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I

(Actos aprovados ao abrigo dos Tratados CE/Euratom cuja publicao obrigatria)


REGULAMENTOS
REGULAMENTO (CE) n.
o
440/2008 DA COMISSO
de 30 de Maio de 2008
que estabelece mtodos de ensaio nos termos do Regulamento (CE) n.
o
1907/2006 do Parlamento
Europeu e do Conselho relativo ao registo, avaliao, autorizao e restrio de substncias qumicas
(REACH)
(Texto relevante para efeitos do EEE)
A COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,
Tendo em conta o Regulamento (CE) n.
o
1907/2006 do
Parlamento Europeu e do Conselho, de 18 de Dezembro
de 2006, relativo ao registo, avaliao, autorizao e restrio
de substncias qumicas (REACH), que cria a Agncia Europeia
das Substncias Qumicas, que altera a Directiva 1999/45/CE e
revoga o Regulamento (CEE) n.
o
793/93 do Conselho e o
Regulamento (CE) n.
o
1488/94 da Comisso, bem como a
Directiva 76/769/CEE do Conselho e as Directivas 91/155/CEE,
93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE da Comisso (
1
), nomea-
damente o n.
o
3 do artigo 13.
o
,
Considerando o seguinte:
(1) Nos termos do Regulamento (CE) n.
o
1907/2006, devem
adoptar-se mtodos comunitrios para o ensaio de
substncias, sempre que tais mtodos sejam necessrios
produo de informaes sobre as propriedades intrnsecas
das substncias.
(2) A Directiva 67/548/CEE do Conselho, de 27 de Junho
de 1967, relativa aproximao das disposies legislativas,
regulamentares e administrativas respeitantes classifica-
o, embalagem e rotulagem das substncias perigosas (
2
)
estabelece, no seu anexo V, mtodos para a determinao
das propriedades fsico-qumicas, da toxicidade e da
ecotoxicidade das substncias e preparaes. O anexo V
da Directiva 67/548/CEE foi revogado pela Directiva 2006/
/121/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, com efeitos
a partir de 1 de Junho de 2008.
(3) Os mtodos de ensaio constantes do anexo V da Directiva
67/548/CEE devem ser incorporados no presente regula-
mento.
(4) O presente regulamento no exclui a utilizao de outros
mtodos de ensaio, desde que a mesma seja conforme com
o n.
o
3 do artigo 13.
o
do Regulamento (CE) n.
o
1907/2006.
(5) Os princpios da substituio, reduo e aperfeioamento
da utilizao de animais em procedimentos devem ser
plenamente tidos em conta na concepo dos mtodos de
ensaio, nomeadamente sempre que se tornem disponveis
mtodos adequados, validados para substituir, reduzir ou
aperfeioar a experimentao com animais.
(6) As disposies do presente regulamento esto em confor-
midade com o parecer do Comit institudo pelo ar-
tigo 133.
o
do Regulamento (CE) n.
o
1907/2006,
ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:
Artigo 1.
o
Os mtodos de ensaio a aplicar para os fins do Regulamento (CE)
n.
o
1907/2006 so os estabelecidos no anexo do presente
regulamento.
Artigo 2.
o
A Comisso reexaminar, quando pertinente, os mtodos de
ensaio constantes do presente regulamento, com o objectivo de
substituir, reduzir ou aperfeioar os ensaios com vertebrados.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/1
(
1
) JO L 396 de 30.12.2006, p. 1. Rectificao no JO L 136 de
29.5.2007, p. 3.
(
2
) JO 196 de 16.8.1967, p. 1. Directiva com a ltima redaco que lhe
foi dada pela Directiva 2006/121/CE do Parlamento Europeu e do
Conselho (JO L 396 de 30.12.2006, p. 850). Rectificao no
JO L 136 de 29.5.2007, p. 281.
Artigo 3.
o
Todas as referncias ao anexo V da Directiva 67/548/CEE devem
entender-se como referncias ao presente regulamento.
Artigo 4.
o
O presente regulamento entra em vigor no dia seguinte ao da sua
publicao no Jornal Oficial da Unio Europeia.
aplicvel a partir de 1 de Junho de 2008.
Feito em Bruxelas, em 30 de Maio de 2008.
Pela Comisso
Stavros DIMAS
Membro da Comisso
L 142/2 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
ANEXO
PARTE A: MTODOS PARA A DETERMINAO DAS PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS
NDICE
A.1. TEMPERATURA DE FUSO/CONGELAO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
A.2. TEMPERATURA DE EBULIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
A.3. DENSIDADE RELATIVA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
A.4. PRESSO DE VAPOR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
A.5. TENSO SUPERFICIAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
A.6. SOLUBILIDADE EM GUA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
A.8. COEFICIENTE DE PARTIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
A.9. PONTO DE INFLAMAO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
A.10. INFLAMABILIDADE (SLIDOS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
A.11. INFLAMABILIDADE (GASES) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
A.12. INFLAMABILIDADE (CONTACTO COM GUA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
A.13. PROPRIEDADES PIROFRICAS DE SLIDOS E LQUIDOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
A.14. PROPRIEDADES EXPLOSIVAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
A.15. TEMPERATURA DE AUTO-IGNIO (LQUIDOS E GASES) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
A.16. TEMPERATURA DE AUTO-IGNIO RELATIVA PARA OS SLIDOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
A.17. PROPRIEDADES OXIDANTES (SLIDOS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
A.18. MASSA MOLECULAR MDIA EM FUNO DO NMERO DE MOLES E DISTRIBUIO DA MASSA
MOLECULAR EM POLMEROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
A.19. TEOR EM POLMEROS DE BAIXA MASSA MOLECULAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
A.20. COMPORTAMENTO DOS POLMEROS DA DISSOLUO/EXTRACO AQUOSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
A.21. PROPRIEDADES DE COMBURNCIA (LQUIDOS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/3
A.1. TEMPERATURA DE FUSO/CONGELAO
1. MTODO
A maior parte dos mtodos descritos baseiam-se na publicao OECD Test Guideline (1) (normas de
procedimento para testes da OCDE). Os princpios fundamentais encontram-se descritos nas referncias (2) e
(3).
1.1. INTRODUO
Os mtodos e dispositivos descritos destinam-se a ser aplicados determinao da temperatura de fuso de
substncias, sem quaisquer restries no que diz respeito ao seu grau de pureza.
A seleco do mtodo depende da natureza da substncia que se pretende testar. Em consequncia, o factor
limitativo depender do facto de a substncia poder ser ou no ser facilmente pulverizada, pulverizada com
dificuldade, ou no poder ser mesmo pulverizada.
Para algumas substncias considera-se mais apropriado a determinao da temperatura de congelao ou de
solidificao, tendo as normas para estas determinaes sido englobadas tambm neste mtodo.
No caso de no se poder medir convenientemente nenhum dos parmetros anteriores devido existncia de
propriedades particulares da substncia, recomenda-se a determinao de um ponto de fluidez.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
Define-se a temperatura de fuso como sendo a temperatura qual ocorre a transio de fase do estado slido
para o estado lquido presso atmosfrica, correspondendo idealmente essa temperatura temperatura de
fuso.
Uma vez que a transio de fase de diversas substncias ocorre num intervalo de temperaturas, associa-se-lhe
frequentemente um intervalo de fuso.
Converso de unidades (K para
o
C)
t = T 273,15
t: temperatura de Celsius, graus Celsius (
o
C)
T: temperatura termodinmica, Kelvin (K)
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNC1A
No necessrio utilizar substncias de referncia quando se est a investigar uma nova substncia. Essas
substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, as caractersticas de execuo do mtodo e
para proporcionar a comparao com resultados obtidos com outros mtodos.
Na referncia (4) encontram-se enumeradas algumas substncias de calibrao.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Determina-se a temperatura (intervalo de temperaturas) da transio de fase do estado slido para o estado
lquido ou do estado lquido para o estado slido. Na prtica, enquanto se aquece/arrefece uma amostra da
substncia ensaiada presso atmosfrica, determina-se as temperaturas da fase inicial de fuso/congelao e da
fase final de fuso/congelao. Descrevem-se cinco tipos de mtodos, designadamente o mtodo capilar, os
mtodos das fases quentes, as determinaes da temperatura de congelao, os mtodos de anlise trmica e a
determinao do ponto de fluidez (desenvolvido para os derivados oleosos do petrleo).
Em alguns casos pode ser conveniente medir a temperatura de congelao em vez de se medir a temperatura de
fuso.
L 142/4 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.4.1. Mtodo capilar
1.4.1.1. Dispositivos para a determinao da temperatura de fuso, com banho lquido
Coloca-se uma pequena quantidade da substncia finamente triturada num tubo capilar e compacta-se
fortemente. Aquece-se o tubo em simultneo com um termmetro e ajusta-se a subida de temperatura para um
valor inferior a 1 K/min durante a fuso efectiva. Determinam-se as temperaturas de fuso inicial e final.
1.4.1.2. Dispositivos para a determinao da temperatura de fuso, com bloco metlico
Conforme descrito em 1.4.1.1, com a excepo de o tubo capilar e o termmetro estarem num bloco metlico
aquecido e poderem ser observados atravs de aberturas existentes no bloco.
1.4.1.3. Deteco por clula fotoelctrica
A amostra no tubo capilar aquecida automaticamente num cilindro metlico. Dirige-se um feixe de luz atravs
da substncia, passando por uma abertura existente no cilindro, de modo a atingir uma clula fotoelctrica
calibrada com preciso. Quando da fuso, as propriedades pticas da maior parte das substncias variam de
opacas para transparentes. A intensidade da luz que atinge a clula fotoelctrica aumenta e envia um sinal de
paragem para o indicador digital, que procede leitura da temperatura de um termmetro de resistncia de
platina localizado na cmara de aquecimento. Este mtodo no adequado para algumas substncias
fortemente coradas.
1.4.2. Fases quentes
1.4.2.1. Barra quente de Kofler
O mtodo da barra quente de Kofler utiliza duas peas metlicas de condutividade trmica diferente, aquecidas
electricamente, sendo a barra concebida de tal modo que o gradiente de temperatura quase linear segundo o
seu comprimento. A temperatura da barra quente pode variar desde 283 at 573 K, existindo um dispositivo
especial de leitura da temperatura constitudo por um cursor com um ponteiro e uma escala, concebidos
especificamente para a barra. No sentido de se determinar uma temperatura de fuso, espalha-se a substncia
em camada fina directamente sobre a superfcie da barra quente. Decorridos alguns segundos surge uma linha
que separa as fases fluida e slida. L-se a temperatura nesta linha ajustando o ponteiro sobre ela.
1.4.2.2. Microscpio de fuso
Existem diferentes tipos de microscpios de placas quentes para a determinao das temperaturas de fuso,
utilizando-se quantidades muito pequenas de material. Na maior parte dos aparelhos mede-se a temperatura
com um termopar sensvel mas, por vezes, utilizam-se termmetros de mercrio. Existe um equipamento
tpico para a medio da temperatura de fuso pelo mtodo das placas quentes utilizando microscpio, o qual
possui uma cmara de aquecimento contendo uma placa metlica, sobre a qual se coloca a amostra numa
lmina. O centro da placa metlica contm um orifcio que permite a entrada de luz proveniente do espelho de
iluminao do microscpio. Durante a utilizao o compartimento fechado com uma placa de vidro para
eliminar o ar da zona da amostra.
O aquecimento da amostra regulado com um restato. Para as medies de elevada preciso das substncias
opticamente anisotrpicas, pode utilizar-se luz polarizada.
1.4.2.3. Mtodo do menisco
Este mtodo utilizado especificamente para as poliamidas.
A temperatura qual ocorre o deslocamento de um menisco de leo de silicone, encerrado entre uma placa
quente e um vidro de cobertura da amostra de poliamida testada, determinada visualmente.
1.4.3. Mtodo para determinar a temperatura de congelao
Coloca-se a amostra num tubo de ensaio especial e leva-se a um aparelho para a determinao da temperatura
de congelao. Agita-se a amostra suave e continuamente durante o arrefecimento e mede-se a temperatura em
intervalos adequados. Logo que a temperatura permanea constante durante algumas leituras considera-se que
esse valor (corrigido em funo do erro do termmetro) a temperatura de congelao.
Deve evitar-se o sobrearrefecimento, mantendo-se o equilbrio entre as fases slida e lquida.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/5
1.4.4. Anlise trmica
1.4.4.1. Anlise trmica diferencial (ATD)
Esta tcnica regista a diferena de temperaturas existente entre a substncia e um material de referncia em
funo da temperatura, enquanto a substncia e o material de referncia so submetidos ao mesmo programa
de temperatura controlada. Quando a amostra sofre uma transio que implica uma variao de entalpia, essa
variao indicada por um afastamento endotrmico (fuso) ou exotrmico (congelao), relativamente linha
de referncia do registo de temperatura.
1.4.4.2. Calorimetria de explorao diferencial (CED)
Esta tcnica regista a diferena entre a absoro de energia por uma substncia e por um material de referncia
em funo da temperatura, enquanto a substncia e o material de referncia so submetidos ao mesmo
programa de temperatura controlada. Essa energia a necessria para estabelecer uma diferena nula de
temperatura entre a substncia e o material de referncia. Quando a amostra sofre uma transio que implica
uma variao de entalpia, essa variao indicada por um afastamento endotrmico (fuso) ou exotrmico
(congelao), relativamente linha de referncia do registo de fluxo de calor.
1.4.5. Ponto de fluidez
Este mtodo foi desenvolvido para ser utilizado com os derivados oleosos do petrleo e adequado para
utilizao apenas com substncias de baixas temperaturas de fuso.
Aps um aquecimento preliminar procede-se ao arrefecimento da amostra segundo um regime especfico e faz-
-se a observao das suas caractersticas de fluidez em intervalos de 3 K. A temperatura mais baixa para a qual se
observa movimento da substncia considerada como ponto de fluidez.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
A aplicabilidade e a preciso dos diversos mtodos utilizados para a determinao da temperatura de fuso/
/intervalo de fuso encontram-se resumidas no quadro seguinte:
QUADRO: APLICABILIDADE DOS MTODOS
A. Mtodos capilares
Mtodo de medio
Substncias que
podem ser
pulverizadas
Substncias
dificilmente
pulverizadas
Intervalo de
temperaturas
Preciso
estimada (
1
)
Norma existente
Dispositivos com
banho lquido
Sim S para algu-
mas
273 a 573 K 0,3 K JIS K 0064
Dispositivos com
bloco metlico
Sim S para algu-
mas
293 a > 573 K 0,5 K ISO 1218 (E)
Deteco por clula
fotoelctrica
Sim Diversas com
dispositivos
de aplicao
253 a 573 K 0,5 K
(
1
) Dependente do tipo de instrumento e do grau de pureza da substncia.
L 142/6 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B. Mtodos das fases quentes e de congelao
Mtodo de medio
Substncias que
podem ser
pulverizadas
Substncias
dificilmente
pulverizadas
Intervalo de
temperaturas
Preciso
estimada (
1
)
Norma existente
Barra quente de
Kofler
Sim No 283 a
> 573 K
1,0 K ANSI/ASTM D
3451-76
Microscpio de
fuso
Sim S para algu-
mas
273 a
> 573 K
0,5 K DIN 53736
Mtodo do menisco No Especifica-
mente para
poliamidas
293 a > 573
K
0,5 K ISO 1218 (E)
Mtodos da tempe-
ratura de congela-
o
Sim Sim 223 a 573 K 0,5 K por ex., BS
4695
(
1
) Dependente do tipo de instrumento e do grau de pureza da substncia.
C. Anlise trmica
Mtodo de medio
Substncias que
podem ser
pulverizadas
Substncias
dificilmente
pulverizadas
Intervalo de
temperaturas
Preciso
estimada (
1
)
Norma existente
Anlise trmica
diferencial
Sim Sim 173 a
1 273 K
at 600 K
0,5 K at
1 273 K
2,0 K
ASTM E 537-
-76
Calorimetria de
explorao diferen-
cial
Sim Sim 173 a
1 273 K
at 600 K
0,5 K at
1 273 K
2,0 K
ASTM E 537-
-76
(
1
) Dependente do tipo de instrumento e do grau de pureza da substncia.
D. Ponto de fluidez
Mtodo de medio
Substncias que
podem ser
pulverizadas
Substncias
dificilmente
pulverizadas
Intervalo de
temperaturas
Preciso
estimada (
1
)
Norma existente
Ponto de fluidez Para deriva-
dos oleosos
do petrleo e
para substn-
cias oleosas
Para deriva-
dos oleosos
do petrleo e
para substn-
cias oleosas
223 a 323 K 3,0 K ASTM D 97-66
(
1
) Dependente do tipo de instrumento e do grau de pureza da substncia.
1.6. DESCRIO DOS MTODOS
Os procedimentos de quase todos os mtodos de ensaio encontram-se descritos em normas internacionais e
nacionais (ver apndice 1).
1.6.1. Mtodos com tubo capilar
Quando submetidas a uma lenta subida de temperatura, as substncias finamente pulverizadas apresentam
normalmente as fases de fuso representadas na figura 1.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/7
Figura 1
Durante a determinao da temperatura de fuso procede-se ao registo das temperaturas da fase inicial da fuso
e da fase final.
1.6.1.1. Dispositivos para a determinao da temperatura de fuso com aparelho de banho lquido
A figura 2 representa um tipo de aparelho normalizado para a determinao da temperatura de fuso, feito de
vidro (JIS K 0064); todas as especificaes so dadas em milmetros.
Figura 2
Lquido do banho:
Deve escolher-se um lquido adequado. A escolha do lquido depende da temperatura de fuso que se pretende
determinar; por exemplo, escolher-se- parafina lquida para temperaturas de fuso no superiores a 473 K,
leo de silicone para temperaturas de fuso no superiores a 573 K.
L 142/8 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Para temperaturas superiores a 523 K pode utilizar-se uma mistura constituda por trs partes de cido
sulfrico e por duas partes de sulfato de potssio (em peso). Devero ser tomadas precaues adequadas no
caso de se utilizar uma mistura deste tipo.
Termmetro
Apenas devero ser utilizados termmetros que satisfaam as exigncias das normas indicadas a seguir ou
critrios equivalentes:
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
Procedimento:
Pulveriza-se finamente a substncia seca utilizando um almofariz e coloca-se no interior do tubo capilar, selado
numa das extremidades, de tal modo que a altura do enchimento seja aproximadamente 3 mm aps boa
compactao. Para se obter uma amostra compacta uniforme o tubo capilar dever cair verticalmente de uma
altura de aproximadamente 700 mm atravs de um tubo de vidro e sobre um vidro de relgio.
Depois de cheio coloca-se o tubo capilar no banho, de tal modo que a parte mdia da ampola de mercrio do
termmetro toque no tubo capilar na parte onde se encontra a amostra. Normalmente o tubo capilar
introduzido no aparelho a uma temperatura cerca de 10 K inferior temperatura de fuso.
Aquece-se o lquido do banho de tal modo que o aumento da temperatura seja aproximadamente 3 K/min. O
lquido dever ser agitado. Quando se atingir uma temperatura cerca de 10 K inferior temperatura de fuso
esperada, ajusta-se a subida da temperatura para um valor mximo de 1 K/min.
Clculo:
O clculo da temperatura de fuso efectua-se do modo seguinte:
T = T
D
+ 0,00016 (T
D
T
E
) n
em que:
T = temperatura de fuso corrigida, em K;
T
D
= leitura da temperatura no termmetro D, em K;
T
E
= leitura da temperatura no termmetro E, em K;
n = nmero de graduaes na linha do mercrio no termmetro D na parte emergente da haste.
1.6.1.2. Dispositivos para a determinao da temperatura de fuso, com bloco metlico
Aparelho:
Este constitudo por:
um bloco metlico cilndrico, cuja parte superior oca e forma um compartimento (ver figura 3),
uma tampa metlica, com duas ou vrias aberturas, para permitir a montagem de tubos no bloco
metlico,
um sistema de aquecimento para o bloco metlico, que pode ser, por exemplo, uma resistncia elctrica
encerrada no bloco,
um restato para regular a potncia de entrada no caso de se utilizar aquecimento elctrico,
quatro janelas de vidro resistente ao calor situadas nas paredes laterais do compartimento, dispostas
diametralmente segundo ngulos rectos relativamente umas s outras. Em frente de uma destas janelas
monta-se um culo para observao do tubo capilar. As outras trs janelas so utilizadas para iluminar o
interior do compartimento, por meio de lmpadas,
um tubo capilar, em vidro resistente ao calor e fechado numa extremidade (ver 1.6.1.1).
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/9
Termmetro
Ver as normas referidas em 1.6.1.1. Tambm se podem utilizar dispositivos de medio termoelctrica, de
preciso equivalente.
Figura 3
1.6.1.3. Deteco por clula fotoelctrica
Aparelho e procedimento:
O aparelho constitudo por um compartimento metlico com um sistema de aquecimento automtico.
Procede-se ao enchimento de trs tubos capilares conforme descrito em 1.6.1.1, os quais so depois colocados
na estufa.
Utilizam-se vrias variaes lineares de temperatura para calibrar o aparelho e ajusta-se electricamente o
aumento de temperatura adequado, segundo uma razo linear e constante pr-seleccionada. Os registadores
mostram a temperatura efectiva da estufa e a temperatura da substncia nos tubos capilares.
1.6.2. Fases quentes
1.6.2.1. Barra quente de Kofler
Ver apndice.
1.6.2.2. Microscpio de fuso
Ver apndice.
1.6.2.3. Mtodo do menisco (poliamidas)
Ver apndice.
O esquema gradual de aquecimento prximo da temperatura de fuso dever ser inferior a 1 K/min.
1.6.3. Mtodos para a determinao da temperatura de congelao
Ver apndice.
L 142/10 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.6.4. Anlise trmica
1.6.4.1. Anlise trmica diferencial
Ver apndice.
1.6.4.2. Calorimetria de explorao diferencial
Ver apndice.
1.6.5. Determinao do ponto de fluidez
Ver apndice.
2. RESULTADOS
Em alguns casos necessrio efectuar uma correco devida ao termmetro.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
mtodo utilizado,
especificao exacta da substncia (identificao e impurezas) e fases de purificao prvias no caso de
existirem,
uma estimativa da preciso.
Considera-se como temperatura de fuso a mdia de peio menos duas medies efectuadas no intervalo de
preciso estimado (ver quadros).
Se a diferena entre a temperatura na fase inicial e a temperatura na fase final da fuso estiver entre os limites de
preciso do mtodo, considera-se como temperatura de fuso o valor observado na fase final da fuso; caso
contrrio sero indicadas as duas temperaturas.
No caso de a substncia se decompor ou sublimar antes de atingir a temperatura de fuso, indicar-se- a
temperatura para a qual se observa esse efeito.
Todas as informaes e notas relevantes para a interpretao dos resultados devero ser descritas, especialmente
no que diz respeito s impurezas e ao estado fsico da substncia.
4. REFERNCIAS
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II,
p. 803-834.
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed.,
Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure
and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 505-515.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/11
Apndice
Para pormenores tcnicos adicionais possvel consultar, por exemplo, as normas seguintes:
1. Mtodos capilares
1.1. Dispositivos de medio da temperatura de fuso com banho lquido
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the
melting range of organic chemicals
BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products
1.2. Dispositivos para a determinao da temperatura de fuso com bloco metlico
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
ISO 1218 (E) Plastics polyamides determination of melting point
2. Fases quentes
2.1. Barra quente de Kofler
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric power coatings
2.2. Microscpio de fuso
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststof-
fen.
2.3. Mtodo do menisco (poliamidas)
ISO 1218 (E) Plastics polyamides determination of melting point
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion
materials
NF T 51-050 Rsines de polyamides. Dtermination du point de fusion. Mthode du
mnisque
3. Mtodos para a determinao da temperatura de congelao
BS 4633 Method for the determination of crystallizing point
BS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (cooling curve)
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und
Motorenbenzolen
ISO 2207 Cires de ptrole: dtermination de la temprature de figeage
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsuren
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines
NF T 20-051 Mthode de dtermination du point de cristallisation (point de conglation)
ISO 1392 Method for the determination of the freezing point
L 142/12 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
4. Anlise trmica
4.1. Anlise trmica diferencial
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods
of differential thermal analysis
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
4.2. Calorimetria de explorao diferencial
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods
of differential thermal analysis
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
5. Determinao do ponto de fluidez
NBN 52014 chantillonnage et analyse des produits du ptrole: point de trouble et point
d'coulement limite Monsterneming en ontleding van aardolieproducten:
Troebelingspunt en vloeipunt
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils
ISO 3016 Petroleum oils Determination of pour point
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/13
A.2. TEMPERATURA DE EBULIO
1. MTODO
A maior parte dos mtodos descritos baseia-se nas normas de ensaio da OCDE (1). Os princpios fundamentais
encontram-se descritos nas referncias (2) e (3).
1.1. INTRODUO
Os mtodos e dispositivos aqui descritos podem ser aplicados a lquidos e a substncias de baixo ponto de
fuso, desde que no sofram uma reaco qumica para os valores da temperatura de ebulio (por exemplo:
auto-oxidao, rearranjo, degradao, etc.). Os mtodos podem ser aplicados a substncias lquidas puras e
impuras.
D-se maior importncia aos mtodos que utilizam a deteco por clula fotoelctrica e aos mtodos de anlise
trmica uma vez que esses mtodos permitem a determinao das temperaturas de fuso e tambm das
temperaturas de ebulio. Alm disso, as medies podem ser efectuadas automaticamente.
O mtodo dinmico possui a vantagem de tambm poder ser aplicado determinao da presso de vapor e
de no ser necessrio corrigir o valor da temperatura de ebulio para a presso normal (101,325 kPa) uma vez
que a presso normal pode ser ajustada durante a medio utilizando um manmetro.
Observaes
A influncia das impurezas na determinao da temperatura de ebulio depende bastante da natureza dessas
impurezas. No caso de existirem na amostra impurezas volteis que possam afectar os resultados, a substncia
deve ser purificada.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
Define-se a temperatura de ebulio normal como sendo a temperatura para a qual a presso de vapor de um
lquido de 101,325 kPa.
No caso de a temperatura de ebulio no ser medida presso atmosfrica normal, a dependncia da presso
do vapor em funo da temperatura pode ser descrita pela equao de Clausius-Clapeyron:
log p =
H
v
2,3RT
const:
em que:
p = presso de vapor da substncia em pascal
H
v
= calor de vaporizao em J mol
-1
R = constante universal dos gases perfeitos = 8,314 J mol
-1
K
-1
T = temperatura termodinmica em K
A temperatura de ebulio especificada tendo em considerao a presso ambiente durante a medio.
Converses
Presso (unidades: kPa)
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa
(bar ainda uma unidade permitida mas no recomendada)
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr
(as unidades mm Hg e Torr no so permitidas)
1 atm = atmosfera padro = 101,325 Pa
(a unidade atm no permitida)
L 142/14 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Temperatura (unidades: K)
t = T 273,15
t: temperatura de Celsius, graus Celsius (
o
C)
T: temperatura termodinmica, kelvin (K)
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
No necessrio utilizar as substncias de referncia em todos os casos quando se investiga uma nova
substncia. Elas devero servir essencialmente para aferir, periodicamente, o mtodo e para permitir a
comparao com resultados obtidos com outros mtodos.
Nos mtodos enumerados no apndice possvel encontrar algumas substncias utilizadas para calibrao.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Existem cinco mtodos para a determinao da temperatura de ebulio (intervalo de ebulio) que se baseiam
na medio da temperatura de ebulio, e existem dois mtodos que se baseiam na anlise trmica.
1.4.1. Determinao utilizando o ebulimetro
Os ebulimetros foram originariamente desenvolvidos para a determinao do peso molecular por elevao da
temperatura de ebulio, mas tambm so adequados para as medies exactas da temperatura de ebulio.
Existe um aparelho muito simples que se encontra descrito na norma ASTM D 1120-72 (ver apndice). O
lquido aquecido nesse aparelho, sob condies de equilbrio presso atmosfrica, at entrar em ebulio.
1.4.2. Mtodo dinmico
Este mtodo implica a medio da temperatura de recondensao do vapor por meio de um termmetro
apropriado no refluxo, mantendo-se a ebulio. Neste mtodo possvel variar a presso.
1.4.3. Mtodo da destilao para a determinao da temperatura de ebulio
Este mtodo compreende a destilao do lquido, a medio da temperatura de recondensao do vapor e a
determinao da quantidade do destilado.
1.4.4. Mtodo de Siwoloboff
Aquece-se uma amostra num tubo de ensaio, que imerso num lquido num banho aquecido. Mergulha-se no
tubo de ensaio um tubo capilar fechado, contendo uma bolha de ar na parte inferior.
1.4.5. Deteco por clula fotoelctrica
Utilizando o princpio de Siwoloboff efectuam-se medies automticas por clula fotoelctrica das bolhas
ascendentes.
1.4.6. Anlise trmica diferencial
Esta tcnica regista a diferena existente entre as temperaturas da substncia e do material de referncia, em
funo da temperatura, quando a substncia e o material de referncia so submetidos ao mesmo programa de
temperatura controlada. Quando a amostra sofre uma transio que implica uma variao de entalpia, essa
variao indicada por um afastamento endotrmico (ebulio) em relao linha de referncia do registo de
temperaturas.
1.4.7. Calorimetria de explorao diferencial
Esta tcnica regista a diferena de absoro de energia existente entre uma substncia e um material de
referncia, em funo da temperatura, quando a substncia e o material de referncia so submetidos ao mesmo
programa de temperatura controlada. Essa energia representa a energia necessria para estabelecer uma
diferena nula de temperatura entre a substncia e o material de referncia. Quando a amostra sofre uma
transio que implica uma alterao da entalpia, essa alterao indicada por um afastamento endotrmico
(ebulio), em relao linha de referncia do registo do fluxo do calor.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/15
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
A aplicabilidade e a preciso dos diferentes mtodos utilizados para a determinao da temperatura de ebulio/
/intervalo de ebulio encontram-se resumidas no quadro 1.
Quadro 1
Comparao dos mtodos
Mtodo de medio Preciso estimada Norma existente
Ebulimetro 1,4 K (at 373 K) (
1
) (
2
)
2,5 K (at 600 K) (
1
) (
2
)
ASTM D 1120-72 (
1
)
Mtodo dinmico 0,5 K (at 600 K) (
2
)
Processo de destilao (intervalo de
ebulio)
0,5 K (at 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/
/71
Mtodo de Siwoloboff 2 K (at 600 K) (
2
)
Deteco por clula fotoelctrica 0,3 K (at 373 K) (
2
)
Anlise trmica diferencial 0,5 K (at 600 K)
2,0 K (at 1 273 K)
ASTM E 537-76
Calorimetria de explorao dife-
rencial
0,5 K (at 600 K)
2,0 K (at 1 273 K)
ASTM E 537-76
(
1
) Esta preciso apenas vlida para um dispositivo simples, como, por exemplo, o descrito na norma ASTM D 1120-72;
pode ser melhorada com ebulimetros mais sofisticados.
(
2
) Vlido apenas para substncias puras. A utilizao noutras circunstncias dever ser justificada.
1.6. DESCRIO DOS MTODOS
Os procedimentos de alguns destes mtodos encontram-se descritos em normas internacionais e nacionais (ver
apndice).
1.6.1. Ebulimetro
Ver apndice.
1.6.2. Mtodo dinmico
Ver o mtodo de ensaio A.4 para a determinao da presso de vapor.
Regista-se a temperatura de ebulio observada para um valor da presso aplicada de 101,325 kPa.
1.6.3. Processo da destilao (intervalo de ebulio)
Ver apndice.
1.6.4. Mtodo de Siwoloboff
Aquece-se a amostra num aparelho para a determinao da temperatura de fuso num tubo de ensaio com um
dimetro de aproximadamente 5 mm (figura 1).
A figura 1 representa um tipo de aparelho normalizado para a determinao das temperaturas de fuso e de
ebulio (JIS K 0064) (o material vidro e todas as especificaes so em milmetros).
L 142/16 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Figura 1
Coloca-se no tubo de ensaio um tubo capilar (capilar para a determinao do ponto de ebulio), o qual se
encontra fechado a cerca de 1 cm acima da sua extremidade inferior. Adiciona-se a substncia que se pretende
testar de modo a que a parte fechada do capilar fique abaixo da superfcie do lquido. O tubo de ensaio que
contm o capilar para a determinao do ponto de ebulio preso ao termmetro com uma fita de borracha
ou fixado lateralmente com um suporte (ver figura 2).
Figura 2
Princpio de Siwoloboff
Figura 3
Princpio modificado
Escolhe-se o lquido do banho de acordo com a temperatura de ebulio. Para temperaturas at 573 K
possvel utilizar leo de silicone. A parafina lquida apenas pode ser utilizada at 473 K. O aquecimento do
lquido do banho deve ser ajustado de modo a que a subida de temperatura seja de 3 K/minuto inicialmente. O
lquido do banho deve ser agitado. Quando a temperatura atinge cerca de 10 K abaixo da temperatura de
ebulio esperada, reduz-se o aquecimento de tal modo que o aumento de temperatura no ultrapasse 1 K/
/minuto. Ao aproximar-se a temperatura de ebulio, observa-se a formao de bolhas que emergem
rapidamente do capilar utilizado para a determinao do ponto de ebulio.
A temperatura de ebulio a temperatura para a qual, face a um arrefecimento momentneo, cessa a corrente
de bolhas e o fluido inicia repentinamente a subida no capilar. A leitura correspondente efectuada no
termmetro a temperatura de ebulio da substncia.
De acordo com o princpio modificado (figura 3) determina-se a temperatura de ebulio num capilar para a
determinao da temperatura de fuso. O capilar distendido at se obter uma ponta fina com cerca de 2 cm
de comprimento (a) e aspira-se uma pequena quantidade da amostra. Fecha-se por fuso a extremidade aberta
do capilar de tal modo que na extremidade fique uma pequena bolha de ar. Enquanto se aquece o aparelho para
a determinao da temperatura de fuso, a bolha de ar expande-se (b). A temperatura de ebulio corresponde
temperatura para a qual o tampo dessa substncia atinge o nvel da superfcie do lquido do banho (c).
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/17
1.6.5. Deteco por clula fotoelctrica
A amostra aquecida num tubo capilar no interior de um bloco metlico aquecido.
Pelos orifcios existentes no bloco, enviado um feixe de luz atravs da substncia para uma clula fotoelctrica
calibrada com preciso.
Durante o aumento da temperatura da amostra emergem bolhas de ar simples provenientes do capilar de
ebulio. Ao atingir-se a temperatura de ebulio o nmero de bolhas aumenta fortemente. Isto provoca uma
alterao na intensidade da luz registada pela clula fotoelctrica, que envia um sinal de paragem transmitido
para o indicador que efectua a leitura da temperatura num termmetro de resistncia de platina localizado no
bloco.
Este mtodo especialmente til, uma vez que permite determinaes de valores inferiores temperatura
ambiente e at 253,15 K ( 20
o
C) sem qualquer modificao no aparelho. Apenas necessrio colocar o
instrumento num banho de arrefecimento.
1.6.6. Anlise trmica
1.6.6.1. Anlise trmica diferencial
Ver apndice.
1.6.6.2. Calorimetria de explorao diferencial
Ver apndice.
2. RESU LTADOS
Para pequenos desvios em relao presso normal (mximo 5 kPa), as temperaturas de ebulio so
corrigidas para o valor T
n
pela equao de converso de Sidney Young:
T
n
= T + (f
T
p)
em que:
p = (101,325 p) [ateno ao sinal]
p = presso medida em kPa
f
T
= taxa de variao da temperatura de ebulio com a presso em K/kPa
T = temperatura de ebulio medida em K
T
n
= temperatura de ebulio corrigida para a presso normal, em K
Os factores para a correco da temperatura, o valor f
T
e as equaes para a sua aproximao esto descritos nas
normas internacionais e nacionais anteriormente referidas para diversas substncias.
Por exemplo, o mtodo DIN 53171 refere as seguintes correces aproximadas para solventes incorporados em
tintas:
Quadro 2
Temperatura factores de correco f
T
Temperatura T (K) Factor de correco f
T
(K/kPa)
323,15 0,26
348,15 0,28
373,15 0,31
398,15 0,33
423,15 0,35
448,15 0,37
L 142/18 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Temperatura T (K) Factor de correco f
T
(K/kPa)
473,15 0,39
498,15 0,41
523,15 0,44
548,15 0,45
573,15 0,47
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
mtodo utilizado,
especificao exacta da substncia (identificao e impurezas) e fases prvias de purificao, se for caso
disso,
uma estimativa da preciso.
Estabelece-se que a temperatura de ebulio a mdia de pelo menos duas medies situadas no intervalo de
preciso estimada (ver quadro 1).
As temperaturas de ebulio medidas e os seus valores mdios devero ser especificados e os valores da presso
para os quais se efectuaram as medies devero ser apresentados em kPa. Preferencialmente a presso dever
ser prxima da presso atmosfrica normal.
Todas as informaes e notas relevantes para a interpretao de resultados devero ser apresentadas,
especialmente no que diz respeito s impurezas e estado fsico da substncia.
4. REFERNCIAS
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II.
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, 3rd ed.,
Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/19
Apndice
Para pormenores tcnicos adicionais possvel consultar, por exemplo, as normas seguintes:
1. Ebulimetro
1.1 Dispositivos de medio da temperatura de fuso com banho lquido
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes
2. Processo de destilao (intervalo de ebulio)
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)
BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products
BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics
DIN 53171 Lsungsmittel fr Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes
NF T 20-608 Distillation: dtermination du rendement et de 1'intervalle de distillation
3. Anlise trmica diferencial e calorimetria de explorao diferencial
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of
differential thermal analysis
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe
L 142/20 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
A.3. DENSIDADE RELATIVA
1. MTODO
Os mtodos descritos baseiam-se nas Normas de Ensaio da OCDE (1). Os princpios fundamentais encontram-
-se na referncia (2).
1.1. INTRODUO
Os mtodos descritos para a determinao da densidade relativa so aplicveis a substncias slidas e a
substncias lquidas, sem qualquer restrio no que diz respeito ao seu grau de pureza. Os diversos mtodos
utilizveis encontram-se resumidos no quadro 1.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
A densidade relativa D
20
4
de um slido ou de um lquido a razo entre a massa de um determinado volume da
substncia que se pretende testar, temperatura de 20
o
C, e a massa de igual volume de gua, temperatura de
4
o
C. A densidade relativa no tem dimenses.
A densidade, p, de uma substncia o quociente entre a massa, m, e o seu volume, v.
A densidade, p, dada, em unidades do SI, em kg/m
3
.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA (1) (3)
No necessrio utilizar substncias de referncia em todos os casos quando se est a investigar uma nova
substncia. Essas substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibrao do mtodo e
para proporcionar a comparao com resultados obtidos com outros mtodos.
1.4. PRINCPIO DOS MTODOS
Recorre-se utilizao de quatro classes de mtodos.
1.4.1. Mtodos de flutuao
1.4.1.1. Hidrmetro (para substncias lquidas)
possvel efectuar determinaes rpidas e suficientemente exactas de densidade utilizando hidrmetros de
flutuao, os quais permitem obter a densidade de um lquido a partir da profundidade de imerso por simples
leitura de uma escala graduada.
1.4.1.2. Balana hidrosttica (para substncias lquidas e slidas)
Pode recorrer-se diferena entre o peso de uma amostra testada medido ao ar e num lquido adequado (por
exemplo gua) para se determinar a sua densidade.
No caso dos slidos, a densidade medida apenas representativa da amostra particular utilizada. Para a
determinao da densidade de lquidos pesa-se primeiro ao ar um corpo de volume conhecido, v, e depois pesa-
-se mergulhado no lquido.
1.4.1.3. Mtodo do corpo imerso (para substncias lquidas) (4)
De acordo com este mtodo determina-se a densidade de um lquido a partir da diferena entre os resultados da
pesagem do lquido antes e aps a imerso, nesse lquido, de um corpo de volume conhecido.
1.4.2. Mtodos do picnmetro
Tanto para os slidos como para os lquidos possvel utilizar picnmetros de configuraes diversas e com
volumes conhecidos. Calcula-se a densidade a partir da diferena em peso entre o picnmetro cheio e vazio e
pelo conhecimento do seu volume.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/21
1.4.3. Picnmetro por comparao ao ar (para slidos)
Pode medir-se a densidade de um slido de qualquer configurao, temperatura ambiente, utilizando o
picnmetro de comparao de gases. Mede-se o volume de uma substncia ao ar ou num gs inerte, usando um
cilindro de volume calibrado varivel. Para se calcular a densidade efectua-se uma medio de massa depois da
medio de volume.
1.4.4. Densmetro oscilante (5) (6) (7)
possvel medir a densidade de um lquido utilizando um densmetro oscilante. Utiliza-se um oscilador
mecnico com a forma de um tubo em U o qual se faz vibrar frequncia de ressonncia do oscilador, a qual
depende da sua massa. A introduo de uma amostra altera a frequncia de ressonncia do oscilador. O
aparelho tem de ser calibrado utilizando duas substncias lquidas de densidades conhecidas. Essas substncias
devero ser preferencialmente escolhidas de tal modo que as suas densidades relativas cubram o intervalo que
se pretende medir.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
A aplicabilidade dos diversos mtodos utilizados para a determinao da densidade relativa encontra-se
resumida no quadro.
1.6. DESCRIO DOS MTODOS
As normas apresentadas como exemplos, que devem ser consultadas para obteno de pormenores tcnicos
adicionais, esto mencionadas no apndice.
Os testes devem ser efectuados temperatura de 20
o
C e devero ser realizadas pelo menos duas medies.
2. RESULTADOS
Ver normas.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
mtodo utilizado,
especificao exacta da substncia (identificao e impurezas) e fases prvias de purificao, se as houver.
A densidade relativa D
20
4
dever constar do relatrio conforme definido em 1.2, em conjunto com o estado
fsico da substncia ensaiada.
No relatrio devem constar todas as informaes e notas relevantes para a interpretao dos resultados,
especialmente no que diz respeito a impurezas e ao estado fsico da substncia.
Quadro
Aplicabilidade dos mtodos
Mtodo de medida
Densidade
Viscosidade
dinmica mxima
possvel
Normas existentes
Slido Lquido
1.4.1.1. Hidrmetro Sim 5 Pa s ISO 387,
ISO 649-2,
NF T 20-050
L 142/22 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Mtodo de medida
Densidade
Viscosidade
dinmica mxima
possvel
Normas existentes
Slido Lquido
1.4.1.2. Balana hidrosttica
a) slidos Sim ISO 1183 (A)
b) lquidos Sim 5 Pa s ISO 901 e 758
1.4.1.3. Mtodo do corpo
imerso
Sim 20 Pa s DIN 53217
1.4.2. Picnmetro ISO 3507
a) slidos Sim ISO 1183 (B),
NF T 20-053
b) lquidos Sim 500 Pa s ISO 758
1.4.3. Picnmetro por com-
parao ao ar
Sim DIN 55990 parte 3,
DIN 53243
1.4.4. Densmetro oscilante Sim 5 Pa s
4. REFERNCIAS
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(8l) 30 final.
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed.,
Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part l.
(3) IUPAC, Recommended reference materiais for realization of physico-chemical properties, Pure and
applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508.
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flssigkeiten, Technisches Messen tm,
1979, vol. ll, p. 427-430.
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, p. 297-302.
(6) Baumgarten, D., Fllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen Verfahren zur Dichtebestim-
mung bei flssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975,
vol. 37, p. 717-726.
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976,
vol. 9, p. 253-255.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/23
Apndice
Para obteno de pormenores tcnicos adicionais possvel consultar, por exemplo, as normas seguintes:
1. Mtodos de flutuao
1.1. Hidrmetro
DIN 12790, ISO 387 Hidrmetro; instrues gerais
DIN 12791 Parte I: Hidrmetros de densidade; sua construo, ajustamento e utilizao
Parte II: Hidrmetros de densidade; dimenses normalizadas, designao
Parte III: Utilizao e teste
ISO 649-2 Objectos de vidro laboratoriais: hidrmetros de densidade para fins gerais
NF T 20-050 Produtos qumicos para utilizao industrial Determinao da densidade de
lquidos Mtodo areomtrico
DIN 12793 Objectos de vidro laboratoriais: hidrmetros de resoluo varivel
1.2. Balana hidrosttica
Para as substncias slidas
ISO 1183 Mtodo A: Mtodos para a determinao da densidade e para a determinao da
densidade relativa de plsticos excluindo os plsticos celulares
NF T 20-049 Produtos qumicos para utilizao industrial Determinao da densidade de
slidos que no sejam ps e de produtos celulares Mtodo da balana
hidrosttica
ASTM-D-792 Determinao do peso especfico e da densidade de plsticos por deslocamento
DIN 53479 Testes de plsticos e de elastmeros; determinao da densidade
Para substncias lquidas
ISO 901 ISO 758
DIN 51757 Testes de leos minerais e de materiais afins; determinao da densidade
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 e ASTM D 1481-62
ASTM D 1298 Densidade, peso especfico ou densidade relativa IPA (indicador de posio
atmosfrico) do petrleo bruto e de produtos derivados de petrleo lquido pelo
mtodo do hidrmetro
BS 4714 Densidade, peso especfico ou densidade IPA (indicador de posio atmosfrico) do
petrleo bruto e de produtos derivados de petrleo lquido pelo mtodo do
hidrmetro
1.3. Mtodo do corpo imerso
DIN 53217 Testes de tintas, de vernizes e de materiais de revestimentos anlogos; determinao
da densidade; mtodo do corpo imerso
2. Mtodos picnomtricos
2.1. Para substncias lquidas
ISO 3507 Picnmetros
ISO 758 Produtos qumicos lquidos; determinao da densidade temperatura de 20
o
C
DIN 12797 Picnmetro de Gay-Lussac (para lquidos no volteis que no sejam muito
viscosos)
L 142/24 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
DIN 12798 Picnmetro de Lipkin (para lquidos com uma viscosidade cinemtica inferior a
100,10
-6
m
2
s
-1
temperatura de 15
o
C)
DIN 12800 Picnmetro de Sprengel (para lquidos conforme a norma DIN 12798)
DIN 12801 Picnmetro de Reischauer (para lquidos com uma viscosidade cinemtica inferior a
100,10
-6
m
2
s
-1
temperatura de 20
o
C, aplicvel em particular tambm aos
hidrocarbonetos e s solues aquosas e bem assim aos lquidos com uma presso
de vapor superior, aproximadamente 1 bar temperatura de 90
o
C)
DIN 12806 Picnmetro de Hubbard (para lquidos viscosos de todos os tipos e que no
possuam uma presso de vapor demasiadamente elevada, aplicvel particularmente
tambm para tintas, vernizes e betumes)
DIN 12807 Picnmetro de Bingham (para lquidos, conforme a norma DIN 12801)
DIN 12808 Picnmetro de Jaulmes (em particular para a mistura de etanol e gua)
DIN 12809 Picnmetro com termmetro incorporado e tubo lateral capilar (para lquidos que
no sejam muito viscosos)
DIN 53217 Testes de tintas, de vernizes e de produtos anlogos; determinao da densidade
com picnmetro
DIN 51757 Ponto 7: Testes de leos minerais e de materiais afins; determinao da densidade
ASTM D 297 Seco 15: Produtos de borracha anlise qumica
ASTM D 2111 Mtodo C: Compostos orgnicos halogenados
BS 4699 Mtodo para a determinao do peso especfico e da densidade de produtos
derivados do petrleo (mtodo do picnmetro bicapilar graduado)
BS 5903 Mtodo para a determinao da densidade relativa e da densidade de produtos
derivados do petrleo recorrendo ao mtodo do picnmetro de capilar fechado
NF T 20-053 Produtos qumicos para utilizao industrial Determinao da densidade de
slidos convertidos em p e de lquidos Mtodo picnomtrico
2.2. Para substncias slidas
ISO 1183 Mtodo B: Mtodo para a determinao da densidade e da densidade relativa dos
plsticos com excluso dos plsticos celulares
NF T 20-053 Produtos qumicos para utilizao industrial Determinao da densidade de
slidos convertidos em p e de lquidos Mtodo picnomtrico
DIN 19683 Determinao da densidade de solos
3. Picnmetro por comparao ao ar
DIN 55990 Parte III: Prfung von Anstrichstoffen und hnlichen Beschichtungsstoffen;
Pulverlack; Bestimmung der Dichte
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prfung
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/25
A.4. PRESSO DE VAPOR
1. MTODO
A maior parte dos mtodos descritos baseiam-se na publicao da OCDE (1). Os princpios fundamentais
encontram-se descritos nas referncias (2) e (3).
1.1. INTRODUO
Considera-se til possuir informaes preliminares sobre a estrutura, a temperatura de fuso e a temperatura de
ebulio da substncia para se efectuar este teste.
No existe nenhum procedimento de medio nico aplicvel a todo o intervalo de presses de vapor. Em
consequncia, recomendam-se diversos mtodos utilizveis para a medio da presso de vapor para valores
compreendidos entre < 10
-4
e 10
5
Pa.
Normalmente as impurezas afectam a presso de vapor. O grau dessa influncia depende muito do tipo das
impurezas.
No caso de existirem na amostra impurezas volteis que possam afectar o resultado, a substncia deve ser
purificada. Tambm se considera apropriado referir a presso de vapor para o material tcnico.
Alguns dos mtodos aqui descritos utilizam aparelhos com partes metlicas; deve tomar-se este facto em
considerao no caso de se testarem substncias corrosivas.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
Define-se a presso de vapor de uma substncia como sendo a presso de saturao exercida sobre uma
substncia slida ou lquida. Para uma situao de equilbrio termodinmico, a presso de vapor de uma
substncia pura, apenas funo da temperatura.
A unidade de presso do SI que se deve utilizar o pascal (Pa).
As unidades antigamente utilizadas e os seus factores de converso so:
1 Torr (- 1 mm Hg) = 1,333 10
2
Pa
1 atmosfera = 1,013 10
5
Pa
1 bar = 10
5
Pa
A unidade de temperatura do SI o kelvin (K).
A constante universal dos gases perfeitos R = 8,314 J mol
-1
K
-1
A dependncia da presso de vapor em funo da temperatura descrita pela equao de Clausius-Clapeyron:
log p =
H
v
2,3RT
const:
em que:
p = presso de vapor da substncia em pascal
H
v
= calor de vaporizao da substncia em J mol
-1
R = constante universal dos gases perfeitos em J mol
-1
K
-1
T = temperatura termodinmica em K
L 142/26 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
No necessrio utilizar substncias de referncia em todos os casos quando se est a investigar uma nova
substncia. Essas substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibrao do mtodo e
para proporcionar a comparao dos resultados obtidos com outros mtodos.
1.4. PRINCPIO DOS MTODOS
Para a determinao da presso de vapor propem-se sete mtodos que podem ser aplicados em diferentes
intervalos de presso de vapor. Para cada um desses mtodos determina-se a presso de vapor para vrias
temperaturas. Num intervalo de temperaturas limitado, o logaritmo da presso de vapor de uma substncia
pura uma funo linear do inverso da temperatura.
1.4.1. Mtodo dinmico
No mtodo dinmico mede-se a temperatura de ebulio referente a uma presso especfica.
Intervalo recomendado:
10
3
at 10
5
Pa
Este mtodo tem sido recomendado tambm para a determinao da temperatura de ebulio normal e til
at temperatura de 600 K.
1.4.2. Mtodo esttico
No processo esttico, determina-se a presso de vapor estabelecida num sistema fechado em equilbrio
termodinmico, para uma temperatura especfica. Este mtodo adequado para slidos e lquidos de um s
componente e de multicomponentes.
Intervalo recomendado:
10 at 10
5
Pa
Este mtodo tambm pode ser utilizado no intervalo de 1 a 10 Pa, com as devidas precaues.
1.4.3. Isoteniscpio
Este mtodo normalizado tambm um mtodo esttico mas normalmente no adequado para sistemas
multicomponentes. Existe informao adicional na publicao ASTM, mtodo D-2879-86.
Intervalo recomendado:
desde 100 at10
5
Pa
1.4.4. Mtodo de efuso: balana de presso de vapor
Determina-se a quantidade de substncia que sai de uma clula, por unidade de tempo, atravs de uma abertura
de dimenses conhecidas, sob condies de vcuo, de forma que o retorno da substncia clula seja
desprezvel (por exemplo, medindo o impulso exercido sobre uma balana sensvel, pela aco de um jacto de
vapor, ou medindo a perda de peso de clula).
Intervalo recomendado:
10
-3
at 1 Pa
1.4.5. Mtodo de efuso: por perda de peso ou por captao do vaporizado
O mtodo baseia-se na estimativa da massa da substncia de teste que se escoa por unidade de tempo numa
clula de Knudsen (4) na forma de vapor, atravs de um micro-orifcio, sob condies de ultravcuo. Pode
obter-se a massa efundida de vapor determinando a perda de massa da clula ou condensando o vapor a baixa
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/27
temperatura e determinando a quantidade de substncia volatilizada, recorrendo-se anlise cromatogrfica.
Calcula-se a presso de vapor aplicando a relao de Hertz-Knudsen.
Intervalo recomendado:
10
-3
a 1 Pa
1.4.6. Mtodo de saturao de gs
Faz-se passar sobre a substncia uma corrente de gs portador inerte, de tal modo que este fique saturado com
o vapor daquela. A quantidade de material transportado por uma quantidade conhecida daquele gs inerte
susceptvel de ser medida por recolha num colector adequado ou por recurso a uma tcnica analtica. Utiliza-se
depois esse material para calcular a presso de vapor a uma determinada temperatura.
Intervalo recomendado:
10
-4
a 1 Pa
Tambm se pode utilizar este mtodo no intervalo de 1 a 10 Pa, com as precaues adequadas.
1.4.7. Rotor giratrio
No manmetro de rotor giratrio, o elemento de medio real uma pequena esfera de ao que colocada em
suspenso num campo magntico e que gira a uma velocidade elevada. Calcula-se a presso de gs, a partir da
diminuio de velocidade da esfera de ao, a qual depende da presso.
Intervalo recomendado:
10
-4
at 0,5 Pa
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
Os diversos mtodos para a determinao da presso de vapor so comparados pelas suas caractersticas de
aplicao, repetitividade, reprodutibilidade, intervalo de medio, normas existentes. Essa comparao
encontra-se resumida no quadro que se segue.
Quadro
Critrios de qualidade
Mtodo de medio
Substncias
Repetitividade
estimada (
1
)
Reprodutibili-
dade estimada
(
1
)
Intervalo
recomendado
Norma existente
Slido Lquido
1.4.1. Mtodo din-
mico
Baixo
ponto
de
fuso
Sim At 25 % At 25 % 10
3
Pa at 2
10
3
Pa

1 a 5 % 1 a 5 % 2 l0
3
Pa
at 10
-5
Pa

1.4.2. Mtodo est-


tico
Sim Sim 5 a 10 % 5 a 10 % 10 Pa at
10
5
Pa (
2
)
NFT 20-048
(5)
1.4.3. Isoteniscpio Sim Sim 5 a 10 % 5 a 10 % 10
2
Pa at
10
5
Pa
ASTM-D
2879-86
1.4.4. Mtodo de
efuso:
balana de
presso de
vapor
Sim Sim 5 a 20 % At 50 % 10
-3
Pa at
1 Pa
NFT
20-047 (6)
L 142/28 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Mtodo de medio
Substncias
Repetitividade
estimada (
1
)
Reprodutibili-
dade estimada
(
1
)
Intervalo
recomendado
Norma existente
Slido Lquido
1.4.5. Mtodo de
efuso: perda
de peso
Sim Sim 10 a 30 % 10
-3
Pa at
1 Pa

1.4.6. Mtodo de
saturao de
gs
Sim Sim 10 a 30 % At 50 % 10
-4
Pa at
1 Pa (
2
)

1.4.7. Mtodo do
rotor girat-
rico
Sim Sim 10 a 20 % 10
-4
Pa at
0,5 Pa

(
1
) Dependente do grau de pureza.
(
2
) Estes mtodos tambm podem ser utilizados no intervalo 1 a 10 Pa, com as precaues adequadas.
1.6. DESCRIO DOS MTODOS
1.6.1. Medio dinmica
1.6.1.1. Equipamento
O equipamento tpico de medida constitudo por um recipiente de ebulio ao qual est associado um sistema
de arrefecimento de vidro ou de metal (figura 1), instrumentos para a medio da temperatura e instrumentos
para regular e medir a presso. Na figura representa-se um equipamento tpico de medio de vidro, resistente
ao calor e composto por cinco partes:
O tubo grande com parede parcialmente dupla constitudo por uma junta normalizada, um sistema de
arrefecimento, um recipiente de arrefecimento e uma entrada.
O cilindro de vidro, com uma bomba Cottrell, montado na seco de ebulio do tubo e possui uma
superfcie rugosa de vidro fragmentado para evitar ressaltos durante o processo de ebulio.
A temperatura medida com um sensor de temperatura adequado (por exemplo, um termmetro de
resistncia, ou um termopar) imerso no interior do equipamento at ao ponto de medida (n.
o
5 da figura 1)
atravs de uma entrada adequada (por exemplo, junta normalizada macho).
Efectuam-se as necessrias ligaes ao equipamento de regulao e de medio da presso.
A ampola, que funciona como um separador volumtrico, ligada ao equipamento de medida por meio de um
tubo capilar.
Aquece-se o recipiente de ebulio utilizando um elemento de aquecimento (por exemplo, um calorfero de
cartucho) inserido no equipamento de vidro pela parte inferior. Liga-se a corrente de aquecimento necessria e
regula-se atravs de um termopar.
A presso de vcuo necessria, compreendida aproximadamente entre 10
2
Pa e 10
5
Pa, produzida com uma
bomba de vcuo.
Utiliza-se uma vlvula adequada para admisso de ar ou de azoto para regular a presso (intervalo de medio
compreendido aproximadamente entre 10
2
e 10
5
Pa) e para ventilao.
Mede-se a presso com um manmetro.
1.6.1.2. Procedimento de medio
Mede-se a presso de vapor determinando a temperatura de ebulio da amostra para diversas presses
especficas compreendidas, grosso modo, entre 10
3
e 10
5
Pa. A existncia de uma temperatura estvel sob uma
presso constante significa que se atingiu a temperatura de ebulio. As substncias espumosas no podem ser
submetidas a este mtodo de medio.
Coloca-se a substncia num recipiente limpo e seco. possvel que surjam problemas com slidos no
pulverizados mas esta questo pode ser resolvida frequentemente aquecendo a gua da manga de
arrefecimento. Depois de se ter enchido o recipiente, veda-se o equipamento na flange e eliminam-se os
gases da substncia. Ajusta-se seguidamente a presso para o valor mais baixo desejado e liga-se o aquecimento.
Simultaneamente liga-se o sensor de temperatura a um registador.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/29
Atinge-se o equilbrio quando se regista uma temperatura de ebulio constante a uma presso constante. E
necessrio tomar precaues para evitar a instabilidade durante a ebulio. Alm disso pode ocorrer
condensao total no sistema de arrefecimento. No caso de se determinar a presso de vapor de slidos de
baixo ponto de fuso necessrio tomar precaues para evitar o bloqueio do condensador.
Depois de se ter registado este ponto de equilbrio ajusta-se a presso para um valor superior. Repete-se este
processo at se atingir a presso de 10
5
Pa (aproximadamente 5 a 10 pontos de medio na totalidade). Para
verificao, os pontos de equilbrio devero ser repetidos para valores decrescentes da presso.
1.6.2. Medio esttica
1.6.2.1. Equipamento
O equipamento constitudo por um recipiente para a amostra, um sistema de aquecimento e um sistema de
arrefecimento para regular a temperatura da amostra e um aparelho para medio da temperatura. O
equipamento incorpora tambm instrumentos para ajustar e medir a presso. As figuras 2a e 2b ilustram os
princpios bsicos envolvidos.
A cmara da amostra (figura 2a) ligada num dos lados a uma vlvula prpria para alto vcuo. Ao outro lado
liga-se um tubo em U contendo um fluido manomtrico adequado. Uma das extremidades do tubo em U
ramifica-se e vai ligar-se bomba de vcuo, botija de azoto ou vlvula de ventilao, e a um manmetro.
possvel utilizar um manmetro com um indicador de presso em vez de um tubo em U (figura 2b).
No sentido de se regular a temperatura da amostra, coloca-se o recipiente da amostra com a vlvula e com o
tubo em U ou com o manmetro num banho que mantido a uma temperatura constante 0,2 K. As
medies de temperatura so efectuadas na parede exterior do recipiente que contm a amostra ou no prprio
recipiente.
Para fazer o vcuo no equipamento utiliza-se uma bomba de vcuo com um sistema de arrefecimento.
No mtodo 2a mede-se a presso de vapor da substncia indirectamente, utilizando um indicador de zero. Este
mtodo leva em considerao o facto de a densidade do fluido no tubo em U se alterar no caso de a
temperatura variar muito.
Os lquidos a seguir indicados so adequados para utilizao como indicadores de zero para o tubo em U,
dependendo do intervalo de presso e do comportamento qumico das substncias testadas: mercrio, leos de
silicone, ftalatos. A substncia testada no deve dissolver-se perceptivelmente ou reagir com o fluido do tubo
em U.
Para o manmetro o mercrio pode ser utilizado no intervalo compreendido entre a presso atmosfrica
normal e 10
2
Pa, ao passo que os leos de silicone e os ftalatos so adequados para utilizao no intervalo
compreendido entre 10 Pa e 10
2
Pa. Os manmetros de membrana aquecvel podem ser utilizados
eventualmente para valores inferiores a 10
-1
Pa. Existem ainda outros manmetros susceptveis de serem
utilizados para valores inferiores a 10
2
Pa.
1.6.2.2. Procedimentos de medio
Antes da medio todos os componentes do equipamento representado na figura 2 devem ser completamente
limpos e secos.
Para o mtodo 2a, enche-se o tubo em U com o lquido escolhido, o qual deve ser desgaseificado a temperatura
elevada, antes de se fazer qualquer leitura.
Coloca-se a substncia testada no equipamento o qual depois fechado e reduz-se a temperatura o suficiente
para remover os gases. A temperatura deve ser suficientemente baixa para garantir a remoo do ar mas, no
caso das amostras com vrios componentes, o seu valor no deve alterar a composio do material. Se
necessrio pode-se estabelecer o equilbrio mais rapidamente por agitao.
A amostra pode ser sobrearrefecida, por exemplo, com azoto lquido (precaues: condensao do ar, fluido da
bomba) ou com uma mistura de etanol e gelo seco. Para medies a baixa temperatura utiliza-se um banho de
regulao da temperatura ligado a um sistema ultracriognico.
Estando aberta a vlvula sobre o recipiente da amostra, aplica-se o sistema de suco durante diversos minutos
para se efectuar a remoo do ar. Depois fecha-se a vlvula e reduz-se a temperatura da amostra para o mais
baixo nvel desejado. Se necessrio, dever repetir-se diversas vezes a operao de desgaseificao.
L 142/30 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Ao aquecer-se a amostra a presso de vapor aumenta. Isto altera o equilbrio do fluido no tubo em U. Para se
compensar este fenmeno permite-se a entrada de azoto ou de ar no aparelho atravs de uma vlvula, at que o
indicador de presso de fluido marque novamente zero. A presso necessria para conseguir isto pode ser lida
com um manmetro de preciso temperatura ambiente. Esta presso corresponde presso de vapor da
substncia para esse valor especfico da temperatura medida.
O mtodo 2b idntico mas a presso de vapor lida directamente.
A dependncia da presso de vapor em funo da temperatura determinada para pequenos intervalos
adequados (aproximadamente 5 a 10 pontos de medio na totalidade) at se alcanar o mximo desejado. Para
verificao devero ser repetidas as leituras com os valores de temperatura a baixar.
No caso de os valores obtidos na repetio das leituras no coincidirem com a curva obtida para os valores
crescentes da temperatura, pode ser devido s razes seguintes:
1. A amostra ainda contm ar (por exemplo, no caso dos materiais de alta viscosidade) ou contm
substncias de baixo ponto de ebulio, as quais so libertadas durante o aquecimento e podem ser
removidas por suco seguindo-se novamente um sobrearrefecimento.
2. A temperatura de arrefecimento no suficientemente baixa. Nesse caso utiliza-se azoto lquido como
agente de arrefecimento.
Se estivermos perante o caso 1 ou 2, os ensaios devero ser repetidos.
3. A substncia sofre uma reaco qumica no intervalo de temperatura pesquisado (por exemplo,
decomposio, polimerizao).
1.6.3. Isoteniscpio
Na referncia 7 encontra-se uma descrio completa deste mtodo. Na figura 3 mostra-se o princpio de
funcionamento deste dispositivo de medio. Analogamente ao mtodo esttico descrito em 1.6.2, o
isoteniscpio apropriado para fazer uma investigao do tipo descrito em slidos ou lquidos.
No caso dos lquidos, a prpria substncia serve como fluido no manmetro auxiliar. Coloca-se no
isoteniscpio uma quantidade do lquido, suficiente para encher a ampola e o segmento curto da seco do
manmetro. Liga-se o isoteniscpio a um sistema de vcuo, procede-se evacuao do isoteniscpio e enche-se
depois com azoto. Repete-se duas vezes a evacuao e a purificao do sistema para garantir a remoo do
oxignio residual. Coloca-se o isoteniscpio cheio em posio horizontal de tal modo que a amostra se espalhe
segundo uma camada fina na ampola da amostra e na seco do manmetro (parte em U). Reduz-se a presso
do sistema para 133 Pa e aquece-se suavemente a amostra at ela iniciar a ebulio (remoo de gases estveis
dissolvidos). Depois coloca-se o isoteniscpio de tal modo que a amostra regresse ampola e ao segmento
curto do manmetro, ficando os dois assim completamente cheios com lquido. Mantm-se a presso tal como
para a desgaseificao; aquece-se com chama fraca a extremidade de sada da ampola da amostra at que o
vapor libertado pela amostra se expanda suficientemente para deslocar parte da amostra da parte superior da
ampola e do brao do manmetro para o interior da seco do manmetro do isoteniscpio, originando um
espao livre de azoto e cheio de vapor.
Depois coloca-se o isoteniscpio num banho a temperatura constante e ajusta-se a presso do azoto at que o
seu valor seja igual ao da amostra. O equilbrio entre presses indicado pela seco do manmetro do
isoteniscpio. Em situao de equilbrio, a presso de vapor do azoto igual presso de vapor da substncia.
No caso dos slidos, dependendo da presso e do intervalo de temperaturas, utilizam-se os lquidos
manomtricos enumerados em 1.6.2.1. O lquido manomtrico isento de gases utilizado para encher uma
protuberncia existente no segmento longo do isoteniscpio. Depois coloca-se na ampola o slido que se est a
estudar e desgaseifica-se a uma temperatura elevada. Depois disso inclina-se o isoteniscpio de tal modo que o
lquido manomtrico possa fluir para o interior do tubo em U. A medio da presso de vapor em funo da
temperatura efectua-se de acordo com 1.6.2.
1.6.4. Mtodo de efuso: balana de presso de vapor
1.6.4.1. Equipamento
Encontram-se descritas na literatura vrias verses de equipamento (1). O equipamento aqui descrito ilustra o
princpio geral do mtodo (figura 4). A figura 4 mostra os componentes principais do equipamento,
consistindo num recipiente de vidro ou de ao inoxidvel para alto vcuo, equipamento para produzir e medir
presso de vcuo e componentes incorporados para medir a presso de vapor numa balana. O equipamento
possui os seguintes componentes incorporados:
um forno evaporador com flange e entrada giratria. O forno evaporador um recipiente cilndrico feito,
por exemplo, de cobre ou de uma liga quimicamente resistente e de boa condutividade trmica. Tambm
se pode utilizar um recipiente de vidro com uma parede de cobre. O forno possui um dimetro de
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/31
aproximadamente 3 a 5 cm e entre 2 e 5 cm de altura. Existem entre uma e trs aberturas de dimenses
diferentes para a corrente de vapor. O forno aquecido utilizando uma placa de aquecimento colocada
por baixo ou uma espiral de aquecimento em torno da superfcie exterior. Para se evitar que o calor seja
dissipado na placa de base, liga-se o calorfero placa de base utilizando um metal de fraca condutividade
trmica (nquel/prata ou ao de crmio-nquel), por exemplo um tubo de nquel/prata ligado a uma
entrada rotativa no caso de se utilizar um forno com diversas aberturas. Este sistema possui a vantagem
de permitir a introduo de uma barra de cobre. Isto permite o arrefecimento exterior utilizando um
banho de arrefecimento,
no caso de a tampa do forno de cobre possuir trs aberturas de dimetros diferentes situadas a 90
o
umas
das outras, possvel abranger diversos intervalos de presso de vapor dentro do intervalo total de
medio (aberturas com dimetros compreendidos aproximadamente entre 0,30 e 4,50 mm). Utilizam-se
as aberturas maiores para valores da presso de vapor menores e vice-versa. Rodando o forno pode
seleccionar-se a abertura desejada ou uma posio intermdia da presso de vapor (abertura do forno/
/blindagem/campnula de balana) e a corrente de molculas libertada ou deflectida pela abertura do
forno sobre a balana. No sentido de se medir a temperatura da substncia coloca-se num ponto
adequado um termopar ou um termmetro de resistncia,
sobre a blindagem existe uma campnula pertencente a uma microbalana altamente sensvel (ver
adiante). O dimetro da campnula da balana de aproximadamente 30 mm. O alumnio revestido a
ouro o material adequado,
consoante o tipo de balana, assim existem aberturas para o travesso da balana e uma abertura na
blindagem para a corrente de molculas garantindo-se a condensao completa do vapor na campnula
da balana. A dissipao do calor para o exterior garantida, por exemplo, por uma barra de cobre ligada
a uma caixa de refrigerao. A barra aplicada atravs da placa de base e termicamente isolada desta, por
exemplo, com um tubo de ao de crmio-nquel. Mergulha-se a barra num balo de Dewar contendo
azoto lquido existente sob a placa da base ou faz-se circular azoto lquido pela barra. Deste modo a caixa
de refrigerao mantida aproximadamente temperatura de 120
o
C. A campnula da balana
arrefecida exclusivamente por radiao o que satisfatrio para o intervalo de presses que se pretende
pesquisar (arrefecer aproximadamente 1 hora antes do incio das medies),
a balana fica colocada sobre a caixa de refrigerao. As balanas adequadas so, por exemplo, as
balanas electrnicas de dois braos altamente sensveis (8) ou instrumentos de bobina mvel altamente
sensveis (ver OCDE Test Guideline 104, Edio de 12 de Maio de 1981),
a placa da base incorpora tambm ligaes elctricas para termopares (ou para termmetros de
resistncia) e para as resistncias de aquecimento,
uma presso de vcuo no recipiente utilizando uma bomba de vcuo parcial ou uma bomba de alto
vcuo (a presso de vcuo necessria de aproximadamente 1 a 2 10
-3
Pa, obtida aps 2 horas de
bombagem). Regula-se a presso com um manmetro de ionisao adequado.
1.6.4.2. Procedimento de medio
Enche-se o recipiente com a substncia testada e fecha-se a tampa. A blindagem e a caixa de refrigerao
deslizam, ficando colocadas sobre o forno. Fecha-se o aparelho e ligam-se as bombas de vcuo. A presso final
antes de se iniciarem as medies dever ser de aproximadamente 10
-4
Pa. O arrefecimento da caixa de
refrigerao tem incio a 10
-2
Pa.
Uma vez alcanado o vcuo necessrio, inicia-se o processo de calibrao para o mais baixo valor da
temperatura necessria. Ajusta-se a abertura correspondente na tampa, passando a corrente de vapor
directamente atravs da blindagem por cima da abertura e atingindo a campnula da balana arrefecida. A
campnula da balana deve ser suficientemente grande para garantir que toda a corrente conduzida atravs da
blindagem a atinja. O jacto da corrente de vapor actua como uma fora contra a campnula da balana e as
molculas condensam na sua superfcie arrefecida.
O jacto e a condensao simultnea produzem um sinal no aparelho de registo. A avaliao dos sinais fornece
duas informaes:
1. No equipamento agora descrito a presso de vapor determinada directamente a partir do jacto aplicado
campnula da balana [no necessrio conhecer o peso molecular (2)]. Ao fazer-se a avaliao das
leituras devero ser tomados em considerao factores geomtricos tais como a abertura do forno e o
ngulo da corrente de vapor.
2. Pode medir-se simultaneamente a massa do condensado podendo calcular-se a partir da a velocidade de
evaporao. Tambm se pode calcular a presso de vapor a partir da velocidade de evaporao e do peso
molecular recorrendo equao de Hertz (2)
L 142/32 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
p = G

2 RT 10
3
M
_
em que:
G = velocidade de evaporao (kg s
-1
m
-2
)
M = massa molar (g mol
-1
)
T = temperatura (K)
R = constante universal dos gases perfeitos (J mol
-1
K
-1
)
p = presso de vapor (Pa)
Depois de se ter alcanado o vcuo necessrio inicia-se a srie de medies a partir da mais baixa temperatura
de medio desejada.
Para as outras medies, aumenta-se a temperatura gradualmente at se atingir o valor da temperatura mxima
desejada. Depois arrefece-se novamente a amostra e pode registar-se uma segunda curva de presso de vapor. Se
os valores da segunda experincia no coincidem com os valores obtidos na primeira experincia, ento
possvel que a substncia possa ter sofrido decomposio no intervalo de temperatura que se est a medir.
1.6.5. Mtodo de efuso por perda de peso
1.6.5.1. Equipamento
O equipamento de efuso constitudo pelas partes bsicas seguintes:
um tanque que pode ser termostatado e esvaziado e no qual esto localizadas as clulas de efuso,
uma bomba de alto vcuo (por exemplo, uma bomba de difuso ou uma bomba turbomolecular) com
manmetro de vcuo,
um sifo, utilizando azoto lquido ou gelo seco.
Na figura 5, por exemplo, mostra-se um tanque de alumnio para vcuo, aquecido electricamente, possuindo
quatro clulas de efuso feitas de ao inoxidvel. A chapa de ao inoxidvel tem uma espessura aproximada de
0,3 mm e possui um orifcio de efuso com um dimetro compreendido entre 0,2 e 1,0 mm, prendendo-se
clula de efuso atravs de uma tampa roscada.
1.6.5.2. Procedimento de medio
Enche-se cada clula de efuso com as substncias de referncia e de teste, fixa-se com a tampa roscada o
diafragma metlico com o orifcio e faz-se a pesagem de cada clula com uma preciso da ordem de 0,1 mg.
Coloca-se a clula no equipamento controlado por termstato o qual depois esvaziado at se obter um valor
inferior a um dcimo da presso esperada. Para intervalos definidos de tempo variando entre 5 e 30 horas,
introduz-se ar no equipamento e determina-se a perda de massa da clula de efuso fazendo nova pesagem.
No sentido de se garantir que os resultados no so influenciados por impurezas volteis, repete-se a pesagem
da clula a intervalos definidos de tempo para verificar se a velocidade de evaporao constante ao longo de
pelo menos dois intervalos de tempo.
A presso de vapor p na clula de efuso dada por:
p =
m
KAt

2 RT
M
_
em que:
p = presso de vapor (Pa)
m = massa da substncia que sai da clula durante o tempo t (kg)
t = tempo (s)
A = rea da perfurao (m
2
)
K = factor de correco
R = constante universal dos gases perfeitos (J mol
-1
K
-1
)
T = temperatura (K)
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/33
M = massa molar (kg mol
-1
)
O factor de correco K depende da razo entre o comprimento e o raio do orifcio do cilindro:
razo: 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0
K: 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514
A equao anterior pode ser escrita da forma seguinte:
p = E
m
t

T
M
_
em que E =
1
KA

2R
p
a constante da clula de efuso.
Esta constante E da clula de efuso pode ser determinada com substncias de referncia (2,9) recorrendo
equao seguinte:
E =
prt
m

Mr
T
_
em que:
p(r) = presso de vapor da substncia de referncia (Pa)
M(r)= massa molar da substncia de referncia (kg.mol
-1
)
1.6.6. Mtodo de saturao com gs
1.6.6.1. Equipamento
Para se efectuar este teste utiliza-se um equipamento tpico que constitudo por diversos componentes
representados na figura 6a e adiante descritos (1).
Gs inerte:
O gs portador no deve reagir quimicamente com a substncia testada. Normalmente o azoto suficiente para
satisfazer essa finalidade mas, ocasionalmente, podem ser necessrios outros gases (10). O gs utilizado deve
ser seco (ver figura 6a, n.
o
4, da legenda: sensor de humidade relativa).
Controlo de fluxo:
necessrio um sistema adequado para o controlo do gs para garantir um fluxo constante e predeterminado
atravs da coluna do saturador.
Sistemas de captao para recolha de vapor:
Estes sistemas dependem das caractersticas da amostra particular e do mtodo de anlise escolhido. O vapor
dever ser recolhido em quantidade e de forma que permita a anlise posterior. Para algumas substncias
testadas so adequados sistemas de captao contendo lquidos tais como o hexano ou o etilenoglicol. Para
outras prefervel aplicar absorventes slidos.
Em alternativa captao de vapor e anlise posterior possvel utilizar diversas tcnicas analticas tais como a
cromatografia para se determinar quantitativamente a quantidade de material transportado por uma
quantidade conhecida de gs portador. Adicionalmente possvel medir a perda de massa da amostra.
Permutador de calor:
Para medies a temperaturas diferentes pode ser necessrio incorporar no equipamento um permutador de
calor.
L 142/34 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Coluna do saturador:
A substncia a testar depositada sob a forma de soluo sobre um suporte inerte adequado. Carrega-se a
coluna do saturador com o suporte revestido, devendo as dimenses daquela e o dbito serem tais que se
garanta a saturao completa do gs portador. A coluna do saturador deve ser controlada por termstato. Para
medies de temperaturas superiores temperatura ambiente deve-se aquecer a regio entre a coluna do
saturador e o sistema de captao para evitar a condensao da substncia a testar.
No sentido de reduzir o transporte de massa que ocorre por difuso pode colocar-se um tubo capilar depois da
coluna do saturador (figura 6b).
1.6.6.2. Procedimento de medio
Preparao da coluna do saturador:
A uma quantidade adequada de suporte adiciona-se uma soluo da substncia a testar num solvente
facilmente voltil. Dever-se- adicionar a substncia a testar em quantidade suficiente para manter a saturao
durante o tempo de durao do teste. Evapora-se o solvente totalmente ao ar ou num evaporador rotativo e
carrega-se a coluna do saturador com o material bem misturado. Aps o controlo da amostra por termstato
faz-se passar azoto atravs do equipamento.
Medio:
Os sistemas de captao ou o detector incorporado so ligados linha dos efluentes da coluna e procede-se ao
registo do tempo. Verifica-se o dbito no incio e a intervalos regulares durante a experincia, utilizando um
contador de bolhas (ou continuamente com um debitmetro).
Deve-se medir a presso sada do saturador. Isto pode ser feito do modo seguinte:
a) Introduzindo um manmetro entre o saturador e os sistemas de captao (isto pode no ser satisfatrio
devido ao facto de aumentar o espao morto e a superfcie de adsoro); ou
b) Determinando as quedas de presso atravs do sistema de captao particular utilizado em funo do
dbito, numa experincia separada (isto pode no ser muito satisfatrio para os sistemas de captao de
lquidos).
Determina-se em experincias preliminares ou por estimativa o tempo necessrio para recolher a quantidade de
substncia a testar que necessria para os diversos mtodos de anlise. Em alternativa, pode utilizar-se uma
tcnica analtica quantitativa (por exemplo, a cromatografia) para recolha da substncia para outras anlises.
Antes de se calcular a presso de vapor para uma determinada temperatura necessrio efectuar experincias
preliminares para se determinar o dbito mximo que saturar completamente o gs portador com o vapor da
substncia. Esta situao fica garantida no caso de se fazer passar o gs portador atravs do saturador
suficientemente devagar e de tal modo que uma velocidade inferior no origine maior presso de vapor
calculada.
O mtodo analtico especfico ser determinado pela natureza da substncia que se pretende testar (por
exemplo, gravimetria ou cromatografia gasosa).
Determina-se a quantidade de substncia transportada por um volume conhecido de gs portador.
1.6.6.3. Calculo da presso de vapor
Calcula-se a presso de vapor a partir da densidade de vapor, W/V, segundo a equao:
p =
W
V

RT
M
em que:
p = presso de vapor (Pa)
W = massa da substncia de teste evaporada (g)
V = volume de gs saturado (m
3
)
R = constante universal dos gases perfeitos (J mol
-1
K
-1
)
T = temperatura (K)
M = massa molar da substncia de teste (g mol
-1
)
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/35
Os volumes medidos devem ser corrigidos em funo das diferenas de presso e de temperatura existentes
entre o debitmetro e o saturador controlado por termstato. No caso de o debitmetro estar localizado a
jusante do sistema de captao de vapor necessrio efectuar correces que levem em considerao quaisquer
ingredientes vaporizados no sistema de captao (1).
1.6.7. Rotor giratrio (8, 11, 13)
1.6.7.1. Equipamento
Pode-se recorrer tcnica do rotor giratrio utilizando um viscosmetro de rotor giratrio conforme se mostra
na figura 8. A figura 7 representa esquematicamente a disposio experimental.
O equipamento de medida tpico constitudo por uma cabea de medio do rotor giratrio colocada num
invlucro termostatado com graduao de 0,1
o
C). O dispositivo que contm a amostra colocado num
invlucro termostatado (com graduao de 0,01
o
C) e todas as outras partes do conjunto experimental so
mantidas a uma temperatura superior, para evitar a condensao. Por meio de vlvulas de alto vcuo, liga-se ao
sistema uma bomba de alto vcuo.
A cabea de medio do rotor giratrio constituda por uma esfera de ao (4 a 5 mm de dimetro) colocada
num tubo. A esfera encontra-se suspensa e estabilizada por um campo magntico, utilizando-se geralmente
uma combinao de magnetos permanentes e de bobinas de controlo.
A esfera forada a girar por aco de campos girantes produzidos pelas bobinas. A existncia de bobinas de
leitura, que medem a sempre presente magnetizao lateral fraca da esfera, permitem efectuar a medio da sua
velocidade de rotao.
1.6.7.2. Procedimento de medio
Quando a esfera atingiu j uma determinada velocidade de rotao v(o) (normalmente cerca de 400 rotaes
por segundo), interrompe-se o fornecimento de energia e inicia-se a desacelerao devido frico com o gs.
Mede-se a diminuio da velocidade de rotao em funo do tempo. Uma vez que o atrito causado pela
suspenso magntica desprezvel quando comparado com a frico com o gs, a presso p do gs dada por:
p =
cr
10 t
ln
vt
vo
em que:
c = velocidade mdia das molculas do gs
r = raio da esfera
= densidade absoluta da esfera
= coeficiente de transferncia do momento tangencial (0 = 1 para uma superfcie esfrica ideal de uma
esfera)
t = tempo
v(t) = velocidade de rotao decorrido o tempo t
v(o) = velocidade de rotao inicial
Tambm se pode escrever esta equao do modo seguinte:
p =
cr
10

t
n
t
n 1
t
n
t
n 1
em que t
n
, t
n-1
so os tempos necessrios para a ocorrncia de um nmero N determinado de revolues. Estes
intervalos de tempo t
n
e t
n-1
so sequenciais e t
n
> t
n-1
A velocidade mdia c das molculas de gs dada por:
c =
8 RT
M
_ _
1
2
em que:
T = temperatura
L 142/36 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
R = constante universal dos gases perfeitos
M = massa molar
2. RESULTADOS
A presso de vapor obtida por quaisquer dos mtodos anteriores dever ser determinada pelo menos para dois
valores de temperatura. prefervel fazer determinaes para trs ou vrios valores de temperatura de
preferncia no intervalo compreendido entre 0 e 50
o
C, no sentido de se verificar a linearidade da curva de
presso de vapor.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
o mtodo utilizado,
a especificao exacta da substncia (identificao e impurezas) e passos de purificao preliminares, se os
houver,
pelo menos dois valores de presso de vapor e dois valores de temperatura, preferencialmente no
intervalo compreendido entre 0 e 50
o
C,
todos os dados no tratados,
uma curva do tipo log p em funo de 1/T,
uma estimativa da presso de vapor para as temperaturas de 20 ou 25
o
C.
No caso de se observar um fenmeno de transio (variao de estado, decomposio), devero ser
acrescentados os seguintes dados informativos:
natureza da alterao,
temperatura qual ocorreu essa alterao, presso atmosfrica,
presso de vapor para temperaturas 10 e 20
o
C inferiores temperatura de transio e para temperaturas
10 e 20
o
C superiores a essa temperatura (salvo no caso de a transio se efectuar do estado slido para o
estado gasoso).
Todas as informaes e notas relevantes para a interpretao dos resultados devem constar do relatrio,
especialmente no que diz respeito s impurezas e ao estado fsico da substncia.
4. REFERNCIAS
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London,
1975, vol. II.
(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed.,
Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I.
(4) Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, p. 593.
(5) NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use Determination of vapour
pressure of solids and liquids within range from 10
-1
to 10
-5
Pa Static method.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/37
(6) NF- T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use Determination of vapour
pressure of solids and liquids within range from 10
-3
to 1 Pa Vapour pressure balance method.
(7) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure temperature relationship and initial
decomposition temperature of liquids by isoteniscope.
(8) G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, vol. 5 (4), p. 2440.
(9) Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, p. 1173.
(10) B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, p. 435.
(11) G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), p. 642.
(12) G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), p. 1148.
(13) J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), p. 1715.
L 142/38 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Apndice 1
Mtodo por estimativa
INTRODUO
Os valores calculados da presso de vapor podem ser utilizados:
para se decidir qual dos mtodos experimentais o mais apropriado,
para proporcionar uma estimativa ou um valor limite nos casos em que o mtodo experimental no pode ser aplicado
por razes tcnicas (incluindo os casos em que a presso de vapor muito baixa),
para auxiliar a identificar os casos em que se justifica a omisso da medio experimental devido ao facto de a presso
de vapor ser eventualmente inferior a 10
-5
Pa temperatura ambiente.
MTODO POR ESTIMATIVA
Pode avaliar-se a presso de vapor de lquidos e de slidos recorrendo correlao de Watson modificada (a). O nico dado
experimental necessrio o ponto de ebulio normal. Este mtodo aplicvel para um intervalo de presses compreendido
entre 10
5
e 10
-5
Pa.
A informao pormenorizada sobre o mtodo encontra-se descrita no Handbook of Chemical Property Estimation
Methods (b).
PROCEDIMENTO DE CLCULO
De acordo com (b) calcula-se a presso de vapor do modo seguinte:
ln P
vp

H
vb
Z
b
RT
b
1
3 2
T
T
b
_ _
m
T
T
b
2m 3 2
T
T
b
_ _
m 1
ln
T
T
b
_

_
_

_
em que:
T = temperatura de trabalho
T
b
= ponto de ebulio normal
P
vp
= presso de vapor temperatura T
H
vb
= calor de vaporizao
Z
b
= factor de compressibilidade (estimado a 0,97)
m = factor emprico dependente do estado fsico para o valor da temperatura de trabalho
Alm disso temos:
H
vb
T
b
= K
F
8,75 R ln T
b

em que K
F
representa um factor emprico que leva em considerao a polaridade da substncia. Na publicao de referncia
(b) encontram-se enumerados os factores K
F
para diversos tipos de compostos.
frequente encontrar dados disponveis de valores de pontos de ebulio para valores de presso reduzida. Num caso desses,
de acordo com (b), calcula-se a presso de vapor do modo seguinte:
ln P
vp
ln P
1

Hv
1
Z
b
RT
1
1 3 2
T
T
1
_ _
m
T
1
T
2m 3 2
T
T
1
_ _
m 1
ln
T
T
1
_ _
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/39
em que T
1
representa o ponto de ebulio para o valor P
1
da presso reduzida.
RELATRIO
No caso de se utilizar o mtodo por estimativa, o relatrio dever conter documentao exaustiva sobre os clculos.
BIBLIOGRAFIA
(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem., 1943, vol. 35, p. 398.
(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.
L 142/40 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Apndice 2
Figura 1
Aparelho para a determinao da curva de presso de vapor de acordo com o mtodo dinmico
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/41
Figura 2a
Aparelho para a determinao da curva de presso de vapor de acordo com o mtodo esttico (utilizando um
manmetro de tubo em U)
L 142/42 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Figura 2b
Aparelho para a determinao da curva da presso de vapor de acordo com o mtodo esttico (utilizando um
indicador de presso)
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/43
Figura 3
Isoteniscpio (ver referncia 7)
L 142/44 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Figura 4
Aparelho para a determinao da curva da presso de vapor de acordo com o mtodo da balana de presso de
vapor
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/45
Figura 5
Exemplo de um aparelho para evaporao a baixa presso utilizando o mtodo de efuso, com uma clula de
efuso com o volume de 8 cm
3
L 142/46 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Figura 6a
Exemplo de um sistema de circulao para a determinao da presso de vapor pelo mtodo da saturao com gs
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/47
Figura 6b
Exemplo de um sistema para a determinao da presso de vapor pelo mtodo da saturao com gs, com um tubo
capilar colocado a seguir ao compartimento de saturao
Figura 7
Exemplo da disposio do conjunto experimental para o mtodo do rotor giratrio
L 142/48 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Figura 8
Exemplo de cabea de medio de rotor giratrio
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/49
A.5. TENSO SUPERFICIAL
1. MTODO
Os mtodos descritos baseiam-se nas normas de ensaio da OCDE (1). Os princpios fundamentais encontram-
-se descritos na referncia (2).
1.1. INTRODUO
Os mtodos descritos so aplicveis medio da tenso superficial em solues aquosas.
Considera-se til possuir informaes preliminares sobre a substncia, relativamente a: solubilidade em gua,
estrutura, propriedades relativas hidrlise e concentrao crtica de formao de micelas, antes de se
efectuarem estes testes.
Os mtodos que se seguem so aplicveis maior parte das substncias qumicas, sem qualquer restrio no
que diz respeito ao seu grau de pureza.
A medio da tenso superficial pelo mtodo do tensimetro de anel aplicvel apenas a solues aquosas com
uma viscosidade dinmica inferior a cerca de 200 mPa s.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
Define-se como tenso superficial a entalpia superficial livre, por unidade de rea da superfcie.
A tenso superficial dada por:
N/m (unidade do SI) ou
mN/m (subunidade do SI)
1 N/m = 10
3
dines/cm
1 mN/m = 1 dine/cm no antigo e obsoleto sistema cgs
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
No necessrio utilizar substncias de referncia quando se est a investigar uma nova substncia. Essas
substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibrao do mtodo e para
proporcionar a comparao com resultados obtidos com outros mtodos.
As substncias de referncia que abrangem um intervalo amplo de tenses superficiais encontram-se
enumeradas nas referncias (1) e (3).
1.4. PRINCPIO DOS MTODOS
Os mtodos baseiam-se na medio da fora mxima que necessrio exercer verticalmente sobre um colchete
ou anel em contacto com a superfcie do lquido que se pretende examinar colocado num recipiente, no sentido
de o separar dessa superfcie, ou sobre uma placa, com uma aresta em contacto com a superfcie, no sentido de
se remover a pelcula que se formou.
As substncias solveis em gua pelo menos para valores de concentrao de 1 mg/l so testadas em soluo
aquosa para um valor nico de concentrao.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
Estes mtodos so susceptveis de proporcionar maior preciso do que a eventualmente necessria para a
avaliao ambiental.
L 142/50 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.6. DESCRIO DOS MTODOS
Prepara-se uma soluo da substncia em gua destilada. A concentrao desta soluo deve atingir 90 % do
valor da solubilidade de saturao da substncia em gua; no caso de esta concentrao exceder o valor de 1 g/l,
utiliza-se para os testes a concentrao de 1 g/l. No necessrio testar as substncias cujo valor de solubilidade
em gua seja inferior a 1 mg/l.
1.6.1. Mtodo da placa
Ver ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinao da tenso superficial por remoo de pelculas
lquidas).
1.6.2. Mtodo do colchete
Ver ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinao da tenso superficial por remoo de pelculas
lquidas).
1.6.3. Mtodo do anel
Ver ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinao da tenso superficial por remoo de pelculas
lquidas).
1.6.4. Mtodo do anel harmonizado pela OCDE
1.6.4.1. Aparelho
Os tensimetros comercialmente disponveis so adequados para esta medio. So constitudos pelos
elementos seguintes:
mesa de amostra mvel,
sistema de medio de fora,
corpo para medio (anel),
recipiente de medio.
1.6.4.1.1. Me s a d e a mos t r a mv e l
Utiliza-se a mesa de amostra mvel como suporte para o recipiente de medio de temperatura controlada que
contm o lquido que se pretende testar. A sua montagem faz-se num suporte em conjunto com o sistema de
medio de fora.
1.6.4.1.2. S i s t e ma d e me d i o d e f or a
O sistema de medio de fora (ver figura) fica colocado sobre a mesa da amostra. O erro de medio de fora
no dever exceder 10
-6
N, correspondente a um erro limite de 0,1 mg numa medio de massa. Em
muitos casos, a escala dos tensimetros comercialmente disponveis calibrada em mN/m, de modo que a
tenso superficial pode ser lida directamente em mN/m, com uma preciso de 0,1 mN/m.
1.6.4.1.3. Cor po pa r a a me d i o ( a ne l )
Normalmente o anel feito de um fio de platina/irdio com a espessura aproximada de 0,4 mm e com um
permetro mdio de 60 mm. O anel suspenso horizontalmente de uma haste metlica, atravs de um suporte
triangular de montagem, que estabelece a ligao ao sistema de medio de fora (ver figura).
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/51
Figura
Corpo para a medio
(Todas as dimenses esto expressas em milmetros)
1.6.4.1.4. Re c i pi e nt e d e me d i o
O recipiente de medio que contm a soluo a testar dever ser um recipiente de vidro termostatizado. Deve
ser concebido de tal modo que durante a medio a temperatura da soluo lquida que se pretende testar e a
fase gasosa sobre a sua superfcie permaneam constantes e impedindo que haja evaporao da amostra. So
aceitveis recipientes cilndricos de vidro que possuam um dimetro interno no inferior a 45 mm.
1.6.4.2. Preparao do equipamento
1.6.4.2.1. L i mpe z a
Os recipientes de vidro devem ser cuidadosamente limpos. Se necessrio, devero ser lavados com cido
cromossulfrico quente e depois lavados com cido fosfrico xaroposo (83 a 98 % em peso de H
3
PO
4
), lavados
muito bem com gua da torneira e lavados finalmente com gua bidestilada at se obter uma reaco neutra,
efectuando-se depois a secagem ou a lavagem com um pouco do lquido da amostra que se pretende medir.
O anel deve ser primeiro muito bem lavado com gua para se fazer a remoo de quaisquer substncias que
sejam solveis em gua, depois mergulhado rapidamente em cido cromossulfrico, lavado com gua
bidestilada at se obter uma reaco neutra e finalmente dever ser aquecido rapidamente sobre uma chama de
metanol.
L 142/52 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Nota:
A contaminao com substncias que no sejam dissolvidas ou destrudas com o cido cromossulfrico ou
com o cido fosfrico, tais como os silicones, deve ser removida usando um solvente orgnico adequado.
1.6.4.2.2. Ca l i br a o d o a pa r e l ho
A validao do aparelho consiste em verificar o seu zero e em ajust-lo de tal modo que a indicao do
instrumento permita uma determinao segura em mN/m.
Montagem:
O aparelho deve ser nivelado, por exemplo, por meio de um nvel de bolha de ar colocado na base do
tensimetro, ajustando-se os parafusos de nivelamento existentes na base.
Ajustamento do zero:
Aps a montagem do anel no aparelho e antes da imerso no lquido deve ajustar-se o zero do tensimetro e
deve verificar-se o paralelismo do anel com a superfcie do lquido. Para satisfazer este objectivo pode utilizar-se
como espelho a superfcie do lquido.
Calibraes:
A calibrao pode ser efectuada recorrendo a um de dois procedimentos:
a) Utilizando uma massa: procedimento que utiliza cavaleiros de massa conhecida compreendida entre 0,1
e 1,0 g colocados sobre o anel. O factor de calibrao
a
pelo qual todas as leituras do instrumento
devem ser multiplicadas determina-se de acordo com a equao (1):

a =

r

a
(1)
em que:

r =
mg
2b
(mN/m)
m = massa do cavaleiro (g)
g = acelerao da gravidade (981 cm s
-2
ao nvel do mar)
b = permetro mdio do anel (cm)

a
= leitura do tensimetro aps colocao do cavaleiro no anel (mN/m)
b) Utilizando gua: procedimento que utiliza gua pura cuja tenso superficial, por exemplo, temperatura
de 23
o
C igual a 72,3 mN/m. Este procedimento mais rpido do que a calibrao com cavaleiros, mas
existe sempre o risco de a tenso superficial da gua estar falseada por vestgios de contaminao com
agentes tensioactivos.
O factor de calibrao
b
pelo qual todas as indicaes do instrumento devero ser multiplicadas
determina-se de acordo com a equao (2):

b =

g
(2)
em que:

o
= valor referido na literatura para a tenso superficial da gua (mN/m)

g
= valor medido da tenso superficial da gua (mN/m) ambos mesma temperatura.
1.6.4.3. Preparao de amostras
As solues aquosas devero ser preparadas com as substncias que se pretende testar, utilizando as necessrias
concentraes em gua, e no devero conter quaisquer substncias no dissolvidas.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/53
A soluo deve ser mantida a uma temperatura constante ( 0,5
o
C). Uma vez que a tenso superficial de uma
soluo no recipiente de medio se altera no decurso do tempo, devero ser efectuadas diversas medies em
momentos diferentes e dever ser traada uma curva que represente a tenso superficial em funo do tempo.
Quando j no ocorrerem mais variaes significa que se atingiu um estado de equilbrio.
A contaminao com poeiras e com gases interfere com a medio. Em consequncia, o trabalho dever ser
efectuado sob uma cobertura de proteco.
1.6.5. Condies do teste
A medio dever ser efectuada aproximadamente temperatura de 20
o
C e dever ser controlada entre
0,5
o
C.
1.6.6. Realizao do teste
As solues que se pretendem medir devem ser cuidadosamente transferidas para o recipiente de medio,
limpo, tomando-se precaues para evitar a formao de espuma, e depois o recipiente de medida dever ser
colocado sobre a mesa do aparelho de teste. A parte superior da mesa com o recipiente de medida dever ser
elevada at que o anel fique imerso sob a superfcie da soluo que se pretende medir. Depois, a parte superior
da mesa dever ser baixada gradual e uniformemente (aproximadamente a velocidade de 0,5 cm/minuto) at
que ocorra a separao do anel da superfcie no momento em que se atingiu a fora mxima. A camada de
lquido associada ao anel no deve separar-se do anel. Depois de se terem completado as medies deve
imergir-se o anel novamente sob a superfcie e devem repetir-se as medies at se atingir um valor constante
para a tenso superficial. O momento da transferncia da soluo para o recipiente de medio dever ser
registado para cada determinao. Devero ser efectuadas leituras da fora mxima necessria para separar o
anel da superfcie do lquido.
2. RESULTADOS
Para se calcular a tenso superficial, o valor lido em mN/m no aparelho dever ser multiplicado primeiro pelo
factor de calibrao
a
ou
b
(conforme o procedimento de calibrao utilizado). Obter-se- deste modo um
valor aproximado, pelo que necessria correco posterior.
Harkins e Jordan (4) determinaram empiricamente factores de correco para valores de tenso superficial
medidos pelo mtodo do anel, os quais dependem das dimenses do anel, da densidade do lquido e da sua
tenso superficial.
Uma vez que trabalhoso determinar o factor de correco para cada medio individual a partir das tabelas de
Harkins e Jordan, para se calcular a tenso superficial de solues aquosas pode utilizar-se o procedimento
simplificado de leitura dos valores de tenso superficial corrigidos directamente a partir da tabela. (Recorrer-se-
- interpolao para leituras compreendidas entre os valores indicados na tabela.)
Tabela
Correco da tenso superficial medida
Apenas para solues aquosas, p = 1 g/cm
3
R 9,55 mm (raio mdio do anel)
r 0,185 mm (raio do fio do anel)
Valor experimental (mN/m)
Valor corrigido (mN/m)
Calibrao de massa [ver 1.6.4.2.2.a)] Calibrao com gua [ver 1.6.4.2.2.b)]
20 16,9 18,1
22 18,7 20,1
24 20,6 22,1
L 142/54 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Valor experimental (mN/m)
Valor corrigido (mN/m)
Calibrao de massa [ver 1.6.4.2.2.a)] Calibrao com gua [ver 1.6.4.2.2.b)]
26 22,4 24,1
28 24,3 26,1
30 26,2 28,1
32 28,1 30,1
34 29,9 32,1
36 31,8 34,1
38 33,7 36,1
40 35,6 38,2
42 37,6 40,3
44 39,5 42,3
46 41,4 44,4
48 43,4 46,5
50 45,3 48,6
52 47,3 50,7
54 49,3 52,8
56 51,2 54,9
58 53,2 57,0
60 55,2 59,1
62 57,2 61,3
64 59,2 63,4
66 61,2 65,5
68 63,2 67,7
70 65,2 69,9
72 67,2 72,0
74 69,2
76 71,2
78 73,2
Este quadro foi compilado com base na correco de Harkins-Jordan e idntico ao da norma DIN (DIN
53914) para a gua e para solues aquosas (densidade p = 1 g/cm
3
e destina-se a um anel comercialmente
disponvel que possui as dimenses R = 9,55 mm (raio mdio do anel) e r = 0,185 mm (raio do fio do anel). A
tabela proporciona valores corrigidos para as medies de tenso superficial obtidas aps calibrao com
massas ou calibrao com gua.
Em alternativa, sem que haja a calibrao precedente, pode calcular-se a tenso superficial de acordo com a
frmula seguinte:
=
f F
4R
em que:
F = fora medida no dinammetro no ponto de ruptura da pelcula
R = raio do anel
f = factor de correco (1)
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/55
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
mtodo utilizado,
tipo de gua ou de soluo utilizada,
especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
resultados da medio: tenso superficial (leitura) especificando as duas leituras individuais e a sua mdia
aritmtica e bem assim o valor mdio corrigido (tomando em considerao o factor relativo ao
equipamento e a tabela de correco,
concentrao da soluo,
temperatura do teste,
perodo de vida da soluo utilizada; em particular, o tempo decorrido entre a preparao e a medio
efectuada na soluo,
descrio da dependncia temporal da tenso superficial aps a transferncia da soluo para o recipiente
de medio,
todas as informaes e notas relevantes para a interpretao dos resultados devem ser descritas,
especialmente no que diz respeito a impurezas e estado fsico da substncia.
3.2. INTERPRETAO DOS RESULTADOS
Considerando que a gua destilada possui uma tenso superficial de 72,75 mN/m temperatura de 20
o
C, as
substncias que apresentem uma tenso superficial inferior a 60 mN/m sob as condies descritas para este
mtodo devero ser consideradas como materiais tensioactivos.
4. REFERNCIAS
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed.,
Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter XIV.
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511.
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, p. 1751.
L 142/56 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
A.6. SOLUBILIDADE EM GUA
1. MTODO
Os mtodos descritos baseiam-se nas Normas de Ensaio da OCDE (1).
1.1. INTRODUO
til possuir informaes preliminares sobre a frmula estrutural, a presso de vapor, a constante de
dissociao e a hidrlise (em funo do pH) da substncia para se realizar este teste.
No existe um mtodo nico susceptvel de abranger todas as possibilidades de solubilidade em gua.
Os dois mtodos de teste adiante descritos abrangem a totalidade de possibilidades de solubilidade em gua
mas no so aplicveis s substncias volteis:
um desses mtodos aplica-se a substncias essencialmente puras, com baixa solubilidade (< 10
-2
gramas
por litro), e que so estveis em gua, designado por mtodo de eluio em coluna,
o outro mtodo aplica-se a substncias essencialmente puras com solubilidades superiores (> 10
-2
gramas
por litro), e que so estveis em gua, designado por mtodo do balo.
A solubilidade da substncia testada em gua pode ser consideravelmente afectada pela presena de impurezas.
1.2. DEFINIO E UNIDADES
A solubilidade de uma substncia em gua especificada pela concentrao da massa de saturao dessa
substncia em gua a uma determinada temperatura. A solubilidade em gua especificada em unidades de
massa por volume de soluo. A unidade do SI kg/m
3
(tambm se pode utilizar gramas por litro).
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
No necessrio utilizar substncias de referncia quando se est a investigar uma nova substncia. Essas
substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, as caractersticas de execuo do mtodo e
para proporcionar a comparao com resultados obtidos com outros mtodos.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Dever-se- determinar a quantidade aproximada de amostra e o tempo necessrio para conseguir a
concentrao da massa de saturao, num ensaio preliminar simples.
1.4.1. Mtodo de eluio em coluna
Este mtodo baseia-se na eluio de uma substncia a testar com gua numa microcoluna, a qual carregada
com um material de suporte inerte tal como esferas de vidro ou areia coberto com um excesso da substncia a
testar. Determina-se a solubilidade em gua quando a concentrao de massa do eluido constante. Esta
situao corresponde a um nvel constante de concentrao em funo do tempo.
1.4.2. Mtodo do balo
De acordo com este mtodo, dissolve-se a substncia (os slidos devem ser pulverizados) em gua a uma
temperatura ligeiramente superior temperatura do teste. Ao atingir-se a saturao arrefece-se a mistura e
mantm-se temperatura de ensaio, agitando enquanto for necessrio para alcanar o equilbrio. Em alternativa
pode efectuar-se a medio directamente temperatura de ensaio, desde que se garanta por amostragem
adequada que se atingiu o equilbrio na saturao. Posteriormente determina-se por um mtodo analtico
adequado concentrao de massa da substncia na soluo aquosa, a qual no deve conter quaisquer
partculas no dissolvidas.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/57
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
1.5.1. Repetitividadc
Para o mtodo de eluio em coluna pode obter-se um resultado < 30 %, para o mtodo do balo poder-se-
observar um resultado < 15 %.
1.5.2. Sensibilidade
Este parmetro depende do mtodo de anlise, mas possvel efectuar determinaes de concentrao de massa
inferiores a 10
-6
gramas por litro.
1.6. DESCRIO DO MTODO
1.6.1. Condies do teste
O teste efectua-se preferencialmente temperatura de 20 0,5
o
C. No caso de se suspeitar da existncia de uma
dependncia da solubilidade em funo da temperatura (> 3 % por
o
C), dever-se- efectuar ensaios para dois
outros valores diferentes de temperatura, pelo menos 10
o
C acima e abaixo da temperatura escolhida. Neste
caso, o controlo de temperatura dever ser da ordem de 0,1
o
C. A temperatura escolhida dever ser mantida
constante em todas as partes relevantes do equipamento.
1.6.2. Teste preliminar
A uma quantidade aproximadamente de 0,1 g de amostra (as substncias slidas devero ser pulverizadas)
colocada numa proveta graduada de 10 ml, com rolha de vidro, adicionam-se volumes crescentes de gua
destilada temperatura ambiente, de acordo com a progresso indicada no quadro a seguir:
0,1 g solveis em x
ml de gua
0,1 0,5 1 2 10 100 > 100
Solubilidade aproxi-
mada (gramas por
litro)
> 1 000 1 000-200 200-100 100-50 50-10 10-1 < 1
Aps cada adio da quantidade de gua indicada, agita-se vigorosamente a mistura durante 10 minutos e
verifica-se visualmente a existncia de quaisquer partes no dissolvidas da amostra. Se aps a adio de 10 ml
de gua a amostra ou partes dela permanecerem por dissolver, necessrio repetir a experincia numa proveta
graduada de 100 ml com maiores volumes de gua. Para valores inferiores de solubilidade o tempo necessrio
para dissolver uma substncia pode ser consideravelmente mais longo (dever-se- esperar pelo menos 24
horas). A solubilidade aproximada dada na tabela anterior relativamente ao volume de gua adicionada para o
qual ocorre a dissoluo completa da amostra. No caso de a substncia continuar aparentemente insolvel, ser
necessrio esperar mais do que 24 horas (96 horas no mximo) ou dever ser experimentada outra diluio
para determinar se deve ser utilizado o mtodo de eluio em coluna ou o mtodo da solubilidade em balo.
1.6.3. Mtodo de eluio em coluna
1.6.3.1. Material de suporte, solvente e eluente
O material de suporte para o mtodo de eluio em coluna dever ser inerte. Os materiais que podem ser
utilizados so as esferas de vidro e a areia e dever ser utilizado um solvente voltil adequado, de qualidade
analtica, para se aplicar a substncia a testar ao material de suporte. Poder-se- utilizar como eluente gua
bidestilada num aparelho de quartzo ou de vidro.
Nota:
No deve ser utilizada gua proveniente directamente de um permutador de ies orgnicos.
1.6.3.2. Carga do suporte
Pesa-se aproximadamente 600 mg de material de suporte e transfere-se para um balo de fundo redondo de
50 ml.
L 142/58 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Dissolve-se no solvente escolhido uma quantidade determinada e adequada da substncia a testar. Adiciona-se
ao material de suporte uma quantidade apropriada desta soluo. O solvente deve ser completamente
evaporado, por exemplo, num evaporador rotativo; caso contrrio no se conseguir a saturao do suporte
com gua, devido a efeitos de repartio que ocorrem na superfcie do material de suporte.
A colocao da carga no material de suporte pode originar problemas (resultados errados) se a substncia a
testar se depositar como um leo ou como uma fase cristalina diferente. O problema dever ser examinado
experimentalmente e os pormenores devero constar do relatrio.
Deixar que o material de suporte assim carregado fique embebido, durante aproximadamente 2 horas, em cerca
de 5 ml de gua e depois transfere-se a suspenso para a microcoluna. Em alternativa, o material de suporte
carregado e seco pode ser vertido na microcoluna a qual foi previamente cheia com gua e depois deixa-se
estabelecer o equilbrio durante aproximadamente 2 horas.
Procedimento de ensaio:
A eluio da substncia a partir do material de suporte pode ser efectuada recorrendo a uma de duas vias
diferentes:
bomba de recirculao (ver figura 1),
reservatrio de nvel (ver figura 4).
1.6.3.3. Mtodo de eluio em coluna com bomba de recirculao
Aparelho
A figura 1 representa uma disposio esquemtica de um sistema tpico. A figura 2 representa uma
microcoluna adequada, embora sejam aceitveis outras dimenses, desde que fiquem satisfeitos os critrios de
reprodutibilidade e de sensibilidade. A coluna dever dispor de um espao superior correspondente a pelo
menos cinco vezes o volume base de gua e dever ser capaz de conter um mnimo de cinco amostras. Em
alternativa, poder-se- reduzir as dimenses no caso de se utilizar um solvente de constituio para substituir os
cinco volumes de base iniciais removidos com as impurezas.
A coluna dever ser ligada a uma bomba de recirculao susceptvel de controlar fluxos aproximadamente
razo de 25 ml/hora. A ligao da bomba feita com tubos de politetrafluoro-etileno (PTFE) e/ou tubos de
vidro. A coluna e a bomba, quando ligadas, devero permitir a amostragem do efluente e o equilbrio da parte
superior presso atmosfrica. O material da coluna suportado com um pequeno tampo (5 mm) de l de
vidro, o qual serve tambm para filtrar partculas. A bomba de recirculao pode ser, por exemplo, uma bomba
peristltica ou uma bomba de membrana ( necessrio tomar precaues para que no haja contaminao e/ou
adsoro com o material do tubo).
Procedimento de medio
Inicia-se o fluxo atravs da coluna. Recomenda-se a utilizao de um dbito de aproximadamente 25 ml/hora
(isto corresponde a 10 volumes de base/hora para a coluna descrita). Os primeiros cinco volumes de base
(mnimo) so eliminados para remoo das impurezas solveis em gua. Depois disto deixa-se a bomba de
recirculao funcionar at que o equilbrio fique estabelecido, conforme definido por cinco amostras sucessivas
cujas concentraes no difiram mais do que 30 % numa observao aleatria. As amostras devero ser
separadas umas das outras por intervalos de tempo correspondentes passagem do eluente de pelo menos 10
volumes de enchimento da coluna.
1.6.3.4. Mtodo de eluio em coluna com reservatrio de nivelamento
Aparelho (ver figuras 4 e 3)
Reservatrio de nivelamento: A ligao ao reservatrio de nivelamento faz-se utilizando uma junta de vidro
esmerilado qual ligado um tubo de politetrafluoretileno (PTFE). Recomenda-se a utilizao de um dbito de
aproximadamente 25 ml/hora. As fraces sucessivas de eluido devero ser recolhidas e analisadas pelo mtodo
escolhido.
Procedimento de medio
Utilizam-se as fraces da zona mdia da eluio em que as concentraes so constantes ( 30 %) em pelo
menos cinco fraces consecutivas, para se determinar a solubilidade em gua.
Em ambos os casos (utilizando uma bomba de recirculao ou um reservatrio de nivelamento) dever-se-
fazer a verificao da presena de matria coloidal nas fraces, pela observao da existncia do efeito de
Tyndall (disperso de luz).
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/59
A presena dessas partculas invalida os resultados, devendo os testes ser repetidos melhorando a aco de
filtrao da coluna.
Deve registar-se o valor do pH de cada amostra. Dever-se- efectuar uma segunda experincia mesma
temperatura.
1.6.4. Mtodo do balo
1.6.4.1. Aparelho
No mtodo do balo necessrio o material seguinte:
instrumentos e utenslios de vidro usais em laboratrio,
um dispositivo adequado para a agitao de solues sob condies de temperatura constante e
controlada,
uma centrifugadora (de preferncia com controlo termosttico), se necessrio para as emulses, e
equipamento para determinao analtica.
1.6.4.2. Procedimento de medio
A partir dos testes preliminares estima-se a quantidade de material necessrio para saturar o volume desejado
de gua. O volume necessrio de gua depender do mtodo analtico e do intervalo de solubilidade. Pesam-se
trs pores de aproximadamente cinco vezes a quantidade anteriormente determinada de material, que se
introduzem em trs recipientes de vidro com rolhas de vidro (por exemplo, tubos de centrifugao, bales).
Adiciona-se a cada recipiente o volume escolhido de gua e fecham-se hermeticamente. Os recipientes fechados
so depois agitados temperatura de 30
o
C. (Deve utilizar-se um dispositivo de oscilao ou de agitao
susceptvel de funcionar a uma temperatura constante, por exemplo, um agitador magntico em banho-maria
com termstato.) Decorrido o perodo de um dia remove-se um dos recipientes e reequilibra-se durante 24
horas temperatura de ensaio com agitao ocasional. O contedo do recipiente depois submetido a
centrifugao temperatura de ensaio e determina-se a concentrao do composto na fase aquosa lmpida
recorrendo a um mtodo analtico adequado. Os outros dois recipientes so tratados de modo anlogo, aps o
equilbrio inicial temperatura de 30
o
C durante dois e trs dias, respectivamente. Se os resultados da
concentrao obtidos pelo menos com os dois ltimos recipientes concordarem com a reprodutibilidade
necessria, considera-se que o teste satisfatrio. Todo o teste dever ser repetido, utilizando perodos de
tempo de equilbrio mais longos, se os resultados obtidos nos recipientes 1, 2 e 3 mostrarem uma tendncia
para valores crescentes.
O procedimento de medio tambm pode ser efectuado sem pr-incubao temperatura de 30
o
C. No sentido
de se estimar a velocidade a que se estabelece o equilbrio de saturao extraem-se amostras at que o tempo de
agitao deixe de influenciar a concentrao da soluo a testar.
Deve registar-se o valor do pH de cada amostra.
1.6.5. Anlise
prefervel um mtodo analtico especfico de cada substncia para estas determinaes uma vez que pequenas
quantidades de impurezas solveis podem originar erros grandes na solubilidade medida. So exemplos desses
mtodos os seguintes: a cromatografia de gases ou de lquidos, os mtodos de titulao, os mtodos
fotomtricos, os mtodos voltamtricos.
2. RESULTADOS
2.1. MTODO DA ELUIO EM COLUNA
Dever-se- calcular, para cada experincia, o valor mdio dos resultados obtidos com pelo menos cinco
amostras consecutivas, extrados do patamar constante de saturao, o mesmo devendo ser feito para o desvio-
-padro. Os resultados devero ser apresentados em unidades de massa por volume de soluo.
Procede-se comparao dos valores mdios calculados relativamente a dois testes utilizando fluxos diferentes,
devendo a sua repetitividade ser menor do que 30 %.
L 142/60 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
2.2. MTODO DO BALO
Devero ser apresentados os resultados individuais para cada um dos trs recipientes e, admitindo-se que esses
resultados so constantes (repetitividade menor do que 15 %), calcular-se- a sua mdia e apresentar-se- o
resultado em unidades de massa por volume de soluo. Isto pode exigir a reconverso de unidades de massa
em unidades de volume, utilizando-se a densidade no caso da solubilidade ser muito elevada (> 100 gramas por
litro).
3. RELATRIOS
3.1. MTODO DE ELUIO EM COLUNA
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
os resultados do teste preliminar,
a especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
as concentraes individuais, os dbitos e o pH de cada amostra,
as mdias e os desvios-padro de pelo menos cinco amostras do patamar constante de saturao para
cada experincia,
o valor mdio de duas experincias sucessivas e aceitveis,
a temperatura da gua durante o processo de saturao,
o mtodo de anlise utilizado,
a natureza do material de suporte utilizado,
o processo de carga do material de suporte,
o solvente utilizado,
a evidncia de qualquer instabilidade qumica da substncia durante o teste e o mtodo utilizado,
toda a informao relevante para a interpretao dos resultados, especialmente no que diz respeito a
impurezas e estado fsico da substncia.
3.2. MTODO DO BALO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
os resultados do teste preliminar,
a especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
as determinaes analticas individuais e o valor mdio no caso de se determinar mais do que um valor
para cada recipiente,
o valor do pH de cada amostra,
a mdia dos valores para recipientes diferentes que tenham estado em conformidade,
a temperatura do teste,
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/61
o mtodo analtico utilizado,
evidncia de qualquer instabilidade qumica da substncia durante o teste e mtodo utilizado,
toda a informao relevante para a interpretao dos resultados, especialmente no que diz respeito a
impurezas e ao estado fsico da substncia.
4. REFERNCIAS
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use Determination of water
solubility of solids and liquids with low solubility Column elution method
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use Determination of water
solubility of solids and liquids with high solubility Flask method
L 142/62 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Apndice
Figura 1
Mtodo de eluio em coluna com bomba de recirculao
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/63
Figura 2
Microcoluna tipo
(Todas as dimenses esto em milmetros)
L 142/64 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Figura 3
Microcoluna tipo
(Todas as dimenses esto em milmetros)
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/65
Figura 4
Mtodo de eluio em coluna com reservatrio de nivelamento
L 142/66 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
A.8 COEFICIENTE DE PARTIO
1. MTODO
O mtodo do frasco agitado descrito baseia-se na norma de ensaio da OCDE (1).
1.1. INTRODUO
til possuir informaes preliminares sobre a frmula estrutural, a constante de dissociao, a solubilidade
em gua, hidrlise, solubilidade em n-octanol e tenso superficial, da substncia sujeita a este teste.
As medies devero ser efectuadas em substncias ionizveis apenas na sua forma no ionizada (cido livre ou
base livre) produzida pela utilizao de um tampo apropriado cujo pH possua um valor de pelo menos uma
unidade de pH abaixo (cido livre) ou acima (base livre) do valor pK.
Este mtodo de ensaio engloba dois procedimentos separados o mtodo do frasco agitado e a cromatografia
lquida de elevado rendimento (mais conhecida por HPLC ou High Performance Liquid Chromatography). O
primeiro mtodo aplica-se nos casos em que o valor log P
oa
(ver as definies mais adiante) se encontra no
intervalo entre 2 e 4 e o outro mtodo aplica-se nos casos em que aquele valor est compreendido entre 0 e
6. Antes de se executar qualquer dos procedimentos experimentais dever-se- obter primeiro uma estimativa
preliminar do coeficiente de partio.
O mtodo do frasco agitado aplica-se apenas a substncias essencialmente puras solveis em gua e em
n-octanol. No aplicvel aos materiais tensioactivos (para os quais dever ser obtido o valor calculado ou uma
estimativa com base nas solubilidades individuais em n-octanol e em gua).
O mtodo de HPLC no se aplica a bases e cidos fortes, a complexos de metais, a materiais tensioactivos ou a
substncias que reajam com o eluente. Para estes materiais dever ser obtido um valor calculado ou uma
estimativa, tomando como base as solubilidades individuais em n-octanol e em gua.
O mtodo de HPLC menos sensvel presena de impurezas do que o mtodo do frasco agitado. Contudo, em
alguns casos as impurezas podem tornar difcil a interpretao de resultados devido ao facto de se tornar
incerta a determinao dos picos. Para misturas que originem uma banda no resolvida devero ser
especificados os limites inferior e superior de log P.
1.2. DEFINIO E UNIDADES
Define-se o coeficiente de partio (P) como sendo a razo entre as concentraes de equilbrio (c
i
) de uma
substncia dissolvida num sistema de duas fases, constitudo por dois solventes claramente imiscveis. No caso
do n-octanol e da gua temos:
p
ow
=
c
n octanol
c
water
Em consequncia, o coeficiente de partio (P) o quociente entre duas concentraes e dado vulgarmente na
forma do seu logaritmo de base 10 (log P).
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Mtodo do frasco agitado
No necessrio utilizar substncias de referncia quando se est a investigar uma nova substncia. Essas
substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibrao do mtodo e para
proporcionar a comparao com resultados obtidos com outros mtodos.
Mtodo de HPLC
No sentido de se estabelecer uma correlao entre os dados de HPLC medidos para um determinado composto
com o seu valor P, torna-se necessrio estabelecer um grfico de calibrao de log P em funo dos dados
cromatogrficos utilizando pelo menos 6 pontos de referncia. deixado ao arbtrio do utilizador seleccionar
as substncias de referncia apropriadas. Sempre que possvel, pelo menos uma substncia de referncia dever
possuir um valor P
oa
superior, e outra um valor P
oa
inferior ao da substncia a testar. Para valores de log P
inferiores a 4, a calibrao pode basear-se nos dados obtidos pelo mtodo do frasco agitado. Para valores de log
P superiores a 4, a calibrao pode basear-se em valores calibrados e publicados em diversa literatura se esses
valores estiverem em conformidade com os valores calculados. Para se conseguir melhor preciso prefervel
escolher substncias de referncia cuja estrutura qumica esteja relacionada com a da substncia a testar.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/67
Existem disponveis listagens extensivas de valores de log P
oa
para muitos grupos de compostos qumicos (2)(3).
No caso dos dados sobre os coeficientes de partio dos compostos estruturalmente afins no se encontrarem
disponveis, pode-se utilizar ento uma calibrao mais geral estabelecida com outros compostos de referncia.
No apndice 2 apresenta-se uma listagem de substncias de referncia recomendadas e seus valores P
oa
.
1.4. PRINCPIO DO MTODO
1.4.1. Mtodo do frasco agitado
No sentido de se determinar um coeficiente de partio, torna-se necessrio conseguir o equilbrio entre todos
os componentes do sistema que actuam entre si e devem-se determinar as concentraes das substncias
dissolvidas nas duas fases. Um estudo publicado na literatura relativa a este assunto indica que possvel utilizar
diversas tcnicas diferentes para resoluo deste problema, isto , a mistura perfeita das duas fases seguindo-se a
sua separao, no sentido de se determinar a concentrao de equilbrio para a substncia que se pretende
examinar.
1.4.2. Mtodo de HPLC
Efectua-se o HPLC em colunas analticas carregadas com uma fase slida comercialmente disponvel contendo
hidrocarbonetos de cadeia longa (por exemplo C
8
, C
18
) quimicamente ligados slica. Os compostos qumicos
injectados nessa coluna movem-se atravs dela a velocidades diferentes devido aos diferentes graus de partio
entre a fase mvel e a fase estacionria do hidrocarboneto. As misturas de compostos qumicas so eludas por
ordem da sua hidrofobicidade, sendo eludos primeiro os compostos qumicos solveis em gua e depois os
compostos qumicos solveis em leo, proporcionalmente ao seu coeficiente de partio entre hidrocarboneto
e gua. Isto permite estabelecer uma relao entre o tempo de reteno numa tal coluna (fase reversa) e o
coeficiente de partio entre n-octanol/gua. Deduz-se o coeficiente de partio a partir do factor de capacidade
k, dado pela expresso:
k =
t
r
t
o
t
o
na qual t
r
= tempo de reteno da substncia a testar e t
0
= tempo mdio que uma molcula de solvente
necessita para passar atravs da coluna (tempo limite).
No so necessrios mtodos analticos quantitativos e apenas necessria a determinao dos tempos de
eluio.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
1.5.1. Repetitividade
Mtodo do frasco agitado
No sentido de se garantir a exactido do coeficiente de partio necessrio efectuar determinaes em
duplicado sob trs condies de ensaio diferentes, podendo consequentemente alterar a quantidade de
substncia especificada e tambm a proporo entre os volumes de solvente. Os valores determinados do
coeficiente de partio, expressos pelos seus logaritmos, devero estar compreendidos num intervalo limitado
por 0,3 unidades logartmicas.
Mtodo de HPLC
No sentido de se aumentar a confiana da medio devero ser efectuadas determinaes em duplicado. Os
valores de log P derivados das medies individuais devero estar dentro de um intervalo limitado por 0,1
unidades logartmicas.
1.5.2. Sensibilidade
Mtodo do frasco agitado
Determina-se o intervalo de medio do mtodo pelo limite de deteco do procedimento analtico. Isto dever
permitir a determinao de valores log P
oa
no intervalo compreendido entre 2 e 4 (ocasionalmente, quando
houver condies adequadas, este intervalo pode ser dilatado at valores de log P
oa
prximos de 5), quando a
concentrao do soluto em qualquer fase no for superior a 0,01 mol por litro.
L 142/68 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Mtodo de HPLC
O mtodo de HPLC permite estimar os coeficientes de partio em termos de log P
oa
no intervalo 0 a 6.
Normalmente o coeficiente de partio de um composto pode ser estimado a menos de 1 unidade
logartmica relativamente ao valor obtido pelo mtodo do frasco agitado. Existem correlaes tpicas que
possvel encontrar na literatura (4)(5)(6)(7)(8). Normalmente, pode-se conseguir uma preciso superior quando
as curvas de correlao se baseiam em compostos de referncia estruturalmente afins (9).
1.5.3. Especificidade
Mtodo do frasco agitado
A Lei de Partio de Nernst aplica-se apenas quando os parmetros temperatura, presso e pH so constantes
para solues diludas. Aplica-se estritamente a uma substncia pura dispersa entre dois solventes puros. Se
houver diversos solutos diferentes numa ou em ambas as fases simultaneamente, isto pode afectar os
resultados.
A dissociao ou a associao das molculas dissolvidas provoca desvios em relao Lei de Partio de Nernst.
Esses desvios so indicados pelo facto de o coeficiente de partio se tornar dependente da concentrao da
soluo.
Devido existncia de mltiplos estados de equilbrio, este mtodo no deve ser aplicado a compostos
ionizveis sem se aplicar uma correco. Deve-se tomar em considerao a utilizao de solues-tampo em
vez de gua para esses compostos; o valor do pH da soluo-tampo dever ser pelo menos uma unidade de pH
afastada do valor pKa da substncia e deve-se ter sempre presente a relevncia desse valor de pH para o
ambiente.
1.6. DESCRIO DO MTODO
1.6.1. Estimativa preliminar do coeficiente de partio
Efectua-se uma estimativa do coeficiente de partio utilizando preferencialmente um mtodo de clculo (ver
apndice 1) ou, se for apropriado, recorrendo razo entre solubilidades da substncia a testar nos solventes
puros (10).
1.6.2. Mtodo do frasco agitado
1.6.2.1. Preparao
n-octanol: a determinao do coeficiente de partio dever ser efectuada com um reagente de qualidade
analtica de elevada pureza.
gua: deve-se utilizar gua destilada ou bidestilada num aparelho de vidro ou de quartzo. Para os compostos
ionizveis dever-se- utilizar solues-tampo em vez de gua, se tal se justificar.
Nota:
No deve ser utilizada gua obtida directamente a partir de um permutador inico.
1.6.2.1.1. P r - s a t ur a o d os s ol v e nt e s
Antes de se determinar um coeficiente de partio as fases do sistema solvente so mutuamente saturadas por
agitao temperatura da experincia. Para se conseguir isto, prtica corrente agitar dois frascos grandes
contendo gua ou n-octanol de qualidade analtica, contendo cada um deles uma quantidade suficiente do
outro solvente, durante um perodo de 24 horas, num agitador mecnico, e deixando-os depois em repouso
durante um perodo de tempo suficiente para permitir a separao de fases e para se conseguir um estado de
saturao.
1.6.2.1.2. P r e pa r a o pa r a o e ns a i o
O volume total do sistema bifsico dever encher quase completamente o recipiente de ensaio. Isto auxiliar a
evitar as perdas de material por volatilizao. A razo volumtrica e as quantidades de substncia a utilizar so
fixadas pelos factores seguintes:
avaliao preliminar do coeficiente de partio (ver supra),
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/69
a quantidade mnima da substncia a testar necessria para o procedimento analtico, e
a limitao de uma concentrao mxima, em qualquer das fases, no valor de 0,01 mol por litro.
Efectuam-se trs testes. No primeiro utiliza-se a razo volumtrica calculada entre n-octanol e a gua; no
segundo divide-se essa razo por dois e no terceiro multiplica-se essa razo por dois (por exemplo, 1:1, 1:2,
2:1).
1.6.2.1.3. S ubs t nc i a a t e s t a r
Prepara-se uma soluo em n-octanol pr-saturado com gua. A concentrao desta soluo dever ser
determinada com exactido antes de se utilizar na determinao do coeficiente de partio. Esta soluo dever
ser guardada em condies que assegurem a sua estabilidade.
1.6.2.2. Condies de ensaio
A temperatura de ensaio dever ser mantida constante ( 1
o
C) e estar compreendida no intervalo entre 20 e
25
o
C.
1.6.2.3. Procedimento de medio
1.6.2.3.1. E s t a be l e c i me nt o d o e q ui l br i o d e pa r t i o
Para cada uma das condies de ensaio dever-se- preparar recipientes de ensaio em duplicado, contendo as
quantidades necessrias, medidas com exactido, dos dois solventes em conjunto com a quantidade necessria
da soluo referida.
Deve-se medir o volume das fases de n-octanol. Os recipientes de ensaio devero ser colocados num agitador
adequado ou em alternativa devero ser agitados manualmente. Quando se usa um tubo de centrifugao, o
mtodo recomendado consiste em rodar o tubo rapidamente 180
o
em torno do seu eixo transversal, de modo
que qualquer bolha de ar que esteja presa se movimente atravs das duas fases. A experincia demonstrou que
50 rotaes deste tipo so normalmente suficientes para se estabelecer o equilbrio de partio. Para melhor
garantia, recomenda-se a execuo de 100 rotaes em 5 minutos.
1.6.2.3.2. S e pa r a o d e f a s e s
Sempre que necessrio, no sentido de se efectuar a separao de fases, dever-se- efectuar a centrifugao da
mistura. Isto dever ser feito numa centrifugadora de laboratrio mantida temperatura ambiente ou, no caso
de se utilizar uma centrifugadora de temperatura no controlada, os tubos de centrifugao devero ser
mantidos, por razes de equilbrio, temperatura de ensaio durante pelo menos 1 hora antes da anlise.
1.6.2.4. Anlise
Para a determinao do coeficiente de partio necessrio determinar as concentraes da substncia a testar
em ambas as fases. Isto pode ser feito extraindo uma quantidade alquota de cada uma das duas fases a partir de
cada um dos tubos, de cada uma das sries de ensaio, procedendo depois sua anlise de acordo com o
procedimento escolhido. Deve-se calcular a quantidade total de substncia presente em ambas as fases e
efectuar-se- a comparao com a quantidade de substncia originalmente introduzida.
Dever ser extrada uma amostra da fase aquosa recorrendo a um procedimento que minimize o risco de
introduzir vestgios de n-octanol: pode-se utilizar uma seringa de vidro com uma agulha removvel para extrair
uma amostra da fase aquosa. A seringa dever estar, de incio, parcialmente cheia com ar. O ar dever ser
expelido suavemente enquanto se introduz a agulha atravs da camada de n-octanol. Retira-se com a seringa
um volume adequado de fase aquosa. Remove-se a seringa rapidamente da soluo e separa-se a agulha. O
contedo da seringa pode ser utilizado depois como amostra aquosa. A concentrao das duas fases separadas
dever ser determinada preferencialmente recorrendo a um mtodo especfico da substncia. Como exemplos
de mtodos analticos considerados apropriados faz-se referncia aos seguintes:
mtodos fotomtricos,
cromatografia gasosa,
cromatografia lquida de elevado rendimento (HPLC).
L 142/70 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.6.3. Mtodo de HPLC
1.6.3.1. Preparao
Aparelho
necessrio um cromatgrafo lquido equipado com uma bomba de pulsao livre e um dispositivo de
deteco adequado. Recomenda-se a utilizao de uma vlvula de injeco com ciclos de injeco. A presena
de grupos polares na fase estacionria pode prejudicar gravemente os resultados da coluna de HPLC. Em
consequncia, as fases estacionrias devero possuir uma percentagem mnima de grupos polares (11). Podem-
-se utilizar colunas pr-carregadas ou cargas de fase reversa de micropartculas disponveis comercialmente.
Pode-se interpor uma coluna de proteco entre o sistema de injeco e a coluna analtica.
Fase mvel
Utiliza-se metanol e gua de qualidade apropriada para HPLC, para a preparao do solvente de eluio, o qual
desgaseificado antes da utilizao. Deve-se utilizar uma eluio isocrtica. Dever-se- utilizar propores
metanol/gua com um teor mnimo de gua de 25 %. Normalmente, satisfatria a proporo de 3:1 (v/v) para
a mistura de metanol/gua para se efectuar a eluio de compostos de log P 6 ao fim de uma hora para um
dbito de 1 mililitro por minuto. Para os compostos com um valor log P elevado pode ser necessrio reduzir o
tempo de eluio (e tambm para os compostos de referncia) diminuindo a polaridade da fase mvel ou o
comprimento da coluna.
As substncias com muito fraca solubilidade em n-octanol tendem a originar valores de log P
oa
anormalmente
baixos quando se utiliza o mtodo de HPLC; os picos desses compostos acompanham frequentemente a frente
do solvente. Isto deve-se provavelmente ao facto de o processo de partio ser muito lento no se atingindo o
equilbrio no tempo normalmente necessrio para uma separao por HPLC. Consequentemente, a diminuio
do dbito e/ou a diminuio da proporo metanol/gua pode ser eficaz para se atingir um valor de confiana.
Os compostos de ensaio e de referncia devero ser solveis na fase mvel em concentraes suficientes para
permitirem as suas deteces. Apenas em casos excepcionais ser aceitvel adicionar aditivos mistura de
metanol/gua, uma vez que esses aditivos iro modificar as propriedades da coluna. Para as cromatografias com
aditivos obrigatrio utilizar uma coluna separada do mesmo tipo. No caso de a mistura metanol/gua no ser
apropriada possvel utilizar outras misturas de solvente orgnico/gua, por exemplo, etanol/gua ou
acetonitrilo/gua.
O pH do eluente constitui um parmetro crtico para os compostos ionizveis. Aquele valor dever estar
compreendido no intervalo de valores de pH de funcionamento da coluna, sendo esse intervalo normalmente
compreendido entre 2 e 8. Recomenda-se a utilizao de uma mistura tampo. necessrio tomar precaues
para evitar a precipitao de sal e a deteriorao da coluna cuja ocorrncia possvel com algumas misturas de
fase orgnica/tampo. As medies por HPLC com fases estacionrias base de slica, para valores de pH
superiores a 8, no so aconselhveis uma vez que a utilizao de uma fase mvel alcalina pode provocar a
deteriorao rpida do funcionamento da coluna.
Solutos
Os compostos de referncia devero possuir a maior pureza possvel. Os compostos destinados a serem
utilizados para efeitos de ensaio ou calibrao so dissolvidos na fase mvel, se possvel.
Condies de ensaio
Durante as medies a temperatura no dever variar 2 K.
1.6.3.2. Medio
Clculo do tempo limite t
o
O tempo limite t
o
pode ser determinado utilizando em alternativa uma srie homloga (por exemplo, n-alquil-
-metil-cetonas) ou compostos orgnicos no retidos (por exemplo, tioureia ou formamida). Para se calcular o
tempo limite t
o
utilizando uma srie homloga, injecta-se um conjunto de pelo menos 7 componentes de uma
srie homloga e procede-se determinao dos respectivos tempos de reteno. Elabora-se um grfico dos
tempos de reteno t
r(nc + 1)
em funo de t
r(nc)
e procede-se determinao da ordenada a na origem e do declive
b, atravs da equao de regresso:
t
r(nc + 1)
= a + b t
r(nc)
(n
c
= nmero de tomos de carbono). O tempo limite t
o
dado pela equao:
t
o
= a/(1 b)
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/71
Grfico de calibrao
O passo seguinte consiste em construir a curva de correlao de log k em funo de log P para os compostos de
referncia apropriados. Na prtica, efectua-se a injeco simultnea, de um conjunto compreendido entre 5 e
10 compostos de referncia padro cujo valor log P seja prximo do valor esperado e procede-se
determinao dos tempos de reteno, utilizando preferencialmente um integrador de registo ligado ao sistema
de deteco. Procede-se ao clculo dos logaritmos correspondentes dos factores de capacidade, log k, e traa-se
uma curva em funo do valor log P determinado pelo mtodo do frasco agitado. Efectua-se a calibrao a
intervalos regulares, pelo menos uma vez diariamente, de modo a poder fazer a compensao das possveis
variaes na evoluo da coluna.
Determinao do factor de capacidade da substncia de ensaio
Injecta-se a substncia de ensaio numa quantidade da fase mvel to pequena quanto possvel. Determina-se o
tempo de reteno (em duplicado), permitindo o clculo do factor k de capacidade. A partir do grfico de
correlao dos compostos de referncia, pode-se fazer uma interpolao para determinao do coeficiente de
partio da substncia de ensaio. Para coeficientes de partio muito baixos ou muito elevados necessria a
extrapolao. Nesses casos particulares necessrio tomar precaues relativamente aos limites de confiana da
curva de regresso.
2. RESULTADOS
Mtodo do frasco agitado
Pode-se testar a fiabilidade dos valores de P determinados efectuando a comparao das mdias das
determinaes em duplicado com a mdia geral.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
no caso de os mtodos no serem aplicveis (por exemplo, material tensioactivo), apresentar-se- um
valor calculado ou uma estimativa tomando como base as solubilidades individuais em n-octanol e em
gua,
todas as informaes e notas relevantes para a interpretao dos resultados, especialmente no que diz
respeito a impurezas e ao estado fsico da substncia.
Para o caso do mtodo do frasco agitado:
o resultado da estimativa preliminar, se existir,
temperatura da determinao,
dados relativos aos procedimentos analticos utilizados na determinao das concentraes,
tempo e velocidade de centrifugao, se for caso disso,
concentraes medidas de ambas as fases para cada determinao (significa isto que devero ser descritas
12 concentraes na totalidade),
o peso da substncia de ensaio, o volume de cada fase utilizada em cada recipiente de ensaio e a
quantidade total calculada de substncia de ensaio presente em cada fase aps se atingir o equilbrio,
para cada conjunto de condies de ensaio devero ser indicados os valores calculados do coeficiente de
partio (P) e o valor mdio, devendo-se indicar igualmente a mdia para todas as determinaes. No
caso de haver indcios de dependncia da concentrao relativamente ao coeficiente de partio, esse
facto dever constar do relatrio,
deve-se referir o desvio-padro dos valores P individuais relativamente sua mdia,
L 142/72 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
o valor mdio de P correspondente a todas as determinaes deve ser expresso tambm na forma
logartmica (base 10),
o valor terico P
oa
calculado no caso de se ter feito a determinao desse valor ou quando o valor medido
for > 10
4
,
os valores de pH da gua utilizada e da fase aquosa durante a experincia,
no caso de se ter recorrido utilizao de tampes, o relatrio dever conter justificao da utilizao
desses tampes em vez de gua, a sua composio, a sua concentrao e os valores de pH e tambm os
valores de pH da fase aquosa antes e aps a experincia.
Para o caso do mtodo de HPLC:
o resultado da estimativa preliminar, se existir,
substncias de ensaio e de referncia e sua pureza,
intervalo de temperaturas das determinaes,
os valores de pH para os quais foram feitas as determinaes,
pormenores sobre a coluna analtica e sobre a coluna de proteco, fase mvel e meios de deteco,
dados de reteno e valores de log P encontrados na literatura para os compostos de referncia utilizados
na calibrao,
pormenores sobre a linha de regresso ajustada (log k em funo de log P),
dados de reteno mdia e valor de log P interpolado para o composto de ensaio,
descrio do equipamento e condies de funcionamento,
perfil de eluio,
quantidades das substncias de ensaio e de referncia introduzidas na coluna,
tempo limite e mtodo para a sua medio.
4. REFERNCIAS
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John
Wiley, New York, 1979.
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman,
A.J. Leo, dir.) Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College,
Claremont, California 91711.
(4) L. Renberg, G. Sundstrm and K. Sundh-Nygrd, Chemosphere, 1980, vol. 80, p. 683.
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, p. 219 (1981).
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73.
(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/73
(8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 675.
(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, p. 787.
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl),
Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band 1/1,
p. 223-339.
(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, p. 479.
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmentai Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use Determination of partition
coefficient Flask shaking method.
(15) C.V. Eadsforth and P.Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459.
(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207.
(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci Technol., 1974, vol. 8, p. 1113.
(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, p. 382.
(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivitt von Wirkstoffen, Verlag
Chemie, Weinheim, New York, 1979.
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984.
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978.
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor, J. Med. Chem., 1976, vol. 19, p. 615.
L 142/74 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Apndice 1
Mtodos de clculo/estimao
INTRODUO
Na publicao Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) encontra-se uma introduo geral aos mtodos de
clculo, dados e exemplos.
possvel utilizar os valores calculados de P
oa
:
para se decidir qual dos mtodos experimentais apropriado (gama de utilizao para o frasco agitado: log P
oa
:
2 a 4, gama de HPLC: log P
oa
: 0 a 6),
para seleco das condies de ensaio apropriadas (por exemplo, substncias de referncia para os procedimentos de
HPLC, relao volumtrica n-octanol/gua para o mtodo do frasco agitado),
como verificao interna laboratorial sobre possveis erros experimentais,
para se obter um valor estimado de P
oa
no caso em que os mtodos experimentais no podem ser aplicados por razes
tcnicas.
MTODO DE ESTIMAO
Estimativa preliminar do coeficiente de partio
Pode-se estimar o valor do coeficiente de partio conhecendo as solubilidades da substncia de ensaio em solventes puros,
utilizando a equao:
P
estimado =
saturao c
n octanol
saturao c
gua
MTODOS DE CLCULO
Princpio dos mtodos de clculo
Todos os mtodos de clculo se baseiam na fragmentao formal da molcula em substruturas adequadas para as quais
sejam conhecidos valores dos fragmentos de log P
oa
. Calcula-se depois o valor log P
oa
da molcula inteira como sendo a
soma dos correspondentes valores dos seus fragmentos mais a soma dos termos de correco, para as interaces
intramoleculares.
Existem disponveis listas de constantes dos fragmentos e dos termos de correlao (b)(c)(d)(e). Algumas so actualizadas
regularmente (b).
Critrios de qualidade
De um modo geral, a fiabilidade do mtodo de clculo diminui com a complexidade crescente do composto submetido a
estudo. No caso de molculas simples com baixo peso molecular e com um ou dois grupos funcionais admite-se um desvio
compreendido entre 0,1 e 0,3 unidades de log P
oa
entre os resultados obtidos com diferentes mtodos de fragmentao e o
valor medido. No caso das molculas mais complexas a margem de erro pode ser superior. Isto depender da fiabilidade e da
disponibilidade de constantes dos fragmentos e tambm da capacidade para identificar interaces intramoleculares (por
exemplo, ligaes de hidrognio) e para utilizar correctamente os termos de correco (este problema pode ser minimizado
utilizando a aplicao informtica CLOGP-3) (b). No caso dos compostos ionizantes importante tomar em considerao
correctamente a carga e o grau de ionisao.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/75
Procedimentos de clculo
Mtodo de Hansch
A constante do substituinte hidrofbico original, , introduzida por Fujita et al. (f), define-se do modo seguinte:

x
= log P
oa
(PhX) log P
oa
(PhH)
em que P
oa
(PhX) representa o coeficiente de partio de um derivado aromtico e P
oa
(PhH) representa o coeficiente de
partio do composto original
(por exemplo:
Cl
= log P
oa
(C
6
H
5
Cl) log P
oa
(C
6
H
6
) = 2,84 2,13 = 0,71).
De acordo com esta definio, o mtodo aplicvel essencialmente nos casos de substituio aromtica. Os valores para
um grande nmero de substituintes encontram-se em tabelas (b)(c)(d) e so utilizados para o clculo dos valores log P
oa
de
substruturas ou molculas aromticas.
Mtodo de Rekker
De acordo com Rekker (g) o valor de log P
oa
calcula-se do modo seguinte:
log P
oa
=
i
a
i
f
i

j
termos de interaco
em que f
i
representa as diferentes constantes dos fragmentos moleculares e a
i
representa a frequncia da sua ocorrncia na
molcula sujeita a investigao. Os termos de correco podem ser expressos na forma de um integral mltiplo de uma
nica constante C
m
(designada por constante mgica). As constantes dos fragmentos f
i
e C
m
foram determinadas a partir de
uma listagem de 1 054 valores experimentais de P
oa
(825 compostos) utilizando anlise de regresso mltipla (c)(h). A
determinao dos termos de interaco efectua-se de acordo com regras consagradas descritas na literatura (e)(h)(i).
Mtodo de Hansch-Leo
De acordo com Hansch e Leo (c) calcula-se o valor de log P
oa
de acordo com a equao:
log P
oa
=
i
a
i
f
i

j
b
j
F
j
em que f
i
representa as diferentes constantes dos fragmentos moleculares, F
j
representa os termos de correco e a
i
e b
j
representam as correspondentes frequncias de ocorrncia. Por aproximaes sucessivas determinou-se, a partir dos valores
experimentais de P
oa
, uma listagem de valores de fragmentos atmicos e de grupos e uma listagem dos termos de correco
F
j
(designados factores). Os termos de correco foram ordenados segundo diversas classes diferentes (a)(c). relativamente
complicado e moroso levar em considerao todas as regras e termos de correco. Existem disponveis diversas aplicaes
informticas (b).
Mtodo combinado
O clculo dos valores log P
oa
de molculas complexas pode ser consideravelmente aperfeioado, se a molcula for cindida
em substruturas para as quais se encontrem disponveis valores fiveis de log P
oa
, tanto a partir de tabelas (b)(c) como a
partir das medies do prprio investigador. Esses fragmentos (por exemplo, heterociclos, antraquinona, azobenzeno)
podem ser combinados depois com os valores y segundo Hansch ou com as constantes dos fragmentos segundo Rekker ou
Leo.
Observaes
i) Os mtodos de clculo apenas podem ser aplicados a compostos parcial ou totalmente ionizados no caso de ser
possvel tomar em considerao os necessrios factores de correco;
ii) No caso de se admitir a existncia de ligaes intramoleculares entre tomos de hidrognio necessrio adicionar (a)
os correspondentes termos de correco (aproximadamente + 0,6 a + 1,0 unidades log P
oa
). As indicaes para a
presena dessas ligaes podem ser obtidas a partir de modelos espaciais ou a partir de dados espectroscpicos da
molcula;
iii) No caso de serem possveis diversas formas tautomricas, deve-se utilizar a forma mais provvel como base de clculo;
L 142/76 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
iv) As revises das listagens de constantes de fragmentos devero ser acompanhadas cuidadosamente.
Relatrio
No caso de se utilizar mtodos de clculo/estimao o relatrio do ensaio dever, se possvel, conter a informao seguinte:
descrio da substncia (mistura, impurezas, etc.),
indicao de quaisquer possveis ligaes intramoleculares entre tomos de hidrognio, dissociao, carga e quaisquer
outros efeitos extraordinrios (por exemplo, tautomerismo),
descrio do mtodo de clculo,
identificao ou fonte da base de dados,
peculiaridades na escolha dos fragmentos,
documentao compreensiva relativa aos clculos.
BIBLIOGRAFIA
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill,
New York, 1983.
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem.
Software (Program CLOGP-3).
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York,
1979.
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 1979, vol. 14, p. 479.
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, p. 5175.
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmentai Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459.
(i) R.A. Scherrer, ACS American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/77
Apndice 2
Substncias de referncia recomendadas para o mtodo de HPLC
Substncia de referncia 2-butanona log P
oa
pKa
1 2-butanona 0,3
2 4-acetilpiridina 0,5
3 anilina 0,9
4 acetanilida 1,0
5 lcool benzlico 1,1
6 p-metoxifenol 1,3 pKa = 10,26
7 cido fenoxi-actico 1,4 pKa = 3,12
8 fenol 1,5 pKa = 9,92
9 2,4-dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96
10 benzonitrilo 1,6
11 fenilacetonitrilo 1,6
12 lcool 4-metilbenzlico 1,6
13 acetofenona 1,7
14 2-nitrofenol 1,8 pKa = 7,17
15 cido 3-nitrobenzico 1,8 pKa = 3,47
16 4-cloranilina 1,8 pKa = 4,15
17 nitrobenzeno 1,9
18 lcool cinmico 1,9
19 cido benzico 1,9 pKa = 4,19
20 p-cresol 1,9 pKa = 10,17
21 cido cinmico 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44
trans
22 anisol 2,1
23 benzoato de metilo 2,1
24 benzeno 2,1
25 cido 3-metilbenzico 2,4 pKa = 4,27
26 4-clorofenol 2,4 pKa = 9,1
27 tricloroetileno 2,4
28 atrazina 2,6
29 benzoato de etilo 2,6
30 2,6-diclorobenzonitrilo 2,6
31 cido 3-clorobenzico 2,7 pKa = 3,82
32 tolueno 2,7
33 1-naftol 2,7 pKa = 9,34
34 2,3-dicloroanilina 2,8
35 clorobenzeno 2,8
36 ter alil-fenlico 2,9
37 bromobenzeno 3,0
38 etilbenzeno 3,2
39 benzofenona 3,2
40 4-fenilfenol 3,2 pKa = 9,54
41 timol 3,3
L 142/78 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Substncia de referncia 2-butanona log P
oa
pKa
42 1,4-diclorobenzeno 3,4
43 difenilamina 3,4 pKa = 0,79
44 naftaleno 3,6
45 benzoato de fenilo 3,6
46 isopropilbenzeno 3,7
47 2,4,6-triclorofenol 3,7 pKa = 6
48 bifenilo 4,0
49 benzoato de benzilo 4,0
50 2,4-dinitro-6-sec-butil-fenol 4,1
51 1,2,4-tricloro-benzeno 4,2
52 cido dodecanico 4,2
53 ter difenlico 4,2
54 n-butil-benzeno 4,5
55 fenantreno 4,5
56 fluoranteno 4,7
57 dibenzilo 4,8
58 2,6-difenilpiridina 4,9
59 trifenilamina 5,7
60 DDT 6,2
Outras substncias de referncia de baixo valor log P
oa
1 cido nicotnico - 0,07
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/79
A.9. PONTO DE INFLAMAO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
til possuir informao preliminar sobre a inflamabilidade da substncia antes de se efectuar este ensaio. O
procedimento de ensaio aplica-se a substncias lquidas cujos vapores possam ser inflamados por fontes de
ignio. Os mtodos de ensaio enumerados neste texto so apenas fiveis para os intervalos de pontos de
inflamao especificados nos mtodos individuais.
Deve tomar-se em considerao a possibilidade de ocorrncia de reaces qumicas entre a substncia e o
suporte da amostra quando se selecciona o mtodo a utilizar.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
O ponto de inflamao a menor temperatura, corrigida para a presso de 101,325 kPa, qual um lquido
liberta vapores, sob as condies definidas no mtodo de ensaio, numa quantidade tal que se produz no
recipiente de ensaio uma mistura ar/vapor inflamvel.
Unidades:
o
C
t = T 273,15
(t em
o
C e T em K)
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
No necessrio utilizar substncias de referncia quando se est a investigar uma nova substncia. Essas
substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, as caractersticas de execuo do mtodo e
para proporcionar a comparao com resultados obtidos com outros mtodos.
1.4. PRINCPIO DO MTODO
Coloca-se a substncia no recipiente de ensaio e aquece-se ou arrefece-se at temperatura de ensaio de acordo
com o procedimento descrito no mtodo de ensaio individual. Efectuam-se diversas tentativas para provocar a
ignio no sentido de se determinar se a amostra ou no inflamvel temperatura de ensaio.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
1.5.1. Repetitividade
A repetitividade varia de acordo com o intervalo de pontos de inflamao e com o mtodo de ensaio utilizado;
mximo 2
o
C.
1.5.2. Sensibilidade
A sensibilidade depende do mtodo de ensaio utilizado.
1.5.3. Especificidade
A especificidade de alguns mtodos de ensaio est limitada a certos intervalos de pontos de inflamao e sujeita
a dados associados substncia (por exemplo, viscosidade elevada).
1.6. DESCRIO DO MTODO
1.6.1. Preparaes
Coloca-se uma amostra da substncia de ensaio num aparelho de teste de acordo com 1.6.3.1. e/ou 1.6.3.2.
Por razes de segurana recomenda-se que no caso das substncias energticas ou txicas se pratique um
mtodo que utilize uma pequena quantidade de amostra, cerca de 2 cm
3
.
L 142/80 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.6.2. Condies de ensaio
Tanto quanto for possvel por razes de segurana, o aparelho dever ser colocado numa posio livre de
correntes de ar.
1.6.3. Realizao do ensaio
1.6.3.1. Mtodo de equilbrio
Ver ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.
1.6.3.2. Mtodo de no equilbrio
Aparelho de Abel:
Ver BS 2000 parte 170, NF M07-011, NF T66-009.
Aparelho de Abel-Pensky:
Ver EN 57, DIN 51755 parte 1 (para temperaturas entre 5 e 65
o
C), DIN 51755 parte 2 (para temperaturas
inferiores a 5
o
C), NF M07-036.
Aparelho de Tag:
Ver ASTM D 56.
Aparelho de Pensky-Martens:
Ver ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.
Observaes:
No caso de se verificar que o ponto de inflamao, determinado por um mtodo de no equilbrio em 1.6.3.2.,
possui os valores 0 2
o
C, 21 2
o
C ou 55 2
o
C, deve fazer-se a sua confirmao recorrendo a um mtodo
de equilbrio que utilize o mesmo aparelho.
Apenas os mtodos que possam proporcionar os valores de temperatura do ponto de inflamao podem ser
utilizados para uma notificao.
Para se determinar o ponto de inflamao de lquidos viscosos (tintas, gomas e anlogos) contendo solventes,
apenas se pode utilizar aparelhos e mtodos de ensaio adequados para a determinao dos pontos de
inflamao de lquidos viscosos.
Ver ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 parte 1.
2. RESULTADOS
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
a especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
deve especificar-se o mtodo utilizado e bem assim quaisquer desvios possveis,
os resultados e quaisquer observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
Nenhuma.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/81
A.10. INFLAMABILIDADE (SLIDOS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Considera-se til possuir informaes preliminares sobre as propriedades potencialmente explosivas da
substncia antes de se efectuar este ensaio.
Este ensaio apenas dever ser aplicado a substncias pulverulentas, granuladas ou pastosas.
No sentido de no se inclurem todas as substncias que podem ser inflamadas, mas apenas aquelas que ardem
rapidamente ou aquelas cuja combusto de alguma forma especialmente perigosa, apenas as substncias cuja
velocidade de combusto excede um determinado valor limite so consideradas altamente inflamveis.
Pode ser especialmente perigosa qualquer situao em que a incandescncia se propague atravs de um metal
em p, devido s dificuldades em extinguir o fogo. Os ps de metais devero ser considerados altamente
inflamveis se permitirem a propagao da incandescncia atravs da sua massa, num intervalo de tempo
especfico.
1.2. DEFINIO E UNIDADES
O tempo de combusto exprime-se em segundos.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
No especificadas.
1.4. PRINCPIO DO MTODO
Dispe-se a substncia numa fita inquebrvel ou num rastilho de p com aproximadamente 250 mm de
comprimento e efectua-se um ensaio preliminar para se determinar se ao provocar-se a ignio com uma
chama de gs existe propagao por combusto rpida ou por combusto lenta. Se ocorrer a propagao da
combusto ao longo de 200 mm do rastilho no decurso de um intervalo especfico de tempo, efectua-se
seguidamente o programa de ensaio total para se determinar a velocidade de combusto.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
No especificados.
1.6. DESCRIO DO MTODO
1.6.1. Ensaio preliminar
Dispe-se a substncia numa fila inquebrvel ou num rastilho de p com aproximadamente 250 mm de
comprimento por 20 mm de largura e por 10 mm de altura, sobre uma placa no combustvel, no porosa e de
fraca condutividade trmica. Aplica-se a uma extremidade do rastilho de p uma chama de um queimador de
gs (dimetro mnimo de 5 mm) at o p iniciar a ignio ou durante um perodo mximo de 2 minutos
(5 minutos para ps de metais ou de ligas metlicas). Deve verificar-se se a combusto se propaga ao longo de
200 mm do rastilho no perodo de tempo do ensaio correspondente a 4 minutos (ou 40 minutos para os ps
de metais). No caso de a substncia no se inflamar e no houver propagao de combusto, quer por
combusto viva, quer por combusto lenta, ao longo de 200 mm do rastilho de p no perodo de ensaio
correspondente a 4 minutos (ou 40 minutos), ento a substncia no dever ser considerada altamente
inflamvel e no ser necessrio mais qualquer ensaio. Se a substncia propagar a combusto ao longo de
200 mm do rastilho de p em menos de 4 minutos ou em menos de 40 minutos no caso dos ps de metais,
deve dar-se continuidade ao procedimento a seguir descrito (ponto 1.6.2 e seguintes).
1.6.2. Ensaio da velocidade de combusto
1.6.2.1. Preparao
Enche-se livremente com as substncias pulverulentas ou granuladas um molde de 250 mm de comprimento
com uma seco transversal triangular cuja altura interna de 10 mm e cuja largura de 20 mm. De ambos os
lados do molde, segundo uma direco longitudinal, faz-se a montagem de duas placas metlicas que
constituem limitaes laterais e as quais se projectam 2 mm para alm da aresta superior da seco recta
triangular (ver figura). Depois deixa-se cair o molde trs vezes de uma altura de 2 cm sobre uma superfcie
slida. Se necessrio completa-se depois o enchimento do molde. Efectua-se depois a remoo das limitaes
L 142/82 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
laterais e retira-se o excesso de substncia. Na parte superior do molde coloca-se uma placa no combustvel,
no porosa e de baixa condutividade trmica, inverte-se o aparelho e remove-se o molde.
As substncias pastosas so dispostas sobre uma placa no combustvel, no porosa e de baixa condutividade
trmica na forma de um cordo de 250 mm de comprimento possuindo uma seco transversal de
aproximadamente 1 cm
2
.
1.6.2.2. Condies de ensaio
No caso de se tratar de uma substncia sensvel humidade o ensaio dever ser efectuado to rapidamente
quanto possvel aps a sua remoo do recipiente.
1.6.2.3. Realizao do ensaio
Coloca-se a pilha numa zona de um sistema de exausto de fumos.
A velocidade do ar dever ser suficiente para evitar que os fumos escapem para o interior do laboratrio e no
dever variar durante o ensaio. Em torno do aparelho dever ser instalada uma blindagem em forma de
chamin.
Para iniciar a ignio da pilha numa das suas extremidades utiliza-se uma chama de um queimador de gs
(dimetro mnimo de 5 mm). Depois de a pilha ter ardido numa extenso de 80 mm, mede-se a velocidade de
combusto nos 100 mm seguintes.
Efectua-se o ensaio seis vezes, utilizando-se de cada vez uma placa fria limpa, a no ser que se observe um
resultado positivo mais cedo.
2. RESULTADOS
O tempo de combusto determinado no ensaio preliminar (1.6.1.) e o tempo mais curto de combusto
observado nos seis ensaios (1.6.2.3.) so relevantes para a avaliao.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
uma descrio da substncia que se pretende ensaiar, o seu estado fsico incluindo o teor em humidade,
os resultados do ensaio preliminar e do ensaio da velocidade de combusto, se tiverem sido efectuados,
todas as observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados.
3.2. INTERPRETAO DOS RESULTADOS
As substncias pulverulentas, granuladas ou pastosas so consideradas altamente inflamveis no caso de o
tempo de combusto em quaisquer ensaios efectuados de acordo com o procedimento de ensaio descrito em
1.6.2. ser inferior a 45 segundos. Os ps de metais ou de ligas metlicas so considerados altamente
inflamveis no caso de poderem ser inflamados e de a chama ou a zona de reaco se propagar a toda a
amostra em 10 minutos ou menos.
4. REFERNCIAS
(1) NF T 20-042 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/83
Apndice
Figura
Molde e acessrios para a preparao da pilha
(Todas as dimenses esto em milmetros)
L 142/84 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
A.11. INFLAMABILIDADE (GASES)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Este mtodo permite determinar se os gases misturados com ar temperatura ambiente (cerca de 20
o
C) e
presso atmosfrica so inflamveis e, em caso afirmativo, qual o intervalo de concentraes. As misturas de
concentraes crescentes do gs com ar so expostas a uma fasca elctrica e observa-se a eventual ocorrncia
de ignio.
1.2. DEFINIO E UNIDADES
O intervalo de inflamabilidade o intervalo de concentraes entre os limites inferior e superior de exploso.
Os limites inferior e superior de exploso so os limites de concentrao do gs inflamvel misturado com ar
para cujos valores no ocorre a propagao da chama.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
No especificadas.
1.4. PRINCPIO DO MTODO
Aumenta-se gradualmente a concentrao do gs em ar e expe-se a mistura escalonadamente aco de uma
fasca elctrica.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
No especificados.
1.6. DESCRIO DO MTODO
1.6.1. Aparelho
O recipiente de ensaio um cilindro de vidro colocado em posio vertical, possuindo um dimetro interno
mnimo de 50 mm e uma altura mnima de 300 mm. Os elctrodos de ignio encontram-se separados por
uma distncia de 3 a 5 mm e esto colocados 60 mm acima do fundo do cilindro. O cilindro possui uma
abertura para a libertao de presso. O aparelho deve ser protegido por uma blindagem para minimizar
quaisquer danos provocados pela exploso.
Como fonte de ignio utiliza-se uma fasca de induo com a durao de 0,5 segundo, que gerada por um
transformador de alta tenso com uma tenso de sada compreendida entre 10 e 15 kV (potncia mxima de
entrada da ordem de 300 W). Na referncia (2) encontra-se descrito um exemplo de um aparelho adequado.
1.6.2. Condies de ensaio
O ensaio deve ser efectuado temperatura ambiente (cerca de 20
o
C).
1.6.3. Realizao do ensaio
Utilizando bombas doseadoras introduz-se no cilindro de vidro uma concentrao conhecida de gs em ar.
Provoca-se uma fasca na mistura e verifica-se se ocorre ou no a existncia de uma chama que se separa da
fonte de ignio e se propaga independentemente. Faz-se variar a concentrao do gs por escales de 1 % em
volume at que haja ocorrncia de ignio conforme anteriormente descrito.
No caso de a estrutura qumica do gs indicar que poder ser eventualmente no inflamvel e de se poder
calcular a composio da mistura estequiomtrica com ar, apenas ser necessrio ensaiar em escales de 1 %
misturas compreendidas no intervalo entre 10 % menos do que a composio estequiomtrica e 10 % mais do
que essa composio.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/85
2. RESULTADOS
A ocorrncia de propagao da chama a nica informao relevante para a determinao desta propriedade.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
a especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
uma descrio, com dimenses, do aparelho utilizado,
a temperatura a que se efectuou o ensaio,
as concentraes de ensaio e os resultados obtidos,
o resultado do ensaio: gs no inflamvel ou gs altamente inflamvel,
no caso de se ter concludo que o gs no inflamvel, dever especificar-se ento o intervalo de
concentraes no qual foi ensaiado em escales de 1 %,
toda a informao e observaes relevantes para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) NF T 20-041 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of
gases.
(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H.Schacke. Entwicklung einer
Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol. 56, 2, p. 126-
-127.
L 142/86 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
A.12. INFLAMABILIDADE (CONTACTO COM GUA)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Este mtodo de ensaio pode ser utilizado para se determinar se a reaco de uma substncia com gua ou com
ar hmido origina o desenvolvimento de quantidades perigosas de um gs ou de gases que possam ser
altamente inflamveis.
O mtodo de ensaio pode ser aplicado tanto a substncias slidas como a substncias lquidas. Este mtodo no
aplicvel a substncias cuja ignio seja espontnea quando em contacto com o ar.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
Altamente inflamvel: substncias que em contacto com gua ou com ar hmido libertam gases altamente
inflamveis em quantidades perigosas numa proporo mnima de 1 litro/kg por hora.
1.3. PRINCPIO DO MTODO
Ensaia-se a substncia de acordo com os passos sequenciais adiante descritos: se ocorrer ignio em qualquer
desses passos no necessrio continuar o ensaio. No caso de se saber j que a substncia no reage
violentamente com a gua, prosseguir com o passo 4 (1.3.4.).
1.3.1. Passo 1
Coloca-se a substncia de ensaio numa tina contendo gua destilada temperatura de 20
o
C e verifica-se se
ocorre ou no o incio da combusto do gs libertado.
1.3.2. Passo 2
Coloca-se a substncia de ensaio sobre uma folha de papel de filtro flutuando sobre a superfcie da gua
destilada contida num prato, temperatura de 20
o
C, e observa-se se ocorre ou no o incio da combusto do
gs libertado. O papel de filtro destina-se apenas a manter a substncia num determinado local para aumentar
as probabilidades de ocorrncia de ignio.
1.3.3. Passo 3
Com a substncia de ensaio prepara-se uma pilha com aproximadamente 2 cm de altura e 3 cm de dimetro.
Verte-se nessa pilha algumas gotas de gua e observa-se se h ou no ocorrncia de incio de combusto do gs
libertado.
1.3.4. Passo 4
Mistura-se a substncia a ensaiar com gua destilada temperatura de 20
o
C e mede-se a velocidade de
libertao de gs durante um perodo de sete horas, em intervalos de uma hora. Se essa taxa de libertao de gs
for errtica ou no caso de ser crescente decorridas as sete horas, dever prolongar-se o tempo de medio at ao
mximo de cinco dias. O ensaio pode ser interrompido se em qualquer momento essa taxa exceder 1 litro/kg
por hora.
1.4. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
No especificadas.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
No especificados.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/87
1.6. DESCRIO DOS MTODOS
1.6.1. Passo 1
1.6.1.1. Condies de ensaio
Efectua-se o ensaio temperatura ambiente (cerca de 20
o
C).
1.6.1.2. Realizao do ensaio
Deve-se colocar uma pequena quantidade (aproximadamente com 2 mm de dimetro) da substncia de ensaio
numa tina contendo gua destilada. Deve-se anotar (i) qualquer eventual libertao de gs e (ii) a eventual
ocorrncia de ignio do gs. No caso de ocorrer ignio do gs no necessrio continuar o ensaio da
substncia uma vez que esta considerada perigosa.
1.6.2. Passo 2
1.6.2.1. Aparelho
Utiliza-se um papel de filtro flutuando sobre a superfcie de gua destilada contida em qualquer recipiente
adequado, por exemplo, um prato de evaporao com o dimetro de 100 mm.
1.6.2.2. Condies de ensaio
Efectua-se o ensaio temperatura ambiente (cerca de 20
o
C).
1.6.2.3. Realizao do ensaio
Coloca-se no centro da folha de papel de filtro uma pequena quantidade da substncia de ensaio
(aproximadamente com 2 mm de dimetro). Deve-se anotar se ocorre (i) qualquer eventual libertao de gs e
(ii) se ocorre ignio desse gs. Se ocorrer a ignio do gs no necessrio continuar o ensaio da substncia,
uma vez que esta considerada perigosa.
1.6.3. Passo 3
1.6.3.1. Condies de ensaio
Efectua-se o ensaio temperatura ambiente (cerca de 20
o
C).
1.6.3.2. Realizao do ensaio
Com a substncia de ensaio prepara-se uma pilha com aproximadamente 2 cm de altura e 3 cm de dimetro
com um entalhe na parte superior. Verte-se na perfurao algumas gotas de gua e verifica-se (i) se ocorre
eventualmente qualquer libertao de gs e (ii) se ocorre ignio desse gs. Se ocorrer ignio do gs no
necessrio continuar o ensaio da substncia uma vez que esta considerada perigosa.
1.6.4. Passo 4
1.6.4.1. Aparelho
O aparelho tem a configurao que se mostra na figura.
1.6.4.2. Condies de ensaio
Procede-se a uma inspeco da embalagem para verificao da existncia de p (dimenso das partculas < 500
m) da substncia de ensaio. Se o p constituir mais do que 1 % p/p do total, ou se a amostra for frivel, ento
dever-se- triturar toda a substncia reduzindo-a a p antes do ensaio de modo a proporcionar uma reduo
das dimenses das partculas durante o armazenamento e o manuseamento; caso contrrio faz-se o ensaio da
substncia tal como foi recebida. O ensaio dever ser efectuado temperatura ambiente (cerca de 20
o
C) e
presso atmosfrica.
L 142/88 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.6.4.3. Realizao do ensaio
Coloca-se 10 a 20 ml de gua no funil de gotejamento do aparelho e coloca-se 10 g de substncia no frasco
cnico. Pode-se medir o volume de gs libertado recorrendo a meios adequados. Abre-se a torneira do funil de
gotejamento para deixar entrar a gua no frasco cnico e pe-se em funcionamento um cronmetro. Mede-se a
libertao de gs em cada hora durante um perodo de sete horas. No caso da libertao de gs durante esse
perodo ser errtica ou no caso de no fim desse perodo a taxa de libertao de gs ser crescente, ento dever-se-
- continuar a efectuar medies durante cinco dias. Se em qualquer momento do perodo de medio a taxa de
libertao de gs exceder 1 litro/kg por hora pode-se interromper o ensaio. Este ensaio dever ser efectuado em
triplicado.
No caso de ser desconhecida a identidade do gs, deve-se proceder a uma anlise desse gs. No caso de o gs
conter componentes altamente inflamveis e de no se saber se a mistura global altamente inflamvel, deve-se
preparar uma mistura da mesma composio e ensaiar-se de acordo com o mtodo A.11.
2. RESULTADOS
A substncia considerada perigosa se:
ocorrer ignio espontnea em qualquer passo do procedimento de ensaio,
ou
ocorrer libertao de gs inflamvel a uma taxa superior a 1 litro/kg de substncia por hora.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
a especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
pormenores sobre qualquer preparao inicial da substncia de ensaio,
os resultados dos ensaios (passos 1, 2, 3 e 4),
a identidade qumica do gs libertado,
a taxa de libertao de gs no caso de se realizar o passo 4 (1.6.4.),
quaisquer observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and Criteria, 1990, United Nations, New
York.
(2) NF T 20-040 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases
formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/89
Apndice
Figura
Aparelho
L 142/90 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
A.13 PROPRIEDADES PIROFRICAS DE SLIDOS E LQUIDOS
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O procedimento de ensaio aplicvel a substncias slidas ou lquidas as quais, em pequenas quantidades,
entram espontaneamente em combusto, decorrido um curto perodo de tempo aps estarem em contacto
com o ar temperatura ambiente (cerca de 20
o
C).
As substncias que necessitem de estar expostas ao ar durante diversas horas ou dias, temperatura ambiente
ou a temperaturas elevadas, antes que ocorra a ignio, no esto abrangidas por este mtodo.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
Considera-se que uma substncia possui propriedades pirofricas se entrar em combusto ou se carbonizar sob
as condies descritas em 1.6.
Pode ser necessrio ensaiar tambm a auto-inflamabilidade de lquidos utilizando o mtodo A.15 relativo
temperatura de auto-ignio (lquidos e gases).
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
No especificadas.
1.4. PRINCPIO DO MTODO
Adiciona-se a substncia, no estado slido ou no estado lquido, a um veculo inerte e coloca-se em contacto
com o ar temperatura ambiente durante um perodo de cinco minutos. Se as substncias lquidas no se
inflamarem utiliza-se papel de filtro para as absorver e faz-se a exposio ao ar temperatura ambiente (cerca
de 20
o
C) durante cinco minutos. No caso de uma substncia slida ou lquida se inflamar, ou no caso de um
lquido se inflamar ou carbonizar uma folha de papel de filtro, ento considera-se que essa substncia
pirofrica.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
Repetitividade: devido importncia que assumem as questes relativas segurana, um nico resultado
positivo suficiente para que essa substncia seja considerada pirofrica.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.6.1. Aparelho
Utiliza-se um vaso de porcelana com cerca de 10 cm de dimetro e enche-se com terra de diatomceas at cerca
de 5 mm de altura, temperatura ambiente (cerca de 20
o
C).
Nota:
A terra de diatomceas ou quaisquer outras substncias inertes comparveis geralmente disponveis devero ser
consideradas como representativas do solo onde a substncia de ensaio possa ser derramada em caso de
acidente.
necessrio papel de filtro seco para ensaiar os lquidos que no se inflamem em contacto com o ar quando
esto em contacto com um veculo inerte.
1.6.2. Realizao do ensaio
a) Slidos pulverulentos
De uma altura de cerca de 1 m deixa-se cair 1 a 2 cm
3
da substncia pulverulenta que se pretende ensaiar, sobre
uma superfcie no combustvel e verifica-se a eventualidade dessa substncia se inflamar durante a queda ou
decorridos cinco minutos em repouso.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/91
Efectua-se o ensaio seis vezes, salvo no caso de se observar combusto.
b) Lquidos
Verte-se no vaso de porcelana cerca de 5 cm
3
do lquido que se pretende ensaiar e observa-se a eventual
inflamao da substncia no perodo de cinco minutos.
Se no houver inflamao nos seis ensaios, executam-se os ensaios seguintes:
Com o auxlio de uma seringa coloca-se 0,5 ml da amostra de ensaio num papel de filtro recortado e observa-
-se a eventual ocorrncia de inflamao ou de carbonizao do papel de filtro nos cinco minutos subsequentes
adio do lquido. Efectua-se o ensaio trs vezes, salvo se ocorrer inflamao ou carbonizao.
2. RESULTADOS
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS
Pode interromper-se o processo de ensaio logo que ocorra um resultado positivo em qualquer dos ensaios.
2.2. AVALIAO
Se a substncia se inflama no perodo de cinco minutos aps ter sido adicionada a um veculo inerte e exposta
ao ar, ou se uma substncia lquida carboniza ou inflama um papel de filtro no perodo de cinco minutos aps
a adio e exposio ao ar, ento considera-se que pirofrica.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
a especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
os resultados dos ensaios,
quaisquer observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) NF T 20-039 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous
flammability of solids and liquids.
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and Criteria, 1990, United Nations, New
York.
L 142/92 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
A.14. PROPRIEDADES EXPLOSIVAS
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O mtodo proporciona um sistema de ensaio para se determinar se uma substncia slida ou pastosa
representa perigo de exploso quando submetida ao efeito de uma chama (sensibilidade trmica) ou quando
submetida a choque ou frico (sensibilidade a estmulos mecnicos) e se uma substncia lquida representa
perigo de exploso quando submetida ao efeito de uma chama ou choque.
O mtodo decompe-se em trs partes:
a) Um ensaio de sensibilidade trmica (1);
b) Um ensaio de sensibilidade mecnica relativamente ao choque (1);
c) Um ensaio de sensibilidade mecnica relativamente frico (1).
O mtodo proporciona dados para se avaliar a possibilidade de se iniciar uma exploso por meio de diversos
estmulos comuns. O mtodo no pretende garantir que uma substncia seja susceptvel de explodir sob
quaisquer condies.
O mtodo apropriado para se determinar se uma substncia representa perigo de exploso (sensibilidade
trmica e mecnica) sob as condies particulares especificadas na directiva. Esse mtodo baseia-se em diversos
tipos de aparelhos amplamente utilizados escala internacional (1) e os quais proporcionam normalmente
resultados significativos. Admite-se que o mtodo no definitivo. possvel utilizar aparelhos alternativos aos
especificados desde que sejam internacionalmente aceites e desde que os resultados possam ser adequadamente
correlacionados com os que se obtm com o aparelho especificado.
No necessrio efectuar os ensaios quando existir informao termodinmica disponvel (por exemplo, calor
de formao, calor de decomposio) e/ou a ausncia de diversos grupos reactivos (2) na frmula estrutural
permitir concluir, para alm de quaisquer dvidas razoveis, que a substncia incapaz de sofrer decomposio
rpida com libertao de gases ou libertao de calor (isto , o material no representa qualquer risco de
exploso). No caso dos lquidos no necessrio qualquer ensaio de sensibilidade mecnica relativamente
frico.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
Explosivo:
Substncias que possam explodir sob o efeito de uma chama ou que sejam sensveis ao choque ou frico no
aparelho especificado (ou que sejam mecanicamente mais sensveis do que o 1,3-dinitrobenzeno num aparelho
alternativo).
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
O 1,3-dinitrobenzeno, produto cristalino tcnico, peneirado de modo a poder passar por uma malha de
0,5 mm, no caso do mtodo por frico e choque.
A perhidro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazina (RDX, hexogneo, ciclonite CAS 121-82-4), cuja recristalizao feita
a partir de uma soluo aquosa de ciclohexanona, peneirada a hmido atravs de uma malha de 250 m e
retida num peneiro de malha de 150 m, fazendo-se a secagem a 103 2
o
C (durante 4 horas) para a segunda
srie de ensaios de frico e choque.
1.4. PRINCPIO DO MTODO
So necessrios ensaios preliminares para se determinar as condies de segurana para a realizao dos trs
ensaios de sensibilidade.
1.4.1. Segurana na realizao dos ensaios (3)
Por razes de segurana, antes de se efectuarem os ensaios principais submetem-se amostras muito pequenas
(cerca de 10 mg) da substncia a aquecimento em ambiente no confinado, com uma chama de gs, aco de
choque em qualquer aparelho conveniente e aco de frico recorrendo utilizao de um malhete contra
uma bigorna ou recorrendo utilizao de qualquer mquina de frico. O objectivo consiste em determinar se
a substncia to sensvel e explosiva que os ensaios de sensibilidade prescritos, particularmente o ensaio de
sensibilidade trmica, devam ser efectuados com precaues especiais de modo a evitar ferimentos no operador.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/93
1.4.2. Sensibilidade trmica
O mtodo implica o aquecimento da substncia num tubo de ao, tapado por placas perfuradas com furos de
diferentes dimetros, no sentido de se determinar se a substncia susceptvel de explodir sob condies de
aquecimento intenso e confinamento definido.
1.4.3. Sensibilidade mecnica (choque)
O mtodo consiste em submeter a substncia ao choque provocado por uma massa determinada caindo de
uma altura determinada.
14.4. Sensibilidade mecnica (frico)
O mtodo consiste em submeter substncias slidas ou pastosas frico entre superfcies normalizadas sob
condies especficas de carga e de movimento relativo.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
No especificados.
1.6. DESCRIO DO MTODO
1.6.1. Sensibilidade trmica (efeito de uma chama)
1.6.1.1. Aparelho
O aparelho constitudo por um tubo de ao no reutilizvel com o seu dispositivo de fecho reutilizvel (figu-
ra 1), instalado num dispositivo de aquecimento e de proteco. Cada tubo constitudo por folha de ao de
estiramento profundo (ver apndice) e possui um dimetro interno de 24 mm, um comprimento de 75 mm e
paredes com espessura de 0,5 mm. Os tubos possuem uma flange na extremidade aberta para permitir que
sejam fechados pelo corpo da placa perfurada. Esse corpo constitudo por uma placa perfurada resistente
presso, possuindo um furo central, presa firmemente a um tubo por meio de uma pea roscada de duas partes
(porca e manga roscada). A porca e a manga roscada so feitas de ao de crmio e mangans (ver apndice), que
no produz fascas at temperatura de 800
o
C. As placas perfuradas possuem 6 mm de espessura, so feitas de
ao resistente ao calor (ver apndice) e encontram-se disponveis com perfuraes de diversos dimetros.
1.6.1.2. Condies de ensaio
Normalmente ensaia-se a substncia tal como recebida, embora em alguns casos a substncia aps triturao
seja, por exemplo, comprimida, moldada ou aglomerada por qualquer outra forma, necessria para o ensaio.
No caso dos slidos determina-se a massa de material a utilizar em cada ensaio recorrendo a um procedimento
experimental a seco em dois andares. Enche-se com 9 cm
3
de substncia um tubo de tara determinada e
carrega-se a substncia com uma fora de 80 N aplicada a toda a seco transversal do tubo. Por razes de
segurana ou nos casos em que a forma fsica da amostra possa ser modificada por compresso, pode recorrer-
-se a outros procedimentos de enchimento; por exemplo, se a substncia for muito sensvel frico o
enchimento pelo mtodo de embuchar no apropriado. Se o material for compressvel adiciona-se mais e
carrega-se enchendo-se o tubo at distncia de 55 mm medida a partir da parte superior. Determina-se a
massa total utilizada para encher o tubo at quele nvel de 55 mm e adiciona-se mais duas pores
carregando-se qualquer delas com a fora de 80 N. Depois, ou se adiciona mais material ou se retira, conforme
necessrio, deixando o tubo cheio at ao nvel de 15 mm medidos a partir da parte superior. Realiza-se uma
segunda experincia a seco, comeando com uma quantidade carregada correspondente a um tero da massa
total determinada na primeira experincia a seco. Adiciona-se mais duas pores dessas utilizando uma fora
de 80 N e ajusta-se o nvel da substncia no tubo at distncia de 15 mm, medida desde a parte superior, por
adio ou por subtraco de material conforme necessrio. A quantidade de slido determinada na segunda
experincia a seco utilizada para cada ensaio; o enchimento efectua-se com trs quantidades iguais, qualquer
delas comprimida at ao volume de 9 cm
3
utilizando-se a fora que for necessria (isto pode ser facilitado
utilizando anis espaadores).
Os lquidos e os geles so carregados no tubo at altura de 60 mm tomando-se precaues particulares com
os geles para se evitar a formao de espaos ocos. Faz-se deslizar a manga roscada pelo tubo, pela parte de
baixo, insere-se a placa perfurada apropriada e aperta-se a porca depois de se ter aplicado um pouco de
lubrificante base de dissulfureto de molibdnio. essencial verificar que no haja quaisquer vestgios de
substncia retida entre a flange e a placa, ou nas roscas.
O aquecimento proporcionado por uma chama de gs propano obtido em garrafa de gs industrial, equipada
com um regulador de presso (60 a 70 mbar), que passa atravs de uma vlvula calibradora e distribudo
uniformemente (conforme indicado por observao visual das chamas dos queimadores) a quatro queimadores
atravs de um cano distribuidor. Os queimadores esto localizados em torno da cmara de ensaio conforme se
mostra na figura 1. Os quatro queimadores conjuntamente possuem um consumo de aproximadamente 3,2
litros de propano por minuto. possvel utilizar outros queimadores e gases combustveis alternativos mas o
regime de aquecimento deve ser conforme especificado na figura 3. Para todos os aparelhos o regime de
aquecimento deve ser verificado periodicamente utilizando tubos cheios com ftalato de dibutilo conforme se
indica na figura 3.
L 142/94 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.6.1.3. Realizao dos ensaios
Cada ensaio efectuado at o tubo se fragmentar ou at o tubo ter sido aquecido durante cinco minutos. Um
ensaio que tenha como consequncia a fragmentao do tubo em trs ou mais partes, as quais podem em
alguns casos ser unidas umas s outras utilizando estreitas fitas de metal, conforme se ilustra na figura 2,
considerado do tipo explosivo. Um ensaio que tenha como consequncia menos fragmentos ou ausncia de
fragmentao considerado como sendo do tipo no explosivo.
Efectua-se primeiro uma srie de trs ensaios com uma placa cujo dimetro do orifcio seja de 6,0 mm e se no
se obtiver qualquer exploso efectua-se uma segunda srie de trs ensaios com uma placa cujo dimetro do
orifcio seja de 2,0 mm. Se ocorrer uma exploso durante quaisquer das sries de ensaio, no necessrio
efectuar mais ensaios.
1.6.1.4. Avaliao
Considera-se que o resultado do ensaio positivo se ocorrer uma exploso em qualquer das anteriores sries de
ensaios.
1.6.2. Sensibilidade mecnica (choque)
1.6.2.1. Aparelho (figura 4)
As partes essenciais de um aparelho de martelo cadente tpico so um bloco de ao moldado com base,
bigorna, coluna, guias, massas cadentes, dispositivo de libertao e um suporte para a amostra. A bigorna de
ao de 100 mm (dimetro) 70 mm (altura) enroscada parte superior de um bloco de ao de 230 mm
(comprimento) 250 mm (largura) 200 mm (altura) com uma base moldada de 450 mm (comprimento)
450 mm (largura) 60 mm (altura). Num suporte aparafusado parte posterior do bloco de ao prende-se
uma coluna feita de tubo de ao estirado sem juntas. Quatro parafusos prendem o aparelho a um slido bloco
de cimento de 60 60 60 cm de tal modo que as guias so absolutamente verticais e a massa cadente cai
livremente. Existem disponveis para utilizao massas de 5 e 10 kg, feitas de ao. A cabea batente de cada
massa feita de ao duro, HRC 60 a 63, e possui um dimetro mnimo de 25 mm.
A amostra de ensaio encerrada num dispositivo de choque constitudo por dois cilindros de ao coaxiais, um
sobre o outro, num guia de ao cilndrico e oco. Os cilindros de ao devero possuir um dimetro de 10
(- 0,003, - 0,005) mm e uma altura de 10 mm e devero possuir superfcies polidas, arestas arredondadas (raio
de curvatura de 0,5 mm) e uma dureza de HRC 58 a 65. O cilindro oco deve possuir um dimetro externo de
16 mm, um furo polido de 10 (+ 0,005, + 0,010) mm e uma altura de 13 mm. O dispositivo de choque
montado numa bigorna intermdia (26 mm de dimetro e 26 mm de altura) feita de ao e centrada por um
anel com perfuraes para permitir o escape dos fumos.
1.6.2.2. Condies de ensaio
O volume da amostra dever ser de 40 mm
3
ou um volume que se ajuste a qualquer aparelho alternativo. As
substncias no estado slido devero ser testadas devidamente secas e preparadas do modo seguinte:
a) As substncias pulverizadas so peneiradas (malha com dimenses de 0,5 mm); toda a substncia que
passar pelo peneiro utilizada no ensaio;
b) As substncias comprimidas, moldadas ou aglomeradas por qualquer outra forma so partidas em
pequenas partes e peneiradas; a fraco peneirada com dimetros compreendidos entre 0,5 e 1 mm
usada no ensaio e dever ser representativa da substncia original.
As substncias normalmente fornecidas em pasta devero ser ensaiadas no estado seco, quando possvel, ou
depois de remover a quantidade mxima possvel de diluente. As substncias lquidas so ensaiadas com o
intervalo de 1 mm entre os cilindros de ao superior e inferior.
1.6.2.3. Realizao dos ensaios
Realiza-se uma srie de seis ensaios deixando cair uma massa de 10 kg, de uma altura de 0,4 m (40 J). Se
ocorrer uma exploso durante os seis ensaios para o valor de 40 J deve realizar-se outra srie de seis ensaios
deixando cair uma massa de 5 kg e de uma altura de 0,15 m (7,5 J). Noutros aparelhos compara-se a amostra
com a substncia de referncia escolhida utilizando um procedimento reconhecido (por exemplo, tcnica de
sobe-e-desce, etc.).
1.6.2.4. Avaliao
Considera-se positivo o resultado do ensaio se ocorrer uma exploso (o aparecimento sbito de uma chama e/
/ou uma repercusso equivalente a uma exploso) pelo menos uma vez em qualquer dos ensaios com o
aparelho de choque especificado ou considera-se que a amostra mais sensvel do que o composto 1,3-
-dinitrobenzeno ou RDX num ensaio de choque alternativo.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/95
1.6.3. Sensibilidade mecnica (frico)
1.6.3.1. Aparelho (figura 5)
O aparelho de frico constitudo por uma placa de base de ao moldado sobre a qual se monta o dispositivo
de frico. Este constitudo por uma cavilha de porcelana fixa e por uma placa de porcelana mvel. A placa de
porcelana suportada por uma armao que desliza em duas guias. A armao ligada a um motor elctrico
atravs de uma biela de ligao, um ressalto excntrico e uma engrenagem adequada de tal modo que a placa de
porcelana se move, uma vez apenas, para trs e para diante por baixo da cavilha de porcelana numa distncia de
10 mm. A carga da cavilha de porcelana de 120 a 360 newtons, por exemplo.
As placas lisas de porcelana so feitas de porcelana branca (rugosidade de 9 a 32 m) e possuem as dimenses
de 25 mm (comprimento) 25 mm (largura) 5 mm (altura). A cavilha cilndrica de porcelana feita tambm
de porcelana branca e tem 15 mm de comprimento, possui um dimetro de 10 mm e na extremidade esfrica
rugosa possui superfcies com um raio de curvatura de 10 mm.
1.6.3.2. Condies de ensaio
O volume da amostra dever ser de 10 mm
3
ou um volume ajustado a qualquer aparelho alternativo.
As substncias slidas so ensaiadas devidamente secas e preparadas do modo seguinte:
a) As substncias pulverizadas so peneiradas (com malha de 0,5 mm); utiliza-se no ensaio toda a
substncia que passe atravs do peneiro;
b) As substncias comprimidas, moldadas ou aglomeradas por qualquer outra forma so partidas em peas
pequenas e peneiradas; utiliza-se para o ensaio a fraco peneirada de dimetro < 0,5 mm.
As substncias normalmente fornecidas em pasta devero ser ensaidas no estado seco, quando possvel. Se a
substncia no pode ser preparada no estado seco, a pasta (depois de removida a quantidade mxima possvel
de diluente) ensaiada na forma de uma pelcula com 0,5 mm espessura, 2 mm de largura e 10 mm de
comprimento preparada com uma matriz.
1.6.3.3. Realizao dos ensaios
Coloca-se a cavilha de porcelana sobre a amostra submetida ao ensaio e aplica-se a carga. Ao efectuar-se o
ensaio, as marcas esponjosas da placa de porcelana devem ficar transversais direco do movimento. Devem
ser tomadas precaues para que a cavilha se ajuste sobre a amostra, para que haja material de ensaio suficiente
sob a cavilha e tambm para que a placa se mova correctamente sob a cavilha. Para as substncias pastosas
utiliza-se um calibrador com 0,5 mm de espessura e com uma fenda de 2 10 mm para se aplicar a substncia
placa. A placa de porcelana tem de se mover 10 mm para diante e para trs sob a cavilha de porcelana no
tempo de 0,44 segundos. Cada parte da superfcie da placa e da cavilha deve ser utilizada apenas uma vez; as
duas extremidades de cada cavilha serviro para duas experincias e as duas superfcies de uma placa serviro,
cada uma delas, para trs experincias.
Efectua-se uma srie de seis ensaios com uma carga de 360 N. Se ocorrer um evento positivo durante estes seis
ensaios deve ser efectuada outra srie de seis ensaios com uma carga de 120 N. Com outros aparelhos
compara-se a amostra com a substncia de referncia escolhida utilizando um procedimento consagrado (por
exemplo, tcnica de sobe-e-desce, etc.).
1.6.3.4. Avaliao
Considera-se positivo o resultado do ensaio se ocorrer uma exploso (a crepitao e/ou uma repercusso ou o
aparecimento sbito de uma chama so equivalentes a uma exploso) pelo menos uma vez em qualquer dos
ensaios com o aparelho de frico especificado ou se for satisfeito um critrio equivalente num ensaio de
frico alternativo.
2. RESULTADOS
Em princpio considera-se que uma substncia representa perigo de exploso no sentido da directiva se for
obtido um resultado positivo no ensaio de sensibilidade trmica, de choque ou de frico.
L 142/96 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
identidade, composio, pureza, teor em humidade, etc., da substncia ensaiada,
a forma fsica da amostra e o facto eventual de ter sido triturada, quebrada e/ou peneirada,
as observaes durante os ensaios de sensibilidade trmica (por exemplo, a massa da amostra, o nmero
de fragmentos, etc.),
as observaes efectuadas durante os ensaios de sensibilidade mecnica (por exemplo, a formao de
quantidades considerveis de fumos ou a decomposio completa sem repercusso, chamas, fascas,
crepitao, etc.),
os resultados de cada tipo de ensaio,
no caso de se ter utilizado um aparelho alternativo, o relatrio dever conter a justificao cientfica e
tambm a evidncia de correlao entre os resultados obtidos com o aparelho especificado e os
resultados obtidos com o aparelho equivalente,
quaisquer comentrios teis tais como as referncias em ensaios com produtos idnticos e que possam
ser relevantes para uma interpretao adequada dos resultados,
todas as observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados.
3.2. INTERPRETAO E AVALIAO DOS RESULTADOS
O relatrio do ensaio dever mencionar quaisquer resultados que sejam considerados falsos, anmalos ou no
representativos. Se for necessrio deduzir quaisquer dos resultados dever descrever-se uma explicao e os
resultados de ensaios alternativos ou complementares. Salvo nos casos em que possa ser explicado um
resultado anmalo, deve aceitar-se o valor nominal e utilizar-se esse valor para classificar a substncia em
conformidade.
4. REFERNCIAS
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and Criteria, 1990, United Nations, New
York.
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Buttcrworths, London, ISBN 0-750-
-60103-5, 1990.
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, p. 6-13 and p. 30-42.
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use Determination of explosion risk.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/97
Apndice
Exemplo de especificao de material para o ensaio de sensibilidade trmica (ver DIN 1623)
(1) Tubo: especificao de material n
o
1.0336.505 g.
(2) Placa perfurada: especificao de material n.
o
1.4873
(3) Manga roscada e porca: especificao de material n.
o
1.3817.
Figura 1
Aparelho para o ensaio da sensibilidade trmica
(Todas as dimenses esto em milmetros)
L 142/98 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Figura 2
Ensaio de sensibilidade trmica
Exemplos de fragmentao
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/99
Figura 3
Calibrao da taxa de aquecimento para o ensaio da sensibilidade trmica
Curva de temperatura/tempo obtida ao aquecer-se ftalato de dibutilo (27 cm3) num tubo fechado (placa com
orifcio de 1,5 mm) utilizando gs propano com o dbito de 3,2 litros/minuto. Mede-se a temperatura com um
termopar de 1 mm de dimetro feito de crmio/alumnio revestido com ao inoxidvel, colocado centralmente
43 mm sob o aro do tubo. A taxa de aquecimento entre 135 C e 285 C dever estar compreendida entre
185 e 215 K/minuto.
L 142/100 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Figura 4
Aparelho para o ensaio de choque
(Todas as dimenses esto em milmetros)
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/101
Figura 4
Continuao
L 142/102 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Figura 5
Sensibilidade frico: aparelho
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/103
A.15. TEMPERATURA DE AUTO-IGNIO (LQUIDOS E GASES)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
As substncias explosivas e as substncias que sofrem ignio espontnea em contacto com o ar temperatura
ambiente no devem ser submetidas a este ensaio. O procedimento de ensaio aplicvel a gases, lquidos e
vapores, que, na presena de ar, podem ser inflamados por uma superfcie quente.
A temperatura de auto-ignio pode ser consideravelmente reduzida pela presena de impurezas catalticas, pela
superfcie do material ou pelo facto de o recipiente de ensaio ter um volume superior.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
O grau de propenso para a auto-ignio exprime-se em termos de temperatura de auto-ignio. A temperatura
de auto-ignio a menor temperatura para a qual a substncia de ensaio se inflama quando misturada com ar
sob as condies definidas no mtodo de ensaio.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
As substncias de referncia esto enumeradas nas normas (ver 1.6.3.). Devem servir essencialmente para a
calibrao do mtodo, de vez em quando, e para permitir a comparao com resultados obtidos com outros
mtodos.
1.4. PRINCPIO DO MTODO
O mtodo permite a determinao da temperatura mnima da superfcie interior de um recinto fechado qual
ocorre a ignio de um gs, vapor ou lquido injectados nesse recinto fechado.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
A repetitividade varia de acordo com o intervalo de temperaturas de auto-ignio e com o mtodo de ensaio
utilizado,
A sensibilidade e a especificidade dependem do mtodo de ensaio utilizado.
1.6. DESCRIO DO MTODO
1.6.1. Aparelho
O aparelho encontra-se descrito no mtodo referido em 1.6.3.
1.6.2. Condies de ensaio
O ensaio de uma amostra da substncia efectua-se de acordo com o mtodo referido em 1.6.3.
1.6.3. Realizao do ensaio
Ver IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.
2. RESULTADOS
Regista-se a temperatura de ensaio, a presso atmosfrica, a quantidade de amostra utilizada e o intervalo de
tempo decorrido at ocorrncia da ignio.
L 142/104 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
a especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
a quantidade de amostra utilizada,
a presso atmosfrica,
o aparelho utilizado,
os resultados das medies (temperaturas de ensaio, resultados relativos ignio, correspondentes
intervalos de tempo),
todas as observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
Nenhuma.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/105
A.16. TEMPERATURA DE AUTO-1GNIO RELATIVA PARA OS SLIDOS
1. MTODO
1.1. INTRODUO
As substncias explosivas e as substncias que se inflamam espontaneamente em contacto com o ar
temperatura ambiente no devero ser submetidas a este ensaio.
O objectivo deste ensaio consiste em proporcionar informao preliminar sobre a auto-inflamabilidade de
substncias slidas a temperaturas elevadas.
Se o calor desenvolvido por reaco da substncia com oxignio ou por decomposio exotrmica no for
perdido para o meio envolvente com rapidez suficiente, ocorre o fenmeno de auto-aquecimento que conduz
auto-ignio. Em consequncia, a auto-ignio ocorre sempre que a razo de produo de calor excede a razo
da perda de calor.
O procedimento de ensaio til como pesquisa preliminar para as substncias slidas. Dada a natureza
complexa da ignio e da combusto de slidos, a temperatura de auto-ignio determinada de acordo com
este mtodo apenas dever ser utilizada para efeitos de comparao.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
A temperatura de auto-ignio obtida por este mtodo a temperatura ambiente mnima expressa em
o
C qual
se inflamar um determinado volume de substncia sob condies definidas.
1.3. SUBSTNCIA DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO
Coloca-se num forno, temperatura ambiente, um determinado volume de substncia a ensaiar; traa-se uma
curva temperatura/tempo relativa s condies no centro da amostra, aumentando-se a temperatura do forno
at 400
o
C ou at ao ponto de fuso da substncia se for menor, razo de 0,5
o
C/minuto. Para os objectivos
deste ensaio, a temperatura do forno para a qual a temperatura da amostra de 400
o
C por auto-aquecimento
designada por temperatura de auto-ignio.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO
1.6.1. Aparelho
1.6.1.1. Forno
Utiliza-se um forno de laboratrio de temperatura programada (com o volume aproximado de dois litros)
equipado com sistema de circulao de ar natural e com sistema para aliviar os efeitos da exploso. No sentido
de se evitar um potencial risco de exploso, no se dever permitir que quaisquer gases de decomposio
estabeleam contacto com os componentes elctricos do sistema de aquecimento.
1.6.1.2. Cubo de rede de arame
De acordo com o diagrama da figura 1 prepara-se uma pea de rede de arame de ao inoxidvel com aberturas
de 0,045 mm. A rede dever ser dobrada e presa com arame no interior de cubos abertos por cima.
L 142/106 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.6.1.3. Termopares
Termopares adequados.
1.6.1.4. Registador
Utiliza-se qualquer registador de dois canais calibrado de 0 a 600
o
C ou calibrado para a tenso correspondente.
1.6.2. Condies de ensaio
As substncias so ensaiadas tal qual so recebidas.
1.6.3. Realizao do ensaio
Enche-se o cubo com a substncia de ensaio e bate-se suavemente adicionando-se mais substncia at o cubo
estar completamente cheio. Depois suspende-se o cubo no centro do forno, temperatura ambiente. Coloca-se
um termopar no centro do cubo e coloca-se outro entre o cubo e a parede do forno para registar a temperatura
deste.
As temperaturas do forno e da amostra so registadas continuamente ao mesmo tempo que a temperatura do
forno aumenta at 400
o
C ou at ao ponto de fuso da substncia, se for inferior, razo de 0,5
o
C/minuto.
Ao ocorrer a ignio da substncia o termopar da amostra indicar uma subida muito rpida da temperatura,
superior temperatura do forno.
2. RESULTADOS
A temperatura do forno qual a temperatura da amostra atinge 400
o
C por auto-aquecimento relevante para a
avaliao (ver figura 2).
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever, se possvel, conter a informao seguinte:
uma descrio da substncia a ensaiar,
os resultados da medio, incluindo a curva temperatura/tempo,
todas as observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) NF T 20-036 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of
the spontaneous flammability of solids.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/107
Figura 1
Planificao do cubo de ensaio com 20 mm de aresta
Figura 2
Curva tpica de temperatura/tempo
L 142/108 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
A.17. PROPRIEDADES OXIDANTES (SLIDOS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
til possuir informaes preliminares sobre quaisquer potenciais propriedades explosivas da substncia antes
de se efectuar este ensaio.
Este ensaio no aplicvel a lquidos, gases, substncias explosivas ou altamente inflamveis ou perxidos
orgnicos.
No necessrio efectuar este ensaio no caso de o exame da frmula estrutural determinar, para alm de
qualquer dvida razovel, que a substncia incapaz de reagir exotermicamente com um material combustvel.
No sentido de se determinar se o ensaio deve ser efectuado com precaues especiais, dever-se- efectuar um
ensaio preliminar.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
Tempo de combusto: o tempo de reaco, em segundos, necessrio para a zona de reaco se deslocar ao
longo de uma pilha utilizando o procedimento descrito em 1.6.
Velocidade de combusto: expressa em milmetros por segundo.
Velocidade mxima de combusto: o valor mximo das velocidades de combusto obtidas com misturas
contendo entre 10 % e 90 % em peso do oxidante.
1.3. SUBSTNCIA DE REFERNCIA
Utiliza-se o nitrato de brio (qualidade analtica) como substncia de referncia para o ensaio e para o ensaio
preliminar.
A mistura de referncia uma mistura de nitrato de brio com p de celulose preparada de acordo com 1.6.,
que possui a velocidade mxima de combusto (normalmente uma mistura contendo nitrato de brio na
proporo de 60 % em peso).
1.4. PRINCPIO DO MTODO
Por razes de segurana, efectua-se um ensaio preliminar. No necessrio mais nenhum ensaio no caso de se
verificar claramente no ensaio preliminar que a substncia de ensaio possui propriedades oxidantes. Se no for
esse o caso, a substncia dever ser ento submetida ao ensaio completo.
No ensaio completo mistura-se, segundo propores variveis, a substncia que se pretende ensaiar e uma
substncia combustvel previamente definida. Depois forma-se uma pilha com cada mistura e procede-se
ignio dessa pilha numa das suas extremidades. A velocidade mxima de combusto determinada ento
comparada com a velocidade mxima de combusto da mistura de referncia.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
Se necessrio, vlido qualquer mtodo de triturao e de mistura desde que a diferena entre as velocidades
mximas de combusto em seis ensaios separados no se afastem do valor correspondente mdia aritmtica
em mais do que 10 %.
1.6. DESCRIO DO MTODO
1.6.1. Preparao
1.6.1.1. Substncia de ensaio
Reduz-se a amostra de ensaio a partculas com dimenses < 0,125 mm utilizando o procedimento seguinte:
peneira-se a substncia de ensaio, tritura-se a parte restante e repete-se o procedimento at toda a substncia de
ensaio passar pelo peneiro.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/109
Pode-se utilizar qualquer mtodo de triturao e de crivagem que satisfaam os critrios qualitativos.
Antes da preparao da mistura seca-se a substncia temperatura de 105
o
C, at se obter um peso constante.
No caso de a temperatura de decomposio da substncia de ensaio ser inferior a 105
o
C, torna-se necessrio
secar a substncia a uma temperatura inferior adequada.
1.6.1.2. Substncia combustvel
Utiliza-se p de celulose como substncia combustvel. A celulose dever ser do tipo utilizado para a
cromatografia de camada fina ou para a cromatografia em coluna. Verificou-se que adequada a celulose em
que 85 % das fibras possui um comprimento compreendido entre 0,020 e 0,075 mm. Faz-se passar o p de
celulose atravs de um peneiro de malha de 0,125 mm. Em todo o ensaio deve-se utilizar o mesmo lote de
celulose.
Antes de se preparar a mistura efectua-se a secagem do p de celulose temperatura de 105
o
C at se obter um
peso constante.
No caso de se utilizar serradura no ensaio preliminar faz-se a preparao dessa serradura de madeira macia
recolhendo a poro que passa atravs de um peneiro de malha de 1,6 mm, mistura-se muito bem e depois
seca-se temperatura de 105
o
C durante 4 horas numa camada com espessura inferior a 25 mm. Arrefece-se e
armazena-se num recipiente estanque ao ar, to cheio quanto for possvel, de preferncia ao fim de 24 horas de
secagem.
1.6.1.3. Fonte de ignio
Como fonte de ignio deve utilizar-se uma chama de um queimador de gs (com dimetro mnimo de 5mm).
No caso de se utilizar outra fonte de ignio (por exemplo, quando se efectua o ensaio em atmosfera inerte),
dever constar do relatrio uma descrio e a justificao.
1.6.2. Realizao do ensaio
Nota:
As misturas de oxidantes com celulose ou com serradura devem ser tratadas como potencialmente explosivas e
manuseadas com as devidas precaues.
1.6.2.1. Ensaio preliminar
Mistura-se muito bem a substncia seca com a celulose ou com a serradura seca na proporo em peso de duas
partes da substncia de ensaio para uma parte de celulose ou de serradura e com essa mistura prepara-se uma
pequena pilha com a configurao de um cone com as dimenses de 3,5 cm (dimetro da base) 2,5 cm
(altura) enchendo, sem bater, uma forma com a configurao do cone (por exemplo, um funil de vidro de
laboratrio com o bico tapado).
Coloca-se essa pilha sobre uma placa fria, no combustvel, no porosa e de fraca condutividade trmica. O
ensaio deve ser efectuado num aparador com exausto de fumos tal como em 1.6.2.2.
Coloca-se a fonte de ignio em contacto com o cone. Observa-se e regista-se o vigor e a durao da reaco
resultante.
Considera-se que a substncia um oxidante se a reaco for vigorosa.
Em qualquer caso em que o resultado suscite dvidas necessrio completar depois a sequncia de ensaio
adiante descrita.
1.6.2.2. Sequncia de ensaio
Procede-se preparao de misturas oxidante/celulose contendo oxidante em propores compreendidas entre
10 % e 90 % em peso, por acrescimentos sucessivos de 10 %. Nos casos limite, deve utilizar-se misturas
intermdias de oxidante/celulose para se obter com maior preciso a velocidade mxima de combusto.
A configurao da pilha conseguida por meio de um molde. Esse molde feito de metal, tem um
comprimento de 250 mm e uma seco recta transversal com uma altura interior de 10 mm e com uma
largura interior de 20 mm. De ambos os lados do molde, segundo a direco longitudinal, faz-se a montagem
de duas placas metlicas que constituem limitaes laterais que ultrapassam 2 mm a aresta superior da seco
recta triangular (ver figura). Enche-se livremente este dispositivo com um ligeiro excesso de mistura. Depois de
se deixar cair o molde uma vez, de uma altura de 2 cm sobre uma superfcie slida, remove-se a substncia em
L 142/110 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
excesso remanescente com uma folha colocada em posio oblqua, procede-se remoo das limitaes
laterais e alisa-se o p restante utilizando um cilindro. Depois coloca-se sobre o molde uma placa no
combustvel, no porosa e de fraca condutibilidade trmica, inverte-se o aparelho e remove-se o molde.
Coloca-se a placa sob o exaustor de um aparador com exausto de fumos.
A velocidade do ar dever ser suficiente para evitar que os fumos escapem para o interior do laboratrio e no
dever variar durante o ensaio. Em torno do aparelho dever instalar-se uma blindagem auxiliar da exausto.
Devido s propriedades higroscpicas da celulose e de algumas substncias que se pretendem ensaiar o teste
dever ser efectuado to rapidamente quanto possvel.
Inflama-se uma extremidade da pilha por contacto com a chama.
Mede-se o tempo de reaco para uma distncia de 200 mm aps a zona de reaco se ter propagado, segundo
uma distncia inicial de 30 mm.
Efectua-se o ensaio com a substncia de referncia e pelo menos com cada uma das misturas de substncia de
ensaio com celulose, no intervalo definido.
No caso de se verificar que a velocidade mxima de combusto significativamente superior da mistura de
referncia, pode-se interromper o ensaio; caso contrrio, deve-se repetir o ensaio cinco vezes para cada uma das
trs misturas que proporcionam a velocidade de combusto mais rpida.
No caso de se suspeitar que o resultado falsamente positivo, deve-se repetir o ensaio utilizando uma
substncia inerte com partculas de dimenses idnticas, tal como a diatomite, em vez de celulose. Em
alternativa deve-se ensaiar novamente a mistura de substncia de ensaio/celulose que possui a velocidade de
combusto mais rpida em atmosfera inerte (teor em oxignio < 2 % v/v).
2. RESULTADOS
Por razes de segurana deve-se considerar a velocidade mxima de combusto em vez do valor mdio
como sendo a propriedade oxidante caracterstica da substncia de ensaio.
Para a avaliao relevante o valor mximo da velocidade de combusto obtido numa srie de seis ensaios para
uma determinada mistura.
Traa-se um grfico do valor mximo da velocidade de combusto para cada mistura em funo da
concentrao do oxidante. A partir de grfico conclui-se sobre a velocidade mxima de combusto.
Os seis valores de velocidade de combusto medidos numa experincia efectuada com a mistura de mxima
velocidade de combusto no devem diferir do valor da mdia aritmtica em mais do que 10 %; caso contrrio,
devem aperfeioar-se os mtodos de triturao e de mistura.
A velocidade mxima de combusto obtida comparada com a velocidade mxima de combusto da mistura
de referncia (ver 1.3.).
Se os ensaios forem efectuados em atmosfera inerte, compara-se a velocidade mxima de reaco com a que se
obtm com a mistura de referncia em atmosfera inerte.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
identidade, composio, pureza, teor em humidade, etc., da substncia ensaiada,
qualquer tratamento da substncia de ensaio (por exemplo, triturao, secagem, etc.),
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/111
a fonte de ignio utilizada nos ensaios,
os resultados das medies,
o modo de reaco (por exemplo, combusto com chama superfcie, combusto atravs de toda a
massa, qualquer informao relativa aos produtos de combusto, etc.),
todas as observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados, incluindo uma descrio
do vigor (chamas, fascas, fumos, combusto lenta, etc.) e durao aproximada observados no ensaio
preliminar sobre segurana/pesquisa, tanto para a substncia de ensaio como para a substncia de
referncia,
os resultados dos ensaios com uma substncia inerte, se existirem,
os resultados dos ensaios em atmosfera inerte, se existirem.
3.2. INTERPRETAO DOS RESULTADOS
Considera-se que uma substncia um oxidante nos casos em que:
a) No ensaio preliminar se observa uma reaco vigorosa;
b) No ensaio completo, a velocidade mxima de combusto das misturas ensaiadas superior ou igual
velocidade mxima de combusto da mistura de referncia constituda por celulose e nitrato de brio.
No sentido de se evitar um resultado positivo falso, os resultados obtidos ao fazer-se o ensaio da substncia
misturada com um material inerte e/ou ao fazer-se o ensaio sob atmosfera inerte devero ser considerados
tambm ao fazer-se a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) NF T 20-035 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of
solids.
L 142/112 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Apndice
Figura
Molde e acessrios para a preparao da pilha
(Todas as dimenses esto em milmetros)
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/113
A.18. MASSA MOLECULAR MDIA EM FUNO DO NMERO DE MOLES E DISTRIBUIO DA MASSA
MOLECULAR EM POLMEROS
1. MTODO
O presente mtodo, que utiliza a cromatografia de permeao em gel (GPC), idntico ao mtodo OCDE TG
118 (1996). Os respectivos fundamentos e outras informaes tcnicas so apresentados na referncia (1).
1.1. INTRODUO
Tendo em conta a diversidade das propriedades dos biopolmeros, torna-se impossvel descrever um nico
mtodo que estabelea de modo preciso as condies de separao e avaliao dos mesmos, abrangendo todas
as possibilidades e especificidades. Muitos sistemas polimricos complexos, nomeadamente, no so analisveis
por cromatografia de permeao em gel. Nos casos em que o recurso a esta tcnica no se afigure vivel, a
massa molecular pode ser determinada atravs de outros mtodos (ver apndice), devendo documentar-se e
justificar-se a opo utilizada.
O mtodo descrito baseia-se na norma DIN 55672 (1); esta ltima contm informaes pormenorizadas sobre
o modo de execuo do ensaio e a avaliao dos respectivos resultados. Caso seja necessrio alterar
determinadas condies do processo experimental, deve apresentar-se a devida justificao. Podem utilizar-se
outras normas, na condio de apresentar as respectivas referncias. O mtodo descrito utiliza, para fins de
calibrao, amostras de poliestireno de polidispersibilidade conhecida, podendo ser necessrio efectuar
alteraes de modo a torn-lo adequado a determinados polmeros, nomeadamente polmeros hidrossolveis e
polmeros reticulados de cadeia longa.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
A massa molecular mdia em funo do nmero de moles, M
n
, e a massa molecular mdia relativa massa das
espcies, M
w
, so determinadas por recurso s equaes:
M
n =

n
i = 1
H
i

n
i = 1
H
i
=M
i
M
w =

n
i = 1
H
i
M
i

n
i = 1
H
i
em que:
H
i
a intensidade do sinal do detector correspondente ao volume de reteno V
i
, contado a partir da linha de
base,
M
i
a massa molecular da fraco do polmero correspondente ao volume de reteno V
i
e
n o nmero de pontos obtidos experimentalmente.
A amplitude da distribuio de massas moleculares, que constitui uma medida da dispersibilidade do sistema,
dada pelo quociente M
w
/M
n
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Uma vez que a cromatografia de permeao em gel constitui um mtodo relativo, deve efectuar-se uma
calibrao. Para tal, podem utilizar-se padres de poliestireno de cadeia linear, com uma distribuio limitada, e
massas moleculares mdias (M
n
e M
w
) e distribuio de massas moleculares conhecidas. A curva de calibrao
apenas pode ser utilizada na determinao da massa molecular da amostra desconhecida caso as condies de
separao da referida amostra e dos padres tenham sido seleccionadas de modo idntico.
Uma determinada relao entre a massa molecular e o volume de eluio apenas vlida nas condies
especficas de cada ensaio. Estas ltimas incluem, nomeadamente, a temperatura, o tipo de solvente (ou mistura
de solventes), as condies cromatogrficas e a coluna ou sistema de colunas de separao.
As massas moleculares da amostra determinadas pelo mtodo em causa constituem valores relativos, sendo
designadas massas moleculares em equivalentes de poliestireno. Tal facto significa que as massas moleculares
podem apresentar desvios relativamente aos valores absolutos em funo das diferenas estruturais e qumicas
entre a amostra e os padres. Caso se utilizem outros padres, nomeadamente polietilenoglicol, xido de
polietileno, metracrilato de polimetilo ou cido poliacrlico, devem justificar-se os motivos.
L 142/114 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
A determinao da distribuio das massas moleculares, bem como das massas moleculares mdias da amostra
(M
n
, M
w
), pode fazer-se por recurso cromatografia de permeao em gel, que consiste numa variante da
cromatografia lquida em que a amostra separada em funo dos volumes hidrodinmicos dos diversos
componentes (2).
A separao efectuada por passagem atravs de uma coluna cujo enchimento consiste num material poroso,
de modo geral um gel orgnico. As molculas de dimenses mais reduzidas passam atravs dos poros, sendo as
restantes excludas. A fixao das molculas de maiores dimenses , pois, menor, sendo eludas em primeiro
lugar. As molculas de dimenses mdias passam atravs de alguns poros, sendo eludas numa fase posterior.
Finalmente, as molculas de dimenses mais reduzidas, que possuem um raio hidrodinmico inferior ao dos
poros do gel, penetram estes ltimos, sendo eludas em ltimo lugar.
Em condies ideais, a separao determinada apenas pelas dimenses das molculas, embora, na prtica, seja
difcil evitar algumas interferncias devidas adsoro. A no uniformidade do enchimento e a existncia de
volumes mortos podero induzir problemas complementares (2).
A deteco pode ser efectuada com base no ndice de refraco ou por absoro no ultravioleta, originando
uma curva de distribuio simples. Todavia, de modo a atribuir valores de massa molecular aos vrios pontos
da curva, necessrio efectuar uma calibrao por recurso a polmeros de massa molecular conhecida e, se
possvel, de estrutura similar, nomeadamente padres de poliestireno. A curva resultante da representao
grfica da quantidade, em massa, das diversas espcies eludas em funo do logaritmo da massa molecular
deve exibir uma distribuio de Gauss, por vezes distorcida por uma ligeira assimetria na regio das massas
moleculares mais reduzidas.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
A repetibilidade (desvio-padro relativo) do volume de eluio deve ser superior a 0,3 %. Se um cromatograma
elaborado em funo do tempo no corresponder aos critrios supra, deve assegurar-se a necessria
repetibilidade da anlise mediante correco por recurso a um padro interno (1). As polidisperses dependem
da massa molecular de cada padro. No caso da utilizao de padres de poliestireno, os valores caractersticos
so os seguintes:
M
p
< 2 000 M
w
/M
n
< 1,20
2 000 M
p
10
6
M
w
/M
n
< 1,05
M
p
> 10
6
M
w
/M
n
< 1,20
em que M
p
representa a massa molecular do padro correspondente ao mximo do pico.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.6.1. Preparao das solues-padro de poliestireno
Os padres de poliestireno so dissolvidos, com agitao, no eluente escolhido. Na preparao das solues
devem ter-se em conta as recomendaes do fabricante.
As concentraes dos padres dependem de vrios factores, nomeadamente o volume de injeco, a
viscosidade da soluo e a sensibilidade do detector. Deve adaptar-se o volume de injeco mximo ao
comprimento da coluna, de modo a evitar uma sobrecarga. Os volumes de injeco caractersticos de
separaes analticas por cromatografia de permeao em gel com uma coluna de 30 cm 7,8 mm situam-se,
de modo geral, entre 40 e 100 l. possvel injectar volumes superiores, que no devem, contudo, exceder
250 l. Antes de calibrar a coluna, deve determinar-se o rcio adequado volume de injeco/concentrao.
1.6.2. Preparao da soluo de amostra
De modo geral, as condies atrs referidas so tambm aplicveis preparao das solues de amostra. Esta
ltima dissolvida num solvente adequado, nomeadamente tetra-hidrofurano (THF), sob agitao cuidadosa.
Em caso algum dever utilizar-se um banho de ultra-sons. Se necessrio, a soluo de amostra pode ser
purificada por passagem atravs de um filtro de membrana, cujos poros devero ter dimenses compreendidas
entre 0,2 e 2 m.
Deve referir-se no relatrio final a eventual presena de partculas no dissolvidas, que podero conter espcies
de massa molecular superior. Deve utilizar-se um mtodo adequado para determinar a percentagem ponderal
das partculas em causa. As solues devem ser utilizadas nas 24 horas subsequentes sua preparao.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/115
1.6.3. Equipamento
Reservatrio de solvente,
desgaseificador (se adequado),
bomba,
amortecedor de pulsaes (se adequado),
sistema de injeco,
colunas cromatogrficas,
detector,
medidor de caudal (se adequado),
sistema de registo e processamento de dados,
recipiente para resduos.
Deve assegurar-se o carcter inerte do sistema cromatogrfico em relao aos solventes utilizados
(nomeadamente no caso da utilizao de capilares de ao com THF).
1.6.4. Sistema de injeco e de aporte de solvente
Introduz-se na coluna um determinado volume de soluo de amostra, manualmente ou por intermdio de um
amostrador automtico, numa zona bem definida. No caso da introduo manual, a compresso do mbolo ou
a retirada da seringa demasiado rpidas podero determinar alteraes na distribuio de massas moleculares
obtida. O sistema de aporte de solvente deve ser uniforme, recorrendo, se possvel, a um amortecedor de
pulsaes. O caudal deve ser da ordem de 1 ml/min.
1.6.5. Coluna
Em funo do tipo de amostra, os polmeros so analisados por recurso a uma nica coluna ou a diversas
colunas ligadas em srie. Encontram-se disponveis nos circuitos comerciais colunas de materiais porosos com
propriedades (por exemplo, dimenses dos poros, limites de excluso) bem definidas. A seleco do gel a
utilizar, bem como do comprimento da coluna, depende das propriedades da amostra (volumes
hidrodinmicos, distribuio das massas moleculares) e das condies especficas de separao, nomeadamente
o tipo de solvente utilizado, a temperatura e o caudal (l) (2) (3).
1.6.6. Pratos tericos
Deve caracterizar-se a coluna ou sistema de colunas a utilizar na separao pelo respectivo nmero de pratos
tericos. No caso da utilizao de THF como solvente de eluio, introduzir uma soluo de etilbenzeno ou
outro soluto apolar adequado numa coluna de comprimento conhecido. O nmero de pratos tericos dado
pela equao:
N= 5,54
V
e
W
1=2
_ _
2
ou N= 16
V
e
W
_ _
2
em que:
N = representa o nmero de pratos tericos,
V
e
= representa o volume de eluio correspondente ao mximo do pico,
W = representa a largura da base do pico,
W
1/2
= representa a largura do pico a meia altura.
L 142/116 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.6.7. Eficincia de separao
Alm do nmero de pratos tericos, que determina a largura das bandas, a eficincia de separao, obtida a
partir do declive da curva de calibrao, desempenha tambm um papel importante. A eficincia de separao
de uma coluna dada por:
V
e,Mx
V
e,10M
x

seco transversal da coluna


6,0
cm
3
cm
2
_ _
em que:
V
e, Mx
= representa o volume de eluio de uma fraco de poliestireno com massa molecular M
x
e
V
e,(10Mxx)
= representa o volume de eluio de uma fraco de poliestireno com massa molecular dez vezes
superior.
A resoluo do sistema geralmente definida do seguinte modo:
R
1,2 = 2
V
e1
V
e2
W
1
W
2

1
log
10
M
2
=M
1

em que:
V
e1
, V
e2
= representam os volumes de eluio dos dois padres de poliestireno, correspondentes ao mximo
dos picos,
W
1
, W
2
= representam a largura da base dos picos, e
M
1
, M
2
= representam as massas moleculares correspondentes aos mximos dos picos, devendo diferir num
factor de 10.
O valor R do sistema de colunas deve ser superior a 1,7 (4).
1.6.8. Solventes
Todos os solventes devem possuir um elevado grau de pureza (no caso do THF, o grau de pureza deve ser de
99,5 %). As dimenses do reservatrio de solvente (que pode, se necessrio, encontrar-se sob atmosfera inerte)
devem ser suficientes para permitir a calibrao da coluna e a realizao de diversas anlises. O solvente deve
ser desgaseificado antes da sua introduo na coluna por intermdio da bomba.
1.6.9. Controlo da temperatura
A temperatura dos componentes crticos internos (septo de injeco, colunas, detector, tubagens) deve ser
constante e adequada ao solvente escolhido.
1.6.10. Detector
A funo do detector consiste no registo quantitativo da concentrao da amostra eluda da coluna. De modo a
evitar o alargamento dos picos, o volume da clula de deteco deve ser to reduzido quanto possvel, no
devendo exceder 10 l, excepto no caso dos detectores de difuso de radiaes e de viscosidade. O mtodo de
deteco mais corrente consiste na refractometria diferencial. Todavia, se as propriedades especficas da amostra
ou do solvente de eluio o justificarem, podem utilizar-se outros tipos de detectores, nomeadamente de
radiao ultravioleta/visvel, infravermelha e detectores de viscosidade.
2. RESULTADOS E SUA APRESENTAO
2.1. RESULTADOS
Para pormenores sobre os critrios de avaliao, bem como no que respeita s exigncias em matria de recolha
e processamento de dados, deve consultar-se a norma DIN relevante (1).
Devem efectuar-se duas anlises independentes e individuais de cada amostra.
Em cada anlise, devem determinar-se os parmetros M
n
, M
w
, M
w
/M
n
e M
p
. Deve indicar-se explicitamente que
os valores determinados constituem valores relativos equivalentes massa molecular do padro utilizado.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/117
Aps a determinao dos volumes de reteno ou tempos de reteno (eventualmente corrigidos por recurso a
um padro interno), representa-se graficamente o logaritmo de M
p
(valor correspondente ao mximo do pico
relativo ao padro de calibrao) em funo de um dos parmetros referidos. So necessrios pelo menos dois
pontos de calibrao por dcada de massas moleculares e pelo menos cinco pontos para a curva total, que deve
abranger a massa molecular estimada da amostra. A extremidade da curva de calibrao correspondente s
massas moleculares mais reduzidas definida pelo n-hexilbenzeno ou outro solvente apolar adequado. As
massas moleculares relativas ao nmero de moles e massa das espcies so, em geral, obtidas por
processamento electrnico dos dados, com base nas frmulas que se apresentam no ponto 1.2. Caso se recorra
ao tratamento manual dos mesmos, pode consultar-se a norma ASTM D 3536-91 (3).
Deve apresentar-se a distribuio na forma de quadro ou de grfico (percentagem da soma ou do diferencial da
frequncia em funo de log M). Na representao grfica, uma dcada de massas moleculares deve
corresponder a cerca de 4 cm, devendo a altura mxima dos picos ser de cerca de 8 cm. No caso de curvas de
distribuio integral, a diferena entre 0 e 100 % deve corresponder a cerca de 10 cm.
2.2. RELATRIO
O relatrio do ensaio deve incluir as seguintes informaes:
2.2.1. Substncia em estudo
Dados disponveis sobre a substncia em estudo (identidade, aditivos, impurezas),
descrio do tratamento da amostra, observaes, problemas surgidos.
2.2.2. Equipamento
Reservatrio de eluente, gs inerte, desgaseificao do eluente, composio do eluente, impurezas,
bomba, amortecedor de pulsaes, sistema de injeco,
colunas de separao (fabricante, todas as informaes disponveis sobre as caractersticas das colunas,
nomeadamente dimenses dos poros, tipo de material utilizado, nmero, comprimento e ordem de
utilizao das colunas),
nmero de pratos tericos da coluna ou sistema de colunas; eficincia de separao (resoluo do
sistema),
informaes relativas simetria dos picos,
temperatura da coluna, tipo de controlo da temperatura utilizado,
detector (princpio utilizado, tipo, volume da clula),
medidor de caudal, se utilizado (fabricante, princpio utilizado),
sistema de registo e processamento dos dados (equipamento e suporte lgico).
2.2.3. Calibrao do sistema
Descrio pormenorizada do mtodo utilizado para obter a curva de calibrao,
informaes relativas aos critrios de qualidade aplicveis ao mtodo (por exemplo, coeficiente de
correlao, erro quadrtico mdio, etc.),
L 142/118 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
informaes relativas s extrapolaes, hipteses e aproximaes efectuadas no decurso do processo
experimental, bem como da avaliao e processamento dos dados,
devem apresentar-se na forma de quadro os dados utilizados para a obteno da curva de calibrao,
incluindo, para cada ponto de calibrao, as seguintes informaes:
nome da amostra,
fabricante da amostra,
valores de M
p
, M
n
, M
w
, M
w
/M
n
caractersticos dos padres, fornecidos pelo fabricante ou obtidos
em determinaes posteriores, bem como pormenores sobre o mtodo de determinao utilizado,
volume de injeco e concentrao da substncia injectada,
valor de M
p
utilizado para a calibrao,
volume de eluio ou tempo de reteno corrigido correspondentes ao mximo dos picos,
valores de M
p
correspondentes ao mximo dos picos,
percentagem de erro dos valores de M
p
calculados e do valor de calibrao.
2.2.4. Avaliao
Avaliao com base no tempo: mtodos utilizados para assegurar a reprodutibilidade requerida (mtodo
de correco, padro interno, etc.),
informaes que indiquem se a avaliao foi efectuada com base no volume de eluio ou no tempo de
reteno,
informaes sobre os limites de avaliao, caso um pico no seja totalmente analisado,
descrio dos eventuais mtodos de nivelamento de dados utilizados,
processos de preparao e tratamento prvio da amostra,
eventual presena de partculas no dissolvidas,
volume de injeco (expresso em l) e concentrao de injeco (expressa em mg/ml),
observaes que indiquem efeitos susceptveis de induzir desvios relativamente s condies
cromatogrficas ideais,
descrio pormenorizada das alteraes aos procedimentos de ensaio,
pormenores relativos s margens de erro,
quaisquer outras informaes e observaes que possuam importncia para a interpretao dos
resultados.
3. REFERNCIAS
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel,
Teil 1.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/119
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J.
Wiley and Sons.
(3) ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight
Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American
Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(4) ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight
Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for
Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
L 142/120 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Apndice
Exemplos de outros mtodos de determinao da massa molecular mdia em funo do nmero de moles (M
n
) em
polmeros
A cromatografia de permeao em gel constitui o mtodo mais indicado para a determinao de M
n
, em especial sempre que
se encontre disponvel uma srie de padres com estrutura idntica do polmero a analisar. Todavia, nos casos em que o
recurso quela tcnica apresente dificuldades prticas ou em que se preveja que a substncia em causa no satisfaz um
critrio regulamentar em matria de M
n
, sendo necessrio confirmar tal facto podem aplicar-se mtodos alternativos,
nomeadamente:
1. Utilizao das propriedades coligativas
1.1. Ebulioscopia/crioscopia:
estas tcnicas baseiam-se, respectivamente, na determinao do aumento do ponto de ebulio e do
abaixamento do ponto de congelao de um solvente induzidos pela adio do polmero. O princpio do
mtodo consiste no facto de os efeitos do polmero dissolvido no ponto de ebulio ou de congelao do
solvente dependerem da massa molecular do polmero (1) (2).
Aplicabilidade: M
n
< 20 000
1.2. Abaixamento da presso de vapor:
esta tcnica baseia-se na medio da presso de vapor de um lquido de referncia antes e aps a adio de
determinadas quantidades do polmero (1) (2).
Aplicabilidade: M
n
< 20 000 (em teoria; na prtica, o valor limitado).
1.3. Osmometria de membrana:
esta tcnica baseia-se no princpio da osmose, isto , da tendncia natural das molculas de solvente de
passarem, atravs de uma membrana semipermevel, de uma soluo diluda para uma soluo concentrada,
at atingir o equilbrio. No ensaio em causa, a concentrao da soluo diluda nula, enquanto que a soluo
concentrada contm o polmero. A passagem do solvente atravs da membrana determina uma diferena de
presso dependente da concentrao e da massa molecular do polmero (1) (3) (4).
Aplicabilidade: valores de M
n
compreendidos entre 20 000 e 200 000.
1.4. Osmometria de fase de vapor:
esta tcnica baseia-se na comparao da velocidade de evaporao de um aerossol de solvente puro com a
velocidade de evaporao de, no mnimo, trs aerossis que contm o polmero em concentraes diversas (1)
(5) (6).
Aplicabilidade: M
n
< 20 000
2. Anlise dos grupos terminais
A utilizao deste mtodo implica o conhecimento simultneo da estrutura global do polmero e da natureza
dos grupos terminais, distinguveis da cadeia principal por recurso a tcnicas tais como a ressonncia
magntica nuclear, a titulao ou a formao de derivados. Com base na determinao da concentrao
molecular dos grupos terminais presentes no polmero, pode obter-se a respectiva massa molecular (7) (8) (9).
Aplicabilidade: M
n
no superior a 50 000 (com fiabilidade decrescente).
3. Referncias
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymeer Science, 3rd ed., John Wiley, New York.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/121
(2) Glover, CA., (1975), Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4 In: Polymer Molecular Weights,
Part I, P.E., Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of
Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia,
Pennsylvania.
(4) Coll, H. (1989), Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper e., J. Wiley
and Sons, p. 25-52.
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by
Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.
Cooper ed., John Wiley and Sons.
(7) Schrder, E. Muller, G., and Arndt, K-F, (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E.
Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.
L 142/122 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
A.19. TEOR EM POLMEROS DE BAIXA MASSA MOLECULAR
1. MTODO
O presente mtodo, que utiliza a cromatografia de permeao em gel, idntico ao mtodo OCDE TG 119
(1996). Os respectivos fundamentos e outras informaes tcnicas so apresentados nas referncias.
1.1. INTRODUO
Tendo em conta a diversidade das propriedades dos biopolmeros, torna-se impossvel descrever um nico
mtodo que estabelea de modo preciso as condies de separao e avaliao dos mesmos, abrangendo todas
as possibilidades e especificidades. Muitos sistemas polimricos complexos, nomeadamente, no so analisveis
por cromatografia de permeao em gel (GPC). Nos casos em que o recurso a esta tcnica no se afigure vivel,
a massa molecular pode ser determinada atravs de outros mtodos (ver apndice), devendo documentar-se e
justificar-se a opo utilizada.
O mtodo descrito baseia-se na norma DIN 55672 (1); esta ltima contm informaes pormenorizadas sobre
o modo de execuo do ensaio e a avaliao dos respectivos resultados. Caso seja necessrio alterar
determinadas condies do processo experimental, deve apresentar-se a devida justificao. Podem utilizar-se
outras normas, na condio de apresentar as respectivas referncias. O mtodo descrito utiliza, para fins de
calibrao, amostras de poliestireno de polidispersibilidade conhecida, podendo ser necessrio efectuar
alteraes de modo a torn-lo adequado a determinados polmeros, nomeadamente polmeros hidrossolveis e
polmeros reticulados de cadeia longa.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
Por conveno, considera-se baixa uma massa molecular inferior a 1 000 dalton.
A massa molecular mdia em funo do nmero de moles, M
n
, e a massa molecular mdia relativa massa das
espcies, M
w
, so determinadas por recurso s equaes:
M
n =

n
i = 1
H
i

n
i = 1
H
i
=M
i
M
w =

n
i = 1
H
i
M
i

n
i = 1
H
i
em que:
H
i
= a intensidade do sinal do detector correspondente ao volume de reteno V
j
, contado a partir da linha
de base,
M
i
= a massa molecular da fraco do polmero correspondente ao volume de reteno V
i
, e n o nmero
de pontos obtidos experimentalmente.
A amplitude da distribuio de massas moleculares, que constitui uma medida da dispersibilidade do sistema,
dada pelo quociente M
w
/M
n
.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Uma vez que a cromatografia de permeao em gel constitui um mtodo relativo deve efectuar-se uma
calibrao. Para tal, podem utilizar-se padres de poliestireno de cadeia linear, com uma distribuio limitada, e
massas moleculares mdias (M
n
e M
w
) e distribuio de massas moleculares conhecidas. A curva de calibrao
apenas pode ser utilizada na determinao da massa molecular da amostra desconhecida caso as condies de
separao da referida amostra e dos padres tenham sido seleccionadas de modo idntico.
Uma determinada relao entre a massa molecular e o volume de eluio apenas vlida nas condies
especficas de cada ensaio. Estas ltimas incluem, nomeadamente, a temperatura, o tipo de solvente (ou mistura
de solventes), as condies cromatogrficas e a coluna ou sistema de colunas de separao.
As massas moleculares da amostra determinadas pelo mtodo em causa constituem valores relativos, sendo
designadas massas moleculares em equivalentes de poliestireno. Tal facto significa que as massas moleculares
podem apresentar desvios relativamente aos valores absolutos em funo das diferenas estruturais e qumicas
entre a amostra e os padres. Caso se utilizem outros padres, nomeadamente polietilenoglicol, xido de
polietileno, metracrilato de polimetilo ou cido poliacrlico, devem justificar-se os motivos.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/123
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
A determinao da distribuio das massas moleculares, bem como das massas moleculares mdias da amostra
(M
n
M
w
), pode fazer-se por recurso cromatografia de permeao em gel, que consiste numa variante da
cromatografia lquida em que a amostra separada em funo dos volumes hidrodinmicos dos diversos
componentes (2).
A separao efectuada por passagem atravs de uma coluna cujo enchimento consiste num material poroso,
de modo geral um gel orgnico. As molculas de dimenses mais reduzidas passam atravs dos poros, sendo as
restantes excludas. A fixao das molculas de maiores dimenses , pois, menor, sendo eludas em primeiro
lugar. As molculas de dimenses mdias passam atravs de alguns poros, sendo eludas numa fase posterior.
Finalmente, as molculas de dimenses mais reduzidas, que possuem um raio hidrodinmico inferior ao dos
poros do gel, penetram estes ltimos, sendo eludas em ltimo lugar.
Em condies ideais, a separao determinada apenas pelas dimenses das molculas, embora, na prtica, seja
difcil evitar algumas interferncias devidas absoro. A no uniformidade do enchimento e a existncia de
volumes mortos podero induzir problemas complementares (2).
A deteco pode ser efectuada com base no ndice de refraco ou por absoro no ultravioleta, originando
uma curva de distribuio simples. Todavia, de modo a atribuir valores de massa molecular aos vrios pontos
da curva, necessrio efectuar uma calibrao por recurso a polmeros de massa molecular conhecida e, se
possvel, de estrutura similar, nomeadamente padres de poliestireno. A curva resultante da representao
grfica da quantidade, expressa em massa, das diversas espcies eludas em funo do logaritmo da massa
molecular deve exibir uma distribuio de Gauss, por vezes distorcida por uma ligeira assimetria na regio das
massas moleculares mais reduzidas.
O teor de espcies de baixa massa molecular determinado a partir da curva. O respectivo clculo preciso
depende da reproduo do comportamento do polmero por parte das referidas espcies, por unidade de
massa.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
A repetibilidade (desvio-padro relativo) do volume de eluio deve ser superior a 0,3 %. Se um cromatograma
elaborado em funo do tempo no corresponder aos critrios supra deve assegurar-se a necessria
repetibilidade da anlise mediante correco por recurso a um padro interno (1). As polidisperses dependem
da massa molecular de cada padro. No caso da utilizao de padres de poliestireno, os valores caractersticos
so os seguintes:
M
p
< 2 000 M
w
/M
n
< 1,20
2 000 M
p
10
6
M
w
/M
n
< 1,05
M
p
> 10
6
M
w
/M
n
< 1,20
(M
p
representa a massa molecular do padro correspondente ao mximo do pico).
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.6.1. Preparao das solues-padro de poliestireno
Os padres de poliestireno so dissolvidos, com agitao, no eluente escolhido, tendo em conta as
recomendaes do fabricante.
As concentraes dos padres dependem de vrios factores, nomeadamente o volume de injeco, a
viscosidade da soluo e a sensibilidade do detector. Deve adaptar-se o volume de injeco mximo ao
comprimento da coluna, de modo a evitar uma sobrecarga. Os volumes de injeco caractersticos de
separaes analticas por cromatografia de permeao em gel com uma coluna de 30 cm 7,8 mm situam-se,
de modo geral, entre 40 e 100 l. possvel injectar volumes superiores, que no devem, contudo, exceder
250 l. Antes de calibrar a coluna, deve determinar-se o rcio adequado volume de injeco/concentrao.
1.6.2. Preparao da soluo de amostra
De modo geral, as condies atrs referidas so tambm aplicveis preparao das solues de amostra. Esta
ltima dissolvida num solvente adequado, nomeadamente tetra-hidrofurano (THF), sob agitao cuidadosa.
Em caso algum dever utilizar-se um banho de ultra-sons. Se necessrio, a soluo de amostra pode ser
purificada por passagem atravs de um filtro de membrana, cujos poros devero ter dimenses compreendidas
entre 0,2 e 2 m.
L 142/124 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Deve referir-se no relatrio final a eventual presena de partculas no dissolvidas, que podero conter espcies
de massa molecular superior. Deve utilizar-se um mtodo adequado para determinar a percentagem ponderal
das partculas em causa. As solues devem ser utilizadas nas 24 horas subsequentes sua preparao.
1.6.3. Correces determinadas pela presena de impurezas e aditivos
No que respeita ao teor de espcies com M < 1 000, torna-se geralmente necessrio introduzir uma correco
destinada a ter em conta a presena de componentes especficos no polimricos (nomeadamente impurezas e
aditivos), excepto no caso de o teor determinado ser inferior a 1 %. A referida correco pode ser efectuada por
anlise directa da soluo de polmero ou da soluo obtida aps a eluio cromatogrfica.
Se a soluo obtida por eluio cromatogrfica for demasiado diluda para permitir a anlise, dever ser
concentrada, podendo ser necessrio evapor-la secura, redissolvendo o resduo. A concentrao deve ser
efectuada em condies que assegurem a no concorrncia de alteraes na soluo eluda. O tratamento desta
depende do mtodo analtico utilizado para a anlise quantitativa.
1.6.4. Equipamento
O equipamento de cromatografia de permeao em gel inclui os seguintes componentes:
reservatrio de solvente,
desgaseificador (se adequado),
bomba,
amortecedor de pulsaes (se adequado),
sistema de injeco,
colunas cromatogrficas,
detector,
medidor de caudal (se adequado),
sistema de registo e processamento de dados,
recipiente para resduos.
Deve assegurar-se o carcter inerte do sistema cromatogrfico em relao aos solventes utilizados
(nomeadamente no caso da utilizao de capilares de ao com THF).
1.6.5. Sistema de injeco e de aporte de solvente
Introduz-se na coluna um determinado volume de soluo de amostra, manualmente ou por intermdio de um
amostrador automtico, numa zona bem definida. No caso da introduo manual, a compresso do mbolo ou
a retirada da seringa demasiado rpidas podero determinar alteraes na distribuio de massas moleculares
obtida. O sistema de aporte de solvente deve ser uniforme, recorrendo, se possvel, a um amortecedor de
pulsaes. O caudal deve ser da ordem de 1 ml/min.
1.6.6. Coluna
Em funo do tipo de amostra, os polmeros so analisados por recurso a uma nica coluna ou a diversas
colunas ligadas em srie. Encontram-se disponveis nos circuitos comerciais colunas de materiais porosos com
propriedades (por exemplo, dimenses dos poros, limites de excluso) bem definidas. A seleco do gel a
utilizar, bem como do comprimento da coluna, depende das propriedades da amostra (volumes
hidrodinmicos, distribuio das massas moleculares) e das condies especficas de separao, nomeadamente
o tipo de solvente utilizado, a temperatura e o caudal (1) (2) (3).
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/125
1.6.7. Pratos tericos
Deve caracterizar-se a coluna ou sistema de colunas a utilizar na separao pelo respectivo nmero de pratos
tericos. No caso da utilizao de THF como solvente de eluio, introduzir uma soluo de etilbenzeno ou
outro soluto apolar adequado numa coluna de comprimento conhecido. O nmero de pratos tericos dado
pela equao:
N= 5,54
V
e
W
1=2
_ _
2
ou N= 16
V
e
W
_ _
2
em que:
N = representa o nmero de pratos tericos,
V
e
= representa o volume de eluio correspondente ao mximo do pico,
W = representa a largura da base do pico,
W
1/2
= representa a largura do pico a meia altura.
1.6.8. Eficincia de separao
Alm do nmero de pratos tericos, que determina a largura das bandas, a eficincia de separao, obtida a
partir do declive da curva de calibrao, desempenha tambm um papel importante. A eficincia de separao
de uma coluna dada por:
V
e,Mx
V
e,10M
x

seco transversal da coluna


6,0
cm
3
cm
2
_ _
em que
V
e, Mx
= representa o volume de eluio de uma fraco de poliestireno com massa molecular M
x
e
V
e,(10Mx)
= representa o volume de eluio de uma fraco de poliestireno com massa molecular dez vezes
superior.
A resoluo do sistema geralmente definida do seguinte modo:
R
1,2 = 2
V
e1
V
e2
W
1
W
2

1
log
10
M
2
=M
1

em que
V
e1
, V
e2
= representam os volumes de eluio dos dois padres de poliestireno, correspondentes ao mximo
dos picos,
W
1
, W
2
= representam a largura da base dos picos, e
M
1
, M
2
= representam as massas moleculares correspondentes aos mximos dos picos, devendo diferir num
factor de 10.
O valor R do sistema de colunas deve ser superior a 1,7 (4).
1.6.9. Solventes
Todos os solventes devem possuir um elevado grau de pureza (no caso do THF, o grau de pureza deve ser de
99,5 %). As dimenses do reservatrio de solvente (que pode, se necessrio, encontrar-se sob atmosfera inerte)
devem ser suficientes para permitir a calibrao da coluna e a realizao de diversas anlises. O solvente deve
ser desgaseificado antes da sua introduo na coluna por intermdio da bomba.
1.6.10. Controlo da temperatura
A temperatura dos componentes crticos internos (septo de injeco, colunas, detector e tubagens) deve ser
constante e adequada ao solvente escolhido.
1.6.11. Detector
A funo do detector consiste no registo quantitativo da concentrao da amostra eluda da coluna. De modo a
evitar o alargamento dos picos, o volume da clula de deteco deve ser to reduzido quanto possvel, no
devendo exceder 10 l, excepto no caso dos detectores de difuso de radiaes e de viscosidade. O mtodo de
L 142/126 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
deteco mais corrente consiste na refractometria diferencial. Todavia, se as propriedades especficas da amostra
ou do solvente de eluio o justificarem, podem utilizar-se outros tipos de detectores, nomeadamente de
radiao ultravioleta/visvel, infravermelha e detectores de viscosidade.
2. RESULTADOS E SUA APRESENTAO
2.1. RESULTADOS
Para pormenores sobre os critrios de avaliao, bem como no que respeita s exigncias em matria de recolha
e processamento de dados, deve consultar-se a norma DIN relevante (1).
Devem efectuar-se duas anlises independentes e individuais de cada amostra. Em todos os casos, devem
efectuar-se tambm ensaios em branco, em condies idnticas.
Deve indicar-se explicitamente que os valores determinados constituem valores relativos expressos em
equivalentes da massa molecular do padro utilizado.
Aps a determinao dos volumes de reteno ou tempos de reteno (eventualmente corrigidos por recurso a
um padro interno), representa-se graficamente o logaritmo de M
p
(valor correspondente ao mximo do pico
relativo ao padro de calibrao) em funo de um dos parmetros referidos. So necessrios pelo menos dois
pontos de calibrao por dcada de massas moleculares e pelo menos cinco pontos para a curva total, que deve
abranger a massa molecular estimada da amostra. A extremidade da curva de calibrao correspondente s
massas moleculares mais reduzidas definida pelo n-hexilbenzeno ou outro solvente apoiar adequado. A parte
da curva correspondente a massas moleculares inferiores a 1 000 determina-se e se necessrio corrige-se para
aditivos e impurezas. Caso se recorra ao tratamento manual dos mesmos, pode consultar-se a norma ASTM D
3536-91 (3).
Caso fique retido na coluna um polmero insolvel, provvel que a sua massa molecular seja superior massa
molecular da fraco solvel, pelo que a no tomada em conta do mesmo no clculo do teor de espcies de
baixa massa molecular determinar uma sobrestimativa deste ltimo. Apresentam-se em apndice directrizes
para a correco do teor de espcies de baixa massa molecular de polmeros insolveis.
Deve apresentar-se a distribuio na forma de quadro ou de grfico (percentagem da soma ou do diferencial da
frequncia em funo de log M). Na representao grfica, uma dcada de massas moleculares deve
corresponder a cerca de 4 cm, devendo a altura mxima dos picos ser de cerca de 8 cm. No caso de curvas de
distribuio integral, a diferena entre 0 e 100 % deve corresponder a cerca de 10 cm.
2.2. RELATRIO
O relatrio do ensaio deve incluir as seguintes informaes:
2.2.1. Substncia em estudo
Dados disponveis sobre a substncia em estudo (identidade, aditivos, impurezas),
descrio do tratamento da amostra, observaes, problemas.
2.2.2. Equipamento
Reservatrio de eluente, gs inerte, desgaseificao do eluente, composio do eluente, impurezas,
bomba, amortecedor de pulsaes, sistema de injeco,
colunas de separao (fabricante, todas as informaes disponveis sobre as caractersticas das colunas,
nomeadamente dimenses dos poros, tipo de material utilizado, nmero, comprimento e ordem de
utilizao das colunas),
nmero de pratos tericos da coluna ou sistema de colunas; eficincia de separao (resoluo do
sistema),
informaes relativas simetria dos picos,
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/127
temperatura da coluna, tipo de controlo da temperatura utilizado,
detector (princpio utilizado, tipo, volume da clula),
medidor de caudal, se utilizado (fabricante, princpio utilizado),
sistema de registo e processamento dos dados (equipamento e suporte lgico).
2.2.3. Calibrao do sistema
Descrio pormenorizada do mtodo utilizado para obter a curva de calibrao,
informaes relativas aos critrios de qualidade aplicveis ao mtodo (por exemplo, coeficiente de
correlao, erro quadrtico mdio, etc.),
informaes relativas s extrapolaes, hipteses e aproximaes efectuadas no decurso do processo
experimental, bem como da avaliao e processamento dos dados,
devem apresentar-se na forma de quadro os dados utilizados para a obteno da curva de calibrao,
incluindo, para cada ponto de calibrao, as seguintes informaes:
nome da amostra,
fabricante da amostra,
valores de M
p
, M
n
, M
w
, M
w
/M
n
caractersticos dos padres, fornecidos pelo fabricante ou obtidos em
determinaes posteriores, bem como pormenores sobre o mtodo de determinao utilizado,
volume de injeco e concentrao da substncia injectada,
valor de M
p
utilizado para a calibrao,
volume de eluio ou tempo de reteno corrigido correspondentes ao mximo dos picos,
valores de M
p
correspondentes ao mximo dos picos,
percentagem de erro dos valores de M
p
calculados e do valor de calibrao.
2.2.4. Informaes sobre o teor em polmeros de baixa massa molecular
Descrio dos mtodos de anlise e dos procedimentos utilizados,
informaes relativas ao teor de espcies e baixa massa molecular da amostra, expresso em percentagem
ponderal,
informaes relativas ao teor de impurezas, aditivos e de outras espcies no polimricas da amostra,
expresso em percentagem ponderal.
2.2.5. Avaliao
Avaliao com base no tempo: mtodos utilizados para assegurar a reprodutibilidade requerida (mtodo
de correco, padro interno, etc.),
informaes que indiquem se a avaliao foi efectuada com base no volume de eluio ou no tempo de
reteno,
informaes sobre os limites de avaliao, caso um pico no seja totalmente analisado,
L 142/128 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
descrio dos eventuais mtodos de nivelamento de dados utilizados,
processos de preparao e tratamento prvio da amostra,
eventual presena de partculas no dissolvidas,
volume de injeco (expresso em l) e concentrao de injeco (expressa em mg/ml),
observaes que indiquem efeitos susceptveis de induzir desvios relativamente s condies
cromatogrficas ideais,
descrio pormenorizada das alteraes aos procedimentos de ensaio,
pormenores relativos s margens de erro,
quaisquer outras informaes e observaes que possuam importncia para a interpretao dos
resultados.
3. REFERNCIAS
(1) DIN 55672 (1995). Geldpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutions-
mittel, Teil 1.
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography,
J.Wiley and Sons.
(3) ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight
Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American
Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(4) ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight
Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for
Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/129
Apndice
Directrizes para a correco do teor de espcies de baixa massa molecular determinada pela presena de polmeros
insolveis
A presena de polmeros insolveis na amostra determina perdas de massa no decurso da anlise por cromatografia de
permeao em gel. Os polmeros insolveis so retidos de forma irreversvel na coluna ou filtro, enquanto que a poro
solvel da amostra prossegue o seu percurso. Se for possvel estimar ou determinar o incremento do ndice de refraco do
polmero (dn/dc), pode calcular-se a perda de massa na coluna. Neste caso, efectua-se uma correco por recurso a
calibrao externa do refractmetro com substncias-padro de concentrao e dn/dc conhecidos. No exemplo que se segue,
utiliza-se um padro de poli(metacrilato de metilo) (pMMA).
No caso dos polmeros acrlicos, a calibrao externa consiste na anlise por cromatografia de permeao em gel de uma
soluo de um padro de pMMA em tetra-hidrofurano, de concentrao conhecida; os dados resultantes so utilizados para
calcular a constante do refractmetro, por recurso frmula:
K = R/(C V dn/dc)
em que:
K = representa a constante do refractmetro, expressa em mV.s/ml,
R = representa a resposta do padro de pMMA, expressa em mV.s,
C = representa a concentrao do padro de pMMA, expressa em mg/ml,
V = representa o volume de injeco, expresso em ml,
dn/dc = representa o incremento do ndice de refraco relativo soluo de pMMA em tetra-hidrofurano, expresso em
ml/mg.
Os valores infra so caractersticos de um padro de pMMA:
R = 2 937 891
C = 1,07 mg/ml
V = 0,1 ml
dn/dc = 9 10
-5
ml/mg
O valor de K resultante (3,05 10
11
) utilizado para o clculo da resposta terica do detector no caso da eluio e deteco
da totalidade do polmero injectado.
L 142/130 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
A.20. COMPORTAMENTO DOS POLMEROS DA DISSOLUO/EXTRACO AQUOSA
1. MTODO
O presente mtodo idntico verso revista do mtodo OCDE TG 120 (1997). As informaes tcnicas
especficas so apresentadas na referncia (1).
1.1. INTRODUO
No caso de determinados polmeros, nomeadamente polmeros de emulso, pode ser necessrio efectuar
trabalhos preliminares antes da aplicao do mtodo descrito infra. O mtodo no aplicvel a polmeros
lquidos e polmeros que reajam com a gua nas condies de ensaio.
Nos casos em que a aplicao do mtodo no se afigure vivel, pode investigar-se o comportamento dos
polmeros na dissoluo/extraco aquosa por recurso a outros mtodos, devendo apresentar-se a justificao
de tal facto, bem como a descrio pormenorizada dos mtodos em causa.
1.2. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
No aplicvel.
1.3. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
O comportamento dos polmeros na dissoluo/extraco aquosa determinado atravs do mtodo do
recipiente de vidro (ver A.6 Solubilidade em gua mtodo do recipiente de vidro) alterado do modo que
se descreve de seguida.
1.4. CRITRIOS DE QUALIDADE
No aplicvel.
1.5. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.5.1. Equipamento
O equipamento necessrio aplicao do mtodo o seguinte:
dispositivo de triturao (por exemplo, triturador que produza partculas de dimenses conhecidas),
dispositivo de agitao com possibilidade de controlo da temperatura,
sistema de filtros de membrana,
equipamento analtico adequado,
crivos normalizados.
1.5.2. Preparao da amostra
Por recurso a crivos adequados, reduz-se uma amostra representativa a uma granulometria compreendida entre
0,125 e 0,25 mm. De modo a assegurar a estabilidade da amostra ou do processo de triturao, pode ser
necessrio utilizar um sistema de refrigerao. Os materiais com consistncia idntica da borracha podem ser
triturados temperatura do azoto lquido (1).
Caso no se obtenham partculas com a granulometria desejada, deve procurar reduzir-se tanto quanto possvel
as dimenses das mesmas, referindo tal facto no relatrio. Este ltimo deve tambm indicar o modo de
armazenagem da amostra triturada, antes da sua utilizao no ensaio.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/131
1.5.3. Procedimento
Pesam-se trs pores de 10 g da substncia em estudo, que se colocam em trs recipientes munidos de rolhas
de vidro, a cada um dos quais se adicionam 1 000 ml de gua. Caso a utilizao de 10 g de amostra se revele
impraticvel, deve utilizar-se a quantidade mxima possvel, ajustando o volume de gua proporcionalmente
mesma.
Os recipientes so hermeticamente fechados e agitados a 20
o
C. Deve utilizar-se um dispositivo de agitao ou
dissoluo que funcione a temperatura constante. Aps 24 horas, centrifuga-se ou filtra-se o contedo de cada
recipiente, determinando-se a concentrao do polmero na fase aquosa lmpida por recurso a um mtodo
analtico adequado. Caso no se encontrem disponveis mtodos analticos adequados aplicveis fase aquosa,
pode estimar-se a solubilidade ou extractividade totais com base na massa a seco do resduo de filtrao ou do
precipitado obtido por centrifugao.
Em geral, necessrio efectuar uma distino quantitativa entre as impurezas e os aditivos, por um lado, e as
espcies de baixa massa molecular, por outro. No caso da determinao gravimtrica, deve tambm efectuar-se
um ensaio em branco, de modo a avaliar a contribuio de eventuais resduos decorrentes do processo
experimental.
O comportamento dos polmeros na dissoluo/extraco aquosa a 37
o
C, a pH 2 e pH 9 determina-se como
descrito para a experincia a 20
o
C. O pH das solues corrigido atravs da adio quer de tampes quer de
cidos ou bases adequados, nomeadamente cido clordrico, cido actico, hodrxido de sdio ou de potssio
de qualidade analtica e amnia.
Em funo do mtodo analtico utilizado, devem efectuar-se um ou dois ensaios. Sempre que seja possvel
utilizar mtodos suficientemente especficos que permitam a determinao directa do componente polimrico
na fase aquosa, pode efectuar-se um nico ensaio, tal como descrito supra. Todavia, caso tal no seja possvel e
seja necessrio determinar o comportamento dos polmeros na dissoluo/extraco aquosa do polmero por
um processo indirecto, nomeadamente atravs da determinao do teor de carbono orgnico total do extracto
aquoso, deve efectuar-se um ensaio complementar em triplicado, utilizando amostras de polmeros dez vezes
inferiores e volumes de gua idnticos aos utilizados no primeiro ensaio.
1.5.4. Anlise
1.5.4.1. Ensaio efectuado com uma nica granulometria
Alguns mtodos permitem a anlise directa dos componentes polimricos na fase aquosa. Todavia, como
alternativa, pode proceder-se anlise indirecta dos componentes polimricos dissolvidos/extrados mediante a
determinao do teor total de componentes solveis, aplicando uma correco destinada a ter em conta a
presena de componentes especficos no polimricos.
A determinao das espcies polimricas totais na fase aquosa pode ser efectuada por recurso a um mtodo
suficientemente sensvel, como por exemplo:
determinao do carbono orgnico total mediante digesto com persulfato ou dicromato, de modo a
obter CO
2
, que seguidamente doseado por espectroscopia de infravermelhos ou anlise qumica,
espectrometria de absoro atmica ou, no caso de polmeros que contenham silcio ou metais, de
plasma indutivo,
espectroscopia de absoro ou espectrofluorimetria no ultravioleta, no caso de polmeros arlicos,
cromatografia em fase lquida acoplada com espectrometria de massa, no caso de amostras de baixa
massa molecular.
A referida determinao pode tambm ser efectuada por evaporao secura, sob vcuo, do extracto aquoso,
seguida de anlise do resduo por espectroscopia de infravermelhos, ultravioleta, etc., ou espectrometria de
absoro atmica de plasma indutivo.
Caso a anlise da fase aquosa no seja vivel, esta ltima deve ser extrada com um solvente orgnico no
miscvel em gua, nomeadamente um hidrocarboneto clorado. Procede-se em seguida evaporao do solvente
e determinao do teor de polmero de acordo com o mtodo descrito supra. Na determinao do grau de
dissoluo/extraco do polmero devem subtrair-se quaisquer componentes do resduo identificados como
impurezas ou aditivos.
L 142/132 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Caso se encontrem presentes quantidades relativamente elevadas das referidas matrias, pode ser necessrio
analisar o resduo por HPLC ou cromatografia em fase gasosa, com o objectivo de distinguir as impurezas do
monmero e das espcies presentes derivadas do mesmo, de modo a determinar o respectivo teor.
Em alguns casos, poder bastar a evaporao do solvente orgnico secura e subsequente pesagem do resduo
seco.
1.5.4.2. Ensaio efectuado com duas granulometrias
Determina-se o teor de carbono orgnico total dos extractos aquosos.
Efectua-se uma determinao gravimtrica com a poro no dissolvida e no extrada da amostra. Se, aps a
centrifugao ou filtragem do contedo de um determinado recipiente, permanecerem resduos polimricos
nas respectivas paredes, deve lavar-se o mesmo com o filtrado at que no se observem quaisquer resduos,
procedendo ento a uma nova centrifugao e filtragem. Os resduos que permaneam no filtro ou no tubo de
centrifugao so secos a 40
o
C, sob vcuo, e pesados.
2. RESULTADOS
2.1. ENSAIO EFECTUADO COM UMA NICA GRANULOMETRIA
Devem apresentar-se os resultados relativos a cada recipiente, bem como os valores mdios, expressos em
unidades de massa por volume de soluo (de modo geral, mg/l) ou de massa por massa de amostra de
polmero (de modo geral, mg/g). Deve tambm fornecer-se a perda de massa da amostra, expressa no quociente
entre a massa de soluto e a massa inicial da amostra, bem como os desvios-padro relativos. Devem apresentar-
-se dados relativos totalidade da substncia (polmero + aditivos essenciais, etc.) e apenas ao polmero (aps
subtraco do teor de aditivos).
2.2. ENSAIO EFECTUADO COM DUAS GRANULOMETRIAS
Os teores de carbono orgnico total dos diversos extractos aquosos (ensaios em triplicado), bem como o valor
mdio relativo a cada ensaio, devem ser expressos em unidades de massa por volume de soluo (de modo
geral, mgC/l) ou de massa por massa de amostra de polmero (de modo geral, mgC/g).
O facto de no se observarem diferenas entre os resultados relativos aos rcios superior e inferior amostra/
/gua poder indicar a extraco efectiva de todos os componentes extractveis. Neste caso, no geralmente
necessrio proceder anlise directa.
Devem apresentar-se as massas dos diversos resduos, expressas em percentagem das massas iniciais das
amostras, calculando as mdias relativas a cada ensaio. A diferena entre 100 % e as percentagens obtidas
representa as percentagens de matrias solveis e extractveis nas amostras originais.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio deve incluir as seguintes informaes:
3.1.1. Substncia em estudo
Informaes disponveis sobre a substncia em estudo (identidade, aditivos, impurezas, teor de espcies
de baixa massa molecular).
3.1.2. Condies experimentais
Descrio dos procedimentos utilizados e das condies experimentais,
descrio dos mtodos analticos e de deteco utilizados.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/133
3.1.3. Resultados
Solubilidade ou extractividade, expressas em mg/ml; valores individuais e mdios obtidos nos ensaios de
extraco das diversas solues, discriminando o teor de polmero e de impurezas, aditivos, etc.,
solubilidade ou extractividade do polmero, expressas em mg/ml,
teor de carbono orgnico total dos extractos aquosos, massa do soluto e percentagens calculadas, se for
caso disso,
pH de cada amostra,
resultados dos ensaios em branco,
sempre que necessrio, referncias instabilidade qumica da substncia em estudo no decurso dos
processos de ensaio e analtico,
quaisquer informaes que possuam importncia para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) DIN 53733 (1976). Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen fr Prfzwecke.
L 142/134 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
A.21. PROPRIEDADES DE COMBURNCIA (LQUIDOS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O presente mtodo de ensaio destina-se determinao do potencial de uma substncia lquida de aumentar a
velocidade ou intensidade de combusto de uma substncia combustvel, ou de formar misturas homogneas
com uma substncia combustvel que possam sofrer ignio espontnea. O mtodo baseia-se no ensaio da
ONU para lquidos comburentes (1l), ao qual equivalente. Todavia, uma vez que o mtodo A.21 se destina
essencialmente a satisfazer as exigncias da Directiva 67/548/CEE, apenas necessria a comparao com uma
substncia de referncia. Caso se preveja que os resultados do ensaio sejam utilizados para outros fins, pode ser
necessrio efectuar ensaios complementares e comparaes com outras substncias de referncia (
1
).
No necessrio realizar o ensaio se uma anlise simples da frmula estrutural da substncia permitir
estabelecer com um grau de confiana elevado que a mesma no reage exotermicamente com matrias
combustveis.
Antes de realizar o ensaio, conveniente obter informaes sobre eventuais propriedades explosivas da
substncia.
O mtodo no aplicvel a slidos, gases e outras substncias explosivas ou altamente inflamveis, nem a
perxidos orgnicos.
No necessrio realizar o ensaio se existirem dados referentes substncia em estudo obtidos por aplicao
do ensaio da ONU para lquidos comburentes (1).
1.2. DEFINIES E UNIDADES
O tempo mdio necessrio para o aumento da presso a mdia dos tempos determinados necessrios para
que a presso da mistura em estudo aumente de 690 kPa para 2 070 kPa acima da presso atmosfrica.
1.3. SUBSTNCIA DE REFERNCIA
Utiliza-se como substncia de referncia uma soluo aquosa a 65 %, em massa, de cido ntrico de qualidade
analtica (
2
).
Caso o experimentador preveja que os resultados do ensaio sejam utilizados para outros fins (
1
), pode revelar-se
adequado efectuar ensaios com outras substncias de referncia (
3
).
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
O lquido em estudo misturado, na proporo 1:1, em massa, com fibras de celulose, e introduzido num
recipiente pressurizado. Se, durante o processo de mistura ou enchimento, ocorrer ignio espontnea, no
necessrio prosseguir o ensaio.
Caso no ocorra ignio espontnea, realiza-se o ensaio na sua totalidade. A mistura aquecida no recipiente
pressurizado, determinando-se o tempo mdio necessrio para que a presso aumente de 690 kPa para
2 070 kPa acima da presso atmosfrica. Este tempo comparado com o tempo mdio necessrio para o
aumento da presso da mistura na proporo de 1:1 da(s) substncia(s) de referncia com celulose.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
Os resultados de uma srie de cinco ensaios com uma determinada substncia no devem diferir em mais de
30 % da mdia aritmtica. Devem desprezar-se os resultados que mostrem uma divergncia superior a 30 %
relativamente mdia, alterando-se os procedimentos de mistura e enchimento, aps o que deve repetir-se o
ensaio.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/135
(
1
) Por exemplo, o ensaio no mbito da regulamentao da ONU relativa ao transporte de mercadorias perigosas.
(
2
) O cido deve ser titulado antes do ensaio, de modo a confirmar a sua concentrao.
(
3
) Na referncia 1, por exemplo, utilizam-se cido perclrico a 50 %, em massa, e clorato de sdio a 40 %, em massa.
1.6. DESCRIO DO MTODO
1.6.1. Preparao
1.6.1.1. Substncia combustvel
Utilizam-se como matria combustvel fibras de celulose secas, de comprimento compreendido entre 50 e 250
m e dimetro mdio 25 m (
1
). As fibras so secas a massa constante, numa placa de espessura no superior a
25 mm, a 105
o
C, durante 4 horas, e mantidas num exsicador com exsicante, at ao arrefecimento e utilizao.
O teor de humidade da celulose seca deve ser inferior a 0,5 % em relao massa seca (
2
). Para tal, se necessrio,
deve prolongar-se o tempo de secagem (
3
). Deve utilizar-se o mesmo lote de celulose em todo o ensaio.
1.6.1.2. Equipamento
1.6.1.2.1. Di s pos i t i v o pr e s s ur i z a d o
Deve utilizar-se um dispositivo constitudo por um recipiente pressurizado de ao de forma cilndrica, com
89 mm de comprimento e 60 mm de dimetro externo (ver figura 1). So maquinadas duas superfcies planas
em lados opostos, reduzindo a seco local do recipiente para 50 mm, de modo a facilitar a imobilizao
durante a colocao dos obturadores de ignio e de ventilao. O recipiente, com um dimetro interno de
20 mm, rebaixado internamente em ambas as extremidades at uma profundidade de 19 mm e roscado para
tubos normalizados BSP (British Standard Pipe) de 1", ou o seu equivalente no sistema mtrico. enroscada
superfcie curva do recipiente pressurizado uma tomada de presso, a 35 mm de uma das extremidades,
perpendicularmente s superfcies planas maquinadas. O encaixe, roscado para receber a rosca da tomada de
presso (tubo normalizado BSP de 1/2", ou o seu equivalente no sistema mtrico), realizado a uma
profundidade de 12 mm. Se necessrio, instalada uma junta de material inerte, de modo a assegurar
estanquidade aos gases. A tomada de presso tem um comprimento exterior de 55 mm relativamente ao corpo
do dispositivo e um furo axial com 6 mm de dimetro. A extremidade da tomada de presso rebaixada e
roscada de forma a receber um transdutor de presso com diafragma. Pode utilizar-se qualquer dispositivo de
medio de presso que no seja atacado pelos gases de combusto ou produtos de decomposio e seja
adequado a aumentos de presso de 690-2 070 kPa em no mais de 5 minutos.
A extremidade do recipiente pressurizado mais distante da tomada de presso tapada com um obturador de
ignio e munida de dois elctrodos, um dos quais isolado do corpo do obturador e o outro ligado massa. A
extremidade oposta do recipiente fechada por um disco de ruptura adequado a uma presso de ruptura de
2 200 kPa, mantido em posio por um obturador de reteno com um furo axial de 20 mm de dimetro. Se
necessrio, instalada uma junta de material inerte, de modo a assegurar estanquidade aos gases. Durante a
utilizao, o dispositivo mantido na posio correcta por meio de um suporte (figura 2), geralmente
constitudo por uma placa de ao macio com 235 mm 184 mm 6 mm e um tubo de 185 mm de
comprimento e seco quadrada de 70 mm 70 mm 4 mm.
So cortados dois lados opostos na extremidade do tubo, de modo a obter uma estrutura constituda por uma
seco de tubo intacto com 86 mm de comprimento prolongada por dois lados at base. As extremidades
destes lados so cortadas de modo a formar um ngulo de 60
o
com a horizontal e soldadas placa de ao
macio que constitui a base. maquinada num dos lados da extremidade superior da base uma fenda com
22 mm de largura e 46 mm de profundidade, de modo que, ao colocar o dispositivo pressurizado com o
obturador de ignio para baixo, a tomada de presso encaixe na fenda. soldada face interna do lado inferior
do tubo um espaador de ao com 30 mm de largura e 6 mm de espessura. O dispositivo pressurizado
mantido firmemente em posio por dois parafusos de orelhas de 7 mm, colocados no lado oposto, e apoiado
inferiormente por dois elementos prismticos de ao de 12 mm de largura e 6 mm de espessura, soldados s
peas laterais na base da poro intacta do tubo.
1.6.1.2.2. S i s t e ma d e i g ni o
O sistema de ignio constitudo por um cabo de nquel-crmio de 25 cm de comprimento e 0,6 mm de
seco, com uma resistncia de 3,85 ohm/m. O cabo enrolado em forma de bobina por recurso a uma haste
de 5 mm de seco, e ligado aos elctrodos do obturador de ignio. A bobina deve apresentar uma das
configuraes que se ilustram na figura 3. A distncia entre a extremidade inferior do recipiente e a superfcie
interior da bobina de ignio deve ser de 20 mm. Caso os elctrodos no sejam ajustveis, as extremidades do
cabo de ignio entre a bobina e a base do recipiente devem ser isoladas por um elemento de cermica. O cabo
aquecido por aco de uma corrente contnua de intensidade mnima 10 A.
1.6.2. Realizao do ensaio (
4
)
O dispositivo completo, incluindo o transdutor de presso e o sistema de aquecimento, mas sem o disco de
ruptura na respectiva posio, colocado com o obturador de ignio para baixo. Com o auxlio de um
agitador de vidro (
5
), misturam-se num recipiente de vidro 2,5 g do lquido em estudo com 2,5 g de celulose
seca. Por motivos de segurana, a mistura deve ser executada com um dispositivo de segurana interposto entre
o operador e a mistura. Em caso de ignio durante os processos de mistura ou o enchimento, no necessrio
L 142/136 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
(
1
) Por exemplo, celulose Whatman para cromatografia em coluna, referncia CF 11, n.
o
de catlogo 4021 050.
(
2
) Confirmado, por exemplo, atravs de uma titulao de Karl Fisher.
(
3
) Como alternativa, pode obter-se o teor de humidade em causa por aquecimento a 105
o
C, sob vcuo, durante 24 h.
(
4
) As misturas de substncias comburentes com celulose devem ser consideradas potencialmente explosivas, devendo manipular-se com os
devidos cuidados.
(
5
) Na prtica, pode preparar-se uma quantidade de mistura na proporo 1:1 do lquido em estudo com celulose superior necessria para
o ensaio, transferindo 5 0,1 g da mesma para o recipiente pressurizado. A mistura deve ser preparada antes de cada ensaio.
prosseguir o ensaio. A mistura vertida em pequenas pores no recipiente pressurizado, agitando
ligeiramente, devendo assegurar-se a acumulao em torno da bobina de ignio, de forma a estabelecer um
bom contacto. A bobina no deve ser distorcida durante o processo de enchimento, facto que poderia
determinar resultados errneos (
1
). O disco de ruptura colocado na respectiva posio e o obturador de
reteno enroscado firmemente. O recipiente carregado, com o disco de ruptura no topo, transferido para o
suporte, que deve estar colocado numa chamin ou cmara com proteco. A fonte de alimentao ligada aos
terminais externos do obturador de ignio, aplicando-se uma corrente de 10 A. O tempo decorrido entre o
incio da mistura e o estabelecimento da corrente elctrica no deve exceder 10 minutos.
O sinal produzido pelo transdutor de presso transmitido a um sistema adequado que permita a deteco e o
registo contnuos da alterao da presso (por exemplo, um detector em contnuo acoplado a um registador). A
mistura aquecida at ruptura do disco de ruptura ou at terem decorrido, pelo menos, 60 segundos. Caso o
disco no sofra ruptura, deve deixar-se arrefecer a mistura antes de desmontar cuidadosamente o dispositivo,
tomando as precaues inerentes a uma eventual pressurizao. Realizam-se cinco ensaios com a substncia
em estudo e a(s) substncia(s) de referncia. Regista-se o tempo necessrio para a presso aumentar de 690 kPa
para 2 070 kPa acima da presso atmosfrica, calculando-se ento o tempo mdio necessrio para o aumento
da presso.
Algumas substncias produzem um aumento de presso excessivo ou demasiado reduzido, determinado por
reaces qumicas independentes das propriedades de comburncia das substncias. Nesses casos, pode ser
necessrio repetir o ensaio, utilizando uma substncia inerte, como, por exemplo, terra de diatomceas
(kieselguhr), em vez da celulose, de modo a esclarecer a natureza da reaco.
2. DADOS
Tempos necessrios para o aumento da presso da(s) substncia(s) em estudo e de referncia. Tempos
necessrios para o aumento da presso no caso dos ensaios com substncias inertes, se for caso disso.
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS
Calculam-se os tempos mdios necessrios para o aumento da presso da(s) substncia(s) em estudo e de
referncia.
Calcula-se o tempo mdio necessrio para o aumento da presso no ensaio com a substncia inerte, se
realizado.
O quadro 1 fornece alguns exemplos de resultados:
Quadro 1
Exemplos de resultados (
a
)
Substncia (
b
)
Tempo mdio necessrio para o aumento da presso
(mistura com celulose na proporo 1:1)
(ms)
Soluo aquosa saturada de dicromato de amnio 20 800
Soluo aquosa saturada de nitrato de clcio 6 700
Soluo aquosa saturada de nitrato frrico 4 133
Soluo aquosa saturada de perclorato de ltio 1 686
Soluo aquosa saturada de perclorato de magnsio 777
Soluo aquosa saturada de nitrato de nquel 6 250
cido ntrico a 65 % 4 767 (
c
)
cido perclrico a 50 % 121 (
c
)
cido perclrico a 55 % 59
Soluo aquosa a 30 % de nitrato de potssio 26 690
Soluo aquosa saturada de nitrato de prata (
d
)
Soluo aquosa a 40 % de clorato de sdio 2 555 (
c
)
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/137
(
1
) Deve evitar-se, em especial, o contacto entre espiras adjacentes da bobina.
Substncia (
b
)
Tempo mdio necessrio para o aumento da presso
(mistura com celulose na proporo 1:1)
(ms)
Soluo aquosa a 45 % de nitrato de sdio 4 133
Substncia inerte
gua: celulose (
d
)
(
a
) Ver a referncia (1) para a classificao no mbito da regulamentao da ONU em matria de transporte de mercadorias
perigosas.
(
b
) As solues saturadas devem ser preparadas temperatura de 20
o
C.
(
c
) Valor mdio com base em ensaios de comparao interlaboratorial.
(
d
) Sem atingir a presso mxima de 2 070 kPa.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DE ENSAIO
O relatrio de ensaio deve incluir as seguintes informaes:
identidade, composio, grau de pureza, etc., da substncia em estudo,
concentrao da substncia em estudo,
procedimento utilizado para a secagem da celulose,
teor de humidade da celulose utilizada,
resultados das determinaes,
resultados dos ensaios com substncias inertes, se for caso disso,
tempos mdios necessrios para o aumento da presso determinados,
quaisquer eventuais alteraes do mtodo e respectiva motivao,
quaisquer informaes complementares ou observaes teis para a interpretao dos resultados.
3.2. INTERPRETAO DOS RESULTADOS (
1
)
Os resultados do ensaio so interpretados com base nos seguintes critrios:
a) Eventual ignio espontnea da mistura da substncia em estudo com celulose; e
b) Comparao do tempo mdio necessrio para o aumento da presso de 690 kPa para 2 070 kPa com
idntico parmetro da(s) substncia(s) de referncia.
Uma substncia lquida considerada comburente se:
a) Uma mistura da substncia com celulose na proporo 1:1, em massa, exibir ignio espontnea; ou
L 142/138 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
(
1
) Ver a referncia n.
o
1 para a interpretao dos resultados no mbito da regulamentao da ONU relativa ao transporte de mercadorias
perigosas, utilizando vrias substncias de referncia.
b) Uma mistura na proporo 1:1, em massa, exibir um tempo mdio necessrio para o aumento da presso
inferior ou igual ao tempo mdio necessrio para o aumento da presso de uma mistura na proporo
1:1, em massa, de soluo aquosa de cido ntrico a 65 % (em massa) e celulose.
De modo a evitar falsos resultados positivos, podem ser tambm tidos em conta na interpretao dos
resultados, se tal for considerado necessrio, os resultados obtidos num ensaio da substncia em estudo com
uma substncia inerte.
4. REFERNCIAS
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria, 3.
o
edio revista.
Publicao da ONU No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, p. 342. Test 0.2: Test for oxidizing liquids.
Figura 1
Dispositivo pressurizado
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/139
Figura 2
Suporte do dispositivo
Figura 3
Sistema de ignio
Nota: Cada uma destas duas configuraes pode ser utilizada
L 142/140 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
PARTE B: MTODOS PARA A DETERMINAO DA TOXICIDADE E DE OUTROS EFEITOS NA SADE
NDICE
INTRODUO GERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
B.1.bis. TOXICIDADE ORAL AGUDA PROCEDIMENTO DE DOSE FIXA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
B.1.tris. TOXICIDADE ORAL AGUDA MTODO DE CLASSIFICAO DE TOXICIDADE AGUDA . . . . . . . . . 158
B.2. TOXICIDADE AGUDA (INALAO) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
B.3. TOXICIDADE AGUDA (DRMICA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
B.4. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAO/CORROSO DRMICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182
B.5. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAO/CORROSO OCULAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
B.6. SENSIBILIZAO CUTNEA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
B.7. TOXICIDADE ORAL DA DOSE REPETIDA (28 DIAS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210
B.8. TOXICIDADE (INALAO) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
B.9. TOXICIDADE (DRMICA) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
B.10. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VITRO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM MAMFEROS . 225
B.11. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VIVO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM CLULAS DA
MEDULA DE MAMFEROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233
B.12. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VIVO DOS MICRONCLEOS EM ERITRCITOS DE MAMFEROS 240
B.13/14. MUTAGENICIDADE ENSAIO DE MUTAO REVERSA EM BACTRIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
B.15. TESTES DE MUTAGNESE E DESPISTE DE CARCINOGNESE MUTAO GNICA SACCHARO-
MYCES CEREVISIAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
B.16. RECOMBINAO MITTICA SACCHAROMYCES CEREVISIAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259
B.17. MUTAGENICIDADE ENSAIO DE MUTAO GNICA EM CLULAS DE MAMFEROS IN VITRO . . 262
B.18. LESO E REPARAO DO ADN SNTESE NO PROGRAMADA CLULAS DE MAMFERO IN
VITRO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
B.19. TESTE IN VITRO DE TROCA ENTRE CROMTIDES DO MESMO CROMOSSOMA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275
B.20. TESTE DE LETALIDADE RECESSIVA LIGADA AO SEXO NA DROSOPHILA MELANOGASTER . . . . . . 279
B.21. TESTES DE TRANSFORMAO DE CLULAS DE MAMFERO IN VITRO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282
B.22. TESTE DE LETALIDADE DOMINANTE NO ROEDOR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285
B.23. ENSAIO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM ESPERMATOGNIAS DE MAMFERO . . . . . . . . . . . 288
B.24. TESTE DAS MALHAS (SPOT-TEST) NO RATINHO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/141
B.25. TRANSLOCAO HEREDITRIA NO RATINHO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298
B.26. ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL SUBCRNICA ESTUDO DE TOXICIDADE ORAL DE DOSE REPETIDA
EM ROEDORES COM A DURAO DE 90 DIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302
B.27. ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL SUBCRNICA ESTUDO DE TOXICIDADE ORAL DE DOSE REPETIDA
EM ESPCIES NO ROEDORAS COM A DURAO DE 90 DIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308
B.28. TOXICIDADE DRMICA SUBCRNICA: TESTE DE DOSE REPETIDA POR VIA DRMICA, A NOVENTA
DIAS, EM ROEDORES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314
B.29. TOXICIDADE SUBCRNICA POR INALAO: TESTE DE DOSE REPETIDA POR INALAO, A
NOVENTA DIAS, EM ROEDORES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
B.30. TESTE DE TOXICIDADE CRNICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
B.31. ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE O DESENVOLVIMENTO PR-NATAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
B.32. TESTE DE CARCINOGNESE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338
B.33. TESTE COMBINADO DE TOXICIDADE CRNICA/CARCINOGNESE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 344
B.34. TESTE DE TOXICIDADE SOBRE A REPRODUO EM UMA GERAO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351
B.35. ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE A REPRODUO EM DUAS GERAES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355
B.36. TOXICOCINTICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365
B.37. NEUROTOXICIDADE RETARDADA DE SUBSTNCIAS ORGANOFOSFORADAS POR EXPOSIO
AGUDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369
B.38. NEUROTOXICIDADE RETARDADA DE SUBSTNCIAS ORGANOFOSFORADAS POR ADMINISTRA-
O REPETIDA A 28 DIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
B.39. ENSAIO IN VIVO DA SNTESE NO PROGRAMADA (UDS) DE ADN EM CLULAS DO FGADO DE
MAMFEROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378
B.40. CORROSO DA PELE IN VITRO: ENSAIO DA RESISTNCIA ELCTRICA TRANSCUTNEA (RET) . . . 384
B.40.A. CORROSO DA PELE IN VITRO: ENSAIO EM MODELOS DE PELE HUMANA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394
B.41. ENSAIO DE FOTOTOXICIDADE IN VITRO 3T3 NRU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400
B.42. SENSIBILIZAO DA PELE: ENSAIO DE GNGLIO LINFTICO LOCAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414
B.43. ESTUDO DE NEUROTOXICIDADE EM ROEDORES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420
B.44. ABSORO CUTNEA: MTODO IN VIVO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432
B.45. ABSORO CUTNEA: MTODO IN VITRO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 438
L 142/142 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
INTRODUO GERAL
A. CARACTERIZAO DA SUBSTNCIA EM ESTUDO
Antes de iniciar qualquer estudo de toxicidade devem conhecer-se a composio da substncia em estudo,
incluindo as principais impurezas que contenha, e as propriedades fsico-qumicas mais importantes,
nomeadamente a estabilidade.
As propriedades fsico-qumicas da substncia fornecem informaes de relevo para a escolha da via de
administrao e a concepo de cada estudo especfico, bem como para o manuseamento e a armazenagem da
substncia.
O estudo deve ser precedido do desenvolvimento de um mtodo analtico para a determinao qualitativa e
quantitativa da substncia em estudo (incluindo, sempre que possvel, as principais impurezas) no meio de
administrao e no material biolgico.
Devem incluir-se no relatrio de ensaio todas as informaes disponveis referentes identificao, s
propriedades fsico-qumicas, pureza e ao comportamento da substncia em estudo.
B. CUIDADOS COM OS ANIMAIS
Nos estudos de toxicidade fundamental efectuar um controlo estrito das condies ambientais e utilizar
tcnicas adequadas para o cuidado dos animais.
i) Condies de alojamento
As condies ambientais nos locais ou recintos destinados aos animais devem ser adequadas s espcies em
estudo. Para ratos, ratinhos e cobaias, a temperatura do local deve ser de 22
o
C 3
o
C e a humidade relativa de
30 % a 70 %; no que respeita aos coelhos, a temperatura ambiente deve ser de 20
o
C 3
o
C e a humidade
relativa de 30 % a 70 %.
Algumas tcnicas experimentais so particularmente sensveis aos efeitos da temperatura; em tais casos, a
descrio do mtodo de ensaio deve incluir pormenores relativos s condies adequadas. Em todos os ensaios
de toxicidade, a temperatura e humidade devem ser controladas, registadas e referidas no relatrio final.
A iluminao deve ser artificial, com uma alternncia de 12 horas de luz e 12 horas de obscuridade. Os
pormenores relativos iluminao devem ser registados e includos no relatrio final.
Salvo especificao em contrrio, os animais devem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do
mesmo sexo. Em caso de alojamento colectivo, no devem colocar-se mais de 5 animais numa gaiola.
Nos relatrios de experincias com animais, conveniente indicar o tipo de gaiolas utilizadas e o nmero de
animais alojados em cada gaiola, tanto durante o perodo de exposio substncia em estudo como durante o
eventual perodo de observao subsequente.
ii) Condies de alimentao
A dieta deve satisfazer todos os requisitos nutricionais da espcie em estudo. No caso de as substncias serem
administradas aos animais na respectiva dieta, o valor nutricional da mesma pode ser reduzido pela interaco
entre a substncia e determinados constituintes da dieta. Essa possibilidade deve ser tida em conta na
interpretao dos resultados dos ensaios. Podem utilizar-se dietas convencionais de laboratrio, com um
fornecimento ilimitado de gua para beber. A escolha da dieta pode ser condicionada pela necessidade de
assegurar a administrao adequada da substncia em estudo, caso se recorra a esta via.
Os eventuais contaminantes que influenciem a toxicidade no devem estar presentes em concentraes que
possam interferir com os resultados.
C. ENSAIOS ALTERNATIVOS
A Unio Europeia est empenhada em promover a elaborao e validao de tcnicas alternativas que forneam
a mesma quantidade de informaes que os ensaios actuais em animais, mas que utilizem um nmero inferior
de animais, lhes causem menor sofrimento ou evitem, de todo, o recurso aos mesmos.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/143
Na caracterizao dos riscos e consequente classificao e rotulagem dos produtos e para a avaliao da
segurana qumica devem utilizar-se, sempre que possvel, mtodos deste tipo, medida que se encontrem
disponveis.
D. AVALIAO E INTERPRETAO
Aquando da avaliao e interpretao dos ensaios devem ter-se em conta as limitaes apresentadas pela
extrapolao directa para o homem dos resultados obtidos em estudos com animais e in vitro, pelo que, para a
confirmao dos referidos resultados, devem utilizar-se, sempre que se encontrem disponveis, dados referentes
a efeitos adversos no homem.
E. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
A maioria dos mtodos apresentados foram elaborados no mbito do programa da OCDE das directrizes em
matria de ensaios, devendo os mesmos ser executados em conformidade com as boas prticas de laboratrio,
de modo a garantir, na medida do possvel, o reconhecimento mtuo dos resultados.
Podem obter-se informaes adicionais nas referncias includas nas directrizes da OCDE, bem como em outras
publicaes no domnio em causa.
L 142/144 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B.1.bis. TOXICIDADE ORAL AGUDA PROCEDIMENTO DE DOSE FIXA
1. MTODO
O presente mtodo equivalente ao Test Guideline TG 420 da OCDE (2001).
1.1. INTRODUO
Os mtodos tradicionais de avaliao de toxicidade aguda utilizam a morte dos animais como critrio
especfico. Em 1984, foi sugerida pela British Toxicology Society uma nova abordagem ao ensaio da toxicidade
aguda com base na administrao de uma srie de doses fixas (1). Esta abordagem evitava a utilizao da morte
dos animais como um critrio especfico. O novo mtodo baseava-se na observao de sinais evidentes de
toxicidade ocorrentes a determinado valor de uma srie de doses fixas. Em 1992 e no seguimento dos estudos
de validao in vivo efectuados tanto no Reino Unido (2) como internacionalmente (3), o procedimento foi
adoptado como mtodo de ensaio. Subsequentemente, as propriedades estatsticas do Procedimento de Dose
Fixa foram avaliadas em vrios estudos utilizando modelos matemticos (4)(5)(6). Em conjunto, os estudos in
vivo e de modelao mostraram que o procedimento reprodutvel, utiliza um menor nmero de animais e
causa menor sofrimento do que os mtodos tradicionais, permitindo classificar as substncias de um modo
semelhante a outros mtodos de ensaio de toxicidade aguda.
No Documento de Orientao sobre Ensaios de Toxicidade Oral Aguda (7) podem consultar-se as orientaes
sobre a seleco do mtodo de ensaio mais apropriado a determinado fim. Este Documento de Orientao
contm igualmente informao adicional sobre o procedimento e interpretao do Mtodo de Ensaio B.1.
Um dos princpios bsicos do presente mtodo consiste na utilizao de doses moderadamente txicas no
estudo principal, evitando a administrao de doses previsivelmente letais. Alm disso, no necessrio
administrar doses para as quais se sabe previamente que causam dor e sofrimento bvios, devido sua aco
corrosiva ou fortemente irritante. Os animais moribundos ou os animais que apresentam sinais bvios de dor
ou sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados sem dor e, na interpretao dos resultados do ensaio,
devem ser considerados do mesmo modo que os animais que morrem durante o ensaio. Os critrios sobre a
deciso de sacrificar animais moribundos ou em sofrimento grave, bem como as orientaes sobre a
identificao de morte previsvel ou iminente, esto includos separadamente num Documento de Orienta-
o (8).
O presente mtodo permite obter informao sobre a perigosidade e possibilita a graduao e classificao da
substncia em conformidade com o Sistema Harmonizado ao Nvel Mundial (GHS) para a classificao de
substncias qumicas que causam toxicidade aguda (9).
Antes de efectuar o estudo, o laboratrio de ensaio deve ter em conta toda a informao disponvel sobre a
substncia de ensaio. Esta informao incluir a identificao e a estrutura qumica da substncia, as suas
propriedades fsico-qumicas, os resultados de quaisquer outros ensaios de toxicidade da substncia in vitro ou in
vivo, dados toxicolgicos sobre substncias estruturalmente semelhantes e a(s) utilizao(es) prevista(s) para a
substncia. Esta informao necessria para satisfazer todos os envolvidos em relao relevncia do ensaio
ao nvel da proteco da sade humana e ser til na determinao de uma dose inicial apropriada.
1.2. DEFINIES
Toxicidade oral aguda: refere-se ao conjunto de efeitos adversos que se manifestam aps a administrao oral
de uma dose nica da substncia ou de vrias doses num perodo de 24 horas.
Morte retardada: significa que o animal no morre nem aparenta estar moribundo num perodo de 48 horas,
mas morre mais tarde, no decorrer do perodo de observao de 14 dias.
Dose: quantidade aplicada da substncia de ensaio. O valor da dose expresso em peso de substncia de ensaio
por unidade de peso do animal (mg/kg).
Toxicidade evidente: termo geral que descreve a ocorrncia de sinais bvios de toxicidade na sequncia da
administrao da substncia de ensaio [consultar os exemplos descritos em (3)] no qual a dose fixa mais elevada
seguinte pode induzir, na maior parte dos animais, dor intensa, sinais persistentes de distrbios graves, estado
moribundo (os respectivos critrios so apresentados no Documento de Orientao de Critrios Especficos
sem Dor (8) ou, provavelmente, mortalidade.
GHS: Sistema Harmonizado ao Nvel Mundial (Globally Harmonised System) para a Classificao de
Substncias Qumicas e Misturas. Trata-se de um trabalho conjunto da OCDE (sade humana e ambiente), do
Comit de Peritos em Transporte de Mercadorias Perigosas das Naes Unidas (propriedades fsico-qumicas) e
da OIT (notificao de perigos) e coordenado pelo Programa Interorganizaes para a Boa Gesto das
Substncias Qumicas [Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)].
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/145
Morte iminente: situao em que se prev a ocorrncia de estado moribundo ou morte antes da prxima
observao planeada. Alguns dos sinais indicativos deste estado em roedores incluem convulses, posio
lateral, posio deitada e tremores. [Consultar o Documento de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (8)
para mais detalhes.]
DL
50
(Dose Letal Mdia): dose nica, calculada estatisticamente, de uma substncia susceptvel de causar a
morte de 50 % dos animais quando administrada por via oral. O valor da DL
50
expresso em peso, de
substncia de ensaio, por unidade de peso do animal de ensaio (mg/kg).
Teste-limite: refere-se a uma dose com o valor limite superior admitido pelo ensaio (2 000 ou 5 000 mg/kg).
Estado moribundo: encontrar-se num estado de morte ou de incapacidade de sobrevivncia, mesmo com
tratamento. [Consultar o Documento de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (8) para mais detalhes.]
Morte previsvel: presena de sinais clnicos indicativos de ocorrncia de morte em determinada altura (antes
do final planeado da experincia, por exemplo): incapacidade de alcanar gua ou comida. [Consultar o
Documento de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (8) para mais detalhes.]
1.3. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
So administradas doses gradualmente crescentes a grupos de animais do mesmo sexo, usando as doses fixas de
5, 50, 300 e 2 000 mg/kg (excepcionalmente pode utilizar-se uma dose fixa adicional de 5 000 mg/kg;
consultar a seco 1.6.2). A dose inicial escolhida com base num estudo preliminar de determinao de
amplitude como a dose para qual previsvel obter alguns sinais de toxicidade sem causar efeitos txicos graves
ou mortalidade. Os sinais clnicos e as condies associadas com dor, sofrimento e morte iminente, so
descritos detalhadamente num Documento de Orientaes da OCDE separado (8). Outros grupos de animais
podero ser sujeitos a dosagens, com doses fixas superiores ou inferiores, consoante a presena ou ausncia de
sinais de toxicidade ou mortalidade. Repete-se este procedimento at identificao da dose que causa toxicidade
evidente ou que provoque uma e apenas uma morte ou at dose mais elevada no caso de no serem
observados quaisquer efeitos. O procedimento imediatamente interrompido no caso de se registarem mortes
dose mais baixa.
1.4. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.4.1. Seleco de espcies animais
A espcie preferida para ensaio o rato, mas podem ser utilizadas outras espcies de roedores. Normalmente,
utilizam-se fmeas (7). Tal escolha deve-se ao facto de uma anlise da literatura cientfica relativa aos ensaios
convencionais de DL
50
revelar que, habitualmente, a diferena de sensibilidade entre os sexos pequena e, nos
casos em que so observadas diferenas, as fmeas so, de um modo geral, ligeiramente mais sensveis (10). No
entanto, devem utilizar-se machos caso as propriedades toxicolgicas ou txico-cinticas descritas para
substncias qumicas estruturalmente semelhantes indicarem que estes podem revelar maior sensibilidade.
Quando o ensaio efectuado com machos, deve ser apresentada uma justificao adequada.
Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudveis e pertencentes a estirpes laboratoriais de uso corrente.
As fmeas devem ser nulparas e no grvidas. No incio da administrao das doses, todos os animais
devem ter idades compreendidas entre as 8 e as 12 semanas e um peso compreendido no intervalo de 20 %
do peso mdio dos animais aos quais foram anteriormente administradas doses.
1.4.2. Condies de alojamento e alimentao
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser de 22
o
C ( 3
o
C). A humidade relativa
dever ser 50-60 %, embora sejam aceitveis valores entre um mnimo de 30 % e um mximo que, de
preferncia, no dever exceder 70 %, salvo durante os perodos de limpeza do compartimento. A iluminao
deve ser artificial, com sequncias de 12 horas de luz e 12 horas de escurido. A alimentao pode basear-se em
dietas de laboratrio convencionais, com fornecimento ilimitado de gua para beber. Os animais aos quais
administrada a mesma dose, podem ser agrupados na mesma gaiola desde que, o nmero de animais em cada
gaiola no impea a observao clara de cada um deles.
1.4.3. Preparao dos animais
Os animais so escolhidos ao acaso, marcados de modo a permitir uma identificao individualizada e
mantidos nas suas gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do incio da administrao das doses de modo
a permitir que se aclimatem s condies laboratoriais.
1.4.4. Preparao das doses
De um modo geral, as substncias de ensaio devem ser administradas num volume constante ao longo de toda
a gama de doses a ensaiar atravs da variao da concentrao na preparao da dose. No entanto, para o caso
do ensaio de um produto ou de uma mistura no estado lquido, pode ser mais relevante para a avaliao de
risco subsequente a utilizao da substncia de ensaio sem qualquer diluio, ou seja, a concentrao constante,
sendo este um requisito apresentado por algumas autoridades competentes. Em qualquer dos casos, no deve
ser excedido o volume mximo da dose a ser administrada. O volume mximo de lquido que pode ser
L 142/146 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
administrado de cada vez depende do tamanho do animal de ensaio. No caso de roedores, em condies
normais o volume no deve exceder 1 ml/100 g de peso corporal. Para solues aquosas, contudo, pode ser
considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Recomenda-se que, sempre que possvel, seja considerada
em primeiro lugar a utilizao de uma soluo/suspenso/emulso aquosa; caso tal no seja vivel, pode
considerar-se o uso de uma soluo/suspenso/emulso em leo (por exemplo, leo de milho); em ltima
instncia, poder eventualmente recorrer-se ao uso de solues noutros excipientes. Devem conhecer-se as
caractersticas txicas dos excipientes que no sejam a gua. As doses devem ser preparadas pouco tempo antes
da sua administrao, a menos que a estabilidade da preparao ao longo do perodo de utilizao seja
conhecida e tenha sido considerada aceitvel.
1.5. PROCEDIMENTO
1.5.1. Administrao de doses
A administrao deve ser feita numa toma nica, por sonda esofgica, usando tubo estomacal ou cnula de
intubao apropriada. Nos casos raros em que no possvel a administrao de uma toma nica, a dose pode
ser administrada em fraces menores ao longo de um perodo no superior a 24 horas.
Os animais devem ser sujeitos a jejum antes da administrao das doses (por exemplo, no caso de ratos, no
deve dar-se comida durante a noite, mas deve manter-se o fornecimento de gua; no caso de ratinhos, a comida
deve ser suspensa durante 3-4 horas e deve ser mantido o fornecimento de gua). Aps o perodo de jejum, os
animais devem ser pesados e deve ser administrada a substncia de ensaio. Aps a administrao da substncia,
pode evitar dar-se comida durante 3-4 horas para ratos e 1-2 horas para ratinhos. Nos casos de administrao
fraccionada da dose durante um certo lapso de tempo, pode ser necessrio dar comida e gua aos animais
consoante a durao do perodo de administrao.
1.5.2. Estudo de determinao de amplitude
O objectivo do estudo de determinao de amplitude consiste em seleccionar a dose inicial apropriada para o
estudo principal. A substncia de ensaio administrada a um nico animal de uma forma sequencial segundo
os fluxogramas do anexo 1. O estudo de determinao de amplitude termina quando se pode seleccionar a dose
inicial para o estudo principal (ou se for registada uma morte dose fixa mais baixa).
Para o estudo de determinao de amplitude, a dose inicial seleccionada de entre as doses fixas de 5, 50, 300 e
2 000 mg/kg, como sendo a dose que se prev poder causar toxicidade evidente com base, se possvel, nas
evidncias de dados in vivo e in vitro da mesma substncia qumica ou de substncias qumicas estruturalmente
semelhantes. Na ausncia de tal informao, a dose inicial ser de 300 mg/kg.
O intervalo de aplicao de doses a cada animal ser de, pelo menos, 24 horas. Todos os animais devem ser
observados durante um perodo de, pelo menos, 14 dias.
Excepcionalmente e apenas quando justificado por necessidades regulamentares especficas, pode ser
considerada a utilizao de uma dose fixa superior adicional de 5 000 mg/kg (consultar o Anexo 3). Por razes
de proteco dos animais, desencorajado o ensaio de animais na Categoria 5 do SHG (2 000-5 000 mg/kg).
Esta dose s deve ser considerada quando existe uma elevada probabilidade dos resultados deste ensaio terem
relevncia directa na proteco dos animais, da sade humana ou do ambiente.
Nos casos em que o animal de ensaio morre no estudo de determinao de amplitude quando se aplica a dose
fixa mais baixa (5 mg/kg), o procedimento normal consiste em terminar o estudo e classificar a substncia na
Categoria 1 do GHS (tal como se indica no Anexo 1). No entanto, se for necessria uma confirmao adicional,
pode ser efectuado um procedimento experimental suplementar, tal como se descreve seguidamente. Aplica-se
uma dose de 5 mg/kg a um segundo animal. Se o segundo animal morrer confirma-se a Categoria 1 do GHS e
o estudo imediatamente terminado. Se o segundo animal sobreviver, ser ento administrada a dose de 5 mg/
/kg a um mximo de mais trs animais. Dado que neste caso o risco de mortalidade elevado, a administrao
das doses a estes animais deve ser feita de um modo sequencial, de modo a proteger os animais. O intervalo,
entre a aplicao da dose a cada um dos animais, deve ser suficiente para assegurar a provvel sobrevivncia do
animal anterior. Se ocorrer uma segunda morte, a sequncia de aplicao da dose ser terminada
imediatamente e no sero ensaiados mais animais. Dado que, a ocorrncia de uma segunda morte
(independentemente do nmero de animais ensaiados at ao final do estudo) classificvel no resultado A
(duas ou mais mortes), segue-se a regra de classificao do Anexo 2 para a dose fixa de 5 mg/kg (Categoria 1, se
ocorrerem duas ou mais mortes, ou Categoria 2, se no ocorrer mais do que uma morte). Alm disso,
apresentam-se no Anexo 4 as orientaes sobre a classificao segundo o sistema da UE, vlido at
implementao do novo GHS.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/147
1.5.3. Estudo principal
1.5.3.1. Nmero de animais e doses
No Anexo 2 apresentam-se os procedimentos a seguir aps o ensaio com a dose inicial. necessrio proceder
de uma das trs formas seguintes: terminar os ensaios e classificar a substncia na classe de perigosidade
apropriada, prosseguir os ensaios como uma dose fixa superior, ou prosseguir os ensaios com uma dose fixa
inferior. No entanto, por uma questo de proteco dos animais, a dose que causou morte, no estudo de
determinao de amplitude, no deve ser repetida no estudo principal (consultar Anexo 2). A experincia
prvia indicativa de que o resultado mais provvel da dose inicial ser a possibilidade de classificao da
substncia, o que toma desnecessrios quaisquer ensaios adicionais.
Ser normalmente utilizado um total de cinco animais do mesmo sexo para cada dose investigada. O grupo de
cinco animais ser constitudo por um animal do estudo prvio, ao qual foi administrada a dose seleccionada e
de quatro outros animais (excepto, em casos raros, se a dose utilizada no estudo principal no tiver sido
includa no estudo de determinao de amplitude).
O intervalo de tempo entre a aplicao de doses em cada nvel determinado pelo aparecimento, durao e
gravidade dos sinais de toxicidade. O tratamento dos animais com a dose seguinte deve ser adiado at ser
possvel estabelecer com segurana a sobrevivncia dos animais previamente tratados. Recomenda-se um
perodo de 3 ou 4 dias entre a administrao das doses para cada nvel de dosagem, se necessrio, de modo a
permitir a deteco de efeitos txicos retardados. O intervalo de tempo pode ser ajustado se necessrio, por
exemplo, em caso de resposta inconclusiva.
No caso de se considerar a utilizao da dose fixa mxima de 5 000 mg/kg, deve proceder-se em conformidade
com o procedimento descrito no Anexo 3. (Consultar igualmente a seco 1.6.2.)
1.5.3.2. Teste-limite
O teste-limite utilizado, essencialmente, em situaes nas quais o analista tem informao indicativa de o
material de ensaio no ser provavelmente txico, ou seja, s apresenta toxicidade acima das doses-limite
regulamentadas. A informao sobre a toxicidade do material de ensaio pode ser obtida a partir de ensaios em
compostos semelhantes ou de ensaios de misturas ou produtos semelhantes, tendo em considerao a
identificao e percentagem dos componentes cuja relevncia toxicolgica conhecida. Nos casos em que a
informao sobre a toxicidade do material de ensaio limitada ou inexistente, ou nos casos em que previsvel
que o material a ensaiar seja txico, deve ser efectuado o estudo principal.
Usando o procedimento normal para este ensaio, o teste-limite pode ser efectuado graas a um estudo de
determinao de amplitude com uma dose inicial de 2 000 mg/kg (ou, excepcionalmente, de 5 000 mg/kg),
seguido da administrao da dose a mais quatro animais.
1.6. OBSERVAES
Aps a aplicao da dose, os animais devem ser observados individualmente pelo menos uma vez durante os
primeiros 30 minutos e periodicamente durante as primeiras 24 horas, com especial cuidado nas primeiras
quatro horas. Seguidamente, necessrio observar os animais diariamente durante um perodo de 14 dias,
excepto se for necessrio retir-los do estudo e sacrific-los, sem dor, por motivo do bem-estar dos animais, ou
se forem encontrados mortos. No entanto, a durao do perodo de observao no deve ser estabelecida de
uma forma rgida, mas determinada com base nas reaces de toxicidade, velocidade do seu aparecimento e
durao do perodo de recuperao, que pode ser prolongado, se for considerado necessrio. O momento em
que os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem so importantes, sobretudo se os sinais de toxicidade
tendem a aparecer de uma forma retardada (11). Todas as observaes so registadas sistematicamente,
mantendo-se uma ficha individual para cada animal.
Sero necessrias observaes adicionais se os animais continuaram a apresentar sinais de toxicidade. As
observaes devem incluir alteraes na pele e plos, olhos e membranas mucosas, aparelho respiratrio,
aparelho circulatrio, sistema nervoso autnomo e central, assim como da actividade somatomotora e
comportamental. Devem ser observados com especial ateno os tremores, convulses, salivao, diarreia,
letargia, sono e coma. Devem ser tomados em considerao os princpios e critrios resumidos no Documento
de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (8). Os animais que forem encontrados em estado moribundo e
os animais que apresentarem dores violentas ou sinais de sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados
sem dor. Quando os animais forem sacrificados a fim de evitar dor ou se forem encontrados mortos, deve ser
registado o momento da morte com o maior rigor possvel.
1.6.1. Peso corporal
O peso individual dos animais deve ser determinado pouco antes da administrao da substncia de ensaio e,
seguidamente, pelo menos uma vez por semana. Devem ser calculadas e registadas todas as variaes de peso.
No final do ensaio, os animais sobreviventes so pesados e, seguidamente, sacrificados sem dor.
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1.6.2. Patologia
Todos os animais de ensaio (incluindo os que morreram durante o ensaio ou que foram retirados do ensaio por
motivos de preservao do seu bem-estar) devem ser sujeitos a uma autpsia pouco pormenorizada. Devem ser
registadas as alteraes patolgicas principais observadas em cada animal. Deve tambm ser considerada a
realizao de um exame microscpico dos rgos que mostrem sinais de patologia grave em animais que
sobreviveram, no mnimo, durante 24 horas aps a aplicao da dose inicial, j que este exame pode fornecer
informao til.
2. DADOS
Devem ser apresentados os dados individuais para cada animal. Adicionalmente, todos os dados devem ser
resumidos em forma tabular, mostrando, para cada grupo de ensaio, o nmero de animais utilizado, o nmero
de animais que apresentaram sinais de toxicidade, o nmero de animais que foram encontrados mortos durante
o ensaio ou que foram sacrificados a fim de evitar dor, o momento da morte de cada um dos animais, a
descrio e evoluo temporal dos efeitos de toxicidade e sua reversibilidade, assim como os resultados da
autpsia.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever incluir as seguintes informaes:
Substncia de ensaio:
natureza fsica, pureza e propriedades fsico-qumicas relevantes (incluindo isomerizao);
dados relativos identificao qumica, incluindo nmero CAS.
Excipiente (se apropriado):
caso o excipiente no seja gua, uma justificao para a sua escolha.
Animais de ensaio:
espcie/estirpe usada;
estado microbiolgico do animal, caso seja conhecido;
nmero, idade e sexo dos animais (incluindo, quando necessrio, uma justificao para o uso de machos
em vez de fmeas);
provenincia, condies de alojamento, dieta, etc.
Condies do ensaio:
informao pormenorizada sobre a formulao da substncia de ensaio, incluindo informao detalhada
sobre a forma fsica do material administrado;
informao pormenorizada sobre a administrao da substncia de ensaio, incluindo volume das doses e
momento de aplicao;
informao pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da gua (incluindo tipo e origem da dieta e
origem da gua);
justificao para a escolha da dose inicial.
Resultados:
tabela dos dados de resposta e da dose para cada animal (ou seja, animais que apresentaram sinais de
toxicidade, incluindo mortalidade, natureza, gravidade e durao dos efeitos);
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/149
tabela com indicao do peso corporal e suas variaes;
pesos individuais de animais no dia em que aplicada a dose, uma vez por semana no restante perodo e
na altura da sua morte ou sacrifcio;
data e momento da morte, no caso de ocorrncia de morte antes do sacrifcio previsto;
evoluo temporal do aparecimento de sintomas de toxicidade e sua reversibilidade, para cada animal;
resultados da autpsia e resultados histopatolgicos para cada animal, caso se encontrem disponveis.
Anlise dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the
classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Biometrics, 20, 385.
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. e Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing
of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279-291.
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, RJ., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J.
e Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the
classical LD
50
test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469-482.
(4) Whitehead, A. e Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol,
30, p. 313-324.
(5) Stallard, N. e Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol,
14, p. 315- 323.
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose
procedure.-Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183-196.
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety
Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as
Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and
Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects
of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the
Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/
/home/displaygeneral/0,3380,EN- documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segai,
L., Springer, J.A. e Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD
50
, and Fixed-
-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol, 33, p. 223-231.
(11) Chan P.K e A.W. Hayes (1994), Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . Em: Principies and Methods of
Toxicology, 3
a
Edio. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd, New York, USA.
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ANEXO 1
FLUXOGRAMA PARA O ESTUDO DE DETERMINAO DE AMPLITUDE
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ANEXO 2
FLUXOGRAMA PARA O ESTUDO PRINCIPAL
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ANEXO 3
CRITRIOS PARA A CLASSIFICAO DE SUBSTNCIAS DE ENSAIO COM VALORES PREVISVEIS DE DL
50
SUPERIORES A 2 000 MG/KG PARA AS QUAIS NO NECESSRIO EFECTUAR ENSAIO
Os critrios para a Categoria 5 de perigosidade destinam-se a permitir a identificao de substncias de ensaio que
representam um perigo de toxicidade aguda relativamente baixo, mas que, em certas circunstncias, podem representar
perigo para populaes vulnerveis. previsvel que estas substncias apresentem valores de DL
50
orais ou drmicos na
gama de 2 000-5 000 mg/kg ou dose equivalente para outras vias. As substncias de ensaio podem ser classificadas na
categoria de perigosidade definida por: 2 000 mg/kg < DL
50
< 5 000 mg/kg (Categoria 5 do GHS) nos seguintes casos:
a) se classificadas nesta categoria por qualquer dos esquemas de ensaio do anexo 2, baseados nas incidncias de
mortalidade;
b) se houver prova fivel indicativa de que os valores de DL
50
se encontram na gama correspondente Categoria 5 ou se
outros estudos em animais ou sobre efeitos de toxicidade em seres humanos forem indicativos de preocupao
acentuada em relao salvaguarda da sade humana;
c) atravs de extrapolao, estimativa ou medio de dados, desde que no seja garantida a atribuio a uma classe mais
perigosa, e
quando existe informao fivel indicativa de efeitos de toxicidade significativos em seres humanos, ou
quando no registada mortalidade nos ensaios por via oral at doses correspondentes aos valores para a
Categoria 4, ou
quando os especialistas so da opinio de que no se verificam sintomas clnicos de toxicidade significativos
para ensaios at doses com valores correspondentes Categoria 4, com excepo de diarreia, ereco pilosa ou
m aparncia, ou
nos casos em que os especialistas confirmem a existncia de informao fivel, proveniente de outros estudos
com animais, indicativa da existncia de potenciais efeitos agudos significativos.
ENSAIOS COM DOSES SUPERIORES A 2 000 MG/KG
Apenas pode ser considerada a utilizao de uma dose fixa superior adicional de 5 000 mg/kg em casos excepcionais e
justificados por necessidades especficas legais. Devido ao reconhecimento da necessidade de proteger o bem-estar dos
animais, os ensaios com doses de 5 000 mg/kg so desencorajados e s devem ser considerados no caso de ser muito
provvel que os resultados desse ensaio tenham especial relevncia para a proteco animal ou da sade humana (9).
Estudo de determinao de amplitude
As regras de deciso para o procedimento sequencial apresentado no anexo 1 sero aplicadas ao ensaio com dose de
5 000 mg/kg. Assim, quando se utiliza uma dose de 5 000 mg/kg no estudo de determinao de amplitude, o resultado A
(morte) requer o ensaio com um segundo animal com uma dose de 2 000 mg/kg. Os resultados B e C (toxicidade evidente
ou sem toxicidade) permitem a seleco da dose de 5 000 mg/kg, como dose inicial do estudo princi-
pal. De igual modo, para uma dose inicial diferente de 5 000 mg/kg, o ensaio realizado at dose de 5 000 mg/kg se
o resultado da dose de 2 000 mg/kg for B ou C. No caso de se obter um resultado A na subsequente dose de 5 000 mg/kg, a
dose inicial do estudo principal dever ser 2 000 mg/kg, enquanto para resultados B ou C deve utilizar-se uma dose inicial
de 5 000 mg/kg no estudo principal.
Estudo principal
As regras de deciso para o procedimento sequencial apresentado no anexo 2 sero aplicadas ao ensaio com dose de
5 000 mg/kg. Assim, quando se utiliza uma dose de 5 000 mg/kg no estudo principal, o resultado A (> duas mortes) requer
o ensaio com um segundo grupo, com uma dose de 2 000 mg/kg. Os resultados B (toxicidade evidente e/ou < uma morte)
ou C (sem toxicidade) no permitem a classificao da substncia em conformidade com o GHS. De igual modo, para uma
dose inicial diferente de 5 000 mg/kg, o ensaio realizado at dose de 5 000 mg/kg se o resultado da dose de 2 000 mg/kg
for C. No caso de se obter um resultado A na subsequente dose de 5 000 mg/kg, a substncia ser classificada na Categoria 5
do GHS, enquanto um resultado B ou C no permite a classificao da substncia.
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ANEXO 4
MTODO DE ENSAIO B.1 bis
Orientaes sobre a classificao em conformidade com o esquema transitrio da UE, vlido at implementao total do Sistema de Classificao Harmonizado a Nvel Mundial (GHS) (obtido da
referncia (8))
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B.1.tris. TOXICIDADE ORAL AGUDA MTODO DE CLASSIFICAO DE TOXICIDADE AGUDA
1. MTODO
O presente mtodo equivalente ao Test Guideline TG 423 da OCDE (2001)
1.1. INTRODUO
O mtodo de classificao de toxicidade aguda (1) estabelecido no presente ensaio um procedimento gradual
que utiliza trs animais do mesmo sexo por etapa. Em mdia, consoante a mortalidade e/ou o estado
moribundo dos animais, so necessrias 2-4 etapas para avaliar a toxicidade aguda da substncia de ensaio. O
presente procedimento reprodutvel, utiliza uma quantidade muito limitada de animais e permite classificar as
substncias de um modo semelhante a outros mtodos de ensaio de toxicidade aguda. O mtodo de
classificao de toxicidade aguda baseia-se na avaliao biomtrica (2) (3) (4) (5) com doses fixas, separadas
apropriadamente de modo a permitir a avaliao da substncia para fins de classificao e avaliao de
perigosidade. O mtodo, adoptado inicialmente em 1996, foi amplamente validado in vivo relativamente aos
dados de DL
50
publicados na literatura nacional (6) e internacional (7).
No Documento de Orientao sobre Ensaios de Toxicidade Oral Aguda (8) podem consultar-se as orientaes
sobre a seleco do mtodo de ensaio mais apropriado a determinado fim. Este Documento de Orientao
contm igualmente informao adicional sobre o procedimento e interpretao do Mtodo de Ensaio B.1.tris.
No presente mtodo de ensaio no necessrio administrar doses de substncias de ensaio, que
comprovadamente causam dor e sofrimento bvios, devido sua aco corrosiva ou gravemente irritante.
Os animais moribundos ou que apresentam sinais bvios de dor ou sofrimento grave e continuado devem ser
sacrificados sem dor e, na interpretao dos resultados do ensaio, considerados do mesmo modo que os
animais que morrem durante o ensaio. Os critrios sobre a deciso de sacrificar animais moribundos ou em
sofrimento, bem como as orientaes sobre o reconhecimento de morte previsvel ou iminente, esto includos
separadamente num Documento de Orientao (9).
O presente mtodo utiliza doses estabelecidas previamente e os resultados permitem classificar a substncia em
conformidade com o Sistema Harmonizado ao Nvel Mundial (GHS) para a classificao de substncias
qumicas que causam toxicidade aguda (10).
Em princpio, o mtodo no se destina a calcular rigorosamente os valores de DL
50
, mas permite a
determinao de gamas de exposio definidas, nas quais expectvel a ocorrncia de mortes, dado que um dos
principais critrios especficos do ensaio a morte de uma dada proporo de animais. O mtodo permite
determinar valores de DL
50
somente quando, pelo menos, duas das doses utilizadas resultam numa mortalidade
superior a 0 % e inferior a 100 %. A utilizao de uma seleco de doses, previamente estabelecidas,
independentemente da substncia de ensaio, com a classificao especificamente dependente do nmero de
animais observados em vrios estados melhora as condies de comunicao de resultados entre laboratrios,
bem como a consistncia e a repetibilidade dos resultados.
Antes de efectuar o estudo, o laboratrio de ensaio deve ter em conta toda a informao disponvel sobre a
substncia de ensaio. Esta informao incluir a identificao e a estrutura qumica da substncia, as suas
propriedades fsico-qumicas, os resultados de quaisquer outros ensaios de toxicidade da substncia in vitro ou in
vivo, dados toxicolgicos sobre substncias estruturalmente semelhantes e a(s) utilizao(es) prevista(s) para a
substncia. Esta informao necessria para satisfazer todos os envolvidos em relao relevncia do ensaio
ao nvel da proteco da sade humana e ser til na determinao da dose inicial mais adequada.
1.2. DEFINIES
Toxicidade oral aguda: refere-se ao conjunto de efeitos adversos que se manifestam aps a administrao oral
de uma dose nica da substncia ou de vrias doses num perodo de 24 horas.
Morte retardada: significa que o animal no morre nem aparenta estar moribundo num perodo de 48 horas,
mas morre mais tarde, no decorrer do perodo de observao de 14 dias.
Dose: quantidade aplicada da substncia de ensaio. O valor da dose expresso em peso de substncia de ensaio
por unidade de peso de animal de ensaio (por exemplo, mg/kg).
GHS: Sistema Harmonizado ao Nvel Mundial (Globally Harmonised System) para a Classificao de
Substncias Qumicas e Misturas. Trata-se de um trabalho conjunto da OCDE (sade humana e ambiente), do
Comit de Peritos em Transporte de Mercadorias Perigosas das Naes Unidas (propriedades fsico-qumicas) e
da OIT (notificao de perigos) e coordenado pelo Programa Interorganizaes para a Boa Gesto das
Substncias Qumicas [Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)].
L 142/158 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Morte iminente: situao em que se prev a ocorrncia de estado moribundo ou morte antes da seguinte
observao planeada. Alguns dos sinais indicativos deste estado em roedores incluem convulses, posio
lateral, posio deitada e tremores. [Para informao detalhada, consultar o Documento de Orientao sobre
Critrios Especficos sem Dor (9)].
DL
50
(Dose Letal Mdia): dose nica, calculada estatisticamente, de uma substncia susceptvel de causar a
morte de 50 % dos animais quando administrada por via oral. O valor da DL
50
expresso em peso de
substncia de ensaio por unidade de peso de animal de ensaio (mg/kg).
Dose-limite: refere-se a uma dose com o valor-limite superior admitido pelo ensaio (2 000 ou 5 000 mg/kg).
Estado moribundo: encontrar-se num estado de morte ou de incapacidade de sobrevivncia, mesmo com
tratamento. [Para informao detalhada, consultar o Documento de Orientao sobre Critrios Especficos sem
Dor (9).]
Morte previsvel: presena de sinais clnicos indicativos de ocorrncia de morte em determinada altura, antes
do final planeado da experincia; por exemplo: incapacidade de alcanar gua ou comida. [Consultar o
Documento de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (9) para mais detalhes.]
1.3. PRINCPIO DO ENSAIO
O princpio do presente ensaio que, com base num procedimento gradual com a utilizao de um nmero
mnimo de animais por etapa, possvel obter informao suficiente sobre a toxicidade aguda de uma
substncia de ensaio, de modo a permitir a sua classificao. A substncia administrada, por via oral, a um
grupo de animais de ensaio a uma das doses anteriormente definidas. A substncia ensaiada utilizando um
procedimento gradual, em que cada etapa utiliza trs animais do mesmo sexo (normalmente fmeas). A
existncia ou inexistncia de mortalidade, relacionada com composto, dos animais tratados numa dada etapa,
determinar a etapa seguinte, ou seja:
no so necessrios mais ensaios,
administrada a mesma dose a mais trs animais,
administrada a dose seguinte, maior ou menor, a mais trs animais.
No anexo 1 apresenta-se informao detalhada sobre o procedimento de ensaio. O mtodo permitir uma
avaliao conducente classificao da substncia de ensaio numa das classes de toxicidade definidas pelos
valores-limite de DL
50
.
1.4. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.4.1. Seleco de espcies animais
A espcie de roedores preferida para ensaio o rato, mas podem ser utilizadas outras espcies de roedores.
Normalmente, utilizam-se fmeas (9). Tal escolha deve-se ao facto de uma anlise da literatura cientfica relativa
aos ensaios convencionais de DL
50
revelar que, habitualmente, a diferena de sensibilidade entre os sexos
pequena e, nos casos em que so observadas diferenas, as fmeas so, de um modo geral, ligeiramente mais
sensveis (11). No entanto, devem utilizar-se machos caso as propriedades toxicolgicas ou txico-cinticas
descritas para substncias qumicas estruturalmente semelhantes indicarem que estes podem revelar maior
sensibilidade. Quando o ensaio efectuado com machos, deve ser apresentada uma justificao adequada.
Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudveis e pertencentes a estirpes laboratoriais de uso corrente.
As fmeas devem ser nulparas e no grvidas. No incio da administrao das doses, todos os animais
devem ter idades compreendidas entre as 8 e as 12 semanas e um peso compreendido no intervalo de 20 %
do peso mdio dos animais aos quais foram anteriormente administradas doses.
1.4.2. Condies de alojamento e alimentao
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 22
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C ( 3
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C). A humidade relativa dever
ser 50 %-60 %, embora sejam aceitveis valores entre um mnimo de 30 % e um mximo que, de preferncia,
no dever exceder 70 %, salvo durante os perodos de limpeza do compartimento. A iluminao deve ser
artificial, com sequncias de 12 horas de luz e 12 horas de escurido. A alimentao pode basear-se em dietas
de laboratrio convencionais, com fornecimento ilimitado de gua para beber. Os animais aos quais
administrada a mesma dose podem ser agrupados na mesma gaiola, desde que o nmero de animais em cada
gaiola no impea a observao clara de cada um deles.
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1.4.3. Preparao dos animais
Os animais so escolhidos ao acaso, marcados de modo a permitir uma identificao individualizada e
mantidos nas suas gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do incio da administrao das doses para que
se aclimatem s condies laboratoriais.
1.4.4. Preparao das doses
De um modo geral, as substncias de ensaio devem ser administradas num volume constante ao longo de toda
a gama de doses a ensaiar atravs da variao da concentrao na preparao da dose. No entanto, para o caso
do ensaio de um produto ou de uma mistura no estado lquido, pode ser mais relevante para a avaliao de
risco subsequente a utilizao da substncia de ensaio sem qualquer diluio, ou seja, a concentrao constante,
sendo este um requisito apresentado por algumas autoridades competentes. Em qualquer dos casos, no deve
ser excedido o volume mximo da dose a ser administrada. O volume mximo de lquido que pode ser
administrado de cada vez depende do tamanho do animal de ensaio. No caso de roedores, o volume no deve
exceder, em condies normais, 1 ml/100 g de peso corporal. Para solues aquosas, contudo, pode ser
considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Recomenda-se que, sempre que possvel, seja considerada
em primeiro lugar a utilizao de uma soluo/suspenso/emulso aquosa; caso tal no seja vivel, pode
considerar-se o uso de uma soluo/suspenso/emulso em leo (por exemplo, leo de milho); em ltima
instncia, poder eventualmente recorrer-se ao uso de solues noutros excipientes. Devem conhecer-se as
caractersticas toxicolgicas dos excipientes que no sejam a gua. As doses devem ser preparadas pouco tempo
antes da sua administrao, a menos que a estabilidade da preparao ao longo do perodo de utilizao seja
conhecida e tenha sido considerada aceitvel.
1.5. PROCEDIMENTO
1.5.1. Administrao de doses
A administrao por sonda esofgica deve ser feita, de preferncia, numa toma nica, usando um tubo
estomacal ou uma cnula de intubao apropriada. Nos casos raros em que no possvel a administrao de
uma toma nica, a dose pode ser administrada em fraces menores ao longo de um perodo no superior a
24 horas.
Os animais devem ser sujeitos a jejum antes da administrao das doses (por exemplo, no caso de ratos, no
deve dar-se comida durante a noite, mas deve manter-se o fornecimento de gua; no caso de ratinhos, a comida
deve ser suspensa durante 3-4 horas e deve ser mantido o fornecimento de gua). Aps o perodo de jejum, os
animais devem ser pesados e deve ser administrada a substncia de ensaio. Aps a administrao da substncia,
pode evitar dar-se comida durante 3-4 horas para ratos e 1-2 horas para ratinhos. Nos casos de administrao
fraccionada da dose durante um certo lapso de tempo, pode ser necessrio dar comida e gua aos animais,
consoante a durao do perodo de administrao.
1.5.2. Nmero de animais e doses
So utilizados trs animais em cada etapa. A dose a utilizar inicialmente deve ser seleccionada entre uma das
quatro doses fixas de 5, 50, 300 e 2 000 mg/kg de peso corporal. A dose inicial deve ser aquela que apresenta
maior probabilidade de induzir mortalidade em alguns dos animais tratados. Os fluxogramas do anexo 1
descrevem o procedimento a seguir para cada uma das doses iniciais. Apresentam-se ainda, no anexo 4, as
orientaes sobre a classificao segundo o sistema da UE, em vigor at implementao do novo GHS.
Quando a informao disponvel for indicativa de que no muito provvel que ocorra mortalidade com a
maior dose inicial (2 000 mg/kg de peso corporal), deve efectuar-se um teste-limite. Quando no existir
qualquer informao disponvel sobre a substncia de ensaio, recomenda-se a utilizao de uma dose inicial de
300 mg/kg de peso corporal por razes de proteco dos animais.
O intervalo de tempo entre os grupos de tratamento determinado pelo aparecimento, durao e gravidade
dos sinais de toxicidade. O tratamento dos animais com a dose seguinte deve ser adiado at ser possvel
estabelecer com segurana a sobrevivncia dos animais previamente tratados.
Excepcionalmente, e apenas quando justificado por necessidades legais especficas, pode ser considerada a
utilizao de uma dose fixa superior adicional de 5 000 mg/kg (consultar o anexo 2). Por razes de proteco
dos animais, desencorajado o ensaio de animais na Categoria 5 do GHS (2 000-5 000 mg/kg) e esta dose s
deve ser considerada quando existe uma elevada probabilidade de os resultados deste ensaio terem relevncia
directa para a proteco da sade humana ou dos animais ou do ambiente.
1.5.3. Teste-limite
O teste-limite utilizado, essencialmente, em situaes nas quais o analista tem informao indicativa do
material de ensaio no ser provavelmente txico, ou seja, s apresenta toxicidade acima das doses limite
regulamentadas. A informao sobre a toxicidade do material de ensaio pode ser obtida a partir de ensaios em
compostos semelhantes ou de ensaios de misturas ou produtos semelhantes, tendo em considerao a
identificao e percentagem dos componentes cuja relevncia toxicolgica conhecida. Nos casos em que a
informao sobre a sua toxicidade limitada ou inexistente ou nos casos em que previsvel que o material a
ensaiar seja txico, deve ser efectuado o estudo principal.
L 142/160 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Pode ser efectuado um teste-limite a uma dose de 2 000 mg/kg de peso corporal com seis animais (trs animais
por etapa). Excepcionalmente, pode ser efectuado um teste-limite a uma dose de 5 000 mg/kg de peso corporal
com trs animais (consultar o anexo 2). Caso ocorra mortalidade na sequncia da administrao da substncia
de ensaio, pode ser necessrio efectuar ensaios posteriores com a dose inferior seguinte.
1.6. OBSERVAES
Aps a aplicao da dose, os animais devem ser observados individualmente, pelo menos uma vez durante os
primeiros trinta minutos e periodicamente durante as primeiras 24 horas, com especial cuidado nas primeiras
quatro horas. Em seguida, necessrio observar os animais diariamente, durante um perodo de 14 dias,
excepto se for necessrio retir-los do estudo e sacrific-los sem dor por motivo de bem-estar dos animais, ou
se forem encontrados mortos. No entanto, a durao do perodo de observao no deve ser estabelecida de
uma forma rgida, mas determinada com base nas reaces de toxicidade, velocidade do seu aparecimento e
durao do perodo de recuperao, que pode ser prolongado, se considerado necessrio. O momento em que
os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem so importantes, sobretudo se os sinais de toxicidade tendem a
aparecer de uma forma retardada (12). Todas as observaes so registadas sistematicamente, mantendo-se uma
ficha individual para cada animal.
Sero necessrias observaes adicionais se os animais continuarem a apresentar sinais de toxicidade. As
observaes devem incluir alteraes na pele e plos, olhos, membranas mucosas, aparelho respiratrio,
aparelho circulatrio, sistema nervoso autnomo e central, assim como na actividade somatomotora e
comportamental. Devem ser observados com especial ateno os tremores, convulses, salivao, diarreia,
letargia, sono e coma. Devem ser tomados em considerao os princpios e critrios resumidos no Documento
de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (9). Os animais que forem encontrados em estado moribundo e
os animais que apresentarem dores violentas ou sinais de sofrimento intenso e continuado devem ser
sacrificados sem dor. Quando os animais forem sacrificados a fim de evitar dor ou se forem encontrados
mortos, deve ser registado o momento da morte com o maior rigor possvel.
1.6.1. Peso corporal
O peso individual dos animais deve ser determinado imediatamente aps a administrao da substncia de
ensaio e, seguidamente, pelo menos uma vez por semana. Devem ser calculadas e registadas todas as variaes
de peso. No final do ensaio, os animais sobreviventes so pesados e, seguidamente, sacrificados sem dor.
1.6.2. Patologia
Todos os animais de ensaio (incluindo aqueles que morreram durante o ensaio ou que foram retirados do
ensaio por motivos de preservao do bem-estar do animal) devem ser sujeitos a uma autpsia pouco
pormenorizada. Devem ser registadas as alteraes patolgicas principais observadas em cada animal. Deve
tambm ser considerada a realizao de um exame microscpico dos rgos que mostrem sinais de patologia
grave em animais que sobreviveram, no mnimo, 24 horas aps a aplicao da dose inicial, j que este exame
pode fornecer informao til.
2. DADOS
Devem ser apresentados os dados individuais para cada animal. Adicionalmente, todos os dados devem ser
resumidos em forma tabular, mostrando, para cada grupo de ensaio, o nmero de animais utilizado, o nmero
de animais que apresentaram sinais de toxicidade, o nmero de animais que foram encontrados mortos durante
o ensaio ou que foram sacrificados a fim de evitar dor, o momento da morte de cada um dos animais, a
descrio e evoluo temporal dos efeitos de toxicidade e sua reversibilidade, assim como os resultados da
autpsia.
3. RELATRIO
3.1. Relatrio do ensaio
O relatrio do ensaio dever incluir as seguintes informaes:
Substncia de ensaio:
natureza fsica, pureza e propriedades fsico-qumicas relevantes (incluindo isomerizao);
dados relativos identificao qumica, incluindo o nmero CAS.
Excipiente (se apropriado):
caso o excipiente no seja gua, uma justificao para a sua escolha.
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Animais de ensaio:
espcie/estirpe usada;
estado microbiolgico do animal, caso seja conhecido;
nmero, idade e sexo dos animais (incluindo, quando necessrio, uma justificao para o uso de machos
em vez de fmeas);
provenincia, condies de alojamento, dieta, etc.
Condies do ensaio:
informao pormenorizada sobre a formulao da substncia, incluindo informao pormenorizada
sobre a forma fsica do material administrado;
informao pormenorizada sobre a administrao da substncia de ensaio, incluindo volume das doses e
o momento da aplicao;
informao pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da gua (incluindo tipo e origem da dieta,
origem da gua);
justificao para a escolha da dose inicial.
Resultados:
tabela dos dados de resposta e da dose para cada animal (ou seja, animais que apresentaram sinais de
toxicidade, incluindo mortalidade, natureza, gravidade e durao dos efeitos);
tabela com indicao do peso corporal e suas variaes;
pesos individuais de animais no dia em que aplicada a dose, uma vez por semana no restante perodo e
na altura da sua morte ou sacrifcio;
data e momento da morte, no caso de ocorrncia de morte antes do sacrifcio previsto;
evoluo temporal do aparecimento de sintomas de toxicidade e sua reversibilidade para cada animal;
resultados da autpsia e resultados histopatolgicos para cada animal, caso se encontrem disponveis.
Anlise dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Roll R., Hfer-Bosse Th. And Kayser D., (1986) New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals.
Toxicol. Lett., Suppl. 31, p. 86.
(2) Roll R., Riebschlger M., Mischke U. and Kayser D., (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten
Toxizitt von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336-341.
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1994) The Biometric Evaluation of the
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559-610.
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1995) The Biometric Evaluation of the OECD Modified
Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729-734.
L 142/162 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
(5) Diener W., and Schlede E., (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC
50
Tests. ALTEX 16,
p. 129-134.
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D., (1992) A National Validation Study of the Acute-Toxic-
Class Method An Alternative to the LD
50
Test. Arch. Toxicol. 66, p. 455-470.
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D., (1994) The International Validation Study of the Acute-
-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659-670.
(8) OECD, (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety
Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris.
(9) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as
Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and
Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19.
(10) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And
Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals
Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11. [http://
/webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].
(11) Lipnick R. L., Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel K. A., Walker A. P., Chu I.; Goddard M, Segal L.,
Springer J. A. and Myers R. C., (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD
50
, and Fixed
Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, p. 223-231.
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes., (1994) Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of
Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd., New York, USA.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/163
ANEXO 1
PROCEDIMENTO A SEGUIR PARA CADA UMA DAS DOSES INICIAIS
CONSIDERAES GERAIS
Os esquemas de ensaio, descritos no presente anexo, descrevem esquematicamente o procedimento a seguir para cada dose
inicial.
Anexo 1a: a dose inicial de 5 mg/kg p.c.
Anexo 1b: a dose inicial de 50 mg/kg p.c.
Anexo 1c: a dose inicial de 300 mg/kg p.c.
Anexo 1d: a dose inicial de 2 000 mg/kg p.c.
Consoante o nmero de animais sacrificados sem dor ou mortos, o procedimento de ensaio segue as setas respectivas.
L 142/164 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
ANEXO 1
A PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 5 MG/KG DE PESO CORPORAL
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ANEXO 1 B
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 50 MG/KG DE PESO CORPORAL
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ANEXO 1 C
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 300 MG/KG DE PESO CORPORAL
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ANEXO 1 D
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 2 000 MG/KG DE PESO CORPORAL
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ANEXO 2
CRITRIOS PARA A CLASSIFICAO DE SUBSTNCIAS DE ENSAIO COM VALORES PREVISVEIS DE DL
50
SUPERIORES A 2 000 MG/KG SEM NECESSIDADE DE EFECTUAR ENSAIO
Os critrios para a Categoria de Perigosidade 5 destinam-se a permitir a identificao de substncias de ensaio que
representam um perigo de toxicidade aguda relativamente baixo, mas que, em certas circunstncias, podem representar
perigo para populaes vulnerveis. previsvel que tais substncias apresentem valores de DL
50
por via oral ou drmica na
gama de 2 000-5 000 mg/kg ou dose equivalente para outras vias. As substncias de ensaio podem ser classificadas na
categoria de perigosidade definida por: 2 000 mg/kg < DL
50
< 5 000 mg/kg (Categoria 5 do GHS) nos seguintes casos:
a) se classificadas nesta categoria por qualquer dos esquemas de ensaio do anexo 1a-1d, baseados nas incidncias de
mortalidade;
b) se existir prova fivel indicativa de que os valores de DL
50
se encontram na gama correspondente Categoria 5 ou se
outros estudos em animais ou sobre efeitos de toxicidade em seres humanos forem indicativos de preocupao
acentuada em relao salvaguarda da sade humana;
c) atravs de extrapolao, estimativa ou medio de dados, desde que no seja garantida a atribuio a uma classe mais
perigosa, e
quando existe informao fivel indicativa de efeitos de toxicidade significativos em seres humanos, ou
quando no registada mortalidade nos ensaios por via oral at doses correspondentes aos valores para a
Categoria 4, ou
quando o perito de opinio de que no se verificam sintomas clnicos de toxicidade significativos para ensaios
at doses com valores correspondentes Categoria 4, com excepo de diarreia, ereco pilosa ou m aparncia,
ou
nos casos em que o perito confirme a existncia de informao fivel, proveniente de outros estudos em animais
que seja indicativa da existncia de potenciais efeitos agudos significativos.
ENSAIOS COM DOSES SUPERIORES A 2 000 MG/KG
Devido ao reconhecimento da necessidade de proteger o bem-estar dos animais, os ensaios de animais na Categoria 5
(5 000 mg/kg) so desencorajados e s devem ser considerados no caso de ser muito provvel que os resultados desse ensaio
tenham especial relevncia para a proteco da sade humana ou animal (10). No devem ser efectuados ensaios a doses
superiores.
Quando necessrio efectuar o ensaio com uma dose de 5 000 mg/kg, s necessria uma etapa (ou seja, trs animais). Se o
primeiro animal tratado morre, o ensaio prossegue a uma dose de 2 000 mg/kg, em conformidade com os fluxogramas do
anexo 1. Se o primeiro animal sobrevive, so tratados dois outros animais. Se somente um dos trs animais morrer, de
prever que o valor de DL
50
seja superior a 5 000 mg/kg. Se ambos os animais morrerem, o ensaio prossegue com uma dose
de 2 000 mg/kg.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/169
ANEXO 3
MTODO DE ENSAIO B.l.tris: Orientaes sobre a classificao em conformidade com o esquema transitrio da
UE em vigor at implementao total do Sistema de Classificao Harmonizado a Nvel Mundial (GHS) [obtido
da referncia (8)]
L 142/170 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/171
L 142/172 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/173
B.2. TOXICIDADE AGUDA (INALAO)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
til possuir informaes preliminares sobre a distribuio granulomtrica das partculas, presso de vapor,
ponto de fuso, ponto de ebulio, ponto de inflamao e explosividade (se aplicvel) da substncia de ensaio.
Ver tambm a Introduo Geral, parte B (ponto A).
1.2. DEFINIES
Ver Introduo Geral, parte B (ponto B).
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Vrios grupos de animais de experincia so expostos, durante um perodo determinado, a concentraes
diferentes de substncias a testar razo de uma concentrao por grupo. Subsequentemente, procede-se
observao dos efeitos e das mortes ocorridas. Os animais que morrem durante o ensaio so submetidos a
autpsia e no fim do ensaio os animais sobreviventes so tambm submetidos a autpsia.
Pode ser necessrio sacrificar os animais que apresentem manifestaes graves e permanentes de angstia e dor.
No se deve dosear as substncias de ensaio de uma forma que se saiba provocar dor acentuada e angstia
devido s suas propriedades corrosivas ou irritantes.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.6.1. Preparativos
Os animais so mantidos sob as condies de alojamento e alimentao experimentais durante pelo menos
cinco dias antes do ensaio. Antes do ensaio procede-se a uma escolha aleatria de animais adultos jovens e
saudveis que so distribudos por grupos de tratamento. No necessrio submet-los a uma exposio
simulada a no ser que tal facto seja indicado pelo tipo de aparelho de exposio que se utiliza.
Pode ser necessrio micronizar as substncias de ensaio slidas no sentido de se conseguir partculas com
dimenses apropriadas.
Sempre que necessrio pode adicionar-se substncia de ensaio um veculo adequado para ajudar a obter uma
concentrao adequada da substncia de ensaio na atmosfera e dever utilizar-se ento um grupo de controlo
tratado com veculo. No caso de se utilizar um veculo ou outros aditivos para facilitar a administrao da dose,
necessrio fazer a sua seleco entre os que no produzem efeitos txicos. Pode recorrer-se a dados histricos
se for apropriado.
1.6.2. Condies de ensaio
1.6.2.1. Animais de experincia
Salvo no caso de haver contra-indicaes, o rato constitui a espcie preferencial. Devem utilizar-se as estirpes
vulgarmente utilizadas em laboratrio. Para cada sexo, no incio do ensaio, o intervalo de variao do peso para
os animais utilizados no dever exceder 20 % do valor mdio apropriado.
L 142/174 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.6.2.2. Nmero e sexo
Utilizam-se pelo menos 10 roedores (cinco fmeas e cinco machos) para cada nvel de concentrao. As fmeas
devem ser nulparas e no grvidas.
Nota: Nos ensaios de toxicidade aguda com animais de uma ordem superior dos roedores deve levar-se em
considerao a possibilidade de utilizar um menor nmero de animais. As doses devero ser seleccionadas
cuidadosamente e devero ser feitos todos os esforos possveis para no exceder as doses moderadamente
txicas. Nestes ensaios deve evitar-se a administrao de doses letais da substncia de ensaio.
1.6.2.3. Concentraes de exposio
Estas devem ser em nmero suficiente, pelo menos trs, e adequadamente espaadas para originarem grupos de
ensaio com uma diversidade de efeitos txicos e de taxas de mortalidade. Os dados devero ser suficientes para
permitirem traar uma curva dose/resposta e, sempre que possvel, uma determinao aceitvel do valor CL
50.
1.6.2.4. Teste limite
Se a exposio de cinco machos e cinco fmeas a uma concentrao de 20 mg/l de um gs ou 1 mg/l de um
aerossol ou de partculas, durante quatro horas (ou, nos casos em que tal no seja possvel devido s
propriedades fsico-qumicas, incluindo propriedades explosivas, da substncia testada, mxima concentrao
que seja possvel utilizar) no provocar a morte a qualquer animal num prazo de 14 dias, pode considerar-se
desnecessrio prosseguir os testes.
1.6.2.5. Tempo de exposio
O perodo de exposio deve ser de quatro horas.
1.6.2.6. Equipamento
Os animais devero ser expostos substncia a testar por meio de um dispositivo de inalao concebido de
forma a conseguir-se um fluxo de ar contnuo que assegurar pelo menos 12 renovaes de ar por hora e que
garanta uma concentrao de oxignio apropriada e uma distribuio uniforme do produto a testar no ar. No
caso de se utilizar uma cmara, essa ser concebida de maneira a obter-se uma superlotao mnima dos
animais e uma exposio mxima da substncia de ensaio. Como regra geral, para se assegurar a estabilidade da
atmosfera na cmara, o volume total dos animais de experincia no dever ultrapassar 5 % do volume da
cmara de ensaio. Pode tambm recorrer-se a um sistema de exposio oronasal, de cabea apenas ou de corpo
inteiro em cmara individual; os dois primeiros tipos de exposio permitem reduzir a penetrao por outras
vias.
1.6.2.7. Perodo de observao
O perodo de observao deve ser de, pelo menos, 14 dias. Contudo, o perodo de durao da observao no
deve ser fixo rigidamente. Deve ser determinado pelas reaces txicas, o momento de aparecimento de
sintomas e a durao do perodo de recuperao; em consequncia, pode ser prolongado quando se considerar
necessrio. O momento em que as manifestaes de toxicidade aparecem e desaparecem e o momento da
morte so importantes, especialmente se existir uma tendncia para retardar as mortes.
1.6.3. Procedimento
Imediatamente antes da exposio, os animais so pesados e depois so expostos concentrao de ensaio no
aparelho especificado durante um perodo de quatro horas, aps equilbrio da concentrao na cmara de
ensaio. O tempo para se estabelecer o equilbrio deve ser curto. A temperatura de ensaio deve ser mantida a
22
o
C 3
o
C. Em condies ideais a humidade relativa dever ser mantida entre 30 % e 70 %, mas em alguns
casos (por exemplo, em ensaios de alguns aerossis) tal pode ser impraticvel. A manuteno de uma presso
ligeiramente negativa no interior da cmara de ensaio ( 5 mm de gua) evitar a fuga da substncia de ensaio
para o meio envolvente. Durante o perodo de exposio no haver fornecimento de alimentos nem de gua.
Devem ser utilizados sistemas adequados para gerar e monitorizar a atmosfera de ensaio. O sistema deve
garantir que se atinja to rapidamente quanto possvel condies de exposio estveis. A cmara de ensaio
dever ser concebida e utilizada de tal modo que se mantenha no seu interior uma distribuio homognea da
atmosfera de ensaio.
Dever ser feita a medio ou monitorizao de:
a) dbito de ar (permanentemente);
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/175
b) concentrao real da substncia a testar medida na zona de respirao, pelo menos trs vezes durante a
exposio (algumas atmosferas, por exemplo aerossis em concentraes elevadas, podem necessitar de
uma monitorizao mais frequente). Durante o perodo de exposio diria a concentrao no variar
alm de + 15 % do valor mdio. Contudo, no caso de alguns aerossis esta preciso pode no ser possvel
e uma variao maior poder ento ser aceitvel. No caso dos aerossis, efectuar-se- uma anlise
granulomtrica das partculas tantas vezes quantas forem necessrias (pelo menos uma vez por grupo de
ensaio);
c) temperatura e humidade, continuamente, se for possvel.
Durante e aps a exposio s concentraes so feitas observaes, que devem ser registadas sistematicamente;
so feitas fichas individuais para cada animal. As observaes devero ser efectuadas com frequncia regular
durante o primeiro dia. Deve efectuar-se um exame clnico cuidadoso pelo menos uma vez durante cada dia de
trabalho, e devero ser efectuadas outras observaes diariamente tomando-se aces apropriadas para
minimizar as perdas de animais submetidos a estudo, por exemplo, efectuar-se- a autpsia ou a refrigerao
dos animais encontrados mortos e efectuar-se- o isolamento ou o sacrifcio dos animais fracos ou
moribundos.
As observaes devero incluir as modificaes do plo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho
respiratrio, do aparelho circulatrio, do sistema nervoso autnomo e central, bem como a actividade
somatomotora e do comportamento. Deve prestar-se particular ateno observao de tremores, convulses,
salivao, diarreia, letargia, sono e coma. O momento da morte deve ser registado com uma exactido to
grande quanto possvel. O peso de cada animal deve ser determinado semanalmente aps a exposio e no
momento da morte.
Os animais que morrem durante o ensaio e os sobreviventes no fim do ensaio so submetidos a autpsia com
particular referncia para quaisquer modificaes no tracto respiratrio superior e inferior. Devero ser
registadas todas as modificaes patolgicas. Sempre que for aconselhvel devero ser preparadas amostras dos
tecidos para exame histopatolgico.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser resumidos em quadros indicando-se para cada grupo de experincia o nmero de
animais no incio do teste, o momento da morte de cada animal, o nmero de animais que exibem outras
manifestaes de toxicidade, a descrio dos efeitos txicos e os resultados da autpsia. As variaes de peso
devero ser calculadas e registadas quando o perodo de sobrevivncia exceder um dia. Procede-se ao registo
dos animais que tiverem de ser sacrificados devido dor e angstia associadas substncia, procedendo-se de
igual modo para as mortes associadas ao composto. O valor CL
50
pode ser determinado por um mtodo
reconhecido. A avaliao dos resultados dever incluir a relao, se existir, entre a exposio dos animais
substncia de ensaio e a incidncia e gravidade de todas as anomalias, incluindo as anomalias de
comportamento e clnicas, as leses graves, as modificaes do peso do corpo, a mortalidade e quaisquer
outros efeitos toxicolgicos.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
espcies, estirpe, origem, condies ambientais, dieta, etc.;
condies de ensaio: descrio do aparelho de exposio incluindo projecto, tipo, dimenses, fonte de ar,
sistema para gerar aerossis, mtodo de condicionamento do ar e mtodo para alojar animais na cmara
de ensaio quando esta utilizada. Deve fazer-se uma descrio do equipamento para a medio da
temperatura, da humidade e das concentraes em aerossol e da distribuio granulomtrica.
Resultados sobre a exposio
Estes resultados devero ser agrupados em quadros e apresentados com valores mdios e com uma medio de
variabilidade (por exemplo, desvio-padro) e se possvel devero conter:
a) dbitos de ar atravs do equipamento de inalao;
b) temperatura e humidade do ar;
c) concentraes nominais (quantidade total da substncia de ensaio fornecida ao equipamento de inalao
dividida pelo volume de ar);
L 142/176 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
d) natureza do veculo, se for utilizado;
e) concentraes reais na zona de respirao;
f) dimetro aerodinmico mdio de massa (DAMM) e desvio-padro geomtrico (DPG);
g) perodo de equilbrio;
h) perodo de exposio:
apresentao de um quadro com os dados de resposta por sexo e por nvel de exposio (isto ,
nmero de animais que morreram ou que foram sacrificados durante o ensaio; nmero de animais
que apresentam manifestaes de toxicidade; nmero de animais expostos),
momento da morte durante ou aps a exposio, razes e critrios utilizados para o sacrifcio dos
animais,
todas as observaes,
valor CL
50
determinado para cada sexo no fim do perodo de observao (com especificao do
mtodo de clculo),
intervalo de confiana a 95 % para o valor CL
50
(no caso de este poder ser obtido),
curva de dose/mortalidade e seu declive (sempre que permitido pelo mtodo de determinao),
resultados da autpsia,
resultados das observaes histopatolgicas,
discusso dos resultados (dever prestar-se particular ateno ao efeito que o sacrifcio de animais
durante o ensaio pode ter sobre o valor CL
50
calculado),
interpretao dos resultados.
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B (ponto D).
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B (ponto E).
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/177
B.3. TOXICIDADE AGUDA (DRMICA)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B (ponto A).
1.2. DEFINIO
Ver Introduo Geral, parte B (ponto B).
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhumas.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Aplica-se a substncia de ensaio sobre a pele de diversos grupos de animais de experincia, em doses graduadas,
utilizando-se uma dose por grupo. Subsequentemente, procede-se observao dos efeitos e das mortes
ocorridas. Os animais que morrem durante o ensaio so submetidos a autpsia e no fim do ensaio os animais
sobreviventes so tambm submetidos a autpsia.
Pode ser necessrio sacrificar os animais que apresentem manifestaes graves e permanentes de angstia e dor.
No se deve dosear as substncias de ensaio de uma forma que se saiba provocar dor acentuada e angstia
devido s suas propriedades corrosivas ou irritantes.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.6.1. Preparativos
Os animais so mantidos nas suas gaiolas sob condies de alimentao e alojamento experimentais durante
pelo menos cinco dias antes da experincia. Antes do ensaio os animais adultos jovens e saudveis so
seleccionados aleatoriamente e distribudos por grupos de tratamento. Aproximadamente 24 horas antes do
ensaio deve remover-se o plo da regio dorsal dos animais, tosquiando-o ou rapando-o. Ao tosquiar ou ao
rapar o plo necessrio tomar precaues para evitar leses da pele que possam alterar a sua permeabilidade.
A rea destinada aplicao da substncia de ensaio no poder ser inferior a 10 % da superfcie corporal.
Sempre que se procede ao ensaio de substncias slidas, as quais podem ser pulverizadas quando necessrio, a
substncia de ensaio deve ser humedecida com gua ou com um veculo apropriado para garantir um bom
contacto com a pele. No caso de se utilizar um veculo, deve tomar-se em considerao a influncia desse
veculo relativamente penetrao da substncia de ensaio na pele. Geralmente utilizam-se as substncias de
ensaio lquidas no diludas.
1.6.2. Condies de ensaio
1.6.2.1. Animais de experincia
Pode ser utilizado o rato ou o coelho. Podem ser utilizadas outras espcies sendo necessrio justificar a sua
utilizao. Devem utilizar-se as estirpes vulgarmente utilizadas em laboratrio. Para cada sexo, no incio do
ensaio, o intervalo de variao do peso para os animais utilizados no dever exceder 20 % do valor mdio
apropriado.
1.6.2.2. Nmero e sexo
Utilizam-se pelo menos cinco animais para cada dose. Devem ser todos do mesmo sexo. No caso de se utilizar
fmeas estas devem ser nulparas e no devem estar grvidas. No caso de existir informao disponvel
demonstrando que um dos sexos nitidamente mais sensvel, deve fazer-se a administrao das doses aos
animais desse sexo.
L 142/178 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Nota: Nos ensaios de toxicidade aguda com animais de uma ordem superior dos roedores deve levar-se em
considerao a possibilidade de utilizar um menor nmero de animais. As doses devero ser seleccionadas
cuidadosamente e devero ser feitos todos os esforos possveis para no exceder as doses moderadamente
txicas. Nestes ensaios deve evitar-se a administrao de doses letais da substncia de ensaio.
1.6.2.3. Doses
Estas devem ser em nmero suficiente, pelo menos trs, e adequadamente espaadas para originarem grupos de
ensaio com uma diversidade de efeitos txicos e de taxas de mortalidade. Ao tomar-se a deciso sobre as doses
deve levar-se em considerao quaisquer efeitos irritantes ou corrosivos. Os dados devero ser suficientes para
permitirem traar uma curva dose/resposta e, sempre que possvel, uma determinao aceitvel do valor DL
50
.
1.6.2.4. Teste limite
Pode efectuar-se um teste limite com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso do corpo num grupo de
cinco machos e de cinco fmeas utilizando os procedimentos anteriormente descritos. No caso de se observar
mortalidade associada ao composto necessrio considerar a hiptese de realizar um estudo completo.
1.6.2.5. Perodo de observao
O perodo de observao deve ser de pelo menos 14 dias. Contudo o perodo de durao da observao no
deve ser fixo rigidamente. Deve ser determinado pelas reaces txicas, o momento de aparecimento de
sintomas e a durao do perodo de recuperao; em consequncia, pode ser prolongado quando se considerar
necessrio. O momento em que as manifestaes de toxicidade aparecem e desaparecem e o momento da
morte so importantes, especialmente se existir uma tendncia para retardar as mortes.
1.6.3. Procedimento
Os animais sero colocados em gaiolas individuais. A substncia de ensaio ser aplicada uniformemente numa
rea aproximadamente equivalente a 10 % da superfcie total do corpo. No caso de substncias altamente
txicas, a superfcie a utilizar poder ser menor mas a camada da substncia dever ser o mais fina e uniforme
possvel.
A substncia de ensaio deve ser mantida em contacto com a pele por meio de uma gaze porosa e de um
adesivo antialrgico, durante um perodo de exposio de 24 horas. A superfcie tratada ser por sua vez
convenientemente coberta de maneira a manter no seu lugar a gaze e a substncia de ensaio e de modo a evitar
que os animais ingiram a substncia. Podem ser utilizados aparelhos de conteno para evitar a ingesto da
substncia mas no se recomenda a imobilizao completa,
No fim do perodo de exposio necessrio eliminar todos os resduos da substncia, se possvel, utilizando
gua ou qualquer outro meio adequado para limpeza da pele.
As observaes devem ser feitas e registadas sistematicamente. So feitas fichas individuais para cada animal. As
observaes devero ser efectuadas com frequncia regular durante o primeiro dia. Deve efectuar-se um exame
clnico cuidadoso pelo menos uma vez durante cada dia de trabalho, e devero ser efectuadas outras
observaes diariamente tomando-se aces apropriadas para minimizar as perdas de animais submetidos a
estudo, por exemplo, efectuar-se- a autpsia ou a refrigerao dos animais encontrados mortos e efectuar-se-
o isolamento ou o sacrifcio dos animais fracos ou moribundos.
As observaes devero incluir as modificaes do plo, pele tratada, dos olhos e das mucosas, do aparelho
respiratrio, do aparelho circulatrio, do sistema nervoso autnomo e central, bem como a actividade
somatomotora e do comportamento. Deve prestar-se particular ateno observao de tremores, convulses,
salivao, diarreia, letargia, sono e coma. O momento da morte deve ser registado com uma exactido to
grande quanto possvel. Os animais que morrem durante o ensaio e os que sobrevivem at ao fim do ensaio so
submetidos a autpsia. Devero ser registadas todas as modificaes patolgicas. Sempre que for aconselhvel
devero ser preparadas amostras dos tecidos para exame histopatolgico.
Avaliao da toxicidade no outro sexo
Depois de se ter completado o estudo relativamente a um dos sexos, submete-se a ensaio pelo menos um grupo
de cinco animais do sexo oposto para se verificar se os animais desse sexo no so nitidamente mais sensveis
substncia de ensaio. Em circunstncias individuais pode justificar-se a utilizao de menos animais. No caso de
existir informao adequada disponvel suficiente para demonstrar que os animais do sexo testado so
nitidamente mais sensveis, dispensvel proceder a ensaios com animais do outro sexo.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/179
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser resumidos em quadros indicando-se para cada grupo de experincia o nmero de
animais no incio do teste, o momento da morte de cada animal, o nmero de animais que exibem outras
manifestaes de toxicidade, a descrio dos efeitos txicos e os resultados da autpsia. Os pesos de cada
animal devero ser determinados e registados imediatamente antes da administrao da substncia de ensaio,
decorrida uma semana e no momento da morte; as variaes de peso devero ser calculadas e registadas
quando o perodo de sobrevivncia exceder um dia. Procede-se ao registo dos animais que tiverem que ser
sacrificados devido dor e angstia provocados pela substncia procedendo-se de igual modo para as mortes
provocadas pela substncia. O valor DL
50
pode ser determinado por um mtodo reconhecido.
A avaliao dos resultados dever incluir a relao, se existir, entre a exposio dos animais substncia de
ensaio e a incidncia e gravidade de todas as anormalidades, incluindo as anomalias de comportamento e
clnicas, as leses graves, as modificaes do peso do corpo, a mortalidade e quaisquer outros efeitos
toxicolgicos.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
espcies, estirpe, origem, condies ambientais, dieta, etc.,
condies experimentais (incluindo o mtodo de limpeza da pele e tipo de gaze: oclusiva ou no
oclusiva),
nveis de dosagem (com veculo, no caso de este ser utilizado, e as concentraes),
sexo dos animais submetidos experincia,
quadros com os dados de resposta por sexo e por valores de dosagem (isto , nmero de animais que
morreram ou que foram sacrificados durante os ensaios, nmero de animais que apresentam
manifestaes de toxicidade, nmero de animais expostos),
momento da morte aps a administrao da dose, razes e critrios utilizados para o sacrifcio dos
animais,
todas as observaes,
valor DL
50
para o grupo do sexo submetido ao estudo completo ao longo do perodo de 14 dias
(especificando-se o mtodo de determinao),
intervalo de confiana a 95 % para o valor DL
50
(no caso de ser possvel obter esse valor),
curva dose/mortalidade e seu declive (no caso de isto ser possvel com o mtodo de determinao),
resultados da autpsia,
quaisquer resultados das observaes histopatolgicas,
resultados de qualquer ensaio efectuado sobre o outro sexo,
discusso dos resultados (deve prestar-se particular ateno ao efeito que o sacrifcio dos animais durante
o ensaio pode ter sobre o valor DL
50
calculado),
interpretao dos resultados.
L 142/180 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B (ponto D).
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B (ponto E).
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/181
B.4. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAO/CORROSO DRMICA
1. MTODO
O presente mtodo baseia-se na publicao OECD TG 404 (2002) (normas de ensaio da OCDE).
1.1. INTRODUO
Na preparao do presente mtodo optimizado foi dada especial ateno aos possveis melhoramentos atravs
da avaliao de toda a informao j existente sobre a substncia de ensaio, de modo a evitar testes
desnecessrios em animais de laboratrio e assim ter em considerao a problemtica da proteco dos
animais. O presente mtodo inclui a recomendao de se levar a cabo uma anlise da importncia das provas de
todos os dados relevantes existentes antes de se efectuar o ensaio in vivo descrito para irritao/corroso pela
substncia. No caso de no se encontrarem disponveis dados suficientes, estes podem ser obtidos atravs da
aplicao de ensaios sequenciais (1). A estratgia de ensaio recomendada inclui a execuo de ensaios in vitro
validados e aceites e fornecida como anexo ao presente mtodo. Alm disso, quando for apropriado,
recomenda-se a aplicao sucessiva (no simultnea) de trs pensos de ensaio ao animal no ensaio in vivo inicial.
Tendo em considerao o interesse cientfico e a proteco dos animais, no devem ser efectuados ensaios in
vivo at se proceder a uma avaliao de todos os dados disponveis relevantes potencial corrosibilidade/
/irritabilidade drmica de uma substncia mediante uma anlise de importncia das provas. Os dados devem
incluir resultados de estudos em humanos e/ou animais de laboratrio, provas de corrosibilidade/irritabilidade
de uma ou mais substncias estruturalmente relacionadas, ou de misturas dessas substncias, dados que
demonstrem elevada acidez ou alcalinidade da substncia (2) (3) e resultados de ensaios in vitro ou ex vivo
validados e aceites (4) (5) (5a). Esta anlise deve reduzir a necessidade de ensaios in vivo da corrosibilidade/
/irritabilidade drmica de substncias para as quais j existem dados suficientes provenientes de outros estudos
em relao a estes dois factores.
Junta-se em anexo ao presente mtodo uma estratgia de ensaio sequencial prefervel, que inclui a execuo de
ensaios validados e aceites in vitro ou ex vivo para irritao/corroso. A estratgia foi desenvolvida num grupo de
trabalho (workshop) da OCDE (6), no qual foi recomendada por unanimidade dos participantes, tendo sido
adoptada como estratgia de ensaio recomendada pelo sistema harmonizado a nvel mundial para a
classificao de substncias qumicas (GHS) (7). Apesar de esta estratgia de ensaio sequencial no ser parte
integrante do mtodo de ensaio B.4, recomenda-se que a mesma seja adoptada antes da realizao de ensaios in
vivo. No caso de novas substncias recomenda-se uma metodologia de ensaio por etapas para a obteno de
dados cientficos sobre a corrosibilidade/irritabilidade da substncia. No caso de substncias j existentes, mas
cujos dados insuficientes sobre irritao/corroso drmica so insuficientes, recomenda-se a adopo desta
estratgia para a obteno dos dados em falta. Caso se opte por uma estratgia ou procedimento de ensaio
diferente ou se decida no aplicar uma metodologia de ensaio por etapas, deve apresentar-se uma justificao
para a opo feita.
Um ensaio in vivo, apenas deve ser considerado caso no seja possvel determinar a corrosibilidade, ou a
irritabilidade, atravs da anlise de importncia das provas e de acordo com a estratgia de ensaio sequencial
(ver anexo).
1.2. DEFINIES
Irritao drmica: consiste na produo de danos reversveis na pele aps a aplicao da substncia de ensaio,
por um perodo no superior a quatro horas.
Corroso drmica: consiste na produo de danos irreversveis na pele por exemplo, necrose visvel atravs
da epiderme e que atinge a derme, aps a aplicao de uma substncia de ensaio por um perodo no superior a
quatro horas. As reaces corrosivas tpicas so lceras, sangramento, crostas ensanguentadas e, aps o perodo
de observao de 14 dias, empalidecimento devido descolorao da pele, reas alargadas de alopecia e
cicatrizes. Deve ser considerada uma anlise histopatolgica na avaliao de leses duvidosas.
1.3. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
A substncia de ensaio aplicada em dose nica na pele de um animal de experincia; as reas de pele no
tratadas do animal de experincia so utilizadas como controlo. O grau de irritao/corroso observado e
registado em intervalos determinados e detalhadamente descrito de modo a permitir uma avaliao completa
dos efeitos. A durao do estudo deve ser suficiente para avaliar a reversibilidade ou irreversibilidade dos efeitos
observados.
Os animais que apresentarem sinais de se encontrarem em grave perigo e/ou apresentarem sinais de dor
durante qualquer das etapas do ensaio devem ser abatidos e a substncia deve ser classificada de acordo com
estas observaes. Os critrios para a deciso de abater animais moribundos e animais em grave sofrimento
podem ser consultados na referncia (8).
L 142/182 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.4. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.4.1. Preparao do ensaio in vivo
1.4.1.1. Seleco de espcies animais
O coelho albino o animal de laboratrio mais adequado, devendo ser usados coelhos jovens adultos
saudveis. A utilizao de outras espcies deve ser justificada.
1.4.1.2. Preparao dos animais
Aproximadamente 24 horas antes do ensaio, o plo deve ser removido por corte curto da rea dorsal do tronco
dos animais. Deve ter-se o cuidado de no ferir a pele do animal e s devem ser usados animais com pele
saudvel e intacta.
Algumas estirpes de coelhos tm tufos densos de plo, que so mais proeminentes em certas pocas do ano.
Estas reas de crescimento denso de plo no devem ser utilizadas como local de ensaio.
1.4.1.3. Condies de alojamento e alimentao
Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do biotrio para os coelhos deve ser de 20
o
C
( 3
o
C). Embora a humidade relativa deva ser de pelo menos 30 % e de preferncia no exceder os 70 %,
excepto durante o perodo de limpezas, o valor pretendido deve ser de 50 %-60 %. A iluminao deve ser
artificial, com uma sequncia de 12 horas de luz seguida de uma de 12 horas de escurido. Na alimentao,
podem ser utilizadas dietas convencionais de laboratrio e deve ser fornecida gua de beber sem restries.
1.4.2. Protocolo de ensaio
1.4.2.1. Aplicao da substncia de ensaio
A substncia de ensaio deve ser aplicada numa pequena rea de pele (aproximadamente 6 cm
2
) e coberta com
um penso de gaze, colado com fita adesiva no irritante. Nos casos em que no possvel aplicao directa (por
exemplo, lquidos e algumas pastas), a substncia de ensaio deve ser aplicada num penso de gaze, que , por sua
vez, aplicado pele. Durante o perodo de exposio, o penso deve estar em contacto com a pele de uma forma
ligeiramente solta atravs de uma ligadura semioclusiva adequada. Se a substncia de ensaio for aplicada num
penso, este deve ser mantido sobre a pele de modo a assegurar um bom contacto e uma distribuio uniforme
da substncia na pele. Deve ser evitado o acesso do animal ao penso e a ingesto ou inalao da substncia de
ensaio.
As substncias de ensaio lquidas so geralmente utilizadas sem diluio. Quando se ensaiam slidos (que
podem ser pulverizados, caso tal seja considerado necessrio), a substncia de ensaio deve ser humedecida com
a menor quantidade de gua (ou, se necessrio, com outro excipiente adequado) suficiente para assegurar um
bom contacto com a pele. No caso de serem utilizados excipientes que no gua, a influncia potencial do
excipiente na irritao da pele pela substncia de ensaio deve ser mnima ou nula.
No final do perodo de exposio, que normalmente de quatro horas, a substncia de ensaio residual deve ser
removida, caso tal seja praticvel, utilizando gua ou um solvente apropriado, que no altere a resposta ou a
integridade da epiderme.
1.4.2.2. Nvel de dosagem
Aplica-se ao local de ensaio uma dose de 0,5 ml de lquido ou de 0,5 g de slido ou pasta.
1.4.2.3. Ensaio inicial (ensaio in vivo de irritao/corroso drmica utilizando um animal)
Recomenda-se vivamente que o ensaio in vivo seja efectuado inicialmente utilizando apenas um animal,
sobretudo quando se suspeita que a substncia potencialmente corrosiva. Tal procedimento est em
conformidade com a estratgia de ensaio sequencial (ver anexo 1).
No caso de uma substncia ter sido considerada corrosiva com base numa anlise de importncia das provas,
no so necessrios ensaios adicionais em animais. Para a maior parte das substncias que se suspeite serem
corrosivas, no so normalmente necessrios ensaios in vivo adicionais. No entanto, nos casos em que, devido a
insuficincia de provas, se considere necessria a obteno de dados adicionais, pode ser efectuado um nmero
restrito de ensaios em animais utilizando a seguinte metodologia: aplicao sequencial de at trs pensos de
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/183
ensaio ao animal. O primeiro penso removido aps trs minutos. Caso no se observe qualquer reaco grave
na pele, aplica-se um segundo penso, que removido ao fim de uma hora. Se nesta etapa as observaes
indicarem que se pode aumentar o tempo de exposio para quatro horas em condies no agressivas para o
animal, aplica-se um terceiro penso, que removido aps quatro horas, sendo a resposta devidamente
graduada.
Caso seja observado um efeito corrosivo aps qualquer das trs exposies sequenciais, o ensaio
imediatamente finalizado. Caso no se observe qualquer efeito corrosivo aps a remoo do ltimo penso, o
animal observado durante 14 dias, excepto se desenvolver corroso antes do final desse perodo.
Nos casos em que a substncia de ensaio no seja susceptvel de provocar corroso, mas que possa ser irritante,
deve ser aplicado um nico penso a um animal durante quatro horas.
1.4.2.4. Ensaio de confirmao (ensaio in vivo de irritao drmica com animais adicionais)
Se no for observado um efeito corrosivo no ensaio inicial, a resposta irritante ou negativa deve ser confirmada
utilizando at dois animais adicionais, cada um com um penso e por um perodo de exposio de quatro horas.
Se for observado um efeito irritante no ensaio inicial, o ensaio de confirmao pode ser efectuado de uma
forma sequencial ou atravs da exposio simultnea de dois animais adicionais. No caso excepcional de no
ser efectuado um ensaio inicial, podem tratar-se dois ou trs animais com um penso nico, que removido
quatro horas aps a aplicao. No caso de se utilizarem dois animais e ambos apresentarem a mesma resposta,
no necessrio efectuar mais ensaios. Caso contrrio, o terceiro animal igualmente ensaiado. Pode ser
necessria a utilizao de animais adicionais para confirmar respostas equvocas.
1.4.2.5. Perodo de observao
O perodo de observao deve ter uma durao suficiente para uma avaliao completa da reversibilidade dos
efeitos observados. No entanto, a experincia deve ser interrompida em qualquer altura caso o animal apresente
sintomas continuados de dor intensa ou de se encontrar em situao de perigo. Para a determinao da
reversibilidade dos efeitos, os animais devem ser observados durante 14 dias aps a remoo dos pensos. No
caso de se observar reversibilidade antes do fim do perodo de 14 dias, deve interromper-se a experincia.
1.4.2.6. Observaes clnicas e graduao das reaces da pele
Todos os animais devem ser examinados para sintomas de eritema e edema, sendo as respostas avaliadas aos 60
minutos e s 24, 48 e 72 horas aps a remoo do penso. No ensaio inicial com um animal, o local de ensaio
igualmente examinado imediatamente aps a remoo do penso. As reaces drmicas so graduadas e
registadas de acordo com a graduao da tabela infra. Caso ocorram danos na pele que no possam ser
identificados como irritao ou corroso aps 72 horas, pode ser necessrio efectuar observaes at ao dia 14
para determinar a reversibilidade dos efeitos. Alm da observao de irritao, todos os efeitos txicos locais,
tais como perda de gordura cutnea e quaisquer efeitos sistmicos adversos (por exemplo, efeitos em sintomas
de toxicidade e efeitos no peso corporal), devem ser descritos e registados pormenorizadamente. Poder ser
efectuado um exame histopatolgico para clarificar respostas equvocas.
A graduao das respostas drmicas necessariamente subjectiva. O pessoal que executa as observaes deve
ser treinado adequadamente no sistema de graduao utilizado (ver tabela infra) para se promover a
harmonizao da graduao da resposta drmica e auxiliar os laboratrios de ensaio e as pessoas envolvidas na
obteno e interpretao das observaes. Poder ser til a consulta de um guia ilustrado para graduao da
irritao drmica e outras leses (9).
2. DADOS
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS
Os resultados do estudo devem ser resumidos sob a forma de tabela no relatrio final de ensaio e devem
abranger todos os itens descritos na seco 3.1.
2.2. ANLISE DOS RESULTADOS
Os resultados de irritao drmica devem ser avaliados conjuntamente com a natureza e a gravidade das leses
e a sua reversibilidade ou ausncia de reversibilidade. As respostas individuais no representam um padro
absoluto das propriedades irritantes do material, j que so tambm avaliados outros efeitos do material de
ensaio. Pelo contrrio, os resultados individuais devem ser encarados como valores de referncia, que
necessitam de ser avaliados conjuntamente com todas as outras observaes efectuadas durante o estudo.
L 142/184 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Deve ser considerada a reversibilidade das leses drmicas na avaliao da resposta irritante. Nos casos em que
ocorrerem respostas como alopecia (rea limitada), hiperqueratose, hiperplasia e descamao persistentes no
final do perodo de 14 dias de observao, a substncia de ensaio deve ser considerada irritante.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever incluir as seguintes informaes:
Fundamentao lgica para o ensaio in vivo: anlise de importncia das provas dos dados de ensaio
preexistentes, incluindo os resultados da estratgia de ensaio sequencial:
descrio dos dados relevantes disponveis de ensaios anteriores;
dados obtidos em cada etapa da estratgia de ensaio;
descrio dos ensaios in vitro efectuados, incluindo detalhes sobre o protocolo, resultados obtidos com
substncias de ensaio/referncia;
anlise de importncia das provas para a realizao do estudo in vivo.
Substncia de ensaio:
dados de identificao (por exemplo, nmero CAS, origem, grau de pureza, impurezas conhecidas,
nmero de lote);
natureza fsica e propriedades fsico-qumicas (por exemplo, pH, volatilidade, solubilidade, estabilidade);
no caso de misturas, composio e percentagens relativas dos componentes.
Excipiente:
identificao, concentrao (quando apropriado), volume utilizado;
justificao para a escolha do excipiente.
Animais de ensaio:
espcie/estirpe utilizada, fundamentao lgica para a utilizao de outro tipo de animais que no
coelhos albinos;
nmero de animais de cada sexo;
peso individual dos animais no incio e no final do ensaio;
idade no incio do estudo;
origem dos animais, condies de alojamento, dieta, etc.
Condies do ensaio:
tcnica de preparao do local de aplicao do penso;
descrio pormenorizada dos materiais utilizados no penso e da tcnica de aplicao do penso;
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/185
descrio pormenorizada da preparao, aplicao e remoo da substncia de ensaio.
Resultados:
tabelas com a classificao das respostas de irritao/corroso para cada animal em cada observao;
descrio de todas as leses observadas;
descrio pormenorizada da natureza e grau da irritao ou corroso observadas e de quaisquer
observaes histopatolgicas;
descrio de quaisquer outros efeitos adversos locais (por exemplo, perda de gordura cutnea) e efeitos
sistmicos, alm da irritao ou corroso drmica.
Anlise dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani,
A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The
Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8.
ATLA 23, p. 410-429.
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin
of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology In
Vitro, 2, p. 19-26.
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998)
Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, p. 709-720.
(4) ECETOC (1990) Monograph No 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and
Toxicology Centre, Brussels.
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G.
and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2.
Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.
(5a) Mtodo de Ensaio B.40. Corroso drmica.
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on
Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held
in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and
Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals
Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/
/HCL6.htm).
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as
Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health
and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.
htm).
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office
of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
[Disponvel no Secretariado da OCDE.]
L 142/186 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Tabela I
GRADUAO DE REACES DRMICAS
Formao de eritema e escara
Ausncia de eritema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
Eritema muito ligeiro (fracamente discernvel) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Eritema bem definido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Eritema moderado a grave . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Eritema grave (vermelhido cor de carne) e formao de escara que impede a graduao do eritema 4
Mximo possvel: 4
Formao de edema
Ausncia de edema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
Edema muito ligeiro (fracamente discernvel) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Edema ligeiro (bordos da rea bem definidos por elevao delineada) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Edema moderado (com uma elevao de aproximadamente 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Edema grave (com uma elevao superior a 1 mm e excedendo a rea de exposio) . . . . . . . . . . . 4
Mximo possvel: 4
Poder ser efectuado um exame histopatolgico para clarificar respostas equvocas.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/187
ANEXO
Uma estratgia de ensaio sequencial para a irritao e corroso drmica
CONSIDERAES GERAIS
No sentido de atender aos interesses quer cientficos, quer da proteco dos animais, torna-se importante evitar o uso
desnecessrio de animais e minimizar os ensaios que possam causar reaces graves em animais. Deve ser avaliada toda a
informao sobre a substncia que seja relevante para a sua potencial capacidade irritante/corrosibilidade drmica antes de
se considerarem os ensaios in vivo. possvel que existam j dados suficientes para classificar a substncia de ensaio segundo
o seu potencial irritante ou corrosivo drmico, sem necessidade de recorrer a ensaios em animais de laboratrio. Assim, a
utilizao de uma anlise de importncia das provas e de uma estratgia de ensaio sequencial minimizar a necessidade de
ensaios in vivo, especialmente no caso de substncias com elevada probabilidade de produzirem reaces graves.
Recomenda-se a utilizao da anlise de importncia das provas para avaliar a informao existente sobre irritao e
corroso drmica de substncias, a fim de determinar a necessidade de se efectuarem estudos adicionais, diferentes dos
estudos drmicos in vivo, que sejam teis para caracterizar o referido potencial. No caso de serem necessrios estudos
adicionais, recomenda-se a utilizao de uma estratgia de ensaio sequencial para a obteno dos dados experimentais
relevantes. No caso de substncias para as quais no exista nenhuma histria de ensaios, deve ser utilizada a estratgia de
ensaio sequencial para a obteno dos dados necessrios para avaliar a sua irritao/corroso drmica. A estratgia de ensaio
descrita no presente anexo foi desenvolvida num grupo de trabalho (workshop) da OCDE (1). Foi subsequentemente
confirmada e ampliada no sistema harmonizado e integrado de classificao de perigos para a sade humana e efeitos
ambientais de substncias qumicas, tal como foi aprovado pela 28.
a
sesso conjunta do comit das substncias qumicas e
do grupo de trabalho de substncias qumicas, em Novembro de 1998 (2).
Apesar da presente estratgia de ensaio no fazer parte integrante do mtodo de ensaio B.4, ela expressa a metodologia
recomendada para a determinao das caractersticas de irritao/corroso drmica. Esta metodologia representa no s a
melhor prtica como tambm um ponto de referncia tico para o ensaio in vivo para irritao/corroso drmica. O mtodo
de ensaio fornece uma orientao para a realizao do ensaio in vivo e resume os factores que devem ser considerados antes
de ponderar a execuo deste ensaio. A estratgia fornece uma metodologia para a avaliao dos dados existentes sobre as
propriedades de irritao/corroso drmica de substncias de ensaio e uma metodologia em sries para a obteno de dados
relevantes sobre substncias para as quais sejam necessrios estudos adicionais ou no tenham sido efectuados quaisquer
estudos. Tambm se recomenda a realizao de ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites para o estudo de irritao/
/corroso drmica em circunstncias especficas.
DESCRIO DA ESTRATGIA DE AVALIAO E ENSAIO
Antes da realizao dos ensaios como parte da estratgia de ensaio sequencial (figura), deve ser avaliada toda a informao
disponvel de modo a determinar a necessidade de realizao de ensaios drmicos in vivo. Apesar de ser possvel obter
informao significativa a partir da avaliao de um s parmetro (por exemplo, pH extremo), deve ser avaliada a totalidade
da informao existente. Para uma deciso baseada na anlise da importncia das provas, devem ser avaliados todos os dados
relevantes sobre os efeitos da substncia em causa ou dos seus anlogos estruturais, e deve apresentar-se uma justificao
fundamentada para a deciso tomada. Deve dar-se especial relevncia aos dados existentes sobre a substncia relativamente a
humanos e animais e, em seguida, aos resultados dos ensaios in vitro ou ex vivo. Sempre que possvel, devem ser evitados
estudos in vivo de substncias corrosivas. Os factores considerados na estratgia de ensaio incluem:
Avaliao dos dados existentes sobre humanos e animais (etapa 1). Devem considerar-se em primeiro lugar os dados existentes
sobre humanos por exemplo, estudos clnicos e ocupacionais, relatrios de casos clnicos e/ou dados de ensaios em
animais como, por exemplo, dados obtidos em estudos de toxicidade de exposio drmica simples ou repetida j que
estes dados fornecem informao directamente relacionada com os efeitos na pele. As substncias que apresentem
capacidade irritante ou corrosiva conhecidas, assim como aquelas para as quais existem dados claros de no serem
corrosivas nem irritantes, no necessitam de ser ensaiadas em estudos in vivo.
Anlise de relaes estrutura-actividade (SAR) (etapa 2). Devem ser considerados os resultados de ensaios de substncias
qumicas estruturalmente semelhantes desde que se encontrem disponveis. No caso de existirem dados suficientes sobre
humanos e/ou animais relativos aos efeitos de substncias estruturalmente semelhantes, ou misturas deste tipo de
substncias, indicativos do seu potencial de irritao/corroso drmica, pode presumir-se que a substncia de ensaio em
avaliao produzir as mesmas respostas. Nestes casos, poder no ser necessrio proceder a ensaios da substncia de
ensaio. Os dados negativos obtidos de estudos de substncias estruturalmente semelhantes ou misturas dessas substncias
no constituem prova suficiente de no corrosibilidade/no irritabilidade da substncia segundo a estratgia de ensaio
sequencial. Devem ser utilizadas abordagens de SAR validadas e aceites para identificao do potencial de irritao e de
corroso drmica.
Propriedades fsico-qumicas e reactividade qumica (etapa 3). As substncias que apresentam um pH extremo, tal como 2,0 ou
11,5, podem ter efeitos locais fortes. Se o pH extremo servir como base de identificao da substncia como corrosiva
para a pele, a sua reserva cida/alcalina (ou poder tampo) deve ser tambm tida em considerao (3) (4). Se o poder tampo
indicar que a substncia pode no ser corrosiva para a pele, devem ser efectuados ensaios adicionais para confirmar esta
indicao, de preferncia utilizando ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites (ver etapas 5 e 6).
L 142/188 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Toxicidade drmica (etapa 4). Caso se tenha provado que uma substncia qumica muito txica por via drmica, pode no ser
exequvel um estudo in vivo de irritao/corroso drmica por a quantidade de substncia de ensaio normalmente aplicada
poder exceder a dose muito txica, resultando consequentemente na morte ou em sofrimento grave dos animais. Alm
disso, pode no ser necessrio efectuar ensaios drmicos de irritao/corroso adicionais quando os estudos de toxicidade
drmica utilizando coelhos albinos tenham sido efectuados at um nvel de dosagem limite de 2 000 mg/kg de peso
corporal ou superior e no tenha sido observada qualquer irritao ou corroso drmica. Deve ter-se em conta uma srie de
consideraes aquando da avaliao da toxicidade drmica aguda em estudos efectuados anteriormente. Por exemplo, a
informao contida no relatrio sobre leses drmicas pode estar incompleta. Os ensaios e as observaes podem ter sido
efectuados noutra espcie que no o coelho, podendo as vrias espcies diferir grandemente na sensibilidade das respostas
apresentadas. A forma como a substncia de ensaio foi aplicada aos animais pode no ter sido adequada avaliao da
irritao/corroso da pele [por exemplo, diluio das substncias para ensaio da toxicidade drmica (5)]. No entanto, nos
casos em que os estudos de toxicidade drmica em coelhos foram projectados e efectuados correctamente, os resultados
negativos podem ser considerados prova suficiente de que a substncia no irritante nem corrosiva.
Resultados de ensaios in vitro ou ex vivo (etapas 5 e 6). No necessrio proceder a ensaios em animais com substncias que
tenham apresentado propriedades corrosivas ou de irritao grave num ensaio in vitro ou ex vivo validado e aceite (6) (7) que
tenha sido desenvolvido para avaliar especificamente estes efeitos. Pode considerar-se que tais substncias produziro efeitos
graves semelhantes in vivo.
Ensaio in vivo em coelhos (etapas 7 e 8). Caso seja tomada a deciso de efectuar um ensaio in vivo com base numa anlise da
importncia das provas, este deve comear por um ensaio inicial usando um animal. Se os resultados deste ensaio indicarem
que a substncia corrosiva para a pele, no devem ser efectuados outros ensaios. Se o ensaio inicial no revelar quaisquer
efeitos corrosivos, a resposta irritante ou negativa deve ser confirmada utilizando at dois animais adicionais com um
perodo de exposio de quatro horas. No caso de se observar um efeito irritante no ensaio inicial, o ensaio de confirmao
deve ser efectuado de uma forma sequencial ou atravs da exposio de dois animais adicionais simultaneamente.
REFERNCIAS
(1) OECD, (1996) Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and
Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://
/www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(2) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of
Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on
Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M., (1998) An Evaluation
of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, p. 709-720.
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H., (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of
Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxicology In Vitro, 2(1), p. 19-
-26.
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I., (1996) Animal, Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation,
in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6,
Chapter 31, p. 411-436.
(6) Mtodo de Ensaio B.40.
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch,
M., (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by
the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483524.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/189
Figura
ESTRATGIA DE ENSAIO E AVALIAO PARA IRRITAO/CORROSO DRMICA
L 142/190 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B.5. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAO/CORROSO OCULAR
1. MTODO
O presente mtodo baseia-se na publicao OECD TG 405 (2002) (normas de ensaio da OCDE).
1.1. INTRODUO
Na preparao do presente mtodo optimizado foi dada especial importncia aos possveis melhoramentos
resultantes da avaliao de toda a informao j existente sobre a substncia de ensaio, de modo a evitar ensaios
desnecessrios em animais de laboratrio e assim ter em considerao a problemtica da proteco dos
animais. O presente mtodo inclui a recomendao de se efectuar uma anlise da importncia das provas (1)
dos dados relevantes existentes antes de se efectuar o ensaio in vivo descrito para irritao/corroso ocular
aguda. No caso de no se encontrarem disponveis dados suficientes, recomenda-se a obteno desses dados
atravs da aplicao de ensaios sequenciais (2) (3). A estratgia de ensaio recomendada inclui a execuo de
ensaios in vitro validados e aceites e fornecida como anexo ao mtodo de ensaio. Alm disso, recomenda-se o
uso de um ensaio in vivo de irritao/corroso drmica para previso da corroso ocular antes de se considerar
um ensaio ocular in vivo.
Tendo em considerao o interesse cientfico e a proteco dos animais, no devem ser considerados ensaios in
vivo at se proceder a uma avaliao de todos os dados disponveis relevantes potencial corrosibilidade/
/capacidade irritante ocular de uma substncia para uma anlise da importncia das provas. Os dados devem
incluir provas de estudos existentes em humanos e/ou animais de laboratrio, provas de corrosibilidade/
/capacidade irritante de uma ou mais substncias estruturalmente relacionadas, ou de misturas dessas
substncias, dados que demonstrem elevada acidez ou alcalinidade da substncia (4) (5) e resultados de ensaios
in vitro ou ex vivo, validados e aceites, para corroso e irritao da pele (6) (6a). Estes estudos podem ter sido
efectuados previamente ou como resultado de uma anlise de importncia das provas.
Uma anlise deste tipo pode indicar, para algumas substncias, a necessidade de estudos in vivo do potencial de
irritao/corroso ocular da substncia. Em todos estes casos, antes de considerar a utilizao de um ensaio
ocular in vivo, deve efectuar-se preferencialmente um estudo in vivo prvio sobre os efeitos drmicos da
substncia, avaliados de acordo com o mtodo de ensaio B.4 (7). A aplicao de uma anlise de importncia das
provas e a estratgia de ensaio sequencial devero reduzir a necessidade de ensaios in vivo para a corrosibilidade/
/capacidade irritante ocular de substncias para as quais existem suficientes provas prvias de outros estudos.
Caso a determinao do potencial de corroso ou irritao ocular no possa ser efectuada utilizando a
estratgia de ensaio sequencial, mesmo aps a realizao de um estudo in vivo da corroso e irritao drmica,
pode ser efectuado um ensaio in vivo de irritao/corroso ocular.
Junta-se ao anexo do presente mtodo de ensaio uma estratgia de ensaio sequencial prefervel, que inclui a
execuo de ensaios validados in vitro ou ex vivo para irritao/corroso. A estratgia foi desenvolvida num
grupo de trabalho (workshop) da OCDE (8), no qual foi recomendada por unanimidade dos participantes, tendo
sido adoptada como estratgia de ensaio recomendada pelo sistema harmonizado a nvel mundial para a
classificao de substncias qumicas (GHS) (9). Recomenda-se que a estratgia de ensaio sequencial seja
adoptada antes de realizar ensaios in vivo. No caso de substncias novas, recomenda-se uma metodologia de
ensaio por etapas para a obteno de dados cientficos sobre a corrosibilidade/capacidade irritante da
substncia. No caso de substncias j existentes mas cujos dados sobre irritao/corroso drmica e ocular so
insuficientes, recomenda-se a adopo desta estratgia para a obteno dos dados em falta. Caso se opte por
uma estratgia ou protocolo de ensaio diferente ou se decida no aplicar uma metodologia de ensaio por
etapas, dever apresentar-se uma justificao fundamentada.
1.2. DEFINIES
Irritao ocular: consiste na produo de alteraes oculares aps a aplicao de uma substncia de ensaio
superfcie anterior do olho, alteraes essas que so completamente reversveis no intervalo de 21 dias aps a
aplicao.
Corroso ocular: consiste na produo de leses do tecido ocular ou enfraquecimento fsico grave da viso
aps aplicao da substncia de ensaio superfcie anterior do olho, no reversveis no intervalo de 21 dias
aps a aplicao.
1.3. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
A substncia de ensaio aplicada em dose nica a um dos olhos do animal de experincia; o olho que no sofre
tratamento utilizado como controlo. O grau de irritao/corroso ocular avaliado pelas leses de perfurao
da conjuntiva, da crnea e da ris, a intervalos determinados. So tambm descritos outros efeitos sobre o olho
e efeitos sistmicos adversos, de modo a permitir uma avaliao completa dos efeitos. A durao do estudo
deve ser suficiente para avaliar a reversibilidade ou irreversibilidade dos efeitos.
Os animais que apresentem sinais continuados de se encontrarem em grave perigo e/ou apresentarem sinais de
dor durante qualquer das etapas do ensaio devem ser abatidos e a substncia deve ser classificada de acordo
com estas observaes. Os critrios para a deciso de abater animais moribundos e animais em grave
sofrimento podem ser consultados na referncia (10).
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/191
1.4. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.4.1. Preparao para o ensaio in vivo
1.4.1.1. Seleco de espcies
O coelho albino o animal de laboratrio mais adequado, devendo ser usados animais adultos, jovens e
saudveis. A utilizao de outras estirpes ou espcies deve ser justificada.
1.4.1.2. Preparao dos animais
Devem examinar-se ambos os olhos do animal seleccionado provisoriamente para o ensaio 24 horas antes do
incio do ensaio. No devem ser usados animais que apresentem irritao ocular, defeitos oculares ou leso
preexistente da crnea.
1.4.1.3. Condies de alojamento e alimentao
Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do biotrio para os coelhos deve ser de 20
o
C (
3
o
C). A humidade relativa deve ser no mnimo de 30 % e, preferivelmente, no exceder 70 %, excepto durante
a lavagem do biotrio, devendo no entanto manter-se idealmente a valores de 50 %-60 %. A iluminao deve
ser artificial, com uma sequncia de 12 horas de luz e 12 horas de escurido. Como alimentao, podem ser
utilizadas dietas de laboratrio convencionais com fornecimento ilimitado de gua para beber.
1.4.2. Protocolo de ensaio
1.4.2.1. Aplicao da substncia de ensaio
A substncia de ensaio deve ser colocada no saco conjuntival de um dos olhos de cada animal, depois de se ter
separado cuidadosamente a plpebra inferior do globo ocular. Fecham-se as plpebras cuidadosamente durante
cerca de um segundo de modo a evitar a perda de material. O outro olho, que permanece sem tratamento,
utilizado como controlo.
1.4.2.2. Irrigao
Os olhos dos animais de ensaio no devem ser lavados pelo menos nas 24 horas seguintes instilao da
substncia de ensaio, excepto para o caso de slidos (consultar a seco 1.4.2.3.2) e no caso de ocorrncia
imediata de efeitos corrosivos ou irritantes. Aps 24 horas, desde que se considere apropriada, pode ser
efectuada uma lavagem.
No se recomenda a utilizao de um grupo-satlite de animais para investigar a influncia da lavagem, excepto
se tal se justificar cientificamente. Se for necessrio um grupo-satlite de animais, devem utilizar-se dois
coelhos. As condies de lavagem devem ser cuidadosamente documentadas, por exemplo, data e hora da
lavagem; composio e temperatura da soluo de lavagem; durao, volume e velocidade de aplicao.
1.4.2.3. Nvel de dosagem
1.4.2.3.1. Ensaio de lquidos
No caso do ensaio de lquidos, usa-se uma dose de 0,1 ml. No devem ser utilizados nebulizadores de bomba
para instilao directa da substncia no olho. O nebulizado lquido deve ser expelido e recolhido num
recipiente antes de se instilar 0,1 ml no olho.
1.4.2.3.2. Ensaio de slidos
No caso de ensaio de substncias slidas, pastas ou substncias em partculas, a quantidade usada deve ter um
volume de 0,1 ml ou uma massa no superior a 100 mg. O material de ensaio deve ser pulverizado a um p
fino. O volume de material slido deve ser medido aps compactao suave, por exemplo, atravs de batidas do
recipiente que o contm. Se ao tempo da primeira observao, 1 hora aps o tratamento, a substncia de ensaio
slida no tiver sido removida do olho do animal de ensaio atravs de mecanismos fisiolgicos, o olho pode ser
lavado com soro fisiolgico ou gua destilada.
L 142/192 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.4.2.3.3. Ensaio de aerossis
Recomenda-se a recolha do contedo de todos os nebulizadores de bomba e aerossis antes de instilao no
olho. A nica excepo para substncias em recipientes de aerossol pressurizados, que no podem ser
recolhidos devido sua vaporizao. Nestes casos, deve manter-se o olho aberto e administrar-se a substncia
de ensaio no olho numa aplicao nica de durao aproximada de um segundo, mantendo o recipiente
directamente frente do olho a uma distncia de 10 cm. Esta distncia pode variar em funo da presso do
nebulizador e do seu contedo. Devem ser tomadas precaues adequadas para no danificar o olho devido
presso do nebulizador. Em casos apropriados, pode ser necessrio avaliar o potencial de leso mecnica do
olho pela fora da nebulizao.
Pode obter-se uma estimativa da dose de um aerossol atravs de simulao do ensaio da seguinte forma:
nebuliza-se a substncia para um papel de pesagem atravs de uma abertura do tamanho do olho de coelho,
colocada directamente em frente do papel. Utiliza-se o aumento de peso do papel como uma aproximao da
quantidade nebulizada para o olho. Para substncias volteis, a dose pode ser estimada por pesagem do
recipiente de recolha antes e aps a remoo do material de ensaio.
1.4.2.4. Ensaio inicial (ensaio in vivo de irritao/corroso ocular utilizando um animal)
Tal como articulado na estratgia de ensaio sequencial (ver anexo 1), recomenda-se vivamente que o ensaio in
vivo seja efectuado inicialmente utilizando um animal.
Se, utilizando o protocolo descrito, os resultados deste ensaio indicarem que a substncia corrosiva ou
fortemente irritante para o olho, no devem ser efectuados outros ensaios de irritao ocular.
1.4.2.5. Anestesia local
A utilizao de anestesia local pode ser feita, mas analisando a sua necessidade caso a caso. Se a anlise de
importncia das provas indicar que a substncia pode causar dor ou se os ensaios iniciais revelarem ocorrncia
de reaco dolorosa, pode utilizar-se um anestsico local antes da instilao da substncia de ensaio. A seleco
do tipo, concentrao e dose de anestsico local deve ser feita cuidadosamente de modo a assegurar que a sua
utilizao no altere a reaco substncia de ensaio. O olho de controlo deve ser anestesiado de igual forma.
1.4.2.6. Ensaio de confirmao (ensaio in vivo de irritao ocular com animais adicionais)
Se no for observado um efeito corrosivo no ensaio inicial, a resposta irritante ou negativa deve ser confirmada
utilizando at dois animais adicionais. Se for observado no ensaio inicial um efeito francamente irritante,
indicativo de um efeito possivelmente forte (irreversvel) no ensaio de confirmao, recomenda-se que se
efectue o ensaio de confirmao de uma forma sequencial num animal de cada vez, em vez de expor dois
animais adicionais simultaneamente. Se o segundo animal apresentar efeitos corrosivos ou fortemente
irritantes, no se deve continuar o ensaio. Pode ser necessria a utilizao de animais adicionais para confirmar
respostas de irritao fracas ou moderadas.
1.4.2.7. Perodo de observao
A durao do perodo de observao deve ser suficiente para uma avaliao completa da magnitude e
reversibilidade dos efeitos observados. No entanto, a experincia deve ser interrompida em qualquer altura se o
animal apresentar sintomas continuados de dor intensa ou de se encontrar em situao de perigo (9). Para a
determinao da reversibilidade dos efeitos, os animais devem ser examinados normalmente durante 21 dias
aps a administrao da substncia de ensaio. No caso de se observar reversibilidade antes do fim do perodo
de 21 dias, deve interromper-se a experincia.
1.4.2.7.1. Observaes clnicas e graduao das reaces oculares
Os olhos devem ser examinados 1, 24, 48 e 72 horas aps a aplicao da substncia de ensaio. Os animais s
devem ser mantidos sob ensaio durante o tempo necessrio para obter informao definitiva. Os animais que
apresentem sintomas continuados de dor intensa ou de perigo devem ser abatidos sem demora, sendo a
substncia classificada de acordo com estes resultados. Os animais que apresentem as seguintes leses oculares
posteriores instilao devem ser abatidos: perfurao da crnea; ulcerao significativa da crnea, incluindo
estafiloma; sangue na cmara anterior do olho; opacidade da crnea de grau 4 persistente durante 48 horas;
ausncia de reflexo luz (resposta da ris de grau 2) persistente durante 72 horas; ulcerao da membrana
conjuntival; necrose da conjuntiva ou da membrana nictitante; ou formao de crosta. Este procedimento
devido ao facto de normalmente este tipo de leses ser irreversvel.
Os ensaios com animais que no desenvolvam leses oculares podem ser interrompidos, mas no antes de trs
dias aps a instilao. Os animais que apresentem leses fracas a moderadas devem permanecer sob observao
at cura de todas as leses ou durante o perodo de 21 dias, aps o qual o estudo finalizado. As observaes
devem ser efectuadas 7, 14 e 21 dias aps a aplicao de modo a determinar o estado das leses e a sua
reversibilidade ou irreversibilidade.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/193
Os graus da reaco ocular (conjuntiva, crnea e ris) devem ser anotados em cada exame (tabela I). Quaisquer
outras leses do olho (por exemplo, pannus da crnea, colorao) ou efeitos sistmicos adversos devem
igualmente ser includos no relatrio.
O exame das reaces pode ser facilitado pela utilizao de uma lupa binocular, de uma lmpada de fenda
manual, de um biomicroscpio ou de outro instrumento apropriado. Aps anotao das observaes no final
de 24 horas, o exame aos olhos pode ser feito recorrendo a fluorescena.
A graduao das respostas oculares necessariamente subjectiva. O pessoal que executa as observaes deve ser
treinado adequadamente no sistema de graduao utilizado para promover a harmonizao da graduao da
resposta ocular e auxiliar os laboratrios de ensaio e as pessoas envolvidas na obteno e interpretao das
observaes.
2. DADOS
2.2. ANLISE DOS RESULTADOS
Os resultados de irritao ocular devem ser avaliados conjuntamente com a natureza e gravidade das leses e a
sua reversibilidade ou ausncia de reversibilidade. As respostas individuais no representam um padro
absoluto das propriedades irritantes do material, j que so tambm avaliados outros efeitos do material de
ensaio. Pelo contrrio, os resultados individuais devem ser encarados como valores de referncia que s so
significativos quando corroborados por uma descrio e avaliao completas de todas as observaes.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever incluir as seguintes informaes:
Fundamentao lgica para o ensaio in vivo: anlise de importncia das provas dos dados de ensaio
preexistentes, incluindo os resultados da estratgia de ensaio sequencial:
descrio dos dados relevantes disponveis de ensaios anteriores;
dados obtidos em cada etapa da estratgia de ensaio;
descrio dos ensaios in vitro efectuados, incluindo detalhes sobre o protocolo, resultados obtidos com
substncias de ensaio/referncia;
descrio do estudo efectuado in vivo sobre irritao/corroso drmica, incluindo os resultados obtidos;
anlise de importncia das provas para a realizao do estudo in vivo.
Substncia de ensaio:
dados de identificao (por exemplo, nmero CAS, origem, grau de pureza, impurezas conhecidas,
nmero de lote);
natureza fsica e propriedades fsico-qumicas (por exemplo, pH, volatilidade, solubilidade, estabilidade,
reactividade com gua);
no caso de misturas, composio e percentagens relativas dos componentes;
no caso de utilizao de um anestsico local, identificao, grau de pureza, tipo, dose e interaco
potencial com a substncia de ensaio.
Excipiente:
identificao, concentrao (quando apropriado), volume utilizado;
L 142/194 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
justificao para a escolha do excipiente.
Animais de ensaio:
espcie/estirpe utilizada, fundamentao lgica para a utilizao de outro tipo de animais que no
coelhos albinos;
idade de cada animal no incio do estudo;
nmero de animais de cada sexo no ensaio e nos grupos de controlo (se necessrio);
peso individual dos animais no incio e no final do ensaio;
origem, condies de alojamento, dieta, etc.
Resultados:
descrio do mtodo utilizado para medir a irritao em cada observao (por exemplo, lmpada de
fenda manual, biomicroscpio, fluorescena);
disposio em tabelas dos dados sobre a resposta irritante/corrosiva para cada animal em cada
observao at remoo do animal do ensaio;
descrio pormenorizada do grau e natureza da irritao ou corroso observadas;
descrio de quaisquer outras leses do olho observadas (por exemplo, vascularizao, formao de
pannus da crnea, adeses, colorao);
descrio de efeitos no oculares locais e efeitos sistmicos adversos e, caso sejam efectuadas, das
observaes histopatolgicas.
Anlise dos resultados.
3.2. INTERPRETAO DOS RESULTADOS
A extrapolao dos resultados dos estudos de irritao ocular em animais de laboratrio para humanos tem
uma validade limitada. Em muitos casos, o coelho albino mais sensvel do que os humanos a substncias
irritantes ou corrosivas oculares.
A interpretao dos dados deve ser feita cuidadosamente de modo a excluir irritao resultante de infeces
secundrias.
4. REFERNCIAS
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani,
A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P., (1995) The
Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8.
ATLA 23, p. 410-429.
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I.,
Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N., (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical
Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159-164.
(3) Worth A.P. and Fentem J.H., (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA
27, 161-177
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin
of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology In
Vitro, 2, p. 19-26.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/195
(5) Neun, D.J., (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH.
J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G.
and Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2.
Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.
(6a) Mtodo de Ensaio B.40 para corroso da pele.
(7) Mtodo de Ensaio B.4. Toxicidade aguda: irritao/corroso drmica.
(8) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held
in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(9) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and
Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals
Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.
htm).
(10) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as
Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health
and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.
htm).
L 142/196 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Tabela I
GRADUAO DE LESES OCULARES
Crnea
Opacidade: grau de densidade (as medies devem ser efectuadas na rea mais densa) (*)
Sem ulcerao nem opacidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
reas de opacidade escassas ou difusas (para alm de uma pequena perda do lustre normal); detalhes da ris
claramente visveis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
rea translcida claramente discernvel; detalhes da ris ligeiramente obscurecidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
rea nacarada; no so visveis os detalhes da ris; o tamanho da pupila dificilmente discernvel . . . . . . . . . . . 3
Crnea opaca; a ris no discernvel atravs da opacidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Mximo possvel: 4
NOTAS
(*) Deve ser anotada qual a rea de opacidade da crnea.
ris
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
Rugas marcadamente profundas, congesto, tumefaco, hiperemia ao redor da crnea moderada; ou injeco;
ris reactiva luz (considera-se que uma reaco lenta um efeito) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Hemorragia, destruio macia ou ausncia de reaco luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Mximo possvel: 2
Conjuntiva
Vermelhido (refere-se conjuntiva palpebral e bulbar; excluindo a crnea e a ris)
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
Alguns vasos sanguneos com hiperemia (injectados) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Cor carmesim difusa; vasos individuais no so claramente discernveis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Cor vermelho-carne difusa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Mximo possvel: 3
Quimiose
Tumefaco (refere-se s plpebras e/ou s membranas nictantes)
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
Alguma tumefaco acima do normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Tumefaco bvia, com everso parcial das plpebras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Tumefaco, com as plpebras semicerradas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Tumefaco, com as plpebras mais do que semicerradas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Mximo possvel: 4
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ANEXO
Uma estratgia de ensaio sequencial para a irritao e corroso ocular
CONSIDERAES GERAIS
No sentido de atender aos interesses quer cientficos, quer da proteco dos animais, torna-se importante evitar o uso
desnecessrio de animais e minimizar os ensaios que possam causar reaces graves em animais. Deve ser analisada toda a
informao sobre a substncia que seja relevante para a sua potencial capacidade irritante/corrosibilidade ocular antes de se
considerarem os ensaios in vivo. possvel que existam j dados suficientes para classificar a substncia de ensaio segundo o
seu potencial irritante ou corrosivo ocular, sem necessidade de recorrer a ensaios em animais de laboratrio. Assim, a
utilizao de uma anlise de importncia das provas e de uma estratgia de ensaio sequencial minimizar a necessidade de
ensaios in vivo, especialmente no caso de substncias susceptveis de produzir reaces graves.
Recomenda-se a utilizao da anlise de importncia das provas para avaliar a informao existente sobre irritao e
corroso ocular e determinar a necessidade de se efectuar estudos adicionais, diferentes dos estudos oculares in vivo, que
sejam teis para caracterizar o referido potencial. No caso de serem necessrios estudos adicionais, recomenda-se a
utilizao de uma estratgia de ensaio sequencial para a obteno dos dados experimentais relevantes. No caso de
substncias para as quais no exista nenhuma histria de ensaios, deve ser utilizada a estratgia sequencial para a obteno
dos dados necessrios para avaliar a sua irritao/corroso ocular. A estratgia de ensaio descrita no presente anexo foi
desenvolvida num grupo de trabalho (workshop) da OCDE (1). Foi subsequentemente confirmado e ampliado no sistema
harmonizado e integrado de classificao de perigos para a sade humana e efeitos ambientais de substncias qumicas, tal
como foi aprovado pela 28.
a
sesso conjunta do comit das substncias qumicas e do grupo de trabalho de substncias
qumicas, em Novembro de 1998 (2).
Apesar da presente estratgia de ensaio no fazer parte integrante do mtodo de ensaio B.5, ela expressa a metodologia
recomendada para a determinao das propriedades de irritao/corroso ocular. Esta metodologia representa no s a
melhor prtica como tambm um ponto de referncia tico para o ensaio in vivo para irritao/corroso ocular. O mtodo de
ensaio fornece uma orientao para a realizao do ensaio in vivo e resume os factores que devem ser considerados antes de
ponderar a execuo deste ensaio. A estratgia de ensaio sequencial fornece uma metodologia de anlise da importncia das
provas para a avaliao dos dados existentes sobre as propriedades de irritao/corroso ocular de substncias e uma
metodologia em sries para a obteno de dados relevantes sobre substncias para as quais sejam necessrios estudos
adicionais ou para os quais no tenham sido efectuados quaisquer estudos. A estratgia inclui inicialmente a realizao de
ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites e, seguidamente, do mtodo de ensaio B.4 para o estudo de irritao/corroso
drmica em circunstncias especficas (3) (4).
DESCRIO DA ESTRATGIA DE ENSAIO POR ETAPAS
Antes da realizao dos ensaios como parte da estratgia de ensaio sequencial (figura) deve ser avaliada toda a informao
disponvel de modo a determinar a necessidade de realizao de ensaios oculares in vivo. Apesar de ser possvel obter
informao significativa a partir da avaliao de um s parmetro (por exemplo, pH extremo), deve ser avaliada a totalidade
da informao existente. Para uma deciso baseada na anlise da importncia das provas, devem ser avaliados todos os dados
relevantes sobre os efeitos da substncia em causa, bem como dos seus anlogos estruturais, e deve apresentar-se uma
justificao fundamentada para a deciso tomada. Deve dar-se especial relevncia aos dados existentes sobre a substncia
relativamente a humanos e animais e, seguidamente, aos resultados dos ensaios in vitro ou ex vivo. Sempre que possvel,
devem ser evitados estudos in vivo de substncias corrosivas. Os factores considerados na estratgia de ensaio incluem:
Avaliao dos dados existentes sobre humanos e animais (etapa 1). Devem considerar-se em primeiro lugar os dados existentes
sobre humanos por exemplo, estudos clnicos e ocupacionais, relatrios de casos clnicos e/ou dados de ensaios de
estudos oculares em animais , j que estes dados fornecem informao directamente relacionada com os efeitos nos olhos.
Em seguida, devem ser avaliados os dados disponveis sobre estudos de investigao da irritao/corroso drmica em
humanos e/ou animais. As substncias que apresentem evidncias de corrosibilidade ou capacidade irritante grave para os
olhos conhecidas no devem ser instiladas em olhos de animais. De igual forma, as substncias que apresentam efeitos
corrosivos ou irritantes para a pele tambm no devem ser instiladas em olhos de animais, devendo ser consideradas
igualmente corrosivas e/ou irritantes para os olhos. As substncias que apresentem provas suficientes de no serem
corrosivas ou irritantes em estudos oculares efectuados anteriormente tambm no devem ser ensaiadas em estudos
oculares in vivo.
Anlise de relaes estrutura-actividade (SAR) (etapa 2). Devem ser considerados os resultados de ensaios de substncias
qumicas estruturalmente semelhantes, caso se encontrem disponveis. No caso de existirem dados sobre humanos e/ou
animais suficientes, relativos aos efeitos de substncias estruturalmente semelhantes ou a misturas deste tipo de substncias,
indicativos do seu potencial de irritao/corroso ocular, pode presumir-se que a substncia de ensaio produzir as mesmas
reaces. Nestes casos, poder no ser necessrio proceder a ensaios da substncia. Os dados negativos obtidos de estudos de
substncias estruturalmente semelhantes ou misturas dessas substncias no constituem prova suficiente de no-
-corrosibilidade/no-irritabilidade da substncia sob estratgia de ensaio sequencial. Devem ser utilizadas abordagens de SAR
validadas e aceites para identificao do potencial de irritao e corroso, tanto dos efeitos drmicos como oculares.
Propriedades fsico-qumicas e reactividade qumica (etapa 3). As substncias que apresentam pH extremos, tais como 2,0 ou
11,5, podem ter efeitos locais fortes. Se o pH extremo servir como base de identificao da corrosibilidade ou capacidade
irritante ocular de uma substncia, a sua reserva cida/alcalina (poder tampo) tambm deve ser tida em considerao (5) (6).
Se o poder tampo indicar que a substncia pode no ser corrosiva para o olho, devem ser efectuados ensaios adicionais
para confirmar esta indicao, de preferncia utilizando ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites (ver seco das eta-
pas 5 e 6).
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Considerao de outras informaes existentes (etapa 4). Nesta etapa, deve ser avaliada toda a informao disponvel sobre
toxicidade sistmica por via drmica. Deve ser tambm considerada a toxicidade drmica aguda da substncia de ensaio. Se
tiver sido demonstrado que a substncia muito txica por via drmica pode no ser necessrio efectuar ensaios oculares.
Apesar de no existir necessariamente uma relao entre a toxicidade drmica aguda e a irritao/corroso ocular, pode
considerar-se que se um agente muito txico por via drmica, tambm mostrar elevada toxicidade quando instilado no
olho. Estes dados podem ser tambm considerados entre as etapas 2 e 3.
Resultados de ensaios in vitro ou ex vivo (etapas 5 e 6). No necessrio proceder a ensaios em animais de substncias que
tenham apresentado propriedades corrosivas ou de irritao grave em ensaios in vitro ou ex vivo (7) (8) que tenham sido
validados e aceites para estimar especificamente a corrosibilidade/capacidade de irritao ocular ou drmica. Pode
considerar-se que estas substncias produziro efeitos graves semelhantes in vivo. Se no se encontrarem disponveis ensaios
in vitro/ex vivo validados e aceites, devem ultrapassar-se as etapas 5 e 6 e passar-se directamente etapa 7.
Avaliao da capacidade irritante ou corrosibilidade drmica in vivo de uma substncia (etapa 7). Caso no existam dados suficientes
para uma anlise da importncia das provas conclusiva sobre o potencial de irritao/corroso de uma substncia baseada
nos dados dos estudos supramencionados, deve proceder-se em primeiro lugar a uma avaliao do potencial de irritao/
/corroso drmica in vivo, utilizando o mtodo de ensaio B.4 (4) e o seu anexo (9). Se a substncia causar corroso ou
irritao grave da pele, deve ser considerada um irritante ocular corrosivo, excepto se existir outro tipo de informao que
apoie uma concluso alternativa. Assim, no h necessidade de efectuar um ensaio ocular in vivo. Se a substncia no for
corrosiva ou gravemente irritante para a pele, deve efectuar-se um ensaio ocular in vivo.
Ensaio in vivo em coelhos (etapas 8 e 9). O ensaio ocular in vivo deve comear por um ensaio inicial usando um animal. Se os
resultados deste ensaio indicarem que a substncia provoca irritao grave ou corrosiva para os olhos, no devem ser
efectuados outros ensaios. Se o ensaio no revelar quaisquer efeitos corrosivos ou de irritao grave, deve efectuar-se um
ensaio de confirmao com dois animais adicionais.
REFERNCIAS
(1) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of
Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January
1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(2) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of
Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on
Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H., (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27,
p. 161-177.
(4) Mtodo de ensaio B.4. Toxicidade aguda: irritao/corroso drmica.
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of
Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology In Vitro, 2, p. 19-26.
(6) Neun, D.J., (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol.
Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch,
M., (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by
the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483524.
(8) Mtodo de Ensaio B.40. Corroso drmica.
(9) Anexo ao mtodo de ensaio B.4: Uma estratgia de ensaio sequencial para irritao e corroso drmicas.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/199
Figura
Estratgia de ensaio e avaliao para irritao/corroso ocular
L 142/200 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/201
B.6. SENSIBILIZAO CUTNEA
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Observaes
A sensibilidade e capacidade dos mtodos de ensaio para detectar substncias que possam induzir
sensibilizao cutnea considera-se importante num sistema de classificao em matria de toxicidade no
domnio da sade pblica.
No existe um mtodo nico que permita identificar de modo adequado todas as substncias que possuam um
potencial de sensibilizao cutnea para o homem.
Na seleco do mtodo de ensaio devem ter-se em conta factores tais como as caractersticas fsicas da
substncia, nomeadamente a sua capacidade de penetrao na pele.
Desenvolveram-se dois tipos de ensaios em porquinhos-da-ndia: ensaios com adjuvantes, em que a reaco
alrgica desencadeada por uma soluo ou suspenso da substncia em estudo em adjuvante completo de
Freunds, e os ensaios sem adjuvantes.
Em geral, os ensaios com adjuvantes permitem determinar o potencial de sensibilizao cutnea no homem
com mais preciso que os mtodos que no utilizam o adjuvante completo de Freunds, pelo que so
preferveis.
O ensaio de maximizao em porquinhos-da-ndia constitui um mtodo com adjuvante largamente utilizado.
Embora possam utilizar-se vrios outros mtodos para determinar o potencial de sensibilizao cutnea, o
mtodo em causa considerado o mais adequado.
Os ensaios sem adjuvantes (de que o ensaio de Buehler constitui o mais popular) so considerados menos
sensveis quando aplicados a determinadas classes de substncias.
Em alguns casos, podem existir motivos para a seleco do ensaio de Buehler, em que se procede aplicao
tpica, em vez do mtodo de maximizao em porquinhos-da-ndia, que utiliza a injeco intradrmica. No
caso do recurso ao mtodo de Buehler, deve fornecer-se a respectiva justificao.
O presente mtodo descreve o ensaio de maximizao em porquinhos-da-ndia e o mtodo de Buehler. Pode
recorrer-se a outros mtodos devidamente validados cuja utilizao seja cientificamente justificada.
Se um ensaio de despiste reconhecido fornecer um resultado positivo, a substncia submetida ao ensaio pode
ser designada potencialmente sensibilizante e pode no ser necessrio efectuar subsequentemente um ensaio
com cobaias. No entanto, se o referido ensaio fornecer um resultado negativo, necessrio efectuar um ensaio
com cobaias segundo a metodologia aplicvel ao presente mtodo de ensaio.
Ver tambm a parte B da Introduo Geral.
1.2. DEFINIES
Sensibilizao cutnea (dermatite de contacto alrgica): reaco cutnea, de origem imunolgica, a uma
determinada substncia. No homem, a reaco pode incluir pruridos, eritrema, edema, ppulas, vesculas,
bolhas ou uma combinao dos mesmos. Em outras espcies, as reaces podem diferir, embora apenas se
observe eritrema e edema.
Exposio de induo: exposio experimental de um indivduo a uma substncia em estudo, com o objectivo de
induzir uma reaco de hipersensibilidade.
Perodo de induo: perodo de, pelo menos, uma semana aps a exposio de induo, durante o qual pode
surgir uma reaco de hipersensibilidade.
Exposio de desencadeamento: exposio experimental a uma determinada substncia, aps o perodo de
induo, de um indivduo previamente exposto mesma, de modo a averiguar uma eventual reaco de
hipersensibilidade.
L 142/202 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
A sensibilidade e a fiabilidade da tcnica experimental utilizada devem ser determinadas semestralmente por
recurso a substncias que se saiba possurem propriedades de sensibilizao cutnea ligeiras ou moderadas.
Num ensaio realizado de forma adequada, a utilizao de um sensibilizante ligeiro ou moderado deve
determinar uma reaco de pelo menos 30 %, no caso de um ensaio com adjuvante, e de pelo menos 15 % no
caso de um ensaio sem adjuvante.
Recomenda-se a utilizao das substncias seguintes:
Nmero CAS Nmero EINECS Denominao EINECS Denominao comum
101-86-0 202-983-3 -Hexilcinamaldedo -Hexilcinamaldedo
149-30-4 205-736-8 Benzotiazolo-2-tiol (mercapto-
benzotiazolo)
Kaptax
94-09-7 202-303-5 Benzocana Norcana
Em determinados casos devidamente justificados podem utilizar-se outras substncias que satisfaam os
critrios atrs referidos.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Os animais utilizados so inicialmente expostos substncia em estudo por injeco intradrmica e/ou
aplicao epidrmica (exposio de induo). Aps um perodo de repouso de 14 dias (perodo de induo),
durante o qual poder observar-se uma reaco imunitria, os animais so expostos a uma dose de
desencadeamento. A extenso e o grau da reaco cutnea exposio de desencadeamento nos animais do
lote de ensaio comparada com a reaco observada nos animais do lote de controlo, sujeitos a um produto
inactivo na fase da induo e objecto da exposio de desencadeamento.
1.5. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
Caso se afigure aconselhvel a remoo da substncia em estudo, deve utilizar-se para tal gua ou um solvente
adequado que no altere a reaco observada, bem como a integridade da epiderme.
1.5.1. Ensaio de maximizao nos porquinhos-da-ndia
1.5.1.1. P r e pa r a o
Os animais (porquinhos-da-ndia albinos adultos, jovens e saudveis) so aclimatados s condies laboratoriais
durante, pelo menos, cinco dias. Antes do ensaio, procede-se respectiva distribuio aleatria por lotes. O
plo removido com o auxlio de uma tesoura ou lmina ou, eventualmente, por depilao qumica, de acordo
com o mtodo utilizado. Deve evitar-se produzir feridas. Os animais so pesados antes do incio do ensaio e
aps o respectivo termo.
1.5.1.2. Cond i e s d e e ns a i o
1.5.1.2.1. Animais de ensaio
Os animais devem ser porquinhos-da-ndia albinos de utilizao corrente em laboratrio.
1.5.1.2.2. Nmero e sexo
Podem utilizar-se animais de ambos os sexos. Caso se utilizem fmeas, estas devem ser nulparas e no grvidas.
Utiliza-se um mnimo de 10 animais no lote de ensaio e um mnimo de cinco animais no lote de controlo.
Caso se utilizem menos de 20 animais no lote de ensaio e menos de 10 animais no lote de controlo, no
possvel concluir a natureza sensibilizante do produto, pelo que se recomenda vivamente a realizao de
ensaios com outros animais, at atingir os nmeros referidos.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/203
1.5.1.2.3. Doses
A concentrao de substncia em estudo utilizada em cada exposio por induo deve apresentar uma boa
tolerncia sistmica e corresponder concentrao mxima que produz uma irritao cutnea ligeira a
moderada. A concentrao utilizada na exposio de desencadeamento deve consistir na dose mxima no
irritante. Se necessrio, as concentraes adequadas podem ser determinadas a partir de um estudo-piloto
utilizando dois ou trs animais. Para tal, devem utilizar-se animais objecto de ensaio com adjuvante completo
de Freunds.
1.5.1.3. P r oc e d i me nt o
1.5.1.3.1. Induo
Dia 0 lote de ensaio
Administram-se trs pares de injeces intradrmicas de 0,1 ml na regio da espdua.
1.
a
injeco: mistura adjuvante completo de Freunds/gua ou soro fisiolgico (1:1) (v/v).
2.
a
injeco: substncia em estudo dissolvida num veculo adequado, na concentrao escolhida.
3.
a
injeco: substncia em estudo dissolvida numa mistura adjuvante completo de Freunds/gua ou soro
fisiolgico (1:1) (v/v), na concentrao escolhida.
Na 3.
a
injeco, as substncias hidrossolveis so dissolvidas na fase aquosa antes da mistura com adjuvante
completo de Freunds. As substncias lipossolveis ou insolveis so suspensas em adjuvante completo de
Freunds antes de adicionadas fase aquosa. A concentrao final da substncia em estudo deve ser igual
utilizada na 2.
a
injeco.
As 1.
a
e 2.
a
injeces so administradas em regies vizinhas, to prximas quanto possvel do crnio, enquanto
que a 3.
a
injeco administrada na parte posterior da zona de ensaio.
Dia 0 lote de controlo
Administram-se trs pares de injeces intradrmicas de 0,1 ml na mesma regio usada no caso dos animais do
lote de ensaio.
1.
a
injeco: mistura adjuvante completo de Freunds/gua ou soro fisiolgico (1:1) (v/v).
2.
a
injeco: veculo no diludo.
3.
a
injeco: mistura a 50 % (m/v) do veculo numa mistura adjuvante completo de Freunds/gua ou soro
fisiolgico (1:1) (v/v).
5.
o
-7.
o
dias lotes de ensaio e de controlo
No caso de a substncia no constituir um irritante cutneo, a zona de ensaio, com o plo previamente
removido, tratada, cerca de 24 horas antes da aplicao tpica de induo, com 0,5 ml de soluo a 10 % de
laurilssulfato de sdio em vaselina, de modo a produzir irritao local.
6.
o
-8.
o
dias lote de ensaio
O plo novamente removido da zona de ensaio. Impregna-se totalmente uma folha de papel de filtro
(2 4 cm) da substncia em estudo, dissolvida ou suspensa num veculo adequado, que se aplica na zona de
ensaio, sendo mantida em contacto com a mesma durante 48 horas, com o auxlio de um penso oclusivo. Deve
justificar-se a escolha do veculo utilizado. Os slidos devem ser finamente divididos e incorporados num
veculo adequado. Os lquidos podem ser aplicados directamente, se for caso disso.
L 142/204 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
6.
o
-8.
o
dias lote de controlo
O plo novamente removido da zona de ensaio. O veculo aplicado de modo anlogo ao anteriormente
descrito, sendo tambm mantido em contacto com a referida zona durante 48 horas, com o auxlio de um
penso oclusivo.
1.5.1.3.2. Desencadeamento
20.
o
-22.
o
dias lotes de ensaio e de controlo
Remove-se o plo do flanco dos animais dos lotes de ensaio e de controlo. Aplica-se num dos flancos de cada
animal um apsito ou uma cmara impregnados da substncia em estudo; se necessrio, pode aplicar-se no
outro flanco um apsito ou uma cmara impregnados do veculo. Os sistemas em causa so mantidos em
contacto com a pele com o auxlio de um penso oclusivo.
1.5.1.3.3. Observao e avaliao: lotes de ensaio e de controlo
Cerca de 21 horas aps a remoo do apsito ou da cmara, a zona em estudo limpa, sendo o plo
removido com o auxlio de uma tesoura ou lmina, se necessrio.
Cerca de 3 horas depois (ou seja, cerca de 48 horas aps o incio do ensaio), observa-se a reaco cutnea,
que se regista de acordo com a escala indicada no apndice.
Cerca de 24 horas aps a primeira observao (72 horas aps o incio do ensaio), procede-se a um novo
exame, cujos resultados se registam de modo anlogo.
Recomenda-se a realizao de leituras cegas com os animais dos lotes de ensaio e de controlo.
Caso seja necessrio clarificar os resultados obtidos no primeiro ensaio de desencadeamento, pode realizar-se
um segundo ensaio com um novo lote de controlo, cerca de uma semana depois. Pode tambm realizar-se um
segundo ensaio de desencadeamento com o mesmo lote de controlo.
Devem observar-se e registar-se de acordo com a escala de Magnusson/Kligman (ver apndice) todas as reaces
anormais, nomeadamente reaces sistmicas, resultantes dos processos de induo e desencadeamento. Alm
disso, podem efectuar-se outros exames, nomeadamente um exame histopatolgico ou uma determinao da
espessura da prega cutnea, com o objectivo de clarificar eventuais reaces duvidosas.
1.5.2. Ensaio de Buehler
1.5.2.1. P r e pa r a o
Os animais (porquinhos-da-ndia albinos adultos, jovens e saudveis) so aclimatados s condies laboratoriais
durante, pelo menos, cinco dias. Antes do ensaio, procede-se respectiva distribuio aleatria por lotes. O
plo removido com o auxlio de uma tesoura ou lmina ou, eventualmente, por depilao qumica, de acordo
com o mtodo utilizado. Deve evitar-se produzir feridas. Os animais so pesados antes do incio do ensaio e
aps o respectivo termo.
1.5.2.2. Cond i e s d e e ns a i o
1.5.2.2.1. Animais de ensaio
Os animais devem ser porquinhos-da-ndia albinos de utilizao corrente em laboratrio.
1.5.2.2.2. Nmero e sexo
Podem utilizar-se animais de ambos os sexos. Caso se utilizem fmeas, estas ltimas devem ser nulparas e no
grvidas.
Utiliza-se um mnimo de 20 animais no lote de ensaio e um mnimo de 10 animais no lote de controlo.
1.5.2.2.3. Doses
A concentrao de substncia em estudo utilizada em cada exposio por induo deve corresponder
concentrao mxima que produz uma irritao cutnea moderada. A concentrao utilizada na exposio de
desencadeamento deve consistir na dose mxima no irritante. Se necessrio, as concentraes adequadas
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/205
podem ser determinadas a partir de um estudo-piloto utilizando dois ou trs animais.
No caso de as substncias em estudo serem hidrossolveis, deve utilizar-se como veculo gua ou uma soluo
diluda de um tensioactivo no irritante. Nos restantes casos, o veculo deve consistir numa mistura etanol/gua
a 80 % (ensaios de induo) ou acetona (ensaios de desencadeamento).
1.5.2.3. P r oc e d i me nt o
1.5.2.3.1. Induo
Dia 0 lote de ensaio
Remove-se o plo do flanco dos animais. O sistema de apsito impregnado da substncia em estudo,
dissolvida ou suspensa num veculo adequado (deve justificar-se a escolha do veculo; as substncias lquidas
podem ser aplicadas sem diluio, se for caso disso)
e aplicado na zona de ensaio, sendo mantido em contacto com a mesma durante 6 horas, com o auxlio de um
apsito ou de uma cmara e de um penso adequado.
O sistema de apsito utilizado deve ser oclusivo. Pode utilizar-se uma mecha de algodo de forma circular ou
quadrada, com 4 a 6 cm
2
. De modo a garantir a ocluso, aconselhvel utilizar um dispositivo de imobilizao
adequado. Caso se utilize uma faixa, poder ser necessrio proceder a exposies adicionais.
Dia 0 lote de controlo
O plo novamente removido da zona de ensaio. O veculo aplicado de modo anlogo ao anteriormente
descrito, sendo tambm mantido em contacto com a referida zona durante 6 horas por intermdio de um
penso oclusivo ou de uma cmara. Caso se conclua que no necessrio efectuar um controlo simulado,
poder efectuar-se um controlo mais simples.
6.
o
-8.
o
dias e 13.
o
-15.
o
dias lotes de ensaio e de controlo
A substncia em estudo aplicada de modo anlogo ao anteriormente descrito, na mesma zona e no mesmo
flanco (se necessrio, proceder remoo do plo), entre o 6.
o
e o 8.
o
dias e, de novo, entre o 13.
o
e o 15.
o
dias.
1.5.2.3.2. Desencadeamento
27.
o
-29.
o
dias lotes de ensaio e de controlo
Remove-se o plo do flanco posterior dos animais dos lotes de ensaio e de controlo no sujeito a exposio
prvia e aplica-se um penso oclusivo ou cmara impregnados da quantidade adequada da substncia em estudo
(concentrao mxima no irritante).
Se necessrio, pode tambm aplicar-se um penso oclusivo ou cmara, impregnados do veculo, ao flanco
anterior dos animais de ambos os lotes no sujeito a exposio prvia. Os pensos ou cmaras so mantidos em
contacto com a pele durante 6 horas, com o auxlio de um dispositivo adequado.
1.5.2.3.3. Observao e avaliao
Cerca de 21 horas aps a remoo do apsito ou da cmara, remove-se o plo da rea em estudo.
Cerca de 3 horas depois (ou seja, cerca de 30 horas aps o incio do ensaio), observa-se a reaco cutnea,
que se regista de acordo com a escala indicada em apndice.
Cerca de 24 horas aps a primeira observao (54 horas aps o incio do ensaio), procede-se a um novo
exame, cujos resultados se registam de modo anlogo.
Recomenda-se a realizao de leituras cegas com os animais dos lotes de ensaio e de controlo.
L 142/206 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Caso seja necessrio clarificar os resultados obtidos no primeiro ensaio de desencadeamento pode realizar-se
um segundo ensaio com um novo lote de controlo, cerca de uma semana depois. Pode tambm realizar-se um
segundo ensaio de desencadeamento com o mesmo lote de controlo.
Devem observar-se e registar-se de acordo com a escala de Magnusson/Kligman (ver apndice) todas as reaces
anormais, nomeadamente reaces sistmicas, resultantes dos processos de induo e desencadeamento. Alm
disso, podem efectuar-se outros exames, nomeadamente um exame histopatolgico ou uma determinao da
espessura da prega cutnea, com o objectivo de clarificar eventuais reaces duvidosas.
2. DADOS (GPMT E ENSAIO DE BUEHLER)
Os dados devem ser apresentados de forma sumria num quadro, referindo, para cada animal, a reaco
cutnea observada.
3. RELATRIO (GPMT E ENSAIO DE BUEHLER)
Caso se tenha realizado um ensaio de prospeco (por exemplo, ensaio ganglionar local LLNA ou ensaio
de tumefaco do pavilho auditivo no ratinho METS) antes do ensaio em porquinhos-da-ndia, deve
fornecer-se, juntamente com os resultados obtidos com a substncia em estudo e a substncia de referncia,
detalhes relativos ao procedimento.
Relatrio do ensaio (ensaio de maximizao em porquinhos da ndia e ensaio de Buehler)
O relatrio do ensaio deve incluir, sempre que possvel, as seguintes informaes:
Animais utilizados no ensaio:
estirpe;
nmero, idade e sexo dos animais;
provenincia, condies de alojamento, dieta administrada, etc.;
massa de cada animal no incio do ensaio.
Condies de ensaio:
pormenores relativos preparao da zona de ensaio;
pormenores relativos aos materiais e tcnicas de apsito utilizadas;
resultados dos estudos-piloto destinados a determinar as concentraes de induo e de
desencadeamento utilizadas no ensaio;
pormenores relativos preparao, aplicao e remoo da substncia em estudo;
justificao da escolha do veculo;
concentraes do veculo e da substncia em estudo utilizadas nos ensaios de induo e de
desencadeamento; quantidade total de substncia aplicada nos ensaios de induo e de desencadea-
mento.
Resultados:
resumo dos resultados do ltimo controlo de sensibilidade e fiabilidade (ver 1.3), nomeadamente
informaes sobre a substncia, a respectiva concentrao e o veculo utilizado;
dados relativos a cada animal, incluindo o sistema de classificao;
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/207
descrio da natureza e gravidade dos efeitos observados;
dados histopatolgicos.
Discusso dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
O presente mtodo anlogo ao mtodo OCDE TG 406.
L 142/208 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Apndice
QUADRO
Escala de Magnusson/Kligman para a avaliao das reaces ao ensaio de desencadeamento
0 = alteraes no visveis;
1 = eritrema discreto ou localizado;
2 = eritrema moderado ou confluente;
3 = eritrema intenso e tumefaco.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/209
B.7. TOXICIDADE ORAL DA DOSE REPETIDA (28 DIAS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver a parte B da Introduo Geral.
1.2. DEFINIES
Ver a parte B da Introduo Geral.
1.3. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
A substncia em estudo administrada diariamente por via oral, em doses crescentes (uma dose por lote), a
vrios lotes de animais de ensaio, durante um perodo de 28 dias. No decurso deste perodo, os animais so
examinados diariamente em pormenor, com vista deteco de quaisquer sinais de toxicidade. Efectua-se a
autpsia dos animais que morrem ou so abatidos durante o ensaio e, no final do mesmo, procede-se ao abate
dos sobreviventes e respectiva autpsia.
O presente mtodo concede especial importncia aos efeitos neurolgicos, devendo efectuar-se um exame
clnico pormenorizado dos animais, de modo a obter o mximo possvel de informaes. O mtodo dever
permitir identificar substncias com potencial neurotxico, que podero necessitar de uma investigao mais
aprofundada. Alm disso, o mtodo pode fornecer indicaes sobre os eventuais efeitos imunolgicos e a
eventual toxicidade sobre os rgos reprodutores.
1.4. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.4.1. Preparao
Seleccionam-se de modo aleatrio animais adultos jovens e saudveis, que se repartem pelos lotes de ensaio e
de controlo. Devem dispor-se as gaiolas de forma a minimizar eventuais efeitos devidos respectiva
localizao. Os animais so identificados individualmente e mantidos nas gaiolas durante pelo menos cinco
dias antes do incio do ensaio, de modo a permitir a aclimatao s condies laboratoriais.
A substncia em estudo administrada por intermdio de uma sonda gstrica ou atravs da alimentao ou da
gua para beber. O mtodo de administrao oral depende do objectivo do ensaio, bem como das propriedades
fsico-qumicas da substncia.
Se necessrio, a substncia dissolvida ou suspensa num veculo adequado. Sempre que possvel, recomenda-se
o uso de uma soluo ou suspenso aquosa ou, se tal no for possvel, uma soluo ou emulso num leo
(nomeadamente leo de milho) ou ainda uma soluo noutro veculo. No caso de se utilizar um veculo no
aquoso, devem conhecer-se as respectivas caractersticas de toxicidade. Deve tambm determinar-se a
estabilidade da substncia no veculo utilizado.
1.4.2. Condies de ensaio
1.4.2.1. Animais de ensaio
Embora possa recorrer-se a outros roedores, o rato constitui a espcie preferida. Devem utilizar-se animais
adultos, jovens e saudveis, de estirpes correntes de laboratrio. As fmeas devem ser nulparas e no grvidas.
A administrao da substncia deve ter incio logo que possvel aps o desmame e, em qualquer caso, antes de
os animais completarem nove semanas de idade.
No incio do estudo, a variao de massa dos animais deve ser mnima, no excedendo + 20 % da massa mdia
de cada sexo.
Caso um ensaio de toxicidade oral da dose repetida preceda um estudo a longo prazo, conveniente utilizar em
ambos os ensaios animais da mesma estirpe e provenincia.
L 142/210 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.4.2.2. Nmero e sexo
Para cada dose, devem utilizar-se, pelo menos, 10 animais (cinco machos e cinco fmeas). Caso se preveja o
sacrifcio de alguns animais durante o ensaio, o referido nmero deve ser acrescido do nmero de animais a
sacrificar.
Alm disso, pode administrar-se a um lote extra de animais (cinco de cada sexo), durante 28 dias, a dose mais
elevada, com o objectivo de estudar a reversibilidade, a persistncia ou a manifestao retardada de efeitos
txicos nos 14 dias subsequentes administrao. Utiliza-se tambm um lote-satlite de 10 animais (cinco de
cada sexo) no ensaio de controlo.
1.4.2.3. Doses
De modo geral, devem utilizar-se, no mnimo, trs lotes de ensaio e um lote de controlo. Excepto no que
respeita administrao da substncia em estudo, deve proceder-se com os animais do lote de controlo do
mesmo modo que com os animais dos lotes de ensaio. Caso se recorra a um veculo para a administrao da
substncia em estudo, deve administrar-se o volume mximo do mesmo aos animais do lote de controlo.
Se, com base em outros dados, for previsvel que a dose de 1 000 mg/kg de massa corporal/dia no determine
quaisquer efeitos, pode proceder-se a um ensaio-limite. Na ausncia de dados adequados, pode realizar-se um
rastreio, de modo a determinar as doses a administrar.
Na seleco das doses devem ter-se em conta os eventuais dados disponveis em matria de toxicidade e
toxicocintica referentes substncia em causa ou a produtos afins. A dose mais elevada deve ser escolhida com
o objectivo de induzir efeitos txicos, evitando contudo a morte e o sofrimento intenso. Posteriormente, deve
seleccionar-se uma sequncia decrescente de doses, com o objectivo de evidenciar uma correlao entre a dose
administrada e a reaco observada, bem como a ausncia de efeitos adversos associados administrao da
dose mnima (NOAEL). A diferena ptima entre as doses consiste, frequentemente, num factor de 2 a 4; em
muitos casos, a utilizao de um quarto lote de ensaio prefervel ao recurso a intervalos de grande amplitude
(superior a um factor de 10) entre as doses.
Caso a substncia em estudo seja administrada atravs dos alimentos ou da gua para beber, deve assegurar-se
que as respectivas quantidades no perturbam o equilbrio nutricional e o balano hdrico normais. Se a
substncia for administrada com os alimentos, pode utilizar-se uma concentrao alimentar constante, expressa
em ppm, ou uma dose constante, expressa em relao massa corporal dos animais; deve especificar-se a
alternativa adoptada. No caso do recurso a uma sonda gstrica, a dose deve ser administrada diariamente
mesma hora e, se necessrio, ajustada de modo a manter uma dose constante em relao massa corporal do
animal.
Caso um ensaio de toxicidade oral da dose repetida preceda um estudo a longo prazo, conveniente utilizar
uma dieta semelhante em ambos os ensaios.
1.4.2.4. Ensaio-limite
Sempre que um ensaio, realizado de acordo com o presente mtodo, que utilize uma dose de, pelo menos,
1 000 mg/kg de massa corporal/dia ou, no caso da administrao atravs dos alimentos ou da gua para beber,
uma percentagem equivalente em relao aos mesmos (com base na determinao da massa corporal), no
produza efeitos txicos observveis, ou se, tendo em conta dados referentes a substncias estruturalmente afins,
no se preveja o surgimento de efeitos txicos, poder no ser necessrio efectuar um estudo completo com
trs doses. Nestes casos, justifica-se a realizao de um ensaio-limite, excepto se a exposio humana indicar a
necessidade de recurso a uma dose superior.
1.4.2.5. Perodo de observao
O perodo de observao deve ser de 28 dias. Os animais includos nos lotes extras destinados a ensaios
subsequentes devem ser mantidos em observao durante, pelo menos, 14 dias suplementares, de modo a
detectar a ocorrncia retardada, a persistncia ou a recuperao dos efeitos txicos.
1.4.3. Procedimento
A substncia administrada diariamente aos animais durante um perodo de 28 dias; em casos devidamente
justificados, pode proceder-se administrao cinco dias por semana. A administrao forada deve efectuar-se
numa dose nica, por intermdio de uma sonda gstrica ou de uma cnula de intubao adequada. O volume
mximo de lquido administrado em cada operao depende das dimenses do animal, no devendo exceder 1
ml/100 g de massa corporal, excepto no que respeita a solues aquosas, em que podem utilizar-se 2 ml/100 g
de massa corporal. Salvo no caso de substncias corrosivas ou irritantes, cujos efeitos so, de modo geral,
agravados em concentraes mais elevadas, devem minimizar-se as variaes no volume mediante o
ajustamento da concentrao, de modo a assegurar um volume constante para todas as doses.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/211
1.4.3.1. Observaes gerais
Deve efectuar-se um exame clnico pelo menos uma vez por dia, de preferncia mesma hora, em funo do
perodo previsto de efeitos mais agudos devidos administrao da substncia, registando-se o estado de sade
dos animais. Alm disso, deve proceder-se observao de todos os animais pelo menos duas vezes por dia, de
modo a determinar a respectiva morbilidade e mortalidade. Os animais moribundos, bem como aqueles que
apresentem sinais de dor e sofrimento intensos, devem ser removidos, abatidos por interveno humana e
autopsiados.
Deve proceder-se a um exame clnico aprofundado de todos os animais pelo menos uma vez antes da primeira
exposio (de modo a permitir efectuar comparaes com o mesmo indivduo) e pelo menos uma semana aps
a mesma. O exame deve decorrer no exterior da gaiola, num recinto adequado e, de preferncia, mesma hora.
As observaes devem ser cuidadosamente registadas, de preferncia por recurso a um sistema definido em
pormenor pelo laboratrio em causa. Devem procurar minimizar-se eventuais alteraes das condies de
ensaio e assegurar que a observao seja efectuada por pessoal exterior ao mesmo. Os sinais anotados devem
incluir alteraes na pele, no plo, nos olhos e nas mucosas, bem como a ocorrncia de secrees, excrees ou
actividade autnoma (como, por exemplo, lacrimao, ereco pilosa, alteraes nas pupilas, respirao
anormal). Deve tambm registar-se quaisquer alteraes da atitude, postura e reaco manipulao, alm da
ocorrncia de movimentos clnicos ou tnicos e comportamentos estereotipados (por exemplo, actos de
higiene repetitivos, movimentos circulares repetitivos) ou estranhos (automutilao, marcha para a retaguarda).
Na 4.
a
semana de exposio deve determinar-se a reaco sensorial a diversos tipos de estmulos (auditivos,
visuais e proprioceptivos), bem como a fora da preenso e a actividade motora. A bibliografia indicada na
parte B da Introduo Geral fornece pormenores sobre os procedimentos a adoptar.
Se o ensaio em causa preceder um estudo de toxicidade subcrnica a 90 dias, podem omitir-se as observaes
funcionais na 4.
a
semana de exposio, que devero efectuar-se no mbito do ensaio subsequente. Alm disso, a
existncia de dados relativos a observaes funcionais efectuadas no mbito do ensaio da dose repetida facilita a
seleco das doses a utilizar no estudo de toxicidade subcrnica posterior.
Excepcionalmente, podem omitir-se as observaes funcionais no caso de lotes que apresentem sinais de
toxicidade numa extenso susceptvel de interferir de modo significativo com as mesmas.
1.4.3.2. Massa corporal e consumo de alimentos e gua para beber
Todos os animais devem ser pesados com uma frequncia pelo menos semanal, devendo tambm determinar-
-se, com a mesma frequncia, a quantidade de alimentos e de gua para beber consumidos, facto que se reveste
de especial importncia no caso de a substncia em estudo ser administrada atravs da gua para beber.
1.4.3.3. Hematologia
No final do ensaio, devem determinar-se os seguintes parmetros hematolgicos: hematcrito, concentrao de
hemoglobina, contagem de eritrcitos, contagem total e diferencial de leuccitos, contagem de plaquetas e
medida do tempo/potencial de coagulao.
As colheitas de sangue devem ser efectuadas numa zona determinada, imediatamente antes do abate dos
animais ou no mbito do mesmo, devendo armazenar-se as amostras em condies adequadas.
1.4.3.4. Bioqumica clnica
Devem tambm efectuar-se determinaes bioqumicas destinadas a investigar os principais efeitos txicos
sobre os tecidos, nomeadamente renal e heptico, com amostras de sangue de todos os animais, colhidas
imediatamente antes do respectivo abate ou no mbito do mesmo ( excepo dos animais encontrados
moribundos ou abatidos no decurso do ensaio). Recomenda-se que os animais sejam jejuados desde a vspera
da colheita de sangue (
1
). Os parmetros a determinar no plasma ou no soro so os seguintes: sdio, potssio,
glucose, colesterol total, ureia, creatinina, protenas totais e albumina, alm de, pelo menos, dois enzimas
indicadores dos efeitos hepatocelulares (tais como a alanina-aminotransferase, a aspartato-aminotransferase, a
fosfatase alcalina, a y-glutamil-transpeptidase e a sorbitol-desidrogenase). A determinao de outros enzimas de
origem heptica ou diversa, bem como de cidos biliares, poder, em determinados casos, proporcionar
informaes teis.
L 142/212 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
(
1
) No caso de algumas determinaes no soro e no plasma, como o caso da glucose, aconselhvel jejuar os animais desde a vspera. O
principal motivo deste facto reside em que a maior variabilidade dos resultados determinada pela ausncia de jejum pode ocultar
determinados efeitos, dificultando a interpretao dos resultados. No entanto, o jejum desde a vspera pode interferir com o metabolismo
geral dos animais, nomeadamente no caso de estudos por via alimentar, alterando a exposio diria substncia em estudo. Assim, caso
se opte pelo jejum desde a vspera, as anlises bioqumicas devem ser efectuadas aps observaes funcionais a realizar na 4.
a
semana do
ensaio.
Como opo, podem realizar-se na ltima semana do ensaio as seguintes determinaes na urina, recolhida de
acordo com um programa previamente estabelecido: aparncia, volume, osmolalidade ou gravidade especfica,
pH, protenas, glucose e sangue/hematcitos.
Alm disso, deve prever-se a pesquisa de marcadores sricos que forneam indicaes gerais sobre a leso de
tecidos. Caso as propriedades conhecidas da substncia afectem, ou se preveja que possam afectar, o perfil
metablico da mesma, devem realizar-se outras determinaes, nomeadamente de clcio, fosfatos, triglicridos
em jejum, hormonas especficas, meta-hemoglobina e colinesterase. A necessidade de efectuar tais
determinaes estabelecida em funo do tipo de substncia em estudo ou de cada caso especfico.
De modo geral, deve adoptar-se uma abordagem flexvel, em funo das espcies e dos efeitos observados ou
previstos da substncia em causa.
Se os dados disponveis relativos a ensaios anteriores se revelarem inadequados, devem determinar-se
parmetros hematolgicos e bioqumicos antes de administrar a substncia.
1.4.3.5. Autpsia
Todos os animais devem ser objecto de uma autpsia pormenorizada que inclua o exame da superfcie exterior
do corpo, dos orifcios e das cavidades craniana, torcica e abdominal, bem como do respectivo contedo.
Devem remover-se de modo adequado as membranas aderentes a rgos tais como o fgado, os rins, as
glndulas supra-renais, os testculos, os epididimos, o timo, o bao, o crebro e o corao, cuja massa hmida
deve ser determinada logo que possvel aps a dissecao, de modo a evitar a respectiva dessecao.
Os rgos e tecidos que se seguem devem ser conservados num meio de fixao adequado aos mesmos, bem
como ao tipo de exame histopatolgico subsequente: todos os tecidos que apresentem leses evidentes,
encfalo (regies representativas, nomeadamente crebro, cerebelo e protuberncia), espinal medula, estmago,
intestino delgado e clon (incluindo as placas de Peyer), fgado, rins, glndulas supra-renais, bao, corao,
timo, tiride, traqueia e pulmes (conservados por insuflao com fixador seguida de imerso), gnadas,
rgos genitais acessrios (por exemplo, tero e prstata), bexiga, gnglios linfticos (de preferncia um gnglio
situado na via de administrao e um gnglio distante da mesma, de modo a investigar possveis efeitos
sistmicos), nervos perifricos (citico ou tibial), nomeadamente na proximidade de msculos, e uma seco de
medula ssea (ou, como alternativa, um aspirado de medula ssea recentemente montado). Em funo das
observaes clnicas ou de natureza diversa efectuadas, poder ser necessrio examinar outros tecidos. Devem
tambm conservar-se quaisquer rgos susceptveis de constiturem alvos da substncia em estudo, em virtude
das propriedades conhecidas da mesma.
1.4.3.6. Exame histopatolgico
Deve proceder-se ao exame histopatolgico dos rgos e tecidos conservados dos animais do lote de controlo,
bem como dos lotes sujeitos a doses elevadas. Caso o exame destes ltimos revele alteraes atribuveis
substncia em estudo, devem examinar-se tambm os animais de todos os lotes restantes.
Devem examinar-se todas as leses importantes.
Sempre que se recorra a um lote extra, deve proceder-se ao exame histopatolgico dos tecidos e rgos que
tenham revelado alteraes nos animais dos restantes lotes.
DADOS
Devem registar-se os dados relativos a cada animal. Alm disso, todos os dados devem ser resumidos num
quadro, referindo-se, para cada lote de ensaio, o nmero de animais utilizados, o nmero de animais
encontrados mortos ou abatidos por interveno humana, a hora da morte de cada animal, o nmero de
animais que apresentam sinais de toxicidade, a descrio dos sinais de toxicidade observados, nomeadamente o
tempo decorrido at respectiva manifestao, bem como a sua durao e gravidade, o nmero de animais que
apresentem leses, o tipo de leses e a percentagem de animais que apresentam cada tipo de leses.
Sempre que possvel, os resultados numricos devem ser avaliados por recurso a um mtodo estatstico de
aceitao geral, cuja escolha deve ser efectuada na fase de concepo do ensaio.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/213
3. RELATRIO
RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio deve incluir, sempre que possvel, as seguintes informaes:
Animais utilizados no ensaio:
espcie/estirpe;
nmero, idade e sexo dos animais;
provenincia, condies de alojamento, dieta administrada, etc.;
massa de cada animal determinada no incio do ensaio, semanalmente aps a administrao da
substncia e no final do ensaio.
Condies de ensaio:
justificao da escolha de um veculo no aquoso;
motivo da seleco da dose de partida;
pormenores relativos preparao da substncia em estudo e sua eventual incorporao nos
alimentos, nomeadamente a respectiva concentrao, estabilidade e homogeneidade;
pormenores relativos administrao da substncia em estudo;
equivalncia entre a concentrao da substncia em estudo nos alimentos ou na gua para beber,
expressa em ppm, e a dose, expressa em mg/kg de massa corporal, se for caso disso;
pormenores relativos qualidade dos alimentos e da gua.
Resultados:
massa corporal e respectivas alteraes;
consumo de alimentos e de gua, se for caso disso;
reaces txicas em funo do sexo e da dose administrada, nomeadamente sinais de toxicidade;
natureza, gravidade e durao dos sinais clnicos (reversveis ou no);
dados relativos actividade sensorial, fora de preenso e actividade motora;
resultados da anlise hematolgica, acompanhados dos respectivos parmetros de base;
resultados da anlise bioqumica, acompanhados dos respectivos parmetros de base;
massa corporal aquando do abate e massa dos diversos rgos;
dados obtidos por autpsia;
dados histopatolgicos pormenorizados;
L 142/214 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
dados de absoro, caso se encontrem disponveis;
tratamento estatstico dos resultados, se for caso disso.
Discusso dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
O presente mtodo anlogo ao mtodo OCDE TG 407.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/215
B.8. TOXICIDADE (INALAO) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
til possuir informaes preliminares sobre a distribuio granulomtrica, a presso de vapor, o ponto de
fuso, o ponto de ebulio, o ponto de inflamao e a explosividade (se aplicvel) da substncia.
Ver tambm a Introduo Geral, parte B (ponto A).
1.2. DEFINIO
Ver Introduo Geral, parte B (ponto B).
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Vrios grupos de animais de experincia so expostos diariamente, por um perodo determinado, a
concentraes diferentes das substncias a ensaiar, razo de uma concentrao por grupo, durante um
perodo de 28 dias. No caso de se utilizar um veculo para auxiliar a obter uma concentrao apropriada da
substncia de ensaio na atmosfera, deve utilizar-se um grupo de controlo para o veculo. Durante o perodo de
administrao os animais so observados diariamente para se detectar as manifestaes de toxicidade. Os
animais que morrem durante a experincia so autopsiados e no fim da experincia os animais sobreviventes
so igualmente autopsiados.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.6.1. Preparativos
Os animais so mantidos nas condies de alojamento e de alimentao da experincia pelo menos durante
cinco dias antes do ensaio. Antes de se comear o ensaio os animais jovens e saudveis so distribudos
aleatoriamente pelos grupos submetidos ao tratamento e pelo grupo de controlo. Se necessrio pode adicionar-
-se um veculo substncia de ensaio para se conseguir uma concentrao apropriada desta na atmosfera; no
caso de se utilizar um veculo ou outros aditivos para facilitar a administrao, estes devem ser
comprovadamente no txicos. Pode recorrer-se a dados anteriormente publicados, se necessrio.
1.6.2. Condies da experincia
1.6.2.1. Animais de experincia
Salvo contra-indicao, a espcie preferida o rato. Devem utilizar-se animais jovens e saudveis de uma estirpe
vulgarmente utilizada em laboratrio.
No incio da experincia a diferena de peso entre os animais no poder ultrapassar 20 % do peso mdio
apropriado.
1.6.2.2. Nmero e sexo
Para cada grupo de ensaio sero utilizados pelo menos 10 animais (cinco fmeas e cinco machos). As fmeas
devero ser nulparas e no grvidas. Se for previsvel sacrificar alguns animais durante a experincia, deve
acrescentar-se ao nmero inicial o nmero de animais que se prev vir a sacrificar. Para alm destes, poder
haver um grupo-satlite de 10 animais (cinco animais de cada sexo) tratado com a dose mais elevada durante
28 dias e observado quanto reversibilidade, persistncia ou aparecimento tardio de efeitos txicos durante
14 dias aps o tratamento. Utiliza-se tambm um grupo-satlite de 10 animais de controlo (cinco animais de
cada sexo).
L 142/216 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.6.2.3. Concentrao de exposio
So utilizadas pelo menos trs concentraes, com um grupo de controlo ou, se necessrio, com um grupo de
controlo para o veculo quando este for utilizado (correspondendo concentrao do veculo ao nvel de
exposio mais elevada). Os animais do grupo de controlo so tratados da mesma forma que os animais dos
grupos de experincia com excepo da inalao da substncia de ensaio. A concentrao mais elevada dever
produzir efeitos txicos mas nenhuma ou poucas mortes. A menor concentrao no dever produzir
quaisquer manifestaes de toxicidade. No caso de se dispor de informao sobre a exposio humana, a
concentrao mais baixa ser superior a esse valor. O ideal seria a concentrao intermdia produzir o efeito
txico mnimo observvel. No caso de se utilizar vrias concentraes intermdias, a diferena entre elas ser
calculada de forma a conseguir-se uma gradao dos efeitos txicos. Nos grupos de concentrao baixa e
intermdia, assim como nos grupos de controlo, a incidncia de mortalidade dever ser baixa para permitir
uma avaliao significativa dos resultados.
1.6.2.4. Tempo de exposio
A durao da exposio diria dever ser de seis horas, podendo utilizar-se outros perodos para satisfazer
exigncias especficas.
1.6.2.5. Equipamento
Os animais sero expostos substncia de ensaio por meio de um dispositivo de inalao concebido de forma a
conseguir-se um fluxo de ar contnuo que assegurar pelo menos 12 renovaes de ar por hora e que garanta
uma concentrao de oxignio apropriada e uma distribuio uniforme do produto de ensaio no ar. No caso de
se utilizar uma cmara, esta ser concebida de maneira a obter-se uma superlotao mnima dos animais e uma
exposio mxima substncia de ensaio. Como regra geral, para se assegurar a estabilidade da atmosfera na
cmara, o volume total dos animais de experincia no dever ultrapassar 5 % do volume da cmara de
ensaio. Pode recorrer-se tambm a um sistema de exposio oronasal, apenas de cabea ou do corpo inteiro,
em cmara individual; os dois primeiros tipos de exposio permitem reduzir a penetrao por outras vias.
1.6.2.6. Perodo de observao
Os animais da experincia devero ser observados diariamente para se detectar manifestaes de toxicidade
durante todo o perodo de exposio e de recuperao. Proceder-se- ao registo do momento da morte e bem
assim do momento do aparecimento e desaparecimento das manifestaes de toxicidade.
1.6.3. Procedimento
Os animais so expostos diariamente substncia de ensaio, cinco a sete dias por semana, durante um perodo
de 28 dias. Os animais dos grupos-satlite destinados s observaes complementares sero mantidos vivos
durante mais 14 dias, sem tratamento, para se detectar a recuperao ou persistncia dos efeitos txicos. A
temperatura a que se efectua o ensaio dever ser mantida a 22 3
o
C.
Em condies ptimas, a humidade relativa dever ser mantida entre 30 % e 70 % mas, nalguns casos, isto
pode ser impraticvel (por exemplo, nos ensaios com aerossis). A manuteno de uma presso ligeiramente
negativa no interior da cmara de ensaio (< 5 mm de gua) evitar a fuga da substncia de ensaio para o meio
envolvente. Durante a exposio os animais no recebero alimentos nem gua.
Dever ser utilizado um sistema de inalao dinmico com um dispositivo apropriado de controlo analtico da
concentrao. Recomenda-se a realizao de um ensaio preliminar para se determinar as concentraes
apropriadas de exposio. O dbito de ar dever assegurar concentraes homogneas em toda a cmara de
exposio. O sistema dever permitir a obteno de condies estveis o mais rapidamente possvel.
Dever ser feita a medio ou monitorizao de:
a) dbito de ar (permanentemente);
b) a concentrao real da substncia de ensaio medida na zona de respirao. Durante o perodo de
exposio diria a concentrao no variar alm de 15 % do valor mdio. Contudo, no caso de alguns
aerossis esta preciso pode no ser possvel e poder ser aceitvel uma variao maior. Durante toda a
durao da experincia as concentraes dirias sero mantidas o mais constantes possvel. Para os
aerossis dever-se- efectuar semanalmente e por grupo de ensaio pelo menos uma anlise
granulomtrica das partculas;
c) temperatura e humidade, continuamente se for possvel.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/217
Durante e aps a exposio s concentraes so feitas observaes e registadas sistematicamente; so feitas
fichas individuais para cada animal. Todos os animais sero observados diariamente e as manifestaes de
toxicidade, assim como o momento do seu aparecimento, a sua intensidade e a sua durao, sero registados.
As observaes devero incluir as modificaes da pele e do plo, dos olhos, das mucosas, do aparelho
respiratrio, do aparelho circulatrio, do sistema nervoso autnomo e central, da actividade somatomotora e
do comportamento. Determinar-se- semanalmente o peso dos animais. Recomenda-se tambm a
determinao do consumo alimentar semanal. Deve observar-se regularmente os animais para se evitar
perdas, tanto quanto possvel, causadas por canibalismo, autlise dos tecidos ou condies imprprias de
alojamento. No fim da experincia todos os animais sobreviventes dos grupos tratados no satlites sero
autopsiados. Os animais moribundos e os animais que apresentem graves sintomas de angstia ou dor devero
ser imediatamente retirados, sacrificados e submetidos a autpsia.
Os exames a seguir enunciados devero ser efectuados no fim do perodo de ensaio para todos os animais
incluindo os de controlo:
i) um exame hematolgico compreendendo os seguintes testes: hematcrito, concentrao de
hemoglobina, contagem de eritrcitos, contagem de leuccitos, frmula leucocitria, bem como um
estudo sobre o potencial de coagulao;
ii) a determinao de dados bioqumicos do sangue incluindo pelo menos um parmetro da funo heptica
e renal: alanina aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutmico-pirvica),
aspartato aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutmico-oxalo-actica), azoto
ureico, albumina, creatinina plasmtica, bilirrubina total e as protenas sricas totais.
As outras anlises eventualmente necessrias para uma avaliao toxicolgica adequada incluem as anlises de
clcio, fsforo, cloretos, sdio, potssio, glicose em jejum, anlises de lpidos, de hormonas, equilbrio cido-
-bsico, meta-hemoglobina e actividade colinestersica.
Pode recorrer-se a outras anlises bioqumicas clnicas sempre que necessrio para melhorar a investigao dos
efeitos observados.
1.6.3.1. Autpsia
Todos os animais submetidos a experincia devero ser submetidos a uma autpsia geral. Pelo menos o fgado,
os rins, as glndulas supra-renais, os pulmes e os testculos devero ser pesados ainda hmidos, to cedo
quanto possvel aps a dissecao para se evitar a perda de lquidos por evaporao. Tanto os rgos como os
tecidos (tracto respiratrio, fgado, rim, bao, testculos, glndulas supra-renais, corao e quaisquer rgos que
apresentem leses graves ou alteraes de volume) devero ser conservados num meio adequado para um
eventual exame histopatolgico futuro. Os pulmes devero ser removidos intactos, pesados e tratados com
um fixador adequado para se garantir que a estrutura do pulmo seja mantida.
1.6.3.2. Exame histopatolgico
No grupo tratado com a concentrao mais elevada e nos grupos de controlo o exame histolgico dever ser
efectuado em rgos e tecidos conservados. Os rgos e tecidos que apresentem efeitos susceptveis de serem
atribudos substncia de ensaio administrada na dose mais elevada devero ser examinados em todos os
grupos tratados com doses inferiores. Deve proceder-se a um exame histolgico dos animais de qualquer
grupo-satlite com particular nfase sobre os rgos e tecidos que apresentaram efeitos identificados nos outros
grupos tratados.
2. RESULTADOS
Os resultados sero resumidos na forma de quadros indicando, para cada experincia, o nmero de animais no
incio do ensaio e o nmero de animais que apresenta cada tipo de leso.
Todos os resultados observados devero ser avaliados por um mtodo estatstico apropriado. Pode ser utilizado
qualquer mtodo estatstico reconhecido.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
espcie, estirpe, origem, condies ambientais, dieta, etc.;
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condies experimentais:
Descrio do aparelho de exposio incluindo projecto, tipo, dimenses, fonte de ar, sistema gerador de
aerossis, mtodo de condicionamento de ar, tratamento do ar evacuado e, no caso disso, o mtodo de
acondicionamento dos animais na cmara de ensaio. Deve apresentar-se uma descrio do equipamento
utilizado para medir a temperatura, a humidade e, se necessrio, a estabilidade das concentraes do
aerossol ou da distribuio granulomtrica das partculas.
Dados relativos exposio:
Estes dados sero apresentados sob a forma de um quadro indicando os valores mdios, assim como uma
medida de variao (por exemplo, o desvio-padro) e diro respeito:
a) aos dbitos de ar atravs do dispositivo de inalao,
b) temperatura e humidade do ar,
c) s concentraes nominais (quantidade total da substncia de ensaio introduzida no dispositivo de
inalao, dividida pelo volume de ar),
d) natureza do veculo, se utilizado,
e) s concentraes reais na zona de respirao,
f) ao dimetro aerodinmico mdio de massa (DAMM) e ao desvio-padro geomtrico (DPG);
resposta txica por sexo e por concentrao;
momento da morte durante a experincia ou indicao dos animais sobreviventes;
descrio dos efeitos txicos ou outros; dose que no produz efeito;
momento de observao de qualquer manifestao anormal e sua evoluo;
dados relativos alimentao e peso corporal;
exames hematolgicos efectuados e seus resultados;
testes bioqumicos clnicos utilizados e seus resultados;
resultados da autpsia;
descrio pormenorizada de todas as observaes histopatolgicas;
tratamento estatstico dos resultados sempre que possvel;
discusso dos resultados;
interpretao dos resultados.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/219
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B (ponto D).
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B (ponto E).
L 142/220 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B.9. TOXICIDADE (DRMICA) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral parte B (ponto A).
1.2. DEFINIES
Ver Introduo Geral, parte B (ponto B).
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Administra-se pele diariamente a substncia de ensaio, em doses graduadas, a diversos grupos de animais de
experincia, utilizando-se uma dose por grupo durante um perodo de 28 dias. Durante o perodo de
administrao observa-se os animais diariamente para se detectar manifestaes de toxicidade. Faz-se a autpsia
dos animais mortos durante o ensaio e no final do ensaio faz-se tambm a autpsia dos animais que
sobreviveram ao teste.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.6.1. Preparativos
Os animais so mantidos sob as condies de alojamento e alimentao experimentais durante pelo menos
cinco dias antes do ensaio. Antes do ensaio procede-se a uma escolha aleatria de animais adultos, jovens e
saudveis e que so distribudos por grupos de tratamento. Pouco tempo antes de se iniciar o ensaio rapa-se os
plos da regio dorsal dos animais. No caso de se recorrer tosquia esta dever ser efectuada aproximadamente
24 horas antes do ensaio. Normalmente necessrio repetir estas operaes todas as semanas, devendo tomar-
-se muito cuidado para no lesar a pele. A rea destinada aplicao da substncia de ensaio no poder ser
inferior a 10 % da superfcie corporal. O peso do animal dever ser tomado em considerao na deciso da
zona a expor e da dimenso da superfcie a tratar. Sempre que se procede ao ensaio de substncias slidas, as
quais podem ser pulverizadas se necessrio, a substncia de ensaio deve ser humedecida com gua ou com um
veculo apropriado para garantir um bom contacto com a pele. As substncias de ensaio lquidas so
geralmente utilizadas sem serem diludas. Procede-se a uma aplicao diria durante cinco a sete dias por
semana.
1.6.2. Condies da experincia
1.6.2.1. Animais de experincia
Podem ser utilizados ratos adultos, coelhos ou cobaias. Outras espcies podero ser utilizadas mas a sua
utilizao dever ser justificada.
No incio da experincia a diferena de peso entre os animais no poder ultrapassar 20 % do peso mdio
apropriado.
1.6.2.2. Nmero e sexo
Para cada grupo de ensaio sero utilizados pelo menos 10 animais (cinco fmeas e cinco machos) com pele
saudvel. As fmeas devero ser nulparas e no grvidas. Se for previsvel sacrificar alguns animais durante a
experincia, deve acrescentar-se ao nmero inicial o nmero de animais que se prev vir a sacrificar. Para alm
destes, poder haver um grupo-satlite de 10 animais (cinco animais de cada sexo) tratado com a dose mais
elevada durante 28 dias e observado quanto reversibilidade, persistncia ou aparecimento tardio de efeitos
txicos durante 14 dias aps o tratamento. Utiliza-se tambm um grupo-satlite de 10 animais de controlo
(cinco animais de cada sexo).
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/221
1.6.2.3. Doses
So necessrias pelo menos trs doses diferentes com um controlo ou com um veculo de controlo no caso de
ser utilizado um veculo. O perodo de exposio dever ser no mnimo de seis horas por dia. A substncia de
ensaio ser aplicada diariamente mesma hora e a quantidade a administrar ser ajustada regularmente
(semanal ou bissemanalmente) de modo a manter-se constante relativamente ao peso corporal do animal. Os
animais do grupo de controlo sero tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de experincia, com
excepo da aplicao da substncia de ensaio. No caso de se utilizar um veculo para facilitar a administrao,
este ser administrado ao grupo de controlo da mesma forma que aos grupos tratados, devendo a dose
corresponder do grupo tratado com a dose mais elevada. A dose mais elevada ser determinada de forma a
produzir efeitos txicos mas nunca, ou raramente, a morte do animal. A dose mais baixa no dever produzir
quaisquer efeitos txicos. No caso de se dispor de informao sobre a exposio humana, a dose mais baixa
dever exceder esse valor. O ideal seria a dose intermdia produzir o efeito txico mnimo observado. No caso
de se utilizar vrias doses intermdias, a diferena entre elas ser calculada de forma a conseguir-se uma
gradao dos efeitos txicos. Nos grupos das doses mais baixa e intermdia, assim como nos grupos de
controlo, a incidncia da mortalidade dever ser baixa para permitir uma avaliao significativa dos resultados.
No caso de a aplicao da substncia de ensaio provocar uma grave irritao cutnea, dever-se- reduzir as
concentraes, o que poder originar uma diminuio ou at um desaparecimento dos outros efeitos txicos da
dose mais elevada. Se as leses cutneas forem muito graves, pode tornar-se necessrio interromper a
experincia e recome-la com concentraes mais fracas.
1.6.2.4. Teste-limite
Se j tiver sido efectuada uma experincia preliminar com uma dose de 1 000 mg/kg ou com uma dose mais
elevada em funo da possibilidade de uma exposio humana conhecida, que no tenha provocado quaisquer
efeitos txicos, ser intil prosseguir a experincia.
1.6.2.5. Perodo de observao
Os animais da experincia sero observados diariamente para se detectar manifestaes de toxicidade. Proceder-
-se- ao registo do momento da morte e do momento do aparecimento e do desaparecimento das manifestaes
de toxicidade.
1.6.3. Procedimento
Os animais sero colocados em gaiolas individuais. Em condies ideais a substncia de ensaio ser
administrada aos animais sete dias por semana durante um perodo de 28 dias. Os animais de todos os grupos-
-satlite que forem objecto de observaes complementares sero mantidos vivos durante mais 14 dias, sem
tratamento, para se detectar a recuperao ou a persistncia dos efeitos txicos. O tempo de exposio ser pelo
menos de seis horas por dia.
A substncia de ensaio ser aplicada uniformemente numa rea equivalente a 10 % da superfcie total do corpo.
No caso de substncias altamente txicas, a superfcie a utilizar poder ser menor mas a camada da substncia
dever ser o mais fina e uniforme possvel.
Durante a exposio a substncia de ensaio mantida em contacto com a pele por meio de uma gaze porosa e
de um adesivo antialrgico. A superfcie tratada ser por sua vez convenientemente coberta de maneira a
manter no seu lugar a gaze e a substncia de ensaio e de modo a evitar que os animais ingiram a referida
substncia. possvel utilizar aparelhos de conteno para evitar a ingesto da substncia, mas no se
recomenda a imobilizao completa. Como alternativa pode utilizar-se uma coleira de proteco.
No fim do tempo de exposio necessrio, se possvel, eliminar todos os resduos da substncia utilizando
gua ou recorrendo a qualquer outro mtodo adequado para limpeza da pele.
Os animais sero observados diariamente, registando-se sempre as manifestaes de toxicidade assim como o
momento do seu aparecimento, a sua intensidade e a sua durao. Proceder-se- observao das modificaes
do plo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratrio, do aparelho circulatrio, do sistema
nervoso autnomo e central, assim como da actividade somatomotora e do comportamento. Determinar-se-
semanalmente o peso dos animais. Recomenda-se tambm que se determine semanalmente o consumo
alimentar. Deve observar-se regularmente os animais para se evitar perdas, tanto quanto possvel, causadas por
canibalismo, autlise dos tecidos ou condies imprprias de alojamento. No fim da experincia todos os
animais sobreviventes dos grupos tratados no satlites sero autopsiados. Os animais moribundos e os
animais que apresentem graves sintomas de angstia ou dor devero ser imediatamente retirados, sacrificados e
submetidos a autpsia.
Os exames a seguir enunciados devero ser efectuados no fim do perodo de ensaio para todos os animais
incluindo os de controlo:
1. Um exame hematolgico compreendendo os seguintes testes: hematcrito, concentrao de
hemoglobina, contagem de eritrcitos, contagem de leuccitos, frmula leucocitria, bem como um
estudo sobre o potencial de coagulao.
L 142/222 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
2. A determinao de dados bioqumicos do sangue incluindo pelo menos um parmetro da funo
heptica e renal: alanina aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutmico-
-pirvica), aspartato aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutmico-oxalo-a-
ctica), azoto ureico, albumina, creatinina plasmtica, bilirrubina total e as protenas sricas totais.
As outras anlises eventualmente necessrias para uma avaliao toxicolgica adequada incluem as anlises de
clcio, fsforo, cloretos, sdio, potssio, glicose em jejum, anlises de lpidos, de hormonas, equilbrio cido-
-bsico, meta-hemoglobina e actividade colinestersica.
Pode recorrer-se a outras anlises bioqumicas clnicas sempre que necessrio para melhorar a investigao dos
efeitos observados.
1.6.4. Autpsia
Todos os animais submetidos a experincia devero ser submetidos a uma autpsia geral. Pelo menos o fgado,
os rins, as glndulas supra-renais e os testculos devero ser pesados ainda hmidos, to cedo quanto possvel
aps a dissecao para se evitar a perda de lquidos por evaporao. Todos os rgos e tecidos, isto , pele
normal e tratada, fgado, rins, bao, testculos, glndulas supra-renais, corao e rgos-alvo (isto , os rgos
que apresentem leses graves ou variaes de volume) devero ser conservados num meio adequado para
eventual exame histopatolgico futuro.
1.6.5. Exame histopatolgico
No grupo tratado com a dose mais elevada e no grupo de controlo deve efectuar-se o exame histolgico dos
rgos e tecidos conservados. Os rgos e tecidos que apresentem efeitos susceptveis de serem atribudos
substncia de ensaio administrada na dose mais elevada devero ser examinados em todos os grupos tratados
com doses inferiores. Deve proceder-se a um exame histolgico dos animais de qualquer grupo-satlite com
particular nfase sobre os rgos e tecidos que apresentaram efeitos identificados nos outros grupos tratados.
2. RESULTADOS
Os resultados sero resumidos na forma de quadros indicando, para cada experincia, o nmero de animais no
incio do ensaio e o nmero de animais que apresenta cada tipo de leso.
Todos os resultados observados devero ser avaliados por um mtodo estatstico apropriado. Pode ser utilizado
qualquer mtodo estatstico reconhecido.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
dados sobre os animais (espcie, estirpe, origem, condies ambientais, dieta, etc.),
condies experimentais (incluindo o tipo de cobertura: oclusiva ou no oclusiva),
doses (incluindo o veculo, se utilizado) e concentraes,
dose sem efeito, se possvel,
resposta txica por sexo e por dose,
momento da morte durante a experincia ou indicao dos animais sobreviventes no fim da experincia,
efeitos txicos ou outros,
momento da observao de qualquer manifestao anormal e sua evoluo,
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/223
dados relativos alimentao e peso corporal,
exames hematolgicos efectuados e resultados,
provas bioqumicas clnicas utilizadas e seus resultados,
resultados da autpsia,
descrio pormenorizada de todos os resultados histopatolgicos,
tratamento estatstico dos resultados, se possvel,
discusso dos resultados,
interpretao dos resultados.
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B (ponto D).
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B (ponto E).
L 142/224 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B.10. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VITRO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM MAMFEROS
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 473 Ensaio in vitro de aberraes cromossmicas em
mamferos (1997).
1.1. INTRODUO
O objectivo do ensaio in vitro de aberraes cromossmicas identificar os agentes que causam aberraes
estruturais dos cromossomas em culturas de clulas de mamferos (1) (2) (3). As aberraes estruturais podem
ser de dois tipos, afectando os cromossomas ou os cromatdeos. A maior parte dos mutagneos qumicos
induzem aberraes cromatdicas, mas tambm podem ocorrer aberraes cromossmicas. Um aumento da
taxa de poliploidia pode indicar que um determinado produto qumico tem potencial para induzir aberraes
numricas. Contudo, este mtodo no foi concebido para medir as aberraes numricas nem normalmente
utilizado com esse objectivo. As mutaes nos cromossomas e eventos relacionados causam diversas doenas
genticas humanas, existindo provas substanciais de que as alteraes que causam nos oncogenes e nos genes
supressores de tumores das clulas somticas esto envolvidas na induo de cancro nos seres humanos e em
animais utilizados em experincias.
O ensaio in vitro de aberraes cromossmicas pode envolver culturas de linhas celulares bem estabelecidas, de
uma determinada estirpe ou ainda culturas de clulas primrias. As clulas utilizadas so seleccionadas com
base na sua capacidade de crescimento em cultura, na estabilidade do caritipo, no nmero e diversidade dos
seus cromossomas e na frequncia das aberraes cromossmicas espontneas.
Os ensaios in vitro exigem geralmente a utilizao de uma fonte exgena de activao metablica, que no
consegue imitar inteiramente as condies in vivo nos mamferos. Deve ter-se o cuidado de evitar condies que
conduzam a resultados positivos que no sejam reflexo de uma mutagenicidade intrnseca mas que possam
resultar, por exemplo, de mudanas do pH, da presso osmtica ou ainda de nveis elevados de citotoxicidade
(4) (5).
O presente ensaio utilizado para a anlise de agentes eventualmente mutagneos ou carcinogneos para os
mamferos. Muitos dos compostos que do um resultado positivo no presente ensaio so carcinogneos nos
mamferos, no existindo, contudo, uma correlao perfeita entre o ensaio e a carcinogenicidade. A correlao
depende da classe qumica e existem cada vez mais provas de que alguns agentes carcinogneos no so
detectados por este ensaio, por os seus mecanismos de actuao no passarem directamente pela danificao do
ADN.
Ver tambm a parte B da Introduo Geral.
1.2. DEFINIES
Aberrao cromatdica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de
unio, de cromatdeos simples.
Aberrao cromossmica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de
unio, de ambos os cromatdeos no mesmo local.
Endorreduplicao: processo mediante o qual, na sequncia de um perodo S de replicao do ADN, o ncleo
no sofre mitose, iniciando-se um novo perodo S, que resulta em cromossomas com 4, 8, 16, ... cromatdeos.
Lacuna: leso acromtica de extenso inferior largura de um cromatdeo e que determine um ligeiro
desalinhamento do mesmo.
ndice mittico: relao entre o nmero de clulas em metafase e o nmero total de clulas observadas numa
populao de clulas, que fornece uma indicao do grau de proliferao da populao em causa.
Aberrao numrica: alterao do nmero de cromossomas relativamente ao nmero de cromossomas
caracterstico das clulas utilizadas.
Poliploidia: nmero de cromossomas mltiplo do nmero haplide (n), mas diferente do nmero diplide (ou
seja, 3n, 4n, etc.).
Aberrao estrutural: alterao da estrutura dos cromossomas detectvel por exame microscpico das clulas
em metafase, na forma de supresso de segmentos, de alteraes de partes da sequncia ou da troca de
segmentos num cromatdeo ou entre cromatdeos.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/225
1.3. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
As culturas celulares so expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de um sistema
de activao metablica. Aps um perodo determinado, adiciona-se um produto fixador da metafase (por
exemplo, Colcemid

ou colchicina); as clulas so colhidas, coradas e analisadas microscopicamente para


detectar a presena de aberraes cromossmicas nas clulas em metafase.
1.4. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.4.1. Preparao
1.4.1.1. Clulas
Podem utilizar-se diversas linhas celulares, estirpes ou culturas celulares primrias, incluindo clulas humanas
(por exemplo: fibroblastos do hamster da China ou linfcitos da circulao perifrica do ser humano ou de
outros mamferos).
1.4.1.2. Meios e condies de cultura
As culturas devem ser mantidas em meios de cultura e condies de incubao adequados (tipo de recipiente,
concentrao de CO
2
, temperatura e humidade). As linhas celulares e estirpes devem ser periodicamente
controladas no que respeita estabilidade do nmero modal de cromossomas e ausncia de contaminao
por micoplasma, no devendo ser utilizadas se se verificar que foram contaminadas. Deve ser conhecida a
durao do ciclo celular normal para as clulas e condies de cultura utilizadas.
1.4.1.3. Preparao das culturas
Linhas e estirpes de clulas definidas: multiplicam-se as clulas provenientes de culturas de arranque por
incubao a 37
o
C num meio cuja densidade no permita a confluncia das culturas antes da colheita.
Linfcitos: adiciona-se sangue total tratado com anticoagulante (por exemplo: heparina) ou linfticos
provenientes de indivduos saudveis a um meio de cultura contendo um agente mitognico (por exemplo: fito-
-hemoglutinina), incubando a 37
o
C.
1.4.1.4. Activao metablica
As clulas devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de um sistema
adequado de activao metablica. O sistema mais frequentemente utilizado consiste numa fraco ps-
-mitocondrial reforada com co-factor (S9) preparada a partir de fgados de roedores tratados com agentes de
induo enzimtica, como por exemplo Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) ou uma mistura de fenobarbitona e
-naftoflavona (10) (11) (12).
A fraco ps-mitocondrial geralmente utilizada em concentraes na gama dos 1-10 % v/v no meio de
ensaio final. O estado do sistema de activao metablica pode depender da classe dos produtos qumicos em
estudo. Em alguns casos pode revelar-se adequado utilizar vrias concentraes diferentes de fraco ps-
-mitocondrial.
Progressos tais como a elaborao por engenharia gentica de linhas celulares que exprimam enzimas de
activao especficos oferecem possibilidades de activao endgena. A escolha das linhas celulares a utilizar
ter de ser cientificamente justificada (por exemplo: pela relevncia do isoenzima de citocromo P450 para o
metabolismo da substncia em estudo).
1.4.1.5. Substncia em estudo/preparao
As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e, se necessrio,
diludas antes de serem adicionadas s clulas. As substncias lquidas podem ser adicionadas directamente aos
sistemas em estudo e/ou diludas antes de serem adicionadas s clulas. Devem ser utilizadas preparaes
frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo
armazenamento no coloca problemas para o ensaio.
1.4.2. Condies de ensaio
1.4.2.1. Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, devendo ser compatvel com a sobrevivncia
das clulas e com a actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se
encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que
possvel, recomenda-se a utilizao de solventes/veculos aquosos. Quando forem realizados ensaios de
substncias instveis na presena de gua, os solventes orgnicos utilizados devem ser anidros. A gua poder
ser removida atravs de um filtro molecular.
L 142/226 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.4.2.2. Concentraes de exposio
A citotoxidade, a solubilidade no sistema de ensaio e as alteraes do pH ou da presso osmtica constituem
alguns dos critrios a ter em conta na determinao da concentrao mxima.
A citotoxidade deve ser determinada na experincia principal tanto na presena como na ausncia de um
sistema de activao metablica, por recurso a um indicador adequado da integridade e do crescimento
celulares, nomeadamente o grau de confluncia, as contagens de clulas viveis ou o ndice mittico. Poder ser
til determinar previamente a citotoxidade e solubilidade atravs de uma experincia preliminar.
Devem utilizar-se pelo menos trs concentraes analisveis. No caso de substncias que sejam citotxicas, as
concentraes utilizadas devem abranger uma gama compreendida entre a toxicidade mxima e uma toxicidade
reduzida ou nula; o que significa geralmente que as concentraes devem variar num factor de 2 a 10. No
momento da colheita, a concentrao mxima deve determinar uma reduo significativa (superior a 50 %) do
grau de confluncia, da contagem de clulas viveis e do ndice mittico. O ndice mittico constitui uma
medida indirecta dos efeitos citotxicos/citostticos, dependendo do tempo decorrido aps a exposio.
Todavia, a sua utilizao aceitvel no caso de culturas em suspenso, em que os restantes mtodos de
determinao da toxicidade podem revelar-se fastidiosos ou impraticveis. Os dados relativos cintica do ciclo
celular, nomeadamente o tempo mdio de gerao (TMG), podem ser utilizados como informao suplementar.
O TMG constitui, no entanto, uma mdia global, que nem sempre permite identificar a existncia de
subpopulaes com um crescimento menos rpido, podendo acontecer em alguns casos que ligeiros aumentos
do TMG possam resultar em atrasos muito substanciais no que respeita ao surgimento de aberraes.
No caso de substncias sem efeitos citotxicos considerveis, a concentrao mxima do ensaio deve ser a mais
baixa de 5 l/ml, 5 mg/ml ou 0,01 M.
Para substncias relativamente insolveis que no sejam txicas em concentraes inferiores concentrao
insolvel, a dose mxima a utilizar deve corresponder a uma concentrao acima do limite de solubilidade no
meio de cultura final aps o perodo de exposio. Em alguns casos (por exemplo: quando a toxicidade apenas
ocorre em concentraes superiores menor concentrao insolvel) conveniente ensaiar mais de uma
concentrao com precipitao visvel. Poder ser til avaliar a solubilidade no incio e no fim da exposio,
uma vez que a mesma se pode alterar durante a exposio no sistema de ensaio devido presena de clulas, de
S9, de soro, etc. A insolubilidade pode ser detectada vista desarmada. O precipitado no deve interferir com as
contagens necessrias.
1.4.2.3. Controlos negativos e positivos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo), tanto na presena
como na ausncia de um sistema de activao metablica. Quando for utilizada activao metablica, o
produto qumico de controlo positivo deve ser o mesmo que exige a activao para dar uma resposta
mutagnica.
Para os controlos positivos deve ser utilizado um agente clastognico conhecido aos nveis de exposio
esperados, de forma a obter um aumento detectvel e reprodutvel ao longo do tempo que permita demonstrar
a sensibilidade do sistema de ensaio.
As concentraes do controlo positivo devem ser escolhidas de modo a que os seus efeitos sejam claros,
devendo ser utilizadas lminas codificadas de forma a que no sejam imediatamente identificveis pela pessoa
que procede leitura. As substncias de controlo positivo podem ser, por exemplo:
Condio de activao metablica Substncia N.
o
CAS N.
o
EINECS
Ausncia de activao metab-
lica exgena
metanossulfonato de metilo 66-27-3 200-625-0
metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7
etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2
mitomicina C 50-07-7 200-008-6
N-xido de 4-nitroquinolina 56-57-5 200-281-1
Presena de activao metab-
lica exgena
benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5
ciclofosfamida
ciclofosfamida monohidrato
50-18-0
6055-19-2
200-015-4
Podem utilizar-se no controlo positivo outras substncias adequadas. A possibilidade de utilizao de produtos
qumicos de uma classe afim para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam.
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Para cada colheita, devem tambm realizar-se controlos negativos, em que as clulas so expostas apenas ao
solvente ou veculo e ao meio de tratamento, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal. Alm
disso, devem igualmente ser utilizados controlos no expostos substncia em estudo, a menos que j existam
dados de controlo que demonstrem que o solvente escolhido no induz nenhum efeito deletrio ou
mutagnico.
1.4.3. Procedimento
1.4.3.1. Exposio substncia em estudo
As clulas em crescimento so expostas substncia em estudo na presena e na ausncia de um sistema de
activao metablica. Os linfcitos devem ser expostos substncia em estudo cerca de 48 horas aps o
estmulo mitognico.
1.4.3.2. Normalmente, devem ser utilizadas culturas em duplicado para cada concentrao, sendo fortemente
recomendada a utilizao de culturas em duplicado tambm para os controlos negativos/solventes. Quando
puder ser demonstrado, a partir dos dados de experincias anteriores, que a diferena entre as culturas
duplicadas mnima (13) (14), pode aceitar-se a utilizao de uma nica cultura para cada concentrao.
As substncias gasosas ou volteis devem ser ensaiadas por mtodos apropriados, por exemplo em recipientes
selados (15) (16).
1.4.3.3. Intervalo de amostragem das culturas
No primeiro ensaio, as clulas so expostas substncia em estudo, na presena e na ausncia de um sistema de
activao metablica, durante 3-6 horas, sendo colhidas a intervalos equivalentes a cerca de 1,5 ciclos celulares
normais, a partir do incio da exposio (12). Se este protocolo der resultados negativos tanto na presena
como na ausncia de um sistema de activao, deve ser realizada uma experincia adicional sem activao, com
exposio em contnuo at colheita, passado um tempo equivalente a 1.5 ciclos celulares normais. Certos
produtos qumicos podem ser detectados mais facilmente com tempos de exposio/colheita superiores a 1,5
ciclos celulares. Os resultados negativos com activao metablica tero de ser confirmados caso a caso. Nos
casos em que a confirmao dos resultados negativos no seja considerada necessria, deve ser apresentada
uma justificao.
1.4.3.4. Preparao dos cromossomas
As culturas de clula so tratadas com Colcemid

ou colchicina, geralmente durante 1-3 horas antes da


colheita. Procede-se colheita individual das culturas e ao respectivo processamento, com vista preparao
dos cromossomas, que inclui o tratamento hipotnico das clulas, seguido de fixao e colorao.
1.4.3.5. Anlise
Todas as lminas, incluindo as provenientes dos lotes de controlo positivo e negativo, devem ser
independentemente codificadas antes da anlise microscpica. Uma vez que os processos de fixao do
frequentemente lugar ruptura de uma determinada proporo das clulas em metafase, com perda dos
cromossomas, as clulas contabilizadas devem apresentar, para todos os tipos de clula, um nmero de
centrmeros igual ao nmero modal 2. Devem ser contabilizadas pelo menos 200 metafases com uma boa
distribuio para cada concentrao e para o controlo, com boa concordncia entre os replicados, quando
existam. Esse nmero pode ser inferior caso se observe um nmero elevado de aberraes.
Embora o objectivo do ensaio consista na deteco de aberraes cromossmicas estruturais, devem registar-se
os casos de poliploidia e de endorreduplicao, quando ocorram.
2. DADOS
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS
A unidade experimental a clula, pelo que se deve avaliar a percentagem de clulas que apresentam uma
aberrao cromossmica estrutural. Os diferentes tipos de aberrao cromossmica estrutural devem ser
enumerados e discriminados pelo seu nmero e frequncia nas culturas experimentais e de controlo. A
ocorrncia de lacunas registada em separado e includa no relatrio, mas no geralmente contabilizada para
o clculo da frequncia total das aberraes.
Durante a experincia principal para a deteco de aberraes, devem ser igualmente registadas as medies da
citotoxidade realizadas em paralelo com os ensaios, para todas as culturas de controlo e para os casos de
resposta negativa.
Devem ser fornecidos dados individuais para cada cultura, para alm de um quadro com o resumo dos dados
globais.
L 142/228 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
No necessrio comprovar uma reaco positiva inequvoca. Os resultados ambguos devem ser esclarecidos
atravs de experincias adicionais, de preferncia com modificao das condies experimentais. A necessidade
de confirmar os resultados negativos j foi discutida no ponto 1.4.3.3. As experincias subsequentes devem
contemplar a modificao dos parmetros de estudo, por forma a alargar a gama de condies avaliadas. Os
parmetros de estudo que podem ser alterados incluem a gama e os intervalos entre as diferentes concentraes
e as condies da activao metablica.
2.2. AVALIAO E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
Existem vrios critrios para determinar um resultado positivo, nomeadamente o aumento do nmero de
clulas com aberraes cromossmicas relacionado com a concentrao ou que seja reprodutvel. Deve
atender-se, antes de mais, importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados
dos ensaios, podero ser utilizados mtodos estatsticos (3) (13), embora a significncia estatstica no deva ser
o nico elemento para a determinao de uma resposta positiva.
Um aumento do nmero de clulas poliplides pode indicar que a substncia em estudo apresenta o potencial
de inibir a mitose e de induzir aberraes cromossmicas numricas. Um aumento do nmero de clulas com
cromossomas endorreduplicados pode indicar que a substncia em estudo apresenta o potencial de inibir a
progresso do ciclo celular (17) (18).
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios supra considerada no mutagnica para o sistema
em causa.
Embora a maioria de experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o
conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da substncia em
estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos independentemente do
nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio in vitro de aberraes cromossmicas indica que a substncia em estudo induz
aberraes cromossmicas estruturais nas clulas somticas de mamferos em cultura. Um resultado negativo
indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo no induz aberraes cromossmicas estruturais
nas clulas somticas de mamferos em cultura.
3. APRESENTAO DE RELATRIOS
RELATRIO DE ENSAIO
O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo,
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.
Clulas:
tipo e origem das clulas,
caractersticas do caritipo e adequao do tipo de clulas utilizado,
ausncia de micoplasma, quando aplicvel,
informao sobre a durao do ciclo celular,
sexo dos dadores de sangue, sangue completo ou linfcitos, agente mitognico utilizado,
nmero de passagens, quando aplicvel,
mtodos de manuteno da cultura celular, quando aplicvel,
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/229
nmero modal de cromossomas.
Condies de ensaio:
identificao e concentrao da substncia que pra a metafase, durao da exposio da clula,
justificao para a seleco das concentraes e do nmero de culturas, incluindo, por exemplo, dados
sobre a citotoxicidade e sobre as limitaes de solubilidade, quando disponveis,
concentrao da substncia em estudo,
volumes adicionados do veculo e da substncia em estudo,
temperatura de incubao,
tempo de incubao,
durao da exposio,
densidade celular da cultura de arranque, quando aplicvel,
tipo e composio do sistema de activao metablica, incluindo critrios de aceitabilidade,
controlos positivos e negativos,
mtodos de preparao das lminas,
critrios de contabilizao das aberraes,
nmero de clulas em metafase analisadas,
mtodos de determinao da toxicidade,
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo.
Resultados:
sinais de toxicidade, ou seja, grau de confluncia, dados relativos ao ciclo celular, contagens de clulas,
ndice mittico,
sinais de precipitao,
dados sobre o pH e a presso osmtica do meio de tratamento, caso tenham sido determinados,
definio das aberraes observadas, incluindo as lacunas,
nmero de clulas em que se observa uma aberrao cromossmica e tipo dessas aberraes,
discriminados para cada cultura exposta e de controlo,
alteraes da ploidia, quando observadas,
relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar,
L 142/230 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
anlise estatstica, quando tenha sido realizada,
dados relativos ao controlo negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo com o ensaio,
dados histricos sobre o controlo negativo (solvente/veculo) e positivo, com as respectivas gamas,
valores mdios e desvios-padro.
Discusso dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Evans, H. J., (1976) Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens,
Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and
London, p. 1-29.
(2) Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T., (1985) The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster
Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds)
Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, p. 427-432.
(3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura,
F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E., (1978)
Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of
108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl. 10), p. 1-175.
(4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991)
Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res,
257, p. 147-204.
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992) Clastogenicity of low pH to Various Cultured
Mammalian Cells. Mutation Res., 268, p. 297-305.
(6) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with
the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364.
(7) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation
Res., 113, p. 173-215.
(8) Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N., (1976) Cytogenetic Effects of
Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome
Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine
(DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, p. 83-90.
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr., (1979) Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals
Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, p. 277-290.
(10) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C.,
(1992) Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-
-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated
Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and
Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, p. 85-
-88.
(12) Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T.,
(1994) Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res.,
312, p. 241-261.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/231
(13) Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B., (1989) Analysis
of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland,
D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, p. 141-154.
(14) Soper, K.A. and Galloway, S.M., (1994) Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome
Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, p. 139-149.
(15) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases
and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents.
New York, Plenum, p. 91-103.
(16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) Evaluation of an Exposure System Using
Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation
Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795-801.
(17) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2
arrest. Mutation Res., 119, p. 403-413.
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster
cells. Cancer Res., 43, p. 1362-1364.
L 142/232 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B.11. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VIVO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM CLULAS DA
MEDULA DE MAMFEROS
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 475 Ensaio de aberraes cromossmicas em clulas da
medula de mamferos (1977).
1.1. INTRODUO
O ensaio de aberraes cromossmicas em clulas da medula de mamferos utilizado para a deteco de
aberraes cromossmicas estruturais induzidas pela substncia em estudo em clulas da medula de animais,
geralmente roedores (1) (2) (3) (4). As aberraes estruturais podem ser de dois tipos, afectando os
cromossomas ou os cromatdeos. A maior parte dos mutagneos qumicos induzem aberraes cromatdicas,
mas tambm podem ocorrer aberraes cromossmicas. Um aumento da taxa de poliploidia pode indicar que
um determinado produto qumico tem potencial para induzir aberraes numricas. As mutaes
cromossmicas e eventos relacionados causam diversas doenas genticas humanas, existindo provas
substanciais de que as alteraes que causam nos oncogenes e nos genes supressores de tumores das clulas
somticas esto envolvidas na induo de cancro nos seres humanos e em animais utilizados em experincias.
Os animais utilizados no presente ensaio so geralmente roedores. A medula o tecido objectivo do ensaio, por
se tratar de um tecido altamente vascularizado e que contm uma populao de clulas com grande ritmo de
duplicao e que podem ser facilmente isoladas e processadas. O presente mtodo no se destina aplicao
noutras espcies animais ou tecidos objectivo.
O presente ensaio de aberraes cromossmicas particularmente relevante para a avaliao dos riscos
mutagnicos, uma vez que permite tomar em considerao os factores do metabolismo in vivo da
farmacocintica e dos processos de reparao do ADN, embora estes possam variar de espcie para espcie e de
tecido para tecido. Os ensaios in vivo so igualmente teis para a investigao complementar de efeitos
mutagnicos detectados atravs de ensaios in vitro.
Se existirem provas de que nem a substncia em estudo nem nenhum dos seus metabolitos reactivos entram
em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio no apropriado.
Ver tambm a parte B da Introduo Geral.
1.2. DEFINIES
Aberrao cromatdica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de
unio, de cromatdeos simples.
Aberrao cromossmica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de
unio, de ambos os cromatdeos no mesmo local.
Endorreduplicao: processo no qual, aps um perodo S de replicao do ADN, o ncleo no entra em
mitose iniciando um novo perodo S. O resultado so cromossomas com 4, 8, 16, ... cromatdeos.
Lacuna: leso acromtica de extenso inferior largura de um cromatdeo e que determine um ligeiro
desalinhamento do mesmo.
Aberrao numrica: alterao do nmero de cromossomas relativamente ao nmero de cromossomas
caracterstico das clulas utilizadas.
Poliploidia: nmero de cromossomas mltiplo do nmero haplide (n), mas diferente do nmero diplide (ou
seja, 3n, 4n, etc.).
Aberrao estrutural: alterao da estrutura dos cromossomas detectvel por exame microscpico das clulas
em metafase, na forma de supresso de segmentos, de alteraes de partes da sequncia ou da troca de
segmentos num cromatdeo ou entre cromatdeos.
1.3. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Os animais so expostos substncia em estudo atravs de um modo de exposio apropriado, sendo
sacrificados passado o tempo necessrio aps a exposio. Antes do sacrifcio, os animais so tratados com um
produto fixador da metafase (por exemplo, colchicina ou Colcemid

). Seguidamente, so feitas preparaes de


cromossomas a partir das clulas de medula onde, aps colorao, as clulas em metafase so analisadas para
deteco de aberraes cromossmicas.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/233
1.4. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.4.1. Preparao
1.4.1.1. Seleco das espcies animais
Geralmente, so utilizados ratos, ratazanas ou hamsters chineses, embora possa ser qualquer outra espcie de
mamifero apropriada. Devem ser utilizados animais adultos saudveis jovens das raas de laboratrio mais
comuns. No incio do estudo, a variaao de peso entre os animais deve ser mnima, no devendo exceder
20 % do peso mdio de cada sexo.
1.4.1.2. Condies de acomodao e alimentao
Devem ser aplicadas as condies gerais referidas na Introduo Geral, parte B, embora o objectivo para a
humidade deva ser de 50 %-60 %.
1.4.1.3. Preparao dos animais
Os animais adultos saudveis jovens so distribudos aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos grupos
expostos. As gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos respectiva colocao sejam
minimizados. Os animais so identificados de forma inequvoca, devendo ser aclimatados s condies de
laboratrio durante pelo menos cinco dias.
1.4.1.4. Preparao das doses
As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e, se necessrio,
diludas antes de serem adicionadas s clulas. As substncias lquidas podem ser adicionadas directamente aos
sistemas em estudo e/ou diludas antes de serem adicionadas s clulas. Devem ser utilizadas preparaes
frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo
armazenamento no coloca problemas para o ensaio.
1.4.2. Condies do ensaio
1.4.2.1. Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo nem produzir efeitos txicos nas doses
utilizadas. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se encontrem totalmente elucidadas,
devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possvel, recomenda-se a
utilizao de solventes/veculos aquosos.
1.4.2.2. Controlos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo) para cada sexo.
Com excepo da exposio substncia em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo,
devem ser manuseados de forma idntica.
Os controlos positivos devem produzir aberraes estruturais in vivo aos nveis a que se espera o surgimento de
um aumento detectvel em relao linha de base. A dose a administrar para o controlo positivo deve ser
escolhida de modo a que os seus efeitos sejam claros mas tambm a que as lminas codificadas no sejam
imediatamente identificadas pela pessoa que procede s leituras. aceitvel que o controlo positivo seja
administrado por uma via diferente da substncia em estudo e que s seja realizada uma amostra. A
possibilidade de utilizao de produtos qumicos de uma classe relacionada para o controlo positivo deve ser
considerada, quando existam. As substncias de controlo positivo podem incluir, por exemplo:
Substncia Nmero CAS Nmero EINECS
metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7
etilnitrosureia 759-73-9 212-072-2
mitomicina C 50-07-7 200-008-6
ciclofosfamida
ciclofosfamida monohidrato
50-18-0
6055-19-2
200-015-4
trietilenomelamina 51-18-3 200-083-5
L 142/234 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Para cada colheita devem tambm realizar-se controlos negativos, em que os animais so expostos apenas ao
solvente ou veculo, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal, a menos que existam dados
histricos de controlo aceitveis em relao variabilidade de animal para animal e frequncia da ocorrncia
de clulas com aberraes cromossmicas. Se s estiver prevista uma amostra dos controlos negativos, a altura
mais apropriada a primeira amostra. Alm disso, devem igualmente ser utilizados controlos no expostos
substncia em estudo, a menos que j existam dados de estudos anteriores ou publicados que mostrem que o
solvente/veculo escolhido no induz nenhum efeito deletrio ou mutagnico.
1.5. PROCEDIMENTO
1.5.1. Nmero e sexo dos animais
Cada grupo de estudo e de controlo deve incluir pelo menos cinco animais analisveis por sexo. Se no
momento do estudo existirem dados disponveis de estudos com as mesmas espcies e com utilizao da
mesma via de administrao que demonstrem que no h qualquer diferena substancial da toxicidade entre os
sexos, ser suficiente testar um nico sexo. Nos casos em que a exposio humana aos produtos qumicos possa
ser especfica a cada sexo, como acontece com alguns produtos farmacuticos, o ensaio deve ser executado com
animais do sexo em causa.
1.5.2. Programao do tratamento
As substncias de ensaio so preferivelmente administradas numa nica exposio, podendo igualmente ser
administradas numa dose dividida, ou seja, duas exposies no mesmo dia, separadas por apenas algumas
horas, para facilitar a administrao de grandes volumes. Qualquer outro regime de administrao ter de ser
cientificamente justificado.
Devem ser colhidas duas amostras separadas, aps exposio durante um dia. Para os roedores, a primeira
amostra deve ser colhida 1,5 ciclos celulares normais (que normalmente de 12-18 horas) aps a exposio.
Dado que o tempo necessrio para a absoro e metabolismo da substncia em estudo, bem como o seu efeito
sobre a cintica do ciclo celular, podem afectar o momento ptimo para a deteco de uma eventual aberrao
cromossmica, recomenda-se a recolha de uma segunda amostra 24 horas aps a primeira. Se forem utilizados
regimes de administrao ao longo de mais de um dia, deve ser colhida uma amostra 1,5 ciclos celulares
normais aps a exposio final.
Antes do sacrifcio, os animais so injectados intraperitonealmente com uma dose apropriada de um agente de
fixao da metafase (por exemplo, Colcemid

ou colchicina). As amostras sero colhidas a intervalos regulares,


correspondentes a aproximadamente 3-5 horas para os ratos e a 4-5 horas para os hamsters chineses, a partir
desse momento. As clulas da medula so colhidas e analisadas para deteco de aberraes cromossmicas.
1.5.3. Doses
Se for realizado um estudo para avaliao da gama de doses a administrar, por no estarem disponveis dados
apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratrio, utilizando as mesmas espcies, linha
celular, sexo e regime de exposio a utilizar no estudo principal (5). Se a substncia for txica, devero ser
utilizadas trs doses diferentes para a primeira amostragem, abrangendo uma gama compreendida entre a
toxicidade mxima e uma toxicidade reduzida ou quase nula. Na segunda amostragem s ser necessrio avaliar
a dose mxima, que definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilizao
de doses superiores, com o mesmo regime de administrao, produzir mortalidade. As substncias com
actividade biolgica especfica em doses baixas e no txicas (como acontece com as hormonas e agentes
mitognicos) podero constituir uma excepo aos critrios de fixao da dose, devendo ser avaliadas caso a
caso. A dose mxima pode igualmente ser definida como a dose que produz algumas indicaes de toxicidade
na medula (por exemplo, uma reduo superior a 50 % do ndice mittico).
1.5.4. Ensaio-limite
Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso corporal numa nica exposio ou em duas
exposies no mesmo dia no produzir nenhum efeito txico perceptvel e se, com base nos dados respeitantes
a substncias estruturalmente relacionadas, no for previsvel a existncia de toxicidade gentica, poder no ser
considerado necessrio um estudo completo com utilizao de trs doses diferentes. Para os estudos de maior
durao, a dose limite de 2 000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposies at 14 dias e de 1 000 mg/kg
de peso corporal/dia para as exposies de durao superior a 14 dias. A exposio prevista para o ser humano
pode indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios-limite.
1.5.5. Administrao das doses
A substncia em estudo geralmente administrada por sonda esofgica, utilizando um tubo estomacal ou
cnula de intubao apropriada, ou por injeco intraperitoneal. Podero ser aceites, mediante justificao,
outras vias de administrao. O volume mximo de lquido que pode ser administrado de cada vez por sonda
esofgica ou por injeco depende tambm do tamanho do animal de ensaio, no devendo exceder 2 ml/100 g
de peso corporal. A utilizao de volumes mais elevados deve ser justificada. Com excepo das substncias que
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/235
causem irritao ou que sejam corrosivas, cujos efeitos sero normalmente agravados em concentraes mais
altas, a variabilidade do volume de ensaio deve ser minimizada atravs do ajustamento das concentraes, por
forma a garantir um volume constante e independente da dose a administrar.
1.5.6. Preparao dos cromossomas
Imediatamente aps o sacrifcio, a medula colhida, exposta a uma soluo hipotnica e fixada. As clulas so
depois esfregadas em lminas e coradas.
1.5.7. Anlise
O ndice mittico deve ser determinado como medio da citotoxicidade em pelos menos 1 000 clulas por
animal para todos os animais expostos substncia em estudo (incluindo os controlos positivos) e para os
animais no expostos do controlo negativo.
Devem ser analisadas pelo menos 100 clulas de cada animal. Este nmero poder ser menor quando se
verificarem taxas elevadas de aberraes. Todas as lminas, incluindo as provenientes dos lotes de controlo
positivo e negativo, devem ser independentemente codificadas antes da anlise microscpica. Uma vez que os
processos de fixao do frequentemente lugar ruptura de uma determinada proporo das clulas em
metafase, com perda dos cromossomas, as clulas contabilizadas devem apresentar, para todos os tipos de
clula, um nmero de centrmeros igual ao nmero modal 2.
2. DADOS
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS
Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num quadro. A unidade experimental o animal.
Para cada animal, devem ser apresentados o nmero de clulas contabilizadas, o nmero de aberraes por
clula e a percentagem de clulas com aberraes cromossmicas estruturais. Os diferentes tipos de aberrao
cromossmica estrutural devem ser enumerados, com os respectivos nmeros e frequncias, para os grupos
expostos substncia em estudo e para os grupos de controlo. A ocorrncia de lacunas registada em separado
e includa no relatrio, mas no geralmente contabilizada para o clculo da frequncia total das aberraes. Se
no houver qualquer evidncia de uma diferena na resposta entre os sexos, os dados de ambos os sexos
podero ser combinados para fins estatsticos.
2.2. AVALIAO E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
Existem vrios critrios para determinar um resultado positivo, nomeadamente o aumento do nmero de
clulas com aberraes cromossmicas relacionado com a concentrao ou um claro aumento do nmero de
clulas com aberraes num determinado grupo ou numa determinada amostra. Deve atender-se, antes de
mais, importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados dos ensaios,
podero ser utilizados mtodos estatsticos (6), embora a significncia estatstica no deva ser o nico elemento
para a determinao de uma resposta positiva. Os resultados ambguos devem ser esclarecidos atravs de
estudos adicionais, de preferncia com modificao das condies experimentais.
Um aumento do nmero de clulas poliplides pode indicar que a substncia em estudo apresenta o potencial
de inibir a mitose e de induzir aberraes cromossmicas numricas. Um aumento do nmero de clulas com
cromossomas endorreduplicados pode indicar que a substncia em estudo apresenta o potencial de inibir a
progresso do ciclo celular (7) (8).
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios supra no presente ensaio considerada no
mutagnica.
Embora a maioria de experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o
conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da substncia em
estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos independentemente do
nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio in vitro de aberraes cromossmicas indica que a substncia em estudo induz
aberraes cromossmicas estruturais nas clulas da medula das espcies testadas. Um resultado negativo
indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo no induz aberraes cromossmicas estruturais
nas clulas da medula das espcies testadas.
L 142/236 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Deve ser discutida a probabilidade de a substncia em estudo ou os seus metabolitos alcanarem o sistema
circulatrio geral ou especificamente o tecido objectivo (ou seja, a toxicidade sistmica).
3. APRESENTAO DE RELATRIOS
RELATRIO DE ENSAIO
O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo,
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.
Animais de ensaio:
espcie/linha celular utilizada,
nmero, idade e sexo dos animais,
origem, condies de acomodao, alimentao, etc.,
peso de cada animal no incio do ensaio, incluindo a gama de pesos, a respectiva mdia e o desvio-padro
para cada grupo.
Condies de ensaio:
controlos positivos e negativos (veculo/solvente),
resultados do estudo para definio da gama de doses, quando tenha sido realizado,
justificao para a seleco das doses,
preparao da substncia em estudo,
modo de administrao da substncia em estudo,
justificao da via de administrao escolhida,
mtodo para a verificao de que a substncia em estudo atingiu a circulao geral ou o tecido objectivo,
quando aplicvel,
converso da concentrao da substncia em estudo (ppm) na alimentao/abeberao para a dose real
(mg/kg peso corporal/dia), quando aplicvel,
qualidade dos alimentos e da gua,
descrio pormenorizada dos calendrios de exposio e amostragem,
mtodos de medio da toxicidade,
substncia utilizada para fixar a metafase, respectiva concentrao e durao de exposio,
mtodos de preparao das lminas,
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/237
critrios de contabilizao das aberraes,
nmero de clulas analisadas por animal,
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo.
Resultados:
sinais de toxicidade,
ndice mittico,
tipo e nmero de aberraes observadas em cada animal,
nmero total de aberraes em cada grupo, com as respectivas mdias e desvios-padro,
nmero de clulas aberrantes em cada grupo, com as respectivas mdias e desvios-padro,
alteraes da ploidia, quando observadas,
relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar,
anlise estatstica, quando tenha sido realizada,
dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio,
dados histricos sobre o controlo negativo com as respectivas gamas, valores mdios e desvios-padro,
dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o ensaio.
Discusso dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Adler, I.D., (1984) Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt
and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275-306.
(2) Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo
Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189,
p. 157-165.
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L., (1990) In Vivo
Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures.
UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
(4) Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M.,
Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994)
Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration
Test. Mutation Res., 312, p. 305-312.
L 142/238 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
(5) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker,
G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK
Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays.
Mutagenesis, 7, p. 313-319.
(6) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth,
D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-
-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity
Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge. p. 184-232.
(7) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2
arrest. Mutation Res. 119, p. 403-413.
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster
cells. Cancer Res., 43, p. 1362-1364.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/239
B.12. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VIVO DOS MICRONCLEOS EM ERITRCITOS DE MAMFEROS
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 474 Ensaio dos microncleos em eritrcitos de
mamferos (1997).
1.1. INTRODUO
O ensaio in vivo dos microncleos de mamferos utilizado para a deteco de danos induzidos pela substncia
em estudo nos cromossomas ou no aparelho mittico dos eritoblastos, atravs da anlise dos eritrcitos
retirados da medula e/ou de clulas de sangue perifrico de animais, geralmente roedores.
O objectivo do ensaio do microncleo identificar substncias que causam danos citognicos, dando lugar
formao de microncleos com fragmentos de cromossoma ou com cromossomas inteiros.
Quando um eritroblasto da medula se desenvolve para dar um eritrcito policromtico, o ncleo principal
expulso; qualquer microncleo que tenha sido formado pode ficar para atrs (lagging), no citoplasma, onde
no deveria existir qualquer material nuclear. A visualizao dos microncleos facilitada nestas clulas, uma
vez que no existe um ncleo principal. Um aumento de frequncia de eritrcitos policromticos,
micronucleados, nos animais expostos substncia em estudo representa uma indicao de danos
cromossmicos induzidos.
Para o presente ensaio utiliza-se normalmente a medula de roedores, uma vez que os eritrcitos policromticos
so produzidos nesse tecido. A medio dos eritrcitos (policromticos) imaturos micronucleados no sangue
perifrico igualmente aceitvel para qualquer outra espcie em que tenha sido demonstrado que o bao no
tem a capacidade de eliminar os eritrcitos micronucleados ou que apresente uma sensibilidade adequada para
a deteco de agentes que causam aberraes cromossmicas estruturais ou numricas. Os microncleos
podem ser distinguidos por alguns critrios, que incluem a identificao da presena ou ausncia de um
centrmero ou de ADN centromrico nos microncleos. A frequncia dos eritrcitos (policromticos) imaturos
micronucleados o principal ponto final utilizado. A proporo de eritrcitos (normocromticos) maturos
com microncleos no sangue perifrico pode igualmente ser utilizada como ponto final do ensaio quando os
animais forem expostos substncia em estudo de forma contnua durante quatro semanas ou mais.
O ensaio in vivo do microncleo de mamferos particularmente relevante para a avaliao dos perigos
mutagnicos, uma vez que permite a avaliao dos elementos metablicos, da farmacocintica e dos processos
de reparao do ADN in vivo, embora estes possam variar de espcie para espcie, de tecido para tecido e em
termos do ponto final gentico. Os ensaios in vivo so igualmente teis para a investigao suplementar de um
efeito mutagnico detectado in vitro.
Se existirem provas de que nem a substncia em estudo nem nenhum dos seus metabolitos reactivos entram
em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio no apropriado.
Ver tambm a parte B da Introduo Geral.
1.2. DEFINIES
Centrmero: Regio(es) de um cromossoma a que esto associadas fibras fusiformes durante a diviso
celular, permitindo o movimento ordeiro dos cromossomas para os plos da clula.
Microncleos: Pequenos ncleos separados e adicionais dos ncleos das clulas principais, produzidos durante
a telefase da mitose (meiose) por fragmentos do cromossoma ou cromossomas inteiros que ficam para trs
(lagging).
Eritrcito normocromtico: Eritrcito maduro a que faltam ribossomas e que pode, por conseguinte,
distinguir-se dos eritrcitos policromticos imaturos por colorao selectiva dos ribossomas.
Eritrcito policromtico: Eritrcito imaturo, numa fase de desenvolvimento intermediria, que ainda contm
ribossomas e pode, por conseguinte, distinguir-se dos eritrcitos normocromticos maturos por colorao
selectiva dos ribossomas.
L 142/240 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.3. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Os animais so expostos substncia em estudo por uma via apropriada. Se for utilizada a medula, os animais
so sacrificados passado o tempo necessrio aps a exposio, a medula extrada e so feitas preparaes
coradas (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Quando utilizado o sangue perifrico, o sangue recolhido passado o tempo
necessrio aps a exposio e so preparados esfregaos corados (4) (8) (9) (10). Nos estudos com sangue
perifrico, as amostras de clula devem ser colhidas to cedo quanto possvel aps a ltima exposio
substncia em estudo. As preparaes so analisadas para a presena de microncleos.
1.4. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.4.1. Preparao
1.4.1.1. Seleco das espcies animais
Quando se pretender utilizar preparaes da medula, recomenda-se a utilizao de ratos ou ratazanas, embora
possa ser utilizada qualquer espcie de mamfero que seja apropriada. Quando se utilizar o sangue perifrico,
recomenda-se a utilizao de ratos. Contudo, pode ser utilizada qualquer espcie de mamfero que seja
apropriada, desde que se trate de uma espcie em que o bao no remove os eritrcitos micronucleados ou que
apresente uma sensibilidade adequada para a deteco de agentes que causam aberraes cromossmicas
estruturais ou numricas. Devem ser utilizados animais saudveis jovens de linhas de laboratrio com
caractersticas bem conhecidas. No incio do estudo, a diferena de peso entre os animais deve ser mnima, no
devendo exceder + 20 % do peso mdio de cada sexo.
1.4.1.2. Condies de acomodao e alimentao
Devem ser aplicadas as condies gerais referidas na Introduo Geral, parte B, embora o objectivo para a
humidade deva ser de 50 %-60 %.
1.4.1.3. Preparao dos animais
Os animais adultos saudveis jovens so distribudos aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos grupos
expostos. Os animais so identificados de forma inequvoca, devendo ser aclimatados s condies de
laboratrio durante pelo menos cinco dias. As gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos
devidos respectiva colocao sejam minimizados.
1.4.1.4. Preparao das doses
As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e, se necessrio,
diludas antes de serem administradas aos animais. As substncias lquidas podem ser adicionadas directamente
aos sistemas em estudo e/ou diludas antes de serem adicionadas s clulas. Devem ser utilizadas preparaes
frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo
armazenamento no coloca problemas para o ensaio.
1.4.2. Condies do ensaio
1.4.2.1. Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo nem produzir efeitos txicos nas doses
utilizadas. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se encontrem totalmente elucidadas,
devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possvel, recomenda-se a
utilizao de solventes/veculos aquosos.
1.4.2.2. Controlos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo) para cada sexo.
Com excepo da exposio substncia em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo,
devem ser manuseados de forma idntica.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/241
Os controlos positivos devem produzir microncleos in vivo aos nveis de exposio a que se espera o
surgimento de um aumento detectvel em relao linha de base. A dose de controlo positivo a administrar
deve ser escolhida de modo a que os seus efeitos sejam claros mas tambm a que as lminas codificadas no
sejam imediatamente identificadas pela pessoa que procede s leituras. aceitvel que o controlo positivo seja
administrado por uma via diferente da substncia em estudo e que s seja realizada uma amostra. A
possibilidade de utilizao de produtos qumicos de uma classe relacionada para o controlo positivo deve ser
considerada, quando existam. As substncias de controlo positivo podem incluir, por exemplo:
Substncia Nmero CAS Nmero EINECS
metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7
etilnitrosureia 759-73-9 212-072-2
mitomicina C 50-07-7 200-008-6
ciclofosfamida
ciclofosfamida monohidrato
50-18-0
6055-19-2
200-015-4
trietilenomelamina 51-18-3 200-08 3-5
Para cada colheita devem tambm realizar-se controlos negativos, em que os animais so expostos apenas ao
solvente ou veculo, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal, a menos que existam dados
histricos de controlo aceitveis em relao variabilidade de animal para animal e frequncia da ocorrncia
de clulas com aberraes cromossmicas. Se s estiver prevista uma amostra dos controlos negativos, a altura
mais apropriada a primeira amostra. Alm disso, devem igualmente ser utilizados controlos no expostos
substncia em estudo, a menos que j existam dados de estudos anteriores ou publicados que mostrem que o
solvente/veculo escolhido no induz nenhum efeito deletrio ou mutagnico.
Se for utilizado o sangue perifrico, uma amostra anterior exposio poder servir para o controlo negativo,
mas apenas nos estudos de menor durao (ou seja, 1 a 3 exposies), desde que os dados respeitantes a essa
amostra estejam de acordo com o esperado em funo de experincias anteriores.
1.5. PROCEDIMENTO
1.5.1. Nmero e sexo dos animais
Cada grupo exposto e de controlo deve incluir pelo menos cinco animais analisveis por sexo (11). Se no
momento do estudo existirem dados disponveis de estudos com as mesmas espcies e com utilizao da
mesma via de administrao que demonstrem que no h qualquer diferena substancial da toxicidade entre os
sexos, ser suficiente testar um nico sexo. Nos casos em que a exposio humana aos produtos qumicos possa
ser especfica a cada sexo, como acontece com alguns produtos farmacuticos, o ensaio deve ser executado com
animais do sexo em causa.
1.5.2. Programao do tratamento
No possvel recomendar qualquer programao especfica para a exposio (ou seja, uma, duas ou mais
exposies com intervalos de 24 horas). As amostras recolhidas durante regimes de administrao prolongada
so aceitveis, desde que o estudo demonstre a existncia de um efeito positivo ou, para um estudo negativo,
desde que a toxicidade seja demonstrada ou que se utilize uma dose limite, com administrao at ao momento
da colheita. As substncias de ensaio podem igualmente ser administradas numa dose dividida, ou seja, duas
exposies no mesmo dia, separadas por apenas algumas horas, para facilitar a administrao de grandes
volumes.
O ensaio pode ser executado de duas formas:
a) Os animais so expostos substncia em estudo uma nica vez. As amostras de medula so colhidas pelo
menos duas vezes, a primeira das quais pelo menos 24 horas aps a exposio, com intervalos
apropriados entre as colheitas mas no ultrapassando as 48 horas aps a exposio. Uma eventual
colheita antes de 24 horas aps a exposio ter de ser justificada. As amostras de sangue perifrico so
colhidas pelo menos duas vezes, a primeira das quais pelo menos 36 horas aps a exposio, com
intervalos apropriados entre as colheitas, mas no ultrapassando as 72 horas aps a exposio. Quando
for identificada uma resposta positiva numa determinada colheita, no ser necessrio continuar o
estudo;
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b) Se forem utilizadas duas ou mais exposies dirias (por exemplo, duas ou mais exposies com
intervalos de 24 horas), a primeira amostra deve ser colhida 18 a 24 horas depois da exposio final no
caso do sangue perifrico (12).
Quando necessrio, podero ser recolhidas amostras adicionais.
1.5.3. Doses
Se for realizado um estudo para avaliao da gama de doses a administrar, por no estarem disponveis dados
apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratrio, utilizando as mesmas espcies, linha
celular, sexo e regime de exposio a utilizar no estudo principal (13). Se a substncia for txica devero ser
utilizadas trs doses diferentes para a primeira amostragem, abrangendo uma gama compreendida entre a
toxicidade mxima e uma toxicidade reduzida ou quase nula. Na segunda amostragem s ser necessrio avaliar
a dose mxima, que definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilizao a
doses superiores, com o mesmo regime de administrao, produzir mortalidade. As substncias com
actividade biolgica especfica em doses baixas e no txicas (como acontece com as hormonas e agentes
mitognicos) podero constituir uma excepo aos critrios de fixao da dose, devendo ser avaliadas caso a
caso. A dose mxima pode igualmente ser definida como a dose que produz algumas indicaes de toxicidade
na medula (por exemplo, reduo da proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais na
medula ou no sangue perifrico).
1.5.4. Ensaio-limite
Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso corporal numa nica exposio ou em duas
exposies no mesmo dia no produzir nenhum efeito txico perceptvel e se, com base nos dados respeitantes
a substncias estruturalmente relacionadas, no for previsvel a existncia de toxicidade gentica, poder no ser
considerado necessrio um estudo completo com utilizao de trs doses diferentes. Para os estudos de maior
durao a dose limite de 2 000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposies at 14 dias e de 1 000 mg/kg
de peso corporal/dia para as exposies de durao superior a 14 dias. A exposio prevista para o ser humano
pode indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios-limite.
1.5.5. Administrao das doses
A substncia em estudo geralmente administrada por sonda esofgica, utilizando um tubo estomacal ou
cnula de intubao apropriada, ou por injeco intraperitoneal. Podero ser aceites, mediante justificao,
outras vias de administrao. O volume mximo de lquido que pode ser administrado de cada vez por sonda
esofgica ou por injeco depende tambm do tamanho do animal de ensaio, no devendo exceder 2 ml/100 g
de peso corporal. A utilizao de volumes mais elevados deve ser justificada. Com excepo das substncias que
causem irritao ou que sejam corrosivas, cujos efeitos sero normalmente agravados em concentraes mais
altas, a variabilidade do volume de ensaio deve ser minimizada atravs do ajustamento das concentraes, por
forma a garantir um volume constante e independente da dose a administrar.
1.5.6. Preparao da medula/sangue
As clulas da medula so retiradas do fmur ou da tbia imediatamente aps o sacrifcio. Geralmente, as clulas
so retiradas do fmur ou da tbia, preparadas e coradas de acordo com mtodos j definidos. O sangue
perifrico retirado da veia caudal ou de outro vaso sanguneo apropriado. As clulas de sangue so
imediatamente sujeitas a uma colorao supravital (8) (9) (10) ou ento so preparados esfregaos que depois
so corados. A utilizao de uma colorao especfica para o ADN [por exemplo, laranja de acridina (14) ou
pironina-y de milho 33 258 plus da Hoechst (15)] pode eliminar alguns dos erros associados utilizao de
uma colorao no especfica para o ADN. Esta vantagem no impossibilita a utilizao de coloraes
convencionais (por exemplo, Giemsa). Outros sistemas [por exemplo, colunas de celulose para remoo das
clulas nucleadas (16)] podem igualmente ser utilizados, desde que se demonstre que esses sistemas funcionam
de forma adequada para a preparao de microncleos em laboratrio.
1.5.7. Anlise
A proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais (imaturos + maduros) determinada para
cada animal atravs da contagem de pelo menos 200 eritrcitos no caso da medula e de 1 000 eritrcitos no
caso do sangue perifrico (17). Todas as lminas, incluindo as dos controlos positivos e negativos, devem ser
codificadas independentemente antes da anlise microscpica. A eventual ocorrncia de eritrcitos imaturos
micronucleados deve ser analisada em pelo menos 2 000 eritrcitos imaturos por animal. A contagem de
eritrcitos maduros micronucleados poder ser utilizada como informao adicional. Ao analisar as lminas, a
proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais no deve ser inferior a 20 % do valor de
controlo. Quando os animais forem sujeitos a uma exposio contnua durante quatro semanas ou mais,
podero ser tambm analisados 2 000 eritrcitos maduros por animal, para determinao da ocorrncia de
microncleos. Os sistemas automatizados de anlise (tratamento de imagens e citometria de fluxo e suspenses
celulares) so alternativas aceitveis avaliao manual, se apropriadamente justificadas e validadas.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/243
2. DADOS
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS
Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num quadro. A unidade experimental o animal.
Para cada animal, devem ser verificados separadamente o nmero de eritrcitos imaturos, o nmero de
eritrcitos imaturos micronucleados e a proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais.
Quando os animais tiverem sido expostos substncia em estudo em contnuo durante quatro semanas ou
mais, devem tambm ser recolhidos dados em relao aos eritrcitos maduros. Para cada animal, deve ser
apresentada a proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais e, se for considerado
necessrio, de eritrcitos maduros micronucleados. Se no houver qualquer evidncia de uma diferena na
resposta entre os sexos, os dados de ambos os sexos podero ser combinados para fins estatsticos.
2.2. AVALIAO E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
H diversos critrios para determinar um resultado positivo, como por exemplo um aumento do nmero de
clulas micronucleadas relacionado com a dose ou um claro aumento do nmero de clulas micronucleadas
num determinado grupo e numa determinada amostragem. Deve ser tomada em considerao, antes de mais, a
importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados dos ensaios podero ser
utilizados mtodos estatsticos (18) (19), embora a significncia estatstica no deva ser o nico elemento para a
determinao de uma resposta positiva. Os resultados ambguos devem ser esclarecidos atravs de estudos
adicionais, de preferncia com modificao das condies experimentais.
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios acima indicados no presente ensaio considerada
no mutagnica.
Embora a maioria de experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o
conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da substncia em
estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos independentemente do
nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio dos microncleos indica que a substncia em estudo induz a ocorrncia dos
mesmos, como resultado de danos nos cromossomas ou no sistema mittico dos eritroblastos da espcie
testada. Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo no induz a
ocorrncia de microncleos nos eritroblastos imaturos da espcie testada.
Deve ser discutida a probabilidade de a substncia em estudo ou os seus metabolitos alcanarem o sistema
circulatrio geral ou especificamente o tecido objectivo (ou seja, a toxicidade sistmica).
3. APRESENTAO DE RELATRIOS
RELATRIO DE ENSAIO
O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo,
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.
Animais de ensaio:
espcie/linha celular utilizada,
nmero, idade e sexo dos animais,
origem, condies de acomodao, alimentao, etc.,
peso de cada animal no incio do ensaio, incluindo a gama de pesos, a respectiva mdia e o desvio-
-padro para cada grupo.
L 142/244 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Condies de ensaio:
controlos positivos e negativos (veculo/solvente),
resultados do estudo para definio da gama de doses, quando tenha sido realizado,
justificao para a seleco das doses,
preparao da substncia em estudo,
modo de administrao da substncia em estudo,
justificao da via de administrao escolhida,
mtodo para a verificao de que a substncia em estudo atingiu a circulao geral ou o tecido objectivo,
quando aplicvel,
converso da concentrao da substncia em estudo (ppm) na alimentao/abeberao para a dose real
(mg/kg peso corporal/dia), quando aplicvel,
qualidade dos alimentos e da gua,
descrio pormenorizada dos calendrios de exposio e amostragem,
mtodos de preparao das lminas,
mtodos de medio da toxicidade,
critrios de contabilizao dos eritrcitos imaturos micronucleados,
nmero de clulas analisadas por animal,
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo.
Resultados:
sinais de toxicidade,
proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais,
nmero de eritrcitos imaturos micronucleados em cada animal,
mdias e desvios-padro dos eritrcitos imaturos micronucleados por grupo,
relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar,
anlise estatstica e respectivo mtodo,
dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio e dados histricos sobre o
controlo negativo,
dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o ensaio.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/245
Discusso dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Heddle, J.A., (1973) A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, p. 187-190.
(2) Schmid, W., (1975) The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, p. 9-15.
(3) Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W.,
(1983) The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res., 123, p. 61-118.
(4) Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A., (1990) The In Vivo
Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S.
Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, p. 29-80.
(5) MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M., (1983) Micronuclei in Circulating Erythrocytes:
A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. In: Developments in
Science and Practice of Toxicology, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam,
p. 555-558.
(6) MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D.,
(1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes.
Mutation Res., 189, p. 103-112.
(7) MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E., (1990) The in vivo Erythrocyte Micronucleus
Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity
Studies. Fund. Appl. Toxicol., 14, p. 513-522.
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1990) The Micronucleus Assay with
Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, p. 245-
-249.
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test, (1992) Micronucleus Test with Mouse
Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th
Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, p. 83-98.
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian
Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), (1995) Protocol
recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 153-
-159.
(11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B.,
Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) In Vivo Rodent Erythrocyte
Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, p. 293-304.
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S., (1995) An optimal, generalized sampling time of 30 6 h after double
dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 313-319.
(13) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker,
G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M., (1992) Report of British Toxicology Society/UK
Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays.
Mutagenesis, 7, p. 313-319.
(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1983) An Application of Acridine Orange Fluorescent
Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241-247.
L 142/246 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
(15) MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G., (1983) A Simple Fluorescent Staining Procedure for
Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, p. 269-
-275.
(16) Romagna, F. and Staniforth, C.D., (1989) The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res.,
213, p. 91-104.
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G., (1995) Sample size for the estimation of polychromatic to
normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, p. 97-99.
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L., (1990) In Vivo
Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures.
UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
(19) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth,
D.G. and Savage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.)
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity
Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne,
Sydney, p. 184-232.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/247
B.13./14. MUTAGENICIDADE ENSAIO DE MUTAO REVERSA EM BACTRIAS
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 471 Ensaio de mutao reversa bacteriana (1997).
1.1. INTRODUO
O ensaio de mutao reversa bacteriana utiliza estirpes de Salmonelas typhimurium e Escherichia coli carentes em
aminocidos para detectar mutaes pontuais, causadas pela substituio, adio ou supresso de um ou mais
pares de bases do ADN (1) (2) (3). O princpio do presente ensaio de mutao reversa bacteriana a deteco de
mutaes que invertem as mutaes existentes nas estirpes de ensaio, restaurando a capacidade funcional das
bactrias sintetizarem um cido essencial. As bactrias com mutao reversa so detectadas pela sua capacidade
de crescimento na ausncia do aminocido em que as estirpes de ensaio eram carentes.
As mutaes pontuais causam diversas doenas genticas humanas, existindo provas substanciais de que as
mutaes pontuais em oncogenes e em genes supressores de tumores nas clulas somticas esto envolvidas na
formao de tumores nos seres humanos e em animais experimentais. O ensaio de mutao reversa bacteriana
rpido, barato e de relativamente fcil execuo. Muitas das estirpes de ensaio tm diversas caractersticas que
as tornam mais sensveis para a deteco de mutaes, nomeadamente sequncias de ADN identificativas dos
locais de inverso, aumento da permeabilidade celular a grandes molculas e eliminao ou aumento da
ocorrncia de erros nos processos de reparao do ADN. A especificidade das estirpes de ensaio pode fornecer
alguma informao til sobre os tipos de mutaes induzidos pelos agentes genotxicos. J existe uma grande
base de dados com resultados respeitantes a uma vasta gama de ensaios de mutao reversa bacteriana, tendo
sido desenvolvidas metodologias com caractersticas bem conhecidas e que utilizam produtos qumicos com
diferentes propriedades fsico-qumicas, nomeadamente compostos temporrios.
Ver tambm a parte B da Introduo Geral.
1.2. DEFINIES
Ensaio de mutao reversa com Salmonelas typhimurium ou Escherichia coli: detecta mutaes em estirpes
carentes num determinado aminocido (histidina ou triptofano, respectivamente), que tem como resultado a
produo de uma estirpe independente do abastecimento externo desse aminocido.
Mutagneos de substituio de um par de bases so os agentes que causam uma alterao das bases do
ADN. No ensaio de mutao reversa essa alterao pode ocorrer no local da mutao original ou num local
diferente do genoma bacteriano.
Mutagneos por deslocao do quadro de leitura so agentes que causam a adio ou supresso de um ou
mais pares de bases no ADN, modificando dessa forma o quadro de leitura do ARN.
1.3. CONSIDERAES INICIAIS
O ensaio de mutao reversa bacteriana utiliza clulas procariotas, que diferem das clulas de mamfero em
caractersticas como a absoro, metabolismo, estrutura dos cromossomas e processos de reparao do ADN.
Os ensaios conduzidos in vitro exigem geralmente a utilizao de uma fonte exgena de activao metablica.
Os sistemas de activao metablica in vitro no reproduzem inteiramente as condies in vivo nos mamferos.
O ensaio no fornece, por conseguinte, informao directa sobre a potncia mutagnica e carcinognica da
substncia nos mamferos.
O ensaio de mutao reversa bacteriana geralmente utilizado para a despistagem inicial da actividade
genotxica e, nomeadamente, para detectar a induo de mutaes pontuais. Uma extensa base de dados
demonstrou que muitos produtos qumicos que do resultados positivos no presente ensaio apresentam uma
actividade mutagnica noutros ensaios. H exemplos de agentes mutagnicos que no so detectados pelo
presente ensaio, podendo as razes para essas falhas ser atribudas natureza especfica do ponto final
detectado, a diferenas na activao metablica ou ainda a diferenas na biodisponibilidade. Por outro lado,
elementos que aumentem a sensibilidade do ensaio de mutao reversa bacteriana podem conduzir
sobrestimao da actividade mutagnica.
O ensaio de mutao reversa bacteriana pode no ser apropriado para a avaliao de certas classes de produtos
qumicos, nomeadamente compostos altamente bactericidas (por exemplo, certos antibiticos) e produtos que
se pensa (ou que se sabe) que interferem especificamente com o sistema de replicao das clulas de mamferos
(por exemplo, alguns inibidores da topoisomerase e alguns compostos anlogos a nucleosdeos). Nesses casos,
poder ser mais apropriado utilizar ensaios de mutao em clulas de mamferos.
L 142/248 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Embora muitos dos compostos que do resultados positivos no presente ensaio sejam carcinogneos para os
mamferos, essa correlao no absoluta. Com efeito, a correlao depende da classe qumica e, por outro
lado, alguns agentes carcinogneos no so detectados no ensaio pelo facto de o seu mecanismo ou
mecanismos de actuao, no genotxicos, no afectarem as clulas bacterianas.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
As suspenses bacterianas so expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de um
sistema de activao metablico exgeno. No mtodo de incorporao em placas, as suspenses so misturadas
num revestimento de gelose e depois vertidas na superfcie duma lmina de gelose com meio mnimo. No
mtodo com incubao prvia, a mistura de tratamento incubada e s depois misturada com uma cobertura
de gelose e preparada em placas com meio mnimo. Independentemente da tcnica que tenha sido utilizada, as
colnias com mutao reversa so contadas e comparadas com o nmero de colnias com mutao reversa
espontnea em placas de controlo com solvente, aps dois ou trs dias de incubao.
Esto descritos diversos procedimentos para executar o ensaio de mutao reversa bacteriana. Entre os mais
geralmente utilizados esto o mtodo de incorporao em placas (1) (2) (3) (4), o mtodo com incubao
prvia (2) (3) (5) (6) (7) (8), o mtodo em flutuao (9) (10) e o mtodo em suspenso (11). As adaptaes
necessrias para os ensaios de gases ou vapores tambm se encontram descritas (12).
Os procedimentos descritos no presente mtodo dizem principalmente respeito aos mtodos de incorporao
em placas e com incubao prvia. Qualquer dos dois aceitvel para a realizao de experincias na presena e
na ausncia de um sistema de activao metablica. Algumas substncias podero ser detectadas de forma mais
eficaz utilizando o mtodo com incubao prvia. Essas substncias pertencem a classes qumicas que incluem
as nitrosaminas alifticas de cadeia curta, os metais, os aldedos, os corantes azicos e compostos diazcios, os
alcalides de priolizidina, os compostos allicos e os compostos nitro (3). Por outro lado, certas classes de
mutagneos nem sempre so detectadas quando se utilizam os procedimentos padro, tais como o mtodo de
incorporao em placas ou o mtodo com incubao prvia. Esses casos so considerados especiais e
recomenda-se fortemente que sejam utilizados procedimentos alternativos para a sua deteco. Esto j
identificados os seguintes casos especiais (e exemplos dos procedimentos que podem ser utilizados para a sua
deteco): corantes azicos e compostos diazticos (3) (5) (6) (13), gases e compostos qumicos (12) (14) (15)
(16) e glicsidos (17) (18) volteis. Qualquer desvio do procedimento padro ter de ser cientificamente
justificado.
1.5. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.5.1. Preparao
1.5.1.1. Bactrias
Devem ser utilizadas culturas frescas de bactrias na fase final do crescimento exponencial ou no incio da fase
estacionria (aproximadamente 10
9
clulas/ml). No devem ser utilizadas culturas em fase estacionria
adiantada. essencial que as culturas utilizadas na experincia contenham um ttulo elevado de clulas viveis,
que pode ser demonstrado por dados histricos de controlo sobre as curvas de crescimento ou durante o
prprio ensaio, atravs da determinao das clulas viveis em placas.
A temperatura de incubao recomendada de 37
o
C.
Devem ser utilizadas pelo menos cinco estirpes das bactrias, entre as quais quatro estirpes de S. typhimurium
(TA1535; TA1537 ou TA97 ou TA 97a; TA98 e TA100) para as quais foi demonstrado que so fiveis e do
resultados reprodutveis entre laboratrios. Essas quatro estirpes de S. typhimurium tm um par com as bases
GC no local da inverso primria e sabe-se que no permitem detectar certos agentes mutagneos oxidantes, de
ligao cruzada nem hidrazinas. Essas substncias podem ser detectadas utilizando as estirpes E. coli WP2 ou S.
typhimurium TA102 (19) que tm um par com as bases AT no local da inverso primria. Por conseguinte, a
combinao de estirpes recomendada :
S. typhimurium TA1535, e
S. typhimurium TA1537 ou TA97 ou TA97a, e
S. typhimurium TA98, e
S. typhimurium TA 100, e
E. coli WP2 uvrA, ou E. coli WP2 uvrA (pKM101), ou S. typhimurium TA102.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/249
Para a deteco de agentes mutagneos causadores de ligaes cruzadas, poder ser prefervel incluir a estirpe
TA102 ou acrescentar uma estirpe capaz de reparar o ADN de E. coli [por exemplo, E. coli WP2 ou E. coli WP2
(pKM101)].
Devem ser utilizados os procedimentos estabelecidos para a preparao de culturas de arranque, verificao dos
mercadores e armazenamento. As quantidades de aminocidos necessrios para o crescimento (histidina para
as estirpes de S. typhimurium e triptofano para as estirpes de E. coli) devem ser demonstradas para cada
preparao de cultura de arranque conservada. Outras caractersticas fenotpicas devem tambm ser verificadas,
a saber: a presena ou ausncia de plasmdeos de Factor-r, quando necessrio [ou seja, resistncia ampicilina
nas estirpes TA98, TA100 e TA97 ou TA97a, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101) e resistncia ampicilina e
tetraciclina na estirpe TA102]; presena de mutaes caractersticas (ou seja, mutao rfa em S. typhimurium,
atravs da sensibilizao com violeta de cristal, e mutao uvrA em E. coli ou mutao uvrB em S. typhimurium,
atravs da sensibilizao com raios ultravioleta) (2) (3). As estirpes devem ainda apresentar, de forma
espontnea, contagens de mutaes reversas nas gamas de frequncia esperadas em funo dos dados histricos
de controlo do laboratrio e tambm, de preferncia, da literatura.
1.5.1.2. Meio
Ser utilizado um meio mmimo de gelose apropriado (por exemplo, contendo meio mnimo Vogel-Bonner E e
glucose) e uma cobertura de gelose com histidina e biotina ou triptofano para permitir alguma diviso celular
(1) (2) (9).
1.5.1.3. Activao metablica
As bactrias devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de um sistema
adequado de activao metablica. O sistema mais geralmente utilizado uma fraco ps-mitocondrial
reforada com co-factor (S9) preparada a partir de fgados de roedores tratados com agentes de induo
enzimtica, como por exemplo Aroclor 1254 (1) (2) ou uma mistura de fenobarbitona e -naftoflavona (18)
(20) (21). A fraco ps-mitocondrial geralmente utilizada em concentraes na gama de 5 % a 30 % v/v na
mistura S9. A escolha e o estado do sistema de activao metablico podem depender da classe dos produtos
qumicos em estudo. Em alguns casos pode revelar-se adequado utilizar vrias concentraes diferentes de
fraco ps-mitocondrial. Para os corantes azicos para os compostos diazicos, poder ser mais indicado um
sistema activao metablica redutor (6) (13).
1.5.1.4. Substncia em estudo/preparao
As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e, se necessrio,
diludas antes da exposio das bactrias. As substncias lquidas podem ser adicionadas directamente aos
sistemas em estudo e/ou diludas antes de serem adicionadas s clulas. Devem ser utilizadas preparaes
frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo
armazenamento no coloca problemas para o ensaio.
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, devendo ser compatvel com a sobrevivncia
das clulas e com a actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se
encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que
possvel, recomenda-se a utilizao de solventes/veculos aquosos. Quando forem realizados ensaios de
substncias instveis na presena de gua, os solventes orgnicos utilizados devem ser anidros.
1.5.2. Condies do ensaio
1.5.2.1. Estirpes (ver 1.5.1.1)
1.5.2.2. Concentrao de exposio
A citotoxidade e a solubilidade na mistura final constituem alguns dos critrios a ter em conta na determinao
da maior quantidade da substncia em estudo a utilizar.
Poder ser til determinar a toxicidade e insolubilidade atravs de uma experincia preliminar. A citotoxicidade
pode ser detectada pela reduo do nmero de colnias com mutao reversa, pela presena de colnias mais
claras ou de menores dimenses ou pelo grau de sobrevivncia das culturas expostas. A citotoxidade de uma
substncia pode variar na presena de sistemas de activao metablicos. A insolubilidade deve ser avaliada em
funo da precipitao verificvel a olho nu na mistura final nas condies reais do ensaio.
A concentrao mxima de ensaio recomendada para substncias solveis no citotxicas de 5 mg/placa ou
de 5 l/placa. Para as substncias no citotxicas insolveis a 5 mg/placa ou a 5 l/placa, uma ou mais das
concentraes ensaiadas devem ser insolveis na mistura final. As substncias de ensaio citotxicas abaixo dos
5 mg/placa ou 5 l/placa devem ser ensaiadas at uma concentrao citotxica. O precipitado no deve
interferir com a contagem.
L 142/250 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Numa experincia inicial devem ser utilizadas pelo menos cinco concentraes analisveis diferentes da
substncia em estudo, com intervalos aproximadamente semilogartmicos (ou seja, 10) entre as
concentraes. Para a investigao da relao concentrao-resposta podero ser indicados intervalos menores.
Poder ser contemplada a possibilidade de ensaiar concentraes superiores a 5 mg/placa ou 5 l/placa quando
se pretender avaliar substncias que contenham quantidades substanciais de impurezas potencialmente
mutagnicas.
1.5.2.3. Controlos negativos e positivos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente ou veculo) especficos para
cada estirpe, devendo, para os controlos positivos, ser escolhidas concentraes que demonstrem o
desempenho eficaz de cada ensaio.
Para os ensaios com utilizao de um sistema de activao metablica, a substncia de referncia para os
controlos positivos deve ser seleccionada com base no tipo de estirpe de bactria utilizada.
As seguintes substncias so exemplos de controlos positivos apropriados para os ensaios com activao
metablica:
Substncia Nmero CAS Nmero EINECS
9,10-dimetilantraceno 781-43-1 212-308-4
7,12-dimetilbenzo[a]antraceno 57-97-6 200-359-5
benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5
2-aminoantraceno 613-13-8 210-330-9
ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4
ciclofosfamida monohidrato 6055-19-2
A seguinte substncia um controlo positivo apropriado para o mtodo de activao metablico redutor:
Substncia Nmero CAS Nmero EINECS
vermelho do Congo 573-58-0 209-358-4
O 2-aminoantraceno no deve ser utilizado como nico indicador da eficcia da mistura S9. Se essa substncia
for utilizada, cada lote S9 deve ser igualmente caracterizado com um agente mutagnico que exija activao
metablica por enzimas microssmicos, como por exemplo o benzo[a]pireno ou o dimetilbenzo[a]an-traceno.
As seguintes substncias so exemplos de controlos positivos especficos apropriados para cada estirpe,
adequados para os ensaios sem utilizao de um sistema exgeno de activao metablica:
Substncia Nmero CAS Nmero EINECS Estirpe
nitrito de
sdio
26628-22-8 247-852-1 TA 1535 e TA 100
2-nitrofluo-
reno
607-57-8 210-138-5 TA 98
9-aminoacri-
dina
90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 e TA 97A
ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 e TA 97A
hidroper-
xido de iso-
propilben-
zeno
80-15-9 201-254-7 TA 102
mitomicina C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA e TA 102
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/251
Substncia Nmero CAS Nmero EINECS Estirpe
N-etil-N-
-nitro-N-nitro-
soguanidina
70-25-7 200-730-1 WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101)
4-nitroquino-
lina-l-xido
56-57-5 200-281-1 WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101)
furilfuramida
(AF2)
3688-53-7 estirpes com plasmdeos
Podem utilizar-se no controlo positivo outras substncias adequadas. A possibilidade de utilizao de produtos
qumicos de uma classe afim para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam.
Devem tambm realizar-se controlos negativos, consistindo apenas em solvente ou veculo e sem a substncia
em estudo, que sero sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos. Alm disso,
devem igualmente ser utilizados controlos no expostos substncia em estudo, a menos que existam dados
histricos de controlo que demonstrem que o solvente escolhido no induz qualquer efeito deletrio ou
mutagnico.
1.5.3. Procedimento
Para o mtodo de incorporao em placas (1) (2) (3) (4) sem activao metablica, utilizam-se geralmente
0,05 ml ou 0,1 ml da soluo de ensaio, 0,1 ml de cultura bacteriana fresca (aproximadamente 10
8
clulas
viveis) e 0,5 ml de tampo estril, que so misturados com 2,0 ml de gelose de cobertura. Para o ensaio com
activao metablica, utilizam-se geralmente 0,5 ml de mistura de activao metablica, que contm uma
quantidade adequada de fraco ps-mitocondrial (entre 5 % a 30 % v/v na mistura de activao metablica),
misturada com a gelose de cobertura (2,0 ml), as bactrias e a substncia em estudo/soluo de ensaio. O
contedo de cada tubo misturado e deitado sobre uma placa de meio mnimo de gelose. A gelose de
cobertura deve solidificar antes da incubao.
No mtodo com incubao prvia (2) (3) (5) (6), a substncia em estudo/soluo de ensaio previamente
incubada com a estirpe de ensaio (aproximadamente 10
8
clulas viveis) e o tampo estril ou o sistema de
activao metablica (0,5 ml), geralmente durante 20 minutos ou mais a 30-37
o
C, antes de ser misturada com
a gelose de cobertura e deitada sobre uma placa com meio mnimo de gelose. Normalmente, so utilizados
0,05 ou 0,1 ml da substncia em estudo/soluo de ensaio, 0,1 ml de cultura bacteriana e 0,5 ml da mistura S9
ou de tampo estril, misturados com 2,0 ml de gelose de cobertura. Os tubos devem ser arejados durante a
pr-incubao, utilizando o agitador.
Para uma avaliao adequada da variao, devem ser utilizadas placas em triplicado para cada dose. A utilizao
de placas em duplicado aceitvel, desde que seja justificada cientificamente. A perda ocasional de uma placa
no invalida necessariamente o ensaio.
As substncias gasosas ou volteis devem ser ensaiadas por mtodos apropriados, por exemplo em recipientes
selados (12) (14) (15) (16).
1.5.4. Incubao
Todas as placas de cada ensaio devem ser incubadas a 37
o
C durante 48-72 horas. Aps a incubao, contam-se
as colnias com mutao reversa em cada placa.
2. DADOS
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS
Os dados devem ser apresentados sob a forma do nmero de colnias com mutao reversa por placa. O
nmero de colnias com mutao reversa nas placas de controlo negativas (controlo do solvente e, se tiver sido
utilizado, controlo no exposto) e positivas deve tambm ser apresentado. As contagens individuais das placas,
o nmero mdio de colnias com mutao reversa por placa e o respectivo desvio-padro devem ser
apresentados para a substncia em estudo e para os controlos positivos e negativos (no expostos substncia
em estudo e/ou solvente).
No h nenhuma exigncia concreta para a verificao de uma resposta positiva clara. Os resultados ambguos
devem ser melhor esclarecidos, de preferncia com modificao das condies experimentais. Os resultados
negativos tm de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmao dos resultados negativos no
seja considerada necessria, deve ser apresentada uma justificao. Para a realizao de experincias adicionais,
L 142/252 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
deve ser analisada a possibilidade de modificao dos parmetros do estudo, por forma a aumentar a gama de
condies avaliadas. Os parmetros que podem eventualmente ser alterados incluem a gama de concentraes,
o mtodo de tratamento (incorporao em placas ou pr-incubao em meio lquido) e as condies de
activao metablica.
2.2. AVALIAO E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
H diversos critrios para determinar um resultado positivo, tais como um aumento do nmero de colnias
por placa com mutao reversa em pelo menos uma estirpe, com ou sem sistema de activao metablico, que
esteja relacionado com a concentrao na gama ensaiada e/ou que seja reprodutvel numa ou mais das
concentraes ensaiadas (23). Deve ser tomada em considerao, antes de mais, a importncia biolgica dos
resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados dos ensaios, podero ser utilizados mtodos
estatsticos (24). Contudo, a significncia estatstica no deve ser o nico elemento de determinao para uma
resposta positiva.
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios acima indicados no presente ensaio considerada
no mutagnica.
Embora a maioria de experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o
conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da substncia em
estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos independentemente do
nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio de mutao reversa bacteriana indica que a substncia induz mutaes
pontuais por substituio das bases ou por deslocao do quadro de leitura no genoma de Salmondas
typhimurium e/ou Escherichia coli. Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a substncia no
mutagnica para as espcies ensaiadas.
3. APRESENTAO DE RELATRIOS
RELATRIO DE ENSAIO
O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do solvente/veculo,
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.
Estirpes:
estirpes usadas,
nmero de clulas por cultura,
caractersticas da estirpe.
Condies de ensaio:
quantidade da substncia em estudo por placa (mg/placa ou l/placa), com justificao da escolha da
dose e do nmero de placas preparadas por concentrao,
meios utilizados,
tipo e composio do sistema de activao metablica, incluindo critrios de aceitabilidade,
protocolo do tratamento.
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Resultados:
sinais de toxicidade,
sinais de precipitao,
contagens individuais das placas,
nmero mdio de colnias com mutao reversa por placa e respectivo desvio-padro,
relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar,
anlise estatstica, quando tenha sido realizada,
dados relativos aos controlos negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo com o ensaio,
com as respectivas gamas, valores mdios e desvios-padro,
dados histricos relativos aos controlos negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo
com o ensaio, com as respectivas gamas, valores mdios e desvios-padro.
Discusso dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with
the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364.
(2) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation
Res., 113, p. 173-215.
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt,
S. and Zeiger, E., (1994) Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation
Res., 312, p. 217-233.
(4) Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J.,
Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V., (1986) The Salmonella typhimurium/Mammalian
Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation
Res., 168, p. 69-240.
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y., (1975)
Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, p. 91-96.
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M., (1980) Factors
Modulating Mutagenicity Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed.
Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. p. 273-285.
(7) Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R., (1980) Bacterial Mutation
Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press,
p. 13-61.
(8) Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L., (1987) Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J.
Food Safety, 8, p. 167-177.
(9) Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A., (1976) Use of a simplified fluctuation test to detect low
levels of mutagens. Mutation Res., 38, p. 33-42.
L 142/254 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
(10) Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984) The Fluctuation Test in Bacteria. In:
Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. and
Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, p. 141-161.
(11) Thompson, E.D. and Melampy, P.J., (1981) An Examination of the Quantitative Suspension Assay for
Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, p. 453-465.
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994) Improved Method for Mutagenicity Testing of
Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, p. 335-344.
(13) Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughn, V.L., (1984) Mutagenicity of Benzidine and
Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res.,
136, p. 33-47.
(14) Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K., (1992) Salmonella Mutagenicity
Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, p. 2-141.
(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G., (1977) Mutagenic Activity of Chemicals Identified in
Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier,
Amsterdam, p. 249-258.
(16) Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D., (1987) Vaporisation Technique to Measure
Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental
Mutagenesis, 9, p. 421-441.
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T., (1979) Mutagenicity of the
Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella
typhimurium. Cancer Res., 39, p. 3780-3782.
(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N., (1980) Fecalase: A Model for Activation of Dietary
Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 4961-4965.
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G., (1990) Comparison of Salmonella typhimurium TA
102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, p. 285-291.
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated
Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: In vitro metabolic Activation in Mutagenesis
Testing Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, p. 85-88.
(21) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C.,
(1992) Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-
-177.
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N., (1981) Compatibility of Organic Solvents with the
Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88, p. 343-350.
(23) Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E., (1987) Guide for the
Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity. Mutation Res. 189,
p. 83-91.
(24) Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J., (1989)
Analysis of Data from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for
Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J.,
Cambridge University Press, p. 28-65.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/255
B.15. TESTES DE MUTAGNESE E DESPISTE DE CARCINOGNESE MUTAO GNICA
SACCHAROMYCES CEREV1SIAE
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.2. DEFINIO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Podem utilizar-se vrias estirpes haplides e diplides do fungo Saccharomyces Cerevisiae para medir a produo
de mutaes gnicas induzidas por agentes qumicos em presena e na ausncia de activao metablica.
A medio de mutaes forward (forward mutations) pode ser realizada nomeadamente pela medio da
passagem dos mutantes vermelhos que exigem adenina (ade-1, ade-2) para uma forma branca duplamente
exigente em adenina, assim como por sistemas selectivos como a induo de resistncia canavanina e
cicloheximida.
O mtodo de mutao reversvel mais frequentemente utilizado implica a utilizao da estirpe haplide XV
185-14C que inclui as mutaes nonsense ocre ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 e trp 5-48, que so reversveis por
mutagnios que provoquem substituies de bases induzindo mutaes num locus especfico ou mutaes
supressivas ocre. A estirpe XV 185-14C inclui igualmente o marcador his 1-7, uma mutao nonsense,
principalmente reversvel pelas mutaes de segundo locus e ainda o marcador hom 3-10 que reversvel por
mutagnios conduzindo ultrapassagem do quadro de leitura do cdigo gentico (Frameshift Mutation).
Das estirpes diplides de S. Cerevisiae, a nica cujo uso est generalizado a estirpe D
7
que homozigtica para
ilv 1-92.
1.5. CRITRIOS QUALITATIVOS
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
Preparativos
As solues das substncias a testar bem como as das substncias de controlo sero preparadas imediatamente
antes do ensaio, com a ajuda de um veculo apropriado. Quando se tratar de substncias orgnicas no solveis
na gua, devero ser utilizados os solventes orgnicos como o etanol, a acetona ou o dimetilsulfxido (DMSO)
numa concentrao no ultrapassando 2 % v/v. A concentrao final do veculo no deve afectar de forma
significativa a viabilidade das clulas nem as caractersticas de crescimento.
Ac t i v a o me t a bl i c a
As clulas devero ser expostas s substncias a testar na presena e na ausncia de um sistema exgeno de
activao metablica apropriado.
O mtodo mais frequentemente utilizado consiste na adio da fraco ps-mitocondrial preparada a partir de
fgados de roedores tratados previamente por indutores enzimticos e adicionada de co-factores. Podem
utilizar-se tambm outras espcies, tecidos, fraces ps-mitocondriais ou mtodos para a activao
metablica.
L 142/256 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Condies do ensaio
E s t i r pe s d e e x pe r i nc i a
A estirpe haplide XV 185-14C e a estirpe diplide D
7
so as mais frequentemente utilizadas em estudos de
mutao gnica. Podem tambm ser apropriadas outras estirpes.
Me i os
Utilizam-se meios de cultura apropriados para determinar a sobrevida celular e o nmero de mutantes.
Us o d e c ont r ol os ne g a t i vos e pos i t i v os
Devero ser realizados simultaneamente controlos positivos, controlos no tratados e controlos com solvente.
Sero utilizadas substncias qumicas apropriadas como controlos positivos para cada fenmeno mutacional
especfico.
Conc e nt r a e s d e e x pos i o
Devero ser utilizados pelo menos cinco concentraes convenientemente espaadas da substncia a testar. No
caso de substncias txicas a concentrao mxima testada no dever diminuir a taxa de sobrevida abaixo de
5 % a 10 %. As substncias relativamente insolveis na gua sero testadas at ao seu limite de solubilidade
com mtodos apropriados. No caso das substncias no txicas francamente solveis na gua a concentrao
mxima ser determinada caso a caso.
Cond i e s d e i nc uba o
Devem incubar-se as placas no escuro temperatura de 28-30
o
C durante quatro a sete dias.
F r e q u nc i a s d e mut a e s e s pont ne a s
Sero utilizadas as subculturas cujas frequncias de mutao espontnea estejam situadas dentro dos limites
normais admitidos.
Nme r o d e pl a c a s
Devero utilizar-se pelo menos trs placas por concentrao para determinar os prototrficos produzidos por
mutao gnica e observar a viabilidade das clulas. No caso de experincias usando marcadores com uma
pequena taxa de mutao como o hom 3-10, pode aumentar-se o nmero de placas utilizado para fornecer
dados estatisticamente significativos.
Procedimento
As estirpes de S. Cerevisiae so tratadas habitualmente no curso dum ensaio em meio lquido, implicando a
utilizao de clulas em fase estacionria ou de crescimento. As experincias iniciais deveriam ser efectuadas
com clulas em crescimento. Expem-se substncia a testar 1-5 10 clulas/ml durante um perodo at 18
horas, temperatura de 28-37
o
C, agitando-se a mistura; deve adicionar-se uma quantidade adequada dum
sistema de activao metablica durante o tratamento. No fim do tratamento as clulas sero centrifugadas,
lavadas, e semeadas num meio de cultura apropriado. Depois da incubao as placas sero examinadas para se
determinar a taxa de sobrevida e a induo de mutaes gnicas. Se a primeira experincia der resultados
negativos deve realizar-se segunda, utilizando-se clulas em fase estacionria. Se a primeira experincia der
resultados positivos, estes sero confirmados por uma experincia independente apropriada.
2. RESULTADOS
Os resultados devem ser apresentados em quadros, indicando o nmero de colnias contadas, o nmero de
mutantes, a taxa de sobrevida e a frequncia de mutantes. Todos os resultados devero ser confirmados por
uma experincia independente. Os resultados devero ser avaliados com mtodos estatsticos adequados.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/257
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO TESTE
O relatrio do teste dever incluir as seguintes informaes:
estirpe utilizada,
condies do teste: clulas em fase estacionria ou de crescimento, composio dos meios, temperatura e
durao da incubao, sistema de activao metablica,
condies do tratamento: nveis de exposio, procedimento e durao do tratamento, temperatura do
tratamento, controlos positivos e negativos,
nmero de colnias contadas, nmero de mutantes, taxa de sobrevida e frequncia de mutantes, relao
dose/resposta se possvel, avaliao estatstica dos resultados.
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B.
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B.
L 142/258 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B.16. RECOMBINAO MITTICA SACCHAROMYCES CEREVISIAE
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.2. DEFINIO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
A recombinao mittica no Saccharomyces Cerevisiae pode ser detectada ao nvel intergnico (ou mais
generalizadamente entre um gene e o seu centrmero) e ao nvel intragnico. O primeiro caso denomina-se
crossing-over mittico e d origem a trocas recprocas, enquanto no segundo caso as trocas so no recprocas a
maior parte das vezes, sendo este denominado converso gnica. O crossing-over geralmente detectado pela
produo de colnias ou de sectores recessivos homozigticos a partir de uma estirpe heterozigtica, enquanto
a converso gnica detectada pela produo de prototrficos revertidos de uma estirpe auxotrfica
heteroallica contendo dois alelos defeituosos diferentes do mesmo gene. As estirpes mais correntemente
utilizadas para detectar uma converso gnica mittica so as D
4
(heteroallica para ade 2 e trp 5), D
7
(heteroallica para trp 5), BZ
34
(heteroallica para arg 4) e JD1 (heteroallica para his 4 e trp 5). O crossing-over
mittico produzindo sectores homozigticos de cor vermelha e rosa pode ser determinado com D
5
ou D
7
(que
mede tambm a converso gnica mittica e a mutao reversvel para ilv 1-92), sendo estas duas estirpes
heteroallicas complementares para os alelos ade 2.
1.5. CRITRIOS QUALITATIVOS
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DO ENSAIO
Preparativos
As solues das substncias a testar assim como das substncias de controlo ou de referncia devero ser
preparadas imediatamente antes do ensaio, com a ajuda do veculo apropriado. No caso de substncias
orgnicas insolveis na gua devero utilizar-se solventes orgnicos como o etanol, a acetona e o
dimetilsulfxido (DMSO), em concentraes no ultrapassando 2 % v/v. A concentrao final do veculo no
dever afectar de maneira significativa a viabilidade das clulas nem as caractersticas de crescimento.
Ac t i v a o me t a bl i c a
As clulas sero expostas s substncias a testar na presena e na ausncia de um sistema exgeno de activao
metablica. O mtodo mais frequentemente utilizado consiste na adio da fraco ps-mitocondrial preparada
a partir de fgados de roedores tratados previamente com indutores enzimticos e adicionada de co-factores.
Podem tambm utilizar-se outras espcies, tecidos, fraces ps-mitocondriais ou mtodos para activao
metablica.
Condies do ensaio
E s t i r pe s d e e x pe r i nc i a
As estirpes mais frequentemente utilizadas so as diplides D
4
, D
5
, D
7
e JDl. Podem tambm ser apropriadas
outras estirpes.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/259
Me i os
Utilizam-se os meios de cultura apropriados para determinar a taxa de sobrevida e a frequncia de
recombinaes mitticas.
Us o d e c ont r ol os ne g a t i vos e pos i t i v os
Devero ser realizados simultaneamente controlos positivos, controlos no tratados e controlos com solvente.
Sero utilizadas substncias qumicas apropriadas como controlos positivos para cada tipo especfico de
recombinao.
Conc e nt r a e s d e e x pos i o
Devero ser utilizadas pelo menos cinco concentraes convenientemente espaadas da substncia a testar. A
citotoxicidade e a solubilidade so alguns dos factores a ter em considerao. A concentrao mais fraca no
deve ter qualquer efeito na viabilidade das clulas. No caso de produtos qumicos txicos, a concentrao
mxima testada no deve diminuir a taxa de sobrevida abaixo de 5 % a 10 %. Os produtos qumicos
relativamente insolveis na gua sero testados at ao seu limite de solubilidade por mtodos apropriados. No
caso de produtos qumicos no txicos, francamente solveis na gua, a concentrao mxima testada ser
determinada caso a caso.
As clulas podem ser expostas s substncias a testar em fase estacionria ou em fase de crescimento durante
perodos de durao at 18 horas. No entanto, no caso de um tratamento de longa durao, as culturas sero
examinadas ao microscpio para se detectar a formao de esporos, cuja presena tornar o teste nulo.
Cond i e s d e i nc uba o
As placas sero incubadas no escuro a uma temperatura de 28-30
o
C, durante quatro a sete dias. As placas
utilizadas para a determinao dos sectores homozigticos vermelho e rosa produzidos por crossing-over
mittico sero conservadas num refrigerador a 4
o
C durante mais um a dois dias antes da contagem, de modo
a que a pigmentao das colnias interessadas possa intensificar-se.
F r e q u nc i a d e r e c ombi na e s mi t t i c a s e s pont ne a s
Devero utilizar-se subculturas cujas frequncias de recombinao mittica se situem dentro da gama admitida
normalmente.
Nme r o d e pl a c a s
Devero ser semeadas pelo menos trs placas por concentrao a fim de determinar a viabilidade bem como o
nmero de prototrficos produzidos por converso gnica mittica. No caso de determinao da homozigotia
recessiva produzida por crossing-over mittico, o nmero de placas ser aumentado para se obter um nmero de
colnias adequado.
Procedimento
As estirpes de S. Cerevisiae so tratadas habitualmente no curso de um ensaio em meio lquido, implicando a
utilizao de clulas em fase estacionria ou de crescimento. As experincias iniciais deveriam ser efectuadas
com clulas em crescimento. So expostas 1-5 10
7
clulas/ml substncia a testar durante um perodo at
18 horas, temperatura de 28-37
o
C, agitando-se a mistura; deve adicionar-se uma quantidade adequada de um
sistema de activao metablica durante o tratamento.
No fim do tratamento as clulas sero centrifugadas, lavadas e semeadas no meio de cultura adequado. Depois
da incubao, as placas sero examinadas a fim de determinar a taxa de sobrevida e a induo de recombinao
mittica.
Se a primeira experincia der resultados negativos deve realizar-se segunda, utilizando-se clulas em fase
estacionria. Se a primeira experincia der resultados positivos, estes sero confirmados por uma experincia
independente apropriada.
2. RESULTADOS
Os resultados devem ser apresentados em quadros, indicando o nmero de colnias contadas, o nmero de
recombinantes, a taxa de sobrevida e a frequncia de recombinantes.
Todos os resultados devero ser confirmados por uma experincia independente.
L 142/260 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Os resultados devero ser avaliados com mtodos estatsticos adequados.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO TESTE
O relatrio do teste dever incluir as informaes seguintes:
estirpe utilizada,
condies do teste: clulas em fase estacionria ou em fase de crescimento, composio dos meios,
temperatura e durao da incubao, sistema de activao metablica,
condies de tratamento: concentrao de exposio, procedimento e durao do tratamento,
temperatura do tratamento, controlos positivos e negativos,
nmero de colnias contadas, nmero de recombinantes, taxa de sobrevida e frequncia de
recombinao, relao dose/resposta se possvel; avaliao estatstica dos resultados,
discusso dos resultados,
interpretao dos resultados.
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B.
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/261
B.17. MUTAGENICIDADE ENSAIO DE MUTAO GNICA EM CLULAS DE MAMFEROS IN VITRO
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 476 Ensaio de mutao gnica de mamferos in vitro
(1997).
1.1. INTRODUO
O ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos in vitro pode ser utilizado para detectar mutaes gnicas
induzidas por substncias qumicas. As linhas celulares que podem ser utilizadas incluem as clulas L5178Y do
linfoma do rato, as linhas celulares CHO, CHO-AS52 e V79 do hamster chins e as clulas linfoblastides
humanas TK6 (1). Nessas linhas celulares, os pontos finais genticos mais utilizados so as mutaes da
timidina quinase (TK), da hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HPRT) e do transgene de xan-tina-
-guanina fosforibosil transferase (XPRT). Os ensaios de mutao TK, HPRT e XPRT detectam diferentes gamas de
ocorrncias genticas. A localizao autossmica das mutaes TK e XPRT pode permitir a deteco de
ocorrncias genticas (por exemplo, supresso de grandes sequncias) que no so detectadas no locus HPRT
nos cromossomas X (2) (3) (4) (6).
No ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos in vitro podem ser utilizadas culturas de qualquer linha
celular ou estirpe de caractersticas bem conhecidas. As clulas utilizadas so seleccionadas com base na sua
capacidade de desenvolvimento em cultura e na estabilidade da frequncia das mutaes espontneas.
Os ensaios realizados in vitro exigem geralmente a utilizao de uma fonte exgena de activao metablica. Os
sistemas de activao metablicos in vitro no reproduzem inteiramente as condies in vivo nos mamferos.
Devem portanto ser evitadas condies que conduzam a resultados que no reflectem uma mutagenicidade
intrnseca. Os eventuais resultados positivos no resultantes de mutagenicidade intrnseca podem ser causados
por alteraes do pH, da presso osmtica ou por nveis elevados de citotoxicidade (7).
O presente ensaio utilizado para o controlo de eventuais agentes mutagneos e carcinogneos em mamferos.
Embora muitos dos compostos que do resultados positivos no presente ensaio sejam carcinogneos para os
mamferos, essa correlao no absoluta. Com efeito, a correlao depende da classe qumica e, por outro
lado, h cada vez mais dados que provam que alguns agentes carcinogneos no so detectados no ensaio
porque parecem actuar atravs de mecanismos no genotxicos ou atravs de mecanismos ausentes nas clulas
bacterianas (6).
Ver tambm a parte B da Introduo Geral.
1.2. DEFINIES
Mutao para diante: mutao gentica do tipo parental para a forma mutante que causa uma alterao ou
perda de actividade enzimtica da funo da protena codificada.
Mutagneos por substituio de um par de bases: substncias que causam a substituio de um ou vrios
pares de bases do ADN.
Mutagneos por deslocao do quadro de leitura: substncias que causam a adio ou supresso de um par
de bases ou de uma sequncia de pares de bases do ADN.
Perodo de expresso fenotpica: perodo que decorre at que os produtos dos genes inalterados se esgotem
nas clulas recentemente sujeitas a uma mutao.
Frequncia de mutao: relao entre o nmero de clulas mutantes observadas e o nmero de clulas viveis.
Crescimento total relativo: aumento no nmero de clulas por unidade de tempo, por comparao com uma
populao de controlo: calculado como o produto da relao entre o crescimento em suspenso e no controlo
negativo com a relao entre a eficincia de clonagem em suspenso e no controlo negativo.
Crescimento relativo em suspenso: relao entre o aumento no nmero de clulas durante o perodo de
expresso em suspenso e no controlo negativo.
Viabilidade: eficincia de clonagem das clulas expostas incubadas em placas, aps o perodo de expresso, sob
condies selectivas.
L 142/262 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Sobrevivncia: eficincia de clonagem das clulas expostas incubadas em placas no fim do perodo de
exposio; a sobrevivncia geralmente expressa em relao sobrevivncia da populao celular de controlo.
1.3. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
As clulas deficientes em timidina quinase (TK) devido mutao TK TK so resistentes aos efeitos
citotxicos do anlogo de pirimidina da trifluorotimidina (TFT). As clulas que dispem de timidina quinase
so sensveis ao TFT, que causa inibio do metabolismo celular e impede a diviso da clula. Logo, as clulas
mutantes podem proliferar na presena de TFT, o que no acontece com as clulas normais, com timidina
quinase. Da mesma forma, as clulas carentes em HPRT ou XPRT so seleccionadas pela resistncia
6-tioguanina (TG) ou 8-azaguanina (AG). As propriedades da substncia em estudo devem ser
cuidadosamente tomadas em considerao se o ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos for
utilizado para ensaiar uma substncia anloga das bases ou um composto relacionado com o agente selectivo.
Assim, por exemplo, deve ser investigada qualquer suspeita de toxicidade selectiva da substncia em estudo para
as clulas mutantes e no mutantes. Logo, o desempenho do sistema/agente selectivo deve ser confirmado
quando se ensaiarem produtos qumicos estruturalmente relacionados com o agente selectivo (8).
As clulas em suspenso ou em cultura em monocamada so expostas substncia em estudo tanto na
presena como na ausncia de um sistema de activao metablica durante um perodo de tempo apropriado,
sendo depois cultivadas para determinar a citotoxidade e para permitir a expresso fenotpica antes de
seleccionar o mutante (9) (10) (11) (12) (13). A citotoxidade geralmente determinada atravs da medio da
eficincia relativa de clonagem (sobrevivncia) ou do crescimento total relativo das culturas aps o perodo de
exposio. As culturas expostas so mantidas em meio de crescimento durante um perodo de tempo suficiente,
que varia em funo do locus seleccionado e do tipo de clula, por forma a permitir uma expresso fenotpica
to boa quanto possvel das mutaes induzidas. A frequncia de mutao determinada inoculando um
nmero conhecido de clulas num meio com agente selectivo para as clulas mutantes e num meio sem agente
selectivo, para determinao das respectivas eficincias de clonagem (viabilidade). Aps um perodo de
incubao apropriado, as colnias so contadas. A frequncia de mutao calculada a partir do nmero de
colnias mutantes no meio selectivo e do nmero de colnias no meio no selectivo.
1.4. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.4.1. Preparao
1.4.1.1. Clulas
O presente ensaio pode ser realizado com diversos tipos de clulas, nomeadamente subclones das clulas
L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 ou TK6. Os tipos de clula utilizados no presente ensaio devem ter uma
sensibilidade demonstrada a mutagneos qumicos, uma eficincia de clonagem elevada e uma frequncia de
mutao espontnea estvel. As clulas devem ser verificadas para detectar eventuais contaminaes por
microplasma, no devendo ser utilizadas se estiverem contaminadas.
O ensaio deve ser concebido para ter uma determinada sensibilidade e definio. O nmero de clulas e de
culturas e as concentraes da substncia em estudo a utilizar sero reflexo dos parmetros definidos (14). O
nmero mnimo de clulas viveis que devem sobreviver exposio e ser utilizadas em cada fase do ensaio
deve basear-se na frequncia da mutao espontnea. A ttulo indicativo, deve ser utilizado um nmero de
clulas pelo menos dez vezes superior ao inverso da frequncia de mutao espontnea, com um mnimo
recomendado de 10
6
clulas. Para verificao da consistncia do desempenho do ensaio, devem estar
disponveis dados histricos adequados sobre o sistema celular utilizado.
1.4.1.2. Meios e condies de cultura
Devem ser utilizados meios de cultura e condies de incubao (recipientes, temperatura, CO
2
, concentrao e
humidade) apropriados. Os meios devem ser escolhidos de acordo com o sistema selectivo e com o tipo de
clulas utilizados no ensaio. particularmente importante que sejam escolhidas condies de cultura que
garantam o crescimento ptimo das clulas durante o perodo de expresso e a capacidade de formao de
colnia por parte das clulas mutantes e no mutantes.
1.4.1.3. Preparao das culturas
As clulas so propagadas a partir de culturas de arranque, inoculadas no meio de cultura e incubadas a 37
o
C.
Antes da realizao no presente ensaio, as culturas podero ter de ser limpas de clulas mutantes eventualmente
presentes.
1.4.1.4. Activao metablica
As bactrias devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de um sistema
adequado de activao metablica. O sistema mais geralmente utilizado uma fraco ps-mitocondrial
reforada com co-factor (S9) preparada a partir de fgados de roedores tratados com agentes de induo
enzimtica, como por exemplo Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) ou uma mistura de fenobarbitona e
-naftoflavona (19) (20).
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/263
A fraco ps-mitocondrial geralmente utilizada em concentraes na gama de 1-10 % v/v no meio de ensaio
final. A escolha e estado do sistema de activao metablico podem depender da classe de produto qumico em
estudo. Em alguns casos, poder ser apropriado utilizar mais de uma concentrao de fraco ps-
-mitocondrial.
Alguns desenvolvimentos, nomeadamente a produo por engenharia gentica de linhas celulares que
expressem enzimas de activao especficas, podem ter algum potencial em termos de activao endgena. A
escolha das linhas celulares utilizadas deve ser cientificamente justificada (por exemplo, pela importncia da
isoenzima do citocromo P450 para o metabolismo da substncia em estudo).
1.4.1.5. Substncia em estudo/preparao
As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e, se necessrio,
diludas antes da exposio das clulas. As substncias lquidas podem ser adicionadas directamente aos
sistemas em estudo e/ou diludas antes de serem adicionadas s clulas. Devem ser utilizadas preparaes
frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo
armazenamento no coloca problemas para o ensaio.
1.4.2. Condies de ensaio
1.4.2.1. Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, devendo ser compatvel com a sobrevivncia
das clulas e com a actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se
encontrem totalmente elucidadas devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que
possvel, recomenda-se a utilizao de solventes/veculos aquosos. Quando forem realizados ensaios de
substncias instveis na presena de gua, os solventes orgnicos utilizados devem ser anidros. A gua poder
ser removida atravs de um filtro molecular.
1.4.2.2. Concentraes de exposio
A citotoxidade, a solubilidade no sistema de ensaio e as alteraes do pH ou da presso osmtica constituem
alguns dos critrios a ter em conta na determinao de concentrao mxima.
A citotoxidade deve ser determinada tanto na presena como na ausncia de um sistema de activao
metablica na experincia principal, utilizando um indicador apropriado da integridade e crescimento das
clulas, tal como a eficincia relativa de clonagem (sobrevivncia) ou o crescimento relativo total. Poder ser til
determinar a toxicidade e insolubilidade atravs de uma experincia preliminar.
Devem ser utilizadas pelo menos quatro concentraes analisveis. Quando existir citotoxicidade, essas
concentraes devem abranger uma gama de toxicidade que varie da toxicidade mxima a quase nula; o que
significa geralmente que as concentraes devem variar num factor de 2 a 10. Se a concentrao mxima for
definida por razes de citotoxicidade, a sobrevivncia relativa (eficincia relativa de clonagem) ou o crescimento
relativo total devem ser da ordem dos 10 %-20 % (mas no inferiores a 10 %). Para as substncias com
citotoxidade relativamente baixa, a concentrao mxima do ensaio deve ser a mais baixa de 5 mg/ml, 5 l/ml
ou 0,01 M.
Para substncias relativamente insolveis a dose mxima a utilizar deve ser igual ou superior ao limite de
solubilidade nas condies de cultura. A insolubilidade no meio final a que as clulas so expostas deve ser
demonstrada. Poder ser til avaliar a solubilidade no incio e no fim do tratamento, uma vez que a mesma se
pode alterar durante a exposio no sistema de ensaio devido presena de clulas, de S9, de soro, etc. A
insolubilidade pode ser detectada vista desarmada. O precipitado no deve interferir com as contagens
necessrias.
1.4.2.3. Controlos negativos e positivos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo), tanto na presena
como na ausncia de um sistema de activao metablica. Quando for utilizada activao metablica, o
produto qumico de controlo positivo deve ser o mesmo que exige activao para dar uma resposta
mutagnica.
L 142/264 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
As substncias de controlo positivo podem ser, por exemplo:
Condio de activao metablica Locus Substncia Nmero CAS
Nmero
EINECS
Ausncia de activao meta-
blica exgena
HPRT Metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7
Etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2
TK (col-
nias peque-
nas e
grandes)
Metanossulfonato de metilo 66-27-3 200-625-0
XPRT Metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7
Etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2
Presena de activao meta-
blica exgena
HPRT 3-3-Metilcolantreno 56-49-5 200-276-4
N-Nitrosodimetilamina 62-75-9 200-549-8
7,12-Dimetilbenzantraceno 57-97-6 200-359-5
TK (col-
nias peque-
nas e
grandes)
Ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4
Ciclofosfamida monohi-
drato
6055-19-2
Benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5
3-3-Metilcolantreno 56-49-5 200-276-5
XPRT N-n- Nitrosodimetilamina
(nveis elevados de S 9)
62-75-9 200-549-8
Benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5
Podem ser utilizadas outras substncias de referncia apropriadas para o controlo positivo. Assim, se um
laboratrio dispuser, por exemplo, de uma base de dados histricos sobre a utilizao de 5-bromo
2'-deoxiuridina (nmero CAS 59-14-3, nmero EINECS 200-415-9), essa substncia de referncia poder
tambm ser utilizada. Quando existam, deve ser analisada a possibilidade de utilizar produtos qumicos de
controlo positivos de classes qumicas relacionadas.
Devem tambm realizar-se controlos negativos, consistindo apenas em solvente ou veculo e sem a substncia
em estudo, que sero sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos. Alm disso,
devem igualmente ser utilizados controlos no expostos substncia em estudo, a menos que existam dados
histricos de controlo que demonstrem que o solvente escolhido no induz qualquer efeito deletrio ou
mutagnico.
1.4.3. Procedimento
1.4.3.1. Exposio substncia em estudo
As clulas em proliferao devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de
um sistema de activao metablica durante um perodo de tempo apropriado (trs a seis horas geralmente
eficaz). O perodo de exposio pode ser alargado a um ou mais ciclos celulares.
Para cada concentrao a ensaiar, podem ser utilizadas culturas expostas nicas ou em duplicado. Quando
forem utilizadas culturas nicas, o nmero de concentraes deve ser aumentado, por forma a garantir um
nmero de culturas adequado para a anlise (por exemplo, pelo menos oito concentraes analisveis). Devem
tambm ser includas culturas de controlo negativas (solventes) duplicadas.
As substncias gasosas ou volteis devem ser ensaiadas por mtodos apropriados, por exemplo em recipientes
selados (21) (22).
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/265
1.4.3.2. Medio da sobrevivncia, viabilidade e frequncia de mutao
No fim do perodo de exposio, as clulas so lavadas e cultivadas para determinar a sobrevivncia e para
permitir a expresso fenotpica das mutaes. A medio de citotoxicidade atravs da determinao da
eficincia relativa de clonagem (sobrevivncia) ou do crescimento total relativo das culturas geralmente
iniciada aps o perodo de exposio.
Para cada locus h um tempo mnimo definido para permitir uma expresso fenotpica quase ptima das
mutaes recentemente induzidas (o HPRT e o XPRT exigem pelo menos de seis a oito dias e o TK pelo menos
dois dias). As clulas so cultivadas em meios com presena e ausncia do agente selectivo para determinao,
respectivamente, do nmero de mutaes e da eficincia de clonagem. A medio da viabilidade (utilizada para
calcular a frequncia de mutao) iniciada no fim do perodo de expresso atravs de cultura em placas com
meio no selectivo.
Se a substncia em estudo der um resultado positivo no ensaio L5178Y TK
+/-
, deve ser realizada uma medio
do tamanho das colnias em pelo menos uma das culturas de ensaio (a concentrao mxima com resultado
positivo) e nos controlos negativos e positivos. Se a substncia em estudo der um resultado negativo no ensaio
L5178Y
+/-
, deve ser realizada uma medio do tamanho das colnias nos controlos negativos e positivos. Nos
estudos que utilizem TK6TK
+/-
a medio do tamanho das colnias poder tambm ser realizada.
2. DADOS
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS
Os dados devem incluir a determinao de citotoxicidade e da viabilidade, para alm da contagem das colnias
e das frequncias de mutao nas culturas expostas e nas culturas de controlo. No caso de um resultado
positivo no ensaio L5178Y TK
+/-
, as colnias devem ser contabilizadas utilizando o critrio das colnias
pequenas e grandes em pelo menos uma das concentraes da substncia em estudo (a concentrao mxima
com resultado positivo) e nos controlos negativos e positivos. A natureza molecular e citognica das clulas
mutantes que formam colnias grandes e pequenas j foi investigada em pormenor (23) (24). No ensaio TK
+/-
as
colnias devem ser contabilizadas utilizando os critrios do crescimento normal (colnias grandes) e do
crescimento lento (colnias pequenas) (25). As clulas mutantes que tenham sofrido danos genticos mais
extensos apresentam tempos de duplicao maiores, pelo que formam colnias mais pequenas. Esses danos
variam tipicamente da perda da totalidade dos genes a aberraes cromossmicas s visveis por anlise do
caritipo. A induo de mutaes que resultam no aparecimento de colnias pequenas foi associada com
produtos qumicos que induzem aberraes cromossmicas graves (26). As clulas menos seriamente afectadas
por mutaes apresentam taxas de crescimento semelhantes s clulas parentais e formam colnias grandes.
Deve ser apresentada a sobrevivncia (eficincias relativas de clonagem) ou o crescimento total relativo. A
frequncia de mutao deve ser expressa como a relao entre o nmero de clulas mutantes e o nmero de
clulas sobreviventes.
Devem ser fornecidos dados individuais das culturas. Para alm disso, todos os dados devem ser apresentados
sob a forma de um quadro.
No h nenhuma exigncia concreta para a verificao de uma resposta positiva clara. Os resultados ambguos
devem ser melhor esclarecidos, de preferncia com modificao das condies experimentais. Os resultados
negativos tm de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmao dos resultados negativos no
seja considerada necessria, deve ser apresentada uma justificao. Para a realizao de experincias adicionais,
deve ser analisada a possibilidade de modificao dos parmetros do estudo, por forma a aumentar a gama de
condies avaliadas. Os parmetros que podem eventualmente ser alterados incluem a gama de concentraes e
as condies de activao metablica.
2.2. AVALIAO E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
H diversos critrios para determinar um resultado positivo, tais como um aumento da frequncia de mutao
que esteja relacionado com a concentrao na gama testada e/ou que seja reprodutvel. Deve ser tomada em
considerao, antes de mais, a importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos
resultados dos ensaios, podero ser utilizados mtodos estatsticos. Contudo, a importncia estatstica no deve
ser o nico elemento de determinao para uma resposta positiva.
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios acima indicados no presente ensaio considerada
no mutagnica.
Embora a maioria das experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o
conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da substncia em
estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos independentemente do
nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos in vitro indica que a substncia
induz mutaes gnicas nas culturas de clulas de mamferos utilizadas. Uma resposta positiva concentrao
que seja reprodutvel mais significativa. Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a
substncia no induz mutaes gnicas nas culturas de clulas de mamfero utilizadas.
L 142/266 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
3. APRESENTAO DE RELATRIOS
RELATRIO DE ENSAIO
O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo,
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.
Clulas:
tipo e origem das clulas,
nmero de culturas celulares,
nmero de transferncias, quando aplicvel,
mtodos de manuteno da cultura celular, quando aplicvel,
ausncia de micoplasma.
Condies de ensaio:
justificao para a seleco das concentraes e do nmero de culturas, incluindo, por exemplo, dados
sobre a citotoxicidade e sobre as limitaes de solubilidade, quando disponveis,
composio dos meios, concentrao de CO
2
concentrao da substncia em estudo,
volumes adicionados do veculo e da substncia em estudo,
temperatura de incubao,
tempo de incubao,
durao de tratamento,
densidade celular durante a exposio,
tipo e composio do sistema de activao metablica, incluindo critrios de aceitabilidade,
controlos positivos e negativos,
durao do perodo de expresso (incluindo o nmero de clulas inoculadas e os calendrios de sub-
-cultura e de alimentao, quando aplicvel),
agentes selectivos,
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo,
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/267
mtodos utilizados para a enumerao dos nmeros de clulas mutantes e viveis,
definio das colnias cuja dimenso e tipo so caracterizados (incluindo os critrios para a definio de
colnias pequenas e grandes, conforme apropriado).
Resultados:
sinais de toxicidade,
sinais de precipitao,
dados sobre o pH e a presso osmtica durante a exposio substncia de ensaio, caso tenham sido
determinados,
dimenso das colnias, caso tenha sido medida pelo menos para os controlos positivos e negativos,
capacidade do laboratrio para a deteco de pequenas colnias mutantes no sistema L5178Y TK
+/-
,
quando aplicvel,
relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar,
anlise estatstica, quando tenha sido realizada,
dados relativos ao controlo negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo com o ensaio,
dados histricos sobre o controlo negativo (solvente/veculo) e positivo, com as gamas, valores mdios e
desvios-padro,
frequncia das mutaes.
Discusso dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.), (1987) Banbury Report 28:
Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
(2) Chu, E.H.Y. and Malling, H.V., (1968) Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus
Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, p. 1306-1312.
(3) Liber, H.L. and Thilly, W.G., (1982) Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human
Lymphoblasts. Mutation Res., 94, p. 467-485.
(4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L., (1989) Differential Mutant
Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, p. 394-403.
(5) Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F., (1989) Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays:
Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, p. 121-128.
(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson,
E., (1994) Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International
Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, p. 235-239.
L 142/268 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
(7) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991)
Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res.,
257, p. 147-204.
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H., (1983) Specific Gene Mutations in
L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program.
Mutation Res., 115, p. 225-251.
(9) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S., (1988) A Review and Analysis of the Chinese Hamster
Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of
Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program.
Mutation Res., 196, p. 17-36.
(10) Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., ONeill, J.P., Riddle, J.C.,
Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L., (1987) A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary
Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189,
p. 135-141.
(11) Liber, H.L., Yandell, D.Wand Little, J.B., (1989) A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT
Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of
Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, p. 9-17.
(12) Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W., (1986) Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl
Methanosulphonate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate and ICR
191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, p. 133-147.
(13) Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D., (1984) Procedures for the L5178Y/TK
+/-
TK
+/-
Mouse
Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures,
Elsevier Science Publishers, New York, p. 239-268.
(14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C., (1989)
Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of
Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, p. 66-101.
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A., (1977) Induction of
6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated
Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, p. 365-373.
(16) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with
the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364.
(17) Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M., (1979) Validation and
Characterization of the L5178Y/TK
+/-
Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, p. 61-
-108.
(18) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation
Res., 113, p. 173-215.
(19) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C.,
(1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-
-177.
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated
Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis
Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, p. 85-88.
(21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases
and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents.
New York, Plenum, p. 91-103.
(22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) Evaluation of an Exposure System Using
Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/269
Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795-801.
(23) Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C., (1990) Molecular Dissection of
Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 87, p. 51-55.
(24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J., (1985)
Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFT
r
) Mutants of L5178Y/TK
+/-
Mouse Lymphoma Cells.
Mutation Res., 151, p. 161-174.
(25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B., (1990) Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a
Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, p. 89-102.
(26) Moore, M.M. and Doerr, C.L., (1990) Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-
-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK
+/-
-3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5,
p. 609-614.
L 142/270 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B.18. LESO E REPARAO DO ADN SNTESE NO PROGRAMADA CLULAS DE MAMFERO IN
VITRO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.2. DEFINIO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
O Teste de Sntese No Programada de ADN (Unscheduled DNA Synthesis-UDS) mede a sntese de ADN para
reparao aps exciso e remoo de um fragmento de ADN contendo uma regio de leso induzida por
agentes qumicos e fsicos. O teste baseia-se na incorporao da timidina marcada com trtio (
3
H-TdR) no ADN
de clulas de mamfero no se encontrando na fase S do ciclo celular. Pode determinar-se a incorporao de
3
H-TdR examinando o ADN proveniente das clulas tratadas por auto-radiografia ou por contagem de
cintilao em meio lquido (LSC-Liquid Scintilation Counting). As clulas de mamfero em cultura, com a
excepo dos hepatcitos primrios de rato, so tratadas com a substncia a testar em presena e na ausncia de
um sistema exgeno de activao metablica. A UDS pode tambm ser medida por mtodos in vivo.
1.5. CRITRIOS QUALITATIVOS
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
Preparativos
As substncias a testar, bem como as de controlo ou de referncia sero preparadas no meio de cultura,
dissolvidas ou colocadas em suspenso em veculos apropriados, sendo depois diludas em meio de cultura,
antes de utilizadas no ensaio. A concentrao final no dever afectar a viabilidade celular.
Podem ser utilizadas neste ensaio culturas primrias de hepatcitos de rato, linfcitos humanos ou linhas
celulares estabelecidas (por exemplo, fibroblastos humanos diplides).
As clulas sero expostas substncia a testar em presena e na ausncia de um sistema de activao metablica
apropriado.
Condies experimentais
Nme r o d e c ul t ur a s
So necessrias para cada ponto experimental pelo menos duas culturas celulares para a auto-radiografia e seis
culturas celulares (ou menos se tal se justificar tecnicamente) para a contagem de cintilao em meio lquido.
Us o d e c ont r ol os ne g a t i vos e pos i t i v os
Devero ser includos em cada experincia controlos simultneos (no tratados e/ou veculo) com e sem
activao metablica.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/271
Para o ensaio com hepatcitos de rato, por exemplo, pode utilizar-se como controlo positivo o 7,12 DMBA
(7,12-dimetil benzantraceno) ou o 2-AAF (2-acetilaminofluoreno). No caso de linhas celulares estabelecidas,
em ensaios com auto-radiografia ou LSC realizados sem activao metablica, pode utilizar-se como controlo o
4-NQO (4-nitroquinolina N-xido); quando se tiver recorrido a sistemas de activao metablica, a N-dimetil-
-nitrosamina um dos compostos utilizveis como controlo positivo.
Conc e nt r a e s d e e x pos i o
Dever utilizar-se uma gama de concentraes da substncia a testar para permitir uma boa determinao da
resposta. A concentrao mxima dever produzir alguns efeitos citotxicos. As substncias relativamente
insolveis na gua sero testadas at ao seu limite de solubilidade. No que respeita s substncias no txicas
francamente solveis na gua, a concentrao mxima a testar dever ser determinada caso a caso.
C l ul a s
Para a manuteno das culturas recorrer-se- a meios de cultura, a uma concentrao de CO
2
, a uma
temperatura e a humidade apropriados. As linhas celulares estabelecidas devero ser examinadas
periodicamente para detectar uma contaminao por Mycoplasma.
Ac t i v a o me t a bl i c a
No se utiliza nenhum sistema de activao metablica nas culturas primrias de hepatcitos. As linhas
celulares estabelecidas e os linfcitos so expostos substncia a testar em presena e na ausncia de um
sistema de activao metablica apropriado.
Procedimentos
P r e pa r a o d a s c ul t ur a s
As linhas celulares estabelecidas provenientes de culturas-me (por exemplo, por tripsinizao ou por agitao)
so semeadas em recipientes de cultura numa densidade adequada e incubada a 37
o
C.
As culturas de pouca durao de hepatcitos de rato so estabelecidas permitindo que os hepatcitos
recentemente dissociados num meio apropriado possam aderir superfcie de crescimento.
As culturas de linfcitos humanos so realizadas com tcnicas apropriadas.
Tr a t a me nt o d a s c ul t ur a s c om s ubs t nc i a a t e s t a r
Hepatcitos primrios de rato
Tratam-se hepatcitos primrios de rato, isolados recentemente, com a substncia a testar no meio contendo
3
H-TdR, durante um perodo de tempo adequado. No fim do perodo de tratamento o meio ser eliminado, as
clulas lavadas, fixadas e secadas. As lminas so mergulhadas numa emulso de auto-radiografia [em
alternativa pode usar-se uma pelcula fotogrfica (stripping film)], passando depois exposio, revelao,
colorao e contagem.
Linhas celulares estabelecidas e linfcitos
Tcnicas auto-radiogrficas: Expem-se as culturas celulares substncia a testar durante perodos de tempo
adequados, sendo tratadas em seguida com a
3
H-TdR. A durao da exposio ser em funo da natureza da
substncia, da actividade do sistema metablico e do tipo das clulas. Para detectar o pico da UDS, dever
acrescentar-se a
3
H-TdR, seja ao mesmo tempo que a substncia a testar, seja nos minutos que se seguem
exposio substncia a testar. A escolha entre estas duas tcnicas ser determinada por eventuais interaces
entre a substncia testada e a
3
H-TdR. Para se poder fazer a distino entre a UDS e a replicao
semiconservativa do ADN pode inibir-se esta ltima utilizando-se, por exemplo, um meio deficiente em
arginina, um baixo teor de sdio ou acrescentando-se hidroxiureia ao meio de cultura.
Medio LSC de UDS: Antes de proceder ao tratamento com a substncia a testar, bloqueia-se a entrada das
clulas na fase S da forma descrita acima; expem-se em seguida as clulas substncia a testar, como descrito
para a auto-radiografia. No fim do perodo de incubao extrai-se o ADN das clulas e determina-se a
quantidade total de ADN, bem como a quantidade de
3
H-TdR incorporada.
preciso notar que, se forem utilizados linfcitos humanos, no necessrio suprimir a replicao
semiconservativa do ADN nas culturas no estimuladas.
L 142/272 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Anlise
De t e r mi n a e s a u t o - r a d i o g r f i c a s
Para determinar a UDS nas clulas em clulas em cultura no se contam os ncleos em fase S. Devero contar-
-se pelo menos 50 clulas por concentrao. As lminas sero codificadas antes da contagem. Em cada lmina
sero contados vrios campos escolhidos ao acaso, suficientemente afastados uns dos outros. Determinar-se- a
quantidade de
3
H-TdR incorporado no citoplasma contando-se trs superfcies do tamanho do ncleo no
citoplasma de cada clula contada.
De t e r mi na o L S C
Nas determinaes LSC-UDS deveria utilizar-se um nmero adequado de culturas para cada concentrao e
para os controlos.
Todos os resultados sero confirmados por experincias independentes.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser apresentados sob a forma de quadros.
2.1. DETERMINAES AUTO-RADIOGRFICAS
A quantidade de
3
H-TdR incorporada no citoplasma, bem como o nmero de gros contados por ncleo
celular, sero registados separadamente.
A mdia, a mediana e a moda podem ser utilizadas para descrever a distribuio da quantidade de
3
H-TdR
incorporado no citoplasma, bem como o nmero de gros por ncleo.
2.2. DETERMINAO LSC
Para as determinaes LSC a incorporao de
3
H-TdR dever ser indicada sob a forma dpm/ug do ADN. Pode
utilizar-se a mdia dos dpm/ug do ADN com o seu desvio-padro para descrever a distribuio da
incorporao.
Os resultados devero ser avaliados com mtodos estatsticos apropriados.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO
O relatrio dever conter as seguintes informaes:
clulas utilizadas, densidade e nmero de passagens na ocasio do tratamento, nmero de culturas
celulares,
mtodos utilizados na manuteno das culturas, incluindo o meio, a temperatura e a concentrao de
CO
2
,
substncia a testar, veculo, concentraes e justificao da escolha das concentraes usadas no teste,
pormenores relativos aos sistemas da activao metablica,
esquema do tratamento,
controlos positivos e negativos,
tcnica de auto-radiografia utilizada,
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/273
mtodos utilizados para bloquear a entrada das clulas na fase S,
tcnicas utilizadas para extraco do ADN e determinao da quantidade total de ADN nas
determinaes LSC,
relao dose/resposta, se possvel,
avaliao estatstica,
discusso dos resultados,
interpretao dos resultados.
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B.
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B.
L 142/274 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B.19. TESTE IN V1TRO DE TROCA ENTRE CROMTIDES DO MESMO CROMOSSOMA
(Sister Chromatid Exchange SCE)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.2. DEFINIO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
O ensaio de troca entre cromtides do mesmo cromossoma (SCE) constitui um teste de curto prazo que se
destina a detectar as trocas recprocas de ADN entre as cromtides de um mesmo cromossoma em duplicao.
As SCE representam a troca recproca de produtos de replicao do ADN em loci aparentemente homlogos. O
processo de troca implica provavelmente uma ciso e uma fuso do ADN, apesar de sabermos pouco acerca da
sua base molecular. Para detectar as SCE necessrio poder marcar separadamente as cromtides do mesmo
cromossoma; isto possvel pela incorporao da bromodesoxiuridina (BrdU) no ADN cromossmico durante
dois ciclos celulares.
As clulas de mamfero in vitro so expostas substncia a testar na presena e na ausncia de um sistema
exgeno de activao metablica de mamfero, se for caso disso, e colocadas num meio de cultura contendo
(BrdU) durante dois ciclos de replicao. Aps tratamento com um inibidor do fuso (por exemplo, colchicina) a
fim de acumular as clulas numa fase da mitose metafase-like (c-metafase) recolhem-se as clulas e fazem-se
preparaes de cromossomas.
1.5. CRITRIOS QUALITATIVOS
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
Preparativos
podem ser utilizadas no ensaio culturas primrias (linfcitos humanos) ou linhas celulares estabelecidas
(por exemplo, clulas de ovrio de hamster chins). As linhas celulares devero ser examinadas para
detectar uma eventual contaminao por Mycoplasma,
sero utilizados meios de cultura e condies de incubao adequados (por exemplo, temperatura,
recipientes de cultura, concentrao em CO
2
e humidade),
as substncias a testar podem ser preparadas nos meios de cultura, dissolvidas ou colocadas em
suspenso em veculos apropriados antes de proceder ao tratamento das clulas. A concentrao final do
veculo no meio de cultura no dever afectar nem a viabilidade das clulas nem a taxa de crescimento, e
os efeitos sobre a frequncia de SCE sero verificados por meio de um solvente de controlo,
as clulas sero expostas substncia a testar na presena e na ausncia de um sistema exgeno de
activao metablica de mamfero. Quando se utilizarem tipos celulares com actividade metablica
intrnseca, a taxa e a natureza dessa actividade devero ser adequadas classe qumica testada.
Condies experimentais
Nme r o d e c ul t ur a s
Sero utilizadas pelo menos duas culturas separadas para cada ponto experimental.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/275
Ut i l i z a o d e c ont r ol os ne ga t i v os e pos i t i v os
Devero ser includos em cada experincia controlos positivos utilizando uma substncia com aco directa e
uma substncia necessitando de activao metablica; dever tambm utilizar-se um controlo para o veculo.
As substncias seguintes podem, por exemplo, ser utilizadas como controlos positivos:
substncia com aco directa:
etilmetanosulfonato de etilo,
substncia com aco indirecta:
ciclofosfamida.
Se for caso disso, pode incluir-se um controlo positivo suplementar pertencendo mesma classe qumica da
substncia a testar.
Conc e nt r a o d e e x pos i o
Deveriam ser utilizadas pelo menos trs concentraes da substncia a testar, convenientemente espaadas. A
concentrao mxima dever produzir um efeito txico significativo mas permitindo ainda uma replicao
celular adequada. As substncias relativamente insolveis na gua sero testadas at ao seu limite de
solubilidade com mtodos apropriados. No caso de substncias no txicas francamente solveis na gua a
concentrao mxima da substncia a testar dever ser determinada caso a caso.
Procedimento
P r e pa r a o d a s c ul t ur a s
Utilizam-se linhas celulares estabelecidas provenientes de culturas-me (por exemplo, por tripsinizao ou por
agitao), semeadas em recipientes de cultura, numa densidade adequada e incubadas a 37
o
C. No caso de
culturas em monocamada, o nmero de clulas por recipiente deveria ser ajustado de forma a que as culturas
no estejam confluentes a mais de 50 % no momento da colheita. As clulas podem tambm ser utilizadas na
forma de cultura em suspenso. As culturas de linfcitos humanos so preparadas a partir de sangue
heparinizado utilizando tcnicas apropriadas e incubadas a 37
o
C.
Tr a t a me nt o
So expostas substncia a testar clulas em fase exponencial de crescimento, durante um lapso de tempo
adequado; na maior parte dos casos uma a duas horas podem ser suficientes mas, nalguns casos, o tratamento
pode ser prolongado para cobrir at dois ciclos celulares completos. As clulas que no tiverem actividade
metablica intrnseca suficiente devero ser expostas substncia a testar na presena e na ausncia de um
sistema de activao metablica apropriado. No fim do perodo de exposio, as clulas so lavadas de forma a
eliminar a substncia testada, e depois cultivadas na presena de BrdU durante dois ciclos de replicao. Um
outro mtodo consiste na exposio simultnea das clulas substncia testada e BrdU durante dois ciclos
celulares completos.
As culturas de linfcitos humanos so tratadas enquanto se encontrarem num estado de semi-sincronizao.
As clulas so analisadas no decurso da segunda diviso aps tratamento, garantindo assim a exposio das
fases mais sensveis de ciclo celular substncia a testar. Todas as culturas a que se adicionou BrdU sero
manipuladas na obscuridade ou com pouca iluminao proveniente de lmpadas incandescentes at ao
momento da colheita das clulas, para reduzir a fotlise do ADN contendo BrdU.
Col he i t a d a s c l ul a s
As culturas de clulas so tratadas com um inibidor do fuso (por exemplo, colchicina) uma a quatro horas antes
da colheita. Cada cultura colhida e processada separadamente para a preparao dos cromossomas.
L 142/276 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
P r e pa r a o d os c r omos s oma s e c ol or a o
As preparaes de cromossomas so feitas com mtodos Standard de citogentica. Podem utilizar-se vrias
tcnicas para corar as lminas de forma a pr em evidncia as SCE (por exemplo, o mtodo por fluorescncia
mais Giemsa).
An l i s e
O nmero de clulas analisado ser em funo da frequncia espontnea controlo de SCE. Habitualmente
analisam-se pelo menos 25 metafases de boa qualidade, por cultura, para contar as SCE. As lminas so
codificadas antes da anlise. Para os linfcitos humanos apenas so analisadas as metafases contendo 46
centrmeros. Para as linhas celulares estabelecidas apenas so analisadas as metafases com 2 centrmeros que
o nmero modal. Dever ser precisado se uma inverso de colorao ao nvel do centrmero ou no
considerada como SCE. Os resultados sero confirmados por uma experincia independente.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser apresentados em quadros. O nmero de SCE por metafase e o nmero de SCE por
cromossoma so dados separadamente para todas as culturas, tratadas e controlos.
Os resultados sero analisados com mtodos estatsticos adequados.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO TESTE
O relatrio deveria conter as informaes seguintes:
clulas utilizadas, mtodos de manuteno da cultura celular,
condies experimentais: composio de meios, concentrao de CO
2
, concentrao da substncia a
testar, veculo utilizado, temperatura de incubao, tempo de tratamento, inibidor do fuso utilizado,
concentrao e durao do tratamento com este, tipo de sistema de activao de mamfero utilizado,
controlos positivos e negativos,
nmero de culturas celulares por ponto experimental,
pormenores relativos tcnica utilizada na preparao das lminas,
nmero de metafases analisadas (resultados indicados separadamente para cada cultura),
nmero mdio de SCE por clula e por cromossoma (resultados indicados separadamente para cada
cultura),
critrio de contagem de SCE,
justificao da escolha das doses,
relao dose/resposta, se possvel,
avaliao estatstica,
discusso dos resultados,
interpretao dos resultados.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/277
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B.
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B.
L 142/278 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B.20. TESTE DE LETALIDADE RECESSIVA LIGADA AO SEXO NA DROSOPHILA MELANOGASTER
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.2. DEFINIO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
O teste de letalidade recessiva ligada ao sexo (SLRL Sex Linked Recessive Letal Test) utilizando a Drosophila
melanogaster detecta a ocorrncia de mutaes mutaes pontuais bem como pequenas deleces na linha
germinal do insecto. Esta prova um ensaio de mutao forward capaz de detectar mutaes em cerca de
800 loci do cromossoma X, o que representa cerca de 80 % de todos os loci deste cromossoma. O cromossoma
X representa cerca de um quinto do genoma haplide completo.
As mutaes do cromossoma X de Drosophila melanogaster so expressas fenotipicamente nos machos
portadores do gene mutante. Quando a mutao letal no estado hemizigtico, a sua presena deduzida a
partir da ausncia de um dos grupos de descendncia masculina, em vez dos dois habitualmente produzidos
por uma fmea heterozigtica. O SLRL baseia-se nestes factos, utilizando cromossomas especificamente
marcados e com rearranjos da sua estrutura.
1.5. CRITRIOS QUALITATIVOS
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
Preparativos
S t oc k s
Podem ser utilizados machos de um stock de tipo selvagem bem definido e fmeas do stock Muller-5. Podem
tambm ser utilizados outros stocks de fmeas marcadas adequadamente, com cromossomas X invertidos de
forma mltipla.
S ubs t nc i a a t e s t a r
As substncias a testar devem ser dissolvidas em gua. As substncias insolveis na gua podem ser dissolvidas
ou colocadas em suspenso em veculos apropriados (por exemplo, uma mistura de etanol com Tween-60 ou
80), sendo depois diludas em gua ou numa soluo salina antes da administrao. Deve evitar-se como
veculo o dimetilsulfxido (DMSO).
Nme r o d e a ni ma i s
O teste deve ser concebido com uma sensibilidade e grau de significncia preestabelecido. A frequncia de
mutantes espontneos observada no grupo de controlo ir influenciar fortemente o nmero de cromossomas
tratados que devem ser analisados.
Vi a d e a d mi ni s t r a o
A administrao pode ser oral, por injeco ou por exposio a gases ou vapores. A ingesto da substncia
testada pode ser feita por intermdio de uma soluo aucarada. Se necessrio, as substncias podem ser
dissolvidas numa soluo de NaCL a 0,7 % e injectadas no trax ou no abdmen.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/279
Us o d e c ont r ol os ne g a t i vos e pos i t i v os
Devem ser includos controlos negativos (veculo) e positivos. No entanto, se existirem dados apropriados de
experincias anteriores, no so necessrios controlos simultneos.
N v e i s d e e x pos i o
Devem utilizar-se trs nveis de exposio. Para uma avaliao preliminar pode utilizar-se apenas uma nica
concentrao da substncia testada, podendo essa ser a concentrao mxima tolerada ou a concentrao
produzindo alguns sinais de toxicidade. No caso de substncias no txicas dever utilizar-se a concentrao
mxima praticvel.
P r oc e d i me nt o
Tratam-se com a substncia a testar machos de fentipo selvagem (com trs a cinco dias de idade), sendo
acasalados individualmente a um maior nmero de fmeas virgens do stock Muller-5 ou outro stock marcado de
forma apropriada (com cromossomas X invertidos de forma mltipla). Estas fmeas sero substitudas de dois
em dois ou de trs em trs dias por outras fmeas virgens para se cobrir o ciclo germinal completo. A
descendncia destas fmeas examinada para detectar os efeitos sobre o esperma maduro, as espermtides em
estdios precoces, intermdios ou tardios, os espermatcitos e as espermatognias na ocasio do tratamento.
As fmeas F
1
heterozigticas provenientes dos cruzamentos mencionados acima so acasaladas individual-
mente (isto , um fmea por frasco de experincia) com os seus irmos. Na gerao F
2
examina-se cada cultura
para detectar a ausncia de machos do tipo selvagem. Se uma cultura revelar ser proveniente de uma fmea F
1
portadora de um gene letal no cromossoma X paterno (isto , quando no se observar nenhum macho
portador do cromossoma tratado), devem testar-se as filhas dessa fmea com o mesmo genotipo para verificar
se a letalidade se repete na gerao seguinte.
2. RESULTADOS
Os resultados devem ser apresentados em quadros indicando o nmero de cromossomas X tratados, o nmero
de machos no frteis e o nmero de cromossomas letais por cada concentrao de exposio e por cada
perodo de acasalamento para cada macho tratado. O nmero de agregados de diferentes dimenses dever ser
indicado. Estes resultados devero ser confirmados por uma experincia separada.
Devero ser utilizados mtodos estatsticos apropriados na avaliao dos testes de letalidade recessiva ligada ao
sexo. O reagrupamento de genes letais recessivos provenientes de um nico macho dever ser considerado e
avaliado com um mtodo estatstico apropriado.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO TESTE
O relatrio do teste dever incluir as seguintes informaes:
stock: stocks ou estirpes de Drosophila utilizados, idade dos insectos, nmero de machos tratados, nmero
de machos estreis, nmero de culturas F
2
estabelecidas, nmero de cromossomas portadores de um gene
letal detectado em cada estdio das clulas germinais,
critrios aplicados para determinar as dimenses dos grupos tratados,
condies experimentais: descrio pormenorizada do esquema de tratamento e de amostragem, nveis
de exposio, dados sobre a toxicidade, controlos negativos (solvente) e positivos se necessrio,
critrios aplicados na contagem das mutaes letais,
relao exposio/efeito, se possvel,
e avaliao estatstica dos resultados,
L 142/280 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
discusso dos resultados,
interpretao dos resultados.
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B.
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/281
B.21. TESTES DE TRANSFORMAO DE CLULAS DE MAMFERO IN VITRO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.2. DEFINIO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Podem utilizar-se sistemas de cultura de clulas de mamfero para detectar in vitro alteraes do fentipo
induzidas por substncias qumicas associadas com uma transformao maligna in vivo. Entre as culturas mais
frequentemente utilizadas contam-se as C3H1OT 1/2, 3T3, SHE, rato Fischer; os testes baseiam-se nas
alteraes da morfologia celular, formao de ninhos celulares ou alteraes ligadas necessidade de
ancoragem a um agar semi-slido. Existem outros sistemas menos frequentemente utilizados que detectam
outras alteraes fisiolgicas ou morfolgicas nas clulas depois de uma exposio a carcinognios qumicos.
Nenhum dos fenmenos finais destes testes in vitro apresenta uma relao mecanicista estabelecida com o
cancro. Alguns dos sistemas de testes so capazes de detectar promotores de tumores. Pode determinar-se a
citotoxicidade medindo o efeito da substncia a testar sobre a capacidade para formar uma colnia (eficcia de
cloning) ou ainda sobre as taxas de crescimento das culturas. A medio da citotoxicidade tem por fim
determinar se a exposio da substncia testada foi toxicologicamente significativa mas no pode servir para
calcular a frequncia das transformaes em todas as provas uma vez que algumas destas podem implicar uma
incubao prolongada e/ou uma nova passagem.
1.5. CRITRIOS QUALITATIVOS
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
Preparativos
C l ul a s
Podem ser utilizadas vrias linhas celulares ou clulas primrias, dependendo do teste de transformao
utilizado. O investigador deve assegurar-se de que as clulas do teste efectuado apresentam a alterao
fenotpica adequada depois da exposio a carcinognios conhecidos e que a validade e fiabilidade do teste
efectuado no seu laboratrio sejam comprovadas e documentadas.
Me i o
Devero utilizar-se meios e condies de ensaio adequados ao teste de transformao utilizado.
S ubs t nc i a a t e s t a r
As substncias a testar podem ser preparadas nos meios de cultura, e dissolvidas ou colocadas em suspenso
em veculos apropriados antes do tratamento das clulas. A concentrao final do veculo no sistema de cultura
no deve afectar a viabilidade celular nem a taxa de crescimento, nem a incidncia de transformaes.
Ac t i v a o me t a bl i c a
As clulas devero ser expostas substncia a testar na presena e na ausncia de um sistema de activao
metablica adequado. Alternativamente, quando se utilizar tipos de clulas com actividade metablica
intrnseca, a natureza dessa actividade ser comprovadamente apropriada classe qumica testada.
L 142/282 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Condies do ensaio
Ut i l i z a o d e c ont r ol os pos i t i v os e ne ga t i v os
Sero includos em cada experincia controlos positivos utilizando uma substncia com aco directa e uma
substncia necessitando de activao metablica; utilizar-se- igualmente um controlo negativo (veculo).
Podem ser utilizadas como controlos positivos as seguintes substncias:
substncias qumicas com aco directa:
etilmetanosulfonato,
-propiolactona,
substncias necessitando de activao metablica:
2-acetilaminofluoreno,
4-dimetilaminobenzeno,
7,12-dimetilbenzantraceno.
Dever ser includo, quando justificado, um controlo positivo suplementar pertencendo mesma classe
qumica que a substncia testada.
Conc e nt r a e s d e e x pos i o
Devero ser utilizadas vrias concentraes das substncias a testar. Estas concentraes devero produzir um
efeito txico dependente da concentrao; a concentrao mxima dever produzir uma baixa taxa de
sobrevivncia, a concentrao mnima uma taxa de sobrevivncia prxima da observada nos controlos
negativos. As substncias relativamente insolveis na gua sero testadas at ao seu limite de solubilidade com
mtodos apropriados. No caso de substncias no txicas, francamente solveis na gua, a concentrao
mxima dever ser determinada caso a caso.
Procedimento
As clulas sero expostas durante um perodo de tempo dependente do sistema celular utilizado, que pode
implicar um novo tratamento acompanhado de mudana de meio (e se necessrio uma nova mistura de
activao metablica) se a exposio for prolongada. As clulas que no tenham actividade metablica
intrnseca suficiente devero ser expostas substncia a testar na presena e na ausncia de um sistema de
activao metablica apropriado. No fim do perodo de exposio, as clulas so lavadas de forma a eliminar a
substncia testada e cultivadas em condies que permitam o aparecimento do fentipo transformado em
estudo sendo ento determinada a incidncia desta transformao. Todos os resultados devero ser
confirmados por uma experincia independente.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser apresentados em quadros e podem ser apresentados de vrias formas consoante o
mtodo utilizado, por exemplo, contagem por placa, placas positivas ou nmero de clulas transformadas.
Quando apropriado, a sobrevivncia ser expressa em percentagem das taxas de controlo e a frequncia de
transformao corresponder ao nmero de clulas transformadas por nmero de sobreviventes. Os resultados
devero ser avaliados com mtodos estatsticos apropriados.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO TESTE
O relatrio do teste dever incluir as seguintes informaes:
tipo de clula utilizada, nmero de culturas de clulas, mtodos de manuteno das culturas de clulas,
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/283
condies do teste: concentrao da substncia a testar, veculo usado, tempo de incubao, durao e
frequncia do tratamento, densidade celular durante o tratamento, tipo de sistema exgeno de activao
metablica utilizado, controlos positivos e negativos, especificao do fentipo estudado, sistema
selectivo usado (se apropriado); justificao da escolha das doses,
mtodo utilizado para contar as clulas viveis e as transformadas;
avaliao estatstica,
discusso dos resultados,
interpretao dos resultados.
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B.
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B.
L 142/284 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B.22. TESTE DE LETALIDADE DOMINANTE NO ROEDOR
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.2. DEFINIO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
A letalidade dominante provoca a morte do embrio ou do feto. A induo de letalidade dominante por
exposio a uma substncia qumica indica que a substncia afectou o tecido germinal da espcie estudada.
Admite-se geralmente que a letalidade dominante devida a uma leso cromossmica (alteraes estruturais e
numricas). No caso de os animais tratados serem fmeas, a morte do embrio pode tambm ser devida a
efeitos txicos.
Em geral, os machos so expostos substncia a testar e acasalados com fmeas virgens no tratadas. Os
diferentes estdios das clulas germinais podem ser testados separadamente utilizando-se perodos de
acasalamento sequenciais. O aumento do nmero de implantes mortos por fmea no grupo tratado em relao
ao nmero de implantes mortos por fmea no grupo de controlo reflecte as perdas aps a implantao. As
perdas antes da implantao podem ser calculadas por contagem dos corpos amarelos ou comparando o
nmero total de implantes por fmea no grupo tratado e no grupo de controlo. O efeito total de letalidade
dominante igual soma das perdas antes e depois da implantao. O clculo do efeito total da letalidade
dominante baseia-se na comparao entre o nmero de implantes vivos por fmea no grupo tratado e o
registado no grupo de controlo. Uma diminuio do nmero dos implantes em determinados intervalos pode
ser devida destruio das clulas (isto , de espermatcitos e/ou espermatognias).
1.5. CRITRIOS QUALITATIVOS
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
Preparativos
Quando for possvel, as substncias a testar sero dissolvidas ou colocadas em suspenso numa soluo salina
isotnica. As substncias qumicas insolveis na gua podem ser dissolvidas ou colocadas em suspenso em
veculos apropriados. O veculo utilizado no dever interferir com a substncia a testar nem dever produzir
efeitos txicos. Sero utilizadas preparaes frescas da substncia a testar.
Condies experimentais
Vi a d e a d mi ni s t r a o
A substncia a testar dever ser administrada uma nica vez. Pode ser utilizado um programa de tratamento
repetido em funo das informaes toxicolgicas disponveis. As vias de administrao habituais so a
intubao oral ou a injeco interperitoneal. Podem ser adequadas outras vias de administrao.
Ani ma i s d e e x pe r i nc i a
Recomenda-se a utilizao de ratos ou ratinhos. Repartem-se ao acaso entre os grupos tratados e de controlo
animais jovens e sos tendo atingido a plena maturidade sexual.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/285
Nme r o e s e xo
Utiliza-se um nmero adequado de machos tratados, tendo em conta a frequncia espontnea da caracterstica
biolgica que est a ser avaliada. O nmero escolhido dever basear-se numa sensibilidade de deteco e grau
de significao preestabelecidos. Por exemplo, num teste tpico, o nmero de machos escolhido para cada
grupo de dose dever ser suficientemente grande para obter 30 a 50 fmeas grvidas por perodo de
acasalamento.
Ut i l i z a o d e c ont r ol os ne ga t i v os e pos i t i v os
Devero ser includos em cada experincia controlos positivos e negativos (veculos), sendo geralmente
simultneos. Se experincias recentes efectuadas no mesmo laboratrio tiverem dado resultados aceitveis com
os controlos positivos, estes resultados podero ser utilizados em vez de um controlo positivo simultneo. No
que respeita s substncias de controlo positivo dever utilizar-se uma dose baixa apropriada (por exemplo
MMS, intraperitonealmente, 10 mg/kg) para demonstrar a sensibilidade do teste.
Dos e s
Normalmente usam-se trs nveis de dose diferentes. A dose mxima dever produzir sinais de toxicidade ou
reduzir a fecundidade dos animais tratados. Em alguns casos pode ser suficiente uma nica dose elevada.
E ns a i o- l i mi t e
As substncias no txicas so testadas razo de 5 g/kg no caso de administrao nica e de 1 g/kg/dia no
caso de administrao repetida.
Procedimento
Vrios esquemas de tratamento so possveis. O mtodo mais frequente o da administrao nica. Podem
utilizar-se outros esquemas de tratamento.
Cada macho acasalado sequencialmente com uma ou duas fmeas virgens no tratadas, a intervalos de tempo
apropriados aps o tratamento. As fmeas devero ser deixadas com os machos durante pelo menos um ciclo
completo do estro, ou at que o acasalamento seja comprovado pela presena de esperma na vagina ou pela
presena de um rolho vaginal.
O nmero de acasalamentos aps tratamento determinado pelo esquema de tratamento e dever assegurar
que sejam testados todos os estdios das clulas germinais tratadas.
As fmeas so sacrificadas durante a segunda metade da gestao e o contedo do tero examinado para
determinao do nmero de implantes vivos e mortos. Os ovrios podem ser examinados para determinar o
nmero de corpos amarelos.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser apresentados em quadros, indicando o nmero de machos, o nmero de fmeas
grvidas bem como o nmero de fmeas no grvidas. Os resultados de cada acasalamento, incluindo a
identidade de cada macho e de cada fmea so apresentados separadamente. Sero descritos para cada fmea a
semana de acasalamento e a dose recebida pelos machos, bem como a frequncia dos implantes vivos e mortos.
O clculo do efeito total de letalidade dominante baseia-se numa comparao do nmero de implantes vivos
por fmea no grupo tratado com o nmero de implantes vivos por fmea no grupo de controlo. Compara-se a
relao implantes vivos/mortos no grupo tratado com a mesma relao no grupo de controlo para indicao
das perdas ps-implantao.
Se os resultados forem registados sob a forma de mortalidades precoces e mortalidades tardias, os quadros
devero tornar clara essa diferena. Se for avaliada a perda anterior implantao, devem apresentar-se os
resultados. Esta perda pode ser calculada como a discrepncia entre o nmero de corpos amarelos e o nmero
de implantes ou como a diminuio do nmero mdio de implantes por fmea em relao ao dos
acasalamentos de controlo.
Os resultados sero avaliados com mtodos estatsticos apropriados.
L 142/286 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO TESTE
O relatrio do teste dever incluir as informaes seguintes:
espcies, estirpe, idade e peso dos animais utilizados, nmero de animais de cada sexo nos grupos
tratados e de controlo,
substncia a testar, veculo, doses testadas e justificao da escolha das doses, controlos negativos e
positivos, dados relativos toxicidade,
via de administrao e esquema do tratamento,
esquema de acasalamento,
mtodo utilizado para comprovar o acasalamento,
momento do sacrifcio,
critrios de contagem dos efeitos de letalidade dominante,
relao dose/resposta, se possvel,
avaliao estatstica,
discusso dos resultados,
interpretao dos resultados.
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B.
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/287
B.23. ENSAIO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM ESPERMATOGNIAS DE MAMFERO
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 483 Ensaio de aberrao cromossmica em
espermatognias de mamfero (1997).
1.1. INTRODUO
O objectivo do ensaio in vivo de aberraes cromossmicas em espermatognias de mamfero identificar as
substncias que causam aberraes cromossmicas estruturais nas clulas espermatognias de mamfero (1) (2)
(3) (4) (5). As aberraes estruturais podem ser de dois tipos, cromossmicas ou cromatdicas. A maior parte
dos mutagneos qumicos induzem aberraes cromatdicas, mas tambm podem ocorrer aberraes
cromossmicas. O mtodo no foi concebido para medir aberraes numricas e no normalmente utilizado
com esse objectivo. As mutaes cromossmicas e eventos relacionados causam diversas doenas genticas
humanas.
O presente ensaio mede eventos a nvel dos cromossomas de clulas germinais espermatognias e, por
conseguinte, pressupe-se que tenha um carcter de previso da induo de mutaes transmissveis nas clulas
germinais.
No presente ensaio utilizam-se normalmente roedores. O ensaio citognico in vivo detecta aberraes
cromossmicas nas mitoses das espermatognias. O mtodo no diz respeito a outros tipos de clulas.
Para detectar aberraes cromatdicas em clulas espermatognias deve examinar-se a primeira diviso mittica
da clula aps a exposio, antes que as eventuais leses sejam perdidas por via de divises celulares
subsequentes. Para obteno de informao adicional sobre as clulas germinais das espermatognias expostas
pode proceder-se anlise dos cromossomas durante a meiose, para deteco de aberraes cromossmicas na
diacinese-metafase 1, momento em que as clulas expostas passam forma de espermatcitos.
O presente ensaio in vivo foi concebido para investigar se os agentes mutagneos das clulas somticas tambm
so activos para as clulas germinais. Alm disso, o ensaio das espermatognias relevante para a avaliao dos
riscos de mutagenicidade, na medida em que permite a considerao dos elementos do metabolismo in vivo, da
farmacocintica e dos processos de reparao do ADN.
Nos testculos esto presentes diversas geraes de espermatognias, com diferentes graus de sensibilidade ao
tratamento qumico. Logo, as aberraes detectadas representam uma resposta agregada das vrias populaes
de clulas espermatognias expostas, com predominncia para as clulas espermatognias mais diferenciadas,
que so em maior nmero. Dependendo da sua posio no testculo, diferentes geraes de espermatognias
podero ou no ser expostas circulao geral, devido barreira fsica e fisiolgica constituda pelas clulas de
Sertoli e barreira sangue-testculo.
Se existirem provas de que nem a substncia em estudo nem nenhum dos seus metabolitos reactivos entram
em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio no apropriado.
Ver tambm a parte B da Introduo Geral.
1.2. DEFINIES
Aberrao cromatdica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de
unio, de cromatdeos simples.
Aberrao cromossmica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de
unio, de ambos os cromatdeos no mesmo local.
Lacuna: leso acromtica de extenso inferior largura de um cromatdeo e que determine um ligeiro
desalinhamento do mesmo.
Aberrao numrica: alterao do nmero de cromossomas relativamente ao nmero de cromossomas
caracterstico das clulas utilizadas.
Poliploidia: nmero de cromossomas mltiplo do nmero haplide (n), mas diferente do diplide (ou seja, 3n,
4n e assim por diante).
Aberrao estrutural: alterao da estrutura dos cromossomas detectvel por exame microscpico das clulas
em metafase sob a forma de supresso de segmentos, de alteraes de partes da sequncia ou da troca de
segmentos num cromatdeo ou entre cromatdeos.
L 142/288 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
1.3. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Os animais so expostos substncia em estudo atravs de um modo de exposio apropriado, sendo
sacrificados passado o tempo necessrio aps a exposio. Antes do sacrifcio os animais so tratados com um
agente de fixao da metafase (por exemplo, colchicina ou Colcemid

). Seguidamente so feitas preparaes de


cromossomas a partir das clulas germinais e, aps serem coradas, as clulas em metafase so analisadas para
deteco de aberraes cromossmicas.
1.4. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.4.1. Preparao
1.4.1.1. Seleco das espcies animais
Geralmente, so utilizados ratos ou hamsters chineses machos, embora possam ser utilizados machos de
qualquer outra espcie de mamfero apropriada. Devem ser utilizados animais adultos saudveis jovens das
raas de laboratrio mais comuns. No incio do estudo, a diferena de peso entre os animais deve ser mnima,
no devendo exceder 20 % do peso mdio de cada sexo.
1.4.1.2. Condies de acomodao e alimentao
Devem ser aplicadas as condies gerais referidas na Introduo Geral, parte B, embora o objectivo para a
humidade deva ser de 50 %-60 %.
1.4.1.3. Preparao dos animais
Os animais machos adultos saudveis jovens so distribudos aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos
grupos expostos. As gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos respectiva colocao
sejam minimizados. Os animais so identificados de forma inequvoca, devendo ser aclimatados s condies
de laboratrio durante pelo menos cinco dias antes de se iniciar o estudo.
1.4.1.4. Preparao das doses
As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e, se necessrio,
diludas antes de serem administradas aos animais. As substncias lquidas podem ser adicionadas directamente
aos sistemas em estudo e/ou diludas antes de serem adicionadas s clulas. Devem ser utilizadas preparaes
frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo
armazenamento no coloca problemas para o ensaio.
1.4.2. Condies do ensaio
1.4.2.1. Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, no devendo produzir efeitos txicos nas doses
utilizadas. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se encontrem totalmente elucidadas,
devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possvel, recomenda-se a
utilizao de um solvente/veculo aquoso.
1.4.2.2. Controlos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo). Com excepo da
exposio substncia em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo, devem ser
manuseados de forma idntica.
Os controlos positivos devem produzir aberraes estruturais in vivo nas clulas espermatognias quando
administrados aos nveis de exposio a que se espera o surgimento de um aumento detectvel em relao
linha de base.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/289
A dose de controlo positiva a administrar deve ser escolhida de modo a que os seus efeitos sejam claros mas
tambm a que as lminas codificadas no sejam imediatamente identificadas pela pessoa que procede s
leituras. aceitvel que o controlo positivo seja administrado por uma via diferente da substncia em estudo e
que s seja realizada uma amostra. A possibilidade de utilizao de produtos qumicos de uma classe
relacionada para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam. As substncias de controlo positivo
podem incluir, por exemplo:
Substncia Nmero CAS Nmero EINECS
Ciclofosfamida
Ciclofosfamida monohidrato
50-18-0
6055-19-2
200-015-4
Ciclohexilamina 108-91-8 203-629-0
Mitomicina C 50-07-7 200-008-6
Acrilamida monomrica 79-06-1 201-173-7
Trietilenomelamina 51-18-3 200-083-5
Para cada amostragem prevista devem ser includos controlos negativos expostos apenas ao solvente ou
veculo, que sero sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos, a menos que existam
dados histricos de controlo aceitveis em relao variabilidade de animal para animal e frequncia da
ocorrncia de clulas com aberraes cromossmicas. Alm disso, devem ser tambm preparados controlos
no expostos substncia em estudo, a menos que existam dados de controlo histricos ou publicados que
mostrem que o solvente/veculo escolhido no induz qualquer efeito deletrio ou mutagnico.
1.5. PROCEDIMENTO
1.5.1. Nmero de animais
Cada grupo exposto e de controlo deve incluir pelo menos cinco animais machos analisveis.
1.5.2. Programao do tratamento
As substncias de ensaio so preferivelmente administradas numa ou em duas doses (ou seja, numa s
exposio ou em duas exposies). As substncias podero igualmente ser administradas numa dose dividida,
ou seja, duas exposies no mesmo dia, separadas por apenas algumas horas, para facilitar a administrao de
grandes volumes. Qualquer outro regime de administrao ter de ser cientificamente justificado.
No grupo exposto dose mais elevada sero realizadas duas amostras aps a exposio. Uma vez que a cintica
celular poder ser afectada pela substncia em estudo, sero colhidas duas amostras, uma cerca de 24 horas
aps a exposio e outra cerca de 48 horas aps a exposio. Para os restantes animais deve ser colhida uma
amostra 1,5 ciclos celulares normais ou 24 horas aps a exposio, a no ser nos casos em que se saiba que a
utilizao de outros tempos de amostragem mais apropriada para a deteco dos efeitos (6).
Para alm disso, podero ser utilizados outros tempos de amostragem. Assim, por exemplo, no caso de
produtos qumicos que possam induzir lagging cromossmico ou efeitos independentes do factor S, poder ser
necessrio fazer a amostragem mais cedo (1).
A necessidade ou no de uma repetio da exposio ter de ser avaliada caso a caso. Se o tratamento for
repetido, os animais devem ser sacrificados 24 horas (1,5 ciclos celulares) aps a ltima exposio. Quando
necessrio, podero ser realizadas amostras adicionais.
Antes do sacrifcio, os animais so injectados intraperitonealmente com uma dose apropriada de um agente de
fixao da metafase (por exemplo, Colcemid

ou colchicina). As amostras sero colhidas a intervalos regulares a


partir desse momento. Esse intervalo corresponde a aproximadamente 3-5 horas para os ratos e a 4-5 horas
para os hamsters chineses.
1.5.3. Doses
Se for realizado um estudo para avaliao da gama de doses a administrar, por no estarem disponveis dados
apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratrio, utilizando as mesmas espcies, linha celular
e regime de exposio a utilizar no estudo principal (7). Se existir toxicidade, sero utilizadas trs doses
diferentes para a primeira amostragem. Essas doses devem abranger uma gama de toxicidade mxima a quase
nula. Na segunda amostragem s ser necessrio avaliar a dose mais elevada. A dose mais elevada definida
como a dose que produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilizao de doses superiores, com o
mesmo regime de administrao, produzir mortalidade.
L 142/290 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
As substncias com actividade biolgica especfica em doses baixas e no txicas (como acontece com as
hormonas e agentes mitognicos) podero constituir uma excepo aos critrios de fixao da dose, devendo
ser avaliadas numa base casustica. A dose mais elevada pode igualmente ser definida como uma dose que
produz algumas indicaes de toxicidade nas espermatognias (por exemplo, reduo da taxa de mitose das
espermatognias na primeira e segunda metafase meiticas; essa reduo no deve ser superior a 50 %).
1.5.4. Ensaio-limite
Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso corporal numa nica exposio ou em duas
exposies no mesmo dia no produzir nenhum efeito txico perceptvel e se no for previsvel a existncia de
toxicidade gentica com base nos dados respeitantes a substncias estruturalmente relacionadas, poder no ser
considerado necessrio um estudo completo com utilizao de trs doses diferentes. A exposio prevista para
o ser humano pode indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios-limite.
1.5.5. Administrao das doses
A substncia em estudo geralmente administrada por sonda esofgica, utilizando um tubo estomacal ou
cnula de intubao apropriada, ou por injeco intraperitoneal. Podero ser aceites, mediante justificao,
outras vias de administrao. O volume mximo de lquido que pode ser administrado de cada vez por sonda
esofgica ou por injeco depende tambm do tamanho do animal de ensaio, no devendo exceder 2 ml/100 g
de peso corporal. A utilizao de volumes mais elevados deve ser justificada. Com excepo das substncias que
causem irritao ou que sejam corrosivas, cujos efeitos sero normalmente agravados em concentraes mais
altas, a variabilidade do volume de ensaio deve ser minimizada atravs do ajustamento das concentraes, por
forma a garantir um volume constante para todas as doses a administrar.
1.5.6. Preparao dos cromossomas
Imediatamente aps o sacrifcio, devem ser preparadas suspenses celulares de um ou de ambos os testculos,
que sero seguidamente expostas a uma soluo hipotnica e fixadas. As clulas so depois esfregadas em
lminas e coradas.
1.5.7. Anlise
Devem ser analisadas pelo menos 100 clulas em metafase avanada de cada animal (ou seja, um mnimo de
500 metafases por grupo). Este nmero poder ser menor quando se verificarem taxas elevadas de aberraes.
Todas as lminas, incluindo as dos controlos positivos e negativos, devem ser independentemente codificadas
antes da anlise microscpica. Uma vez que os procedimentos de preparao das lminas do frequentemente
lugar ruptura de uma certa proporo das clulas em metafase, com perda de cromossomas, as clulas
contabilizadas devem conter um nmero de centrmeros igual a 2n 2.
2. DADOS
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS
Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num quadro. A unidade experimental o animal.
Para cada animal devem ser verificados o nmero de clulas com aberraes cromossmicas e o nmero de
aberraes cromossmicas por clula. Os diferentes tipos de aberrao cromossmica estrutural devem ser
enumerados com os respectivos nmeros e frequncias para os grupos expostos substncia em estudo e de
controlo. A ocorrncia de lacunas registada em separado e includa no relatrio, mas no geralmente
contabilizada para o clculo da frequncia total das aberraes.
Se para alm das mitoses tambm se observarem meioses, a relao entre o nmero de mitoses e de metafases I
ou II das espermatognias deve ser determinada num total de 100 clulas em diviso por animal, para medio
da citotoxicidade em todos os animais expostos substncia em estudo e do controlo negativo, de forma a
poder estabelecer se existem efeitos citotxicos. Se s se observarem mitoses, o ndice mittico deve ser
calculado utilizando pelo menos 1 000 clulas de cada animal.
2.2. AVALIAO E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
H diversos critrios para determinar um resultado positivo, como por exemplo um aumento do nmero de
clulas com aberraes cromossmicas relacionado com a dose ou um claro aumento do nmero de clulas
com aberraes num determinado grupo e numa determinada amostragem. Deve ser tomada em considerao,
antes de mais, a importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados dos
ensaios, podero ser utilizados mtodos estatsticos (8), embora a significncia estatstica no deva ser o nico
elemento para a determinao de uma resposta positiva. Os resultados ambguos devem ser esclarecidos atravs
de estudos adicionais, de preferncia com modificao das condies experimentais.
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios acima indicados no presente ensaio considerada
no mutagnica.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/291
Embora a maioria de experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o
conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da substncia em
estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos independentemente do
nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio in vitro para aberraes cromossmicas em espermatognias indica que a
substncia em estudo induz aberraes cromossmicas estruturais nas clulas germinais das espcies testadas.
Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo no induz aberraes
cromossmicas estruturais nas clulas germinais das espcies testadas.
Deve ser discutida a probabilidade de a substncia em estudo ou os seus metabolitos alcanarem o sistema
circulatrio geral ou especificamente o tecido objectivo.
3. APRESENTAO DE RELATRIOS
RELATRIO DE ENSAIO
O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo,
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.
Animais de ensaio:
espcie/linha celular utilizada,
nmero e idade dos animais,
origem, condies de acomodao, alimentao, etc.,
peso de cada animal no incio do ensaio, incluindo a gama de pesos, a respectiva mdia e o desvio-
-padro para cada grupo.
Condies de ensaio:
resultados do estudo para definio da gama de doses, quando tenha sido realizado,
justificao para a seleco das doses,
justificao da via de administrao escolhida,
preparao da substncia em estudo,
modo de administrao da substncia em estudo,
justificao do momento do sacrifcio,
converso da concentrao da substncia em estudo (ppm) na alimentao/abeberao para a dose real
(mg/kg peso corporal/dia), quando aplicvel,
qualidade dos alimentos e da gua,
descrio pormenorizada dos calendrios de tratamento e amostragem,
L 142/292 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
mtodos de medio da toxicidade,
substncia utilizada para fixar a metafase, respectiva concentrao e durao da exposio,
mtodos de preparao das lminas,
critrios de contabilizao das aberraes,
nmero de clulas analisadas por animal,
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo.
Resultados:
sinais de toxicidade,
ndice mittico,
proporo de clulas espermatognias em mitose em relao s clulas em metafase I ou II,
tipo e nmero de aberraes, discriminados para cada animal,
nmero total de aberraes por grupo,
nmero de clulas aberrantes por grupo,
relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar,
anlise estatstica, quando tenha sido realizada,
dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio,
dados histricos sobre o controlo negativo, com as respectivas gama, valor mdio e o desvio-padro,
dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o ensaio,
alteraes da ploidia, quando observadas.
Discusso dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Adler, I.D., (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their
Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and
Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, p. 477-484.
(2) Adler, I.D., (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S.
Venitt and J.M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, p. 275-306.
(3) Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from
Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/293
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L., (1990). In Vivo Cytogenetic
Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS
Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press,
Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y., (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial
Chromosomes. Mutation Res., 52, p. 207-209.
(6) Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N.,
(1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of
the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, p. 313-318.
(7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker,
G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M., (1992). Report of British Toxicology Society/UK
Environmental Mutagen Society Working group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays.
Mutagenesis, 7, p. 313-319.
(8) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth,
D.G. and Savage, J.R.K., (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.)
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity
Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne,
Sydney, p. 184-232.
L 142/294 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
B.24. TESTE DAS MALHAS (SPOT-TEST) NO RATINHO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.2. DEFINIO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Este teste uma prova in vivo efectuada no ratinho, cujos embries em desenvolvimento so expostos
substncia a testar. As clulas visadas dos embries em desenvolvimento so os melanoblastos e os genes alvo
so os responsveis pela pigmentao do plo. Os embries em desenvolvimento so heterozigticos para
alguns desses genes. Uma mutao ao nvel do alelo dominante ou a perda do alelo dominante de um desses
genes num melanoblasto (na sequncia de vrios fenmenos genticos) traduz-se pela expresso do fentipo
recessivo nas clulas que dele descendem, do que resulta o aparecimento de uma malha de cor diferente no plo
do ratinho. Conta-se assim o nmero de descendentes portadores de malhas (mutaes) e a sua frequncia
comparada com a frequncia observada na descendncia resultante do desenvolvimento de embries tratados
apenas com o solvente. O teste das malhas no ratinho (spot test) detecta as mutaes somticas presumveis nas
clulas fetais.
1.5. CRITRIOS QUALITATIVOS
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
Preparativos
Quando for possvel as substncias a testar so dissolvidas ou colocadas em suspenso numa soluo salina
isotnica. As substncias insolveis na gua sero dissolvidas ou colocadas em suspenso em veculos
apropriados. O veculo utilizado no dever interferir com a substncia a testar nem produzir efeitos txicos.
Devero utilizar-se solues preparadas de fresco da substncia a testar.
Ani ma i s d e e x pe r i nc i a
Ratinhos da estirpe T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c
ch
p/c
ch
p; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald
spotting, s/s) so acasalados seja com a estirpe HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln
fz/ln fz; pearl pe/pe) ou com a C57 BL (nonagouti, a/a). Podem utilizar-se outros cruzamentos apropriados como
entre a NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) e a DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute, d/d) na condio de
produzirem uma descendncia nonagouti.
Nme r o e s e xo
Deve tratar-se um nmero suficiente de fmeas grvidas de forma a obter um nmero adequado de
descendentes vivos para cada dose utilizada. A dimenso da amostra depende do nmero de malhas observadas
nos ratinhos tratados bem como da importncia dos dados dos controlos. S se aceitar um resultado negativo
se forem examinados pelo menos 300 descendentes das fmeas tratadas com a dose mxima.
Cont r ol os ne ga t i v os e pos i t i v os
Dever dispor-se de dados de controlo simultneos respeitantes aos ratinhos tratados apenas com o veculo
(controlos negativos). Dados de controlo de experincias anteriores provenientes do mesmo laboratrio podem
ser-lhes reunidos para se aumentar a sensibilidade do teste, no caso de estes serem homogneos. Se a substncia
testada no se revelar mutagnica, deveriam estar disponveis os dados obtidos recentemente pelo mesmo
laboratrio para um controlo positivo cuja aco mutagnica nesta prova seja conhecida.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/295
Vi a d e a d mi ni s t r a o
As vias de administrao habituais nas fmeas grvidas so a intubao oral e a injeco intraperitoneal.
Tratamentos por inalao ou outras vias de administrao sero usados quando tal for apropriado.
Dos e s
Utilizam-se pelo menos dois nveis de dose, um dos quais provocando sinais de toxicidade ou reduzindo o
tamanho das ninhadas. No caso de substncias no txicas, recorrer-se- a um tratamento com a dose mxima
praticvel.
Procedimento
Administra-se normalmente um tratamento nico no dia 8, 9 ou 10 de gestao, sendo o dia 1 aquele em que
se observe pela primeira vez a presena de um rolho vaginal. Estes dias correspondem 7,25, 8,25 e 9,25 dias
aps a concepo. Podem ser efectuados tratamentos sucessivos durante esses dias.
An l i s e
Trs a quatro semanas aps o nascimento a descendncia codificada e examinada para se detectar a presena
de malhas. Distinguem-se trs classes de malhas:
a) Malhas brancas situadas a menos de 5 mm da linha mdio-ventral que se presuma resultarem de morte
celular (WMVS);
b) Malhas amarelas de tipo agouti, associadas aos mamilos, aos rgos genitais, garganta, s regies axilar
e inguinal bem como no meio da regio frontal, que se presuma serem devidas a uma diferenciao
defeituosa (MDS); e
c) Malhas pigmentadas e brancas, distribudas ao acaso no plo, que se presuma serem devidas a mutaes
somticas (RS).
Contam-se as trs classes mas apenas a ltima, isto , a RS, tem relevncia gentica. Os problemas postos pela
distino entre as classes MDS e RS podem ser resolvidos examinando-se amostras de plos ao microscpio de
fluorescncia.
Sero anotadas as alteraes macroscpicas evidentes observadas na descendncia.
2. RESULTADOS
Os resultados so apresentados indicando o nmero total de crias examinadas e o nmero de crias
apresentando uma ou vrias malhas que se presuma serem devidas a uma mutao somtica. Os resultados
relativos aos animais tratados e aos controlos negativos so comparados por mtodos apropriados. Os
resultados so apresentados igualmente referindo-se a ninhada como unidade.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO TESTE
O relatrio do teste dever incluir as seguintes informaes:
as estirpes utilizadas no cruzamento,
o nmero de fmeas grvidas nos grupos tratados e de controlo,
o tamanho mdio das ninhadas nos grupos tratados e de controlo na ocasio do nascimento e do
desmame,
as doses da substncia a testar,
o solvente utilizado,
o dia da gestao em que se administrou o tratamento,
L 142/296 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
a via de administrao,
o nmero total de crias observadas, bem como o nmero das que apresentavam malhas WMVS, MDS e
RS nos grupos tratados e de controlo,
alteraes morfolgicas macroscpicas,
relao dose/efeito, se possvel,
avaliao estatstica,
discusso dos resultados,
interpretao dos resultados.
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B.
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/297
B.25. TRANSLOCAO HEREDITRIA NO RATINHO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.2. DEFINIO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
O teste de translocao hereditria no ratinho detecta alteraes cromossmicas estruturais e numricas nas
clulas germinais de mamfero que so postas em evidncia na descendncia da primeira gerao. Os tipos de
alteraes cromossmicas detectadas so as translocaes recprocas e, se for includa a descendncia do sexo
feminino, a perda do cromossoma X. Os portadores de translocaes e as fmeas XO apresentam uma
fertilidade reduzida, permitindo a seleco de uma descendncia F
1
para anlise citogentica. Alguns tipos de
translocao provocam esterilidade total (X-autossoma e tipo c-t). As translocaes so observadas por
mtodos citogenticos nas clulas meiticas na diacinese-metafase I de indivduos do sexo masculino, sejam
machos F
1
ou filhos de fmeas F
1
. As fmeas XO so identificadas citogeneticamente pela presena de apenas
39 cromossomas nas mitoses da medula ssea.
1.5. CRITRIOS QUALITATIVOS
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
Preparativos
As substncias a testar so dissolvidas numa soluo salina isotnica. Se forem insolveis na gua sero
dissolvidas ou colocadas em suspenso em veculos apropriados. Utilizam-se solues preparadas de fresco da
substncia a testar. Se se utilizar um veculo para facilitar a administrao este no deve interferir com a
substncia a testar nem produzir efeitos txicos.
Vi a d e a d mi ni s t r a o
As vias de administrao so habitualmente a intubao oral ou a injeco intraperitoneal. Podem ser
adequadas outras vias de administrao.
Ani ma i s d e e x pe r i nc i a
Estas experincias so efectuadas em ratinhos para facilitar a reproduo e a verificao citolgica. No
requerida nenhuma estirpe especfica. No entanto, o nmero mdio de crias por ninhada da estirpe utilizada
dever ser superior a oito e ser relativamente constante.
Sero utilizados animais sos tendo j atingido a maturidade sexual.
Nme r o d e a ni ma i s
O nmero de animais necessrios depende da frequncia de translocaes espontneas bem como da taxa de
induo mnima requerida para um resultado positivo.
O teste consiste habitualmente na anlise da descendncia masculina F
1
. Sero testados pelo menos 500
descendentes masculinos F
1
por cada dose. Se se incluir a descendncia feminina F
1
, sero necessrios 300
machos e 300 fmeas.
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Cont r ol os ne ga t i v os e pos i t i v os
Devem estar disponveis dados de controlo adequados provenientes de provas realizadas simultaneamente ou
de experincias anteriores. Quando existirem dados aceitveis de controlos positivos provenientes de
experincias efectuadas recentemente no mesmo laboratrio, estes podem ser utilizados em vez de controlos
positivos simultneos.
Dos e s
testada apenas uma dose, tratando-se habitualmente da dose mxima associada produo de efeitos txicos
mnimos mas no afectando o comportamento reprodutor nem a sobrevivncia. Para estabelecer uma relao
dose/resposta so necessrias duas doses adicionais, mais baixas. No caso de substncias no txicas, dever
recorrer-se a uma exposio dose mxima praticvel.
Procedimento
Tr a t a me nt o e a c a s a l a me nt o
So possveis dois esquemas de tratamento. A administrao nica da substncia a testar o mtodo mais
frequente. A substncia a testar pode tambm ser administrada sete dias por semana durante 35 dias. O
nmero de acasalamentos depois do tratamento determinado pelo esquema de tratamento e ser tal que
todos os estdios de clulas germinais sejam implicados. No fim do perodo de acasalamento as fmeas so
colocadas em gaiolas individuais. Quando as fmeas parirem registar-se-o a data, o nmero de crias da
ninhada e o sexo das crias. Toda a descendncia do sexo masculino desmamada e toda a do sexo feminino
afastada a no ser que esteja includa na experincia.
P e s q ui s a d os he t e r oz i gt i c os d e t r a ns l oc a o
utilizado um de dois mtodos disponveis:
anlise da fertilidade da descendncia F
1
e verificao ulterior de eventuais portadores de translocaes
por anlise citogentica,
anlise citogentica de todos os machos F
1
sem seleco prvia por verificao da fertilidade.
a) Anlise da fertilidade
A diminuio de fertilidade de um indivduo F
1
pode ser determinada observando-se o nmero de crias
da ninhada e/ou analisando o contedo uterino das fmeas com que acasalou.
Devero estabelecer-se critrios para determinao da fertilidade normal e diminuda da estirpe de
ratinhos utilizada.
Observao do nmero de animais por ninhada: Os machos F
1
a testar so colocados em gaiolas individuais
com fmeas provenientes da mesma experincia ou da colnia. As gaiolas so inspeccionadas
diariamente a partir do dia 18 aps o acasalamento. O nmero de crias da ninhada e o sexo da
descendncia F
2
so registados na ocasio do nascimento, sendo as crias eliminadas em seguida. Se se
testar a descendncia do sexo feminino F
1
ento os descendentes F
2
provenientes de ninhadas pequenas
so conservados com vista a uma anlise mais profunda. As fmeas portadoras de uma translocao
sero objecto de uma verificao por anlise citogentica de uma translocao em qualquer dos seus
descendentes machos. As fmeas XO so identificadas pela alterao da razo macho/fmea na sua
descendncia que passa de 1/1 para 1/2 machos/fmeas. Num mtodo sequencial os animais F
1
normais
no sero objecto de outra verificao se a primeira ninhada F
2
atingir ou ultrapassar um valor normal
preestabelecido, seno observar-se- uma segunda ou uma terceira ninhada F
2
.
Os animais F
1
que no puderem ser classificados como normais aps uma observao de at trs
ninhadas F
2
no mximo, sero submetidos seja a um novo controlo por anlise do contedo uterino das
fmeas com que acasalaram, seja directamente a uma anlise citogentica.
Anlise do contedo uterino: A reduo do nmero de crias por ninhada nos portadores de translocao
devida morte de embries, de modo que um grande nmero de implantes mortos indica a presena de
uma translocao no animal submetido ao teste. Cada macho F
1
a testar acasalado com duas ou trs
fmeas. A concepo confirmada pela inspeco matinal diria das fmeas para detectar a presena de
rolho vaginal. As fmeas so sacrificadas 14 a 16 dias mais tarde, registando-se o nmero de implantes
vivos e mortos presentes nos seus teros.
b) Anlise citogentica
As preparaes de testculo so efectuadas pelo mtodo de secagem ao ar. Os portadoras de translocaes
so identificados pela presena de configuraes multivalentes na diacinese-metafase I nos
espermatcitos primrios. A observao de pelo menos duas clulas apresentando uma associao
multivalente constitui a prova necessria de que o animal testado portador de uma translocao.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/299
Se no tiver sido efectuada nenhuma seleco por anlise de fertilidade, todos os machos F
1
so
submetidos a um exame citogentico. Devem ser analisadas ao microscpio um mnimo de 25 clulas em
diacinese-metafase I por macho. necessrio o exame das metafases mitticas nas espermatognias ou
na medula ssea, no caso dos machos tendo testculos pequenos ou apresentando uma paragem meitica
antes da diacinese ou no caso das fmeas F
1
suspeitas de serem XO. A presena de um cromossoma
anormalmente longo e/ou curto em alguma de 10 clulas a prova de uma translocao particular
acarretando a esterilidade do macho (tipo c-t). Algumas translocaes X-autossoma provocando a
esterilidade do macho podem apenas ser identificadas por uma anlise de bandas de cromossomas
mitticos. A presena de 39 cromossomas em 10 mitoses por cada 10 a prova de um estado XO numa
fmea.
2. RESULTADOS
Os resultados so apresentados sob a forma de quadros.
O nmero mdio de crias por ninhada e a razo entre os sexos so registados nascena e no desmame para
cada perodo de acasalamento.
Quando da avaliao da fertilidade dos animais F
1
devero apresentar-se o nmero mdio de crias por ninhada
das ninhadas resultantes de todos os acasalamentos normais bem como o nmero de crias individual das
ninhadas provenientes de animais F
1
portadores de translocao. No que respeita anlise do contedo uterino
sero anotados o nmero mdio de implantes vivos e mortos resultantes de acasalamentos normais e o nmero
de implantes vivos e mortos para cada acasalamento de animais portadores de translocao.
Quando da anlise citogentica da diacinese-metafase I, sero registados os diferentes tipos de configuraes
multivalentes e o nmero total de clulas para cada portador de translocao.
Para os indivduos F
1
estreis sero indicados o nmero total de acasalamentos e a durao do perodo de
acasalamento. Sero indicados o peso dos testculos bem como os pormenores da anlise citogentica.
Para as fmeas XO indicar-se- o nmero de crias mdio por ninhada, a razo entre os sexos na descendncia
F
2
, bem como os resultados da anlise citogentica.
Se forem seleccionados eventuais portadores de translocao F
1
por testes de fertilidade os quadros devero
mencionar quantos deles foram confirmados como sendo heterozigticos de translocao.
Sero apresentados os dados relativos aos controlos negativos bem como as experincias de controlo positivo.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO TESTE
O relatrio do teste dever incluir as seguintes informaes:
estirpe de ratinho utilizada, idade dos animais, peso dos animais tratados,
nmero de animais progenitores de cada sexo nos grupos tratados e de controlo,
condies experimentais, descrio pormenorizada do tratamento, doses, solventes, esquema de
acasalamento,
nmero e sexo de crias por fmea, nmero e sexo das crias mantidas para uma anlise de translocao,
momento e critrios da anlise de translocao,
nmero e descrio pormenorizada dos portadores de translocao, incluindo dados relativos
reproduo e ao contedo uterino, se possvel,
mtodos citogenticos e pormenores da anlise microscpica, de preferncia com fotografias,
avaliao estatstica,
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discusso dos resultados,
interpretao dos resultados.
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B.
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B.
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B.26. ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL SUBCRNICA ESTUDO DE TOXICIDADE ORAL DE DOSE
REPETIDA EM ROEDORES COM A DURAO DE 90 DIAS
1. MTODO
O presente mtodo de ensaio da toxicidade oral subcrnica idntico ao mtodo OCDE TG 408 (1998).
1.1. INTRODUO
Ao avaliarem-se as caractersticas txicas de uma substncia qumica poder proceder-se determinao da
toxicidade oral subcrnica utilizando doses repetidas depois de se ter obtido informao inicial sobre a
toxicidade a partir de ensaios de toxicidade aguda ou de dose repetida com a durao de 28 dias. O estudo de
90 dias permite obter informao sobre os perigos para a sade susceptveis de decorrer de uma exposio
repetida ao longo de um perodo de tempo prolongado, abrangendo a maturao e o crescimento aps o
desmame e prolongando-se pela vida adulta. O estudo permitir obter informao sobre os principais efeitos
txicos, identificar os rgos-alvo e a possibilidade de acumulao, bem como fazer uma estimativa de um
nvel de exposio sem efeitos adversos observados a utilizar na seleco dos nveis de administrao em
estudos crnicos e na determinao de critrios de segurana para a exposio no caso de seres humanos.
O mtodo utilizado d um maior destaque aos terminais neurolgicos e permite formar uma ideia sobre os
efeitos imunolgicos e ao nvel da reproduo. Deve salientar-se a necessidade de efectuar uma observao
clnica pormenorizada dos animais, de modo a obter-se o mximo de informao possvel. Este estudo deve
permitir tambm identificar substncias susceptveis de causar efeitos neurotxicos, imunolgicos ou ao nvel
dos rgos de reproduo, que podero justificar uma investigao mais aprofundada.
Ver tambm a parte B da Introduo Geral.
1.2. DEFINIES
Dose: quantidade de substncia administrada. A dose expressa em termos de massa (g, mg) ou em termos da
massa da substncia em estudo por massa unitria do animal estudado (por exemplo, mg/kg), ou em termos de
concentraes dietticas constantes (ppm).
Dosagem: termo geral que abrange a dose administrada, bem como a frequncia e durao da administrao.
NOAEL: abreviatura de no observed adverse effect level (dose sem efeitos adversos observados), que consiste na
dose mxima ou no nvel de exposio mximo que no produz efeitos adversos detectveis no ensaio
atribuveis ao mesmo.
1.3. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
A substncia em estudo administrada diariamente por via oral, em doses crescentes (uma dose por lote), a
vrios lotes de animais de ensaio, durante um perodo de 90 dias. No decurso deste perodo, os animais so
examinados em pormenor, com vista deteco de quaisquer sinais de toxicidade. Efectua-se a autpsia dos
animais que morrem ou so sacrificados durante o ensaio e, no final do mesmo, procede-se ao abate dos
sobreviventes e respectiva autpsia.
1.4. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.4.1. Preparao dos animais
Devem ser utilizados animais saudveis que tenham sido aclimatados s condies laboratoriais durante pelo
menos cinco dias e no tenham sido anteriormente submetidos a procedimentos experimentais. Os animais
utilizados no estudo devem ser caracterizados quanto espcie, estirpe, provenincia, sexo, peso e/ou idade. Os
animais devem ser repartidos aleatoriamente pelos grupos de ensaio e de controlo. As gaiolas devem ser
dispostas de modo a reduzir ao mnimo os eventuais efeitos devidos respectiva colocao. Deve ser atribudo
a cada animal um nmero de identificao diferente.
1.4.2. Preparao das doses
A substncia em estudo administrada por intermdio de uma sonda gstrica ou atravs da alimentao ou da
gua de beber. O mtodo de administrao oral depende do objectivo do ensaio, bem como das propriedades
fsico-qumicas da substncia em estudo.
L 142/302 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
Se necessrio, a substncia dissolvida ou suspensa num veculo adequado. Sempre que possvel, recomenda-se
que se considere primeiramente a possibilidade de se utilizar uma soluo ou suspenso aquosa; em segundo
lugar, uma soluo ou emulso em leo (nomeadamente leo de milho); e, por ltimo, uma soluo noutro
veculo. No caso de se utilizar um veculo no aquoso, devem conhecer-se as respectivas caractersticas de
toxicidade. Deve tambm determinar-se a estabilidade da substncia nas condies de administrao.
1.4.3. Condies de ensaio
1.4.3.1. Animais a utilizar no ensaio
Embora possa recorrer-se a outros roedores, como por exemplo o ratinho, o rato constitui a espcie preferida.
Devem utilizar-se animais adultos, jovens e saudveis, de estirpes correntes de laboratrio. As fmeas devem ser
nulparas e no grvidas. A administrao da substncia deve ter incio logo que possvel aps o desmame e, em
qualquer caso, antes de os animais completarem nove semanas de idade. No incio do estudo, a variao de
massa dos animais deve ser mnima, no excedendo 20 % da massa mdia de cada sexo. Caso o estudo
preceda um estudo da toxicidade crnica a longo prazo, conveniente utilizar em ambos os casos animais da
mesma estirpe e provenincia.
1.4.3.2. Nmero e sexo
Para cada dose devem utilizar-se, pelo menos, 20 animais (10 machos e 10 fmeas). Caso se preveja o sacrifcio
de alguns animais durante o ensaio, o referido nmero deve ser acrescido do nmero de animais a sacrificar.
Com base em conhecimentos anteriores da substncia em estudo ou de um anlogo prximo, dever
considerar-se a possibilidade de incluir um lote extra de 10 animais (cinco de cada sexo) no grupo de controlo e
no grupo a que ir ser administrada a dose mxima, a fim de se observar, aps o perodo de ensaio, a
reversibilidade ou persistncia de eventuais efeitos txicos. A durao deste perodo de observao dever ser
correctamente estabelecida tendo em conta os efeitos a observar.
1.4.3.3. Doses
Devem ser utilizadas pelo menos trs doses e um controlo simultneo, excepto nos casos em que seja realizado
um ensaio-limite (ver 1.4.3.4). As dose