Reportagem

edio 40 - Setembro 2005

Dentes de Proveta
Mais complicada do que parece, a arcada dentria um conjunto de pequenos rgos. A produo de dentes protticos vivos pode colocar a odontologia na era da medicina regenerativa e, de quebra, abrir caminho para a engenharia de rgos maiores
por Paul T. Sharpe e Conan S. Young

No costumamos dar valor a eles at que caiam ou necessitem de reparos substanciais. E as opes so cruis: ficar sem os dentes perdidos ou substitu-los por prteses inertes. No mundo ocidental, aproximadamente 85% dos adultos j sofreram algum tipo de tratamento dentrio. Cerca de 7% perderam um ou mais dentes antes dos 17 anos. Aps os 50 anos, a mdia de dentes perdidos por pessoa de 12. Teoricamente, o melhor dente de substituio possvel seria feito a partir do tecido do prprio paciente e cultivado no prprio local do dente, mas realizar essa obra de bioengenharia no passava de sonho at pouco tempo. Progressos no entendimento do desenvolvimento dentrio, combinados com avanos da biologia de clulas-tronco e da tecnologia de engenharia tecidual nos aproximaram da realidade dos dentes de substituio biolgicos. Alm do potencial benefcio para pessoas que precisam de novos dentes, essa pesquisa oferece duas vantagens significativas para testar o conceito de substituio de rgos: os dentes so de fcil acesso e, embora sua presena aumente substancialmente a qualidade de vida, eles no so essenciais para viver. Esses pontos parecem triviais, mas, com a chegada da primeira onda de rgos de substituio s clnicas, os dentes serviro como um teste crucial para a viabilidade de diferentes tcnicas de engenharia tecidual. Com rgos essenciais vida os mdicos no tero margem de segurana para cometer erros mas, em se tratando de dentes, os erros no apresentam riscos vida e ainda podem ser corrigidos. Isso no quer dizer que a engenharia dentria seja algo simples. Foram necessrios milhes de anos de evoluo para o estabelecimento dos complexos processos de produo de rgos, inclusive de dentes, durante o desenvolvimento embrionrio. O desafio dos engenheiros de tecidos replicar tais processos, rigorosamente controlados pelos genes do embrio em crescimento. Por isso, uma boa forma de aprender a produzir dentes observar como a Natureza o faz. Dilogo Delicado O embrio humano, seis semanas aps a concepo, mede menos do que 2,5 cm e tem uma forma que mal se reconhece. Apesar disso, j est em curso uma conversa cruzada constante entre suas

clulas guiando a formao dos dentes. A complexidade dessa troca de sinais um dos motivos pelos quais, por enquanto, os dentes e outros rgos no podem ser desenvolvidos inteiramente em laboratrio. Pode ser que os cientistas nunca consigam reproduzir completamente essas condies de maneira artificial. Entretanto, quanto mais entendermos esses processos primrios de desenvolvimento, maiores sero as chances de conseguir criar tecidos dentrios usando os sinalizadores celulares mais importantes e deixando a Natureza cuidar do resto. A maioria dos rgos, incluindo os dentes, surge atravs de interaes entre dois tipos diferentes de clulas embrionrias, a epitelial e a mesenquimal. No embrio, clulas epiteliais orais (destinadas ao revestimento de cavidade oral) enviam os primeiros sinais indutivos s clulas mesenquimais (que produzem a maxila e os tecidos moles), instruindo-as a iniciar a odontognese, ou a formao dos dentes. Aps receberem as instrues inicias, as clulas mesenquimais comeam a mandar de volta sinais s clulas epiteliais. Esse intercmbio continua durante todo o desenvolvimento embrionrio dos dentes. No incio, o futuro dente nada mais do que espessamento do epitlio oral embrionrio. Ao crescer, o epitlio comea a penetrar pelo tecido mesenquimal de base, que por sua vez se condensa ao redor da protruso, formando a coroa do dente ao redor da stima semana da vida embrionria (ver quadro dir.). A penetrao do epitlio continua, e este ento envolve o mesnquima em condensao, formando por fim, ao redor da 14a semana, uma estrutura em forma de sino aberta na parte inferior. Por ltimo, o epitlio se transforma no esmalte externo visvel do dente, que irrompe na gengiva do beb seis a 12 meses aps o nascimento, e as clulas mesenquimais formam as partes no visveis do dente, como a dentina, a polpa, o cemento e um ligamento periodontal que fixa o dente maxila. A forma do dente predeterminada, antes mesmo do incio de sua formao, por sua posio. Alguns dos mesmos sinais epiteliais que do incio odontognese regulam uma categoria importante de genes do mesnquima do maxilar. Conhecidos como genes homeobox, participam da determinao da forma e da localizao de rgos e apndices no corpo durante o desenvolvimento embrionrio. No desenvolvimento do maxilar humano, diferentes genes homeobox so ativados em diferentes reas, guiando cada coroa de dente por um caminho at se tornar um molar, pr-molar, canino ou incisivo. Um gene homeobox chamado Barx1, por exemplo, ligado, ou expresso, por clulas mesenquimais na posio dos molares. Em experimentos com animais, quando se alterou a expresso do Barx1 no mesnquima que normalmente formaria os incisivos, estes nasciam com a forma de molares. Como a capacidade de prever e controlar a forma dos dentes ser essencial para a produo de dentes pela engenharia gentica, os cientistas podem utilizar a atividade de genes como o Barx1 como marcadores preditivos definitivos de forma futura quando os dentes de laboratrio comearem ser cultivados. Para isso, devemos fornecer os sinais corretos ao dente em desenvolvimento, e na hora certa. Ainda nos anos 1960, Shirley Glasstone, do Laboratrio de Pesquisa Strangeways, de Cambridge (Inglaterra), comeou a explorar a possibilidade de cultivar dentes fazendo experimentos com tecidos de camundongos. Em estudos seminais realizados nas trs dcadas seguintes, pedacinhos bem pequenos do epitlio dentrio embrionrio e de mesnquima de camundongos foram combinados e cultivados em culturas de tecidos ou implantados cirurgicamente no corpo de um hospedeiro, onde os tecidos recombinantes receberiam alimentao sangnea. Esses experimentos demonstraram que esses dentes embrionrios primordiais poderiam continuar a se desenvolver como se ainda estivessem no embrio, produzindo dentina e esmalte. Contudo, o processo acaba cessando cedo, e no so gerados dentes totalmente formados. Falta algo de seu ambiente. Os fatores de crescimento e outros sinais necessrios para completar a formao de dentes em embries vm provavelmente do tecido mandibular circundante. Assim, transplantar dentes primordiais para a mandbula para finalizar o desenvolvimento pareceria uma soluo simples. Quando se realiza a engenharia de dentes de substituio, por exemplo, o ideal seria que eles fossem cultivados em seu local permanente para que pudessem produzir conexes nervosas e vasos sangneos e se fixar mandbula. Contudo, a mandbula adulta um ambiente altamente diferente da verso embrionria, e os cientistas no estavam certos de que ela daria os sinais corretos para um dente em desenvolvimento. Alm disso, os dentes primordiais devem ser produzidos a partir da combinao certa de clulas a fim de reproduzir o material e a estrutura dos dentes naturais. Seria prefervel usar clulas do corpo do prprio paciente, e no clulas embrionrias, para evitar um ataque imunolgico ao implante.

Trs objetivos importantes devem ser atingidos para tornar possvel a engenharia de dentes de substituio biolgicos. Deve-se identificar fontes de clulas que possam formar dentes e que sejam facilmente obtidas do prprio paciente. Os dentes produzidos a partir dessas clulas devem ser capazes de se desenvolver no ambiente da mandbula adulta, produzindo razes que possam ser fixadas ao osso por um ligamento periodontal funcional. E a forma e o tamanho desses dentes biolgicos devem ser previsveis e controlveis para ter aparncia igual dos dentes do paciente. Essas metas so ambiciosas, mas h avanos em relao a cada uma delas feitos por diferentes grupos de pesquisadores que utilizam abordagens um tanto quanto dspares. Armao Biodegradvel No final de dcada de 1980 o cirurgio de transplantes de rgos Joseph P. Vacanti, da Escola de Medicina da Universidade Harvard, e o qumico de polmeros Robert S. Langer, do Instituto de Tecnologia de Massachusets (MIT) conceberam a idia de colocar clulas de um rgo ou tecido em um arcabouo biodegradvel, uma armao pr-fabricada com o fim de gerar tecidos e rgos para transplante. Grosso modo, sua abordagem era baseada no fato que o tecido vivo feito de clulas que constantemente trocam sinais entre si e se movimentam dentro de uma comunidade tridimensional de tipos. Cada clula parece conhecer seu lugar e seu papel no coletivo maior que forma e mantm um tecido funcional. Assim, se a mistura certa de clulas dissociadas for reagregada em um arcabouo que reproduza seu ambiente 3-D natural, as clulas instintivamente reformariam o tecido ou rgo ao qual pertencem. O sucesso inicial de Vacanti e Langer na regenerao de pedaos de tecidos do fgado a partir de clulas hepticas usando a estratgia baseada no arcabouo abriu caminho para experimentos similares com msculo cardaco, intestino, osso mineralizado e, agora, dentes. Pamela C. Yelick e John D. Bartlett, do Instituto Forsyth, de Boston, comearam a trabalhar com Vacanti no ano de 2000 para pesquisar a viabilidade de produzir dentes dessa forma focando em porcos que, assim como os humanos, produzem dois conjuntos de dentes durante a vida. Um de ns (Young) tambm participou desses experimentos, cuja matria-prima derivava dos terceiros molares (dentes do siso) no irrompidos de porcos com 6 meses de idade. Para obter uma mistura heterognea de clulas epiteliais do esmalte do dente e de clulas mesenquimais da polpa, os dentes dos porcos foram quebrados em pedacinhos pequenos e dissolvidos com uso de enzimas. Arcabouos em formato de dente foram feitos de plstico biodegradvel de po-lister e cobertas com uma substncia que torna o plstico grudento, para as clulas aderirem a ele. As misturas de clulas foram semeadas nos arcabouos, e as montagens foram implantadas cirurgicamente em ratos hospedeiros envolvidos em omento, um material gorduroso branco rico em vasos sangneos que circunda o intestino. Essa etapa importante porque os tecidos dentrios em desenvolvimento precisam de alimentao sangnea abundante para receber nutrientes e oxignio durante o crescimento. Os arcabouos servem inicialmente de suporte s clulas, mas posteriormente elas se dissolvem conforme o esperado e so substitu-dos por tecido novo. Quando os implantes foram examinados aps 20 ou 30 semanas, era possvel ver estruturas pequeninas parecidas com dentes nos limites do arcabouo original. A forma e a organizao dos tecidos lembra a coroa do dente natural. Eles tambm incluem a maioria dos tecidos que formam um dente normal, demonstrando pela primeira vez que esmalte, dentina, polpa e estruturas que pareciam ser razes de dentes em desenvolvimento podiam ser regenerados em arcabouos. Aparentemente, misturas de clulas dentrias eram capazes de se reorganizar nos arcabouos em arranjos favorecendo a formao de esmalte mineralizado e tecido dentrio mole. Outra possvel explicao para esses fantsticos resultados, claro, que um arranjo aleatrio de clulas semeadas em arcabouos favoreceu o desenvolvimento de tecido dentrio apenas por acaso. O grupo de Forsyth testou ento essas possibilidades em um novo estudo utilizando clulas epiteliais e mesenquimais dentrias retiradas de primeiros, segundos e terceiros molares de ratos. Desta vez, entretanto, as clulas foram cultivadas e aumentaram em nmero na cultura de tecido por seis dias antes de serem semeadas nos arcabouos e implantadas nos ratos hospedeiros. Aps 12 semanas de crescimento, os tecidos resultantes foram extrados e examinados. Mais uma vez, notou-se a formao de pequenas estruturas dentrias consistindo de esmalte, dentina e tecido de polpa no arcabouo original. Os novos resultados foram estimulantes, pois deram peso s evidncias prvias de que as clulas podem se reorganizar em configuraes de formao dentria. Alm disso, as clulas no pareciam ter sofrido reaes adversas por terem sido expandidas em cultura um processo que ser essencial, porque os engenheiros de tecidos provavelmente tero de talhar o dente de substituio a partir de pequenas amostras das prprias clulas do paciente. O experimento mostrou finalmente que a

regenerao dentria possvel em mamferos de uma segunda espcie, tornando mais provvel o sucesso de uma abordagem semelhante em humanos. Embora a equipe de Forsyth tenha sido capaz de gerar a maioria dos tipos de tecido desejados com clulas de uma fonte adulta, esses tecidos se organizaram em um arranjo prprio para um dente natural apenas 15% a 20% das vezes. O grupo continua a trabalhar na busca de mtodos de colocao mais precisos de diferentes tipos de clulas em arcabouos para conseguir uma estrutura dentria mais exata. Ao mesmo tempo, a equipe explora a possibilidade de que os novos tecidos observados nesses experimentos possam no ter sido produzidos unicamente pela reorganizao das clulas dentrias dissociadas. Em detrimento disso, as coroas dos terceiros molares que forneceram clulas para semear os arcabouos poderiam conter clulas-tronco potentes progenitores de outros tipos de clulas responsveis pela formao de novos tecidos. Se isso for verdade, significaria que pode haver nos prprios dentes clulas capazes de produzir quase todos os tipos de tecido necessrios bioengenharia de dentes, pelo menos at o incio da idade adulta, quando os den-tes do siso irrompem. Essas clulas-tronco dentrias adultas versteis certamente acelerariam os esforos para a gerao de dentes em arcabouos, e poderiam tambm facilitar a abordagem de engenharia dentria utilizada pelo grupo de Sharpe, do Kings College de Londres. Criao do Zero Em vez de tentar produzir dentes adultos a partir de suas clulas constituintes, um de ns (Sharpe) est buscando uma estratgia baseada na reproduo dos processos naturais de desenvolvimento dentrio embrionrio descritos previamente. O mtodo, em essncia, necessita de um entendimento dos princpios bsicos que controlam a formao inicial do dente e uma fonte de clulas para fazer o papel do epitlio e do mesnquima oral embrionrio. At agora, o grupo de Sharpe fez a maioria de suas experincias com camundongos, usando clulastronco e clulas comuns, de fonte embrionria e adulta, para testar o potencial de cada tipo em produzir dentes de substituio. Na maioria dos casos o grupo comeou agregando clulas mesenquimais em uma centrfuga at a formao de uma pequena massa slida. Esse pellet (material decantado) foi ento coberto por epitlio e cultivado por vrios dias, e a atividade gentica do tecido foi monitorada para indicao do desenvolvimento inicial de dentes. Em seguida, esses dentes primordiais foram implantados no corpo de hospedeiros, onde pudessem receber alimentao sangnea, como o rim de um camundongo, e foram deixados por cerca de 26 dias crescendo. No curso desses experimentos, observou-se a formao clara de dentes apenas quando o epitlio provinha de fonte embrionria, e a populao de clulas mesenquimais continha pelo menos algumas clulas-tronco. Quando clulas-tronco da medula espinhal tomaram o lugar do mesnquima oral, por exemplo, as contrues transplantadas produziram dentes estruturalmente corretos. Assim, tem-se a impresso de que o mesnquima embrionrio pode ser substitudo por clulas-tronco adultas para gerar dentes novos. Vrios anos de experimentos atestaram, infelizmente, que o epitlio embrionrio contm um conjunto exclusivo de sinais para odontognese que desaparece da boca aps o nascimento. Sharpe continua a busca por uma populao efetiva de clulas substitutas que possam ser derivadas de uma fonte adulta. Apesar de tudo, os resultados atingidos com dentes primordiais feitos a partir da combinao de clulas-tronco adultas e epitlio oral embrionrio foram extremamente estimulantes. Algo importante foi que esses dentes estavam dentro do espectro normal de tamanho para camundongos. Alm disso, eram circundados por osso novo e tecido conectivo, e apresentavam os sinais iniciais de formao de razes. A etapa a seguir seria verificar se esses explantes tambm poderiam formar dentes na boca. Na mandbula embrionria, tecidos moles, dentes e osso se desenvolvem sem tenses externas como a mastigao e a fala, mas a mandbula adulta um local rgido e bastante exigido. Ningum sabia se seria possvel obter os sinais necessrios para os dentes crescerem e se integrarem ao ambiente, como o fariam em um embrio. Para descobrir isso, o grupo de Sharpe extraiu coroas de dentes de camundongos embrionrios e as transplantaram para a boca de camundongos adultos. Foram feitas pequenas incises no tecido mole da mandbula superior dos camundongos hospedeiros, em uma regio conhecida como diastema entre os molares e incisivos, onde geralmente no h dentes. Os primrdios dos dentes incisivos foram inseridos nas incises e selados no local com cola cirrgica. Depois, os camundongos receberam dieta leve, e os transplantes foram monitorados. Apenas trs semanas depois os dentes podiam ser

claramente identificados no diastema. Foram formados na orientao correta, eram de tamanho apropriado para camundongos, e eram fixos ao osso de base por um tecido conectivo mole . Notavelmente, provvel que a boca adulta possa prover um ambiente adequado para o desenvolvimento dentrio. Entretanto, esse apenas um dos trs objetivos em relao engenharia de dentes de substituio identificados anteriormente. A estrada que leva aos dentes bioengenheirados humanos pode apresentar ainda algumas curvas. Ponta da Coroa Comparados com esforos da engenharia de outros rgos, os dentes tiveram progressos considerveis em um perodo curto. O desafio maior continua sendo o desenvolvimento de mtodos simples, mas controlados. Outra meta, a capacidade de prever e controlar o tamanho e a forma do dente, est perto de ser atingida. Em dentes primordiais cultivados, germes de incisivos e molares podem ser facilmente distinguidos por sua aparncia e atividade gentica, embora outras formas encontradas na boca humana, como pr-molares e caninos, sejam mais difceis. Os dentes produzidos pelo grupo de Sharpe no diastema de camundongos adultos tinham formas apropriadas a suas locaes no embrio. Molares primordiais cresciam at se tornar molares de fato, por exemplo. Como os sinais para formato so recebidos muito no incio do desenvolvimento dos dentes, os germes de dente embrionrios j estavam programados. Engenheiros de tecidos precisam compreender melhor esses sinais iniciais de formato para induzi-los a formar biodentes humanos. Os dentes gerados at agora por qualquer um desses mtodos de engenharia tecidual que descrevemos no criaram razes. Na realidade, o desenvolvimento de razes, assim como os estmulos que do incio erupo do dente, algo complexo e ainda pouco compreendido. A raz a ltima parte do dente a ser formada, e seu desenvolvimento se completa durante o processo de erupo. So necessrias mais pesquisas para se entender que condies favoreceriam sua criao nos dentes. Outro ponto desconhecido quanto tempo levaria para dentes humanos engenheirados serem formados na boca adulta. O segundo conjunto de dentes adultos dos humanos tambm comea a se desenvolver nos embries, mas levam seis a sete anos para finalmente irromper ou 20 anos, no caso dos dentes do siso. Nossa experincia com gerao de dentes sugere que um dente humano de laboratrio se formaria muito mais rpido do que isso, mas no sabemos se levaria mais tempo para amadurecer totalmente e para seu esmalte se endurecer completamente. A maioria das pesquisas sobre a bioengenharia de dentes, claro, tambm busca uma fonte efetiva e de fcil acesso para que as prprias clulas do paciente possam ser utilizadas como matria-prima. Alm de evitar a rejeio imune, o tamanho, a forma e a cor do dente so determinados geneticamente. Assim, o dente de bioengenharia seria mais similar aos do paciente. O grupo de Sharpe verificou que as clulas-tronco mesenquimais adultas derivadas da medula espinhal (mas tambm obtida de gordura) podem substituir o mesnquima embrionrio no processo de formao dos dentes. Ainda est por ser identificado um substituto do epitlio embrionrio, embora j tenham sido descobertas clulas-tronco adultas expressas em outros tecidos com origens epiteliais, como pele e cabelo. Estes ou outros tipos de clulas adultas podem se mostrar eficientes, talvez com a ajuda de manipulao gentica, para induzir os sinais de iniciao apropriados da odontognese. Das vrias fontes celulares potenciais, os dentes em si podem ser a mais conveniente. Os resultados do grupo de Forsyth sugerem que clulas-tronco capazes de formar os tecidos de ossos, incluindo o esmalte, podem estar presentes nos dentes. Pesquisadores de outros lugares tambm mostraram que a dentina e outros tecidos sofrem regenerao natural aps dano, o que tambm sugere a presena de clulas progenitoras capazes de gerar uma variedade de tecidos dentrios. Portanto, existe a possibilidade de algum dia produzirmos dentes novos a partir dos velhos.

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