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1, 31-34, 2008 DETERMINAO DA DIFERENA ENTRE O VALOR REAL E O TERICO DO TRIGLICERDEO ECN 42 PARA A DETECO DE ADULTERAO EM AZEITES DE OLIVA COMERCIALIZADOS NO BRASIL Sabria Aued-Pimentel*, Emy Takemoto, Edna Emy Kumagai e Cristiane Bonaldi Cano Instituto Adolfo Lutz, Servio de Alimentos, Diviso de Bromatologia e Qumica, Av. Dr. Arnaldo, 355 - CP. 1783, 01059-970 So Paulo SP, Brasil Recebido em 11/10/06; aceito em 25/5/07; publicado na web em 19/12/07

CALCULATION OF THE DIFFERENCE BETWEEN THE ACTUAL AND THEORETICAL ECN 42 TRIACYLGLYCERIDE CONTENT TO DETECT ADULTERATION IN OLIVE OIL SAMPLES COMMERCIALIZED IN BRAZIL. The difference between the actual ECN 42 triacylglyceride content in vegetable oils, obtained by HPLC analysis, and the theoretical value calculated from the fatty acid composition was applied to detect the addition of seed oils with high contents of linoleic acid to olive oils commercialized in Brazil. The results indicate that samples analyzed were probably adulterated with low commercial value seed oils, rich in linoleic acid, like soybean, sunflower or corn. Keywords: ECN 42 triacylglyceride content, olive oil, adulteration.

INTRODUO O azeite de oliva o nico produto no setor de leos e gorduras que possui seu prprio acordo internacional de comrcio. O Conselho Olecola Internacional (COI) a organizao intergovernamental responsvel pela administrao desse acordo, o qual tem sido constantemente negociado nas conferncias sobre produtos alimentcios nas Naes Unidas. A norma de comrcio do COI estabelece teores mnimos de pureza do produto e critrios de qualidade para cada categoria de azeite de oliva e leo de bagao de oliva. Tambm so estabelecidas normas de higiene, embalagem e rotulagem, alm da recomendao de aplicao de determinados mtodos analticos1,2. Vrios trabalhos realizados no Brasil e no mundo ressaltam a alta incidncia de adulteraes em leos vegetais, com destaque para o azeite de oliva, e leos importados de alto valor comercial1,3-8. O azeite de oliva apesar de representar pequeno volume em termos de produo mundial (aproximadamente 2% do total de leos produzidos), contribui com cerca de 15% do valor monetrio da produo dos leos. No Brasil as importaes deste leo tm crescido nos ltimos anos, atingindo volumes considerveis em termos mundiais1. O tipo de adulterao mais comum a adio de outros leos vegetais de menor valor comercial, principalmente quando o azeite enlatado no Brasil3,5,9-11. Os ndices fsico-qumicos clssicos e a composio de cidos graxos, os quais so aplicados freqentemente nos laboratrios brasileiros para a avaliao dos azeites, detectam apenas as fraudes mais grosseiras. Entretanto outras fraudes, mais elaboradas, relativas qualidade do azeite so praticadas sendo, em muitos casos, de difcil deteco devido s diferentes categorias de azeites existentes1,12-14. Os critrios de pureza estipulados na Norma comercial do COI esto direcionados, principalmente, a detectar outros tipos de leos no azeite de oliva ou no leo de bagao de oliva2. Estes critrios so os mesmos encontrados na norma Codex Stan 33 (1981, rev. 2. 2003)14 para azeite de oliva e leo de bagao de oliva, os quais devem ser seguidos atualmente no Brasil na fiscalizao destes leos15. As metodologias recomendadas para a determinao dos diferentes parmetros previstos nas normas do COI foram desenvolvi*e-mail: spimente@ial.sp.gov.br

das por organizaes internacionais como a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), International Organization for Standardization (ISO), Conselho Olecola Internacional e empregam, em grande parte, tcnicas cromatogrficas na avaliao da identidade e qualidade dos diferentes tipos de azeite. Estas metodologias tm sido endossadas pela Comisso do Codex Alimentarius para aplicao nas disputas comerciais. A presena de outros tipos de leos vegetais no azeite normalmente avaliada atravs da determinao da composio de esteris e cidos graxos. A determinao da absoro no espectro ultravioleta a 270 nm (extino especfica) e do contedo de hidrocarbonetos esteroidais, na frao insaponificvel dos azeites, so empregadas para verificar a presena de leos refinados no azeite de oliva virgem. No espectro de absoro no ultravioleta de azeites de oliva que sofreram aquecimento observa-se um mximo ao redor de 270 nm devido absoro de produtos de oxidao do leo, tais como cetonas insaturadas e compostos trienos conjugados. Estes ltimos so formados, a partir de cidos graxos insaturados como linolico (C18:2), no processo de refino dos leos vegetais, na etapa de clarificao, na qual os fenmenos de superfcie, oxidao e desidratao so favorecidos. A formao de sistemas conjugados atribuda desidratao de epxidos, resultantes do processo de oxidao dos leos, pela ao da terra clarificante16-18. Uma vez que outros produtos de oxidao tambm so formados no azeite e absorvem na regio ao redor de 270 nm, o mtodo para a deteco de leos refinados a partir da absoro neste comprimento de onda torna-se menos especfico. Entretanto, foram estabelecidas faixas de valores para a leitura de extino especfica a 270 nm para cada categoria de azeite. Valores acima daquelas faixas podem indicar a presena de leos refinados de oliva ou de sementes. Durante o refino dos leos vegetais, devido aos tratamentos trmicos, tambm podem ser formados hidrocarbonetos com esqueleto esteroidal como produto de desidratao dos esteris. Os leos refinados tambm podem ser detectados nos leos virgens pelo contedo de cidos graxos trans1,12. O leo de bagao de oliva, o qual obtido por extrao com solvente da torta residual das olivas, detectado no azeite de oliva atravs da determinao do contedo de ceras contendo de 40 a 46 tomos de carbono e do teor de eritrodiol e uvaol, na frao

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insaponificvel do leo. Os leos extrados com solventes contm quantidades maiores de ceras e de lcoois triterpnicos pentacclicos (eritrodiol e uvaol) que leos extrados a frio. O contedo destes lcoois no azeite de oliva no deve ser superior a 4,5% do total de esteris e o de ceras inferior a 350 mg/kg. Valores superiores indicam a presena de leo de bagao de oliva1,12. A presena de pequenas quantidades de leos de semente (menor que 5%), ricos em cidos linolico como soja, milho e girassol, no azeite de oliva pode ser constatada pela determinao da diferena entre o valor real de triacilgliceris com um nmero equivalente de carbonos igual a 42, obtido experimentalmente (ECN 42CLAE) por cromatografia lquida de alta eficincia e o valor terico (ECN 42terico), calculado a partir da composio de cidos graxos obtidos por cromatografia em fase gasosa. Este parmetro detecta a presena de um ou mais leos de sementes oleaginosas, ricos em cido linolico, como adulterantes dos azeites. A determinao da diferena do ECN 42 se juntou s normas comerciais do Conselho Olecola Internacional em 1991 e um mtodo oficial da comunidade europia desde 19971,19. O objetivo deste trabalho foi empregar o mtodo de determinao da diferena do ECN 42 experimental e terico para avaliar adulteraes em azeites de oliva comercializados no Brasil. PARTE EXPERIMENTAL Material Foram analisadas 15 amostras comerciais de azeite de oliva, sendo 14 denominadas de azeite de oliva e 01 denominada de azeite de oliva virgem (a granel). Tambm foi analisada uma amostra preparada no laboratrio, composta de 95% azeite de oliva virgem e 5% leo de girassol refinado alto linolico (v/v) e 06 amostras de referncia de leos vegetais enviadas pelo Conselho Olecola Internacional, com a composio descrita no quadro abaixo: Quadro 1. Especificao das amostras de referncia de leos enviadas pelo Conselho Olecola Internacional (COI) Amostra Referncia Ref 1 Cdigo COI 22/03 Composio 80% azeite de oliva virgem + 10% de leo de girassol refinado + 10% leo de soja refinado 100% azeite de oliva virgem 100% azeite de oliva virgem 70% leo de oliva refinado + 20% de leo de colza refinado + 10% azeite de oliva virgem 100% azeite de oliva virgem 90% azeite de oliva virgem + 5% leo de colza refinado + 5% leo de soja refinado

2 mol/L de KOH. Agitou-se o frasco por 60 s em agitador tipo vortex e adicionou-se 2 mL de soluo saturada de cloreto de sdio, at a separao da fase orgnica. Os steres metlicos de cidos graxos foram analisados atravs da injeo de 1 L da fase orgnica em cromatgrafo a gs marca Shimadzu, modelo GC-17A, com detector de ionizao de chama. Os componentes foram separados em coluna capilar de slica fundida SP-2560, de 100 m, com dimetro interno de 0,25 cm e espessura do filme de 0,20 m. Foram obedecidas as seguintes condies de operao: temperatura programada da coluna: 45C (4 min), taxa de aquecimento 13 oC/min at 175C (27 min), taxa de aquecimento 4C/min at 215C (35 min.); temperatura do injetor: 220 oC; temperatura do detector: 220 oC; gs de arraste: hidrognio; velocidade linear do gs de arraste de 15 cm/s; razo de diviso da amostra 1:50. Os cidos graxos foram identificados atravs da comparao dos tempos de reteno dos padres puros de steres metlicos de cidos graxos e das amostras. A quantificao foi feita por normalizao de rea. Os triacilgliceris foram separados e quantificados por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) com detector de ndice de refrao, de acordo com o mtodo COI/T.20/Doc. no 20, 199119. A diferena entre o valor experimental (CLAE) e o terico (a partir da composio dos cidos graxos) foi obtida atravs de clculo em um programa de computador22. Foram empregadas as seguintes condies: cromatgrafo a lquido de alta eficincia marca Shimadzu, composto dos mdulos: bomba LC-10AD; injetor Rheodyne com detector de ndice de refrao RID-10AD; mdulo de comunicao CBM-10-AD; e software Class LC10-AD para estocagem de dados e controle do sistema. A coluna utilizada foi de fase reversa C-18, 5 m e a fase mvel acetona:acetonitrila (1:1), fluxo 1,15 mL/min. O nmero equivalente de carbonos (ECN) calculado pela frmula: ECN = CN 2n, onde: CN = nmero total de carbonos da molcula de triacilglicerol n = nmero de duplas ligaes. Determinao da extino especfica a 270 nm Os leos foram dissolvidos em cicloexano Uvasol e a absoro da soluo foi determinada a 270 nm, usando como referncia o solvente puro20. A extino especfica E1% , refere-se absoro de 1cm uma soluo a 1% do leo no solvente, numa espessura de 1 cm e convencionalmente indicada por K. RESULTADOS E DISCUSSO A Tabela 1 apresenta a composio de cidos graxos dos leos analisados e valores de referncia do Codex Alimentarius (Codex Stan 33-81, rev 2003)14. Na Tabela 2 esto os valores de extino especfica a 270 nm e da diferena de ECN 42 para as amostras de leos comerciais e de referncia. Todos os leos analisados apresentaram valores de extino especfica a 270 nm altos (Tabela 2) e prximos de 1,00, sendo que o valor mximo previsto para azeites de oliva, categoria declarada no rtulo na maioria dos produtos, 0,90. Para a amostra de azeite virgem (nmero 7) o limite da legislao bem inferior, isto 0,25, enquanto para o azeite totalmente refinado este limite 1,10, segundo a norma Codex 33-81, rev. 200314. A anlise espectrofotomtrica na regio do ultravioleta pode fornecer informaes sobre a qualidade de um leo, seu estado de conservao e alteraes causadas pelo processamento e oxidao. A absoro em 270 nm ocorre devido presena de compostos tpicos de oxidao do azeite,

Ref 2 Ref 3 Ref 4

23/03 25/04 26/04

Ref 5 Ref 6

27/05 28/05

Determinao da diferena entre valor real e terico de triacilgliceris com ECN 42 A composio de cidos graxos dos leos foi determinada por cromatografia em fase gasosa segundo descrito nos Mtodos Fsico-Qumicos para anlise de alimentos do Instituto Adolfo Lutz20. A converso dos cidos graxos em steres metlicos foi realizada conforme mtodo IUPAC 2301 com algumas modificaes21. Em frasco de centrfuga de 20 mL com tampa, pesou-se cerca de 100 mg do leo, adicionou-se 2 mL de hexano e 0,2 mL de soluo metanlica

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Determinao da diferena entre o valor real e o terico do triglicerdeo ECN 42

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Tabela 1. Composio de cidos graxos das amostras comerciais de azeite e de refernciado do COI (valores expressos em % p/p de steres metlicos) AMOSTRAS C14:0 Ref 1 Ref 2 Ref 3 Ref 4 Ref 5 Ref 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ** 0,00 0,01 0,01 0,03 0,01 0,01 0,04 0,01 0,01 0,04 0,04 0,02 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,02 0,01 0,01 0,01 C16:0 10,32 14,51 11,33 10,03 10,1 9,91 8,29 12,38 12,43 9,33 9,17 9,40 9,29 9,96 10,83 12,80 13,50 12,70 12,30 12,40 12,50 C16:1 0,64 1,20 1,11 0,88 0,84 0,72 0,38 0,98 0,98 0,58 0,61 0,58 0,60 0,63 0,67 1,00 1,00 1,00 0,90 0,90 0,90 C17:0 C17:1 0,05 0,10 0,05 0,06 0,06 0,06 0,05 0,07 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 0,08 0,06 0,06 0,07 0,07 0,07 0,07 <0,3 0,06 0,22 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,13 0,13 0,09 0,09 0,09 0,09 0,10 0,10 0,12 0,12 0,13 0,13 0,13 0,13 <0,6 CIDOS GRAXOS* C18:0 C18:1 C18:2 3,32 2,01 3,22 2,94 3,41 3,38 3,45 2,12 2,12 3,06 2,96 3,14 3,15 3,16 3,11 2,10 2,00 2,00 2,10 2,00 2,00 67,99 64,21 76,52 73,99 78,33 76,34 43,74 68,44 68,24 54,85 57,70 73,57 75,57 74,87 74,13 68,50 67,50 68,30 67,90 68,90 68,70 15,02 16,10 6,31 9,32 4,94 7,45 41,37 13,21 13,24 28,61 26,59 10,50 8,88 8,55 8,53 13,00 13,00 13,00 13,00 12,80 12,90 C18:3 0,98 0,69 0,66 1,88 0,7 1,19 0,5 0,74 0,75 1,04 0,64 0,74 0,59 0,64 0,64 0,72 0,72 0,70 0,70 0,70 0,70 <0,9 C20:0 0,33 0,40 0,38 0,23 0,40 0,37 0,26 0,39 0,39 0,34 0,34 0,40 0,40 0,42 0,36 0,32 0,32 0,40 0,40 0,40 0,40 <0,6 C20:1 0,21 0,28 0,23 0,42 0,24 0,32 0,15 0,34 0,34 0,22 0,23 0,28 0,28 0,28 0,24 0,29 0,29 0,30 0,30 0,30 0,30 <0,4 C22:0 C24:0 0,17 0,12 0,09 0,13 0,12 0,12 0,43 0,18 0,18 0,40 0,43 0,20 0,20 0,18 0,13 0,12 0,12 0,10 0,20 0,20 0,20 <0,2 0,06 0,00 0,03 0,04 0,05 0,05 0,10 0,09 0,09 0,16 0,15 0,07 0,08 0,07 0,04 0,04 0,04 0,063 0,09 0,09 0,08 <0,2

<0,05 7,520,0 0,33,5

0,5-5,0 55,083,0 3,521,0

* Mdia de duas determinaes, **faixas de variao dos cidos graxos para azeite de oliva segundo Codex Stan 33-1981, rev 200314

Tabela 2. Valores da diferena do ECN 42 e de extino especfica a 270 nm para amostras comerciais de azeite e de referncia do COI* Amostras Comerciais 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Amostras de Referncia Ref Ref Ref Ref Ref Ref 1 2 3 4 5 6 Extino Especfica a 270 nm (n=3) 4,620,04 1,840,01 1,810,05 1,710,01 1,830,01 1,030,02 1,000,03 1,100,05 1,070,03 2,120,04 2,150,05 2,110,02 2,130,01 2,150,05 2,110,01 Extino Especifica a 270 nm (n=3) 0,1490,007 0,1230,007 0,2510,008 Diferena do ECN 42 (n=3) 7,480,06 1,530,04 1,410,03 7,100,06 6,960,07 1,530,04 0,990,02 0,700,02 0,770,03 1,550,03 1,570,03 1,460,02 1,440,04 1,500,02 1,420,03 Diferena do ECN 42 (n=3) 4,390,13 0,200,02 0,0120,003 0,850,02 0,080,01 1,300,03 Faixa Aceitvel** 4,540,24 0,180,07 0,030,03 0,710,15 0,060,03 1,270,05

* Mdia desvio padro, n:nmero de repeties **Valores obtidos de ensaios interlaboratoriais organizados pelo COI.

tais como cetonas insaturadas, e de sistemas trienos conjugados formados no refino dos leos. Azeites de oliva virgens de boa qualidade e armazenados sob condies adequadas contm poucos produtos de oxidao e, portanto, valores baixos de absoro a 270 nm. Quando estes valores superam os limites previstos para cada categoria de azeite, podem indicar a presena de azeites de baixa qualidade ou refinado, leo de bagao de oliva ou outros leos refinados de sementes adicionados ao azeite1,4,10. Alguns leos apresentaram composio de cidos graxos no limite para azeite de oliva autntico (Tabela 1). Entretanto, para a grande maioria das amostras analisadas, isto em 12 amostras, o perfil de cidos graxos situou-se dentro da faixa caracterstica para azeite de oliva. Todas as amostras apresentaram valores da diferena de ECN 42 acima do maior valor previsto para o azeite de oliva na norma Codex 33-8113, reviso de 2003, a qual deve ser atualmente aplicada no Brasil15. O limite daquela diferena 0,30 para os azeites de oliva e 0,50 para o leo de bagao de oliva refinado. No leo extrado do bagao tem sido demonstrado que a contribuio de vrias partes do fruto influencia na composio do leo, refletindo num aumento do teor de triliolena (LLL) e, conseqentemente, no valor da diferena do ECN 4222. O azeite de oliva contm quatro grupos majoritrios de triacilgliceris correspondentes a valores de ECN 44, 46, 48 e 50. Os triacilgliceris com valores de ECN 40 no esto presentes no azeite de oliva e os com ECN 42 encontram-se apenas como traos (Figura 1). Por outro lado, todos os leos comestveis ricos em cido linolico (leos de milho, soja e girassol) apresentam quantidades expressivas de triacilgliceris com ECN 42. Na determinao da diferena do ECN 42 os triacilgliceris so agrupados de acordo com o nmero equivalente de carbonos. So considerados apenas os cidos graxos com 16 e 18 carbonos, pois apenas estes so importantes na anlise do azeite. Os valores

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A implantao da metodologia de determinao da diferena do ECN 42 nos laboratrios brasileiros que fiscalizam os leos vegetais possibilitar a deteco da adio no azeite de oliva de leos de sementes, ricos em cido linolico, em nveis mais baixos que os mtodos clssicos. Tendo em visto o potencial de importao brasileiro de azeite de oliva e a constatao de uma alta incidncia de adulterao nos produtos aqui comercializados, outras metodologias analticas mais sensveis e diversificadas, que atendam s normas do Codex e legislao brasileira em vigor, devem ser adotadas para um controle mais eficiente. MATERIAL SUPLEMENTAR
Figura 1. Perfil de triacilgliceris de azeite de oliva virgem obtido por cromatografia lquida de alta eficincia com detector de ndice de refrao, coluna C-18 de 5 m, fase mvel acetona:acetonitrila (1:1), fluxo 1,15 mL/ min. Amostra Ref 2 (100% de azeite de oliva). P - cido palmtico; S - cido esterico; O - cido olico; L - cido linolico; Ln - cido linolnico

Est disponvel em http://quimicanova.sbq.org.br, em forma de arquivo PDF, com acesso livre. REFERNCIAS
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da composio de cidos graxos, obtidos por cromatografia em fase gasosa, so analisados em um programa23 para prever a composio terica dos triacilgliceris, baseado na distribuio natural dos cidos graxos no triacilglicerol, isto : 1, 3-random, 2random. Segundo esta teoria, os cidos graxos das posies 1 e 3 (numerao dos carbonos do glicerol) so distribudos ao acaso, enquanto na posio 2, que mais impedida estericamente, se ligam cidos graxos de cadeia mais curta e insaturados24. O desempenho do mtodo de determinao da diferena do ECN 42, aplicado no laboratrio, foi avaliado com amostras de referncia enviadas pelo Conselho Olecola Internacional. Os resultados encontram-se na Tabela 2 e mostram que os valores obtidos situam-se dentro da faixa aceitvel para cada amostra de referncia. Os resultados obtidos para extino especfica a 270 nm e, principalmente, para a diferena do ECN 42, nas amostras comerciais, excederam os limites previstos pela legislao para azeite de oliva. Foi calculado o coeficiente de correlao25 entre o valor da diferena de ECN 42 e do teor de cido linolico das amostras comerciais analisadas. A correlao foi positiva e igual a 0,90, o que refora a sensibilidade do mtodo na deteco de adulterao dos azeites com leos de sementes ricos em cido linolico. A anlise de cidos graxos trans revelou teores abaixo dos limites para as amostras denominadas de azeite de oliva e acima para a denominada como azeite de oliva virgem, considerando as respectivas categorias14. Para os azeites de oliva os teores de cidos graxos trans obtidos foram: C18:1t < 0,20% e C18:2+C18:3t < 0,30% (p/p de steres metlicos); para a amostra denominada azeite de oliva virgem (amostra 7) os valores foram: C18:1t = 0,10% (limite< 0,05%) e C18:2 +C18:3t = 0,25% (limite <0,05%). Os resultados foram indicativos de uma classificao imprpria atribuda a uma das amostras analisadas, uma vez que o azeite de oliva virgem um produto de maior qualidade e valor comercial. CONCLUSO Apesar do perfil de cidos graxos situar-se dentro da faixa caracterstica para azeite de oliva, em 12 das 15 amostras analisadas, todas apresentaram valores de extino especfica a 270 nm e da diferena do ECN 42 acima do maior valor previsto para o azeite de oliva, segundo a norma Codex 33-81, rev. 200314. Os resultados indicam uma provvel adulterao das amostras com leos de semente, ricos em cidos linolico como soja, milho ou girassol. Estes leos so de baixo valor comercial no Brasil e, portanto, potenciais adulterantes do azeite de oliva.