Nota Tcnica

Quim. Nova, Vol. 31, No. 5, 1224-1229, 2008

ESTUDO COMPARATIVO DE TCNICAS DE SCREENING PARA AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE EXTRATOS BRUTOS DE ESPCIES VEGETAIS E DE SUBSTNCIAS PURAS
Everton Giovanni Alves, Adriana Helena Chicharo Vinholis, Luciana Assirati Casemiro, Niege Araari Jacometti
Cardoso Furtado, Mrcio Luis Andrade e Silva, Wilson Roberto Cunha e Carlos Henrique Gomes Martins*
Ncleo de Pesquisa em Cincias Exatas e Tecnolgicas, Universidade de Franca, Av. Dr. Armando Salles Oliveira, 201,
14404-600 Franca SP, Brasil
Recebido em 3/1/07; aceito em 25/9/07; publicado na web em 2/4/08

COMPARATIVE STUDY OF SCREENING TECHNIQUES FOR ANTIBACTERIAL ACTIVITY EVALUATION OF PLANT

CRUDE EXTRACTS AND PURE COMPOUNDS. In this work, the effectiveness of four screening techniques (three techniques
of the diffusion method and one microdilution broth method) were compared. Evaluated were the ethanolic and dichloromethanic
extracts of Miconia rubiginosa (Melastomataceae) against six standard bacteria (ATCC). The results showed statistical disagreement
among the three diffusion techniques. Among the diffusion techniques, the well technique displayed the best result. However the
microdilution broth method demonstrated to be the most adequate method to evaluate the antibacterial activity of plant crude extracts
and pure compounds when compared to the other methodologies.
Keywords: antimicrobial activity; screening methods; plant extracts.

INTRODUO
Atualmente existem diversas tcnicas de screening para definir
se o extrato de uma determinada planta possui atividade antimicrobiana, desde as mais simples, que podem ser realizadas rotineiramente, at as mais sofisticadas, que muitas vezes se tornam indisponveis em alguns laboratrios. Apesar disso, h poucos estudos que
relatam qual o melhor mtodo de screening a ser utilizado de acordo
com o tipo de extrato a ser testado, mesmo no que se refere s tcnicas mais simples. Por vezes, relatos de resultados em diferentes artigos publicados com uma mesma planta so apresentados de maneira distinta em relao atividade antimicrobiana, s vezes at
mesmo discrepantes, mesmo naqueles em que foram utilizadas as
mesmas condies de experimento (ex: solvente utilizado para extrao, temperatura, tempo de incubao e microrganismos indicadores), embora as tcnicas ou modificaes empregadas nos mtodos de screening para avaliar a atividade antimicrobiana por diferentes autores no tenham sido as mesmas.1
Os dois mtodos mais comumente utilizados para o screening
de extratos de plantas com potencial antibacteriano so o de difuso em gar e de diluio em caldo. O mtodo de difuso em gar
pode ser realizado atravs das tcnicas do disco, do poo ou
template. 2-4 Diversas modificaes j foram realizadas nas
metodologias de screening a fim de se obter resultados mais
confiveis, uma vez que alguns fatores, tais como composio do
meio de cultura, microrganismos testados, mtodo de extrao, pH
e solubilidade das amostras no meio de cultura, podem alterar os
resultados, sendo difcil, portanto, padronizar um procedimento.1
Quando se utiliza o mtodo de difuso vrios fatores podem se
tornar fontes de erros, tais como composio do meio de cultura,
preparao incorreta do meio de cultura, espessura do meio de cultura, densidade do inculo incorreta, uso de swab com excesso de
caldo para inoculao das placas, temperatura e tempo de incubao inadequados, interaes entre o antimicrobiano e o meio de
cultura, utilizao errada da atmosfera de CO2 quando necessria,
*e-mail: martinsc@unifran.br

leitura prematura, erro na medida das zonas de inibio ou uso de

culturas mistas ou contaminadas.5
O mtodo de difuso em gar geralmente utilizado para microrganismos de crescimento rpido e para alguns de crescimento
fastidiosos.6 Para um resultado confivel dos testes, preciso trabalhar com uma metodologia padronizada. O mtodo padronizado
que atualmente recomendado pelo NCCLS (atualmente CLSI) se
baseia no originalmente descrito por Bauer et al..7
Atualmente, o mtodo de diluio usado para determinar a
concentrao mnima de um agente necessrio para inibir ou matar
um microrganismo. Os procedimentos para determinar a atividade
inibitria podem ser realizados tanto pelas tcnicas de diluio em
caldo ou em gar. Os agentes antimicrobianos so geralmente testados em diluies consecutivas, e a menor concentrao capaz de
inibir o crescimento de um organismo considerada como a Concentrao Inibitria Mnima (CIM).8 Segundo Andrews,9 as CIMs
so consideradas excelentes ferramentas para determinar a susceptibilidade dos organismos aos antimicrobianos e, portanto, usadas para julgar a performance de todos os outros mtodos de susceptibilidade. Nos laboratrios de diagnstico, as CIMs so tambm usadas como uma ferramenta de pesquisa para determinar a
atividade in vitro de novos antimicrobianos.
Os mtodos de diluio em caldo ou gar so igualmente aceitveis para medir quantitativamente a atividade in vitro de um agente
antimicrobiano contra um determinado isolado bacteriano.10,11 Para
realizar o teste preparam-se vrios tubos de ensaio ou placas com
meio caldo ou gar, aos quais so acrescentadas diversas concentraes dos agentes antimicrobianos. A seguir, os tubos ou as placas so inoculados com uma suspenso padro do organismo a ser
testado. Aps incubao overnight, a 35 C, examinam-se os testes
e determina-se a CIM. A CIM pode ser detectada a olho nu ou
atravs de aparelhos baseados em leitura ptica.
A tcnica de microdiluio em caldo uma adaptao da
macrodiluio em caldo. denominada microdiluio, porque
envolve o uso de pequenos volumes de caldo colocados em placas
de 80, 96 ou mais poos de fundo redondo ou cnico estreis, prprias para microdiluio. As placas de microdiluio inoculadas

Vol. 31, No. 5

Estudo comparativo de tcnicas de screening para avaliao

devem ser incubadas a 35 C por 16-24 h, com no mximo quatro

placas em cada pilha, a fim de manter a mesma temperatura de
incubao para todas as culturas.11 Os fatores primrios que influenciam nos valores de CIM no mtodo de diluio em caldo so os
mesmos tanto para a tcnica de macrodiluio como para de
microdiluio, ou seja, a sensibilidade do organismo, o diluente
utilizado, o estgio e a taxa de crescimento bacteriano.12
O presente estudo teve como objetivo avaliar a eficcia de
metodologias de screening comumente usadas em trabalhos que
envolvem extratos de espcies vegetais, bem como antimicrobianos
padro (substncias puras). Foi estudado o mtodo de difuso em
gar pelas tcnicas do poo, do disco e do template e o mtodo da
microdiluio em caldo. Nos ensaios foram avaliados os extratos
etanlico e diclorometnico de Miconia rubiginosa (Melastomataceae) frente s bactrias Staphylococcus aureus, Enterococcus
faecalis, Kokuria rhizophila, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, e Salmonella typhimurium. As substncias puras penicilina e gentamicina foram utilizadas na avaliao da atividade frente a bactrias Gram-positivas e Gram-negativas, respectivamente.
PARTE EXPERIMENTAL
Coleta e identificao do vegetal Miconia rubiginosa
A espcie vegetal foi coletada numa regio do cerrado prximo Rodovia Tancredo Neves (Franca-SP Claraval-MG) e uma
exsicata (UEC 10830) foi depositada no Departamento de Botnica do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas.
Obteno e diluio dos extratos
As partes areas do vegetal foram secas e estabilizadas em estufa de ar circulante a 40 C e trituradas at a forma de p em
moinho de facas. O p resultante foi extrado atravs de macerao,
utilizando os solventes diclorometano e etanol por 21 dias. O material lquido resultante foi concentrado em evaporador rotativo.
Uma alquota dos extratos brutos etanlico e diclorometnico foram diludos em dimetilsulfxido (DMSO) para obteno das amostras nas concentraes de 100 e 300 mg/mL, a serem utilizadas
para as tcnicas do poo, disco e template.
Padronizao da densidade do inculo
Como a densidade do inculo influencia no resultado dos experimentos, padronizou-se a quantidade de inculo a ser utilizada,
a fim de assegurar a reprodutibilidade dos ensaios. Inicialmente
preparou-se a escala 0,5 de McFarland segundo Bier.13 Para isso,
adicionou-se 0,5 mL de cloreto de brio a 1% em 99,5 mL de cido
sulfrico a 1%. Em seguida, transferiu-se 2 mL dessa suspenso
para uma cubeta espectrofotomtrica.
Para calibrar a transmitncia a 100% em um espectrofotmetro
a um comprimento de onda de 530 nm, utilizou-se gua destilada.
Em seguida, colocou-se a suspenso 0,5 de McFarland, obtendo a
transmitncia de 88%. Todas as suspenses bacterianas foram ajustadas na mesma transmitncia.
Avaliao da atividade antibacteriana pelo mtodo de difuso
em gar pelas tcnicas do disco, poo e template
Todos os ensaios foram realizados em triplicata utilizando-se
cepas provenientes da American Type Culture Collection (ATCC):
Staphylococcus aureus (25923), Enterococcus faecalis (29212),
Kokuria rhizophila (9341), Escherichia coli (35218), Pseudomonas

1225

aeruginosa (27853) e Salmonella typhimurium (14028).

Nas tcnicas do disco, poo e template as substncias puras
penicilina G e gentamicina foram utilizadas tambm como controle positivo. Para Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis
utilizou-se a penicilina G na concentrao de 0,05 mg/mL, enquanto
que para Kokuria rhizophila a concentrao foi de 0,03 mg/mL.
Para Escherichia coli, Salmonella typhimurium e Pseudomonas
aeruginosa foi utilizada gentamicina na concentrao de 0,05 mg/
mL. No mtodo da microdiluio em caldo para determinao da
CIM foram utilizadas as mesmas substncias puras, onde as concentraes avaliadas variaram de 0,0115 a 5,9 g/mL. O antimicrobiano penicilina G foi preparado em tampo fosfato de potssio
a 1% pH 6,0, enquanto gentamicina foi preparado em gua destilada esterilizada. Dimetilsulfxido foi utilizado como controle negativo para todos os microrganismos.
A determinao da atividade antibacteriana pela tcnica do poo
foi realizada segundo Grove e Randall,14 a qual consiste na utilizao de placas com camada dupla (camada base e camada seed de
meios adequados ao microrganismo testado). A camada base foi
obtida com meio de cultura Agar Mueller Hinton (AMH). Aps
esterilizado e resfriado a cerca de 50 C, foram distribudos 25 mL
em placas de Petri de 25 x 150 mm esterilizadas (Pleion ). A
camada seed foi obtida colocando-se em um tubo 12,5 mL de meio
de cultura AMH esterilizado e resfriado a 50 C, ao qual foi incorporado 2,5 mL de Caldo Mueller Hinton com o inculo j preparado. Imediatamente a camada seed foi vertida sobre a camada base.
Aps a solidificao da camada seed, os poos foram confeccionados com um dispositivo contendo cilindros metlicos esterilizados
de 4,0 mm de dimetro. A seguir, os poos foram completamente
preenchidos com 40 L dos extratos a serem testados, alm das
substncias puras e o controle negativo. Em seguida foi colocado
papel de filtro (Whatman, Inglaterra) esterilizado na tampa de
cada placa para reter a gua de condensao. Aps um perodo de
pr-incubao de 2 h temperatura ambiente, que permite a difuso dos extratos antes do incio do desenvolvimento dos microrganismos, como preconizado por Mller,15 as placas foram incubadas em aerobiose a 36 C por 18 h.
O teste para determinao da atividade antibacteriana pela tcnica do disco foi realizado conforme atualizaes do CLSI M2A8. Inicialmente foi preparado o meio de cultura AMH. Aps
resfriamento a cerca de 50 C, foi transferido um volume de 50 mL
do meio liquefeito para placas de Petri esterilizadas de 25 x 150
mm, at atingir a espessura de 4 mm. Com um swab esterilizado, o
inculo foi distribudo uniformemente sobre a superfcie do gar e
deixado em repouso temperatura ambiente durante 3 min. Os
discos foram preparados no momento de sua utilizao contendo
16 L dos extratos, das substncias puras e do controle negativo.
Aps um intervalo de 15 min, as placas foram incubadas em estufa
bacteriolgica a 36 C por 18 h.
A determinao da atividade antibacteriana pela tcnica do
template foi realizada conforme descrio original da Farmacopia
Brasileira 4a edio,16 com modificaes. Inicialmente foi preparada a camada base para a qual foram transferidos 15 mL de AMH,
previamente esterilizado, para placas de Petri esterilizadas medindo 20 x 100 mm (Pyrex ). As placas permaneceram em superfcie
plana at a solidificao do meio. Para preparao do meio de superfcie, o meio de cultura AMH foi previamente esterilizado e
mantido em banho-maria a uma temperatura aproximada de 50 C
at o momento do uso. Em seguida, foram transferidos volumes de
20 mL do meio fundido a 50 C para tubos com tampa de rosca
(Pyrex ). Imediatamente foram adicionados a estes tubos 100 L
do inculo previamente preparado, obtendo-o na proporo de 0,5%.
Em seguida, o lquido foi vertido na placa de petri contendo a ca-

1226

Alves et al.

mada base. Aps a solidificao do meio de superfcie, foi colocado um molde de ao inoxidvel esterilizado (template) em cada
placa. Com auxlio de uma micropipeta, foram adicionados 50 L
dos extratos a serem testados, alm das substncias puras e do controle negativo em cada cavidade do template. As placas foram incubadas a 36 C por 18 h.
A fim de otimizar a visualizao dos halos de inibio da tcnica de difuso, foi preparado o revelador cloreto de trifeniltetrazlio
(CTT) em gel de gar bacteriolgico a 1%, onde foram distribudas 8 mL da soluo em cada placa de 20 x100 mm ou 20 mL em
cada placa de 25 x 150 mm, aps as 18 h de incubao. As placas
foram reincubadas a 37 C por 30 min. Os halos de inibio do
crescimento bacteriano foram medidos em milmetros, com auxlio de uma rgua milimetrada.
Determinao da concentrao inibitria mnima (CIM) pela
tcnica da microdiluio em caldo
A determinao da concentrao inibitria mnima dos extratos foi realizada segundo a metodologia da diluio em caldo
(microtcnica) proposta pelo NCCLS,11 com as mesmas bactrias
utilizadas nas tcnicas de difuso em gar. Foram utilizadas
microplacas com fundo em U esterilizadas com 96 orifcios
(TPP, EUA). Cada orifcio recebeu o inculo, o meio de cultura
lquido CMH e as solues dos extratos brutos em concentraes
finais que variaram de 50 a 400 g/mL, sendo o volume final de
100 L. Logo aps a micropipetagem as placas foram tampadas e
incubadas a 35 C por 24 h, sem agitao. Terminado o perodo de
incubao, foram adicionados em cada orifcio das placas 15 L
de resazurina a 0,01% em soluo aquosa esterilizada onde, aps 4
h de reincubao, a leitura foi realizada. A resazurina facilita verificar a presena de crescimento microbiano, a colorao azul indica ausncia de crescimento microbiano, enquanto a cor vermelha
indica a presena de clulas viveis em crescimento. Dessa maneira foi possvel determinar a menor concentrao de cada extrato
capaz de inibir o crescimento dos microrganismos indicadores diludos. Para as substncias puras, as quais foram tambm utilizadas como controles positivos, as concentraes avaliadas variaram
de 0,0115 a 5,9 g/mL, perfazendo 100 L de volume final. Soluo de DMSO no meio de cultura lquido CMH foi utilizada como
controle negativo.
RESULTADOS E DISCUSSO
Comparao entre os halos de inibio das tcnicas do disco,
poo e template
Os resultados obtidos com os extratos etanlico e diclorometnico de M. rubiginosa aps a realizao dos ensaios de difuso em gar pela tcnica do poo demonstraram que houve inibio da maioria das bactrias, pela verificao da formao de halos
de inibio ao redor dos poos onde foram depositadas as solues
testadas (Tabela 1). Com o objetivo de avaliar se o tamanho do
halo de inibio aumentava proporcionalmente ao aumento da concentrao do extrato, realizaram-se anlises estatsticas de varincia
seguindo o modelo ONE-WAY ANOVA e teste de Tukey, onde foi
evidenciado que, no conjunto dos dados, no houve proporcionalidade entre a concentrao dos extratos e o dimetro do halo de
inibio para a maioria dos microrganismos avaliados.
A fim de avaliar se cada mtodo possua uma preciso adequada, foram calculados os coeficientes de variao a partir das medidas dos halos de inibio, tanto para os extratos como para as substncias puras (antimicrobianos padro). Para os extratos, obser-

Quim. Nova

vou-se quem em 75% das medidas dos halos de inibio utilizando

a tcnica do template, os coeficientes de variao ficaram abaixo
de 5%. Para as tcnicas do poo e do disco, respectivamente, 63 e
66% das medidas ficaram com um coeficiente de variao abaixo
de 5%. Para as substncias puras observou-se um coeficiente de
variao inferior a 5% para 100% das medidas quando utilizada a
tcnica do poo. Para as tcnicas do template e do disco, respectivamente, 83,3 e 50% das medidas ficaram com um coeficiente de
variao abaixo de 5%. Isso indica que houve uma preciso significativa entre as medidas dos halos de inibio.17
Atravs dos resultados do ensaio de difuso em gar pela tcnica do disco (Tabela 1), possvel observar que o nmero de bactrias inibidas pelos extratos foi menor quando comparado tcnica do poo (p<0,05). Assim como na tcnica do poo, as anlises
estatsticas demonstraram que, no conjunto dos dados, no houve
proporcionalidade entre a concentrao dos extratos e os dimetros dos halos de inibio para a maior parte dos microrganismos
avaliados. Alm disso, na grande maioria das anlises que demonstraram proporcionalidade, no havia coincidncia com a tcnica
do poo (Tabela 1).
Ao contrrio das tcnicas do poo e do disco, os resultados
obtidos na realizao dos ensaios de difuso em gar pela tcnica
do template demonstraram que houve inibio apenas de uma pequena parte das bactrias. Fica evidente que dentre as trs tcnicas
de difuso em gar analisadas, a do template foi a que demonstrou
o menor nmero de halos de inibio, embora nesta tcnica a quantidade de extrato aplicada na placa tenha sido maior. Considerando
as outras duas tcnicas, fica evidente pelos resultados alcanados
que a do poo se mostrou mais satisfatria para deteco da atividade antibacteriana das amostras avaliadas por propiciar a maior
facilidade de contato entre estas e os microrganismos testados.
A Tabela 1 tambm apresenta os resultados da anlise estatstica seguindo o modelo ONE-WAY ANOVA e teste de Tukey
(significncia de 5%), comparando as medidas dos halos de inibio obtidos pelas diferentes tcnicas de difuso em gar: poo,
disco e template. Os resultados obtidos com extrato etanlico nas
duas concentraes frente a E. faecalis, E. coli e P. aeruginosa
evidenciam que houve diferena estatstica significante entre as
tcnicas do poo e do disco nas concentraes testadas (p<0,05).
No caso de S. aureus, observou-se que no houve diferena estatisticamente significante entre os halos de inibio da tcnica do poo
e do disco para o extrato etanlico. Para K. rhizophila e S.
typhimurium, os halos de inibio apresentados pelo extrato
etanlico foram estatisticamente semelhantes entre as tcnicas do
disco e do poo somente na concentrao de 300 mg/mL.
Como na tcnica do template no houve formao de halos de
inibio para grande parte dos microrganismos testados, houve diferena estatstica entre a maioria dos halos medidos quando
comparados tcnica do poo, sendo semelhantes somente na concentrao de 300 mg/mL contra K. rhizophila.
Os halos de inibio foram estatisticamente semelhantes entre
as tcnicas do template e do disco para o extrato etanlico na concentrao de 300 mg/mL frente a K. rhizophila e para concentraes de 100 e 300 mg/mL contra E. coli.
Em relao ao extrato diclorometnico de M. rubiginosa, foi
possvel observar que houve diferena estatisticamente significativa entre os halos de inibio das tcnicas do poo e do disco para
as concentraes testadas (p<0,05), s havendo semelhana estatstica entre as tcnicas, na concentrao de 300 mg/mL frente a S.
aureus. Alm disso, foi possvel observar que para E. coli o extrato
diclorometnico apresentou halos de inibio pela tcnica do poo,
o que no ocorreu na tcnica do disco.
Assim como observado para o extrato etanlico, o extrato

1227
Estudo comparativo de tcnicas de screening para avaliao
Vol. 31, No. 5
0,00

D
11,00 0,00

(cv = 8,23%)

21,00 1,73

(cv = 0,00%)

12,00 0,00

0,00 0,00

(cv = 5,03%)

11,33 0,57

0,00 0,00

(cv = 15,77%)

19,33 3,05

0,00 0,00

ab

(cv= 3,71%)

15,33 0,57

14,00 0,00

0,00 0,00

(cv = 0,00%)

11,00 0,00

Extrato diclorometnico

P
19,00 0,00
(cv = 0,00%)

0,00 0,00

13,00 0,00

(cv = 0,00%)

Extrato diclorometnico

T
20,00 0,00
(cv = 0,00%)
b

0,00 0,00

17,33 0,57

(cv = 0,00%)

Extrato etanlico

D
11,00 0,00
(cv = 0,00%)
a

0,00 0,00

11,00 0,00

(cv = 3,28%)

0,00 0,00

Extrato etanlico

Tabela 1. Comparao estatstica entre as medidas dos dimetros dos halos de inibio do crescimento microbiano (mm) obtidas pelas tcnicas do poo, disco e template utilizando os extratos etanlico e diclorometnico de Miconia rubiginosa frente
a bactrias padro
Microrganismo

P
19,33 0,57
(cv = 0,00%)
a

9,66 0,57

9,00 0,00

(cv = 0,00%)

0,00 0,00

Miconia rubiginosa

19,00 1,00
(cv = 2,94%)
b

11,00 0,00
(cv = 5,90%)

15,33 3,21

(cv = 0,00%)

ab

18,66 0,57

Miconia rubiginosa

(cv = 5,26%)
a

0,00 0,00
(cv = 0,00%)
b

17,00 0,00

(cv = 20,93%)

0,00 0,00

Miconia rubiginosa

9,00 0,00

16,33 1,52

(cv = 0,00%)

0,00 0,00

Miconia rubiginosa

10,66 0,57
(cv = 0,00%)
c

18,66 0,57

(cv = 9,30%)

16,66 0,57

300 mg/mL

(cv = 5,34%)
b

16,66 0,57
(cv = 3,05%)

0,00 0,00

100 mg/mL

16,33 1,52
(cv = 3,42%)
a

0,00 0,00

300 mg/mL

19,00 0,00
(cv = 9,30%)
c

19,00 0,00

100 mg/mL

K.
(cv = 0,00%)
b

0,00 0,00

E. faecalis

29212

14,66 0,57

8,66 0,57

0,00 0,00

18,66 1,15

10,66 0,57

0,00 0,00

rhizophila
a

0,00 0,00

S. aureus

9341

17,00 1,00

25923

E. coli

0,00 0,00

(cv = 3,05%)
a

12,00 0,00

(cv = 3,42%)

17,00 0,00

(cv = 0,00%)
b

0,00 0,00

(cv = 5,88%)
a

11,66 0,57

35218

17,66 0,57

(cv = 4,88%)
b

(cv = 0,00%)

(cv = 0,00%)
c

(cv = 3,88%)

(cv = 6,58%)
c

(cv = 6,16%)

(cv = 5,34%)

P.
aeruginosa (cv = 3,22%)
a

0,00 0,00

27853

12,00 0,00

(cv = 0,00%)

18,66 0,57

(cv = 3,05%)

0,00 0,00

9,66 0,57
(cv = 5,90%)

18,33 0,57
(cv = 3,10%)

0,00 0,00

12,33 0,57
(cv = 4,62%)

17,66 0,57
(cv = 3,22%)

0,00 0,00

12,00 0,00

18,66 1,15

S.

(cv = 0,00%)
a

typhimurium (cv = 6,16%)

14028

P = poo; D = disco; T = template; letras distintas indicam diferena significativa entre as tcnicas, de acordo com o teste de Tukey ( = 0,05); cv = coeficiente de variao

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Alves et al.

diclorometnico no produziu halos de inibio para grande parte

dos microrganismos testados, quando foi utilizada a tcnica do
template. Houve diferena estatstica entre a maioria das medidas
dos halos de inibio quando comparadas tcnica do poo
(p<0,05), sendo semelhantes apenas nas concentraes de 100 e
300 mg/mL contra E. faecalis.
Os halos de inibio medidos na tcnica do template quando
comparados do disco mostraram semelhana estatstica para o
extrato diclorometnico nas concentraes de 100 e 300 mg/mL
contra S. aureus, E. faecalis e E. coli e na concentrao de 100 mg/
mL contra K. rhizophila (p<0,05).
O solvente DMSO utilizado como controle negativo nas trs tcnicas no apresentou nenhuma atividade antimicrobiana frente a
qualquer microrganismo testado, enquanto as substncias puras, as
quais foram tambm utilizadas como controles positivos, mostraram halos de inibio frente a todas as bactrias, demonstrando a
efetividade das tcnicas (Tabela 2). Entretanto, deve-se considerar
que a avaliao da atividade antimicrobiana de substncias puras
est sujeita a um menor nmero de interferentes quando comparada
avaliao da atividade de amostras complexas, como os extratos
brutos de espcies vegetais, pois o conhecimento das caractersticas
fsico-qumicas do agente antimicrobiano, como solubilidade, carga
inica e massa molecular, possibilita evidenciar possveis interferncias que possam ser causadas por constituintes desconhecidos
presentes nas amostras. A atividade da gentamicina, por exemplo,
influenciada pela presena de magnsio no meio de cultura, enquanto que a atividade da penicilina influenciada pelo pH do meio.18
Observando-se os resultados obtidos na avaliao da atividade
antimicrobiana das substncias puras, pelo mtodo de difuso em
gar utilizando-se as trs tcnicas, percebe-se que a quantidade de
substncia aplicada na placa no foi o fator preponderante para a
formao dos halos de inibio, pois se assim fosse, a utilizao
do template possibilitaria a obteno de maiores halos de inibio
em todos os experimentos. A tcnica utilizada na avaliao da atividade exerce influncia direta na formao do halo de inibio.
Como exemplo, pode-se citar as polimixinas, as quais so grandes

Quim. Nova

peptdeos cclicos, que por difundirem muito pouco produzem pequenos halos de inibio, mesmo quando microrganismos altamente
sensveis so testados contra uma alta concentrao do antibitico.18
Tcnica da microdiluio em caldo para determinao da
concentrao inibitria mnima (CIM)
A Tabela 3 apresenta as concentraes inibitrias mnimas
(CIMs) dos extratos etanlico e diclorometnico de M. rubiginosa,
obtidas pelo mtodo de microdiluio em caldo. As CIMs variaram
entre 250 e >400 g/mL frente aos microrganismos testados. Observa-se que os extratos apresentaram atividade antibacteriana contra
todos os microrganismos testados, embora para S. aureus a CIM
tenha sido superior a 400 g/mL. As sustncias puras avaliadas, as
quais foram tambm utilizadas como controles positivos, foram capazes de inibir o crescimento microbiano em baixas concentraes.
Os valores de CIM foram determinados pela leitura visual aps
revelao com resazurina, um indicador de xido-reduo que
Tabela 3. Concentrao inibitria mnima (CIM) dos extratos
etanlico e diclorometnico de Miconia rubiginosa
Microrganismos/ATCC

CIM (g/mL)
Extrato diclorometnico de
Miconia
rubiginosa

Extrato
etanlico
Miconia
rubiginosa
S. aureus / 25923
E. faecalis / 29212
K. rhizophila / 9341
E. coli / 35218
P. aeruginosa / 27853
S. typhimurium / 14028

>400
400
300
400
250
300

>400
400
300
400
250
350

Substncia
pura

0,18*
0,36*
0,02*
2,95#
2,95#
1,47#

* Penicilina; #Gentamicina

Tabela 2. Comparao estatstica entre as medidas dos dimetros dos halos de inibio do crescimento microbiano (mm) obtidas pelas
tcnicas do poo, disco e template utilizando substncias puras frente a bactrias padro
Microrganismo
S.
aureus
25923
E.
faecalis
29212
K.
rhizophila
9341
E. coli

Penicilina G
D

35,33 0,57
(cv = 1,61%)
abc
15,00 0,00
(cv = 0,00%)
a
36,00 1,73
(cv = 4,80%)
a
_

37,66 0,57
(cv = 1,51%)
ab
11,33 0,57
(cv = 5,03%)
bc
49,66 1,52
(cv = 3,06%)
b
_

35218
P.
aeruginosa
27853
S.
typhimurium
14028

33,33 0,57
_
(cv = 1,71%)
c
14,00 0,00
_
(cv = 0,00%)
ac
48,33 1,52
_
(cv = 3,14%)
b
_
22,00 1,00
(cv = 4,54%)
a
_
25,00 0,00
(cv = 0,00%)
a
_
20,00 0,00
(cv = 0,00%)
a

Gentamicina
D

DMSO
D

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

14,00 1,00
(cv = 7,14%)
b
10,66 0,57
(cv = 5,34%)
b
13,33 0,57
(cv = 4,27%)
b

15,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

(cv = 0,00%)
b
13,33 1,52 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
(cv = 11,40%)
c
14,33 0,57 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
(cv = 3,97%)
c

P = poo; D = disco; T = template; _: No avaliado; Letras distintas indicam diferena significativa entre as tcnicas, de acordo com o teste
de Tukey ( = 0,05); cv = coeficiente de variao

Vol. 31, No. 5

Estudo comparativo de tcnicas de screening para avaliao

tem sido utilizado para avaliar a viabilidade de clulas microbianas.19 A resazurina (7-hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona-10-xido)
de cor azul oxidada na presena de clulas viveis a resofurina,
substncia de colorao vermelha.20
No foi possvel comparar os resultados obtidos pela tcnica
da microdiluio em caldo, j que ainda no foram publicados trabalhos demonstrando as CIMs de extratos de M. rubiginosa.
Ao contrrio do mtodo de microdiluio em caldo, alguns extratos no apresentaram atividade antibacteriana quando foram utilizados os mtodos de difuso. Esses resultados talvez possam ser explicados pela dificuldade de difuso do extrato no meio de cultura. Bandeira et al.21 observaram que a dificuldade de difuso de produtos
naturais pode estar relacionada sua hidrossolubilidade e sua massa
molecular. Essas afirmaes esto de acordo com Rios et al.,1 que
argumentaram que as pesquisas sobre atividade antimicrobiana de
extratos de plantas e de substncias isoladas encontram problemas
devido caracterstica lipoflica de algumas amostras.
Celloto et al.22 avaliaram a atividade antimicrobiana de extratos etanlico, hexnico e diclorometnico de Miconia rubiginosa
utilizando a tcnica do poo. Observaram que o extrato etanlico
em uma concentrao de 300 mg/mL foi o mais ativo, inibindo a
bactria Gram-positiva S. aureus (ATCC 25923), o que coincide
com os nossos resultados. O mesmo efeito no foi observado para
o extrato etanlico frente bactria Gram-negativa P. aeruginosa
(ATCC 27853), que no demonstrou atividade antimicrobiana, ao
contrrio de nosso estudo. A contradio entre os resultados talvez
possa ser explicada pela densidade do inculo, j que a mesma no
foi ajustada por espectrofotometria no estudo de Celloto et al.22 e
se constitui em uma varivel que influencia nos testes de difuso.
Segundo Auricchio et al.,23 quando se comparam estudos de atividade antimicrobiana de extratos de plantas medicinais, notria a
dificuldade de comparao entre os resultados, pois as variveis vo
dos aspectos climticos que exercem influncia na composio qumica, como o estgio de desenvolvimento do vegetal quando da sua
coleta, parte da planta estudada, forma de preparar o material para
estudo e, principalmente, os protocolos seguidos nos experimentos.
Rios et al.,1 na tentativa de solucionar a falta de uniformidade nos
critrios de seleo para o estudo da atividade antimicrobiana de plantas medicinais, propuseram mtodos padro usados para o estudo de
extratos de plantas e de leos essenciais, bem como de seus compostos isolados, sendo estes os mtodos de difuso, diluio e bioautografia.
Em uma reviso recente de artigos publicados sobre atividade
antimicrobiana de plantas medicinais, Rios e Recio24 revelaram que
o maior problema com as pesquisas ainda continua sendo a falta de
uniformidade nos critrios selecionados para estudar a atividade.
Isso freqentemente leva a relevantes contradies entre os resultados obtidos por diferentes grupos e at para o mesmo autor estudando a mesma amostra com diferentes mtodos.

1229

CONCLUSES
Quando comparados os resultados da atividade antibacteriana
dos extratos brutos e substncias puras utilizando-se o mtodo de
difuso em gar observou-se que houve discordncia estatisticamente significante entre as trs tcnicas de screening analisadas,
sendo que o ensaio de difuso em gar pela tcnica do poo demonstrou melhor performance, j que houve inibio da maioria
das bactrias testadas. Embora essa tenha sido a melhor tcnica de
difuso observada nesse estudo, pode-se considerar que o mtodo
de diluio em caldo foi a melhor opo para se determinar a atividade antimicrobiana.
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