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Meio BG 11 para Cianobacteria
Meio BG 11 para Cianobacteria
CONTEDO
INTRODUO
INFRAESTRUTURA E EQUIPAMENTOS
PLANEJAMENTO DO LABORATRIO
EQUIPAMENTOS
PARA ESTERILIZAO
PARA PREPARO E CONSERVAO DOS MEIOS DE CULTIVO
PARA TRANSFERNCIA E INOCULAO DAS CIANOBACTRIAS
PARA CULTIVO E MANUTENO DAS CEPAS
4
5
5
5
LAVAGEM DE VIDRARIA
ESTERILIZAO DE VIDRARIA
ESTERILIZAO DOS UTENSLIOS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NO ISOLAMENTO
6
7
7
MEIOS DE CULTURA
8
9
10
10
11
12
12
13
13
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CULTIVO E ISOLAMENTO
15
15
16
17
18
19
TIPOS DE CULTURA
21
PRODUO DE BIOMASSA
21
23
24
24
25
26
REFERNCIAS
27
INTRODUO
As cianobactrias so organismos procariontes capazes de realizar fotossntese
oxignica por possurem clorofila a e fotossistema II (Reviers 2006). Atualmente, a
taxonomia destes organismos fundamenta-se na chamada abordagem polifsica, isto , a
identificao taxonmica de acordo com caractersticas de mltiplas reas de pesquisa,
tais como morfologia, ecologia, fisiologia, ultraestrutura e biologia molecular (Komrek
2005).
Alm de produtores primrios, as cianobactrias tambm tm grande
importncia para o meio ambiente e para a sade pblica, dado que algumas so capazes
de formar floraes e produzir toxinas (SantAnna et al. 2008), alm de geosmina e
MIB (2-metil isoborneol) que causam forte odor na gua (Tanaka et al. 1996).
Adicionalmente, muitas espcies tm demonstrado capacidade de produzir grande
diversidade de substncias com propriedades bioativas (Gault & Marler 2009).
Contudo, nem a taxonomia polifsica e tampouco a investigao de toxinas, compostos
causadores de odor e bioativos seriam possveis sem o cultivo das cianobactrias.
Inicialmente, as pesquisas envolvendo estudos em cultura eram voltadas
principalmente para investigaes taxonmicas e ecofisiolgicas. Contudo, com o
avano da interdisciplinaridade, estudos de biotecnologia revelaram um potencial at
ento desconhecido das cianobactrias. Mais recentemente, o conhecimento sobre
protemica e genmica ampliou muito o entendimento sobre a evoluo destes
organismos, sendo isso possvel graas ao cultivo desses procariotos.
No Brasil, o primeiro manual sobre cultivo de microalgas foi desenvolvido por
Vieira (1977), sendo uma adaptao de vrias tcnicas amplamente utilizadas em outros
pases e voltadas para o cultivo do fitoplncton marinho. Desde ento, outros trabalhos
descrevendo tcnicas para cultivos de microalgas foram desenvolvidos no Brasil (Vieira
& Tundisi 1979, Loureno 2006), todos tratando do cultivo de microalgas aquticas em
geral, tanto marinhas como de gua doce. Na literatura brasileira no h um compilado
especfico de tcnicas de cultivo voltado apenas para cianobactrias, sendo estas
informaes encontradas dispersas em dissertaes/teses e artigos cientficos.
Conforme Loureno (2006), os bancos de cultura de cianobactria existentes no
Brasil so os seguintes:
INFRAESTRUTURA E EQUIPAMENTOS
PLANEJAMENTO DO LABORATRIO
Alternativa
A sala de cultivo pode ser substituda por cmaras de cultivo.
uma opo quanto h falta de espao disponvel ou quando
preciso manter cepas em diferentes condies.
o Sala de lavagem: nesta sala ficam a pia principal para lavagem da
vidraria, a estufa para secagem de vidraria, alm de outros itens de
laboratrio. Dentre os principais equipamentos dispostos nesta sala tm-se
a autoclave e o destilador de gua, que ficam em rea prxima janela e
existe ventilador de teto para circular o ar. Ateno: importante separar
todos estes equipamentos dos demais devido elevada umidade e calor
gerados por eles, o que pode levar a oxidao de outros equipamentos e
problemas com fungos nas outras salas. A osmose reversa uma tima
alternativa ao destilador de gua convencional, sendo um equipamento que
produz gua de melhor qualidade e diminui bastante o desperdcio.
EQUIPAMENTOS
PARA ESTERILIZAO
cianobactrias.
LAVAGEM DE VIDRARIA
A lavagem da vidraria, seja ela nova ou j de uso rotineiro do laboratrio, deve
obedecer seguinte sequncia:
Imerso em soluo de cloro ativo com concentrao entre 2 e 2,5% por
12 horas para desinfeco;
Lavagem manual com sabo no residual (Extran ou similar) para
remover os resqucios mais grosseiros como material orgnico ou gar
aderido no interior na vidraria;
Enxgue em gua corrente at que todo sabo seja retirado;
Enxgue em gua destilada, no mnimo trs vezes, para remoo de
possveis sais deixados pelo sabo ou pela gua da torneira;
Secagem em estufa a temperatura aproximada de 60C;
Embalagem da vidraria com filme PVC transparente;
Estocagem das vidrarias devidamente embaladas em armrios fechados.
ESTERILIZAO DE VIDRARIA
A vidraria previamente lavada deve ser esterilizada pouco antes do uso, a fim de
se evitar contaminao. O processo de esterilizao deve seguir os seguintes passos:
Ressalta-se que toda vidraria autoclavada s deve ser aberta no momento do uso
e dentro da cmara de fluxo laminar.
MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura so utilizados com a finalidade de isolar e cultivar as
cianobactrias em laboratrio, geralmente em culturas uniespecficas. Um meio de
cultura pode ser classificado quanto consistncia como slido ou lquido. O meio
slido contm agentes solidificantes (gar) e utilizado para o isolamento. O meio
lquido utilizado para a manuteno das cepas e produo de biomassa para anlises
diversas. Em relao aos estudos taxonmicos, deve-se atentar para o meio utilizado no
cultivo, pois a cepa pode apresentar morfometria distinta segundo a consistncia ou/e
composio do meio.
Alguns dos meios comumente utilizados para cultivo de cianobactrias so:
Meio BG-11
Meio ASM-1
2.
3.
Quantidade (g)
EDTA (C10H16N2O8)
0,1000
0,6000
( *)
150,0000
4,0000
7,5000
3,6000
2,0000
0,6000
Quantidade (g)
H3BO3
2,8600
MnCl2 + 4H2O
1,8100
ZnSO4 + 7H2O
0,2220
NaMoO4
0,3900
CuSO4 + 5H2O
0,0790
Co(NO3)2 + 6H2O
0,0494
10
11
50
4,05
100
8,1
200
16,2
500
40,5
1.000
81
5.000
405
Sol. B
Sol. C
Sol. D
Nutrientes
Quantidade (g)
NaNO3
8,5000
MgSO4 + 7H2O
2,4500
MgCl2 + 6H2O
2,0500
CaCl2 + 2H2O
1,4500
KH2PO4
8,7000
Na2HPO4 + 12H2O
17,8000
H3BO3
28,4000
MnCl2 + 4H2O
13,9000
FeCl2 + 6H2O
10,8000
ZnCl2
3,3500
CoCl2 + 6H2O
0,1900
CuCl2 + 2H2O
0,0140
EDTA titriplex
18,6000
12
50
1,125
100
2,250
200
4,500
500
11,25
1.000
22,50
5.000
112,50
13
1.000
0,05
500
0,025
300
0,015
100
0,005
Meio slido
Para preparar 1.000 mL de meio, utilizamos 1 Erlenmeyer de 2.000 mL e outro de
1.000 mL. (A quantidade de cicloheximida indicada no mtodo de 50 mg/L e o gar
de 10 g/L.)
Pesar a cicloheximida e o gar, reservar;
Medir meio concentrado (81 mL de meio BG-11 ou 22,50 mL de meio ASM-1) e
diluir em 500 mL de gua deionizada, reservar;
14
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O material a ser descartado, tanto aquele mantido em meio slido como lquido,
deve ser retirado das condies de cultivo e mantido isolado em seu recipiente original
at que o processo de descarte seja finalizado. Para tanto, os tubos (com as rolhas) e
placas de Petri (sem o parafilm) devem ser autoclavados em temperatura de 125C e
presso de 1,5 atm. Em seguida o material descartado e os recipientes so colocados
imersos em soluo de cloro ativo com concentrao entre 2 e 2,5% por cerca de 12
horas, sendo lavados normalmente em seguida.
Tal procedimento de suma importncia para a segurana das pessoas que
manipulam o material e para evitar contaminao do laboratrio e do meio ambiente
atravs da produo de resduos.
CULTIVO E ISOLAMENTO
PROCEDIMENTO PARA O ISOLAMENTO DAS CEPAS
H dois mtodos bsicos para o isolamento das cianobactrias em cultura:
plaqueamento e seleo por capilar (pescaria). Ambos so eficazes, porm algumas
cepas no se adequam bem ao meio slido e a tcnica de pescaria requer prtica e
pacincia.
Para se obter melhor resultado, recomenda-se que os procedimentos de isolamento
sejam feitos na maior variabilidade possvel de meios, a no ser que se saiba
previamente qual o melhor para o cultivo da cepa de interesse. A seguir os mtodos so
detalhados:
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PLAQUEAMENTO
Coloca-se nas placas de Petri os meios de cultura, ASM-1 ou BG-11, slidos e
com cicloheximida;
Na cmara de fluxo laminar, homogenizar a amostra e colocar trs gotas de
material sobre o meio slido, espalhando uniformemente com o auxilio da ala
de Drigalski ou basto, previamente flambados no bico de Bunsen. importante
que, ao se espalhar o material, no haja sobreposio de inculo (figura 1);
Aps inoculao, as placas so vedadas com parafilm e colocadas na sala de
cultivo. importante que a parte na qual se encontra o meio esteja para cima,
pois comum que na tampa acumule gua, o que pode ocasionar contaminao;
Cada placa com o inculo deve ser etiquetada com informaes relevantes como
local e data de coleta, data do plaqueamento e meio utilizado, ou algum cdigo
que resuma estas informaes;
Aps 2-3 semanas possvel visualizar o crescimento de diferentes massas de
cianobactrias. Nesse exame (visualmente e depois ao microscpio) so
analisadas: cor, estrutura, e consistncia do crescimento. Os diferentes
crescimentos so marcados e colnias isoladas ou pequenas fraes dos
crescimentos so retirados com o auxlio de uma ala metlica e ento so
inoculados em um tubo de ensaio contendo meio lquido;
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PESCARIA
Flamba-se uma lmina de vidro, espera-se esfriar e em seguida coloca-se uma gota
da amostra e vrias gotas de meio de cultura estril (figura 2);
Ao
microscpio,
visualiza-se
espcime
ser
isolado,
escolhendo-se
Para formao do capilar, afina-se uma pipeta Pasteur na chama do bico de Bunsen,
quebrando-se a ponta de acordo com o tamanho do organismo de interesse
selecionado;
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Se for necessrio, utilizar mais de uma lmina e deve-se fazer o processo da mesma
forma.
Pode acontecer que o organismo selecionado no se desenvolva, tanto pela sua
fragilidade ou pela perda do mesmo durante o processo. Assim, o ideal que sejam
feitos vrios tubos, em mdia 5 para cada cepa.
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PROTOCOLO
PARA
LAVAG EM
DE
CLULAS
DE
20
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TIPOS DE CULTURA
Temperatura: 24 1 C
22
Na etapa 3:
Aerao: constante
Iluminao: constante
Temperatura: 24 1 C
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ESQUEMA
PAR A
UNIESPECFICA
OBTENO
DE
UMA
CULTURA
24
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1 rea
N de Clulas.mL-1
1/16 de A
n de cel. X 80.000
1/8 de A
n de cel. X 40.000
1/4 de A
n de cel. X 20.000
1/2 de A
n de cel. X 10.000
1 A (16 )
n de cel. X
2 A (32 )
n de cel. X 2.500
4 A (64 )
n de cel. X 1.250
8 A (128 )
n de cel. X 625
16 A (256 )
n de cel. X 312,5
5.000
BIOMASSA (BIOVOLUME MM L -1 )
O volume celular (V) pode ser obtido a partir da mdia do comprimento (a) e
dimetro (b) de trinta clulas, usando modelos geomtricos aproximados forma das
clulas das cianobactrias (Sun & Liu 2003).
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G= ln 2. -1
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REFERNCIAS
of
saxitoxins
production
in
Cylindrospermopsis
raciborskii
28
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