceto as espcies B. anthracis
e B. mycoides.
B. anthracis, B. subtilis, B. licheniformis e B. megaterium expressam cpsula polipeptdica na presena de on bicarbonato (HCO3-) e em anaerobiose ou em
atmosfera de CO2.
As formas vegetativas so retas largas, podendo ser alongadas, dispostas
isoladamente ou em cadeias. A morfologia e a disposio intracitoplasmtica dos esporos so teis para sua classificao:
cilndricos, ovais, redondos, e riniformes
central, subterminal, terminal
dilatando ou no a clula vegetativa de origem
A maioria dos micro-organismos aerbios formadores de esporos so saprfitas amplamente distribudos na natureza. Entretanto, algumas espcies so
97
oportunistas e outras so patgenos obrigatrios para animais, incluindo os

humanos. Os micro-organismos do gnero Bacillus so encontrados principalmentemente no solo, gua, matria orgnica animal e vegetal, em condies ambientais bastante variadas, temperatura, umidade, salinidade e pH.
As duas espcies de maior relevncia cllnica e que devem ser reconhecidas
pelo laboratrio de microbiologia so o B. anthracis e B. cereus.
6.7.2
Principais espcies de Bacillus relacionadas com quadros de infeces

humanas
Espcie
Quadros clnicos
B. anthracis
Anthrax cutneo, anthrax intestinal, antrax pulmonar, antrax meningite
B. cereus
Intoxicao alimentar, necrose ou gangrena de partes moles, bacteremia e

septicemia, infeces pulmonares, endocardite, meningite, osteomielite e
endoftalmite ps-trauma
B. circulans
Infeces de partes moles, abscessos, bacteremia, septicemia e meningite
B. coagulans
Infeces de crneas e bacteremia
B. licheniformis
Intoxicao alimentar, bacteremia e septicemia
B. subtilis
Intoxicao alimentar, bacteremia, septicemia, endocardite e infeces

respiratrias
B. thuringiensis
Intoxicao alimentar e gastroenterite
A) Diferenas entre Bacillus e Clostridium

Bacillus
Clostridium
Endosporos em aerobiose
Endosporos em aerobiose
Catalase positivos
Catalase negativos
B) Diferenas entre B. anthracis, B. cereus e espcies relacionadas

Espcies
Morfologia colonial *
Mobilidade
Hemlise
Penicilina
Citrato
Lecitinase
B. anthracis
branco acinzentado
sensvel
(+)
B. cereus
esverdeado claro
resistente
B. mycoides
rizides/
espalhando
(+)
resistente
B. thuringiensis
esverdeado claro
resistente
*gar sangue; positivo; negativo; varivel; (), reao fraca
A produo de material capsular por amostras virulentas de B. anthracis

pode ser demontrada em gar nutriente acrescido de 0,7% de bicarbonato
de sdio, incubado por uma noite em condies de microaerofilia (mtodo
da vela). Colnias capsuladas de B. anthracis exibem aspecto mucoide e a
cpsula pode ser evidenciada atravs do metodo de colorao com tinta da
India (nanquim).
98
6.7.2.1 Bacillus cereus

Em seres humanos, B. cereus pode causar duas enfermidades transmitidas
por alimentos, a sndrome diarreica e a sndrome emtica:
Sndrome diarreica de aparico tardia; caracterizada pelo aparecimento

de dor abdominal e diarreia 8 a 16 h em decorrncia da ingesto de alimentos contaminados com os esporos, sendo mais comuns os vegetais (crus
ou cozidos), produtos crneos, leite e derivados, massas e outros alimentos
base de amido e farinhas. Os esporos so ingeridos juntamente com os
alimentos e, uma vez no intestino, esses esporos germinam e causam a doena em funo das toxinas que o micro-organismo capaz de produzir.
Sndrome emtica caracteriza-se por um perodo de incubao bastante
curto (uma a cinco horas); causada por alimentos que j possuem a toxina
produzida pela bactria; vmitos, nuseas e mal-estar geral aps a ingesto
de alimentos contaminados, principalmente pratos orientais preparados
com arroz, alm de alimentos derivados de leite, doces e massas.
6.7.2.2 Bacillus anthracis
Carbnculo, carbnculo hemtico, antraz ou ainda antrax foi no passado causa importante de mortalidade em herbvoros domsticos como vacas, cabras, ovelhas.
Atualmente as infeces de carbnculo so raras nos pases desenvolvidos, mas
no excepcionais nos subdesenvolvidos. O nmero de casos foi reduzido significativamente em decorrncia de imunizao e melhoria das condies de higiene.
Os casos humanos de carbnculo devem-se normalmente exposio a animais
infectados ou a carne ou pele infectada. As vtimas tm profisses relacionadas com
a manipulao de animais ou de produtos derivados (trabalhadores da rea rural
e veterinrios; manuseio industrial de ossos, l, crina, e outros produtos animais).
Na comunidade, o risco de infeco preocupante nas regies do globo potencialmente ameaadas por ataques biolgicos.
Importncia clnica
O anthrax cutneo, quando no tratado, pode ser fatal em aproximadamente 20%

dos casos, principalmente quando a leso encontra-se prxima a cabea ou pescoo. No local de inoculao, aparece aps 2 a 3 dias uma pequena mancha ou ppula.
Em seguida, ocorre o aparecimento de anel de vesculas em torno da ppula, que
ulcera, seca, escurece formando uma escara caracterstica que cresce, fica mais espessa e aderente aos planos profundos. O edema pode ser importante, mas tem a
caracterstica de ser indolor e sem pus.
As formas pulmonares e intestinais so raras e mais graves, e na maioria das vezes
fatais em decorrncia da dificuldade em diagnosticar o quadro clnico.
No antrax pulmonar o esporo inalado transportado pelos macrfagos do pulmo
para o sistema linftico onde os esporos germinam e causam septicemia que fatal.
O anthrax intestinal semelhante ao cutneo, atingindo a mucosa com leses e
eventualmente gastroenterite devido ingesto de carne contaminada.
Ateno ao fato de que evoluo nos casos fatais inicialmente caracterizada por
sintomas leves como fadiga, mal-estar e febre baixa, ou s vezes at sem sintomas,
quando repentinamente se instala dispnia, cianose, febre elevada, desorientao,
falncia circulatria, choque, coma e morte em poucas horas.
99
6.8 Actinomicetos
BGPs que apresentam como caracterstica em comum a produo de filamentos ou
hifas vegetativas, sendo que alguns tambm apresentam hifas areas, semelhanas
na composio e padro de cidos graxos de parede celular.
O gnero Oerskovia, embora apresente hifas vegetativas, foi analisado juntamente
com o grupo de micro-organismos corineformes.
Nesta oportunidade sero abordados os gneros Nocardia, Rhodococcus e Streptomyces. Dentre os demais actinomicetos raros ou de menor importncia clnica esto includos os gneros Gordonia, Tsukamurella, Actinomadura e Nocardiopsis.
Informaes importantes sobre os actinomicetos
Para a adequada caracterizao dos actinomicetos que apresentam semelhana morfolgica com os fungos, importante considerar os seguintes aspectos:

Origem do material clnico, valorizando os abscessos.

Nmero de micro-organismos isolados e correlao com a bacterioscopia direta do material clnico.
Possibilidade de contaminao com bactrias da mucosa oral.
Pigmento da colnia.
Anlise morfolgica da bactria pelo microcultivo em lmina, idntico ao utilizado
no setor de Micologia, empregando gar fub sem dextrose a 25oC.
Identificao presuntiva de actinomicetos

Miclio
areo
Condio
AAR
fraca ou parcial
Metabolismo
glicose
Crescimento em
lisozima
Gordonia
oxidativo
Nocardia
oxidativo
Rhodococcus
oxidativo
Oerskovia
fermentativo
Rhotia
fermentativo
Streptomyces
oxidativo
Tsukamurella
oxidativo
Gnero
100
6.8.1
Nocardia
O gnero Nocardia compreende atualmente 22 espcies. As nocardias so

micro-organismos saprfitas de solo, aerbios estritos, imveis e catalase
positivas; levemente lcool-cido resistentes quando visualizados pelo mtodo
de Kinyoun-modificado. Usualmente formam hifas areas, algumas vezes
observadas apenas ao microscpio. As hifas ramificadas quando fragmentadas
podem exibir formas cocides e bacilares.
Importncia clnica
O nmero de casos de nocardioses humanas vem aumentando significativamente, especialmente entre indivduos imunocomprometidos apresentando
doena pulmonar, neoplasias, infeces pelo vrus HIV, histria prvia de alcoolismo, cirurgia, trauma, transplantes ou uso de corticosterides. O maior nmero de casos clnicos tem sido observado em pacientes adultos, predominantemente do sexo masculino (razo Masc:Fem = 3:1), a partir da terceira dcada
de vida. As manifestaes clnicas, severidade e/ou prognstico da doena so
extremamente variveis e relacionados com via de infeco e eficincia do sistema imunolgico do indivduo. Na maioria dos casos de nocardioses ocorre manifestao clnica disseminada.
Indivduos imunocomprometidos podem desenvolver doena de evoluo progressiva e doena disseminada ou pulmonar crnica, por vezes apresentando
pneumonia necrotizante e cavitao pulmonar.
As nocardioses cutneas so usualmente apresentadas em quatro formas clnicas: micetoma, infeco linfocutnea, infeco cutnea superficial (abscesso
ou celulite) e infeco cutnea secundria com doena disseminada freqentemente de carter crnico e de difcil diagnstico.
Em indivduos imunocompetentes, foram observados quadros de endocardite,
abscesso pulmonar e cerebral em adultos, alm de quadros de linfadenite
necrotizante em crianas e pneumonia em neonato.
O maior nmero de bitos ocorre em pacientes apresentando quadros de
abscesso cerebral, infeces sistmicas e pneumonias.
As nocardias so transmitidas principalmente por inalao e mais raramente
atravs de inoculao direta na pele. A doena cutnea primria pode ocorrer
a partir de feridas contaminadas com resduos do solo. Embora a doena esteja
mais relacionada distribuio comunitria, surtos nosocomiais de nocardioses
em pacientes imunocomprometidos tambm tem sido observados. No
ambiente hospitalar, parece ocorrer a disseminao bacteriana por vias areas e
transmisso pessoa a pessoa, inclusive ps-cirrgica.
Importncia clnica
Diversas espcies tem sido relacionadas com quadros de nocardioses humanas.

Dentre as espcies predominantemente isoladas podemos destacar Nocardia
asteroides, Nocardia farcinica, Nocardia brasiliensis e Nocardia otitidiscaviarium.
N. asteroides so responsveis pela maioria dos casos de infeces invasivas em
humanos, sendo predominantemente relacionadas com quadros pulmonares e
raramente com infeces cutneas. A maioria dos casos de artrite sptica foi relacionada com N. asteroides e N. farcinica.
N. farcinica tem sido relacionado com quadros de infeces nosocomiais ps-cirrgicas em pacientes submetidos a cirurgias cardacas e vasculares. A diferenciao de N. farcinica dos demais membros do complexo asteroides torna-se ainda mais relevante em virtude da multiresistncia aos agentes antimicrobianos.
101
Quando colhido o material por puno, bipsia ou mesmo swab da leso profunda, deve ser processado rapidamente; existe uma caracterstica do material
descrita como grnulos de enxofre, especialmente nos micetomas.
A bacterioscopia pode revelar bacilos irregulares com ramificaes e parcialmente ou fracamente lcool-cido resistentes pelo Ziehl ou Kinyoun. Cortes
histolgicos corados pela hematoxilina-eosina caracterizam os grnulos, mas
no os filamentos da bactria. O Gram ou a colorao de metenamina prata de
Gomori so teis.
A presena de hifas areas diferencia as nocardias dos outros gneros relacionados Corynebacterium, Gordonia, Mycobacterium, Rhodococcus e Tsukamurella. As micobactrias de crescimento rpido podem apresentar hifas de substrato curtas ramificadas em ngulo agudo, porm sem ramificaes secundrias,
enquanto as nocardias exibem hifas complexas com ramificaes em angulo
reto e com ramificaes secundrias.
No isolamento de nocardias podem ser utilizados meios de cultivo usualmente
empregados na rotina laboratorial (gar sangue, gar chocolate, gar Sabouraud
dextrose, gar seletivo para Legionella e Lowenstein Jensen), sendo necessrio
tempo de incubao prolongado (4 a 14 dias).
Com exceo da N. asteroides, a maioria das nocardias apresenta beta-hemlise
em gar sangue de carneiro. Crescem em meio de parafina (como fonte nica
de carbono), juntamente com Rhodococcus e algumas micobactrias. Uma caracterstica importante a variedade na cor das colnias lisas ou rugosas, indo
do branco giz ao amarelo, salmo, alaranjado e violeta, dependendo da espcie,
tempo de incubao e do meio de cultivo utilizado.
O envio da amostra clnica a um Laboratrio de Referncia pode ser requerido
para a identificao da espcie.
Catalase
Cultivo
35/45oC
Lisozima
Esculina
Glicose
Galactose
Inositol
Trealose
Gelatina
Xantina
Hipoxantina
Caracteristicas diferenciais das principais espcies de nocardia de interesse clnico
N. nova
branco giz; laranja
N. farcinica
branco giz; laranja
N. asteroides
salmo; laranja
N. brasiliensis
amarelo; laranja
N. otitidiscaviarium
marrom claro
Nocardia
*, Leitura do teste aps 72h de incubao; +, reao positiva; -, reao negativa;

v, reao varivel
102
Pigmento*
6.8.2
Streptomyces
Importncia clnica
Alguns milhares de espcies de Streptomyces j foram caracterizados, sendo

na quase totalidade saprfitas. O Streptomyces somaliensis responsvel pelo
micetoma de cabea e pescoo. Outras espcies foram identificadas em casos
de pericardite crnica e infeces de partes moles ps-traumticas (S. griseus).
O abscesso pode revelar a presena de grnulos duros. O mtodo de Gram revela

uma massa de BGPs finos. No fastidioso, cresce melhor em meio Sabouraud
dextrose incubado a temperatura ambiente entre 4 a 10 dias de incubao. Pode-se visualizar no microcultivo hifas finas e longas com ramificaes, hifas areas e
condios (via assexuada de propagao com forma arredondada). No alcoolcido resistente, e apenas os condios podem apresentar essa propriedade;
metaboliza a glicose por oxidao e cresce a 50oC. As colnias so mais secas
com diferentes pigmentos (creme, marron, preto, etc), com a presena ou no
de hifas areas. Uma caracterstica importante das colnias o cheiro de terra
molhada.
6.8.3
Rhodococcus
Importncia clnica
R. equi est relacionado com infeces em humanos, principalmente em indivduos imunocomprometidos, especialmente entre pacientes que apresentavam
sndrome da imunodeficincia adquirida (SIDA), neoplasias ou terapias imunossupressoras.
Quadros de pneumonias causados pelo R. equi podem surgir como o primeiro
sintoma de infeco pelo HIV. As manifestaes clnicas pulmonares incluem abscessos pulmonares, pneumonia piogranulomatosa e cavitao de aspecto semelhante tuberculose pulmonar, sendo comum a presena de febre, tosse e dores
no peito. Alguns autores sugerem que a deteco de infeco por R. equi deveria
ser rotineiramente utilizada como um critrio para o diagnstico de SIDA.
Outras patologias humanas, tais como malacoplaquia pulmonar, abscessos cerebrais e na tireide, mediastinite, pericardite, linfadenite, osteomielite, endoftalmite e infeco de feridas, alm de adenite retroperitoneal, com diarreia sanguinolenta e/ou abscesso no psoas, tambm podem estar associadas infeco
por R. equi.
Infeces pulmonares, associadas ou no a acometimentos extrapulmonares, so
observadas na maioria dos casos de infeco em indivduos imunocomprometidos
e imunocompetentes. Entretanto, leses exclusivamente extrapulmonares
ocorreram principalmente entre indivduos imunocompetentes.
Em indivduos imunologicamente competentes o R. equi foi relacionado com

quadros de meningite, osteomielite, artrite sptica, endoftalmite e retinite em
indivduos imunocompetentes, alm de processos infecciosos em crianas (9
meses e 13 anos de idade).
Em algumas oportunidades, o desenvolvimento de infeco por R. equi foi relacionado com o contato prvio dos pacientes com animais.
O R. equi agente etiolgico de broncopneumonias supurativas, linfoadenites
e enterites em equinos, responsvel por aproximadamente 10% dos casos de
pneumonia e 3% de morte em potro. Infeco pelo R. equi tambm pode ocorrer em bovinos, caprinos, ovinos, sunos alm de ces e gatos. O R. equi pode ser
isolado de animais sadios e assintomticos, principalmente em regies rurais endmicas. Em raras oportunidades outras espcies do gnero Rhodococcus e dos
gneros Gordonia e Tsukamurella foram associados a infeces em humanos.
Rhodococcus sp. foram isolados de casos de septicemia endoftalmites. Gordonia spp. de infeces cutneas, pulmonares e sistmicas enquanto Tsukamurella
spp. foram isoladas de casos de meningite, pneumonia e peritonite.
103
104
O diagnstico clnico diferencial deve ser feito com micobactrias, fungos,

nocardia e actinomices. Hemoculturas com elevada frequncia podem ser
positivas.
O R equi aerbio, no formador de esporos, imvel, catalase-positivo, DNAse
e gelatinase negativos, CAMP positivo (utilizando cepa de Staphylococcus
aureus produtora de beta-lisina), incapaz de hidrolizar a esculina, apresenta
variabilidade na reduo do nitrato e produo de urease e no fermenta
acares. Alguns autores descreveram amostras de R. equi esculina-positivas e/
ou capazes de metabolizar a glicose.
A colheita e o transporte dos espcimes seguem os procedimentos comumente
utilizados na rotina laboratorial. As amostras de R. equi podem ser isoladas
principalmente a partir de sangue, secrees do trato respiratrio, extremidades
de cateteres e de outros stios de infeces de acordo com o quadro clnico do
paciente. Procedimentos invasivos, como a broncoscopia, podem favorecer o
isolamento do micro-organismo nas secrees do trato respiratrio inferior.
Na bacterioscopia direta dos espcimes clnicos, o R. equi pode ser observado
sob a forma de bastonetes ou cocobacilos localizados extra ou intracelularmente.
Em algumas oportunidades o micro-organismo apresenta-se lcool-cido
resistente pelos mtodos de colorao de Ziehl ou de Kinyoun. Entretanto os
procedimentos de descontaminao dos espcimes clnicos utilizados para
micobactrias podem ser prejudiciais ao isolamento do micro-organismo.
A maioria dos meios de cultivo empregados na rotina microbiolgica permite
o crescimento dos micro-organismos do gnero Rhodococcus, Gordonia e
Tsukamurella. Meios seletivos especficos tambm podem ser utilizados na
rotina microbiolgica (NANAT). As culturas devem ser incubadas em aerobiose
ou em atmosfera de 5% de CO2 em temperaturas entre 35 e 370C. Devem ser
examinadas a cada dois dias durante a primeira semana de incubao e 3 a 4
dias durante a segunda e terceira semanas. Nos cultivos realizados em meios
slidos, inicialmente o R. equi pode originar colnias esbranquiadas, no
hemolticas, comumente mucoides, que frequentemente podem adquirir
colorao rosada ou salmo dentro de 4 a 7 dias. No entanto, outras coloraes,
tais como vermelho, coral, laranja, amarelo, creme at o branco podem ser
observadas mais raramente, sendo tambm infrequente a formao de colnias
no mucides.
A diferenciao entre as espcies dos gneros Rhodococcus, Gordonia, Tsukamurella e Nocardia pode ser difcil. As cepas de R. equi so sensveis aos antimicrobianos vancomicina, eritromicina e gentamicina permitindo uma diferenciao preliminar das cepas de nocardias.
As dificuldades no diagnstico microbiolgico parecem decorrer do isolamento
de amostras bacterianas que assemelham-se morfologica e bioquimicamente
ao R equi (Rhodococcus equi-like). Segundo alguns autores, tambm tem sido
frequente a caracterizao errnea do R. equi como Mycobacterium ou o seu
descarte como mero contaminante.
Alm dos mtodos bioqumicos convencionais encontram-se comercialmente
disponveis sistemas semiautomatizados de identificao, alm de mtodos moleculares.
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108
Captulo 7:
Fastidiosos
John Anthony McCulloch
Carlos Emlio Levy
7.1 Introduo
7.1.1
Caractersticas gerais dos fastidiosos

Esse grupo heterogneo de bactrias apresenta como caracterstica comum
exigncias especiais de condies de cultivo, em relao s enterobactrias
e maioria dos bacilos Gram-negativos no fermentadores. As condies de
cultivo variam para cada micro-organismo, tal como uma concentrao de
CO2 maior do que a da atmosfera, um maior tempo de incubao (30 dias
no caso de espcies do gnero Brucella), ou a suplementao de meios de
cultivo com fatores especiais de crescimento, etc.
7.1.2
Pontos-chave para classificao

Os fastidiosos so bactrias Gram negativas ou Gram lbeis (coram-se de forma tnue pela safranina).
Muitos, mas no todos, so coco-bacilos e oxidase positivos; no crescem
em gar MacConkey. Para teste de fermentao de carboidratos exigem uma
base mais rica do que a base O/F, usualmente empregada. Uma opo para
testar a fermentao de carboidratos usar CTA como base (vide fascculo
de Meios de Cultura). Para cultivo in vitro, o inculo deve ser denso, sendo
que muitas vezes necessria a adio de 2 ou 3 gotas de soro de coelho ou
cavalo para permitir o crescimento nos meios utilizados para provas bioqumicas.
Com exceo das espcies do gnero Capnocytophaga spp., que crescem
formando colnias grandes e com aparncia de vu em torno da colnia, os
demais fastidiosos crescem lentamente e necessitam 48 a 72 horas para que
as colnias fiquem plenamente visveis, ainda que diminutas.
109
Alguns desses patgenos em potencial esto associados a sndromes clnicas bem definidas, embora no frequentes, tal como a brucelose e tularemia. importante nesses casos obter informaes adicionais com o mdico
assistente ou o paciente/familiares para facilitar o processo de identificao
microbiolgica. Sempre se deve valorizar isolados de hemocultura, principalmente se ocorrerem em mais de uma amostra, ou em materiais com bom
valor preditivo de infeco, tais como LCR, lquidos pleural, pericrdico e sinovial e lavado broncoalveolar.
Cabe destacar que alguns fastidiosos podem positivar sistemas automatizados de hemocultura ao mesmo tempo em que a bacterioscopia pode apresentar-se aparentemente negativa tanto pelo pequeno tamanho da bactria
como pela m colorao pela safranina.
A topografia do local de isolamento uma pista importante, pois diferentes
espcies pertencentes aos gneros Neisseria, Haemophilus, Bordetella, Capnocytophaga, Actinobacillus, Eikenella, Kingella e Cardiobacterium podem ser
encontrados em pele e mucosas enquanto que bactrias do gnero Gardnerella o so em locais especficos, tal como no trato genital.
Como o tratamento de infeces causadas por bactrias fastidiosas pode requerer a utilizao de esquemas teraputicos pouco usuais, extremamente importante chegar definio do gnero ao qual um isolado fastidioso
pertence ou encaminh-lo a um Laboratrio de Referncia se o gnero no
puder ser definido no laboratrio de rotina. A correta identificao de um
fastidioso tambm importante por motivos de epidemiologia, uma vez
que um aumento na incidncia de infeces por essas bactrias caracterizaria um surto, e logo, um problema de sade pblica.
O diagnstico correto de casos isolados de brucelose, legionelose e coqueluche (causada por Bordetella pertussis) tem importncia individual e coletiva,
sendo por isso de suma importncia que o microbiologista tenha em mente
esses patgenos e saiba caracteriz-los ou tenha a iniciativa de encaminhar
o espcime clnico ou a cepa isolada para Laboratrio de Referncia.
A Pasteurella spp., embora considerada uma bactria fastidiosa, cresce com
facilidade em gar Sangue, gar Chocolate, e comporta-se no TSI como fermentador, todavia no cresce em meio MacConkey. oxidase positiva.
A transmisso de algumas bacterias fastidiosas ocorre atravs de contato
com fluidos biolgicos contaminados (saliva, sangue e fezes), atravs de acidente com materiais prfuro-cortantes ou mordedura de animais domsti110
cos ou silvestres, que podem transmitir infeces por bactrias dos gneros
Pasteurella, Bartonella, Francisella e Brucella.
Destaca-se ainda a necessidade de precaues especiais no manuseio de alguns desses agentes pelo seu potencial patognico (gneros Brucella e Francisella).
Com base na importncia clnica e epidemiolgica, esse grupo de bactrias
ser dividido em dois grupos:
Grupo A: maior interesse clnico e epidemiolgico

Grupo B: casos clnicos espordicos/microbiota oral humana
A) Grupo A Maior interesse clnico e epidemiolgico

Bactria
Hospedeiro principal
Via de transmisso
Bordetella pertussis/parapertussis
Homem
Secrees de vias areas
Bartonella spp.
Gatos, humanos
infectados,outros
desconhecidos.
Mordida ou arranho de gato;

picada de piolho infectado
Brucella spp.
Mamferos domsticos
Leite e derivados, carne, sangue,

secrees de animais doentes
Francisella spp.
Animais silvestres
Picada de carrapato ou mosquito

infectado em zona endmica
Haemophilus spp.
Homem
Secrees de vias areas
Legionella spp.
Meio ambiente/gua
Inalao de gua contaminada
Pasteurella spp.
Animais domsticos/silvestres
Mordida e secrees de animais

domsticos e silvestres
B) Grupo B Casos clnicos espordicos

Bactria
Fonte
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Cavidade oral humana
Cardiobacterium hominis
Capnocytophaga spp.
Chromobacterium violaceum
gua e solo
Eikenella corrodens
Kingella spp.
Streptobacillus spp.
Cavidade oral de roedores
111
As caractersticas desse grupo heterogneo so:

Dificuldade ou ausncia de crescimento em meios ricos como gar Sangue e gar Chocolate.
Exigncia de incubao em diferentes concentraes de CO2.
Dificuldade em caracteriz-los, pois exigem meios enriquecidos.
Crescimento lento e pouca importncia clnica, talvez pela dificuldade do
seu isolamento e caracterizao.
Os gneros Actinobacillus, Capnocytophaga e Eikenella tm em comum o
fato de pertencerem microbiota da cavidade oral humana e estarem relacionados a doenas gengivais e, a partir desse foco, doenas sistmicas
especialmente em indivduos imunocomprometidos.
As espcies dos gneros Kingella e Cardiobacterium so residentes do trato respiratrio humano.
Em contraste, as bactrias desse grupo que no so encontradas em seres
humanos so: Chromobacterium violaceum que encontrada na natureza,
em gua e solo; e o gnero Streptobacillus, na orofaringe e nasofaringe de
camundongos selvagens e de laboratrio.
7.1.3
Principais fastidiosos e diagnstico
Bactria
Material clnico
Meio especfico
Bordetella pertussis
Swab de nasofaringe
Meio de Bordet &

Gengou
7 dias
Bartonella spp.
Sangue, gnglios, bipsias
gar chocolate, gar

sangue de carneiro
5 a 15 dias
Brucella spp.
Sangue, aspirado de medula
Rotina de
Hemocultura ou meio
de Castaeda
At 30 dias
Francisella spp.
Gnglios, bipsias
gar chocolate
enriquecido
7 dias
Haemophilus spp.
Sangue, LCR
gar chocolate de
cavalo
48-72 h at 7 dias
Legionella spp.
Secrees ou aspirados de
trato respiratrio inferior
Meio especfico BCYE*
7 a 14 dias
Pasteurella spp.
Sangue, LCR, leses
gar sangue, gar

chocolate
24 a 72 h
* gar extrato de levedura, carvo, com pirofosfato frrico e alfa-cetoglutarato.
112
Incubao
7.1.4
Principais provas diferenciais para os fastidiosos
Bactrias
Oxidase
Catalase
Motilidade
gar
Sangue
Actinobacillus
actinomycetemcomitans
neg/+
fraco
neg
Bartonella spp.
neg
neg
varivel
Bordetella pertussis
varivel
neg
neg
neg
Brucella spp.
neg
Capnocytophaga spp.
neg
neg
neg
neg
neg
Chromobacterium spp.
Eikenella corrodens
neg
neg
Francisella tularensis neg
neg
fraco
neg
neg
Chocolate
+
7.2 Bartonella
A classificao taxonmica dos membros do gnero Bartonella ainda no definitiva
e agrupa as espcies B. bacilliformis, B. quintana, B. henselea, B. elizabethae e Afipia felis.
B. bacilliformis o agente etiolgico da verruga peruana (febre de Oroya), doena geograficamente restrita regio dos Andes, caracterizada por profunda anemia,
trombocitopenia, adenopatia, mialgia, delrio, coma e alta mortalidade.
B. quintana causa de doena febril que afetou soldados na I Guerra Mundial, conhecida como febre das trincheiras, e relacionada picada por piolhos infectados e
m higiene. Caracterizada por febre e bacteremia com durao varivel. Casos associados infeco por HIV foram relatados.
B. henselae pode causar bacteremia, principalmente em imunossuprimidos, bem
como uma sndrome conhecida como doena da arranhadura do gato. O quadro de
bacteremia caracteriza-se de forma insidiosa por fadiga, dores no corpo, perda de
peso e febre progressiva. A doena da arranhadura do gato manifesta-se inicialmente
com uma ppula ou pstula localizada cerca de uma semana aps a leso causada
pelo animal (gato ou co que arranha ou morde). Aps 1 a 7 semanas ocorre adenopatia regional. Um tero dos pacientes apresenta febre e um em seis apresenta supurao do linfonodo afetado. A maioria dos pacientes evolui sem outros sintomas.
A cura espontnea ocorre entre 2 a 4 meses do incio da infeco. B. quintanae e B.
henselae podem causar um quadro de angiomatose bacilar caracterizado por proliferao neovascular envolvendo pele, gnglios e fgado. A infeco por B. elizabethae
ainda pouco conhecida.
113
Afipia felis foi considerada por vrios anos como sendo o agente etiolgico da doena da arranhadura do gato, que hoje atribuda B. henselae. Seu papel na patognese dessa doena ainda no est bem esclarecido.
Isolamento As espcies do gnero Bartonella podem ser isoladas de hemoculturas,
leses cutneas, bipsias e gnglios.
O SPS (polianetol sulfonato) que o anticoagulante comumente usado em hemoculturas inibidor de espcies do gnero Bartonella, por isso deve-se usar outro anticoagulante.
Quando h suspeita clnica, deve-se incubar por pelo menos sete dias, at 40 dias.
Vrios meios enriquecidos podem permitir o crescimento das espcies do gnero
Bartonella. O caldo infuso corao de preparo recente, com 5-10% de sangue desfibrinado de coelho ou cavalo adequado, bem como o gar chocolate.
Essas espcies podem crescer no meio de cultura do sistema Bactec, todavia o alarme
de CO2 que indica o crescimento bacteriano pode no ser acionado. Bartonella spp.
exige atmosfera mida e temperatura de 35-37oC por 3 a 4 semanas. B. bacilliformis e
Afipia fellis crescem melhor entre 25 a 30oC.
Identificao Colnias podem crescer rugosas ou lisas, de um mesmo material.
So bacilos Gram-negativos pequenos, s vezes curvos. As espcies B. quintana e B.
henselae, que so as mais frequentemente isoladas, so caracterizados pelas seguintes provas: catalase e oxidase negativas, motilidade em lmina presente (que no
devida a flagelos, uma vez que essas espcies no o possuem, mas sim a fmbrias). O
perodo de incubao longo (maior do que sete dias). A espcie B. henselae bastante aderente ao meio.
Provas para diferenciao de espcies de Bartonella e de A. felis
Espcies
Oxidase
Ureia
Flagelo
Motilidade
B. baciliformis
neg
neg
B. quitanae
neg
neg
neg
B. henselae
neg
neg
neg
B. elizabetae
neg
neg
neg
neg
neg
A. felis
* Motilidade por fmbrias
114
Catalase
7.3 Bordetella sp.

7.3.1
O gnero Bordetella compreende as espcies B. pertussis, responsvel pela
coqueluche ou tosse comprida, e B. parapertussis, com quadro clnico semelhante ao da coqueluche, mas em geral menos severo. Ambas as espcies so exclusivamente patognicas para humanos. A B. bronchiseptica e B.
avium so bactrias comensais de mamferos e aves, causando infeces em
ces (tosse dos canis) e a B. avium causa rinotraquete em perus. So patgenos oportunistas para humanos que entram em contato com esses animais.
Foram classificadas mais recentemente como pertencentes ao gnero Bordetella as espcies B. holmesii e B. hinzii.
7.3.2
Importncia clnica
A Bordetella pertussis causa a coqueluche em crianas no vacinadas, com
quadro clnico bastante caracterstico: Perodo prodrmico que inicia 5 a 10
dias aps a aquisio do agente, com sintomas semelhantes a um resfriado
ou gripe. Essa fase altamente contagiosa e os sintomas so inespecficos.
Segue-se o perodo paroxstico, com quadro de tosse convulsiva, persistente
e caracterstica, seguida de inspirao ruidosa. Podem ser acompanhadas de
cianose e vmito e vrias complicaes, tal como convulses, insuficincia
respiratria, encefalopatia e infeces secundrias. A convalescena ocorre
cerca de quatro semanas aps incio dos primeiros sintomas.
7.3.3
Material clnico e Semeadura

Para cultivo, podem ser coletadas secreo de nasofaringe por aspirao ou
swab seguido de semeadura imediata em meio de Bordet & Gengou suplementado com 40 g/mL de cefalexina (para inibir os contaminantes da microbiota) recm-preparado. Um meio alternativo mais especfico e sensvel o
MCS (Ohtuska et al., 2009). Os meios devem ser incubados a 35C por 5 dias
at a obteno de colnias. Pode-se realizar uma prova de imunofluorescncia utilizando material colhido da nasofaringe, em concomitncia com o
cultivo, que por sua vez mais especfico, e no pode ser omitido. O cultivo,
todavia no sensvel j na fase de convalescena, quando ento a melhor
opo para diagnstico a sorologia do paciente. Devido s dificuldades
inerentes cultura, outro mtodos tm sido utilizados com algumas vantagens. Esto entre esses a imunoflorescncia direta (FA) e o PCR realizados a
partir do material clnico. Diferentes iniciadores ou primers tm sido usados
para PCR. Uma combinao de mtodos incluindo testes sorolgicos talvez
seja a melhor abordagem.
115
Vrios meios de transporte so indicados, incluindo casena hidrlise cida

a 1% (Casamino cido) e meio de Amies acrescido de carvo. Vrios meios
de isolamento foram descritos, O meio tradicional consiste em base de batata (Bordet-Gengou) ou de carvo suplementado com glicerol, peptona e
sangue de cavalo ou carneiro. Antimicrobianos com cefalexina devem ser
adicionados para diminuir o crescimento da microbiota.
7.3.4
As espcies do gnero Bordetella so cocobacilos Gram-negativos pequenos
e aerbios estritos. Na colorao de Gram, a safranina deve ser deixada por
2 minutos. Para B. pertussis e B. parapertussis os Laboratrios de Referncia
devem dispor de identificao sorolgica para acelerar a identificao.
Provas diferenciais para espcies de Bordetella
Espcies
Oxidase
Motilidade
Ureia
gar Sangue e
Chocolate
B & G ou
Regan-Lowe
Salmonella
-Shigella
B. pertussis
neg
neg
neg
+ 3-6 dias
neg
B. parapertussis
neg
neg
+ em 24h
+ 2-3 dias
neg
B. bronchiseptica
+ em 4h
+ 1-2 dias
B. avium
+2
neg
+ 1-2 dias
B. holmesii
neg
neg
neg
+ 1-2 dias
B. hinzii
varivel
+ 1-2 dias
1 necessita de meio especfico: Bordet & Gengou (infuso de batata + glicerol + sangue de carneiro)
ou Regan Lowe. 2 mais evidente a 25C
7.4 Brucella sp.

A brucelose uma doena de sintomas vagos, de curso insidioso com febre baixa,
calafrios, sudorese noturna, cefaleia, mialgia e artralgia. Pode ser acompanhada, na
forma crnica, de alteraes hematolgicas importantes como leucopenia, pancitopenia, trombocitopenia e anemia hemoltica.
7.4.1
116
Importncia clnica
A brucelose pode ser contrada atravs da ingesto de leite e seus derivados
ou de carne de mamferos infectados. Profissionais como veterinrios, aougueiros ou trabalhadores rurais que manipulam carne e sangue desses animais esto sujeitos infeco. H relatos de contrao de brucelose devido
a acidentes em laboratrios que trabalham com Brucella sp. A hemocultura
exige um tempo maior do que 5 a 7 dias de incubao. importante a infor-
mao de suspeita clnica para orientar o laboratrio na pesquisa e caracterizao do agente.

7.4.2

Sangue, aspirado de medula, aspirado e bipsia de gnglios, fgado, bao,
LCR e outros materiais. A partir do segundo dia de febre, as hemoculturas
podem apresentar-se positivas, ocorrendo tambm hemoculturas positivas
em pacientes afebris. Outro recurso utilizado para facilitar o isolamento o
mtodo de lise-centrifugao:
Colher 5 a 10mL de sangue em tubo de 50mL com 1,5mL de citrato de
sdio a 4%.
Adicionar cerca de 40mL de gua destilada estril.
Centrifugar 2.000g por 30 minutos.
Transferir 0,5mL do sedimento para uma placa de gar sangue e semear.
Pode-se fazer o mesmo com LCR e aspirado de medula.
Incubar 35oC em estufa com atmosfera de 5% a 10% de CO2 (com gerador
de CO2 ou estufa apropriada).
7.4.3
As espcies do gnero Brucella so aerbios OF oxidativos, crescem nos frascos de hemocultura, meio de Thayer Martin, gar sangue, gar chocolate
tendo como gar base Tripticase Soy gar ou Brucella gar, mas no cresce em Mc Conkey. O crescimento visvel em 48 a 72 horas aps inculo.
As colnias so pequenas, brancas a creme, e atravs da colorao de Gram
visualizam-se coco-bacilos bem finos e pequenos.
Espcies mais importantes so:
melitensis, abortus, suis e canis.
Ureia positivos: B. suis (1 a 30 minutos), B. canis (1 a 30 minutos) e B. abortus (1 a 2 h).
no meio ureia de Christensen.
H2S com tira de acetato positivo: B.abortus e de B.suis (biotipo 1).
CO2 para crescimento: biotipos de B. abortus e B. ovis.
117
Provas para a diferenciao de coco-bacilos Gram-negativos

Bactria
Oxidase
Motilidade
Ureia
gar Sangue
Mac Conkey
Brucella spp.
neg
neg
Bordetella bronchiseptic
neg
Acinetobacter spp.
neg
neg
varivel
Moraxella phenylpyruvica
neg
Pasteurella spp.
neg
varivel
neg
Haemophilus influenzae
neg
varivel
neg
neg
* cresce no TSI como fermentador acidificando pice e base sem gs.
Considerando que as espcies do gnero Brucella so de difcil identificao

em laboratrio no especializado, um isolado que for identificado no laboratrio de rotina como pertencente a esse gnero deve ser encaminhado a um
laboratrio de referncia para confirmao. Suspeitar quando houver quadro clnico sugestivo, quando o isolado for encontrado em amostra de sangue ou medula, cuja cultura resulta em crescimento de coco-bacilos finos
que se coram fracamente, so oxidase e catalase positivas, e que crescem
lentamente em gar sangue ou chocolate. A prova de soroaglutinao com
anticorpos especficos til como elemento da caracterizao.
7.5 Francisella tularensis

um coco-bacilo pequeno, Gram-negativo, no-mvel e pleomrfico, aerbio estrito e
capsulado.
Apresenta grande resistncia perda da viabilidade no meio ambiente, sobrevivendo
semanas em meios midos, carcaas de animais, gua e lama. o agente etiolgico
da tularemia, uma doena de animais selvagens transmitida por vetores artrpodes
hematfagos. transmitida principalmente por carrapatos, mas tambm por mosquitos.
Nos Estados Unidos prevalece o biovar A, mais grave, enquanto que no hemisfrio
sul prevalece o biovar B que causa tularemia em uma forma clnica mais branda, sendo raramente diagnosticada, principalmente devido ao pouco conhecimento sobre a
bactria e a doena pelos profissionais de sade.
7.5.1
118
Fontes de transmisso
Centenas de espcies de animais silvestres, bem como algumas espcies domsticas (incluindo ces, gatos e pssaros), podem ser portadores desse agente. Cerca de uma dezena de espcies diferentes de inseto servem de vetores. A
transmisso pode ocorrer tambm por contato direto com animais infectados
atravs de sua mordida, exposio ao sangue, carne contaminada e eventualmente gua contaminada por esses animais, e at mesmo pela inalao de
aerossis deixados pelos animais infectados.
7.5.2
Quadro clnico
A bactria extremamente infectante, sendo que o material clnico suspeito
deve ser manipulado de acordo com as prticas de biossegurana nvel 2,
mas culturas puras dessa espcie devem ser manipuladas de acordo com as
prticas de biossegurana nvel 3. A dose infecciosa de apenas 10 clulas
injetadas por via subcutnea ou 25 clulas inaladas. Logo aps a penetrao
do agente, o que ocorre em geral pela pele, aparecem sintomas semelhantes
aos da gripe: febre, tremores, cefaleia e mialgia. Aps um perodo de incubao de 2 a 10 dias, forma-se uma lcera no local de penetrao, que pode
persistir por meses. Os linfonodos que drenam a regio inicialmente afetada
ficam entumecidos e ento pode ocorrer necrose do tecido. Se a bactria
conseguir atingir a circulao sangunea, o quadro de endotoxemia tpico se
manifesta. Esses casos so pouco frequentes e ocorrem quando o inculo for
grande ou o paciente imunocomprometido. A mortalidade alcana 60%,
ocorrendo toxemia, cefaleia intensa, febre elevada e contnua, com delrios,
prostrao e choque.
A forma lcero-ganglionar ocorre em cerca de 80% dos casos relatados. A
lcera endurada, eritematosa, e de difcil cicatrizao. Outras formas relatadas so a culo-ganglionar, a ganglionar sem lcera, a pleuropulmonar e
a gastrointestinal.
7.5.3

Os materiais que oferecem maior valor preditivo positivo so aqueles obtidos a partir de raspados de lceras, bipsias e escarro. A Francisella tularensis
cresce em gar chocolate suplementado com o suplemento comercialmente disponvel Isovitalex . Um laboratrio de referncia deve ser consultado
sobre as tcnicas e procedimentos mais recentes para a correta identificao
dessa espcie e, se necessrio, pode realizar a confirmao da identificao
da amostra.
7.5.4
A bacterioscopia de material clnico de leses ou bipsias raramente ajuda,
pois o micro-organismo muito pequeno e cora mal pelo mtodo de Gram,
tornando difcil a sua observao por microscopia ptica. Esse agente deve
ser considerado sempre que houver doena associada a picada de carrapato
e formao de lcera com comprometimento ganglionar. Entretanto, o diag119
nstico microbiolgico difcil, sendo na maioria das vezes feito com base
em testes de aglutinao em amostras pareadas colhidas com intervalo de 2
a 3 semanas e armazenadas a 20oC.
7.6 Haemophilus sp.

Diferentes espcies pertencentes ao gnero Haemophilus podem ser encontradas
como parte da microflora da nasofaringe e orofaringe em at 50% da populao. As
espcies so geralmente no capsuladas. H. influenzae pode causar vrios tipos de infeco, sendo H. influenzae do tipo b a sub-espcie mais virulenta. A partir do incio do
sculo XXI, com o aumento da vacinao contra Haemophilus influenzae, houve uma
drstica reduo na incidncia dessa bactria nas populaes vacinadas.
Doenas causadas pelo H. influenzae tipo b ocorrem principalmente na infncia, sendo
meningite, epiglotite, pericardite, pneumonia, artrite sptica, osteomielite, celulite
facial. Mais raramente, H. influenzae pode causar peritonite e infeco urinria em
crianas menores que cinco anos. As doenas causadas por cepas no b e no tipveis (em maiores de 9 anos e adultos associados a doena de base predisponente,
como neoplasia, AIDS, alcoolismo, DPOC) incluem traqueobronquite e pneumonia,
bacteremia, conjuntivite, otite (sendo a segunda espcie mais prevalente, depois do
pneumococo) e sinusite.
120
7.6.5
Haemophilus aphrophilus
Essa espcie faz parte da microbiota do trato respiratrio superior, especialmente em placas dentrias e no sulco gengival; pode causar endocardite e
abscesso cerebral e mais raramente meningite, pneumonia e bacteremia em
pacientes com comprometimento imunolgico. A endocardite no est necessariamente relacionada a uma leso valvular prvia, mas a associao com
embolia arterial frequente. Existem relatos tambm de isolamento em otites,
sinusites e epiglotites. Essa espcie cresce bem em gar chocolate no isolamento primrio e em gar sangue de carneiro nos subcultivos sem exigncia
de fatores X e V, mas as colnias so muito pequenas de cor amarelada, tm
cheiro de cola e necessitam de 48 a 72h para boa visualizao. Em caldo, essa
espcie tem a caracterstica de aderir-se s paredes do tubo, assim como Actinobacillus actinomycetemcomitans o faz. No crescem em meio MacConkey.
7.6.6
Haemophilus ducreyi
o agente etiolgico do cancro mole, que uma afeco de transmisso
exclusivamente sexual, mais frequente nas regies tropicais. Caracteriza-se
por leses mltiplas (podendo ser nica) e habitualmente dolorosas. Denomina-se tambm de cancride, cancro venreo, cancro de Ducrey. O perodo
de incubao geralmente de 3 a 5 dias, podendo-se estender por at 2

semanas. O cancro mole muito mais frequente no sexo masculino. Devido
ao declnio da incidncia da infeco, contaminao das leses com flora
genital, que inibe e/ou dificulta o isolamento da espcie e ao frequente uso
prvio de antibiticos o isolamento dessa bactria difcil.
O material para o isolamento deve ser colhido de lceras genitais, removendo-se previamente a secreo superficial ou lavando-a com salina estril e
utilizando um swab. Recomenda-se semear imediatamente e fazer em paralelo um esfregao a ser observado por microscopia. Em geral de difcil
cultivo. Emprega-se gar chocolate de cavalo com base GC ou meio Mueller
Hinton. O acrscimo de vancomicina pode ajudar a inibir bactrias Gram-positivas. A colorao de Gram em esfregaos do material da base da lcera, ou do material obtido por aspirao do bubo permite a observao
de bacilos Gram-negativos intracelulares dispostos em cadeias, geralmente
paralelas, acompanhados de cocos Gram-positivos. A colocao de um disco
de vancomicina pode ajudar a inibir bactrias Gram positivas. Na bacterioscopia, aparecem coco-bacilos Gram lbeis agrupados e em cadeias como
cardumes.
7.6.7
Identificao de espcies do gnero Haemophilus

Caractersticas:
Anaerbio facultativo.
No crescem no TSI e no OF-glicose.
Melhor meio de cultura para Haemophilus influenzae o gar chocolate com
sangue de cavalo. A base GC usada para Neisseria sp. indicada, embora os
hemfilos cresam em meios com outras bases, tal como Columbia e Mueller
Hinton. Esse gnero exige uma atmosfera com alta umidade e uma concentrao CO2 entre 3 a 5%, especialmente para as espcies H. influenzae e H.
aphrophilus. O gar chocolate suporta muito bem o crescimento dos Haemophilus, mas para outros fastidiosos recomenda-se adicionar suplemento de
crescimento (vitox, isovitalex ).
As diferentes espcies de hemfilos podem apresentar reao de oxidase

fracamente positiva e demorada (cerca de 25 a 20 segundos).
Em amostras de LCR, pode ser til a utilizao de tcnicas de soroaglutinao com partculas de ltex, mas a confirmao bioqumica e sorolgica em laboratrio de referncia necessria.
O antibiograma deve ser realizado em meio padronizado HTM (vide
captulo sobre meios de cultura).
121
Verificar hemlise em gar sangue de cavalo GLI = glicose SAC = sacarose

LAC = lactose
Obs.: Fermentao de aucares com base CTA e 1% de acar adicionado de
fator X e V (vide cap. meios de cultura); vide leitura de fatores X e V
7.6.8
Tcnica para testar fatores X e V

Principais provas para diferenciar algumas espcies de Haemophilus
Espcies
Fator X
Fator V
Hemlise *
Ureia
Indol
GLI
SAC
LAC
Catalase
H. influenzae
neg
neg
varivel
neg
neg
H. haemolyticus
neg
varivel
neg
neg
H. parainfluenzae
neg
neg
varivel
varivel
neg
varivel
H. ducreyi
neg
fraca
neg
neg
neg
neg
neg
neg
H. ducreyi
neg
neg
neg
neg
neg
neg
Fator V
Fator X
Fator V X
7.6.9
122
Usar meio gar tripticase soja ou BHI gar.

Discos comerciais impregnados com os fatores X=hemina/hematina e
V=NAD ou coenzima I.
Semear a bactria como se fosse fazer um antibiograma e colocar os discos com pina a uma distncia de 1,5 cm um disco do outro. Flambar a
pina antes e aps a retirada de cada disco.
Aps 24h de incubao em jarra com vela e umidade a 35oC, verificar crescimento prximo aos discos:
Haemophilus influenzae: Crescimento entre os discos (exige X e V).
Prova do satelitismo
Semear com swab uma suspenso em salina cerca de 1 a 2 da escala MacFarland no centro de uma placa de gar sangue de carneiro.
Semear em uma nica estria um repique de S. aureus hemoltico (ATCC
25923).
Incubar 18 a 24h em jarra com vela e umidade ou CO2 a 5%.
Verificar crescimento de colnias pequenas prximas a zona de hemlise
do estafilococo.
Encaminhar cepas isoladas de lquidos nobres (sangue, LCR, pleural, pericrdico) a Laboratrios de Referncia para confirmao e sorotipagem.
7.7 Legionella sp.

7.7.1
Importncia clnica
Pneumonia com ou sem sepsis a manifestao clnica mais importante,
podendo ocorrer tambm infeces de partes moles e sinusite. Est em geral associada a surtos cuja fonte a gua contaminada com esse agente.
Largamente distribuda na natureza em ambiente mido e gua potvel e
ocasionalmente em chuveiros. Est associada presena de outras bactrias
e amebas de vida livre na gua. A presena de bactrias do gnero Legionella
em material clnico humano est invariavelmente associada doena clnica.
7.7.2
Espcies e manifestaes clnicas

Existem algumas dezenas de espcies de Legionella, sendo a espcie mais
importante a L. pneumophila, sorogrupos 1 e 6. A doena pode apresentar-se
nas formas subclnica, no pulmonar, pneumonia e doena extrapulmonar.
A forma no pulmonar tem perodo de incubao curto (horas a dias), sendo
autolimitada e sem evidncias radiolgicas de comprometimento pulmonar.
Os sintomas so febre, mal-estar, mialgia e tosse. A pneumonia a forma
mais frequente de manifestao da doena, acompanhada dos mesmos sintomas acima descritos para a forma no pulmonar e em geral com tosse no
produtiva. A doena apresenta rpida progresso e, nos casos graves, a formao de abscessos so sugestivos da legionelose. Bacteremia comum e o
comprometimento dos mais variados orgos e tecidos j foi descrito.
7.7.3
Materiais recomendados
Escarro.
Aspirado traqueal e outros que nesse caso especfico esto indicados
como teis.
Lavado/escovado bronco-alveolar.
Bipsia pulmonar ou outros tecidos e aqueles obtidos em autpsia.
LCR e outros lquidos de derrame.
Urina (pesquisa de antgenos) conservar a 20oC.
Para transporte: usar frasco estril com gua destilada estril, mas no
salina, que pode inibir o cultivo. Sempre que possvel concentrar os materiais por centrifugao, evitando formar aerossis.
123
7.7.4
Recursos diagnsticos mais utilizados

Sensibilidade e especificidade de recursos diagnsticos para legionelose
Teste
124
Sensibilidade
Especificidade
Observao *
Cultura
70%
100%
Mtodo de escolha
Aglutinao pelo ltex
55-90%
85-99%
Imunofluorescncia ndireta
70-80%
>95%
til com cultura ou fins

epidemiolgicos
7.7.5
Cultura em meio enriquecido

Cresce em meio suplementado com extrato de levedura, l-cisteina, sais de
ferro e alfacetoglutarato em meio denominado BCYEa ou BCYE, e seu crescimento favorecido pela incubao em 5% de CO2. Para materiais com
microbiota, como para secreo traqueal e escarro, acidificar o meio por 15
minutos a pH 2,0 com tampo cido (0,2M HCl e 0,2M KCl) e em seguida neutralizao a pH 7,0 com KOH 0,1N.
7.7.6
Cultura em meio seletivo

Recomenda-se uso de meio seletivo, adicionando ao meio BCYE os antibiticos: polimixina B, cefamandol e anisomicina ou vancomicina, polimixina B e
anfotericina B. As colnias so azuladas ou esverdeadas.
7.7.7
Cultura em meio diferencial BCYE

Adicionado de glicina, vancomicina, prpura de bromocresol e azul de bromotimol, a cor das colnias indicativa da espcie, sendo: L. pneumophila
(branco esverdeado), L. micdadei (colnias azul claro ou acinzentadas), outras legionelas (colnias verde bem claro). Crescem bem no frasco utilizado
pelo BACTEC.
7.7.8
Identificao
So bacilos Gram-negativos finos que se coram fracamente pela fucsina ou
safranina da colorao de Gram. Aps repiques, tornam-se filamentosos.
7.7.9
Caractersticas e procedimentos
Aerbio estrito.
No primeiro isolamento a presena de l-cistena imprescindvel.
No meio BCYEa o crescimento pode ser observado a partir do 3 ao 5 dia
a 35C.
Semear o material tambm em gar sangue como controle, pois a Legionella
no dever crescer.
Aguardar 14 dias de incubao para descartar as culturas como negativas.
7.7.10 Caractersticas da L. Pneumophila

oxidase positiva fraca
catalase positiva
no sacaroltica
motilidade positiva
gelatinase positiva
hidrlise do hipurato positiva
sensvel a macroldeos, rifampicina, sulfametoxazol-trimetoprim e a quinolonas.
A identificao com base apenas em testes laboratoriais difcil. A suspeita
deve ser baseada na clnica, no aspecto da colnia, crescimento em meio
BCYEa, dependncia da l-cisteina, ausncia de crescimento em gar sangue
e gar chocolate no suplementados.
A imunofluorescncia direta de amostras clnicas utilizadas para cultura um mtodo complementar para diagnstico da legionelose. Encaminhar cepas suspeitas
a Laboratrio de referncia para confirmao.
7.8 Pasteurella sp.

A infeco pelo gnero Pasteurella constitui uma zoonose, pois se trata de bactria
que faz parte da microbiota oral e do trato respiratrio superior de alguns mamferos
no humanos e aves. As diferentes espcies esto associadas a infeces em humanos relacionadas mordida dos animais descritos abaixo ou com o contato com o
sangue, carne, carcaa, ou outros materiais de animais infectados/colonizados.
A P. multocida a espcie mais comumente isolada em material clnico humano, em
geral associada mordida ou arranhadura de ces e gatos. Caracteriza-se pela formao de abscessos ou celulite e, eventualmente, osteomielite. Infeces respiratrias
podem ocorrer, incluindo pneumonia lobar, com ou sem derrame e empiema. Em pacientes imunocomprometidos, com cirrose ou neoplasias essa espcie pode causar
bacteremia e septicemia.
125
Principais espcies de Pasteurella e doenas relacionadas

Bactria
Doenas Relacionadas
P. multocida
Microbiota do trato respiratrio de mamferos e aves (domsticos e silvestres,

encontrado na boca de cerca de 50% dos ces e gatos). Pode causar infeces em
mamferos e diarreia em aves.
P. pneumotropica
Trato respiratrio de roedores, ces, gatos, entre outros.
P. haemolytica
Infeces pulmonares em bovinos, mastite em ovelhas, sepse em ovinos e caprinos.
P. aerogenes
Infeces pulmonares em bovinos, mastite em ovelhas, sepse em ovinos e caprinos.
P. dagmatis (n. sp1)
Trato respiratrio de ces e gatos
7.8.1
Diagnstico de zoonoses
Para facilitar o isolamento e identificao de espcies do gnero Pasteurella,
muito importante a informao clnica, pois deve-se tambm considerar
outras zoonoses tal como brucelose, micobacterioses, tularemia, leptospirose e yersiniose.
A) Caracterizao microbiolgica
Coco-bacilo ou bacilo Gram-negativo podem ser capsulados.
Anaerbio facultativo (fermentador) TSI cido/cido.
Oxidase positiva em colnias isoladas em gar sangue ou gar chocolate.
Catalase positiva.
Motilidade negativa.
Indol positivo.
Sacarose positiva.
Muitas espcies so ornitina positivas.
Todas so oxidase positiva, catalase positiva e fermentadoras da glicose.
Provas diferenciais das espcies de Pasteurella sp. de importncia clnica
Espcie
Hemlise
MacConkey
Indol
Ureia
Ornitina
OF Glicose
P. multocida
neg
neg
positivo
neg
positivo
F sem gs
P. pneumotropica
neg
positivo
positivo
positivo
F gs V
P. haemolytica
positivo
V 72%
neg
neg
F sem gs
P. aerogenes
neg
positivo
neg
positivo
F sem gs
P. dagmatis (n. sp1)
neg
neg
positivo
positivo
positivo
F sem gs
Obs.: a P. multocida cresce bem em gar sangue de carneiro e gar chocolate,

formando pequenas colnias acinzentadas. No cresce em gar Mac Conkey.
Tem odor forte caracterstico e podem ser diferenciadas entre si por poucas
provas (vide tabela acima), mas dependendo do animal-fonte, outras espcies menos frequentes podem estar envolvidas.
126
7.9 Actinobacillus sp.

So habitantes das mucosas do trato respiratrio e urinrio de humanos e outros
animais. As trs espcies mais importantes so: A. actinomycetemcomitans, A. urea e
A. hominis.
A. actinomycetemcomitans est relacionada doena periodontal e particularmente
periodontite juvenil localizada, bem como endocardite e abscesso cerebral como
complicao de infeco na cavidade oral. A doena periodontal est associada endocardite pelos seguintes agentes:

A. actinomycetemcomitans
E. corrodens
Kingella spp.
As outras espcies de Actinobacillus so patgenos oportunistas e causam raramente

infeces do trato respiratrio e bacteremia.
7.9.1
Principais caractersticas para diagnstico

So coco-bacilos Gram-negativos ou pequenos bacilos que crescem em aerobiose, em uma atmosfera com umidade de 5% a 10% de CO2 ou anaerobiose em gar sangue e gar chocolate. Recomenda-se adicionar suplementos
com vitaminas e sangue lisado de carneiro ou cavalo ao gar chocolate. As
colnias ficam bem visveis com 48 a 72 h de incubao, so brancas acinzentadas, com um pregueamento no centro, fortemente aderentes ao meio
e pegajosas no primeiro isolamento.
Provas diferenciais entre os principais fastidiosos
Bactrias
Oxidase
Catalase
CO2
MacConkey
Ureia
Indol
Glic
TSI
Motil
Actinobacilus1
neg ou +
fraco
varivel
neg
neg
ac/ac
neg
Cardiobacterium
neg
neg
neg
ac/ac
neg
Eikenella
neg
neg
neg
neg
neg
alcalino
neg
Kingella
neg
neg
neg
neg
alcalino
neg
Kingella
neg2
neg
neg
neg
neg
No
cresc.
neg
Streptobacillus
neg
neg
neg
neg
neg
No
cresce
neg
Chromobacterium
varivel
neg
neg
neg
ac/ac
127
Principais caractersticas das bactrias fastidiosas analisadas

Actinobacilus sp.
Cocobacilos a bacilos longos, anaerbios facultativos, colnias cinza,

aderentes ao meio, com centro da colnia enrugado
Cardiobacterium sp.
Bacilos que podem apresentar formas semelhantes a gota dgua
Eikenella sp.
Cocobacilos com extremidades arredondadas, cheiro de gua clorada,

colnias podem corroer o meio
Kingella sp.
Pequenos cocobacilos
Capnocytophaga sp.
Fusiforme e curvo, colnias crescem espalhadas
Streptobacillus sp.
Filamentos longos
Chromobacterium sp.
Pode ter forte pigmento violeta, cresce em gar MacConkey
7.10 Capnocytophaga sp.

As espcies Capnocytophaga gingivalis, C. granulosa, C. haemolitica, C. ochracea e C. sputigena fazem parte da microbiota da cavidade oral humana, enquanto outras espcies
podem ser encontradas na boca de animais domsticos. O isolamento de Capnocytophaga sp. ocorre com maior frequncia em hemoculturas, em pacientes neutropnicos com mucosite, mas esto tambm implicadas na doena periodontal juvenil (C.
gingivalis e C. ochracea), periodontite em adultos (C. sputigena) e isoladas em placas
dentais supragengivais em adultos (C. granulosa e C. haemolytica). As doenas localizadas (ceratites, abscessos e endoftalmites), bem como doenas sistmicas (septicemia,
endocardite, osteomielite), ocorrem em pacientes imunocomprometidos ou no.
7.10.1 Morfologia e cultivo
A morfologia de espcies do gnero Capnocytophaga bem caracterstica,
facilitando a sua identificao, pois lembra um Fusobacterium sp. aerotolerante. Tem as extremidades afiladas e o centro mais largo, podendo ser encurvada e eventualmente cocoide.
Para cultivo, crescem melhor com 5 a 10% de CO2 e em anaerobiose, o que
pode levar confuso com o anaerbio estrito, se no for feita a prova de
crescimento em aerobiose com CO2. Chama a ateno o fato de crescer melhor em gar sangue de carneiro que em gar chocolate sem suplemento de
vitaminas. No crescem em gar MacConkey. O crescimento pode ocorrer
em 24 a 72 h. A colnia chata e sua borda irregular; com incubao mais
longa, nota-se o espalhamento em torno da colnia, semelhante ao que
ocorre com Proteus sp., mas em escala muito reduzida, cerca de 2 a 4 mm de
dimetro. A espcie C. haemolytica apresenta um poder hemoltico discreto,
e a espcie C. ochracea tem cheiro de amndoas.
128
7.10.2 Identificao
As Capnocytophaga sp. de origem humana so oxidase e catalase negativas,
produzem cido a partir da glicose em caldo enriquecido com soro de coelho
com inculo denso. So motilidade negativa; indol negativo; lisina, ornitina
e arginina negativas. A maioria esculina positiva (C. gingivalis varivel).
A diferenciao entre as espcies difcil. As amostras de origem animal (C.
canimorsus e C.cynodegmi) so oxidase, catalase e arginina positivas.
7.11 Eikenella sp.

Tambm uma espcie que faz parte da microbiota da cavidade oral humana e pode
causar infeces periodontais, sendo encontrada na placa bacteriana subgengival
em adultos com periodontite. Isolada de material obtido do trato respiratrio inferior, abscessos de partes moles, sangue e fludos estreis infectados em casos de infeces pleuropulmonares, infeces ps-cirrgicas, artrite, meningite, endocardite
e septicemia.
7.11.1 Cultivo, bacterioscopia e identificao
anaerbio facultativo, mas cresce melhor em atmosfera com 5% de CO2,
em gar sangue e chocolate, mas no em gar MacConkey. O crescimento
lento, necessitando de 2 a 4 dias para boa visualizao das colnias. Em
cerca da metade das cepas, pode-se observar a corroso do gar, que sua
caracterstica marcante. Produz um pigmento amarelo claro e tem odor de
hipoclorito no gar sangue e gar chocolate.
Na bacterioscopia so observados bacilos delgados ou coco-bacilos Gram-negativos com extremidades arredondadas. Bioquimicamente, caracteriza-se por ser oxidase positiva, catalase negativa, motilidade negativa e ornitina positiva; provas negativas para a utilizao de carboidratos, ureia, indol e
esculina.
7.12 Kingella sp.

Espcies do gnero Kingella fazem parte do trato respiratrio e genito-urinrio humanos. K. kingae a espcie mais importante e um patgeno oportunista responsvel
por casos graves de endocardite, osteomielite, septicemia, com provvel porta de
entrada em leses da mucosa da orofaringe. A doena valvular pode estar ou no
associada doena cardaca prvia. A osteomielite ocorre com maior frequncia em
crianas menores de 5 anos. Os quadros spticos podem ser semelhantes doena
meningoccica.
129

A K. kingae cresce em gar sangue e gar chocolate com 5% de CO2, aps
pelo menos 48 h de incubao, mas no em gar MacConkey. Tem como
caracterstica ser beta-hemoltica no gar sangue de carneiro, no produz
hemlise intensa. Pode crescer numa mesma placa de isolamento como colnias lisas e convexas ou fazendo corroso, ou colnias espalhadas como se
fossem mveis.
So coco-bacilos que ocorrem aos pares ou cadeias curtas, podendo ser confundida com Neisseria spp. So oxidase positiva, motilidade e catalase negativas, e acidificam a glicose lentamente.
7.13 Cardiobacterium hominis

Fastidiosos oxidase positivas e catalase, ureia e esculina negativas
Bactrias
Hemlise
Indol
Ornitina
Glicose
C. hominis
neg
neg
E. corrodens
neg
neg
neg
K. kingae
neg
neg
Cardiobacterium sp. faz parte da microflora do trato respiratrio humano e ocasionalmente do trato urogenital. Est associada quase exclusivamente a quadros de endocardite, precedidos de manipulao dentria.
Cresce em 3 a 5 dias em hemoculturas, mas no causa alteraes no meio
(turvao, hemlise, pelcula ou grumos). Cresce em 3 a 5 dias em 5 a 7%
de CO2, em gar sangue e gar chocolate, mas no em gar MacConkey. As
colnias so branco-amareladas e podem manifestar um pequeno espraiamento, simulando motilidade no gar como o Proteus spp., e eventualmente
pode apresentar corroso do gar.
So bacilos Gram-negativos, podendo apresentar pleomorfismo com extremidades dilatadas como bulbos que podem reter corante cristal violeta da
colorao de Gram e apresentam arranjos caractersticos em agrupamentos
de rosetas e formas isoladas como gota dgua ou halteres. Deve-se observar
essas caractersticas para no confundi-los com bacilos Gram-positivos.
Uma prova fundamental a pesquisa de produo de indol, que deve ser feita em caldo triptona, com inculo denso, com incubao de 48 h, e extrao
com xilol e uso do reagente de Ehrlich.
130
7.14 Chromobacterium violaceum

Encontrada na natureza no solo e na gua, a infeco em geral est relacionada a
leses cutneas aps contato com esses elementos. As leses localizadas ou formas
septicmicas graves com mltiplos abscessos tm sido esporadicamente relatadas.
Mais raramente, diarreia e infeco urinria tm sido descritos.
7.14.1 Cultivo e bacterioscopia
um bacilo Gram-negativo anaerbio facultativo, reto ou ligeiramente curvo, com extremidades arredondadas, isolados ou em arranjos aos pares ou
em cadeias curtas.
Diferente da maioria dos fastidiosos, cresce, alm de no gar sangue e chocolate, tambm em gar MacConkey. Apresenta colnias convexas, lisas e de
cor violeta forte, embora algumas variantes sem cor possam ocorrer. Algumas cepas podem ser fracamente hemolticas no gar sangue.
7.15 Streptobacillus moniliformis

Encontrado na nasofaringe e orofaringe de ratos, camundongos e outros roedores
domsticos, tal como a cobaia. As infeces esto relacionadas mordida desses roedores ou ingesto de leite ou alimentos contaminados. A febre por mordedura do
rato apresenta quadro clnico bem definido com perodo de incubao de cerca de
10 dias, incio abrupto com febre alta, tremores, cefaleia intensa, vmitos e artralgia
migratria.
Ocorre um rash semelhante ao do sarampo, com erupes maculopapulares podendo ser pustulosa, com petquias ou prpuras nas extremidades, incluindo regio palmar e plantar. Complicaes graves podem ocorrer, como endocardite, pericardite,
septicemia e abscesso cerebral. Sem tratamento, pode evoluir favoravelmente em 2
semanas ou pode se tornar crnica; a mortalidade chega a 10%.
um bacilo Gram-negativo muito pleomrfico, podendo ter em culturas
mais velhas de 1 a 150 m de comprimento (habitualmente bactrias tm
de 1 a 3 m), com eventuais dilataes como um colar de prolas, sem apresentar ramificaes, quebrando em formas coco-bacilares. Em culturas jovens pode apresentar uma morfologia mais uniforme. O isolamento feito a
partir de hemocultura, aspirado de derrames (devem ser centrifugados para
concentr-los) e abscessos.
131
A) Meios de cultivo
Colher sangue para hemocultura com citrato. No devem ser usadas hemoculturas com SPS, pois esse inibidor do S. moniliformis.
Cultivar em meio bifsico TSA/TSB ou gar infuso corao ou caldo infuso
corao, suplementados com 10% de soro de cavalo ou 15% de soro de coelho, e 0,5% de extrato de levedura.
Incubar em jarra de anaerobiose ou 10% CO2 a 35-36oC e umidade.
Aps cerca de trs dias crescem colnias cinzas de 1-2 mm de dimetro, com
consistncia butirosa, podendo surgir colnias variantes com aparncia de
ovo frito como a de colnias de micoplasmas. Em caldo de cultura, crescem
em 2 a 3 dias com aparncia de bolas de plo.
As provas bioqumicas exigem a adio de soro de cavalo ou coelho para
suportar o crescimento. So oxidase, catalase, indol e ureia negativos; e positivos para esculina, H2S com a prova da tira de acetato de chumbo e hidrlise
da arginina. Acidificam lentamente a glicose em base CTA com 0,5% de soro
de cavalo.
132
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modified cyclodextrin solid medium. Journal of Clinical Microbiology, 47(12), 4164-7.
133
Captulo 8:
Bactrias Anaerbias Estritas
Lycia M. Jenne Mimica
8.1 Introduo
Bactrias anaerbias estritas so dominantes na microbiota anfibintica humana
e so isoladas de diversas infeces. Algumas dessas infeces so graves e apresentam altas taxas de morbidade e mortalidade. No com facilidade que se define
o termo anaerbio. Com finalidades prticas, podemos definir bactria anaerbia
estrita com base na quantidade de oxignio que ela pode tolerar, na exigncia de
uma tenso de oxignio reduzida e o no crescimento em superfcie de um meio de
cultura slido sob uma atmosfera de 10% de CO2 (18% de O2). O oxignio letal ao
anaerbio estrito porque na sua reduo so formadas substncias intermedirias
txicas (radical hidroxila/anion superxido/perxido de hidrognio) que so removidas, eventualmente, por enzimas da famlia das superxido desmutase e peroxidase,
presentes em quantidades variveis em algumas espcies, que assim garantem certa
tolerncia ao O2. Os anaerbios exigem, alm da excluso do O2, um ambiente com
potencial de xido-reduo (Eh) baixo que pode tambm variar em funo do pH
estabelecido. importante salientar que esse grupo de bactrias formado por espcies que variam de aerotolerantes a muito exigentes quanto ausncia de oxignio.
As mais estritas crescem em atmosferas com 0,5% de oxignio, muitas crescem em
atmosferas ao redor de 3% e algumas podem crescer ainda em concentraes de at
6% de oxignio (Tabela 1).
135
Tabela 1 Diferenas quanto sensibilidade ao O2 entre espcies de bactrias

% de O2 no ar atmosfrico
Espcies
0,1
0,5
1,0
3,0
6,0
10,0
C. haemolyticum
++
++
C. novyi
++
++
++
++
+,v
P. oralis
++
++
++
++
+,v
P. melaninogenica
++
++
++
++(v)
+,v
B. fragilis
++
++
++
++
+,v
F. nucleatum
++
++
++
++
++
++ crescimento; + pouco crescimento; 0 sem crescimento; v cepa dependente
Essa labilidade dos anaerbios estritos ao oxignio explica as dificuldades existentes

nos laboratrios para seu isolamento e estudo. A introduo dos aminoglicosdeos
como agentes antimicrobianos de largo espectro veio a determinar a importncia
das bactrias anaerbias em diversas infeces, uma vez que tais bactrias so intrinsecamente resistentes a essa classe de antibiticos. A partir dessa poca, as bactrias
anaerbias no esporuladas (cocos e bacilos Gram-positivos; bacilos Gram-negativos) tiveram seu papel reconhecido na etiologia das infeces, particularmente nas
intra-abdominais, nas do trato genital feminino e nas pleuropulmonares. A partir da
dcada de 1970 foram desenvolvidos procedimentos prticos de laboratrios para
criar atmosferas de anaerobiose. At esse momento, somente as infeces provocadas pelos micro-organismos mais resistentes, dentro desse grupo, os esporulados do
gnero Clostridium, eram diagnosticadas com maior frequncia. Hoje se sabe que as
infeces por Clostridium so menos frequentes que as infeces provocadas por outros gneros de bactrias anaerbias.
Um fato que tambm merece ser destacado, para explicar a frequncia com que essas bactrias provocam infeco, que os anaerbios estritos so habitantes normais
do organismo humano, ultrapassando em nmero os aerbios e anaerbios facultativos. Assim, os anaerbios estritos esto em propores 5 a 1000 vezes maiores que
os aerbios estritos e facultativos na microbiota normal do tubo digestivo, pele, trato
respiratrio superior e genital feminino.
Quando existem fatores predisponentes, essas bactrias provocam processos patolgicos em diferentes rgos e sistemas. Por esse motivo, a maior parte das infeces
provocadas pelas bactrias anaerbias estritas so infeces chamadas endgenas.
a prpria microbiota do indivduo que em determinado momento provoca o processo infeccioso, sendo esse tipo de infeco pouco ou nada contagioso. As infeces
provocadas pelo gnero Clostridium so fundamentalmente adquiridas a partir do
meio ambiente externo e por esse motivo so chamadas de infeces exgenas. Nas
mucosas, onde os anaerbios estritos so prevalentes como microbiota, a atmosfera
anaerbia conseguida devido ao metabolismo de micro-organismos facultativos e
136
aerbios estritos frente a compostos orgnicos, enzimas, restos celulares, entre outros. A ao desses micro-organismos baixa o potencial redox nesses locais.
Como as bactrias anaerbias facultativas e aerbias estritas favorecem a mutiplicao
dos anaerbios, por consumirem o oxignio existente no local e por produzirem alguns
fatores de crescimento como substncias secundrias do seu metabolismo (por exemplo, Staphylococcus sp. produz vitamina k), a maior parte das infeces por bactrias
anaerbias estritas so infeces mistas. Assim, so frequentes as infeces conjuntas
com Enterobactrias, Streptococcus sp. e Staphylococcus aureus.
Alguns aspectos clnicos fazem suspeitar de uma infeco com envolvimento de bactrias anaerbias, sendo os principais esses abaixo relacionados:

Secreo Ftida
Infeco nas proximidades de superfcie mucosa
Tecido necrtico
Presena de gs em tecidos ou secreo
Tromboflebite sptica
Colorao negra em secreo com sangue
Infeco decorrente de mordida humana ou de animal
Presena de grnulos de enxofre nas secrees
Teraputica prvia com aminoglicosdeo
Gangrena gasosa
A presena de leso com aspecto de micetoma e a observao de grnulos de enxofre

no pus caracterstica de uma infeco por Actinomyces. A infeco por anaerbios
secundria a uma mordida de animal ou do ser humano explicada pela existncia
de um grande nmero dessas bactrias na cavidade oral desses hospedeiros. Associados a esses elementos clnicos, existem alguns outros, laboratoriais, que sedimentam ainda mais a suspeita de uma infeco por anaerbios estritos:

Ocorrncia de formas pleomrficas na colorao de Gram (como regra geral, os

anaerbios so mais pleomrficos que os aerbios e anaerbios facultativos).
Observao no material clnico de bacilos Gram-positivos esporulados que lembram
Clostridium.
Observao de bactrias no material clnico corado pela colorao de Gram, que
no crescem nos meios mantidos em atmosferas de aerobiose.
Crescimento de bactrias somente na parte inferior de tubos com meios de caldo
Tioglicolato.
137
8.1.1
Fatores predisponentes
Uma variedade de condies predispe um indivduo a desenvolver infeco por anaerbios. Baixo potencial de oxi-reduo facilita o crescimento de
bactrias anaerbias. A causa clnica mais comum de diminuio do potencial redox a anxia dos tecidos resultante normalmente de leses vasculares, compresso, hipotermia, choque, edema e outras condies que levam
m perfuso.
Quanto s doenas sistmicas ou condies gerais como corticoterapia, teraputica de tumores, leucopenia, hipergamaglobulinemia, colagenoses,
diabetes, esplenectomias, embora relacionadas como predisponentes, no
h evidncia concreta de que realmente estejam associadas a maior incidncia de infeco por anaerbios.
8.2 Coleta de material

Devido presena marcante de bactrias anaerbias como microbiota das mucosas
e pele e s caractersticas endgena e polimicrobiana das infeces por anaerbios, a
coleta de materiais clnicos para a pesquisa de bactrias anaerbias representa uma
das etapas cruciais para a realizao de um diagnstico de qualidade. As amostras
devem ser colhidas de forma que no entrem em contato com oxignio e no se
contaminem com bactrias anaerbias da microbiota. Por esse motivo sempre que
possvel devem ser aspiradas com seringa e agulha, da qual eliminado o ar imediatamente aps a obteno da amostra. Amostras de tecido e bipsia tambm so adequadas para pesquisa de anaerbios. A coleta com swab deve ser rejeitada, quando
for inevitvel, incluir em meio semi slido. No so aceitveis para o processamento
laboratorial espcimes como urina obtida por mico espontnea, escarro expectorado, secrees vaginais e de feridas localizadas prximas a stios contaminados e
fezes, pelo fato de que a presena de micro-organismos componentes da microbiota
impossibilitam definies quanto etiologia dos processos infecciosos. Em resumo,
apenas espcimes clnicas que no estejam contaminadas com as bactrias anaerbias da microbiota so aceitveis (Tabela 2).
138
Tabela 2 Amostras clnicas aceitveis para isolamento de bactrias anaerbias

Local
Amostras clnicas aceitveis
Amostras clnicas no aceitveis
Cabea e pescoo
Aspirados de abscessos
Bipsias de materiais cirrgicos
Swabs obtidos durante o ato cirrgico
Swabs da oro e nasofaringe
Pulmo
Aspirado transtraqueal
Puno percutnea
Bipsias de mat. cirrgicos
Amostras de broncoscopia (protegida)
Escarro expectorado
Escarro induzido
Aspirado endotraqueal
Amostras de broncoscopia no
protegida
SNC
Swabs mantidos em aerobiose
Abdomem
Fluido peritoneal por puno

Swabs mantidos em aerobiose
Trato urinrio
Aspirado supra-pbico
Urina por mico espontnea

Urina por cateter
Trato genital
feminino
Amostras por culdoscopia

Aspirado endometrial (protegido)
DIU
Swabs vaginais ou cervicais
Ossos e articulaes
Aspirados com agulha e seringa

Bipsias de mat. cirrgicos
Material superficial obtidos com Swabs
Tecidos moles
Aspirados com agulha e seringa

Aspirados de sinus
Aspirados com agulha e seringa de
material profundo
Swabs superficiais
Intestino
Somente para pesquisa de toxinas
8.3 Transporte do material

A etapa de transporte do material coletado tambm requer cuidados especiais centrados na manuteno de condies anaerbias, visando minimizar os efeitos deletrios da exposio ao oxignio atmosfrico. O tempo depende do material e do volume da amostra. Grandes quantidades de material purulento (> 3 mL), mantidasem
tubos vedados, tm viabilidade por 2-3 horas. Tubos gaseificados (mistura de N2, H2
e CO2 ou CO2 apenas), meios de transporte semi-slidos contendo agentes redutores
139
como a cistena, dispostos em camada alta (Cary-Blair pre-reduzido, tioglicolato) ou

envelopes geradores de gs podem ser utilizados.
O transporte no deve ser feito na seringa em que o material foi colhido, pelo risco
ocupacional que representa; o material deve ser inoculado em meio de transporte
semi slido pr reduzido, como tioglicolato (fig. 1). A amostra deve ser mantida entre
18 e 22C durante o transporte.
8.4 Processamento do material

Sempre feita uma colorao de Gram da amostra recebida e, quando necessrio,
de esporos. O bacterioscpico pode orientar o clnico quanto ao diagnstico e teraputica precoce. Por exemplo, a observao de bacilos Gram-positivos esporulados
em um processo com aspecto de gangrena gasosa indicativo de Clostridium e de
gangrena gasosa.
Figura 1 Material colhido por aspirao inoculado em tioglicolato
A anlise macroscpica da amostra clnica pode fornecer informaes importantes

sobre a natureza e qualidade da amostra. Deve-se observar a presena de pus, necrose, odor ftido e presena de grnulos sulfurosos.
A observao da quantidade de bactrias na amostra permite orientar o bacteriologista se ele deve enriquecer previamente a amostra em um caldo ou semear o material diretamente nos meios de isolamento.
140
8.4.1
Produo de anaerobiose
Existem vrios procedimentos para conseguir no laboratrio uma atmosfera
de anaerobiose adequada multiplicao das bactrias anaerbias patognicas ao ser humano. Por exemplo: o uso de tubos com meios slidos pr-reduzidos a anaerobiose mantida dentro do tubo e os meios utilizados
so reduzidos e possuem indicadores de oxi-reduo.
O sistema mais empregado em laboratrios clnicos o sistema das jarras de
anaerobiose com geradores qumicos que permitem obter uma atmosfera
adequada para a multiplicao dessas bactrias. Existem diversos tipos de
geradores. Os mais utilizados so os que provocam o consumo do oxignio
atravs da reao desse com o H2, gerado pela presena de um haleto, formando gua. A atmosfera da jarra substituda por CO2, gerado pela presena de bicarbonato. Dentro da jarra colocada, alm dos geradores qumicos,
uma fita de papel de filtro impregnada de azul de metileno, que um indicador de anaerobiose. Quando a atmosfera do interior da jarra tem condies
adequadas de anaerobiose, a fita, inicialmente azul, alterada para branca.
Numa jarra de tamanho mdio de 2,5 litros, coloca-se aproximadamente 10
placas e vrios tubos. Nesse sistema o contedo de O2 da jarra cai a 0.4%,
em aproximadamente 1 hora e meia, de forma que as condies anaerbias
esto presentes bem antes da transformao do azul de metileno, que acontece por volta de 4-6 horas.
Figura 2 Jarra de anaerobiose
8.4.2
Isolamento
As amostras so semeadas em duas placas de gar preparadas com sangue
desfibrinado de carneiro em uma concentrao de 5%. As bases utilizadas
podem ser gar Brucella, gar Columbia ou gar BHI. Aos meios se adicionam tambm vitamina K e hemina bovina. Uma das placas incubada a
35-37C em atmosfera aerbia acrescida de 5% de CO2, e uma segunda
141
incubada a 35-37C em uma atmosfera de anaerobiose. A essa se acrescenta

hemina bovina (100 ug/mL), vitamina K (10 ug/mL) e extrato de levedura (2
mg/mL). Como meio seletivo para anaerbios Gram-negativos (ASL), pode-se utilizar uma terceira placa, cujo meio foi acrescido de canamicina e vancomicina, alm da vitamina K e hemina bovina.
Para se obter um meio mais eficaz quanto produo de pigmentos, o sangue de carneiro deve ser lisado pelo frio. Outro meio seletivo bastante utilizado o gar feniletialcool, suplementado com sangue de carneiro, hemina
e vitamina K, nas mesmas concentraes utilizadas no meio no seletivo.
Esse meio seletivo para bactrias anaerbias, pois inibe o crescimento de
bactrias facultativas tanto Gram-positivas como Gram-negativas.
Figura 3 Esquema de trabalho recomendado
Transporte
ASS
+VitK
Amostra
ASL
KV
PEA
Observao macroscpica
Colorao de Gram
resultado preliminar
Tioglicolato
Vit K
Hemina
Glicose sem indicador
AS
Cultura
Aerobiose
24 horas
Anaerobiose por 48 horas

GRAM para cada colnia diferente e semeadura em caldo e ASH
Ach
ASS= gar sangue suplementado | ASL= gar sangue suplementado lisado | PEA= gar feniletilacool | AS= gar sangue |
Ach= gar chocolate
A adio dos antibiticos cria um meio seletivo para bacilos Gram-negativos

anaerbios j que essa categoria de bactrias resistente aos aminoglicosdeos e bactrias Gram-positivas so sensveis vancomicina. Como a maior
parte das infeces provocadas pelos anaerbios estritos so infeces mistas, o uso de meios seletivos auxilia no isolamento bacteriano. No se justifica o uso de mais uma placa sem antibitico porque aumentam os custos
sem aumentar o isolamento de anaerbios.
Essas placas so incubadas dentro da jarra de anaerobiose a 35-37C de temperatura durante 48 horas. Quando se suspeita, pelo quadro clnico ou pela
colorao de Gram da amostra, que estamos em presena de uma infeco
142
por Clostridium, que so de crescimento mais rpido, as jarras podem ser

abertas aps 18 a 24 horas de incubao.
Por outro lado, bactrias de crescimento mais lento, como Actinomyces, podem demorar sete dias ou mais para formar colnias visveis.
8.5 Identificao bacteriana

8.5.1
Comprovao de anaerobiose estrita

Aps a incubao, as placas so examinadas e, agora o passo mais importante, a comprovao de que as bactrias isoladas nos meios de cultura
incubados em anaerobiose so anaerbias estritas.
Para esse fim, as caractersticas macroscpicas e microscpicas (colorao de
Gram) dos diferentes tipos de colnias, obtidos aps a incubao dos meios de
cultura em anaerobiose, devem ser observados. Alm disso, cada tipo deve se
semeado em gar sangue (AS) e em gar sangue suplementado (ASS) a fim de
se separar os micro-organismos facultativos dos anaerbios estritos. A primeira placa deve ser incubada a 35-37 C em atmosfera de 5% de CO2 e a segunda
em anaerobiose. Somente os facultativos crescero na primeira condio.
S feito o diagnstico de anaerbio estrito quando, aps 24 a 48 horas da
nova incubao, a bactria apenas crescer na placa de anaerobiose. A morfologia microscpica observada pela colorao de Gram das colnias orienta
para uma identificao preliminar do grupo de anaerbio isolado.
Bactrias anaerbias estritas, de importncia em patologia humana de acordo com sua morfologia na colorao de Gram.
Cocos Gram-positivos
Peptostreptococcus
Peptococcus niger
Cocos Gram-negativos
Veillonella
Acidaminococcus
Megasphaera
Bacilos Gram-positivos no esporulados
Propionibacterium
Bifidobacterium
Actinomyces
143
Eubacterium
Lactobacillus
Bacilos Gram-positivos esporulados

Clostridium
Bacilos Gram-negativos
Bacteroides
Fusobacterium
Prevotella
Porphyromonas
Campylobacter
Sutterella
Bilophila
8.5.2
Identificao bacteriana presuntiva

A morfologia microscpica obtida pela colorao de Gram, acrescido do teste de anaerobiose, um resultado presuntivo importante, que deve ser imediatamente passado ao clnico. J nessa etapa o laboratrio informa que o
paciente tem uma infeco por uma bactria anaerbia estrita que pertence
a um determinado grupo morfolgico.
Mtodos convencionais para a identificao de bactrias anaerbias usam,
frequentemente, procedimentos que utilizam as bactrias isoladas em cultura pura para o estudo da fermentao de diversos carboidratos e outras
atividades bioqumicas. Esses procedimentos envolvem trabalho intensivo e
consomem muito tempo. Muitos laboratrios no esto aptos a manterem
a vasta seleo de meios e substncias exigidas para a identificao bioqumica. Devido a esses fatores, cada vez mais a pesquisa de mtodos alternativos rpidos e simples estimulada. Os micromtodos, tais como API 20A e
Minitek, foram os primeiros a serem propostos como alternativas ao mtodo
convencional. Os dois mtodos possuem um melhor desempenho com bactrias anaerbias de crescimento rpido (grupo B. fragilis ou C. perfringens).
Outros sistemas como RapID ANA II esto baseados principalmente na deteco rpida de glicosidases e aminopeptidases. O inculo pesado e o curto
tempo de incubao (quatro horas) evitam a contaminao e fornecem rapidamente resultados, cuja especificidade na identificao das espcies varia
entre 60 a 90%.
A pesquisa de cidos graxos produzidos pelo metabolismo da fermentao
da glicose utilizando-se cromatografia a gs um mtodo rpido, especfico e sensvel para diversas espcies. O equipamento e os programas com-
144
putadorizados necessrios representam um custo inicial elevado, porm,

subsequentemente, ele menor. Devido caracterstica polimicrobiana das
infeces por anaerbios, a reao em cadeia da polimerase (PCR) no preconizada para o diagnstico, com exceo para tecidos ou fludos estreis.
Sondas de cidos nuclicos para pesquisa de bactrias anaerbias no esto
ainda padronizadas e no so encontradas comercialmente. Contudo, laboratrios de microbiologia oral e empresas que trabalham com esse segmento desenvolveram um conjunto de sondas para a identificao de bactrias
envolvidas na doena periodontal. Essas sondas so bastante eficientes na
identificao de colnias provenientes da placa de cultura do primeiro isolamento ou de micro-organismos isolados em cultura pura.
A interpretao de resultados de uma cultura mista, contendo mltiplos isolados, difcil. Culturas semiquantitativas em conjunto com a bacterioscopia
so teis para a definio do que importante ou no entre os isolados. A
natureza das bactrias isoladas pode tambm dar indcios da importncia
delas no processo infeccioso. Na maioria das vezes, a manuteno de um
dilogo entre o mdico e o microbiologista essencial para uma apropriada
interpretao dos resultados bacteriolgicos obtidos.
A) A identificao de gnero e espcie feito a partir de:
Provas bioqumicas: fermentao de acares, produo de indol, reduo de nitrato, pesquisa de urease, crescimento em presena de bile, liquefao da gelatina, hidrlise de esculina etc.
Produo de pigmentos
Hemlise
Aprofundamento no gar
Susceptibilidade a antimicrobianos
Formao de cidos detectados por cromatografia gasosa
Sorologia
As seguintes consideraes prticas so teis para a orientao do microbiologista para uma conduta adequada, sem a necessidade de aparelhos ou
metodologias dispendiosas por parte do laboratrio:
Na presena de cocos Gram-positivos, quando necessrio o laboratrio

deve fazer o diagnstico diferencial de Peptostreptococcus ou Peptococcus que so os mais frequentemente isolados nesse grupo morfolgico.
Para a diferenciao entre espcies e gneros so utilizados os seguintes
testes: disco de SPS, indol, urease, fosfatase alcalina e alfa galactosidase.
Na presena de cocos Gram-negativos, o laboratrio deve fazer o diagnstico presuntivo de Veillonella, gnero mais frequente nesse grupo.
145
146
Para o diagnstico diferencial com os outros cocos Gram-negativos a prova utilizada a reduo do nitrato e, para diagnstico de outras espcies,
a cromatografia gasosa.
Na presena de bacilos Gram-positivos esporulados, o laboratrio deve
fazer o diagnstico de Clostridium. Na dvida no diagnstico de bacilo
esporulado, recomenda-se o tratamento com lcool etlico a 95%, durante 1 hora temperatura ambiente e ressemeadura posterior. Alm disso,
a suspenso bacteriana pode ser aquecida a 80C durante 10 minutos,
esfriada e feita ressemeadura. Aps um ou outro procedimento, s sobrevivem bactrias esporuladas. importante salientar que C. perfringens
dificilmente se apresenta na forma esporulada no material clnico. Ele s
esporula em condies bastante adversas. Para o diagnstico diferencial
das outras espcies de Clostridium devem ser feitas provas bioqumicas
como hidrlise da gelatina, fermentao da glicose, lecitinase, lipase, produo de indol, ureia, nitratos, e motilidade.
Na presena de bacilos Gram-positivos no esporulados recomendamos
fazer a prova de catalase, reduo de nitratos, hidrlise de esculina, urease,
e produo de pigmento. Para o diagnstico definitivo, deve ser feita a pesquisa do perfil da produo de cidos graxos pela cromatografia gasosa.
A presena de bacilos Gram-negativos em forma de fuso indicativo de
Fusobacterium. Na presena de bacilos pleomrficos ou cocobacilos, recomenda-se seguir o esquema acima descrito. Essas provas junto com a
produo de pigmento permitem fazer o diagnstico presuntivo de Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas e Fusobacterium. Frente aos discos de
antibiticos, a bactria considerada sensvel se o halo de inibio de
12mm ou maior; como inculo para a semeadura utiliza-se uma suspenso com turvao semelhante ao nmero 3 de escala de MC Farland ou
uma turvao semelhante aps incubao em meio de tioglicolato.
A prova da bile considerada positiva, se existir crescimento bacteriano
no quadrante respectivo. Ainda deve ser observado se o crescimento na
presena de bile foi estimulado. Para a produo de pigmento, recomendamos a observao direta das colnias no meio de ASL ou ASS, e, em
caso de no existir pigmento evidente, iluminar a placa com luz ultravioleta ( de 360 nm). Colnias de Prevotella melaninogenicus aparecem de
cor tijolo avermelhado.
Para a prova de indol, recomendamos passar uma colnia, a partir do
meio com triptofano, com ajuda de uma ala de platina num papel filtro
impregnado em 1% de paradimetilaminocinamaldeido (em cido clordrico 10%). Uma reao positiva produz imediatamente uma cor azul.
O diagnstico presuntivo feito de acordo com a seguinte tabela:

Bacilos Gram-negativos anaerbios estritos
Bactrias
Rifampicin
Kanamicin a 1.000 mcg
Bile 20%
Indol
Pigmento
Bacteroides grupo
gragilis
sensvel
resistente
+/neg
neg
Prevotella sp.
sensvel
resistente
neg
+/neg
Porphyromonas sp.
sensvel
resistente
neg
Bacterides sp.
sensvel
sensvel resistente
neg
neg
neg
F. mortiferum
resistente
sensvel
neg
neg
F. variium
resistente
sensvel
neg
Fusobacterium spp.
sensvel
sensvel
neg
neg
Para Rifampicin a Kanamicina: Sensvel = halo de inibio com 12mm ou mais de dimetro Resistente =
ausnsia de halo ou menor que 12 mm de dimetro
A diferenciao dos gneros Prevotella e Porphyromonas realizada pela capacidade de fermentar glicose que positiva para o primeiro gnero e negativa para o segundo.
Alguns sistemas comerciais manuais ou automatizados permitem fazer o
diagnstico das diferentes espcies de anaerbios utilizando numerosas
provas bioqumicas. Alguns utilizam a ao de enzimas bacterianas pr-formadas podendo fazer esse diagnstico aps 4 horas de incubao. Destes
os mais frequentemente utilizados so: API, Vitek e Microscan. Esses sistemas mais caros no so fundamentais para o diagnstico dos grupos bacterianos e para uma orientao teraputica adequada.
Em algumas infeces importante, para o diagnstico, determinar a presena de toxinas como acontece nas infeces intestinais por Clostridium difficille. Essa determinao feita com provas imunolgicas para a pesquisa
da toxina nas fezes, disponveis comercialmente.
8.6 Provas de sensibilidade a antimicrobianos

O estudo da sensibilidade dessas bactrias importante pelo aumento crescente
de sua resistncia frente aos diversos antimicrobianos disponveis. Essa resistncia
mais comum nos gneros Bacteroides e Prevotella, mas pode estar presente tambm
nos gneros Clostridium, Porphyromonas e Fusobacterium.
147
8.6.1
Mtodo da difuso em disco

O mtodo do disco difuso no adequado para estudar a sensibilidade das bactrias anaerbias estritas. O CLSI (Clnical and Laboratory Standarts Institute) recomenda um mtodo de diluio em gar, onde as concentraes de antimicrobianos
so incorporadas ao meio Wilkins-Chalgren. Cada placa tem uma concentrao de
um antimicrobiano. As bactrias so semeadas utilizando o inoculador mltiplo de
Steers e as placas colocadas em jarras com gerador de anaerobiose. A leitura
feita aps 48 horas de incubao na estufa, determinando-se a CIM (concentrao
inibitria mnima).
8.6.2
148
Mtodo da Fita com gradiente de difuso

Um mtodo alternativo mais prtico a determinao da sensibilidade utilizando fitas de plstico impregnadas com gradiente de concentrao de antimicrobianos como no mtodo do E test. As bactrias so semeadas em
forma similar empregada no mtodo do disco para aerbios. So colocadas duas fitas cada uma com um antibitico diferente em cada placa de 9
cm de dimetro. Em geral necessrio testar 6 antibiticos (3 placas). Os
antimicrobianos com maior atividade in vitro e in vivo frente aos anaerbios
estritos so: cloranfenicol, clindamicina, cefoxitina, metronidazol, penicilina
e amoxicilina com cido clavulnico. As placas so incubadas dentro de jarra
de anaerobiose a 35-37C de temperatura. A leitura feita aps 48 horas de
incubao, e a sensibilidade interpretada em ambos mtodos seguindo as
ltimas tabelas publicadas pelo CLSI. Salientamos que existe uma boa correlao nos resultados obtidos com as duas metodologias descritas. Contudo
h relatos de falsa resistncia ao metronidazol quando o Etest utilizado.
Esse fenmeno pode ser resultado das condies do teste e da qualidade do
meio de cultura empregado. Geralmente, o problema eliminado quando se
utiliza meios recm-preparados ou mantidos em anaerobiose antes do uso.
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE GUIDELINES. Performance standards
for antimicrobial susceptibility testing. 2012 Approved standards M100-S22. 22th ed. Wayne,
PA: 2012.
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MURRAY, P. R. et al. Manual of Clnical Microbiology. 10th ed. Washington DC. American
Society for Microbiology ASM Press 2010, 2252p.
149
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Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

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nias necrotizantes graves. Esse tipo de pneumonia caracteriza-se por quadros

Estafilococos coagulase negativos

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

crobianos de cada isolado e esclarecer o significado clnico de cada espcie

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A identificao presuntiva comea com a inoculao primria na placa de

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

Esquema simplificado para identificao das espcies do gnero Staphylococcus

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Diviso dos cocos Gram-positivos pela prova da catalase

Gemella spp., Leuconostoc spp.

Ao coletar a colnia, no carregar meio de cultura (gar sangue), que pode

1 E. casseliflavus e E. gallinarum so positivos

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

1.2 Identificao de estafilococos

Provas diferenciais dos Gneros Catalase positivos ou variveis

Obs. Veja esquema completo em Iorio et al 2007

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Teste da resistncia a novobiocina

Testes da Trealose, Urease e Novobiocina

1.3 Identificao dos Staphylococcus aureus

Teste da coagulase em lmina

Colocar 2 gotas de salina em uma lmina.

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

Teste da coagulase em tubo

Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentrao de 0,1%.

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Outras provas que diferenciam o Staphylococcus aureus

Teste do crescimento em gar manitol

Identificao de outros gneros

Identificao dos estreptococos

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

Incubar por uma noite a 35C sem CO2.

1.3.10 Teste do Sulfametoxazol Trimetoprim (SXT)

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C) Teste da bile esculina e do NACL 6,5%

Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile

1.3.11 Teste da hidrlise do hipurato

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

1.3.12 Identificao dos estreptococos no beta hemolticos

Optoquina e Bile solubilidade

Tolerncia 6,5% a NaCl

1.3.15 Teste da optoquina

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Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

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Diagnstico diferencial entre Neisserias e outros cocobacilos Gramnegativos

Caractersticas de algumas espcies de importncia clnica

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

Moraxella (Branhamella catarrhalis)

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macroldeos, tetraciclinas e fluoroquinolonas. Outras espcies de Neisseria

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

Em leses de pele, preferir a bipsia ao swab.

Moraxella (branhamella) catarrhalis