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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRADE SANTANA

ENGENHARIA DE ALIMENTOS BACHARELADO EM CINCIAS BIOLGICAS

Manual da Disciplina
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Professora: Elinalva Maciel Paulo

Carga Horria: Terica 30 h Prtica 30 h

Feira de Santana Bahia 2005.1

2. PLANO DE DISCIPLINA 2.1 EMENTA Introduo microbiologia dos alimentos. Crescimento bacteriano. Tcnicas microbiolgicas aplicadas microbiologia dos alimentos. Ecologia microbiana dos alimentos. Contaminao e deteriorao dos alimentos. Toxinfeces alimentares. Conservao dos alimentos. Controle microbiolgico de alimentos. Padres microbiolgicos e APPCC. 2.2.1. Objetivo Geral Ao final do curso os alunos devero conhecer os fatores intrnsecos e extrnsecos que controlam o desenvolvimento microbiano dos alimentos, os principais microrganismos deteriorantes dos alimentos e a sua influncia na sade do consumidor,bem como os mtodos de anlises. 2.2.2. Objetivos Especficos Fornecer aos alunos conhecimentos sobre os tipos de microrganismos de interesse em alimentos; Mostrar os diferentes fatores que contribuem para a colonizao dos microrganismos nos alimentos, Conhecer os principais microrganismos deteriorantes e patognicos encontrados nos alimentos, Ressaltar a importncia da escolha do mtodo do controle do crescimento microbiano no alimento. 2.3. CONTEDO PROGRAMTICO PROGRAMA TERICO I UNIDADE 01- Importncia dos microrganismos nos alimentos 02- Fatores extrnsecos que controlam o crescimento bacteriano 03- Fatores intrnsecos que controlam o crescimento bacteriano 04- Bactrias patognicas transmitidos prelos alimentos: Enterobactrias (Salmonella, Shigella e Escherichia), Vbrios, Yersnia,Campylobacter 05- Bactrias patognicas transmiotidas pelos alimentos: Listria, Staphylococcus aureus, Clostridios, Bacillus 06- Protozorios transmitidos pelos alimento: 07- helmintos transmitidos pelos alimentos , 08-vrus transmitidos pelos alimentos, 09- Micotoxinas II UNIDADE 01- Microrganismo indicador- Amostragem, padres microbiolgicos 02.Deteriorao de carne, frango, ovos e pescados 03- Deteriorao microbiana de cereais, farinhas, produtos lcteos e doces 04- Conservao dos alimentos mtodos fsicos 05- Conservao dos Alimentos mtodos qumicos e biolgicos 06- Conservao dos Alimentos mtodos qumicos e biolgicos 07- GMP, PPHO, HACCP

PROGRAMA PRTICO I UNIDADE 01- Montagem de materiais para esterilizao / Preparo de Meios de cultura 02- Reaes tintoriais: colorao de Gram, 03- Reaes tintoriais: colorao de esporos: Wirtz Conklin 04- Tcnicas de semeadura 05- Prepara de amostras de alimentos para anlises: diluio e plaqueamento 06- Contagem de Bactrias mesfilas, psicrotfilas e termfilas, 07- Esterilidade comercial 08- Contagem de bolor e levedura, Esterilidade comercial II UNIDADE 01- Avaliao da qualidade do leite - (teste da fervura, teste do lcool teste do azul de metileno) 02-Contagem de coliformes a 37 C e a 45 C 03- Contagem de Staphylococcus coagulase positiva 04- Contagem de Bacillus cereus 05- Contagem de Clostridios sulfito redutor 06- Deteco de Salmonella 07- Deteco de vibrios 08- Microrganismos presentes em produtos comerciais 2.4. MTODO Aulas expositivas induzindo os alunos a discusso, pesquisas em artigos cientficos, realizao de seminrios e realizao de prticas relacionadas com os assuntos tericos. 2.5. RECURSOS DIDTICOS Para as aulas expositivas: quadro, transparncias e multimdia. Para as aulas prticas: vidrarias, meios de cultura, corantes , reagentes e microrganismos teste. 2.6. AVALIAO Provas escritas com questes objetivas e subjetivas acerca do contedo terico Relatrios das aulas prticas Seminrio 2.7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BSICA FRANCO, B. G. M. Microbiologia dos Alimentos. So Paulo, ed. Atheneu, 1999 JAMES, M. J. Microbiologia moderna de los alimentos. Zaragoza(Espana): Acribia, 4 ed. 1994 SIQUEIRA, R.S. Manual de microbiologia de Alimentos, EMBRAPA. Centro Nacional se Pesquisa de Tecnologia Agroindustrial de Alimentos (Rio de Janeiro). Braslia: EMBRAPA. SPI, Rio de Janeiro EMBRAPA_CTTA, 1995. SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A. ;SILVEIRA, N. F. A. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos, So Paulo, Varela, 1997 COMPLEMENTAR AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Compendium of methods for the microbiological examination of foods 3 ed. New York: Vanderzant, 1992. FRAZIER, W. C.WESTHOF, D. C. Food Microbiology, 4o ed McGraW-Holl, p. 17-58, 1988. BOURGEOIS, C. M E LARPENT, J. P. Microbiologia alimentaria. Zaragoza: acribia, 1995. ICMSF. Mtodos de muestra para analisis microbiolgicas: principio e aplicaes especficas. Zaragoza: Acrbia, 1995

3. PLANO DE AULA N.AULA/DIA 01/02 11/10 11-15/10 03/04 18/10 18-22/10 05/06 25/10 25-29/10 07/08 01/11 01-05/11 09/10 08/11 08-12/11 11/12 22/11 13/14 29/11 15/16 06/12 CONTEDO T Microrganismos de interesse em alimentos: prions, vrus, bactrias, fungos, protozorios e helmintos RECURSOS UTILIZADOS Materiais: Quadro branco, piloto,retroprojetor. METODOLOGIA

P Montagem de materiais para esterilizao / Preparo de Meios de Materiais: materiais de laboratrios cultura Materiais: Quadro branco, T- Fatores extrnsecos que controlam o crescimento bacteriano piloto,retroprojetor. P Reaes tintoriais: colorao de Gram, T Fatores intrnsecos que controlam o crescimento bacteriano P Reaes tintoriais: colorao de esporos: Wirtz Conklin T- Toxinfeco alimentar: Enterobactrias (Salmonella, Shigella e Escherichia), Vbrios, Yersnia, Campylobacter P- Tcnicas de semeadura T - Toxinfeco alimentar: Listria, Staphylococcus aureus, Clostridios, Bacillus Materiais: materiais de laboratrios Materiais: Quadro branco, piloto,retroprojetor. Materiais: materiais de laboratrios Materiais: Quadro branco, piloto,retroprojetor, Data show. Materiais: materiais de laboratrios Materiais: Quadro branco, piloto, retroprojetor. Data show.

Aula expositiva Aula Prtica

Aula expositiva Aula Prtica Aula expositiva Aula Prtica

Seminrio Aula Prtica

Seminrio Aula Prtica

P Prepara de amostras de alimentos para anlises: diluio e Materiais: materiais de laboratrios. plaqueamento T- Protozorios transmitidos pelos alimentos: helmintos transmitidos Materiais: Quadro branco, piloto,retroprojetor. Data show. pelos alimentos , vrus transmitidos pelos alimentos, Micotoxinas P- Contagem de Bactrias mesfilas, psicrotfilas e termfilas, T I AVALIAO ESCRITA P- Contagem de bolor e levedura, Esterilidade comercial Materiais: materiais de laboratrios Materiais: Prova impressa Materiais: materiais de laboratrios

Seminrio Aula Prtica Aplicao da prova Aula Prtica Seminrio Aula Prtica

T Microrganismo indicador- Amostragem, portaria RCD no 12- Materiais: Quadro branco, piloto,retroprojetor. 01/02/2001- (ANVISA) Materiais: materiais de laboratrios

P Avaliao da qualidade do leite - (teste da fervura, teste do lcool teste do azul de metileno) - Esterilidade comercial 17/18 13/12 Materiais: Quadro branco, piloto,retroprojetor. P anlise microbiolgica de pratos prontos base de pescados crus Materiais: materiais de laboratrios (sushi, sashmi, etc.): Coliformes a 45 , Estaf. Coag.positiva, Vbrio T Deteriorao de carne, frango, ovos e pescados parahaemolyticus, Salmonella 19/20 20/12 Materiais: Quadro branco, piloto,retroprojetor. P- nlise microbiolgica de hortalias: Coliformes a 45 C, Salmonella Materiais: materiais de laboratrios sp., contagem de mesfilos T Deteriorao microbiana dos vegetais T Deteriorao microbiana de cereais, farinhas, produtos lcteos e Materiais: prova impressa Materiais: materiais de laboratrios doces P nlise microbiolgica da granola: B. cereus, coliformes a 45 C, estaf. Coagulase positiva, Salmonella T Conservao dos alimentos mtodos fsicos P Anlise microbiolgica da lingia: Coliformes a 45 C, Salmonella, Clostrdio sulfito redutor T Conservao dos Alimentos mtodos qumicos e biolgicos P- Anlise microbiolgica do queijo de coalho: Coliformes a 45 C, Salmonella, Staphylococcus aureus T GMP, PPHO, HACCP P Microrganismos presentes em produtos comerciais II AVALIAO ESCRITA Seminrio Aula Prtica Seminrio Aula Prtica

21/22 07/02/06

Prova escrita Aula Prtica

23/24 14/02/06 25/26 21/02/06 27/28 08/03 29/30 15/03

Materiais: Quadro branco, piloto,retroprojetor. Materiais: materiais de laboratrios Materiais: Quadro branco, piloto,retroprojetor. Materiais: materiais de laboratrios Materiais: Quadro branco, piloto,retroprojetor. Materiais: materiais de laboratrios Materiais: Prova impressa Materiais: materiais de laboratrios

Aula expositiva Aula Prtica

Aula expositiva Aula Prtica Aula expositiva Aula Prtica Aplicao da prova Aula Prtica

4. INSTRUES GERAIS DA DISCIPLINA E DO LABORATRIO

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Estudar previamente a aula prtica a ser realizada; Ser pontual no horrio previsto para incio das aulas; Trabalhar com ATENO, CALMA e seguir sempre o roteiro de aula; Solicitar aos professores esclarecimentos sobre todas as dvidas; Usar somente os materiais de sua prpria bancada; Cuidado para no contaminar reagentes e solues; Ter o mximo de cuidado para evitar acidentes consigo e com os colegas. Caso ocorra, avise imediatamente o professor. O laboratrio no lugar para brincadeiras; obrigatrio o uso do jaleco (avental) em todas aulas prticas.

NORMAS DE BIOSSEGURANA APLICADAS DISCIPLINA O fundamento bsico da biossegurana assegurar o avano dos processos tecnolgicos e proteger a sade humana, animal e o meio ambiente (Ministrio do meio Ambiente). O trabalho laboratorial executado de forma adequada e bem planejada previne a exposio indevida a agentes considerados de risco sade e sem dvida evita acidentes. A esse procedimento denominamos boas prticas de laboratrio. As prticas de biossegurana baseiam-se na necessidade de proteo ao operador, seus auxiliares e a comunidade local contra riscos que possam prejudicar a sade, assim como proteger o local de trabalho, os instrumentos de manipulao e o meio ambiente. Manipular com biossegurana, os organismos considerados contaminantes, so regidos por leis federais, estaduais e municipais. 1-A permanncia dos alunos no laboratrio de aula prtica de microbiologia ser apenas permitida mediante o uso de avental ou jaleco. O avental dever estar sempre devidamente abotoado; 2-No trabalhar com calados abertos; 3 A entrada dos alunos no laboratrio ser apenas permitida aps a autorizao dos professores responsveis; 4-No se alimentar, beber ou fumar no laboratrio; 5-Trabalhar com seriedade, evitando brincadeiras; 6-Nunca pipetar com a boca. Usar, sempre que possvel, pipetadores automticos ou pras de borracha; 7-Evitar conversar durante a manipulao de cultura de microrganismos; 8-No usar microscpio, caso esteja com conjuntivite; 9- Comunicar imediatamente ao responsvel pela aula prtica, caso ocorra algum acidente como derramamento de cultura bacteriana ou quebra de vidraria; 10-Observar os locais corretos para o descarte do material; 11-Lavar as mos ao termino da aula, mesmo que no tenha trabalhado com cultura de microrganismos; 12- Em caso de dvida, em qualquer situao, solicitar orientao ao professor. LABORATRIO E INSTRUMENTAL 1- Introduo Todo laboratrio bacteriolgico, seja qual for a sua finalidade, deve obedecer a um conjunto de normas gerais, as quais so sempre comuns. Deve possuir amplitude suficiente para abrigar comodamente os mveis, aparelhos e instrumental necessrio. Paredes e pisos devem ser recobertos de material impermevel, de fcil limpeza e as mesas devem ser resistentes a ao de substncias qumicas. A iluminao natural ou artificial tem que ser abundante e difusa. As correntes de ar devem ser evitadas e a ventilao tem que ser controlada, a fim de que possa ser totalmente eliminada, quando necessrio.

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2 - Instrumental indispensvel o conhecimento do instrumental especializado bacteriolgico, sendo a maioria de vidro e de outros materiais diversos. exigido no trabalho

2.1 - Tubos de ensaio Existem tubos de ensaio de diversos tamanhos e formatos: Tubos grossos (20 x 200 mm), tubos finos (12 x 180 mm), tubos de hemlise (10 x 90 mm), Tubo de Durham (5 x 30 mm). 2.3 Pipetas (graduadas , de Pasteur e micropipetas) 2.4 Frascos Bales, Erlenmeyer, Kitasato, frascos tipo conta gotas, provetas, clice (vasos cnicos), Becker (copo graduado), garrafa de Roux 2.5 Vidrarias Diversas Placas de Petri, ala de Drigalsky, Funil, Gral e pistilo, lmina de vidro, lmina escavada, lamnula, cristalizadores, basto de vidro, lmpada a lcool, etc. 2.6 Instrumental Ala de platina, Fio ou agulha de platina, estantes para tubos de ensaio, galerias ou placa de Malassez, swab, esptulas, pinas, etc. 2.7 Aparelhos Balana simples, balana de preciso ou analtica, estufa bacteriolgica, estufa de esterilizao, autoclave, banho Maria, microscpio, centrifuga, potencimetro, contador de colnias, filtro Seitz, bico de Bunsen, micro - incinerador, destilador. indispensvel no laboratrio: capela de fluxo laminar, gua corrente, caneta vidrogrfica, gua destilada, papel kraft, cordo, fita adesiva, algodo hidrfilo e hidrfobo.

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ROTEIRO 1 PREPARO DE MATERIAIS PARA USO NOS TRABALHOS DE MICROBIOLOGIA Os materiais utilizados nos trabalhos do laboratrio de microbiologia, devem estar devidamente limpos e esterilizados. Para tanto, faz-se necessrio o uso rigoroso de tratamentos que possibilitem a perfeita esterilizao dos materiais, que vo desde sua lavagem at a esterilizao propriamente dita. LAVAGEM DE VIDRARIAS As pipetas, frascos, placas de Petri, erlenmyers, etc. devem ser imersos em soluo sulfocrmica concentrada, a qual capaz de dissolver qualquer sujeira, e depois lavadas com sabo neutro ( a fim de no formar resduos que podero interferir no crescimento dos microrganismos) e enxaguados com gua destilada ( para que no fixe os minerais presentes na gua comum). Lavagem de lminas e lamnulas Ferver as lminas e as lamnulas com uma soluo de bicromato de potssio a 5% durante cerca de 1/2 hora. Adicionando a cada 10 min. Um pouco de cido sulfrico concentrado. Lavar o abundantemente em gua destilada e conservar em lcool 95 at o momento do uso. PREPARO DAS VIDRARIAS PARA ESTERILIZAO As vidrarias depois de lavadas de maneira adequada, devem se esterilizadas, obedecendo os seguintes procedimentos: os tubos, bales e outros devem ser embuchados com rolhas de algodo hidrfobo (no absorve gua). A rolha de algodo deve ser suficientemente, porm no muito apertada. Sobre os tampes de algodo coloca-se cartuchos de papel. As tampas das placas de Petri devem ser munidas de um disco de papel de filtro. Traar com a tampa da placa um crculo sobre o papel de filtro, corta-lo, aplica-lo contra a face interna da tampa e ajusta-la bem. A funo deste papel de filtro, de absorver as gotculas de gua que se evaporam da superfcie do meio de cultura. As placas de Petri devero ser envolvidas em papel ou acondicionadas em recipientes apropriados. As pipetas devem ser providas de algodo na extremidade destinada aspirao e enroladas em papel ou guardadas em recipientes apropriados. Os outros objetos ( ala de Drigalsky, pina, bisturi, tesoura, basto de vidro,etc.) devem ser mergulhados em uma soluo de lcool iodado e flambados no momento do uso, repetindo este processo trs vezes. ESTERILIZAO DE VIDRARIAS As vidrarias sero esterilizadas no forno a 160 C , durante 2 horas ou 180/ 1 h. Deixar o forno esfriar antes de abrir, pois o contrrio poder haver quebra de materiais devido a mudana brusca de temperatura. Vidrarias especiais que no puderem ser esterilizadas pelo calor (bales o tarados e pipetas de preciso) sero tratadas por processos qumicos (sublimados a 1 /00 ou soluo de formalina a 5% e depois lavadas em gua estril. o As vidrarias com o meio de cultura, devero ser esterilizadas na autoclave sob presso (121 / o 15 min) ou em vapor fluente (100 C / 1 h , trs dias sucessivos.
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ROTEIRO 2

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA 1 DEFINIO: So substncias ou complexos de substncias capazes de dar aos microrganismos os elementos nutritivos necessrios ao seu desenvolvimento. Considerando que as exigncias nutritivas das bactrias variam muito, existe um grande nmero de meio de cultura. 2 CLASSIFICAO: 2.1 - Quanto ao estado fsico Lquidos, Slidos, Semi- slidos 2.2 Quanto aos componentes nutricionais - Bsicos Permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazerem especialmente nenhuma exigncia caractersticas. - Especiais Cumprem as exigncias vitais de determinados microrganismos. Geralmente so adicionados sangue, soro ou com outros nutrientes. Ex: gar sangue 2.3 - Quanto a procedncia Naturais Sintticos e Semi-sintticos 2.4 - Quanto a finalidade bacteriolgica: Diferenciais Possuem substncias que evidenciam a utilizao de determinados substratos. Estabelecem diferenas entre microrganismos de caractersticas parecidas. Ex: Mac Conkey e Teague. Seletivos permitem o crescimento de um tipo particular de microrganismos ou suprimem o crescimento de outros tipos de microrganismos. Ex: gar SS e gar verde brilhante Enriquecimento favorece o crescimento da espcie desejada, mas no o crescimento das outras espcies presentes em uma populao mista. Estoque - meio pobre em nutrientes, utilizado para manter as culturas armazenadas por um determinado perodo de tempo. 3 COMPOSIO DE MEIOS BSICOS Caldo Simples: Agar Sabouraud ( para fungos ) Extrato de carne........................0,3% Glicose ...........................................40g Peptona.....................................1,0% Peptona ..........................................10g Cloreto de sdio.......................0,5% gar gar ......................................15g gua destilada......................100ml gua destilada ............................1000 ml 3.1 - Etapas na preparao do meio Pesar as substncias, juntar a gua, deixar dissolver, filtrar, ajustar se necessrio o pH para 7,2 a 7,4 usando cido lctico ou hidrxido de sdio com pipeta de 1ml, gotejando aos poucos, antes da adio da gar gar. Distribuir em tubos se o meio for caldo simples. Para tornar o meio slido acrescentar gar - gar e colocar o meio para fundir. O meio para o cultivo de fungos o pH tem que ser ligeiramente cido (5.4) 4 FUNO DAS SUBSTNCIAS: Extrato de carne: Contm substncias que estimulam a atividade bacteriana (fatores de crescimento) e alimento plstico, pois vai integrar o protoplasma bacteriano. Fonte de Carbono. Peptona: fonte de nitrognio Cloreto de sdio aumenta a presso osmtica e mantm a isotonia do meio. garagar: uma substncia mucilaginosa extrada de vrias espcies de Gelidium e outras algas afins. Tem somente funo de solidificar os meios, no sendo metabolizado pelas bactrias.

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5 ESTERILIZAO feita a 121C durante 15 minutos a 1 atmosfera de presso (autoclave). Deixar esfriar a 50c e distribuir assepticamente em placas de Petri. 6 PROVA DE ESTERILIDADE Os meios aps a esterilizao sero colocados na estufa de crescimento a 37c, durante 24h, para comprovao da esterilidade. 7 PROVA DE FERTILIDADE Inocular a cultura no meio esterilizado e incubar a 37 C por 24 - 48horas. NOTA: Partindo-se dos meios bsicos podemos preparar meios com acares. Os meios contendo aucares e protenas naturais no sero esterilizados pelo calor sobre presso e sim pela tindalizao ou pela filtrao. Em se tratando de meios contendo aucares, podemos ainda preparar solues concentradas destes, esteriliz-las por filtrao, na proporo de 1% ou 5%

ROTEIRO 3 COLORAO PELO MTODO DE GRAM 1 INTRODUO A colorao um dos passos mais importantes para a identificao bacteriana. A finalidade facilitar a observao microscpica das bactrias e diferenci-las quanto s suas caractersticas morfotintoriais. 2 PREPARO DO ESFREGAO Coloca-se no centro da lmina, com a ala de platina estril uma alada do material a ser examinado e com movimentos circulares espalhamos cuidadosamente. Se o material estiver em meio slido, colocamos previamente uma gota de soluo salina estril com a ala de platina no centro da lmina e sobre esta uma alada do material, misturamos e espalhamos. O esfregao deve ser fixado pelo calor, passando a lmina trs a quatro vezes pela chama do bico de Bunsen. O aquecimento fixa e mata as bactrias do esfregao. Deixar a lmina esfriar. 3 COLORAO PELO MTODO DE GRAM A colorao de Gram uma das mais importantes e rotineiras em Microbiologia, uma colorao composta e diferencial, pois permite a diferenciao de bactrias em Gram positivas e Gram negativas. Tcnica Cobrir o esfregao com cristal violeta durante 1 minuto, escorrer o corante e lavar rapidamente. Cobrir a preparao com lugol, durante 1 minuto. Lavar em gua corrente. Diferenciar com lcool etlico a 95% at que no se desprenda mais corante (cerca de 30 segundos). Lavar e escorrer o excesso de gua. Cobrir a lmina com fucsina diluda durante 30 segundos, Lavar em gua corrente, escorrer, secar com papel de filtro e passar rapidamente na chama do bico de Bunsen para terminar a secagem. Examinar em microscpio tico utilizando objetiva de imerso (100x), com o condensador alto e o diafragma aberto

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ROTEIRO 4

TCNICA DE COLORAO DE ESPOROS (Endosporos) MTODO DE WIRTZ-CONKLIN 1 INTRODUO Esta colorao baseia-se no grau de afinidade que a estrutura do esporo possui ao corante, comparada com o resto da clula bacteriana, tornando possvel a sua diferenciao. O esporo bacteriano uma parede espessa formada no interior de algumas clulas bacterianas. muito resistente ao calor e a outros agentes fsicos e qumicos; capaz de permanecer em estado latente por longos perodos e, em seguida, germinar, dando origem a uma nova clula vegetativa. 2 FINALIDADE Evidenciar a presena de esporos no interior do Bacillus sp. 3 MATERIAL Cultura em agar de Bacillus sp. Solues: Verde malaquita a 5% em gua Safranina a 1% em gua Soluo fisiolgica Lmina de microscopia e ala de platina 4 ESFREGAO Espalha-se sobre uma lmina, com o auxlio da ala de platina, uma gota do material a ser corado. Fixar pelo calor, passando-se a lmina (a superfcie sobre a qual foi feito o esfregao voltada para cima) sobre a chama por 3 vezes. 5 PROCEDIMENTO TCNICO: Preparar esfregao, secar a temperatura ambiente. Cobrir com soluo de verde malaquita. Aquecer at o desprendimento de vapores por 6 minutos. (aquecer at a emisso de vapores e a partir da iniciar a marcao do tempo) No deixar ferver ou secar. Lavar em gua corrente, suavemente. Cobrir com soluo de safranina durante 30 segundos. Lavar em gua corrente e secar ao ar. Examinar no microscpio com objetiva de imerso. 5 RESULTADO O esporo se cora na de verde, porm o resto da clula ou a clula que no possui esporo se tinge de vermelho ou rseo. 6 INTERPRETAO Com a ao drstica do calor sobre a clula esporulada h penetrao do verde malaquita no cerne do esporo e no h descoramento com a lavagem de gua; quando se coloca a safranina, ela cora as estruturas da clula vegetativa que no conseguiram reter o verde malaquita.

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ROTEIRO 5

TCNICAS GERAIS DE SEMEADURA 1 DEFINIO Semear um microrganismo coloc-lo em um ambiente adequado, em meio de cultura apropriado ao seu desenvolvimento e reproduo. Ao semear um germe, preciso levar em conta as tcnicas de assepsia nas manipulaes, esterilidade do instrumento e dos meios de cultura empregados. 2 FINALIDADE Isolar do material uma ou mais espcies microbianas, transplantar (repicar) uma cepa pura, visando conserv-la ou estudar as suas caractersticas morfolgicas, culturais e bioqumicas. A semeadura, plantio ou inoculao de bactrias em meios de cultura pode ser feita mediante diversos procedimentos. 3 NATUREZA DO INCULO Secreo, fluidos orgnicos, produtos patolgicos, fragmentos de tecidos, raspado de pele, amostras retiradas de alimentos, etc. Suspenso de bactrias provenientes de crescimento em meio de cultura slido. Bactrias desenvolvidas em meio liquido. Definir inculo 4 MEIOS DE CULTURA Slido- em tubo ( em coluna e inclinado ), em placa e em garrafa de Roux Lquido em balo, em tubo Semi - slido em tubo 5 - TIPOS DE SEMEADURA E FINALIDADES 5.1 PLACA Estrias simples e estrias compostas (Agar semeado com ala de platina) no crescem colnias isoladas Esgotamento por Estrias ( gar semeado com ala de platina ) Isolamento de colnias. Disseminao ( gar semeado com ala de Drigalsky ou Swab ) Teste de sensibilidade Obteno de Antgeno Pour- plate ( gar fundido resfriado a 45c 50c semeado com pipeta, - Contagem de colnias. 5.2 - TUBOS Punctura ou picada (gar semi - slido, slido em coluna, semeado com agulha de platina) Teste de Motilidade Conservao de bactrias Shake tube (Agar fundido e resfriado a 45 C- 50 C, semeado com pipeta, ala de platina) Estrias (Agar inclinado semeado com ala ou agulha de platina) Realizao de determinadas provas bioqumicas, ativao das culturas, conservao dos microrganismos. Meio Lquido (com ala ou pipeta) Testes Bioqumicos, ativao da cultura 6 LEITURA E INTERPRETAO DAS SEMEADURAS Caractersticas do crescimento em meios lquidos - turvao, depsito, pelcula, pigmento. Caractersticas do crescimento em meio semi-slido (tubo) - Observar se o crescimento ficou restrito linha de inoculao (microrganismo imvel). Observar se o crescimento difundiu-se ao longo da linha de inoculao (microrganismo mvel). Usualmente todo o meio encontra-se turvo. Caractersticas do crescimento em meios slidos Em tubo inclinado - Observar a quantidade de crescimento: abundante, escasso, nulo, presena de pigmentos (cor) difusvel ou no. Em placas - semeado por estrias: verificar o isolamento das colnias, estudar as caractersticas em relao ao tamanho, forma, bordos, pigmentos, caracteres pticos, dentre outros; semeados por disseminao - Crescimento confluente; semeados por "pour - plate" - contagem de colnias.

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ROTEIRO 6

AVALIAO DA QUALIDADE DO LEITE O Leite um excelente meio de cultura para vrios microrganismos. Ao ser produzido nos alvolos, ele estril, mas medida que se desloca pelos canais da glndula, em direo cisterna, pode contaminar-se com microrganismos da microbiota normal. Algumas vezes o leite pode conter microrganismos patognicos (Salmonella, Coxiela burnetti, Mycpbacterium bovis, M. tuberculosis, Brucella abotrus).A contaminao do leite pode continuar durante a ordenha, o transporte e o armazenamento. Pessoas portadoras de infeces que participam da manipulao do produto tambm podem representar fonte de contaminao. As condies de transporte e?ou armazenamentos tambm contribuem para a multiplicao dos microrganismos presentes no leite. Assim grandes populaoes de microrganismos degradadores (Streptococcus, Leuconostoc, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Proteus) podem estar presentes no leite. A qualidade do leite pode ser avaliada em funo de sua microbiota, fornecendo informaoes que refletem as condies sob as quais o alimento foi produzido, beneficiado e/ou mantido (refrigerao e armazenamento inadequado). PROCEDIMENTOS UTILIZADOS 1. Teste de fervura Baseia-se no fato de que o aquecimento reduz o pH. Se um leite apresenta-se bastante alterado(pH baixo), embora com aspecto fsico normal, ele coagular ao ser aquecido, pois o pH baixa ainda mais. colocar 5 mL de leite num tubo de ensaio - Ferver - Observar se h ou no coagulao (leite alterado ou normal respectivamente) 2. Teste do lcool Este mtodo particularmente til na identificao de animais portadores de infeces (Streptococcus) sem manifestaes clnicas. Animais infectados levam coagulao do leite, neste teste, que pode aparecer rapidamente ou demorar de quatro a seis horas, quando as alteraes so pequenas. - Colocar 5 mL de leite num tubo de ensaio - Adicionar 5 mL de lcool 70% - Observar se h ou no coagulao (leite alterado ou normal, respectivamente) 3. Teste do azul de metileno O crescimento de microrganismo no leite provoca o consumo do oxignio presente no meio. Esse fenmeno leva produo de substncias redutoras, diminuindo o potencial xido-redutor (O/R). Atravs de uma substncia indicadora, possvel acompanhar ou medir essa diminuio do potencial O/R. O corante azul de metileno um exemplo de substncia indicadora. Em sua forma oxidada ele apresenta de cor azul, e, em sua forma reduzida, ele incolor (leuco azul de metileno).Quando introduzido numa cultura bacteriana,ou em qualquer meio contendo bactrias, o azul de metileno age como aceptor de eltrons, ou seja, sofre reduo, tornando-se incolor. A velocidade dessa transformao diretamente proporcional concentrao bacteriana no meio. possvel, dessa forma,avaliar a concentrao bacteriana no meio pela adio desse corante e pela determinao do tempo de descoramento.

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Tabela 3 Relao entre o tempo aps a adio de azul de metileno Tempo de descoramento < 20 minutos 20 minutos 2 horas 2 horas 5,5 horas > 5,5 horas de descoramento do leite e o nmero de bactrias UFC/mL 7 > 2,0 x 10 6 7 4 x 10 2,0x 20 5 6 5 x 10 4 x 10 5 < 5 x 10 Qualidade pssima m regular boa

- Pipetar para um tubo de ensaio 10 mL do leite a ser testado - Juntar 1 mL de azul de metileno (0,02%) - Misturar e colocar na estufa a 37 C. Anotar o horrio de incio. - Fazer a primeira leitura aps 20 minutos e as seguintes a cada 30 minutos. Considera-se um teste positivo quando a cor do fundo do tubo estiver branca 4. Contagem de bactrias aerbias mesfilas (pour plate) No aspecto quantitativo procura-se avaliar a populao de um modo geral - Preparar uma diluio decimal em srie at 10 . 3 5 - Inocular as placas em duas repeties com 1 mL das diluies de 10 a 10 . - Verter nas placas o meio Agar padro para contagem (PCA) a 45 C - Homogeneizar, deixar solidificar, inverter e incubar por 48h a 37 C. - Proceder a contagem Tabela 2 Limite de tolerncia para os diferentes tipos de leite. * Excludo na RDC 12 Tipo de leite A B B Salmonella sp Ausncia em 25 mL 25/mL 25/mL Coliformes totais* NMP/mL 1 4 10 Coliformes fecais NMP/mL Ausncia 1 2 Contagem padro em placas* UFC/mL 3 2 x 10 /mL 4 8 x 10 /mL 5 3 x 10 /mL
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ROTEIRO 7

PREPARA DE AMOSTRAS DE ALIMENTOS PARA ANLISES: DILUIO E PLAQUEAMENTO AMOSTRAS LQUIDAS 1- Amostras lquidas em frascos com espao suficiente para agitao devem ser misturadas antes da retirada da unidade analtica, invertendo-se a embalagem 25 vezes 2- Antes de abrir a embalagem, limpar a rea externa com etanol 75%, para remoo dos contaminantes presentes 3- Amostra direta transferir assepticamente 1,0 mL ou 10 mL das amostras para o meio em questo -1 4- Amostra diluda - diluies seriadas: 10 transferir assepticamente uma poro de 1,0mL da amostra para 9,0 mL de diluente ( gua salina peptonada 0,1% ou tampo -2 fosfato pH 7,2), para a preparao da segunda diluio (10 ) , transferir -1 assepticamente 1,0 mL da diluio 10 para 9,0mL de diluente. As diluies 3 -4 subseqente(10- , 10 etc.) so obtidas de maneira similar, transferindo-se 1,0 mL da diluio anterior para 9,0 mL de diluente. Antes de retirar o volume a ser transferido, agitar o tubo no agitador tipo vortex ou inverter o tubo 25 vezes. Usar sempre uma pipeta diferente para cada diluio AMOSTRAS SLIDAS 1- Antes de abrir a embalagem, limpar a rea externa com etanol 75%, para remoo dos contaminantes presentes

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2- A unidade analtica utilizada na maioria dos alimentos slidos 25g. Retirar assepticamente a amostra e transferir para um triturador (liquidioficador), contendo 225 mL do diluente. Triturar e homogeneizar por 60 segundos. Transferir o material -1 diludo (!0 ) para um erlenmayer de 500mL e proceder as diluies subseqentes 2 -3 (10- , 10 etc ) utilizando tubos com 9,0mL do diluente. OBS: O nmero de diluies requeridas depender do nvel de contaminao esperado. Caso no haja possibilidade de se estimar o nvel de contaminao da amostra, deve-se 0 preparar e inocular amostra direta (10 em caso de amostra lquida ) seguindo a diluio -1 -7 10 at a diluio 10 TCNICA DO PAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE POUR PLATE 1- Selecionar trs diluies adequadas da amostra e inocular 1,0mL de cada diluio em placas de Petri estreis. (realizar este procedimento em duplicatas) 2- Verter nas placas inoculadas 20 mL do agar requerido para a anlise, previamente fundido e resfriado a 45 C. Misturar o inoculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas, numa superfcie plana e seca, em movimentos circulares (4 vezes no sentido horrio, 4 vezes no sentido anti-horrio e 4 vezes na forma de oito). 3- Esperar solidificar o meio. Inverter as placas e incubar nas temperaturas requeridas

ROTEIRO 8

CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERBIOS 1. Preparar diluies de 10 ate 10 da amostra (No caso da amostra lquida comear 0 com a amostra direta 10 ) 2. Inocular 1,0mL de cada diluio em placas de Petri estreis. (realizar este procedimento em duplicatas) 3. Verter nas placas inoculadas 20 mL do Agar Padro para Contagem (PCA), previamente fundido e resfriado a 45 C. Homogeneizar. Esperar solidificar Contagem total de aerbios mesfilos 1. Incubar as placas invertidas a 35 C/48h. Contar todas as colnias Contagem total de aerbios psicrotfilos 2. Incubar as placas invertidas a 7 C/10 dias . Contar todas as colnias Contagem total de aerbios termfilos 3. Incubar as placas invertidas a 55 C/24 h . Contar todas as colnias Contagem das colnias: Selecionar as placas que tenha entre 25 a 250 colnias. Calcular o nmero de unidades formadora de colnia (UFC) por mL ou grama , multiplicar pelo inverso da diluio inoculada . Ex: 100 colnias na diluio 10 = 100 x 10 = 10 000 = 1,0 x 10 UFC/g ou mL Contagem de bolor e levedura 1. Preparar diluies de 10 ate 10 da amostra (No caso da amostra lquida 0 comear com a amostra direta 10 ) 2. Inocular 0,1 mL de cada diluio nas placas contendo o meio solidificado Agar batata dextrosado (PDA)
-1 -6 -2 2 4 -1 -7

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3. Incubar as placas no invertidas a 25 C ou temperatura ambiente por 5 dias (contar primeiro com 3 dias). 4. Contagem das colnias: Selecionar as placas que tenha entre 15 a 150 colnias. Calcular o nmero de unidades formadora de colnia (UFC) por mL ou grama , multiplicar pelo inverso da diluio inoculada e depois por 10 (j que foi inoculado 0,1 ml e no 1 ml) Ex: 100 colnias na diluio 10 = 100 x 10 = 10 000 x 10 = 1,0 x 10 UFC/g ou mL
-2 2 5

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CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS A utilizao de meios acidificados a pH 3,5 0,1 promove seletivamente o crescimento de fungos, inibindo a maioria das bactrias presentes no alimento. - PROCEDIMENTOS - Inocular 0,1 mL das diluies selecionadas sobre a superfcie seca de gar batata glicose 2% acidificado com cido tartrico a pH 3,5. Com o auxlio de ala de Drigalski , espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio, at sua completa absoro. Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir -1 em duplicata 1 mL da diluio 10 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos lquidos poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10), o que corresponder -1 diluio 10 . - Incubao: Incubar as placas, sem inverter, a 25 C por 5 a 7 dias, em incubadora de B.O.D. - Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias.

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CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS (37 C) E COLIFORMES FECAIS (45 C ou termotolerante) A contagem de coliformes) baseada nas caractersticas do grupo: bastonete Gramnegativo, que produzem cido e gs a partir de lactose. Coliformes Totais: Habitat intestinal e ambiental: Escherichia coli, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella Coliformes Fecais: Habitat excluisivamente intestinal: Escherichia coli Procedimento: Mtodo: tubos mltiplos (Nmero mais provvel NMP) 1. Teste presuntivo Presume-se que os microrganismos que crescem e produzem gs a partir da lactose sejam coliformes Meio de enriquecimento: caldo lauryl sulfato triptose - Inocular trs tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10 mL de caldo lauryl sulfato triptose (dupla concentrao) com 10 mL da amostra . - Inocular trs tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10 mL de caldo lauryl sulfato tripose (concentrao normal) com 1m L da amostra.

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- Inocular trs tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10mL de caldo lauryl sulfato triptose (concentrao normal) com 0,1 mL da amostra - Incubar a bateria com as sries te tubos a 37 C/48h - Fazer a leitura, considerando positivos os tubos com presena de gs no interior dos tubos de Durham 3- Teste confirmativo Coliformes Totais Meio seletivo caldo lactosado bile verde brilhante. Neste meio, os sais de bile tm a funo de inibir o crescimento de bactrias no entricas e o verde brilhante de inibir as bactrias Gram-positivas,selecionando desta forma os coliformes. - Imediatamente aps a leitura do teste presuntivo,transferir com uma ala de platina uma alquota de cada tubo positivo para tubos ( tubos de Durham invertidos no seu interior) contendo caldo lactosado bile verde brilhante. - Incubar a 35 C por 48h - Fazer a leitura identificando como positivos os tubos com gs. - Usar a tabela de NMP para verificar qual o nmero mais provvel de coliformes totais por grama ou mL. Coliformes Fecais Os coliformes fecais tm em seu ambiente natural (trato intestinal) temperaturas mais elevadas. Eles so capazes de crescer a 44,5 C, possibilitando, assim,de uma forma prtica, serem avaliados separadamente. - Imediatamente aps a leitura do teste presuntivo, transferir com a ala de platina uma poro de cada tubo positivo para tubos contendo caldo EC (Escherichia coli) (tubos de Durham invertido no seu interior). - Incubar a 44,5 (pescado) ou 45 C por 24h. Utilizar o banho-maria Fazer leitura identificando como positivo os tubos com gs Usar a tabela de NMP para verificar qual o nmero mais provvel de coliformes fecais/g ou mL

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PESQUISA de Salmonella sp Todas as salmonelas so consideradas potencialmente patognicas para o homem.A nica via de entrada destes microrganismos no corpo humano a oral, por isso de suma importncia a anlise dos alimentos para detectar sua presena. A metodologia recomendada segue 4 etapas que podem ser aplicadas a qualquer tipo de alimentos

Pr- enriquecimento em caldo no seletivo; objetiva a recuperao de clulas injuriadas -1 - Adicionar 25g ou mL da amostra em 225 mL do caldo de pr- enriquecimento (diluio 10 ). Homogeneizar no liquidificador por 60 seg. Verter todo material em erlenmyer estril e incubar a 35 C/ 24h. Para uso geral recomenda-se o caldo lactosado ou a gua peptonada 0,1% tamponada e para produtos lcteos gua destilada verde brilhante. Enriquecimento Seletivo: estimula a multiplicao de salmonelas e reduz ou inibe o crescimento dos organismos competitivos, tais como coliformes, Proteus e Pseudomonas - Transferir 1,0 mL para 10mL de caldo Tetrationato (TT) .Incubar a 35 C/24h.

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Plaqueamento seletivo diferencial: Objetiva promover o desenvolvimento preferencial de colnias de Salmonella, com caractersticas tpicas que as distingam dos competidores, para posterior confirmao sorolgica e bioqumica. - Agitar o tubo de enriquecimento seletivo e estriar uma alada do caldo tetrationato em placas de Agar entrico de Hectoen (HE) e gar xilose lisina descarboxilado (XLD). Incubar as placas invertidas a 35 C/24h. Verificar se h desenvolvimento de colnias tpicas de Salmonella: Agar HE: colnias transparentes, verde-azuladas, com ou sem centro preto. Agar XLD: colnias transparentes, cor de rosa escuro,com ou sem centro preto. Confirmao Preliminar das colnias tpicas de Salmonella Com o auxlio de uma agulha de inoculao, remover uma poro da massa de clulas, do centro da colnia tpica (no mnimo 2 colnia) e semear em tubos inclinados de Agar Lisina Ferro (LIA) e gar Trplice Acar.. A semeadura deve ser feita por picada e estrias na rampa. Incubar os tubos a 35 C/24h. Observar reao tpica: TSI- rampa alcalina (vermelha) e fundo cido (amarelo),com ou sem produo de H2S (escurecimento do agar). Reao atpica que no deve ser descartada se as demais reaoes em LIA se apresentarem tpicas: rampa e fundo cidos (amarelos), com ou sem produo de H2S. LIA fundo e rampa alcalinos(prpura, sem alterao da cor do meio), com ou sem produo de H2S. Reao atpica, que no devem ser descartada se as demais reaoes em TSI se apresentarem tpicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produo de H2S. Teste bioqumico . Meio SIM Transferir com uma agulha atravs de picada a cultura de colcia tpicado TSI para o meio. Incubar 35 C/24h. . Produo de H2S: escurecimento do agar. Salmonela pode produzir ou no H2S . Motilidade : crescimento na regio da picada imvel crescimento em todo agar ou ao redor da regio da picada: mvel. Salmonela mvel Aps a leitura do H2S e da motilidade, adicionar 5 gotas de reativo de Erlich ou Kovacs no tubo. Aparecimento de cor rsea: indol positivo. Aparecimento de cor amarelado: indol negativo. Salmonela indol negativo Teste do vermelho de metila (VM) 3 Voges-Proskauer (VP): Transferir uma alada com inoculo da cultura em TSI, para dois tubo com caldo 3mL VM-VP e incubar a 35 C/48h para VP e 96h VM. Aps o perodo de incubao , no tubo VP adicionar 1,8 mL de soluo de alfa naftol 5% e agitar. Adicionar em seguida 0,6 mL de soluo KOH 40%, agitar. Observar at 1 hora. Desenvolvimento de cor vermelha ou rosea teste positivo Permanncia do meio na cor do reagente(amarelado ou ligeiramente esverdeado) teste negativo. A maioria das Salmonelas so VP negativas No tubo VM adicionar 5 gotas de soluo vermelho metila e observar imediatamente se o meio adquire uma colorao vermelha teste positivo ou amarela _ teste negativo. A maioria das cepas de Salmonela so VM positivas. Teste do citrato: Com uma agulha de inoculao, transferir um inoculo da cultura para um tubo de agar citrato de Simmons inclinado, estriando a rampa e picando o fundo. Incubar a 35 C/ 96h. Observar o crescimento: Cor azul: citrato positivo: a maioria das cepas de Salmonelas so citrato positivo Cor do meio inalterado: citrato negativo Teste de urease: transferir uma alada da cultura crescida no TSI para um tubo com caldo uria de Chistensen. Incubar 35 C/24h. Observar crescimento Cor do meio original (pssego): teste negativo. A maioria das cepas de Salmonelas so ureases negativa Cor do meio rosa escuro: teste positivo Teste da descarboxilao da lisina em caldo Transferir uma alada da cultura em TSI para um tubo com caldo lisina ( previamente desaerado). Cobrir a superfcie do caldo com 2 q 3 ml de parafina ou leo mineral estril.Incubar

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a 35 C /48h h. Observar: Alterao do meio de esverdeado para prpura azulado : teste positivo- As cepas de Salmonelas so lisinas positivas . alterao do meio par cor amarela (cida): tesete negativo. Reao sorolgica frente ao anti-soro polivalente O Ressuspender o cultivo obtido em gar estoque inclinado (de 18 a 24 horas) em aproximadamente 2 mL de soluo salina 0,85%. Em lmina de vidro, placa de Petri ou placa de Huddleson, depositar separadamente uma gota de soluo salina 2% e uma gota do soro anti-Salmonella polivalente "O", diretamente do frasco. Em seguida, acrescentar a cada uma delas uma gota da suspenso em teste. Com movimentos circulares, realizar a leitura com iluminao sobre fundo escuro em 1 a 2 minutos. Classificar a reao do seguinte modo: Positiva: presena de aglutinao somente na mistura cultivo + anti-soro; Negativa: ausncia de aglutinao em ambas as misturas; No especfica: presena de aglutinao em ambas as misturas (formas rugosas). ROTEIRO 12 CONTAGEM DE Staphylococcus aureus A contagem de S. aureus em alimentos pode ser feita com dois objetivos, um relacionado com a sade pblica, para confirmar o envolvimento em surtos de intoxicao alimentar, e outro relacionado com o controle de qualidade higinico-sanitria dos processos de produo de alimentos, condio em que S. aureus serve como indicador de contaminao ps-processo ou das condies de sanificao das superfcies destinadas ao contato com alimentos. Mtodo: Contagem direta em placa Procedimento: - Inocular 0,1 mL de cada diluio na superfcie de placas de agar Baird-Parker(BP). Espalhar o inculo com uma ala de Drigalski, at que todo o excesso de lquido seja absorvido. Se as contagens estimadas de S. aureus na amostra forem menores do que 100/g ou mL, inocular 1,0 mL da primeira diluio, distribuindo o volume por quatro placas , 3 com 0,3 e uma com 0,1 mL. - Incubar invertidas a 37 C por 48h. - Contar as colnias tpicas de S. aureus selecionando as placas que tenha entre 25 a 250 colnias. Colnias tpicas: colnias circulares,pretas, pequenas, lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa de clulas esbranquiadas nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para alm da zona opaca. Colnias atpicas: cinzentas, sem um ou ambos os halos tpicos. Confirmao das colnias - Selecionar no mnimo cinco colnias tpicas, para teste de coagulase, e havendo menos do que cinco tomar todas. Se a placa apresentar colnias suspeitas de mais de um tipo, tpicas e atpicas, selecionar pelo menos cinco de cada tipo.Transferir cada colnia para um tubo de caldo infuso crebro corao (BHI), emulsionar bem a massa de clulas com o caldo, transferir uma alada para um tubo com agar tripticase de soja (TSA) inclinado e incubar ambos os tubos a 35 C/24h. Teste da coagulase: Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho. Incubar a 36 1C por 6 horas. Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir: Reao negativa: no formao de cogulo; Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado; Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado; Reao 3+ : cogulo grande e organizado; Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo, que no se desprender quando o

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tubo for invertido; Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus; Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus. Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo contendo gar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas, para a realizao dos testes complementares: Testes complementares: A partir da cultura pura em BHI ou gar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas: Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes complementares. Pesquisa de termonuclease: Fazer orifcios eqidistantes com cerca de 2 mm de dimetro no gar para ensaio de termonuclease ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas. Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado. Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas. O aparecimento, ao redor dos orifcios, de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo de clarificao no agar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de reao positiva para termonuclease. Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1 mm. O Staphylococcus aureus termonuclease positiva. Prova da catalase: Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou Pipeta de Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase.. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus catalase positiva. RESULTADOS Quando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias selecionadas e repicadas, o resultado ser igual contagem inicial, levando-se em considerao a diluio utilizada. ROTEIRO 13

CONTAGEM DE Bacillus cereus O Bacillus cereus aerbico formador de esporos e se encontra normalmente presente no solo, poeira e gua e alimentos com baixo aw. Os alimentos envolvidos so pratos a base de cereais e hortalias. . PROCEDIMENTOS Inoculao - Inocular sobre a superfcie seca do gar MYP (Polimixina gema de ovo) ,0,1 mL de cada diluio selecionada.Com auxilio de ala de Drigalski, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio at completa absoro.Nos casos em que for necessria a obteno -1 de resultado menor que 100 UFC/g ou mL distribuir 1 mL da diluio 10 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de amostras lquidas, poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra. - Incubao: Incubar as placas invertidas a 30 por 30 a 48 horas. - Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias

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rodeadas por um halo de precipitao opaco sobre um fundo rseo, no gar MYP. - Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e seme-las em tubos com gar nutriente inclinado. - Incubar a 35C por 24 horas. - De cada tubo, fazer esfregao e corar pelo mtodo Gram para verificar a presena de bastonetes curtos Gram positivos, com extremidades quadradas dispostos em cadeias. Os esporos so centrais ou sub-terminais. - Das culturas puras em gar estoque inclinado, realizar as seguintes provas: Identificao Bioqumica - Motilidade e reduo de nitrato Inocular, com agulha, tubos contendo gar motilidade-nitrato. Incubar a 35 C por 18 a 24 horas. Aps incubao, verificar o tipo de crescimento presente. Culturas imveis mostram crescimento apenas na linha de inoculao, enquanto que as mveis crescem de forma difusa.O Bacillus cereus em 50 a 90% dos casos mostra-se mvel. Aps a leitura da motilidade, adicionar aos tubos 2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato.O Bacillus cereus reduz o nitrato a nitrito. - -hemlise em gar sangue de carneiro. Inocular por estria em placa com gar sangue de carneiro. - Incubar a 35 C por 24 horas. Observar a produo de -hemlise caracterstica do Bacillus cereus. Bacillus cereus produtor de -hemlise. - Crescimento rizide: Inocular com ala sobre a superfcie seca de gar nutriente, depositando o inculo no ponto central da placa. - Incubar a 35 por 48 a 72 horas. - Aps incubao verificar o tipo de crescimento: Crescimento rizide se caracteriza pelo aparecimento de colnias com longas extenses em forma de razes ou longos fios, tpicas de Bacillus mycoides. O Bacillus cereus no apresenta crescimento rizide, porm algumas cepas podem apresentar colnias rugosas em forma de galxia. - RESULTADOS Calcular o nmero de Bacillus cereus multiplicando o nmero de colnias confirmadas, nas provas confirmativas, pelo fator de diluio usado.

ROTEIRO 14 CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E DE Clostridium perfringens A partir das diluies escolhidas, semear alquotas de 1 mL em placas estreis e adicionar cerca de 15 mL de gar TSC ou SFP em temperatura de 46 - 48C. Homogeneizar cuidadosamente e deixar solidificar em superfcie plana. Aps, adicionar uma segunda camada de cerca de 10 mL do mesmo meio. Deixar solidificar em superfcie plana. Incubao: Imediatamente aps a solidificao do gar, incubar as placas (sem inverter), em jarra de anaerobiose a 35C por 18 a 24 horas. Seleo e Isolamento: As colnias tpicas de Clostridium sulfito redutores so negras e de tamanho varivel de 1 a 3 mm no gar TSC. Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colnias tpicas. Contar todas as colnias negras presentes. Anotar o resultado. Esse resultado, multiplicado pela diluio usada, corresponde ao nmero de Clostridium sulfito redutores presentes por grama da amostra em anlise. RESULTADOS Calcular o nmero de Clostridium sulfito redutores multiplicando o nmero de colnias negras contadas no gar TSC pelo fator de diluio usado

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NMERO MAIS PROVVEL DE Vibrio parahaemolyticus PROCEDIMENTOS Provas presuntivas -1 Inoculao em caldo de enriquecimento seletivo: A partir da diluio inicial (10 ), efetuar as demais diluies desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mnimo mais duas diluies). Inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies desejadas em sries de 3 tubos contendo GSTB . Incubar os tubos a 35 C por 18 horas a 24 horas. Leitura: A presena de turvao do meio indica a suspeita da presena de Vibrio parahaemolyticus. Anotar o nmero de tubos de cada srie que apresentaram turvao. Isolamento em gar tiosulfato citrato sais biliares (TCBS) Inoculao: A partir de cada tubo de GSTB que apresentar turvao, sem agit-lo e com auxlio de uma ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril, retirar uma alada do crescimento da superfcie e estri-la sobre a superfcie seca de gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS). Incubar as placas em posio invertida a 35C por 24 horas. Leitura: Verificar o aparecimento de colnias arredondadas, opacas, de cor azul esverdeada, com 2 a 3 mm de dimetro, tpicas de Vibrio parahaemolyticus. Quando no houver colnias suspeitas, o resultado ser negativo para o tubo de origem. Provas preliminares para identificao de Vibrio parahaemolyticus De cada placa, selecionar de 2 a 3 colnias tpicas e transfer-las simultaneamente para tubos contendo caldo peptonado sal 3% e gar nutriente sal 3% inclinado.Incubar a 35C por 18 a 24 horas. Colorao de Gram: A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, proceder colorao de Gram . O Vibrio parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gram negativos. Em culturas antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos. Crescimento com 8% de sal e sem sal: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, transferir, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, uma alada para um tubo contendo caldo peptonado sem sal e caldo peptonado sal 8%. Incubar os tubos a 35C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, verificar a presena de turvao indicativa da ocorrncia de crescimento. O Vibrio parahaemolyticus no cresce no meio sem sal e cresce no meio com 8% de sal. Prova da oxidase: A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, usando palitos de madeira, de plstico descartveis, pipetas Pasteur, ou ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, podem ocorrer reaes falso-positivas. O aparecimento de cor azul (quando usado o reativo N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou de cor vermelha intensa (quando o reativo usado o oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. OBS: No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva. O Vibrio parahaemolyticus oxidase positiva Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, inocular, com auxlio de ala de nquel-cromo, um tubo contendo caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estreis. Incubar a 35 C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio, de vermelho para amarelo, devido fermentao da sacarose e produo de cido. O Vibrio parahaemolyticus no altera a colorao do meio pois no capaz de fermentar a sacarose. gar Kligler ferro sal 3% A partir do cultivo mantido no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de platina

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ou nquel-cromo, inocular, mediante picada central em toda a profundidade do gar e estriando a superfcie inclinada, tubos com gar TSI sal 3% ou gar Kligler ferro sal 3%. Incubar a 36 1C por 24 horas. O Vibrio parahaemolyticus apresenta base cida (amarela), sem gs, sem produo de H2S e bisel alcalino (vermelho). .Provas adicionais para identificao de Vibrio parahaemolyticus As colnias que apresentarem comportamento compatvel com V.parahaemolyticus nas provas preliminares, devero ser submetidas s provas adicionais, conforme descrito em 5.5.1 a 5.5.9. Teste do crescimento a 42C: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo peptonado sal 3%. Incubar a 42 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao dos meios. O vbrio parahaemolyticus cresce temperatura de 42C. gar gelatina sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular uma placa de Petri contendo gar gelatina sal 3% (cada placa pode ser dividida em at 6 setores e cada cultivo pode ser inoculado no centro de cada setor). Incubar as placas a 35C por 18 a 24 horas. Colocar as placas em refrigerao por alguns minutos antes e realizar a leitura, o que facilita a vizualizao do halo. O aparecimento de um halo opaco ao redor do crescimento indica a presena da gelatinase. O Vibrio parahaemolyticus gelatinase positiva. Teste da motilidade: A partir da cultura mantida no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, atravs de picada central, inocular um tubo contendo gar motilidade sal 3%.Incubar a 36 1C por 24 horas. Um crescimento bacteriano difuso ao redor da picada caracteriza motilidade positiva. O Vibrio parahaemolyticus apresenta motilidade positiva. Prova de Hugh-Leifson glicose (OF): A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3% , inocular, com auxlio de agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, dois tubos contendo meio OF glicose (Hugh-Leifson) sal 3%. Cobrir um dos tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida,estril.Incubar a 35C/24h Aps o perodo de incubao, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo e a presena de bolhas de gs nos meios. A cor amarela nos dois tubos significa fermentao da glicose. A presena de cor amarela somente no tubo sem leo mineral significa utilizao oxidativa da glicose. O Vibrio parahaemolyticus fermenta a glicose sem produo de gs, ou seja, os dois tubos devem apresentar colorao amarela. Descarboxilao da lisina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%. Inocular tambm um tubo contendo meio base (sem adio do aminocido) que servir de controle. Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 35C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de Caldo vermelho de fenol lisina sal 3% no inoculado, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose, e, ocorrendo a descarboxilao da lisina, o meio retorna cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio parahaemolyticus descarboxila a lisina. Hidrlise da arginina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo arginina sal 3%. Inocular tambm um tubo contendo o meio base (sem adio do aminocido) que servir de controle. Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 35C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina sal 3% no inoculado, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose, e, ocorrendo a hidrlise da arginina, o meio retorna a cor prpura devido produo de

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aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio parahaemolyticus no hidrolisa a arginina. Prova da fermentao do manitol e arabinose: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol sal 3% e outro tubo contendo caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 35C por 24 h Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao dos meios de vermelho para amarelo, devido fermentao dos acares e conseqente produo de cido. 99% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta o manitol. 50% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta a arabinose. Teste do halofilismo: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular tubos contendo caldo peptonado sal 6% e 10%.Incubar a 35C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao nos meios. O Vibrio parahaemolyticus cresce a 6% de sal e no cresce, ou apresenta crescimento discreto, a 10% de sal. RESULTADOS Sero consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus as culturas que apresentarem os seguintes resultados nas provas adicionais de identificao: Motilidade - positiva Hugh Leifson (OF) - glicose fermentativo Descarboxilao da lisina - positivo Hidrlise da arginina - negativo Crescimento a 42C - positivo Fermentao do manitol - positivo Fermentao da arabinose - positivo gar gelatina sal 3% - crescimento com formao de halo Halofilismo (6% sal) - positivo Halofilismo (8% sal) - positivo Halofilismo (10% sal) - negativo ou crescimento discreto A partir da combinao de tubos com resultado positivo em cada srie, calcular o Nmero Mais Provvel.Expressar o valor obtido em NMP/g.

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